JP6700180B2 - 神経興奮性および運動行動を調節するための組成物および方法 - Google Patents
神経興奮性および運動行動を調節するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
(A)miR−128−2の欠損が、マウスにおいて活動亢進および早発性死亡を引き起こす。(左側パネル)60分オープンフィールドアッセイで全水平距離を測定することによって、運動活動を測定した(n=23および12)。(右側パネル)miR−128−2−/−マウスおよび同腹子対照の寿命を示す(n=20および46)。(B、C)miR−128欠損は、抗痙攣薬治療によって予防することができる致死的発作を引き起こす。
(B)22日の観察期間中のmiR−128−2−/−(黒色)またはCamk2a−cre;miR−128−2fl/flマウス(赤色)における自発強直間代発作エピソードの代表的表示。
(C)対照miR−128−2−/−(点線、Aに示される通り)またはバルプロ酸ナトリウム処理(赤色、n=11)miR−128−2−/−マウスの寿命を示す。
(D)生後ニューロンのmiR−128の欠損が、活動亢進および致死的てんかんを引き起こす。Camk2a−cre;miR−128−2fl/flマウス(n=21および25)および同腹子(n=8および47)の運動活動および生存率を示す。
(E)miR−128の異所性発現が、Camk2a−cre;miR−128−2fl/flマウスの自発運動亢進を正常化し、死亡を防ぐことを示す。Camk2a−cre;miR−128−2fl/fl;Rosa−miR−128(n=4、青色)および野生型マウス(n=10、灰色)の運動活動を示す。異所性miR−128発現の存在下(n=4、青色)または非存在下(n=9、黒色)でのCamk2a−cre;miR−128−2fl/flマウスの寿命を示す。
(F)D1−ニューロンのmiR−128欠損が、活動亢進および致死的てんかんを引き起こす。D1−ニューロン特異的miR−128欠損を有するマウスまたは対照マウスの運動活動(n=26および42)および寿命(n=16および28)を示す。エラーバーは平均値の標準誤差、ウェルチのt検定、非有意(ns)、*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001を示す。カプラン・マイヤーグラフは、突然変異体および同腹子対照マウスの生存曲線、***p≦0.001、対数順位検定を示す。
(A、B)miR−128がD1−ニューロン樹状突起興奮性および棘の数を調節する。
(A)シグナル活動電位を細胞体で産生させ、遠位カルシウムシグナルを細胞1個当たりの最大近位カルシウムシグナルで割ることによって、活動電位侵入を計算した(n=4個の細胞、11〜21個の軸/群)。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、***p≦0.001。
(B)対照および突然変異体D1−ニューロンの遠位樹状突起の代表的な最大強度投影像を示す。箱ひげ図は、集団棘密度(1群当たりn=10〜11個の細胞)を示す。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、エラーバーは、第90パーセンタイル間隔、*p≦0.05を示す。(C〜E)miR−128は、D1−ニューロンにおける運動反応、ERK2リン酸化、およびドーパミンD1受容体(Drd1)活性化を受けた即時型遺伝子(IEG)誘導を調節する。
(C)Drd1a−cre;miR−128−2fl/flおよび対照マウス(n=25および30)の運動活動をオープンフィールドチャンバーで評価した。生理食塩水および3mg/kg Drg1アゴニストSKF81297をそれぞれ10分および20分に腹腔内注射した。
(D)生理食塩水またはD1アゴニストSKF81297注射を受けたDrg1a−cre;miR−128−2fl/flおよび対照マウス(それぞれn=5)に由来する線条体溶解物のウエスタンブロット法によって、ERK2リン酸化を定量化した。棒グラフは、ホスホERK2と全ERK2の発現の比を示す。
(E)生理食塩水またはSKF81297で処理したDrd1a−TRAP;Drd1a−cre;miR−128−2fl/flおよび対照マウスから精製したD1−ニューロン特異的ポリリボソーム結合mRNAのqRT−PCR(それぞれn=5)によって、IEGおよびD1−ニューロン発現Darpp32遺伝子発現レベルを測定した。エラーバーは平均値の標準誤差、ウェルチのt検定、*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001を示す。
(A)Drg1a−cre;miR−128−2fl/flおよび同腹子対照マウスに、ビヒクルまたは12mg/kgのMEK1阻害剤SL327のいずれかを腹腔内注射した(n=5/群)。薬物注射30分後のERK2リン酸化のウエスタンブロット解析(左)およびビヒクルまたはSL327注射後の運動活動(右)を示す。二元配置分散分析、引き続いてボンフェローニポストテスト。エラーバーは、平均値の標準誤差、*p≦0.05、**p≦0.01、***p≦0.001を示す。
(B)miR−128の過剰発現が、ドーパミン枯渇線条体においてD1−ニューロン反応性亢進を抑制する。片側性6−OHDA損傷Camk2a−cre;Rosa−miR−128または対照マウス(n=11/群)におけるベースラインでのおよびコカイン(10mg/kg)またはD1−アゴニストSKF81297(5mg/kg)に反応した反対側回転の数を示す。エラーバーは平均値の標準誤差、ウェルチのt検定、**p≦0.01を示す。
(C)miR−128がマウスの化学的誘発発作に対する感受性を低下させる。痙攣誘発薬(pro−convulsive drug)カイニン酸(30mg/kg、p値=0.005)またはピクロトキシン(3mg/kg、p値=0.04)の腹腔内注射60分後に強直間代発作を示すCamk2a−cre;Rosa−miR−128または同腹子対照マウス(n=12/群)の数を示す。p値はフィッシャーの正確確率検定によって計算した。
(A)miR−128がマウス脳内に豊富にある。8週齢成体マウスの脳、骨格筋、心臓、腎臓、肺および肝臓から精製したRNAにおけるqRT−PCR(n=3)によって、miR−128の発現レベルを測定した。miR−128の発現レベルをsnoRNA135発現に正規化し、肝臓におけるそれぞれのmiRNA発現レベルに対する倍率増加として示した。脳対他の器官の比較のための、一元配置分散分析、引き続いてテューキーのポストテスト、p<0.01。
(B)生後脳発達がmiR−128発現レベルの増加を伴う。miR−128およびニューロン富化miR−124aの発現レベルを、胚発生の12日目(E12)、新生マウス(P0)または8週齢成体マウス(1齢群当たりn=3)のマウス胚に由来する脳におけるqRT−PCRによって測定した。miRNAの発現レベルをsnoRNA135発現に正規化し、E12胚性脳におけるそれぞれのmiRNA発現レベルに対する倍率増加として示した。
(C)miR−128が異なる脳領域中で発現している。成体マウスの示される脳領域中のmiR−128の発現を、(A)のように定量化し、脳幹中の平均miR−128発現に対して示した(n=3/領域)。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
(A、B)マウスの条件遺伝子不活性化のための(A)miR−128−1の生成(B)miR−128−2の生成。(左側パネル)miR−128遺伝子の遺伝子組換えおよび不活性化のための戦略を示す。miR−128保有遺伝子の両方のmiRNAヘアピンを含有する領域を、マウスES細胞のloxP部位と隣接させ、引き続いてmiR−128−1fl/flおよびmiR−128−2fl/flマウスの作成のための日常的手順を行った。マイクロRNAヘアピン、塗りつぶされた長方形;エクソン、空の長方形;loxP部位、黒色三角形。FRT配列(黒色円)が隣接したネオマイシン耐性遺伝子を、FLTリコンビナーゼを用いて標的化遺伝子座から除去した;DTA、ジフテリア毒素遺伝子;TK、チミジンキナーゼ遺伝子;LAH/SAH、相同性の長腕および短腕。(右側パネル)miR−128−1fl/flおよびmiR−128−2fl/flマウスをそれぞれCMV−creマウスと交配することによって、miR−128−1(miR−128−1−/−)またはmiR−128−2(miR−128−2−/−)欠損マウスを作成した。示されるDNAプローブ(黒色長方形)を用いるEcoRIもしくはSacIにより消化したマウス尾DNAのサザンブロット法、またはスキームに示されるプライマーを用いるPCR遺伝子型判定によって、組換えmiR−128−1およびmiR−128−2対立遺伝子を同定した。miR−128−1(それぞれn=7)またはmiR−128−2(n=5および3)遺伝子が欠損したマウスの線条体中のmiR−128の相対発現レベルを示す。
(C)miR−128−1遺伝子の不活性化は、マウスの運動活動にも生存にも影響を与えない。マウスの運動活動に対するmiR−128−1欠損の影響を、オープンフィールド分析を用いて測定した。オープンフィールドでの60分以内の(左側パネル)全移動水平距離(m)および(中央パネル)垂直立ち上がりエピソード数を示す(n=7および9)。(右側パネル)miR−128−1が欠損したマウス(n=6)およびそれぞれの野生型同腹子対照(n=22)の寿命を示す。
(D)miR−128−2遺伝子の不活性化がマウスの探索を増加させる。miR−128−2−/−および同腹子対照の垂直立ち上がりエピソードの数を示す(n=23および12)。エラーバーは平均値の標準誤差、*p≦0.05、**p≦0.01、ウェルチのt検定および対数順位検定を示す。
(A)生後Camk2a−ニューロンにおけるmiR−128欠損が探索を増加させる。Camk2a−creをmiR−128−2fl/flマウスと交配することによって、生後Camk2a−ニューロンにおけるmiR−128欠損を達成した。(左側パネル)棒グラフは、Camk2a−cre;miR−128−2fl/flマウスおよび対照同腹子(n=7および4)における相対miR−128発現レベルを示す。(右側パネル)Camk2a−cre;miR−128−2fl/flマウスおよび対照同腹子(n=21および8)によって行われた垂直立ち上がりエピソードの数を示す。
(B)D1−ニューロンにおけるmiR−128欠損が探索を増加させる。Drd1a−creをmiR−128−2fl/flマウスと交配することによって、D1−ニューロンにおけるmiR−128欠損を達成した。Drd1a−cre;miR−128−2fl/flマウスおよび対照同腹子(n=22および26)の相対線条体miR−128発現レベル(左側、それぞれn=3)および垂直立ち上がりエピソード(右側)を示す。
(C)D2−ニューロンにおけるmiR−128欠損がマウスの運動活動にも生存にも影響を与えない。A2A−creをmiR−128−2fl/flマウスと交配することによって、D2−ニューロンにおけるmiR−128欠損を達成した。A2A−cre;miR−128−2fl/flマウスおよびそれぞれの同腹子(n=7)の線条体miR−128発現レベル(左側、それぞれn=3)、水平運動活動および垂直立ち上がりエピソード(中央、n=9および7)ならびに生存期間(右側、n=8および7)を示す。エラーバーは平均値の標準誤差、*p≦0.05、**p≦0.01、ウェルチのt検定および対数順位検定を示す。
(A)miR−128の条件付き過剰発現を有するマウスを作成するための標的化戦略。前記のノックイン戦略を用いて、外因性miR−128−2遺伝子をES細胞の内因性Rosa26遺伝子座に挿入した。miR−128−2遺伝子(赤色長方形)を、floxed−STOP−ネオマイシンカセットによって強力なCAGGプロモーターから分離した。エクソン、灰色長方形。DTA、ジフテリア毒素遺伝子。示されるDNAプローブ(青色長方形)を用いるEcoPI消化DNA(右上)のサザンブロット解析、またはPCR遺伝子型判定(右下、スキームに示されるプライマー位置)によって、組換えROSA−Stopfl/fl−miR−128対立遺伝子(単純化のために今からRosa−miR−128と呼ぶ)を確認した。
(B)miR−128のニューロン特異的過剰発現を有するマウスにおける運動活動および探索の減少。(上部)Camk2a−creをRosa−miR−128マウスと交配することによって、miR−128の生後ニューロン特異的過剰発現を有するマウス(Camk2a−cre;Rosa−miR−128)を作成した。(左側)線条体におけるmiR−128発現レベルを上記のように(図4)qRT−PCRによって測定し(それぞれn=3)、野生型線条体における平均miR−128発現に対して示す。ウェルチのt検定。(中央および右側)Camk2a−cre;Rosa−miR−128マウス(n=21)および同腹子対照(野生型n=8、Camk2a−cre n=5、Rosa−miR−128 n=17)についての60分間にわたるオープンフィールドでの全水平距離および立ち上がり活動を示す。一元配置分散分析、引き続いてテューキーのポストテスト。
(C)Rosa26遺伝子座からのmiR−128の異所性発現が、Camk2a−cre;miR−128−2fl/flマウスにおけるmiR−128発現レベルを正常化する。(左側)Camk2a−cre;miR−128−2fl/flをRosa−miR−128マウスと交配することによって、miR−128−2の生後ニューロン特異的ノックアウトおよびRosa26遺伝子座からのmiR−128−2の異所性発現を有するマウス(Camk2a−cre;miR−128−2fl/fl;Rosa−miR−128)を作成した。(右側)Camk2a−cre;miR−128−2fl/fl;Rosa−miR−128マウス(n=4)の線条体におけるmiR−128発現をqRT−PCRによって測定し、データを同腹子対照(n=3)における平均発現に対して示す。ウェルチのt検定。エラーバーは、平均値の標準誤差、*p≦0.05、**p≦0.01を示す。
(A、左側)体性電流注入に対する対照(Drd−1a−TRAP;miR−128−2fl/fl、上部、黒色)およびmiR−128欠損(Drd1a−TRAP、Drd1a−cre;miR−128fl/fl、底部、赤色)D1−ニューロンの代表的なD1−ニューロン原型反応。D1−ニューロンを、eGFP−L10発現によって同定し、電圧トレースは−100、−50、+100、+190および+250pAに応じたものである。(A、右側)体性電流注入に対するD1−ニューロン特徴的平均発火頻度を示す頻度−電流(F−I)プロット。野生型(黒色、n=6)D1ニューロンと突然変異(赤色、n=7)D1−ニューロンとの間に差は観察されなかった。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、p>0.05。
(B)miR−128がD1−ニューロン中の機能的棘の数を制御する。連続的な隣接棘頭に対するグルタミン酸の二光子アンケージングによって、対照とmiR−128欠損D1−ニューロン(n=5〜6個の細胞、1群当たり40〜48本の棘、左側)の体性EPSCを生成する同様の成功率が明らかになり、(図3B)中の棘密度の増加が機能的グルタミン酸受容体を有する棘の数の増加となることを示唆している。グルタミン酸アンケージング誘導性体性EPSC振幅は両群で類似であった(右側)。
(A)Camk2a−ニューロンにおけるmiR−128過剰発現が、マウスにおけるERK2リン酸化を抑制する。トランスジェニックCamk2a−cre;Rosa−miR−128突然変異体および対照マウス(それぞれn=4)の線条体中のERK2リン酸化レベルを、ウエスタンブロット法によって定量化し、全ERK2発現に正規化し、平均対照レベルに対して示した。代表的なブロットを示す。ウェルチのt検定、*p≦0.05。
(B)miR−128過剰発現が、マウスにおける化学的誘発反応亢進運動行動を減弱する。このスキームは、片側性6−OHDA誘発損傷を有する野生型マウスの標準的な回転反応を示している。6−OHDAおよびビヒクルをそれぞれ左線条体および右線条体に注射し、コカイン(ドーパミン作動性末端での内因性ドーパミン取り込みを阻害し、それによってシナプスドーパミンレベルを増加させる)またはDrd1−アゴニストSKF81297(ドーパミンD1受容体(Drd1)の特異的活性化)のいずれかに対する回転反応を3週間の回復期間後に評価する。コカイン注射は、機能的ドーパミン作動性末端をまだ含有する非損傷反対側線条体の強力な活性化による同側性(損傷側に向けた)回転を誘発する。Drd1−アゴニストSKF81297の注射は、損傷同側性線条体におけるドーパミン枯渇後のDrd1活性化に対するD1−ニューロンの異常な過敏性による反対側回転(損傷部位から離れる)を誘発する。
1.M.He et al.,Neuron 73,35(Jan 12,2012).2.N.Y.Shao et al.,BMC genomics 11,409(2010).3.E.A.Miska et al.,Genome biology 5,R68(2004).4.A.M.Krichevsky et al.,RNA 9,1274(Oct,2003).5.C.R.Gerfen.Annual review of neuroscience 15,285(1992).6.A.V.Kravitz et al.,Nature 466,622(Jul 29,2010).7.M.R.Fabian et al.Annual review of biochemistry 79,351(2010).8.A.Schaefer et al.,The Journal of experimental medicine 207,1843(Aug 30,2010).9.S.W.Chi.Nature 460,479(Jul 23,2009).10.D.P.Bartel,Cell 136,215(Jan 23,2009).11.M.Heiman et al.,Cell 135,738(Nov 14,2008).12.S.van Dongen et al.,Nature methods 5,1023(Dec,2008).13.A.Grimson et al.,Molecular cell 27,91(Jul 6,2007).14.J.G.Doench,Genes & development 18,504(Mar 1,2004).15.M.J.Brodie,Seizure:the journal of the British Epilepsy Association 19,650(Dec,2010).16.J.W.Ramos et al.,Molecular biology of the cell 11,2863(Sep,2000).17.A.Matsuda et al.,Oncogene 22,3307(May 22,2003).18.S.V.Rakhilin et al.,Science 306,698(Oct 22,2004).19.S.P.Megraw M et al.,Theor Chem Acc,593(2010).20.J.D.Sweatt,Current opinion in neurobiology 14,311(Jun,2004).
Claims (14)
- miR−128、化学的に安定化されたmiR−128、miR−128をコードする核酸、およびmiR−128をコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含み、miR−128が、ヌクレオチド配列:UCACAGUGAACCGGUCUCUUUを有する、てんかんを有する危険があるまたは有する疑いがある個体のてんかんまたはてんかん重積状態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物。
- miR−128、化学的に安定化されたmiR−128、miR−128をコードする核酸、およびmiR−128をコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含み、miR−128が、ヌクレオチド配列:UCACAGUGAACCGGUCUCUUUを有する、発作の危険があるまたは発作を有する個体の発作の発症もしくは発生の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、ここで、前記個体が、発作の発症を特徴とする脳関連障害を有するものとする、前記医薬組成物。
- miR−128、化学的に安定化されたmiR−128、miR−128をコードする核酸、およびmiR−128をコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤の治療上有効量を含み、miR−128が、ヌクレオチド配列:UCACAGUGAACCGGUCUCUUUを有する、てんかんを発症する危険がある個体のてんかんの発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物であって、ここで、前記個体が、前記個体のてんかんのリスクを増加させる脳損傷を以前に患っているものとする、前記医薬組成物。
- 前記個体が、Dravet症候群を有する疑いがあるまたはDravet症候群と診断されている、請求項1、2または3に記載の医薬組成物。
- くも膜下腔内または鼻腔内に投与するための、請求項1、2または3に記載の医薬組成物。
- 前記個体の中枢神経系に投与するための、請求項1、2または3に記載の医薬組成物。
- 海馬または皮質に投与するための、請求項1、2または3に記載の医薬組成物。
- 前記薬剤が、化学的に安定化されたmiR−128である、請求項1、2または3に記載の医薬組成物。
- 発作の発症を特徴とする前記脳関連障害が、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害からなる群から選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記脳損傷が脳卒中によって引き起こされる、請求項3に記載の医薬組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、miR−128、化学的に安定化されたmiR−128、miR−128をコードする核酸、およびmiR−128をコードするウイルスベクターからなる群から選択される薬剤を含み、miR−128が、ヌクレオチド配列:UCACAGUGAACCGGUCUCUUUを有する、発作を特徴とする神経病態の発症の治療またはその可能性の減少に使用するための医薬組成物。
- 前記薬剤が、化学的に安定化されたmiR−128、miR−128をコードする核酸およびmiR−128をコードするウイルスベクターである、請求項11に記載の医薬組成物。
- miR−128発現細胞を候補化合物と接触させることと、前記細胞によって発現されている前記miR−128の発現のレベルを測定することとを含む、発作を特徴とする病態の治療またはその可能性の減少に有用な化合物を同定する方法であって、ここで、前記候補化合物と接触していない細胞中のmiR−128の発現の基準レベルに対する前記miR−128の発現のレベルの増加が、前記候補化合物が発作を特徴とする病態の治療または予防に有用であることを示すものとし、miR−128が、ヌクレオチド配列:UCACAGUGAACCGGUCUCUUUを有する、前記方法。
- 発作を特徴とする前記病態が、てんかん、てんかん重積状態、脳卒中、低酸素症、外傷性脳損傷、感染症、腫瘍、神経変性障害、発作を引き起こす代謝および自己免疫障害を含む群から選択される、請求項13に記載の方法。
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