ES2831360T3 - Método de sellado de sustancia y método de detección de molécula diana - Google Patents

Método de sellado de sustancia y método de detección de molécula diana Download PDF

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Abstract

Un método para almacenar una sustancia seleccionada de entre perlas, ácidos nucleicos, proteínas, virus, células y complejos de lípido membrana en una pluralidad de receptáculos provistos sobre un sustrato y separados entre sí por una pared lateral, en donde una región que incluye los receptáculos del sustrato está abierta al exterior formando un pocillo abierto y en donde la pared lateral tiene una superficie superior hidrófoba, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) introducir a través de la región del pocillo abierto sobre el sustrato un disolvente hidrófilo que contiene la sustancia; y (ii) introducir a través de la región del pocillo abierto sobre el disolvente hidrófilo, un disolvente hidrófobo que tiene un peso específico mayor que el del disolvente hidrófilo de modo que el disolvente hidrófobo se estratifica sobre el disolvente hidrófilo, llevándose a cabo la etapa (ii) después de la etapa (i), en donde tras la etapa (ii), el disolvente hidrófobo desplaza hacia abajo el disolvente hidrófilo y el disolvente hidrófilo se estratifica sobre el disolvente hidrófobo, y en donde al menos uno de entre el disolvente hidrófilo y el disolvente hidrófilo contiene un tensioactivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de sellado de sustancia y método de detección de molécula diana
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a un método para sellar sustancias y detectar una molécula diana.
Estado de la técnica
Se conoce un ensayo de molécula única como método para llevar a cabo varios ensayos por observación de biomoléculas, como puedan ser proteínas y ácidos nucleicos, de tal manera que se identifican las biomoléculas individualmente. Para llevar a cabo el ensayo de molécula única, se conocen algunos métodos.
La bibliografía de patente 1 describe una microcámara para detectar actividad enzimática de una sola molécula. Dicha microcámara incluye una parte recipiente en la que se puede sellar una gotita de líquido y que tiene capacidad para almacenar una gotita de líquido de hasta 1000 fl (femtolitros). La parte de recipiente está hecha de un rebaje proporcionado en al menos uno de entre un primer miembro y un segundo miembro que están unidos entre sí. Según la bibliografía de patente 1, se lleva a cabo una reacción enzimática en la gotita de líquido. Con esta configuración, se puede llevar a cabo la reacción enzimática con una alta concentración de productos de reacción, incluso aunque el número de moléculas de los productos de reacción sea demasiado reducido. Por tanto, es posible detectar una actividad de una molécula de enzima.
La bibliografía de patente 2 y la bibliografía de patente 3 describen un detector y un método de detección.
La bibliografía de patente 4 y la bibliografía de patente 5 describen un método de sellado de perla, un método para la detección de molécula diana, una matriz, un equipo de reactivos y un dispositivo de detección de molécula diana. La bibliografía de patente 6 describe ensayos sándwich en gotitas.
La bibliografía de patente 7 describe sistemas microfluídicos y métodos para reducir el intercambio de moléculas entre gotitas.
La biografía no de patente 1 describe un método para llevar a cabo un ensayo de enzima de una sola molécula mediante el uso de una matriz en el que se cubre una gotita líquida con aceite, del orden de femtolitros, y accesible directamente desde el exterior. Esta matriz incluye un patrón de una región hidrófila hecha de una superficie hidrófila sobre la cual se proporciona una región hidrófoba que tiene una altura de 17 nm.
La bibliografía no de patente 2 describe un método para detectar una proteína mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) de una sola molécula. Según este método, se captura una cantidad muy reducida de proteínas mediante perlas diminutas cubiertas de anticuerpos específicos de la proteína y se marcan los complejos de las perlas y las proteínas con fluorescencia. A continuación, se introducen las perlas que incluyen los complejos en una cámara de reacción por fuerza centrífuga. A continuación, se hace el recuento del número de perlas que han capturado las proteínas. De esta manera, se determinan cuantitativamente las proteínas.
Cita de referencias
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patente 1 Publicación de solicitud de patente japonesa, Tokukai, No. 2004-309405 A Bibliografía de patente 2 Publicación de solicitud de patente europea, No. 2891886,
Bibliografía de patente 3 Publicación de solicitud de patente PCT No.2014/034781, Bibliografía de patente 4 Publicación de solicitud
Figure imgf000002_0001
patente europea No. 2685266, Bibliografía de patente 5 Publicación de solicitud patente PCT No.2012/121310, Bibliografía de patente 6 Publicación de solicitud
Figure imgf000002_0002
patente PCT No.2012/045012, Bibliografía de patente 7 Publicación de solicitud
Figure imgf000002_0003
patente PCT No.2011/079176.
Biografía no de patente
Biografía no de patente 1 S. Sakakihara et al., Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362
Biografía no de patente 2 David M Rissin et al., Nature Biotechnology: doi: 10,1038/nbt.1641
Objeto de la invención
El alcance de la invención se define con las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se salga fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
Problema técnico
A fin de detectar, p.ej., marcadores de una enfermedad de baja concentración para una detección temprana de enfermedades, enfermedades infecciosas y similares, existe la demanda del desarrollo de las técnicas de biodetección para que tengan una mayor sensibilidad. Por ejemplo, en un caso en el que un millón de células cancerosas incluidas en un tumor que tiene un volumen de 1 mm3 secretan proteínas marcadoras (100 moléculas por célula) en 5 litros de sangre, una concentración de proteínas en la sangre es aproximadamente 30 aM. Se necesita una técnica capaz de detectar moléculas diana a esa concentración tan baja.
Un posible método para detectar dichas moléculas diana puede ser el que sirve para detectar las moléculas diana a través del ensayo de enzima de una sola molécula que se ha mencionado anteriormente con sensibilidad a nivel de una sola molécula. Específicamente, dicho método se lleva a cabo (i) sellando la molécula diana específicamente en una gotita de líquido en un orden de femtolitros (una gotita líquida muy pequeña), (ii) ligando la molécula diana a una sustancia como pueda ser un anticuerpo marcado con enzima y (iii) detectando una actividad de la enzima marcando el anticuerpo de la manera que se ha mencionado anteriormente. El sellado de la molécula diana específicamente en la gotita de líquido muy pequeña se puede llevar a cabo a través de un método en el que se utiliza, p.ej., una perla marcada con una sustancia, como pueda ser otro anticuerpo, para unirse específicamente a la molécula diana. En este método, una vez que se une la perla a la molécula diana, se sella la perla en la gotita de disolución muy pequeña.
Por otra parte, a fin de detectar eficientemente moléculas dianas que están contenidas en una disolución solamente en una cantidad muy reducida, p.ej., aproximadamente 30 aM moléculas diana, tal como se ha descrito anteriormente, es necesario preparar un gran número de matrices de gotitas de líquido muy pequeñas, en una cantidad de aproximadamente un millón, y hacer que las matrices capturen las perlas.
Sin embargo, según el método descrito en la bibliografía no de patente 2, se ha de introducir las perlas en matrices a través de una intensa fuerza centrífuga y, por tanto, se requiere mucho tiempo y esfuerzo. Asimismo, el número de matrices utilizado en el método de la bibliografía no de patente 2 es aproximadamente cincuenta mil.
Por tanto, el método de la bibliografía no de patente 2 resulta bastante difícil de aplicar para un caso que requiera aproximadamente un millón de matrices. Por tanto, con el método de la bibliografía no de patente 2, resulta difícil sellar eficientemente un gran número de perlas en las matrices. Por otra parte, ni la bibliografía de patente 1 ni la bibliografía no de patente 1 describen ningún método para resolver dicho problema.
En vista de ello, la presente invención tiene por objeto proporcionar una técnica para sellar eficientemente un gran número de sustancias, como puedan ser perlas, ácidos nucleicos, proteínas, virus, células y complejos lípidomembrana en una matriz.
Solución del problema
Con el fin de alcanzar el objeto mencionado anteriormente, se proporciona el siguiente método para sellar una sustancia y similares.
1 Un método para sellar una sustancia que incluye: (i) una etapa de introducir un primer disolvente que contiene una sustancia sobre un sustrato sobre el que está formada una pluralidad de receptáculos capaces de almacenar la sustancia separados entre sí por una pared lateral; y (ii) una etapa de introducir un segundo disolvente que tiene un peso específico mayor que el del primer disolvente en el primer disolvente, llevándose a cabo la etapa (ii) después de la etapa (i).
2 El método según 1, en donde al menos uno de entre el primer disolvente y el segundo disolvente contiene un tensioactivo.
3 El método según 2, en donde el tensioactivo en el primer disolvente tiene una concentración de 0,01% a 1%.
4 El método según 2 o 3, en donde el tensioactivo es TWEEN 20 o Triton X-100.
5 El método según uno cualquiera de 1 a 4, en donde el segundo disolvente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburo saturado, hidrocarburo insaturado, hidrocarburo aromático, aceite de silicona, polímero de epóxido de hexafluoropropileno, un polímero que tiene una estructura hidrofluoroéter, perfluoropoliéter, polímero de clorotrifluoroetileno y un polímero que tiene una estructura perfluorocarbono, o es una mezcla que incluye al menos uno.
6 El método según uno cualquiera de 1 a 5, en donde el primer disolvente es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en agua, alcohol hidrófilo, éter hidrófilo, cetona, disolventes de nitrilo, sulfóxido de dimetilo y N,N- dimetilformamida, o es una mezcla que incluye al menos uno.
7 El método según 5 o 6, en donde la pared lateral tiene una superficie superior hidrófoba que incluye una resina de polímero de fluorocarbono y el segundo disolvente es un polímero que tiene una estructura de perfluorocarbono.
8 El método según 7, en donde la resina de polímero de fluorocarbono es una resina de fluorocarbono amorfa.
9 El método según uno cualquiera de 1 a 8, en donde una región que incluye receptáculos del sustrato está abierta al exterior.
10 El método según uno cualquiera de 1 a 9, en donde la sustancia es una o más seleccionada entre perlas, ácido nucleico, proteína, virus, células y complejos lípido-membrana.
11 Un método para detectar una molécula diana que incluye: (i) una etapa de hacer reaccionar las perlas que capturan específicamente moléculas dianas con las moléculas diana; una etapa de llevar a cabo mediante el uso de perlas un método citado en uno cualquiera de 1 a 9, llevándose a cabo la etapa (ii) después de la etapa (i); y una etapa de determinar si se almacena o no una cualquiera de las perlas que han capturado la molécula diana en cada uno de la pluralidad de receptáculos, llevándose a cabo la etapa (iii) después de la etapa (i).
12 El método según 11, en donde las perlas son perlas a las que se unen moléculas específicamente capaces de unirse a las moléculas diana.
13 Un método para sellar una sustancia en receptáculos provistos sobre un sustrato al introducir un disolvente hidrófilo que contiene la sustancia en los receptáculos y recubrir el disolvente hidrófilo que contiene la sustancia introducida en los receptáculos con un disolvente hidrófobo, que incluye: (i) una etapa de introducir un disolvente hidrófilo que contiene la sustancia sobre un sustrato en el que está formada una pluralidad de receptáculos capaces de almacenar la sustancia, separados entre sí por una pared lateral; y (ii) una etapa de introducir un disolvente hidrófobo que tiene un peso específico mayor que el del disolvente hidrófilo sobre el disolvente hidrófilo, llevándose a cabo la etapa (ii) antes que la etapa (i).
14 El método según 13, en el que al menos uno de entre el disolvente hidrófilo y el disolvente hidrófobo contiene un tensioactivo.
15 El método según 14, en donde el tensioactivo en el disolvente hidrófilo tiene una concentración de 0,01% a 1%.
16 El método según 14 o 15, en donde el tensioactivo es TWEEN 20 o Triton X-100.
17 El método según uno cualquiera de 13 a 16, en donde el disolvente hidrófobo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburo saturado, hidrocarburo insaturado, hidrocarburo aromático, aceite de silicona, polímero de epóxido de hexafluoropropileno, un polímero que tiene una estructura hidrofluoroéter, perfluoropoliéter, polímero de clorotrifluoroetileno y un polímero que tiene una estructura perfluorocarbono, o es una mezcla que incluye al menos uno.
18 El método según uno cualquiera de 13 a 17, en donde el disolvente hidrófilo es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en agua, alcohol hidrófilo, éter hidrófilo, cetona, disolventes de nitrilo, sulfóxido de dimetilo y N,N-dimetilformamida, o es una mezcla que incluye al menos uno.
19 El método según 17 o 18, en donde la pared lateral tiene una superficie superior hidrófoba que incluye una resina de polímero de fluorocarbono y el disolvente hidrófobo es un polímero que tiene una estructura perfluorocarbono.
20 El método según 19, en donde la resina de polímero de fluorocarbono es una resina de fluorocarbono amorfa.
21 El método según uno cualquiera de 13 a 20, en donde una región que incluye los receptáculos del sustrato está abierta al exterior.
22 El método según uno cualquiera de 13 a 21, en donde el sustrato es uno o más seleccionado entre perlas, ácido nucleico, proteína, virus, células y complejos lípido-membrana.
23. Un método para detectar una molécula diana que incluye: (i) una etapa de hacer reaccionar las perlas que capturan específicamente moléculas diana con las moléculas diana; (ii) una etapa de llevar a cabo, mediante el uso de las perlas, un método citado en uno cualquiera de 13 a 21, llevándose a cabo la etapa (ii) después de la etapa (i); y (iii) una etapa de determinar si se almacena o no una cualquiera de las perlas que ha capturado la molécula diana en cada uno de la pluralidad de receptáculos, llevándose a cabo la etapa (iii) tras la etapa (ii).
22 El método según 21, en donde las perlas son perlas a las que se unen moléculas capaces de unirse específicamente a las moléculas diana.
Efectos ventajosos
El uso del método para sellar una sustancia según la presente descripción hace posible sellar eficientemente muchas sustancias, como puedan ser perlas, ácido nucleico, proteína, virus, células y complejos lípido-membrana, en una matriz contribuyendo así a la técnica a través de la cual son detectables moléculas diana de baja concentración con una alta sensibilidad.
Descripción de las figuras
La figura 1 es una serie de vistas que ilustran esquemáticamente el procedimiento del método de sellado de una sustancia que presenta vistas transversales laterales de una matriz 1.
La figura 2 es una vista que ilustra esquemáticamente una realización de un dispositivo de detección de molécula diana.
Descripción detallada de la invención
A continuación, se describirá un modo de realización preferible de la presente invención haciendo referencia a los dibujos. Las realizaciones que se describen a continuación tienen como objeto únicamente mostrar un ejemplo de una realización ejemplar de la presente invención, pero no se pretende que el alcance de la presente invención se deba interpretar en un sentido exhaustivo con ello.
En el método para el sellado de una sustancia según la presente descripción, la sustancia sellada en receptáculos provistos sobre un sustrato puede ser perlas, ácido nucleico, proteína, virus, células, complejo de lípido-membrana, o similares; sin embargo, se describirá la siguiente realización utilizando perlas como ejemplo.
1. Método para sellar perlas
Haciendo referencia a la figura 1, se describe a continuación un método para sellar perlas. La figura 1 es una serie de vistas que ilustran esquemáticamente el procedimiento del método para sellar perlas, que presenta vistas transversales laterales de una matriz 1.
La presente realización trata del caso que se describirá en el que se sellan las perlas 21 y 21' en la matriz 1 que incluye un sustrato 10. El sustrato 10 incluye una pluralidad de receptáculos 13 con capacidad cada uno de ellos para almacenar únicamente una de las perlas 21 y 21' y que están separados entre sí por una pared 12 lateral que tiene una superficie hidrófila.
En la presente memoria “perla” se utiliza como sinónimo de “partícula” y es un término técnico comúnmente utilizado en la técnica. La forma de la perla no está particularmente limitada; sin embargo, típicamente, es esférica. El material de la perla tampoco está particularmente limitado y puede ser vidrio, gel de sílice, poliestireno, polipropileno, membrana, material magnético, o similares. Ejemplos específicos del material incluyen celulosa, derivados de celulosa, resina acrílica, vidrio, gel de sílice, poliestireno, gelatina, polivinil pirrolidona, copolímeros de vinilo y acrilamida, poliestirenos reticulados con divinilbenceno y similares, poliacrilamida, gel de látex, poliestireno dextrano, caucho, silicio, plásticos, nitrocelulosa, celulosa, esponja natural, gel de sílice, vidrio, plásticos metálicos, celulosa, dextrano reticulado (Sephadex (marca registrada)) y gel de agarosa (Sepharose (marca registrada). Las perlas pueden ser porosas. Las perlas tienen preferiblemente un diámetro medio de partícula de 5 pm o menos, por ejemplo, aproximadamente de 1 pm a 4 pm. Con esto, las perlas se pueden sellar eficientemente en la matriz y la matriz puede conseguir una alta densidad. Debe advertirse que la expresión “diámetro medio de partícula” en la presente memoria se refiere a un valor obtenido como resultado de la medición de las perlas por observación con un microscopio electrónico o dispersión de luz dinámica.
La presente realización describe, pero no está particularmente limitada a un caso en el que se utilizan perlas que capturan específicamente moléculas diana. En la presente realización, las perlas para su sellado son una mezcla de perlas 21, que no han capturado todavía las moléculas diana y las perlas 21' que han capturado las moléculas diana. Por ejemplo, es posible utilizar, como perlas que capturan específicamente las moléculas diana, perlas que están unidas a una molécula para capturar específicamente la molécula diana. La molécula para capturar específicamente la molécula diana puede estar unida a un grupo de modificación sobre una superficie de la perla, p.ej., a través de un enlazador. Por ejemplo, la presente invención puede configurarse de tal modo que la molécula para capturar específicamente la molécula diana esté covalentemente unida a un grupo amino sobre una superficie de una perla modificada con grupo amino a través de un reticulante que tiene N-hidroxisuccinimida y/o similar.
La “molécula diana” se refiere a una molécula para su detección (molécula dirigida). Específicamente, la “molécula diana” en la presente memoria se refiere a una molécula para su detección haciendo que la perla capture la molécula. Los ejemplos de la molécula diana abarcan (i) biomoléculas, como puedan ser una proteína, un ácido nucleico y azúcar, y (ii) las propias partículas de virus.
La molécula para capturar específicamente una molécula diana (en adelante, se hace referencia a dicha molécula también como “molécula de captura de diana”) puede seleccionarse según la molécula diana. Los ejemplos de molécula de captura de diana abarcan una proteína, un anticuerpo y un ácido nucleico. Preferiblemente, se une una perla a cien mil o más moléculas de captura de diana. Por ejemplo, en el caso en el que la molécula de captura de diana es un anticuerpo, la molécula de captura de diana tiene una constante de disociación, en el orden de nM, o entorno a ello. Sin embargo, con la configuración mencionada anteriormente, es posible causar la reacción entre las perlas y las moléculas diana con una concentración suficientemente alta de moléculas de captura de diana (por ejemplo, en el caso en el que la concentración de las perlas es 8*106 partículas/ml, la concentración de las moléculas de captura de diana es aproximadamente 1 nM).
El método para sellar perlas según la presente realización incluye una etapa de introducción de las perlas, una etapa de desgasificación y una etapa de almacenamiento de perlas. A continuación, se describirá cada una de estas etapas en detalle.
Etapa de introducción de perlas
A continuación, se describe la etapa de introducción de perlas haciendo referencia a la figura 1 A.
La etapa de introducción de las perlas es una etapa en la que se introduce un primer 20 disolvente que contienen las perlas 21 y 21' sobre el sustrato 10. El método de introducción del primer 20 disolvente no está particularmente limitado; sin embargo, se puede adoptar un método que implica el uso de una región 14 que incluye los receptáculos 13 del sustrato 10 como un pocillo abierto que está abierto al exterior para introducir el primer 20 disolvente desde la abertura al pocillo.
El primer 20 disolvente es preferiblemente un disolvente hidrófilo; preferiblemente, se utiliza como tal, por ejemplo, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en agua, alcohol hidrófilo, éter hidrófilo, cetona, disolventes de nitrilo; sulfóxido de dimetilo (DMSO) y N,N-dimetilformamida (DMF) o es una mezcla que incluye al menos uno. Ejemplos de alcohol hidrófilo abarcan etanol, metanol, propanol y glicerina. Ejemplos de éter hidrófilo abarcan tetrahidrofurano, polióxido de etileno y 1,4-dioxano. Ejemplos de cetonas abarcan acetona y metil etil cetona. Ejemplos de disolventes de nitrilo abarcan acetonitrilo.
El primer 20 disolvente contiene preferiblemente un tensioactivo. En la etapa de almacenamiento de perlas que se describe más adelante, se introduce un segundo 30 disolvente que tiene un peso específico mayor que el primer 20 disolvente en el primer 20 disolvente (véase figura 1B), seguido de la realización de sustitución basada en la diferencia de peso específico entre el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente para desplazar el segundo 30 disolvente a la capa inferior del primer 20 disolvente (véase figura 1H). En esta ocasión, se puede añadir un tensioactivo al primer 20 disolvente y/o el segundo 30 disolvente para favorecer la sustitución entre el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente.
El tensioactivo no está particularmente limitado; sin embargo, ejemplos del mismo abarcan TWEEN 20 (CAS No.
9005-64-5, monolaurato de polioxietilen sorbitano) y Triton X-100 (CAS No. 9002-93-1, nombre general: éter polietilen glicol mono-4-octilfenílico (n “ 10)). La concentración del tensioactivo añadido al primer 20 disolvente no está particularmente limitada; sin embargo, es preferiblemente de 0,01 a 1%.
Además, puede utilizarse ampliamente como tensioactivo un tensioactivo aniónico, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico, un tensioactivo zwiteriónico, un tensioactivo de origen natural o similar.
El tensioactivo aníonico se clasifica por ejemplo en tipo carboxílico, tipo sulfato, tipo sulfónico y tipo fosfato. Los ejemplos específicos del mismo abarcan dodecil sulfato sódico, laurato de sodio, a-sulfo éster metílico de ácido graso de sodio, dodecilbencenosulfonato de sodio y dodeciletoxilato sulfato de sodio, entre ellos, se utiliza preferiblemente dodecilbenceno sulfonato de sodio.
El tensioactivo catiónico se clasifica por ejemplo en tipo sal amonio cuaternario, tipo alquilamina y tipo amina heterocíclica. Ejemplos específicos de los mismos abarcan cloruro de esteariltrimetilamonio, cloruro de diestearildimetilamonio, cloruro de didecildimetilamonio, cloruro de cetiltripiridinio y cloruro de dodecildimetilbencil amonio.
Los ejemplos de tensioactivo no iónico abarcan éteres alquilo de polioxietileno, aceites de ricino hidrogenados polioxietilenados, ésteres de monoácido graso de polioxietileno, ésteres de monoácido graso de polioxietilen sorbitano, ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de poliglicerilo, alquil poliglucósidos y N-metilalquil glucamidas. Entre ellos, son preferibles los tensioactivos no iónicos distribuidos con los nombres Triton X (Triton X-100, y similares), Pluronic (Marca registrada) (Pluronic F-123, F-68, y similares), Tween (Tween 20, 40, 60, 65, 80, 85, y similares), Brij (Marca registrada) (Brij 35, 58, 98, y similares) y Span (Span 20, 40, 60, 80, 83 y 85) además de etoxilato de alcohol dodecílico, etoxilato de nonil fenol y lauroíl dietanol amida.
Los ejemplos de tensioactivo anfótero abarcan ácido laurildimetil aminoacético betaína, dodecilaminometildimetil sulfopropil betaína y 3-(tetradecildimetilamino)propano-12-sulfonato; sin embargo, los ejemplos preferibles de los mismos abarcan sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano (CHAPS) y sulfonato de 3-[(3-colamido-propil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1 -propano (CHAPSO).
El tensioactivo de origen natural es preferiblemente por ejemplo lecitina o saponina. Entre los ejemplos denominados lectina, son preferibles específicamente fosfatidilcolina, fosfatodiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico y fosfatidilglicerol. La saponina de Quillaja es preferible como saponina.
Además de las perlas 21 y 21', el primer 20 disolvente puede incluir además, p.ej., una sustancia para detectar específicamente la molécula diana capturada por cualquiera de las perlas 21'. Dicha sustancia puede ser por ejemplo un sustrato fluorescente que libera un material fluorescente cuando lo descompone una determinada enzima unida a (i) la molécula diana capturada por cualquiera de las perlas 21' o (ii) una molécula unida específicamente a la molécula diana. Ejemplos de la molécula unida específicamente a la molécula diana abarcan un anticuerpo secundario y un ácido nucleico. Ejemplos de la enzima determinada abarcan p-galactosidasa y peroxidasa. Ejemplos del sustrato fluorescente abarcan fluoresceína-di-p-galactopiranosida (fDg ) y Amplex red (Marca registrada).
[Etapa de almacenamiento de perlas]
A continuación se describe la etapa de almacenamiento de perlas haciendo referencia a las figuras 1B a 1H.
La etapa de almacenamiento de perlas es una etapa en la que se introduce el segundo 30 disolvente que tiene un peso específico mayor que el del primer 20 disolvente en el primer 20 disolvente. El método para introducir el segundo 30 disolvente no está particularmente limitado; sin embargo, se puede adoptar un método que implica el uso de la región 14 que incluye los receptáculos 13 del sustrato 10 como un pocillo abierto que está abierto al exterior para introducir el segundo 30 disolvente desde la abertura al pocillo. En esta ocasión, preferiblemente, se introduce el segundo 30 disolvente de modo que la capa del segundo 30 disolvente queda estratificada sobre la capa del primer 20 disolvente tal como se muestra en la Figura 1B.
El segundo 30 disolvente puede ser un disolvente que tiene un peso específico mayor que el del primer 20 disolvente utilizado en la etapa de introducción de las perlas. El primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente son preferiblemente anfifílicos uno con otro hasta el grado de ser capaces de sustitución de capas; sin embargo, es necesario que no sean compatibles entre sí. Una anfifilia demasiado baja entre el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente no produce la sustitución de capas entre el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente. La sustitución de capas entre el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente tampoco tiene lugar cuando el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente son compatible entre sí. Para evitar el entremezclado del primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente, es preferible utilizar un disolvente hidrófilo como primer 20 disolvente y un disolvente hidrófobo como segundo 30 disolvente. Al igual que el primer 20 disolvente, el segundo 30 disolvente puede contener un tensioactivo para promover la sustitución de capas.
Dicho segundo 30 disolvente es preferiblemente un disolvente hidrófobo; preferiblemente utilizado como tal, es por ejemplo al menos uno seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburo saturado, hidrocarburo insaturado, hidrocarburo aromático, aceite de silicona, polímero epóxido de hexafluoropropileno, un polímero que tiene una estructura hidrofluoroéter, perfluoropoliéter, polímero de clorotrifluoroetileno y polímero que tiene una estructura perfluorocarbono o es una mezcla que incluye al menos uno. Ejemplos de hidrocarburos saturados abarcan alcanos y cicloalcanos. Ejemplos de alcanos abarcan decano y hexadecano. Ejemplos de hidrocarburos insaturados abarcan escualeno. Ejemplos de hidrocarburos aromáticos abarcan benceno y tolueno. Ejemplos de polímeros de epóxido de hexafluoropropileno abarcan Krytox 143 (de DuPont Co., Ltd.) y Krytox GPL (de DuPont Co., Ltd.). Ejemplos del polímero que tiene una estructura hidrofluoréter abarcan Asahiklin AE3000 (de Asahi Glass Co., Ltd.) y Novec 7000 (de Sumitomo 3M Co., Ltd.). Ejemplos de polímero que tiene una estructura perfluorocarbono abarcan Fluorinert FC-40 y Fluorinert FC-43 (de Sumitomo 3M Co., Ltd.).
El segundo 30 disolvente introducido y estratificado sobre el primer 20 disolvente tiene un peso específico mayor que el del primer 20 disolvente y, por tanto, desplaza hacia abajo el primer 20 disolvente. Específicamente, tiene lugar la sustitución entre el primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente y en virtud de ello, el estado en el que la capa superior es el segundo 30 disolvente, siendo el primer 20 disolvente la capa inferior (véase figura 1B), pasa a ser el estado en el que la capa superior es el primer 20 disolvente siendo la capa inferior el segundo 30 disolvente (véase figura 1H). Las figuras 1C a G muestran esquemáticamente cómo tiene lugar la sustitución de capas. En esta sustitución de capas, se almacenan las perlas 21 y 21' que precipitan desde el fondo de la región 14 en los correspondientes receptáculos 13, caso en el cual son forzadas hacia dentro por el segundo 30 disolvente que desplaza hacia abajo el primer 20 disolvente (véase las figuras 1D a F). Como resultado, se pueden sellar las perlas con una alta eficiencia en cada uno de un gran número de receptáculos 13 que se proporcionan sobre el sustrato 10.
En el caso de utilizar un disolvente hidrófilo como primer 20 disolvente y un disolvente hidrófobo como segundo 30 disolvente, se forman eficientemente gotitas (gotitas de líquido del primer 20 disolvente) cubiertas por el segundo 30 disolvente en los correspondientes receptáculos 13.
En la Tabla 1 y la Tabla 2 se proporcionan ejemplos preferibles en la presente memoria del primer 20 disolvente y el segundo 30 disolvente utilizado en el método de sellado de perlas.
[Tabla 1]
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[Tabla 2]
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En la etapa de almacenamiento de perlas, cuando se utilizan perlas magnéticas como las perlas 21 y 21', se puede utilizar un medio magnético para promover el movimiento de las perlas hacia los receptáculos 13. Se introduce el primer 20 disolvente que contiene las perlas 21 y 21' en la región 14 que incluye los receptáculos 13 en la etapa de introducción de perlas, seguido de la aplicación de un campo magnético externo a las perlas 21 y 21' antes y después de introducir el segundo 30 disolvente en el primer 20 disolvente en la etapa. Esto puede promover el movimiento de las perlas 21 y 21' a los receptáculos 13 haciendo que la fuerza hacia los receptáculos 13 actúe sobre las perlas 21 y 21'. La aplicación del campo magnético puede llevarse a cabo por ejemplo haciendo que se aproxime un imán al lado opuesto del lado en el que se proporcionan los receptáculos 13 del sustrato 10 (el lado de la cara del fondo de la matriz 1).
La presente realización permite proporcionar una matriz de gran superficie que incluye un gran número de receptáculos. Por ejemplo, incluso con una matriz que incluye un millón o más de receptáculos, es posible sellar eficientemente la perla 21 o 21' en los receptáculos de modo que se almacena una cualquiera de las perlas 21 y 21' en cada uno de los receptáculos. Por tanto, con la presente realización, es posible detectar las moléculas diana con una alta sensibilidad permitiendo así detectar las moléculas diana de concentraciones tan bajas como aproximadamente10 aM.
[Etapa de desgasificación]
La región 14 que incluye los receptáculos 13 del sustrato 10 se puede preparar en un espacio abierto superior, tal como se ha descrito anteriormente; sin embargo, cuando se prepara la región 14 en un espacio cerrado, puede llevarse a cabo una etapa de desgasificación del interior de la región 14 entre la etapa de introducción de perlas y la etapa de almacenamiento de perlas. Preferiblemente, la desgasificación se lleva a cabo, por ejemplo, a través de un método que permita que la matriz 1 permanezca inmóvil a presión reducida. Específicamente, la desgasificación se lleva a cabo por ejemplo a través de un método que permite que la matriz 1 permanezca inmóvil en un desecador de vacío de aproximadamente 0,1 atm durante aproximadamente 30 segundos.
La etapa de desgasificación no es esencial para la presente invención. Sin embargo, llevar a cabo la etapa de desgasificación elimina el aire de los receptáculos 13 con lo cual se hace posible introducir eficientemente en los receptáculos 13 las perlas 21 y 21'.
2. Método de detección de molécula diana
A continuación, se describe el método para detectar la molécula diana. El método para detectar una molécula diana incluye una etapa de reacción, una etapa de sellado de perlas y una etapa de determinación.
Como perlas, en la presente realización se utilizan perlas que capturan específicamente las moléculas diana. Por ejemplo, cada una de dichas perlas puede ser aquella que se ha unido a una molécula para capturar específicamente la molécula diana. Como perlas que se utilizan adecuadamente, la molécula diana y la molécula para capturar específicamente la molécula diana pueden ser cualquiera de las ejemplificadas en las descripciones anteriores para el método de sellado de perlas.
La etapa de reacción es una etapa en la que hace reaccionar las perlas con las moléculas diana. Por ejemplo, la reacción entre las perlas y las moléculas diana puede llevarse a cabo mezclando una solución que contiene las perlas con una solución que contiene las moléculas diana.
La etapa de sellado de perlas es una etapa en la que se lleva a cabo el método mencionado anteriormente para sellar perlas mediante el uso de las perlas que se han hecho reaccionar con las moléculas diana en la etapa de reacción. Concretamente, la etapa de sellado de perlas es una etapa que incluye la etapa de introducción de perlas y la etapa de almacenamiento de perlas, o una etapa que incluye la etapa de introducción de perlas, la etapa de desgasificación y la etapa de almacenamiento de perlas. Debe advertirse que las descripciones de la etapa de introducción de perlas, la etapa de desgasificación y la etapa de almacenamiento de perlas se omiten en este caso, ya que estas etapas se pueden llevar a cabo de la misma manera que se ha descrito en la sección anterior “Método de sellado de perlas”.
La etapa de determinación es una etapa en la que se determina, después de la etapa de sellado de perlas, si cada uno de los receptáculos 13 contiene o no una cualquiera de las perlas 21' que han capturado las moléculas diana. Los ejemplos adecuados del método de determinación de si cada uno de los receptáculos 13 contiene o no una cualquiera de las perlas 21' que han capturado las moléculas diana abarca reacciones de reconocimiento molecular conocidas, como puedan ser la reacción antígeno-anticuerpo, reacción estreptavidina-biotina o unión complementaria de ácidos nucleicos. Por ejemplo, este método puede ser un método de detección de un material fluorescente liberado desde un sustrato fluorescente cuando lo descompone determinada enzima unida a (i) una molécula diana o (ii) una molécula unida específicamente a la molécula diana. La detección del material fluorescente se lleva a cabo por ejemplo a través de un método de determinación de una intensidad fluorescente de cada receptáculo mediante el uso p.ej., de un microscopio de fluorescencia o un sensor de imagen.
En la etapa de determinación, es preferible determinar también si cada uno de los receptáculos 13 contiene o no una cualquiera de las perlas 21 o una cualquiera de las perlas 21'. La determinación de si cada uno de los receptáculos 13 contiene o no una cualquiera de las perlas 21 o una cualquiera de las perlas 21' puede llevarse a cabo por ejemplo por observación con el microscopio para determinar la presencia o ausencia de una cualquiera de las perlas 21 o una cualquiera de las perlas 21' en cada uno de los receptáculos 13. Alternativamente, la determinación de la presencia o ausencia de una cualquiera de las perlas 21 o una cualquiera de las perlas 21' en cada uno de los receptáculos 13 puede llevarse a cabo a través de un método de detección de luz dispersada desde las perlas o un método de medición del potencial eléctrico con un transistor de efecto campo (FET).
Tras la etapa de determinación, basada en (i) el número de receptáculos 13 que contienen las perlas 21 o las perlas 21'; y (ii) el número de receptáculos 13 que contienen las perlas 21' que han capturado las moléculas diana, es posible calcular la relación del número de perlas que han capturado las moléculas diana con respecto al número de perlas total. De esta manera, es posible cuantificar una concentración de las moléculas diana.
Según la presente realización, es posible proporcionar una matriz de gran superficie que incluye un gran número de receptáculos; asimismo, incluso con una matriz que incluye un millón de receptáculos o más, es posible sellar eficientemente las perlas 21 o 21' en cada uno de los receptáculos. Por tanto, con la presente realización, es posible detectar las moléculas diana con una alta sensibilidad, lo cual permite detectar las moléculas diana de una concentración tan baja como aproximadamente 10 aM.
3. Matriz
A continuación, se describe una configuración de la matriz 1 haciendo referencia a la figura 1.
En la matriz 1, el sustrato 10 incluye un miembro 11 de tipo placa y la pared 12 lateral que tiene una superficie superior hidrófoba. El sustrato 10 incluye la pluralidad de receptáculos 13 que están separados entre sí por la pared 12 lateral.
Preferiblemente, el miembro 11 de tipo placa tiene una superficie hidrófila. El término "superficie hidrófila" se refiere a una superficie cuya afinidad con un disolvente hidrófilo es más alta que la que tiene con un disolvente hidrófobo. Es posible que el miembro 11 de tipo placa requiera estar hecho solamente de un material sólido. Por ejemplo, el miembro 11 de tipo placa puede estar hecho de vidrio, silicio o una resina de polímero.
La pared 12 lateral está provista sobre la superficie, preferiblemente, sobre la superficie hidrófila del miembro 11 de tipo placa y separa la pluralidad de receptáculos 13. La pared 12 lateral tiene la superficie superior hidrófoba. El término “hidrófobo” se utiliza en la presente memoria como sinónimo de “lipófilo” y se refiere a una naturaleza cuya afinidad con el disolvente hidrófobo es más alta que la que tiene con un disolvente hidrófilo.
Debe advertirse que la superficie superior de la pared 12 lateral es preferiblemente hidrófoba y su superficie lateral, es decir, una pared interior de cada uno de los receptáculos 13, puede ser hidrófoba o hidrófila.
Por ejemplo, la 12 pared lateral puede estar hecha de una estructura hidrófila y una capa hidrófoba que está formada sobre una de sus superficies superiores. La estructura hidrófila puede estar hecha p.ej., de vidrio, sílice o una resina de polímero. La capa hidrófoba puede estar hecha p.ej., de una resina repelente al agua o una resina de polímero de fluorocarbono. Los ejemplos de polímero de fluorocarbono abarcan resina de fluorocarbono amorfa. Preferiblemente, se utiliza la resina de fluorocarbono amorfa, dado que tiene una propiedad hidrófoba alta y presenta una baja toxicidad para una muestra biológica.
Es preferible utilizar como segundo 30 disolvente, un disolvente que tenga una afinidad con la capa hidrófoba que forma la superficie superior de la pared 12 lateral en un grado que no disuelva la capa hidrófoba. Una baja afinidad de la capa hidrófoba del segundo 30 disolvente puede inhibir la sustitución de capas con el primer 20 disolvente. Una afinidad demasiado alta con la capa hidrófoba del segundo 30 disolvente puede dar como resultado la disolución de la capa hidrófoba e impedir que se mantenga la forma de la pared 12 lateral. Desde este punto de vista, preferiblemente, se utiliza un polímero que tiene una estructura perfluorocarbono (Fluorinert FC-40, Fluorinert FC-43, o similares) como el segundo 30 disolvente cuando la superficie superior de la pared 12 lateral está formada de una resina de polímero fluorocarbono.
Los ejemplos preferibles de resina de fluorocarbono amorfa abarcan al menos un seleccionado de entre CYTOP (marca registrada), TEFLON (marca registrada) AF2400, y TEFLON (marca registrada) AF1600. Entre ellos, se prefiere sobre todo CYTOP (Marca registrada) ya que es fácil de fabricar a nivel microscópico.
Alternativamente, la pared 12 lateral puede estar hecha de un material hidrófobo. Por ejemplo, la pared 12 lateral puede estar hecha de una resina de polímero de fluorocarbono o una resina de polímero de paraxileno. Los ejemplos de resina de polímero de fluorocarbono abarcan una resina de fluorocarbono amorfa. Preferiblemente, se utiliza como resina de fluorocarbono amorfa cualquiera de las ejemplificadas anteriormente.
La pared 12 lateral requiere simplemente tener una configuración para que se proporcione la pluralidad de receptáculos 13 sobre el miembro 11 de tipo placa. Por ejemplo, la pared 12 lateral puede tener una estructura de tipo placa partes de las cuales que corresponden a los receptáculos 13 son agujeros.
La altura de la pared 12 lateral medida desde la superficie del miembro 11 de tipo placa (es decir, el grosor en una dirección vertical) requiere simplemente estar diseñado para que no se descargue de nuevo desde receptáculos 13 una de las perlas 21 y 21' una vez almacenada en los receptáculos 13 durante la etapa de almacenamiento de perlas. Por ejemplo, la altura de la pared 12 lateral puede estar diseñada para que la mayor parte, preferiblemente, la parte total de una de las perlas 21 y 21' almacenadas en uno de los receptáculos 13 quede situada debajo de la superficie superior de la pared 12 lateral.
Para almacenar eficientemente las perlas 21 y 21' en los receptáculos 13, la altura de la pared 12 lateral es preferiblemente igual o mayor al diámetro medio de partícula de las perlas 21 y 21'. Asimismo, para que se almacene solamente una de las perlas 21 y 21' en uno de los receptáculos 13, la altura de la pared 12 lateral es preferiblemente igual o menor a 1,5 veces el diámetro medio de partícula de las perlas 21 y 21'.
Cada uno de la pluralidad de receptáculos 13 es un rebaje capaz de almacenar solamente una de las perlas 21 y 21', y la pluralidad de receptáculos 13 están separados entre sí por la pared 12 lateral. Cada uno de los receptáculos 13 tiene una superficie inferior que forma parte de la superficie del miembro 11 de tipo placa, y la superficie inferior es hidrófila.
Los receptáculos 13 pueden tener cualquier forma o tamaño siempre y cuando la forma y el tamaño permitan que cada uno de los receptáculos 13 almacene solamente una de las perlas 21 y 21' en él. La región rodeada por la superficie inferior y la superficie lateral de cada uno de los receptáculos 13 puede tener la forma p.ej., de una columna cilíndrica circular o rectangular.
El ancho "w" de cada uno de los receptáculos 13 en la dirección horizontal (p.ej., en el caso en el que la sección transversal de cada receptáculo 13 cuando se observa en la dirección horizontal tiene forma de círculo, el ancho “w” es el diámetro del círculo; en el caso en el que la sección transversal de cada receptáculo 13 cuando se observa en la dirección horizontal tiene forma de cuadrado, el ancho “w” es la longitud en un lado del cuadrado) requiere únicamente ser más largo que el diámetro medio de partícula de las perlas 21 y 21'. Preferiblemente, el ancho "w" es por ejemplo 1 a 2 veces más largo que el diámetro medio de partícula de las perlas 21 y 21'. En la presente realización, cada uno de los receptáculos 13 tiene una profundidad igual a la altura de la pared 12 lateral. Para almacenar eficientemente las perlas en los receptáculos, la profundidad de cada uno de los receptáculos es preferiblemente igual o mayor que el diámetro medio de partícula de las perlas. Asimismo, para que se almacene solamente una de las perlas en los receptáculos, la profundidad de cada uno de los receptáculos es preferiblemente igual o menor a 1,5 veces el diámetro medio de partícula de las perlas.
Las técnicas, como puedan ser fotolitografía, grabado y estratificación de sustrato para preparar la matriz 1 son las mismas técnicas que las utilizadas para preparar microchips y matrices multiuso.
Según la presente realización, cada uno de los receptáculos 13 tiene una superficie inferior hidrófila y la pared 12 lateral tiene una superficie superior hidrófoba. Por tanto, puede introducirse el primer 20 disolvente que contiene las perlas 21 y 21' eficientemente en los receptáculos 13 cuando se utiliza el primer 20 disolvente hidrófilo en la etapa de introducción de perlas. Además, dado que puede evitarse que el segundo 30 disolvente hidrófobo utilizado en la etapa de almacenamiento de perlas entre en los receptáculos 13, se puede revestir y sellar herméticamente el primer 20 disolvente hidrófilo en los receptáculos 13 con el segundo 30 disolvente para formar gotitas (gotitas de líquido).
La matriz 1 de la presente realización puede ser por ejemplo una matriz que incluye un millón o más de receptáculos. Incluso con una matriz que tenga una superficie grande, el uso del método para sellar perlas de la presente realización, o el método para la detección de una molécula diana de la presente realización hace posible sellar eficientemente las perlas en los receptáculos, de modo que se almacena una cualquiera de las perlas en cada uno de los receptáculos. Por tanto, según la presente realización, es posible detectar las moléculas diana con una alta sensibilidad, permitiendo así proporcionar una matriz que permite la detección de moléculas diana a una concentración tan baja como aproximadamente 10 aM.
4. Equipo de reactivos
La matriz 1 y las perlas 21 pueden estar compuestas en forma de equipo de reactivos. Cada uno de los receptáculos 13 en las matrices 1 está configurado para ser capaz de almacenar únicamente una de las perlas 21 incluidas en este equipo de reactivos.
Cada una de las perlas 21 incluida en este equipo de reactivos puede ser la que capture la molécula diana. Por ejemplo, cada una de las perlas 21 incluida en este equipo de reactivos puede ser aquella que se ha unido a una molécula para unirse específicamente a la molécula diana. La molécula diana y la molécula para unirse específicamente a la molécula diana utilizadas adecuadamente pueden ser cualquiera de las mencionadas anteriormente.
El equipo de reactivos puede incluir además una sustancia para detectar específicamente la molécula diana. Preferiblemente, la sustancia para detectar específicamente la molécula diana utilizada puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente. Asimismo, el equipo de reactivos puede incluir además p.ej., el primer disolvente y el segundo disolvente.
5. Dispositivo de detección de molécula diana
A continuación, se describe un dispositivo 50 de detección de molécula diana haciendo referencia a la figura 2. La figura 2 es una vista esquemática en la que se ilustra una realización de un dispositivo de detección de molécula diana.
El dispositivo 50 de detección de molécula diana según la presente realización incluye la matriz 1, un sensor 51 de imagen y una fuente 52 de luz. En este caso, se muestra la matriz 1 como una placa de varios pocillos. Cada pocillo de la placa de varios pocillos corresponde a la región 14 de la figura 1. La composición de la matriz 1 es como la descrita anteriormente y, por tanto, en este caso se omiten las explicaciones de la matriz 1.
El sensor 51 de imagen es un sensor para detectar la luz emitida por cada uno de los receptáculos 13 cuando se almacenan las perlas que han capturado moléculas diana en los receptáculos 13. Por ejemplo, el sensor 51 de imagen puede ser un sensor para detectar la fluorescencia emitida por un sustrato fluorescente cuando lo descompone determinada enzima unida a (i) la molécula diana o (ii) una molécula unida específicamente a la molécula diana. El sensor 51 de imagen utilizado adecuadamente puede ser por ejemplo un sensor de imagen CMOS.
La fuente 52 de luz es una fuente de luz para emitir luz a la matriz 1. En la figura 2, la fuente 52 de luz se proporciona por encima de la matriz 1. Sin embargo, la presente invención no está particularmente limitada a esto. Alternativamente, la fuente de luz 52 puede ser aquella que emite luz al lado lateral de la matriz 1, por ejemplo. Entre la matriz 1 y el sensor 51 de imagen, puede proporcionarse un filtro de interferencia y/o una matriz de guía de luz por ejemplo. Asimismo, entre la fuente 52 de luz y la matriz 1, se puede proporcionar un filtro de excitación, por ejemplo.
Según la presente realización, la matriz 1 y el sensor 51 de imagen están conectados directamente uno a otro. Esto hace posible determinar fácilmente, sin el uso de otro dispositivo como pueda ser un microscopio, si está almacenada o no una cualquiera de las perlas que han capturado las moléculas diana en cada uno de los receptáculos 13. Esto permite llevar a cabo una detección fácil y a alta velocidad de si está almacenada o no una cualquiera de las perlas que han capturado las moléculas diana en cada uno de los receptáculos 13, y proporcionar a un precio asequible el dispositivo de detección de molécula diana.
6. Ejemplo de aplicación del método para sellar sustancias
En el método para sellar una sustancia, la sustancia sellada en los receptáculos proporcionados sobre un sustrato puede ser perlas, ácido nucleico, proteína, virus, células, complejo de lípido membrana, o similares. En la realización anterior, se ha descrito el método utilizando perlas como ejemplo.
El ácido nucleico incluye ADN y ARN. La proteína y el virus incluyen polímeros (oligómeros) de los mismos y complejos de los mismos con otras sustancias. Las células incluyen particularmente células bacterianas y el complejo de lípido membrana incluye particularmente liposoma y exosoma y, además, orgánulos celulares, como mitocondrias.
Cuando el objeto del sellado es ácido nucleico, proteína, virus, células, complejo de lípido membrana, o similar, el método para el sellado de una sustancia puede utilizarse en aplicaciones como puedan ser ELISA-PCR.
Susceptibilidad de aplicación industrial
La presente invención se puede aplicar adecuadamente a un método para detectar moléculas diana de baja concentración en una matriz para ello, y similares.
Lista de signos de referencia
1: Matriz
10: Sustrato
11: Miembro de tipo placa
12: Pared lateral
13: Receptáculo
14: Región
20: Primer disolvente
21, 21': Perlas
30: Segundo disolvente

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para almacenar una sustancia seleccionada de entre perlas, ácidos nucleicos, proteínas, virus, células y complejos de lípido membrana en una pluralidad de receptáculos provistos sobre un sustrato y separados entre sí por una pared lateral, en donde una región que incluye los receptáculos del sustrato está abierta al exterior formando un pocillo abierto y en donde la pared lateral tiene una superficie superior hidrófoba, comprendiendo dicho método las etapas de:
(i) introducir a través de la región del pocillo abierto sobre el sustrato un disolvente hidrófilo que contiene la sustancia; y
(ii) introducir a través de la región del pocillo abierto sobre el disolvente hidrófilo, un disolvente hidrófobo que tiene un peso específico mayor que el del disolvente hidrófilo de modo que el disolvente hidrófobo se estratifica sobre el disolvente hidrófilo, llevándose a cabo la etapa (ii) después de la etapa (i),
en donde tras la etapa (ii), el disolvente hidrófobo desplaza hacia abajo el disolvente hidrófilo y el disolvente hidrófilo se estratifica sobre el disolvente hidrófobo, y en donde al menos uno de entre el disolvente hidrófilo y el disolvente hidrófilo contiene un tensioactivo.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el tensioactivo en el disolvente hidrófilo tiene una concentración de 0,01% a 1%.
3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el disolvente hidrófobo es al menos un disolvente seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburo saturado, hidrocarburo insaturado, hidrocarburo aromático, aceite de silicona, polímero de epóxido de hexafluoropropileno, un polímero que tiene una estructura hidrofluoroéter, perfluoropoliéter, polímero de clorotrifluoroetileno y un polímero que tiene una estructura de perfluorocarbono, o es una mezcla que incluye dicho al menos un disolvente.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el disolvente hidrófilo es al menos un disolvente seleccionado del grupo que consiste en agua, alcohol hidrófilo, éter hidrófilo, cetona, disolventes de nitrilo, sulfóxido de dimetilo y N,N-dimetilformamida o es una mezcla que incluye al menos un disolvente.
5. El método según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la pared lateral tiene una superficie superior hidrófoba que comprende una resina de polímero de hidrocarburo y el disolvente hidrófobo es un polímero que tiene una estructura perfluorocarbono.
6. Un método para detectar una molécula diana, que comprende las etapas de:
(i) hacer reaccionar las perlas que capturan específicamente las moléculas diana con las moléculas diana;
(ii) llevar a cabo un método citado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las perlas de la etapa (i) se utilizan como sustancia y en donde la etapa (ii) se lleva a cabo después de la etapa (i); y
(iii) determinar si se ha almacenado o no una cualquiera de las perlas que han capturado la molécula diana en cada uno de la pluralidad de receptáculos, en donde la etapa (iii) se lleva a cabo tras la etapa (ii).
7. El método según la reivindicación 6, en donde las perlas son perlas a las que están unidas moléculas que se unen específicamente a las moléculas diana.
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