ES2836133T3 - Composiciones y métodos para modular la excitabilidad neuronal y el comportamiento motor - Google Patents

Abstract

Un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128 en el cerebro para su uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de estado epiléptico en un individuo sospechoso de tener o diagnosticado con síndrome de Dravet, donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para modular la excitabilidad neuronal y el comportamiento motor

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes de patente provisional de los EE.UU. N° de serie 61/896.463, presentada el 28 de octubre de 2013, y número de serie 61/898.952, presentada el 1 de noviembre de 2013.

INVESTIGACIÓN FINANCIADA POR LOS GOBIERNOS DEL ESTADO Y FEDERAL

[0002] La invención descrita en este documento se realizó con el apoyo de subvenciones del Instituto Nacional de Salud (DA025962) y de US Army Medical Research Adquisición Activity (W81XWH-09-1-0095). El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre esta invención.

CAMPO TÉCNICO

[0003] La invención se refiere al campo de la biología molecular. Más particularmente, se refiere a métodos y composiciones que implican moléculas de microARN (miARN). En particular, la divulgación también se refiere a una estrategia terapéutica para tratar o prevenir el desarrollo de trastornos relacionados con convulsiones y lesiones neurológicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] Una convulsión es un acontecimiento paroxístico debido a descargas anormales excesivas, hipersincrónicas de un agregado de neuronas del sistema nervioso central (SNC), mientras que la epilepsia es una condición en la cual una persona tiene convulsiones recurrentes debido a una enfermedad crónica, proceso subyacente. Los datos experimentales y clínicos indican que la aparición de convulsiones repetidas puede provocar una enfermedad epiléptica. Por tanto, es de gran interés identificar posibles tratamientos farmacológicos para las convulsiones y el marco de tiempo en donde dicho tratamiento es eficaz.

[0005] La epilepsia es un trastorno cerebral caracterizado por convulsiones periódicas e impredecibles provocadas por la activación rítmica de grandes grupos de neuronas. Las manifestaciones conductuales de las convulsiones epilépticas en pacientes humanos varían desde espasmos leves de una extremidad hasta pérdida del conocimiento y convulsiones incontrolables. Hasta el 1 % de la población está afectada, por lo que la epilepsia es uno de los problemas neurológicos más comunes. La actividad anormal asociada con la epilepsia genera cambios plásticos en los circuitos corticales que juegan un papel en la patogenia de la enfermedad. Durante un período de tiempo, un estímulo débil que inicialmente no tuvo ningún efecto eventualmente causará convulsiones en toda regla. Este fenómeno es esencialmente permanente; incluso después de un intervalo de un año; el mismo estímulo débil volverá a desencadenar una convulsión.

[0006] La investigación se ha centrado en dónde se originan las convulsiones y los mecanismos que hacen que la región afectada sea hiperexcitable. La evidencia sugiere que la actividad anormal en los focos de la corteza cerebral proporciona los desencadenantes de una convulsión que luego se propaga a otras regiones conectadas sinápticamente. Las convulsiones epilépticas pueden ser causadas por una variedad de factores agudos o congénitos, que incluyen daño cortical por trauma, accidente cerebrovascular, tumores, disgenesia cortical congénita y malformaciones vasculares congénitas.

[0007] No existe ninguna prevención o cura efectiva para la epilepsia. Las terapias farmacológicas que inhiben con éxito las convulsiones se basan en dos estrategias generales. Un enfoque es mejorar la función de las sinapsis GABAérgicas inhibitorias; el otro es limitar la activación del potencial de acción actuando sobre los canales de Na+ activados por voltaje. Los medicamentos anticonvulsivos de uso común incluyen carbamazepina, fenobarbital, feniloína y ácido valproico. Estos agentes deben tomarse a diario y solo inhiben las convulsiones en el 60-70% de los pacientes. Así, existe un gran grupo de pacientes con epilepsia para los que actualmente no existe un tratamiento eficaz.

[0008] Los microARN (miARN o miR) son una pequeña familia no codificante de ARN de 19-25 nucleótidos que regulan la expresión génica dirigiéndose a los ARN mensajeros (ARNm) de una manera específica de secuencia, induciendo la represión traduccional o la degradación del ARNm dependiendo del grado de complementariedad entre los miARN y sus dianas (Bartel, DP (2004) Cell 116, 281-297). Muchos miARN se conservan en secuencia entre organismos relacionados lejanamente, lo que sugiere que estas moléculas participan en procesos esenciales. De hecho, los miARN participan en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo, la proliferación celular, la apoptosis, el metabolismo de la glucosa, la resistencia al estrés y el cáncer. Se han realizado considerables esfuerzos para comprender y caracterizar los niveles de expresión temporal, espacial y celular y los patrones de expresión de los miARN para determinar su papel preciso en el desarrollo y la diferenciación celular tanto en estados normales como patológicos.

[0009] Aunque miARNs se han demostrado estar involucrados en la regulación de la expresión génica en diferentes condiciones, p. ej., cáncer o apoptosis, hay poca o ninguna técnica centrándose en la participación de miARN en la epilepsia y/o convulsiones. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de proporcionar otras alternativas y tratamientos eficaces para la epilepsia y trastornos relacionados, especialmente aquellos en los que los tratamientos existentes no proporcionan ningún remedio a los pacientes.

SUMARIO

[0010] La presente descripción se refiere a una estrategia terapéutica para tratar o reducir la probabilidad del desarrollo de trastornos convulsivos y lesiones neurológicas. Los inventores de la presente solicitud han descubierto sorprendentemente un papel del miR-128 en la señalización neuronal y, en particular, un papel del miR-128 en la modulación de las vías de señalización que controlan la excitabilidad neuronal y la actividad motora.

La invención proporciona un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128 en el cerebro para su uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de estado epiléptico en un individuo sospechoso de tener o diagnosticado con síndrome de Dravet, en donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128. La invención también proporciona un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128 para su uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de desarrollo o aparición de convulsiones en un individuo con riesgo de convulsiones o que las tenga, en donde se sospecha que el individuo tiene o ha sido diagnosticado con el síndrome de Dravet, en donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128.

[0011] También se describe un método para tratar o reducir la probabilidad del desarrollo de epilepsia o estado epiléptico en un individuo en riesgo de o que se sospecha que tiene una condición caracterizada por convulsiones, que comprende administrar a un individuo en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de incrementar la expresión y/o actividad de miR-128. En una forma de realización, el individuo muestra síntomas o se le ha diagnosticado síndrome de Dravet. En una realización, el agente se administra por vía intratecal o intranasal. En otra realización, el agente se administra al sistema nervioso central del individuo. En una realización particular, la administración es directamente al hipocampo y/o corteza.

[0012] En una realización, el agente es miR-128, o es un agente con 90 por ciento o más homología de secuencia con miR-128. En una realización particular, el agente capaz de aumentar y/o la activación de miR-128 se selecciona del grupo que consiste en miR-128 estabilizado químicamente, un imitador de miR-129, un ácido nucleico que codifica miR-128 y un vector viral que codifica miR-128. En una realización, el agente capaz de aumentar y/o activar miR-128 es un factor neurotrófico derivado del cerebro.

[0013] También se describe un método para tratar o reducir la probabilidad del desarrollo o aparición de convulsiones en un individuo, que comprende administrar a un individuo en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128, en donde dicho paciente tiene un trastorno relacionado con el cerebro caracterizado por el desarrollo de convulsiones. En una realización, al individuo se le diagnostica el síndrome de Dravet. El agente puede administrarse por vía intratecal o intranasal. En una realización, el agente se administra al hipocampo y/o corteza. En una realización, el trastorno relacionado con el cerebro caracterizado por el desarrollo de convulsiones se selecciona del grupo que consiste en apoplejía, hipoxia, lesión cerebral traumática, infección, tumor, trastornos neurodegenerativos, trastornos metabólicos y autoinmunitarios que provocan convulsiones.

[0014] También se describe un método para tratar o reducir la probabilidad del desarrollo de la epilepsia en un individuo, que comprende administrar al individuo en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128, en donde dicho individuo ha sufrido una lesión cerebral previa que aumenta el riesgo de epilepsia de dicho individuo. En una realización, la lesión cerebral está causada por un accidente cerebrovascular.

[0015] La invención proporciona además una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o la reducción de la probabilidad de que el desarrollo del síndrome de Dravet que comprende un agente, como se definió anteriormente, que es capaz de aumentar la expresión o actividad de miR-128, en donde el agente es miR 128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. El agente capaz de potenciar la actividad de miR-128 puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-128 estabilizado químicamente, un imitador de miR-128 o un ácido nucleico que codifica miR-128; los agentes capaces de potenciar la expresión de miR-128 incluyen, p. ej., un vector viral que codifica miR-128. También se describe un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128 para su uso en la reducción de la probabilidad de convulsiones recurrentes espontáneas en un individuo o como un agente antiepiléptógeno en un individuo que tiene una lesión cerebral que probablemente precipite la epilepsia, el agente se entrega al cerebro del individuo.

[0016] La invención proporciona además un método de identificación de compuestos útiles en el tratamiento de o para reducir la probabilidad de una patología caracterizada por convulsiones, comprende poner en contacto una célula de miR-128 que expresan con un compuesto candidato, y determinar el nivel de expresión y/o actividad de la célula que expresa miR-128, donde un aumento en el nivel de expresión y/o actividad del miR-128 en relación con el nivel de referencia de expresión y/o actividad de miR-128 en una célula que no tiene estado en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto candidato es útil en el tratamiento o la prevención del síndrome de Dravet, en donde el compuesto candidato es un agente con 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128, el método realizado in vitro o en animales humanos.

[0017] En una realización, el miR-128 se proporciona en la forma de células que expresan de miR-128, y en donde el nivel de actividad se determina mediante el ensayo para un nivel de expresión de miR-128 en las células.

[0018] También se describe un método para aumentar miR-128 de expresión y/o actividad en una célula de mamífero, que comprende la administración de un agente capaz de aumentar la expresión de miR-128 en la célula o imitar la actividad de miR-128 en la célula de mamífero, en donde dicho agente comprende un oligómero de entre 6 y 30 nucleótidos de longitud, y en donde dicho oligómero comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es idéntica a al menos seis nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de miR-128. En una realización, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en células en el hipocampo, la corteza, el cuerpo estriado y el tálamo. En una realización, el método se realiza in vitro. En otra realización, el método se realiza in vivo.

[0019] En una realización, el oligómero comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es idéntica a la secuencia de la región de semilla de miR-128. En otra realización, el oligómero consiste en una secuencia de nucleótidos contigua que es idéntica a la secuencia de la región semilla de miR-128. En una realización, la secuencia de nucleótidos contigua del oligómero comprende entre 7 y 23 nucleótidos, que son idénticos a la secuencia de la región correspondiente de miR-128.

[0020] En una realización, miR-128 tiene la secuencia de nucleótidos:

UCACAGUGAACCGGUCUCUUU.

[0021] También se describe un método para tratar o reducir la probabilidad para el desarrollo de convulsiones y/o la epilepsia en un sujeto, que comprende administrar miR-128 o un agente con 90 por ciento o más homología de secuencia con la región correspondiente de miR-128 a un sitio de lesión cerebral en el sujeto. En una realización, miR-128 o un agente con un 90 por ciento o más de homología de secuencia con la región correspondiente de miR-128 se administra por vía intratecal o intranasal y en donde la administración es en el hipocampo y/o la corteza. En una realización, miR-128 está codificado por un vector que comprende a) un promotor unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica miR-128; y b) una secuencia de terminación de la transcripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0022]

La Figura 1 muestra el comportamiento motor de los controles de miR-128 en ratones. (A) La deficiencia de miR-128-2 provoca hiperactividad y muerte prematura en ratones. (Panel izquierdo) La actividad motora se determinó midiendo la distancia horizontal total en un ensayo de campo abierto de 60 minutos (n = 23 y 12). (Panel derecho) Se muestran las vidas útiles de los ratones miR-128-2-/- y los controles de los compañeros de camada (n = 20 y 46). (B, C) La deficiencia de miR-128 causa convulsiones mortales que pueden prevenirse con un tratamiento anticonvulsivo (B) Presentación representativa de episodios convulsivos tónicoclónicos espontáneos en miR-128-2-/- (negro) o CamK2a-cre; Ratones miR-128-2fl/fl (rojo) durante un período de observación de 22 días. (C) Se muestra la esperanza de vida de los ratones de control miR-128-2-/-(línea de puntos, como se muestra en A) o tratados con valproato de sodio (rojo, n = 11) miR-128-2-/-(D) La deficiencia de miR-128 en las neuronas posnatales provoca hiperactividad y epilepsia mortal. Tasas de actividad motora y supervivencia de CamK2a-cre; Se muestran ratones miR-128-2fl/fl (n = 21 y 25) y compañeros de camada (n = 8 y 47). (E) La expresión ectópica de miR-128 normaliza la hiperlocomoción y previene la muerte de CamK2a-cre; Ratones miR-128-2fl/fl. Actividad motora en CamK2acre; miR-128-2fl/fl; Se muestran ratones Rosa-miR-128 (n = 4, azul) y de tipo silvestre (n = 10, gris). La esperanza de vida de CamK2a-cre; Se muestran ratones miR-128-2fl/fl en presencia (n = 4, azul) o ausencia (n = 9, negro) de expresión ectópica de miR-128. La deficiencia de (F) miR-128 en las neuronas D1 causa hiperactividad y epilepsia fatal. Se muestran la actividad motora (n = 26 y 42) y la esperanza de vida (n = 16 y 28) de ratones con una deficiencia de miR-128 específica de la neurona D1 o ratones de control. Las barras de error muestran s.e.m., prueba t de Welch, no significativo (ns), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. El gráfico de Kaplan-Meier muestra las curvas de supervivencia de ratones de control mutantes y compañeros de camada, *** p < 0,001, pruebas de rango logarítmico.

La Figura 2 muestra que miR-128 controla la excitabilidad de la neurona D1 y la capacidad de respuesta a la dopamina. (A, B) miR-128 regula la excitabilidad dendrítica de la neurona D1 y el número de espinas. (A) Se generaron potenciales de acción únicos en el soma y se calculó la invasión del potencial de acción dividiendo la señal de calcio distal por la señal de calcio proximal máxima por célula (n = 4 células, 11 -21 ejes por grupo). Prueba no paramétrica de Mann-Whitney, *** p < 0,001 (B) Se muestran imágenes de proyección de intensidad máxima representativas de dendritas distales en neuronas D1 mutantes y de control. Los diagramas de caja muestran las densidades de la columna de la población (n = 10-11 células por grupo). Prueba no paramétrica de Mann-Whitney, las barras de error muestran el intervalo del percentil 90, * p < 0,05. (CE) miR-128 regula la respuesta motora, la fosforilación de ERK2 y la inducción inmediata del gen temprano (IEG) tras la activación del receptor de dopamina D1 (Drd1) en las neuronas D1. (C) Actividad motora de Drd1a-cre; Se evaluaron ratones miR-128-2fl/fl y control (n = 25 y 30) en una cámara de campo abierto. Se inyectaron intraperitonealmente solución salina y 3 mg/kg de agonista de Drd1 SKF81297 a los 10 y 20 minutos, respectivamente. (D) La fosforilación de ERK2 se cuantificó mediante transferencia Western de lisados estriados derivados de Drd1a-cre; miR-128-2fl/fl y ratones de control que recibieron una inyección de solución salina o agonista D1 SKF81297 (n = 5 cada uno). El gráfico de barras muestra la relación de fosfo-ERK2 a la expresión total de ERK2. (E) Los niveles de expresión génica de Darpp32 expresados en neuronas D1 y IEG se midieron mediante qRT-PCR de ARNm asociados a polirribosomas específicos de neuronas D1 purificados a partir de solución salina o Drd1a-TRAP tratado con SKF81297; Drd1a-cre; miR 128-2fl/fl y el control de ratones (n = 5 cada uno). Las barras de error muestran s.e.m., prueba t de Welch, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** pp < 0,001.

La Figura 3 muestra que la actividad motora anormal causada por la deficiencia de miR-128 se corrige mediante inhibición farmacológica de ERK o expresión ectópica de miR-128. (A) Drd1a-cre; Se inyectaron i.p. ratones miR-128-2fl/fl y ratones de control de camada por vía intraperitoneal o 12 mg/kg del inhibidor de MEK1 SL327 (n = 5/grupo). Se muestra el análisis de transferencia Western de la fosforilación de ERK2 a los 30 minutos después de la inyección del fármaco (izquierda) y la actividad motora después de la inyección de vehículo o SL327 (derecha). ANOVA de 2 vías seguido de una prueba posterior de Bonferroni. Las barras de error muestran s.e.m., * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (B) La sobreexpresión de miR-128 suprime la hiperreactividad de la neurona D1 en el cuerpo estriado empobrecido en dopamina. El número de rotaciones contralaterales al inicio del estudio y en respuesta a la cocaína (10 mg/kg) o al agonista D1 SKF81297 (5 mg/kg) en CamK2a-cre lesionado con 6-OHDA unilateral; Se muestran ratones Rosa-miR-128 o de control (n = 11/grupo). Las barras de error muestran s.e.m., prueba t de Welch, ** p < 0,01. (D) miR-128 reduce la susceptibilidad a convulsiones inducidas químicamente en ratones. Los números de CamK2a-cre; Rosa-miR-128 o ratones de control de camada (n = 12/grupo) que presentan convulsiones tónico-clónicas 60 minutos después de la inyección i.p. de fármacos proconvulsivos ácido kaínico (30 mg/kg, valor p = 0,005) o picrotoxina (3 mg/kg, pvalue = 0,04). Los valores de p se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher.

La Figura 4 muestra que miR-128 está altamente expresado en el cerebro de ratón postnatal. (A) miR-128 se enriquece en el cerebro del ratón. Los niveles de expresión de miR-128 se midieron mediante qRT-PCR en ARN purificado del cerebro, músculo esquelético, corazón, riñón, pulmón e hígado de ratones adultos de 8 semanas de edad (n = 3). Los niveles de expresión de miR-128 se normalizaron a la expresión de snoRNA135 y se mostraron como un aumento de veces sobre los niveles de expresión de miARN respectivos en el hígado. ANOVA de 1 vía seguido de la prueba posterior de Turquía, p <0,01 para comparaciones de cerebro frente a otros órganos. (B) El desarrollo cerebral posnatal se acompaña de un aumento en los niveles de expresión de miR-128. Los niveles de expresión de miR-128 y miR-124a enriquecido en neuronas se midieron mediante qRT-PCR en el cerebro derivado de embriones de ratón en el día 12 del desarrollo embrionario (E12), ratones recién nacidos (P0) o ratones adultos de 8 semanas (n = 3 por grupo de edad). Los niveles de expresión de miARN se normalizaron a la expresión de snoARN135 y se mostraron como un aumento de veces sobre los respectivos niveles de expresión de miARN en el cerebro embrionario E12. (C) miR-128 se expresa en diferentes regiones del cerebro. La expresión de miR-128 en las regiones cerebrales indicadas en ratones adultos se cuantificó como en (A) y se mostró en relación con la expresión media de miR-128 en el tronco cerebral (n = 3 por región). Las barras de error muestran s.e.m.

La Figura 5 muestra que los genes miR-128-1 y miR-128-2 contribuyen de manera diferencial a la expresión de miR-128 en el cerebro. (A, B) Generación de los loci (A) miR-128-1 y (B) miR-128-2 para la inactivación condicional de genes en ratones. (Paneles de la izquierda) Se muestra la estrategia para la modificación de genes y la inactivación de genes miR-128. Las regiones que contienen la horquilla de miARN en ambos genes portadores de miR-128 estaban flanqueadas con sitios loxP en células ME de ratón seguido por el procedimiento de rutina para la generación de ratones miR-128-1fl/fl y miR-128-2fl/fl. Horquilla de microARN, rectángulo relleno; exones, rectángulos abiertos; sitios loxP, triángulos negros. El gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias FRT (círculos negros) se eliminó de los loci diana utilizando recombinasa FLT; DTA, gen de la toxina diftérica; TK, gen de la timidina quinasa; LAH/SAH, brazo largo y corto de homología. (Paneles derechos) Se generaron ratones deficientes en miR-128-1 (miR-128-1-/-) o miR-128-2 (miR-128-2-/-) mediante la reproducción de miR-128-1fl/fl y miR-128-2fl/fl de ratones, respectivamente, a ratones CMV-cre. Los alelos de miR-128-1 y miR-128-2 modificados se identificaron mediante transferencia Southern del ADN de la cola de ratón digerido con EcoRI o Sacl usando las sondas de ADN indicadas (rectángulos negros) o mediante genotipificación por PCR usando cebadores como se indica en el esquema. Se muestran los niveles de expresión relativa de miR-128 en el cuerpo estriado de ratones deficientes para el gen miR-128-1 (n = 7 cada uno) o miR-128-2 (n = 5 y 3). (C) La inactivación del gen miR-128-1 no afecta la actividad motora o la supervivencia en ratones. El impacto de la deficiencia de miR-128-1 sobre la actividad motora en ratones se midió mediante análisis de campo abierto. (Panel izquierdo) Se muestra la distancia horizontal total movida en metros y (panel central) el número de episodios de cría vertical dentro de los 60 minutos en campo abierto (n = 7 y 9). (Panel derecho) Se muestran la esperanza de vida de los ratones deficientes para miR-128-1 (n = 6) y sus respectivos controles de compañero de camada de tipo silvestre (n = 22). (D) La inactivación del gen miR-128-2 aumenta la exploración en ratones. Se muestra el número de episodios de cría vertical de o miR-128-2-/- y controles de compañeros de camada (n = 23 y 12). Las barras de error muestran s.e.m., * p < 0,05, ** p < 0,01, prueba t de Welch y prueba de rango logarítmico.

La Figura 6 (S3) muestra una actividad exploratoria aumentada en ratones con inactivación condicional en las neuronas CamK2a y D1 posnatales, pero no D2 en ratones. (A) La deficiencia de miR-128 en las neuronas CamK2a posnatales aumenta la exploración. La deficiencia de miR-128 en las neuronas CamK2a posnatales se ha logrado mediante la reproducción de CamK2a-cre con ratones miR-128-2fl/fl. (Panel izquierdo) El gráfico de barras muestra los niveles de expresión relativos de miR-128 en CamK2a-cre; Ratones miR-128-2fl/fl y compañeros de camada de control (n = 7 y 4). (Panel derecho) El número de episodios de cría vertical realizados por CamK2a-cre; Se muestran ratones miR-128-2fl/fl y compañeros de camada de control (n = 21 y 8). (B) La deficiencia de miR-128 en las neuronas D1 aumenta la exploración. La deficiencia de miR-128 en las neuronas D1 se ha logrado mediante la reproducción de Drd1a-cre con ratones miR-128-2fl/fl. Niveles de expresión estriatal relativa de miR-128 (izquierda, n = 3 cada uno) y episodios de cría vertical (derecha) de Drd1a-cre; Se muestran ratones miR-128-2fl/fl y compañeros de camada de control (n = 22 y 26). (C) La deficiencia de miR-128 en las neuronas D2 no afecta la actividad motora o la supervivencia en ratones. La deficiencia de miR-128 en las neuronas D2 se ha logrado mediante la reproducción de A2A-cre con ratones miR-128-2fl/fl. Niveles de expresión estriatal de miR-128 (izquierda, n = 3 cada uno), actividad motora horizontal y episodios de crianza vertical (medio, n = 9 y 7) y período de supervivencia (derecha, n = 8 y 7) de A2A-cre; Se muestran ratones miR-128-2fl/fl y sus respectivos compañeros de camada (n = 7). Las barras de error muestran s.e.m., * p < 0,05, ** p < 0,01, prueba t de Welch y prueba de rango logarítmico.

La Figura 7 (S4) muestra que la expresión ectópica de miR-128 in vivo atenúa la actividad motora en ratones de tipo silvestre y normaliza los niveles de expresión de miR-128 en CamK2acre; Ratones miR-128-2fl/fl. (A) Estrategia de focalización para la generación de ratones con sobreexpresión condicional de miR-128. El gen miR-128-2 exógeno se insertó en el locus del gen Rosa26 endógeno en las células madre embrionarias usando una estrategia de knock-in como se describió previamente. El gen miR-128-2 (rectángulo rojo) se separó de un promotor CAGG fuerte mediante un casete de neomicina STOP floxado. Exones, rectángulos grises. DTA, gen de la toxina diftérica. El alelo ROSA-Stopfl/fl-miR-128 modificado (para simplificar en adelante llamado Rosa-miR-128) fue confirmado por análisis de transferencia Southern del ADN digerido con EcoRI (arriba a la derecha) usando la sonda de ADN indicada (rectángulo azul) o por genotipado por PCR (abajo a la derecha, ubicaciones de cebadores como se indica en el esquema). (B) Actividad motora reducida y exploración en ratones con sobreexpresión neuronal específica de miR-128. (Arriba) Se generaron ratones con sobreexpresión posnatal específica de neuronas de miR-128 (CamK2a-cre; Rosa-miR-128) criando CamK2a-cre con ratones Rosa-miR-128. (Izquierda) Los niveles de expresión de miR-128 en el cuerpo estriado se midieron mediante qRT-PCR (n = 3 cada uno) como se describe (Fig. 4) y se muestran en relación con la expresión media de miR-128 en el cuerpo estriado de tipo silvestre. Prueba t de Welch. (Medio y derecha) Distancia horizontal total y actividad de cría en campo abierto durante 60 minutos para CamK2acre; Se muestran ratones Rosa-miR-128 (n = 21) y controles de compañero de camada (tipo silvestre n = 8, CamK2a-cre n = 5, Rosa-miR-128 n = 17). ANOVA de 1 vía seguido de la prueba posterior de Turquía. (C) La expresión ectópica de miR-128 del locus Rosa26 normaliza los niveles de expresión de miR-128 en CamK2a-cre; Ratones miR-128-2fl/fl. (Izquierda) Ratones con desactivación específica de neuronas posnatales de miR-128-2 y expresión ectópica de miR-128-2 del locus Rosa26 (CamK2a-cre; miR-128-2fl/fl; Rosa-miR-128) fueron generados por la cría de CamK2a-cre; miR-128-2fl/fl a ratones Rosa-miR-128. (Derecha) expresión de miR-128 en el cuerpo estriado de CamK2a-cre; miR-128-2fl/fl; Se midieron ratones Rosa-miR-128 (n = 4) mediante qRT-PCR y los datos se muestran en relación con la expresión media en los controles de la camada (n = 3). Prueba t de Welch. Las barras de error muestran s.e.m., * p < 0,05, ** p < 0,01.

La Figura 8 (S9) muestra que las neuronas D1 estriatales deficientes en miR-128 presentan una excitabilidad somática característica de la neurona D1. (A, izquierda) Respuestas prototípicas representativas de la neurona D1 de control (Drd1a-TRAP; miR-128-2fl/fl, superior, negro) y deficiente de miR-128 (Drd1a-TRAP, Drd1a-cre; miR-128fl/fl, abajo, rojo) neuronas D1 a inyecciones de corriente somática. Las neuronas D1 se identificaron mediante la expresión de eGFP-L10, las trazas de voltaje son en respuesta a -100, -50, 100, 190 y 250 pA. (A, derecha) Gráfico de frecuencia-corriente (FI) que muestra las frecuencias de disparo promedio características de la neurona D1 para la inyección de corriente somática. No se observaron diferencias entre las neuronas D1 de tipo silvestre (negro, n = 6) y mutantes (rojo, n = 7). Prueba no paramétrica de Mann-Whitney, p> 0,05. (B) miR-128 controla el número de espinas funcionales en las neuronas D1. La liberación de 2 fotones de glutamato en sucesivas cabezas de espinas vecinas reveló tasas de éxito similares para producir EPSC somáticas en neuronas de control y D1 deficientes en miR-128 (n = 5­ 6 células, 40-48 espinas por grupo, izquierda), lo que sugiere un aumento de la densidad de la espina en (Fig. 3B) representa un aumento en el número de espinas con receptores de glutamato funcionales. Las amplitudes de EPSC somáticas inducidas por la liberación de glutamato fueron similares en ambos grupos (derecha).

La Figura 9 (S10) muestra una mayor expresión de miR-128 en neuronas que suprime la activación de ERK2 y protege contra la actividad motora anormal y las convulsiones asociadas con la enfermedad de Parkinson y las convulsiones inducidas químicamente. (A) La sobreexpresión de miR-128 en las neuronas CamK2a suprime la fosforilación de ERK2 en ratones. Niveles de fosforilación de ERK2 en el cuerpo estriado de CamK2a-cre transgénico; Se cuantificaron ratones rosa-miR-128 mutantes y de control (n = 4 cada uno) por transferencia Western, normalizados a la expresión total de ERK2 y mostrados en relación con los niveles medios de control. Se muestra una mancha representativa. Prueba t de Welch, * p < 0,05. (B) La sobreexpresión de miR-128 atenúa el comportamiento motor hiperreactivo desencadenado químicamente en ratones. El esquema muestra las respuestas de rotación estándar de ratones de tipo silvestre con lesión unilateral inducida por 6-OHDA. Se inyectaron 6-OHDA y vehículo en el cuerpo estriado izquierdo y derecho, respectivamente, y las respuestas de rotación a la cocaína (que inhibe la recaptación de dopamina endógena en las terminales dopaminérgicas y, por lo tanto, aumenta los niveles de dopamina sináptica) o al agonista de Drd1 SKF81297 (activación específica de la dopamina Receptor D1 (Drd1)) se analizan después de un período de recuperación de 3 semanas. Las inyecciones de cocaína inducen rotaciones ipsilaterales (hacia el lado lesionado) debido a la activación más fuerte del cuerpo estriado contralateral no lesionado que aún contiene las terminales dopaminérgicas funcionales. Las inyecciones del agonista de Drd1 SKF81297 inducen rotaciones contralaterales (lejos del lado lesionado) debido a la hipersensibilidad anormal de las neuronas D1 a la activación de Drd1 después de la depleción de dopamina en el cuerpo estriado ipsilateral lesionado.

La Figura 10 muestra que el agotamiento de miR-128 en las neuronas postnatales provoca un aumento de la actividad motora dependiente de la dosis. miR-128 controla el comportamiento motor en ratones de una manera dependiente de la dosis. La deficiencia de miR-128-2 provoca hiperactividad en ratones. (Panel izquierdo) La actividad motora en miR-128-2 -/-, miR-128-2 /- y controles de compañeros de camada de tipo silvestre se determinó midiendo la distancia horizontal total movida (en metros) y el recuento de episodios de cría vertical en un ensayo de campo abierto de 60 min. La deficiencia de miR-128-2 en las neuronas posnatales es responsable del aumento de la actividad motora dependiente de la dosis. (Panel derecho) Actividad motora en ratones con un agotamiento homocigoto (CamK2a-Cre; miR-128 fl/fl) o heterocigoto (CamK2a-Cre; miR-128 /fl) de miR-128-2, y sus controles de compañeros de camada de tipo silvestre se determinó midiendo la distancia horizontal total movida (en metros) y el recuento de episodios de cría vertical en un ensayo de campo abierto de 60 minutos.

La Figura 11 muestra un rescate dependiente de la dosis de epilepsia fatal e hiperactividad mediante miR-128 expresado ectópicamente. La expresión ectópica de miR-128 normaliza la hiperlocomoción y previene la muerte de CamK2a-cre; ratones miR-128-2fllfl de una manera dependiente de la dosis. (Panel izquierdo) La vida útil de CamK2a-cre; Se muestran ratones miR-128-2fllflen ausencia (negro) de presencia de uno (azul claro) o dos (azul oscuro) alelos del miR-128 expresados ectópicamente. (Panel derecho) Actividad motora en CamK2a-cre; miR-128-2fllf/; Rosa-miR-128 (azul), CamK2a-cre; Se muestran miR-128-2fllf (negro) y ratones de tipo silvestre (blancos).

La Figura 12 muestra la deleción de miR-128 mediada por virus en el cuerpo estriado del adulto, pero no en el hipocampo, conduce a un aumento de la actividad motora similar a la depleción genética de miR-128. El agotamiento local específico de neuronas de AAV2-Cre de miR-128 en ratones adultos en el cuerpo estriado, pero no en el hipocampo, reproduce el aumento de la actividad motora basal. Se inyectó estereotácticamente AAV2-Cre en una de las dos regiones del cerebro en ratones miR-128-2fl/fl de 8-12 semanas de edad y sus respectivos compañeros de camada de tipo silvestre. La actividad motora se determinó midiendo la distancia horizontal total recorrida (en metros) en un ensayo de campo abierto de 60 minutos. Mientras que la mayoría de los ratones inyectados en el hipocampo murieron de convulsiones graves 1-2 meses después de la inyección del virus, la mayoría de los ratones inyectados en el cuerpo estriado sobrevivieron hasta ser sacrificados 6 meses después.

La Figura 13 muestra que la deleción de miR-128 mediada por virus en el cuerpo estriado del adulto pero no en el hipocampo conduce a un aumento de la actividad motora. El agotamiento local neuronal específico de AAV2-Cre de miR-128 en ratones adultos en el cuerpo estriado, pero no en el hipocampo, reproduce el aumento de la actividad motora basal. Se inyectó estereotácticamente AAV2-Cre en una de las dos regiones del cerebro en ratones miR-128-2fl/fl de 8-12 semanas de edad y sus respectivos compañeros de camada de tipo silvestre. Se determinó la actividad motora 2 semanas después de la cirugía (antes de la expresión total del virus) y 4 semanas después de la cirugía (tiempo de expresión completa del virus) midiendo la distancia horizontal total movida (en metros) en un ensayo de campo abierto de 60 minutos. Los datos muestran un efecto claro del aumento inducido por el virus AAV-Cre en la actividad motora tras el agotamiento de miR-128 en el cuerpo estriado pero no en el hipocampo. En conjunto, los datos de AAV-Cre indican la expresión de miR-128 en el cuerpo estriado como regulador de la actividad basal y en el hipocampo como supresor de las actividades convulsivas espontáneas.

La Figura 14 muestra, contrariamente al agotamiento de miR-128 específico de D1 estriatal, el agotamiento de miR-128 específico de la corteza y el hipocampo provoca aumentos de la actividad exploratoria solo durante los primeros 20 minutos seguido de la actividad basal normal en campo abierto. (Panel superior) Actividad motora en Drd1a-cre; ratones miR-128-2,//fl o (panel inferior) Emx-cre; miR-128-2m y sus respectivos controles de camada se determinaron midiendo la distancia horizontal total movida (en metros) y el recuento de episodios de cría vertical en un ensayo de campo abierto de 60 minutos.

La Figura 15 muestra que el agotamiento de miR-128 específico de la corteza y el hipocampo conduce a la muerte prematura inducida por convulsiones en ratones con un inicio mucho más temprano que con el agotamiento específico de la neurona D1 estriatal. (Panel izquierdo) La vida útil de Drd1a-cre; ratones miR-128-2f//fl y (panel derecho) Emx-cre; se muestran miR-128-2fllfl y sus respectivos controles de compañeros de camada.

La Figura 16 muestra al contrario de los genes BDNF y Fos inducidos por la actividad, la expresión de miR-128 permanece estable y no aumenta con las convulsiones inducidas por ácido caínico en la corteza de ratones adultos C57BI6 de tipo silvestre.

La Figura 17 muestra que BDNF induce Arpp21 y miR-128 en neuronas estriatales de cultivo primario. Los cultivos primarios de neuronas estriatales obtenidos de cerebro de ratón E18 se trataron el día 10 in vitro con 0,05 ng/ul de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en agua. El ARN de los cultivos se preparó a las 0, 2, 6 y 24 horas después de la estimulación y se analizaron los cambios en la expresión génica utilizando el ensayo Tagman qRT-PCR. El BDNF es un inductor fuerte pero transitorio del gen temprano inmediato FosB (el control positivo se muestra a la izquierda) pero no tiene ningún efecto sobre la expresión del miARN específico de neurona miR-124a. Sin embargo, como muestran los resultados, el tratamiento con BDNF conduce a un aumento estable de miR-128 y del gen huésped miR-128 Arpp21. Los datos se muestran como media, las barras de error representan s.e.m., el valor de p se determinó mediante ANOVA de 2 vías, tratamiento con FosB 0,0014, tiempo <0,0001. tratamiento 124a .1091, tiempo .0861, tratamiento Arpp21 .0064, tiempo .0190. tratamiento miR 128-2 .0160, tiempo .2097.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0023] La invención se refiere a una estrategia terapéutica para tratar o reducir la probabilidad de que el desarrollo de trastornos convulsivos y lesiones neurológicas. En particular, la invención se refiere al aumento de la expresión y/o actividad de microARN-128 en el cerebro de mamíferos para tratar o reducir la probabilidad de desarrollar trastornos relacionados con convulsiones y lesiones neurológicas.

[0024] La epilepsia es un trastorno neurológico crónico grave caracterizado por convulsiones espontáneas recurrentes que afectan a aproximadamente 50 millones de personas en todo el mundo y se cree que el coste socioeconómico de la epilepsia en Europa y EE.UU. es de aproximadamente 30 mil millones de dólares por año. Los fármacos antiepilépticos suelen controlar las convulsiones en dos tercios de los pacientes, pero por lo general no alteran la fisiopatología subyacente. El tercio restante de las personas con epilepsia son resistentes a los medicamentos o padecen efectos secundarios aceptables de los medicamentos actualmente disponibles y continúan teniendo convulsiones, lo que deja a los pacientes con pocas opciones, p. ej., cirugía cerebral para extirpar parte del cerebro que causa las convulsiones.

[0025] La epilepsia es la aparición de tormentas eléctricas esporádicas en el cerebro comúnmente llamadas convulsiones. Estas tormentas provocan manifestaciones de comportamiento (como mirar fijamente) y/o movimientos involuntarios (como convulsiones tónico-clónicas). Hay varios tipos de epilepsia, cada uno con diferentes causas, síntomas y tratamientos. Hay cuatro tipos principales de epilepsia, 1) generalizada, 2) parcial, 3) no pilpética y 4) estado epiléptico.

[0026] 1) Las convulsiones generalizadas afectan a ambos hemisferios cerebrales (lados del cerebro) desde el principio de la convulsión. Producen pérdida del conocimiento, ya sea brevemente o por un período de tiempo más largo, y se subcategorizan en varios tipos principales: tónico clónico generalizado; mioclónico; ausencia; y atónico. 2) En las convulsiones parciales, la alteración eléctrica se limita a un área específica de un hemisferio cerebral (lado del cerebro). Las convulsiones parciales se subdividen en convulsiones parciales simples (en las que se conserva la conciencia); y convulsiones parciales complejas (en las que se deteriora o pierde el conocimiento). Las convulsiones parciales pueden extenderse para causar una convulsión generalizada, en cuyo caso la categoría de clasificación es convulsiones parciales secundariamente generalizadas. Las convulsiones parciales son el tipo más común de convulsiones que experimentan las personas con epilepsia. Prácticamente cualquier síntoma de movimiento, sensorial o emocional puede ocurrir como parte de una convulsión parcial, incluidas las alucinaciones visuales o auditivas complejas. 3) Las convulsiones no epilépticas son episodios que cambian brevemente el comportamiento de una persona y, a menudo, parecen convulsiones epilépticas. Las convulsiones epilépticas son causadas por cambios eléctricos anormales en el cerebro y, en particular, la corteza (capa externa del cerebro). Las convulsiones no epilépticas no son causadas por interrupciones eléctricas en el cerebro. 4) La mayoría de las convulsiones terminan después de unos momentos o unos minutos. Si las convulsiones son prolongadas o ocurren en una serie, existe un mayor riesgo de estado epiléptico, un estado continuo de convulsiones.

[0027] Se cree que el desarrollo de la epilepsia sintomática (adquirida) para involucrar a la expresión alterada de los canales de iones y receptores de neurotransmisores, remodelación sináptica, inflamación, gliosis y la muerte neuronal, entre otros. Sin embargo, pocas intervenciones antiepilépticas dirigidas a estos procesos han demostrado una eficacia suficiente in vivo, y nuestra comprensión de los mecanismos celulares y moleculares sigue siendo incompleta. Actualmente no existe un tratamiento profiláctico después de una lesión cerebral que causa epilepsia, ni tratamientos neuroprotectores específicos para el estado epiléptico o para lesiones neurológicas agudas que puedan causar daño cerebral o epilepsia, p. ej., accidente cerebrovascular, trauma.

[0028] La epilepsia febril tiene una alta tasa de incidencia de aproximadamente el 8% en niños. Un síntoma principal de las convulsiones febriles se conoce como la continuación de las convulsiones generalizadas durante 1 a 5 minutos con fiebre de 38°C o más. La mayoría de los casos de convulsiones febriles comienzan entre los 6 meses después del nacimiento y alrededor de los 5 años cura en el momento en que el paciente cumpla 6 años. Sin embargo, entre los pacientes cuyo inicio de convulsiones febriles fue menor de un año, hay algunos pacientes que sufren convulsiones de forma continua incluso después de cumplir los 6 años, y hay algunos pacientes que son pacientes del síndrome de Dravet, que son pacientes de una enfermedad de la epilepsia intratable.

[0029] Epilepsia mioclónica severa de la infancia (SMEI), ahora conocida como Síndrome de Dravet, es una forma rara y catastrófica de epilepsia intratable que comienza en la infancia. Consulte la información general en la url: www.dravetfoundation.org. Las características de la epilepsia intratable asociada con el síndrome de Dravet incluyen 1) alta ocurrencia de convulsiones parciales seguidas de convulsiones generalizadas (particularmente epilepsia del lóbulo temporal); 2) alta incidencia de epilepsia sintomática causada por una lesión orgánica en el cerebro; 3) ausencia de tratamiento a largo plazo desde el inicio hasta la consulta de un especialista y alta incidencia de convulsiones; y 4) alta ocurrencia de estado epiléptico en la anamnesis. En otras palabras, es probable que el lóbulo temporal sea una parte del cerebro responsable de la epilepsia intratable.

[0030] Se indica que la epilepsia se vuelve más intratable cambiando la naturaleza de la misma y en evolución como adquiridos se repiten las convulsiones. Las convulsiones asociadas con la epilepsia intratable se clasifican en una variedad de tipos, p. ej., convulsiones tónicas, convulsiones tónico-clónicas, convulsiones de ausencia atípicas, convulsiones atónicas, convulsiones mioclónicas, convulsiones clónicas, convulsiones parciales simples, convulsiones parciales complejas y convulsiones generalizadas secundarias.

[0031] Como tal, el síndrome de Dravet, una forma grave de epilepsia, es una condición debilitante que afecta generalmente a los bebés y niños. Está causada por mutaciones en el canal de sodio Scn1a y los niños con la enfermedad padecen convulsiones tónico-clónicas frecuentes y prolongadas y muerte súbita inexplicable a una edad temprana. A pesar de la existencia de numerosos y potentes medicamentos anticonvulsivos, más del 30% de los pacientes con epilepsia, especialmente los pacientes diagnosticados con síndrome de Dravet, no responden a ningún tratamiento y con frecuencia son resistentes a todos los medicamentos anticonvulsivos aprobados por la FDA. B. Ceulemans (2011, Developmental Medicine and Child Neurology 53: 19-23) revisa el tratamiento de los pacientes con síndrome de Dravet.

[0032] En este contexto, los inventores de la presente solicitud han descubierto sorprendentemente que el incremento en la expresión de un solo cerebro enriquecido microARN, miR-128 que se conserva en los ratones y los seres humanos, se puede utilizar para controlar excitabilidad neuronal patológica, convulsiones y epilepsia in vivo.

[0033] Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación está dirigida a un método para tratar o reducir la probabilidad de desarrollo de epilepsia o estado epiléptico en un individuo. El método comprende administrar a un individuo que necesite dicho tratamiento (el sujeto) una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de MiR-128.

[0034] Además de la aplicación para todos los pacientes con epilepsia, este novedoso tratamiento puede proporcionar una línea de vida especialmente a aquellos pacientes que sufren de epilepsia para el cual no hay actualmente tratamiento disponible; es decir, para aproximadamente un tercio de los pacientes que padecen epilepsia. P. ej., en el contexto de la presente divulgación, el individuo puede ser un paciente diagnosticado con síndrome de Dravet. Dado que el agente terapéutico de la presente divulgación actúa sobre el sistema nervioso central, la vía de administración del agente puede incluir intratecal o intranasal. Los inventores identifican que el hipocampo y/o la corteza son dianas particularmente buenas para el agente terapéutico y, como tal, se prefieren los medios para administrar el agente de manera que el agente esté más concentrado o expuesto al hipocampo y/o la corteza.

[0035] En 2001, un gran grupo de microARNs (miARNs) se aislaron e identificaron. Los miARN son moléculas que pueden regular la expresión génica e interrumpir la traducción mediante un emparejamiento de bases preciso o impreciso con sus dianas. Ha quedado claro que los genes de ARN no codificantes producen moléculas de ARN funcionales con funciones importantes en la regulación de la expresión génica, el tiempo de desarrollo, la vigilancia viral y la inmunidad. Ahora se cree que no solo los ARN de transferencia clásicos (tARN) y ARN ribosómico (rARN), sino también ARN nucleares pequeños (snARN), ARN nucleolares pequeños (snoARN), ARN de interferencia pequeños (siARN), ARN no codificantes minúsculos (tncARN), ARN interferentes pequeños asociados con repetición (rasiARN) y microARN (miARN) actúan en diversos procesos celulares, como el mantenimiento de los cromosomas, la impronta genética, el empalme de pre-ARNm, las modificaciones del ARN guía, la regulación transcripcional y el control de la traducción del ARNm (Kawasaki y Taira, Nature, 2003, 423, 838-842).

[0036] Los microARN (miARN) se derivan de genes endógenos que inicialmente se transcriben como transcripciones de ARN más largas. Los miARN son polirribonucleótidos pequeños, generalmente entre 18 y 24 residuos, derivados de transcripciones no codificantes en horquilla más largas en eucariotas. Los miARN juegan un papel importante en las vías de desarrollo y diferenciación celular. En consecuencia, se han realizado esfuerzos considerables para comprender y caracterizar los niveles de expresión temporal, espacial y celular y los patrones de expresión de los miARN para determinar su papel preciso en el desarrollo y diferenciación celular tanto en estados normales como patológicos.

[0037] De los cientos de microARN presentes, los inventores han descubierto uno aquí, miR-128, para desempeñar un importante papel en la epilepsia. El miR-128 es uno de los miARN más abundantes y enriquecidos en el cerebro humano y de ratón adulto (ver, p. ej., He et al., Neuron 73, 35, 12 de enero de 2012); y (Fig. 4A). La expresión de miR-128 en el cerebro del ratón aumenta gradualmente durante el desarrollo posnatal y alcanza su punto máximo en la edad adulta (Miska et al., Genome biology 5, R68 (2004); y Krichevsky et al., RNA 9, 1274 (Oct, 2003)); y (Fig. 4B). La expresión de miR-128 en diversas regiones del cerebro (Fig. 4D) sugirió a los inventores de la presente aplicación que miR-128 desempeña un papel importante en procesos que son comunes a muchos tipos de células neuronales.

[0038] La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que realizan las actividades de miARN endógenos cuando se introducen en células. Estos ácidos nucleicos son miARN sintéticos en algunas realizaciones. Se han descrito métodos para introducir y eliminar miARN de las células (Meister et al., 2004; Hutvagner et al., 2004). Otra publicación describe el uso de plásmidos que se transcriben mediante ARN polimerasas endógenas y producen miARN específicos cuando se transfectan a células (Zeng et al., 2002).

[0039] Los inventores de la presente solicitud descubrieron que microARN-128 (miR-128), que se expresa en adultos neuronas, regula el comportamiento motor mediante la modulación de las redes de señalización neuronal y la excitabilidad. Los inventores descubrieron que miR-128 gobierna la actividad motora suprimiendo la expresión de varios canales iónicos y componentes de señalización de la red ERK2 de quinasa regulada por señales extracelulares que regulan la excitabilidad neuronal. En consecuencia, se ha descubierto aquí que miR-128 es un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de la epilepsia y afecciones relacionadas, incluida la epilepsia resistente al tratamiento en el síndrome de Dravet.

[0040] En particular, un aspecto de la presente descripción está dirigida a un método para tratar o reducir la probabilidad del desarrollo de la epilepsia en un individuo en necesidad de tal tratamiento. El método comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128, en donde dicho individuo ha sufrido una lesión cerebral previa que aumenta el riesgo de epilepsia de dicho individuo. La lesión cerebral anterior puede haber sido causada por un accidente cerebrovascular.

[0041] El agente terapéutico puede miR-128, un agente con 90 por ciento o más homología de secuencia con miR-128, o un inductor de la actividad y/o expresión de miR-128, p. ej., el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). El agente capaz de aumentar y/o activar miR-128 puede ser miR-128 estabilizado químicamente, un ácido nucleico que codifica miR-128 y/o un vector viral que codifica miR-128. Una de las ventajas del miR-128 como tratamiento para la epilepsia es su capacidad para apuntar a varios genes dentro de una red de señalización que regula la excitabilidad neuronal.

[0042] El control del comportamiento motor en animales y humanos requiere una adaptación constante de redes neuronales para las señales de diversos tipos y puntos fuertes. En ratones, se demostró que una reducción de la expresión de miR-128 en las neuronas posnatales aumenta la actividad motora y la epilepsia mortal. Se demostró que la sobreexpresión de miR-128 atenúa la capacidad de respuesta neuronal, suprime la actividad motora y alivia las anomalías motoras asociadas con la enfermedad y las convulsiones similares al Parkinson.

[0043] Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación está dirigido a un método para tratar o reducir la probabilidad de desarrollo o aparición de convulsiones. El método comprende administrar a un individuo que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128, en donde dicho paciente tiene un trastorno relacionado con el cerebro caracterizado por el desarrollo de convulsiones. El trastorno relacionado con el cerebro que se caracteriza por el desarrollo de convulsiones puede ser accidente cerebrovascular, hipoxia, lesión cerebral traumática, infección, tumor, trastornos neurodegenerativos, trastornos metabólicos y/o autoinmunitarios que provocan convulsiones. El individuo puede ser alguien diagnosticado con síndrome de Dravet.

[0044] El sujeto puede ser de cualquier edad. El agente puede administrarse por vía intratecal o intranasal. El objetivo de la administración es permitir que el agente terapéutico alcance su objetivo en el sistema nervioso central. P. ej., preferiblemente, el agente se administra de manera que entre en contacto con el hipocampo y/o la corteza. Cabe señalar que se demostró que miR-128 no afecta la morfología del cerebro, la morfología del estriado o la supervivencia neurona!.

[0045] Varios sistemas de entrega se conocen y se pueden utilizar para administrar un terapéutico de la invención, p. ej., por vía intranasal. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, intranasal, epidural e intracerebral. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc). y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. Además, las composiciones de la invención pueden administrarse en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; La inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, p. ej., unido a un depósito, como un depósito Ommaya.

[0046] Preferiblemente, el terapéutico se entrega con el sistema nervioso central. Los medios de administración incluyen administración intratecal y administración por inhalación. Los métodos para lograr estos medios de administración serán bien conocidos por los expertos en la técnica de administración de fármacos e incluyen, p. ej., administración intratecal mediante bombas mini-osmóticas o mediante un implante (p. ej., un pequeño implante de silicona) que liberará el agente activo. Dichos implantes se pueden usar, p. ej., para administrar miR-128 o un agente con un 90 por ciento o más de homología de secuencia con miR-128 durante un período de tiempo, de manera que se reduzca la gravedad y/o frecuencia de los episodios de epilepsia y las convulsiones asociadas. El agente terapéutico se administra de manera que el agente entre en contacto con las células del hipocampo y/o la corteza, preferiblemente sin estar distribuido más ampliamente.

[0047] Otro aspecto de la presente divulgación se dirige a un método para identificar compuestos útiles en el tratamiento o reducir la probabilidad de una patología caracterizada por convulsiones. Los compuestos pueden identificarse poniendo en contacto una célula que expresa miR-128 con un compuesto candidato y determinando el nivel de expresión y/o actividad del miR-128 en la célula. Un aumento en el nivel de expresión y/o actividad de miR-128 en relación con el nivel de referencia de actividad de miR-128 en una célula que expresa miR-128 que no se ha puesto en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto candidato es útil en el tratamiento o prevención de una patología caracterizada por convulsiones.

[0048] En una realización, el miR-128 se puede proporcionar en forma de células que expresan miR-128. La patología caracterizada por convulsiones puede ser epilepsia, estado epiléptico, accidente cerebrovascular, hipoxia, lesión cerebral traumática, infección, tumor, trastornos neurodegenerativos, trastornos metabólicos y/o autoinmunitarios que provocan convulsiones.

[0049] El término humano "miR-128", también se debe tomar para incluir cualesquiera parálogos humanos miR-128. La familia de genes de miARN incluye muchos miembros. Algunos miembros de la familia de genes de miARN (secuencias mir-12850) se muestran en la Tabla 1 a continuación.

[0050] En la presente descripción, los inventores de la presente invención supusieron que hay un papel regulador potente para miR-128 en la función cerebral de su observación seminal que hay epilepsia fatal de aparición temprana en ratones deficientes en miR-128 (Fig. 1A).

[0051] El miR-128 está codificado por dos genes separados, miR-128-1 y miR-128-2, en los cromosomas de ratón 1 y 9 (Fig. 5A, B) o los cromosomas humanos 2 y 3, respectivamente. En ratones, se demostró que la deficiencia de miR-128-2 en la línea germinal da como resultado una reducción del 80% de la expresión de miR-128 en el prosencéfalo, mientras que la ablación del gen miR-128-1 eliminó solo el 20% de miR-128 (Fig. 5A, B).

[0052] Los solicitantes han descubierto que la profunda disminución de miR-128 en los niveles de expresión de miR-128-2-/-, pero no ratones miR 128-1-/- se asocia con el desarrollo de la hiperactividad y el aumento de la exploración a las 4 semanas de edad (Fig. 1A, Fig. 5C, D). Aquí, los inventores muestran que la hiperactividad juvenil en ratones miR-128-2-/- progresó rápidamente a convulsiones graves y muerte a los 2-3 meses de edad (Fig. 1 A, B). Además, se demostró que el impacto letal de la deficiencia de miR-128 en ratones se previene mediante el tratamiento con el fármaco anticonvulsivo ácido valproico (Fig. 1C), demostrando así el papel causal de las convulsiones en la muerte de los animales.

[0053] La observación de hiperactividad y epilepsia fatal en ratones deficientes en miR-128-2 refleja la capacidad de miR-128 para controlar la excitabilidad de las neuronas postnatales. La inactivación selectiva del gen miR-128-2 en las neuronas del prosencéfalo (CamK2acre; miR-128-2fl/fl) conduce a una reducción de la expresión de miR-128, seguida de hiperactividad de inicio temprano, convulsiones y muerte, como se observa en ratones miR-128-2-/- (Fig. 1B, D, Fig. 6A). Además, la corrección de la deficiencia de miR-128 mediante la expresión ectópica de miR-128-2 en neuronas normalizó la actividad motora y evitó la muerte inducida por convulsiones (Fig. 1E, Fig. 7A, C).

[0054] Los presentes datos revelaron que miR-128 tiene la capacidad de regular la susceptibilidad a las convulsiones en un modo dependiente de la dosis y proteger contra convulsiones independientemente si son causadas por un aumento de la excitabilidad neuronal (modelo de ácido kaínico) o disminución de la actividad inhibidora (modelo picrotoxina) de neuronas.

[0055] En un aspecto, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o la reducción de la probabilidad del desarrollo de una patología neuronal se caracteriza por convulsiones que comprende un agente capaz de activar miR-128 en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización de la presente divulgación, la patología caracterizada por convulsiones se selecciona del grupo que comprende epilepsia, estado epiléptico, accidente cerebrovascular, hipoxia, lesión cerebral traumática, infección, tumor, trastornos neurodegenerativos, trastornos metabólicos y autoinmunitarios que provocan convulsiones. En un ejemplo particular, la enfermedad neurológica es una asociada con convulsiones y/o epilepsia, y en particular, p. ej., síndrome de Dravet.

[0056] Los inventores de la presente solicitud trataron de obtener una comprensión del mecanismo que media control dependiente de miR-128 de la actividad motora, y para evitar interferencias entre los fenotipos causados por la pérdida de miR-128 en diversos tipos de células neuronales. Se diseñó y realizó un estudio restringido para investigar el efecto de la deficiencia de miR-128-2 en las neuronas sensibles a la dopamina que regulan el comportamiento motor en ratones y humanos. Hay dos tipos principales de neuronas que expresan CamK2a sensibles a la dopamina en el prosencéfalo del ratón, que tienen distintas contribuciones a la actividad motora.

[0057] Si bien la activación de las neuronas que expresan receptor de dopamina 1 (neuronas D1) aumenta la locomoción, la activación de dopamina 2 de los receptores de las neuronas que expresan (neuronas D2) reduce la locomoción en ratones. Los solicitantes encontraron que la deficiencia de miR-128 en las neuronas D1 (Drd1a-cre; miR-128-2fl/fl), pero no en las neuronas D2 (A2acre; miR-128-2fl/fl), conduce a hiperactividad juvenil seguida de letal convulsiones alrededor de los 5 meses de edad (Fig. 1F, Fig. 6B, C).

[0058] Como tal, un aspecto de la presente descripción es un método de activación de miR-128 en una célula de mamífero, que comprende administrar un agente capaz de activar o imitar la actividad de miR-128 a la célula de mamífero, en donde dicho agente comprende un oligómero de entre 6 y 30 nucleótidos de longitud, y en donde dicho oligómero comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es completamente complementaria a al menos seis nucleótidos contiguos presentes en la secuencia de miR-128. Las células de mamífero que pueden usarse incluyen células del hipocampo, corteza, cuerpo estriado y/o tálamo, neuronas derivadas de IPSC y varias líneas celulares. El método puede realizarse in vitro o in vivo.

[0059] El oligómero puede comprender una secuencia de nucleótidos contiguos que es o bien idéntica o es totalmente complementaria a la secuencia de la región semilla de miR-128. El oligómero puede consistir en una secuencia de nucleótidos contigua que es idéntica o es completamente complementaria a la secuencia de la región semilla de miR-128. La secuencia de nucleótidos contigua del oligómero puede comprender entre 7 y 23 nucleótidos, que son completamente complementarios a la secuencia de la región correspondiente de miR-128.

[0060] Los estudios electrofisiológicos en rebanadas estriatales de Drd1a-Cre; Los ratones miR-128-2fl/fl revelaron un aumento en la excitabilidad de la neurona D1. Las neuronas D1 deficientes en miR-128 mostraron una excitabilidad normal de la membrana en el soma (Fig. 8A), pero mostraron una mayor excitabilidad dendrítica (Fig. 3A), así como un aumento de -20% de las espinas dendríticas funcionales (Fig. 3B, 8B). Además, la red ERK2 en excitabilidad neuronal y plasticidad sináptica.

[0061] La activación de ERK2 mejorada está vinculada a un aumento de la actividad motora y convulsiones en los ratones. La hiperactivación de ERK2 y el aumento concomitante de la sensibilidad de la neurona D1 a la dopamina se produce también durante la enfermedad de tipo Parkinson en ratones causada por el agotamiento inducido químicamente de la dopamina en el cuerpo estriado del ratón. Los niveles reducidos de dopamina y el aumento simultáneo de la sensibilidad de la neurona D1 dan como resultado una hipersensibilidad a los efectos inductores de la actividad motora de la dopamina. En los seres humanos, la hipersensibilidad de la neurona D1 es una de las principales causas de discinesia, un efecto secundario del tratamiento con L-Dopa en la enfermedad de Parkinson.

[0062] Los inventores de la presente descripción han descubierto que la deficiencia de miR-128 en neuronas estriatales D1 imita la hipersensibilidad de neuronas D1 en ratones que padecen síndrome similar a Parkinson. Los inventores aquí muestran que la deficiencia de miR-128 en las neuronas D1 potencia la actividad motora en respuesta al tratamiento con agonistas específicos de Drd1 en ratones (Fig. 3C). También se demostró que la hipersensibilidad de la neurona D1 al agonista Drd1 está asociada con un aumento de la fosforilación de ERK2 en el cuerpo estriado de Drd1a-cre; ratones miR-128-2fl/fl (Fig. 3D). El aumento de la sensibilidad a la dopamina y la activación mejorada de ERK2 en ratones con enfermedad similar a la de Parkinson se acompañan de una mayor expresión de genes tempranos inmediatos (IEG) inducidos por dopamina en las neuronas D1. De manera similar, el tratamiento con agonista Drd1 mejoró la expresión de IEG en neuronas deficientes en D1 en miR-128 en comparación con las neuronas D1 de ratones de control (Fig. 3E).

[0063] El aumento de actividad locomotora característico de Drd1a-Cre; los ratones miR128-2fl/fl se normalizaron mediante la inhibición farmacológica de la proteína quinasa quinasa MEK1 activada por mitógenos, un activador principal de ERK2 en las neuronas. El inhibidor SL327 específico de MEK1 administrado in vivo no afecta la actividad motora en ratones de tipo silvestre pero normaliza la fosforilación de ERK2 y la actividad motora en los ratones mutantes (Fig.4A). En otro descubrimiento, los inventores demostraron que el efecto de una mayor expresión de miR-128 en neuronas adultas era proteger a los ratones contra actividades motoras anormales asociadas con la enfermedad de Parkinson inducida químicamente (figura 4B) y convulsiones (figura 4C).

[0064] En un aspecto, los inventores de la presente solicitud han descubierto miR-128 como un modulador de la señalización de vías que controlan la excitabilidad neuronal y la actividad motora. El gen humano del cromosoma 3p que codifica miR-128-2 se ha relacionado con la epilepsia generalizada idiopática. Los cambios en la expresión del gen diana miR-128 o miR-128 pueden ser una causa potencial de aumento de la excitabilidad neuronal y epilepsia en humanos.

[0065] Por consiguiente, la presente divulgación está dirigida a un agente capaz de activar miR-128 para su uso en la reducción de la probabilidad de convulsiones recurrentes espontáneas en un individuo o como agente antiepiléptógeno en un individuo que tiene una lesión cerebral que probablemente precipite la epilepsia, en donde el agente se administra al cerebro del individuo. El agente capaz de activar miR-128 puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-128 estabilizado químicamente, un ácido nucleico que codifica miR-128 y un vector viral que codifica miR-128.

[0066] En un aspecto, la presente descripción está dirigida a un método para tratar o reducir la probabilidad del desarrollo de convulsiones y/o la epilepsia en un sujeto. Este método se puede lograr administrando miR-128 o un agente con un 90 por ciento o más de homología de secuencia con miR-128 en un sitio de lesión cerebral del sujeto. miR-128 o el agente con un 90 por ciento o más de homología de secuencia con miR-128 puede administrarse intratecal o intranasalmente, preferiblemente de modo que la administración dé como resultado la acumulación del agente activo en el hipocampo y/o la corteza. El miR-128 puede estar codificado por un vector. En particular, miR-128 puede estar codificado por un vector que comprende a) un promotor unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica miR-128; y b) una secuencia de terminación de la transcripción.

[0067] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Los médicos se dirigen particularmente a Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, NY (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999), para definiciones y términos de la técnica.

[0068] El uso de la palabra "un" o "una" cuando se utiliza en conjunción con el término comprendido en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más," "al menos uno" y "uno o más de uno”. El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiera únicamente a alternativas, o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas y "y/o."

[0069] Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones, las palabras que comprenden (y cualquier forma de comprender, tales como comprenden y comprende), que tiene (y cualquier forma de tener, tal como tener y tiene), incluyendo (y cualquier forma de incluir, como incluyen e incluye) o contener (y cualquier forma de contener, como contiene y contener) son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos o pasos de método adicionales no citados.

[0070] Como se usa en este documento, los términos aproximadamente o alrededor de en referencia a un número generalmente se entienden para incluir números que caen dentro de un rango de 5% en cualquier dirección (mayor o menor que) del número a menos que se indique o de otra manera evidente del contexto. Cuando se establecen rangos, los puntos finales se incluyen dentro del rango a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto.

[0071] En el contexto de la invención presente, la modulación y la modulación de la expresión significan ya sea un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la cantidad o los niveles de una diana pequeña no codificante de ARN de ácido nucleico, un ARN o proteína asociada con un ARN pequeño no codificante, o una diana corriente abajo del ARN pequeño no codificante (p. ej., un ARNm que representa un ácido nucleico codificante de proteína que está regulado por un ARN pequeño no codificante). En el contexto de la presente invención, modulación de función significa una alteración en la función del pequeño ARN no codificante o una alteración en la función de cualquier componente celular con el que el pequeño ARN no codificante tiene una asociación o efecto corriente abajo.

[0072] Los términos microARN, miARN, y MiR son intercambiables y se refieren a ARN endógenos o artificiales no codificantes que son capaces de regular la expresión génica. Se cree que los miARN funcionan a través de la interferencia de ARN. Los miARN endógenos (p. ej., naturales) se expresan típicamente a partir de promotores de ARN polimerasa II y se generan a partir de un transcrito más grande.

[0073] Los términos polinucleótido, oligonucleótido, ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se usan en el presente documento para incluir una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, el término incluye ADN de cadena triple, doble y monocatenaria, así como ARN de cadena triple, doble y monocatenaria. También incluye modificaciones, como por metilación y/o protección, y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, los términos polinucleótido, oligonucleótido, ácido nucleico y molécula de ácido nucleico incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-o C-glucósido. de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen cadenas principales no nucleotídicas, p. ej., poliamida (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos (PNA)) y polímeros de polimorfolino (disponibles comercialmente de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oreg., como Neugene) y otros polímeros sintéticos de ácidos nucleicos específicos de secuencia, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareamiento y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el ADN y el ARN. No existe una distinción pretendida en cuanto a longitud entre los términos polinucleótido, oligonucleótido, ácido nucleico y molécula de ácido nucleico, y estos términos se usarán indistintamente.

[0074] Polinucleótidos homólogos típicamente tienen al menos 70% de homología, preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, 97% o 99% de homología con la secuencia relevante, por ejemplo sobre una región de al menos 5, 10, 20, 40 nucleótidos contiguos más (de la secuencia homóloga). La homología se puede calcular basándose en cualquier método de la técnica. P. ej., el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología. Los algoritmos PILEUP y BLAST se pueden usar para calcular la homología o alinear secuencias (típicamente en su configuración predeterminada). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (URL: www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0075] La administración de un ácido nucleico, como un microARN, siARN, piARN, ARNpn, ácido nucleico antisentido o IncARNinc a una célula comprende transducción, transfección, electroporación, translocación, fusión, fagocitación, métodos de disparo o balísticos, etc., cualquier medio por el cual se pueda transportar un ácido nucleico a través de una membrana celular.

[0076] En lo que se refiere a vías de administración de agentes terapéuticos de la presente invención, en un ejemplo, la barrera sangre-cerebro es una preocupación. Es decir, un obstáculo para el desarrollo de enfoques terapéuticos basados en ARN para patologías cerebrales es la barrera hematoencefálica (BBB). El cerebro está protegido contra sustancias potencialmente tóxicas por la presencia de dos sistemas de barrera: la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB). Se considera que la BBB es la ruta principal para la captación de ligandos séricos, ya que su área de superficie es aproximadamente 5000 veces mayor que la de BCSFB. El endotelio cerebral, que constituye la BHE, representa el principal obstáculo para el uso de fármacos potenciales contra muchos trastornos del SNC. Como regla general, solo pequeñas moléculas lipofílicas pueden atravesar la BHE, es decir, desde la sangre sistémica circulante al cerebro.

[0077] La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término farmacéuticamente aceptable significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos. En esta especificación, el término cantidad terapéuticamente eficaz debe entenderse como una cantidad de agente terapéutico que da como resultado una inhibición, mejora o reversión clínicamente significativa del desarrollo o aparición de convulsiones.

[0078] El término vehículo se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de EW Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma adecuada para la administración al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, p. ej., como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo.

[0079] En el contexto de la presente descripción, en ciertas realizaciones, el agente terapéutico se administra por vía intranasal o por vía intratecal. El objetivo del modo de administración es permitir que el agente terapéutico alcance su objetivo de visión, el sistema nervioso central. En una realización, la ubicación diana de los agentes terapéuticos de la presente divulgación es la corteza y/o el hipocampo.

[0080] La administración de productos biológicos a través de la barrera hematoencefálica y en el sistema nervioso central se logra mejor mediante ciertos medios de administración y/o formulación de fármacos, como entendería un farmacólogo de administración de fármacos con experiencia ordinaria. Las composiciones de la presente divulgación pueden incluir además agentes que mejoran la mucoadhesividad, la tolerancia nasal o las propiedades de flujo de la composición, mucoadhesivos, potenciadores de la absorción, odorantes, humectantes y conservantes. Los agentes adecuados que aumentan las propiedades de flujo de la composición cuando están en un vehículo acuoso incluyen, p. ej., carboximetilcelulosa de sodio, ácido hialurónico, gelatina, algina, carragenanos, carbómeros, galactomananos, polietilenglicoles, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetildextrano de sodio y goma de xantana. Los potenciadores de la absorción adecuados incluyen sales biliares, fosfolípidos, glicirretinato de sodio, caprato de sodio, tartrato de amonio, gamma. ácido aminolevulínico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido oxaloacético. Los humectantes adecuados para composiciones acuosas incluyen, p. ej., glicerina, polisacáridos y polietilenglicoles. Los mucoadhesivos adecuados incluyen, p. ej., polímero de polivinilpirrolidona.

[0081] Otro aspecto de la invención es composiciones farmacéuticas que pueden incluir además agentes potenciadores de permeación que mejoran la administración del agente al sistema nervioso central a través de la administración intranasal. Además, los potenciadores de la absorción facilitan el transporte de moléculas a través de la mucosa, que incluye la mucosa, y la membrana celular epitelial. Se han descrito una variedad de clases de potenciadores de la absorción, que incluyen mucoadhesivos, inhibidores del latido ciliar, fluidificantes de la mucosa, fluidificantes de membrana y moduladores de unión estrecha.

[0082] El término transfección se usa para referirse a la captación de ADN extraño o ARN por una célula. Se ha transfectado una célula cuando se ha introducido ADN o ARN exógeno dentro de la membrana celular. Se conocen generalmente en la técnica varias técnicas de transfección. Véase, p. ej., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, a laboratory manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN o ARN exógenos en células huesped adecuadas. El término se refiere tanto a la captación estable como transitoria del material genético, e incluye la captación, p. ej., de microARN, siARN, piARN, IncARN o ácidos nucleicos antisentido. El término transformación se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la inserción. P. ej., se incluyen la captación directa, la transducción o el apareamiento f. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, p. ej., un plásmido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped.

[0083] Las células huésped recombinantes, células huésped, células, líneas celulares, cultivos celulares, y otros términos de este tipo que denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como receptores para vector recombinante u otro ADN transferido, e incluyen la progenie original de la célula original que ha sido transfectada.

[0084] Excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no causa efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. La sal farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, sales de aminoácidos, sales preparadas con ácidos inorgánicos, tales como sales de cloruro, sulfato, fosfato, difosfato, bromuro y nitrato, o sales preparadas a partir de la forma de ácido inorgánico correspondiente de cualquiera de los precedentes, p. ej., clorhidrato, etc., o sales preparadas con un ácido orgánico, como malato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, etilsuccinato, citrato, acetato, lactato, metanosulfonato, benzoato, ascorbato, paratoluensulfonato, palmoato, salicilato y estearato, así como sales de estolato, gluceptato y lactobionato. De manera similar, las sales que contienen cationes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio (incluido el amonio sustituido).

[0085] Los términos sujeto, individual, y paciente, se usan indistintamente en este documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para quien se desea el diagnóstico, pronóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos. Otros sujetos pueden incluir ganado, perros, gatos, caballos, etc.

[0086] La secuencia de codificación de la descripción (p. ej., la secuencia que codifica el precursor miARN o secuencia portadora codificadora más larga) puede estar presente en el constructo en unión operativa con un promotor. Pueden seleccionarse promotores apropiados basándose en la célula huésped y el efecto buscado. Los promotores adecuados incluyen promotores constitutivos e inducibles, tales como promotores inducibles basados en ARN polimerasa II (polll). Los promotores pueden ser específicos de tejido, siendo dichos promotores bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor reprimible o inducible por tetraciclina, los promotores basados en ARN polimerasa I o III, los promotores virales dependientes de pol II tales como el promotor CMV-IE y los promotores pollII U6 y H1. También se puede utilizar el promotor del bacteriófago T7 (en cuyo caso, se apreciará, la polimerasa T7 también debe estar presente).

[0087] Las construcciones de la descripción pueden ser introducidas en células huésped utilizando cualquiera de una variedad de enfoques. Puede efectuarse la infección con un vector viral que comprende la construcción. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores retrovirales defectuosos en la replicación, vectores adenovirales, vectores adenoasociados y vectores lentivirales. La transfección con un plásmido que comprende la construcción es un modo alternativo de introducción. El plásmido puede estar presente como ADN desnudo o puede estar asociado, p. ej., con un liposoma. La naturaleza del vehículo de administración puede variar con la célula huésped.

[0088] La administración in vivo de la construcción (p. ej., presente en un vector viral) puede llevarse a cabo usando cualquiera de una variedad de técnicas, dependiendo del tejido diana. La administración puede ser, según sea apropiado, mediante inyección directa, inhalación, inyección intravenosa u otro método físico (incluso mediante microproyectiles para apuntar a regiones visibles y accesibles de tejido (p. ej., con ADN desnudo)). La administración puede ser con aguja de jeringa, trócar, cánula, catéter, etc., según corresponda.

[0089] Las células cultivadas adecuadas como huéspedes de acuerdo con la invención incluyen tanto células primarias como líneas celulares. Las células pueden ser células humanas, incluidas células madre humanas. Se puede introducir una construcción que codifica un miARN en células cultivadas para inactivar un gen específico de función desconocida. El silenciamiento del gen usando el método de la invención puede usarse como un enfoque para evaluar su función. Alternativamente, se puede introducir una construcción que codifique un miARN en células para implantar en un animal humano o no humano con fines terapéuticos.

EJEMPLOS

[0090] La invención, habiéndose descrito en general, puede entenderse más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente para fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención de cualquier manera.

Materiales y métodos

Animales

[0091] Los ratones se alojaron en dos a cinco animales por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas a partir de 0700 y 1900 horas) a temperatura constante (23°C) con acceso ad libitum a la comida y agua. Todos los protocolos con animales fueron aprobados por IACUC en la Universidad Rockefeller, la Universidad Northwestern y la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai.

Generación de ratones

Generación de ratones con una deleción condicional de miR-128-1 y miR-128-2:

[0092] Subclonación de vectores de abordaje: Una región del locus genómico miR-128-1 o miR-128-2 que contiene los brazos de homología se subclonó recombinogénicamente a partir de un clon BAC (miR128-1: RP24-574G14, miR128-2: RP24-242F13, C57BI/6J, CHORI, Oakland CA, EE.UU). en pBlueScriptI IKS+ usando amplicones que insertan un sitio AscI y un sitio Xhol para flanquear la región subclonada.

[0093] Los cebadores de PCR usados para la subclonación:

mir-128-1

5'ccttcatgttatgccctcatccctttatcacacaaatctgtgtagttttcggcgcgccattcgccctat agtgagtcg

5' aatcttctaaatttccatttgagcacctagttcatatgtaatttagattcctcgaggcttggcgtaatcatggtc mir-128-2

5'cgaaaaatattttcatttattcttcgaaactttcatacattcatacaatgtggcgcgccattcgcccta tagtgagtcg

5'tcaggcctgccagccttctgtctactgtttaatgactgacagccagtgaactcgaggcttggcgta atcatggtc

Modificación del vector dirigido para miR-128-1:

[0094] pZeroloxP-FRT-neoR-FRT (-) se modificó para reemplazar el sitio EcoRI único con un sitio Smal único. Los siguientes fragmentos de oligonucleótidos se reasociaron y se insertaron en el sitio EcoRI:

5' aattgcatcgcatgggtcacgacgagatcccgggc

5' aattgcccgggatctcgtcgtgacccatgcgatgc

[0095] El plásmido modificado se digirió con Nsil, y el fragmento que contiene un solo sitio loxP y el gen neo flanqueado por FRT se insertó en el único sitio NsiI en el vector de direccionamiento y se seleccionó para una orientación adecuada. Para la inserción del segundo sitio loxP, los siguientes fragmentos de oligonucleótidos se reasociaron y se insertaron en el único sitio Spel:

5' ctagaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaattct

5' ctagagaattcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatt

Modificación del vector dirigido para miR-128-2

[0096] pZeroloxP-FRT-neoR-FRT (-) fue modificado mediante la digestión del plásmido con SacI y ApaI y el recocido y la inserción de los siguientes fragmentos de oligonucleótidos:

5'ggaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcagagctcatcgagcc cgggtagacggccc

5'gtctacccgggctcgatgagctctgaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtatagga acttccagct

[0097] El plásmido se digirió adicionalmente con Acc65I y se hibridaron y se insertaron los siguientes oligonucleótidos:

5' gtacccccgggataacttcgtatagcatacattatacgaagttataagcttc

5' gtacgaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatcccgggg

[0098] El plásmido modificado se digirió con SmaI y se insertó el fragmento que contiene un solo sitio loxP y el neo gen flanqueado por FRT en el único sitio SmaI en el vector de direccionamiento y se tamiza para el buen orientación. Para la inserción del segundo sitio loxP, los siguientes oligonucleótidos se reasociaron y se insertaron en el sitio HindIII único:

5' agctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatggatcct

5' agctaggatccataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatt

[0099] Para ambos vectores de abordaje, las regiones modificadas de homología fueron extirpadas de pBluescript con digestiones de XhoI y AscI e insertadas en pDTA-TK digerido de manera similar para producir las construcciones de direccionamiento finales. Las construcciones de focalización se linealizaron con Not1, y se transfectaron células madre embrionarias E14 CY2.4 (fondo homocigoto C57Negro/6JTyr-C-2J con mutación natural en el gen de tirosinasa) y se seleccionaron para una recombinación exitosa usando una sonda Southern. Los clones positivos se confirmaron usando una sonda Southern alternativa y mediante secuenciación por PCR de la región modificada. Se usaron clones positivos para producir ratones quiméricos como se describe. Las quimeras se cruzaron con ratones C57BL6/J, y la transmisión de la línea germinal se evaluó mediante el color del pelaje, PCR y análisis de transferencia Southern. La deleción de la línea germinal del neo gen flanqueado por FRT se logró cruzando ratones que portaban los alelos diana con ratones transgénicos FLPe (Laboratorio Jackson). La eliminación de la línea germinal de miR-128-1 y miR-128-2 para generar ratones miR-128-1 -/- y miR-128-2-/- se logró cruzando ratones que portaban alelos floxados con ratones transgénicos que expresan Cre-recombinasa impulsado por el promotor de CMV expresado de forma ubicua (ratones CMV-cre, Jackson Laboratory).

[0100] La deleción posnatal, específica de neuronas en el prosencéfalo del ratón se logró mediante la reproducción de ratones que llevaban alelos floxados (miR-128-2fl/fl) a ratones CamK2a-cre (31) para generar CamK2a-cre; Ratones miR-128-2fl/fl. Se obtuvieron ratones transgénicos Drd1a-cre (EY262) y A2a-cre (KG139) de Gensat (32) y se cruzaron con miR-128-2fl/fl para generar Drd1a-cre; miR-128-2fl/fl y A2a-cre; ratones miR-128-2fl/fl.

[0101] El genotipado habitual de ratones miR-128-1 se realizó usando cebadores siguientes:

5’ tctggaccaaatgaaccaaag

5' ccgcaatgctgcctatattc

5’ gcctgaagaacgagatcagc

5' gcagtcatgcaagcagctat

Alelo de tipo silvestre: 194bp

Alelo nulo: 282bp

Alelo floxado: 336bp

[0102] El genotipado habitual de ratones miR-128-2 se realizó usando cebadores siguientes:

5’ cgccttttagtttcccacag

5' gaccacacagcaagcaggta

5’ aaagacgggaccattcacat

5' tctctcgtgggatcattgttt

Alelo de tipo silvestre: 185bp

Alelo nulo: 531bp

Alelo floxado: 306bp

Generación de ratones con una sobreexpresión neuronal específica de miR-128-2.

[0103] El vector de direccionamiento para la recombinación homóloga en el locus ROSA26 fue proporcionado generosamente por K. Rajewsky (30). Se amplificó una región de 1 kb que incluía la horquilla de miR-128-2 a partir de ADN genómico con los siguientes cebadores y se clonó en el sitio Xhol único en el vector de orientación:

5’ aaaggcgcgccacgtgACTAAAAGGCGCGAGGAGAT

5' aaaggcgcgccTACGCCCTGTACGGTTG

[0104] Se linealizó el vector de orientación modificado y se usó para generar quimeras como arriba. La transmisión exitosa de la línea germinal se evaluó mediante el color del pelaje y se confirmó mediante PCR y análisis Southern. El genotipado de rutina de los ratones RosamiR-128 se realizó usando los siguientes cebadores:

5'-gagttctctgctgcctcctg

5'-ggaaagtccctattggcgtta

5'-tgctgcataaaaccccagat

Alelo de tipo silvestre: 292 pb

Alelo dirigido a Rosa-miR-128: 408 pb

[0105] La sobreexpresión específica de neurona de miR-128-2 posnatal en el prosencéfalo del ratón se logró criando ratones Rosa-miR-128 homocigotos con ratones CamK2acre (31) para generar CamK2a-cre; Ratones Rosa-miR-128. Los ratones Rosa-miR-128 se cruzaron con CamK2a-cre; ratones miR-128-2fl/fl para generar CamK2a-cre; miR-128-2fl/fl; Ratones de rescate Rosa-miR-128.

Generación de ratones con expresión etiquetada-Ago2 FLAG específica a neuronas:

[0106] Ratones transgénicos que expresan una Ago2 etiquetada de FLAG-HA2 inducible por Cre bajo el control del promotor ROSA26 fueron generados como se describió previamente (9, 30). El vector STOP-eGFP-ROSA26TV fue un regalo de K. Rajewsky, Harvard Medical School, Boston, MA. Se cruzaron ratones Rosa-Stopfl/fl-Flag-Ago2 con ratones transgénicos CamK2acre (amablemente proporcionados por G. Schuetz, Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Heidelberg, Alemania (31)) para generar CamK2a-cre; Ratones RosaStopfl/fl-Flag-Ago2.

Preparación de ARN

[0107] Los ratones fueron anestesiados con CO² , y las regiones cerebrales respectivas u órganos periféricos se diseccionaron rápidamente y se congeló en nitrógeno líquido hasta su posterior procesamiento. La extracción de ARN de muestras congeladas se realizó utilizando la técnica TRIzol/Cloroformo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la extracción, el ARN se precipitó durante la noche a -80°C en isopropanol con acetato de sodio 0,15 M, se lavó dos veces con etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en agua sin ARNasa.

Análisis TRAP específico a neurona D1

[0108] Los ratones con pérdida específica de neuronas D1 de miR-128-2 (Drd1a-Cre; miR-128-2fl/fl) se cruzaron con los ratones que llevan D1 - expresión específica MSN de ribosoma eGFP-tagged proteína L10 ((11), D1 -TRAP). ARNm asociados a polirribosomas de Drd1a-cre de 6 semanas de edad, emparejados por edad y sexo; Drd1a-TRAP; miR-128fl/fl y Drd1a-TRAP; Se obtuvieron ratones miR-128fl/fl (n = 5/genotipo) como se describió previamente (11). Los ribosomas marcados con eGFP y los ARNm asociados se inmunoprecipitaron usando una mezcla de dos anticuerpos monoclonales anti-GFP (50 pg de los clones n° 19C8 y n° 19F7 para cada IP, disponibles en Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility). El ARNm purificado se amplificó y procesó para análisis de microarrays y qPCR utilizando el kit de síntesis de ADNc de dos ciclos de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA) como se describió anteriormente (11). En todos los experimentos se utilizaron matrices Affymetrix Mouse Genome 430 2.0. Puede encontrar información sobre el diseño y las características de la matriz en www.affymetrix.com. Las matrices Mouse Genome 430 2.0 se escanearon usando el GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA) y se escalaron globalmente a 150 usando el software operativo Affymetrix GeneChip (GCOS v1.4). Los archivos GeneChip (.cel) se importaron en el software GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se procesaron con el algoritmo RMA, y los valores de expresión en cada chip se normalizaron a la mediana de todas las muestras. Se analizaron los ARNm asociados a ribosomas específicos de la neurona D1 de dos experimentos independientes. Todas las sondas con expresión diferencial y valor p < 0,05 usando ANOVA de 2 vías (genotipo) se consideraron cambiadas significativamente en ausencia de miR-128-2.

[0109] El conjunto de datos de los experimentos de TRAP se analizó mediante el algoritmo SYLAMER para determinar si las dianas de miR-128 eran más abundantes entre los genes regulados positivamente en ausencia de miR-128 en comparación con los genes regulados negativamente en ausencia de miR-128. Los genes de la matriz se clasificaron desde los más regulados por aumento hasta los más regulados por disminución en Drd1a-cre; Drd1aTRAP; miR-128fl/fl en comparación con Drd1a-TRAP; Ratones miR-128fl/fl según la estadística t de cambio de veces. El análisis de enriquecimiento fue obtenido por SYLAMER con el umbral de valor p corregido por Bonferroni de 0,05 (http://www.ebi.ac.uk/enrightsrv/sylarray/).

TaqMan RT-PCR cuantitativa para los genes miARN y análisis de ARNm

[0110] Niveles relativos de expresión de maduro miARNs y mARNs se midieron mediante ensayos TaqMan utilizando total de ARN extraído de muestras de cerebro, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA). Las muestras de ARN purificado se analizaron mediante qRT-PCR para determinar la expresión génica relativa utilizando ensayos de expresión génica TaqMan prediseñados de Applied Biosystems (ABI) según lo recomendado por el fabricante. Se utilizaron los siguientes ensayos prediseñados de expresión génica TaqMan de Applied Biosystems (ABI): miR-128 (Ensayo ID 002216), sno135 (Ensayo ID 001230), miR-124a (Ensayo ID 001182), Fosb Mm00500401_m1, Fosl2 Mm00484442_m1, Arc Mm00479619_g1, JunB Mm04243546_s1, DARPP-32 Mm00454892_m1, Btg2 Mm00476162_m1, GADD45G Mm01352550_g1, dusp1 Mm00457274_g1, NR4A1 Mm01300401_m1, Jun Mm00495062_s1, Actb Mm00607939_s1, Arpp21 Mm00473630_m1 (sonda que abarca el exón detecta los exones que son comunes a todas las isoformas Arpp21), Arpp21 Mm00473645_m1 (sonda de extensión de exón que detecta específicamente la isoforma TARPP larga de Arpp-21). Los recuentos de ciclos para la cuantificación de miARN se normalizaron a snoRNA135 o miR-124a como se indica, y los recuentos de ciclos para la cuantificación de mARN se normalizaron a Actb o Gapdh. La expresión relativa (□Ct) y la cuantificación (RQ = 2-□□C) para cada ARNm se calcularon usando el software RQ Manager y el método □□Ct como se sugirió. Cálculo de la desviación estándar (SDACt = (SDdiana2 SDref2) 1/2) y barras de error (RQ1 = 2A(-(AACt+SDAACt)) y RQ2 = 2A(-(AACt-SDAACt))) se realizó de acuerdo a ABI literatura técnica Número de pieza 4371095 Rev B.

Análisis de rutas

[0111] La red bioinformática y la vía de análisis de los 154 genes diana miR-128 se realizó usando IPA (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) y la Base de Datos para Anotación, Visualización y Descubrimiento Integrado (DAVID) versión 6.7 (david.abcc.ncifcrf.gov/).

Preparación de proteínas y análisis de expresión

[0112] Los ratones fueron anestesiados con CO² y la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado fueron disecados y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta su posterior procesamiento. Las muestras se sometieron a ultrasonidos en hielo en una solución de SDS al 1% complementada con inhibidor de proteasa (Roche, Suiza) e inhibidor de fosfatasa, y se hirvieron durante 10 minutos. La concentración de proteína se determinó usando el kit de ensayo de proteína BCA (ThermoFisherScientific, EE.UU). De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de proteína se diluyeron en un volumen igual de tampón de muestra 2X LDS (Invitrogen) y se suplementaron con DTT hasta una concentración final de 200 mM (Sigma). Se separaron 25 pg de muestras de proteína en geles desnaturalizantes prefabricados de Bis-tris al 4-12% (Invitrogen), se transfirieron a membranas de PVDF y se bloquearon con leche al 5% en solución de TBS-Tween al 0,1% (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se sondaron con anticuerpos primarios diluidos en solución de leche-TBST al 5% durante la noche a 4°C. Después, las membranas se lavaron y se sondaron con anticuerpo secundario IgG (GE) anti-ratón (GE) o anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se desarrollaron utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorado (PerkinElmer, EE.UU). Y se expusieron en una película BioMax (Kodak, EE.UU.). Se escanearon las películas expuestas y se cuantificaron las bandas de proteínas utilizando el software ImageJ (NIH, EE.UU.). Las cantidades de proteína se normalizaron usando beta-actina, los niveles de fosfoproteína se normalizaron a los niveles totales de proteína no fosforilada y todos los valores se representaron en relación con la muestra de camada de control. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: ERK1/2 total (137F5), fosfoERK1/2 (Thr202/Tyr204), Arpp21 (monoclonal de ratón 6A, regalo. A. Nairn), beta-actina (Abcam), PEA15a (H80) (Santa Cruz,), D4ertd22e (Atlas).

Ensayo ELISA

[0113] La cuantificación ELISA se realizó usando el PathScan MAP kinase Multi-Target Sandwich ELISA kit (Señalización Celular) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras de tejido se diseccionaron y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes de su procesamiento adicional. Las muestras congeladas se lisaron en tampón de lisis celular con una breve sonicación en hielo. El lisado celular se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min, y el sobrenadante se diluyó 1:10 en diluyente de muestra y se usó para la incubación con micropocillos de anticuerpos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se generaron curvas estándar usando diluciones de una mezcla que contenía la misma proporción de todas las muestras de control. Cantidad relativa de proteínas de la vía MAP quinasa totales o fosforiladas en Drd1a-cre; Se cuantificaron los lisados de miR-128-2fl/fl y del cuerpo estriado de control basándose en los valores de absorbancia individuales a 450 nm. Los valores p se calcularon utilizando la prueba de Welch.

Ensayo reportero de luciferasa

[0114] Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa para medir la represión de la RCS y la expresión TARPP mARN por miR-128. Los plásmidos informadores diana de microARN 3'UTR que contienen las secuencias de longitud completa de RCS y TARPP 3'UTR corriente abajo de un gen de luciferasa de luciérnaga dirigido por un promotor SV40 para la expresión en células de mamífero se adquirieron de GeneCopoeia, MD (pEZX-MT01). Se usaron plásmidos de control que no contenían insertos 3'UTR para comparación. Los plásmidos contienen el gen de la luciferasa de Renilla para controlar la transfección y la eficiencia de expresión. Las secuencias de todos los plásmidos se verificaron mediante secuenciación y digestión con enzimas de restricción. Los plásmidos informadores o de control se cotransfectaron con los plásmidos de luciferasa de Renilla en células Neuro2A confluentes cultivadas en placas de cultivo de 24 pocillos sin mimetismo de miARN, un imitador de control codificado de miR-124a o imitadores de miR-128 en las dos concentraciones indicadas Fisher Scientific, EE.UU.). Las células se recogieron y lisaron 24 horas después de la transfección y los lisados celulares se ensayaron para determinar la actividad luciferasa de luciérnaga y Renilla usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega, Wisconsin, EE.UU) La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla para cada pocillo de cultivo celular y se representó como actividad relativa a las transfecciones de control sin adición de mímicos. Se realizaron al menos 3 réplicas biológicas que constan de 3 réplicas técnicas cada una.

Análisis electrofisiológico

Preparación de porción de cerebro:

[0115] Porciones de cerebro para-sagitales (275 pm) se obtuvieron de 3-5 meses de edad macho y hembra Drd1a-TRAP; Drd1a-cre; miR-128fl/fl y Drd1a-TRAP; Ratones de control de compañero de camada miR-128fl/fl siguiendo los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones se anestesiaron con una mezcla de ketamina (50 mg kg-1) y xilacina (4,5 mg kg-1) y se perfundieron transcardialmente con 5-10 ml de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) helado que contenía (en mM): 124 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl2, 1,5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 y 16,66 glucosa, burbujeados continuamente con carbogen (95% O2 y 5% CO2). Luego, las porciones se transfirieron a una cámara de retención donde se incubaron en ACSF que contenía (en mM) 2 CaCl2, 1 MgCl2, a 35°C durante 60 min, después de lo cual se almacenaron a temperatura ambiente hasta el registro.

Electrofisiología:

[0116] Pipetas de parche se sacaron de vidrio de borosilicato de paredes gruesas en un extractor Sutter P-97. La resistencia de la pipeta fue típicamente de 3-5 M^ cuando se llenó con solución de grabación. Para los estudios que implican la propagación de bAP, la solución de grabación interna contenía (en mM): 135 KMeSO4, 5 KCl, 10 HEPES, 2 ATP-Mg2 , 0,5 GTP-Na+, 5 fosfocreatina-tris; 5 fosfocreatina-Na+ y 0,1 espermina. El pH se ajustó a 7,25 con NaOH y la osmolaridad a 270-280 mOsm 1-1. Para los experimentos de formación de imágenes de Ca2+, la solución de registro también contenía sal de pentapotasio Fluo-4 200 gm y sal de hidrazida Na+ de Alexa Fluor 568 50 gm (Invitrogen). Para estudios de pinzamiento de voltaje, la solución de registro contenía (en mM): 120 CsMeSO3, 5 NaCl, 10 TEA-CI (tetraetilamonio-CI), 10 HEPES, 5 Qx-314, 4 ATP-Mg2, 0.3 GTP-Na, 0.2 Fluo 4 sal de pentapotasio y 0,05 sal de Na+ de hidrazida Alexa Fluor 568 (Invitrogen), pH 7,25, 270-280 mOsm-1. Las porciones se transfirieron a una cámara de registro de inmersión montada en un microscopio de platina fija y vertical Olympus BX51 y se perfundieron continuamente con ACSF con burbujas de carbogeno. Los registros electrofisiológicos se obtuvieron con un amplificador Multiclamp 700B. La estimulación y la visualización se obtuvieron como se describió anteriormente (Day et al., 2008) utilizando el paquete de shareware personalizado WinFluor (John Dempster, Strathclyde University, Glasgow, Escocia, Reino Unido), que automatiza y sincroniza los protocolos electrofisiológicos y de imágenes de dos fotones. El circuito del puente del amplificador se ajustó para compensar la resistencia en serie y se monitorizó continuamente durante las grabaciones.

Microscopía de escaneo láser de 2 fotones (2PLSM) y las imágenes de Ca2+:

[0117] Formación de imágenes de 2PLSM y Ca2+ se realizaron como se ha descrito previamente (37). Las neuronas de proyección espinosa (SPN) estriatonigrales se identificaron mediante fluorescencia excitada por dos fotones de eGFP somático utilizando un sistema de microscopio de barrido láser Ultima (Prairie Technologies). Se utilizó un sistema detector de contraste DODT para proporcionar una imagen de transmisión de campo brillante en registro con las imágenes fluorescentes. Las señales verdes de GFP (490-560 nm) se adquirieron usando excitación de 810 nm (láser Verdi/Mira). Los SPN se parchearon usando microscopía de video con una cámara CCD de Hitachi y una lente NA Olympus 60X/0.9. La fluorescencia de Alexa 568 se utilizó para la visualización de cuerpos celulares, dendritas y espinas. Después de la rotura del parche, se dejó que la solución interna se equilibrara durante 15-20 minutos antes de obtener la imagen. Se adquirieron imágenes de proyección máxima de gran aumento de dendritas con píxeles de 0,072 gm2 con un tiempo de permanencia de píxeles de 10 gm. Aproximadamente 20 imágenes tomadas con pasos focales de 0,5 gm. La densidad de la columna se calculó a partir de imágenes de proyección máxima de segmentos dendríticos-100-120 gm del soma, como se describió anteriormente (38). Las espinas se contaron manualmente y se normalizaron a la longitud de la dendrita correspondiente.

[0118] bAPs individuales se generaron mediante la inyección de impulsos de corriente somáticos (2 nA, 2 ms). Los cambios dendríticos en Ca2+ se midieron como AF/Fo mediante exploraciones lineales, donde Fo es la fluorescencia verde promedio antes del bAP. Los valores pico de AF/Fo se obtuvieron del promedio de 6 ensayos consecutivos y se calcularon mediante un único ajuste exponencial de la desintegración transitoria de Ca2+. Se adquirieron señales de exploración de línea fluorescente verde a 6 ms por línea y 512 píxeles por línea con 0,08 gm píxeles y 10 gs de tiempo de permanencia de píxeles. Las imágenes escaneadas con láser se adquirieron con luz de 810 nm pulsada a 90 MHz (duración de pulso de -250 fs). La atenuación de potencia se logró con dos moduladores electroópticos de celdas de Pockels (modelos 350-80 y 350-50, Con Optics, Danbury, CT). Las dos celdas se alinearon en serie para proporcionar un rango de modulación mejorado para un control fino de la dosis de excitación (pasos del 0,1% durante cuatro décadas). El escaneo de línea se inició 200 ms antes del protocolo de estimulación y continuó 4 s después de la estimulación para obtener la fluorescencia de fondo y registrar la caída de la señal óptica después de la estimulación. Para reducir el foto-daño y el foto-blanqueamiento, el láser se atenuó por completo utilizando la segunda celda de Pockels en todo momento durante el escaneo, excepto en el período que flanquea directamente la ráfaga de bAP. Las exploraciones de la línea dendrítica se adquirieron de las regiones dendríticas proximales (-50 gm del soma) y distales (-100-120 gm del soma) para cada célula. La atenuación de bAP se calculó normalizando los picos transitorios de Ca2+ distal al transitorio de Ca2+ proximal máximo por célula.

[0119] La liberación de glutamato se logró utilizando un sistema láser camaleón-XR (grupo coherente láser, Santa Clara, CA). Se superfundió MNI-glutamato 5 mM (Tocris, Cookson, Ellisville, MO) sobre el corte usando una bomba de jeringa y un colector de perfusión de múltiples cañones (Cell MicroControls, Norfolk, VA). El glutamato se retiró junto a las cabezas de las espinas individuales utilizando pulsos de 1 ms de luz de 720 nm, normalmente de 10 a 20 mW de potencia en el plano de la muestra. La potencia de fotólisis se sintonizó mediante un tercer modulador de células de Pockels (Con Optics, Danbury, CT) para lograr EPSC sin jaula (uEPSC) con un promedio de 5-10 pA.

Análisis del comportamiento

[0120] Para todos los experimentos de comportamiento, los experimentadores fueron cegados a los genotipos de los animales. Todas las pruebas de comportamiento se han realizado en mutantes de 4 a 16 semanas de edad y sus respectivos controles de compañeros de camada emparejados por edad y sexo. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron entre las 07:00 h y las 19:00 h. Los genotipos se decodificaron después de que se procesaron y analizaron los datos. Se utilizaron tamaños de muestra de al menos 5 animales para análisis de comportamiento. Los sujetos correspondientes a puntos de datos que están a más de 2 desviaciones estándar de la media de la muestra fueron excluidos de los análisis. Cuando fue posible, todos los animales de la camada se incluyeron en experimentos de comportamiento como grupos de control. No se utilizó ningún protocolo de aleatorización. Los animales se asignaron a grupos de tratamiento para asegurar una distribución uniforme de edades y sexos en cada grupo. Cuando se comparan 2 condiciones, se utilizó la prueba t de Welch de 2 colas. Para las comparaciones que involucran múltiples grupos de muestras, se utilizó ANOVA de 1 o 2 factores. Cuando un factor tuvo un efecto significativo, se realizaron pruebas posteriores para realizar comparaciones por pares.

Análisis de campo abierto:

[0121] La locomoción y el comportamiento exploratorio se midieron utilizando el campo abierto (40 x 40 x 30 cm). La actividad se cuantificó mediante el sistema de actividad Photobeam operado por computadora (Accuscan Instruments, Columbia, OH). Los ratones se registraron por la distancia total recorrida en toda la arena y el número de episodios verticales (crianza). El análisis de campo abierto se realizó en ratones de 4 semanas de edad y sus respectivos controles de compañeros de camada emparejados por edad y sexo. Para asegurarse de que los ratones experimentales no tuvieran convulsiones en el momento del análisis, los ratones utilizados para las pruebas de comportamiento se mantuvieron bajo vigilancia durante 2 horas antes de la prueba, durante la prueba motora de 1 hora y 4 horas después de la prueba.

Fármacos utilizados:

[0122] Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con el volumen microlitro equivalente de peso corporal 10X (g). Se diluyó el agonista del receptor D1 SKF 81297 (Taconic) a partir de la solución madre (10 mg/ml en DMSO) con solución salina al 0,9% hasta la concentración indicada. El inhibidor de MEK SL327 (Taconic) se diluyó a partir de la solución madre (diluida en DMSO) con DMSO al 30%/solución salina hasta la concentración indicada. Se diluyó cocaína (Sigma, C5776) en agua hasta una solución madre de 100 mg/ml. Se preparó valproato de sodio (Sigma, P4543) en una solución al 0,26% p/v en agua de bebida para administración oral. Se disolvió ácido kínico (Sigma, K0250) en solución salina justo antes de su uso a una concentración de 30 mg/kg para inyecciones i.p. Se preparó picrotoxina (Sigma, P1675) como una solución madre de 25 mg/ml en etanol y se diluyó adicionalmente en solución salina para inyectar a una concentración de 3 mg/kg para la inducción de convulsiones.

Monitoreo de convulsiones en el inicio de la jaula:

[0123] Los animales fueron alojados en cámaras de plexiglás claras con cámaras pre-instaladas (Phenotyper, Noldus Información Technology), y provistos de alimentos y agua ad libitum. Se tomaron grabaciones continuas de video de ratones durante 24 horas. Las grabaciones de video se calificaron manualmente según la gravedad, la duración y la frecuencia de las convulsiones. Para constituir convulsiones tónicoclónicas registradas, los ratones deben interrumpir toda actividad normal, como caminar, olfatear o acicalarse, adoptar una postura rígida con la espalda arqueada y progresar hacia la cría y caída repetidas. Una gran mayoría de los episodios convulsivos tónico-clónicos progresaron a una etapa posterior con un comportamiento de carrera rápida y rebote, aunque esto no fue necesario para su inclusión como convulsión tónico-clónica.

Convulsiones inducidas químicamente:

[0124] Los ratones se inyectaron i.p. con ácido kaínico (30 mg/kg en solución salina) o picrotoxina (3 mg/kg en solución salina) y se colocaron en cámaras de aislamiento y se observaron durante 60 min. después de la inyección. Todos los animales inyectados entran rápidamente en un período de inmovilidad (paso 1). Se observó a los animales durante el tiempo de aparición de las convulsiones tónico-clónicas caracterizadas por repetidas crías y caídas seguidas de correr y rebotar, o movimientos constantes de las extremidades si se pierde el control postural.

Curvas de supervivencia:

[0125] Se registró la fecha de sacrificio o muerte en la jaula doméstica para los mutantes y los controles de compañero de jaula, se trazó como curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y se comparó usando pruebas de rango logarítmico.

Lesiones 6-OHDA:

[0126] Los ratones fueron anestesiados con ketamina/xilazina. Los ratones se inyectaron estereotácticamente con 6-OHDA (3,5 mg/ml en ácido ascórbico al 0,02%) 2X2ul en el cuerpo estriado izquierdo (ML = -2,1 AP = 1,0 DV = -3,4; ML = -2,3 AP = 0,3 DV = -3,4) e inyección de vehículo 2X2ul en el cuerpo estriado derecho (ML = 2,1 AP = 1,0 DV = -3,4; ML = 2,3 AP = 0,3 DV = -3,4). Los ratones se alojaron en un solo alojamiento durante 3 semanas después de la cirugía para permitir la recuperación antes de los ensayos de comportamiento.

Comportamiento de rotación:

[0127] El comportamiento rotacional en ratones lesionados fue ensayado por un experimentador ciego a los genotipos para dos consecutivos intervalos de 2 min 5 min después de la inyección i.p. de la cocaína. Las rotaciones contralaterales netas están dadas por las rotaciones contralaterales totales menos las rotaciones ipsilaterales. Los datos muestran el promedio de ambas lecturas. Después de 3 días, se registró el mismo ensayo de comportamiento en respuesta a SKF81297.

[0128] En términos de la región de especificidad, el aumento de la actividad motora basal está regulado por miR-128 en el cuerpo estriado, mientras que el agotamiento en el hipocampo o corteza sólo tienen un pequeño o ningún efecto sobre la actividad motora (excepto aumento temporal de la exploración como se ve por primeros 20 min en la línea de ratones EMX-cre). Las convulsiones y la supervivencia se ven más afectadas si miR-128 se agota en el hipocampo y la corteza. Por lo tanto, los solicitantes sobreexpresan miR-128 específicamente en la corteza o el hipocampo y encuentran los efectos supresores de convulsiones más fuertes sin cambiar la actividad motora basal.

[0129] En un ejemplo, el ARN modificado in vivo inyectable utilizado tenía la siguiente secuencia: mmu-miR-128-3p MIMAT0000140: UCACAGUGAACCGGUCUCUUU a ser modificado como se indica: * 2'OMe todas las bases, fosfotioatos 2x 5' y 4x 3', 3'-colesterol. HPLC in vivo con intercambio de contraiones (Na+), filtraciones estériles y pruebas de endotoxinas como procesamiento posterior a la síntesis

5'mU*mC*mAmCmAmGmUmGmAmAmCmCmGmGmUmCmUmC*mU

*mU*mU*-3'-Chl

Eficacia de la sobreexpresión de miR-128 ectópico en la protección de ratones contra convulsiones inducidas químicamente in vivo

[0130] En otro ejemplo, los solicitantes prueban la eficacia de sobreexpresión ectópica de miR-128 en la corteza, hipocampo, cuerpo estriado y tálamo. El curso temporal y el nivel de sobreexpresión de miR-128 se establecen tras la administración de i) oligonucleótidos de miR-128, ii) miR-128 liberado por AAV, así como iii) sobreexpresión genética de miR-128 en ratones in vivo. El aumento local de la expresión de miR-128 en el cerebro del ratón se logra mediante el uso de un enfoque estereotáxico. Se estudian las regiones del cerebro y los enfoques de sobreexpresión de miR-128 para ver cuál tiene el mayor efecto en la reducción de la sensibilidad a las convulsiones inducidas químicamente en ratones in vivo. Los solicitantes utilizan diferentes agentes proconvulsivos que incluyen picrotoxina, ácido kaínico y policarpina para imitar las convulsiones inducidas por un tono excitador aumentado así como un tono inhibidor disminuido en neuronas. La sobreexpresión de miR-128 en el hipocampo utilizando el enfoque AAV muestra la mayor eficacia.

Tratamiento de modelos de ratón de severa epilepsia infantil generalizada humana tales como el síndrome Dravet por sobreexpresión genética o ectópica de miR-128

[0131] Los inventores de la presente descripción sobreexpresan ectópicamente miR-128 en modelos de ratón de epilepsia en infancia generalizada severa humana tales como el síndrome de Dravet (ratones deficientes en Scn1a o Gabrg2) para establecer la eficacia del miR-128 para evitar convulsiones en estos ratones. Los ratones con pérdida de Scna1 y Gabrg2 muestran convulsiones espontáneas y ataxia que comienza en la cuarta semana posnatal seguida de muerte prematura por una causa relacionada con las convulsiones. Los solicitantes prueban los efectos de la sobreexpresión de miR-128 en el desarrollo de convulsiones y la supervivencia en ratones con síndrome de Dravet de tres a cuatro semanas de edad. También se prueba la capacidad de la sobreexpresión genética de miR-128 en las neuronas del prosencéfalo postnatales para proteger a los ratones contra el desarrollo de convulsiones espontáneas. En segundo lugar, los solicitantes prueban la capacidad de supresión de convulsiones de la sobreexpresión de oligonucleótidos o de miR-128 basado en AAV en diferentes regiones del cerebro (cuerpo estriado, corteza temporal, hipocampo, tálamo mediodorsal) para determinar si hay ubicaciones específicas que pueden provocar un cortocircuito en las convulsiones en todo el cerebro debido a sobreexpresión local de miR-128. El miR-128 suministrado ectópicamente en las neuronas del hipocampo o el tálamo protege a los ratones que padecen síndrome similar a Dravet contra convulsiones recurrentes espontáneas y muerte prematura.

Tabla 1

ID Adhesión RPM Cromosoma Inicio Final Hebra Confianza Ale; ac8'm ir-i28" ? MI0018728- 6 42720735 42720830

aca-mtr-128-2 MKM18729. 1 96868145 $6868238 ■ -3ae-mir-128 m0QQ2522 - ■ ^p

jfe fc m tó iih g MHXXH3B1265 19 44518214 44518336 * r ssg :JSaír..12S;.j MIÜG12821- chr16 49037163 49087246 - *

eca-mtr-128'2. MKK312838. chr18 19492350 1949241$ - ^..... fru-fflsr-128-1 M10003421 - HE602542.1 3B2943S 3829520 • - p fru-msr-128-2 M10003346 - HE602546.1 1445834 1445905 ^{* *}

(Continuación)

oan-mif-128-1 MKJ006787 - Cors6g290C19 34 104 - -oan-rair-126-2 M10006692 - Ü1tra389 820000 320110 - -ata-mir-128 M100194 82 • 11 21614207 21614306 - -oma-mir-128-1 M10017060 v G L 476334.1 422133 422221 + -oma-mir-128-2 M1C017061 - GL477033.1 40713 40801 +

(Continuación)

ID Adhesión Cromosoma Inicio Final F Hebra Confianza Alcance

sca-iTÉr-128 «10002523-

otawwr-123-1 RS (0002520- 2b 24605741 24605822

sov-mr-126-2 Mf0014319 - 3 111073053111073141-

Cir-nv-128-1 Sí (000251S- 28 130815381139618062 ♦

Olr-mií-128-2 Sí (0003482 • 3 36312033 36312155 *

mo-mir-128-i Sí10000300- 13 4Q507575 40907556

mo-rrir-128-2 Sí 10000301- 8 116727237116727320-

shamjr-128 Sí (0015025 - GL845603 1 2503875 2504025

sia-ay-128 Sí 10002521 -

ssc-mir-128-1 Sí (0002451- c!v15 16661614 16661695 -

ssc-ná-128-2 Sí(0013004- Chf13 226581S1 22859270

fau-mif.128-1 Sí (0013712 - Chr7 33185771 33135541 ♦

tau-iflif-128-2 Sí(0013711 - Chf2 26894377 26334486 -

ini-írsf-128-1 Sí (0003422 - 3 4160307 4160378 -

takirif. i *7 M \ < ¿ 7 * 21 1237202 1237273 -

xlr-mir-128-1 Sí10004332- GL172713.1 3010851 3010933 -

x1f.Nr-12.r-2 Sí (0004823- GL173401 1 415153 415232

v e r urt www. m:r&ase.o?§'c#&;n;mima summafy.p!?fam*MIPF00

Referencias:

[0132]

1. M. He etal., Neuron 73, 35 (Ene 12, 2012). 2. N. Y. Shao et al., BMC genomics 11, 409 (2010). 3. E. A. Miska et al., Genome biology 5, R68 (2004). 4. A. M. Krichevsky et al., RNA 9, 1274 (Oct, 2003). 5. C. R. Gerfen. Annual review of neuroscience 15, 285 (1992). 6. A. V. Kravitz et al., Nature 466, 622 (Jul 29, 2010).

7. M. R. Fabian et al. Annual review of biochemistry 79, 351 (2010). 8. A. Schaefer et al., The Journal of experimental medicine 207, 1843 (Ago 30, 2010). 9. S. W. Chi. Nature 460, 479 (Jul 23, 2009). 10. D. P. Bartel, Cell 136, 215 (Ene 23, 2009). 11. M. Heiman et al., Cell 135, 738 (Nov 14, 2008). 12. S. van Dongen et al., Nature methods 5, 1023 (Dic, 2008). 13. A. Grimson et al., Molecular cell 27, 91 (Jul 6, 2007). 14. J. G. Doench, Genes & development 18, 504 (Mar 1, 2004). 15. M. J. Brodie, Seizure : the journal of the British Epilepsy Association 19, 650 (Dic, 2010). 16. J. W. Ramos et al., Molecular biology of the cell 11,2863 (Sep, 2000). 17. A. Matsuda et al., Oncogene 22, 3307 (Mayo 22, 2003). 18. S. V. Rakhilin et al., Science 306, 698 (Oct 22, 2004). 19. S. P. Megraw M et al., Theor Chem Acc, 593 (2010). 20. J. D. Sweatt, Current opinion in neurobiology 14, 311 (Jun, 2004).

21. G. M. Thomas, et al. Nature reviews. Neuroscience 5, 173 (Mar, 2004). 22. E. Valjent, et al., BMC neuroscience 7, 20 (2006). 23. A. S. Nateri et al., The EMBO journal 26, 4891 (Nov 28, 2007). 24. C. Mazzucchelli et al., Neuron 34, 807 (Mayo 30, 2002). 25. C. R. Gerfen et al., The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 22, 5042 (Jun 15, 2002). 26. M. Feyder et al., Frontiers in behavioral neuroscience 5, 71 (2011). 27. M. A. Cenci et al., Progress in brain research 183, 209 (2010). 28. D. S. Kim et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 20, 4405 (Jun 15, 2000). 29. M. A. Blair et al., Epilepsia 52, 993 (Mayo, 2011). 30. B. A. Chioza et al., Epilepsy research 87, 247 (Dic, 2009). 31. Y. Sasaki et al., Immunity 24, 729 (Jun, 2006). 32. E. Casanova et al., Genesis 31, 37 (Sep, 2001). 33. S. Gong et al., Nature 425, 917 (Oct 30, 2003). 34. H. Li, Bioinformatics 25, 1754 (Jul 15, 2009). 35. X. Ji et al., Nucleic Acids Res 34, W551 (Jul 1, 2006). 36. P. Machanick et al., Bioinformatics 27, 1696 (Jun 15, 2011). 37. B. Langmead et al., Genome Biol 10, R25 (2009). 38. M. Day et al., The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 28, 11603 (Nov 5, 2008). 39. C. S. Chan et al., The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 32, 9124 (Jul 4, 2012).

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128 en el cerebro para su uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de estado epiléptico en un individuo sospechoso de tener o diagnosticado con síndrome de Dravet, donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128.

2. Un agente capaz de aumentar la expresión y/o la actividad de miR-128 para su uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de desarrollo o aparición de convulsiones en un individuo en riesgo de convulsiones o que las tenga, en donde se sospecha que el individuo tiene o ha sido diagnosticado con síndrome de Dravet, en donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128.

3. Un agente para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el agente se administra por vía intratecal o intranasal.

4. Un agente para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el agente se administra al sistema nervioso central del individuo.

5. Un agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el agente se administra al hipocampo o corteza.

6. Un agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el agente capaz de aumentar la expresión y/o actividad de miR-128 se selecciona del grupo que consiste en un miR-128 estabilizado químicamente, un mimético de miR-128, un ácido nucleico que codifica miR-128 y un vector viral que codifica miR-128.

7. Un agente para su uso según la reivindicación 6, en donde miR-128 tiene la secuencia de nucleótidos: UCACAGUGAACCGGUCUCUUU.

8. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o reducción de la probabilidad de desarrollo del síndrome de Dravet que comprende un agente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, capaz de aumentar la expresión o actividad de miR-128, en donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en donde el agente capaz de aumentar la expresión o actividad de miR-128 se selecciona del grupo que consiste en miR-128 estabilizado químicamente, un mimético de miR-128, un ácido nucleico que codifica miR-128, y un vector viral que codifica miR-128.

10. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 9, en donde miR-128 tiene la secuencia de nucleótidos: UCACAGUGAACCGGUCUCUUU.

11. Un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 capaz de aumentar la expresión o actividad de miR-128 para su uso en la reducción de la probabilidad de convulsiones en un individuo con riesgo de convulsiones, en donde el agente se administra al cerebro del individuo, en donde se sospecha que el individuo tiene o se le ha diagnosticado síndrome de Dravet, y en donde el agente es miR-128, o es un agente con un 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128.

12. Un método para identificar compuestos útiles en el tratamiento de o para reducir la probabilidad de una patología caracterizada por convulsiones, que comprende poner en contacto una célula que expresa miR-128 con un compuesto candidato y determinar el nivel de expresión y/o actividad del miR-128 expresado por dicha célula, en donde un aumento en el nivel de expresión y/o actividad del miR-128 con respecto al nivel de referencia de expresión y/o actividad del miR-128 en una célula que no ha sido contactada con el compuesto candidato indica que el compuesto candidato es útil en el tratamiento o la prevención del síndrome de Dravet, en donde el compuesto candidato es un agente con 90 por ciento o más de identidad de secuencia con miR-128, el método realizado in vitro o en animales no humanos.