ES2869978T3

ES2869978T3 - Inhibidor de Dinamina 2 para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne

Info

Publication number: ES2869978T3
Application number: ES16722076T
Authority: ES
Inventors: Jocelyn Laporte; Belinda Cowling
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Strasbourg
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Strasbourg
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2036-04-22
Also published as: CN107532169A; AU2016251973A1; US20180142008A1; EP3286317A1; EP3286317B1; CN107532169B; WO2016170162A1; AU2016251973B2; JP6791877B2; EP3085785A1; US10822400B2; CA2983211A1; JP2018518456A; US20210130447A1; DK3286317T3; PT3286317T

Abstract

Un inhibidor de Dinamina 2 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, seleccionado del grupo que consiste en: - un anticuerpo dirigido contra la Dinamina 2, - una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2, - un ácido nucleico o una nucleasa diseñada para dirigirse al gen de DNM2 y suministrar nucleasas mediante la terapia de edición del genoma, y - una molécula pequeña que inhibe la actividad, expresión o función de la Dinamina 2, seleccionándose dicha molécula pequeña del grupo que consiste en (3,4-dihidroxibenciliden)hidrazida del ácido 3-hidroxinaftalen- 2-carboxílico, 3-Hidroxi-N'-[(2,4,5-trihidroxifenil)metiliden]naftaleno-2-carbohidrazida, bromuro de tetradeciltrimetilamonio, Ácido 4-cloro-2-((2-(3-nitrofenil)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-5-carbonil)- amino)-benzoico, 2-Ciano-n-octil-3-[1-(3-dimetilaminopropil)-1H-indol-3-il]acrilamida, 3-(2,4-Dicloro-5- metoxifenil)-2-sulfanilquinazolin-4(3H)-ona, N,N'- (Propano-1,3-diil)bis(7,8-dihidroxi-2-imino-2H-cromeno-3- carboxamida), N,N'-(Etano-1,2-diil)bis(7,8-dihidroxi-2-imino-2H-cromeno-3-carboxamida), Bromuro de OctadecilTriMetilAmonio, el péptido inhibidor de Dinamina de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, 3-Hidroxi-N'-[(2,4,5-trihidroxifenil)metiliden]naftaleno-2-carbohidrazida y Bromuro de 4-(N,N-dimetil-N- octadecil-N-etil)-4-aza-10-oxatriciclo-[5,2,1 ]decano-3,5-diona.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidor de Dinamina 2 para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a un inhibidor de Dinamina 2 o una composición que lo comprende para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.

Antecedentes de la invención

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la miopatía más común en los niños. Los pacientes con DMD desarrollan un fenotipo distrófico en el músculo. La DMD es un trastorno severo ligado al cromosoma X, con desgaste muscular progresivo y debilidad que afecta a casi todos los músculos, y normalmente da como resultado una muerte prematura debido a insuficiencia cardiorrespiratoria. A pesar de una extensa investigación sobre terapias para la DMD, muchas de las cuales se dirigen a la expresión de la distrofina (revisada por Al-Zaidy, S., L. Rodino-Klapac y J. R. Mendell (2014). "Gene therapy for muscular dystrophy: moving the field forward". Pediatr Neurol 51(5): 607-618), todavía no se ha desarrollado un tratamiento eficaz para esta devastadora enfermedad.

La DMD se debe a mutaciones en la distrofina, que dan lugar a la pérdida de la expresión de la proteína distrofina. La distrofina forma la conexión mecánica entre el aparato contráctil y la membrana plasmática de la fibra muscular. En los pacientes con DMD, la pérdida de expresión de distrofina provoca una interrupción de la transmisión de fuerza normal, lo que ejerce una gran cantidad de estrés sobre la fibra y da como resultado el daño de la fibra muscular. Se requieren terapias eficaces para pacientes con DMD que se dirijan a la fuerza muscular fisiológica y, por lo tanto, mejoren la función muscular. La mayoría de los enfoques terapéuticos para la DMD se han dirigido al gen mutado, distrofina, para intentar mejorar la expresión de la totalidad o parte de la distrofina.

Recientemente, se ha divulgado una nueva terapia potencial para pacientes con miopatía centronuclear ligada al cromosoma X (XLCNM) mediante la reducción de la expresión de DNM2. Este nuevo enfoque se basó en los hallazgos de que la reducción de la expresión de la dinamina 2 (DNM2) puede rescatar el fenotipo de la XLCNM, también llamada miopatía miotubular, en ratones Mtm1-/y.

Los autores de la presente invención han descubierto una mejora significativa en la fuerza muscular específica a varias edades mediante la reducción de DNM2 en ratones mdx, que son el modelo de ratón clásico utilizado para la investigación preclínica de la DMD. Además, una mejora en la resistencia a la lesión muscular inducida por contracción confirma la importancia fisiológica de este hallazgo. Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona un enfoque terapéutico novedoso para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne mediante la reducción de la expresión de DNM2.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un inhibidor de Dinamina 2 para su uso en el tratamiento de la DMD, como se define mediante las reivindicaciones.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho inhibidor de Dinamina 2 y un portador/excipiente farmacéuticamente aceptables para su uso en el tratamiento de la DMD.

El inhibidor de Dinamina 2 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra la Dinamina 2, una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2, un ácido nucleico o una nucleasa diseñados para dirigirse al gen de DNM2 y suministrar nucleasas mediante la terapia de edición del genoma, y una molécula pequeña que inhibe la actividad, expresión o función de la Dinamina 2 como se define en la reivindicación 1. En una realización preferida, el inhibidor de Dinamina 2 se selecciona del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2. En una realización particular, el inhibidor de Dinamina 2 es un ARNi, un ácido nucleico antisentido o una ribozima que interfieren específicamente en la expresión de la Dinamina 2.

En una realización más específica, el inhibidor de Dinamina 2 es un ARNip, ARNhc o ARNpn antisentido. En otra realización particular, el inhibidor de dinamina 2 es un ADN, ARNm o una nucleasa diseñados para dirigirse al gen de DNM2 y para suministrar nucleasas utilizando la terapia de edición del genoma.

Otro objeto de la invención se refiere a un método de escrutinio para identificar compuestos útiles para el tratamiento de la DMD que comprende:

a) Proporcionar u obtener un compuesto candidato; y

b) Determinar si dicho compuesto candidato inhibe la actividad/expresión de la Dinamina 2,

c) Seleccionar dicho compuesto candidato si inhibe la actividad/expresión de la Dinamina 2.

El método para escrutar o identificar una molécula adecuada para el tratamiento de la DMD puede comprender opcionalmente adicionalmente la etapa de administración in vivo o in vitro de la molécula seleccionada en un modelo animal no humano de DMD o una porción del mismo (tejido o células) y analizar el efecto sobre el inicio o la progresión de la miopatía.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La fuerza muscular específica aumenta en ratones mdx con menos DNM2. La fuerza muscular específica se midió en ratones mdx/y (color blanco) y mdx-/y Dnm2+/- (color negro), a las 6 semanas, 3 meses y 1 año de edad. Los resultados se muestran como fuerza absoluta, con relación a la masa muscular (sPo/mg). La significación estadística se indica de la siguiente manera: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Figura 2. La fuerza muscular mejora después de una lesión muscular inducida por contracción, en ratones mdx con menos DNM2. La fuerza muscular absoluta se midió en ratones mdx/y (color negro, línea continua) y mdx"/y Dnm2+/-(color negro, línea discontinua) de 1 año de edad. Los resultados se muestran como un porcentaje de la fuerza inicial (%). La significación estadística se indica de la siguiente manera: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

Figura 3. (A) La fuerza muscular específica (sPo) se midió inicialmente en el músculo tibial anterior de ratones mdx-/y (color blanco) y mdx-/yDnm2+/-(color negro). (B) El músculo tibial anterior se sometió a continuación a 9 contracciones en elongación. Los resultados para ratones mdx-/y (línea continua de color negro) y mdx-/yDnm2+/-(línea discontinua de color negro) se muestran como un porcentaje de la fuerza inicial (%), después de 0, 3, 6 y 9 contracciones en elongación. (C) Se realizó una inyección intramuscular de ARNhc de AAV dirigido a DNM2 (color negro) o una secuencia de control desorganizada (color blanco) en el tibial anterior de ratones mdx-/y a las 3 semanas de edad. La fuerza muscular específica (sPo) se midió en el músculo tibial anterior a los 3 meses de edad. (D) El músculo tibial anterior se sometió a continuación a 9 contracciones en elongación como en (B), control de ARNhc de AAV (línea continua de color negro) y ARNhc de AAV para DNM2 (línea discontinua de color negro). Descripción detallada

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente memoria tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La Dinamina 2 está codificada por el gen DNM2 (ID Gen 1785). Más precisamente, el gen DNM2 está ubicado del par de bases 10.919.884 al par de bases 10.942.586 en el cromosoma 19 (versión GRCh37/hg19) o de los pares de bases 10.718.053 a 10.831.910 en la ubicación NC_000019.10 (GRCh38/hg19). El gen o los productos génicos de dinamina 2 también se conocen por otros nombres, incluidos, entre otros, CMTDI1, CMTDIB, DI-CMTB, DYN2, DYN2_HUMAN, dinamina II, DYNII.

Inhibidores de Dinamina 2

Como se emplea en la presente memoria, el término "inhibidor de Dinamina 2" se refiere a cualquier molécula capaz de disminuir específicamente la expresión de la Dinamina 2 o inhibir la actividad o función de la Dinamina 2. Preferiblemente, tal inhibidor de Dinamina 2 es un inhibidor directo, lo que significa que interactúa directamente con la proteína Dinamina 2 o con un ácido nucleico que codifica dicha Dinamina 2 o una porción de la misma. Los inhibidores de Dinamina 2 según la invención son capaces de inhibir o disminuir la actividad funcional de la Dinamina 2 en vivo y/o in vitro. El inhibidor puede inhibir la actividad funcional de la Dinamina 2 en al menos aproximadamente 30%, preferiblemente en al menos aproximadamente 50%, preferiblemente en al menos aproximadamente 70, 75 u 80%, aún más preferiblemente en 85, 90 o 95%. En particular, el inhibidor puede inhibir la expresión de la Dinamina 2 en al menos aproximadamente 10%, preferiblemente en al menos aproximadamente 30%, 35%, 40%, 45%, preferiblemente en al menos aproximadamente 50%, preferiblemente en al menos aproximadamente 70, 75 u 80%. Un inhibidor de Dinamina 2 de la invención puede actuar bloqueando y/o inhibiendo la actividad o función de la Dinamina 2. Esto se puede lograr, por ejemplo, inhibiendo la actividad enzimática de la Dinamina 2. La actividad funcional o enzimática de la Dinamina 2 puede ser evaluada fácilmente por un experto en la técnica de acuerdo con métodos conocidos sometiendo a prueba, por ejemplo, la actividad GTPasa o la función de la Dinamina 2 en la endocitosis mediada por clatrina (Macia E. et al., Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin: Developmental cell 10, 839-850, junio de 2006). Para los inhibidores de la actividad GTPasa o la unión de lípidos, la localización subcelular, la endocitosis mediada por clatrina, la endocitosis de vesículas sinápticas, se puede utilizar el método descrito por McCluskey et al, Traffic, 2013; McGeachie et al., ACS Chem Biol, 2013. Para la actividad GTPasa, la oligomerización, la unión a lípidos de la Dinamina 2, se pueden utilizar los métodos descritos por Wang et al en J Biol Chem 2010; o Kenniston y Lemmon, en Embo J, 2010.

El inhibidor de Dinamina 2 de la invención también puede actuar bloqueando y/o inhibiendo la expresión de la Dinamina 2 (incluyendo transcripción, corte y empalme, maduración del transcrito o traducción). La disminución o inhibición de la expresión de la Dinamina 2 se pueden evaluar por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la evaluación del nivel de proteína Dinamina 2 utilizando, por ejemplo, análisis de T ransferencia Western (tal como se muestra en la figura 1) o ELISA, por ejemplo, utilizando un anticuerpo Anti-Dinamina 2 y/o evaluando el nivel de ARNm para la Dinamina 2 (tal como se muestra en la figura 2) utilizando cualquier técnica disponible tal como PCR cuantitativa, por ejemplo.

El inhibidor de Dinamina 2 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra Dinamina 2, una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2 y una molécula pequeña que inhibe la actividad enzimática de la Dinamina 2 (es decir, inhibición de la actividad de GTPasa), la expresión (por ejemplo, inhibiendo el promotor, el corte y empalme o la traducción), o la función (tal como inhibición de la oligomerización, la activación, la unión de lípidos o la unión del compañero).

Según una realización particular, el inhibidor de Dinamina 2 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra Dinamina 2 o una molécula de ácido nucleico (o nucleótido) que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2. En una realización preferida, el inhibidor de Dinamina 2 se selecciona del grupo que consiste en una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2. Según la invención, la molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2 es habitualmente un ácido nucleico de origen no natural. En una realización particular, el inhibidor de Dinamina 2 es un ARNi, un ácido nucleico antisentido o una ribozima que interfieren específicamente en la expresión de la Dinamina 2. En una realización particular, el inhibidor de Dinamina 2 es un ARNip o ARNhc.

En la presente invención, el ácido nucleico es capaz de hibridar específicamente con un gen o transcritos que codifican Dinamina 2. Se pretende que "hibridar específicamente", signifique hibridar en condiciones rigurosas. En particular, las condiciones rigurosas se pueden definir por la concentración de sal, la concentración de disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, temperatura y otras condiciones bien conocidas en la técnica. Las condiciones de hibridación rigurosas típicas incluyen temperaturas por encima de 30°C, preferiblemente por encima de 35°C, más preferiblemente por encima de 42°C y/o salinidad de menos de aproximadamente 500 mM, preferiblemente menos de 200 mM. No obstante, se entiende que no se necesita que el ácido nucleico según la invención tenga 100% de complementariedad con la secuencia diana para hibridar específicamente. En particular, un ácido nucleico con un grado de complementariedad al menos igual a aproximadamente 90% es capaz de hibridar específicamente. Preferiblemente, el grado de complementariedad entre el ácido nucleico según la invención y la secuencia diana es igual al menos a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.

Los términos "complementario" o "complementariedad" se refiere a la capacidad de los polinucleótidos para formar pares de bases con otra molécula de polinucleótido. Los pares de bases se forman típicamente por enlaces de hidrógeno entre unidades de nucleótidos en hebras de polinucleótidos antiparalelas. Las hebras de polinucleótidos complementarias pueden formar pares de bases a la manera de Watson-Crick (por ejemplo, A con T, A con U, C con G), o de cualquier otra manera que permita la formación de dúplex. Como saben los expertos en la técnica, cuando se utiliza ARN en lugar de ADN, la base que se considera complementaria de la adenosina es uracilo en lugar de timina. Sin embargo, cuando se indica una U en el contexto de la presente invención, se implica la capacidad de sustituir una T, a menos que se indique lo contrario. Complementariedad perfecta o complementariedad de 100 por ciento se refiere a la situación en la que cada unidad de nucleótidos de una hebra de polinucleótidos puede unirse a una unidad de nucleótidos de una segunda hebra de polinucleótidos. La complementariedad menos que perfecta se refiere a la situación en la que algunas, pero no todas, las unidades de nucleótidos de dos hebras pueden unirse entre sí. Por ejemplo, para dos oligómeros de 20 unidades, si solo dos pares de bases en cada hebra pueden unirse entre sí, las hebras de polinucleótidos exhiben un 10 por ciento de complementariedad. De la misma manera, si 18 pares de bases en cada hebra pueden unirse entre sí, las hebras de polinucleótidos exhiben 90 por ciento de complementariedad.

Como se emplea en la presente memoria, el término "ARNi", "iARN" o "ARN de interferencia" significa cualquier ARN que sea capaz de regular por disminución la expresión de la proteína elegida como diana. Abarca moléculas ARN interferente pequeño (ARNip), ARN de doble hebra (ARNdh), ARN de hebra sencilla (ARNhs) y ARN en horquilla corta (ARNhc). La interferencia de ARN designa un fenómeno por el cual el ARNdh suprime específicamente la expresión de un gen diana a nivel postranscripcional. En condiciones normales, la interferencia del ARN es iniciada por moléculas de ARN de doble hebra (ARNdh) de varios miles de pares de bases de longitud. In vivo, el ARNdh introducido en una célula se escinde en una mezcla de moléculas cortas de ARNdh denominadas ARNip. La enzima que cataliza la escisión, Dicer, es una endo-ARNasa que contiene dominios de ARNasa III (Bernstein, Caudy et al.

2001 Nature. 18 de enero de 2001; 409 (6818):363-6). En células de mamíferos, los ARNip producidos por Dicer tienen una longitud de 21-23 pb, con una secuencia dúplex de 19 o 20 nucleótidos, salientes 3' de dos nucleótidos y extremos 5'-trifosfato (Zamore, Tuschl et al. Cell. 31 de marzo de 2000; 101 (1): 25-33; Elbashir, Lendeckel et al. Genes Dev. 15 de enero de 2001; 15(2):188-200; Elbashir, Martinez et al. EMBO J. 3 de diciembre de 2001; 20(23):6877-88). Según una realización particular, los ARNi no abarcan microARN.

Varias patentes y solicitudes de patente han descrito, en términos generales, el uso de moléculas de ARNip para inhibir la expresión génica, por ejemplo, el documento WO 99/32619. La terapia de interferencia de ARN por ARNip y ARNhc también se detalla en la revisión de Z. Wang et al., en Pharm Res (2011) 28:2983-2995.

El ARNip o ARNhc normalmente se diseñan contra una región de 19 a 50 nucleótidos aguas abajo del codón de inicio de la traducción, mientras que la 5'UTR (región no traducida) y la 3'UTR normalmente se evitan. La secuencia diana de ARNip o ARNhc elegida se debe someter a una búsqueda BLAST contra la base de datos EST para asegurarse de que se dirige al único gen deseado. Existen varios productos disponibles comercialmente para ayudar en la preparación y uso de ARNip o ARNhc.

En una realización preferida, la molécula de ARNi es un ARNip de al menos aproximadamente 10-40 nucleótidos de longitud, preferiblemente aproximadamente 15-30 nucleótidos de base.

El ARNip o el ARNhc pueden comprender ARN natural, ARN sintético o ARN producido de manera recombinante, así como ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo de la molécula o en uno o más nucleótidos internos del ARNip, incluidas modificaciones que hacen que el ARNip sea resistente a la digestión por nucleasas.

Algunos ácidos nucleicos inhibidores de Dinamina 2 están disponibles comercialmente. Se pueden citar, por ejemplo, pero sin limitarse a: Abnova-Novus Biologicals, Dynamin 2 RNAi con referencias: H00001785-R05-H00001785-R08; Santa Cruz Biotechnology, Dynamin II siRNA (h) con referencia: sc-35236, Dynamin II (h)-PR con referencia: sc-35236-PR, Dynamin II shRNA Plasmid (h) con referencia: sc-35236-SH, Dynamin II shRNA (h) Lentiviral Particles con referencia: sc-35236-V).

En una realización particular, la molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente con la Dinamina 2 es un ácido nucleico que interfiere específicamente con al menos una porción de la secuencia de ADNc humano de músculo de longitud completa de dinamina 2 (como se muestra en SEQ ID NO 1, variante de transcrito 1 (NM_001005360.2) (exón 10a, 13ter) con 12b añadido). Según esta realización, y más específicamente, la molécula de ARNi es un ARNip o ARNhc de al menos aproximadamente 10-40 nucleótidos de longitud, preferiblemente un ARNi de aproximadamente 15-30 nucleótidos de base. En una realización particular, el ARNip o el ARNhc se dirigen al menos a un exón del ARNm de Dinamina2, y más específicamente al menos a uno de los exones 1,4, 5, 12b, 13, 15, 17 y 21 del ARNm de Dinamina2.

En una realización particular, la molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente con la Dinamina 2 comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 2: 5'- AAGGACATGATCCTGCAGTTCAT - 3’ (o sec. ARNhc Núm. C, a continuación),

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 3: 5'- AAGAGGCTACATTGGCGTGGTGA- 3’

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 4: 5'- AGGTGGACACTCTGGAGCTCTCC - 3’,

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 5: 5'- AAGAAGTACATGCTGCCTCTGGA - 3’,

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 6: 5'- AACGTCTACAAGGACCTGCGGCA - 3’,

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 7: 5'- AGGAGAACACCTTCTCCATGGAC - 3’,

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 8: 5'- AACTGTTACTATACTGAGCAG - 3’,

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 9: 5'- T GCCAACT GTT ACT AT ACT - 3’,

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 10: 5 '- GAAGAGCTGATCCCGCTGG -3'

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 11: 5 '- GCACGCAGCTGAACAAGAA -3'

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 12: 5'-GGACTTACGACGGGAGATC-3 '

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 13: 5 '-GGAT ATT GAGGGCAAGAAG-3'

- Secuencia de ARNi de SEQ ID NO 14: 5'-GGACCAGGCAGAAAACGAG-3 '

- Secuencia de ARNi de ARNhc 15: 5'- GCGAATCGTCACCACTTAC-3 '

El ácido nucleico antisentido también se puede utilizar para regular por disminución la expresión de la Dinamina 2. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a todo o parte de un ácido nucleico efector que codifica la Dinamina 2, p. ej., complementario a la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementario a una secuencia de ARNm, y se cree que interfiere con la traducción del ARNm diana. Los ácidos nucleicos antisentido utilizados en la invención interfieren específicamente en la expresión de la Dinamina 2.

Según una realización, el ácido nucleico antisentido es una molécula de ARN complementaria a un ARNm diana que codifica la Dinamina 2.

Según otra realización, el nucleótido antisentido denota una secuencia de ácido nucleico de hebra sencilla, ya sea ADN o ARN, que es complementaria a una porción de un pre-ARNm que codifica la Dinamina 2. En particular, el nucleótido antisentido de la presente invención está diseñado para bloquear un sitio aceptor de empalme (SA) y/o un potenciador de corte y empalme de exón (ESE) y/o un punto de ramificación en el pre-ARNm de Dinamina 2 y/o cualquier secuencia que pueda modular el corte y empalme del pre-ARNm, es decir, está diseñado para ser complementario a una porción del pre-ARNm de Dinamina 2 que comprende un SA, un ESE, una secuencia de punto de ramificación o cualquier secuencia que pueda modular el corte y empalme del pre-ARNm. Más específicamente, el nucleótido antisentido se utiliza para inducir la omisión del exón dentro de un pre-ARNm de Dinamina 2, lo que conduce a un desplazamiento de marco que produce un ADNc truncado que contiene un codón de parada prematuro en el ARNm resultante. Por tanto, esta estrategia permite la reducción del nivel de proteína DNM2. En una realización particular, el nucleótido antisentido se utiliza para inducir la omisión del exón dentro de un pre-ARNm de Dinamina 2. Por ejemplo, el nucleótido antisentido implementado está diseñado para inducir específicamente la omisión del exón 2 o del exón 8. En una realización particular, el nucleótido antisentido de la presente invención es capaz de inducir la inclusión de un codón de parada prematuro en el ARNm de DNM2 humana. Se demostró que la omisión del exón 2 o del exón 8 conduce a la ausencia de la proteína Dinamina 2 (como se menciona en "Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy". Cowling BS, Chevremont T, Prokic I, Kretz C, Ferry A, Coirault C, Koutsopoulos O, Laugel V, Romero NB, Laporte J., J Clin Invest. 3 de marzo de 2014; 124(3):1350-63. Doi: 10.1172/JCI71206. Publicación electrónica de 24 de febrero de 2014; y Tinelli E, Pereira JA, Suter U. Hum Mol Genet. 2013 1 de noviembre; 22(21):4417-29. doi: 10.1093/hmg/ddt292. Publicación electrónica 27 de junio de 2013).

En una realización particular, el nucleótido antisentido está diseñado para inducir específicamente la omisión del exón 2 o del exón 8 de DNM2, y comprende o consiste en una de las siguientes secuencias: U7-Ex2 (omisión de del exón 2 de DNM2 diana con un ARNpn de U7 antisentido), que comprende la siguiente secuencia:

SEQ ID NO 26: GTCACCCGGAGGCCTCTCATTCTGCAGCTC

U7-Ex8 (omisión del exón 8 de DNM2 diana con un ARNpn U7 antisentido), que comprende la siguiente secuencia:

SEQ ID NO 27: ACACACTAGAGTTGTCTGGTGGAGCCCGCATCA

Un ácido nucleico antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. En particular, las moléculas de ARN antisentido suelen tener una longitud de 15 a 50 nucleótidos. Se puede construir un ácido nucleico antisentido para su uso en la invención utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Particularmente, el ARN antisentido puede ser sintetizado químicamente, producido por transcripción in vitro a partir de moldes (p. ej., vectores virales o no virales) lineales (p. ej., productos de PCR) o circulares, o producidos por transcripción in vivo de vectores virales o no virales. El ácido nucleico antisentido se puede modificar para que tenga una mayor estabilidad, resistencia a nucleasas, especificidad de la diana y unas propiedades farmacológicas mejoradas. Por ejemplo, el ácido nucleico antisentido puede incluir nucleótidos modificados o/y una cadena principal diseñada para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y efectores.

En el contexto de la invención, las "ribozimas" son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de hebra sencilla, tal como un ARNm, con el que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas se pueden utilizar para escindir catalíticamente los transcritos de ARNm para inhibir de ese modo la traducción de la proteína codificada por el ARNm. Las moléculas de ribozima específicas para Dinamina 2 funcional se pueden diseñar, producir y administrar mediante métodos comúnmente conocidos en la técnica (véase, p. ej., Fanning y Symonds (2006) RNA Towards Medicine (Handbook of Experimental Pharmacology), ed. Springer pág. 289-303).

La edición del genoma también se puede utilizar como una herramienta según la invención. La edición del genoma es un tipo de ingeniería genética en la que el ADN se inserta, reemplaza o elimina de un genoma utilizando nucleasas diseñadas artificialmente o "tijeras moleculares". Las nucleasas crean rupturas de la doble hebra específicas (DSB) en las ubicaciones deseadas del genoma y aprovechan los mecanismos endógenos de la célula para reparar la ruptura inducida mediante procesos naturales de recombinación homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ). Actualmente se utilizan cuatro familias de nucleasas modificadas mediante ingeniería genética: nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas (más específicamente el sistema Cas9, como describen P. Mali et al., en Nature Methods, vol.

10 Núm. 10, octubre de 2013), o endonucleasas de asentamiento remodeladas mediante ingeniería genética a meganucleasas modificadas genéticamente. Dichas nucleasas se pueden suministrar a las células en forma de ADN o ARNm, tales ADN o ARNm se modifican mediante ingeniería genética para dirigirse al gen DNM2, de acuerdo con la invención. Según una realización, el inhibidor de Dinamina 2 es un ADN o ARNm modificado mediante ingeniería genética para dirigirse al gen DNM2 y para suministrar nucleasas utilizando la terapia de edición del genoma o es una nucleasa modificada mediante ingeniería genética para dirigirse al DNM2 utilizando la terapia de edición del genoma.

Los nucleótidos definidos anteriormente utilizados de acuerdo con la invención se pueden administrar en forma de precursores de ADN o moléculas que los codifican.

Para su uso in vivo, los nucleótidos de la invención se pueden estabilizar mediante modificaciones químicas, tales como modificaciones de la cadena principal de fosfato (p. ej., enlaces fosforotioato). Los nucleótidos de la invención se pueden administrar en forma libre (desnudos) o mediante el uso de sistemas de suministro que mejoran la estabilidad y/o el direccionamiento, por ejemplo, liposomas, o se pueden incorporar a otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, microesferas bioadhesivas, o vectores proteináceos, o combinados con un péptido catiónico. También se pueden acoplar a un péptido penetrante de células biomiméticas. También se pueden administrar en forma de sus precursores o ADN codificantes. Las versiones estabilizadas químicamente de los nucleótidos también incluyen "Morfolinos" (oligómeros de fosforodiamidato-morfolino - PMO), oligómeros 2'-O-Metilo, PMO etiquetado con péptido AcHN-(RXRRBR) 2XB (R, arginina, X, ácido 6-aminohexanoico y B, ®-alanina) (PPMO), triciclo-ADN o ARN pequeño nuclear (pn). Las últimas formas de nucleótidos que se pueden utilizar con este fin son pequeñas moléculas de ARN nuclear que incluyen U1, U2, U4, U4atac, U5, U7, U11 y U12 (u otros UsnRNPs), preferiblemente U7snRNA (como se identificó anteriormente para SEQ ID NO 26 y 27, en particular combinado con un método de transferencia viral basado en, pero sin limitarse a, lentivirus, retrovirus, adenovirus o virus adenoasociados. Todos estos mecanismos son bien conocidos en la técnica.

La molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2 de la invención se puede suministrar in vivo sola o asociada con un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del nucleótido a las células y preferiblemente a las células que expresan DNM2. Preferiblemente, el vector transporta el nucleótido a las células con menor degradación con respecto al grado de degradación que daría como resultado la ausencia del vector. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus y otros vehículos derivados de fuentes virales o bacterianas que han sido manipulados mediante la inserción o incorporación de los nucleótidos de la invención. Los vectores virales son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: lentivirus tales como VIH-1, retrovirus, tales como virus de leucemia murina de Moloney, adenovirus, virus adenoasociado; virus de tipo SV40; virus del herpes tal como HSV-1 y virus vaccinia. Se pueden utilizar fácilmente otros vectores que no se mencionan en la presente memoria pero que se conocen en la técnica. Entre los vectores que han sido validados para aplicaciones clínicas y que se pueden utilizar para suministrar los nucleótidos, los lentivirus, retrovirus y virus adenoasociados (AAV) muestran un mayor potencial para la estrategia de omisión de exón.

Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "anticuerpo" se refiera en sentido amplio a cualquier agente de unión inmunológico tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y anticuerpo humanizado o quimérico. En ciertas realizaciones, se prefieren IgG y/o IgM porque son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y se fabrican con mayor facilidad. El término "anticuerpo" se utiliza para hacer referencia a cualquier molécula similar a un anticuerpo que tenga una región de unión a antígeno e incluye fragmentos de anticuerpos tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único (DAB), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla) y similares. Los mecanismos para preparar y utilizar diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Harlow, E. y Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, ed., Cold Spring Harbor Laboratory).

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en el que la región marco constante y variable de una o más inmunoglobulinas humanas se fusiona con la región de unión, p. ej. la CDR, de una inmunoglobulina animal. Los anticuerpos "humanizados" contemplados en la presente invención son anticuerpos quiméricos de ratón, rata u otras especies, que portan dominios de región constante y/o variable humana, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos recombinantes y modificados mediante ingeniería genética y fragmentos de los mismos. Tales anticuerpos humanizados están diseñados para mantener la especificidad de unión del anticuerpo no humano del que se obtienen las regiones de unión, pero evitar una reacción inmunitaria contra el anticuerpo no humano.

Un anticuerpo "quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia de modo que el sitio de unión al antígeno (región variable) se conecte a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferentes o alteradas, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, p. ej., una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia por una región variable que tiene una especificidad antigénica diferente o alterada.

Los anticuerpos dirigidos contra Dinamina 2 están disponibles comercialmente, tales como los anticuerpos comercializados o fabricados por Novus Biologicals: números de catálogo: Dynamin 2 Antibody NB300-617, Dynamin 2 Antibody NBP2-16244, Dynamin 2 Antibody (6C9) H00001785-M01, por Santa Cruz Biotechnology: número de catálogo: sc-81150, sc-6400, sc-166525, sc-166669, sc-166526, por BD-Biosciences: anti-DNM2 (ab de ratón, 610264), o por IGBMC-Illkirch: anti-DNM2: R2679, R2680, R2865, R2866, R2640 o R2641.

En otra realización particular, el inhibidor de Dinamina 2 es una molécula pequeña que inhibe la actividad o función enzimática de Dinamina 2.

Como se emplea en la presente memoria, el término "molécula pequeña que inhibe la actividad, expresión o función de Dinamina 2" se refiere a una molécula pequeña que puede ser un compuesto orgánico o inorgánico, generalmente de menos de 1000 daltons, con la capacidad de inhibir o reducir la actividad, expresión o función de Dinamina 2. Esta molécula pequeña se puede obtener de cualquier organismo conocido (incluidos, entre otros, animales, plantas, bacterias, hongos y virus) o de una biblioteca de moléculas sintéticas. Las moléculas pequeñas que inhiben la actividad, expresión o función de Dinamina 2 se pueden identificar con el método descrito en la presente memoria.

Los inhibidores de dinamina son descritos por Harper CB et al., Trends Cell Biol. febrero de 2013; 23(2):90-101. Revisión. La molécula pequeña de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en:

- Dynasore (un compuesto de semicarbazona no competitivo, permeable a las células, inhibidor de Dinamina 1 y Dinamina 2. - Núm. CAS 304448-55-3), su nombre químico es (3,4-dihidroxibenciliden)hidrazida del ácido 3-hidroxinaftalen-2-carboxílico,

- Hydroxy-Dynasore (un inhibidor muy potente de dinamina 2 (CI⁵⁰= 2,6 pM)) (Hydroxy-Dynasore es un análogo hidroxilado permeable a las células de Dynamin Inhibitor, Dynasore - Núm. CAS 1256493-34-1), su nombre químico es 3-hidroxi-N'-[(2,4,5-trihidroxifenil)metiliden]naftaleno-2-carbohidrazida,

- Bromuro de tetradeciltrimetilamonio (Núm. CAS 1119-97-7), comercializado bajo el nombre MiTMAB™ (ab120466) por Abcam (un inhibidor de dinamina 1 y dinamina 2 permeable a las células (CI50 = 8,4 pM para la inhibición de dinamina II). Se dirige al dominio de homología de pleckstrina (PH) (unión a lípidos). Inhibe la endocitosis de vesículas sinápticas y mediada por receptores (valores de CI502,2 pM),

- Phthaladyn-23 (un compuesto de ftalimida permeable a las células que se ha informado que inhibe la actividad GTPasa de Dinamina 2 (CI⁵⁰= 63 pM)), el nombre químico de Phthaladyn-23 es Ácido 4-cloro-2-((2-(3-nitrofenil)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-carbonilo)-amino)-benzoico,

- Dynole 34-2, es un inhibidor V de Dinamina (scbt.com) y actúa sobre la actividad GTPasa, no competitivo para GTP, el nombre químico de Dynole 34-2 es 2-Ciano-n-octil-3-[1-(3-dimetilaminopropil)-1H-indol-3-il]acrilamida, - M-divi 1 (inhibidor de la división mitocondrial, CI50 = 10pM) (scbt.com), el nombre químico de M-divi-1 es 3-(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)-2-sulfanilquinazolin-4(3H)-ona,

- Iminodyn-22/17 (scbt.com) (Iminodyn 22: CI⁵⁰= 390 nM que actúa sobre un sitio alostérico de GTPasa y muestra antagonismo no competitivo con respecto a GTP), el nombre químico de Iminodyn 22 es N,N'-(Propano-1,3-diil)bis(7,8-dihidroxi-2-imino-2H-cromeno-3-carboxamida), el nombre químico de Iminodyn 17 es N,N'-(Etano-1,2diil)bis(7,8-dihidroxi-2-imino-2H-cromeno-3-carboxamida).

- OcTMAB, es decir, Bromuro de OctadecilTriMetilAmonio, (abcam.com), se dirige al dominio PH,

- Péptido inhibidor de dinamina (Tocris Biosciences 1774): con secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 28: QVPSRPNRAP,

- Dyngo-4a (CI50 -2,5 qM), actúa sobre un sitio alostérico de GTPasa, el nombre químico de Dyngo-4a es 3-Hidroxi-W'-[(2,4,5-trihidroxifenil)metiliden]naftalen-2-carbohidrazida,

- RTIL-13 (CI50 -2,3 qM), es un armazón de norcantaridina dirigido al dominio PH, el nombre químico de RTIL-13 es Bromuro de 4-(N,N-dimetil-N-octadecil-N-etil)-4-aza-10-oxatriciclo-[5,2,1]decano-3,5-diona.

Usos de los inhibidores de Dinamina 2

La invención se refiere a un inhibidor de Dinamina 2 como se describe en la presente memoria para su uso en el tratamiento de la DMD.

Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho inhibidor de Dinamina 2 y un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de la DMD.

En una realización particular de la invención, la distrofia muscular de Duchenne (DMD) se puede tratar aumentando la fuerza muscular de los pacientes con DMD y/o mejorando la resistencia de los músculos a la lesión inducida por contracción.

Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiera a una cantidad de agente terapéutico, administrada a un paciente, que es suficiente para constituir un tratamiento de la DMD. En una realización particular, la cantidad terapéuticamente eficaz que se debe a administrar es una cantidad suficiente para reducir la expresión, actividad o función de Dinamina 2 en un nivel igual o menor que el nivel normal. El nivel normal es la expresión, actividad o función de Dinamina 2 de sujetos que no presentan DMD. La cantidad de inhibidor de Dinamina 2 que se debe administrar se puede determinar mediante un procedimiento convencional bien conocido por los expertos en la técnica. Los datos fisiológicos del paciente (p. ej., edad, tamaño y peso), las vías de administración y la enfermedad que se vaya a tratar se deben tener en cuenta para determinar la dosificación adecuada, opcionalmente comparada con sujetos que no presentan DMD. Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad de inhibidor de Dinamina 2 o de un vector que contiene o expresa el ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de Dinamina 2 que se vaya a administrar será una cantidad que sea suficiente para inducir la mejora de los síntomas de DMD no deseados o para inducir alivio de uno o más síntomas o características de la DMD. El alivio de uno o más síntomas o características se puede evaluar mediante cualquiera de los siguientes ensayos en una célula miogénica o una célula muscular de un paciente: reducción de la absorción de calcio por las células musculares, disminución de la síntesis de colágeno, alteración de la morfología, alteración de la biosíntesis de lípidos, disminución del estrés oxidativo y/o función, integridad y/o supervivencia mejoradas de las fibras musculares. Estos parámetros generalmente se evalúan mediante análisis de inmunofluorescencia y/o histoquímicos de secciones transversales de biopsias musculares. El alivio de uno o más síntomas o características también se puede evaluar mediante cualquiera de los siguientes ensayos en el propio paciente: prolongación del tiempo hasta la pérdida de la capacidad para caminar, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad para levantar peso, mejora del tiempo empleado para levantarse del suelo, mejora en el tiempo de capacidad para caminar de nueve metros o marcha de 6 minutos, mejora en el tiempo necesario para subir cuatro escalones, mejora del grado de función de la pierna, mejora de la función pulmonar, mejora de la función cardíaca, mejora de la calidad de vida. El experto en la técnica conoce cada uno de estos ensayos. Para cada uno de estos ensayos, tan pronto como se haya encontrado una mejora o prolongación detectable de un parámetro medido en un ensayo, significará preferiblemente que uno o más síntomas de la distrofia muscular de Duchenne se han aliviado en un individuo utilizando el método de la invención. La mejora o prolongación detectable son preferiblemente una mejora o prolongación estadísticamente significativa como describen Hodgetts et al (Hodgetts S., et al, (2006), en Neuromuscular Disorders, 16:591-602.2006). Alternativamente, el alivio de uno o más síntomas de la distrofia muscular de Duchenne se puede evaluar midiendo una mejora de la función, integridad y/o supervivencia de las fibras musculares como se define más adelante en la presente memoria. La mejora de la función, integridad y/o supervivencia de las fibras musculares se puede evaluar utilizando al menos uno de los siguientes ensayos: una disminución detectable de la creatina quinasa en sangre, una disminución detectable de la necrosis de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico, y/o un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico. El experto en la técnica conoce cada uno de estos ensayos. La cantidad de inhibidor de Dinamina 2 o de un vector que contiene o expresa el ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2 puede variar, entre otros, dependiendo de factores tales como el tipo de inhibidores de dinamina 2 seleccionados, el sexo, la edad, el peso, la condición física general del paciente, etc. y se puede determinar caso por caso. La cantidad también puede variar según otros componentes de un protocolo de tratamiento (p. ej., administración de otros medicamentos, etc.). Generalmente, cuando el inhibidor de Dinamina 2 es un ácido nucleico, una dosis adecuada está en el intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, y más habitualmente de aproximadamente 2 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg. Si se elige un suministro del ácido nucleico basada en virus, las dosis adecuadas dependerán de diferentes factores, tales como el virus que se emplee, la vía de suministro (intramuscular, intravenosa, intraarterial u otra), pero normalmente puede oscilar entre 10-9 a 10-15 partículas virales/kg. Si el inhibidor es una molécula pequeña que inhibe la actividad, expresión o función de Dinamina 2, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 2 a 300 mg/kg de peso corporal, particularmente de 5 a 100 mg/kg de peso corporal. Si el inhibidor es un anticuerpo, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, particularmente de 4 a 10 mg/kg de peso corporal. Los expertos en la técnica reconocerán que tales parámetros normalmente se determinan durante los ensayos clínicos. Adicionalmente, los expertos en la técnica reconocerán que, aunque los síntomas de la enfermedad pueden aliviarse completamente con los tratamientos descritos en la presente memoria, no es necesario que este sea el caso. Incluso un alivio parcial o intermitente de los síntomas puede tener gran beneficio para el receptor. Además, el tratamiento del paciente puede ser un solo evento, o al paciente se le administra el inhibidor de Dinamina 2 en múltiples ocasiones, que pueden ser, dependiendo de los resultados obtenidos, con varios días de diferencia, con varias semanas de diferencia o con varios meses de diferencia o incluso con varios años de diferencia. Un tratamiento en un método de acuerdo con la invención puede tener una duración de al menos una semana, al menos un mes, al menos varios meses, al menos un año, al menos 2, 3, 4, 5, 6 años o más. La frecuencia de administración puede oscilar entre al menos una vez en dos semanas, o tres semanas o cuatro semanas o cinco semanas o un período de tiempo más largo.

Cada inhibidor de Dinamina 2 como se define en la presente memoria para su uso de acuerdo con la invención puede ser adecuado para la administración directa a una célula, tejido y/o órgano en vivo de individuos afectados o en riesgo de desarrollar DMD y se puede administrar directamente in vivo, ex vivo o in vitro. Un oligonucleótido como se emplea en la presente memoria se puede administrar directa o indirectamente a una célula, tejido y/o órgano in vivo de un individuo afectado o en riesgo de desarrollar DMD, y se puede administrar directa o indirectamente in vivo, ex vivo o in vitro. Puesto que la distrofia muscular de Duchenne tiene un fenotipo pronunciado en las células musculares, se prefiere que dichas células sean células musculares, adicionalmente se prefiere que dicho tejido sea un tejido muscular y/o adicionalmente se prefiere que dicho órgano comprenda o consista en un tejido muscular. Un órgano preferido es el corazón. Preferiblemente, dichas células son células de un individuo que padece DMD.

Un inhibidor de Dinamina 2 como se define en la presente memoria se puede suministrar tal cual a una célula. Cuando se administra dicho inhibidor a un individuo, se prefiere que esté disuelto en una solución que sea compatible con el método de suministro. Para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular, se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. Particularmente preferido para un método de la invención es el uso de un excipiente que mejorará adicionalmente el suministro de dicho inhibidor como se define en la presente memoria, a una célula y al interior de una célula, preferiblemente una célula muscular.

La composición farmacéutica de la invención se formula de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (véanse, p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) conocido por un experto en la técnica. Preferiblemente, el inhibidor de Dinamina 2 como se define en la presente memoria se disuelve en una solución que es compatible con el método de suministro. Para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular, se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica.

Más generalmente, las posibles composiciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, mucosa, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual) o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial e intradérmica). Para estas formulaciones, se puede utilizar un excipiente convencional de acuerdo con mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Más particularmente, para proporcionar un efecto terapéutico localizado, se prefieren vías de administración muscular específicas. En particular, se prefiere la administración intramuscular.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden formular para liberar el fármaco activo sustancialmente inmediatamente después de la administración o en cualquier momento o período de tiempo predeterminado después de la administración.

En el contexto de la invención, el término tratamiento denota tratamiento curativo, sintomático y preventivo. Como se emplea en la presente memoria, el término "tratamiento" de una enfermedad se refiere a cualquier acto destinado a prolongar la vida útil de los sujetos (o pacientes), tal como la terapia y el retraso de la progresión de la enfermedad. El tratamiento se puede diseñar para erradicar la enfermedad, detener la progresión de la enfermedad y/o promover la regresión de la enfermedad. El término "tratamiento" de una enfermedad también se refiere a cualquier acto destinado a disminuir los síntomas asociados con la enfermedad, tales como hipotonía y debilidad muscular. La prolongación del tiempo hasta la pérdida de la capacidad para caminar, la mejora de la fuerza muscular, la mejora de la capacidad para levantar peso, la mejora del tiempo necesario para levantarse del suelo, la mejora del tiempo de marcha de 6 minutos o de la capacidad para caminar nueve metros, la mejora del tiempo empleado para subir cuatro escalones, la mejora del grado de función de la pierna, la mejora de la función pulmonar, la mejora de la función cardíaca o la mejora de la calidad de vida de los sujetos (o pacientes) también están dentro de la definición del término "tratamiento". Más específicamente, el tratamiento según la invención está destinado a retrasar la aparición de los fenotipos o síntomas de DMD, mejorar el comportamiento motor y/o muscular y/o la esperanza de vida, en particular mejorando la fuerza muscular y/o la resistencia a la lesión muscular inducida por contracción.

El sujeto (o paciente) que se va a tratar es cualquier mamífero, preferiblemente un ser humano. Preferiblemente, el sujeto es un paciente humano, sea cual sea su edad o sexo. Los recién nacidos, los bebés y los niños también están incluidos. Más preferiblemente, el paciente o sujeto según la invención es un paciente con Duchenne o se sospecha que es un paciente con Duchenne (un paciente susceptible de desarrollar DMD debido a sus antecedentes genéticos).

Escrutinio de inhibidores de Dinamina 2

La presente invención también se refiere a un método para identificar o escrutar moléculas útiles en el tratamiento de la DMD, basado en la capacidad de tales moléculas para inhibir la expresión, actividad y/o función de la Dinamina 2. Dicho método de escrutinio comprende las etapas de:

a) proporcionar u obtener un compuesto candidato; y

b) determinar si dicho compuesto candidato inhibe la actividad, función y/o expresión de la Dinamina 2, c) en donde la capacidad de dicho compuesto candidato para inhibir la expresión, función o actividad de dicho compuesto candidadto de la Dinamina 2 es indicativa de la utilidad de dicho compuesto candidato para el tratamiento de la DMD.

El compuesto candidato que se va a someter a prueba en el marco de este método puede ser de cualquier naturaleza molecular, por ejemplo, puede corresponder a una molécula química (preferiblemente una molécula pequeña), un anticuerpo, un péptido, un polipéptido, un aptámero, un ARNip, un ARNhc, un ARNpn, un oligonucleótido efector o antisentido, una ribozima o una endonucleasa dirigida.

La capacidad de dicho compuesto candidato para inhibir la expresión, actividad o función de la Dinamina 2 se puede someter a prueba utilizando cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como los identificados anteriormente o descritos en los ejemplos.

El método para escrutar o identificar una molécula adecuada para el tratamiento de la DMD puede comprender opcionalmente adicionalmente la etapa de administrar in vivo o in vitro la molécula seleccionada en un modelo animal no humano de DMD o una porción del mismo (tejido o células, tales como tejido o células musculares) y analizar el efecto sobre el inicio o la progresión de la miopatía.

Como modelos animales no humanos de DMD, se pueden citar los ratones mdx con deficiencia de distrofina. Los ratones mdx con deficiencia de distrofina son un modelo clásico utilizado para la investigación médica sobre la distrofia muscular de Duchenne, que se descubrió por primera vez hace 30 años (Bulfield, G., W. G. Siller, P. A. Wight y K. J. Moore (1984). "X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse." Proc Natl Acad Sci USA 81(4): 1189-1192). Los ratones mdx tienen una mutación espontánea que da como resultado un codón de parada prematuro en el exón 23 del gen de la distrofina y una pérdida total de la expresión de la proteína. El modelo de ratón mdx se ha utilizado ampliamente para la investigación de la fisiopatología de la DMD y para probar terapias potenciales en enfoques preclínicos (Manning, J. y D. O'Malley (2015). "What has the mdx mouse model of duchenne muscular dystrophy contributed to our understanding of this disease?" J Muscle Res Cell Motil). Este modelo de ratones se utilizó en los siguientes ejemplos.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales:

Experimentos con animales. Los animales se alojaron en una sala con temperatura controlada (19-22°C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas. Cuando fue necesario, los ratones fueron sacrificados humanamente mediante inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical, de acuerdo con las legislaciones nacionales y europeas sobre experimentación animal, y los músculos tibiales anteriores fueron disecados y congelados en isopentano enfriado con nitrógeno y nitrógeno líquido. La experimentación animal fue aprobada por el comité ético institucional Com'Eth IGBMC-ICS, y el Ministerio francés (número de aprobación Núm. 01594.01).

Cría de ratones: Se obtuvieron ratones mdx, un modelo de ratón de aparición espontánea para DMD que no expresa distrofina y presenta un fenotipo distrófico leve, mediante la reproducción de machos Homocigotos para Dmdmdx y hembras Homocigotas para Dmdmdx de Charles River Laboratories. Se criaron ratones mdx con ratones Dnm2+/- para regular por disminución genéticamente DNM2. Los ratones Dnm2+/- fueron generados y caracterizados por el laboratorio anfitrión, como se describió anteriormente (Cowling, B. S., T. Chevremont, I. Prokic, C. Kretz, A. Ferry, C. Coirault, O. Koutsopoulos, V. Laugel, N. B. Romero y J. Laporte (2014). "Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy." J Clin Invest 124(3): 1350-1363).

Fuerza muscular in situ: La fuerza muscular máxima del tibial anterior se midió in situ en ratones mdx/y y mdx/y Dnm2+/- a las 6 semanas, 3 meses y un año de edad, utilizando el sistema de prueba de ratón completo (Aurora 1300A). Se estimuló el nervio ciático y se midió la fuerza total producida por la contracción del músculo tibial anterior, como se describió anteriormente (Cowling et al. 2014). La fuerza muscular específica se calculó como una razón de la fuerza muscular máxima con respecto a la masa muscular.

Lesión muscular inducida por contracción: La susceptibilidad a la lesión muscular inducida por contracción se midió utilizando el sistema de prueba de ratón completo (Aurora 1300A) al año de edad, como se describió anteriormente (Hourde et al. 2013). Se midió la disminución de la fuerza muscular absoluta resultante de varias contracciones en elongación que inducen daños. Inicialmente se estimuló el nervio ciático (700 milisegundos, frecuencia 150 Hz), y se midió la fuerza muscular isométrica producida, seguida de 8 contracciones en elongación (+ 10% de longitud), en las que se midió la fuerza muscular isométrica (a la longitud inicial) después cada contracción. La fuerza se representa como un porcentaje de la fuerza inicial producida. Los datos se representan como el porcentaje de la fuerza inicial, después de 2, 5 y 8 contracciones en elongación. Después de las mediciones contráctiles, los animales se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital y se pesaron los músculos tibiales anteriores.

Resultados:

La mejora fisiológica en la función muscular se evaluó mediante la medición de la fuerza muscular específica del músculo tibial anterior, in situ. Cuando se estimuló el nervio ciático, se midió la fuerza muscular absoluta. A continuación, se calculó la fuerza muscular específica como una razón de la fuerza muscular total en comparación con la masa de fibras musculares. En ratones mdx/y con expresión reducida de DNM2 (mdx/yDnm2+/-), la fuerza muscular específica aumentó a las 6 semanas y a los 3 meses de edad, en comparación con el control ratones mdx/y (Figura 1).

Con el fin de confirmar la relevancia fisiológica de esta mejora en la fuerza muscular. De manera similar a los pacientes con distrofia muscular de Duchenne (DMD), los músculos esqueléticos de los ratones mdx/y carecen de distrofina y se sabe que son más susceptibles a las lesiones inducidas por contracciones que los controles sanos. Por lo tanto, los ratones fueron sometidos a contracciones musculares en elongación que inducen daño a las fibras musculares, para analizar la susceptibilidad de los músculos distróficos mdx al daño, cuando se reduce la expresión de DNM2.

Se realizaron 8 contracciones en elongación, induciendo daño en las fibras musculares, y se midió la fuerza muscular máxima después de cada contracción. En gran medida, los ratones mdx/y Dnm2+/- mostraron un aumento de 2 veces en la resistencia a la lesión inducida por contracción, en comparación con los ratones mdx/y (figura 2). Por lo tanto, la reducción de DNM2 mejora la resistencia de los músculos mdx a la lesión inducida por contracción.

Conclusiones:

La reducción de la expresión de DNM2 tiene, por tanto, potencial terapéutico en la distrofia muscular de Duchenne. De hecho, se demostró una mejora significativa en la fuerza muscular específica a varias edades al reducir DNM2 en ratones mdx, que son el modelo de ratón clásico utilizado para la investigación preclínica de DMD. Además, se observa una mejora del doble en la resistencia a la lesión muscular inducida por la contracción, lo que confirma la importancia fisiológica de este hallazgo. Por lo tanto, la reducción de DNM2 es una nueva diana terapéutica para la distrofia muscular de Duchenne.

Ejemplo 2

Materiales y métodos:

Producción y purificación de AAV:

Se generaron vectores AAV2/9 mediante una transfección triple de la línea celular AAV-293 con el inserto pAAV2 que contenía el inserto bajo el control del promotor de CMV y flanqueado por repeticiones terminales invertidas del serotipo 2, pXR1 que contenía los genes rep y cap del serotipo 9 de AAV, y pHelper que codificaba las funciones auxiliares de adenovirus. Los productos lisados celulares se sometieron a 3 ciclos de congelación/descongelación, a continuación se trataron con 50 U/ml de Benzonase (Sigma) durante 30 minutos a 37°C y se clarificaron mediante centrifugación. Los vectores virales se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de Iodixanol seguido de diálisis y concentración contra solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco utilizando filtros centrífugos (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices 30K, Millipore, Bedford). Las partículas físicas se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando un plásmido patrón pAAV-eGFP, y los títulos se expresaron como genomas virales por mililitro (gv/mL). Los títulos de rAAV utilizados en estos experimentos fueron de 5 a 7 x 1011 gv/mL.

Transducción con AAV de músculos tibiales anteriores (T.A) mdx-/y de ratones:

Se anestesiaron ratones macho, mdx-/y de 3 semanas de edad mediante inyección i.p. de 5 gl/g de ketamina (20 mg/ml; Virbac, Carros, Francia) y xilacina (0,4%, Rompun; Bayer, Wuppertal, Alemania). Se realizó una inyección intramuscular de ARNhc de AAV2/9 dirigido a DNM2 (color negro) o una secuencia de control desorganizada de AAV2/9 (color blanco) en el tibial anterior de ratones mdx-/y a las 3 semanas de edad. Los animales se alojaron en una sala con temperatura controlada (19°C a 22°C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas.

La cría de ratones fue como la descrita en el ejemplo 1.

Resultados:

Fuerza muscular después de una lesión muscular inducida por contracción, en ratones mdx con DNM2 reducida. Se analizó la fuerza muscular de los ratones mdx-/y y mdx-/yDnm2 /-. La fuerza muscular específica (sPo) se midió inicialmente en el músculo tibial anterior de ratones mdx-/y (color blanco) y mdx-/yDnm2+/-(color negro) (véase la figura 3A). A continuación, el músculo tibial anterior se sometió a 9 contracciones en elongación. Los resultados de los ratones mdx-/y (línea de color negro continua) y mdx-/yDnm2+/-(línea de color negro discontinua) se muestran como un porcentaje de la fuerza inicial (%), después de 0, 3, 6 y 9 contracciones en elongación (véase la figura 3B). A ratones Mdx-/y de 3 semanas de edad se les inyectó ARNhc de AAV2/9 dirigido a DNM2 (color negro) o una secuencia de control desorganizadas de AAV2/9 (color blanco) en los músculos tibiales anteriores. Se midió la fuerza muscular específica (sPo) en el músculo tibial anterior a los 3 meses de edad (véase la figura 3C). A continuación, el músculo tibial anterior se sometió a 9 contracciones en elongación como en la figura 3B (véase la figura 3D), control de ARNhc de AAV (línea de color negro continua) y ARNhc de AAV DNM2 (línea de color negro discontinua).

Todos los ratones tenían 3 meses de edad a la edad de análisis. n = 7-10 ratones/grupo. Todos los gráficos representan la media e.t.m.

Los ratones mdx-/y con DNM2 reducida (línea negra discontinua) de las figuras 3B y 3D muestran una tendencia hacia la resistencia a la lesión inducida por contracción.

Conclusiones:

Se cruzaron ratones Mdx con ratones Dnm2+/- o se sometieron a inyección intramuscular de AAV que expresaba ARNhc dirigido a Dnm2 para reducir el nivel de DNM2. A los 3 meses de edad, aunque no hubo una diferencia significativa en la fuerza muscular específica entre los grupos, se observó una tendencia a una mayor resistencia a la lesión inducida por contracción para ambas técnicas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de Dinamina 2 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, seleccionado del grupo que consiste en:

- un anticuerpo dirigido contra la Dinamina 2,

- una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2,

- un ácido nucleico o una nucleasa diseñada para dirigirse al gen de DNM2 y suministrar nucleasas mediante la terapia de edición del genoma, y

- una molécula pequeña que inhibe la actividad, expresión o función de la Dinamina 2, seleccionándose dicha molécula pequeña del grupo que consiste en (3,4-dihidroxibenciliden)hidrazida del ácido 3-hidroxinaftalen-2- carboxílico, 3-Hidroxi-N'-[(2,4,5-trihidroxifenil)metiliden]naftaleno-2-carbohidrazida, bromuro de tetradeciltrimetilamonio, Ácido 4-cloro-2-((2-(3-nitrofenil)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1 H-isoindol-5-carbonil)-amino)-benzoico, 2-Ciano-n-octil-3-[1 -(3-dimetilaminopropil)-1 H-indol-3-il]acrilamida, 3-(2,4-Dicloro-5-metoxifenil)-2-sulfanilquinazolin-4(3H)-ona, N,N’- (Propano-1,3-diil)bis(7,8-dihidroxi-2-imino-2H-cromeno-3-carboxamida), N,N'-(Etano-1,2-diil)bis(7,8-dihidroxi-2-imino-2H-cromeno-3-carboxamida), Bromuro de OctadecilTriMetilAmonio, el péptido inhibidor de Dinamina de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, 3- Hidroxi-N'-[(2,4,5-trihidroxifenil)metiliden]naftaleno-2-carbohidrazida y Bromuro de 4-(N,N-dimetil-N-octadecil-N-etil)-4-aza-10-oxatriciclo-[5,2,1 ]decano-3,5-diona.

2. El inhibidor de Dinamina 2 para su uso según la reivindicación 1, en donde el inhibidor de dinamina 2 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra Dinamina 2, o una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2.

3. El inhibidor de Dinamina 2 para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de Dinamina 2 es un ARNi, un ácido nucleico antisentido o una ribozima que interfiere específicamente en la expresión de la Dinamina 2, preferiblemente el inhibidor de Dinamina 2 es un ARNip o ARNhc.

4. El inhibidor de Dinamina 2 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el inhibidor de Dinamina 2 es un nucleótido antisentido que induce la omisión de exón dentro de un pre-ARNm de Dinamina 2.

5. El inhibidor de Dinamina 2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el nucleótido antisentido está diseñado para inducir específicamente la omisión del exón 2 o del exón 8 de DNM2, y preferiblemente comprende o consiste en una de las siguientes secuencias:

U7-Ex2 (omisión del exón 2 de DNM2 diana), que comprende la siguiente secuencia:

SEQ ID NO 26: GTCACCCGGAGGCCTCTCATTCTGCAGCTC

U7-Ex8 (omisión del exón 8 de DNM2 diana), que comprende la siguiente secuencia:

SEQ ID NO 27: ACACACTAGAGTTGTCTGGTGGAGCCCGCATCA.

6. El inhibidor de Dinamina 2 para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el inhibidor de dinamina 2 es una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la Dinamina 2 que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID 2-25.

7. El inhibidor de Dinamina 2 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el inhibidor de dinamina 2 es un ADN, ARNm o una nucleasa diseñada para dirigirse al gen de DNM2 y para suministrar nucleasas utilizando terapia de edición del genoma.

8. El inhibidor de Dinamina 2 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el inhibidor se administra en una cantidad suficiente para reducir la expresión de la Dinamina 2 o la actividad, expresión o función de la Dinamina 2 a un nivel igual o preferiblemente menor que el nivel normal.

9. Un método para identificar o escrutar moléculas que inhiben la Dinamina 2 útil en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne, que comprende las etapas de:

a. proporcionar u obtener un compuesto candidato; y

b. determinar si dicho compuesto candidato inhibe la actividad, función y/o expresión de la Dinamina 2, c. en donde la capacidad de dicho compuesto candidato para inhibir la expresión, función o actividad de dicha Dinamina 2 indica la utilidad de dicho compuesto candidato en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.

10. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Dinamina 2 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador/excipiente farmacéuticamente aceptables para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne.