ES2831048T3 - Permanencia de moléculas de unión a antígeno en plasma sanguíneo y método para modificar la inmunogenicidad - Google Patents

Permanencia de moléculas de unión a antígeno en plasma sanguíneo y método para modificar la inmunogenicidad Download PDF

Info

Publication number
ES2831048T3
ES2831048T3 ES12764620T ES12764620T ES2831048T3 ES 2831048 T3 ES2831048 T3 ES 2831048T3 ES 12764620 T ES12764620 T ES 12764620T ES 12764620 T ES12764620 T ES 12764620T ES 2831048 T3 ES2831048 T3 ES 2831048T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amino acid
antigen
antibody
binding
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12764620T
Other languages
English (en)
Inventor
Tomoyuki Igawa
Atsuhiko Maeda
Kenta Haraya
Yuki Iwayanagi
Tatsuhiko Tachibana
Futa Mimoto
Taichi Kuramochi
Hitoshi Katada
Shojiro Kadono
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2011/001888 external-priority patent/WO2011122011A2/en
Priority claimed from PCT/JP2012/054624 external-priority patent/WO2012115241A1/ja
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority claimed from PCT/JP2012/058603 external-priority patent/WO2012133782A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of ES2831048T3 publication Critical patent/ES2831048T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG humano de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es (i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) es 2 o más; o (ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcγ activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una cuya actividad de unión a un receptor Fcγ activador es menor que la actividad de unión de una región Fc de la IgG humana de tipo silvestre al receptor Fcγ activador, en donde la actividad de unión se refiere a la KD.

Description

DESCRIPCIÓN
Permanencia de moléculas de unión a antígeno en plasma sanguíneo y método para modificar la inmunogenicidad
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión a antígeno en animales a los que se administra la molécula y métodos para reducir la respuesta inmunitaria a una molécula de unión a antígeno, modificando la región Fc de la molécula de unión a antígeno que tiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro. La presente invención también se refiere a moléculas de unión a antígeno que presentan una farmacocinética mejorada o una respuesta inmunitaria reducida en animales a los que se administran las moléculas. Asimismo, la presente invención se refiere a métodos para producir moléculas de unión a antígeno y a composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo una de dichas moléculas de unión a antígeno.
Antecedentes de la técnica
Los anticuerpos están llamando la atención como productos farmacéuticos, ya que son muy estables en plasma y tienen pocos efectos secundarios. En la actualidad, están disponibles en el mercado varios productos farmacéuticos de anticuerpos de tipo IgG y se están desarrollando actualmente muchos productos farmacéuticos de anticuerpos (documentos no de patente 1 y 2). Al mismo tiempo, se ha informado de diversas tecnologías aplicables a productos farmacéuticos de anticuerpos de segunda generación, incluyendo los que mejoran la función efectora, capacidad de unión a antígenos, farmacocinética y estabilidad, y los que reducen el riesgo de inmunogenicidad (documento no de patente 3). En general, la dosis necesaria de un producto farmacéutico de anticuerpo es muy alta. Esto, a su vez, ha dado lugar a problemas, tales como alto coste de producción, así como la dificultad para producir formulaciones subcutáneas. En teoría, la dosis de un producto farmacéutico de anticuerpo puede reducirse mejorando la farmacocinética del anticuerpo o mejorando la afinidad entre anticuerpos y antígenos.
La bibliografía ha presentado métodos para mejorar la farmacocinética de anticuerpos usando sustitución artificial de aminoácidos en regiones constantes (documentos no de patente 4 y 5). De manera análoga, se ha informado de la maduración de la afinidad como una tecnología para mejorar la capacidad de unión a antígeno o la actividad neutralizadora de antígenos (documento no de patente 6). Esta tecnología permite la mejora de la actividad de unión a antígeno mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en la región CDR de una región variable o similar. La mejora de la capacidad de unión a antígenos permite mejorar la actividad biológica in vitro o reducir la dosis, y permite además mejorar la eficacia in vivo (documento no de patente 7).
La capacidad de neutralización de antígenos de una sola molécula de anticuerpo depende de su afinidad. Al aumentar la afinidad, un antígeno puede neutralizarse mediante una menor cantidad de anticuerpo. Se pueden usar diversos métodos para mejorar la afinidad del anticuerpo (documento no de patente 6). Asimismo, si la afinidad pudiera hacerse infinita uniendo covalentemente el anticuerpo al antígeno, una sola molécula de anticuerpo podría neutralizar una molécula de antígeno (un anticuerpo divalente puede neutralizar dos moléculas de antígeno). Sin embargo, la neutralización estequiométrica de un anticuerpo contra un antígeno (un anticuerpo divalente contra dos antígenos) es el límite de los métodos preexistentes y, por tanto, es imposible neutralizar completamente el antígeno con una cantidad menor de anticuerpo que la cantidad de antígeno. En otras palabras, el efecto de mejora de la afinidad tiene un límite (documento no de patente 9). Para prolongar el efecto de neutralización de un anticuerpo neutralizante durante un periodo determinado, el anticuerpo debe administrarse a una dosis mayor que la cantidad de antígeno producido en el cuerpo durante el mismo periodo. Con la mejora de la farmacocinética de anticuerpos o la tecnología de maduración de la afinidad descrita anteriormente, existe, por tanto, una limitación en la reducción de la dosis de anticuerpo necesaria. Por consiguiente, para mantener el efecto neutralizador de antígenos del anticuerpo durante un periodo diana con una cantidad del anticuerpo menor que la cantidad de antígeno, un solo anticuerpo debe neutralizar múltiples antígenos. Recientemente se ha señalado un anticuerpo que se une a un antígeno de manera dependiente del pH como un método novedoso para lograr el objetivo anterior (documento de patente 1). Los anticuerpos de unión a antígeno dependientes del pH, que se unen fuertemente a un antígeno en condiciones neutras en el plasma y se disocian del antígeno en condiciones ácidas en el endosoma, pueden disociarse del antígeno en el endosoma. Cuando un anticuerpo de unión a antígeno dependiente del pH se disociado del antígeno se recicla al plasma por FcRn, puede volver a unirse a otro antígeno. Por tanto, un único anticuerpo de unión a antígeno dependiente del pH puede unirse repetidas veces a varios antígenos.
Además, la permanencia en plasma de un antígeno es muy corta en comparación con los anticuerpos reciclados mediante unión a FcRn. Cuando un anticuerpo con dicha permanencia en plasma prolongada se une al antígeno, el tiempo de permanencia en plasma del complejo antígeno-anticuerpo se prolonga hasta el mismo que el del anticuerpo. Por tanto, la permanencia en plasma del antígeno se prolonga por unión al anticuerpo y, por tanto, aumenta la concentración de antígeno en plasma.
El anticuerpo IgG tiene un tiempo de permanencia en plasma más largo como resultado de la unión a FcRn. La unión entre IgG y FcRn solo se observa en condiciones ácidas (pH 6,0). Por el contrario, la unión es casi indetectable en condición neutra (pH 7,4). El anticuerpo IgG se capta en células de manera inespecífica. El anticuerpo vuelve a la superficie celular mediante unión a FcRn endosómico en condición ácida endosómica y después se disocia de FcRn en condición neutra del plasma. Cuando la unión de FcRn en condición ácida se pierde al introducir mutaciones en la región Fc IgG, la ausencia de reciclaje de anticuerpos al plasma desde el endosoma altera notablemente el tiempo de permanencia de anticuerpos en el plasma. Un método presentado para mejorar la permanencia en plasma del anticuerpo IgG es mejorar la unión a FcRn en condiciones ácidas. Se introducen mutaciones de aminoácidos en la región Fc del anticuerpo IgG para mejorar la unión a FcRn en condiciones ácidas. Esto aumenta la eficacia del reciclaje al plasma desde el endosoma, lo que da lugar a una mejora de la permanencia en plasma. Un requisito importante en la sustitución de aminoácidos es no aumentar la unión a FcRn en condiciones neutras. Si un anticuerpo IgG se une a FcRn en condiciones neutras, el anticuerpo vuelve a la superficie celular mediante unión a FcRn en condición ácida endosómica y no se disocia de FcRn en condición neutra del plasma. En este caso, la permanencia en plasma se pierde más bien porque el anticuerpo IgG no se recicla al plasma. Por ejemplo, se ha señalado que un anticuerpo IgG1 modificado mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos de modo que el anticuerpo resultante sea capaz de unirse al FcRn de ratón en condición neutra (pH 7,4) presenta una permanencia en plasma muy escasa cuando se administra a ratones (documento no de patente 10). Asimismo, se ha modificado un anticuerpo IgG1 mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos de modo que el anticuerpo resultante presente mejor unión a FcRn humano en condición ácida (pH 6,0) y al mismo tiempo sea capaz de unirse a FcRn humano en condición neutra (pH 7,4) (documentos no de patente 10, 11 y 12). Se informó de que el anticuerpo resultante no mostraba mejora ni alteración en la permanencia en plasma cuando se administró a monos cinomolgos. Por tanto, la tecnología de ingeniería de anticuerpos para mejorar las funciones de los anticuerpos solo se ha centrado en la mejora de la permanencia en plasma de anticuerpos mejorando la unión a FcRn humano en condiciones ácidas sin mejorarla en condición neutra (pH 7,4). Hasta la fecha, no hay ningún informe que describa la ventaja de mejorar la unión de FcRn humano en condición neutra (pH 7,4) mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo IgG. Incluso si se mejora la afinidad antigénica del anticuerpo, no se puede mejorar la eliminación de antígenos del plasma. Se ha informado de que los anticuerpos de unión a antígeno dependientes del pH descritos anteriormente son más eficaces como un método para mejorar la eliminación de antígenos del plasma en comparación con anticuerpos habituales (documento de patente 1).
Por tanto, un único anticuerpo de unión a antígeno dependiente del pH se une a varios antígenos y es capaz de facilitar la eliminación de antígenos del plasma en comparación con anticuerpos habituales. Por consiguiente, los anticuerpos de unión a antígeno dependientes del pH tienen efectos que no logran los anticuerpos habituales. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún informe sobre métodos de ingeniería de anticuerpos para mejorar adicionalmente la capacidad de los anticuerpos de unión a antígenos dependiente del pH para unirse repetidas veces a antígenos y el efecto de mejorar la eliminación de antígenos del plasma.
Al mismo tiempo, la inmunogenicidad de los productos farmacéuticos de anticuerpos es muy importante desde el punto de vista de la permanencia en plasma, eficacia y seguridad cuando se administran a seres humanos.
Se ha informado de que si se producen anticuerpos contra productos farmacéuticos de anticuerpos administrados en el cuerpo humano, provocan efectos indeseables tales como aceleración de la eliminación de los productos farmacéuticos de anticuerpos del plasma, reducción de la eficacia e inducción de una reacción de hipersensibilidad e influencia en la seguridad (documento no de patente 13).
En primera instancia, cuando se tiene en cuenta la inmunogenicidad de los productos farmacéuticos de anticuerpos, se tienen que entender las funciones in vivo de los anticuerpos naturales. En primer lugar, la mayoría de los productos farmacéuticos de anticuerpos son anticuerpos que pertenecen a la clase IgG y se conoce la presencia de receptores Fcy (también denominados en lo sucesivo en el presente documento FcyR) como receptores de Fc que actúan uniéndose a la región de Fc de anticuerpos IgG. Los FcyR se expresan en la membrana celular de células dendríticas, linfocitos NK, macrófagos, neutrófilos, adipocitos y otros; y se sabe que transducen señales intracelulares activadoras o inhibidoras en células inmunitarias tras la unión de una región Fc IgG. Para la familia de proteínas FcyR humanas, se conocen isoformas FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa y FcYRIIIb, y también se han indicado sus alotipos (documento no de patente 14). Se han indicado dos alotipos para FcYRIIa humano: Arg (hFcYRIIa (R)) e His (hFcYRIIa (H)) en la posición 131. Asimismo, se han indicado dos alotipos para FcYRIIa humano: Val (hFcYRIIIa (V)) y Phe (hFcYRIIIa (F)) en la posición 158. Al mismo tiempo, para la familia de proteínas FcyR de ratón, se han indicado FcyRI, FcYRIIb, FcyRIII y FcyRIV (documento no de patente 15).
Los FcyR humanos incluyen los receptores activadores FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIIa y FcYRIIIb, y el receptor inhibidor FcYRIIb. Del mismo modo, los FcyR ratón incluyen los receptores activadores FcyRI, FcyRIII y FcyRIV, y el receptor inhibidor FcYRIIb.
Cuando el FcyR activador se reticula con un complejo inmunitario, fosforila motivos activadores de inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM) contenidos en el dominio intracelular o cadena Y común de FcR (un compañero de interacción), activa un transductor de señal SYK y desencadena una respuesta inmunitaria inflamatoria al iniciar una cascada de señales de activación (documento no de patente 15).
Se ha demostrado, que para la unión entre una región Fc y FcyR, determinados restos de aminoácidos en la región bisagra del anticuerpo y el dominio CH2, y la cadena de azúcar unida al dominio CH2 en Asn de la posición 297 en el sistema de numeración EU son importantes (documentos no de patente 15 a 17). Con un enfoque en anticuerpos introducidos con mutaciones en los sitios descritos anteriormente, se han investigado mutantes con diversas propiedades de unión a FcyR, y se obtuvieron mutantes de la región Fc que tienen mayor afinidad para activar los FcyR (documentos de patente 2 a 5).
Al mismo tiempo, FcYRIIb, que es un FcyR inhibidor, es el único FcyR expresado en linfocitos B (documento no de patente 18). Se ha informado de que la interacción de la región Fc del anticuerpo con FcYRIIb suprime la respuesta inmunitaria primaria de los linfocitos B (documento no de patente 19). Asimismo, se informa de que cuando FcYRIIb en linfocitos B y un receptor de linfocitos B (BCR) se entrecruzan a través de un complejo inmunitario en sangre, Se suprime la activación de linfocitos B y se suprime la producción de anticuerpos por linfocitos B (documento no de patente 20). En esta transducción de señal inmunosupresora mediada por BCR y FcYRIIb, es necesario el motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) contenido en el dominio intracelular de FcYRIIb (documentos no de patente 21 y 22). Esta acción inmunosupresora está provocada por la fosforilación de ITIM. Como resultado de la fosforilación, se recluta inositol polifosfato 5-fosfatasa que contiene SH2 (SHIP), se inhibe la transducción de otras cascadas de señales de FcyR activador y se suprime la respuesta inmunitaria inflamatoria (documento no de patente 23).
Debido a esta propiedad, FcYRIIb es prometedor como medio para reducir directamente la inmunogenicidad de productos farmacéuticos de anticuerpos. Exendina-4 (Ex4) es una proteína extraña para ratones, pero no se producen anticuerpos incluso cuando se administra a ratones una molécula fusionada con IgG1 (Ex4/Fc). Al mismo tiempo, se producen anticuerpos contra Ex4 tras la administración de la molécula (Ex4/Fc mut) que se obtiene modificando Ex4/Fc para que no se una a FcYRIIb en linfocitos B (documento no de patente 24). Este resultado sugiere que Ex4/Fc se une a FcYRIIb en linfocitos B e inhibe la producción de anticuerpos de ratón contra Ex4 en linfocitos B.
Asimismo, FcYRIIb también se expresa en células dendríticas, macrófagos, neutrófilos activados, mastocitos y basófilos. FcYRIIb inhibe las funciones de FcyR activador, tales como fagocitosis y liberación de citocinas inflamatorias en estas células, y suprime las respuestas inmunitarias inflamatorias (documento no de patente 25).
La importancia de las funciones inmunosupresoras de FcYRIIb se ha dilucidado hasta ahora a través de estudios usando ratones con inactivación de FcYRIIb. Hay informes de que en ratones con inactivación de FcYRIIb, la inmunidad humoral no está regulada adecuadamente (documento no de patente 26), la sensibilidad hacia la artritis inducida por colágeno (CIA) aumenta (documento no de patente 27), se presentan síntomas de tipo lupus y se presentan síntomas de tipo síndrome de Goodpasture (documento no de patente 28).
Asimismo, se ha informado de que la insuficiencia reguladora de FcYRIIb está relacionada con enfermedades autoinmunitarias humanas. Por ejemplo, se ha informado de la relación entre el polimorfismo genético en la región transmembrana y la región promotora de FcYRIIb, y la frecuencia de desarrollo del lupus eritematoso sistémico (LES) (documentos no de patente 29, 30, 31,32 y 33) y la disminución de la expresión de FcYRIIb en la superficie de linfocitos B en pacientes con LES (documentos no de patente 34 y 35).
A partir de modelos de ratón y hallazgos clínicos como tales, se considera que el FcYRIIb desempeña la función de controlar las enfermedades autoinmunitarias y las enfermedades inflamatorias principalmente a través de la participación de linfocitos B, y es una molécula diana prometedora para controlar las enfermedades autoinmunitarias y las enfermedades inflamatorias.
Se sabe que IgG1, utilizada principalmente como un producto farmacéutico de anticuerpo disponible en el mercado, se une no solo a FcYRIIb, sino también fuertemente a FcyR activador (documento no de patente 36). Puede ser posible desarrollar productos farmacéuticos de anticuerpos que tengan mayores propiedades inmunosupresoras en comparación con las de IgG1, utilizando una región Fc con unión mejorada a FcYRIIb o selectividad mejorada de unión a FcYRIIb en comparación con FcyR activador. Por ejemplo, se ha sugerido que el uso de un anticuerpo que tiene una región variable que se une a BCR y un Fc con unión mejorada a FcYRIIb puede inhibir la activación de linfocitos B (documento no de patente 37).
Sin embargo, FcYRIIb comparte una identidad de secuencia del 93 % en la región extracelular con la de FcYRIIa, que es uno de los FcyR activadores, y son muy similares estructuralmente. Existen alotipos de FcYRIIa, tipo H y tipo R, en los que el aminoácido en la posición 131 es His (tipo H) o Arg (tipo R) y, sin embargo, cada uno de ellos reacciona de manera diferente con los anticuerpos (documento no de patente 38). Por lo tanto, para producir una región Fc que se una específicamente a FcYRIIb, el problema más difícil puede ser conferir a la región Fc del anticuerpo la propiedad de actividad de unión a FcYRIIb mejorada de forma selectiva, lo que implica disminuir o no aumentar la actividad de unión hacia cada alotipo de FcYRIIa, aumentando al mismo tiempo la actividad de unión hacia FcYRIIb.
Se ha informado de un caso sobre la mejora de la especificidad de unión a FcYRIIb mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en la región Fc (documento no de patente 39). Según este documento, se construyeron mutantes de modo que, en comparación con IgG1, conservan su unión a FcYRIIb más que a FcYRIIa que tiene dos formas polimórficas. Sin embargo, en comparación con IgG1 natural, se ha descubierto que todos los mutantes que se ha señalado que tienen mejor especificidad para FcYRIIb en este documento tienen unión a FcYRIIb alterada. Por tanto, se considera difícil que los mutantes induzcan una reacción inmunosupresora mediada por FcYRIIb en mayor medida que IgG1.
También hay un informe sobre el aumento de la unión a FcYRIIb (documento no de patente 37). En este documento, se aumentó la unión a FcYRIIb mediante la introducción de mutaciones tales como 267E/L328F, G236D/S267E y S239D/S267E en la región Fc del anticuerpo. Entre ellas, un anticuerpo con la mutación S267E/L328F introducida se unió con más fuerza a FcYRIIb. Se ha mostrado que este mutante conserva la unión a FcyRIa y a FcYRIIa de tipo H a niveles comparables a los de la IgG1 natural. Incluso si la unión a FcYRIIb aumentara en relación con IgG1, solo se espera que el aumento de la unión a FcYRIIa, pero no el aumento de la unión a FcYRIIb, tenga un efecto en células tales como plaquetas que expresan FcYRIIa pero no FcYRIIb (documento no de patente 25). Por ejemplo, se ha informado de que las plaquetas se activan a través de un mecanismo dependiente de FcYRIIa en el eritematoso sistémico y la activación de las plaquetas se correlaciona con la gravedad (documento no de patente 40). Según otro informe, la mutación descrita anteriormente aumentó la unión a FcYRIIa de tipo R varios cientos de veces hasta el mismo grado que la unión a FcYRIIb y no mejoró la especificidad de unión para FcYRIIb en comparación con FcYRIIa de tipo R (documento de patente 17). Asimismo, en tipos celulares que expresan tanto FcYRIIa como FcYRIIb, tales como células dendríticas y macrófagos, la selectividad de unión para FcYRIIb en relación con FcYRIIa es esencial para la transducción de señales inhibidoras; sin embargo, dicha selectividad no se pudo lograr para el tipo R.
El FcYRIIa de tipo H y tipo R se encuentran casi en la misma proporción entre personas caucásicas y afroamericanas (documentos no de patente 41 y 42). Por lo tanto, existen determinadas restricciones sobre el uso de anticuerpos con mayor unión a FcYRIIa de tipo R para tratar enfermedades autoinmunitarias. Incluso si la unión a FcYRIIb aumentara en comparación con FcyR activador, el hecho de que la unión a cualquier forma polimórfica de FcYRIIa aumente no puede pasarse por alto desde el punto de vista de su uso como agente terapéutico para enfermedades autoinmunitarias.
Cuando se producen productos farmacéuticos de anticuerpos dirigidos a FcYRIIb para tratar enfermedades autoinmunitarias, es importante que la actividad de unión mediada por Fc a cualquier forma polimórfica de FcYRIIa no aumente o se reduzca preferiblemente, y que la actividad de unión a FcYRIIb aumente en comparación con la IgG natural. Sin embargo, no ha habido informes de mutantes que tengan las propiedades descritas anteriormente y, por tanto, existe una demanda para desarrollar dichos mutantes.
Se muestran a continuación documentos de la técnica anterior de la presente invención.
Documentos de la técnica anterior
[Documentos de patente]
[Documento de patente 1] WO 2009/125825
[Documento de patente 2] WO 2000/042072
[Documento de patente 3] WO 2006/019447
[Documento de patente 4] WO 2004/099249
[Documento de patente 5] WO 2004/029207
[Documentos no de patente]
[Documento no de patente 1] Janice M. Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden y Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic., Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073 - 1078
[Documento no de patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
[Documento no de patente 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29
[Documento no de patente 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG 1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356
[Documento no de patente 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640 [Documento no de patente 6] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (2005) 102 (24), 8466-8471
[Documento no de patente 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665
[Documento no de patente 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S., Catalytic antibodies and their applications., Curr Opin Biotechnol. (2005) 16 (6), 631-636
[Documento no de patente 9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J., Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 1004-1013
[Documento no de patente 10] Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, Wu H, Kiener PA, Langermann S., Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences., J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180
[Documento no de patente 11] Yeung YA, Leabman MK, Marvin JS, Qiu J, Adams CW, Lien S, Starovasnik MA, Lowman HB., Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates., J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671
[Documento no de patente 12] Datta-Mannan A, Witcher DR, Tang Y, Watkins J, Wroblewski VJ., Monoclonal antibody clearance. Impact of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor., J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717
[Documento no de patente 13] Niebecker R, Kloft C., Safety of therapeutic monoclonal antibodies., Curr. Drug Saf. (2010) 5 (4), 275-286
[Documento no de patente 14] Jefferis R, Lund J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models., Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
[Documento no de patente 15] Nimmerjahn F, Ravetch JV., Fcgamma receptors as regulators of immune responses., Nat. Rev. Immunol. (2008) 8 (1), 34-47
[Documento no de patente 16] M. Clark, Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms., Chemical Immunology (1997), 65, 88-110
[Documento no de patente 17] Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
[Documento no de patente 18] Amigorena S, Bonnerot C, Choquet D, Fridman WH, Teillaud JL., Fc gamma RII expression in resting and activated B lymphocytes., Eur. J. Immunol. (1989) 19, 1379-1385
[Document no de patente 19] Nicholas R, Sinclair SC, Regulation of the immune response. I. Reduction in ability of specific antibody to inhibit long-lasting IgG immunological priming after removal of the Fc fragment., J. Exp. Med. (1969) 129, 1183-1201
[Documento no de patente 20] Heyman B., Feedback regulation by IgG antibodies., Immunol. Lett. (2003) 88, 157-161 [Documento no de patente 21] S Amigorena, C Bonnerot, Drake, JR, D Choquet, W Hunziker, JG Guillet, P Webster, C Sautes, I Mellman y WH Fridman, Cytoplasmic domain heterogeneity and functions of IgG Fc receptors in B lymphocytes., Science (1992) 256, 1808-1812
[Documento no de patente 22] Muta, T., Kurosaki, T., Misulovin, Z., Sanchez, M., Nussenzweig, M. C. y Ravetch, J. V., A 13-amino-acid motif in the cytoplasmic domain of FcyRIIB modulates B-cell receptor signaling., Nature (1994) 368, 70-73
[Documento no de patente 23] Ravetch JV, Lanier LL., Immune inhibitory receptors., Science (2000) 290, 84-89 [Documento no de patente 24] Liang Y, Qiu H, Glinka Y, Lazarus AH, Ni H, Prud'homme GJ, Wang Q., Immunity against a therapeutic xenoprotein/Fc construct delivered by gene transfer is reduced through binding to the inhibitory receptor FcYRIIb., J. Gene Med. (2011) doi: 10.1002/jgm.1598
[Documento no de patente 25] Smith KG, Clatworthy MR., FcgammaRIIB in autoimmunity and infection: evolutionary and therapeutic implications., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10, 328-343
[Documento no de patente 26] Wernersson S, Karlsson MC, Dahlstrom J, Mattsson R, Verbeek JS, Heyman B., IgG-mediated enhancement of antibody responses is low in Fc receptor gamma chain-deficient mice and increased in Fc gamma RII-deficient mice., J. Immunol. (1999) 163, 618-622
[Documento no de patente 27] Joachim L. Schultze, Sabine Michalak, Joel Lowne, Adam Wong, Maria H. Gilleece, John G. Gribben y Lee M. Nadler, Human Non-Germinal Center B Cell Interleukin (IL)-12 Production Is Primarily Regulated by T Cell Signals CD40 Ligand, Interferon y, and IL-10: Role of B Cells in the Maintenance of T Cell Responses., J. Exp. Med. (1999) 189, 187-194
[Documento no de patente 28] Nakamura, A., Yuasa, T., Ujike, A., Ono, M., Nukiwa, T., Ravetch, J.V., Takai, T., Fcy receptor IIB-deficient mice develop Goodpasture's syndrome upon immunization with type IV collagen: A novel murine model for autoimmune glomerular basement membrane disease., J. Exp. Med. (2000) 191,899-906
[Documento no de patente 29] Blank MC, Stefanescu RN, Masuda E, Marti F, King PD, Redecha PB, Wurzburger RJ, Peterson MG, Tanaka S, Pricop L., Decreased transcription of the human FCGR2B gene mediated by the -343 G/C promoter polymorphism and association with systemic lupus erythematosus., Hum. Genet. (2005) 117, 220-227
[Documento no de patente 30] Olferiev M, Masuda E, Tanaka S, Blank MC, Pricop L., The Role of Activating Protein 1 in the Transcriptional Regulation of the Human FCGR2B Promoter Mediated by the -343 G ->C Polymorphism Associated with Systemic Lupus Erythematosus., J. Biol. Chem. (2007) 282, 1738-1746
[Documento no de patente 31] Lv J, Yang Y, Zhou X, Yu L, Li R, Hou P, Zhang H., FCGR3B copy number variation is not associated with lupus nephritis in a Chinese population., Arthritis Rheum. (2006) 54, 3908-3917
[Documento no de patente 32] Floto RA, Clatworthy MR, Heilbronn KR, Rosner DR, MacAry PA, Rankin A, Lehner PJ, Ouwehand WH, Allen JM, Watkins NA, Smith KG., Loss of function of a lupus-associated FcgammaRIIb polymorphism through exclusion from lipid rafts., Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058
[Documento no de patente 33] Li DH, Tung JW, Tarner IH, Snow AL, Yukinari T, Ngernmaneepothong R, Martinez OM, Parnes JR., CD72 Down-Modulates BCR-Induced Signal Transduction and Diminishes Survival in Primary Mature B Lymphocytes., J. Immunol. (2006) 176, 5321-5328
[Documento no de patente 34] Mackay M, Stanevsky A, Wang T, Aranow C, Li M, Koenig S, Ravetch JV, Diamond B., Selective dysregulation of the FcgammaIIB receptor on memory B cells in SLE., J. Exp. Med. (2006) 203, 2157-2164
[Documento no de patente 35] Su K, Yang H, Li X, Li X, Gibson AW, Cafardi JM, Zhou T, Edberg JC, Kimberly RP., Expression profile of FcgammaRIIb on leukocytes and its dysregulation in systemic lupus erythematosus., J. Immunol. (2007) 178, 3272-3280
[Documento no de patente 36] Bruhns P, Iannascoli B, England P, Mancardi DA, Fernandez N, Jorieux S, Daéron M., Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses., Blood (2009) 113, 3716-[Documento no de patente 37] Chu SY, Vostiar I, Karki S, Moore GL, Lazar GA, Pong E, Joyce PF, Szymkowski DE, Desjarlais JR., Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies., Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933
[Documento no de patente 38] Warmerdam PA, van de Winkel JG, Gosselin EJ, Capel PJ., Molecular basis for a polymorphism of human Fc gamma receptor II (CD32)., J. Exp. Med. (1990) 172, 19-25
[Documento no de patente 39] Armour, KL, van de Winkel, JG, Williamson, LM, Clark, MR., Differential binding to human FcgammaRIIa and FcgammaRIIb receptors by human IgG wildtype and mutant antibodies., Mol. Immunol. (2003) 40, 585-593
[Documentos no de patente 40] Science Translational Medicine (2010) Vol. 2, número 47, p. 47ra63
[Documento no de patente 41] Salmon JE, Millard S, Schachter LA, Arnett FC, Ginzler EM, Gourley MF, Ramsey-Goldman R, Peterson MG, Kimberly RP., Fc gamma RIIA alleles are heritable risk factors for lupus nephritis in African Americans., J. Clin. Invest. (1996) 97, 1348-1354
[Documento no de patente 42] Manger K, Repp R, Spriewald BM, Rascu A, Geiger A, Wassmuth R, Westerdaal NA, Wentz B, Manger B, Kalden JR, van de Winkel JG., Fcgamma receptor IIa polymorphism in Caucasian patients with systemic lupus erythematosus: association with clinical symptoms., Arthritis Rheum. (1998) 41, 1181-1189
[Documento no de patente 43] Qiao SW, Kobayashi K, Johansen FE, Sollid LM, Andersen JT, Milford E, Roopenian DC, Lencer WI, Blumberg RS., Dependence of antibody-mediated presentation of antigen on FcRn., Proc. Natl. Acad. Sci. (2008) 105 (27) 9337-9342
[Documento no de patente 44] Mi W, Wanjie S, Lo ST, Gan Z, Pickl-Herk B, Ober RJ, Ward ES., Targeting the neonatal fc receptor for antigen delivery using engineered fc fragments., J. Immunol. (2008) 181 (11), 7550-7561
Compendio de la invención
[Problemas a resolver por la invención]
Además de la participación de FcyR activador descrita anteriormente, el denominado mecanismo de presentación de antígenos es muy importante como factor en la inducción de la respuesta inmunitaria a productos farmacéuticos de anticuerpos administrados. La presentación de antígenos se refiere a un mecanismo inmunológico en el que, después de la internalización intracelular y la degradación de antígenos extraños tales como bacterias y antígenos endógenos, las células presentadoras de antígenos, tales como macrófagos y células dendríticas, presentan partes de los antígenos en la superficie celular. Los antígenos presentados son reconocidos por linfocitos T y otros, y activan la inmunidad tanto celular como humoral.
La ruta de presentación de antígenos por células dendríticas implica la internalización de un antígeno como un complejo inmunitario (un complejo formado entre un anticuerpo multivalente y un antígeno) en las células, degradación en el lisosoma y presentación de los péptidos resultantes derivados del antígeno por moléculas del MHC de clase II. FcRn desempeña una función importante en esta ruta; y se ha informado que cuando se utilizan células dendríticas deficientes en FcRn o complejos inmunitarios que son incapaces de unirse a FcRn, no se producen presentación de antígenos ni activación de linfocitos T resultante (documento no de patente 43).
Cuando se administra a animales normales una proteína antigénica como sustancia extraña, con frecuencia producen anticuerpos contra la proteína antigénica administrada. Por ejemplo, cuando se administra a ratones un receptor de IL-6 humano soluble como proteína extraña, producen anticuerpos de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble. Por otro lado, incluso cuando se administra a ratones un anticuerpo IgG1 humano como proteína extraña, apenas producen anticuerpos de ratón contra el anticuerpo IgG1 humano. Esta diferencia sugiere que la tasa de eliminación de la proteína extraña administrada del plasma podría influir.
Como se describe en el ejemplo de referencia 4, un anticuerpo IgG1 humano tiene la capacidad de unirse al FcRn de ratón en condiciones ácidas y, por tanto, como los anticuerpos de ratón, un anticuerpo IgG1 humano se recicla a través de FcRn de ratón cuando se incorpora en endosomas. Por este motivo, cuando se administra un anticuerpo IgG1 humano a ratones normales, la eliminación del anticuerpo del plasma es muy lenta. Al mismo tiempo, un receptor de IL-6 humano soluble no se recicla a través de FcRn de ratón y, por tanto, se elimina rápidamente después de la administración. Por otro lado, como se describe en el ejemplo de referencia 4, la producción de anticuerpos de ratón contra un anticuerpo de IL-6R humano soluble se observa en ratones normales a los que se administra un receptor de IL-6 humano soluble, mientras que la producción de anticuerpos de ratón contra un anticuerpo IgG1 humano no se encuentra en ratones normales a los que se administra un anticuerpo IgG1 humano. En otras palabras, un receptor de IL-6 humano soluble que se elimina rápidamente es más inmunogénico en ratones que un anticuerpo IgG1 humano que se elimina lentamente.
Se supone que parte de la ruta para la eliminación de estas proteínas extrañas (receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo IgG1 humano) del plasma es captada por células presentadoras de antígenos. Las proteínas extrañas incorporadas en células presentadoras de antígenos se asocian con moléculas del MHC de clase II después del procesamiento intracelular y se transportan a la membrana celular. A continuación, la presentación de un antígeno a linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, linfocitos T que responden específicamente a un receptor de IL-6 humano soluble o un anticuerpo IgG1 humano) induce la activación de linfocitos T específicos de antígeno. En este contexto, es de suponer que es difícil que una proteína extraña que se elimina lentamente del plasma se procese en células presentadoras de antígeno y, como resultado, es poco probable que se produzca presentación de antígeno a linfocitos T específicos de antígeno.
Se sabe que la unión a FcRn en condiciones neutras afecta negativamente a la permanencia del anticuerpo en plasma. Una vez que un anticuerpo IgG se une a FcRn en condiciones neutras, incluso si se vuelve a la superficie celular en condiciones ácidas endosómicas como resultado de la unión a FcRn, el anticuerpo IgG no puede reciclarse al plasma sin disociarse de FcRn en condición neutra en plasma; y esto altera negativamente la permanencia en plasma. Por ejemplo, según un informe (documento no de patente 10), cuando se administró a ratones un anticuerpo que se vuelve capaz de unirse a FcRn de ratón en condición neutra (pH 7,4) como resultado de sustituciones de aminoácidos introducidas en IgG1, empeoró la permanencia del anticuerpo en plasma. Al mismo tiempo, se ha informado de que cuando se administró a monos cinomolgos un anticuerpo que se ha confirmado que se une al FcRn humano en condición neutra (pH 7,4), la permanencia del anticuerpo en plasma no se prolongó, sino que permaneció más bien inalterada (documentos no de patente 10 a 12). Cuando el tiempo de permanencia de una molécula de unión a antígeno en plasma se acorta debido al aumento de su unión a FcRn en condición neutra (pH 7,4), la inmunogenicidad puede aumentar debido a la aceleración de la eliminación de la molécula de unión a antígeno.
Asimismo, se ha informado de que FcRn se expresa en células presentadoras de antígenos y participa en la presentación de antígenos. Según un informe publicado sobre la evaluación de la inmunogenicidad de una proteína resultante de la fusión de proteína básica de mielina (PBM), aunque no es una molécula de unión a antígeno, con la región Fc de IgG1 de ratón (en lo sucesivo en el presente documento abreviado como PBM-Fc), los linfocitos T que responden de una manera específica de PBM-Fc se activan y proliferan cuando se cultivan en presencia de PBM-Fc. En este aspecto, se sabe que la activación de linfocitos T se intensifica in vitro añadiendo a la región Fc de PBM-Fc una modificación que potencia la unión a FcRn para aumentar la incorporación en células presentadoras de antígenos a través de FcRn expresado en las células presentadoras de antígenos. Se ha informado de que, independientemente de la eliminación acelerada del plasma como resultado de la adición de una modificación que mejora la unión a FcRn, se ha informado de que la activación de linfocitos T in vivo está más bien alterada (documento no de patente 44). Por tanto, la inmunogenicidad no se mejora necesariamente cuando la eliminación se acelera al aumentar la unión a FcRn.
Como se ha descrito anteriormente, no ha habido suficiente investigación para comprender cómo el aumento de la unión a FcRn de una molécula de unión a antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn en condición neutra (pH 7,4) influye en la permanencia en plasma y la inmunogenicidad de la molécula de unión a antígeno. Por tanto, no se ha informado de ningún método para mejorar la permanencia en plasma y la inmunogenicidad de moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condición neutra (pH 7,4).
Se ha revelado que la eliminación de antígeno del plasma puede acelerarse mediante el uso de una molécula de unión a antígeno que comprende el dominio de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro. Sin embargo, no se han realizado suficientes estudios para comprender cómo el aumento de la actividad de unión a FcRn de una región Fc en un intervalo de pH neutro influye en la permanencia de moléculas de unión a antígeno en plasma y la inmunogenicidad. Durante los estudios, los presentes inventores encontraron el problema de que, como resultado del aumento de la actividad de unión a FcRn de la región Fc en un intervalo de pH neutro, el tiempo de permanencia de la molécula de unión a antígeno en plasma se reduce (la farmacocinética empeora) y la inmunogenicidad de la molécula de unión a antígeno se eleva (se agrava la respuesta inmunitaria a la molécula de unión a antígeno).
La presente invención se logró en vista de las circunstancias descritas anteriormente. Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para mejorar la farmacocinética en animales a los que se administra una molécula de unión a antígeno modificando la región Fc de la molécula de unión a antígeno que comprende el dominio de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para reducir la respuesta inmunitaria a una molécula de unión a antígeno modificando la región Fc de la molécula de unión a antígeno que comprende el dominio de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar moléculas de unión a antígeno que presenten mejor farmacocinética o respuesta inmunitaria in vivo alterada cuando se administren a animales. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar métodos para producir dichas moléculas de unión a antígeno así como composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo las moléculas de unión a antígeno.
[Medios para resolver los problemas]
Los presentes inventores realizaron estudios dedicados para lograr los objetivos descritos anteriormente. Como resultado, los presentes inventores revelaron que una molécula de unión a antígeno que comprende el dominio de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro formaron un heterocomplejo que consta de cuatro moléculas: molécula de unión a antígeno/dos moléculas de FcRn/receptor Fcy activador (fig. 48). Los presentes inventores también han demostrado que la formación del tetrámeros afectó de negativamente a la farmacocinética y la respuesta inmunitaria. Los presentes inventores han demostrado que la farmacocinética de una molécula de unión a antígeno se mejoró al modificar la región Fc de dicha molécula de unión a antígeno en una región Fc que en un intervalo de pH neutro no forma un complejo de heterotetrámero que comprende dos moléculas de FcRn y un receptor Fcy activador. Los presentes inventores también han demostrado que la respuesta inmunitaria en animales a los que se ha administrado una molécula de unión a antígeno podría alterarse al modificar la región Fc de dicha molécula de unión a antígeno en una región Fc que en un intervalo de pH neutro no forma un complejo de tetrámero que comprende dos moléculas de FcRn y un receptor Fcy activador. Los presentes inventores también han demostrado que la respuesta inmunitaria a la molécula de unión a antígeno se redujo mediante la modificación en una región Fc que en un intervalo de pH neutro no forma un complejo de heterotetrámero que comprende dos moléculas de FcRn y un receptor Fcy activador. Asimismo, los presentes inventores han descubierto moléculas de unión a antígeno y métodos para producirlas, y además encontraron que, cuando se administran, las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo una molécula de unión a antígeno o una molécula de unión a antígeno producida mediante un método de producción de la presente invención tenían propiedades superiores tales como farmacocinética mejorada y reducción de la respuesta inmunitaria en el organismo vivo administrado en comparación con moléculas de unión a antígeno convencionales; y completaron de este modo la presente invención.
De manera más específica, la presente invención proporciona lo siguiente.
1. Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG humano de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es
(i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/Kd (pH 7,4) es 2 o más; o
(ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una cuya actividad de unión a un receptor Fcy activador es menor que la actividad de unión de una región Fc de la IgG humana de tipo silvestre al receptor Fcy activador, en donde la actividad de unión se refiere a la KD. El método del artículo 1, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc en uno cualquiera o más aminoácidos de las posiciones 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 y 329 como se indica mediante la numeración EU.
El método del artículo 2, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc como se indica mediante la numeración EU en uno cualquiera o más de:
el aminoácido de la posición 234 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr y Trp;
el aminoácido de la posición 235 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val y Arg;
el aminoácido de la posición 236 por uno cualquiera de Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro y Tyr; el aminoácido de la posición 237 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr y Arg;
el aminoácido de la posición 238 por uno cualquiera de Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp y Arg; el aminoácido de la posición 239 por uno cualquiera de Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr y Arg;
el aminoácido de la posición 265 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 266 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 267 por uno cualquiera de Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 269 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 270 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 271 por uno cualquiera de Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 295 por uno cualquiera de Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 296 por uno cualquiera de Arg, Gly, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 297 por Ala;
el aminoácido de la posición 298 por uno cualquiera de Arg, Gly, Lys, Pro, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 300 por uno cualquiera de Arg, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 324 por Lys o Pro;
el aminoácido de la posición 325 por uno cualquiera de Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr y Val; el aminoácido de la posición 327 por uno cualquiera de Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 328 por uno cualquiera de Arg, Asn, Gly, His, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 329 por uno cualquiera de Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y Arg;
el aminoácido de la posición 330 por Pro o Ser;
el aminoácido de la posición 331 por uno cualquiera de Arg, Gly y Lys; o
el aminoácido de la posición 332 por uno cualquiera de Arg, Lys y Pro.
Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es
(i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/Kd (pH 7,4) es 2 o más; o
(ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una que tiene una mayor actividad de unión a un receptor Fcy inhibidor que a un receptor Fcy activador, en donde la actividad de unión se refiere a KD, en donde el receptor Fcy inhibidor es FcYRIIb humano y en donde el receptor Fcy activador es FcYRIa humano, FcYRIIa(R) humano, FcYRIIa(H) humano, FcYRIIIa(V) humano o FcyRIIIa(F) humano.
El método del artículo 4, en donde dicha modificación comprende sustituir el aminoácido de la posición 238 o 328 indicado por la numeración EU.
El método del artículo 5, en donde dicha modificación comprende sustituir el aminoácido de la posición 238 por Asp o el aminoácido de la posición 328 por Glu indicado por la numeración EU.
El método del artículo 5 o 6, en donde dicha modificación comprende sustituir uno o más aminoácidos cualesquiera de:
el aminoácido de la posición 233 por Asp;
el aminoácido de la posición 234 por Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 237 por uno cualquiera de Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 239 por Asp;
el aminoácido de la posición 267 por uno cualquiera de Ala, Gln y Val;
el aminoácido de la posición 268 por uno cualquiera de Asn, Asp y Glu;
el aminoácido de la posición 271 por Gly;
el aminoácido de la posición 326 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser y Thr;
el aminoácido de la posición 330 por uno cualquiera de Arg, Lys y Met;
el aminoácido de la posición 323 por uno cualquiera de Ile, Leu y Met; y
el aminoácido de la posición 296 por Asp; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
El método de uno cualquiera de los artículos 1 a 7, en donde la región Fc comprende uno o más aminoácidos que son diferentes de los aminoácidos de la región Fc nativa en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311,312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 de dicha región Fc como se indica por la numeración EU.
El método del artículo 8, en donde los aminoácidos de dicha región Fc indicados por la numeración EU son una combinación de uno o más de:
Met en la posición de aminoácido 237;
Ile en la posición de aminoácido 248;
uno cualquiera de Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 250;
uno cualquiera de Phe, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 252;
Thr en la posición de aminoácido 254;
Glu en la posición de aminoácido 255;
uno cualquiera de Asn, Asp, Glu y Gln en la posición de aminoácido 256;
uno cualquiera de Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr y Val en la posición de aminoácido 257;
His en la posición de aminoácido 258;
Ala en la posición de aminoácido 265;
Ala o Glu en la posición de aminoácido 286;
His en la posición de aminoácido 289;
Ala en la posición de aminoácido 297;
Gly en la posición de aminoácido 298;
Ala en la posición de aminoácido 303;
Ala en la posición de aminoácido 305;
uno cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 307;
uno cualquiera de Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln y Thr en la posición de aminoácido 308;
uno cualquiera de Ala, Asp, Glu, Pro y Arg en la posición de aminoácido 309;
uno cualquiera de Ala, His e Ile en la posición de aminoácido 311;
Ala o His en la posición de aminoácido 312;
Lys o Arg en la posición de aminoácido 314;
uno cualquiera de Ala, Asp e His en la posición de aminoácido 315;
Ala en la posición de aminoácido 317;
Val en la posición de aminoácido 332;
Leu en la posición de aminoácido 334;
His en la posición de aminoácido 360;
Ala en la posición de aminoácido 376;
Ala en la posición de aminoácido 380;
Ala en la posición de aminoácido 382;
Ala en la posición de aminoácido 384;
Asp o His en la posición de aminoácido 385;
Pro en la posición de aminoácido 386;
Glu en la posición de aminoácido 387;
Ala o Ser en la posición de aminoácido 389;
Ala en la posición de aminoácido 424;
uno cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 428;
Lys en la posición de aminoácido 433;
uno cualquiera de Ala, Phe, His, Ser, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 434; y
uno cualquiera de His, Ile, Leu, Phe, Thr y Val en la posición de aminoácido 436.
Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG humano de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es
(i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/Kd (pH 7,4) es 2 o más; o
(ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una en la que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en relación con un polipéptido que constituye la región Fc de la IgG humana de tipo silvestre y el otro tiene la actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 de la IgG humana de tipo silvestre, en donde la actividad de unión es KD.
El método del artículo 10, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido en una o más cualesquiera de las posiciones 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311,312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 como se indica por la numeración EU en la secuencia de aminoácidos de uno de los dos polipéptidos que constituyen dicha región Fc.
El método del artículo 11, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc en uno cualquiera o más de:
aminoácido de a posición 237 por Met;
aminoácido de a posición 248 por Ile;
aminoácido de a posición 250 por Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp o Tyr;
aminoácido de a posición 252 por Phe, Trp o Tyr;
aminoácido de a posición 254 por Thr;
aminoácido de a posición 255 por Glu;
aminoácido de a posición 256 por Asn, Asp, Glu o Gln;
aminoácido de a posición 257 por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val;
aminoácido de a posición 258 por His;
aminoácido de a posición 265 por Ala;
aminoácido de a posición 286 por Ala o Glu;
aminoácido de a posición 289 por His;
aminoácido de a posición 297 por Ala;
aminoácido de a posición 298 por Gly;
aminoácido de a posición 303 por Ala;
aminoácido de a posición 305 por Ala;
aminoácido de a posición 307 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr;
aminoácido de a posición 308 por Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln o Thr;
aminoácido de a posición 309 por Ala, Asp, Glu, Pro o Arg;
aminoácido de a posición 311 por Ala, His o Ile;
el aminoácido de la posición 312 por Ala o His;
el aminoácido de la posición 314 por Lys o Arg;
el aminoácido de la posición 315 por Ala, Asp o His;
el aminoácido de la posición 317 por Ala;
el aminoácido de la posición 332 por Val;
el aminoácido de la posición 334 por Leu;
el aminoácido de la posición 360 por His;
el aminoácido de la posición 376 por Ala;
el aminoácido de la posición 380 por Ala;
el aminoácido de la posición 382 por Ala;
el aminoácido de la posición 384 por Ala;
el aminoácido de la posición 385 por Asp o His;
el aminoácido de la posición 386 por Pro;
el aminoácido de la posición 387 por Glu;
el aminoácido de la posición 389 por Ala o Ser;
el aminoácido de la posición 424 por Ala;
el aminoácido de la posición 428 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; el aminoácido de la posición 433 por Lys;
el aminoácido de la posición 434 por Ala, Phe, His, Ser, Trp o Tyr; y
el aminoácido de la posición 436 por His, Ile, Leu, Phe, Thr o Val; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
También se proporciona:
[1] Un método de (a) o (b) a continuación, en donde el método comprende modificar la región Fc de una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro en una región Fc que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador en un intervalo de pH neutro:
(a) un método para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión a antígeno; y
(b) un método para reducir la inmunogenicidad de una molécula de unión a antígeno.
[2] El método de [1], en donde la modificación en una región Fc que no forma dicho heterocomplejo comprende modificar la región Fc en una región Fc cuya actividad de unión a un receptor Fcy activador es menor que la actividad de unión de una región Fc de IgG humana nativa al receptor Fcy activador.
[3] El método de [1] o [2], en donde el receptor Fcy activador es FcYRIa humano, FcYRIIa(R) humano, FcYRIIa(H) humano, FcYRIIIa(V) humano o FcYRIIIa(F) humano.
[4] El método de uno cualquiera de [1] a [3], que comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc en uno cualquiera o más aminoácidos de las posiciones 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 y 329 como se indica mediante la numeración EU.
[5] El método de [4], que comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc como se indica mediante la numeración EU en uno cualquiera o más de:
el aminoácido de la posición 234 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr y Trp;
el aminoácido de la posición 235 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val y Arg;
el aminoácido de la posición 236 por uno cualquiera de Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro y Tyr;
el aminoácido de la posición 237 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr y Arg;
el aminoácido de la posición 238 por uno cualquiera de Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp y Arg;
el aminoácido de la posición 239 por uno cualquiera de Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr y Arg;
el aminoácido de la posición 265 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 266 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 267 por uno cualquiera de Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 269 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 270 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 271 por uno cualquiera de Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 295 por uno cualquiera de Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp y Tyr; el aminoácido de la posición 296 por uno cualquiera de Arg, Gly, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 297 por Ala;
el aminoácido de la posición 298 por uno cualquiera de Arg, Gly, Lys, Pro, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 300 por uno cualquiera de Arg, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 324 por Lys o Pro;
el aminoácido de la posición 325 por uno cualquiera de Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr y Val; el aminoácido de la posición 327 por uno cualquiera de Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 328 por uno cualquiera de Arg, Asn, Gly, His, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 329 por uno cualquiera de Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y Arg;
el aminoácido de la posición 330 por Pro o Ser;
el aminoácido de la posición 331 por uno cualquiera de Arg, Gly y Lys; o
el aminoácido de la posición 332 por uno cualquiera de Arg, Lys y Pro.
[6] El método de [1], en donde la modificación en una región Fc que no forma dicho heterocomplejo comprende modificar la región Fc en una región Fc que tiene una mayor actividad de unión a un receptor Fcy inhibidor que a un receptor Fcy activador.
[7] El método de [6], en donde el receptor Fcy inhibidor es FcYRIIb humano.
[8] El método de [6] o [7], en donde el receptor Fcy activador es FcYRIa humano, FcYRIIa(R) humano, FcYRIIa(H) humano, FcYRIIIa(V) humano o FcYRIIIa(F) humano.
[9] El método de uno cualquiera de [6] a [8], que comprende sustituir el aminoácido de la posición 238 o 328 indicado por la numeración EU.
[10] El método de [9], que comprende sustituir el aminoácido de la posición 238 por Asp o el aminoácido de la posición 328 por Glu indicado por la numeración EU.
[11] El método de [9] o [10], que comprende sustituir uno o más aminoácidos de:
el aminoácido de la posición 233 por Asp;
el aminoácido de la posición 234 por Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 237 por uno cualquiera de Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 239 por Asp;
el aminoácido de la posición 267 por uno cualquiera de Ala, Gln y Val;
el aminoácido de la posición 268 por uno cualquiera de Asn, Asp y Glu;
el aminoácido de la posición 271 por Gly;
el aminoácido de la posición 326 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser y Thr;
el aminoácido de la posición 330 por uno cualquiera de Arg, Lys y Met;
el aminoácido de la posición 323 por uno cualquiera de Ile, Leu y Met; y
el aminoácido de la posición 296 por Asp; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
[12] El método de uno cualquiera de [1] a [11], en donde la región Fc comprende uno o más aminoácidos que son diferentes de los aminoácidos de la región Fc nativa en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 de dicha región Fc como se indica por la numeración EU.
[13] El método de [12], en donde los aminoácidos de dicha región Fc indicados por la numeración EU son una combinación de uno o más de:
Met en la posición de aminoácido 237;
Ile en la posición de aminoácido 248;
uno cualquiera de Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 250;
uno cualquiera de Phe, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 252;
Thr en la posición de aminoácido 254;
Glu en la posición de aminoácido 255;
uno cualquiera de Asp, Asn, Glu y Gln en la posición de aminoácido 256;
uno cualquiera de Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr y Val en la posición de aminoácido 257;
His en la posición de aminoácido 258;
Ala en la posición de aminoácido 265;
Ala o Glu en la posición de aminoácido 286;
His en la posición de aminoácido 289;
Ala en la posición de aminoácido 297;
Gly en la posición de aminoácido 298;
Ala en la posición de aminoácido 303;
Ala en la posición de aminoácido 305;
uno cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 307;
uno cualquiera de Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln y Thr en la posición de aminoácido 308;
uno cualquiera de Ala, Asp, Glu, Pro y Arg en la posición de aminoácido 309;
uno cualquiera de Ala, His e Ile en la posición de aminoácido 311;
Ala o His en la posición de aminoácido 312;
Lys o Arg en la posición de aminoácido 314;
uno cualquiera de Ala, Asp e His en la posición de aminoácido 315;
Ala en la posición de aminoácido 317;
Val en la posición de aminoácido 332;
Leu en la posición de aminoácido 334;
His en la posición de aminoácido 360;
Ala en la posición de aminoácido 376;
Ala en la posición de aminoácido 380;
Ala en la posición de aminoácido 382;
Ala en la posición de aminoácido 384;
Asp o His en la posición de aminoácido 385;
Pro en la posición de aminoácido 386;
Glu en la posición de aminoácido 387;
Ala o Ser en la posición de aminoácido 389;
Ala en la posición de aminoácido 424;
uno cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 428;
Lys en la posición de aminoácido 433;
uno cualquiera de Ala, Phe, His, Ser, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 434; y
uno cualquiera de His, Ile, Leu, Phe, Thr y Val en la posición de aminoácido 436.
[14] El método de uno cualquiera de [1] a [13], en donde dicho dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones de calcio.
[15] El método de [14], en donde dicho dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía de tal manera que la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de calcio es menor que la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de calcio.
[16] El método de uno cualquiera de [1] a [13], en donde dicho dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo del pH.
[17] El método de [16], en donde dicho dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía de tal manera que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH neutro.
[18] El método de uno cualquiera de [1] a [17], en donde el dominio de unión a antígeno es una región variable de anticuerpo.
[19] El método de uno cualquiera de [1] a [18], en donde la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo.
[20] El método de [1], en donde la modificación en una región Fc que no forma dicho heterocomplejo comprende la modificación en una región Fc en la que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro y el otro no tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro.
[21] El método de [20], que comprende sustituir un aminoácido en una o más cualesquiera de las posiciones 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 como se indica por la numeración Eu en la secuencia de aminoácidos de uno de los dos polipéptidos que constituyen dicha región Fc.
[22] El método de [21], que comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc en uno cualquiera o más de: el aminoácido de la posición 237 por Met;
el aminoácido de la posición 248 por Ile;
el aminoácido de la posición 250 por Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 252 por Phe, Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 254 por Thr;
el aminoácido de la posición 255 por Glu;
el aminoácido de la posición 256 por Asp, Asn, Glu o Gln;
el aminoácido de la posición 257 por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val;
el aminoácido de la posición 258 por His;
el aminoácido de la posición 265 por Ala;
el aminoácido de la posición 286 por Ala o Glu;
el aminoácido de la posición 289 por His;
el aminoácido de la posición 297 por Ala;
el aminoácido de la posición 298 por Gly;
el aminoácido de la posición 303 por Ala;
el aminoácido de la posición 305 por Ala;
el aminoácido de la posición 307 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; el aminoácido de la posición 308 por Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln o Thr;
el aminoácido de la posición 309 por Ala, Asp, Glu, Pro o Arg;
el aminoácido de la posición 311 por Ala, His o Ile;
el aminoácido de la posición 312 por Ala o His;
el aminoácido de la posición 314 por Lys o Arg;
el aminoácido de la posición 315 por Ala, Asp o His;
el aminoácido de la posición 317 por Ala;
el aminoácido de la posición 332 por Val;
el aminoácido de la posición 334 por Leu;
el aminoácido de la posición 360 por His;
el aminoácido de la posición 376 por Ala;
el aminoácido de la posición 380 por Ala;
el aminoácido de la posición 382 por Ala;
el aminoácido de la posición 384 por Ala;
el aminoácido de la posición 385 por Asp o His;
el aminoácido de la posición 386 por Pro;
el aminoácido de la posición 387 por Glu;
el aminoácido de la posición 389 por Ala o Ser;
el aminoácido de la posición 424 por Ala;
el aminoácido de la posición 428 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; el aminoácido de la posición 433 por Lys;
el aminoácido de la posición 434 por Ala, Phe, His, Ser, Trp o Tyr; y
el aminoácido de la posición 436 por His, Ile, Leu, Phe, Thr o Val; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
[23] El método de uno cualquiera de [20] a [22], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de calcio.
[24] El método de [23], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía de tal manera que la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de calcio es menor que la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de calcio.
[25] El método de uno cualquiera de [20] a [22], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo del pH.
[26] El método de [25], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía de tal manera que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH neutro.
[27] El método de uno cualquiera de [20] a [26], en donde el dominio de unión a antígeno es una región variable de anticuerpo.
[28] El método de uno cualquiera de [20] a [27], en donde la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo.
[29] Una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro, en donde la región Fc comprende uno o más aminoácidos seleccionados de:
Ala en la posición de aminoácido 234;
Ala, Lys o Arg en la posición de aminoácido 235;
Arg en la posición de aminoácido 236;
Arg en la posición de aminoácido 238;
Lys en la posición de aminoácido 239;
Phe en la posición de aminoácido 270;
Ala en la posición de aminoácido 297;
Gly en la posición de aminoácido 298;
Gly en la posición de aminoácido 325;
Arg en la posición de aminoácido 328; y
Lys o Arg en la posición de aminoácido 329; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
[30] La molécula de unión a antígeno de [29], que comprende uno o más aminoácidos seleccionados de:
Lys o Arg en la posición de aminoácido 237;
Lys en la posición de aminoácido 238;
Arg en la posición de aminoácido 239; y
Lys o Arg en la posición de aminoácido 329; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
[31] Una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc en la que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro y el otro no tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro.
[32] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [31], en donde la región Fc comprende uno o más aminoácidos que son diferentes de los aminoácidos de una región Fc nativa en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311,312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 indicado por la numeración EU en la secuencia de aminoácidos de uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc.
[33] La molécula de unión a antígeno de [32], que comprende una combinación de uno o más aminoácidos de dicha región Fc de:
Met en la posición de aminoácido 237;
Ile en la posición de aminoácido 248;
Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp o Tyr en la posición de aminoácido 250;
Phe, Trp o Tyr en la posición de aminoácido 252;
Thr en la posición de aminoácido 254;
Glu en la posición de aminoácido 255;
Asp, Asn, Glu o Gln en la posición de aminoácido 256;
Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val en la posición de aminoácido 257;
His en la posición de aminoácido 258;
Ala en la posición de aminoácido 265;
Ala o Glu en la posición de aminoácido 286;
His en la posición de aminoácido 289;
Ala en la posición de aminoácido 297;
Ala en la posición de aminoácido 303;
Ala en la posición de aminoácido 305;
Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr en la posición de aminoácido 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln o Thr en la posición de aminoácido 308;
Ala, Asp, Glu, Pro o Arg en la posición de aminoácido 309;
Ala, His o Ile en la posición de aminoácido 311;
Ala o His en la posición de aminoácido 312;
Lys o Arg en la posición de aminoácido 314;
Ala, Asp o His en la posición de aminoácido 315;
Ala en la posición de aminoácido 317;
Val en la posición de aminoácido 332;
Leu en la posición de aminoácido 334;
His en la posición de aminoácido 360;
Ala en la posición de aminoácido 376;
Ala en la posición de aminoácido 380;
Ala en la posición de aminoácido 382;
Ala en la posición de aminoácido 384;
Asp o His en la posición de aminoácido 385;
Pro en la posición de aminoácido 386;
Glu en la posición de aminoácido 387;
Ala o Ser en la posición de aminoácido 389;
Ala en la posición de aminoácido 424;
Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr en la posición de aminoácido 428;
Lys en la posición de aminoácido 433;
Ala, Phe, His, Ser, Trp o Tyr en la posición de aminoácido 434; e His,
Ile, Leu, Phe, Thr o Val en la posición de aminoácido 436; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
[34] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [33], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones de calcio.
[35] La molécula de unión a antígeno de [34], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía de tal manera que la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de calcio es menor que la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de calcio.
[36] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [33], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo del pH.
[37] La molécula de unión a antígeno de [36], en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía de tal manera que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH neutro.
[38] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [37], en donde el dominio de unión a antígeno es una región variable de anticuerpo.
[39] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [38], en donde la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo.
[40] Un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [39].
[41] Un vector que está unido operativamente al polinucleótido de [40].
[42] Una célula en la que se ha introducido el vector de [41].
[43] Un método para producir la molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [39], que comprende la etapa de recoger la molécula de unión a antígeno de un cultivo de la célula de [42].
[44] Una composición farmacéutica que comprende como principio activo la molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de [29] a [39] o una molécula de unión a antígeno obtenida mediante el método de producción de [43]. Asimismo, se describen equipos para su uso en los métodos de la presente invención, que comprenden una molécula de unión a antígeno de la presente invención o una molécula de unión a antígeno producida mediante un método de producción de la presente invención. También se describen agentes para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión a antígeno y agentes para alterar la inmunogenicidad de una molécula de unión a antígeno, que comprenden como principio activo una molécula de unión a antígeno descrita en el presente documento o una molécula de unión a antígeno producida mediante un método de producción de la presente invención. También se describen métodos para tratar enfermedades inmunitarias/inflamatorias, que comprenden la etapa de administrar a un sujeto una molécula de unión a antígeno de la presente descripción o una molécula de unión a antígeno producida mediante un método de producción de la presente invención. Además, se describe el uso de moléculas de unión a antígeno de la presente descripción o moléculas de unión a antígeno producidas por un método de producción de la presente invención en la producción de agentes para mejorar la farmacocinética de moléculas de unión a antígeno y agentes para alterar la inmunogenicidad de moléculas de unión a antígeno. También se describen moléculas de unión a antígeno de la presente descripción o moléculas de unión a antígeno producidas mediante un método de producción de la presente invención para su uso en los métodos de la presente invención.
[Efectos de la invención]
La presente invención proporciona métodos para mejorar la farmacocinética de moléculas de unión a antígeno y métodos para alterar la inmunogenicidad de moléculas de unión a antígeno. La presente invención permite la terapia con anticuerpos sin provocar efectos desfavorables in vivo en comparación con los anticuerpos generales.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 es un diagrama que muestra los efectos sobre un antígeno soluble de un anticuerpo neutralizante existente y un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera dependiente del pH y presenta aumento de la unión a FcRn en condición neutra.
La fig. 2 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración en plasma después de la administración intravenosa o subcutánea de Fv4-IgG1 o Fv4-IgG1-F1 a ratones normales.
La fig. 3 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcYRIa humano. La fig.4 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcYRIIa(R) humano. La fig.5 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcYRIIa(H) humano. La fig. 6 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcYRIIb humano. La fig.7 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcYRIIIa(F) humano. La fig. 8 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1 -F157 se une a FcyRI de ratón. La fig. 9 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcYRIIb de ratón. La fig. 10 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcyRIII de ratón. La fig. 11 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se une a FcyRIV de ratón. La fig. 12 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn de ratón, Fv4-IgG1-F20 se une a FcyRI de ratón, FcYRIIb de ratón, FcyRIII de ratón y FcyRIV de ratón.
La fig. 13 es un gráfico que demuestra que en un estado unido a FcRn de ratón, mPM1-mIgG1-mF3 se une a FcYRIIb de ratón y FcyRIII de ratón.
La fig. 14 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración en plasma de Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1 -F140, Fv4-IgG1-F157 y Fv4-IgG1-F424 en ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 15 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración en plasma de Fv4-IgG1 y Fv4-IgG1-F760 en ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 16 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración en plasma de Fv4-IgG1-F1 1, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 y Fv4-IgG1-F1009 en ratones transgénicos con FcRn humano. La fig. 17 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración en plasma de mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39 y mPM1-mIgG1-mF40 en ratones normales.
La fig. 18 es un diagrama que muestra el resultado de la evaluación de la inmunogenicidad usando Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F140.
La fig. 19 es un diagrama que muestra el resultado de la evaluación de la inmunogenicidad usando hA33-IgG1-F21 y hA33-IgG1-F140.
La fig. 20 es un diagrama que muestra el resultado de la evaluación de la inmunogenicidad usando hA33-IgG1-F698 y hA33-IgG1-F699.
La fig. 21 es un diagrama que muestra el resultado de la evaluación de la inmunogenicidad usando hA33-IgG1-F698 y hA33-IgG1-F763.
La fig. 22 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra Fv4-IgG1-F1 1,3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 23 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra Fv4-IgG1-F821,3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 24 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra Fv4-IgG1-F890, 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano. B es una ampliación de A La fig. 25 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra Fv4-IgG1-F939, 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 26 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra Fv4-IgG1-F947, 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 27 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra Fv4-IgG1-F1009, 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 28 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra mPM1-IgG1-mF14, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones normales.
La fig. 29 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra mPM1-IgG1-mF39, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones normales.
La fig. 30 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra mPM1-IgG1-mF38, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones normales.
La fig. 31 es un gráfico que muestra los títulos de anticuerpos de ratón producidos contra mPM1-IgG1-mF40, 14, 21 y 28 días después de la administración a ratones normales.
La fig. 32 es un gráfico que muestra las concentraciones de anticuerpos en plasma para Fv4-IgG1-F947 y Fv4-IgG1-FA6a/FB4a 15 minutos, siete horas, uno, dos, tres, cuatro y siete días después de la administración a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 33 es un diagrama que muestra la variación en la unión de cada mutante B3 a FcYRIIb y FcyRIa.
La fig. 34 es un diagrama que muestra la variación en la unión de cada mutante B3 a FcYRIIb y FcyRIIa(H).
La fig. 35 es un diagrama que muestra la variación en la unión de cada mutante B3 a FcYRIIb y FcYRIIa(R).
La fig. 36 es un diagrama que muestra la variación en la unión de cada mutante B3 a FcYRIIb y FcyRIIIa.
La fig. 37 es un gráfico que muestra la cinética en plasma de un receptor de IL-6 humano soluble en ratones normales y el título de anticuerpos del anticuerpo de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble en plasma de ratón. La fig. 38 es un gráfico que muestra la cinética en plasma de un receptor de IL-6 humano soluble en ratones normales a los que se ha administrado un anticuerpo anti-CD4 de ratón y el título de anticuerpos del anticuerpo de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble en plasma de ratón.
La fig. 39 es un gráfico que muestra la cinética en plasma de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 en ratones normales. La fig. 40 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración del receptor de IL-6 humano soluble después de la coadministración de un receptor de IL-6 humano soluble y un anticuerpo anti-receptor de IL-6 a ratones transgénicos con FcRn humano.
La fig. 41 es un diagrama que muestra la estructura de la CDR3 de cadena pesada del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 determinada por cristalografía de rayos X.
La fig. 42 es un gráfico que muestra la evolución temporal de la concentración de anticuerpos en plasma para H54/L28-IgG 1 ,6RL#9-IgG1 y FH4-IgG1 en ratones normales.
La fig. 43 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración del receptor de IL-6 humano soluble en plasma en ratones normales a los que se ha administrado H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 o FH4-IgG1.
La fig. 44 es un gráfico que muestra la evolución temporal de las concentraciones de anticuerpos en plasma de H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W y FH4-N434W en ratones normales.
La fig. 45 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración del receptor de IL-6 humano soluble en plasma en ratones normales a los que se ha administrado H54/L28-N434W, 6RL#9-n 434W o FH4-N434W. La fig. 46 es un cromatograma de intercambio iónico para un anticuerpo que comprende una secuencia de Vk5-2 humana y un anticuerpo que comprende una secuencia de h Vk5-2_L65 que tiene una secuencia de glucosilación modificada de la secuencia de Vk5-2 humana. La línea continua representa un cromatograma del anticuerpo que comprende la secuencia de Vk5-2 humana (cadena pesada: CIM_H, SEQ ID NO: 108; y cadena ligera: hVk5-2, SEQ ID NO: 4). La línea discontinua representa un cromatograma del anticuerpo que comprende la secuencia de hVk5-2_L65 (cadena pesada: CIM_H (SEQ ID NO: 108); y cadena ligera: hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 107)).
La fig. 47 es un diagrama que muestra una alineación de las secuencias de región constante de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que están numerados según el sistema de numeración EU.
La fig. 48 es un diagrama esquemático que muestra la formación de un complejo de tetrámero que consta de una molécula de una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro, dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR.
La fig. 49 es un diagrama esquemático que muestra la interacción de dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR con una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro y una menor actividad de unión a FcyR activador que la de una región Fc nativa.
La fig. 50 es un diagrama esquemático que muestra la interacción de dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR con una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro y actividad de unión selectiva para FcyR inhibidor.
La fig. 51 es un diagrama esquemático que muestra la interacción de dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR con una región Fc en la que solo uno de los dos polipéptidos del dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro y el otro no tiene actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro.
La fig. 52 es un gráfico que muestra la relación de una distribución de aminoácidos diseñada (indicada como diseño) con la distribución de aminoácidos (indicada como biblioteca) para la información de secuencia en 290 clones aislados de E. coli en la que se ha introducido biblioteca de genes de anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de Ca. El eje horizontal indica las posiciones de los aminoácidos en el sistema de numeración de Kabat. El eje vertical indica el % de distribución de aminoácidos.
La fig. 53 es un gráfico que muestra la relación de una distribución de aminoácidos diseñada (indicada como diseño) con la distribución de aminoácidos (indicada como biblioteca) para la información de secuencia en 132 clones aislados de E. coli en la que se ha introducido biblioteca de genes de anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de pH. El eje horizontal indica las posiciones de los aminoácidos en el sistema de numeración de Kabat. El eje vertical indica el % de distribución de aminoácidos.
La fig. 54 es un gráfico que muestra una evolución temporal de la concentración en plasma de Fv4-IgG1-F947 y Fv4-IgG1 -F1326 en ratones transgénicos con FcRn humano a los que se ha administrado Fv4-IgG1-F947 o Fv4-IgG1-F1326.
La fig. 55 muestra un gráfico en el que el eje horizontal muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIb de cada variante de PD y el eje vertical muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIa de tipo R de cada variante de PD. El valor de la cantidad de unión de cada variante de PD a cada FcyR se dividió por el valor de la cantidad de unión de IL6R-F652, que es un anticuerpo de control antes de la introducción de la alteración (Fc alterado con sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp), a cada FcyR; y después el valor obtenido se multiplicó por 100 y se usó como el valor de la actividad de unión relativa para cada variante de PD a cada FcyR. El gráfico F652 de la figura muestra el valor de IL6R-F652.
La fig. 56 muestra un gráfico en el que el eje vertical muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIb de variantes producidas al introducir cada alteración en GpH7-B3 que no tiene la alteración P238D y el eje horizontal muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIb de variantes producidas al introducir cada alteración en IL6R-F652 que tiene la alteración P238D. El valor de la cantidad de unión a FcYRIIb de cada variante se dividió por el valor de la cantidad de unión a FcYRIIb del anticuerpo previamente alterado; y después el valor obtenido se multiplicó por 100 y se usó como el valor de la actividad de unión relativa. Aquí, la región A contiene alteraciones que presentan el efecto de potenciar la unión a FcYRIIb en ambos casos donde se introduce una alteración en GpH7-B3 que no tiene P238D y donde se introduce una alteración en IL6R-F652 que tiene P238D. La región B contiene alteraciones que presentan el efecto de potenciar la unión a FcYRIIb cuando se introduce en GpH7-B3 que no tiene P238D, pero no presentan el efecto de potenciar la unión a FcYRIIb cuando se introducen en IL6R-F652 que tiene P238D.
La fig. 57 muestra una estructura cristalina del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb.
La fig. 58 muestra una imagen de superposición de la estructura cristalina del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb y la estructura modelo del complejo Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb, con respecto a la región extracelular de FcYRIIb y el dominio A de CH2 de Fc por el ajuste de mínimos cuadrados basado en las distancias de los pares de átomos Ca .
La fig. 59 muestra una comparación de la estructura detallada alrededor de P238D después de superponer la estructura cristalina del complejo Fc (P238D)/región extracelular de FcYRIIb y la estructura modelo del complejo Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb con respecto al único dominio A de CH2 de Fc o el único dominio B de CH2 de Fc mediante el ajuste de mínimos cuadrados basado en las distancias los pares de átomos Ca .
La fig. 60 muestra que se puede encontrar un enlace de hidrógeno entre la cadena principal de Gly en la posición 237 (indicada por la numeración EU) en el dominio A de CH2 de Fc y Tyr en la posición 160 en FcYRIIb en la estructura cristalina del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb.
La fig. 61 muestra que se puede encontrar una interacción electrostática entre Asp en la posición 270 (indicada por la numeración EU) en el dominio B de CH2 de Fc y Arg en la posición 131 en FcYRIIb en la estructura cristalina del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb.
La fig. 62 muestra un gráfico en el que el eje horizontal muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIb de cada variante de 2B y el eje vertical muestra el valor relativo de la actividad de unión a FcYRIIa de tipo R de cada variante de 2B. El valor de la cantidad de unión de cada variante 2B a cada FcyR se dividió por el valor de la cantidad de unión de un anticuerpo de control antes de la alteración (Fc alterado con sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp) a cada FcyR; y después se multiplicó el valor obtenido por 100 y se usó como el valor de la actividad de unión relativa de cada variante 2B hacia cada FcyR.
La fig. 63 muestra Glu en la posición 233 (indicada por la numeración EU) en la cadena A de Fc y los restos circundantes en la región extracelular de FcYRIIb en la estructura cristalina del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb.
La fig. 64 muestra Ala en la posición 330 (indicada por la numeración EU) en la cadena A de Fc y los restos circundantes en la región extracelular de FcYRIIb en la estructura cristalina del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb.
La fig. 65 muestra las estructuras de Pro en la posición 271 (numeración EU) de la cadena B de Fc después de superponer las estructuras cristalinas del complejo Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb y el complejo Fc(TS)/región extracelular de FcyRIIIa mediante el ajuste de mínimos cuadrados basado en las distancias de pares de átomos Ca con respecto a la cadena B de Fc.
[Modo para llevar a cabo la invención]
Las definiciones y la descripción detallada a continuación se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención ilustrada en el presente documento.
Aminoácidos
En la presente memoria, los aminoácidos se describen en códigos de una o tres letras o ambos, por ejemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I o Val/V.
Antígenos
En la presente memoria, los ''antígenos'' no están particularmente limitados en su estructura, siempre que comprendan epítopos a los que se unen los dominios de unión a antígeno. En otras palabras, los antígenos pueden ser sustancias inorgánicas u orgánicas.
Otros antígenos incluyen, por ejemplo, las moléculas a continuación: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RiB Al K-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adresina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista de alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, a Pr IL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, aspártico, péptido natriurético auricular, integrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, factor estimulante de linfocitos B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, osteogenina BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, factor neurotrófico derivado del hueso, BPDE, BPDE-ADN, BTC, factor del complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, AMPc, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado al cáncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, GMPc, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno asociado a tumores de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, factor regulador del complemento (factor de aceleración de la descomposición), des (1-3)-IGF-I (IGF-1 del cerebro), Dhh, digoxina, DNAM-1, DNasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinasa, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, Er CC, E-selectina, ET-1, factor lia, factor VII, factor VlIIc, factor IX, proteína de activación de fibroblastos (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormona foliculoestimulante, fractalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, G iT r , glucagón, Glut4, glucoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormona liberadora de hormona del crecimiento, hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, glucoproteína de la envoltura gB de HCMV, glucoproteína de la envoltura gH de HCMV, HCMV UL, factor de crecimiento hematopoyético (HGF), Hep B gp120, heparanasa, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glucoproteína gB del virus del herpes simple (VHS), glucoproteína gD del VHS, HGFA, antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), VIH gp120, bucle v 3 de gp 120 de HIVIIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovirus humano (HCMV), hormona del crecimiento humana (HGH), HVEM, 1 -309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de unión a IGF, IGF-1 R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1 R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferón (INF)-alfa, INF-beta, INF-gamma, inhibina, iNOS, cadena A de insulina, cadena B de insulina, factor insulínico de crecimiento 1, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfa V), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferón gamma, IP-10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), laminina 5, lAm P, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno de Lewis-Y, antígeno asociado a Lewis-Y, LfA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIg Ht , lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, lTb4, LTBP-1, superficie pulmonar, hormona luteinizante, receptor de linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, Ma G, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASAS, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), FIM, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, sustancia antimuleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, Nc AD, adherina N-C, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 o -6, neurturina, factor de crecimiento nervioso (NGF), n Gf R, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormona paratiroidea, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-cadherina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), P1GF, PLP, PP14, proinsulina, prorrelaxina, proteína C, pS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico de la próstata (pSm A), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RAn K, RANKL, RANTES, RANTES, cadena A de relaxina, cadena B de relaxina, renina, F del virus respiratorio sincitial (RSV), RSV Fgp, Ret, factor reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, seroalbúmina, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glucoproteína 72 asociada a tumores), TARC, TCA-3, receptor de linfocitos T (por ejemplo, receptor de linfocitos T alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, T e M7, T eM8, TERT, fosfatasa alcalina de tipo PLAP de testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta panespecífico, TGF-betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 de timo, hormona estimulante del tiroides, Tie, TIMP, TIQ, factor tisular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligando TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligando ODF de TRANCE/RANK, ligando OPG), TNFSF12 (ligando TWEAK Apo-3, ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligando LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligando GITR ligando AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligando gp34 de OX40, TXGP1), TNFSF5 (ligando CD154 de CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAMPA), TNFSF6 (ligando Fas ligando Apo-1, ligando APT1), TNFSF7 (ligando CD70 de CD27), TNFSF8 (ligando CD153 de CD30), Tn Fs F9 (ligando 4-1BB ligando CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno asociado a tumor CA125, antígeno asociado a tumor que expresa hidratos de carbono asociados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinasa, VCAM, VCAM-1, v Ec AD, VE-cadherina, VE-cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno vírico, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, factor de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Ap, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, cromogranina A, cromogranina B, tau, VAP1, cininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdina, esclerostina, fibrinógeno, fibrina, protrombina, trombina, factor tisular, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminógeno, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, sindecano-1, sindecano-2, sindecano-3, sindecano-4, LPA y S1P; y receptores de hormonas y factores de crecimiento.
"Epítopo" significa un determinante antigénico en un antígeno y se refiere a un sitio de antígeno al que se une el dominio de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno descrita en la presente memoria. Por tanto, por ejemplo, el epítopo se puede definir según su estructura. Como alternativa, el epítopo se puede definir según la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno que reconoce el epítopo. Cuando el antígeno es un péptido o polipéptido, el epítopo se puede especificar mediante los restos de aminoácidos que forman el epítopo. Como alternativa, cuando el epítopo es una cadena de azúcar, el epítopo puede especificarse por su estructura de cadena de azúcar específica.
Un epítopo lineal es un epítopo que contiene un epítopo cuya secuencia de aminoácidos primaria es reconocida. Dicho epítopo lineal normalmente contiene al menos tres y más habitualmente al menos cinco, por ejemplo, aproximadamente de 8 a 10 o de 6 a 20 aminoácidos en su secuencia específica.
En contraste con el epítopo lineal, el "epítopo conformacional" es un epítopo en el que la secuencia de aminoácidos primaria que contiene el epítopo no es el único determinante del epítopo reconocido (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos primaria de un epítopo conformacional no es necesariamente reconocida por un anticuerpo que define un epítopo). Los epítopos conformacionales pueden contener una mayor cantidad de aminoácidos en comparación con los epítopos lineales. Un anticuerpo que reconoce un epítopo conformacional reconoce la estructura tridimensional de un péptido o una proteína. Por ejemplo, cuando una molécula proteica se pliega y forma una estructura tridimensional, los aminoácidos y/o las cadenas principales polipeptídicas que forman un epítopo conformacional se alinean y el epítopo se hace reconocible por el anticuerpo. Los métodos para determinar las conformaciones de epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional, marcaje de espín específico de sitio y resonancia paramagnética electrónica, pero no se limitan a los mismos. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), vol. 66, Morris (ed.).
Actividad de unión
A continuación se describen ejemplos de un método para evaluar la unión al epítopo mediante una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R. Según los ejemplos a continuación, también se puede realizar de forma adecuada métodos para evaluar la unión al epítopo por una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno para un antígeno distinto de IL-6R.
Por ejemplo, se puede confirmar si una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R reconoce un epítopo lineal en la molécula de IL-6R, por ejemplo, como se menciona a continuación. Un péptido lineal que comprende una secuencia de aminoácidos que forma el dominio extracelular de IL-6R se sintetiza para el fin anterior. El péptido se puede sintetizar químicamente o se puede obtener mediante técnicas de ingeniería genética utilizando una región que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular en un ADNc de IL-6R. A continuación, se evalúa la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R hacia un péptido lineal que comprende la secuencia de aminoácidos que forma el dominio extracelular. Por ejemplo, se puede utilizar un péptido lineal inmovilizado como antígeno mediante ELISA para evaluar la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno hacia el péptido. Como alternativa, la actividad de unión hacia un péptido lineal puede evaluarse basándose en el nivel en el que el péptido lineal inhibe la unión de la molécula de unión a antígeno a las células que expresan IL-6R. Estas pruebas pueden demostrar la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno hacia el péptido lineal.
Se puede evaluar si una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R reconoce un epítopo conformacional de la siguiente manera. Se preparan células que expresan IL-6R para el fin anterior. Se puede determinar que una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión al antígeno IL-6R reconoce un epítopo conformacional cuando se une fuertemente a células que expresan IL-6R al entrar en contacto, pero no se une sustancialmente a un péptido lineal inmovilizado que comprende una secuencia de aminoácidos que forma el dominio extracelular de IL-6R. En la presente memoria, "no se une sustancialmente" significa que la actividad de unión es 80 % o menos, en general 50 % o menos, preferiblemente 30 % o menos y preferiblemente en particular 15 % o menos en comparación con la actividad de unión hacia células que expresan IL-6R humano.
Los métodos para analizar la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R hacia células que expresan IL-6R incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). De manera específica, la evaluación se puede realizar basándose en el principio de ELISA o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando células que expresan IL-6R como antígeno.
En el formato de ELISA, la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R hacia células que expresan IL-6R puede evaluarse cuantitativamente comparando los niveles de señal generada por reacción enzimática. De manera específica, se añade un complejo polipeptídico de prueba a una placa de ELISA en la que se inmovilizan células que expresan IL-6R. A continuación, la molécula de unión a antígeno de prueba unida a las células se detecta utilizando un anticuerpo marcado con enzima que reconoce la molécula de unión a antígeno de prueba. Como alternativa, cuando se usa FACS, se prepara una serie de diluciones de una molécula de unión a antígeno de prueba y se puede determinar el título de unión del anticuerpo para las células que expresan IL-6R para comparar la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno de prueba hacia las células que expresan IL-6R.
La unión de una molécula de unión a antígeno de prueba hacia un antígeno expresado en la superficie de células suspendidas en tampón o similares puede detectarse utilizando un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo conocidos incluyen, por ejemplo, los siguientes dispositivos:
FACSCanto™ II
FACSAria™
FACSArray™
FACSVantage™ SE
FACSCalibur™ (son todos nombres comerciales de BD Biosciences)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (son todos nombres comerciales de Beckman Coulter).
Los métodos preferibles para analizar la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R hacia un antígeno incluyen, por ejemplo, el siguiente método. En primer lugar, se hacen reaccionar células que expresan IL-6R con una molécula de unión a antígeno de prueba y después se tiñe esta con un anticuerpo secundario marcado con FITC que reconoce la molécula de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno de prueba se diluye de manera adecuada con un tampón adecuado para preparar la molécula a una concentración deseada. Por ejemplo, la molécula se puede utilizar a una concentración dentro del intervalo de 10 gg/ml a 10 ng/ml. A continuación, se determinan la intensidad de fluorescencia y el recuento de células utilizando FACSCalibur (BD). La intensidad de fluorescencia obtenida mediante análisis con el programa informático CELL QUEST (BD), es decir, el valor de la media geométrica, refleja la cantidad de anticuerpo unido a células. Es decir, la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de prueba, que está representada por la cantidad de molécula de unión a antígeno de prueba unida, se puede determinar midiendo el valor de la media geométrica.
Se puede evaluar si una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R comparte un epítopo común con otra molécula de unión a antígeno basándose en la competencia entre las dos moléculas por el mismo epítopo. La competencia entre moléculas de unión a antígeno puede detectarse mediante ensayo de bloqueo cruzado o similares. Por ejemplo, el ensayo ELISA competitivo es un ensayo de bloqueo cruzado preferido.
De manera específica, en el ensayo de bloqueo cruzado, la proteína IL-6R inmovilizada en los pocillos de una placa de microtitulación se preincuba en presencia o ausencia de una molécula de unión a antígeno competidora candidata y después se le añade una molécula de unión a antígeno de prueba. La cantidad de molécula de unión a antígeno de prueba unida a la proteína IL-6R en los pocillos está correlacionada indirectamente con la capacidad de unión de una molécula de unión a antígeno competidora candidata que compite por la unión al mismo epítopo. Es decir, cuanto mayor sea la afinidad de la molécula de unión a antígeno competidora por el mismo epítopo, menor será la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno de prueba hacia los pocillos recubiertos con proteína IL-6R.
La cantidad de molécula de unión a antígeno de prueba unida a los pocillos a través de la proteína IL-6R puede determinarse fácilmente marcando de antemano la molécula de unión a antígeno. Por ejemplo, se mide una molécula de unión a antígeno marcada con biotina utilizando un conjugado de avidina/peroxidasa y un sustrato adecuado. En particular, el ensayo de bloqueo cruzado que utiliza marcadores enzimáticos tales como peroxidasa se denomina "ensayo ELISA competitivo". La molécula de unión a antígeno también se puede marcar con otras sustancias marcadoras que permitan la detección o medición. De manera específica, se conocen radiomarcadores, marcadores fluorescentes y similares.
Cuando la molécula de unión a antígeno competidora candidata puede bloquear la unión de una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R en al menos 20 %, preferiblemente al menos de 20 a 50 % y más preferiblemente al menos 50 % en comparación con la actividad de unión en un experimento de control realizado en ausencia de la molécula de unión a antígeno competidora, se determina que la molécula de unión a antígeno de prueba se une sustancialmente al mismo epítopo con el que se une la molécula de unión a antígeno competidora o compite por la unión al mismo epítopo.
Cuando ya se ha identificado la estructura de un epítopo al que se une una molécula de unión a antígeno de prueba que contiene un dominio de unión a antígeno IL-6R, se puede evaluar si las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control comparten un epítopo común, comparando las actividades de unión de las dos moléculas de unión a antígeno hacia un péptido preparado mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos en el péptido que forma el epítopo.
Para medir las actividades de unión anteriores, por ejemplo, se comparan las actividades de unión de las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control hacia un péptido lineal en el que se introduce una mutación en el formato de ELISA anterior. Además de los métodos de ELISA, la actividad de unión hacia el péptido mutante unido a una columna se puede determinar haciendo fluir moléculas de unión a antígeno de prueba y de control en la columna y cuantificando después la molécula de unión a antígeno eluida en la solución de elución. Se conocen métodos para adsorber un péptido mutante a una columna, por ejemplo, en forma de péptido de fusión de GST.
Como alternativa, cuando el epítopo identificado es un epítopo conformacional, se puede evaluar si las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control comparten un epítopo común mediante el siguiente método. En primer lugar, se preparan células que expresan IL-6R y células que expresan IL-6R con una mutación introducida en el epítopo. Las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control se añaden a una suspensión celular preparada suspendiendo estas células en un tampón adecuado, tal como PBS. A continuación, las suspensiones celulares se lavan de forma adecuada con un tampón y se añade a las mismas un anticuerpo marcado con FITC que reconoce las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control. La intensidad de fluorescencia y el número de células teñidas con el anticuerpo marcado se determinan utilizando FACSCalibur (BD). Las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control se diluyen de forma apropiada usando un tampón adecuado y se usan a las concentraciones deseadas. Por ejemplo, se pueden utilizar a una concentración dentro del intervalo de 10 pg/ml a 10 ng/ml. La intensidad de fluorescencia determinada mediante análisis con el programa informático CELL QUEST (BD), es decir, el valor de la media geométrica, refleja la cantidad de anticuerpo marcado unido a células. Es decir, las actividades de unión de las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control, que están representadas por la cantidad de anticuerpo marcado unido, se pueden determinar midiendo el valor de la media geométrica.
En el método anterior, se puede evaluar si una molécula de unión a antígeno "no se une sustancialmente a células que expresan IL-6R mutante", por ejemplo, mediante el siguiente método. En primer lugar, las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control unidas a células que expresan IL-6R mutante se tiñen con un anticuerpo marcado. A continuación, se determina la intensidad de fluorescencia de las células. Cuando se utiliza FACSCalibur para la detección de fluorescencia mediante citometría de flujo, la intensidad de fluorescencia determinada se puede analizar utilizando el programa informático CELL QUEST. A partir de los valores de la media geométrica en presencia y ausencia del complejo polipeptídico, el valor de comparación (Amedia-geo) se puede calcular según la siguiente fórmula para determinar la proporción de aumento de la intensidad de fluorescencia como resultado de la unión por la molécula de unión a antígeno.
Amedia-geo = media-geo (en presencia del complejo polipeptídico)/media-geo (en ausencia del complejo polipeptídico)
El valor de comparación de la media geométrica (valor Amedia-geo para la molécula de IL-6R mutante) determinado por el análisis anterior, que refleja la cantidad de una molécula de unión a antígeno de prueba unida a células que expresan IL-6R mutante, se compara con el valor de comparación Amedia-geo que refleja la cantidad de la molécula de unión a antígeno de prueba unida a células que expresan IL-6R. En este caso, las concentraciones de la molécula de unión a antígeno de prueba utilizadas para determinar los valores de comparación Amedia-geo para células que expresan IL-6R y células que expresan IL-6R mutante se ajustan de manera preferiblemente en particular para que sean iguales o sustancialmente iguales. Una molécula de unión a antígeno que se ha confirmado que reconoce un epítopo en IL-6R se utiliza como molécula de unión a antígeno de control.
Si el valor de comparación Amedia-geo de una molécula de unión a antígeno de prueba para células que expresan IL-6R mutante es menor que el valor de comparación Amedia-geo de la molécula de unión a antígeno de prueba para células que expresan IL-6R en al menos 80 %, preferiblemente 50 %, más preferiblemente 30 % y preferiblemente en particular 15 %, entonces la molécula de unión a antígeno de prueba "no se une sustancialmente a las células que expresan IL-6R mutante". La fórmula para determinar el valor de media-geo (media geométrica) se describe en la guía del usuario del programa informático CELL QUEST (BD biosciences). Cuando la comparación muestra que los valores de comparación son sustancialmente equivalentes, se puede determinar que el epítopo de las moléculas de unión a antígeno de prueba y de control es el mismo.
Dominio de unión a antígeno
En la presente memoria, un "dominio de unión a antígeno" puede ser de cualquier estructura siempre que se una a un antígeno de interés. Dichos dominios incluyen preferiblemente, por ejemplo:
regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos;
un módulo de aproximadamente 35 aminoácidos denominado dominio A que está contenido en la proteína de la membrana celular in vivo Avimer (documentos WO 2004/044011, WO 2005/040229);
Adnectina que contiene el dominio 10Fn3 que se une al resto proteico de fibronectina, una glucoproteína expresada en la membrana celular (documento WO 2002/032925);
Affibody que se compone de un haz de tres hélices de 58 aminoácidos basado en el armazón del dominio de unión a IgG de la proteína A (documento WO 1995/001937);
Proteínas de repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin) que son una región expuesta en la superficie molecular de repeticiones de anquirina (RA) que tienen una estructura en la que una subunidad que consta de una vuelta que comprende 33 restos de aminoácidos, dos hélices antiparalelas y un bucle se apila repetidamente (documento WO 2002/020565);
Anticalinas y similares, que son dominios que constan de cuatro bucles que sostienen un lado de una estructura de barril compuesta por ocho hebras antiparalelas dispuestas circularmente que están muy conservadas entre las moléculas de lipocalina, tales como lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (NGAL) (documento WO 2003/029462); y
la región cóncava formada por la estructura de láminas paralelas dentro de la estructura en forma de herradura constituida por repeticiones apiladas del módulo de repetición rica en leucina (RRL) del receptor de linfocitos variable (RLV) que no tiene la estructura de inmunoglobulina y se utiliza en el sistema de inmunidad adquirida en vertebrados sin mandíbula tales como lamprea y mixina (documento WO 2008/016854). Los dominios de unión a antígeno preferidos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los que tienen regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos. Los ejemplos preferidos de dominios de unión a antígeno incluyen "Fv monocatenario (scFv)", "anticuerpo monocatenario", "Fv", "Fv 2 de cadena sencilla (scFv2)", "Fab" y "F(ab')2".
Los dominios de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno de la presente invención pueden unirse a un epítopo idéntico. Dicho epítopo puede estar presente, por ejemplo, en una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Como alternativa, el epítopo puede estar presente en la proteína que comprende los aminoácidos en las posiciones 20 a 365 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Como alternativa, cada uno de los dominios de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno de la presente invención pueden unirse a un epítopo diferente. En la presente memoria, el epítopo diferente puede estar presente en, por ejemplo, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Como alternativa, el epítopo puede estar presente en la proteína que comprende los aminoácidos en las posiciones 20 a 365 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
Especificidad
"Específico" significa que una de las moléculas que se une específicamente no muestra ninguna unión significativa a moléculas distintas de una única o varias moléculas compañeras de unión. Asimismo, también se usa "específico" cuando un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular entre múltiples epítopos en un antígeno. Cuando un epítopo con el que se une un dominio de unión a antígeno está contenido en múltiples antígenos diferentes, las moléculas de unión a antígeno que contienen el dominio de unión a antígeno pueden unirse a diversos antígenos que tienen el epítopo.
Anticuerpo
En la presente memoria, "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina natural o una inmunoglobulina producida por síntesis parcial o completa. Los anticuerpos pueden aislarse de fuentes naturales tales como plasma y suero de origen natural o sobrenadantes de cultivo de hibridomas productores de anticuerpos. Como alternativa, los anticuerpos se pueden sintetizar parcial o completamente utilizando técnicas tales como recombinación genética. Los anticuerpos preferidos incluyen, por ejemplo, anticuerpos de un isotipo de inmunoglobulina o subclase perteneciente al mismo. Las inmunoglobulinas humanas conocidas incluyen anticuerpos de las siguientes nueve clases (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. De estos isotipos, los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los expertos en la técnica conocen métodos para producir un anticuerpo con la actividad de unión deseada. A continuación se muestra un ejemplo que describe un método para producir un anticuerpo que se une a IL-6R (anticuerpo anti-IL-6R). También se pueden producir anticuerpos que se unen a un antígeno distinto de IL-6R según el ejemplo descrito a continuación.
Se pueden obtener anticuerpos anti-IL-6R como anticuerpos policlonales o monoclonales utilizando métodos conocidos. Los anticuerpos anti-IL-6R preferiblemente producidos son anticuerpos monoclonales procedentes de mamíferos. Dichos anticuerpos monoclonales procedentes de mamíferos incluyen anticuerpos producidos por hibridomas o células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que porta un gen de anticuerpo mediante técnicas de ingeniería genética. Los "anticuerpos humanizados" o "anticuerpos quiméricos" se incluyen en los anticuerpos monoclonales de la presente invención.
Se pueden producir hibridomas productores de anticuerpos monoclonales usando técnicas conocidas, por ejemplo, como se describe a continuación. De manera específica, los mamíferos se inmunizan mediante métodos de inmunización convencionales utilizando una proteína IL-6R como antígeno sensibilizante. Las células inmunitarias resultantes se fusionan con células parentales conocidas mediante métodos convencionales de fusión celular convencionales. A continuación, pueden seleccionarse hibridomas que producen un anticuerpo anti-IL-6R mediante cribado de células productoras de anticuerpos monoclonales utilizando métodos de cribado convencionales.
De manera específica, se preparan anticuerpos monoclonales como se menciona a continuación. En primer lugar, el gen de IL-6R cuya secuencia de nucleótidos se describe en la SEQ ID NO: 2 puede expresarse para producir una proteína IL-6R mostrada en la SEQ ID NO: 1, que se utilizará como antígeno sensibilizante para la preparación de anticuerpos. Es decir, se inserta una secuencia génica que codifica IL-6R en un vector de expresión conocido y se transforman células hospedadoras adecuadas con este vector. La proteína IL-6R humana deseada se purifica a partir de las células hospedadoras o sus sobrenadantes de cultivo mediante métodos conocidos. Para obtener IL-6R soluble a partir de sobrenadantes de cultivo, por ejemplo, una proteína que consta de los aminoácidos en las posiciones 1 a 357 en la secuencia polipeptídica de IL-6R de la SEQ ID NO: 1, tal como se describe en Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), se expresa como IL-6R soluble, en lugar de la proteína IL-6R de la SEQ ID NO: 1. La proteína IL-6R natural purificada también se puede utilizar como antígeno sensibilizante.
La proteína IL-6R purificada puede utilizarse como un antígeno sensibilizante para inmunización de mamíferos. También se puede utilizar un péptido IL-6R parcial como antígeno sensibilizante. En este caso, se puede preparar un péptido parcial mediante síntesis química basada en la secuencia de aminoácidos de IL-6R humano o insertando un gen de IL-6R parcial en un vector de expresión para la expresión. Como alternativa, se puede producir un péptido parcial degradando una proteína IL-6R con una proteasa. La longitud y la región del péptido IL-6R parcial no se limitan a realizaciones particulares. Una región preferida puede seleccionarse arbitrariamente de la secuencia de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 20 a 357 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. El número de aminoácidos que forman un péptido que se va a utilizar como antígeno sensibilizante es preferiblemente de al menos cinco o más, seis o más o siete o más. De manera más específica, un péptido de 8 a 50 restos, más preferiblemente de 10 a 30 restos, se puede utilizar como antígeno sensibilizante.
Para el antígeno sensibilizante, es posible, como alternativa, utilizar una proteína de fusión preparada fusionando un polipéptido o péptido parcial deseado de la proteína IL-6R con un polipéptido diferente. Por ejemplo, se utilizan preferiblemente fragmentos de anticuerpo Fc y marcadores peptídicos para producir proteínas de fusión que se van a utilizar como antígenos sensibilizantes. Se pueden construir vectores para la expresión de dichas proteínas de fusión fusionando en fase genes que codifican dos o más fragmentos polipeptídicos deseados e insertando el gen de fusión en un vector de expresión como se ha descrito anteriormente. Se describen métodos para producir proteínas de fusión en Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Se describen específicamente métodos para preparar IL-6R para utilizar como antígeno sensibilizante y métodos de inmunización que utilizan IL-6R en los documentos WO 2003/000883, WO 2004/022754, w O 2006/006693 y similares.
No existe una limitación particular sobre los mamíferos para inmunizar con el antígeno sensibilizante. Sin embargo, es preferible seleccionar los mamíferos considerando su compatibilidad con las células progenitoras que se van a utilizar para fusión celular. En general, se utilizan preferiblemente roedores tales como ratones, ratas y hámsteres, conejos y monos.
Los animales anteriores se inmunizan con un antígeno sensibilizante mediante métodos conocidos. Los métodos de inmunización realizados en general incluyen, por ejemplo, inyección intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante en mamíferos. De manera específica, un antígeno sensibilizante se diluye adecuadamente con PBS (solución salina tamponada con fosfato), solución salina fisiológica o similares. Si se desea, se mezcla un adyuvante convencional tal como adyuvante completo de Freund con el antígeno y se emulsiona la mezcla. A continuación, el antígeno sensibilizante se administra a un mamífero varias veces a intervalos de 4 a 21 días. Se pueden utilizar vehículos adecuados en la inmunización con el antígeno sensibilizante. En particular, cuando se utiliza un péptido parcial de bajo peso molecular como antígeno sensibilizante, a veces es deseable acoplar el péptido antigénico sensibilizante a una proteína transportadora tal como albúmina o hemocianina de lapa californiana para inmunización.
Como alternativa, se pueden preparar hibridomas que producen un anticuerpo deseado utilizando inmunización con ADN como se menciona a continuación. La inmunización con ADN es un método de inmunización que confiere inmunoestimulación al expresar un antígeno sensibilizante en un animal inmunizado como resultado de la administración de un ADN de vector construido para permitir la expresión de un gen codificante de proteína antigénica en el animal. En comparación con los métodos de inmunización convencionales en los que se administra un antígeno proteico a animales que se van a inmunizar, se espera que la inmunización con ADN sea superior porque:
- se puede proporcionar inmunoestimulación conservando al mismo tiempo la estructura de una proteína de membrana tal como IL-6R; y
- no es necesario purificar el antígeno para la inmunización.
Para preparar un anticuerpo monoclonal de la presente invención utilizando inmunización con ADN, en primer lugar, se administra un ADN que expresa una proteína IL-6R a un animal que se va a inmunizar. El ADN que codifica IL-6R puede sintetizarse mediante métodos conocidos tales como PCR. El ADN obtenido se inserta en un vector de expresión adecuado y después este se administra a un animal que se va a inmunizar. Los vectores de expresión utilizados preferiblemente incluyen, por ejemplo, vectores de expresión disponibles en el mercado tales como pcDNA3.1. Los vectores se pueden administrar a un organismo utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, se realiza inmunización con ADN utilizando una pistola génica para introducir partículas de oro recubiertas con el vector de expresión en células del cuerpo de un animal que se va a inmunizar. Los anticuerpos que reconocen IL-6R también pueden producirse mediante los métodos descritos en el documento WO 2003/104453.
Después de inmunizar a un mamífero como se ha descrito anteriormente, se confirma en el suero un aumento del título de un anticuerpo de unión a IL-6R. A continuación, se recogen células inmunitarias del mamífero y después se someten a fusión celular. En particular, los esplenocitos se utilizan preferiblemente como células inmunitarias.
Se utiliza una célula de mieloma de mamífero como una célula que se va a fusionar con las células inmunitarias mencionadas anteriormente. Las células de mieloma comprenden preferiblemente un marcador de selección adecuado para cribado. Un marcador de selección confiere características a las células para su supervivencia (o muerte) en una condición de cultivo específica. La deficiencia de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como deficiencia de HGPRT) y la deficiencia de timidina quinasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como deficiencia de TK) se conocen como marcadores de selección. Las células con deficiencia de HGPRT o TK tienen sensibilidad a hipoxantina-aminopterina-timidina (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como sensibilidad a HAT). Las células sensibles a HAT no pueden sintetizar ADN en un medio de selección de HAT y, por tanto, se destruyen. Sin embargo, cuando las células se fusionan con células normales, pueden continuar la síntesis de ADN utilizando la ruta de rescate de las células normales y, por lo tanto, pueden crecer incluso en el medio de selección de HAT.
Las células deficientes en HGPRT y deficientes en TK se pueden seleccionar en un medio que contiene 6-tioguanina, 8-azaguanina (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como 8AG) o 5'-bromodesoxiuridina, respectivamente. Las células normales se destruyen porque incorporan estos análogos de pirimidina en su ADN. Al mismo tiempo, las células que son deficientes en estas enzimas pueden sobrevivir en el medio de selección, ya que no pueden incorporar estos análogos de pirimidina. Además, un marcador de selección denominado resistencia a G418 proporcionado por el gen resistente a la neomicina confiere resistencia a antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Se conocen diversos tipos de células de mieloma que son adecuadas para la fusión celular.
Por ejemplo, se pueden usar preferiblemente células de mieloma que incluyen las siguientes células:
P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);
P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7);
NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511 -519);
MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);
SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);
FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);
S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);
R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
Las fusiones celulares entre los inmunocitos y las células de mieloma se llevan a cabo esencialmente utilizando métodos conocidos, por ejemplo, un método de Kohler y Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
De manera más específica, se puede llevar a cabo fusión celular, por ejemplo, en un medio de cultivo convencional en presencia de un agente promotor de la fusión celular. Los agentes promotores de la fusión incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y virus de Sendai (HVJ). Si es necesario, también se añade una sustancia auxiliar tal como dimetilsulfóxido para mejorar la eficacia de fusión.
La proporción de células inmunitarias a células de mieloma se puede determinar a discreción propia, preferiblemente, por ejemplo, una célula de mieloma por cada uno a diez inmunocitos. Los medios de cultivo que se van a utilizar para fusiones celulares incluyen, por ejemplo, medios que son adecuados para el cultivo de líneas celulares de mieloma, tales como medio RPMI1640 y medio MEM, y otros medios de cultivo convencionales utilizados para este tipo de cultivo celular. Además, pueden añadirse preferiblemente al medio de cultivo complementos de suero, tales como suero de ternero fetal (FCS).
Para la fusión celular, se mezclan bien cantidades predeterminadas de las células inmunitarias y células de mieloma anteriores en el medio de cultivo anterior. A continuación, se añade al mismo una solución de PEG (por ejemplo, el peso molecular promedio es de aproximadamente 1000 a 6000) precalentada a aproximadamente 37 °C a una concentración de, en general, 30 % a 60 % (p/v). Esta se mezcla suavemente para producir las células de fusión deseadas (hibridomas). A continuación, se añade gradualmente a las células un medio de cultivo adecuado mencionado anteriormente y este se centrifuga repetidas veces para eliminar el sobrenadante. Por tanto, se pueden eliminar agentes de fusión celular y similares que son desfavorables para el crecimiento de hibridomas.
Los hibridomas obtenidos de este modo pueden seleccionarse mediante cultivo utilizando un medio selectivo convencional, por ejemplo, medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Las células distintas de los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden destruirse mediante cultivo continuo en el medio HAT anterior durante un periodo de tiempo suficiente. Normalmente, el periodo es de varios días a varias semanas. A continuación, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se criban y clonan individualmente mediante métodos convencionales de dilución limitante.
Los hibridomas obtenidos de este modo pueden seleccionarse utilizando un medio de selección basado en el marcador de selección que posee el mieloma utilizado para la fusión celular. Por ejemplo, se pueden seleccionar células deficientes en HGPRT o TK mediante cultivo utilizando el medio HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). De manera específica, cuando se utilizan células de mieloma sensibles a HAT para la fusión celular, las células fusionadas con éxito con células normales pueden proliferar selectivamente en el medio HAT. Las células distintas de los hibridomas deseados (células no fusionadas) pueden destruirse mediante cultivo continuo en el medio HAT anterior durante un periodo de tiempo suficiente. De manera específica, los hibridomas deseados pueden seleccionarse mediante cultivo durante, en general, varios días a varias semanas. A continuación, los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se criban y clonan individualmente mediante métodos convencionales de dilución limitante.
Los anticuerpos deseados pueden preferiblemente seleccionarse y clonarse individualmente mediante métodos de cribado basados en una reacción conocida de antígeno/anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de unión a IL-6R puede unirse a IL-6R expresado en la superficie celular. Dicho anticuerpo monoclonal se puede cribar mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). FACS es un sistema que evalúa la unión de un anticuerpo a la superficie celular mediante el análisis de células que han entrado en contacto con un anticuerpo fluorescente utilizando un haz de láser y midiendo la fluorescencia emitida por células individuales.
Para seleccionar hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante FACS, en primer lugar, se preparan células que expresan IL-6R. Las células que se utilizan preferiblemente para el cribado son células de mamífero en las que se expresa de forma forzada IL-6R. Como control, la actividad de un anticuerpo para unirse a IL-6R de la superficie celular puede detectarse selectivamente utilizando células de mamífero no transformadas como células hospedadoras. De manera específica, Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R pueden aislarse seleccionando hibridomas que producen un anticuerpo que se une a las células forzadas a expresar IL-6R, pero no a las células hospedadoras.
Como alternativa, la actividad de un anticuerpo para unirse a células que expresan IL-6R inmovilizadas puede evaluarse basándose en el principio de ELISA. Por ejemplo, se inmovilizan células que expresan IL-6R en los pocillos de una placa de ELISA. Se ponen en contacto sobrenadantes de cultivo de hibridomas con las células inmovilizadas en los pocillos y se detectan los anticuerpos que se unen a las células inmovilizadas. Cuando los anticuerpos monoclonales proceden de ratón, se pueden detectar anticuerpos unidos a las células utilizando un anticuerpo antiinmunoglobulina de ratón. Se seleccionan hibridomas que producen un anticuerpo deseado que tiene la capacidad de unión a antígeno mediante el cribado anterior y pueden clonarse mediante un método de dilución limitante o similares.
Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales preparados de este modo pueden pasarse en un medio de cultivo convencional y almacenarse en nitrógeno líquido durante un periodo prolongado.
Los hibridomas anteriores se cultivan mediante un método convencional y se pueden preparar anticuerpos monoclonales deseados a partir de los sobrenadantes de cultivo. Como alternativa, los hibridomas se administran y se cultivan en mamíferos compatibles, y se preparan anticuerpos monoclonales a partir del líquido ascítico. El primer método es adecuado para preparar anticuerpos con alta pureza.
También se pueden usar preferiblemente anticuerpos codificados por genes de anticuerpos que se clonan a partir de células productoras de anticuerpos tales como los hibridomas anteriores. Se inserta un gen de anticuerpo clonado en un vector adecuado y este se introduce en un hospedador para expresar el anticuerpo codificado por el gen. Ya se han establecido métodos para aislar genes de anticuerpos, insertar los genes en vectores y transformar células hospedadoras, por ejemplo, en Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). También se conocen métodos para producir anticuerpos recombinantes como se describe a continuación.
Por ejemplo, se prepara un ADNc que codifica la región variable (región V) de un anticuerpo anti-IL-6R a partir de células de hibridoma que expresan el anticuerpo anti-IL-6R. Para este fin, se extrae en primer lugar ARN total de los hibridomas. Los métodos utilizados para extraer ARNm de las células incluyen, por ejemplo:
- el método de ultracentrifugación de guanidina (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299) y
- el método AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
Se pueden purificar ARNm extraídos utilizando el equipo de purificación de ARNm (GE Healthcare Bioscience) o similares. Como alternativa, también están disponibles en el mercado equipos para extraer ARNm total directamente de células, tales como el equipo de purificación de ARNm QuickPrep (GE Healthcare Bioscience), Se pueden preparar ARNm a partir de hibridomas utilizando dichos equipos. Los ADNc que codifican la región V del anticuerpo pueden sintetizarse a partir de los ARNm preparados utilizando una transcriptasa inversa. Se pueden sintetizar ADNc utilizando el equipo de síntesis de ADNc de primera hebra de transcriptasa inversa de AMV (Seikagaku Co.) o similares. Asimismo, el equipo de amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech) y el método de 5'-RACE basado en PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932) se puede utilizar de forma adecuada para sintetizar y amplificar ADNc. En dicho proceso de síntesis de ADNc, los sitios de enzimas de restricción adecuados descritos a continuación pueden introducirse en ambos extremos de un ADNc.
El fragmento de ADNc de interés se purifica a partir del producto de PCR resultante y después se liga a un vector de ADN. Por tanto, se construye un vector recombinante y se introduce en E. co lio similares. Después de la selección de colonias, el vector recombinante deseado se puede preparar a partir de la E. coli formadora de colonias. A continuación, si el vector recombinante tiene la secuencia de nucleótidos de ADNc de interés se prueba mediante un método conocido tal como el método de terminación de la cadena de didesoxinucleótidos.
El método de 5'-RACE que usa cebadores para amplificar el gen de la región variable se usa convenientemente para aislar el gen que codifica la región variable. En primer lugar, se construye una biblioteca de ADNc de 5'-RACE mediante síntesis de ADNc utilizando ARN extraídos de células de hibridoma como molde. Se usa adecuadamente un equipo disponible en el mercado, tal como el equipo de amplificación de ADNc SMART RACE para sintetizar la biblioteca de ADNc de 5'-RACE.
El gen del anticuerpo se amplifica mediante PCR utilizando la biblioteca de ADNc de 5'-RACE preparada como molde. Los cebadores para amplificar el gen del anticuerpo de ratón pueden diseñarse basándose en secuencias conocidas genes de anticuerpos. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores varían dependiendo de la subclase de inmunoglobulina. Por lo tanto, es preferible que la subclase se determine de antemano utilizando un equipo disponible en el mercado tal como el equipo de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón Iso Strip (Roche Diagnostics).
De manera específica, por ejemplo, se utilizan cebadores que permiten la amplificación de genes que codifican cadenas pesadas y1, Y2a, Y2b y y3 y cadenas ligeras k y A para aislar genes que codifican IgG de ratón. En general, un cebador que se hibrida con un sitio de región constante cercano a la región variable se utiliza como cebador del lado 3' para amplificar un gen de región variable de IgG. Al mismo tiempo, se utiliza un cebador unido a un equipo de construcción de biblioteca de ADNc de 5' RACE como cebador del lado 5'.
Se utilizan productos de PCR amplificados para remodelar inmunoglobulinas compuestas por una combinación de cadenas pesadas y ligeras. Se puede seleccionar un anticuerpo deseado utilizando la actividad de unión a IL-6R de una inmunoglobulina remodelada como indicador. Por ejemplo, cuando el objetivo es aislar un anticuerpo contra IL-6R, es más preferido que la unión del anticuerpo a IL-6R sea específica. Se puede cribar un anticuerpo de unión a IL-6R, por ejemplo, mediante las siguientes etapas:
(1) poner en contacto una célula que expresa IL-6R con un anticuerpo que comprende la región V codificada por un ADNc aislado de un hibridoma;
(2) detectar la unión del anticuerpo a la célula que expresa IL-6R; y
(3) seleccionar un anticuerpo que se una a la célula que expresa IL-6R.
Se conocen métodos para detectar la unión de un anticuerpo a células que expresan IL-6R. De manera específica, la unión de un anticuerpo a células que expresan IL-6R puede detectarse mediante las técnicas descritas anteriormente tales como FACS. Las muestras inmovilizadas de células que expresan IL-6R se usan de manera adecuada para evaluar la actividad de unión de un anticuerpo.
Los métodos de cribado de anticuerpos preferidos que utilizan la actividad de unión como indicador también incluyen métodos de selección que utilizan vectores de fagos. Los métodos de cribado que utilizan vectores de fagos son ventajosos cuando los genes de anticuerpos se aíslan de bibliotecas de subclases de cadena pesada y cadena ligera de una población de células que expresan anticuerpos policlonales. Los genes que codifican las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera pueden unirse mediante una secuencia conectora adecuada para formar un Fv de cadena sencilla (scFv). Se pueden producir fagos que presentan scFv en su superficie insertando un gen que codifica scFv en un vector de fago. Los fagos se ponen en contacto con un antígeno de interés. A continuación, un ADN que codifica scFv que tiene la actividad de unión de interés se puede aislar recogiendo fagos unidos al antígeno. Este proceso se puede repetir según sea necesario para enriquecer scFv que tenga la actividad de unión de interés.
Después del aislamiento del ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R de interés, el ADNc se digiere con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción introducidos en ambos extremos del ADNc. Las enzimas de restricción preferidas reconocen y escinden una secuencia de nucleótidos que se produce en la secuencia de nucleótidos del gen de anticuerpo a baja frecuencia. Asimismo, un sitio de restricción para una enzima que produce un extremo pegajoso se introduce preferiblemente en un vector para insertar un fragmento digerido de una sola copia en la orientación correcta. El ADNc que codifica la región V del anticuerpo anti-IL-6R se digiere como se ha descrito anteriormente y este se inserta en un vector de expresión adecuado para construir un vector de expresión de anticuerpo. En este caso, si un gen que codifica la región constante del anticuerpo (región C) y un gen que codifica la región V anterior se fusionan en fase, se obtiene un anticuerpo quimérico. En la presente memoria, "anticuerpo quimérico" significa que el origen de la región constante es diferente del de la región variable. Por tanto, además de anticuerpos heteroquiméricos de ratón/humanos, se incluyen anticuerpos aloquiméricos humanos/humanos en los anticuerpos quiméricos de la presente invención. Se puede construir un vector de expresión de anticuerpo quimérico insertando el gen de la región V anterior en un vector de expresión que ya tiene la región constante. De manera específica, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción que escinde el gen de la región V anterior puede colocarse adecuadamente en el lado 5' de un vector de expresión que porta un ADN que codifica una región constante de anticuerpo deseada (región C). Se construye un vector de expresión de anticuerpo quimérico fusionando en fase los dos genes digeridos con la misma combinación de enzimas de restricción.
Para producir un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R, se insertan genes de anticuerpo en un vector de expresión de modo que los genes se expresen bajo el control de una región reguladora de la expresión. La región reguladora de la expresión para la expresión de anticuerpos incluye, por ejemplo, potenciadores y promotores. Asimismo, se puede unir una secuencia señal adecuada al extremo amino de modo que el anticuerpo expresado se secrete al exterior de las células. En los ejemplos que se describen más adelante, se utiliza un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3) como secuencia señal. Al mismo tiempo, se pueden unir otras secuencias señal adecuadas. El polipéptido expresado se escinde en el extremo carboxilo de la secuencia anterior y el polipéptido resultante se secreta al exterior de las células como un polipéptido maduro. A continuación, las células hospedadoras adecuadas se transforman con el vector de expresión y se obtienen células recombinantes que expresan el ADN codificante del anticuerpo anti-IL-6R.
Se insertan por separado ADN que codifican la cadena pesada (cadena H) y la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo en diferentes vectores de expresión para expresar el gen del anticuerpo. Una molécula de anticuerpo que tiene las cadenas H y L se puede expresar cotransfectando la misma célula hospedadora con vectores en los que se insertan los genes de la cadena H y la cadena L, respectivamente. Como alternativa, las células hospedadoras se pueden transformar con un único vector de expresión en el que se insertan ADN que codifican las cadenas H y L (véase documento WO 1994/011523).
Existen diversas combinaciones de célula hospedadora/vector de expresión conocidas para la preparación de anticuerpos mediante la introducción de genes de anticuerpos aislados en hospedadores adecuados. Todos estos sistemas de expresión son aplicables al aislamiento de los dominios de unión a antígeno de la presente invención. Las células eucariotas adecuadas utilizadas como células hospedadoras incluyen células animales, células vegetales y células fúngicas. De manera específica, las células animales incluyen, por ejemplo, las siguientes células.
(1) células de mamíferos: CHO, COS, mieloma, riñón de cría de hámster (BHK), HeLa, Vero, riñón embrionario humano (HEK) 293 o similares;
(2) células de anfibios: Ovocitos de Xenopus o similares; y
(3) células de insectos: sf9, sf21, Tn5 o similares.
Además, como célula vegetal, se conoce un sistema de expresión de genes de anticuerpos que utiliza células derivadas del género Nicotiana tal como Nicotiana tabacum. Se pueden usar adecuadamente células cultivadas de callos para transformar células vegetales.
Asimismo, las siguientes células se pueden utilizar como células fúngicas:
- levaduras: el género Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevisiae y el género Pichia tal como Pichia pastoris; y
- hongos filamentosos: el género Aspergillus tal como Aspergillus niger.
Asimismo, también se conocen sistemas de expresión génica de anticuerpos que utilizan células procariotas. Por ejemplo, cuando se utilizan células bacterianas, se pueden utilizar convenientemente en la presente invención células de E. coli, células de Bacillus subtilis y similares. Se introducen vectores de expresión que portan los genes de anticuerpos de interés en estas células mediante transfección. Las células transfectadas se cultivan in vitro y el anticuerpo deseado se puede preparar a partir del cultivo de células transformadas.
Además de las células hospedadoras descritas anteriormente, también se pueden utilizar animales transgénicos para producir un anticuerpo recombinante. Es decir, el anticuerpo puede obtenerse de un animal en el que se introduce el gen que codifica el anticuerpo de interés. Por ejemplo, el gen del anticuerpo se puede construir como un gen de fusión insertando en fase en un gen que codifica una proteína producida específicamente en la leche. Se puede usar pcaseína de cabra o similares, por ejemplo, como la proteína secretada en la leche. Se inyectan fragmentos de ADN que contienen el gen fusionado con el gen de anticuerpo insertado en un embrión de cabra y después este embrión se introduce en una cabra hembra. Los anticuerpos deseados se pueden obtener como una proteína fusionada con la proteína láctea de la leche producida por la cabra transgénica nacida de la cabra receptora del embrión (o su descendencia). Además, para aumentar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, se pueden administrar hormonas a la cabra transgénica según sea necesario (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
Cuando un complejo polipeptídico descrito en la presente memoria se administra a un ser humano, se puede utilizar convenientemente un dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo genéticamente recombinante que se ha modificado artificialmente para reducir la antigenicidad heteróloga contra seres humanos y similares como el dominio de unión a antígeno del complejo. Dichos anticuerpos genéticamente recombinantes incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos modificados se producen de forma adecuada mediante métodos conocidos.
Una región variable de anticuerpo utilizada para producir el dominio de unión a antígeno de un complejo polipeptídico descrito en el presente documento está formada, en general, por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que están separadas por cuatro regiones marco conservadas (FR). CDR es una región que determina sustancialmente la especificidad de unión de un anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de las CDR son muy diversas. Por otro lado, las secuencias de aminoácidos que forman FR tienen con frecuencia alta identidad incluso entre anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, en general, la especificidad de unión de un determinado anticuerpo puede introducirse en otro anticuerpo mediante injerto de CDR.
Un anticuerpo humanizado también se denomina anticuerpo humano remodelado. De manera específica, se conocen anticuerpos humanizados preparados mediante el injerto de la CDR de un anticuerpo animal no humano tal como un anticuerpo de ratón contra un anticuerpo humano y similares. También se conocen técnicas de ingeniería genética habituales para obtener anticuerpos humanizados. De manera específica, por ejemplo, la PCR de extensión solapante se conoce como un método para injertar una CDR de anticuerpo de ratón a una FR humana. En PCR de extensión solapante, se añade una secuencia de nucleótidos que codifica una CDR de anticuerpo de ratón que se va a injertar a cebadores para sintetizar una FR de anticuerpo humano. Se preparan cebadores para cada una de las cuatro FR. En general, se considera que cuando se injerta una CDR de ratón a una FR humana, seleccionar una FR humana que tenga alta identidad con una FR de ratón es ventajoso para mantener la función de CDR. Es decir, en general, es preferible utilizar una FR humana que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga alta identidad con la secuencia de aminoácidos de la FR adyacente a la CDR de ratón que se va a injertar.
Las secuencias de nucleótidos que se van a ligar se diseñan de modo que se conecten entre sí en fase. Las FR humanas se sintetizan individualmente utilizando los cebadores respectivos. Como resultado, se obtienen productos en los que el ADN codificante de CDR de ratón se une a los ADN que codifican FR individuales. Las secuencias de nucleótidos que codifican la CDR de ratón de cada producto se diseñan de modo que se solapen entre sí. A continuación, se realiza reacción de síntesis de hebra complementaria para hibridar las regiones CDR solapantes de los productos sintetizados utilizando un gen de anticuerpo humano como molde. Se ligan FR humanas a través de las secuencias de CDR de ratón mediante esta reacción.
El gen de la región V de longitud completa, en el que en última instancia se ligan tres CDR y cuatro FR, se amplifica utilizando cebadores que se hibridan con su extremo 5' o 3', que se añaden con secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción adecuadas. Puede producirse un vector de expresión para un anticuerpo humanizado insertando el ADN obtenido como se ha descrito anteriormente y un ADN que codifica una región C de un anticuerpo humano en un vector de expresión de modo que se liguen en fase. Después de que el vector recombinante se transfecte en un hospedador para establecer células recombinantes, las células recombinantes se cultivan y el ADN que codifica el anticuerpo humanizado se expresa para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo celular (véase, publicación de patente europea n.° EP 239400 y publicación de patente internacional n.° WO 1996/002576).
Midiendo y evaluando cualitativa o cuantitativamente la actividad de unión a antígeno del anticuerpo humanizado producido como se ha descrito anteriormente, se pueden seleccionar convenientemente FR de anticuerpos humanos que permitan que las CDR formen un sitio de unión a antígeno favorable cuando se ligan a través de las CDR. Los restos de aminoácidos en las FR pueden sustituirse según sea necesario, de modo que las CDR de un anticuerpo humano remodelado formen un sitio de unión a antígeno adecuado. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones de la secuencia de aminoácidos en las FR aplicando el método de PCR utilizado para injertar una CDR de ratón en una FR humana. De manera más específica, pueden introducirse mutaciones parciales de la secuencia de nucleótidos en cebadores que se hibridan con la FR. Se introducen mutaciones de la secuencia de nucleótidos en las FR sintetizadas utilizando dichos cebadores. Las secuencias de FR mutantes que tienen las características deseadas se pueden seleccionar midiendo y evaluando la actividad del anticuerpo mutante con aminoácidos sustituidos para unirse al antígeno mediante el método mencionado anteriormente (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).
Como alternativa, se pueden obtener los anticuerpos humanos deseados inmunizando animales transgénicos que tienen el repertorio completo de genes de anticuerpos humanos (véase documentos WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) mediante inmunización con ADN.
Asimismo, también se conocen técnicas para preparar anticuerpos humanos mediante selección utilizando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la región V de un anticuerpo humano se expresa como un anticuerpo monocatenario (scFv) en la superficie del fago mediante el método de presentación en fago. Pueden seleccionarse fagos que expresan un scFv que se une al antígeno. La secuencia de ADN que codifica la región V del anticuerpo humano que se une al antígeno se puede determinar analizando los genes de los fagos seleccionados. Se determina la secuencia de ADN del scFv que se une al antígeno. Se prepara un vector de expresión fusionando la secuencia de la región V en fase con la secuencia de la región C de un anticuerpo humano deseado, e insertándolo en un vector de expresión adecuado. El vector de expresión se introduce en células adecuadas para la expresión tales como las descritas anteriormente. El anticuerpo humano puede producirse expresando el gen codificante del anticuerpo humano en las células. Estos métodos ya son conocidos (véase documentos WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).
Además de las técnicas descritas anteriormente, se puede utilizar de forma adecuada técnicas de clonación de linfocitos B (identificación de cada secuencia codificante del anticuerpo, clonación y su aislamiento; uso en la construcción de un vector de expresión para preparar cada anticuerpo (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 en particular); y similares) tal como se describe en Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) o en el documento WO 2008/081008 para aislar genes de anticuerpos.
Sistema de numeración EU y sistema de numeración de Kabat
Según los métodos utilizados en la presente invención, las posiciones de aminoácidos asignadas al CDR y FR de anticuerpos se especifican según la numeración de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991)). En la presente memoria, cuando una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, los aminoácidos de la región variable se indican según el sistema de numeración de Kabat, mientras que los aminoácidos de la región constante se indican según el sistema de numeración EU basado en las posiciones de los aminoácidos de Kabat.
Condiciones de concentración de iones
Condiciones de concentración de iones metálicos
En una realización de la presente invención, la concentración de iones se refiere a una concentración de iones metálicos. Los "iones metálicos" se refieren a iones de los elementos del grupo I, excepto el hidrógeno, tales como metales alcalinos y elementos del grupo del cobre, elementos del grupo II tales como metales alcalinotérreos y elementos del grupo del cinc, elementos del grupo III excepto boro, elementos del grupo IV excepto carbono y silicio, elementos del grupo VIII tales como elementos del grupo del hierro y del grupo del platino, elementos pertenecientes al subgrupo A de los grupos V, VI y VII y elementos metálicos tales como antimonio, bismuto y polonio. Los átomos de metales tienen la propiedad de liberar electrones de valencia para convertirse en cationes. Esta se denomina tendencia a la ionización. Los metales con fuerte tendencia a la ionización se consideran químicamente activos.
En la presente invención, los iones metálicos preferidos incluyen, por ejemplo, ion de calcio. El ion de calcio está implicado en la modulación de muchos fenómenos biológicos, incluyendo la contracción de músculos tales como músculos esqueléticos, lisos y cardíacos; activación del movimiento, la fagocitosis y similares de leucocitos; activación del cambio de forma, la secreción y similares de plaquetas; activación de linfocitos; activación de mastocitos, incluyendo la secreción de histamina; respuestas celulares mediadas por el receptor a de catecolamina o el receptor de acetilcolina; exocitosis; liberación de sustancias transmisoras de terminales neuronales; y flujo axoplásmico en neuronas. Los receptores de iones de calcio intracelulares conocidos incluyen troponina C, calmodulina, parvalbúmina y cadena ligera de miosina, que tienen varios sitios de unión a iones de calcio y se cree que proceden de un origen común en términos de evolución molecular. También hay muchos motivos de unión a calcio conocidos. Dichos motivos conocidos incluyen, por ejemplo, dominios de cadherina, mano EF de calmodulina, dominio C2 de la proteína cinasa C, dominio Gla de la proteína de coagulación sanguínea factor IX, lectinas de tipo C del receptor de asialoglucoproteína y del receptor de unión a manosa, dominios A de receptores de LDL, anexina, dominio de trombospondina de tipo 3 y dominios de tipo EGF.
En la presente invención, cuando el ion metálico es ion de calcio, las condiciones de concentración de iones de calcio incluyen bajas concentraciones de iones de calcio y altas concentraciones de iones de calcio. "La actividad de unión varía dependiendo de las concentraciones de iones de calcio" significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno varía debido a la diferencia en las condiciones entre las concentraciones de iones de calcio bajas y altas. Por ejemplo, la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno puede ser mayor a una concentración alta de iones de calcio que a una concentración baja de iones de calcio. Como alternativa, la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno puede ser mayor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio.
En la presente memoria, la concentración alta de iones de calcio no se limita en particular a un valor específico; sin embargo, la concentración puede seleccionarse preferiblemente entre 100 gM y 10 mM. En otra realización, la concentración puede seleccionarse entre 200 gM y 5 mM. En una realización alternativa, la concentración puede seleccionarse entre 400 gM y 3 mM. En otra realización más, la concentración puede seleccionarse entre 200 gM y 2 mM. Asimismo, la concentración puede seleccionarse entre 400 gM y 1 mM. En particular, se prefiere una concentración seleccionada entre 500 gM y 2,5 mM, que está cerca de la concentración en plasma (sangre) de ion de calcio in vivo.
En la presente memoria, la concentración baja de iones de calcio no se limita en particular a un valor específico; sin embargo, la concentración puede seleccionarse preferiblemente entre 0,1 gM y 30 gM. En otra realización, la concentración puede seleccionarse entre 0,2 gM y 20 gM. En otra realización más, la concentración puede seleccionarse entre 0,5 gM y 10 gM. En una realización alternativa, la concentración puede seleccionarse entre 1 gM y 5 gM. Asimismo, la concentración puede seleccionarse entre 2 gM y 4 gM. En particular, se prefiere una concentración seleccionada entre 1 gM y 5 gM, que está cerca de la concentración de calcio ionizado en los primeros endosomas in vivo.
En la presente memoria, "la actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio" significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno es más débil a una concentración de iones de calcio seleccionada entre 0,1 gM y 30 gM que a una concentración de iones de calcio seleccionada entre 100 gM y 10 mM. Preferiblemente, significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno es más débil a una concentración de iones de calcio seleccionada entre 0,5 gM y 10 gM que a una concentración de iones de calcio seleccionada entre 200 gM y 5 mM.
Significa en particular preferiblemente que la actividad de unión a antígeno a la concentración de iones de calcio en el endosoma temprano in vivo es más débil que a la concentración de iones de calcio en plasma in vivo; y, específicamente, significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno es más débil a una concentración de iones de calcio seleccionada entre 1 pM y 5 pM que a una concentración de iones de calcio seleccionada entre 500 pM y 2,5 mM.
Se puede determinar si la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno cambia dependiendo de las concentraciones de iones metálicos, por ejemplo, mediante el uso de métodos de medición conocidos, tales como los descritos en la sección "Actividad de unión" anterior. Por ejemplo, para confirmar que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno se vuelve mayor a una concentración alta de iones de calcio que a una concentración baja de iones de calcio, se compara la actividad de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno a concentraciones bajas y altas de iones de calcio.
En la presente invención, la expresión "la actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio" también puede expresarse como "la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno es mayor a una concentración alta de iones de calcio que a una concentración baja de iones de calcio". En la presente invención, "la actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio" se escribe en ocasiones como "la capacidad de unión a antígeno es más débil a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio". Además, "la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de calcio se reduce hasta ser menor que a una concentración alta de iones de calcio" puede escribirse como "la capacidad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de calcio se hace más débil que a una concentración alta de iones de calcio".
Al determinar la actividad de unión a antígeno, las condiciones distintas de la concentración de iones de calcio pueden ser seleccionadas adecuadamente por los expertos en la técnica y no están particularmente limitadas. Por ejemplo, la actividad se puede determinar a 37 °C en tampón HEPES. Por ejemplo, Biacore (GE Healthcare) o similar se puede utilizar para la determinación. Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno se puede evaluar haciendo fluir el antígeno como analito sobre un chip en el que se inmoviliza la molécula de unión a antígeno. Cuando el antígeno es un antígeno de membrana, la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno al antígeno de membrana se puede evaluar haciendo fluir la molécula de unión a antígeno como analito sobre un chip en el que se inmoviliza el antígeno.
Siempre que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención sea más débil a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, la relación de la actividad de unión a antígeno entre concentraciones bajas y altas de iones de calcio no está particularmente limitada. Sin embargo, la relación de la KD (constante de disociación) de la molécula de unión a antígeno para un antígeno a una concentración baja de iones de calcio con respecto a la KD a una concentración alta de iones de calcio, es decir, el valor de KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM), es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 10 o más y aún más preferiblemente 40 o más. El límite superior del valor de KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM) no está limitado en particular y puede ser cualquier valor, tal como 400, 1000 o 10000, siempre que la molécula se pueda producir mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Cuando el antígeno es un antígeno soluble, puede usarse KD (constante de disociación) para representar la actividad de unión a antígeno. Al mismo tiempo, cuando el antígeno es un antígeno de membrana, se puede usar la KD aparente (constante de disociación aparente) para representar la actividad. Se pueden determinar KD (constante de disociación) y KD aparente (constante de disociación aparente) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, utilizando Biacore (GE healthcare), gráfico de Scatchard o citómetro de flujo.
Como alternativa, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación (kd) también se puede utilizar preferiblemente como un índice para representar la relación de la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención entre concentraciones bajas y altas de calcio. Cuando se utiliza la constante de velocidad de disociación (kd) en lugar de la constante de disociación (KD) como índice para representar la relación de actividad de unión, la relación de la constante de velocidad de disociación (kd) entre concentraciones bajas y altas de calcio, es decir, el valor de kd (concentración baja de calcio)/kd (concentración alta de calcio), es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 5 o más, aún más preferiblemente 10 o más y todavía más preferiblemente 30 o más. El límite superior del valor de la Kd (concentración baja de calcio)/kd (concentración alta de calcio) no está limitado en particular y puede ser cualquier valor, tal como 50, 100 o 200, siempre que la molécula se pueda producir mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Cuando el antígeno es un antígeno soluble, puede usarse kd (constante de velocidad de disociación) para representar la actividad de unión a antígeno. Al mismo tiempo, cuando el antígeno es un antígeno de membrana, puede usarse kd aparente (constante de velocidad de disociación aparente) para representar la actividad de unión a antígeno. Se pueden determinar la kd (constante de velocidad de disociación) y kd aparente (constante de velocidad de disociación aparente) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, utilizando Biacore (GE healthcare) o citómetro de flujo. En la presente invención, cuando la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno se determina a diferentes concentraciones de iones de calcio, es preferible utilizar las mismas condiciones excepto por las concentraciones de calcio.
Por ejemplo, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que es una realización de la presente invención, se puede obtener mediante el cribado de dominios de unión a antígeno o anticuerpos, incluyendo las etapas de:
(a) determinar la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo a una concentración baja de calcio;
(b) determinar la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo a una concentración alta de calcio; y
(c) seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de calcio que a una concentración alta de calcio.
Por otra parte, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que es una realización de la presente invención, puede obtenerse mediante el cribado de dominios de unión a antígeno o anticuerpos, o una biblioteca de los mismos, incluyendo las etapas de:
(a) poner en contacto un antígeno con un dominio de unión a antígeno o anticuerpo, o una biblioteca del mismo a una concentración alta de calcio;
(b) incubar a una concentración baja de calcio un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que se ha unido al antígeno en la etapa (a); y
(c) aislar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo disociado en la etapa (b).
Asimismo, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que es una realización de la presente invención, puede obtenerse mediante el cribado de dominios de unión a antígeno o anticuerpos, o una biblioteca de los mismos, incluyendo las etapas de:
(a) poner en contacto un antígeno con una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos a una concentración baja de calcio;
(b) seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que no se une al antígeno en la etapa (a);
(c) permitir que el dominio de unión a antígeno o anticuerpo seleccionado en la etapa (c) se una al antígeno a una concentración alta de calcio; y
(d) aislar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que se ha unido al antígeno en la etapa (c).
Además, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que es una realización de la presente invención, puede obtenerse mediante un método de cribado que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto a una concentración alta de calcio una biblioteca de dominios de unión a antígenos o anticuerpos con una columna en la que se inmoviliza un antígeno;
(b) eluir un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que se ha unido a la columna en la etapa (a) de la columna a una concentración baja de calcio; y
(c) aislar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo eluido en la etapa (b).
Asimismo, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que es una realización de la presente invención, puede obtenerse mediante un método de cribado que comprende las etapas de:
(a) permitir a una concentración baja de calcio que una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos pase a través de una columna en la que se inmoviliza un antígeno;
(b) recoger un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que se ha eluido sin unirse a la columna en la etapa (a); (c) permitir que el dominio de unión a antígeno o anticuerpo recogido en la etapa (b) se una al antígeno a una concentración alta de calcio; y
(d) aislar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que se ha unido al antígeno en la etapa (c).
Por otra parte, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que es una realización de la presente invención, puede obtenerse mediante un método de cribado que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto un antígeno con una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos a una concentración alta de calcio;
(b) obtener un dominio de unión a antígeno o anticuerpo que se ha unido al antígeno en la etapa (a);
(c) incubar a una concentración baja de calcio el dominio de unión a antígeno o anticuerpo obtenido en la etapa (b); y
(d) aislar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno en la etapa (c) es más débil que el criterio para la selección de la etapa (b).
Las etapas descritas anteriormente se pueden repetir dos o más veces. Por tanto, la presente invención proporciona dominios de unión a antígeno o anticuerpos cuya actividad de unión a antígeno es menor a una concentración baja de iones de calcio que a una concentración alta de iones de calcio, que se obtienen mediante métodos de cribado que comprenden además la etapa de repetir dos o más veces las etapas (a) a (c) o (a) a (d) en los métodos de cribado descritos anteriormente. El número de ciclos de las etapas (a) a (c) o (a) a (d) no está particularmente limitado, pero es, en general, 10 o menos.
En los métodos de cribado de la presente invención, la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno 0 anticuerpo a una concentración baja de calcio no está particularmente limitada siempre que sea actividad de unión a antígeno a una concentración de calcio ionizado de entre 0,1 pM y 30 pM, pero preferiblemente es actividad de unión a antígeno a una concentración de calcio ionizado de entre 0,5 pM y 10 pM. Más preferiblemente, es la actividad de unión a antígeno a la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo, de manera específica, entre 1 pM y 5 pM. Al mismo tiempo, la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo a una concentración alta de calcio no está particularmente limitada, siempre que sea actividad de unión a antígeno a una concentración de calcio ionizado de entre 100 pM y 10 mM, pero preferiblemente es actividad de unión a antígeno a una concentración de calcio ionizado de entre 200 pM y 5 mM. Más preferiblemente, es la actividad de unión a antígeno a la concentración de calcio ionizado en plasma in vivo, de manera específica, entre 0,5 mM y 2,5 mM.
La actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica pueden determinar condiciones distintas de la concentración de calcio ionizado. La actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo se puede evaluar como una constante de disociación (KD), constante de disociación aparente (KD aparente), constante de velocidad de disociación (kd), constante de disociación aparente (kd aparente) y similares. Estas pueden determinarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, utilizando Biacore (GE healthcare), gráfico de Scatchard o FACS.
En la presente invención, la etapa de seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es mayor a una concentración alta de calcio que a una concentración baja de calcio es sinónimo de la etapa de seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno es menor a concentración baja de calcio que a concentración alta de calcio.
Siempre que la actividad de unión a antígeno sea mayor a una concentración alta de calcio que a una concentración baja de calcio, la diferencia en la actividad de unión a antígeno entre concentraciones altas y bajas de calcio no está particularmente limitada; sin embargo, la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de calcio es preferiblemente dos veces o más, más preferiblemente 10 veces o más y aún más preferiblemente 40 veces o más que a una concentración baja de calcio.
Los dominios de unión a antígeno o anticuerpos de la presente invención que se van a cribar mediante los métodos de cribado descritos anteriormente pueden ser cualquier dominio de unión a antígeno y anticuerpo. Por ejemplo, es posible cribar los dominios de unión a antígeno o anticuerpos descritos anteriormente. Por ejemplo, pueden seleccionarse dominios de unión a antígeno o anticuerpos que tienen secuencias naturales o secuencias de aminoácidos sustituidas.
Bibliotecas
En una realización, se puede obtener un dominio de unión a antígeno o anticuerpo de la presente invención a partir de una biblioteca que está compuesta principalmente por una pluralidad de moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de unión a antígeno tienen al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones. Las concentraciones de iones preferiblemente incluyen, por ejemplo, concentración de iones metálicos y concentración de iones de hidrógeno.
En la presente memoria, una "biblioteca" se refiere a una pluralidad de moléculas de unión a antígeno o una pluralidad de polipéptidos de fusión que contienen moléculas de unión a antígeno, o ácidos nucleicos o polinucleótidos que codifican sus secuencias. Las secuencias de una pluralidad de moléculas de unión a antígeno o una pluralidad de polipéptidos de fusión que contienen moléculas de unión a antígeno en una biblioteca no son idénticas, sino que son diferentes entre sí.
En la presente memoria, la frase "secuencias son diferentes entre sí" en la expresión "una pluralidad de moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí" significa que las secuencias de moléculas de unión a antígeno en una biblioteca son diferentes entre sí. De manera específica, en una biblioteca, el número de secuencias diferentes entre sí refleja el número de clones independientes con secuencias diferentes y también puede denominarse "tamaño de la biblioteca". El tamaño de la biblioteca de una biblioteca de presentación en fagos convencional varía de 106 a 1012 El tamaño de la biblioteca se puede aumentar hasta 1014 mediante el uso de técnicas conocidas tales como presentación en ribosomas. Sin embargo, el número real de partículas de fago utilizadas en la selección de exploración de una biblioteca de fagos es en general 10-10.000 veces mayor que el tamaño de la biblioteca. Este exceso de multiplicidad también se denomina "el número de equivalentes de biblioteca" y significa que hay de 10 a 10.000 clones individuales que tienen la misma secuencia de aminoácidos. Por tanto, en la presente invención, la frase "secuencias son diferentes entre sí" significa que las secuencias de moléculas de unión a antígeno independientes en una biblioteca, excluyendo equivalentes de biblioteca, son diferentes entre sí. De manera más específica, lo anterior significa que hay de 106 a 1014 moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí, preferiblemente de 107 a 1012 moléculas, más preferiblemente de 108 a 1011 moléculas y de manera particularmente preferible de 108 a 1010 moléculas cuyas secuencias son diferentes entre sí.
En la presente memoria, la frase "una pluralidad de" en la expresión "una biblioteca compuesta principalmente por una pluralidad de moléculas de unión a antígeno" se refiere, en general, a, en el caso de, por ejemplo, moléculas de unión a antígeno, polipéptidos de fusión, moléculas polinucleotídicas, vectores o virus de la presente invención, un grupo de dos o más tipos de sustancia. Por ejemplo, cuando dos o más sustancias son diferentes entre sí en una característica particular, esto significa que hay dos o más tipos de sustancia. Dichos ejemplos pueden incluir, por ejemplo, aminoácidos mutantes observados en posiciones específicas de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, cuando hay dos o más moléculas de unión a antígeno de la presente invención cuyas secuencias son sustancialmente iguales o preferiblemente iguales excepto por restos flexibles o excepto por aminoácidos mutantes en particular en posiciones hipervariables expuestas en la superficie, hay una pluralidad de moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En otro ejemplo, cuando hay dos o más moléculas polinucleotídicas cuyas secuencias son sustancialmente iguales o preferiblemente iguales, excepto por nucleótidos que codifican restos flexibles o nucleótidos que codifican aminoácidos mutantes de posiciones hipervariables expuestas en la superficie, hay una pluralidad de moléculas polinucleotídicas de la presente invención.
Además, en la presente memoria, la frase "compuesta principalmente por" en la expresión "una biblioteca compuesta principalmente por una pluralidad de moléculas de unión a antígeno" refleja el número de moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de las concentraciones de iones, entre clones independientes con secuencias diferentes en una biblioteca. De manera específica, es preferible que haya al menos 104 moléculas de unión a antígeno que tienen dicha actividad de unión en una biblioteca. Más preferiblemente, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca que contiene al menos 105 moléculas de unión a antígeno que tienen dicha actividad de unión. Aún más preferiblemente, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca que contiene al menos 106 moléculas de unión a antígeno que tienen dicha actividad de unión. De manera particularmente preferible, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca que contiene al menos 107 moléculas de unión a antígeno que tienen dicha actividad de unión. Aún más preferiblemente, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca que contiene al menos 108 moléculas de unión a antígeno que tienen dicha actividad de unión. Como alternativa, esto también puede expresarse preferiblemente como la relación del número de moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de las concentraciones de iones con respecto al número de clones independientes que tienen secuencias diferentes en una biblioteca. De manera específica, pueden obtenerse dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca en la que las moléculas de unión a antígeno que tienen dicha actividad de unión representan de 0,1 % a 80 %, preferiblemente de 0,5 % a 60 %, más preferiblemente de 1 % a 40 %, aún más preferiblemente de 2 % a 20 % y de manera particularmente preferible de 4 % a 10 % de clones independientes con diferentes secuencias en la biblioteca. En el caso de polipéptidos de fusión, moléculas polinucleotídicas o vectores, pueden ser posibles expresiones similares utilizando el número de moléculas o la relación con respecto al número total de moléculas. En el caso de virus, también pueden ser posibles expresiones similares utilizando el número de viriones o la relación con respecto al número total de viriones.
Aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de los dominios de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio
Los dominios de unión a antígenos o anticuerpos de la presente invención que se van a cribar mediante los métodos de cribado descritos anteriormente se pueden preparar de cualquier manera. Por ejemplo, cuando el ion metálico es ion de calcio, es posible utilizar anticuerpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (biblioteca de fagos, etc.), anticuerpos o bibliotecas preparados a partir de hibridomas obtenidos inmunizando animales o a partir de linfocitos B de animales inmunizados, anticuerpos o bibliotecas obtenidos mediante la introducción de aminoácidos capaces de quelar calcio (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico) o mutaciones de aminoácidos no naturales en los anticuerpos o bibliotecas descritos anteriormente (aminoácidos quelables con calcio (tales como ácido aspártico y ácido glutámico), bibliotecas con mayor contenido de aminoácidos no naturales, bibliotecas preparadas mediante la introducción de aminoácidos quelables con calcio (tales como ácido aspártico y ácido glutámico) o mutaciones de aminoácidos no naturales en posiciones particulares, o similares.
Los ejemplos de los aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones, como se ha descrito anteriormente, pueden ser cualquier tipo de aminoácido siempre que los aminoácidos formen un motivo de unión a calcio. Los motivos de unión a calcio son bien conocidos por los expertos en la técnica y se han descrito en detalle (por ejemplo, Springer et al. (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki y Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief et al. (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux et al. (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch y Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer et al. (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg et al. (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). De manera específica, cualquier motivo de unión a calcio conocido, incluyendo lectinas de tipo C tales como ASGPR, CD23, MBR y DC-SIGN, puede incluirse en moléculas de unión a antígeno de la presente invención. Los ejemplos preferidos de dichos motivos de unión a calcio preferidos también incluyen, además de los descritos anteriormente, por ejemplo, el motivo de unión a calcio en el dominio de unión a antígeno de la SEQ ID NO: 4.
Asimismo, como aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio, por ejemplo, también se pueden usar preferiblemente aminoácidos que tienen actividad quelante de metales. Los ejemplos de dichos aminoácidos quelantes de metales incluyen, por ejemplo, serina (Ser(S)), treonina (Thr(T)), asparagina (Asn(N)), glutamina (Gln(Q)), ácido aspártico (Asp(D)) y ácido glutámico (Glu(E)).
Las posiciones en los dominios de unión a antígeno en los que están contenidos los aminoácidos descritos anteriormente no se limitan en particular a posiciones particulares y pueden ser cualquier posición dentro de la región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera que forma un dominio de unión a antígeno, siempre que alteren la actividad de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. De manera específica, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de unión a antígeno de cadena pesada contienen aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. En otra realización, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención pueden obtenerse de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR3 de cadena pesada contienen los aminoácidos mencionados anteriormente. En otra realización más, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR3 de cadena pesada contienen los aminoácidos mencionados anteriormente en las posiciones 95, 96, 100a y/o 101 como se indica según el sistema de numeración de Kabat.
Al mismo tiempo, en una realización de la presente invención, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios de unión a antígeno de cadena ligera contienen aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. En otra realización, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR1 de cadena ligera contienen los aminoácidos mencionados anteriormente. En otra realización más, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR1 de cadena ligera contienen los aminoácidos mencionados anteriormente en las posiciones 30, 31 y/o 32 como se indica según el sistema de numeración de Kabat.
En otra realización, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR2 de cadena ligera contienen los restos de aminoácidos mencionados anteriormente. En otra realización más, la presente invención proporciona bibliotecas compuestas principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR2 de cadena ligera contienen los restos de aminoácidos mencionados anteriormente en la posición 50 como se indica según el sistema de numeración de Kabat.
En otra realización más de la presente invención, los dominios de unión a antígeno de la presente invención pueden obtenerse de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR3 de cadena ligera contienen los restos de aminoácidos mencionados anteriormente. En una realización alternativa, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyos dominios CDR3 de cadena ligera contienen los restos de aminoácidos mencionados anteriormente en la posición 92 como se indica según el sistema de numeración de Kabat.
Asimismo, en una realización diferente de la presente invención, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y en la que dos o tres CDR seleccionadas de la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera descrita anteriormente, contienen los restos de aminoácidos mencionados anteriormente. Por otra parte, se pueden obtener dominios de unión a antígeno de la presente invención de una biblioteca compuesta principalmente por moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí y cuyas cadenas ligeras contienen los restos de aminoácidos anteriormente mencionados en una cualquiera o más de las posiciones 30, 31, 32, 50 y/o 92 como se indica según el sistema de numeración de Kabat.
En una realización particularmente preferida, las secuencias marco conservadas de la región variable de cadena ligera y/o cadena pesada de una molécula de unión a antígeno contienen preferiblemente secuencias marco conservadas de línea germinal humana. Por tanto, en una realización de la presente invención, cuando las secuencias marco conservadas son secuencias completamente humanas, se espera que cuando dicha molécula de unión a antígeno de la presente invención se administre a seres humanos (por ejemplo, para tratar enfermedades), induce poca o ninguna respuesta inmunogénica. En el sentido anterior, la frase "que contiene una secuencia de línea germinal" en la presente invención significa que una parte de las secuencias marco conservadas de la presente invención es idéntica a una parte de cualquier secuencia marco conservada de línea germinal humana. Por ejemplo, cuando la secuencia de FR2 de cadena pesada de una molécula de unión a antígeno de la presente invención es una combinación de secuencias de FR2 de cadena pesada de diferentes secuencias marco conservadas de línea germinal humana, dicha molécula es también una molécula de unión a antígeno de la presente invención "que contiene una secuencia de línea germinal". Los ejemplos preferidos de los marcos conservados incluyen, por ejemplo, secuencias de región marco conservada completamente humanas conocidas actualmente, que se incluyen en el sitio web de V-Base (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) u otros. Esas secuencias de región marco conservada se pueden usar de manera adecuada como una secuencia de línea germinal contenida en una molécula de unión a antígeno de la presente invención. Las secuencias de línea germinal pueden clasificarse según su similitud (Tomlinson et al. (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776­ 798); Williams y Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Las secuencias de línea germinal adecuadas se pueden seleccionar de Vk, que se agrupa en siete subgrupos; VA, que se agrupa en diez subgrupos; y VH, que se agrupa en siete subgrupos.
Las secuencias de VH completamente humanas incluyen preferiblemente, pero sin limitación, por ejemplo, secuencias de VH de:
subgrupo VH1 (por ejemplo, VH1-2, VH1-3, VH1 -8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1 -58 y VH1-69); subgrupo VH2 (por ejemplo, VH2-5, VH2-26 y VH2-70);
subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 y VH3-74);
subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 y VH4-61); subgrupo VH5 (VH5-51); subgrupo VH6 (VH6-1); y
subgrupo VH7 (VH7-4 y VH7-81).
Estos también se describen en documentos conocidos (Matsuda et al. (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) y similares, y de este modo los expertos en la técnica pueden diseñar adecuadamente moléculas de unión a antígeno de la presente invención basándose en la información de estas secuencias. También es preferible utilizar otros armazones o subregiones de armazones completamente humanos.
Las secuencias de Vk completamente humanas incluyen preferiblemente, pero sin limitación, por ejemplo:
A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 y O18 agrupados en el subgrupo Vk1;
A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 y O11, agrupados en el subgrupo Vk2; A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 y L25, agrupados en el subgrupo Vk3;
B3, agrupados en el subgrupo Vk4;
B2 (también denominado en el presente documento Vk5-2), agrupado en el subgrupo Vk5; y
A10, A14 y A26, agrupados en el subgrupo Vk6
(Kawasaki et al. (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable y Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173-181)).
Las secuencias de VL completamente humanas incluyen preferiblemente, pero sin limitación, por ejemplo:
V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 y V1-22, agrupados en el subgrupo VL1;
V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 y V2-19, agrupados en el subgrupo VL1;
V3-2, V3-3 y V3-4, agrupados en el subgrupo VL3;
V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 y V4-6, agrupados en el subgrupo VL4; y
V5-1, V5-2, V5-4 y V5-6, agrupados en el subgrupo VL5 (Kawasaki et al. (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).
Normalmente, estas secuencias marco conservadas son diferentes entre sí en uno o más restos de aminoácidos. Estas secuencias marco se pueden usar en combinación con "al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones" de la presente invención. Otros ejemplos de armazones completamente humanos utilizados en combinación con "al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones" de la presente invención incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, KOL, NEWM, REI, UE, TUR, TEI, LAY y POM (por ejemplo, Kabat et al. (1991) mencionado anteriormente; Wu et al. (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
Sin quedar ligados a una teoría en particular, se cree que una de las razones de la expectativa de que el uso de secuencias de línea germinal excluya respuestas inmunitarias adversas en la mayoría de los individuos es la siguiente. Como resultado del proceso de maduración de la afinidad durante las respuestas inmunitarias normales, se produce mutación somática con frecuencia en las regiones variables de inmunoglobulina. Dichas mutaciones se producen principalmente alrededor de CDR cuyas secuencias son hipervariables, pero también afectan a restos de regiones marco conservadas. Dichas mutaciones de marco conservado no existen en los genes de la línea germinal y también es menos probable que sean inmunógenas en los pacientes. Por otro lado, la población humana normal está expuesta a la mayoría de las secuencias marco conservadas expresadas a partir de los genes de la línea germinal. Como resultado de la inmunotolerancia, se espera que estos armazones de línea germinal tengan una inmunogenicidad baja o nula en los pacientes. Para maximizar la posibilidad de inmunotolerancia, los genes que codifican la región variable pueden seleccionarse de un grupo de genes de línea germinal funcionales que aparecen habitualmente.
Se pueden emplear de manera adecuada métodos conocidos tales como mutagénesis dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y PCR de extensión solapante para producir moléculas de unión a antígeno de la presente invención en las que las secuencias marco conservadas descritas anteriormente contienen aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio.
Por ejemplo, se puede construir una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión a antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí combinando regiones variables de cadena pesada preparadas como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias con una región variable de cadena ligera seleccionada como secuencia marco conservada que contiene originalmente al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. Como ejemplo no limitante, cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, dichas bibliotecas preferidas incluyen, por ejemplo, las construidas combinando la secuencia de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4 (Vk5-2) y la región variable de cadena pesada producida como una biblioteca de secuencias de región variable aleatorias.
Como alternativa, una secuencia de región variable de cadena ligera seleccionada como región marco conservada que contiene originalmente al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno como se ha mencionado anteriormente puede diseñarse para contener diversos restos de aminoácidos distintos de los restos de aminoácidos anteriores. En la presente memoria, dichos restos se denominan restos flexibles. El número y la posición de los restos flexibles no están particularmente limitados siempre que la actividad de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las concentraciones de iones. De manera específica, las secuencias de CDR y/o secuencias de FR de la cadena pesada y/o cadena ligera pueden contener uno o más restos flexibles. Por ejemplo, cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, los ejemplos no limitantes de restos flexibles para introducir en la secuencia de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4 (Vk5-2) incluyen los restos de aminoácidos enumerados en las tablas 1 o 2.
[Tabla 1]
Figure imgf000045_0001
[Tabla 2]
Figure imgf000045_0002
En la presente memoria, los restos flexibles se refieren a variaciones de restos de aminoácidos presentes en posiciones hipervariables en las que están presentes varios aminoácidos diferentes en las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada cuando se comparan las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o dominios de unión a antígeno conocidos y/o nativos. Las posiciones hipervariables se localizan en general en las regiones CDR.
En una realización, los datos proporcionados por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 y 1991) son útiles para determinar posiciones hipervariables en anticuerpos conocidos y/o nativos. Asimismo, las bases de datos en Internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) proporcionan las secuencias recogidas de muchas cadenas ligeras y cadenas pesadas humanas y sus ubicaciones. La información sobre las secuencias y ubicaciones es útil para determinar posiciones hipervariables en la presente invención. Según la presente invención, cuando una determinada posición de aminoácido tiene preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 posibles variaciones de restos de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 19, preferiblemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 18, preferiblemente de 5 a 17, preferiblemente de 6 a 16, preferiblemente de 7 a 15, preferiblemente de 8 a 14, preferiblemente de 9 a 13 y preferiblemente de 10 a 12 posibles variaciones de restos de aminoácidos, la posición es hipervariable. En algunas realizaciones, una determinada posición de aminoácido puede tener preferiblemente al menos aproximadamente 2, preferiblemente al menos aproximadamente 4, preferiblemente al menos aproximadamente 6, preferiblemente al menos aproximadamente 8, preferiblemente aproximadamente 10 y preferiblemente aproximadamente 12 variaciones de restos de aminoácidos.
Como alternativa, se puede construir una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión a antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí combinando regiones variables de cadena pesada producidas como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias con regiones variables de cadena ligera en las que se introduce al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de las moléculas de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones, como se ha mencionado anteriormente. Cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, los ejemplos no limitantes de dichas bibliotecas incluyen preferiblemente, por ejemplo, bibliotecas en las que se combinan regiones variables de cadena pesada producidas como una biblioteca de secuencias de región variable aleatorias con secuencias de región variable de cadena ligera en las que un resto o restos particulares en una secuencia de línea germinal tal como las SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) o SEQ ID NO: 8 (Vk4) se han sustituido por al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. Los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos incluyen restos de aminoácidos en CDR1 de cadena ligera. Asimismo, los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos incluyen restos de aminoácidos en CDR2 de cadena ligera. Además, los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos también incluyen restos de aminoácidos en CDR3 de cadena ligera.
Los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos contenidos en CDR1 de cadena ligera incluyen los de las posiciones 30, 31 y/o 32 en la CDR1 de región variable de cadena ligera como se indica mediante numeración EU. Asimismo, los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos contenidos en CDR2 de cadena ligera incluyen un resto de aminoácido en la posición 50 en la CDR2 de región variable de cadena ligera como se indica mediante numeración de Kabat. Por otra parte, los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos contenidos en CDR3 de cadena ligera incluyen un resto de aminoácido en la posición 92 en la CDR3 de región variable de cadena ligera como se indica mediante numeración de Kabat. Estos restos de aminoácidos pueden estar contenidos solos o en combinación siempre que formen un motivo de unión a calcio y/o siempre que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno varíe dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. Al mismo tiempo, como se conocen troponina C, calmodulina, parvalbúmina y cadena ligera de miosina, que tienen varios sitios de unión a iones de calcio y se cree que proceden de un origen común en términos de evolución molecular, las CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se pueden diseñar para que tengan sus motivos de unión. Por ejemplo, es posible utilizar dominios de cadherina, mano EF de calmodulina, dominio C2 de la proteína cinasa C, dominio Gla de la proteína de coagulación sanguínea factor IX, lectinas de tipo C del receptor de asialoglucoproteína y del receptor de unión a manosa, dominios A de receptores de LDL, anexina, dominio de trombospondina de tipo 3 y dominios de tipo EGF de una manera adecuada para los fines anteriores.
Cuando se han descrito regiones variables de cadena pesada producidas como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias y regiones variables de cadena ligera en las que se ha introducido al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones, como se ha descrito anteriormente, las secuencias de las regiones variables de cadena ligera pueden diseñarse para que contengan restos flexibles de la misma manera que se ha descrito anteriormente. El número y la posición de dichos restos flexibles no están particularmente limitados a realizaciones particulares siempre que la actividad de unión a antígeno de moléculas de unión a antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las concentraciones de iones. De manera específica, las secuencias de CDR y/o secuencias de FR de cadena pesada y/o cadena ligera pueden contener uno o más restos flexibles. Cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, los ejemplos no limitantes de restos flexibles para introducir en la secuencia de región variable de cadena ligera incluyen los restos de aminoácidos enumerados en las tablas 1 y 2.
Las regiones variables de cadena pesada preferidas para combinar incluyen, por ejemplo, bibliotecas de regiones variables aleatorias. Se combinan métodos conocidos según sea adecuado para producir una biblioteca de regiones variables aleatorias. En una realización no limitante de la presente invención, una biblioteca inmunitaria construida a base de genes de anticuerpos derivados de linfocitos de animales inmunizados con un antígeno específico, pacientes con infecciones, personas con un título elevado de anticuerpos en sangre como resultado de la vacunación, pacientes con cáncer o pacientes con enfermedades autoinmunitarias, puede utilizarse preferiblemente como una biblioteca de regiones variables aleatorias.
En otra realización no limitante de la presente invención, una biblioteca sintética producida reemplazando las secuencias de CDR de genes V en ADN genómico o genes V remodelados funcionales con un conjunto de oligonucleótidos sintéticos que contienen secuencias que codifican conjuntos de codones de una longitud adecuada también se puede utilizar preferiblemente como una biblioteca de regiones variables aleatorias. En este caso, ya que se observa diversidad de secuencia en la secuencia de CDR3 de cadena pesada, también es posible reemplazar solamente la secuencia de CDR3. Un criterio para dar lugar a diversidad de aminoácidos en la región variable de una molécula de unión a antígeno es que se proporciona diversidad a restos de aminoácidos en posiciones expuestas en superficie en la molécula de unión a antígeno. La posición expuesta en superficie se refiere a una posición que se considera que puede exponerse en la superficie y/o ponerse en contacto con un antígeno, en función de la estructura, conjunto de estructuras y/o estructura modelada de una molécula de unión a antígeno. En general, dichas posiciones son CDR. Preferiblemente, las posiciones expuestas en superficie se determinan utilizando coordenadas de un modelo tridimensional de una molécula de unión a antígeno utilizando un programa informático tal como el programa InsightII (Accelrys). Las posiciones expuestas en superficie se pueden determinar utilizando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee y Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). La determinación de las posiciones expuestas en superficie se puede realizar utilizando un programa informático adecuado para el modelado de proteínas y la información estructural tridimensional obtenida de un anticuerpo. El programa informático que se puede utilizar para estos fines incluye preferiblemente el programa informático SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). En general, o preferiblemente, cuando un algoritmo requiere un parámetro de tamaño introducido por el usuario, el "tamaño" de una sonda que se utiliza en el cálculo se establece en aproximadamente 1,4 Angstrom o menos de radio. Asimismo, se describen métodos para determinar regiones y áreas expuestas en superficie utilizando programas informáticos para ordenadores personales en Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1,46-53).
En otra realización no limitante de la presente invención, una biblioteca sin exposición previa, que se construye a partir de genes de anticuerpos procedentes de linfocitos de personas sanas y cuyo repertorio consiste en secuencias sin exposición previa, que son secuencias de anticuerpos sin sesgo, también se puede utilizar de manera particularmente preferible como una biblioteca de regiones variables aleatorias (Gejima etal. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51,337-344)). En la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia sin exposición previa se refiere a una secuencia de aminoácidos obtenida de dicha biblioteca sin exposición previa.
En una realización de la presente invención, se puede obtener un dominio de unión a antígeno de la presente invención a partir de una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión a antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí, preparado combinando regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias con una región variable de cadena pesada seleccionada como una secuencia marco conservada que originalmente contiene "al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones". Cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, los ejemplos no limitantes de tales bibliotecas incluyen preferiblemente las construidas combinando regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencias de región variable aleatorias con la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) o la SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1). Como alternativa, dicha biblioteca se puede construir seleccionando regiones variables de cadena ligera adecuadas de las que tienen secuencias de línea germinal, en lugar de regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias. Dichas bibliotecas preferidas incluyen, por ejemplo, aquellas en las que la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ iD NO: 9 (6RL#9-IgG1) o la SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) se combina con regiones variables de cadena ligera que tienen secuencias de línea germinal.
Como alternativa, la secuencia de una región variable de cadena pesada seleccionada como secuencia marco conservada que contiene originalmente "al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno" como se ha mencionado anteriormente puede diseñarse para contener restos flexibles. El número y la posición de los restos flexibles no están particularmente limitados siempre que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las concentraciones de iones. De manera específica, las secuencias de CDR y/o FR de cadena pesada y/o cadena ligera pueden contener uno o más restos flexibles. Cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, los ejemplos no limitantes de restos flexibles que se van a introducir en la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) incluyen todos los restos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de cadena pesada y los restos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada excepto los de las posiciones 95, 96 y/o 100a. Como alternativa, los ejemplos no limitantes de restos flexibles que se van a introducir en la secuencia de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) incluyen todos los restos de aminoácidos de CDR1 y CDR2 de cadena pesada y los restos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada excepto los de las posiciones de aminoácidos 95 y/o 101.
Como alternativa, se puede construir una biblioteca que contiene una pluralidad de moléculas de unión a antígeno cuyas secuencias son diferentes entre sí combinando regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencias de región variable aleatorias o regiones variables de cadena ligera que tienen secuencias de línea germinal con regiones variables de cadena pesada en las que "al menos un resto de aminoácido responsable del cambio dependiente de la concentración de iones en la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno" se ha introducido como se ha mencionado anteriormente. Cuando la concentración de iones es la concentración de iones de calcio, los ejemplos no limitantes de dichas bibliotecas incluyen preferiblemente aquellas en las que las regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias o regiones variables de cadena ligera que tienen secuencias de línea germinal se combinan con la secuencia de una región variable de cadena pesada en la que un resto o restos particulares se han sustituido por al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio. Los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos incluyen restos de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada. Ejemplos no limitantes adicionales de dichos restos de aminoácidos incluyen restos de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada. Además, los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos también incluyen restos de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada. Los ejemplos no limitantes de dichos restos de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada incluyen los aminoácidos de las posiciones 95, 96, 100a y/o 101 en la CDR3 de región variable de la cadena pesada, como se indica mediante la numeración de Kabat. Asimismo, estos restos de aminoácidos pueden estar contenidos solos o en combinación siempre que formen un motivo de unión a calcio y/o la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno varíe dependiendo de las concentraciones de iones de calcio.
Cuando se combinan regiones variables de cadena ligera construidas como una biblioteca de secuencias de región variable aleatorias o regiones variables de cadena ligera que tienen una secuencia de línea germinal con una región variable de cadena pesada en la que se ha introducido al menos un resto de aminoácido que altera la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones como se ha mencionado anteriormente, la secuencia de la región variable de cadena pesada también puede diseñarse para que contenga restos flexibles de la misma manera que se ha descrito anteriormente. El número y la posición de restos flexibles no están particularmente limitados siempre que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención varíe dependiendo de las concentraciones de iones. De manera específica, las secuencias de CDR y/o FR de cadena pesada pueden contener uno o más restos flexibles. Asimismo, se pueden usar preferiblemente bibliotecas de regiones variables aleatorias como secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la región variable de cadena pesada distinta de los restos de aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno. Cuando se utilizan secuencias de línea germinal como regiones variables de cadena ligera, los ejemplos no limitantes de dichas secuencias incluyen las de las SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) y SEQ ID NO: 8 (Vk4).
Se puede utilizar preferiblemente cualquiera de los aminoácidos descritos anteriormente que alteran la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de las concentraciones de iones de calcio, siempre que formen un motivo de unión a calcio. De manera específica, dichos aminoácidos incluyen aminoácidos donantes de electrones. Los ejemplos preferidos de dichos aminoácidos donantes de electrones incluyen, serina, treonina, asparagina, ácido glutámico, ácido aspártico y ácido glutámico.
Condición de las concentraciones de iones de hidrógeno
En una realización de la presente invención, la condición de las concentraciones de iones se refiere a la condición de las concentraciones de iones de hidrógeno o la condición del pH. En la presente invención, la concentración de protones, es decir, el núcleo del átomo de hidrógeno, se trata como sinónimo del índice de hidrógeno (pH). Cuando la actividad del ion de hidrógeno en una solución acuosa se representa como aH+, el pH se define como -log10aH+. Cuando la fuerza iónica de la solución acuosa es baja (por ejemplo, inferior a 10-3), aH+ es casi igual a la fuerza del ion de hidrógeno. Por ejemplo, el producto iónico del agua a 25 °C y 1 atmósfera es Kw = aH+aOH = 10-14 y, por lo tanto, en agua pura, aH+ = aOH = 10-7. En este caso, pH = 7 es neutro; una solución acuosa cuyo pH es inferior a 7 es ácida o cuyo pH es superior a 7 es alcalina.
En la presente invención, cuando se usa la condición de pH como condición de concentración de iones, las condiciones de pH incluyen altas concentraciones de iones de hidrógeno o pH bajos, es decir, un intervalo de pH ácido y concentraciones bajas de iones de hidrógeno o pH altos, es decir, un intervalo de pH neutro. "La actividad de unión varía dependiendo de la condición de pH" significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión de antígeno varía debido a la diferencia en las condiciones de una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo (un intervalo de pH ácido) y una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto (un intervalo de pH neutro). Esto incluye, por ejemplo, el caso donde la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno es mayor en un intervalo de pH neutro que en un intervalo de pH ácido y el caso donde la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno es mayor en un intervalo de pH ácido que en un intervalo de pH neutro.
En la presente memoria descriptiva, el intervalo de pH neutro no se limita a un valor específico y se selecciona preferiblemente entre pH 6,7 y pH 10,0. En otra realización, el pH se puede seleccionar entre pH 6,7 y pH 9,5. En otra realización más, el pH se puede seleccionar entre pH 7,0 y pH 9,0. En aún otra realización, el pH se puede seleccionar entre pH 7,0 y pH 8,0. En particular, el pH preferido incluye pH 7,4, que está cerca del pH del plasma (sangre) in vivo.
En la presente memoria descriptiva, un intervalo de pH ácido no se limita a un valor específico y se selecciona preferiblemente entre pH 4,0 y pH 6,5. En otra realización, el pH se puede seleccionar entre pH 4,5 y pH 6,5. En otra realización más, el pH se puede seleccionar entre pH 5,0 y pH 6,5, En aún otra realización, el pH se puede seleccionar entre pH 5,5 y pH 6,5. En particular, el pH preferido incluye pH 5,8, que está cerca del pH en el endosoma temprano in vivo.
En la presente invención, "la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo (un intervalo de pH ácido) es menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto (un intervalo de pH neutro)" significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a un pH seleccionado entre pH 4,0 y pH 6,5 es más débil que a un pH seleccionado entre pH 6,7 y pH 10,0; preferiblemente significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a un pH seleccionado entre pH 4,5 y pH 6,5 es más débil que a un pH seleccionado entre pH 6,7 y pH 9,5; más preferiblemente, significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a un pH seleccionado entre pH 5,0 y pH 6,5 es más débil que a un pH seleccionado entre pH 7,0 y pH 9,0; aún más preferiblemente significa que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a un pH seleccionado entre pH 5,5 y pH 6,5 es más débil que a un pH seleccionado entre pH 7,0 y pH 8,0; de manera particularmente preferible significa que la actividad de unión a antígeno al pH en el endosoma temprano in vivo es más débil que la actividad de unión a antígeno al pH del plasma in vivo; y significa específicamente que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a pH 5,8 es más débil que la actividad de unión a antígeno a pH 7,4.
Se puede determinar si la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno ha cambiado por la condición de pH, por ejemplo, mediante el uso de métodos de medición conocidos, tales como los descritos en la sección "Actividad de unión" anterior. De manera específica, la actividad de unión se mide en diferentes condiciones de pH utilizando los métodos de medición descritos anteriormente. Por ejemplo, la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno se compara en las condiciones de intervalo de pH ácido e intervalo de pH neutro para confirmar que la actividad de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno cambia para ser mayor en la condición de intervalo de pH neutro que en la condición de intervalo de pH ácido.
Asimismo, en la presente invención, la expresión "la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, es menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro" también se puede expresar como "la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, es mayor que a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido". En la presente invención, "la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, es menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro" puede describirse como "la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, es más débil que la capacidad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro". Como alternativa, "la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, se reduce hasta ser menor que a una baja concentración de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro" puede describirse como "la actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, se reduce hasta ser más débil que la capacidad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro".
Las condiciones distintas de la concentración de iones de hidrógeno o el pH para medir la actividad de unión a antígeno pueden ser seleccionadas adecuadamente por los expertos en la técnica y no están particularmente limitadas. Se pueden llevar a cabo mediciones, por ejemplo, a 37 °C utilizando tampón HEPES. Se pueden llevar a cabo mediciones, por ejemplo, utilizando Biacore (GE Healthcare). Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno se puede determinar evaluando la actividad de unión a antígeno soluble vertiendo el antígeno como analito en un chip con la molécula de unión a antígeno inmovilizada. Cuando el antígeno es un antígeno de membrana, la actividad de unión al antígeno de membrana se puede evaluar vertiendo la molécula de unión a antígeno como analito en un chip con el antígeno inmovilizado.
Siempre que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea más débil que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, la relación de la actividad de unión a antígeno entre a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, un intervalo de pH ácido, y a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, un intervalo de pH neutro no está particularmente limitado, y el valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), que es la relación de la constante de disociación (KD) para un antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, con respecto a la KD a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, es preferiblemente 2 o más; más preferiblemente, el valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) es 10 o más; y aún más preferiblemente, el valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) es 40 o más. El límite superior del valor de KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) no está particularmente limitado y puede ser cualquier valor, tal como 400, 1000 o 10.000, siempre que la molécula pueda producirse mediante las técnicas de los expertos en la técnica.
Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la constante de disociación (KD) se puede utilizar como valor de la actividad de unión a antígeno. Al mismo tiempo, cuando el antígeno es un antígeno de membrana, se puede utilizar la constante de disociación (KD) aparente. La constante de disociación (KD) y la constante de disociación (KD) aparente pueden medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica y pueden utilizarse Biacore (GE healthcare), gráfico de Scatchard, citómetro de flujo y similares.
Como alternativa, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación (kd) puede utilizarse adecuadamente como un índice para indicar la relación de la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención entre a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, un intervalo de pH ácido, y una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, un intervalo de pH neutro. Cuando se utiliza kd (constante de velocidad de disociación) como índice para indicar la relación de actividad de unión en lugar de KD (constante de disociación), el valor de kd (en un intervalo de pH ácido)/kd (en un intervalo de pH neutro), que es la relación de kd (constante de velocidad de disociación) para el antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, con respecto a kd (constante de velocidad de disociación) a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 5 o más, aún más preferiblemente 10 o más y todavía más preferiblemente 30 o más. El límite superior del valor de kd (en un intervalo de pH ácido)/kd (en un intervalo de pH neutro) no está particularmente limitado y puede ser cualquier valor tal como 50, 100 o 200, siempre que la molécula pueda producirse mediante las técnicas de los expertos en la técnica.
Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la constante de velocidad de disociación (kd) se puede utilizar como valor de la actividad de unión a antígeno y cuando el antígeno es un antígeno de membrana, se puede utilizar la constante de velocidad de disociación (kd) aparente. La constante de velocidad de disociación (kd) y la constante de disociación (kd) aparente pueden determinarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica y pueden utilizarse Biacore (GE healthcare), citómetro de flujo y similares. En la presente invención, cuando la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno se mide a diferentes concentraciones de iones de hidrógeno, es decir, pH, las condiciones distintas de la concentración de iones de hidrógeno, es decir, pH, son preferiblemente iguales.
Por ejemplo, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, que es una realización proporcionada por la presente invención, se puede obtener mediante el cribado de dominios de unión a antígeno o anticuerpos, que comprende las siguientes etapas (a) a (c):
(a) obtener la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo en un intervalo de pH ácido;
(b) obtener la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo en un intervalo de pH neutro; y
(c) seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno en el intervalo de pH ácido es menor que en el intervalo de pH neutro.
Como alternativa, un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, que es una realización proporcionada por la presente invención, puede obtenerse mediante el cribado de dominios de unión a antígeno o anticuerpos, o una biblioteca de los mismos, que comprende las siguientes etapas (a) a (c):
(a) poner en contacto un dominio de unión a antígeno o anticuerpo, o una biblioteca de los mismos, en un intervalo de pH neutro con un antígeno;
(b) colocar en un intervalo de pH ácido el dominio de unión a antígeno o anticuerpo unido al antígeno en la etapa (a); y
(c) aislar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo disociado en la etapa (b).
Un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, que es otra realización proporcionada por la presente invención, puede obtenerse mediante el cribado de dominios de unión a antígeno o anticuerpos, o una biblioteca de los mismos, que comprende las siguientes etapas (a) a (d):
(a) poner en contacto en un intervalo de pH ácido un antígeno con una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos;
(b) seleccionar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo que no se une al antígeno en la etapa (a);
(c) permitir que el dominio de unión a antígeno o anticuerpo seleccionado en la etapa (b) se una con el antígeno en un intervalo de pH neutro; y
(d) aislar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo unido al antígeno en la etapa (c).
Un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, que es otra realización más proporcionada por la presente invención, puede obtenerse mediante un método de cribado que comprende las siguientes etapas (a) a (c):
(a) poner en contacto en un intervalo de pH neutro una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos con una columna con un antígeno inmovilizado;
(b) eluir en un intervalo de pH ácido de la columna el dominio de unión a antígeno o anticuerpo unido a la columna en la etapa (a); y
(c) aislar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo eluido en la etapa (b).
Un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, que es aún otra realización proporcionada por la presente invención, puede obtenerse mediante un método de cribado que comprende las siguientes etapas (a) a (d):
(a) permitir, en un intervalo de pH ácido, que una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos pase por una columna con un antígeno inmovilizado;
(b) recoger el dominio de unión a antígeno o anticuerpo eluido sin unirse a la columna en la etapa (a);
(c) permitir que el dominio de unión a antígeno o anticuerpo recogido en la etapa (b) se una con el antígeno en un intervalo de pH neutro; y
(d) aislar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo unido al antígeno en la etapa (c).
Un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, que es todavía otra realización proporcionada por la presente invención, puede obtenerse mediante un método de cribado que comprende las siguientes etapas (a) a (d):
(a) poner en contacto un antígeno con una biblioteca de dominios de unión a antígeno o anticuerpos a un intervalo de pH neutro;
(b) obtener el dominio de unión a antígeno o anticuerpo unido al antígeno en la etapa (a);
(c) colocar en un intervalo de pH ácido el dominio de unión a antígeno o anticuerpo obtenido en la etapa (b); y
(d) aislar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno en la etapa (c) es más débil que el patrón seleccionado la etapa (b).
Las etapas descritas anteriormente se pueden repetir dos o más veces. Por tanto, la presente invención proporciona dominios de unión a antígeno y anticuerpos cuya actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que en un intervalo de pH neutro, que se obtienen mediante un método de cribado que comprende además las etapas de repetir las etapas (a) a (c) o (a) a (d) en los métodos de cribado descritos anteriormente. El número de veces que se repiten las etapas (a) a (c) o (a) a (d) no está particularmente limitado; sin embargo, en general, el número es 10 o menos.
En los métodos de cribado de la presente invención, la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, no está particularmente limitada, siempre que sea la actividad de unión a antígeno a un pH de entre 4,0 y 6,5, e incluya la actividad de unión a antígeno a un pH de entre 4,5 y 6,6 como el pH preferido. La actividad de unión a antígeno también incluye la de un pH entre 5,0 y 6,5 y la de un pH entre 5,5 y 6,5 como otro pH preferido. La actividad de unión a antígeno también incluye la del pH en el endosoma temprano in vivo como pH más preferido y, específicamente, la de pH 5,8. Al mismo tiempo, la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, no está particularmente limitada, siempre que sea la actividad de unión a antígeno a un pH de entre 6,7 y 10, e incluya la actividad de unión a antígeno a un pH de entre 6,7 y 9,5 como el pH preferido. La actividad de unión a antígeno también incluye la de un pH entre 7,0 y 9,5 y la de un pH entre 7,0 y 8,0 como otro pH preferido. La actividad de unión a antígeno también incluye la del pH de plasma in vivo como pH más preferido y, específicamente, la de pH 7,4.
La actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica pueden determinar adecuadamente condiciones distintas de la concentración de calcio ionizado. La actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno o anticuerpo se puede evaluar en función de la constante de disociación (KD), constante de disociación (KD) aparente, constante de velocidad de disociación (kd), constante de velocidad de disociación (kd) aparente y similares. Estas pueden determinarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, utilizando Biacore (GE healthcare), gráfico de Scatchard o FACS.
En la presente memoria, la etapa de seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, sea mayor que a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, es sinónimo de la etapa de seleccionar un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, sea menor que a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro.
Siempre que la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, sea mayor que a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, la diferencia entre la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, un intervalo de pH neutro, y a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, un intervalo de pH ácido, no está particularmente limitada; sin embargo, la actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, es preferiblemente dos veces o más, más preferiblemente 10 veces o más y aún más preferiblemente 40 veces o más que a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido.
El dominio de unión a antígeno o anticuerpo de la presente invención cribado mediante los métodos de cribado descritos anteriormente puede ser cualquier dominio de unión a antígeno o anticuerpo y puede cribarse el dominio de unión a antígeno o anticuerpo mencionado anteriormente. Por ejemplo, se puede cribar el dominio de unión a antígeno o anticuerpo que tiene la secuencia nativa y el dominio de unión a antígeno o anticuerpo en el que se han sustituido sus secuencias de aminoácidos.
El dominio de unión a antígeno o anticuerpo de la presente invención que se va a cribar mediante los métodos de cribado descritos anteriormente se puede preparar de cualquier manera. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos convencionales, bibliotecas convencionales (biblioteca de fagos, etc.), anticuerpos o bibliotecas preparados a partir de linfocitos B de animales inmunizados o de hibridomas obtenidos inmunizando animales, anticuerpos o bibliotecas (bibliotecas con mayor contenido de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, bibliotecas en las que se han introducido aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o mutaciones de aminoácidos no naturales en posiciones específicas, etc.) obtenidas introduciendo aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o mutaciones de aminoácidos no naturales en los anticuerpos o las bibliotecas descritos anteriormente.
Los métodos para obtener un dominio de unión a antígeno o anticuerpo cuya actividad de unión a antígeno a una concentración baja de iones de hidrógeno o pH alto, es decir, en un intervalo de pH neutro, sea mayor que a una concentración alta de iones de hidrógeno o pH bajo, es decir, en un intervalo de pH ácido, de dominios de unión a antígeno o anticuerpos preparados a partir de hibridomas obtenidos inmunizando animales o de linfocitos B de animales inmunizados preferiblemente incluyen, por ejemplo, la molécula de unión a antígeno o el anticuerpo en los que al menos uno de los aminoácidos del dominio de unión a antígeno o anticuerpo está sustituido por un aminoácido con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o una mutación de aminoácido no natural, o el dominio de unión a antígeno o anticuerpo en el que se ha insertado un aminoácido con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácido no natural, tales como los descritos en el documento WO 2009/125825.
Los sitios de introducción de mutaciones de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales no están particularmente limitados y pueden estar en cualquier posición siempre que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido se vuelva más débil que en un intervalo de pH neutro (el valor de KD (en un intervalo de pH ácido)/KD (en un intervalo de pH neutro) o kd (en un intervalo de pH ácido)/kd (en un intervalo de pH neutro ) aumenta) en comparación con antes de la sustitución o inserción. Por ejemplo, cuando la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo, la región variable del anticuerpo y las CDR son adecuadas. Los expertos en la técnica pueden determinar adecuadamente el número de aminoácidos que se van a sustituir o el número de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales que se van a insertar. Es posible sustituir por un solo aminoácido que tenga una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o un solo aminoácido no natural; es posible insertar un solo aminoácido que tenga una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o un solo aminoácido no natural; es posible sustituir por dos o más aminoácidos que tengan una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o dos o más aminoácidos no naturales; y es posible insertar dos o más aminoácidos que tengan una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o dos o más aminoácidos no naturales. Como alternativa, se pueden suprimir, añadir, insertar y/o sustituir otros aminoácidos simultáneamente, además de la sustitución en aminoácidos que tienen una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, o la inserción de aminoácidos que tienen una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales. Se puede realizar sustitución en o inserción de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales de forma aleatoria mediante métodos tales como exploración de histidina, en la que la alanina de exploración de alanina conocida por los expertos en la técnica se reemplaza por histidina. Se pueden seleccionar moléculas de unión a antígeno que presentan un valor mayor de KD (en un intervalo de pH ácido)/KD (en un intervalo de pH neutro) o kd (en un intervalo de pH ácido)/kd (en un intervalo de pH neutro) en comparación con antes de la mutación de dominios de unión a antígeno o anticuerpos en los que se han introducido inserciones aleatorias o mutaciones de sustitución de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales.
Los ejemplos preferidos de moléculas de unión a antígeno que contienen la mutación en aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales como se ha descrito anteriormente y cuya actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que en un intervalo de pH neutro incluyen, moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno en el intervalo de pH neutro después de la mutación en aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales es comparable a la anterior a la mutación en aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales. En la presente memoria, "una molécula de unión a antígeno después de la mutación con aminoácidos que tienen una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales tiene una actividad de unión a antígeno comparable a la anterior a la mutación con aminoácidos que tienen una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales" significa que, cuando se toma la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno antes de la mutación con aminoácidos que tienen una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales como 100 %, la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno después de la mutación con aminoácidos que tienen una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales es al menos 10 % o más, preferiblemente 50 % o más, más preferiblemente 80 % o más y aún más preferiblemente 90 % o más. La actividad de unión a antígeno después de la mutación de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales a pH 7,4 puede ser mayor que antes de la mutación de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales a pH 7,4. Si la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno disminuye debido a la inserción o sustitución en aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, puede hacerse que la actividad de unión a antígeno sea comparable a la anterior a la inserción o sustitución en aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, introduciendo una sustitución, supresión, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos de la molécula de unión a antígeno. La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión se ha ajustado para que sea comparable por sustitución, supresión, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos después de la sustitución o inserción de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales.
Al mismo tiempo, cuando una molécula de unión a antígeno es una sustancia que contiene una región constante de anticuerpo, las realizaciones preferidas de moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que en un intervalo de pH neutro incluyen métodos en los que se han modificado las regiones constantes de anticuerpo contenidas en las moléculas de unión a antígeno. Los ejemplos específicos de regiones constantes de anticuerpo modificadas incluyen preferiblemente las regiones constantes de las SEQ ID NO: 11, 12, 13 y 14.
Aminoácidos que alteran la actividad de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno dependiendo de las condiciones de concentración de iones de hidrógeno
Los dominios de unión a antígenos o anticuerpos de la presente invención que se van a cribar mediante los métodos de cribado descritos anteriormente se pueden preparar de cualquier manera. Por ejemplo, cuando la condición de concentración de iones es la condición de concentración de iones de hidrógeno o la condición de pH, se pueden utilizar anticuerpos convencionales, bibliotecas convencionales (biblioteca de fagos, etc.), anticuerpos o bibliotecas preparados a partir de linfocitos B de animales inmunizados o de hibridomas obtenidos inmunizando animales, anticuerpos o bibliotecas (bibliotecas con mayor contenido de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales, bibliotecas en las que se han introducido mutaciones de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales en posiciones específicas, etc.) obtenidas introduciendo mutaciones de aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 (por ejemplo, histidina y ácido glutámico) o aminoácidos no naturales en los anticuerpos o las bibliotecas descritos anteriormente.
En una realización de la presente invención, también puede construirse una biblioteca que contiene múltiples moléculas de unión a antígeno de la presente invención cuyas secuencias son diferentes entre sí combinando regiones variables de cadena pesada, producida como una biblioteca de secuencias de regiones variables aleatorias, con regiones variables de cadena ligera en las que se ha introducido "al menos un resto de aminoácido que cambia la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de la condición de concentración de iones de hidrógeno".
Dichos restos de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, restos de aminoácidos contenidos en la CDR1 de cadena ligera. Los restos de aminoácidos también incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, restos de aminoácidos contenidos en la CDR2 de cadena ligera. Los restos de aminoácidos también incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, restos de aminoácidos contenidos en la CDR3 de cadena ligera.
Los restos de aminoácidos descritos anteriormente contenidos en la CDR1 de cadena ligera incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, restos de aminoácidos de las posiciones 24, 27, 28, 31, 32 y/o 34 según la numeración de Kabat en la CDR1 de la región variable de cadena ligera. Al mismo tiempo, los restos de aminoácidos contenidos en la CDR2 de cadena ligera incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, restos de aminoácidos de las posiciones 50, 51, 52, 53, 54, 55 y/o 56 según la numeración de Kabat en la CDR2 de la región variable de cadena ligera. Asimismo, los restos de aminoácidos en la CDR3 de cadena ligera incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, restos de aminoácidos de las posiciones 89, 90, 91, 92, 93, 94 y/o 95A según la numeración de Kabat en la CDR3 de la región variable de cadena ligera. Por otra parte, los restos de aminoácidos pueden estar contenidos solos o pueden estar contenidos en combinación de dos o más aminoácidos siempre que permitan el cambio en la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de la concentración de iones de hidrógeno.
Incluso cuando la región variable de cadena pesada producida como una biblioteca de secuencias de región variable aleatorias se combina con la región variable de cadena ligera descrita anteriormente en la que se ha introducido "al menos un resto de aminoácido que cambia la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de la condición de concentración de iones de hidrógeno ", es posible diseñar de manera que los restos flexibles estén contenidos en la secuencia de la región variable de cadena ligera de la misma manera que se ha descrito anteriormente. El número y la posición de los restos flexibles no están limitados en particular a una realización específica, siempre que la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno de la presente invención cambie dependiendo de la condición de concentración de iones de hidrógeno. De manera específica, las secuencias de CDR y/o FR de cadena pesada y/o cadena ligera pueden contener uno o más restos flexibles. Por ejemplo, los restos flexibles que se van a introducir en las secuencias de las regiones variables de cadena ligera incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, los restos de aminoácidos enumerados en las tablas 3 y 4. Al mismo tiempo, las secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena ligera distintas de los restos flexibles y restos de aminoácidos que cambian la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de la condición de concentración de iones de hidrógeno incluyen adecuadamente, pero sin limitación, secuencias de línea germinal tales como Vk1 (SEQ ID NO: 5), Vk2 (SEQ ID NO: 6), Vk3 (SEQ ID NO: 7) y Vk4 (SEQ ID NO: 8).
[Tabla 3]
Figure imgf000054_0001
(La posición indica la numeración de Kabat)
[Tabla 4]
Figure imgf000055_0001
(La posición indica la numeración de Kabat)
Cualquier resto de aminoácido puede utilizarse adecuadamente como los restos de aminoácidos descritos anteriormente que cambian la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno dependiendo de la condición de concentración de iones de hidrógeno. De manera específica, dichos restos de aminoácidos incluyen aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 4,0-8,0. Dichos aminoácidos liberadores de electrones incluyen preferiblemente, por ejemplo, aminoácidos de origen natural tales como histidina y ácido glutámico, así como aminoácidos no naturales tales como análogos de histidina (documento US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21) y 3,5-I2-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Los restos de aminoácidos particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, aminoácidos con una pKa de cadena lateral de 6,0-7,0. Dichos restos de aminoácidos liberadores de electrones incluyen preferiblemente, por ejemplo, histidina.
Se pueden emplear de manera adecuada métodos conocidos tales como mutagénesis dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y PCR de extensión solapante para modificar los aminoácidos de dominios de unión a antígeno. Asimismo, también se pueden usar diversos métodos conocidos como un método de modificación de aminoácidos para sustituir aminoácidos por aminoácidos distintos de los naturales (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por ejemplo, puede usarse convenientemente un sistema de traducción sin células (Clover Direct (Protein Express)) que contiene ARNt en los que ARNt supresor ámbar, que es complementario del codón UAG (codón ámbar) que es un codón de terminación, está ligado con un aminoácido no natural.
La región variable de cadena pesada preferida que se utiliza en combinación incluye, por ejemplo, bibliotecas de regiones variables aleatorias. Se combinan métodos conocidos de forma apropiada como método para producir una biblioteca de regiones variables aleatorias. En una realización no limitante de la presente invención, una biblioteca inmunitaria construida a base de genes de anticuerpos procedentes de animales inmunizados con antígenos específicos, pacientes con infección o personas con un título elevado de anticuerpos en sangre como resultado de la vacunación, pacientes con cáncer o linfocitos de enfermedades autoinmunitarias puede utilizarse adecuadamente como una biblioteca de regiones variables aleatorias.
En otra realización no limitante de la presente invención, de la misma manera que se ha descrito anteriormente, una biblioteca sintética en la que las secuencias de CDR de genes V de ADN genómico o genes V reconstruidos funcionales con un conjunto de oligonucleótidos sintéticos que contienen las secuencias que codifican conjuntos de codones de una longitud adecuada también se puede utilizar preferiblemente como una biblioteca de regiones variables aleatorias. En este caso, la secuencia de CDR3 sola puede reemplazarse porque se observa diversidad en la secuencia génica de CDR3 de cadena pesada. La base para dar lugar a variaciones de aminoácidos en la región variable de una molécula de unión a antígeno es generar variaciones de restos de aminoácidos de posiciones expuestas en superficie de la molécula de unión a antígeno. La posición expuesta en superficie se refiere a una posición en donde un aminoácido se expone en la superficie y/o se pone en contacto con un antígeno en función de la conformación, el conjunto estructural y/o la estructura modelada de una molécula de unión a antígeno y, en general, dichas posiciones son las CDR. Las posiciones expuestas en superficie se determinan preferiblemente utilizando las coordenadas derivadas de un modelo tridimensional de la molécula de unión a antígeno utilizando programas informáticos tales como el programa InsightII (Accelrys). Las posiciones expuestas en superficie se pueden determinar utilizando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee y Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Las posiciones expuestas en superficie se pueden determinar basándose en la información sobre la estructura tridimensional de los anticuerpos utilizando un programa informático adecuado para el modelado de proteínas. El programa informático que se utiliza adecuadamente para este fin incluye el programa informático del módulo de biopolímeros de SYBYL (Tripos Associates). Cuando el algoritmo requiere el parámetro de tamaño introducido por el usuario, el "tamaño" de la sonda para su uso en la computación se establece en general o preferiblemente en aproximadamente 1,4 angstrom o menos de radio. Asimismo, se describe un método para determinar la región y el área expuestas en superficie utilizando un programa informático de PC en Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; y J. Mol. Model. (1995) 1,46-53).
En otra realización más no limitante de la presente invención, una biblioteca sin exposición previa construida a partir de genes de anticuerpos procedentes de linfocitos de personas sanas y que consiste en secuencias sin exposición previa, que son un repertorio sin sesgos de secuencias de anticuerpos, también se puede utilizar de manera particularmente adecuada como una biblioteca de regiones variables aleatorias (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); y Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51,337-344)).
FcRn
A diferencia del receptor Fcy que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, el FcRn humano es estructuralmente similar a los polipéptidos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I, que presenta una identidad de secuencia de 22 % a 29 % con las moléculas del MHC de clase I (Ghetie et al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). El FcRn se expresa como un heterodímero que consiste en una cadena ligera o p soluble (microglobulina p2) en complejo con una cadena pesada o transmembrana a. Como MHC, la cadena a de FcRn comprende tres dominios extracelulares (a1, a2 y a3) y su dominio citoplásmico corto ancla la proteína en la superficie celular, los dominios a1 y a2 interactúan con el dominio de unión a FcRn de la región Fc del anticuerpo (Raghavan et al., Immunity (1994) 1: 303-315).
El FcRn se expresa en la placenta materna y en el saco vitelino de los mamíferos y participa en la transferencia de IgG de la madre al feto. Además, en el intestino delgado neonatal de roedores, donde se expresa FcRn, el FcRn participa en la transferencia de IgG materna a través del epitelio del borde en cepillo a través del calostro o la leche ingeridos. El FcRn se expresa en diversos otros tejidos y sistemas de células endoteliales de diversas especies. El FcRn también se expresa en endotelios humanos adultos, vasos sanguíneos musculares y capilares sinusoides hepáticos. Se cree que el FcRn desempeña una función en el mantenimiento de la concentración de IgG en plasma al mediar en el reciclaje de IgG al suero tras la unión a IgG. Normalmente, la unión de FcRn a moléculas de IgG depende estrictamente del pH. La unión óptima se observa en un intervalo de pH ácido por debajo de 7,0.
El FcRn humano cuyo precursor es un polipéptido que tiene la secuencia señal de la SEQ ID NO: 15 (el polipéptido con la secuencia señal se muestra en la SEQ ID NO: 16) forma un complejo con p2-microglobulina humana in vivo. Como se muestra en los ejemplos de referencia que se describen a continuación, se produce FcRn humano soluble en complejo con p2-microglobulina utilizando técnicas de expresión recombinante convencionales. Las regiones FcRn de la presente invención pueden evaluarse para determinar su actividad de unión a dicho FcRn humano soluble en complejo con p2-microglobulina. En la presente memoria, a menos que se especifique otra cosa, el FcRn humano se refiere a una forma capaz de unirse a una región FcRn de la presente invención. Los ejemplos incluyen un complejo entre FcRn humano y p2-microglobulina humana.
Región Fc
Una región Fc contiene la secuencia de aminoácidos derivada de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo. Una región Fc es una parte de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo, que comienza en el extremo N terminal de la región bisagra, que corresponde al sitio de escisión de la papaína en un aminoácido alrededor de la posición 216 según el sistema de numeración EU y contiene los dominios bisagra, CH2 y CH3.
La actividad de unión de una región Fc de la presente invención a FcRn, FcRn humano en particular, puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, como se ha descrito en la sección "actividad de unión" anterior. Los expertos en la técnica pueden determinar adecuadamente las condiciones distintas del pH. La actividad de unión a antígeno y la actividad de unión a FcRn humano de una molécula de unión a antígeno se pueden evaluar basándose en la constante de disociación (KD), constante de disociación (KD) aparente, velocidad de disociación (kd), velocidad de disociación (kd) aparente y similares. Estas pueden medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar Biacore (GE healthcare), gráfico de Scatchard o citómetro de flujo.
Cuando se mide la actividad de unión a FcRn humano de una región Fc de la presente invención, las condiciones distintas del pH no están particularmente limitadas y los expertos en la técnica pueden seleccionarlas de manera adecuada. Se pueden llevar a cabo mediciones, por ejemplo, a 37 °C utilizando tampón MES, como se describe en el documento WO 2009125825. Como alternativa, la actividad de unión a FcRn humano de una región Fc de la presente invención puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica y puede medirse utilizando, por ejemplo, Biacore (GE Healthcare) o similares. La actividad de unión de una región Fc de la presente invención a FcRn humano se puede evaluar vertiendo, como analito, FcRn humano, una región Fc o una molécula de unión a antígeno de la presente invención que contiene la región Fc en un chip con una región Fc inmovilizada, una molécula de unión a antígeno de la presente invención que contiene la región Fc o FcRn humano.
Un intervalo de pH neutro como la condición donde la región Fc contenida en una molécula de unión a antígeno de la presente invención tiene la actividad de unión a FcRn significa pH 6,7 a pH 10,0 en general. Preferiblemente, el intervalo de pH neutro es un intervalo indicado con valores de pH arbitrarios entre pH 7,0 y pH 8,0, y se selecciona preferiblemente de pH 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 y 8,0, y es de manera particularmente preferible pH 7,4 que está cerca del pH del plasma (sangre) in vivo. Cuando la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano a pH 7,4 es demasiado baja para evaluarla, se puede usar pH 7,0 en lugar de pH 7,4. En la presente memoria, un intervalo de pH ácido como la condición donde la región Fc contenida en una molécula de unión a antígeno de la presente invención tiene la actividad de unión a FcRn significa pH 4,0 a pH 6,5 en general. Preferiblemente, el intervalo de pH ácido significa pH 5,5 a pH 6,5, de manera particularmente preferible pH 5,8 a pH 6,0 que está cerca del pH en el endosoma temprano in vivo. Con respecto a la temperatura utilizada como condición de medición, la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano puede evaluarse a cualquier temperatura entre 10 °C y 50 °C. Preferiblemente, la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano se puede determinar de 15 °C a 40 °C. Más preferiblemente, la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano se puede determinar de la misma manera a una temperatura arbitraria entre 20 °C y 35 °C, tal como una temperatura cualquiera de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35 °C. En una realización de la presente invención, la temperatura incluye, pero sin limitación, por ejemplo, 25 °C.
Según "The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671", la actividad de unión a FcRn humano de la IgG1 humana nativa es 1,7 pM (KD) en un intervalo de pH ácido (pH 6,0) mientras que la actividad es casi indetectable en el intervalo de pH neutro. Por tanto, en una realización preferida, se pueden cribar moléculas de unión a antígeno de la presente invención que tienen la actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido y en un intervalo de pH neutro, incluyendo moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido es 20 pM (KD) o más fuerte y cuya actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH neutro es comparable a o más fuerte que la de IgG humana nativa. En una realización más preferida, se pueden cribar moléculas de unión a antígeno de la presente invención, incluyendo moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido es 20 pM (KD) o más fuerte y que en un intervalo de pH neutro es 40 pM (KD) o más fuerte. En una realización aún más preferida, se pueden cribar moléculas de unión a antígeno de la presente invención, incluyendo moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido es 0,5 pM (KD) o más fuerte y que en un intervalo de pH neutro es 15 pM (KD) o más fuerte. Los valores de KD indicados anteriormente se pueden determinar mediante el método descrito en "The Journal of Immunology (2009) 182: 7663­ 7671 (se inmovilizan moléculas de unión a antígeno en un chip y se vierte FcRn humano como analito)".
En la presente invención, las regiones Fc preferidas tienen la actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido y en un intervalo de pH neutro. Cuando una región Fc tiene originalmente la actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido y en un intervalo de pH neutro, se puede utilizar tal cual. Cuando una región Fc tiene solo actividad de unión a FcRn humano débil o nula en un intervalo de pH ácido y/o en un intervalo de pH neutro, se pueden obtener regiones Fc que tienen la actividad de unión a FcRn humano deseada modificando los aminoácidos de una molécula de unión a antígeno. También se pueden obtener de forma adecuada regiones Fc que tienen la actividad de unión a FcRn humana deseada en un intervalo de pH ácido y/o en un intervalo de pH neutro modificando los aminoácidos de una región Fc humana. Como alternativa, se pueden obtener regiones Fc que tienen la actividad de unión a FcRn humana deseada modificando los aminoácidos de una región Fc que originalmente tiene la actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido y/o en un intervalo de pH neutro. Las modificaciones de aminoácidos de una región Fc humana que dan lugar a dicha actividad de unión deseada pueden revelarse comparando la actividad de unión a FcRn humano en un intervalo de pH ácido y/o en un intervalo de pH neutro antes y después de la modificación de aminoácidos. Los expertos en la técnica pueden modificar de manera apropiada los aminoácidos utilizando métodos conocidos.
En la presente invención, la "modificación de aminoácidos" o "modificación aminoacídica" de una región Fc incluye la modificación a una secuencia de aminoácidos que es diferente de la de la región Fc de partida. El dominio de partida puede ser cualquier región Fc, siempre que una variante modificada de la región Fc de partida pueda unirse a FcRn humano en un intervalo de pH ácido (es decir, la región Fc de partida no necesita necesariamente tener la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro). Las regiones Fc preferidas como región Fc de partida incluyen, por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo IgG, es decir, región Fc nativa.
Asimismo, una región Fc alterada modificada a partir de una región Fc de partida que ya ha sido modificada también puede utilizarse preferiblemente como una región Fc alterada de la presente invención. La "región Fc de partida" puede referirse al polipéptido en sí mismo, una composición que comprende la región Fc de partida, o una secuencia de aminoácidos que codifica la región Fc de partida. Las regiones Fc de partida pueden comprender una región Fc de anticuerpo IgG conocida producida mediante recombinación descrita brevemente en la sección "Anticuerpos". El origen de las regiones Fc de partida no está limitado y pueden obtenerse de organismos humanos o cualquiera no humano. Dichos organismos incluyen preferiblemente ratones, ratas, cobayas, hámsteres, jerbos, gatos, conejos, perros, cabras, ovejas, bovinos, caballos, camellos y organismos seleccionados de primates no humanos. En otra realización, las regiones Fc de partida también se pueden obtener de monos cinomolgos, titíes, monos rhesus, chimpancés o seres humanos. Las regiones Fc de partida se pueden obtener preferiblemente de IgG1 humana; sin embargo, no se limitan a ninguna subclase de IgG en particular. Esto significa que una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana se puede utilizar de manera apropiada como región Fc de partida y también significa en la presente memoria que se puede utilizar preferiblemente una región Fc de una clase o subclase de IgG arbitraria procedente de cualquier organismo descrito anteriormente como región Fc de partida. Se describen ejemplos de variantes de IgG de origen natural o formas modificadas en documentos publicados (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; w O 2007/041635; and WO 2006/105338); sin embargo, no se limitan a los ejemplos.
Los ejemplos de alteraciones incluyen aquellas con una o más mutaciones, por ejemplo, mutaciones mediante sustitución de aminoácidos de las regiones Fc de partida por diferentes restos de aminoácidos, mediante inserción de uno o más restos de aminoácidos en las regiones Fc de partida o mediante supresión de uno o más aminoácidos de la región Fc de partida. Preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc alteradas comprenden al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de una región Fc no nativa. Dichas variantes tienen necesariamente una identidad o similitud de secuencia menor del 100 % con su región Fc de partida. En una realización preferida, las variantes tienen una identidad o similitud de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75 % a menos de 100 %, más preferiblemente de aproximadamente 80 % a menos de 100 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente 85 % a menos de 100 %, aún más preferiblemente de aproximadamente 90 % a menos de 100 % y aún más preferiblemente de aproximadamente 95 % a menos de 100 % con la secuencia de aminoácidos de su región Fc de partida. En una realización no limitante de la presente invención, al menos un aminoácido es diferente entre una región Fc modificada de la presente invención y su región Fc de partida. La diferencia de aminoácidos entre una región Fc modificada de la presente invención y su región Fc de partida también se puede especificar preferiblemente basándose en las diferencias de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos particulares descritas anteriormente según el sistema de numeración EU.
Se pueden emplear de manera adecuada métodos conocidos tales como mutagénesis dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y PCR de extensión solapante para modificar los aminoácidos de regiones Fc. Asimismo, también se pueden usar diversos métodos conocidos como un método de modificación de aminoácidos para sustituir aminoácidos por aminoácidos distintos de los naturales (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por ejemplo, puede usarse convenientemente un sistema de traducción sin células (Clover Direct (Protein Express)) que contiene ARNt en los que ARNt supresor ámbar, que es complementario del codón UAG (codón ámbar) que es un codón de terminación, está ligado con un aminoácido no natural.
Se pueden obtener regiones Fc que tienen actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro, que están contenidas en las moléculas de unión a antígeno de la presente invención, por cualquier método. De manera específica, se pueden obtener regiones Fc que tienen actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro modificando aminoácidos de inmunoglobulina humana de tipo IgG como región Fc de partida. Las regiones Fc de inmunoglobulinas de tipo IgG adecuadas para la modificación incluyen, por ejemplo, las de IgG humanas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y formas modificadas de las mismas). Pueden modificarse aminoácidos de cualquier posición a otros aminoácidos, siempre que las regiones Fc tengan la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro o puedan aumentar la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo neutro. Cuando la molécula de unión a antígeno contiene la región Fc de IgG1 humana como región Fc humana, es preferible que la región Fc resultante contenga una modificación que dé lugar al efecto de potenciar la unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro en comparación con la actividad de unión de la región Fc de partida de IgG 1 humana. Los aminoácidos que permiten dicha modificación incluyen, por ejemplo, aminoácidos de las posiciones 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241,243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341,343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440 y 442 según la numeración EU. Más específicamente, dichas modificaciones de aminoácidos incluyen las enumeradas en la tabla 5. La modificación de estos aminoácidos aumenta la unión a FcRn humano de la región Fc de la inmunoglobulina de tipo IgG en el intervalo de pH neutro.
A partir de las descritas anteriormente, las modificaciones que aumentan la unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro se seleccionan de forma apropiada para su uso en la presente invención. Los aminoácidos particularmente preferidos de las regiones Fc modificadas incluyen, por ejemplo, aminoácidos de las posiciones 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 según el sistema de numeración Eu . La actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro de la región Fc contenida en una molécula de unión a antígeno puede aumentarse sustituyendo al menos un aminoácido seleccionado de los aminoácidos anteriores en un aminoácido diferente.
Las modificaciones particularmente preferidas incluyen, por ejemplo:
Met para el aminoácido de la posición 237;
Ile para el aminoácido de la posición 248;
Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp o Tyr para el aminoácido de la posición 250;
Phe, Trp o Tyr para el aminoácido de la posición 252;
Thr para el aminoácido de la posición 254;
Glu para el aminoácido de la posición 255;
Asp, Asn, Glu o Gln para el aminoácido de la posición 256;
Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val para el aminoácido de la posición 257;
His para el aminoácido de la posición 258:
Ala para el aminoácido de la posición 265;
Ala o Glu para el aminoácido de la posición 286;
His para el aminoácido de la posición 289;
Ala para el aminoácido de la posición 297;
Ala para el aminoácido de la posición 303;
Ala para el aminoácido de la posición 305;
Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr para el aminoácido de la posición 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln o Thr para el aminoácido de la posición 308;
Ala, Asp, Glu, Pro o Arg para el aminoácido de la posición 309;
Ala, His o Ile para el aminoácido de la posición 311;
Ala o His para el aminoácido de la posición 312;
Lys o Arg para el aminoácido de la posición 314;
Ala, Asp o His para el aminoácido de la posición 315;
Ala para el aminoácido de la posición 317;
Val para el aminoácido de la posición 332;
Leu para el aminoácido de la posición 334;
His para el aminoácido de la posición 360;
Ala para el aminoácido de la posición 376;
Ala para el aminoácido de la posición 380;
Ala para el aminoácido de la posición 382;
Ala para el aminoácido de la posición 384;
Asp o His para el aminoácido de la posición 385;
Pro para el aminoácido de la posición 386;
Glu para el aminoácido de la posición 387;
Ala o Ser para el aminoácido de la posición 389;
Ala para el aminoácido de la posición 424;
Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr para el aminoácido de la posición 428;
Lys para el aminoácido de la posición 433;
Ala, Phe, His, Ser, Trp o Tyr para el aminoácido de la posición 434; e
His, Ile, Leu, Phe, Thr o Val para el aminoácido de la posición 436 de la región Fc según la numeración EU. Al mismo tiempo, el número de aminoácidos que se van a modificar no está particularmente limitado y se puede modificar un aminoácido en un solo sitio y se pueden modificar aminoácidos en dos o más sitios. Las combinaciones de modificaciones de aminoácidos en dos o más sitios incluyen, por ejemplo, las descritas en la tabla 6.
Molécula de unión a antígeno
En la presente invención, "una molécula de unión a antígeno" se usa en el sentido más amplio para referirse a una molécula que contiene un dominio de unión a antígeno y una región Fc. De manera específica, las moléculas de unión a antígeno incluyen diversos tipos de moléculas siempre que presenten la actividad de unión a antígeno. Las moléculas en las que un dominio de unión a antígeno está ligado a una región Fc incluyen, por ejemplo, anticuerpos. Los anticuerpos pueden incluir anticuerpos monoclonales individuales (incluyendo anticuerpos agonistas y anticuerpos antagonistas), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y similares. Como alternativa, cuando se utilizan como fragmentos de anticuerpos, preferiblemente incluyen dominios de unión a antígeno y fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab')2, scFv y Fv). Se incluyen también moléculas de armazón donde se utilizan tres estructuras tridimensionales, tales como la estructura de proteína de barril a/p estable ya conocida, como armazón (base) y solo algunas partes de las estructuras se convierten en bibliotecas para construir dominios de unión a antígeno en las moléculas de unión a antígeno de la presente invención.
Una molécula de unión a antígeno de la presente invención puede contener al menos algunas partes de una región Fc que media en la unión al receptor FcRn y Fcy. En una realización no limitante, la molécula de unión a antígeno incluye, por ejemplo, anticuerpos y proteínas de fusión Fc. Una proteína de fusión se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido que tiene una primera secuencia de aminoácidos que está ligada a un polipéptido que tiene una segunda secuencia de aminoácidos que no se ligaría de forma natural en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de al menos una parte de una región Fc (por ejemplo, una parte de una región Fc responsable de la unión a FcRn o una parte de una región Fc responsable de la unión al receptor Fcy) y un polipéptido distinto de inmunoglobulina que contiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a ligando de un receptor o un dominio de unión a receptor de un ligando. Las secuencias de aminoácidos pueden estar presentes en proteínas separadas que se transportan juntas a una proteína de fusión o, en general, pueden estar presentes en una sola proteína; sin embargo, se incluyen en un nuevo reordenamiento en un polipéptido de fusión. Se pueden producir proteínas de fusión, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante técnicas de recombinación genética para expresar un polinucleótido que codifica regiones peptídicas en una disposición deseado.
Los dominios respectivos de la presente invención pueden ligarse entre sí mediante conectores o directamente mediante unión de polipéptidos.
Los conectores comprenden conectores peptídicos arbitrarios que pueden introducirse mediante ingeniería genética, conectores sintéticos y conectores descritos en, por ejemplo, Protein Engineering (1996) 9 (3), 299-305. Sin embargo, en la presente invención se prefieren conectores peptídicos. La longitud de los conectores peptídicos no está particularmente limitada y los expertos en la técnica pueden seleccionarla adecuadamente según el fin. La longitud es preferiblemente de cinco aminoácidos o más (sin limitación particular, el límite superior es en general de 30 aminoácidos o menos, preferiblemente 20 aminoácidos o menos) y de manera particularmente preferible 15 aminoácidos.
Por ejemplo, dichos conectores peptídicos incluyen preferiblemente:
Ser
G lySer
G lyG lySer
SerG lyG ly
Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 17)
Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 18)
Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19)
Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20)
G lyG lyG lyG lyG lyS e r (SEQ ID NO: 21)
S e rG IyG lyG lyG lyG ly (SEQ ID NO: 22)
Gl yGl yG ly Gl yG ly Gl ySe r (SEQ ID NO: 23)
Se rG lyGl yG lyGl yG lyGl y (SEQ ID NO: 24)
(Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 19))n
(Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 20))n
donde n es un número entero de 1 o mayor. Los expertos en la técnica pueden seleccionar por consiguiente la longitud o las secuencias de conectores peptídicos, dependiendo del fin.
Se utilizan habitualmente conectores sintéticos (agentes de reticulación químicos) para reticular péptidos y, por ejemplo: N-hidroxisuccinimida (NHS),
suberato de disuccinimidilo (DSS),
suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3),
ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP),
ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP),
bis(succinato de succinimidilo) de etilenglicol (EGS),
bis(succinato de sulfosuccinimidilo) de etilenglicol (sulfo-EGS),
tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST),
bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (BSOCOES),
y bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Estos agentes de reticulación están disponibles en el mercado.
Cuando se utilizan múltiples conectores para ligar los dominios respectivos, todos pueden ser del mismo tipo o pueden ser de diferentes tipos.
Además de los conectores ilustrados anteriormente, también se pueden utilizar adecuadamente conectores con marcadores peptídicos tales como marcador de His, marcador de HA, marcador de myc y marcador de FLAG. Asimismo, se pueden utilizar adecuadamente enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro, enlaces covalentes, interacción iónica y propiedades de unión entre sí como resultado de la combinación de las mismas. Por ejemplo, se puede utilizar también la afinidad entre CH1 y CL del anticuerpo y las regiones Fc que se originan a partir de los anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente para la asociación de la región hetero Fc. Por otra parte, también se pueden utilizar adecuadamente enlaces disulfuro formados entre dominios.
Para ligar dominios respectivos a través de enlace peptídico, se ligan juntos en fase polinucleótidos que codifican los dominios. Los métodos conocidos para ligar polinucleótidos en fase incluyen técnicas tales como ligación de fragmentos de restricción, PCR de fusión y PCR solapante. Dichos métodos pueden usarse apropiadamente solos o en combinación para construir moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En la presente invención, los términos "ligado" y "fusionado" o "enlace" y "fusión" se utilizan indistintamente. Estos términos significan que dos o más elementos o componentes tales como polipéptidos están ligados entre sí para formar una estructura única por cualquier medio, incluyendo los medios de unión química y técnicas de recombinación genética descritos anteriormente. Fusionar en fase significa, cuando dos o más elementos o componentes son polipéptidos, ligar dos o más unidades de fases de lectura para formar una fase de lectura continua más larga manteniendo al mismo tiempo las fases de lectura correctas de los polipéptidos. Cuando se utilizan dos moléculas de Fab como dominio de unión a antígeno, un anticuerpo, que es una molécula de unión a antígeno de la presente invención donde el dominio de unión a antígeno se liga en fase a una región Fc mediante un enlace peptídico sin conector, puede utilizarse como una molécula de unión a antígeno preferida de la presente invención.
Receptor Fcy
El receptor Fcy (también descrito como FcyR) se refiere a un receptor capaz de unirse a la región Fc de anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 monoclonales, e incluye todos los miembros que pertenecen a la familia de proteínas codificadas sustancialmente por un gen del receptor Fcy. En seres humanos, la familia incluye FcyRI (CD64), incluyendo las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32) incluyendo las isoformas FcYRIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcYRIIb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16) incluyendo las isoformas FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluyendo los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2); así como todos los FcyR humanos no identificados, isoformas de FcyR y alotipos de las mismas. Sin embargo, el receptor Fcy no se limita a estos ejemplos. Sin estar limitado a esto, FcyR incluye los procedentes de seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. FcyR puede proceder de cualquier organismo. FcyR de ratón incluye, sin limitación, FcyRI (CD64), FcyRi I (CD32), FcyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (FcyRiV, CD16-2), así como todos los FcyR de ratón no identificados, isoformas de FcyR y alotipos de las mismas. Dichos receptores Fcy preferidos incluyen, por ejemplo, FcyRI humano (CD64), FcYRIIa (CD32), FcYRIIb (CD32), FcYRIIIa (CD16) y/o FcYRIIIb (CD16). La secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcyRI se muestran en las SEQ ID NO: 25 (NM_000566.3) y 26 (NP000557.1), respectivamente; la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIa (alotipo H131) se muestran en las SEQ ID NO: 27 (BC020823.1) y 28 (AAH20823.1) (el alotipo R131 es una secuencia en la que el aminoácido en la posición 166 de la SEQ ID NO: 28 está sustituido por Arg), respectivamente; la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcyIIB se muestran en las SEQ ID NO: 29 (BC146678.1) y 30 (AAI46679.1), respectivamente; la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIIa se muestran en las SEQ ID NO: 31 (BC033678.1) y 32 (AAH33678.1), respectivamente; y la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYlIlb se muestran en las s Eq ID NO: 33 (BC128562.1) y 34 (AAI28563.1), respectivamente (el número de referencia de RefSeq se muestra en cada paréntesis).
Por ejemplo, como se describe en el ejemplo de referencia 27 y tal como FcYRIIIaV cuando se usa el alotipo V158, a menos que se especifique otra cosa, se utiliza el alotipo F158; sin embargo, el alotipo de isoforma FcYRIIIa descrito en la presente memoria no debe interpretarse como particularmente limitado.
Si un receptor Fcy tiene actividad de unión a la región Fc de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 monoclonal se puede evaluar mediante el cribado ALPHA (ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada), método BIACORE basado en resonancia de plasmón superficial (RPS) y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010), además de los formatos FACS y ELISA descritos anteriormente.
Al mismo tiempo, "ligando Fc" o "ligando efector" se refiere a una molécula y preferiblemente un polipéptido que se une a una región Fc de un anticuerpo, formando un complejo de Fc/ligando de Fc. La molécula puede proceder de cualquier organismo. La unión de un ligando Fc a Fc induce preferiblemente una o más funciones efectoras. Dichos ligandos Fc incluyen, pero sin limitación, receptores de Fc, FcyR, FcaR, FcsR, FcRn, C1q y C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A de Staphylococcus, proteína G de Staphylococcus y FcyR víricos. Los ligandos de Fc también incluyen homólogos del receptor de Fc (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), que son una familia de receptores de Fc homólogos de FcyR. Los ligandos de Fc también incluyen moléculas no identificadas que se unen a Fc.
En FcyRI (CD64) incluyendo FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc, y FcyRIII (CD16) incluyendo las isoformas FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluyendo los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2), la cadena a que se une a la parte Fc de IgG está asociada con una cadena Y común que tiene ITAM responsable de la transducción de la señal de activación intracelular. Al mismo tiempo, el dominio citoplásmico de FcyRII (CD32), incluyendo las isoformas FcYRIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131) y FcyRIIc, contiene ITAM. Estos receptores se expresan en muchas células inmunitarias tales como macrófagos, mastocitos y células presentadoras de antígenos. La señal de activación transducida al unirse estos receptores a la parte Fc de IgG da lugar a mejora de la actividad fagocítica de los macrófagos, producción de citocinas inflamatorias, desgranulación de mastocitos y la función mejorada de las células presentadoras de antígenos. Los receptores Fcy que tienen la capacidad de transducir la señal de activación como se ha descrito anteriormente también se denominan receptores Fcy activadores.
Al mismo tiempo, el dominio intracitoplásmico de FcYRIIb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) contiene ITIM responsable de la transducción de señales inhibidoras. La reticulación entre FcYRlIb y el receptor de linfocitos B (BCR) en linfocitos B suprime la señal de activación de BCR, lo que da lugar a supresión de la producción de anticuerpos a través de BCR. La reticulación de FcyRIII y FcYRIIb en macrófagos suprime la actividad fagocítica y la producción de citocinas inflamatorias. Los receptores Fcy que tienen la capacidad de transducir la señal inhibidora como se ha descrito anteriormente también se denominan receptores Fcy inhibidores.
Se realiza cribado ALPHA mediante la tecnología ALPHA basada en el principio descrito a continuación utilizando dos tipos de perlas: perlas donantes y aceptoras. Se detecta una señal luminiscente solo cuando las moléculas ligadas a las perlas donantes interactúan biológicamente con moléculas ligadas a las perlas aceptoras y cuando las dos perlas se encuentran muy próximas. Excitado por el haz de láser, el fotosensibilizador en una perla donante convierte el oxígeno alrededor de la perla en oxígeno singulete excitado. Cuando el oxígeno singulete se difunde alrededor de las perlas donantes y alcanza las perlas aceptoras ubicadas muy próximas, se induce una reacción quimioluminiscente dentro de las perlas aceptoras. Esta reacción da lugar en última instancia a emisión de luz. Si las moléculas ligadas a las perlas donantes no interactúan con moléculas ligadas a las perlas aceptoras, el oxígeno singulete producido por perlas donantes no alcanza las perlas aceptoras y no se produce reacción quimioluminiscente.
Por ejemplo, una molécula de unión a antígeno marcada con biotina que comprende la región Fc se inmoviliza en las perlas donantes y el receptor Fcy marcado con glutatión S-transferasa (GST) se inmoviliza en las perlas aceptoras. En ausencia de una molécula de unión a antígeno que comprenda una variante de la región Fc competitiva, el receptor Fcy interactúa con un complejo polipeptídico que comprende una región Fc de tipo silvestre, induciendo como resultado una señal de 520 a 620 nm. La molécula de unión a antígeno que tiene una variante de la región Fc no marcada compite con la molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc nativa por la interacción con el receptor Fcy. La afinidad de unión relativa se puede determinar cuantificando la reducción de la fluorescencia como resultado de la competencia. Se conocen métodos para biotinilar las moléculas de unión a antígeno tales como anticuerpos utilizando sulfo-NHS-biotina o similares. Los métodos adecuados para añadir el marcador de GST a un receptor Fcy incluyen métodos que implican fusionar polipéptidos que codifican Fcy y GST en fase, expresar el gen fusionado utilizando células en las que se ha introducido un vector al que el gen está unido operativamente y después purificar utilizando una columna de glutatión. La señal inducida se puede analizar preferiblemente, por ejemplo, ajustando a un modelo de competencia de un sitio basado en análisis de regresión no lineal utilizando un programa informático tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).
Una de las sustancias para observar su interacción se inmoviliza como ligando sobre la capa fina de oro de un chip sensor. Cuando se proyecta luz sobre la superficie trasera del chip sensor de modo que se produzca reflejo total en la interfaz entre la capa fina de oro y el vidrio, la intensidad de la luz reflejada se reduce parcialmente en un sitio determinado (señal de RPS). La otra sustancia para observar su interacción se inyecta como analito en la superficie del chip sensor. La masa de molécula de ligando inmovilizada aumenta cuando el analito se une al ligando. Esto altera el índice de refracción del solvente en la superficie del chip sensor. El cambio en el índice de refracción provoca un cambio posicional de la señal de RPS (por el contrario, la disociación desplaza la señal de nuevo a la posición original). En el sistema Biacore, la cantidad de desplazamiento descrito anteriormente (es decir, el cambio de masa en la superficie del chip sensor) se traza en el eje vertical y, por tanto, el cambio de masa a lo largo del tiempo se muestra como datos medidos (sensorgrama). Los parámetros cinéticos (constante de velocidad de asociación (ka) y constante de velocidad de disociación (kd)) se determinan a partir de la curva del sensorgrama y la afinidad (KD) se determina a partir de la relación entre estas dos constantes. El ensayo de inhibición se utiliza preferiblemente en los métodos de BIACORE. Se describen ejemplos de dicho ensayo de inhibición en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010.
Heterocomplejo que comprende los cuatro elementos de: dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador
Los estudios cristalográficos sobre FcRn y anticuerpos IgG demostraron que un complejo FcRn-IgG está compuesto por una molécula de IgG para dos moléculas de FcRn y se cree que las dos moléculas se unen cerca de la interfaz de los dominios CH2 y CH3 ubicados en ambos lados de la región Fc de IgG (Burmeister et al. (Nature (1994) 372, 336­ 343)). Al mismo tiempo, como se muestra en el ejemplo 3 a continuación, se demostró que la región Fc del anticuerpo puede formar un complejo que contiene los cuatro elementos de: dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador (fig. 48). Esta formación de heterocomplejos es un fenómeno que se reveló como resultado del análisis de las propiedades de las moléculas de unión a antígeno que contienen una región Fc que tiene una actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro.
Sin quedar ligado a un principio particular, se puede considerar que las moléculas de unión a antígeno administradas in vivo producen los efectos descritos a continuación en la farmacocinética in vivo (permanencia en plasma) de las moléculas de unión a antígeno y la respuesta inmunitaria (inmunogenicidad) a las moléculas de unión a antígeno administradas, como resultado de la formación de heterocomplejos que contienen los cuatro elementos de: la región Fc contenida en las moléculas de unión a antígeno, dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador. Como se ha descrito anteriormente, además de los diversos tipos de receptores Fcy activadores, el FcRn se expresa en células inmunitarias y la formación por moléculas de unión a antígeno de dichos complejos de cuatro partes en células inmunitarias sugiere que la afinidad hacia células inmunitarias aumenta y que los dominios citoplásmicos están ensamblados, lo que conduce a la amplificación de la señal de internalización y promoción de la incorporación en células inmunitarias. Lo mismo se aplica también a células presentadoras de antígenos y se sugiere la posibilidad de que la formación de complejos de cuatro partes en la membrana celular de células presentadoras de antígenos haga que las moléculas de unión a antígeno se incorporen fácilmente a células presentadoras de antígenos. En general, las moléculas de unión a antígeno incorporadas en células presentadoras de antígenos se degradan en los lisosomas de las células presentadoras de antígenos y se presentan a linfocitos T. Como resultado, debido a que la incorporación de moléculas de unión a antígeno en células presentadoras de antígenos es promovida por la formación de los complejos de cuatro partes descritos anteriormente en la membrana celular de las células presentadoras de antígenos, la permanencia plasmática de las moléculas de unión a antígeno puede empeorar. De manera análoga, se puede inducir (agravar) una respuesta inmunitaria.
Por este motivo, es concebible que, cuando se administra al cuerpo una molécula de unión a antígeno que tiene una capacidad alterada para formar dichos complejos de cuatro partes, la permanencia en plasma de las moléculas de unión a antígeno mejoraría y se suprimiría la inducción de respuesta inmunitaria en el cuerpo. Las realizaciones preferidas de dichas moléculas de unión a antígeno que inhiben la formación de estos complejos en células inmunitarias, incluyendo células presentadoras de antígenos, incluyen las tres realizaciones descritas a continuación.
(Realización 1) Una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro y cuya actividad de unión hacia FcyR activador es menor que la actividad de unión de una región Fc nativa hacia FcyR activador
La molécula de unión a antígeno de la realización 1 forma un complejo de tres partes al unirse a dos moléculas de FcRn; sin embargo, no forma ningún complejo que contenga FcyR activador (fig. 49). Una región Fc cuya actividad de unión hacia FcyR activador es menor que la actividad de unión de una región Fc nativa hacia FcyR activador puede prepararse modificando los aminoácidos de la región Fc nativa como se ha descrito anteriormente. Si la actividad de unión hacia FcyR activador de la región Fc modificada es menor que la actividad de unión hacia FcyR activador de la región Fc nativa puede ensayarse adecuadamente usando los métodos descritos en la sección "actividad de unión" anterior.
Los ejemplos de receptores Fcy activadores preferibles incluyen FcyRI (CD64) que incluye FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcYRIIa (incluyendo los alotipos R131 y H131); y FcyRIII (CD16) que incluye las isoformas FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluyendo los alotipos FcyRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2).
Para las condiciones de pH para medir la actividad de unión de la región de Fc y el receptor Fcy contenido en la molécula de unión a antígeno de la presente invención, se pueden usar adecuadamente condiciones en un intervalo de pH ácido o en un intervalo de pH neutro. El intervalo de pH neutro, como condición para medir la actividad de unión de la región Fc y el receptor Fcy contenido en la molécula de unión a antígeno de la presente invención, indica en general pH 6,7 a pH 10,0. Preferiblemente, es un intervalo indicado con valores de pH arbitrarios entre pH 7,0 y pH 8,0; y, preferiblemente, se selecciona de pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 y pH 8,0; y, de manera particularmente preferible, es pH 7,4, que está cerca del pH del plasma (sangre) in vivo. En la presente memoria, el intervalo de pH ácido, como condición para tener una actividad de unión de la región Fc y el receptor Fcy contenido en la molécula de unión a antígeno de la presente invención, indica en general pH 4,0 a pH 6,5. Preferiblemente, indica de pH 5,5 a pH 6,5 y de manera particularmente preferible, indica de pH 5,8 a pH 6,0, que está cerca del pH en el endosoma temprano in vivo. Con respecto a la temperatura utilizada como condición de medición, la afinidad de unión entre la región Fc y el receptor Fcy humano puede evaluarse a cualquier temperatura entre 10 °C y 50 °C. Preferiblemente, se usa una temperatura entre 15 °C y 40 °C para determinar la afinidad de unión entre la región Fc humana y el receptor Fcy. Más preferiblemente, cualquier temperatura entre 20 °C y 35 °C, tal como cualquiera de 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C o 35 °C, puede usarse de manera similar para determinar la afinidad de unión entre la región Fc y el receptor Fcy. Una temperatura de 25 °C es un ejemplo no limitante en una realización de la presente invención.
En la presente memoria, "la actividad de unión de la variante de la región Fc hacia el receptor Fcy activador es menor que la actividad de unión de la región Fc nativa hacia el receptor Fcy activador" significa que la actividad de unión de la variante de la región Fc hacia cualquiera de los receptores Fcy humanos de FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa y/o FcYRIIIb es menor que la actividad de unión de la región Fc nativa hacia estos receptores Fcy humanos. Por ejemplo, significa que, basándose en un método analítico descrito anteriormente, la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno que contiene una variante de la región Fc es de 95 % o menos, preferiblemente 90 % o menos, 85 % o menos, 80 % o menos, 75 % o menos, de manera particularmente preferible 70 % o menos, 65 % o menos, 60 % o menos, 55 % o menos, 50 % o menos, 45 % o menos, 40 % o menos, 35 % o menos, 30 % o menos, 25 % o menos, 20 % o menos, 15 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos o 1 % o menos en comparación con la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc nativa como control. Como región Fc nativa, se puede usar la región Fc de partida y también se pueden usar regiones Fc de anticuerpos de tipo silvestre de diferentes isotipos.
Al mismo tiempo, la actividad de unión de la forma nativa hacia FcyR activador es preferiblemente una actividad de unión hacia el receptor Fcy para IgG1 humana. Para reducir la actividad de unión hacia el receptor Fcy, además de realizar las modificaciones descritas anteriormente, el isotipo también puede cambiarse a IgG2 humana, IgG3 humana o IgG4 humana. Como alternativa, además de realizar las modificaciones descritas anteriormente, la actividad de unión hacia el receptor Fcy también puede reducirse expresando la molécula de unión a antígeno que contiene la región Fc que tiene una actividad de unión hacia el receptor Fcy en hospedadores que no añaden cadenas de azúcar, tales como Escherichia coli.
Como molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc que se utiliza como control, pueden usarse adecuadamente moléculas de unión a antígeno que tienen una región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal. Las estructuras de dichas regiones Fc se muestran en las SEQ ID NO: 1 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAC82527.1), SEQ ID NO: 2 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAB59393.1), SEQ ID NO: 3 (n.° de referencia RefSeq. CAA27268.1) y SEQ ID NO: 4 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAB59394.1). Además, cuando se usa como sustancia de ensayo una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc de un isotipo de anticuerpo particular, el efecto de la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno que contiene esa región Fc hacia el receptor Fcy se prueba utilizando como control una molécula de unión a antígeno que tiene una región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal de ese isotipo particular. De este modo, se seleccionan adecuadamente moléculas de unión a antígeno que contienen una región Fc cuya actividad de unión hacia el receptor Fcy se ha demostrado que es alta.
En una realización no limitante de la presente invención, los ejemplos preferidos de regiones Fc cuya actividad de unión hacia FcyR activador es menor que la de la región Fc nativa hacia FcyR activador incluyen regiones Fc en las que uno o más aminoácidos en cualquiera de las posiciones 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 y 329 como se indica por la numeración EU se modifican en aminoácidos que son diferentes de los de la región Fc nativa, entre los aminoácidos de una región Fc descrita anteriormente. Las modificaciones en la región Fc no se limitan al ejemplo anterior y pueden ser, por ejemplo, modificaciones tales como desglucosilación (N297A y N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4-L236E descritas en Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; modificaciones tales como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R y N325LL328R descritas en el documento WO 2008/092117; inserciones de aminoácidos en las posiciones 233, 234, 235 y 237 según la numeración EU; y modificaciones en las posiciones descritas en el documento WO 2000/042072.
En una realización no limitante de la presente invención, los ejemplos de una región Fc favorable incluyen regiones Fc que tienen una o más de las siguientes modificaciones según lo indicado por la numeración EU en una región Fc mencionada anteriormente:
el aminoácido en la posición 234 es uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr o Trp;
el aminoácido en la posición 235 es uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val o Arg;
el aminoácido en la posición 236 es uno cualquiera de Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro o Tyr;
el aminoácido en la posición 237 es uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr o Arg;
el aminoácido en la posición 238 es uno cualquiera de Ala,
Figure imgf000065_0001
sn, Gln, Glu, Gly,
Figure imgf000065_0002
His, Ile, Lys, Thr, Trp o Arg; el aminoácido en la posición 239 es uno cualquiera de Gln,
Figure imgf000065_0003
is, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr o Arg;
el aminoácido en la posición 265 es uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
el aminoácido en la posición 266 es uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp o Tyr;
el aminoácido en la posición 267 es uno cualquiera de Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp o Tyr;
el aminoácido en la posición 269 es uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
el aminoácido en la posición 270 es uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
el aminoácido en la posición 271 es uno cualquiera de Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp o Tyr;
el aminoácido en la posición 295 es uno cualquiera de Arg, Asn, Asp, Gly, His,
Figure imgf000065_0004
Phe, Ser, Trp o Tyr; el aminoácido en la posición 296 es uno cualquiera de Arg, Gly, Lys o Pro;
el aminoácido en la posición 297 es uno cualquiera de Ala;
el aminoácido en la posición 298 es uno cualquiera de Arg, Gly, Lys, Pro, Trp o Tyr;
el aminoácido en la posición 300 es uno cualquiera de Arg, Lys o Pro;
el aminoácido en la posición 324 es uno cualquiera de Lys o Pro;
el aminoácido en la posición 325 es uno cualquiera de Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr o Val;
el aminoácido en la posición 327 es uno cualquiera de Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
el aminoácido en la posición 328 es uno cualquiera de Arg, Asn, Gly, His, Lys o Pro;
el aminoácido en la posición 329 es uno cualquiera de Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val o Arg;
el aminoácido en la posición 330 es uno cualquiera de Pro o Ser;
el aminoácido en la posición 331 es uno cualquiera de Arg, Gly o Lys; o
el aminoácido en la posición 332 es uno cualquiera de Arg, Lys o Pro.
(Realización 2) Una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro y cuya actividad de unión hacia FcyR inhibidor es mayor que la actividad de unión hacia receptor Fcy activador
Al unirse a dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR inhibidor, la molécula de unión a antígeno de la realización 2 puede formar un complejo que comprende estos cuatro elementos. Sin embargo, ya que una sola molécula de unión a antígeno puede unirse solo a una molécula de FcyR, la molécula de unión a antígeno en un estado unido a un FcyR inhibidor no puede unirse a otros FcyR activadores (fig. 50). Asimismo, se ha informado de que las moléculas de unión a antígeno que se incorporan en células en un estado unido a FcyR inhibidor se reciclan en la membrana celular y, por tanto, escapan de la degradación intracelular (Immunity (2005) 23, 503-514). Por tanto, se cree que las moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión selectiva hacia FcyR inhibidor no pueden formar heterocomplejos que contengan FcyR activador y dos moléculas de FcRn, que provocan la respuesta inmunitaria.
Los ejemplos de receptores Fcy activadores preferibles incluyen FcyRI (CD64) que incluye FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcYRIIa (incluyendo los alotipos R131 y H131); y FcyRIII (CD16) que incluye las isoformas FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluyendo los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2). Al mismo tiempo, los ejemplos de receptores Fcy inhibidores preferidos incluyen FcYRIIb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2).
En la presente memoria, "la actividad de unión hacia FcyR inhibidor es mayor que la actividad de unión hacia el receptor Fcy activador" significa que la actividad de unión de la variante de la región Fc hacia FcYRIIb es mayor que la actividad de unión hacia cualquiera de los receptores Fcy humanos FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa y/o FcYRIIIb. Por ejemplo, significa que, basándose en un método analítico descrito anteriormente, la actividad de unión hacia FcYRIIb de la molécula de unión a antígeno que contiene una variante de la región Fc es de 105 % o más, preferiblemente 110 % o más, 120 % o más, 130 % o más, 140 % o más, de manera particularmente preferible 150 % o más, 160 % o más, 170 % o más, 180 % o más, 190 % o más, 200 % o más, 250 % o más, 300 % o más, 350 % o más, 400 % o más, 450 % o más, 500 % o más, 750 % o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 40 veces o más, 50 veces o más en comparación con la actividad de unión hacia cualquiera de los receptores Fcy humanos de FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa y/o FcYRIIIb.
Lo más preferiblemente, la actividad de unión hacia FcYRIIb es mayor que cada una de las actividades de unión hacia FcYRIa, FcYRIIa (incluyendo los alotipos R131 y H131) y FcYRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158). FcYRIa muestra una afinidad notablemente alta hacia la IgG1 nativa; por tanto, se cree que la unión está saturada in vivo debido a la presencia de una gran cantidad de IgG1 endógena. Por este motivo, la inhibición de la formación de complejos puede ser posible incluso si la actividad de unión hacia FcYRIIb es mayor que las actividades de unión hacia FcYRIIa y FcYRIIIa y menor que la actividad de unión hacia FcYRIa.
Como molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc que se utiliza como control, pueden usarse adecuadamente moléculas de unión a antígeno que tienen una región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal. Las estructuras de dichas regiones Fc se muestran en las SEQ ID NO: 11 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAC82527.1), SEQ ID NO: 12 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAB59393.1), SEQ ID NO: 13 (n.° de referencia RefSeq. CAA27268.1) y SEQ ID NO: 14 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAB59394.1). Además, cuando se usa como sustancia de ensayo una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc de un isotipo de anticuerpo particular, el efecto de la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno que contiene esa región Fc hacia el receptor Fcy se prueba utilizando como control una molécula de unión a antígeno que tiene una región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal de ese isotipo particular. De este modo, se seleccionan adecuadamente moléculas de unión a antígeno que contienen una región Fc cuya actividad de unión hacia el receptor Fcy se ha demostrado que es alta.
En una realización no limitante de la presente invención, los ejemplos preferidos de regiones Fc que tienen una actividad de unión selectiva hacia FcyR inhibidor incluyen regiones Fc en las que, entre los aminoácidos de una región Fc descrita anteriormente, el aminoácido en 328 o 329 como se indica por la numeración EU se modifica a un aminoácido que es diferente del de la región Fc nativa. Asimismo, como regiones Fc que tienen actividad de unión selectiva hacia el receptor Fcy inhibidor, las regiones Fc o modificaciones descritas en el documento US 2009/0136485 se pueden seleccionar de forma adecuada.
En otra realización no limitante de la presente invención, un ejemplo preferido es una región Fc que tiene una o más de las siguientes modificaciones según lo indicado por la numeración EU en una región Fc mencionada anteriormente: el aminoácido en la posición 238 es Asp; o el aminoácido en la posición 328 es Glu.
En otra realización más no limitante de la presente invención, los ejemplos de una región Fc favorable incluyen regiones Fc que tienen una o más de las siguientes modificaciones: una sustitución de Pro en la posición 238 según la numeración EU por Asp, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Trp, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Phe, el aminoácido en la posición 267 según la numeración EU es Val, el aminoácido en la posición 267 según la numeración EU es Gln, el aminoácido en la posición 268 según la numeración EU es Asn, el aminoácido en la posición 271 según la numeración EU es Gly, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Leu, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Gln, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Glu, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Met, el aminoácido en la posición 239 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 267 según la numeración EU es Ala, el aminoácido en la posición 234 según la numeración EU es Trp, el aminoácido en la posición 234 según la numeración EU es Tyr, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Ala, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Glu, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Leu, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Met, el aminoácido en la posición 237 según la numeración EU es Tyr, el aminoácido en la posición 330 según la numeración EU es Lys, el aminoácido en la posición 330 según la numeración EU es Arg, el aminoácido en la posición 233 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 268 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 268 según la numeración EU es Glu, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Ser, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Thr, el aminoácido en la posición 323 según la numeración EU es Ile, el aminoácido en la posición 323 según la numeración EU es Leu, el aminoácido en la posición 323 según la numeración EU es Met, el aminoácido en la posición 296 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Ala, el aminoácido en la posición 326 según la numeración EU es Asn y el aminoácido en la posición 330 según la numeración EU es Met.
(Realización 3) Una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc, en la que uno de los dos polipéptidos que forman la región Fc tiene una actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro y el otro no tiene ninguna actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro
Al unirse a una molécula de FcRn y una molécula de FcyR, la molécula de unión a antígeno de la realización 3 puede formar un complejo de tres partes; sin embargo, no forma ningún heterocomplejo que contenga los cuatro elementos de dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR (fig. 51). Como región Fc en la que uno de los dos polipéptidos que forman la región Fc tiene una actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro y el otro no tiene ninguna actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro contenida en la molécula de unión a antígeno de la realización 3, pueden utilizarse adecuadamente regiones Fc procedentes de anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son dos tipos de anticuerpos que tienen especificidades hacia diferentes antígenos. Los anticuerpos biespecíficos de tipo IgG pueden secretarse a partir de hibridomas híbridos (cuadromas) resultantes de la fusión de dos tipos de hibridomas que producen anticuerpos IgG (Milstein et al. (Nature (1983) 305, 537-540).
Cuando una molécula de unión a antígeno de la realización 3 descrita anteriormente se produce utilizando técnicas de recombinación tales como las descritas en la sección anterior "anticuerpo", se puede utilizar un método en el que los genes que codifican los polipéptidos que constituyen los dos tipos de regiones Fc de interés se introducen en células para coexpresarlos. Sin embargo, las regiones Fc producidas serán una mezcla en la que existirá lo siguiente en una relación molecular de 2:1:1: regiones Fc en las que uno de los dos polipéptidos que forman la región Fc tiene una actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro y el otro polipéptido no tiene ninguna actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro; Las regiones Fc en las que los dos polipéptidos que forman la región Fc tienen ambos una actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro; y regiones Fc en las que ninguno de los dos polipéptidos que forman la región Fc tiene ninguna actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro. Es difícil purificar moléculas de unión a antígeno que contienen la combinación deseada de regiones Fc de los tres tipos de IgG.
Cuando se producen las moléculas de unión a antígeno de la realización 3 usando dichas técnicas de recombinación, las moléculas de unión a antígeno que contienen una combinación heteromérica de regiones Fc pueden secretarse preferentemente añadiendo sustituciones de aminoácidos adecuadas en los dominios CH3 que constituyen las regiones Fc.
De manera específica, este método se realiza sustituyendo un aminoácido en el dominio CH3 de una de las cadenas pesadas por un aminoácido que tiene una cadena lateral mayor (botón (que significa "abultamiento")), y sustituyendo un aminoácido en el dominio CH3 de la otra cadena pesada por un aminoácido que tiene una cadena lateral menor (ojal (que significa "vacío")) de modo que el botón se coloque en el ojal. Esto promueve la formación de cadenas H heteroméricas y simultáneamente inhibe la formación de cadenas H homoméricas (documento WO 1996027011; Ridgway et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
Asimismo, también existen técnicas conocidas para producir un anticuerpo biespecífico aplicando métodos para controlar la asociación de polipéptidos o asociación de multímeros heteroméricos formados por polipéptidos a la asociación entre los dos polipéptidos que forman una región Fc. De manera específica, se pueden emplear métodos para controlar la asociación de polipéptidos para producir un anticuerpo biespecífico (documento WO 2006/106905), en el que los restos de aminoácidos que forman la interfaz entre dos polipéptidos que forman la región Fc se alteran para inhibir la asociación entre regiones Fc que tienen la misma secuencia y para permitir la formación de complejos polipeptídicos formados por dos regiones Fc de secuencias diferentes. Dichos métodos pueden usarse para preparar la molécula de unión a antígeno de la realización 3 de la presente invención.
En una realización no limitante de la presente invención, se pueden utilizar adecuadamente dos polipéptidos que constituyen una región Fc procedente de un anticuerpo biespecífico descrito anteriormente como región Fc. Más específicamente, se pueden utilizar adecuadamente dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 349 como se indica por la numeración EU es Cys y el aminoácido en la posición 366 es Trp, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 como se indica por la numeración EU es Cys, el aminoácido en la posición 366 es Ser, el aminoácido en la posición 368 es Ala y el aminoácido en la posición 407 es Val.
En otra realización no limitante de la presente invención, se pueden utilizar adecuadamente como región Fc dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 según la numeración EU es Asp, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 según la numeración EU es Lys. En la realización anterior, el aminoácido en la posición 409 puede ser Glu en lugar de Asp y el aminoácido en la posición 399 puede ser Arg en lugar de Lys. Por otra parte, además del aminoácido Lys en la posición 399, se puede añadir Asp adecuadamente como aminoácido en la posición 360 o se puede añadir adecuadamente Asp como aminoácido en la posición 392.
En otra realización más no limitante de la presente invención, se pueden utilizar adecuadamente como región Fc dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 370 según la numeración EU es Glu, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 357 según la numeración EU es Lys.
En todavía otra realización no limitante de la presente invención, se pueden utilizar adecuadamente como región Fc dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 439 según la numeración EU es Glu, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 según la numeración EU es Lys.
En todavía otra realización más no limitante de la presente invención, se puede utilizar adecuadamente como región Fc cualquiera de las realizaciones indicadas a continuación, en las que se han combinado los anteriores:
dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 según la numeración EU es Asp y el aminoácido en la posición 370 es Glu, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 según la numeración EU es Lys y el aminoácido en la posición 357 es Lys (en esta realización, el aminoácido en la posición 370 según la numeración EU puede ser Asp en lugar de Glu y se puede utilizar el aminoácido Asp en la posición 392 según la numeración EU en lugar del aminoácido Glu en la posición 370 según la numeración EU);
dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 según la numeración EU es Asp y el aminoácido en la posición 439 es Glu, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 según la numeración EU es Lys y el aminoácido en la posición 356 es Lys (en esta realización, se puede utilizar el aminoácido Asp en la posición 360 según la numeración EU, el aminoácido Asp en la posición 392 según la numeración EU o el aminoácido Asp en la posición 439 según la numeración EU en lugar del aminoácido Glu en la posición 439 según la numeración EU);
dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 370 según la numeración EU es Glu y el aminoácido en la posición 439 es Glu, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 357 según la numeración EU es Lys y el aminoácido en la posición 356 es Lys; y
dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 409 según la numeración EU es Asp, el aminoácido en la posición 370 es Glu y el aminoácido en la posición 439 es Glu, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 399 según la numeración EU es Lys, el aminoácido en la posición 357 es Lys y el aminoácido en la posición 356 es Lys (en esta realización, el aminoácido en la posición 370 según la numeración EU puede no estar sustituido por Glu y, asimismo, cuando el aminoácido en la posición 370 no está sustituido por Glu, el aminoácido en la posición 439 puede ser Asp en lugar de Glu o puede utilizarse el aminoácido Asp en la posición 392 en lugar del aminoácido Glu en la posición 439).
Además, en otra realización no limitante de la presente invención, también se pueden utilizar adecuadamente dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 según la numeración EU es Lys, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 435 según la numeración EU es Arg y el aminoácido en la posición 439 es Glu.
En otra realización más no limitante de la presente invención, también se pueden utilizar adecuadamente dos polipéptidos que constituyen una región Fc, en los que, de la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 356 según la numeración EU es Lys y el aminoácido en la posición 357 es Lys, y de la secuencia de aminoácidos del otro de los polipéptidos, el aminoácido en la posición 370 según la numeración EU es Glu, el aminoácido en la posición 435 es Arg y el aminoácido en la posición 439 es Glu.
Se espera que estas moléculas de unión a antígeno de las realizaciones 1 a 3 sean capaces de reducir la inmunogenicidad y mejorar la permanencia en plasma en comparación con las moléculas de unión a antígeno capaces de formar complejos de cuatro partes.
Deterioro de la respuesta inmunitaria (reducción de la inmunogenicidad)
Puede evaluarse si se ha modificado la respuesta inmunitaria contra la molécula de unión a antígeno de la presente invención midiendo la reacción de respuesta en un organismo al que se ha administrado una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno como principio activo. Las reacciones de respuesta de un organismo incluyen principalmente dos respuestas inmunitarias: inmunidad celular (inducción de linfocitos T citotóxicos que reconocen fragmentos peptídicos de moléculas de unión a antígeno unidos al MHC de clase I) e inmunidad humoral (inducción de la producción de anticuerpos que se unen a moléculas de unión a antígenos). Respecto a los productos farmacéuticos proteicos en particular, la producción de anticuerpos contra las moléculas de unión a antígeno administradas se denomina inmunogenicidad. Existen dos tipos de métodos para evaluar la inmunogenicidad: métodos para evaluar la producción de anticuerpos in vivo y métodos para evaluar la reacción de las células inmunitarias in vitro.
La respuesta inmunitaria in vivo (inmunogenicidad) se puede evaluar midiendo el título de anticuerpos después de la administración de las moléculas de unión a antígeno a un organismo. Por ejemplo, los títulos de anticuerpos se miden después de administrar las moléculas de unión a antígeno A y B a ratones. Cuando el título de anticuerpos para la molécula de unión a antígeno A es mayor que el de B, o cuando, después de la administración a varios ratones, la administración de la molécula de unión a antígeno A dio una mayor incidencia de ratones con títulos de anticuerpos elevados, entonces se valora que A tiene mayor inmunogenicidad que B. Los títulos de anticuerpos se pueden medir utilizando métodos para medir moléculas que se unen específicamente a moléculas administradas usando ELISA, ECL o RPS que son conocidos por los expertos en la técnica (J. Pharm. Biomed. Anal. (2011) 55 (5), 878-888).
Los métodos de evaluación in vitro de la respuesta inmunitaria de un organismo contra las moléculas de unión a antígeno (inmunogenicidad) incluyen métodos de reacción in vitro de células mononucleares de sangre periférica humana aisladas de donantes (o células fraccionadas de las mismas) con moléculas de unión a antígeno y medición del número de células o el porcentaje de linfocitos T auxiliares que reaccionan o proliferan o la cantidad de citocinas producidas (Clin. Immunol. (2010) 137 (1), 5-14; Drugs R D. (2008) 9 (6), 385-396). Por ejemplo, tras la evaluación de las moléculas de unión a antígeno A y B por mediante dichas pruebas de inmunogenicidad in vitro, cuando la respuesta con la molécula de unión a antígeno A fue mayor que con B, o cuando se evaluaron varios donantes y la tasa de reacción positiva con la molécula de unión a antígeno A fue mayor, entonces se valora que A tiene mayor inmunogenicidad que B.
Sin quedar ligados a una teoría en particular, ya que las moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro pueden formar complejos heterotetraméricos que comprenden dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR en la membrana celular de células presentadoras de antígenos, se cree que la respuesta inmunitaria se induce fácilmente debido a la incorporación mejorada en células presentadoras de antígenos. Hay sitios de fosforilación en los dominios intracelulares de FcyR y FcRn. En general, se produce fosforilación de los dominios intracelulares de los receptores expresados en la superficie celular tras el ensamblaje de los receptores y su fosforilación provoca la internalización de los receptores. No se produce ensamblaje de los dominios intracelulares de FcyR incluso si la IgG1 nativa forma un complejo dimérico de FcYR/IgG1 en células presentadoras de antígenos. Sin embargo, en el caso de que una molécula de IgG que tenga una actividad de unión hacia FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro forme un complejo que contenga los cuatro elementos de FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG, los tres dominios intracelulares de FcyR y FcRn se ensamblarían y es posible que, como resultado, se induzca internalización del heterocomplejo que contiene los cuatro elementos de FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG. Se cree que los heterocomplejos que contienen los cuatro elementos de FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG se forman en células presentadoras de antígenos que coexpresan FcyR y FcRn y es posible que la cantidad de moléculas de anticuerpo incorporadas en las células presentadoras de antígenos aumente de este modo, lo que da lugar a peor inmunogenicidad. Se cree que, al inhibir la formación del complejo descrito anteriormente en células presentadoras de antígenos utilizando uno cualquiera de los métodos de las realizaciones 1, 2 o 3 revelados en la presente invención, se puede reducir la incorporación en células presentadoras de antígenos y, en consecuencia, se puede mejorar la inmunogenicidad.
Mejora de la farmacocinética
Sin quedar ligados a un principio particular, las razones por las que aumenta el número de antígenos a los que puede unirse una sola molécula de unión a antígeno y por las que se acelera la disipación de la concentración de antígeno en el plasma después de la promoción de la incorporación en las células de un organismo tras la administración en el organismo de, por ejemplo, una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc que tiene una actividad de unión hacia el FcRn humano en condiciones de un intervalo de pH neutro y un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno cambia dependiendo de las condiciones de las concentraciones de iones de modo que la actividad de unión a antígeno en las condiciones de un intervalo de pH ácido es menor que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH neutro pueden explicarse, por ejemplo, de la siguiente manera.
Por ejemplo, cuando la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo que se une a un antígeno de membrana, el anticuerpo administrado al cuerpo se une al antígeno y después es captado mediante internalización en endosomas en las células junto con el antígeno mientras que el anticuerpo se mantiene unido al antígeno. A continuación, el anticuerpo se transloca a lisosomas mientras el anticuerpo se mantiene unido al antígeno y el lisosoma degrada el anticuerpo junto con el antígeno. La eliminación del plasma mediada por internalización se denomina eliminación dependiente de antígeno y se ha informado de dicha eliminación con numerosas moléculas de anticuerpos (Drug Discov Today (2006) 11 (1-2): 81-88). Cuando una sola molécula de anticuerpo IgG se une a antígenos de manera divalente, la molécula de anticuerpo individual se internaliza mientras que el anticuerpo se mantiene unido a las dos moléculas de antígeno y se degrada en el lisosoma. Por consiguiente, en el caso de anticuerpos comunes, una molécula de anticuerpo IgG no puede unirse a tres o más moléculas de antígeno. Por ejemplo, una sola molécula de anticuerpo IgG que tiene una actividad neutralizante no puede neutralizar tres o más moléculas de antígeno.
La permanencia relativamente prolongada (eliminación lenta) de moléculas de IgG en el plasma se debe a la función del FcRn humano, que se conoce como receptor de rescate de moléculas de IgG. Cuando se captan en endosomas mediante pinocitosis, las moléculas de IgG se unen al FcRn humano expresado en los endosomas en condiciones ácidas en los endosomas. Mientras que las moléculas de IgG que no se unieron al FcRn humano se transfieren a lisosomas donde se degradan, las moléculas de IgG que están unidas al FcRn humano se translocan a la superficie celular y regresan de nuevo al plasma al disociarse del FcRn humano en condiciones neutras en el plasma.
Como alternativa, cuando la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo que se une a un antígeno soluble, el anticuerpo administrado al cuerpo se une al antígeno y después es captado en células mientras que el anticuerpo se mantiene unido al antígeno.
La mayoría de los anticuerpos incorporados en las células se unen a FcRn en los endosomas y se translocan a la superficie celular. Los anticuerpos se disocian del FcRn humano en condiciones neutras en el plasma y se liberan al exterior de las células. Sin embargo, se liberan anticuerpos que tienen dominios de unión a antígeno ordinarios cuya actividad de unión a antígeno no cambia dependiendo de las condiciones de concentración de iones, tales como el pH, al exterior de las células mientras permanecen unidos a los antígenos; por tanto, son incapaces de unirse de nuevo a los antígenos. Por consiguiente, de manera similar a los anticuerpos que se unen a antígenos de membrana, una sola molécula de anticuerpo IgG habitual cuya actividad de unión a antígeno no cambia dependiendo de las condiciones de concentración de iones, tales como el pH, no puede unirse a tres moléculas de antígeno o más.
Los anticuerpos que se unen a antígenos de manera dependiente del pH, anticuerpos que se unen fuertemente a antígenos en condiciones de un intervalo de pH neutro en el plasma y se disocian de los antígenos en condiciones de un intervalo de pH ácido en los endosomas (anticuerpos que se unen a antígenos en condiciones de un intervalo de pH neutro y se disocian en condiciones de un intervalo de pH ácido) y anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio, anticuerpos que se unen fuertemente a antígenos en condiciones de una concentración alta de iones de calcio en el plasma y se disocian de los antígenos en condiciones de una concentración baja de iones de calcio en los endosomas (anticuerpos que se unen a antígenos en condiciones de una concentración alta de iones de calcio y se disocian en condiciones de una concentración baja de iones de calcio) pueden disociarse de los antígenos en los endosomas. Los anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente del pH o los anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio pueden unirse a antígenos de nuevo después de disociarse de los antígenos y son reciclados al plasma por FcRn. Por tanto, una sola molécula de anticuerpo puede unirse repetidamente a varias moléculas de antígeno. Al mismo tiempo, los antígenos unidos a las moléculas de unión a antígeno se disocian de los anticuerpos en los endosomas y se degradan en lisosomas reciclarse al plasma. Al administrar dichas moléculas de unión a antígeno a organismos, se promueve la incorporación de antígenos en las células y se puede reducir la concentración de antígenos en el plasma.
La incorporación en células de antígenos contra los que se unen moléculas de unión a antígeno se promueve adicionalmente al otorgar la capacidad de unirse al FcRn humano en condiciones de un intervalo de pH neutro (pH 7,4) a anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente del pH, anticuerpos que se unen fuertemente a antígenos en condiciones de un intervalo de pH neutro en el plasma y se disocian de los antígenos en condiciones de un intervalo de pH ácido en los endosomas (anticuerpos que se unen a antígenos en condiciones de un intervalo de pH neutro y se disocian en condiciones de un intervalo de pH ácido) y anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio, anticuerpos que se unen fuertemente a antígenos en condiciones de una concentración alta de iones de calcio en el plasma y se disocian de los antígenos en condiciones de una concentración baja de iones de calcio en los endosomas (anticuerpos que se unen a antígenos en condiciones de una concentración alta de iones de calcio y se disocian en condiciones de una concentración baja de iones de calcio). Por tanto, al administrar dichas moléculas de unión a antígeno a organismos, se promueve la eliminación de antígenos y se puede reducir la concentración de antígenos en el plasma. Se incorporan en células anticuerpos habituales que carecen de la capacidad de unirse a antígenos de una manera dependiente del pH o de la capacidad de unirse a los antígenos de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio, así como complejos de antígeno-anticuerpo de los mismos, mediante endocitosis inespecífica, se transportan a la superficie celular después de la unión con FcRn en condiciones ácidas en los endosomas y se reciclan en el plasma después de la disociación del FcRn en condiciones neutras en la superficie celular. Por este motivo, cuando un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera suficientemente dependiente del pH (que se une en condiciones de un intervalo de pH neutro y se disocia en condiciones de un intervalo de pH ácido) o un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio suficiente (que se une en condiciones de una concentración alta de iones de calcio y se disocia en condiciones de una concentración baja de iones de calcio) se une a un antígeno en el plasma y se disocia en los endosomas del antígeno al que está unido, la velocidad de eliminación del antígeno será equivalente a la velocidad de incorporación en células por endocitosis inespecífica del anticuerpo o complejo de antígeno-anticuerpo del mismo. Cuando la dependencia del pH o la dependencia de la concentración de iones de calcio de la unión entre los anticuerpos y los antígenos es insuficiente, los antígenos que no se disociaron de los anticuerpos en los endosomas se reciclarán al plasma junto con los anticuerpos. Sin embargo, cuando la dependencia del pH o la dependencia de la concentración de iones de calcio es suficiente, la velocidad de incorporación en las células por endocitosis inespecífica será limitante para la velocidad de eliminación del antígeno. Al mismo tiempo, ya que el FcRn transporta anticuerpos desde los endosomas a la superficie celular, se cree que una parte del FcRn también está presente en la superficie celular.
En general, la inmunoglobulina de tipo IgG, que es una realización de la molécula de unión a antígeno, no muestra casi ninguna actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro. Los presentes inventores consideraron que la inmunoglobulina de tipo IgG que tiene una actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro puede unirse a FcRn en la superficie celular y se incorporará en células de una manera dependiente de FcRn al unirse al FcRn en la superficie celular. La velocidad de incorporación mediada por FcRn en células es más rápida que la incorporación en células por endocitosis inespecífica. Por tanto, los presentes inventores consideraron que la velocidad de eliminación de antígenos por las moléculas de unión a antígeno puede acelerarse adicionalmente al conferir una capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro. De manera específica, las moléculas de unión a antígeno que tienen capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro enviarían antígenos a células más rápidamente que las inmunoglobulinas de tipo IgG nativas, liberarían los antígenos en los endosomas, se reciclarían de nuevo a la superficie celular o al plasma, se unirían una vez más a los antígenos allí y se incorporarían de nuevo en células a través de FcRn. La velocidad de este ciclo se puede acelerar aumentando la capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro; por tanto, se acelera la velocidad de eliminación de los antígenos del plasma. Por otra parte, la velocidad de eliminación de antígenos del plasma se puede acelerar adicionalmente reduciendo la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido de una molécula de unión a antígeno en comparación con la actividad de unión a antígeno en el intervalo de pH neutro. Además, se cree que el número de moléculas de antígeno a las que puede unirse una sola molécula de unión a antígeno aumenta debido al aumento del número de ciclos que resulta de la aceleración de la velocidad de este ciclo. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención comprenden un dominio de unión a antígeno y un dominio de unión a FcRn y el dominio de unión a FcRn no afecta a la unión a antígeno. Por otra parte, a la luz del mecanismo descrito anteriormente, no dependen del tipo de los antígenos. Por tanto, al reducir la actividad de unión a antígeno (capacidad de unión) de una molécula de unión a antígeno en condiciones de un intervalo de pH ácido o concentraciones de iones tales como concentración baja de iones de calcio en comparación con la actividad de unión a antígeno (capacidad de unión) en condiciones de un intervalo de pH neutro o concentraciones de iones tales como concentración alta de iones de calcio y/o al aumentar la actividad de unión a FcRn al pH del plasma, se puede promover la incorporación en células de los antígenos mediante las moléculas de unión a antígeno y se puede acelerar la velocidad de eliminación del antígenos.
En la presente memoria, la "incorporación de antígenos en células" mediante moléculas de unión a antígeno significa que los antígenos se incorporan en células mediante endocitosis. Asimismo, en la presente memoria, "promover la incorporación en células" indica que se promueve la velocidad de incorporación en células de las moléculas de unión a antígeno que se unen a antígenos en el plasma y/o se reduce la cantidad de antígenos incorporados que se reciclan al plasma. En este caso, se debería promover la velocidad de incorporación en células de una molécula de unión a antígeno que tiene una actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro o de una molécula de unión a antígeno que tiene esta actividad de unión a FcRn humano y cuya actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que en el intervalo de pH neutro en comparación con una molécula de unión a antígeno que no tiene una actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro o con una molécula de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que en el intervalo de pH neutro. En otra realización, la velocidad de incorporación en células de una molécula de unión a antígeno de la presente invención se promueve preferiblemente en comparación con la de una IgG humana nativa y se promueve de manera particularmente preferible en comparación con la de una IgG humana nativa. Por tanto, en la presente invención, se puede determinar si se promueve o no la incorporación de antígenos en células mediante moléculas de unión a antígeno, basándose en si aumenta o no la velocidad de incorporación de antígenos en células. Se puede medir la velocidad de incorporación celular de antígenos, por ejemplo, añadiendo las moléculas de unión a antígeno y los antígenos a un medio de cultivo que contiene células que expresan FcRn humano y midiendo la reducción a lo largo del tiempo de la concentración de los antígenos en el medio o midiendo a lo largo del tiempo la cantidad de antígenos incorporados en células que expresan FcRn humano. Mediante el uso de métodos para promover la incorporación celular de antígenos mediada por las moléculas de unión a antígeno de la presente invención, por ejemplo, administrando las moléculas de unión a antígeno, se puede promover la velocidad de eliminación de antígenos del plasma. Por tanto, también se puede evaluar si se promueve o no la incorporación de antígenos en células mediante moléculas de unión a antígeno, por ejemplo, midiendo si la velocidad de eliminación de los antígenos presentes en el plasma se acelera o no o midiendo si la concentración de antígeno total en el plasma se reduce o no después de la administración de las moléculas de unión a antígeno.
En la presente memoria, "IgG humana nativa" se refiere a IgG humana sin modificar y no se limita a una subclase de IgG en particular. Esto significa que se puede utilizar IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana como "IgG humana nativa" siempre que sea capaz de unirse al FcRn humano en un intervalo de pH ácido. Preferiblemente, la "IgG humana nativa" puede ser IgG1 humana.
En la presente memoria, la "capacidad de eliminar los antígenos en plasma" se refiere a la capacidad de eliminar los antígenos presentes en el plasma del plasma después de la administración in vivo de las moléculas de unión a antígeno o la secreción in vivo de las moléculas de unión a antígeno. Por tanto, en la presente memoria, "aumenta la capacidad de las moléculas de unión a antígeno para eliminar los antígenos en el plasma" significa que, cuando se administran las moléculas de unión a antígeno, la actividad de unión a FcRn humano de las moléculas de unión a antígeno en el intervalo de pH neutro aumenta, o que, además de este aumento de la actividad de unión a FcRn humano, la velocidad de eliminación de antígenos del plasma se acelera en comparación con antes de reducir la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido en comparación con la del intervalo de pH neutro. Se puede evaluar si aumenta o no la capacidad de una molécula de unión a antígeno para eliminar los antígenos en el plasma, por ejemplo, mediante la administración de antígenos solubles y la molécula de unión a antígeno in vivo y midiendo la concentración en plasma de los antígenos solubles después de la administración. Si la concentración de los antígenos solubles en el plasma disminuye después de la administración de los antígenos solubles y las moléculas de unión a antígeno después de aumentar la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro de las moléculas de unión a antígeno, o, además de aumentar esta actividad de unión a FcRn humano, reducir la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido en comparación con la del intervalo de pH neutro, entonces se considera que aumenta la capacidad de las moléculas de unión a antígeno para eliminar los antígenos en el plasma. El antígeno soluble puede ser un antígeno que está unido a una molécula de unión a antígeno o un antígeno que no está unido a una molécula de unión a antígeno y su concentración se puede determinar como una "concentración en plasma del antígeno unido a las moléculas de unión a antígeno" o como una "concentración en plasma del antígeno que no está unido a las moléculas de unión a antígeno", respectivamente (esto último es sinónimo de "concentración de antígeno libre en plasma"). "La concentración de antígeno total en el plasma" significa la suma de antígeno unido a la molécula de unión a antígeno y la concentración de antígeno no unido, o la "concentración de antígeno libre en plasma" que es la concentración de antígeno no unido a la molécula de unión a antígeno. Por tanto, la concentración de antígeno soluble se puede determinar como la "concentración de antígeno total en plasma".
Se conocen bien en la técnica diversos métodos para medir la "concentración de antígeno total en plasma" o "concentración de antígeno libre en plasma", como se describe a continuación en la presente memoria. En la presente memoria, "potenciación de la farmacocinética", "mejora de la farmacocinética" y "farmacocinética superior" pueden reformularse como "potenciación de la permanencia en plasma (sangre)", "mejora de la permanencia en plasma (sangre)", "permanencia superior en plasma (sangre)" y "permanencia prolongada en plasma (sangre)". Estas expresiones son sinónimas.
En la presente memoria, "mejora de la farmacocinética" significa no solo la prolongación del periodo hasta la eliminación del plasma (por ejemplo, hasta que una molécula de unión a antígeno se degrade intracelularmente o similar y no pueda regresar al plasma) después de la administración de la molécula de unión a antígeno a seres humanos o animales no humanos tales como ratones, ratas, monos, conejos y perros, sino también la prolongación de la permanencia en plasma de la molécula de unión a antígeno en una forma que permite la unión a antígeno (por ejemplo, en una forma sin antígenos de la molécula de unión a antígeno) durante el periodo de administración hasta la eliminación debido a la degradación. La IgG humana que tiene región Fc de tipo silvestre puede unirse a FcRn de animales no humanos. Por ejemplo, se puede utilizar preferiblemente ratón para administrar con el fin de confirmar la propiedad de la molécula de unión a antígeno de la invención, ya que la IgG humana que tiene región Fc de tipo silvestre puede unirse al FcRn de ratón con más fuerza que al FcRn humano (Int Immunol. (2001) 13 (12): 1551-1559). Como otro ejemplo, también se puede utilizar preferiblemente ratón en el que sus genes de FcRn nativos están alterados y se alberga un transgén para el gen de FcRn humano para expresar (Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104) para administrar con el fin de confirmar la propiedad de la molécula de unión a antígeno de la invención descrita a continuación en la presente memoria. De manera específica, la "mejora de la farmacocinética" también incluye la prolongación del periodo hasta la eliminación debido a la degradación de la molécula de unión a antígeno no unida a antígenos (la forma sin antígenos de la molécula de unión a antígeno). La molécula de unión a antígeno en plasma no puede unirse a un nuevo antígeno si la molécula de unión a antígeno ya se ha unido a un antígeno. Por tanto, cuanto mayor sea el periodo en el que la molécula de unión a antígeno no esté unida a un antígeno, mayor será el periodo en el que puede unirse a un nuevo antígeno (mayor será la probabilidad de unirse a otro antígeno). Esto permite reducir el periodo de tiempo en el que un antígeno está exento de la molécula de unión a antígeno in vivo y prolongar el periodo en el que un antígeno está unido a la molécula de unión a antígeno. La concentración en plasma de la forma sin antígenos de la molécula de unión a antígeno se puede aumentar y el periodo en el que el antígeno está unido a la molécula de unión a antígeno se puede prolongar acelerando la eliminación del antígeno del plasma mediante la administración de la molécula de unión a antígeno. De manera específica, en la presente memoria, "mejora de la farmacocinética de la molécula de unión a antígeno" incluye la mejora de un parámetro farmacocinético de la forma sin antígenos de la molécula de unión a antígeno (cualquiera de prolongación de la semivida en plasma, prolongación del tiempo medio de permanencia en plasma y alteración de la eliminación del plasma), prolongación del periodo en el que el antígeno se une a la molécula de unión a antígeno después de la administración de la molécula de unión a antígeno y aceleración de la eliminación del plasma del antígeno mediada por la molécula de unión a antígeno. La mejora de la farmacocinética de la molécula de unión a antígeno se puede evaluar determinando uno cualquiera de los parámetros, la semivida en plasma, el tiempo medio de permanencia en plasma y eliminación del plasma de la molécula de unión a antígeno o la forma sin antígenos de la misma ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Por ejemplo, la concentración en plasma de la molécula de unión a antígeno o su forma sin antígenos se determina después de la administración de la molécula de unión a antígeno a ratones, ratas, monos, conejos, perros o seres humanos. A continuación, se determina cada parámetro. Cuando se prolonga la semivida en plasma o el tiempo medio de permanencia en plasma, se puede valorar que la farmacocinética de la molécula de unión a antígeno está mejorada. Los parámetros pueden determinarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los parámetros pueden evaluarse adecuadamente, por ejemplo, mediante análisis no compartimental utilizando el programa informático de análisis farmacocinético WinNonlin (Pharsight) según el manual de instrucciones adjunto. La concentración en plasma de la molécula de unión a antígeno sin antígenos se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, utilizando el método de ensayo descrito en Clin Pharmacol. abril de 2008; 48 (4): 406-417.
En la presente memoria, la "mejora de la farmacocinética" también incluye la prolongación del periodo en el que un antígeno está unido a una molécula de unión a antígeno después de la administración de la molécula de unión a antígeno. Se puede evaluar si se prolonga el periodo en el que un antígeno está unido a la molécula de unión a antígeno después de la administración de la molécula de unión a antígeno determinando la concentración en plasma de antígeno libre. La prolongación se puede valorar basándose en la concentración en plasma determinada de antígeno libre o el periodo de tiempo necesario para un aumento en la relación de concentración de antígeno libre con respecto a la concentración de antígeno total.
La concentración en plasma de antígeno libre no unido a la molécula de unión a antígeno o la relación de la concentración de antígeno libre con respecto a la concentración total se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante el método utilizado en Pharm Res. enero de 2006; 23 (1): 95-103. Como alternativa, cuando un antígeno presenta una función particular in vivo, se puede evaluar si el antígeno está unido a una molécula de unión a antígeno que neutraliza la función del antígeno (molécula antagonista) probando si la función del antígeno está neutralizada. Se puede evaluar si la función del antígeno está neutralizada analizando un marcador in vivo que refleja la función del antígeno. Se puede evaluar si el antígeno está unido a una molécula de unión a antígeno que activa la función del antígeno (molécula agonista) analizando un marcador in vivo que refleja la función del antígeno.
La determinación de la concentración en plasma de antígeno libre y relación de la cantidad de antígeno libre en plasma con respecto a la cantidad de antígeno total en plasma, ensayo de marcador in vivo, y mediciones de este tipo no están particularmente limitadas; sin embargo, los ensayos se llevan a cabo preferiblemente después de que haya pasado un periodo de tiempo determinado después de la administración de la molécula de unión a antígeno. En la presente invención, el periodo después de la administración de la molécula de unión a antígeno no está particularmente limitado; los expertos en la técnica pueden determinar el periodo adecuado dependiendo de las propiedades y similares de la molécula de unión a antígeno administrada. Dichos periodos incluyen, por ejemplo, un día después de la administración de la molécula de unión a antígeno, tres días después de la administración de la molécula de unión a antígeno, siete días después de la administración de la molécula de unión a antígeno, 14 días después de la administración de la molécula de unión a antígeno y 28 días después de la administración de la molécula de unión a antígeno. En la presente memoria, el concepto "concentración de antígeno en plasma" comprende tanto "concentración de antígeno total en plasma" que es la suma del antígeno unido a la molécula de unión a antígeno y la concentración de antígeno no unido o "concentración de antígeno libre en plasma" que es la concentración de antígeno no unido a la molécula de unión a antígeno.
La concentración de antígeno total en plasma se puede reducir mediante la administración de la molécula de unión a antígeno de la presente invención en 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces o incluso más en comparación con la administración de una molécula de unión a antígeno de referencia que comprende la región Fc de IgG de tipo silvestre como molécula de unión a antígeno de referencia o en comparación con cuando no se administra molécula de dominio de unión a antígeno de la presente invención.
La relación molar antígeno/molécula de unión a antígeno se puede calcular como se muestra a continuación;
valor A: Concentración molar de antígeno en cada punto temporal
valor B: Concentración molar de molécula de unión a antígeno en cada punto temporal
valor C: Concentración molar de antígeno por concentración molar de molécula de unión de antígeno (relación molar de antígeno/molécula de unión de antígeno) en cada punto temporal
C = A/B.
Un valor C más pequeño indica mayor eficacia de eliminación de antígenos por molécula de unión a antígeno, mientras que un valor C más alto indica menor eficacia de eliminación de antígenos por molécula de unión a antígeno.
La relación molar antígeno/molécula de unión a antígeno se puede calcular como se ha descrito anteriormente.
La relación molar de antígeno/molécula de unión a antígeno se puede reducir mediante la administración de la molécula de unión a antígeno de la presente invención en 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces o incluso más en comparación con la administración de una molécula de unión a antígeno de referencia que comprende la región Fc de IgG humana de tipo silvestre como dominio de unión a FcRn humano.
En la presente memoria, se utiliza preferiblemente una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana de tipo silvestre como IgG humana de tipo silvestre con el fin de comparar una IgG humana de tipo silvestre de referencia con las moléculas de unión a antígeno con respecto a su actividad de unión a FcRn humano o actividad de unión in vivo. Preferiblemente, se puede utilizar apropiadamente una molécula de unión a antígeno de referencia que comprende el mismo dominio de unión a antígeno que una molécula de unión a antígeno de interés y una región Fc de IgG humana de tipo silvestre como dominio de unión a FcRn humano. Más preferiblemente, se utiliza una IgG 1 humana intacta con el fin de comparar una IgG humana de tipo silvestre de referencia con las moléculas de unión a antígeno con respecto a su actividad de unión a FcRn humano o actividad in vivo.
Se puede evaluar la reducción de la concentración de antígeno total en plasma o la relación molar de antígeno/anticuerpo como se describe en los ejemplos 4, 5 y 12. Más específicamente, utilizando la línea 32 o la línea 276 de ratón transgénico para FcRn humano (Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104), se pueden evaluar mediante un modelo de coinyección de antígeno-anticuerpo o un modelo de infusión de antígeno en estado estacionario cuando la molécula de unión a antígeno no reacciona de forma cruzada con el antígeno homólogo de ratón. Cuando una molécula de unión a antígeno reacciona de forma cruzada con su homólogo de ratón, pueden evaluarse simplemente inyectando una molécula de unión a antígeno a la línea 32 o la línea 276 de ratón transgénico para FcRn humano (Jackson Laboratories). En el modelo de coinyección, se administra al ratón una mezcla de molécula de unión a antígeno y antígeno. En el modelo de infusión de antígeno en estado estacionario, se implanta en el ratón una bomba de infusión que contiene una solución de antígeno para lograr una concentración constante de antígeno en plasma y después se inyecta al ratón molécula de unión a antígeno. La molécula de unión a antígeno de prueba se administra a la misma dosis. La concentración total de antígeno en plasma, la concentración de antígeno libre en plasma y la concentración de la molécula de unión a antígeno en plasma se miden en el punto temporal apropiado utilizando un método conocido por los expertos en la técnica.
La concentración de antígeno total o libre en plasma y la relación molar de antígeno/molécula de unión a antígeno se pueden medir a los 2, 4, 7, 14, 28, 56 u 84 días después de la administración para evaluar el efecto a largo plazo de la presente invención. En otras palabras, una concentración de antígeno en plasma a largo plazo se determina midiendo la concentración de antígeno total o libre en plasma y la relación molar de antígeno/molécula de unión a antígeno a los 2, 4, 7, 14, 28, 56 u 84 días después de la administración de una molécula de unión a antígeno para evaluar la propiedad de la molécula de unión a antígeno de la presente invención. Se puede determinar si se logra la reducción de la concentración de antígeno en plasma o la relación molar de antígeno/molécula de unión a antígeno por la molécula de unión a antígeno descrita en la presente invención mediante la evaluación de la reducción en uno cualquiera o más de los puntos temporales descritos anteriormente.
La concentración de antígeno total o libre en plasma y la relación molar de antígeno/molécula de unión a antígeno se puede medir a los 15 min, 1,2, 4, 8, 12 o 24 horas después de la administración para evaluar el efecto a corto plazo de la presente invención. En otras palabras, se determina una concentración de antígeno en plasma a corto plazo midiendo la concentración de antígeno total o libre en plasma y la relación molar de antígeno/molécula de unión a antígeno a los 15 min, 1, 2, 4, 8, 12 o 24 horas después de la administración de una molécula de unión a antígeno para evaluar la propiedad de la molécula de unión a antígeno de la presente invención.
La vía de administración de una molécula de unión a antígeno de la presente invención se puede seleccionar entre inyección intradérmica, intravenosa, intravítrea, subcutánea, intraperitoneal, parenteral e intramuscular.
En la presente invención, se prefiere la mejora de la farmacocinética de la molécula de unión a antígeno en el ser humano. Cuando es difícil determinar la permanencia en plasma en el ser humano, esta puede predecirse basándose en la permanencia en plasma en ratones (por ejemplo, ratones normales, ratones transgénicos que expresan antígenos humanos, ratones transgénicos que expresan FcRn humano) o monos (por ejemplo, monos cinomolgos).
En la presente memoria, "la mejora de la farmacocinética y la permanencia en plasma prolongada de una molécula de unión a antígeno" significa la mejora de cualquier parámetro farmacocinético (cualquiera de prolongación de la semivida en plasma, prolongación del tiempo medio de permanencia en plasma, reducción de la eliminación del plasma y biodisponibilidad) después de administración in vivo de la molécula de unión a antígeno o un aumento de la concentración de la molécula de unión a antígeno en el plasma en un tiempo apropiado después de la administración. Puede determinarse midiendo cualquier parámetro, tal como la semivida en plasma, tiempo medio de permanencia en plasma, eliminación del plasma y biodisponibilidad de la molécula de unión a antígeno (Pharmacokinetics: Enshuniyoru Rikai (Understanding through practice), (Nanzando)). Por ejemplo, cuando se administra una molécula de unión a antígeno a ratones (ratones normales y ratones transgénicos para FcRn humano), ratas, monos, conejos, perros, seres humanos, etc., y se determina la concentración de la molécula de unión a antígeno en el plasma y se calcula cada uno de los parámetros, se puede valorar que la farmacocinética de la molécula de unión a antígeno está mejorada cuando se prolonga la semivida en plasma o el tiempo medio de permanencia en el plasma. Estos parámetros pueden determinarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los parámetros pueden evaluarse adecuadamente mediante análisis no compartimentales utilizando el programa informático de análisis farmacocinético WinNonlin (Pharsight) según el manual de instrucciones adjunto.
Sin quedar ligados a una teoría en particular, ya que una molécula de unión a antígeno que tiene una actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro pueden formar un complejo tetramérico que comprenden dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR en la membrana celular de células presentadoras de antígenos, se promueve la incorporación en células presentadoras de antígenos y, por tanto, se cree que la permanencia en plasma se reduce y la farmacocinética empeora. Hay sitios de fosforilación en los dominios citoplásmicos de FcyR y FcRn. En general, se produce fosforilación del dominio citoplásmico de un receptor expresado en superficie celular tras el ensamblaje de los receptores y la fosforilación induce la internalización del receptor. Incluso si la IgG1 nativa forma un complejo dimérico FcYR/IgG1 en las células presentadoras de antígenos, no se produce ensamblaje de los dominios citoplásmicos de FcyR. Sin embargo, cuando una molécula de IgG que tiene una actividad de unión a FcRn en condiciones de un intervalo de pH neutro forma un complejo heteromérico tetramérico que comprende FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG, los tres dominios citoplásmicos de FcyR y FcRn se ensamblarían y, de ese modo, se puede inducir la internalización del complejo heteromérico tetramérico que comprende FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG. Se cree que se produce formación de los complejos heteroméricos tetraméricos que comprenden FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG en células presentadoras de antígenos que coexpresan FcyR y FcRn y, en consecuencia, la cantidad de moléculas de anticuerpo incorporadas en las células presentadoras de antígenos puede aumentar y, como resultado, la farmacocinética puede empeorar. Por tanto, al inhibir la formación del complejo descrito anteriormente en células presentadoras de antígenos utilizando uno cualquiera de los métodos de las realizaciones 1, 2 y 3 revelados en la presente invención, se puede reducir la incorporación en células presentadoras de antígenos y, como resultado, se puede mejorar la farmacocinética.
Método para producir moléculas de unión a antígeno cuya actividad de unión varía dependiendo de las condiciones de concentración de iones
En una realización no limitante de la presente invención, después de aislar un polinucleótido que codifica un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión cambia dependiendo de la condición seleccionada como se ha descrito anteriormente, el polinucleótido se inserta en un vector de expresión apropiado. Por ejemplo, cuando el dominio de unión a antígeno es una región variable de anticuerpo, una vez que se obtiene un ADNc que codifica la región variable, el ADNc se digiere con enzimas de restricción que reconocen los sitios de restricción insertados en los dos extremos del ADNc. Preferiblemente, las enzimas de restricción reconocen y digieren una secuencia de nucleótidos que aparece con una frecuencia baja en la secuencia de nucleótidos que compone el gen de la molécula de unión a antígeno. Asimismo, se insertan preferiblemente enzimas de restricción que proporcionan extremos cohesivos para insertar una única copia de un fragmento digerido en el vector en la orientación correcta. El ADNc que codifica una región variable de una molécula de unión a antígeno digerida como se ha descrito anteriormente se inserta en un vector de expresión apropiado para obtener un vector de expresión para la molécula de unión a antígeno de la presente invención. En este momento, un gen que codifica una región constante de anticuerpo (región C) puede fusionarse en fase con el gen que codifica la región variable.
Para producir una molécula de unión a antígeno de interés, un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno se inserta de una manera unida operativamente a una secuencia reguladora en un vector de expresión. Las secuencias reguladoras incluyen, por ejemplo, potenciadores y promotores. Asimismo, se puede ligar una secuencia señal adecuada al extremo N de modo que la molécula de unión a antígeno expresada se secrete al exterior de las células. Como secuencia señal, por ejemplo, se utiliza un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SeQ ID n O: 3); sin embargo, también es posible ligar otras secuencias señales apropiadas. El polipéptido expresado se escinde en el extremo carboxilo de la secuencia descrita anteriormente y el polipéptido escindido se secreta como polipéptido maduro al exterior de las células. A continuación, las células hospedadoras apropiadas se transforman con este vector de expresión de modo que se puedan obtener células recombinantes que expresan el polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno de interés. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se pueden producir a partir de las células recombinantes siguiendo los métodos descritos anteriormente en la sección de anticuerpos.
En una realización no limitante de la presente invención, después de aislar un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno descrita anteriormente cuya actividad de unión varía dependiendo de una condición seleccionada, una variante del polinucleótido se inserta en un vector de expresión apropiado. Dichas variantes incluyen preferiblemente las preparadas mediante humanización basada en la secuencia polinucleotídica que codifica una molécula de unión a antígeno de la presente invención obtenida mediante cribado como una biblioteca de regiones variables aleatorias de una biblioteca sintética o una biblioteca inmunitaria construida a partir de animales no humanos. Pueden utilizarse los mismos métodos descritos anteriormente para producir anticuerpos humanizados descritos anteriormente como un método para producir variantes de moléculas de unión a antígeno humanizadas.
En otra realización, dichas variantes incluyen preferiblemente las obtenidas mediante la introducción de una alteración que aumenta la afinidad del antígeno (maduración de afinidad) de una molécula de unión a antígeno de la presente invención en una secuencia polinucleotídica aislada para la molécula obtenida mediante el cribado utilizando una biblioteca sintética o una biblioteca sin exposición previa como biblioteca de regiones variables aleatorias. Dichas variantes pueden obtenerse mediante diversos procedimientos conocidos para la maduración de afinidad, incluyendo mutagénesis de CDR (Yang et al. (J. Mol. Biol. (1995) 254, 392-403)), redistribución de cadenas (Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10, 779-783)), uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al. (J. Mol. Biol. (1996) 250, 359­ 368)), redistribución de ADN (Patten et al. (Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733)), presentación en fagos (Thompson et al. (J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88)) y pCr sexual (Clameri et al. (Nature (1998) 391,288-291)).
Como se ha descrito anteriormente, las moléculas de unión a antígeno que se producen mediante los métodos de producción de la presente invención incluyen moléculas de unión a antígeno que tienen una región Fc. Se pueden utilizar diversas variantes como regiones Fc. En una realización, las variantes de la presente invención incluyen preferiblemente polinucleótidos que codifican moléculas de unión a antígeno que tienen una cadena pesada en la que un polinucleótido que codifica una variante de la región Fc como se ha descrito anteriormente se une en fase a un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno descrita anteriormente cuya actividad de unión varía dependiendo en una condición seleccionada.
En una realización no limitante de la presente invención, las regiones Fc incluyen preferiblemente, por ejemplo, regiones constantes Fc de anticuerpos tales como IgG1 de la SEQ ID NO: 11 (se añade Ala al extremo N de AAC82527.1), IgG2 de la SEQ ID NO: 12 (se añade Ala al extremo N de AAB59393.1), IgG3 de la SEQ ID NO: 13 (CAA27268.1) e IgG4 de la SEQ ID NO: 14 (se añade Ala al extremo N de AAB59394.1). La permanencia en plasma de moléculas de IgG es relativamente larga (la eliminación del plasma es lenta) ya que FcRn, en particular, FcRn humano, actúa como un receptor de rescate para moléculas de IgG. Las moléculas de IgG incorporadas en endosomas por pinocitosis se unen en condiciones ácidas endosómicas a FcRn, en particular, FcRn humano, expresado en endosomas. Las moléculas de IgG que no pueden unirse a FcRn, en particular, FcRn humano, se transfieren a lisosomas y se degradan allí. Al mismo tiempo, las moléculas de IgG unidas a FcRn, en particular, FcRn humano, se transfieren a la superficie celular y después regresan al plasma como resultado de la disociación de FcRn, en particular, FcRn humano, en condiciones neutras en plasma.
Ya que los anticuerpos que comprenden una región Fc habitual no tienen actividad de unión a FcRn, en particular, a FcRn humano, en la condición de intervalo de pH neutro en plasma, se incorporan anticuerpos y complejos anticuerpoantígeno habituales a las células mediante endocitosis inespecífica y se transfieren a la superficie celular mediante unión a FcRn, en particular, FcRn humano, en la condición de intervalo de pH ácido endosómico. FcRn, en particular, FcRn humano, transporta anticuerpos desde el endosoma a la superficie celular. Por tanto, se cree que algunos FcRn, en particular, FcRn humano, también están presentes en la superficie celular. Sin embargo, los anticuerpos se reciclan al plasma, ya que se disociaron de FcRn, en particular, FcRn humano, en la condición de intervalo de pH neutro en la superficie celular.
Se pueden obtener regiones Fc que tienen actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro, que están incluidas en moléculas de unión a antígeno de la presente invención, por cualquier método. De manera específica, se pueden obtener regiones Fc que tienen actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro alterando aminoácidos de inmunoglobulina humana de tipo IgG como región Fc de partida. Las regiones Fc preferidas de inmunoglobulina de tipo IgG humana para alteración incluyen, por ejemplo, las de IgG humanas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 y variantes de las mismas). Los aminoácidos en cualquier posición se pueden alterar a otros aminoácidos siempre que las regiones resultantes tengan la actividad de unión al FcRn humano en el intervalo de pH neutro o mayor actividad de unión al FcRn humano en el intervalo neutro. Cuando una molécula de unión a antígeno comprende la región Fc de IgG1 humana como región Fc humana, es preferible que la región resultante comprenda una alteración que dé lugar al efecto de potenciar la unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro en comparación con la actividad de unión de la región Fc de partida de IgG1 humana. Los aminoácidos que permiten dichas alteraciones incluyen, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241,243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341,343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440 y 442 (indicadas por la numeración EU). Más específicamente, dichas alteraciones de aminoácidos incluyen las enumeradas en la tabla 5. La alteración de estos aminoácidos mejora la unión a FcRn humano de la región Fc de la inmunoglobulina de tipo IgG en el intervalo de pH neutro.
Entre las descritas anteriormente, las alteraciones apropiadas que mejoran la unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro se seleccionan para su uso en la presente invención. Los aminoácidos particularmente preferidos para dichas variantes de la región Fc incluyen, por ejemplo, aminoácidos en las posiciones 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 (indicadas por la numeración EU). La actividad de unión a FcRn humano de la región Fc incluida en una molécula de unión a antígeno puede aumentarse en el intervalo de pH neutro sustituyendo al menos un aminoácido por un aminoácido diferente.
Las alteraciones particularmente preferidas en la región Fc incluyen, por ejemplo, sustituciones de:
el aminoácido en la posición 237 por Met;
el aminoácido en la posición 248 por Ile;
el aminoácido en la posición 250 por Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 252 por Phe, Trp o Tyr;
el aminoácido en la posición 254 por Thr;
el aminoácido en la posición 255 por Glu;
el aminoácido en la posición 256 por Asp, Asn, Glu o Gln;
el aminoácido en la posición 257 por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val;
el aminoácido en la posición 258 por His;
el aminoácido en la posición 265 por Ala;
el aminoácido en la posición 286 por Ala o Glu;
el aminoácido en la posición 289 por His;
el aminoácido en la posición 297 por Ala;
el aminoácido en la posición 303 por Ala;
el aminoácido en la posición 305 por Ala;
el aminoácido en la posición 307 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; el aminoácido en la posición 308 por Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln o Thr;
el aminoácido en la posición 309 por Ala, Asp, Glu, Pro o Arg;
el aminoácido en la posición 311 por Ala, His o Ile;
el aminoácido en la posición 312 por Ala o His;
el aminoácido en la posición 314 por Lys o Arg;
el aminoácido en la posición 315 por Ala, Asp o His;
el aminoácido en la posición 317 por Ala;
el aminoácido en la posición 332 por Val;
el aminoácido en la posición 334 por Leu;
el aminoácido en la posición 360 por His;
el aminoácido en la posición 376 por Ala;
el aminoácido en la posición 380 por Ala;
el aminoácido en la posición 382 por Ala;
el aminoácido en la posición 384 por Ala;
el aminoácido en la posición 385 por Asp o His;
el aminoácido en la posición 386 por Pro;
el aminoácido en la posición 387 por Glu;
el aminoácido en la posición 389 por Ala o Ser;
el aminoácido en la posición 424 por Ala;
el aminoácido en la posición 428 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; el aminoácido en la posición 433 por Lys;
el aminoácido en la posición 434 por Ala, Phe, His, Ser, Trp o Tyr; y
el aminoácido en la posición 436 por His, Ile, Leu, Phe, Thr o Val en el sistema de numeración EU. Al mismo tiempo, el número de aminoácidos alterados no está particularmente limitado; dichas alteraciones de aminoácidos incluyen la alteración de un solo aminoácido y la alteración de aminoácidos en dos o más sitios. Las combinaciones de alteraciones de aminoácidos en dos o más sitios incluyen, por ejemplo, las descritas en la tabla 6.
La presente invención no se limita a una teoría en particular, pero proporciona métodos para producir moléculas de unión a antígeno que comprenden no solo una alteración descrita anteriormente, sino también una alteración de la región Fc para no formar el complejo heterotetramérico que consiste en la región Fc incluida en la molécula de unión a antígeno, dos moléculas de FcRn y receptor Fcy activador. Las realizaciones preferidas de dichas moléculas de unión a antígeno incluyen tres realizaciones que se describen a continuación.
(Realización 1) Moléculas de unión a antígeno que comprenden una región Fc que tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR activador es menor que la de la región Fc nativa
Las moléculas de unión a antígeno de la realización 1 forman complejos triméricos uniéndose a dos moléculas de FcRn; sin embargo, no forman complejos, incluyendo FcyR activador (fig. 49). Las regiones Fc cuya actividad de unión a FcyR activador es menor que la de la región Fc nativa pueden prepararse alterando los aminoácidos de la región Fc nativa como se ha descrito anteriormente. Se puede probar apropiadamente si la actividad de unión de una región Fc alterada para activar FcyR es menor que la de la región Fc nativa, se puede probar de manera apropiada utilizando los métodos descritos en la sección "actividad de unión" anterior.
En la presente memoria, la actividad de unión de una región Fc alterada al receptor Fcy activador es menor que la de la región Fc nativa lo que significa que la actividad de unión de una región Fc alterada a cualquier receptor Fcy humano, FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIIa y/o FcYRIIIb, es menor que la de la región Fc nativa y, por ejemplo, significa que, cuando se compara basándose en un método analítico descrito anteriormente, la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno que tiene una variante de la región Fc es de 95 % o menos, preferiblemente 90 % o menos, 85 % o menos, 80 % o menos, 75 % o menos, de manera particularmente preferible 70 % o menos, 65 % o menos, 60 % o menos, 55 % o menos, 50 % o menos, 45 % o menos, 40 % o menos, 35 % o menos, 30 % o menos, 25 % o menos, 20 % o menos, 15 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, 1 % o menos en comparación con la actividad de unión de una molécula de unión a antígeno de control que tiene la región Fc nativa. Dichas regiones Fc nativas incluyen la región Fc de partida y las regiones Fc de anticuerpos de tipo silvestre de diferentes isotipos.
Las moléculas de unión a antígeno apropiadas que tienen una región Fc como control incluyen las que tienen una región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal. Las estructuras de dichas regiones Fc se muestran en las SEQ ID NO: 11 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAC82527.1), 12 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAB59393.1), 13 (n.° de referencia de RefSeq CAA27268.1) y 14 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq AAB59394.1). Al mismo tiempo, cuando una molécula de unión a antígeno que tiene la región Fc de un anticuerpo de un determinado isotipo se utiliza como sustancia de prueba, la actividad de unión al receptor Fcy de la molécula de unión a antígeno que tiene la región Fc puede probarse utilizando como control una molécula de unión a antígeno que tiene la región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal del mismo isotipo. Es adecuado seleccionar una molécula de unión a antígeno que comprenda una región Fc cuya actividad de unión al receptor Fcy se ha demostrado que es alta como se ha descrito anteriormente.
En una realización no limitante de la presente invención, las regiones Fc preferidas cuya actividad de unión a FcyR activador es menor que la de la región Fc nativa incluyen, por ejemplo, regiones Fc en las que uno o más de los aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 y 329 (indicadas por la numeración EU) entre los aminoácidos de una región Fc anteriormente descrita están sustituidos por diferentes aminoácidos de la región Fc nativa. Dichas alteraciones de la región Fc no están limitadas a las alteraciones descritas anteriormente e incluyen, por ejemplo, alteraciones tales como cadenas desglucosiladas (N297A y N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG 1 -A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331 S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4-L236E descritas en Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; alteraciones tales como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R y N325LL328R descritas en el documento WO 2008/092117; inserciones de aminoácidos en las posiciones 233, 234, 235 y 237 (indicadas por la numeración EU); y alteraciones en los sitios descritos en el documento WO 2000/042072.
Asimismo, en una realización no limitante de la presente invención, las regiones Fc preferidas incluyen las alteradas para tener una o más alteraciones de:
una sustitución del aminoácido en la posición 234 por Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr o Trp;
una sustitución del aminoácido en la posición 235 por Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val o Arg;
una sustitución del aminoácido en la posición 236 por Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro o Tyr;
una sustitución del aminoácido en la posición 237 por Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr o Arg;
una sustitución del aminoácido en la posición 238 por Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp o Arg;
una sustitución del aminoácido en la posición 239 por Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr o Arg; una sustitución del aminoácido en la posición 265 por Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
una sustitución del aminoácido en la posición 266 por Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp o Tyr;
una sustitución del aminoácido en la posición 267 por Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp o Tyr; una sustitución del aminoácido en la posición 269 por Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
una sustitución del aminoácido en la posición 270 por Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val;
una sustitución del aminoácido en la posición 271 por Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp o Tyr;
una sustitución del aminoácido en la posición 295 por Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp o Tyr;
una sustitución del aminoácido en la posición 296 por Arg, Gly, Lys o Pro;
una sustitución del aminoácido en la posición 297 por Ala;
una sustitución del aminoácido en la posición 298 por Arg, Gly, Lys, Pro, Trp o Tyr;
una sustitución del aminoácido en la posición 300 por Arg, Lys o Pro;
una sustitución del aminoácido en la posición 324 por Lys o Pro;
una sustitución del aminoácido en la posición 325 por Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr o Val; una sustitución del aminoácido en la posición 327 por Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val; una sustitución del aminoácido en la posición 328 por Arg, Asn, Gly, His, Lys o Pro;
una sustitución del aminoácido en la posición 329 por Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val o Arg;
una sustitución del aminoácido en la posición 330 por Pro o Ser;
una sustitución del aminoácido en la posición 331 por Arg, Gly o Lys; y
una sustitución del aminoácido en la posición 332 por Arg, Lys o Pro en el sistema de numeración EU en la región Fc. (Realización 2) Moléculas de unión a antígeno que comprenden una región Fc que tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR inhibidor es mayor que la actividad de unión al receptor Fcy activador
Las moléculas de unión a antígeno de la realización 2 pueden formar el complejo tetramérico uniéndose a dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR inhibidor. Sin embargo, ya que una molécula de unión a antígeno puede unirse solo a una molécula de FcyR, una molécula de unión a antígeno unida a FcyR inhibidor no puede unirse adicionalmente a FcyR activador (fig. 50). Asimismo, se ha informado de que las moléculas de unión a antígeno incorporadas en células en un estado unido a FcyR inhibidor se reciclan en la membrana celular y, por tanto, escapan de la degradación intracelular (Immunity (2005) 23, 503-514). De manera específica, se supone que las moléculas de unión a antígeno que tienen la actividad de unión selectiva a FcyR inhibidor no pueden formar el complejo heteromérico que comprende FcyR activador, que es responsable de la respuesta inmunitaria, y dos moléculas de FcRn.
En la presente memoria, "la actividad de unión al FcyR inhibidor es mayor que la actividad de unión al receptor Fcy activador" significa que la actividad de unión de una variante de la región Fc a FcYRIIb es mayor que la actividad de unión a cualquier receptor Fcy humano, FcyRI, FcYRIIa, FcyRIIIa y/o FcYRIIIb. Por ejemplo, significa que, basándose en un método analítico descrito anteriormente, la actividad de unión a FcYRIIb de una molécula de unión a antígeno que tiene una variante de la región Fc es de 105 % o más, preferiblemente 110 % o más, 120 % o más, 130 % o más, 140 % o más, de manera particularmente preferible 150 % o más, 160 % o más, 170 % o más, 180 % o más, 190 % o más, 200 % o más, 250 % o más, 300 % o más, 350 % o más, 400 % o más, 450 % o más, 500 % o más, 750 % o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 40 veces o más, 50 veces o más la actividad de unión a cualquier receptor Fcy humano, FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa y/o FcYRIIIb.
Como moléculas de unión a antígeno de control que tienen una región Fc, se pueden utilizar apropiadamente las que tienen una región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal. Las estructuras de dichas regiones Fc se muestran en las SEQ ID NO: 11 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAC82527.1), 12 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq. AAB59393.1), 13 (n.° de referencia de RefSeq CAA27268.1) y 14 (A se añade al extremo N del n.° de referencia RefSeq AAB59394.1). Al mismo tiempo, cuando una molécula de unión a antígeno que tiene la región Fc de un anticuerpo de un determinado isotipo se utiliza como sustancia de prueba, la actividad de unión al receptor Fcy de la molécula de unión a antígeno que tiene la región Fc puede probarse utilizando como control una molécula de unión a antígeno que tiene la región Fc de un anticuerpo IgG monoclonal del mismo isotipo. Como se ha descrito anteriormente, se selecciona apropiadamente una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc cuya actividad de unión al receptor Fcy se ha demostrado que es alta.
En una realización no limitante de la presente invención, las regiones Fc preferidas que tienen la actividad de unión selectiva al FcyR inhibidor incluyen, por ejemplo, regiones Fc en las que el aminoácido en la posición 238 o 328 (indicada por la numeración EU) entre los aminoácidos de una región Fc descrita anteriormente está alterado a un aminoácido diferente de la región Fc nativa. Asimismo, como regiones Fc que tienen la actividad de unión selectiva al FcyR inhibidor, también es posible seleccionar apropiadamente regiones Fc o alteraciones de las descritas en el documento US 2009/0136485.
En otra realización no limitante de la presente invención, las regiones Fc preferidas incluyen aquellas en las que uno cualquiera o más de: el aminoácido en la posición 238 (indicada por la numeración EU) está sustituido por Asp y el aminoácido en la posición 328 (indicada por la numeración EU) está sustituido por Glu en una región Fc descrita anteriormente.
En otra realización más no limitante de la presente invención, las regiones Fc preferidas incluyen la sustitución de Pro por Asp en la posición 238 (indicada por la numeración EU) y aquellas en las que una o más de:
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Trp,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Phe,
una sustitución del aminoácido en la posición 267 (indicada por la numeración EU) por Val,
una sustitución del aminoácido en la posición 267 (indicada por la numeración EU) por Gln,
una sustitución del aminoácido en la posición 268 (indicada por la numeración EU) por Asn,
una sustitución del aminoácido en la posición 271 (indicada por la numeración EU) por Gly,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Leu,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Gln,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Glu,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Met,
una sustitución del aminoácido en la posición 239 (indicada por la numeración EU) por Asp,
una sustitución del aminoácido en la posición 267 (indicada por la numeración EU) por Ala,
una sustitución del aminoácido en la posición 234 (indicada por la numeración EU) por Trp,
una sustitución del aminoácido en la posición 234 (indicada por la numeración EU) por Tyr,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Ala,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Asp,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Glu,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Leu,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Met,
una sustitución del aminoácido en la posición 237 (indicada por la numeración EU) por Tyr,
una sustitución del aminoácido en la posición 330 (indicada por la numeración EU) por Lys,
una sustitución del aminoácido en la posición 330 (indicada por la numeración EU) por Arg,
una sustitución del aminoácido en la posición 233 (indicada por la numeración EU) por Asp,
una sustitución del aminoácido en la posición 268 (indicada por la numeración EU) por Asp,
una sustitución del aminoácido en la posición 268 (indicada por la numeración EU) por Glu,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Asp,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Ser,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Thr,
una sustitución del aminoácido en la posición 323 (indicada por la numeración EU) por Ile,
una sustitución del aminoácido en la posición 323 (indicada por la numeración EU) por Leu,
una sustitución del aminoácido en la posición
Figure imgf000081_0001
323 (indicada por la numeración EU) por Met,
una sustitución del aminoácido en la posición
Figure imgf000081_0002
296 (indicada por la numeración EU) por Asp,
una sustitución del aminoácido en la posición 326 (indicada por la numeración EU) por Ala,
una sustitución del aminoácido en la posición
Figure imgf000081_0003
326 (indicada por la numeración EU) por Asn y
una sustitución del aminoácido en la posición
Figure imgf000081_0004
330 (indicada por la numeración EU) por Met.
(Realización 3) Moléculas de unión a antígeno que comprenden una región Fc en la que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro y el otro no tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro
La molécula de unión a antígeno de la realización 3 puede formar complejos tetraméricos uniéndose a una molécula de FcRn y una molécula de FcyR; sin embargo, no forman el complejo heterotetramérico que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR (fig.51). Pueden utilizarse apropiadamente regiones Fc procedentes de anticuerpos biespecíficos como regiones Fc en las que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro y el otro no tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro, que están incluidos en la molécula de unión a antígeno de la realización 3. Un anticuerpo biespecífico se refiere a dos tipos de anticuerpos que tienen especificidad para diferentes antígenos. Los anticuerpos biespecíficos de tipo IgG pueden secretarse a partir de hibridomas híbridos (cuadromas) resultantes de la fusión de dos tipos de hibridomas que producen anticuerpos IgG (Milstein et al. (Nature (1983) 305, 537-540).
Cuando se producen moléculas de unión a antígeno de la realización 3 anterior utilizando técnicas de recombinación tales como las descritas en la sección "anticuerpo", se puede utilizar un método en el que los genes que codifican polipéptidos que constituyen los dos tipos de regiones Fc de interés se introducen en células para coexpresarlos. Sin embargo, la región Fc producida es una mezcla que contiene, en una relación molecular de 2:1:1, una región Fc en la que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro y el otro no tiene la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro, La región Fc en la que ambos polipéptidos que constituyen la región Fc tienen la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro y la región Fc en la que ambos polipéptidos que constituyen la región Fc no tienen la actividad de unión a FcRn en la condición de intervalo de pH neutro. Es difícil purificar moléculas de unión a antígeno que comprenden una combinación deseada de regiones Fc de los tres tipos de IgG.
Cuando se producen moléculas de unión a antígeno de la realización 3 utilizando técnicas de recombinación tales como las descritas anteriormente, pueden secretarse preferentemente moléculas de unión a antígeno que comprenden la heterocombinación de regiones Fc alterando el dominio CH3 que constituye una región Fc utilizando sustituciones de aminoácidos apropiadas. De manera específica, es un método para mejorar la formación de cadenas hetero H e inhibir la formación de cadenas homo H mediante la sustitución de la cadena lateral de aminoácidos en un dominio CH3 de cadena pesada con una cadena lateral de mayor volumen (botón (que significa "proyección")) mientras se sustituye la cadena lateral de aminoácidos en el otro dominio CH3 de cadena pesada con una cadena lateral más pequeña (ojal (que significa "vacío")) de modo que el "botón" se coloca en el "ojal" (documento WO 1996027011, Ridgway et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant et al. (Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).
Asimismo, Las técnicas conocidas para producir anticuerpos biespecíficos incluyen aquellas en las que se aplica un medio para regular la asociación de polipéptidos o la asociación para formar multímeros heteroméricos constituidos por polipéptidos a la asociación de un par de polipéptidos que constituyen una región Fc. De manera específica, para producir anticuerpos biespecíficos, se pueden utilizar métodos para regular la asociación de polipéptidos alterando los restos de aminoácidos que forman la interfaz entre un par de polipéptidos que constituyen una región Fc para formar un complejo de dos polipéptidos con diferentes secuencias que constituyen la región Fc, mientras se inhibe la asociación de polipéptidos que tienen una secuencia idéntica que constituyen la región Fc (documento WO 2006/106905). Dichos métodos pueden utilizarse para producir moléculas de unión a antígeno de la presente invención descritas en la realización 3.
En una realización no limitante de la presente invención, se puede utilizar apropiadamente un par de polipéptidos que constituyen una región Fc descrita anteriormente que se origina a partir de un anticuerpo biespecífico como región Fc. Más específicamente, un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 349 y 366 (indicadas por la numeración EU) son Cys y Trp, respectivamente, y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 356 (indicada por la numeración EU) es Cys, el aminoácido en la posición 366 (indicada por la numeración EU) es Ser, el aminoácido en la posición 368 es Ala y el aminoácido en la posición 407 (indicada por la numeración EU) es Val, se utiliza preferiblemente como regiones Fc.
En otra realización no limitante de la presente invención, un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 409 (indicada por la numeración EU) es Asp y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 399 (indicada por la numeración EU) es Lys se utiliza preferiblemente como regiones Fc. En la realización descrita anteriormente, el aminoácido en la posición 409 puede ser Glu en lugar de Asp y el aminoácido en la posición 399 puede ser Arg en lugar de Lys. Como alternativa, es preferible que, cuando el aminoácido en la posición 399 es Lys, adicionalmente, el aminoácido en la posición 360 puede ser Asp o el aminoácido en la posición 392 puede ser Asp.
En otra realización más no limitante de la presente invención, se utiliza preferiblemente un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 370 (indicada por la numeración EU) es Glu y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 357 (indicada por la numeración EU) es Lys, como regiones Fc.
En todavía otra realización no limitante de la presente invención, se utiliza preferiblemente un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 439 (indicada por la numeración EU) es Glu y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en la posición 356 (indicada por la numeración EU) es Lys, como regiones Fc.
En todavía otra realización más no limitante de la presente invención, dichas regiones Fc preferidas incluyen aquellas como una combinación de cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como:
un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 409 y 370 (indicadas por la numeración EU) son Asp y Glu, respectivamente, y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 399 y 357 (indicadas por la numeración EU) son ambos Lys (en esta realización, el aminoácido en la posición 370 (indicada por la numeración EU) puede ser Asp en lugar de Glu o el aminoácido en la posición 392 puede ser Asp, en lugar de Glu en la posición de aminoácido 370);
un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 409 y 439 (indicadas por la numeración EU) son Asp y Glu, respectivamente, y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 399 y 356 (indicadas por la numeración EU) son ambos Lys (en esta realización, en lugar de Glu en la posición de aminoácido 439 (indicada por la numeración EU), el aminoácido en la posición 360 puede ser Asp, el aminoácido en la posición 392 puede ser Asp o el aminoácido en la posición 439 puede ser Asp); un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 370 y 439 (indicadas por la numeración EU) son ambos Glu y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 357 y 356 (indicadas por la numeración EU) son ambos Lys; y
un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 409, 370 y 439 (indicadas por la numeración EU) son Asp, Glu y Glu, respectivamente, y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en las posiciones 399, 357 y 356 (indicadas por la numeración EU) son todos Lys (en esta realización, el aminoácido en la posición 370 puede no estar sustituido por Glu y, además, cuando el aminoácido en la posición 370 no está sustituido por Glu, el aminoácido en la posición 439 puede ser Asp en lugar de Glu o el aminoácido en la posición 439 puede ser Asp, en lugar de Glu en la posición de aminoácido 392).
En otra realización no limitante de la presente invención, se utiliza preferiblemente un par de polipéptidos que constituyen una región Fc, uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos en la posición 356 (indicada por la numeración EU) es Lys y el otro tiene una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido en las posiciones 435 y 439 (indicadas por la numeración EU) son Arg y Glu, respectivamente.
Se espera que estas moléculas de unión a antígeno de las realizaciones 1 a 3 tengan inmunogenicidad reducida y mejor permanencia en plasma en comparación con las moléculas de unión a antígeno capaces de formar el complejo tetramérico.
Se pueden aplicar métodos conocidos apropiados tales como mutagénesis dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) y PCR de extensión solapante para alterar los aminoácidos de regiones Fc. Asimismo, también se pueden utilizar diversos métodos conocidos como un método de alteración de aminoácidos para sustituir aminoácidos por aminoácidos distintos de los naturales (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por ejemplo, también es preferible utilizar un sistema de traducción sin células (Clover Direct (Protein Express)) que comprenda ARNt en los que un aminoácido no natural esté ligado a un ARNt supresor ámbar, que es complementario del codón de terminación UAG (codón ámbar).
En una realización de variantes de la presente invención, se ligan polinucleótidos que codifican moléculas de unión a antígeno que tienen una cadena pesada donde un polinucleótido que codifica una región Fc modificada para tener una mutación de aminoácidos como se ha descrito anteriormente en fase con un polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno descrita anteriormente cuya actividad de unión varía dependiendo de una condición seleccionada.
La presente invención proporciona métodos para producir moléculas de unión a antígeno, que comprenden recoger las moléculas de unión a antígeno de medios de cultivo de células en las que se han introducido vectores en los que un polinucleótido que codifica una región Fc está unido operativamente en fase con un polinucleótido que codifica un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión varía dependiendo de la condición de concentración de iones. Asimismo, la presente invención también proporciona métodos para producir moléculas de unión a antígeno, que comprende recoger las moléculas de unión a antígeno de medios de cultivo de células en las que se han introducido vectores construidos uniendo operativamente un polinucleótido que codifica un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión varía dependiendo de la condición de concentración de iones a un polinucleótido que codifica una región Fc que está previamente unida operativamente a un vector.
Composiciones farmacéuticas
Cuando se administra un anticuerpo neutralizante convencional contra un antígeno soluble, se espera que se prolongue la permanencia en plasma del antígeno mediante unión al anticuerpo. En general, los anticuerpos tienen una semivida larga (de una semana a tres semanas) mientras que la semivida del antígeno es, en general, corta (un día o menos). Al mismo tiempo, los antígenos unidos a anticuerpos tienen una semivida significativamente más larga en plasma en comparación con cuando los antígenos están presentes solos. Por este motivo, la administración de un anticuerpo neutralizante existente da lugar a un aumento de la concentración de antígeno en plasma. Se ha informado de casos de este tipo con diversos anticuerpos neutralizantes que se dirigen a antígenos solubles, incluyendo, por ejemplo, IL-6 (J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), beta amiloide (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1 (ArTh RITiS & RHEUMATISM (2006) 54, 2387-2392), hepcidina (AAPS J. (2010) 4, 646-657) y receptor de sIL-6 (Blood (2008) 112 (10), 3959-64). Se ha informado de que la administración de anticuerpos neutralizantes existentes aumenta la concentración de antígeno en plasma total hasta aproximadamente 10 a 1000 veces (el nivel de aumento varía dependiendo del antígeno) el valor inicial. En la presente memoria, la concentración total de antígeno en plasma se refiere a una concentración como la cantidad total de antígeno en plasma, es decir, la suma de las concentraciones de antígenos unidos a anticuerpos y no unidos a anticuerpos. Un aumento de la concentración de antígeno en plasma total es indeseable para dichos productos farmacéuticos de anticuerpos que se dirigen a un antígeno soluble. La razón es que la concentración de anticuerpo tiene que ser mayor que al menos la concentración de antígeno en plasma total para neutralizar el antígeno soluble. De manera específica, "la concentración de antígeno en plasma total aumenta de 10 a 1000 veces" significa que, para neutralizar el antígeno, la concentración de anticuerpo en plasma (es decir, dosis de anticuerpo) tiene que ser de 10 a 1000 veces mayor en comparación con cuando no se produce un aumento de la concentración de antígeno en plasma total. Por el contrario, si la concentración de antígeno en plasma total se puede reducir en 10 a 1000 veces en comparación con el anticuerpo neutralizante existente, la dosis de anticuerpo también se puede reducir en un grado similar. Por tanto, los anticuerpos capaces de disminuir la concentración de antígeno en plasma total eliminando el antígeno soluble del plasma son muy útiles en comparación con los anticuerpos neutralizantes existentes.
La presente invención no se limita a una teoría en particular, pero se puede explicar, por ejemplo, de la siguiente manera, por qué aumenta el número de antígenos a los que pueden unirse moléculas de unión a antígeno individuales y por qué se acelera la eliminación de antígenos del plasma cuando se administran moléculas de unión a antígeno que tienen un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la condición de concentración de iones de modo que la actividad de unión a antígeno en un intervalo de pH ácido es menor que en la condición de intervalo de pH neutro y, además, tienen un dominio de unión a FcRn tal como una región constante de anticuerpo que presenta la actividad de unión a FcRn humano en la condición de intervalo de pH neutro in vivo y se mejora la captación in vivo en células.
Por ejemplo, cuando se administra un anticuerpo que se une a un antígeno de membrana in vivo, después de unirse a un antígeno, el anticuerpo se incorpora, en un estado unido al antígeno, en el endosoma mediante internalización intracelular. A continuación, el anticuerpo se transfiere al lisosoma mientras permanece unido al antígeno y allí se degrada junto con el antígeno. La eliminación del plasma mediada por internalización se denomina eliminación dependiente de antígeno y se ha indicado para muchas moléculas de anticuerpos (Drug Discov Today (2006) 11 (1­ 2), 81-88). Cuando una sola molécula de anticuerpo IgG se une a antígenos de manera divalente, la molécula de anticuerpo individual se internaliza mientras permanece unida a los dos antígenos y se degrada en el lisosoma. En el caso de anticuerpos habituales, por tanto, una sola molécula de anticuerpo IgG no puede unirse a tres moléculas de antígeno o más. Por ejemplo, una sola molécula de anticuerpo IgG que tiene una actividad neutralizante no puede neutralizar tres moléculas de antígeno o más.
La permanencia en plasma de la molécula de IgG es relativamente larga (la eliminación es lenta) ya que el FcRn humano, que se conoce como un receptor de rescate para la molécula de IgG, actúa. Las moléculas de IgG incorporadas en endosomas por pinocitosis se unen en la condición ácida endosómica a FcRn humano expresado en endosomas. Las moléculas de IgG que no pueden unirse al FcRn humano se transfieren a lisosomas y se degradan allí. Al mismo tiempo, las moléculas de IgG unidas al FcRn humano se transfieren a la superficie celular. Las moléculas de IgG se disocian del FcRn humano en condiciones neutras en plasma y se reciclan de nuevo al plasma.
Como alternativa, cuando las moléculas de unión a antígeno son anticuerpos que se unen a un antígeno soluble, los anticuerpos administrados in vivo se unen a antígenos y después los anticuerpos se incorporan en células mientras permanecen unidos a los antígenos. La mayoría de los anticuerpos incorporados en células se unen a FcRn en el endosoma y después se transfieren a la superficie celular. Los anticuerpos se disocian del FcRn humano en condiciones neutras en plasma y se liberan al exterior de las células. Sin embargo, los anticuerpos que tienen dominios de unión a antígeno habituales cuya actividad de unión a antígeno no varía dependiendo de la condición de concentración de iones, tal como el pH, se liberan al exterior de las células mientras permanecen unidos a los antígenos y, por tanto, no pueden volver a unirse a un antígeno. Por tanto, como anticuerpos que se unen a antígenos de membrana, la molécula de anticuerpo IgG habitual individual cuya actividad de unión a antígeno no varía dependiendo de la condición de concentración de iones, tal como el pH, no puede unirse a tres moléculas de antígeno o más.
Los anticuerpos que se unen a antígenos de manera dependiente del pH, que se unen fuertemente a antígenos en la condición de intervalo de pH neutro en el plasma y se disocian de los antígenos en la condición de intervalo de pH ácido endosómico (anticuerpos que se unen a antígenos en la condición de intervalo de pH neutro y se disocian en una condición de intervalo de pH ácido), y anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio, que se unen fuertemente a antígenos en una condición de concentración alta de iones de calcio en el plasma y se disocian de antígenos en una condición de concentración baja de iones de calcio en el endosoma (anticuerpos que se unen a antígenos en una condición de concentración alta de iones de calcio y se disocian en una condición de concentración baja de iones de calcio) pueden disociarse del antígeno en el endosoma. Los anticuerpos que se unen a antígenos de manera dependiente del pH o de manera dependiente de la concentración de iones de calcio, cuando se reciclan al plasma mediante FcRn después de la disociación de los antígenos, puede volver a unirse a un antígeno. Por tanto, dicha molécula de anticuerpo individual puede unirse repetidamente a varias moléculas de antígeno. Al mismo tiempo, los antígenos unidos a moléculas de unión a antígeno se disocian del anticuerpo en el endosoma y se degradan en el lisosoma sin reciclarse al plasma. Al administrar dichas moléculas de unión a antígeno in vivo, la captación de antígeno en las células se acelera y es posible disminuir la concentración de antígeno en plasma.
La captación de antígenos con los que se unen moléculas de unión a antígeno en células se promueve adicionalmente al conferir la actividad de unión a FcRn humano en la condición de intervalo de pH neutro (pH 7,4) a anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente del pH, que se unen fuertemente a antígenos en la condición de intervalo de pH neutro en el plasma y se disocian de los antígenos en la condición de intervalo de pH ácido endosómico (anticuerpos que se unen a antígenos en la condición de intervalo de pH neutro y se disocian en una condición de intervalo de pH ácido), y anticuerpos que se unen a antígenos de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio, que se unen fuertemente a antígenos en una condición de concentración alta de iones de calcio en el plasma y se disocian de antígenos en una condición de concentración baja de iones de calcio en el endosoma (anticuerpos que se unen a antígenos en una condición de concentración alta de iones de calcio y se disocian en una condición de concentración baja de iones de calcio). De manera específica, al administrar dichas moléculas de unión a antígeno in vivo, la eliminación del antígeno se acelera y es posible reducir la concentración de antígeno en plasma. Se incorporan anticuerpos habituales que no tienen la capacidad de unirse a antígenos de una manera dependiente del pH o de una manera dependiente de la concentración de iones de calcio y complejos antígeno-anticuerpo de dichos anticuerpos a células mediante endocitosis inespecífica y se transportan a la superficie celular uniéndose a FcRn en la condición ácida endosómica. Se disocian de FcRn en condiciones neutras en la superficie celular y se reciclan al plasma. Por tanto, cuando un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera completamente dependiente del pH (que se une en la condición de intervalo de pH neutro y se disocia en una condición de intervalo de pH ácido) o de una manera completamente dependiente de la concentración de iones de calcio (que se une en una condición de concentración alta de iones de calcio y se disocia en una condición de concentración baja de iones de calcio) se une a un antígeno en el plasma y se disocia del antígeno en el endosoma, se considera que la velocidad de eliminación del antígeno es igual a la velocidad de captación en células del anticuerpo o del complejo de antígeno-anticuerpo por endocitosis inespecífica. Cuando la dependencia del pH o de la concentración de iones de calcio de la unión antígenoanticuerpo es insuficiente, los antígenos que no están disociados de los anticuerpos en el endosoma se reciclan, junto con los anticuerpos, al plasma. Por otro lado, cuando la dependencia del pH o de la concentración de iones de calcio es suficientemente fuerte, la etapa limitante de la velocidad de eliminación de antígenos es la captación celular por endocitosis inespecífica. Al mismo tiempo, FcRn transporta anticuerpos desde el endosoma a la superficie celular y se espera que una fracción de FcRn también se distribuya en la superficie celular.
En general, la inmunoglobulina de tipo IgG, que es una realización de moléculas de unión a antígeno, tiene poca actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro. Los presentes inventores concibieron que la inmunoglobulina de tipo IgG que tiene la actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro puede unirse a FcRn en la superficie celular y se incorpora en células de una manera dependiente de FcRn al unirse a FcRn en la superficie celular. La velocidad de captación celular mediada por FcRn es más rápida que la captación celular por endocitosis inespecífica. Por tanto, los presentes inventores sospecharon que la velocidad de eliminación de antígenos por moléculas de unión a antígeno se puede incrementar adicionalmente confiriendo la capacidad de unión de FcRn en el intervalo de pH neutro a moléculas de unión a antígeno. De manera específica, las moléculas de unión a antígeno que tienen la capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro suministran antígenos a las células más rápidamente que la inmunoglobulina de tipo IgG nativa; las moléculas se disocian de los antígenos en el endosoma y de nuevo se reciclan a la superficie celular o al plasma; y de nuevo se unen a los antígenos allí y se incorporan en células mediante FcRn. La velocidad de ciclado se puede acelerar aumentando la capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro, lo que da lugar a la aceleración de la eliminación de antígenos del plasma. Por otra parte, la velocidad de eliminación de antígenos del plasma puede acelerarse adicionalmente al reducir la actividad de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno en un pH ácido que en el intervalo de pH neutro. Además, se predice que el número de moléculas de antígeno a las que puede unirse una única molécula de unión a antígeno aumentará debido a un aumento del número de ciclos como resultado de la aceleración de la velocidad de ciclado. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención comprenden un dominio de unión a antígeno y un dominio de unión a FcRn. Dado que el dominio de unión a FcRn no afecta a la unión del antígeno y no depende del tipo de antígeno según el mecanismo descrito anteriormente, la captación de antígeno mediada por moléculas de unión a antígeno en células se puede mejorar para acelerar la velocidad de eliminación de antígenos al reducir la actividad de unión a antígeno (capacidad de unión) de una molécula de unión a antígeno de modo que sea menor en una condición de concentración de iones tal como un intervalo de pH ácido o una concentración baja de iones de calcio que en una condición de concentración de iones tal como un intervalo de pH neutro o una concentración alta de iones de calcio y/o al aumentar la actividad de unión a FcRn al pH plasmático. Por tanto, se espera que las moléculas de unión a antígeno de la presente invención presenten efectos más excelentes que los anticuerpos terapéuticos convencionales desde el punto de vista de la reducción de los efectos secundarios de los antígenos, aumento de la dosis de anticuerpos, mejora de la dinámica in vivo de los anticuerpos, etc.
La fig. 1 muestra un mecanismo en el que se eliminan antígenos solubles del plasma mediante la administración de un anticuerpo de unión a antígeno dependiente del pH que tiene mayor actividad de unión a FcRn a pH neutro en comparación con un anticuerpo neutralizante convencional. Después de unirse al antígeno soluble en plasma, el anticuerpo neutralizante existente que no tiene la capacidad de unión a antígeno dependiente del pH se incorpora lentamente en células mediante interacción inespecífica con las células. El complejo entre el anticuerpo neutralizante y el antígeno soluble incorporado en la célula se transfiere al endosoma ácido y después se recicla al plasma mediante FcRn. Al mismo tiempo, el anticuerpo de unión a antígeno dependiente de pH que tiene la actividad de unión a FcRn aumentada en la condición neutra se incorpora rápidamente, después de unirse al antígeno soluble en plasma, en células que expresan FcRn en su membrana celular. A continuación, el antígeno soluble unido al anticuerpo de unión a antígeno dependiente del pH se disocia del anticuerpo en el endosoma ácido debido a la capacidad de unión dependiente del pH. El antígeno soluble disociado del anticuerpo se transfiere al lisosoma y se degrada mediante actividad proteolítica. Al mismo tiempo, el anticuerpo disociado del antígeno soluble se recicla a la membrana celular y después se libera de nuevo al plasma. El anticuerpo libre, reciclado como se ha descrito anteriormente, puede volver a unirse a otros antígenos solubles. Al repetir dicho ciclo: la captación mediada por FcRn en células; la disociación y degradación del antígeno soluble; y el reciclaje de anticuerpos, dichos anticuerpos de unión a antígeno dependientes del pH como se ha descrito anteriormente que tienen la actividad de unión a FcRn aumentada en la condición neutra pueden transferir una gran cantidad de antígeno soluble al lisosoma y de este modo disminuir la concentración de antígeno en plasma total.
De manera específica, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas de unión a antígeno de la presente invención, moléculas de unión a antígeno producidas mediante métodos de alteración de la presente invención o moléculas de unión a antígeno producidas mediante métodos de producción de la presente invención. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención o las moléculas de unión a antígeno producidas mediante los métodos de producción de la presente invención son útiles como composiciones farmacéuticas ya que, cuando se administran, tienen el fuerte efecto de reducir la concentración de antígeno en plasma en comparación con las moléculas de unión a antígeno habituales y presentan la respuesta inmunitaria in vivo, farmacocinética y otras mejoradas en animales a los que se administran las moléculas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender vehículos farmacéuticamente aceptables.
En la presente invención, las composiciones farmacéuticas se refieren en general a agentes para tratar o prevenir, o analizar y diagnosticar enfermedades.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar por vía parenteral, en forma de inyecciones de soluciones o suspensiones estériles incluyendo agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, dichas composiciones se pueden formular mezclando en forma de dosis unitaria necesaria en la práctica de fabricación de medicamentos generalmente aprobada, mediante la combinación apropiada con vehículos o medios farmacológicamente aceptables, específicamente con agua esteril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, emulsionante, suspensión, tensioactivo, estabilizante, agente aromatizante, excipiente, vehículo, conservante, aglutinante o similares. En dichas formulaciones, la cantidad de principio activo se ajusta para obtener una cantidad apropiada en un intervalo predeterminado.
Se pueden formular composiciones estériles para inyección utilizando vehículos tales como agua destilada para inyección, según la práctica de formulación convencional.
Las soluciones acuosas para inyección incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen dextrosa u otros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). También es posible utilizar en combinación solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcoholes (etanol y similares), polialcoholes (propilenglicol, polietilenglicol y similares), tensioactivos no iónicos (polisorbato 80(TM), HCO-50 y similares).
Los aceites incluyen aceite de sésamo y aceites de soja. Se pueden usar benzoato de bencilo y/o alcohol bencílico en combinación como solubilizantes. También es posible combinar tampones (por ejemplo, tampón de fosfato y tampón de acetato de sodio), agentes calmantes (por ejemplo, hidrocloruro de procaína), estabilizantes (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol) y/o antioxidantes. Se llenan ampollas apropiadas con las inyecciones preparadas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran preferiblemente por vía parenteral. Por ejemplo, las composiciones se administran en forma farmacéutica para inyecciones, administración transnasal, administración transpulmonar o administración transdérmica. Por ejemplo, se pueden administrar se forma sistémica o local mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea o similares.
Los métodos de administración se pueden seleccionar de forma apropiada teniendo en cuenta la edad y los síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene una molécula de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, de 0,0001 a 1000 mg/kg para cada administración. Como alternativa, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0,001 a 100.000 mg por paciente. Sin embargo, la presente invención no está limitada por los valores numéricos descritos anteriormente. Las dosis y los métodos de administración varían según el peso del paciente, la edad, los síntomas y similares. Los expertos en la técnica pueden establecer dosis y métodos de administración apropiados teniendo en cuenta los factores descritos anteriormente.
Asimismo, la presente invención proporciona kits para su uso en los métodos de la presente invención, que comprenden al menos una molécula de unión a antígeno de la presente invención. Además de lo anterior, se pueden empaquetar vehículos, medios, manuales de instrucciones que describen el método de uso y similares farmacéuticamente aceptables en los equipos.
Asimismo, la presente invención se refiere a agentes para mejorar la farmacocinética de moléculas de unión a antígeno o agentes para reducir la inmunogenicidad de moléculas de unión a antígeno, que comprenden como principio activo una molécula de unión a antígeno de la presente invención o una molécula de unión a antígeno producida mediante el método de producción de la presente invención.
La presente invención también se refiere a métodos para tratar enfermedades inmunitarias inflamatorias, que comprenden la etapa de administrar a sujetos (sujetos de prueba) una molécula de unión a antígeno de la presente invención o una molécula de unión a antígeno producida mediante el método de producción de la presente invención.
La presente invención también se refiere al uso de moléculas de unión a antígeno de la presente invención o moléculas de unión a antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención en la producción de agentes para mejorar la farmacocinética de moléculas de unión a antígeno o agentes para reducir la inmunogenicidad de moléculas de unión a antígeno.
Además, la presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno de la presente invención y moléculas de unión a antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención para su uso en los métodos de la presente invención.
Los aminoácidos contenidos en las secuencias de aminoácidos de la presente invención pueden modificarse postraduccionalmente (por ejemplo, los expertos en la técnica conocen bien la modificación de una glutamina N-terminal a un ácido piroglutámico mediante piroglutamilación). Naturalmente, dichos aminoácidos modificados postraduccionalmente se incluyen en las secuencias de aminoácidos de la presente invención.
[Ejemplos]
A continuación en la presente memoria, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos, pero no debe interpretarse como limitada a los mismos.
[Ejemplo 1] Efecto de potenciar la unión a FcRn humano en condiciones neutras sobre la permanencia en plasma y la inmunogenicidad del anticuerpo humano de unión al receptor de IL-6 humano dependiente del pH
Es importante que un dominio de unión a FcRn, tal como la región Fc de moléculas de unión a antígeno tales como anticuerpos que interactúa con FcRn (Nat. Rev. Immunol. (2007) 7 (9), 715-25), tenga actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro para eliminar el antígeno soluble del plasma. Como se indica en el ejemplo de referencia 5, se ha realizado investigación sobre un mutante del dominio de unión a FcRn (sustitución de aminoácidos) que tiene actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro del dominio de unión a FcRn. Se evaluó la actividad de unión de F1 a F600 que se desarrollaron como mutantes de Fc a FcRn en la región de pH neutro y se confirmó que la eliminación del antígeno del plasma se acelera al aumentar la actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro. Para desarrollar estos mutantes de Fc como productos farmacéuticos, además de tener propiedades farmacológicas preferibles (tales como aceleración de la eliminación de antígenos del plasma al mejorar la unión a FcRn), también es preferible tener estabilidad y pureza superiores de moléculas de unión a antígeno, permanencia en plasma superior de moléculas de unión a antígeno en el cuerpo y baja inmunogenicidad.
Se sabe que la permanencia de anticuerpos en plasma empeora como resultado de la unión a FcRn en condiciones neutras. Si un anticuerpo termina unido a FcRn en condiciones neutras, incluso si el anticuerpo regresa a la superficie celular al unirse a FcRn en condiciones ácidas en endosomas, un anticuerpo IgG no se recicla al plasma a menos que el anticuerpo IgG se disocie de FcRn en el plasma en condiciones neutras, provocando de este modo, por el contrario, que se altere la permanencia en plasma. Por ejemplo, se ha informado de que la permanencia de anticuerpos en plasma empeora en el caso de la administración de anticuerpos a ratones para los que se ha observado unión a FcRn de ratón en condiciones neutras (pH 7,4) como resultado de la introducción de una sustitución de aminoácidos en IgG1 (documento no de patente 10). Por otro lado, sin embargo, también se ha informado de que en el caso de que se haya administrado un anticuerpo a monos cinomolgos en los que se ha observado unión a FcRn humano en condiciones neutras (pH 7,4), no hubo mejora en la permanencia de anticuerpos en plasma y no se observaron cambios en la permanencia en plasma (documentos no de patente 10, 11 y 12).
Además, se ha informado de que FcRn se expresa en células presentadoras de antígenos y participa en la presentación de antígenos. En un informe que describe la evaluación de la inmunogenicidad de una proteína (denominada en lo sucesivo en la presente memoria MBP-Fc) obtenida fusionando la región Fc de IgG1 de ratón con la proteína básica de mielina (MBP), aunque no es una molécula de unión a antígeno, los linfocitos T que reaccionan específicamente con MBP-Fc experimentan activación y proliferación como resultado del cultivo en presencia de MBP-Fc. Se sabe que la activación de linfocitos T mejora in vitro al aumentar la incorporación en células presentadoras de antígenos mediada por FcRn expresado en células presentadoras de antígenos al añadir una modificación a la región Fc de MBP-Fc que provoca un aumento de la unión a FcRn. Sin embargo, ya que la permanencia en plasma empeora como resultado de añadir una modificación que provoca un aumento de la unión a FcRn, se ha informado de que, por el contrario, la activación de linfocitos T disminuye in vivo (documento no de patente 43).
De esta manera, el efecto de potenciar la unión a FcRn en condiciones neutras sobre la permanencia en plasma y la inmunogenicidad de las moléculas de unión a antígeno no se ha investigado adecuadamente. En el caso de desarrollar moléculas de unión a antígeno como productos farmacéuticos, la permanencia en plasma de estas moléculas de unión a antígeno es preferiblemente lo más larga posible y la inmunogenicidad es preferiblemente lo más baja posible.
(1-1) Producción de anticuerpos humanos de unión al receptor de IL-6 humano
Por lo tanto, con el fin de evaluar la permanencia en plasma de moléculas de unión a antígeno que contienen un dominio de unión a FcRn que tiene la capacidad de unirse a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y evaluar la inmunogenicidad de esas moléculas de unión a antígeno, se produjeron anticuerpos humanos que se unen al receptor de IL-6 humano que tienen actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro en forma de Fv4-IgG1 compuesto de VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36), Fv4-IgG1-F1 compuesto de VH3-IgG1-F1 (SEQ ID NO: 37) y VL3-CK, Fv4-IgG1-F157 compuesto de VH3-IgG1-F157 (SEQ ID NO: 38) y VL3-CK, Fv4-IgG1-F20 compuesto de VH3-IgGl-F20 (SEQ ID NO: 39) y VL3-CK, y Fv4-IgG1-F21 compuesto de VH3-IgGl-F21 (SEQ ID NO: 40) y VL3-CK según los métodos mostrados en el ejemplo de referencia 1 y el ejemplo de referencia 2.
(1-2) Análisis cinético de la unión a FcRn de ratón
Se produjeron anticuerpos que contenían VH3-IgG1 o VH3-IgG1-F1 para la cadena pesada y L(TS)-CK (SEQ ID NO: 41) para la cadena ligera utilizando el método mostrado en el ejemplo de referencia 2 y se evaluó la actividad de unión a FcRn de ratón de la manera descrita a continuación.
La unión entre el anticuerpo y el FcRn de ratón se analizó cinéticamente utilizando Biacore T100 (GE Healthcare). Se inmovilizó una cantidad apropiada de proteína L (ACTIGEN) en el chip sensor CM4 (GE Healthcare) mediante el método de acoplamiento de amino y se permitió que el chip capturara un anticuerpo de interés. Después, se inyectaron soluciones de FcRn diluidas y tampón de ejecución (como solución de referencia) para permitir que el FcRn de ratón interactuara con el anticuerpo capturado en el chip sensor. El tampón de ejecución utilizado contiene 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCl y 0,05 % (p/v) de Tween20 (pH 7,4). Se diluyó FcRn utilizando cada tampón. El chip sensor se regeneró utilizando 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5). Los ensayos se llevaron a cabo exclusivamente a 25 grados C. La constante de velocidad de asociación ka (1/Ms) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), ambas de las cuales son parámetros cinéticos, se calcularon basándose en los sensogramas obtenidos en los ensayos y a partir de estos valores se determinó la KD (M) de cada anticuerpo para FcRn de ratón. Cada parámetro se calculó utilizando el programa informático de evaluación Biacore T100 (GE Healthcare).
Como resultado, aunque no se detectó la KD(M) de IgG1, la KD(M) de la IgG1-F1 producida fue 1,06E-06 (M). Esto indicó que la actividad de unión de la IgG1-F1 producida a FcRn de ratón aumenta en condiciones de la región de pH neutro (pH 7,4).
(1-3) Estudio de PK in vivo con ratones normales
Se realizó un estudio de PK utilizando el método mostrado a continuación utilizando ratones normales que tienen los anticuerpos humanos que se unen al receptor de IL-6 humano dependientes del pH producidos, Fv4-IgG1 y Fv4-IgG1-F1. El anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano se administró a 1 mg/kg en una sola administración a una vena caudal o debajo de la piel del lomo de ratones normales (ratón C57BL/6J, Charles River Japan). Se recogió sangre a los 5 minutos, 7 horas y 1,2, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. El plasma se obtuvo centrifugando inmediatamente la sangre recogida durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
(1-4) Medición de la concentración de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en plasma mediante ELISA
La concentración de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en plasma de ratón se midió mediante ELISA. En primer lugar, se distribuyó un fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico de cadena y) (SIGMA) en una placa Nunc-Immuno, MaxiSoup (Nalge Nunc International) seguido de permitir que repose sin alteraciones durante un noche a 4 °C para producir una placa de fase sólida anti-IgG humana. Se prepararon muestras de la curva de calibración que contenían 0,8, 0,4, 0,2, 0,1,0,05, 0,025 y 0,0125 Mg/ml de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en concentración en plasma y muestras de medición de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Después se permitió que las mezclas obtenidas añadiendo 200 |M de receptor de IL-6 humano soluble 20 ng/ml a 100 |M de las muestras de la curva de calibración y las muestras de medición de plasma reposaran sin alteraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la placa de fase sólida anti-IgG humana en la que se habían distribuido las mezclas en cada uno de los pocilios de la misma se dejó reposar adicionalmente sin alteraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se llevó a cabo la reacción cromogénica de un líquido de reacción obtenido tras una hora de reacción con un anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) a temperatura ambiente y una hora de reacción con Estreptavidina-PoliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) a temperatura ambiente utilizando como sustrato el sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories). Después de detenerse la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm del líquido de reacción de cada pocillo con un lector de microplacas. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos en el plasma de ratón a partir de los valores de absorbancia de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Las concentraciones de los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH en plasma después de la administración intravenosa o subcutánea de los anticuerpos humanos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH a ratones normales se muestran en la fig. 2. En función de los resultados de la fig. 2, en comparación con Fv4-IgG1 administrado por vía intravenosa, se mostró que la permanencia en plasma empeora con la administración intravenosa de Fv4-IgG1-F1, para lo que se potenció la unión a FcRn de ratón en condiciones neutras. Por otro lado, mientras que el Fv4-IgG1 administrado por vía subcutánea demostró permanencia en plasma comparable a la del administrado por vía intravenosa, en el caso de Fv4-IgG1-F1 administrado por vía subcutánea, 7 días después de la administración, se observó una disminución repentina de la concentración en plasma que se creyó que se debía a la producción de anticuerpo anti-Fv4-IgG1-F1 de ratón, y el día 14 después de la administración no se detectó Fv4-IgG1-F1 en plasma. A partir de este resultado, se confirmó que la permanencia en plasma y la inmunogenicidad empeoraban como resultado de mejorar la unión de moléculas de unión a antígeno a FcRn en condiciones neutras.
[Ejemplo 2] Producción de anticuerpo de ratón de unión al receptor de IL-6 humano que tiene actividad de unión al FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro
Se produjo anticuerpo de ratón que tenía actividad de unión al FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro según el método mostrado a continuación.
(2-1) Producción de anticuerpo de ratón de unión al receptor de IL-6 humano
La secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de ratón que tiene la capacidad de unirse al IL-6R humano, se utilizó PM-1 de ratón (Sato, K., etal., Cancer Res. (1993) 53 (4), 851-856) para la región variable del anticuerpo de ratón. En las siguientes descripciones, la región variable de cadena pesada de PM-1 de ratón se denomina mPM1H (SEQ ID NO: 42), mientras que la región variable de cadena ligera se denomina mPM1 L (SEQ ID NO: 43).
Además, se utilizó IgG1 de ratón de origen natural (SEQ ID NO: 44, denominado en lo sucesivo en la presente memoria mIgG1) para la región constante de cadena pesada, mientras que se utilizó kappa de ratón de origen natural (SEQ ID NO: 45, denominado en lo sucesivo en la presente memoria mk1) para la región constante de cadena ligera.
Se produjo un vector de expresión que tiene las secuencias de bases de mPM1 H-mIgG1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 46) y mPM1 L-mk1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 47) según el método del ejemplo de referencia 1. Además, se produjo mPM1-mIgG1, que es un anticuerpo de ratón de unión a IL-6R humano compuesto de mPM1H-mIgG1 y mPM1 L-mk1, según el método del ejemplo de referencia 2.
(2-2) Producción de anticuerpo mPM1 que tiene la capacidad de unirse al FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro
El mPM1-mIgG1 producido es un anticuerpo de ratón que contiene una región Fc de ratón de origen natural y no tiene actividad de unión al FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro. Por lo tanto, se introdujo una modificación de aminoácidos en la región constante de cadena pesada de mPM1-mIgG1 con el fin de transmitir actividad de unión al FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro.
Más específicamente, se produjo mPH1H-mIgG1-mF3 (SEQ ID NO: 48) añadiendo una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Thr por Tyr en la posición 252 de mPH1 H-mIgG1 como se indica mediante la numeración EU, una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Thr por Glu en la posición 256 (numeración EU), una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir His por Lys en la posición 433 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Asn por Phe en la posición 434 (numeración EU).
De manera análoga, se produjo mPH1H-mIgG1-mF14 (SEQ ID NO: 49) al añadir una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Thr por Tyr en la posición 252 (numeración EU) de mPH1 H-mIgG1, una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Thr por Glu en la posición 256 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir His por Lys en la posición 433 (numeración EU).
Por otra parte, se produjo mPM1H-mIgG1-mF38 (SEQ ID NO: 50) al añadir una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Thr por Tyr en la posición 252 (numeración EU) de mPH1 H-mIgG1, una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Thr por Glu en la posición 256 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Asn por Trp en la posición 434 (numeración EU).
Como anticuerpo IgG1 de ratón que tiene la capacidad de unirse al FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro, se produjo mPM1-mIgG1-mF3 que está compuesto de mPM1H-mIgG1-mF3 y mPM1L-mk1 utilizando el método del ejemplo de referencia 2.
(2-3) Confirmación de la actividad de unión al FcRn de ratón con Biacore
Se produjeron anticuerpos que contenían mPM1-mIgG1 o mPM1-mIgG1-mF3 para la cadena pesada y L(TS)-CK (SEQ ID NO: 41) para la cadena ligera y se midió la actividad de unión de estos anticuerpos al FcRn de ratón a pH 7,0 (constante de disociación KD). Los resultados se muestran en la tabla 5 a continuación.
[Tabla 5]
Figure imgf000089_0001
[Ejemplo 3] Experimento de unión sobre la unión de moléculas de unión a antígeno que tienen la región Fc a FcRn y FcyR
En el ejemplo 1, se confirmó que la permanencia en plasma y la inmunogenicidad empeoraban como resultado de mejorar la unión de moléculas de unión a antígeno a FcRn en condiciones neutras. Ya que la IgG1 de origen natural no tiene actividad de unión al FcRn humano en la región neutra, se creyó que la permanencia en plasma y la inmunogenicidad empeoraban como resultado de transmitir la capacidad de unirse a FcRn en condiciones neutras.
(3-1) Dominio de unión a FcRn y dominio de unión a FcyR
Un dominio de unión a FcRn y un dominio de unión a FcyR están presentes en la región Fc del anticuerpo. El dominio de unión a FcRn está presente en dos ubicaciones en la región Fc y se ha informado previamente de que dos moléculas de FcRn pueden unirse simultáneamente a la región Fc de una sola molécula de anticuerpo (Nature (1994) 372 (6504), 379-383). Por otro lado, aunque un dominio de unión a FcyR también está presente en dos ubicaciones en la región Fc, se cree que dos moléculas de FcyR no pueden unirse simultáneamente. Esto se debe a que la segunda molécula de FcyR no puede unirse debido a un cambio estructural en la región Fc que se produce por la unión de la primera molécula de FcyR a la región Fc (J. Biol. Chem. (2001) 276 (19), 16469-16477).
Como se ha descrito anteriormente, el FcyR activo se expresa en las membranas celulares de numerosas células inmunitarias, tales como células dendríticas, linfocitos NK, macrófagos, neutrófilos y adipocitos. Por otra parte, en seres humanos, se ha informado de que el FcRn se expresa en células inmunitarias tales como células presentadoras de antígenos, por ejemplo, células dendríticas, macrófagos y monocitos (J. Immunol. (2001) 166 (5), 3266-3276). Ya que la IgG1 normal de origen natural no puede unirse a FcRn en la región de pH neutro y solo puede unirse a FcyR, la IgG1 de origen natural se une a células presentadoras de antígenos formando un complejo binario de FcYR/IgG1. Los sitios de fosforilación están presentes en los dominios intracelulares de FcyR y FcRn. Normalmente, se produce fosforilación de dominios intracelulares de receptores expresados en superficies celulares mediante conjugación del receptor y los receptores se internalizan como resultado de esa fosforilación. Incluso si la IgG1 de origen natural forma un complejo binario de FcYR/IgG1 en células presentadoras de antígenos, no se produce conjugación del dominio intracelular de FcyR. Sin embargo, cuando hipotéticamente una molécula de IgG que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro forma un complejo que contiene cuatro componentes: FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG, como resultado, puede inducirse la internalización de un heterocomplejo que contiene cuatro componentes que consisten en FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG, ya que se produce conjugación de tres dominios intracelulares de FcyR y FcRn. Se cree que la formación de un heterocomplejo que contiene cuatro componentes que consisten en FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG se produce en células presentadoras de antígenos que expresan tanto FcyR como FcRn, y como resultado de ello, se creyó que la permanencia en plasma de moléculas de anticuerpos incorporadas en células presentadoras de antígenos empeoraba y también se consideró la posibilidad de empeoramiento de la inmunogenicidad.
Sin embargo, no ha habido informes que verifiquen la manera en que las moléculas de unión a antígeno que contienen un dominio de unión a FcRn, tal como una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro, se unen a células inmunitarias tales como las células presentadoras de antígenos que expresan FcyR y FcRn juntos.
Si se puede formar o no un complejo cuaternario de FcYR/dos moléculas de FcRn/IgG se puede determinar si una molécula de unión a antígeno que contiene una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro es capaz o no de unirse simultáneamente a FcyR y FcRn. Por lo tanto, se realizó un experimento de unión simultánea a FcRn y FcyR mediante una región Fc contenida en una molécula de unión a antígeno según el método indicado a continuación.
(3-2) Evaluación de la unión simultánea a FcRn y FcyR utilizando Biacore
Se evaluó si el FcRn humano o de ratón y los FcyR humanos o de ratón se unen o no simultáneamente a una molécula de unión a antígeno utilizando el sistema Biacore T100 o T200 (GE Healthcare). La molécula de unión a antígeno que se está probando fue capturada por FcRn humano o de ratón inmovilizado en el chip sensor CM4 (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina. A continuación, se inyectaron FcyR humanos o de ratón diluidos y un tampón de ejecución utilizado como blanco para permitir que los FcyR humanos o de ratón interactuaran con la molécula de unión a antígeno unida a FcRn en el chip sensor. También se utilizó un tampón que consistía en fosfato de sodio 50 mmol/l, NaCl 150 mmol/l y Tween 20 al 0,05 % (p/v) (pH 7,4) para el tampón de ejecución y este tampón también se utilizó para diluir los FcyR. Se utilizó T ris-HCl 10 mmol/l (pH 9,5) para regenerar el chip sensor. Todas las medidas de unión se llevaron a cabo a 25 °C.
(3-3) Experimento de unión simultánea en IgG humana, FcRn humano, FcvR humano o FcvR de ratón
Se realizó una evaluación de si Fv4-IgG1-F157 producido en el ejemplo 1, que es un anticuerpo humano que tiene la capacidad de unirse al FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro, se une o no a diversos tipos de FcyR humano o diversos tipos de FcyR de ratón mientras que simultáneamente se une a FcRn humano.
El resultado mostró que Fv4-IgG1-F157 podía unirse a FcvRIa humano, FcvRIIa(R), FcvRIIa(H), FcvRIIb y FcvRIIIa(F) simultáneamente con la unión a FcRn humano (figs. 3, 4, 5, 6 y 7). Además, se mostró que Fv4-IgG1-F157 puede unirse a FcyRI, FcvRIIb, FcyRIII y FcyRIV de ratón simultáneamente con la unión a FcRn humano (figs. 8, 9, 10 y 11).
De acuerdo con lo anterior, se mostró que los anticuerpos humanos que tienen actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro pueden unirse a diversos tipos de FcyR humano y a diversos tipos de FcyR de ratón tales como FcvRIa, FcvRIIa(R), FcvRIIa(H), FcvRIIb y FcvRIIIa(F) humanos así como FcyRI, FcvRIIb, FcyRIII y FcyRIV de ratón simultáneamente con la unión a FcRn humano.
(3-4) Experimento de unión simultánea en IgG humana, FcRn de ratón y FcvR de ratón
Se realizó una evaluación de si Fv4-IgG1-F20 producido en el ejemplo 1, que es un anticuerpo humano que tiene actividad de unión a FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro, se une a diversos tipos de FcyR de ratón simultáneamente con la unión a FcRn de ratón.
El resultado mostró que Fv4-IgG1-F20 podía unirse a FcyRI, FcvRIIb, FcyRIII y FcyRIV de ratón simultáneamente con la unión a FcRn de ratón (fig. 12).
(3-5) Experimento de unión simultánea en IgG de ratón, FcRn de ratón y FcvR de ratón
Se realizó una evaluación de si mPM1-mIgG1-mF3 producido en el ejemplo 2, que es un anticuerpo de ratón que tiene actividad de unión a FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro, se une a diversos tipos de FcyR de ratón simultáneamente con la unión a FcRn de ratón.
El resultado mostró que mPM1-mIgG1-mF3 podía unirse a FcvRIIb y FcyRIII de ratón simultáneamente con la unión a FcRn de ratón (fig. 13). Cuando se valora a partir del informe de que un anticuerpo IgG1 de ratón no tiene la capacidad de unirse a FcyRI y FcyRIV de ratón (J. Immunol. (2011) 187 (4), 1754-1763), el resultado de que no se confirmó la unión a FcyRI y FcyRIV de ratón se considera un resultado razonable.
En función de estos hallazgos, se mostró que los anticuerpos humanos y los anticuerpos de ratón que tienen actividad de unión a FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro también pueden unirse a diversos tipos de FcyR de ratón simultáneamente con la unión a FcRn de ratón.
El hallazgo anterior indica la posibilidad de formación de un heterocomplejo que comprende una molécula de Fc, dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR sin ninguna interferencia mutua, aunque una región de unión a FcRn y una región de unión a FcyR están presentes en la región Fc de IgG humana y de ratón.
Esta propiedad de la región Fc de anticuerpo de poder formar dicho heterocomplejo no se ha indicado anteriormente y se determinó aquí por primera vez. Como se ha descrito anteriormente, se expresan diversos tipos de FcyR y FcRn activos en células presentadoras de antígenos y se sugiere que la formación de este tipo de complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos por moléculas de unión a antígenos mejora la afinidad por moléculas presentadoras de antígenos promoviendo al mismo tiempo además la incorporación en células presentadoras de antígenos mediante la mejora de señales de internalización a través de la conjugación del dominio intracelular. En general, las moléculas de unión a antígeno incorporadas en células presentadoras de antígenos se degradan en lisosomas dentro de las células presentadoras de antígenos y se presentan después a linfocitos T.
Concretamente, las moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro forman un heterocomplejo que contiene cuatro componentes, incluyendo una molécula de FcyR activo y dos moléculas de FcRn, y se cree que esto da lugar a un aumento de la incorporación en células presentadoras de antígenos, empeorando de este modo la permanencia en plasma y empeorando adicionalmente la inmunogenicidad.
En consecuencia, en el caso de introducir una mutación en una molécula de unión a antígeno que tiene actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro, producir una molécula de unión a antígeno en la que ha disminuido la capacidad de formar dicho complejo cuaternario y administrar esa molécula de unión a antígeno en el cuerpo, la permanencia en plasma de esa molécula de unión a antígeno mejora y se puede inhibir la inducción de una respuesta inmunitaria por parte del cuerpo (es decir, se puede disminuir la inmunogenicidad). Los ejemplos de realizaciones preferibles de moléculas de unión a antígeno incorporadas en células sin formar dicho complejo incluyen los tres tipos mostrados a continuación.
(Realización 1) Moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR activo es menor que la actividad de unión del dominio de unión a FcyR nativo.
Las moléculas de unión a antígeno de la realización 1 forman un complejo que contiene tres componentes al unirse a dos moléculas de FcRn, pero no forman un complejo que contenga FcyR activo.
(Realización 2) Moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y tienen actividad de unión selectiva a FcyR inhibidor
Las moléculas de unión a antígeno de la realización 2 pueden formar un complejo que contiene cuatro componentes uniéndose a dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR inhibidor. Sin embargo, ya que una molécula de unión a antígeno solo puede unirse a una molécula de FcyR, una sola molécula de unión a antígeno es incapaz de unirse a otro FcyR activo mientras está unido al FcyR inhibidor. Por otra parte, se informa de que las moléculas de unión a antígeno que se incorporan en células mientras aún están unidas al FcyR inhibidor se reciclan en la membrana celular para evitar que se degraden dentro de las células (Immunity (2005) 23, 503-514). Concretamente, se cree que las moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión selectiva al FcyR inhibidor son incapaces de formar un complejo que contenga FcyR activo que provoque una respuesta inmunitaria.
(Realización 3) Moléculas de unión a antígeno en las que solo uno de los dos polipéptidos que componen el dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro mientras que el otro no tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de región de pH neutro
Aunque las moléculas de unión a antígeno de la realización 3 pueden formar un complejo ternario uniéndose a una molécula de FcRn y una molécula de FcyR, no forman un heterocomplejo que contenga cuatro componentes, incluyendo dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR.
Se espera que las moléculas de unión a antígeno de las realizaciones 1 a 3 puedan mejorar la permanencia en plasma y reducir la inmunogenicidad en comparación con las moléculas de unión a antígeno que son capaces de formar complejos que contienen cuatro componentes incluyendo dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR.
[Ejemplo 4] Evaluación de la permanencia en plasma de anticuerpos humanos que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR humano y de ratón es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo
(4-1) Producción de anticuerpo cuya actividad de unión a FcvR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcvR nativo y que se une al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente del pH
Las moléculas de unión a antígeno de la realización 1 entre las tres realizaciones mostradas en el ejemplo 3, concretamente moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR activo es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo, se produjeron de la manera descrita a continuación.
Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F157 producidos en el ejemplo 1 son anticuerpos que tienen actividad de unión al FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y se unen al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente del pH. Se produjeron variantes en las que la unión a FcyR de ratón se redujo mediante una sustitución de aminoácidos en la que Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) en las secuencias de aminoácidos de las mismas. Más específicamente, se produjo VH3-IgG1-F140 (SEQ ID NO: 51) en el que Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F21. Además, se produjo VH3-IgG1-F424 (SEQ ID NO: 52) en el que Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F157.
Se produjeron Fv4-IgG1-F140 y Fv4-IgG1-F424 que contenían estas cadenas pesadas y la cadena ligera de VL3-CK utilizando el método del ejemplo de referencia 2.
(4-2) Confirmación de la actividad de unión a FcRn humano y FcvR de ratón
Se midieron la actividad de unión (constante de disociación KD) a FcRn humano a pH 7,0 y actividad de unión a FcyR de ratón a pH 7,4 de anticuerpos que contienen el VH3-IgG1-F21, VH3-IgG1-F140, VH3-IgG1-F157 o VH3-IgG1-F424 producido para la cadena pesada y L(TS)-CK para la cadena ligera utilizando el método mostrado a continuación.
(4-3) Análisis cinético de la unión a FcRn humano
El análisis acinético de la unión entre el FcRn humano y los anticuerpos mencionados anteriormente se llevó a cabo utilizando Biacore T100 o T200 (GE Healthcare). Los anticuerpos que se estaban probando se capturaron en el chip sensor CM4 (GE Healthcare) en el que se inmovilizó adecuadamente una cantidad adecuada de proteína L (ACTIGEN) mediante acoplamiento de amina. A continuación, se inyectaron FcRn humano diluido y un tampón de ejecución utilizado como blanco para permitir que el FcRn humano interactuara con el anticuerpo capturado en el chip sensor. También se utilizó un tampón que consistía en fosfato de sodio 50 mmol/l, NaCl 150 mmol/l y Tween 20 al 0,05 % (p/v) (pH 7,0 o pH 7,4) para el tampón de ejecución y cada tampón también se utilizó para diluir el FcRn humano. Se utilizó glicina-HCl 10 mmol/l (pH 1,5) para regenerar el chip sensor. Todas las medidas de unión se llevaron a cabo a 25 °C. Se calculó la Kd(M) de cada anticuerpo para FcRn humano se calculó en función de los parámetros cinéticos, es decir, la constante de velocidad de asociación ka (1/Ms) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s) calculadas a partir de un sensorgrama obtenido por la medición. Se utilizó el software de evaluación Biacore T100 o T200 (GE Healthcare) para calcular cada parámetro.
Los resultados se muestran en la tabla 6 a continuación.
[Tabla 6]
Figure imgf000092_0001
Se midió la actividad de unión a FcyR de ratón a pH 7,4 utilizando el método mostrado a continuación.
(4-4) Evaluación de la actividad de unión a FcvR de ratón
Se evaluó la actividad de unión entre los anticuerpos y FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcyRIV de ratón (R&D Systems, Sino Biological) (en lo sucesivo en la presente memoria denominados FcyR de ratón) utilizando Biacore T100 o T200 (GE Healthcare). Los anticuerpos que se estaban probando fueron capturados por la proteína L (ACTIGEN) que se inmovilizó en cantidades adecuadas en el chip sensor CM4 (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina. A continuación, se inyectaron los FcyR de ratón diluidos y un tampón de ejecución utilizado como blanco para permitir la interacción con el anticuerpo capturado en el chip sensor. También se utilizó un tampón que consistía en ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l y Tween 20 al 0,05 % (p/v) (pH 7,4) para el tampón de ejecución y este tampón también se utilizó para diluir los FcyR de ratón. Se utilizó glicina-HCl 10 mmol/l (pH 1,5) para regenerar el chip sensor. Todas las medidas se llevaron a cabo a 25 °C.
La actividad de unión a los FcyR de ratón se puede representar mediante la actividad de unión relativa a los FcyR de ratón. El anticuerpo fue capturado por la proteína L y la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de capturar el anticuerpo se definió como X1. A continuación, se permitió que los FcyR de ratón interactuaran con el anticuerpo y el valor obtenido al restar la actividad de unión de los FcyR de ratón representada como la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de permitir que el tampón de ejecución interactúe con el anticuerpo capturado por la proteína L (AA2) del valor obtenido al multiplicar por 1500 el valor obtenido al dividir la actividad de unión de los FcyR de ratón representada como la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de esa interacción (AA1) por la cantidad capturada (X) de cada anticuerpo, se dividió por la cantidad capturada de cada anticuerpo (X) seguido de multiplicar por 1500 para obtener la actividad de unión de los FcyR de ratón (Y) (ecuación 1).
[Ecuación 1]
Actividad de unión de FcyR de ratón (Y) = (AA1 - AA2)/X x 1500
Los resultados se muestran en la tabla 7 a continuación.
[Tabla 7]
Figure imgf000093_0001
Según los resultados de las tablas 2 y 3, Fv4-IgG1-F140 y Fv4-IgG1-F424 demostraron una disminución de la unión a FcyR de ratón sin afectar a la actividad de unión a FcRn humano en comparación con Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F157.
(4-5) Estudio de PK in vivo usando ratones transgénicos para FcRn humano
Se llevó a cabo un estudio de APK en la administración de los anticuerpos Fv4-IgG1-F140, Fv4-IgG1-F424, Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F157 producidos a ratones transgénicos para FcRn humano según el método mostrado a continuación.
Se administró anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano a 1 mg/kg en una sola administración en una vena caudal de ratones transgénicos para FcRn humano (ratón 32 /+ de línea Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Se recogió sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1,2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. El plasma se obtuvo centrifugando inmediatamente la sangre recogida durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
(4-6) Medición de la concentración de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en plasma mediante ELISA
La concentración de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en plasma de ratón se midió mediante ELISA. En primer lugar, se distribuyó un fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico de cadena y) (SIGMA) en una placa Nunc-Immuno, MaxiSoup (Nalge Nunc International) seguido de permitir que repose sin alteraciones durante un noche a 4 °C para producir una placa de fase sólida anti-IgG humana. Se prepararon muestras de la curva de calibración que contenían 0,8, 0,4, 0,2, 0,1,0,05, 0,025 y 0,0125 gg/ml de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en concentración de anticuerpo en plasma y muestras de medición de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Después se permitió que las mezclas obtenidas añadiendo 200 gl de receptor de IL-6 humano soluble 20 ng/ml a 100 gl de las muestras de la curva de calibración y las muestras de medición de plasma reposaran sin alteraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la placa de fase sólida anti-IgG humana en la que se habían distribuido las mezclas en cada uno de los pocillos de la misma se dejó reposar adicionalmente sin alteraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se llevó a cabo la reacción cromogénica de un líquido de reacción obtenido tras la reacción con un anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) durante 1 hora a temperatura ambiente y la reacción adicional con Estreptavidina-PoliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando el sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories) como sustrato. Después de detenerse la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm de los líquidos de reacción de cada pocillo con un lector de microplacas. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos en el plasma de ratón a partir de los valores de absorbancia de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Las concentraciones de los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH en plasma después de la administración intravenosa de los anticuerpos humanos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH a ratones transgénicos para FcRn humano se muestran en la fig. 14.
En función de los resultados de la fig. 14, se observó que Fv4-IgG1-F140, cuya unión a FcyR de ratón era menor en comparación con Fv4-IgG1-F21, demostraba una mejora de la permanencia en plasma en comparación con Fv4-IgG1-F21. De manera análoga, se observó que Fv4-IgG1-F424, cuya unión a FcyR de ratón era menor en comparación con Fv4-IgG1-F157, demostraba una prolongación de la permanencia en plasma en comparación con Fv4-IgG1-F157.
Basándose en esto, se mostró que un anticuerpo que tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y tiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR es menor que la de un dominio de unión a FcyR normal tiene mayor permanencia en plasma que un anticuerpo que tiene el dominio de unión a FcyR normal.
Aunque la presente invención no está ligada a una teoría específica, se cree que la razón para haber observado dicha mejora de la permanencia en plasma de moléculas de unión a antígeno es que, ya que las moléculas de unión a antígeno tienen actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro, y tienen un dominio FcyR cuya actividad de unión a FcyR es menor que la del dominio de unión a FcyR de origen natural, se inhibió la formación del complejo cuaternario descrito en el ejemplo 3. En otras palabras, Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F157, que forman un complejo cuaternario en la membrana celular de células presentadoras de antígenos, se cree que se incorporan más fácilmente en células presentadoras de antígenos. Por otro lado, en Fv4-IgG1-F140 y Fv4-IgG1-F424, que se clasifican como realización 1 indicada en el ejemplo 3 y no forman un complejo cuaternario en la membrana celular de células presentadoras de antígenos, se cree que se inhibe la incorporación en células presentadoras de antígenos. Aquí, se cree que la incorporación de moléculas de unión a antígeno en células tales como células endoteliales vasculares que no expresan FcyR activo incluye principalmente la incorporación inespecífica o la incorporación mediada por FcRn en la membrana celular y no se considera que se vea afectada por una disminución de la actividad de unión a FcyR. En otras palabras, se cree que la mejora de la permanencia en plasma que se observó como se ha descrito anteriormente es el resultado de la inhibición selectiva de la incorporación en células inmunitarias, incluyendo células presentadoras de antígenos.
[Ejemplo 5] Evaluación de la permanencia en plasma de anticuerpos humanos que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro, pero no tienen actividad de unión a FcyR de ratón
(5-1) Producción de anticuerpos humanos que no tienen actividad de unión a FcyR humano y de ratón, y se unen al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente del pH
Se produjeron anticuerpos de la manera mostrada a continuación para producir anticuerpos humanos que no tienen actividad de unión al FcyR humano y de ratón y se unen al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente del pH. Se produjo VH3-IgG1-F760 (SEQ ID NO: 53) que no tiene actividad de unión al FcyR humano y de ratón mediante una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Leu por Arg en la posición 235 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Ser por Lys en la posición 239 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1.
De manera análoga, Se produjeron VH3-IgG1-F821 (SEQ ID NO: 57), VH3-IgG1-F939 (SEQ ID NO: 58) y VH3-IgG1-F1009 (SEQ ID NO: 59) que no tienen actividad de unión al FcyR humano y de ratón mediante una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Leu por Arg en la posición 235 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Ser por Lys en la posición 239 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F11 (SEQ ID NO: 54), VH3-IgG1-F890 (SEQ ID NO: 55) y VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 56).
Se produjeron Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 y Fv4-IgG1-F1009 que contenían estos anticuerpos para las cadenas pesadas y VL3-CK para la cadena ligera usando el método del ejemplo de referencia 2.
(5-2) Confirmación de la actividad de unión a FcRn humano y FcyR de ratón
Utilizando el método del ejemplo 4 se midió la actividad de unión (constante de disociación KD) al FcRn humano a pH 7,0 de anticuerpos que contenían VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, v H3-IgG 1-F821, VH3-IgG1-F939 o VH3-IgG1-F1009 para la cadena pesada y L(TS)-CK para la cadena ligera producida utilizando el método del ejemplo de referencia 2. Los resultados de la medición se muestran en la tabla 8 a continuación.
[Tabla 8]
Figure imgf000094_0001
Se midió la actividad de unión al FcyR de ratón a pH 7,4 de anticuerpos que contienen VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1-F939 o VH3-IgG1-F1009 para la cadena pesada y L(TS)-CK para la cadena ligera de la misma manera que en el método del ejemplo 4. Los resultados de la medición se muestran en la tabla 9 a continuación.
[Tabla 9]
Figure imgf000095_0001
Según los resultados de las tablas 4 y 5, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 y Fv4-IgG1-F1009 demostraron una disminución de la unión a FcyR de ratón sin afectar a la actividad de unión a FcRn humano en comparación con Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890 y Fv4-IgG1-F947.
(5-3) Estudio de PK in vivo usando ratones transgénicos para FcRn humano
Se llevó a cabo un estudio de APK en la administración de los anticuerpos Fv4-IgG1 y Fv4-IgG1-F760 producidos a ratones transgénicos para FcRn humano según el método mostrado a continuación.
Se administró anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano a 1 mg/kg en una sola administración en una vena caudal de ratones transgénicos para FcRn humano (ratón 32 /+ de línea Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Se recogió sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1,2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. El plasma se obtuvo centrifugando inmediatamente la sangre recogida durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
La concentración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en el plasma de ratón se midió mediante ELISA de la misma manera que en el método del ejemplo 4. Los resultados se muestran en la fig. 15. Fv4-IgG1-F760, que redujo la actividad de unión de Fv4-IgG1 a FcyR de ratón, demostró permanencia en plasma casi igual a la de Fv4-IgG1-F11; sin embargo, no se observó un efecto de mejora de la permanencia en plasma al disminuir la actividad de unión a FcyR.
(5-4) Estudio de PK in vivo usando ratones transgénicos para FcRn humano
Se llevó a cabo un estudio de APK en la administración de los anticuerpos Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 y Fv4-IgG1-F1009 producidos a ratones transgénicos para FcRn humano según el método mostrado a continuación.
Se administró anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano a 1 mg/kg en una sola administración debajo de la piel del lomo de ratones transgénicos para FcRn humano (ratón 32 /+ de línea Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Se recogió sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. El plasma se obtuvo centrifugando inmediatamente la sangre recogida durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
La concentración de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en el plasma de ratón se midió mediante ELISA de la misma manera que en el método del ejemplo 4. Los resultados se muestran en la fig. 16. Fv4-IgG1-F821, que redujo la actividad de unión de Fv4-IgG1-F11 a FcyR de ratón, demostró permanencia en plasma casi igual a la de Fv4-IgG1-F11. Por otro lado, se observó que Fv4-IgG1-F939, que redujo la actividad de unión de Fv4-IgG1-F890 a FcyR de ratón, demostraba permanencia en plasma mejorada en comparación con Fv4-IgG1-F890. De manera análoga, se observó que Fv4-IgG1-F1009, que redujo la actividad de unión de Fv4-IgG1-F947 a FcyR de ratón, demostraba permanencia en plasma mejorada en comparación con Fv4-IgG1 -F947.
Por otro lado, ya que no se observaron diferencias en la permanencia en plasma de Fv4-IgG1 e IgG1-F760, y Fv4-IgG 1, que no tiene actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro, es capaz de formar un complejo binario con FcyR en células inmunitarias pero no puede formar un complejo cuaternario, se creyó que no se había observado mejora de la permanencia en plasma atribuible a una disminución de la actividad de unión a FcyR. Concretamente, se puede decir que solo se observa mejora de la permanencia en plasma como resultado de la disminución de la actividad de unión a FcyR de moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro y la inhibición de la formación de un complejo cuaternario. De acuerdo con este hallazgo también, se cree que la formación de un complejo cuaternario cumple una función importante en la exacerbación de la permanencia en plasma.
(5-5) Producción de anticuerpos humanos que no tienen actividad de unión a FcvR humano y de ratón, y se unen al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente del pH
Se produjo VH3-IgG1-F1326 (SEQ ID NO: 155), en el que no se disminuye la actividad de unión a FcyR humano y de ratón, mediante una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Leu por Ala en la posición 234 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Leu por Ala en la posición 235 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 56).
Se produjo Fv4-IgG1-F1326 que contenía VH3-IgG1-F1326 para la cadena pesada y VL3-CK para la cadena ligera utilizando el método del ejemplo de referencia 2.
(5-6) Confirmación de la actividad de unión a FcRn humano y FcvR de ratón
Utilizando el método del ejemplo 4 se midió la actividad de unión (constante de disociación KD) al FcRn humano a pH 7,0 de anticuerpos que contenían VH3-IgG1-F1326 para la cadena pesada y L(TS)-CK para la cadena ligera producida utilizando el método del ejemplo de referencia 2. Además, se midió la actividad de unión a FcyR de ratón a pH 7,4 de la misma manera que en el método del ejemplo 4. Los resultados de la medición se muestran en la tabla 10 a continuación.
[Tabla 10]
Figure imgf000096_0001
Según los resultados de la tabla 10, Fv4-IgG1-F1326 demostró una disminución de la unión a FcyR de ratón sin afectar a la actividad de unión a FcRn humano en comparación con Fv4-IgG1-F947.
(5-7) Estudio de PK in vivo usando ratones transgénicos para FcRn humano
Se llevó a cabo un estudio de PK en la administración del anticuerpo Fv4-IgG1-F1326 producido a ratones transgénicos para FcRn humano de la misma manera que en el método del ejemplo 5-4. La concentración de anticuerpo anti­ receptor de IL-6 humano en el plasma de ratón se midió mediante ELISA de la misma manera que en el método del ejemplo 4. Los resultados se muestran en la fig. 54 junto con los resultados para Fv4-IgG1-F947 obtenidos en el ejemplo 5-4. Se observó que Fv4-IgG1-F1326, que redujo la actividad de unión de Fv4-IgG1-F947 a FcyR de ratón, demostraba mejora de la permanencia en plasma en comparación con Fv4-IgG1-F947.
De acuerdo con lo anterior, en el caso de un anticuerpo humano que tenga unión mejorada a FcRn humano en condiciones neutras, se indicó que era posible mejorar la permanencia en plasma en ratones transgénicos para FcRn humano al disminuir la actividad de unión a FcyR de ratón e inhibir la formación de un complejo cuaternario. Aquí, para demostrar el efecto de mejora de la permanencia en plasma al disminuir la actividad de unión al FcyR de ratón, la afinidad (KD) por el FcRn humano a pH 7,0 es preferiblemente mayor de 310 nM y más preferiblemente 110 nM o menos.
Como resultado, se confirmó que la permanencia en plasma mejoraba al transmitir las propiedades de la realización 1 a moléculas de unión a antígeno de la misma manera que en el ejemplo 4. Aquí, se cree que la mejora observada de la permanencia en plasma se ha debido a la inhibición selectiva de la incorporación en células inmunitarias, incluyendo células presentadoras de antígenos y, como resultado de ello, se espera que sea posible inhibir la inducción de una respuesta inmunitaria.
[Ejemplo 6] Evaluación de la permanencia en plasma de anticuerpos de ratón que tienen actividad de unión a FcRn de ratón en la región de pH neutro, pero no tienen actividad de unión a FcyR de ratón
(6-1) Producción de anticuerpos de ratón que se unen al receptor de IL-6 humano pero que no tienen actividad de unión a FcvR de ratón
En los ejemplos 4 y 5, se ha indicado que las moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y que contienen un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR de ratón es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo, demuestran mejor permanencia en plasma en ratones transgénicos para FcRn humano. De manera análoga, se verificó si la permanencia en plasma en ratones normales mejora o no para moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro y contienen un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR de ratón es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo.
Se produjo mPM1H-mIgG1-mF40 (SEQ ID NO: 60) mediante una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Pro por Lys en la posición 235 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Ser por Lys en la posición 239 en la secuencia de aminoácidos de mPM1H-mIgG1-mF38 producida en el ejemplo 2, mientras que se produjo mPM1 H-mIgG1-mF39 (SEQ ID NO: 61) mediante una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Pro por Lys en la posición 235 (numeración EU) y una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Ser por Lys en la posición 239 en la secuencia de aminoácidos de mPM1H-mIgG1-mF14.
(6-2) Confirmación de la actividad de unión a FcRn de ratón y FcvR de ratón
Se midió la actividad de unión (constante de disociación KD) a FcRn de ratón a pH 7,0 utilizando el método del ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla 11 a continuación.
[Tabla 11]
Figure imgf000097_0001
Se midió la actividad de unión a FcyR de ratón a pH 7,4 utilizando el método del ejemplo 4. Los resultados se muestran en la tabla 12 a continuación.
[Tabla 12]
Figure imgf000097_0002
(6-3) Estudio de PK in vivo con ratones normales
Se llevó a cabo un estudio de PK en la administración de los mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39 y mPM1-mIgG1-mF40 producidos a ratones normales según el método indicado a continuación.
El anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano se administró a 1 mg/kg en una sola administración debajo de la piel del lomo de ratones normales (ratón C57BL/6J, Charles River Japan). Se recogió sangre a los 5 minutos, 7 horas y 1,2, 4, 7 y 14 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. El plasma se obtuvo centrifugando inmediatamente la sangre recogida durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
(6-4) Medición de la concentración de anticuerpo de ratón anti-receptor de IL-6 humano en plasma mediante ELISA
La concentración de anticuerpo de ratón anti-receptor de IL-6 humano en plasma de ratón se midió mediante ELISA. En primer lugar, se distribuyó receptor de IL-6 humano soluble en una placa Nunc-Immuno, MaxiSoup (Nalge Nunc International) seguido de permitir que repose sin alteraciones durante un noche a 4 °C para producir una placa de fase sólida de receptor de IL-6 humano soluble. Se prepararon muestras de la curva de calibración que contenían 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078, 0,039 y 0,020 pg/ml de anticuerpo de ratón anti-receptor de IL-6 humano en concentración de anticuerpo en plasma y muestras de medición de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Se distribuyeron alícuotas de 100 pl de estas muestras de la curva de calibración y muestras de medición de plasma en cada pocillo de la placa de fase sólida de receptor de IL-6 humano soluble y después se dejó reposar sin alteraciones durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se llevó a cabo la reacción cromogénica de un líquido de reacción obtenido por reacción con un anticuerpo anti-IgG de ratón-peroxidasa (SIGMA) durante 1 hora a temperatura ambiente y la reacción adicional con Estreptavidina-PoliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando el sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories) como sustrato. Después de detenerse la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm de los líquidos de reacción de cada pocillo con un lector de microplacas. Se calcularon las concentraciones de anticuerpos en el plasma de ratón a partir de los valores de absorbancia de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los cambios en la concentración de anticuerpos en plasma de ratón normal después de la administración intravenosa medida con este método se muestran en la fig. 17.
Según los resultados mostrados en la fig. 17, se observó que mPM1-mIgG1-mF40, que no tiene actividad de unión a FcyR de ratón, demostraba mejora de la permanencia en plasma en comparación con mPM1-mIgG1-mF38. Además, se observó que mPM1-mIgG1-mF39, que no tiene actividad de unión a FcyR de ratón, demostraba mejora de la permanencia en plasma en comparación con mPM1-mIgG1-mF14.
De acuerdo con lo anterior, se mostró que un anticuerpo que tiene actividad de unión a FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro y que tiene un dominio de unión a FcyR que no tiene actividad de unión a FcyR de ratón tiene mayor permanencia en plasma en ratones normales que un anticuerpo que tiene un dominio de unión a FcyR normal.
Como resultado, de la misma manera que en los ejemplos 4 y 5, se confirmó que la permanencia en plasma era alta para las moléculas de unión a antígeno que tenían las propiedades de las moléculas de unión a antígeno de la realización 1. Aunque la presente invención no está ligada a una teoría específica, se cree que la mejora de la permanencia en plasma observada aquí es el resultado de la inhibición selectiva de la incorporación en células inmunitarias, incluyendo células presentadoras de antígenos y, como resultado de ello, se espera que sea posible inhibir la inducción de una respuesta inmunitaria.
[Ejemplo 7] Evaluación in vitro de la inmunogenicidad de un anticuerpo humanizado (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano) que tiene actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo
Para evaluar la inmunogenicidad en seres humanos de una molécula de unión a antígeno de la realización 1, concretamente moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y que contiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcyR activo es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo, se evaluó la respuesta de linfocitos T a la molécula de unión a antígeno in vitro según el método mostrado a continuación.
(7-1) Confirmación de la actividad de unión a FcRn humano
Las constantes de asociación (KD) de VH3/L(TS)-IgG1, VH3/L(TS)-IgG1-F21 y VH3/L(TS)-IgG1-F140 a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro (pH 7,0) medidas en el ejemplo 4 se muestran en la tabla 13 a continuación.
[Tabla 13]
Figure imgf000098_0001
(7-2) Evaluación de la actividad de unión a FcvR humano
Las actividades de unión de VH3/L(TS)-IgG1, VH3/L(TS)-IgG1-F21 y VH3/L(TS)-IgG1-F140 a FcyR humano a pH 7,4 se midieron utilizando el método mostrado a continuación.
La actividad de unión entre los anticuerpos y el FcvRIa, FcvRIIa(H), FcvRIIa(R), FcvRIIb y FcvRIIIa(F) humanos (en lo sucesivo en la presente memoria denominados FcyR humanos) se evaluó usando el Biacore T100 o T200 (GE Healthcare). Los anticuerpos que se estaban probando fueron capturados por la proteína L (ACTIGEN) que se inmovilizó en cantidades adecuadas en el chip sensor CM4 (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina. A continuación, se inyectaron los FcyR humanos diluidos y un tampón de ejecución utilizado como blanco para permitir la interacción con los anticuerpos capturados en el chip sensor. También se utilizó un tampón que consistía en ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l y Tween 20 al 0,05 % (p/v) (pH 7,4) para el tampón de ejecución y este tampón también se utilizó para diluir los FcyR humanos. Se utilizó glicina-HCl 10 mmol/l (pH 1,5) para regenerar el chip sensor. Todas las medidas se llevaron a cabo a 25 °C.
La actividad de unión a los FcyR humanos se puede representar mediante la actividad de unión relativa a los FcyR humanos. El anticuerpo fue capturado por la proteína L y la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de capturar el anticuerpo se definió como X1. A continuación, se permitió que los FcyR humanos interactuaran con el anticuerpo y el valor obtenido al restar la actividad de unión de los FcyR humanos representada como la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de permitir que el tampón de ejecución interactúe con el anticuerpo capturado por la proteína L (AA2) del valor obtenido al multiplicar por 1500 el valor obtenido al dividir la actividad de unión de los FcyR humanos representados como la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de esa interacción (AA1) por la cantidad capturada (X) de cada anticuerpo, se dividió por la cantidad capturada de cada anticuerpo (X) seguido de multiplicar por 1500 para obtener la actividad de unión de los FcyR humanos (Y) (ecuación 2).
[Ecuación 2] Actividad de unión de FcyR humanos (Y) = (AA1-AA2)/X x 1500
Los resultados se muestran en la tabla 14 a continuación.
[Tabla 14]
Figure imgf000099_0001
Según los resultados de la tabla 14, Fv4-IgG1-F140 demostró una disminución de la unión a cada FcyR humano sin afectar a la actividad de unión a FcRn humano en comparación con Fv4-IgG1-F21.
(7-3) Estudio de inmunogenicidad in vitro con PBMC humanas
Se llevó a cabo un estudio de inmunogenicidad in vitro como se muestra a continuación utilizando Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F140 producidos en el ejemplo 1.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre recogida de voluntarios sanos. Después de separar las PBMC de la sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll (GE Healthcare), se eliminaron linfocitos CD8+ de las PBMC magnéticamente utilizando Dynabeads CD8 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo convencional proporcionado. A continuación, se eliminaron linfocitos CD25alto magnéticamente utilizando Dynabeads CD25 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo convencional proporcionado.
Se llevó a cabo un ensayo de proliferación de la manera descrita a continuación. Concretamente, se añadieron PBMC de cada donante, de los que se habían eliminado linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD25alto y que se habían resuspendido en medio AIMV (Invitrogen) que contenía suero humano desactivado al 3 % a una concentración de 2 x 106/ml, a una placa de 24 pocillos de fondo plano a 2 x 106 células por pocillo. Después de cultivar durante 2 horas en condiciones de 37 °C y CO2 al 5 %, las células a las que se añadió cada sustancia de ensayo a concentraciones finales de 10, 30, 100 y 300 pg/ml se cultivaron durante 8 días. Se añadió BrdU (bromodesoxiuridina) a 150 pl de suspensión celular durante el cultivo después de transferir a una placa de 96 pocillos de fondo redondo los días 6, 7 y 8 de cultivo, después de lo cual las células se cultivaron adicionalmente durante 24 horas. Las BrdU que se habían incorporado a los núcleos de las células cultivadas con BrdU se tiñeron utilizando el equipo de flujo BrdU (BD Bioscience) de acuerdo con el protocolo convencional proporcionado, mientras que los antígenos de superficie (CD3, CD4 y CD19) se tiñeron con anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD19 (BD Bioscience). A continuación, se detectó el porcentaje de linfocitos T CD4+ positivos para BrdU con b D FACS Calibur o BD FACS CantII (BD). Se calculó el porcentaje de linfocitos T CD4+ positivos para BrdU a cada concentración de sustancia de prueba de 10, 30, 100 y 300 pg/ml en los días 6, 7 y 8 de cultivo, seguido del cálculo de los valores promedios de los mismos.
Los resultados se muestran en la fig. 18. La fig. 18 indica las respuestas proliferativas de linfocitos T CD4+ a Fv4-IgG1-F21 y Fv4-IgG1-F140 en las PBMC de cinco donantes humanos de los que se habían eliminado linfocitos T CD8+ y linfocitos CD25alto. En primer lugar, no se observó un aumento de la respuesta proliferativa de linfocitos T CD4+ atribuible a la adición de la sustancia de prueba en las PBMC de los donantes A, B y D en comparación con un control negativo. Se cree que estos donantes no han experimentado inherentemente una respuesta inmunitaria a las sustancias de prueba. Por otro lado, se observó una respuesta proliferativa de linfocitos CD4+ atribuible a la adición de la sustancia de prueba en las PBMC de los donantes C y E en comparación con un control negativo. Uno de los puntos que cabe señalar aquí es que la respuesta proliferativa de linfocitos T CD4+ a Fv4-IgG1-F140 tendió a disminuir en comparación con Fv4-IgG1-F21 para los donantes tanto C como E. Como se ha descrito anteriormente, Fv4-IgG1F140 tiene una menor actividad de unión a FcyR humano que Fv4-IgG1-F21 y tiene las propiedades de la realización 1. A partir de los resultados anteriores, se ha sugerido que la inmunogenicidad se puede suprimir con respecto a moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y que contienen un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo.
[Ejemplo 8] Evaluación in vitro de la inmunogenicidad de un anticuerpo humanizado (anticuerpo anti-A33 humano) que tiene actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y que contiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo
(8-1) Producción de hA33-IgG1
Ya que las PBMC humanas tienen inherentemente una respuesta inmunitaria baja a Fv4-IgG1-F21 como se ha indicado en el ejemplo 7, se ha sugerido que no son adecuadas para evaluar la supresión de la respuesta inmunitaria a Fv4-IgG1-F140 que contiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcyR es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo. Por lo tanto, un anticuerpo A33 humanizado (hA33-IgG1), que es un anticuerpo IgG1 humanizado contra el antígeno A33, se produjo con el fin de mejorar la capacidad de detectar efectos reductores de la inmunogenicidad en un sistema de evaluación de la inmunogenicidad in vitro.
En hA33-IgGl, se ha confirmado que el anti-anticuerpo se produce en 33 % a 73 % de los sujetos en un estudio clínico (Hwang, etal. (Methods (2005) 36, 3-10) y Walle, et al. (Expert Opin. Bio. Ther. (2007) 7 (3), 405-418)). Ya que la alta inmunogenicidad de hA33-IgG1 se origina en la secuencia de región variable, para moléculas en las que la actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro se había mejorado para hA33-IgG1, sería fácil detectar efectos reductores de la inmunogenicidad que surgen de la inhibición de la formación de un complejo cuaternario al reducir la actividad de unión a FcyR.
Las secuencias de aminoácidos de hA33H (SEQ ID NO: 62) utilizada para la región variable de cadena pesada del anticuerpo A33 humanizado y hA33L (SEQ ID NO: 63) utilizada para la región variable de cadena ligera se adquirieron a partir de información conocida (British Journal of Cancer (1995) 72, 1364-1372). Además, se utilizó IgG1 humana de origen natural (SEQ ID NO: 11, denominada en lo sucesivo en la presente memoria IgG 1) para la región constante de cadena pesada y se utilizó kappa humana de origen natural (SEQ Id NO: 64, denominado en lo sucesivo en la presente memoria k0) para la región constante de cadena ligera.
Se produjo un vector de expresión que contenía las secuencias de bases de hA33H-IgG1 de cadena pesada y hA33L-k0 de cadena ligera según el método del ejemplo de referencia 1. Además, se produjo un anticuerpo A33 humanizado en forma de hA33-IgG1 que contenía hA33H-IgG1 de cadena pesada y hA33L-k0 de cadena ligera de acuerdo con el método del ejemplo de referencia 2.
(8-2) Producción de un anticuerpo de unión a A33 que tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro
Ya que la hA33-IgG1 producida es un anticuerpo humano que tiene una región Fc humana de origen natural, no tiene actividad de unión al FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro. Por lo tanto, se introdujo una modificación de aminoácidos en la región constante de cadena pesada de hA33-IgG1 con el fin de transmitir la capacidad de unión al FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro.
Más específicamente, se produjo hA33H-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 65) sustituyendo Met por Tyr en la posición 252 (numeración EU), sustituyendo Val por Pro en la posición 308 (numeración EU) y sustituyendo Asn por Tyr en la posición 434 (numeración EU) en la región constante de cadena pesada de hA33-IgG1 en forma de hA33H-IgG1. Utilizando el método del ejemplo de referencia 2, se produjo un anticuerpo de unión a A33 que tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro en forma de hA33-IgG1-F21 que contiene hA33H-IgG1-F21 para la cadena pesada y hA33L-k0 para la cadena ligera.
(8-3) Producción de un anticuerpo de unión a A33 que contiene un dominio de unión a FcvR cuya actividad de unión a FcvR humano en condiciones de la región de pH neutro es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcvR nativo
Se produjo hA33H-IgG1-F140 (SEQ ID NO: 66) en el que Ser se sustituye por Lys en la posición 239 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de hA33H-IgG1-F21 con el fin de reducir la actividad de unión de hA33-IgG1-F21 a FcyR humano.
(8-4) Evaluación de la inmunogenicidad de diversos tipos de anticuerpos de unión a A33 mediante ensayo de linfocitos T in vitro
La inmunogenicidad de los hA33-IgG1-F21 y hA33-IgG1-F140 producidos se evaluó utilizando el mismo método que el del ejemplo 7. Asimismo, los voluntarios sanos que actuaban como donantes no eran los mismos individuos que los voluntarios sanos de los que se aislaron las PBMC utilizadas en el ejemplo 7. En otras palabras, el donante A en el ejemplo 7 y el donante A en este estudio eran voluntarios sanos diferentes.
Los resultados del estudio se muestran en la fig. 19. En la fig. 19, se realiza una comparación entre los resultados para hA33-IgG1-F21 que tiene actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y hA33-IgG1-F140 que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de un dominio de unión a FcyR nativo. Ya que no se ha observado una respuesta a hA33-IgG1-F21 en PBMC aisladas de los donantes C, D y F en comparación con un control negativo, se cree que los donantes C, D y F son donantes en los que no se produce una respuesta inmunitaria a hA33-IgG1-F21. Se observó una fuerte respuesta inmunitaria a hA33-IgG1-F21 en las PBMC aisladas de los otros siete donantes (donantes A, B, E, G, H, I y J) en comparación con el control negativo; y hA33-IgG1-F21 demostró un alto nivel de inmunogenicidad in vitro como se esperaba. Por otro lado, se observó un efecto en el que la respuesta inmunitaria de las PBMC aisladas de estos siete donantes (donantes A, B, E, G, H, I y J) a hA33-IgG1-F140 que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo, disminuyó en comparación con la de hA33-IgG1-F21. Además, ya que la respuesta inmunitaria de las PBMC aisladas de los donantes E y J a hA33-IgG1-F140 también fue aproximadamente igual que la del control negativo, se creyó que la inmunogenicidad se puede reducir en moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro al reducir la actividad de unión a FcyR humano a un nivel menor que la actividad de unión de un dominio de unión de FcyR nativo y al inhibir la formación de un complejo cuaternario.
[Ejemplo 9] Evaluación de la inmunogenicidad in vitro de un anticuerpo humanizado (anticuerpo anti-A33 humano) que tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro pero que no tiene actividad de unión a FcyR humano
(9-1) Producción de un anticuerpo de unión a A33 que tiene fuerte actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro
Se produjo hA33H-IgG1-F698 (SEQ ID NO: 67) según el método del ejemplo de referencia 1 sustituyendo Met por Tyr en la posición 252 (numeración EU), sustituyendo Asn por Glu en la posición 286 (numeración EU), sustituyendo Thr por Gln en la posición 307 (numeración EU), sustituyendo Gln por Ala en la posición 311 (numeración EU) y sustituyendo Asn por Tyr en la posición 434 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de hA33H-IgG1. Se produjo un anticuerpo de unión a A33 que tiene fuerte actividad de unión a FcRn humano en las condiciones de la región de pH neutro en forma de hA33-IgG1-F698 que contiene hA33H-IgG1-F698 para la cadena pesada y hA33L-k0 para la cadena ligera.
(9-2) Producción de un anticuerpo de unión a A33 que contiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcvR humano en condiciones de la región de pH neutro es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcvR nativo
Se produjo hA33H-IgG1-F699 (SEQ ID NO: 68) en el que Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) de hA33H-F698 y que contiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo.
Se midió la actividad de unión a FcRn humano a pH 7,0 de VH3/L(TS)-IgG1, VH3/L(TS)-IgG1-F698 y VH3/L(TS)-IgG1-F699 usando el método del ejemplo 4. Por otra parte, se midió la actividad de unión a FcyR humano a pH 7,4 de VH3/L(TS)-IgG1, VH3/L(TS)-IgG1-F698 y VH3/L(TS)-IgG1-F699 utilizando el método del ejemplo 7. Los resultados para ambos se muestran en la tabla 15 a continuación.
[Tabla 15]
Figure imgf000101_0001
Como se muestra en la tabla 15, VH3/L(TS)-IgG1-F699, en el que Ser se sustituye por Lys en la posición 239 (numeración EU) y que contiene un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a cada tipo de FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo, demostró actividad de unión a hFcgRI aunque se disminuyó la unión a hFcgRIIa(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb y hFcgRIIIa(F).
(9-3) Evaluación de la inmunogenicidad de diversos tipos de anticuerpos de unión a A33 mediante ensayo de linfocitos T in vitro
Se evaluó la inmunogenicidad frente a las hA33-IgG1-F698 y hA33-IgG1-F699 producidas según el mismo método que en el ejemplo 7. Asimismo, los voluntarios sanos que actuaban como donantes no eran los mismos individuos que los voluntarios sanos de los que se aislaron las PBMC utilizadas en los ejemplos 7 y 8. En otras palabras, el donante A en los ejemplos 7 y 8 y el donante A en este estudio eran voluntarios sanos diferentes.
Los resultados del estudio se muestran en la fig. 20. En la fig. 20, se realiza una comparación entre los resultados para hA33-IgG1-F698 que tiene fuerte actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y hA33-IgG1-F699 que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de un dominio FcyR de origen natural. Ya que no se observó una respuesta a hA33-IgG1-F698 en las PBMC aisladas de los donantes G e I en comparación con un control negativo, se cree que los donantes G e I son donantes en los que no se produce una respuesta inmunitaria a hA33-IgG1-F698. Se observó una fuerte respuesta inmunitaria a hA33-IgG1-F698 en las PBMC aisladas de los otros siete donantes (donantes A, B, C, D, E, F y H) en comparación con el control negativo y se demostró un alto nivel de inmunogenicidad in vitro de la misma manera que el hA33-IgG1-F21 mencionado anteriormente. Por otro lado, se observó un efecto en el que la respuesta inmunitaria de las PBMC aisladas de cinco donantes (donantes A, B, C, D y F) a hA33-IgG1-F699 que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo, disminuyó en comparación con la de hA33-IgG1-F698. En particular, se confirmó que la respuesta inmunitaria de las PBMC aisladas de los donantes C y F a hA33-IgG1-F699 también fue aproximadamente igual que la del control negativo. El hecho de que se confirmara el efecto de reducir la inmunogenicidad no solo para hA33-IgG1-F21 sino también para hA33-IgG1-F698, que tiene fuerte actividad de unión a FcRn humano, mostró que la inmunogenicidad puede reducirse en moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro, haciendo que la actividad de unión a FcyR humano sea más baja que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo e inhibiendo la formación de un complejo cuaternario.
(9-4) Producción de un anticuerpo de unión a A33 que no tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro
Como se ha descrito anteriormente en (9-3), hA33-IgG1-F699 demostró una disminución de la actividad de unión a diversos tipos de FcyR humano al sustituir Ser por Lys en la posición 239 (numeración EU) en hA33-IgG1-F698 y la unión a hFcgRI permaneció aunque la unión a hFcgRIIa(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb y hFcgRIIIa(F) disminuyó considerablemente.
Por lo tanto, para producir un anticuerpo de unión a A33 que contenga un dominio de unión a FcyR que no tenga actividad de unión a todos los FcyR humanos, incluyendo hFcgRIa, se produjo hA33H-IgG1-F763 (SEq ID NO: 69) en el que Leu se sustituyó por Arg en la posición 235 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) en hA33H-IgG1-F698 (SEQ ID NO: 67).
Se midieron las constantes de asociación (KD) para el FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro (pH 7,0) para VH3/L(TS)-IgG1, VH3/L(TS)-IgG1-F698 y VH3/L(TS)-IgG1-F763 utilizando el método del ejemplo 4. Además, se evaluó la actividad de unión a FcyR humano para VH3/L(TS)-IgG1, VH3/L(TS)-IgG1-F698 y VH3/L(TS)-IgG1-F763 según el método descrito en el ejemplo 7. Estos resultados también se muestran en la tabla 16 a continuación.
[Tabla 16]
Figure imgf000102_0001
Como se muestra en la tabla 16, se mostró que IgG1-F763, en el que Leu se sustituyó por Arg en la posición 235 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU), demostraba disminución de la actividad de unión a todos los FcyR humanos, incluyendo hFcYRIa.
(9-5) Evaluación de la inmunogenicidad de diversos tipos de anticuerpos de unión a A33 mediante ensayo de linfocitos T in vitro
La inmunogenicidad de los hA33-IgG1-F698 y hA33-IgG1-F763 producidos se evaluó utilizando el mismo método que el del ejemplo 7. Asimismo, de la misma manera que se ha descrito anteriormente, los voluntarios sanos que actuaban como donantes no eran los mismos individuos que los voluntarios sanos de los que se aislaron las PBMC utilizadas en los ejemplos anteriormente mencionados. En otras palabras, el donante A en los ejemplos anteriormente mencionados y el donante A en este estudio eran voluntarios sanos diferentes.
Los resultados del estudio se muestran en la fig. 21. En la fig. 21, se realiza una comparación entre los resultados para hA33-IgG1-F698 que tiene fuerte actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y hA33-IgG1-F763 que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de un dominio de unión a FcyR nativo. Ya que no se ha observado una respuesta a hA33-IgG1-F698 en PBMC aisladas de los donantes B, E, F y K en comparación con un control negativo, se cree que los donantes B, E, F y K son donantes en los que no se produce una respuesta inmunitaria a hA33-IgG1-F698. Se observó una fuerte respuesta inmunitaria a hA33-IgG1-F698 en las PBMC aisladas de los otros siete donantes (donantes A, C, D, G, H, I y J) en comparación con el control negativo. Por otro lado, se observó un efecto en el que la respuesta inmunitaria de las PBMC aisladas de cuatro donantes (donantes A, C, D y H) a hA33-IgG1-F763 que contiene un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de FcyR de origen natural, disminuyó en comparación con la de hA33-IgG1-F698. Entre estos cuatro donantes, la respuesta inmunitaria de las PBMC aisladas de los donantes C, D y H en particular a hA33-IgG1-F763 fue aproximadamente igual que la del control negativo, y entre los cuatro donantes en los que la respuesta inmunitaria de las PBMC disminuyó como resultado de la disminución de la unión a FcyR, de hecho, fue posible inhibir completamente la respuesta inmunitaria de PBMC en tres donantes. También según este hallazgo, las moléculas de unión a antígeno que contienen un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR humano es baja se consideran moléculas extremadamente eficaces que tienen inmunogenicidad reducida.
Según los resultados de los ejemplos 7, 8 y 9, se confirmó que una respuesta inmunitaria a moléculas de unión a antígeno en la que se inhibía la formación de un complejo cuaternario al disminuir la unión a FcyR activo (realización 1) estaba inhibida en numerosos donantes en comparación con moléculas de unión a antígeno que son capaces de formar un complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos. Los resultados anteriores mostraron que la formación de un complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos es importante para la respuesta inmunitaria de moléculas de unión a antígeno y que las moléculas de unión a antígeno que no forman ese complejo cuaternario permiten reducir la inmunogenicidad en numerosos donantes.
[Ejemplo 10] Evaluación de la inmunogenicidad in vivo de un anticuerpo humanizado que tiene actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro pero que no tiene actividad de unión a FcyR de ratón
Se demostró por el experimento in vitro en los ejemplos 7, 8 y 9 que la inmunogenicidad se reduce en moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y que contienen un dominio de unión a FcyR cuya actividad de unión a FcyR es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo en comparación con moléculas de unión a antígeno en las que no se ha reducido la actividad de unión a FcyR. El siguiente estudio se realizó para confirmar si este efecto también se demuestra o no in vivo.
(10-1) Estudio de inmunogenicidad in vivo en ratones transgénicos para FcRn humano
Se evaluó la producción de anticuerpos contra Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 y Fv4-IgG1-F1009 utilizando plasma de ratón obtenido en el ejemplo 5 según el método indicado a continuación.
(10-2) Medición del anticuerpo anti-muestra de ensayo administrada en plasma mediante luminiscencia electroquímica
Se midió el anticuerpo contra un anticuerpo de muestra de ensayo administrada presente en plasma de ratón mediante luminiscencia electroquímica. En primer lugar, el anticuerpo administrado se distribuyó en una placa Multi-Array no recubierta (Meso Scale Discovery) y después se dejó reposar sin alteraciones durante una noche a 4 °C para producir una placa de fase sólida de anticuerpo administrado. Se prepararon muestras para medición de plasma de ratón diluyendo 50 veces seguido de distribución en la placa de fase sólida y reacción durante una noche a 4 °C. Posteriormente, se permitió que la IgG anti-ratón (molécula completa) (Sigma) rutenada con NHS éster eon sulfomarcador (Meso Scale Discovery) reaccionara durante 1 hora a temperatura ambiente y se añadió tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery), seguido inmediatamente por la medición con el Sector PR 400 (Meso Scale Discovery). El plasma de cinco animales a los que no se les administró el anticuerpo se midió como una muestra de control negativo para cada sistema de medición, y el valor (X), obtenido al sumar el producto de la multiplicación de la desviación típica (DT) de los valores medidos usando el plasma de esos cinco animales por 1,645 a la media (MEDIA) de los valores medidos usando los cinco animales, se utilizó como criterio para determinar una reacción positiva (ecuación 3). Se consideró que los animales que demostraron una reacción que superaba el criterio positivo incluso una vez en cualquiera de los días de recogida de sangre tenían respuesta de producción de anticuerpos positiva a la sustancia de prueba.
[Ecuación 3]
Criterio positivo para la producción de anticuerpos (X) = MEDIA 1,645 x DT
(10-3) Efecto inhibidor sobre la inmunogenicidad in vivo al disminuir la actividad de unión a FcvR
Los resultados se muestran en las fig. 22 a 27. La fig. 22 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a Fv4-IgG1-F11 a los 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración de Fv4-IgG1-F11 a ratones transgénicos para FcRn humano. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F11 era positiva en uno de los tres ratones (n.° 3) cada día que se extrajo sangre después de la administración (tasa positiva: 1/3). Por otro lado, La fig. 23 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a Fv4-IgG1-F821 a los 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración de Fv4-IgG1-F821 a ratones transgénicos para FcRn humano. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F821 era negativa en los tres ratones cada día que se extrajo sangre después de la administración (tasa positiva: 0/3).
La fig. 24A y su vista ampliada en forma de fig. 24B muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a Fv4-IgG1-F890 a los 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración de Fv4-IgG1-F890 a ratones transgénicos para FcRn humano. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F890 era positiva en dos de los tres ratones (n.° 1 y n.° 3) a los 21 y 28 días después de la administración (tasa positiva: 2/3). Por otro lado, La fig. 25 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a Fv4-IgG1-F939 a los 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración de Fv4-IgG1-F939 a ratones transgénicos para FcRn humano. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F939 era negativa en los tres ratones cada día que se extrajo sangre después de la administración (tasa positiva: 0/3).
La fig. 26 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a Fv4-IgG1-F947 a los 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración de Fv4-IgG1-F947 a ratones transgénicos para FcRn humano. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F947 era positiva en dos de los tres ratones (n.° 1 y n.° 3) a los 14 días después de la administración (tasa positiva: 2/3). Por otro lado, La fig. 27 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a Fv4-IgG1-F1009 a los 3, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración de Fv4-IgG1 -F1009 a ratones transgénicos para FcRn humano. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F1009 era positiva en dos de los tres ratones (n.° 4 y n.° 5) comenzando 7 días después de la administración (tasa positiva: 2/3).
Como se ha indicado en el ejemplo 5, Fv4-IgG1-821 ha disminuido la unión a diversos tipos de FcyR de ratón con respecto a Fv4-IgG1-F11, de manera similar, Fv4-IgG1-F939 ha disminuido la unión a diversos tipos de FcyR de ratón con respecto a Fv4-IgG1-F890, y Fv4-IgG1-F1009 ha disminuido de manera similar la unión a diversos tipos de FcyR de ratón con respecto a Fv4-IgG1-F947.
Se ha indicado que la inmunogenicidad in vivo se puede reducir notablemente al disminuir la unión de Fv4-IgG1-F11 y Fv4-IgG1-F890 a diversos tipos de FcyR de ratón. Por otro lado, no se ha demostrado el efecto de reducir la inmunogenicidad in vivo como resultado de la disminución de la unión de Fv4-IgG1-F947 a diversos tipos de FcyR de ratón.
Aunque sin quedar ligados a una teoría específica, la razón para observar este efecto inhibidor sobre la inmunogenicidad se puede explicar de la manera descrita a continuación.
Como se ha descrito en el ejemplo 3, se cree que la inhibición de la formación de un complejo cuaternario en la membrana celular de células presentadoras de antígenos es posible disminuyendo la actividad de unión a FcyR de moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro. Como resultado de la inhibición de la formación de un complejo cuaternario, se cree que se inhibe la incorporación de moléculas de unión a antígeno en células presentadoras de antígenos y, como resultado de ello, se cree que se suprime la inducción de inmunogenicidad a las moléculas de unión a antígeno. Se cree que Fv4-IgG1 -F11 y Fv4-IgG1-F890 han suprimido la inducción de inmunogenicidad de esta manera al disminuir la actividad de unión a FcyR.
Por otro lado, Fv4-IgG1-F947 no demostró el efecto de suprimir la inmunogenicidad como resultado de la disminución de la actividad de unión a FcyR. Aunque sin quedar ligados a una teoría específica, la razón de esto se puede analizar de la manera indicada a continuación.
Como se muestra en la fig. 16, la eliminación de Fv4-IgG1-F947 y Fv4-IgG1-F1009 del plasma es extremadamente rápida. Aquí, se cree que Fv4-IgG1-F1009 ha experimentado una disminución de la actividad de unión a FcyR de ratón y se cree que se inhibe la formación de un complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos. En consecuencia, se cree que Fv4-IgG1-F1009 se incorpora en células como resultado de la unión solo a FcRn expresado en la membrana celular de células tales como células endoteliales vasculares o células hematopoyéticas. Aquí, ya que FcRn también se expresa en las membranas celulares de algunas células presentadoras de antígenos, también se puede incorporar Fv4-IgG1-F1009 en células presentadoras de antígenos al unirse solo a FcRn. En otras palabras, entre la rápida eliminación de Fv4-IgG1-F1009 del plasma, se puede incorporar una parte en células presentadoras de antígenos.
Por otra parte, Fv4-IgG1-F1009 es un anticuerpo humano y es una proteína completamente extraña para los ratones. En otras palabras, se cree que los ratones tienen numerosas poblaciones de linfocitos T que responden específicamente a Fv4-IgG1-F1009. La mera pequeña cantidad de Fv4-IgG1-F1009 incorporada en células presentadoras de antígenos se presenta a linfocitos T después del procesamiento dentro de células y, ya que los ratones tienen numerosas poblaciones de linfocitos T que responden específicamente a Fv4-IgG1-F1009, se cree que se induce fácilmente una respuesta inmunitaria a Fv4-IgG1-F1009. En realidad, cuando se administra una proteína extraña en forma de receptor de IL-6 soluble humano a ratones como se indica en el ejemplo de referencia 4, el receptor de IL-6 soluble humano se elimina en un periodo corto de tiempo y se induce una respuesta inmunitaria al receptor de IL-6 soluble humano. Se cree que el hecho de que se indujera inmunogenicidad a pesar de que el receptor de IL-6 soluble humano no tiene actividad de unión a FcyR y FcRn en la región de pH neutro se debe a la rápida eliminación del receptor de IL-6 soluble humano y a la gran cantidad que se incorpora en células presentadoras de antígenos.
En otras palabras, en el caso de que una molécula de unión a antígeno sea una proteína extraña (tal como en el caso de la administración de una proteína humana a ratones), se cree que es más difícil suprimir una respuesta inmunitaria inhibiendo la formación de un complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos en comparación con el caso de que la molécula de unión a antígeno sea una proteína homóloga (tal como en el caso de administrar una proteína murina a ratones).
En realidad, en el caso de que la molécula de unión a antígeno sea un anticuerpo, ya que el anticuerpo administrado a seres humanos es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano, se produce una respuesta inmunitaria a la proteína homóloga. Por lo tanto, se llevó a cabo una evaluación en el ejemplo 11 para determinar si la inhibición de la formación de un complejo cuaternario conduce o no a una reducción de la inmunogenicidad mediante la administración de un anticuerpo de ratón a ratones.
[Ejemplo 11 ] Evaluación de la inmunogenicidad in vivo de anticuerpos de ratón que tienen actividad de unión a FcRn de ratón en condiciones de la región de pH neutro pero que no tienen actividad de unión a FcyR de ratón
(11-1) Estudio de inmunogenicidad in vivo en ratones normales
El siguiente estudio se realizó con el fin de verificar el efecto inhibidor sobre la inmunogenicidad obtenido al inhibir la formación de un complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos en el caso de que la molécula de unión a antígeno sea una proteína homóloga (como en el caso de administrar un anticuerpo de ratón contra ratones).
Se evaluó la producción de anticuerpos contra mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF40, mPM1-mIgG1-mF14 y mPM1-mIgG1-mF39 utilizando plasma de ratón obtenido en el ejemplo 6 según el método indicado a continuación.
(11-2) Medición del anticuerpo anti-muestra de ensayo administrada en plasma mediante luminiscencia electroquímica
Se midió el anticuerpo contra una muestra de ensayo administrada presente en plasma de ratón mediante luminiscencia electroquímica. En primer lugar, la muestra administrada se distribuyó en una placa de 96 pocillos de matriz múltiple, seguido de 1 hora de reacción a temperatura ambiente. Después del lavado de la placa, se prepararon muestras de medición de plasma de ratón diluidas 50 veces; y después de 2 horas de reacción a temperatura ambiente y lavado de la placa, se distribuyó la muestra administrada rutenada con NHS éster eon sulfomarcador (Meso Scale Discovery), seguido de reacción durante una noche a 4 °C. Después de lavar la placa al día siguiente, se distribuyó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery), seguido inmediatamente por la medición con el lector Sector PR 2400 (Meso Scale Discovery). El plasma de cinco animales a los que no se les administró el anticuerpo se midió como muestra de control negativo para cada sistema de medición y el valor (X) se obtuvo sumando el producto de multiplicar la desviación típica (DT) de los valores medidos utilizando el plasma de esos cinco animales por 1,645 a la media (MEDIA) de los valores medidos utilizando el plasma de los cinco animales, se utilizó como criterio para determinar una reacción positiva (ecuación 3). Se consideró que los animales que demostraron una reacción que superaba el criterio positivo incluso una vez en cualquiera de los días de recogida de sangre tenían respuesta de producción de anticuerpos positiva a la sustancia de prueba.
[Ecuación 3]
Criterio de evaluación positivo para la producción de anticuerpos (X) = MEDIA 1,645 x DT
(11-3) Efecto inhibidor sobre la inmunogenicidad in vivo al disminuir la actividad de unión a FcyR
Los resultados se muestran en las fig. 28 a 31. La fig. 28 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a mPM1-mIgG1-mF14 a los 14, 21 y 28 días después de la administración de mPM1-mIgG1-mF14 a ratones normales. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra mPM1-mIgG1-mF14 era positiva en los tres ratones a los 21 días después de la administración (tasa positiva: 3/3). Por otro lado, la fig. 29 muestra los títulos de anticuerpo de ratón producidos en respuesta a mPM1-mIgG1-mF39 a los 14, 21 y 28 días después de la administración de mPM1-mIgG1-mF39 a ratones normales. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra mPM1-mIgG1-mF39 era negativa en los tres ratones cada día que se extrajo sangre después de la administración (tasa positiva: 0/3).
La fig. 30 muestra títulos de anticuerpo de ratón producido en respuesta a mPM1-mIgG1-mF38 a los 14, 21 y 28 días después de la administración de mPM1-mIgG1-mF38 a ratones normales. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra mPM1-mIgG1-mF38 era positiva en dos de los tres ratones (n.° 1 y n.° 2) a los 28 días después de la administración (tasa positiva: 2/3). Por otro lado, La fig. 31 muestra títulos de anticuerpo de ratón producido en respuesta a mPM1-mIgG1-mF40 a los 14, 21 y 28 días después de la administración de mPM1-mIgG1-mF40 a ratones normales. Se ha mostrado que la producción de anticuerpo de ratón contra mPM1-mIgG1-mF40 era negativa en los tres ratones cada día que se extrajo sangre después de la administración (tasa positiva: 0/3).
Como se ha mostrado en el ejemplo 6, en relación con mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF40 ha disminuido la unión a diversos tipos de FcyR de ratón y, de forma similar, con respecto a mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF39 ha disminuido la unión a diversos tipos de FcyR de ratón.
Estos resultados confirmaron que incluso si los anticuerpos de ratón mPM1-mIgG1-mF38 y mPM1-mIgG1-mF14, que son proteínas homologas, se administraran a ratones normales, se confirmó la producción de anticuerpos en respuesta al anticuerpo administrado y se confirmó una respuesta inmunitaria. Como se indica en los ejemplos 1 y 2, se cree que esto se debe a la promoción de la incorporación en células presentadoras de antígenos mediante la formación de un complejo cuaternario en células presentadoras de antígenos aumentando la actividad de unión a FcRn en la región de pH neutro.
Se mostró que es posible reducir la inmunogenicidad in vivo inhibiendo la formación de un complejo cuaternario al disminuir la unión de dichas moléculas de unión a antígeno que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro a diversos tipos de FcyR de ratón.
Estos resultados indican que al disminuir la actividad de unión a FcyR de una molécula de unión a antígeno que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro, la inmunogenicidad de esa molécula de unión a antígeno se puede disminuir de manera extremadamente eficaz tanto in vitro como in vivo. En otras palabras, se indicó que la inmunogenicidad de una molécula de unión a antígeno que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR activo es menor que la actividad de unión de un dominio de unión de FcyR nativo (concretamente, una molécula de unión a antígeno de la realización 1 descrita en el ejemplo 3) disminuía notablemente en comparación con una molécula de unión a antígeno que tiene actividad de unión aproximadamente comparable a la del dominio de unión a FcyR nativo (es decir, una molécula de unión a antígeno capaz de formar un complejo cuaternario como se ha descrito en el ejemplo 3).
[Ejemplo 12] Producción y evaluación de anticuerpos humanos que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo
(12-1) Producción y evaluación de anticuerpos IgG1 humanos que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcvR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcvR nativo
En un aspecto no limitante de la presente invención, aunque los ejemplos preferibles de una región Fc cuya actividad de unión al FcyR activo es menor que la actividad de unión al FcyR activo de una región Fc de origen natural incluyen regiones Fc en las que uno o más aminoácidos en cualquiera de las posiciones 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 y 329 (numeración EU) entre los aminoácidos de la región Fc anteriormente mencionada se modifican a un aminoácido que difiere de la región Fc de origen natural, la modificación de la región Fc no se limita a la descrita anteriormente, sino que también puede ser, por ejemplo, desglucosilación (N297A, N297Q) descrita en Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691, modificaciones tales como IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331 S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A o IgG4-L236E, así como modificaciones tales como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R o N325LL328R descritas en el documento WO 2008/092117, inserción de aminoácidos en las posiciones 233, 234, 235 y 237 (numeración EU) y modificaciones de las ubicaciones descritas en el documento WO 2000/042072.
Los Fv4-IgG1-F890 y Fv4-IgG1-F947 producidos en el ejemplo 5 son anticuerpos que tienen actividad de unión al FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y se unen al receptor de IL-6 humano de una manera dependiente del pH. Se han producido diversas variantes en las que se redujo la unión a FcyR humano mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos en sus secuencias de aminoácidos (tabla 17). Más específicamente, se produjeron variantes que incluían VH3-IgG1-F938 (SEQ ID NO: 156), en la que Leu se sustituyó por Lys en la posición 235 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1315 (SEQ ID NO: 157), en la que Gly se sustituyó por Lys en la posición 237 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1316 (SEQ ID NO: 158), en la que Gly se sustituyó por Arg en la posición 237 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 en la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1317 (SEQ ID NO: 159), en la que Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) y Pro se sustituyó por Lys en la posición 329 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1318 (SEQ ID NO: 160), en la que Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 (numeración EU) y Pro se sustituyó por Arg en la posición 329 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1324 (SeQ ID NO: 161), en la que Leu se sustituyó por Ala en la posición 234 (numeración EU) y Leu se sustituyó por Ala en la posición 235 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1325 (SEQ ID NO: 162), en la que Leu se sustituyó por Ala en la posición 234 (numeración EU), Leu se sustituyó por Ala en la posición 235 y Asn se sustituyó por Ala en la posición 297 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1333 (SEQ ID NO: 163), en la que Leu se sustituyó por Arg en la posición 235 (numeración EU), Gly se sustituyó por Arg en la posición 236 y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1356 (SEQ ID NO: 164), en la que Gly se sustituyó por Arg en la posición 236 (numeración EU) y Leu se sustituyó por Arg en la posición 328 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1326 (SEQ ID NO: 155), en la que Leu se sustituyó por Ala en la posición 234 (numeración EU) y Leu se sustituyó por Ala en la posición 235 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F947, y VH3 -IgG 1 -F1327 (SEQ ID NO: 165), en la que Leu se sustituyó por Ala en la posición 234 (numeración EU), Leu se sustituyó por Ala en la posición 235 y Asn se sustituyó por Ala en la posición 297 de la secuencia de aminoácidos de VH3-IgG1-F947.
[Tabla 17]
Figure imgf000107_0001
(12-2) Confirmación de la actividad de unión a FcRn humano y FcvR humano
Se midió la actividad de unión (constante de disociación KD) a FcRn humano a pH 7,0 de anticuerpos que contienen cada una de las secuencias de aminoácidos producidas en (12-1) como cadenas pesadas y que contienen L(TS)-CK como cadena ligera utilizando el método del ejemplo 4. Además, se midió la actividad de unión a FcyR humano a pH 7,4 utilizando el método del ejemplo 7. Los resultados de la medición se muestran en la tabla 18 a continuación.
[Tabla 18]
Figure imgf000107_0002
Según los resultados de la tabla 18, no existen limitaciones particulares sobre las modificaciones de aminoácidos introducidas con el fin de disminuir la actividad de unión a diversos tipos de FcyR humano en comparación con la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo y esto se puede lograr utilizando diversas modificaciones de aminoácidos.
(12-3) Producción de un anticuerpo de unión anti-glipicano-3
Se realizó un análisis exhaustivo de la unión a cada FcyR de variantes de restos de aminoácidos que se cree que son los sitios de unión para FcyR en la región Fc de IgG1 para descubrir modificaciones en las que la unión a FcgR disminuye en comparación con IgG1 de origen natural. Se utilizó la región variable de un anticuerpo anti-glipicano-3 que tiene mejo dinámica plasmática descrita en el documento WO 2009/041062 en forma de anticuerpo de glipicano-3 que contiene la CDR de GpH7 (SEQ ID NO: 74) para la cadena H del anticuerpo. De manera análoga, se utilizó GpL16-k0 del anticuerpo de glipicano-3 que tiene mejor dinámica plasmática como se describe en el documento WO 2009/041062 (SEQ ID NO: 75) en común para la cadena L del anticuerpo. Además, se utilizó B3, obtenido introduciendo una mutación de K439E en G1d, en el que se habían eliminado Gly y Lys del extremo C de IgG1 (SEQ ID NO: 76), para la región constante de cadena H del anticuerpo. Esta cadena H se denomina posteriormente GpH7-B3 (SEQ iD NO: 77), mientras que la cadena L se denomina posteriormente GpL16-k0 (SEQ iD NO: 75).
(12-4) Análisis cinético de la unión a diversos tipos de FcyR
En primer lugar, con el fin de verificar la validez de un análisis exhaustivo utilizando GpH7-B3/GpL16-k0 como control, se realizó una comparación de la capacidad de unión a cada FcgR entre GpH7-B3/GpL16-k0 y GpH7-G1d/GpL16-k0 (tabla 19). Se evaluó la unión a cada FcyR humano (FcYRIa, FcYRIIa(H), FcYRIIa(R), FcYRIIb y FcYRIIa(F)) de ambos anticuerpos después de la expresión y purificación según el método del ejemplo de referencia 2 según el método indicado a continuación.
Se analizó la interacción entre cada anticuerpo modificado y el receptor Fcy preparado de la manera descrita anteriormente utilizando el Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 o Biacore 4000. Se utilizó HBS-EP+ (GE Healthcare) para el tampón de ejecución y se llevaron a cabo mediciones a 25 °C. Los chips utilizados fueron chips en los que se inmovilizaron péptidos antigénicos, proteína A (Thermo Scientific), proteína A/G (Thermo Scientific) o proteína L (ACTIGEN o Bio Vision) en el chip sensor CM5 de la serie S (GE Healthcare) o el chip sensor CM4 de la serie S (GE Healthcare) mediante acoplamiento de amina, o chips en los que se permitió que los péptidos antigénicos biotinilados preliminarmente interactuaran y después se inmovilizaron en el chip sensor de la serie S SA (certificado) (GE Healthcare). Los anticuerpos diana se capturaron en estos chips sensores, se permitió que el receptor Fcy diluido con el tampón de ejecución interactuara, seguido de la medición de la cantidad de anticuerpo unido. Las cantidades unidas se compararon entre anticuerpos. Sin embargo, ya que la cantidad de receptor Fcy unido depende de la cantidad de anticuerpo capturado, los valores utilizados para comparación se corrigieron en primer lugar dividiendo la cantidad de receptor Fcy unido por la cantidad capturada de cada anticuerpo. Mediante reacción con glicina-HCl 10 mM a pH 1,5, los chips sensores se regeneraron retirando el anticuerpo capturado por lavado en los chips sensores y se usaron repetidamente.
Se analizó la fuerza de unión según el siguiente método basado en los resultados del análisis de la interacción con cada FcyR. Se utilizó el valor obtenido al dividir el valor de la cantidad de GpH7-B3/GpL16-k0 unido a FcyR por el valor de la cantidad de GpH7-G1d/GpL16-k0 unido a FcyR y multiplicar ese valor por 100 como indicador de la actividad de unión relativa a cada FcyR. Según los resultados mostrados en la tabla 19, ya que la unión de GpH7-B3/GpL16-k0 a cada FcgR era aproximadamente igual a la de GpH7-G1d/GpL16-k0, se valoró que GpH7-B3/GpL16-k0 puede usarse como control en estudios posteriores.
[Tabla 19]
Figure imgf000108_0001
(12-5) Producción y evaluación de mutantes de Fc
A continuación, los aminoácidos y sus aminoácidos circundantes que se cree que están implicados en la unión a FcyR en la secuencia de aminoácidos de GpH7-B3 (de la posición 234 a la posición 239, de la posición 265 a la posición 271, posición 295, posición 296, posición 298, posición 300 y de la posición 324 a la posición 327 (numeración EU)) se sustituyeron respectivamente por 18 tipos de aminoácidos excluyendo los aminoácidos originales y Cys. Estos mutantes de Fc se denominan variantes B3. La unión de variantes b 3, expresadas y purificadas según el método del ejemplo de referencia 2, a cada FcyR (FcYRIa, FcYRIIa(H), FcYRIIa(R), FcYRIIb y FcYRIIIa(F)) se evaluó exhaustivamente según el método de (12-4).
Se evaluó la fuerza de unión según el siguiente método basado en los resultados del análisis de la interacción con cada FcyR. El valor de la cantidad de anticuerpo procedente de cada variante B3 unida a FcyR se dividió por el valor de la cantidad de anticuerpo comparativo en el que no se introdujeron mutaciones en B3 (anticuerpo que tiene la secuencia de IgG1 humana de origen natural en la posición 234 a la posición 239, posición 265 a la posición 271, posición 295, posición 296, posición 298, posición 300 y posición 324 a la posición 337, indicadas por la numeración EU) ligado a FcyR. A continuación, ese valor se multiplicó adicionalmente por 100 y el valor resultante se utilizó como indicador de la actividad de unión relativa a cada FcyR.
Las modificaciones que disminuyeron la unión a todos los FcgR entre las variantes analizadas se muestran en la tabla 21. Los 236 tipos de modificaciones mostrados en la tabla 20 son modificaciones que redujeron la unión a al menos un tipo de FcgR en comparación con el anticuerpo antes de la introducción de una modificación (GpH7-B3/GpL16-k0) y se cree que son modificaciones que tienen el efecto de reducir de forma similar la unión a al menos un tipo de FcgR incluso cuando se introducen en IgG1 de origen natural.
Por consiguiente, no existen limitaciones particulares en las modificaciones de aminoácidos introducidas para disminuir la actividad de unión a cada tipo de FcyR humano en comparación con la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo y se ha mostrado que era posible lograr esto mediante la introducción de las modificaciones de aminoácidos mostradas en la tabla 20 en al menos una ubicación. Además, las modificaciones de aminoácidos introducidas aquí pueden estar en una ubicación o una combinación de múltiples ubicaciones.
[Tabla 20]
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
(12-6) Producción y evaluación de un anticuerpo IgG2 humano y un anticuerpo IgG4 humano que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcvR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcvR nativo
Se produjo una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión de FcyR nativo de la manera descrita a continuación utilizando IgG2 humana o IgG4 humana.
Se produjo anticuerpo que contiene VH3-IgG2 (SEQ ID NO: 166) para la cadena pesada y L(TS)-CK (SEQ ID NO: 41) para la cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo de referencia 2 para su uso como anticuerpo de unión al receptor de IL-6 humano que tiene IgG2 humana para la región constante. De manera análoga, se produjo anticuerpo que contiene VH3-IgG4 (SEQ ID NO: 167) para la cadena pesada y L(TS)-CK (SEQ ID NO: 41) para la cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo de referencia 2 para su uso como anticuerpo de unión al receptor de IL-6 humano que tiene IgG4 humana para la región constante.
Se introdujeron sustituciones de aminoácidos en cada región constante de VH3-IgG2 y VH3-IgG4 con el fin de transmitir actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro. Más específicamente, se produjeron VH3-IgG2-F890 (SEQ ID NO: 168) y VH3-IgG4-F890 (SEQ ID n O: 169) mediante una sustitución de aminoácidos de VH3-IgG2 y VH3-IgG4 en la que Met se sustituyó por Tyr en la posición 252 (numeración EU), Asn se sustituyó por Tyr en la posición 434 y Tyr se sustituyó por Val en la posición 436.
Se introdujeron sustituciones de aminoácidos en cada región constante de VH3-IgG2-F890 y VH3-IgG4-F890 para reducir la unión a FcyR humano. Más específicamente, se produjo VH3-IgG2-F939 (SEQ ID NO: 170) mediante una sustitución de aminoácidos de VH3-IgG2-F890 en la que Ala se sustituyó por Arg en la posición 235 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239. Además, se produjo VH3-IgG4-F939 (SEQ ID NO: 171) mediante una sustitución de aminoácidos de VHE-IgG4-F890 en la que Leu se sustituyó por Arg en la posición 235 (numeración EU) y Ser se sustituyó por Lys en la posición 239.
Se produjo anticuerpo que contiene el VH3-IgG2-F890, VH3-IgG4-F890, VH3-IgG2-F939 o VH3-IgG4-F939 producido como cadena pesada y L(TS)-CK (SEQ ID NO: 41) como cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo de referencia 2.
(12-7) Evaluación de un anticuerpo IgG2 humano y un anticuerpo IgG4 humano que tienen actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcvR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcvR nativo
Se midió la actividad de unión (constante de disociación KD) al FcRn humano a pH 7,0 del anticuerpo (tabla 21) producido en (12-6) utilizando el método del ejemplo 4. Además, se midió la actividad de unión a FcyR humano a pH 7,4 utilizando el método del ejemplo 7. Los resultados de la medición se muestran en la tabla 22 a continuación. [Tabla 21]
Figure imgf000115_0001
[Tabla 22]
Figure imgf000115_0002
Los resultados de la tabla 22 mostraron que es posible lograr una región Fc que tiene actividad de unión a FcRn humano en la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcyR humano es menor que la actividad de unión de un dominio de unión a FcyR nativo mediante el uso de IgG 1 humana sin limitación particular y también se pueden usar IgG2 o IgG4 humanas.
[Ejemplo 13] Producción y evaluación de una molécula de unión a antígeno en la que solo uno de dos polipéptidos que componen el dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro Se produjo una molécula de unión a antígeno en la que solo uno de los dos polipéptidos que componen el dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro, mientras que el otro no tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro como se ha mostrado en la realización 3 en el ejemplo 3, de la manera indicada a continuación.
(13-1) Producción de una molécula de unión a antígeno en la que solo uno de dos polipéptidos que componen el dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro mientras que el otro no tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro
En primer lugar, se produjo VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 70) según el método del ejemplo de referencia 1 como la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-6R humano que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro. Además, VH3-IgG1-F46 (SEQ ID NO: 71) se produjo añadiendo una sustitución de aminoácidos obtenida al sustituir Ile por Ala en la posición 253 (numeración EU) VH3-IgG1 para su uso como molécula de unión a antígeno que no tiene actividad de unión a FcRn tanto en la región de pH ácido como en la región de pH neutro. El uso de regiones Fc en las que una región Fc de un anticuerpo contiene sustituciones en las que Asp se sustituye por Lys en la posición 356 (numeración EU) y Glu se sustituye por Lys en la posición 357 (numeración EU) y la otra región Fc contiene sustituciones en las que Lys se sustituye por Glu en la posición 370 (numeración EU), His se sustituye por Arg en la posición 435 (numeración EU) y Lys se sustituye por Glu en la posición 439 (numeración EU) se conoce como un método para obtener un heterodímero de un anticuerpo con alta pureza (documento WO 2006/106905).
Se produjo VH3-IgG1-FA6a (SEQ ID NO: 72) en el que Asp se sustituye por Lys en la posición 356 (numeración EU) y Glu se sustituye por Lys en la posición 357 (numeración EU) de VH3-IgG1-F947 (denominado en lo sucesivo en la presente memoria cadena pesada A). Además, se produjo VH3-IgG1-FB4a (SEQ ID NO: 73) en el que Lys se sustituye por Glu en la posición 370 (numeración EU), His se sustituye por Arg en la posición 435 (numeración EU) y Lys se sustituye por Glu en la posición 439 (numeración EU) de VH3-IgG1-F46 (denominado en lo sucesivo en la presente memoria cadena pesada B) (tabla 23).
[Tabla 23]
Figure imgf000116_0001
Se produjo Fv4-IgG1-FA6a/FB4a con referencia al método del ejemplo de referencia 2 que tiene VH3-IgG1-FA6a y VH3-IgG1-FB4a como cadenas pesadas y VL3-CK para la cadena ligera añadiendo cantidades iguales de plásmidos de cadena pesada en forma de VH3-IgG1-FA6a y VH3-IgG1-FB4a.
(13-2) Estudio de PK de una molécula de unión a antígeno en el que solo uno de los dos polipéptidos que componen el dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro mientras que el otro no tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro
Se realizó un estudio de PK según el método descrito a continuación en la administración de Fv4-IgG1-F947 y Fv4-IgG1-FA6a/FB4a a ratones transgénicos para FcRn humano.
Se administró anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano a 1 mg/kg en una sola administración debajo de la piel del lomo de ratones transgénicos para FcRn humano (ratón 32 /+ de línea Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). Se recogió sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1,2, 3, 4 y 7 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. El plasma se obtuvo centrifugando inmediatamente la sangre recogida durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
La concentración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en plasma de ratón se midió mediante ELISA de la misma manera que en el método del ejemplo 4. Los resultados se muestran en la fig. 32. Se ha mostrado que Fv4-IgG1-FA6a/FB4a, que es capaz de unirse a una sola molécula de FcRn humano a través de una única región de unión, demuestra un cambio de mayor concentración en plasma en comparación con Fv4-IgG1-F947, que es capaz de unirse a dos moléculas de FcRn humano a través de dos regiones de unión.
Como se ha descrito anteriormente, aunque hay dos regiones de unión a FcRn en la región Fc de IgG, se ha informado de que las moléculas que tienen una Fc de la que se ha suprimido una de las dos regiones de unión a FcRn se eliminan del plasma más rápidamente en comparación con moléculas que tienen una región Fc de origen natural (Scand. J. Immunol., 1994; 40: 457-465). En otras palabras, se sabe que la IgG que tiene dos regiones de unión que se unen a FcRn en condiciones de la región de pH ácido demuestra mejor permanencia en plasma en comparación con IgG que tiene una única región de unión a FcRn. Estas mostraron que la IgG incorporada en células se recicla de nuevo al plasma al unirse a FcRn dentro de los endosomas y ya que la IgG de origen natural es capaz de unirse a dos moléculas de FcRn por medio de dos regiones de unión a FcRn, se une a FcRn con una alta capacidad de unión y, por lo tanto, se cree que se recicla una gran cantidad de IgG. Por otro lado, se cree que la IgG que tiene solo una única región de unión a FcRn tiene una baja capacidad de unión para FcRn dentro de los endosomas y, ya que no puede reciclarse adecuadamente, se elimina del plasma más rápidamente.
Por consiguiente, en Fv4-IgG1-FA6a/FB4a que tiene solo un único sitio de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro como se muestra en la fig. 32, el fenómeno por el que se observa una mejora de la permanencia en plasma fue completamente inesperado ya que es lo opuesto al del caso de la IgG de origen natural.
Aunque la presente invención no está ligada a una teoría específica, una posible razón de la transición observada de estos altos niveles de permanencia en plasma es un aumento de la tasa de absorción de anticuerpo por debajo de la piel en la administración subcutánea de anticuerpo a ratones.
En general, se cree que el anticuerpo que se ha administrado por vía subcutánea migra al plasma después de ser absorbido a través del sistema linfático (J. Pharm. Sci. (2000) 89 (3), 297-310). Ya que hay una gran cantidad de células inmunitarias presentes en el sistema linfático, se cree que el anticuerpo que se ha administrado por vía subcutánea migra al plasma después de haber sido expuesto a un gran número de células inmunitarias. En general, se sabe que la inmunogenicidad aumenta cuando las preparaciones farmacéuticas de anticuerpos se administran por vía subcutánea en comparación con su administración intravenosa y una posible causa de esto es que los anticuerpos administrados por vía subcutánea están expuestos a un gran número de células inmunitarias en el sistema linfático. En realidad, como se ha mostrado en el ejemplo 1, se ha confirmado que, cuando se administra por vía subcutánea, se eliminó rápidamente Fv4-IgG1-F1 del plasma y esto sugiere la producción de anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F1. Por otro lado, en el caso de la administración intravenosa, no se confirmó la eliminación rápida de Fv4-IgG1-F1 del plasma, lo que sugiere que no se produjo anticuerpo de ratón contra Fv4-IgG1-F1.
Concretamente, durante el transcurso de la absorción de un anticuerpo administrado por vía subcutánea, cuando el anticuerpo se incorpora en células inmunitarias presentes en el sistema linfático, provoca una disminución de la biodisponibilidad y al mismo tiempo se convierte en una causa de inmunogenicidad.
Sin embargo, en el caso de la administración subcutánea de la molécula de unión a antígeno mostrada como un ejemplo de la realización 3 en el ejemplo 3 en el que solo uno de dos polipéptidos que componen el dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro mientras que el otro polipéptido no tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro, incluso si se expone a células inmunitarias presentes en el sistema linfático durante el transcurso de la absorción, no se cree que se forme un complejo cuaternario en la membrana celular de células inmunitarias. Por consiguiente, se produce un aumento de la biodisponibilidad debido a la inhibición de la incorporación en células inmunitarias presentes en el sistema linfático y, como resultado, se considera posible que se haya producido un aumento de la concentración en plasma.
Los métodos para provocar un aumento de la concentración en plasma o una disminución de la inmunogenicidad al aumentar la biodisponibilidad de un anticuerpo administrado por vía subcutánea no se limitan a moléculas de unión a antígeno mostradas como la realización 3 del ejemplo 3. En su lugar, se puede utilizar cualquier molécula de unión a antígeno siempre que sea una molécula de unión a antígeno que no forme un complejo cuaternario en la membrana celular de células inmunitarias. Es decir, cuando se administra por vía subcutánea, se cree que cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de las realizaciones 1, 2 y 3 puede mejorar la permanencia en plasma y, al mismo tiempo, aumentar la biodisponibilidad y provocar además una disminución de la inmunogenicidad, en comparación con moléculas de unión a antígeno capaces de formar un complejo cuaternario.
Se cree que una parte de las moléculas de unión a antígeno que permanecen en el plasma migran siempre al sistema linfático. Además, también están presentes células inmunitarias en sangre. Por consiguiente, aunque la adaptación de la presente invención no está limitada en absoluto a una vía de administración específica, se cree que un ejemplo que se espera que demuestre efectos de manera particularmente fácil es una vía de administración mediada por el sistema linfático durante el transcurso de la absorción de una molécula de unión a antígeno y uno de estos ejemplos es la administración subcutánea.
[Ejemplo 14] Producción de anticuerpo que tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y actividad de unión selectiva a FcyR inhibidor
Además, la molécula de unión a antígeno de la realización 2 mostrada en el ejemplo 3 puede producirse utilizando una modificación que produzca una mejora de la actividad de unión selectiva a FcYRIIb inhibidor para una molécula de unión a antígeno que tiene mejor unión a FcRn en condiciones neutras. En otras palabras, una molécula de unión a antígeno que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones neutras y en la que se introduce una modificación para producir un aumento de la actividad de unión selectiva a FcYRIIb inhibidor es capaz de formar un complejo cuaternario mediado por dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR. Sin embargo, ya se produce que unión selectiva al FcyR inhibidor por el efecto de esa modificación, se reduce la actividad de unión a FcyR activo. Se cree que, como resultado, se forma preferentemente un complejo cuaternario que contiene FcyR inhibidor en células presentadoras de antígenos. Como se ha descrito anteriormente, se cree que la inmunogenicidad está provocada por la formación de un complejo cuaternario que contiene FcyR activo y puede inhibirse la respuesta inmunitaria como resultado de la formación de un complejo cuaternario que contiene FcyR inhibidor de esta manera.
Por lo tanto, el siguiente estudio se realizó con el fin de descubrir mutaciones de aminoácidos que producen mejora de la actividad de unión selectiva a FcYRIIb inhibidor.
(14-1) Análisis exhaustivo de la unión a FcyR de la variante de Fc
Se realizó un análisis exhaustivo sobre la actividad de unión a cada FcyR de una pluralidad de variantes de anticuerpos IgG1 en las que se introdujo una mutación que reduce la unión mediada por Fc a FcyR activo, en particular cualquiera de los polimorfismos de tipo H y tipo R de FcYRIIa, en comparación con IgG1 de origen natural y mejora la unión a FcYRIIb.
Se utilizó la región variable de un anticuerpo anti-glipicano-3 que tiene mejo dinámica plasmática descrita en el documento WO 2009/041062 en forma de un anticuerpo de glipicano-3 que contiene la c Dr de GpH7 (SEQ ID NO: 74) para la cadena H del anticuerpo. De manera análoga, se utilizó GpL16-k0 del anticuerpo de glipicano-3 que tiene mejor dinámica plasmática descrita en el documento WO 2009/041062 (SEQ ID NO: 75) en común para la cadena L del anticuerpo en combinación con la cadena H diferente. Además, se utilizó B3, obtenido introduciendo una mutación de K439E en G1d, en el que se habían eliminado Gly y Lys del extremo C de IgG 1 (SEQ ID NO: 76), para la región constante de cadena H del anticuerpo. Esta cadena H se denomina posteriormente GpH7-B3 (SEQ ID NO: 77), mientras que la cadena L se denomina posteriormente GpL16-k0 (SEQ ID NO: 75).
Los aminoácidos y sus aminoácidos circundantes que se cree que están implicados en la unión a FcyR en la secuencia de aminoácidos de GpH7-B3 (de la posición 234 a la posición 239, de la posición 265 a la posición 271, posición 295, posición 296, posición 298, posición 300 y de la posición 324 a la posición 337 (numeración EU)) se sustituyeron respectivamente por 18 tipos de aminoácidos excluyendo los aminoácidos anteriores y Cys. Estas variantes de Fc se denominan variantes B3. La actividad de unión de las variantes B3 expresadas y purificadas según el método del ejemplo de referencia 2 a cada FcyR (FcYRIa, FcYRIIa(H), FcYRIIa(R), FcYRIIb y FcYRIIIa) se evaluó exhaustivamente de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 9.
Se prepararon diagramas para cada FcyR de acuerdo con el método descrito a continuación. Concretamente, el valor de la cantidad de anticuerpo procedente de cada variante B3 unida a FcyR se dividió por el valor de la cantidad de anticuerpo de control que no tiene mutaciones introducidas en B3 (anticuerpo que tiene la secuencia de IgG 1 humana de origen natural en la posición 234 a la posición 239, posición 265 a la posición 271, posición 295, posición 296, posición 298, posición 300 y posición 324 a la posición 337 (numeración EU)). A continuación, ese valor se multiplicó adicionalmente por 100 y el valor resultante se expresó como el valor de unión a cada FcyR. La unión de cada variante a FcYRIIb se representó en el eje horizontal y los valores de cada FcyR activo en forma de FcYRIa, FcYRIIa(H), FcYRIIa(R) y FcYRIIIa se representaron respectivamente en el eje vertical (figs. 33, 34, 35 y 36).
Como resultado, como se indica en las etiquetas de las figs. 33 a 36, entre todas las modificaciones, la mutación A (modificación obtenida al sustituir Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU)) y la mutación B (modificación obtenida al sustituir Leu por Glu en la posición 328 (numeración EU)) demostraron una unión notablemente mejorada a FcYRIIb en comparación con IgG 1 de origen natural y se descubrió que demostraban un efecto de supresión notable de la unión a ambos tipos de FcyRIIa.
(14-2) Análisis RPS de variantes de unión selectiva a FcvRIIb
Se realizó un análisis más detallado de la unión a cada FcyR de la variante obtenida al sustituir Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU) descubierta en (14-1).
Para la cadena H de IgG 1, la región variable de IL6R-H descrita en el documento WO 2009/125825 (SEQ ID NO: 78) que es la región variable de un anticuerpo contra el receptor de interleucina-6 humano se utiliza como región variable de cadena H de anticuerpo y IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79) que contiene una región constante de G1d de la que se había eliminado Gly y Lis del extremo C de la IgG1 humana se utiliza como región constante de cadena H de anticuerpo. Se produjo IL6R-G1d_v1 (SEQ ID NO: 80) en el que Pro se sustituyó por Asp en la posición 238 (numeración EU) de IL6R-G1d. A continuación, se produjo IL6R-G1d_v2 (SEQ ID NO: 81) en el que Leu se sustituyó por Glu en la posición 328 (numeración EU) de IL6R-G1 d. Con el fin de comparar, se produjo IL6R-G1d_v3 (SEQ ID NO: 82) que es una variante de IL6R-G1d, en el que se introdujo una mutación conocida (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933) sustituyendo Ser por Glu en la posición 267 (numeración EU) y sustituyendo Leu por Phe en la posición 328 (numeración EU). Se utilizó IL6R-L (SEQ ID NO: 83) que es la cadena L de tocilizumab en común para la cadena L de anticuerpo en combinación con estas cadenas pesadas. Los anticuerpos se expresaron y purificaron de acuerdo con el método del ejemplo de referencia 2. Los anticuerpos que contienen como cadena H del anticuerpo IL6R-G1d, IL6R-G1d_v1, IL6R-G1 d v2 e IL6R-G1d_v3 se denominan en lo sucesivo en la presente memoria respectivamente IgG1, IgG 1 -v1, IgG1-v2 e IgG1-v3.
A continuación, la interacción entre estos anticuerpos y FcyR se analizó cinéticamente utilizando el Biacore T100 (GE Healthcare). La interacción se midió a una temperatura de 25 °C utilizando HBS-EP+ (GE Healthcare) para el tampón de ejecución. Se utilizó el chip sensor CM5 serie S (GE Healthcare) después de inmovilizar la proteína A mediante acoplamiento de amina. La unión de cada FcyR al anticuerpo se midió permitiendo que cada FcyR diluido con tampón de ejecución actuara sobre el chip en el que se había capturado un anticuerpo diana. El anticuerpo capturado en el chip se lavó permitiendo que glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) reaccionara después de la medición. El chip regenerado de esta manera se utilizó repetidamente. La constante de disociación KD (mol/l) se calculó a partir de la constante de velocidad de asociación ka (l/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s) calculada mediante el ajuste global de los resultados de la medición con un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore.
Ya que la unión de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcvRIIa(H) o FcYRIIIa fue extremadamente débil, KD no se pudo calcular mediante ajuste global de los resultados de medición con el modelo de unión de Langmuir 1:1 mencionado anteriormente utilizando el software de evaluación Biacore. Podría calcularse la KD para la interacción de IgG 1 -v1 e IgG1-v2 con FcvRIIa(H) o FcYRIIIa utilizando el siguiente modelo de unión 1:1 descrito en el manual del programa informático Biacore T100 BR1006-48, edición AE.
El comportamiento de las moléculas de interacción en el sistema Biacore utilizando el modelo de unión 1:1 se puede representar mediante la ecuación 4 a continuación.
[Ecuación 4]
Req = C x Rmáx/(KD C) RI
El significado de cada parámetro en la ecuación 4 mencionada anteriormente es el siguiente:
Req (UR): Nivel de unión en estado estacionario
C (M): Concentración de analito
C: Concentración
Rmáx (UR): Capacidad de unión a superficie del analito
IR (UR): Contribución en bruto del índice de refracción en la muestra
KD (M): Constante de disociación en equilibrio
La KD se puede expresar como en la ecuación 5 a continuación transformando la ecuación 4.
[Ecuación 5]
KD = C x Rmáx/(Req - RI) - C
KD se puede calcular sustituyendo los valores de Rmáx, IR y C en esta ecuación. En las condiciones de medición utilizadas aquí, los valores sustituidos en la ecuación fueron IR = 0 y C = 2 pmol/l. Se utilizó el valor obtenido al dividir el valor de Rmáx obtenido al realizar ajuste global de los resultados del análisis de la interacción de IgG1 con cada FcyR utilizando el modelo de unión de Langmuir 1:1 por la cantidad de IgG1 capturada y multiplicar por las cantidades capturadas de IgG1-v1 e IgG1-v2 para Rmáx.
En las condiciones de medición utilizadas aquí, la unión de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcYRIIa(H) fue de aproximadamente 2,5 UR y 10 UR, respectivamente, y la unión de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcYRIIIa fue de aproximadamente 2,5 UR y 5 UR, respectivamente. Las cantidades capturadas de anticuerpos IgG1-v1 e IgG1-v2 en el chip sensor durante el análisis de la interacción de IgG 1 con FcYRIIa(H) fueron 469,2 UR y 444,2 UR, y las cantidades capturadas de anticuerpos IgG1-v1 e IgG1-v2 en el chip sensor durante el análisis de la interacción de IgG1 con FcYRIIIa fueron 470,8 UR y 447,1 UR. Además, los valores de Rmáx obtenidos por ajuste global de los resultados del análisis de la interacción de IgG1 con FcYRIIa(H) y FcYRIIIa utilizando el modelo de unión de Langmuir 1:1 fueron 69,8 UR y 63,8 UR, respectivamente, y las cantidades de anticuerpo capturadas en el chip sensor fueron 452 UR y 454,5 UR, respectivamente. Se calculó que los valores de Rmáx de IgG1-v1 e IgG1-v2 contra FcYRIIa(H) eran 72,5 UR y 68,6 UR, respectivamente, mientras que se calculó que los valores de Rmáx de IgG 1 -v1 e IgG1-v2 contra FcYRIIIa eran 66,0 UR y 62,7 UR, respectivamente, utilizando estos valores. Se calcularon los valores de KD para IgG1-v1 e IgG1-v2 contra FcYRIIa(H) y FcYRIIIa sustituyendo estos valores en la ecuación 5.
[Ecuación 5]
KD = C x Rmáx/(Req - RI) - C
Los valores de KD de IgG 1, IgG1-v1, IgG1-v2 e IgG1-v3 contra cada FcyR (valores de KD de cada anticuerpo contra cada FcyR) se muestran en la tabla 24, mientras que los valores de KD relativos de IgG 1 -v1, IgG1-v2 e IgG1-v3, obtenidos al dividir los valores de KD de IgG 1 contra cada FcyR por los valores de KD de IgG1-v1, IgG1-v2 e IgG1-v3 contra cada FcyR (valores de KD relativos de cada anticuerpo contra cada FcyR) se muestran en la tabla 25.
[Tabla 24]
Figure imgf000119_0001
En la tabla 24 anterior, los asteriscos indican valores de KD que se calcularon utilizando la ecuación 5 cuando la unión de FcyR a IgG no se observó adecuadamente.
[Ecuación 5]
KD = C x Rmáx/(Req - RI) - C
[Tabla 25]
Figure imgf000120_0001
Como se muestra en la tabla 25, la afinidad de IgG1-v1 por FcYRIa disminuyó a 0,047 veces en comparación con IgG1, la afinidad por FcYRIIa(R) disminuyó a 0,10 veces, la afinidad por FcYRIIa(H) disminuyó a 0,014 veces y la afinidad por FcyRIi Ia disminuyó a 0,061 veces. Por otro lado, la afinidad por FcYRIIb mejoró 4,8 veces.
Además, como se muestra también en la tabla 25, la afinidad de IgG1-v2 por FcYRIa disminuyó a 0,74 veces en comparación con IgG 1, la afinidad por FcYRIIa(R) disminuyó a 0,41 veces, la afinidad por FcYRlIa(H) disminuyó a 0,064 veces y la afinidad por FcYRIIIa disminuyó a 0,14 veces. Por otro lado, la afinidad por FcYRIIb mejoró 2,3 veces.
Concretamente, según estos resultados, IgG1-v1, en el que Pro se sustituyó por Asp en la posición 238 (numeración EU) e IgG1-v2, en el que Leu se sustituyó por Glu en la posición 328 (numeración EU) demostró unión disminuida a todas las formas activas de FcyR, incluyendo ambos polimorfismos de FcYRIIa; y la unión a FcYRIIb que es inhibidor de FcyR se incrementó claramente. Hasta ahora, no se han informado de alteraciones que tengan dichas propiedades y son muy poco habituales, como se muestra en las figs. 33 a 36. Las alteraciones producidas al sustituir Pro en la posición 238 (numeración EU) por Asp o sustituir Leu en la posición 328 (numeración EU) por Glu son muy útiles para el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades inflamatorias inmunológicas y similares.
Asimismo, como se muestra en la tabla 25, IgG1-v3 ciertamente muestra una unión 408 veces mayor a FcYRIIb, mientras que la unión a FcYRIIa (H) se disminuye a 0,51 veces y la unión a FcYRIIa (R) aumenta a 522 veces. Por consiguiente, ya que IgG1-v1 e IgG1-v2 suprimen su unión tanto a FcYRIIa (R) como a FcYRIIa (H) y mejoran su unión a FcYRIIb, se considera que son variantes que se unen con una mayor selectividad de FcYRIIb en comparación con IgG1-v3. De manera específica, las alteraciones producidas al sustituir Pro en la posición 238 (numeración EU) por Asp o sustituir Leu en la posición 328 (numeración EU) por Glu son muy útiles para el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades inflamatorias inmunológicas y similares.
(14-3) Efectos de combinación de la modificación de la unión selectiva a FcvRIIb y otras sustituciones de aminoácidos de la región Fc
En (14-2), se descubrió que una variante obtenida al sustituir Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de IgG1 humana de origen natural o una variante obtenida al sustituir Leu por Glu en la posición 328 (numeración EU) demostraban disminución de la unión mediada por Fc a FcYRIa, FcvRIIIa y cualquiera de los polimorfismos de FcvRIIa, así como mejor unión a FcYRIIb. Por lo tanto, se crearon variantes de Fc para reducir adicionalmente la unión a cualquiera de FcyRI, FcvRIIa(H), FcvRIIa(R) y FcvRIIIa, y mejorar adicionalmente la unión a FcYRIIb como resultado de la introducción de sustituciones de aminoácidos adicionales en la variante obtenida al sustituir Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU) o la variante obtenida al sustituir Leu por Glu en la posición 328 (numeración EU).
(14-4) Producción de anticuerpos que tienen actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcvRIIb humano se ha mejorado selectivamente
Se produjeron anticuerpos según el método mostrado a continuación con el fin de mejorar selectivamente la actividad de unión a FcYRIIb humano para VH3-IgG1 y VH3-IgG1-F11. Se produjo VH3-IgG1-F648 (SEQ ID NO: 84) introduciendo una sustitución de aminoácidos obtenida sustituyendo Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU) en VH3-IgG1 según el método del ejemplo de referencia 1. De manera análoga, se produjo VH3-IgG1-F652 (SEQ ID NO: 85) introduciendo una sustitución de aminoácidos obtenida sustituyendo Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU) en VH3-IgG1-F11 según el método del ejemplo de referencia 1.
(14-5) Evaluación de anticuerpos que tienen actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro y cuya actividad de unión a FcvRIIb humano se ha mejorado selectivamente
Se produjeron anticuerpos que contienen VH3-IgG1, VH3-IgG1-F648, VH3-IgG1-F11 o VH3-IgG1-F652 para la cadena pesada y L(TS)-CK para la cadena ligera según el método del ejemplo de referencia 2.
La interacción de estos anticuerpos con FcYRIIa(R) y FcYRIIb se analizó utilizando el Biacore T100 (GE Healthcare). Se llevaron a cabo mediciones a 25 °C utilizando un tampón que consistía en ACES 20 mM, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05 % (pH 7,4) para el tampón de ejecución. Se utilizó el chip sensor CM4 serie S (GE Healthcare) después de inmovilizar la proteína L mediante acoplamiento de amina. La interacción de cada FcyR con el anticuerpo se midió permitiendo que cada FcyR diluido con tampón de ejecución actuara sobre el chip en el que se había capturado un anticuerpo diana. El anticuerpo capturado en el chip se lavó haciendo reaccionar con glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) después de la medición y el chip regenerado de esta manera se usó repetidamente.
Los resultados de las mediciones se analizaron utilizando el programa informático de evaluación Biacore. El anticuerpo fue capturado por la proteína L y la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de capturar el anticuerpo se definió como X1. A continuación, se permitió que los FcyR humanos interactuaran con el anticuerpo y el valor obtenido al restar la actividad de unión de los FcyR humanos representada como la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de permitir que el tampón de ejecución interactúe con el anticuerpo capturado por la proteína L (AA2) del valor obtenido al multiplicar por 1500 el valor obtenido al dividir la actividad de unión de los FcyR humanos representados como la cantidad de cambio en un sensorgrama antes y después de esa interacción (AA1) por la cantidad capturada (X) de cada anticuerpo, se dividió por la cantidad capturada de cada anticuerpo (X) seguido de multiplicar por 1500 para obtener la actividad de unión de los FcyR humanos (Y) (ecuación 1).
[Ecuación 1]
Actividad de unión de FcyR de ratón (Y) = (AA1 - AA2)/X x 1500
Los resultados se muestran en la tabla 26 a continuación. Se confirmó que el efecto de potenciar selectivamente la actividad de unión a FcYRIIb humano mediante la introducción de una mutación obtenida al sustituir Pro por Asp en la posición 238 (numeración EU) se observa igualmente incluso en el caso de introducción en un anticuerpo que tiene actividad de unión a FcRn humano en condiciones de la región de pH neutro.
[Tabla 26]
Figure imgf000121_0001
El IgG1-F652 obtenido aquí es un anticuerpo que tiene actividad de unión a FcRn en condiciones de la región de pH neutro y que produce aumento de la actividad de unión selectiva a FcYRIIb inhibidor. Concretamente, este anticuerpo corresponde a una molécula de unión a antígeno de la realización 2 mostrada en el ejemplo 3. En otras palabras, IgG1-F652 es capaz de formar un complejo cuaternario mediado por dos moléculas de FcRn y una molécula de FcyR; sin embargo, ya que produce mejora de la actividad de unión selectiva al FcyR inhibidor, la actividad de unión al FcyR activo disminuye. Como resultado, se cree que un complejo cuaternario que contiene FcyR inhibidor se forma preferentemente en células presentadoras de antígenos. Como se ha descrito anteriormente, se cree que la inmunogenicidad está provocada por la formación de un complejo cuaternario que contiene FcyR activo y que la respuesta inmunitaria se inhibe como resultado de la formación de un complejo cuaternario que contiene FcyR inhibidor de esta manera.
[Ejemplo de referencia 1] Construcción de vectores de expresión de anticuerpos IgG con aminoácidos sustituidos
Se prepararon mutantes utilizando el equipo de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se insertaron fragmentos de plásmidos que contenían los mutantes en vectores de expresión de células animales para construir vectores de expresión de cadena L y cadena H deseados. Las secuencias de nucleótidos de los vectores de expresión resultantes se determinaron mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica.
[Ejemplo de referencia 2] Expresión y purificación de anticuerpos IgG
Los anticuerpos se expresaron utilizando el siguiente método. La línea celular HEK293H procedente de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen) se suspendió en DMEM (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Las células se sembraron en placas a 10 ml por placa en placas para células adherentes (10 cm de diámetro; CORNING) a una densidad celular de 5 a 6 x 105 células/ml y cultivadas en una incubadora de CO2 (37 °C, CO2 al 5 %) durante todo un día y una noche. A continuación, el medio se eliminó por aspiración y se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen). El plásmido preparado se introdujo en las células mediante el método de lipofección. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo resultantes, se centrifugaron (aproximadamente 2000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para eliminar las células y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro MILLEX (marca registrada)-GV (Millipore) de 0,22 pm para obtener los sobrenadantes. Los anticuerpos se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo obtenidos mediante un método conocido por los expertos en la técnica utilizando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Para determinar la concentración del anticuerpo purificado, se midió la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de absorbancia calculado por el método descrito en Protein Science (1995) 4: 2411 -2423.
[Ejemplo de referencia 3] Preparación del receptor de IL-6 humano soluble (hsIL-6R)
El receptor de IL-6 humano recombinante del receptor de IL-6 humano que es un antígeno se preparó de la manera descrita a continuación. Se construyó una línea CHO que expresa constantemente el receptor de IL-6 humano soluble compuesto por una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1 a 357 del extremo N como se informa en J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968 (en lo sucesivo en la presente memoria denominado hsIL-6R) utilizando un método conocido entre las personas con experiencia normal en la técnica. El receptor de IL-6 humano soluble se expresó cultivando esta línea CHO. El receptor de IL-6 humano soluble se purificó del sobrenadante del cultivo de la línea CHO resultante mediante las dos etapas de cromatografía en columna Blue Sepharose 6 FF y cromatografía en columna de filtración en gel. La fracción que eluyó como el pico principal en la etapa final se utilizó como producto purificado final.
[Ejemplo de referencia 4] Estudio de PK sobre el receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpos humanos en ratones normales
Para examinar la permanencia en plasma y la inmunogenicidad del receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpos humanos en un ratón normal, se realizó la siguiente prueba.
(4-1) Examen de la permanencia en plasma e inmunogenicidad del receptor de IL-6 humano soluble en ratones normales
Para examinar la permanencia en plasma y la inmunogenicidad del receptor de IL-6 humano soluble en un ratón normal, se realizó la siguiente prueba.
Se administró una dosis única (50 pg/kg) del receptor de IL-6 humano soluble (preparado en el ejemplo de referencia 3) en la vena caudal de un ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Japan). Se recogieron muestras de sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1,2, 3, 4, 7, 14 y 21 días después de la administración del receptor de IL-6 humano soluble. Las muestras de sangre se centrifugaron inmediatamente durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm para separar el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición. La concentración plasmática del receptor de IL-6 humano soluble y el título de anticuerpo del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano de ratón soluble se determinaron como se describe a continuación.
La concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en un ratón se determinó mediante un método de electroquimioluminiscencia. Una muestra de curva de calibración del receptor de IL-6 humano soluble, preparada a 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 o 31,25 pg/ml, y una muestra de medición de plasma de ratón, diluida 50 veces o más, se mezclaron con un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) rutenado con NHS éster eon sulfomarcador (Meso Scale Discovery), un anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) y tocilizumab, seguido de reacción durante una noche a 37 °C. Se preparó tocilizumab a una concentración final de 333 pg/ml. Posteriormente, el líquido de reacción se distribuyó en una placa de estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Además, después de lavar el líquido de reacción que se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, se distribuyó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery). Posteriormente, el líquido de reacción se sometió inmediatamente a medición utilizando un lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). La concentración del receptor de IL-6 humano soluble se calculó a partir de la respuesta de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices).
El título del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano de ratón en plasma de ratón se determinó mediante un método de electroquimioluminiscencia. En primer lugar, el receptor de IL-6 humano se distribuyó en una placa sin recubrimiento MA100 PR (Meso Scale Discovery). La placa se dejó reposar sin alteraciones durante una noche a 4 °C para preparar una placa de fase sólida del receptor de IL-6 humano. La placa de fase sólida del receptor de IL-6 humano, con una muestra de medición de plasma de ratón diluida 50 veces distribuida, se dejó reposar sin alteraciones durante una noche a 4 °C. Posteriormente, dicha placa que se dejó reaccionar con la IgG anti-ratón (molécula completa) (Sigma-Aldrich) rutenada con NHS éster con sulfomarcador (Meso Scale Discovery), se lavó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se distribuyó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) en dicha placa, seguido inmediatamente de medición con un lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery).
Los resultados se muestran en la fig. 37. Los resultados demuestran que el receptor de IL-6 humano soluble en el plasma de ratón desapareció rápidamente. De tres ratones que recibieron receptor de IL-6 humano soluble, dos ratones (n.° 1 y 3) mostraron un aumento del título de anticuerpo del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano de ratón soluble en plasma. Se sugiere que estos dos ratones desarrollaron una respuesta inmunitaria al receptor de IL-6 humano soluble, lo que da lugar a la producción de anticuerpos de ratón.
(4-2) Evaluación de la inmunogenicidad del receptor de IL-6 humano soluble en un modelo de estado estacionario
Para examinar los efectos de la producción de anticuerpos de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble sobre la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble, se realizó la siguiente prueba.
El siguiente modelo de estudio se construyó como modelo para mantener la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en el estado estacionario (aproximadamente 20 ng/ml). Se implantó por vía subcutánea una bomba de infusión (minibomba osmótica alzet, modelo 2004), cargada con el receptor de IL-6 humano soluble, en el lomo de un ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Japan) para crear un modelo animal con concentración en plasma de receptor de IL-6 humano soluble mantenido en el estado estacionario.
El estudio se realizó en dos grupos (n = 4 por grupo). Al grupo de ratones que imitan la tolerancia inmunitaria, se administró una dosis única (20 mg/kg) de anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón (R&D) en la vena caudal para inhibir la producción de anticuerpos de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble. Posteriormente, el anticuerpo se administró de forma similar una vez cada 10 días (en lo sucesivo denominado grupo de administración de anticuerpo anti-CD4 de ratón). El otro grupo se utilizó como grupo de control, es decir, grupo sin administración de anticuerpo anti-CD4 de ratón que no recibió ningún anticuerpo monoclonal anti-CD4 de ratón. Posteriormente, se implantó por vía subcutánea una bomba de infusión cargada con 92,8 pg/ml de receptor de IL-6 humano soluble en el lomo de un ratón. Después de la implantación de una bomba de infusión, se recogieron muestras de sangre a lo largo del tiempo, seguido inmediatamente de centrifugación durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm para obtener plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición. La concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble (hsIL-6R) se determinó de la misma manera que en el ejemplo de referencia 4-1.
Los cambios de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en un ratón normal individual, determinada como se ha descrito anteriormente, se muestran en la fig. 38.
Como resultado, el día 14 después de la implantación subcutánea de la bomba de infusión en el lomo de un ratón, se observa que las concentraciones en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se redujeron en todos los ratones del grupo sin administración de anticuerpos anti-CD4 de ratón. Por otro lado, no se ha observado que las concentraciones en plasma del receptor de IL-6 humano soluble se redujeran en todos los ratones que recibieron anticuerpo anti-CD4 de ratón para inhibir la producción de anticuerpos de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble.
Los resultados de (4-1) y (4-2) indican los siguientes tres puntos:
(1) El receptor de IL-6 humano soluble, después de administrarlo a un ratón, desaparece rápidamente del plasma;
(2) el receptor de IL-6 humano soluble es una proteína extraña para ratones, que es inmunogénico cuando se administra a un ratón, induciendo la producción de anticuerpos de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble; y
(3) si se produce la producción de anticuerpos de ratón contra el receptor de IL-6 humano soluble, la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble se acelera adicionalmente, incluso en un modelo con la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble mantenido en un nivel determinado, se produce reducción de la concentración en plasma.
(4-3) Examen de la permanencia en plasma e inmunogenicidad del anticuerpo humano en un ratón normal
Para examinar la permanencia en plasma y la inmunogenicidad del anticuerpo humano en un ratón normal, se realizó la siguiente prueba.
Se administró una dosis única (1 mg/kg) de anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano, Fv4-IgG1, en la vena caudal de un ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Japan). Se recogieron muestras de sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1, 2, 3, 4, 7, 14 y 21 días después de la administración del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. Las muestras de sangre obtenidas se centrifugaron inmediatamente a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para separar el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
La concentración en plasma del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en un ratón se determinó mediante ELISA. En primer lugar, se distribuyó un fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico de cadena y) (SIGMA) en una placa Nunc-Immuno, MaxiSoup (Nalge Nunc International), y se permitió que reposara sin alteraciones durante una noche a 4 °C para preparar una placa de fase sólida anti-IgG humana. Se prepararon muestras de curvas de calibración que contenían anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano a una concentración en plasma de 0,8, 0,4, 0,2, 0,1,0,05, 0,025 o 0,0125 pg/ml y muestras de medición de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Se dejó reposar una mezcla de 100 pl de la muestra de la curva de calibración y la muestra de medición de plasma y 200 pl de receptor de IL-6 humano soluble 20 ng/ml sin alteraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la placa de fase sólida anti-IgG humana en la que se había distribuido la mezcla en cada uno de los pocillos de la misma se dejó reposar adicionalmente sin alteraciones durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se dejó que la placa reaccionara con anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción cromogénica del líquido de reacción obtenido al reaccionar con estreptavidina-poliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) durante 1 hora a temperatura ambiente se realizó utilizando sustrato de micropocillos de HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories) como sustrato. Después de detenerse la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm del líquido de reacción en cada pocillo usando un lector de microplacas. La concentración en plasma del anticuerpo en un ratón se calculó a partir de la absorbancia de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Los resultados se muestran en la fig. 39. La permanencia en plasma de anticuerpo humano cuando se administró una dosis única de anticuerpo humano a un ratón fue significativamente mayor que la del receptor de IL-6 humano soluble cuando se administró una dosis única del receptor de IL-6 humano soluble (fig. 37) y se demostró que se mantenía la concentración alta en plasma incluso el día 21 después de la administración. Esto se debe probablemente a que los anticuerpos humanos que se incorporan en células se unen al FcRn de ratón dentro del endosoma para reciclarse en el plasma. Por otro lado, se cree que el receptor de IL-6 humano soluble que se incorpora en células desaparece rápidamente del plasma, debido a que no tiene ninguna ruta para reciclarse desde el endosoma.
Asimismo, la concentración en plasma reducida, vista en el modelo de estado estacionario del receptor de IL-6 humano soluble (fig. 38), no se observó en ninguno de los tres ratones que recibieron anticuerpo humano. En otras palabras, se sugirió que, a diferencia del receptor de IL-6 humano, no se produjo ningún anticuerpo de ratón contra el anticuerpo humano.
Los resultados de (4-1), (4-2) y (4-3) pueden sugerir lo siguiente. En primer lugar, tanto el receptor de IL-6 soluble humano como el anticuerpo humano son proteínas extrañas en ratones. Por tanto, se cree que los ratones tienen una gran población de linfocitos T que responde a ellos específicamente.
Cuando se administró el receptor de IL-6 soluble humano, es decir, una proteína extraña, a un ratón, desapareció del plasma en poco tiempo y se confirmó la respuesta inmunitaria al receptor de IL-6 soluble humano. Aquí, la rápida desaparición del receptor de IL-6 soluble humano del plasma sugiere que muchos receptores de IL-6 solubles humanos se incorporan en células presentadoras de antígenos en poco tiempo y se someten a procesamiento dentro de las células y después activan linfocitos T que responden específicamente al receptor de IL-6 soluble humano. Se cree que, como resultado, se produce una respuesta inmunitaria al receptor de IL-6 soluble humano (es decir, producción de anticuerpo de ratón contra el receptor de IL-6 soluble humano).
Por otro lado, cuando un anticuerpo humano, es decir, una proteína extraña, fue administrado a un ratón, su permanencia en plasma fue significativamente más larga que la del receptor de IL-6 soluble humano y no se produjo una respuesta inmunitaria al anticuerpo humano. La permanencia en plasma más larga indica la presencia de solo una pequeña cantidad de anticuerpos humanos que se incorporan en células presentadoras de antígenos y se someten a procesamiento. Por tanto, se cree que incluso si el ratón tiene una población de linfocitos T que responde específicamente al anticuerpo humano, los linfocitos T no se activan a través de la presentación de antígenos y, como resultado, no se produce una respuesta inmunitaria al anticuerpo humano (es decir, producción de anticuerpo de ratón contra el anticuerpo humano).
[Ejemplo de referencia 5] Preparación y evaluación de diversas variantes de Fc de anticuerpo con mayor afinidad de unión a FcRn humano a pH neutro
(5-1) Preparación y evaluación de la actividad de unión de diversas variantes de Fc de anticuerpos con mayor afinidad de unión a FcRn humano a pH neutro
Para aumentar la afinidad de unión al FcRn humano en un intervalo de pH neutro, se introdujeron diversas mutaciones en VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) para su evaluación. Las variantes (IgG1-F1 a IgG1-F1052) que contenían las cadenas pesadas y ligeras creadas L(TS)-CK (SEQ ID NO: 41) se expresaron y purificaron según el método descrito en el ejemplo de referencia 2.
La unión del anticuerpo a FcRn humano se analizó según el método descrito en el ejemplo 4. En otras palabras, las actividades de unión de las variantes de FcRn humano en condiciones neutras (pH 7,0), determinadas con Biacore, se muestran en las tablas 27-1 a 27-32.
[Tabla 27-1]
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
La tabla 27-2 es una continuación de la tabla 27-1.
[Tabla 27-2]
Figure imgf000125_0002
Figure imgf000126_0001
La tabla 27-3 es una continuación de la tabla 27-2.
[Tabla 27-3]
Figure imgf000126_0002
Figure imgf000127_0001
La tabla 27-4 es una continuación de la tabla 27-3.
[Tabla 27-4]
Figure imgf000127_0002
Figure imgf000128_0001
La tabla 27-5 es una continuación de la tabla 27-4.
[Tabla 27-5]
Figure imgf000128_0002
La tabla 27-6 es una continuación de la tabla 27-5.
[Tabla 27-6]
Figure imgf000129_0001
La tabla 27-7 es una continuación de la tabla 27-6.
[Tabla 27-7]
Figure imgf000129_0002
Figure imgf000130_0001
La tabla 27-8 es una continuación de la tabla 27-7.
[Tabla 27-8]
Figure imgf000130_0002
Figure imgf000131_0001
La tabla 27-9 es una continuación de la tabla 27-8.
[Tabla 27-9]
Figure imgf000131_0002
Figure imgf000132_0001
La tabla 27-10 es una continuación de la tabla 27-9.
[Tabla 27-10]
Figure imgf000132_0002
Figure imgf000133_0001
La tabla 27-11 es una continuación de la tabla 27-10.
[Tabla 27-11]
Figure imgf000133_0002
La tabla 27-12 es una continuación de la tabla 27-11.
[Tabla 27-12]
Figure imgf000134_0001
La tabla 27-13 es una continuación de la tabla 27-12.
[Tabla 27-13]
Figure imgf000134_0002
Figure imgf000135_0001
La tabla 27-14 es una continuación de la tabla 27-13.
[Tabla 27-14]
Figure imgf000135_0002
Figure imgf000136_0001
La tabla 27-15 es una continuación de la tabla 27-14.
[Tabla 27-15]
Figure imgf000136_0002
Figure imgf000137_0001
La tabla 27-16 es una continuación de la tabla 27-15.
[Tabla 27-16]
Figure imgf000137_0002
Figure imgf000138_0001
La tabla 27-17 es una continuación de la tabla 27-16.
[Tabla 27-17]
Figure imgf000138_0002
La tabla 27-18 es una continuación de la tabla 27-17.
[Tabla 27-18]
Figure imgf000139_0001
La tabla 27-19 es una continuación de la tabla 27-18.
[Tabla 27-19]
Figure imgf000139_0002
Figure imgf000140_0001
La tabla 27-20 es una continuación de la tabla 27-19.
[Tabla 27-20]
Figure imgf000140_0002
Figure imgf000141_0001
La tabla 27-21 es una continuación de la tabla 27-20.
[Tabla 27-21]
Figure imgf000141_0002
Figure imgf000142_0001
La tabla 27-22 es una continuación de la tabla 27-21.
[Tabla 27-22]
Figure imgf000142_0002
Figure imgf000143_0001
La tabla 27-23 es una continuación de la tabla 27-22.
[Tabla 27-23]
Figure imgf000143_0002
La tabla 27-24 es una continuación de la tabla 27-23.
[Tabla 27-24]
Figure imgf000144_0001
La tabla 27-25 es una continuación de la tabla 27-24.
[Tabla 27-25]
Figure imgf000144_0002
Figure imgf000145_0001
La tabla 27-26 es una continuación de la tabla 27-25.
[Tabla 27-26]
Figure imgf000145_0002
Figure imgf000146_0001
La tabla 27-27 es una continuación de la tabla 27-26.
[Tabla 27-27]
Figure imgf000146_0002
Figure imgf000147_0001
La tabla 27-28 es una continuación de la tabla 27-27.
[Tabla 27-28]
Figure imgf000147_0002
Figure imgf000148_0001
La tabla 27-29 es una continuación de la tabla 27-28.
[Tabla 27-29]
Figure imgf000148_0002
Figure imgf000149_0001
La tabla 27-30 es una continuación de la tabla 27-29.
[Tabla 27-30]
Figure imgf000149_0002
Figure imgf000150_0001
La tabla 27-31 es una continuación de la tabla 27-30.
[Tabla 27-31]
Figure imgf000150_0002
Figure imgf000151_0001
La tabla 27-32 es una continuación de la tabla 27-31.
[Tabla 27-32]
Figure imgf000151_0002
(5-2) Prueba in vivo de anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH con mejor unión a FcRn humano en la condición de pH neutro
Se produjeron anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH que tienen capacidad de unión a FcRn humano en una condición neutra utilizando las cadenas pesadas preparadas como se ha descrito en el ejemplo 5-1 para tener capacidad de unión a FcRn humano en una condición neutra. Los anticuerpos se evaluaron para determinar su efecto de eliminación de antígeno in vivo. De manera específica, los anticuerpos enumerados a continuación se expresaron y purificaron mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica como se ha descrito en el ejemplo de referencia 2:
Fv4-IgG1 que comprende VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-v2 que comprende VH3-IgG1-v2 (SEQ ID NO: 37) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F14 que comprende VH3-IgG1-F14 (SEQ ID NO: 86) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F20 que comprende VH3-IgG1-F20 (SEQ ID NO: 39) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F21 que comprende VH3-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 40) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F25 que comprende VH3-IgG1-F25 (SEQ ID NO: 87) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F29 que comprende VH3-IgG1-F29 (SEQ ID NO: 88) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F35 que comprende VH3-IgG1-F35 (SEQ ID NO: 89) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F48 que comprende VH3-IgG1-F48 (SEQ ID NO: 90) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36);
Fv4-IgG1-F93 que comprende VH3-IgG1-F93 (SEQ ID NO: 91) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36); y
Fv4-IgG1-F94 que comprende VH3-IgG1-F94 (SEQ ID NO: 92) y VL3-CK (SEQ ID NO: 36).
Se analizaron los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH preparados in vivo mediante el método descrito a continuación utilizando ratones transgénicos para FcRn humano (ratón 276 /+ de línea Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104).
A un ratón transgénico FcRn humano (ratón 276 /+ de línea Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104) y ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Japan), Se administró hsIL-6R (receptor de IL-6 humano soluble preparado en el ejemplo de referencia 3) solo o se administraron receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano simultáneamente para examinar la farmacocinética del receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano in vivo. Se administró una dosis individual (10 ml/kg) de solución de receptor de IL-6 humano soluble (5 pg/ml) o una mezcla de receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano (5 pg/ml y 0,1 mg/ml, respectivamente) en la vena caudal. En ese momento, el anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano contra el receptor de IL-6 humano soluble existía en una cantidad suficiente o excesiva. Por tanto, se cree que la mayoría de los receptores de IL-6 humanos solubles se unieron al anticuerpo. Se recogieron muestras de sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1,2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración. Las muestras de sangre obtenidas se centrifugaron inmediatamente durante 15 minutos a 4 °C y 15.000 rpm para separar el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
(5-3) Determinación de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble mediante un método de electroquimioluminiscencia
Una muestra de la curva de calibración del receptor de IL-6 humano soluble preparada a 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 o 31,25 pg/ml y una muestra de medición de plasma de ratón diluida 50 veces o más, se mezclaron con un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) rutenado con NHS éster con sulfomarcador (Meso Scale Discovery), un anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) y tocilizumab, seguido de reacción durante una noche a 37 °C. Se preparó tocilizumab a una concentración final de 333 pg/ml. Posteriormente, el líquido de reacción se distribuyó en una placa de estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Además, después de lavar el líquido de reacción que se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, se distribuyó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery). Posteriormente, el líquido de reacción se sometió inmediatamente a medición utilizando un lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). La concentración del receptor de IL-6 humano soluble se calculó a partir de la respuesta de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFT max PRO (Molecular Devices).
Se muestra una evolución temporal de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble después de la administración intravenosa a ratones transgénicos para FcRn humano en la fig. 40. El resultado de la prueba mostró que la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble permaneció baja con el tiempo en presencia de cualquiera de los anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes del pH con unión a FcRn humano aumentada en condiciones neutras, en comparación con en presencia de Fv4-IgG1 que casi no tiene capacidad de unión a FcRn humano en condiciones neutras. Entre otros, los anticuerpos que produjeron el efecto notable incluyen, por ejemplo, Fv4-IgG1 -F14. Se demostró que la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-IgG1-F14 se redujo aproximadamente 54 veces un día después de la administración en comparación con la del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-IgG1. Asimismo, se demostró que la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-IgG 1-F21 se redujo aproximadamente 24 veces siete horas después de la administración en comparación con la del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-IgG1. Además, la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-IgG1-F25 siete horas después de la administración estaba por debajo del límite de detección (1,56 ng/ml). Por tanto, se esperaba que Fv4-IgG1-F25 permitiera una reducción notable de 200 o más veces de la concentración del receptor de IL-6 humano soluble en relación con la concentración del receptor de IL-6 humano soluble administrado simultáneamente con Fv4-IgG1.
Los hallazgos descritos anteriormente demuestran que el aumento de la unión a FcRn humano de los anticuerpos de unión a antígeno dependientes del pH en una condición neutra es muy eficaz para potenciar el efecto de eliminación de antígenos. Al mismo tiempo, el tipo de alteración de aminoácidos para aumentar la unión a FcRn humano en condiciones neutras, que se introduce para mejorar el efecto de eliminación de antígenos, no está particularmente limitado; y dichas alteraciones incluyen las mostradas en la tabla 16. Se puede predecir que el efecto de eliminación de antígenos aumentará in vivo por cualquier alteración introducida.
[Ejemplo de referencia 6] Adquisición de anticuerpos que se unen al receptor de IL-6 de manera dependiente de Ca a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos con tecnología de presentación en fagos
(6-1) Preparación de una biblioteca de presentación en fagos para anticuerpos humanos sin exposición previa
Se construyó una biblioteca de presentación en fagos para anticuerpos humanos, que consiste en múltiples fagos que presentan los dominios Fab de secuencias de anticuerpos humanos mutuamente diferentes, según un método conocido por los expertos en la técnica utilizando un ARN de poli A preparado a partir de PBMC humanas y ARN de poli A humano comercial como molde.
(6-2) Adquisición de fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno de manera dependiente de Ca a partir de la biblioteca mediante selección de perlas
La biblioteca de presentación en fagos construida para anticuerpos humanos sin exposición previa se sometió a una selección inicial mediante la concentración solo de fragmentos de anticuerpos que tenían una capacidad de unión a antígeno (receptor de IL-6) o concentración de fragmentos de anticuerpos que utilizaban una capacidad de unión a antígeno dependiente de la concentración de Ca (receptor de IL-6) como indicador. Se realizó concentración de fragmentos de anticuerpos utilizando una capacidad de unión a antígeno dependiente de la concentración de Ca (receptor de IL-6) como indicador mediante elución de los fagos de la biblioteca de fagos unidos al receptor de IL-6 en presencia de iones de Ca con EDTA que quela los iones de Ca. Se utilizó receptor de IL-6 biotinilado como antígeno.
Los fagos se produjeron a partir de Escherichia coli que portaba el fagémido de presentación en fagos construido. Se obtuvo una solución de biblioteca de fagos diluyendo con TBS una población de fagos precipitada añadiendo NaCl 2,5 M/PEG al 10 % a la solución de cultivo de E. coli en la que se produjeron los fagos. Posteriormente, se añadieron BSA y CaCl2 a la solución de biblioteca de fagos a una concentración final de BSA al 4 % y 1,2 mM de concentración de iones de calcio. Un método de selección común que utiliza un antígeno inmovilizado en perlas magnéticas se denomina método de selección (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). Como perlas magnéticas se utilizaron perlas recubiertas con NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads recubiertas con NeutrAvidin) o perlas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280 estreptavidina).
De manera específica, se añadieron 250 pmol del antígeno marcado con biotina a la solución de biblioteca de fagos preparada para permitir el contacto de dicha solución de biblioteca de fagos con el antígeno durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron perlas magnéticas, bloqueadas con BSA, para unirse a los complejos antígenofago durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron una vez con 1 ml de CaCl21,2 mM/TBS (TBS que contiene CaCl2 1,2 mM). Posteriormente, se recuperó una solución de fagos mediante un método de elución general para concentrar un fragmento de anticuerpo que tiene una capacidad de unión al receptor de IL-6 o mediante elución de perlas suspendidas en EDTA 2 mM/TBS (TBS que contiene EDTA 2 mM) para concentrar un fragmento de anticuerpo utilizando una capacidad de unión al receptor de IL-6 de una manera dependiente de la concentración de Ca como indicador. La solución de fago recuperada se añadió a 10 ml de la cepa TG1 de E. coli en una fase de crecimiento logarítmico (DO600 de 0,4-0,7). La E. coli se cultivó con agitación suave a 37 °C durante 1 hora para permitir que los fagos infectaran la E. coli. La E. coli infectada se inoculó en una placa de 225 mm x 225 mm. Posteriormente, los fagos se recuperaron del medio de cultivo de E. coli después de la inoculación para preparar una solución de biblioteca de fagos.
En la segunda selección y posteriores, los fagos se concentraron utilizando la capacidad de unión dependiente de Ca como indicador. De manera específica, se añadieron 40 pmol del antígeno marcado con biotina a la solución de biblioteca de fagos preparada para permitir el contacto de la biblioteca de fagos con el antígeno durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron perlas magnéticas, bloqueadas con BSA, para unirse a los complejos antígenofago durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron con 1 ml de CaCl21,2 mM/TBST y CaCl2 1,2 mM/TBS. Posteriormente, las perlas, a las que se añadieron 0,1 ml de EDTA 2 mM/TBS, se suspendieron a temperatura ambiente. Inmediatamente después de eso, las perlas se separaron utilizando un soporte magnético para recoger una solución de fago. La solución de fago recuperada se añadió a 10 ml de la cepa TG1 de E. coli en una fase de crecimiento logarítmico (DO600 de 0,4-0,7). La E. coli se cultivó con agitación suave a 37 °C durante 1 hora para permitir que los fagos infectaran la E. coli. La E. coli infectada se inoculó en una placa de 225 mm x 225 mm. Posteriormente, los fagos se recuperaron del medio de cultivo de la E. coli después de la inoculación para recoger una solución de biblioteca de fagos. La selección usando la capacidad de unión dependiente de Ca como indicador se repitió varias veces.
(6-3) Examen por ELISA de fagos
Se recogió un sobrenadante de cultivo que contenía fagos según un método rutinario (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de una sola colonia de E. coli, obtenida como se ha descrito anteriormente.
Un sobrenadante de cultivo que contenía fagos, al que se añadieron BSA y CaCl2 a una concentración final de BSA de 4 % y una concentración de ion de calcio de 1,2 mM se sometió a ELISA como se describe a continuación. Una placa de microtitulación StreptaWell 96 (Roche) se recubrió durante una noche con 100 gl de PBS que contenía el antígeno marcado con biotina. Cada pocillo de dicha placa se lavó con PBST para eliminar el antígeno y después se bloquearon los pocillos con 250 gl de BSA-TBS al 4 % durante 1 hora o más. Dicha placa con el sobrenadante de cultivo preparado añadido a cada pocillo, del que se eliminó el BSA-TBS al 4 %, se dejó reposar sin alteraciones a 37 °C durante 1 hora, permitiendo la unión del anticuerpo presentador de fagos al antígeno presente en cada pocillo. A cada pocillo lavado con CaCl21,2 mM/TBST, se añadió CaCl21,2 mM/TBS o EDTA 1 mM/TBS. La placa se dejó reposar sin alteraciones durante 30 minutos a 37 °C para incubación. Después de lavar con CaCl21,2 mM/TBST, se añadió a cada pocillo un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluido con TBS a una concentración final de BSA de 4 % y concentración de calcio ionizado de 1,2 mM y la placa se incubó durante 1 hora. Después de lavar con CaCl21,2 mM/TBST, la reacción cromogénica de la solución en cada pocillo con una única solución de TMB (ZYMED) añadida se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico. Posteriormente, se midió dicho color midiendo la absorbancia a 450 nm.
Como resultado del ELISA de fagos anterior, se analizó la secuencia de bases de un gen amplificado con cebadores específicos y un fragmento de anticuerpo que se ha identificado que tiene una capacidad de unión a antígeno dependiente de Ca como molde.
(6-4) Expresión y purificación de anticuerpos
Como resultado del ELISA de fagos anterior, se introdujo un clon que se ha identificado que tiene una capacidad de unión a antígeno dependiente de Ca en un plásmido de expresión para células animales. Los anticuerpos se expresaron como se describe a continuación. La cepa FreeStyle 293-F (Invitrogen) procedente de células renales fetales humanas se suspendió en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen), seguido de la inoculación de 3 ml en cada pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1,33 x 106 células/ml. El plásmido preparado se introdujo en las células mediante lipofección. Las células se cultivaron durante 4 días en una incubadora de CO2 (37 °C, CO2 al 8 %, 90 rpm). Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante de cultivo obtenido anteriormente mediante un método conocido en la técnica utilizando rProtein A Sepharose (marca comercial) Fast Flow (Amersham Biosciences). La absorbancia de la solución de anticuerpo purificada se midió a 280 nm utilizando un espectrofotómetro. La concentración de anticuerpo se calculó a partir de las mediciones obtenidas usando un coeficiente de extinción calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
[Ejemplo de referencia 7] Examen de la capacidad de unión dependiente de Ca de los anticuerpos obtenidos al receptor de IL-6 humano
Para examinar si las actividades de unión de los anticuerpos 6RL#9-IgG1 [cadena pesada (una secuencia de región constante derivada de IgG1 ligada a SEQ ID NO: 9) y cadena ligera (SEQ ID NO: 93)] y FH4-IgG1 [cadena pesada (SEQ ID NO: 94) y cadena ligera (SEQ ID NO: 95)], obtenidos en el ejemplo de referencia 6, al receptor de IL-6 humano son dependientes de Ca, se realizó el análisis cinético de las reacciones de antígeno-anticuerpo de estos anticuerpos con el receptor de IL-6 humano utilizando Biacore T100 (GE Healthcare). H54/L28-IgG1 [región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 96) y región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 97)], descrito en el documento WO2009/125825, se utilizó como un anticuerpo de control que no tiene actividad de unión dependiente de Ca al receptor de IL-6 humano. El análisis cinético de las reacciones de antígeno-anticuerpo se realizó en soluciones con concentraciones de iones de calcio 2 mM y 3 gM, establecidas como condiciones de concentración alta y baja de iones de calcio, respectivamente. El anticuerpo de interés se capturó en el chip sensor CM4 (GE Healthcare) en el que se inmovilizó una cantidad apropiada de proteína A (Invitrogen) mediante un método de acoplamiento de amina. Se utilizaron dos tampones [Ac Es 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 % (p/v) y CaCl22 mM (pH 7,4) o ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 % (p/v) y CaCl23 gmol/l (pH 7,4)] como tampones de ejecución. Estos tampones se utilizaron para diluir el receptor de IL-6 humano. Todas las mediciones se realizaron a 37 °C.
En el análisis cinético de la reacción de antígeno-anticuerpo utilizando el anticuerpo H54L28-IgG1, se permitió que el anticuerpo H54L28-IgG1 capturado en el chip sensor interactuara con el receptor de IL-6 inyectando un diluyente del receptor de IL-6 y tampón de ejecución (blanco) a un caudal de 20 gl/min durante 3 minutos. Posteriormente, después de observarse la disociación del receptor de IL-6 utilizando tampón de ejecución a un caudal de 20 gl/min durante 10 minutos, el chip sensor se regeneró inyectando glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) a un caudal de 30 gl/min durante 30 segundos. Los parámetros cinéticos, constante de unión (ka) (1/Ms) y constante de velocidad de disociación (kd) (1/s), se calcularon a partir de los sensorgramas obtenidos en la medición. Estos valores se utilizaron para calcular la constante de disociación (KD) (M) del anticuerpo H54L28-IgG1 para el receptor de IL-6 humano. Cada parámetro se calculó utilizando el programa informático de evaluación Biacore T100 (GE Healthcare).
En el análisis cinético de la reacción de antígeno-anticuerpo con anticuerpos FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1, se permitió que el anticuerpo FH4-IgG1 o 6RL#9-IgG1 capturado en el chip sensor interactuara con el receptor de IL-6 inyectando un diluyente del receptor de IL-6 y tampón de ejecución (blanco) a un caudal de 5 pl/min durante 15 minutos. Posteriormente, el chip sensor se regeneró inyectando glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) a un caudal de 30 pl/min durante 30 segundos. Se calcularon las constantes de disociación (KD) (M) a partir de los sensorgramas obtenidos en la medición, utilizando un modelo de afinidad de estado estacionario. Cada parámetro se calculó utilizando el programa informático de evaluación Biacore T100 (GE Healthcare). Las constantes de disociación (KD) entre cada anticuerpo y el receptor de IL-6 en presencia de CaCl22 mM, determinadas por el método anterior, se muestran en la tabla 28.
[Tabla 28]
Figure imgf000155_0001
El valor de KD del anticuerpo H54/L28-IgG1 en la condición de concentración de Ca 3 pM se puede calcular de la misma manera que en presencia de concentración de Ca 2 mM. En la condición de concentración de Ca 3 pM, apenas se observó que los anticuerpos FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1 se unieran al receptor de IL-6, por tanto, el cálculo de los valores de KD por el método descrito anteriormente es difícil. Sin embargo, los valores de KD de estos anticuerpos en la condición de concentración de Ca 3 pM se pueden estimar utilizando la fórmula 5 (manual del programa informático Biacore T100, BR-1006-48, AE 01/2007) descrito en el ejemplo 13.
Los resultados aproximados de los valores de constante de disociación KD para los anticuerpos y el receptor de IL-6 a una concentración de Ca de 3 pmol/l, estimados utilizando la fórmula 3 descrita en el ejemplo 13, se muestran en la tabla 29. En la tabla 29, los valores de Req, Rmáx, IR y C se estiman en función del resultado del ensayo.
[Tabla 29]
Figure imgf000155_0002
Según los hallazgos descritos anteriormente, se predijo que la Kd entre el receptor de IL-6 y el anticuerpo FH4-IgG1 o el anticuerpo 6RL#9-IgG1 aumentó en aproximadamente 60 o 120 veces (la afinidad se redujo en 60 o 120 veces o más) cuando la concentración de CaCl2 en el tampón se redujo de 2 mM a 3 pM. La tabla 30 resume los valores de Kd a concentraciones de CaCl2 de 2 mM y 3 pM y la dependencia de Ca para los tres tipos de anticuerpos H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1.
[Tabla 30]
Figure imgf000155_0003
No se observó ninguna diferencia en la unión del anticuerpo H54/L28-IgG1 al receptor de IL-6 debido a la diferencia de la concentración de Ca. Por otro lado, se ha observado que la unión de los anticuerpos FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1 al receptor de IL-6 estaba significativamente atenuada en la condición de la baja concentración de Ca (tabla 30).
[Ejemplo de referencia 8] Examen de la unión del ion de calcio al anticuerpo obtenido
Posteriormente, la temperatura intermedia de desnaturalización térmica (valor de Tm) se midió mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) como indicador para examinar la unión de ion de calcio al anticuerpo (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). La temperatura intermedia de desnaturalización térmica (valor de Tm) es un indicador de la estabilidad. La temperatura intermedia de la desnaturalización térmica (valor de Tm) aumenta cuando se estabiliza una proteína mediante la unión de iones de calcio, en comparación con ausencia de unión de iones de calcio (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Se examinó la actividad de unión del ion de calcio al anticuerpo examinando los cambios en el valor de Tm del anticuerpo dependiendo de los cambios en la concentración de iones de calcio de la solución de anticuerpo. El anticuerpo purificado se sometió a diálisis (EasySEP, TOMY) utilizando una solución externa de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM y CaCl22 mM (pH 7,4) o Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM y CaCl23 pM (pH 7,4). Se realizó medición de DSC a una velocidad de calentamiento de 240 °C/h de 20 a 115 °C utilizando una solución de anticuerpo preparada a aproximadamente 0,1 mg/ml con el dializado como sustancia de prueba. Las temperaturas intermedias de desnaturalización térmica (valores de Tm) de los dominios Fab de cada anticuerpo, calculadas según la curva de desnaturalización obtenida por DSC, se muestran en la tabla 31.
[Tabla 31]
Figure imgf000156_0001
A partir de los resultados mostrados en la tabla 31, se indica que los valores de Tm del Fab de los anticuerpos FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1, que muestran una capacidad de unión dependiente del calcio, variaron con los cambios en la concentración de iones de calcio, mientras que los valores de Tm del Fab del anticuerpo H54/L28-IgG1 que no muestra ninguna capacidad de unión dependiente del calcio no varían con los cambios en la concentración de iones de calcio. La variación de los valores de Tm del Fab de los anticuerpos FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1 demuestra que los iones de calcio se unen a estos anticuerpos para estabilizar las partes Fab. Los resultados anteriores muestran que los iones de calcio se unieron a los anticuerpos FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1, mientras que ningún ion de calcio se unió al anticuerpo H54/L28-IgG1.
[Ejemplo de referencia 9] Identificación del sitio de unión de iones de calcio en el anticuerpo 6RL#9 mediante cristalografía de rayos X
(9-1) Cristalografía de rayos X
Como se describe en el ejemplo de referencia 8, las mediciones de la temperatura de desnaturalización térmica Tm sugirieron que el anticuerpo 6RL#9 se une al ion de calcio. Sin embargo, era impredecible qué parte del anticuerpo 6RL#9 se une al ion de calcio. A continuación, utilizando la técnica de cristalografía de rayos X, se identificaron restos del anticuerpo 6RL#9 que interactúan con el ion de calcio.
(9-2) Expresión y purificación del anticuerpo 6RL#9
El anticuerpo 6RL#9 se expresó y purificó para cristalografía de rayos X. De manera específica, los plásmidos de expresión animal construidos para poder expresar la cadena pesada (la secuencia de región constante procedente de IgG1 estaba ligada a la SEQ ID NO: 9) y la cadena ligera (SEQ ID NO: 93) del anticuerpo 6RL#9 se introdujeron transitoriamente en células animales. Los plásmidos construidos se introdujeron mediante el método de lipofección en células de FreeStyle 293-F (Invitrogen) procedentes de células de riñón fetal humano suspendidas en 800 ml del medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) (densidad celular final: 1 x 106 células/ml). Se cultivaron células con plásmido introducido en una incubadora de CO2 (37 °C, CO2 al 8 %, 90 rpm) durante cinco días. Del sobrenadante de cultivo obtenido como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos se purificaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica utilizando el rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Se midió la absorbancia a 280 nm de soluciones de anticuerpo purificadas utilizando un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon a partir de los valores medidos utilizando un coeficiente de extinción calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(9-3) Purificación del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9
El anticuerpo 6RL#9 se concentró a 21 mg/ml utilizando un ultrafiltro con un punto de corte de peso molecular de 10.000 PCPM. Se preparó una muestra de anticuerpo de 5 mg/ml (2,5 ml) diluyendo la solución de anticuerpo usando tampón de L-cisteína 4 mM/EDTA 5 mM/fosfato de sodio 20 mM (pH 6,5). Se añadieron a la muestra 0,125 mg de papaína (Roche Applied Science). Después de agitar, la muestra se incubó a 35 °C durante dos horas. Después de la incubación, se disolvió un comprimido de minicóctel inhibidor de proteasa, sin EDTA (Roche Applied Science) en 10 ml de tampón MES 25 mM (pH 6) y se añadió a la muestra. La muestra se incubó en hielo para detener la reacción proteolítica de papaína. A continuación, la muestra se cargó en una columna de intercambio catiónico de 1 m1HiTrap SP HP (GE Healthcare) equilibrada con tampón MES 25 mM (pH 6), corriente abajo de la cual se conectó en tándem una columna HiTrap MabSelect Sure de proteína A de 1 ml (GE Healthcare). Se obtuvo una fracción purificada del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 realizando elución con un gradiente de concentración de NaCl lineal de hasta 300 mM en el tampón descrito anteriormente. A continuación, la fracción purificada resultante se concentró hasta aproximadamente 0,8 ml utilizando un ultrafiltro de 5000 PCPM. El concentrado se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con tampón HEPES 100 mM (pH 8) que contenía NaCl 50 mM. El fragmento Fab purificado del anticuerpo 6RL#9 para cristalización se eluyó de la columna utilizando el mismo tampón. Todos los tratamientos de columna descritos anteriormente se llevaron a cabo a una temperatura baja de 6 a 7,5 °C.
(9-4) Cristalización del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca
Se prepararon de antemano cristales de siembra del fragmento Fab de 6RL#9 en condiciones generales. A continuación, el fragmento Fab purificado del anticuerpo 6RL#9 en CaCl25 mM se concentró a 12 mg/ml con un ultrafiltro de 5000 PCPM. A continuación, la muestra concentrada como se ha descrito anteriormente se cristalizó mediante el método de difusión de vapor de gota colgante utilizando tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía PEG4000 de 20 % a 29 % como solución de depósito. Los cristales de siembra descritos anteriormente se trituraron en tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía PEG4000 al 29 % y CaCl25 mM, y se diluyó en serie de 100 a 10.000 veces. A continuación, se combinaron 0,2 pl de soluciones diluidas con una mezcla de 0,8 pl de la solución de depósito y 0,8 pl de la muestra concentrada para preparar gotas de cristalización en un portaobjetos con cubreobjetos de vidrio. Las gotas de cristal se dejaron reposar a 20 °C durante dos o tres días para preparar cristales en forma de placa fina. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron utilizando los cristales.
(9-5) Cristalización del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca
El fragmento Fab purificado del anticuerpo 6RL#9 se concentró a 15 mg/ml con un ultrafiltro de 5000 PCPM. A continuación, la muestra concentrada como se ha descrito anteriormente se cristalizó mediante el método de difusión de vapor de gota colgante utilizando tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía PEG4000 de 18 % a 25 % como solución de depósito. Los cristales del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 obtenido en presencia de Ca se trituraron en tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía PEG4000 al 25 % y se diluyeron en serie hasta 100 a 10.000 veces. A continuación, se combinaron 0,2 pl de soluciones diluidas con una mezcla de 0,8 pl de la solución de depósito y 0,8 pl de la muestra concentrada para preparar gotas de cristalización en un portaobjetos con cubreobjetos de vidrio. Las gotas de cristal se dejaron reposar a 20 °C durante dos o tres días para preparar cristales en forma de placa fina. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron utilizando los cristales.
(9-6) Medición cristalográfica de rayos X del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca
Se empaparon cristales del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en presencia de Ca en una solución de tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía PEG4000 al 35 % y CaCl25 mM. Al eliminar la solución exterior de la superficie de un cristal individual con una brida de micro-nailon, el cristal individual se congeló en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X del cristal congelado se recogieron de la línea de haz BL-17A de Photon Factory en la Organización para la Investigación de Altas Energías con Aceleradores. El cristal congelado se mantuvo en estado congelado durante la medición colocándolo constantemente en una corriente de gas nitrógeno a -178 °C. Se recogieron un total de 180 imágenes de difracción utilizando el detector CCD Quantum315r (ADSC) conectado a la línea del haz mientras se giraba el cristal en intervalos de 1°. Se realizaron determinación de la constante reticular, indexación de puntos de difracción y análisis de datos de difracción utilizando los programas Xia2 (paquete de programas informáticos CCP4), paquete XDS (Walfgang Kabsch) y Scala (paquete de programas informáticos CCP4). Por último, se obtuvieron datos de intensidad de difracción con una resolución de hasta 2,2 angstrom. El cristal pertenece al grupo espacial P212121 con constante reticular a = 45,47 angstrom, b = 79,86 angstrom, c = 116,25 angstrom, a = 90°, p = 90° y y = 90°.
(9-7) Medición cristalográfica de rayos X del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca
Se empaparon cristales del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en ausencia de Ca en una solución de tampón HEPES 100 mM (pH 7,5) que contenía PEG4000 al 35 %. Al eliminar la solución exterior de la superficie de un cristal individual con una brida de micro-nailon, el cristal individual se congeló en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X del cristal congelado se recogieron de la línea de haz BL-5A de Photon Factory en la Organización para la Investigación de Altas Energías con Aceleradores. El cristal congelado se mantuvo en estado congelado durante la medición colocándolo constantemente en una corriente de gas nitrógeno a -178 °C. Se recogieron un total de 180 imágenes de difracción utilizando el detector CCD Quantum210r (ADSC) conectado a la línea del haz mientras se giraba el cristal en intervalos de 1°. Se realizaron determinación de la constante reticular, indexación de puntos de difracción y análisis de datos de difracción utilizando los programas Xia2 (paquete de programas informáticos CCP4), paquete XDS (Walfgang Kabsch) y Scala (paquete de programas informáticos CCP4). Por último, se obtuvieron datos de intensidad de difracción con una resolución de hasta 2,3 angstrom. El cristal pertenece al grupo espacial P212121 con constante reticular a = 45,40 angstrom, b = 79,63 angstrom, c = 116,07 angstrom, a = 90°, p = 90°, y = 90°, por lo que es estructuralmente idéntico al cristal preparado en presencia de Ca.
(9-8) Medición cristalográfica de rayos X del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca
La estructura cristalina del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en presencia de Ca se determinó mediante un método de reemplazo molecular utilizando el programa Phaser (paquete de programas informáticos CCP4). Se estimó que el número de moléculas en una unidad asimétrica era uno a partir del tamaño de la red cristalina y el peso molecular del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9. Según la homología de secuencia primaria, se utilizó una parte de las posiciones de los aminoácidos 112 a 220 de la cadena A y una parte de las posiciones de los aminoácidos 116 a 218 de la cadena B en la coordenada conformacional del código de PDB 1ZA6 como moléculas modelo para analizar las regiones CL y CH1. A continuación, se utilizó una parte de las posiciones de aminoácidos 1 a 115 de la cadena B en la coordenada conformacional del código de PDB 1ZA6 como molécula modelo para analizar la región VH. Por último, se utilizó una parte de las posiciones de aminoácidos 3 a 147 de la cadena ligera la coordenada conformacional del código de PDB 2A9M como molécula modelo para analizar la región VL. Basándose en este orden, se obtuvo un modelo de estructura inicial para el fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 determinando a partir de las funciones de traducción y rotación las posiciones y orientaciones de las moléculas modelo para el análisis en la red cristalina. El factor de fiabilidad cristalográfica R para los datos de reflexión a una resolución de 25 a 3,0 angstrom fue de 46,9 % y R libre fue de 48,6 % después del refinamiento de cuerpo rígido donde se permitió que los dominios VH, VL, CH1 y CL se desviaran del modelo de estructura inicial. A continuación, se realizó refinamiento del modelo repitiendo el refinamiento estructural con el programa Refmac5 (paquete de programas informáticos CCP4) seguido de la revisión del modelo realizada con el programa Coot (Paul Emsley) con referencia a los mapas de densidad electrónica Fo-Fc y 2Fo-F donde se calcularon los coeficientes Fo-Fc y 2Fo-Fc utilizando el factor estructural Fo determinado experimentalmente, el factor estructural Fc calculado según el modelo y las fases. El refinamiento final se llevó a cabo utilizando el programa Refmac5 (paquete de programas informáticos CCP4) basado en los mapas de densidad electrónica Fo-Fc y 2Fo-F añadiendo moléculas de agua e iones de Ca al modelo. Con 21.020 datos de reflexión a una resolución de 25 a 2,2 angstrom, finalmente, el factor de fiabilidad cristalográfica R se convirtió en 20,0 % y R libre se convirtió en 27,9 % para el modelo que consta de 3440 átomos.
(9-9) Medición de los datos de difracción de rayos X del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca
La estructura cristalina del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 en ausencia de Ca se determinó basándose en la estructura del cristal preparado en presencia de Ca. Las moléculas de agua e iones de Ca se omitieron de la coordenada conformacional del cristal del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en presencia de Ca. El factor de fiabilidad cristalográfica R para los datos de reflexión a una resolución de 25 a 3,0 angstrom fue de 30,3 % y R libre fue de 31,7 % después del refinamiento de cuerpo rígido donde se permitió que los dominios VH, VL, CH1 y CL se desviaran. A continuación, se realizó refinamiento del modelo repitiendo el refinamiento estructural con el programa Refmac5 (paquete de programas informáticos CCP4) seguido de la revisión del modelo realizada con el programa Coot (Paul Emsley) con referencia a los mapas de densidad electrónica Fo-Fc y 2Fo-Fc donde se calcularon los coeficientes Fo-Fc y 2Fo-Fc utilizando el factor estructural Fo determinado experimentalmente, el factor estructural Fc calculado según el modelo y las fases. El refinamiento final se llevó a cabo utilizando el programa Refmac5 (paquete de programas informáticos CCP4) basado en los mapas de densidad electrónica Fo-Fc y 2Fo-F añadiendo moléculas de agua e iones de Ca al modelo. Con 18.357 datos de reflexión a una resolución de 25 a 2,3 angstrom, finalmente, el factor de fiabilidad cristalográfica R se convirtió en 20,9 % y R libre se convirtió en 27,7 % para el modelo que consta de 3351 átomos.
(9-10) Comparación de datos de difracción cristalográfica de rayos X de los fragmentos Fab del anticuerpo 6RL#9 entre en presencia y ausencia de Ca
Cuando se comparan las estructuras cristalográficas de los fragmentos Fab del anticuerpo 6RL#9 entre en presencia y ausencia de Ca, se observan cambios significativos en la CDR3 de cadena pesada. La estructura de la CDR3 de cadena pesada del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 determinada por cristalografía de rayos X se muestra en la fig. 41. De manera específica, un ion de calcio residía en el centro de la región de bucle CDR3 de cadena pesada del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9 preparado en presencia de Ca. Se supuso que el ion de calcio interactuaba con las posiciones 95, 96 y 100a (numeración de Kabat) de la CDR3 de cadena pesada. Se creía que el bucle de CDR3 de cadena pesada, que es importante para la unión al antígeno, se estabilizó mediante la unión de calcio en presencia de Ca y se convirtió en una estructura óptima para la unión al antígeno. No hay ningún informe que demuestre que el calcio se una a la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo. Por tanto, la estructura unida a calcio de la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo es una estructura novedosa.
El motivo de unión a calcio presente en la CDR3 de cadena pesada, revelado en la estructura del fragmento Fab del anticuerpo 6RL#9, también se puede convertir en un nuevo elemento de diseño para la biblioteca de Ca. Por ejemplo, se cree que es posible una biblioteca que contenga la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 6RL#9 y restos flexibles en otras CDR, incluyendo la cadena ligera.
[Ejemplo de referencia 10] Preparación de anticuerpos que se unen a IL-6 de manera dependiente de Ca a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos con técnicas de presentación en fagos
(10-1) Preparación de una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos sin exposición previa
Se construyó una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos que contiene múltiples fagos que presentan diversas secuencias de dominio Fab de anticuerpos humanos mediante un método conocido por los expertos en la técnica utilizando, como molde, ARN de poliA preparado a partir de PBMC humanas, ARN de poliA humano disponible en el mercado y similares.
(10-2) Preparación de fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno de manera dependiente de Ca a partir de una biblioteca mediante selección de perlas
Se llevó a cabo selección primaria a partir de la biblioteca de presentación en fagos construida de anticuerpos humanos sin tratamiento previo enriqueciendo fragmentos de anticuerpos que tienen actividad de unión a antígeno (IL-6). El antígeno utilizado fue IL-6 marcado con biotina.
Se produjeron fagos a partir de E. co lique porta el fagémido construido para presentación en fagos. Para precipitar los fagos producidos por E. coli, se añadió NaCl 2,5 M/PEG al 10 % al medio de cultivo de E. coli. La fracción de fagos se diluyó con TBS para preparar una solución de biblioteca de fagos. A continuación, se añadieron BSA y CaCl2 a la solución de biblioteca de fagos a concentraciones finales de 4 % y 1,2 mM de concentración de iones de calcio, respectivamente. El método de selección utilizado fue un método de selección convencional con perlas magnéticas con antígeno inmovilizado (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2): 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2): 191­ 203; Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2): 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2): 61-9). Las perlas magnéticas utilizadas fueron perlas recubiertas con NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads recubiertas con NeutrAvidin) y perlas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280 estreptavidina).
De manera específica, se añadieron 250 pmol del antígeno marcado con biotina a la solución de biblioteca de fagos preparada. Por tanto, la solución se puso en contacto con el antígeno a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se añadieron perlas magnéticas bloqueadas con BSA y se permitió que el complejo antígeno-fago se uniera a las perlas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las perlas se lavaron tres veces con CaCl21,2 mM/TBST (TBST que contiene CaCl21,2 mM) y después dos veces con 1 ml de CaCl21,2 mM/TBS (TBS que contiene CaCl2 1,2 mM). A continuación, se añadieron a las perlas 0,5 ml de tripsina 1 mg/ml. Después de 15 minutos de dispersión a temperatura ambiente, las perlas se separaron inmediatamente utilizando un soporte magnético para recoger una suspensión de fagos. La suspensión de fagos preparada se añadió a 10 ml de E. coli de la cepa TG1 en la fase de crecimiento logarítmico (DO600 = 0,4 a 0,5). La E. coli se incubó con agitación suave a 37 °C durante una hora para infectar los fagos. La E. coli infectada se sembró en una placa (225 mm x 225 mm). A continuación, se recogieron fagos del medio de cultivo de la E. coli sembrada para preparar una solución de biblioteca de fagos.
En la selección de segundo ciclo y posteriores, los fagos se enriquecieron utilizando la actividad de unión dependiente de Ca como indicador. De manera específica, se añadieron 40 pmol del antígeno marcado con biotina a la solución de biblioteca de fagos preparada. Por tanto, la biblioteca de fagos se puso en contacto con el antígeno a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se añadieron perlas magnéticas bloqueadas con BSA y se permitió que el complejo antígeno-fago se uniera a las perlas magnéticas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las perlas se lavaron con 1 ml de CaCl21,2 mM/TBST y CaCl21,2 mM/TBS. A continuación, se añadieron 0,1 ml de EDt A 2 mM/TBS a las perlas. Después de la dispersión a temperatura ambiente, las perlas se separaron inmediatamente utilizando un soporte magnético para recoger una suspensión de fagos. La proteína pIII (proteína pIII procedente de fagos auxiliares) se escindió de fagos que no presentaban Fab al añadir 5 ^l de tripsina 100 mg/ml a la suspensión de fagos recogida para eliminar la capacidad de los fagos que no presentaban Fab para infectar E. coli. Se añadieron fagos recogidos de la reserva de fagos líquida tripsinizada a 10 ml de células de E. coli de la cepa TG1 en la fase de crecimiento logarítmico (DO600 = 0,4 a 0,7). La E. coli se incubó agitando suavemente a 37 °C durante una hora para infectar los fagos. La E. coli infectada se sembró en una placa (225 mm x 225 mm). A continuación, se recogieron fagos del medio de cultivo de las E. coli sembradas para preparar una reserva líquida de la biblioteca de fagos. Se realizó selección tres veces utilizando la actividad de unión dependiente de Ca como indicador.
(10-3) Evaluación por ELISA de fagos
Se recogieron sobrenadantes de cultivo que contenían fagos de colonias individuales de E. coli obtenidas por el método descrito anteriormente según un método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). Se añadieron BSA y CaCl2 a las concentraciones finales de 4 % y 1,2 mM de concentración de iones de calcio, respectivamente, a los sobrenadantes de cultivo que contenían fagos.
Los sobrenadantes se sometieron a ELISA mediante el siguiente procedimiento. Una placa de microtitulación de 96 pocillos StreptaWell (Roche) se recubrió durante una noche con 100 ^l de PBS que contenía el antígeno marcado con biotina. El antígeno se eliminó lavando cada pocillo de la placa con PBST. A continuación, los pocillos se bloquearon con 250 |jl de BSA al 4 %-TBS durante una hora o más. Después de eliminar BSA al 4 %-TBS, los sobrenadantes de cultivo preparados se añadieron a cada pocillo. La placa se incubó a 37 °C durante una hora de modo que se permitió que los fagos que presentaban anticuerpos se unieran al antígeno en cada pocillo. Después de lavar cada pocillo con CaCl2 1,2 mM/TBST, se añadió CaCl21,2 mM/TBS o EDTA 1 mM/TBS. La placa se dejó incubar a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavar con CaCl21,2 mM/TBST, se añadió a cada pocillo un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluido con TBS que contenía BSA e ion de calcio a concentraciones finales de 4 % y 1,2 mM de concentración de iones de calcio, y la placa se incubó durante una hora. Después de lavar con CaCl2 1,2 mM/TBST, se añadió la solución individual de TMB (ZYMED) a cada pocillo. La reacción cromogénica en la solución de cada pocillo se detuvo añadiendo ácido sulfúrico. A continuación, el color desarrollado se evaluó midiendo la absorbancia a 450 nm.
De los 96 clones aislados, el anticuerpo 6KC4-1#85 que tiene actividad de unión a IL-6 dependiente de Ca se obtuvo mediante ELISA de fagos. Utilizando fragmentos de anticuerpos que se predijo que tenían una actividad de unión a antígeno dependiente de Ca según el resultado del ELISA de fagos descrito anteriormente como molde, los genes se amplificaron con cebadores específicos y se analizaron sus secuencias. Las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo 6KC4-1#85 se muestran en las SEQ ID NO: 10 y 98, respectivamente. El polinucleótido que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 10) se ligó a un polinucleótido que codifica una secuencia procedente de IgG1 mediante el método de PCR. El fragmento de ADN resultante se insertó en un vector de expresión de células animales para construir un vector de expresión para la cadena pesada de la SEQ ID NO: 99. Un polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 98) se ligó a un polinucleótido que codifica la región constante de cadena kappa natural (SEQ ID NO: 100) mediante PCR. Se insertó un fragmento de ADN que codifica la secuencia ligada mostrada en la SEQ ID NO: 101 en un vector de expresión de células animales. Las secuencias de las variantes construidas se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Las secuencias de las variantes construidas se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica.
(10-4) Expresión y purificación de anticuerpos
El clon 6KC4-1#85 que se predijo que tenía una actividad de unión a antígeno dependiente de Ca según el resultado del ELISA de fagos se insertó en plásmidos de expresión de células animales. Se llevó a cabo expresión de anticuerpos mediante el siguiente método. Se suspendieron células de FreeStyle 293-F (Invitrogen) procedentes de células de riñón fetal humano en el medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) y se sembraron en placas a una densidad celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Los plásmidos preparados se introdujeron en las células mediante un método de lipofección. Las células se cultivaron durante cuatro días en una incubadora de CO2 (37 °C, CO2 al 8 %, 90 rpm). De los sobrenadantes de cultivo, se purificaron los anticuerpos utilizando el rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbancia a 280 nm de las soluciones de anticuerpo purificadas utilizando un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de extinción calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411 -2423).
[Ejemplo de referencia 11] Evaluación del anticuerpo 6KC4-1#85 con respecto a la unión al ion de calcio
(11-1) Evaluación del anticuerpo 6KC4-1#85 con respecto a la unión al ion de calcio
Se evaluó la unión a calcio del anticuerpo de unión a antígeno dependiente de calcio 6KC4-1#85 que se aisló de una biblioteca de anticuerpos humanos. Se evaluó si el valor de Tm medido varía dependiendo de la condición de la concentración de calcio ionizado mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 6.
Los valores de Tm para el dominio Fab del anticuerpo 6KC4-1#85 se muestran en la tabla 32. Como se muestra en la tabla 32, el valor de Tm del dominio Fab del anticuerpo 6KC4-1#85 varió dependiendo de la concentración de iones de calcio. Esto demuestra que el anticuerpo 6KC4-1#85 se une al calcio.
[Tabla 32]
Figure imgf000160_0001
(11-2) Identificación del sitio de unión a ion de calcio en el anticuerpo 6KC4-1#85
Como se demuestra en (11-1) del ejemplo de referencia 11, el anticuerpo 6KC4-1#85 se une al ion de calcio. Sin embargo, 6KC4-1#85 no tiene un motivo de unión a calcio tal como la secuencia de hVk5-2 que se reveló a partir de la evaluación que tiene un motivo de unión a calcio. Por tanto, para identificar los restos responsables de la unión a iones de calcio del anticuerpo 6KC4-1#85, se construyeron cadenas pesadas alteradas (6_H1 -11 (SEQ ID NO: 102), 6_H1-12 (SEQ ID NO: 103), 6_H1-13 (SEQ ID NO: 104), 6_H1-14 (SEQ ID NO: 105), 6_H1 -15 (SEQ ID NO: 106)) o cadenas ligeras alteradas (6_L1-5 (SEQ ID NO: 107) y 6_L1 -6 (SEQ ID NO: 108)) sustituyendo un resto Asp (D) en la CDR del anticuerpo 6KC4-1#85 por un resto Ala (A) que no participa en la unión o quelación del ion de calcio. Por el método descrito en el ejemplo de referencia 6, los anticuerpos alterados se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo de células animales en las que se han introducido vectores de expresión que portaban los genes de anticuerpos alterados. Se evaluó la unión de calcio de los anticuerpos alterados purificados mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 6. El resultado de la medición se muestra en la tabla 33. Como se muestra en la tabla 33, la sustitución del resto en la posición 95 o 101 (numeración de Kabat) por un resto de Ala en la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 6KC4-1#85 dio lugar a pérdida de la actividad de unión a calcio del anticuerpo 6KC4-1 #85. Esto sugiere que estos restos son responsables de la unión al calcio. El motivo de unión a calcio presente alrededor de la base del bucle de la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 6KC4-1#85, como se revela a partir de las propiedades de unión a calcio del anticuerpo 6KC4-1#85 modificado, también puede convertirse en un nuevo elemento de diseño para la biblioteca de Ca como se describe en el ejemplo de referencia 9. En otras palabras, además de una biblioteca con un motivo de unión a calcio introducido en la región variable de cadena ligera proporcionada como ejemplo específico en el ejemplo de referencia 20 y etc., es posible una biblioteca que contenga el motivo de unión a calcio presente en, por ejemplo, la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo 6KC4-1#85 y que contenga restos flexibles en otros restos de aminoácidos.
[Tabla 33]
Figure imgf000161_0001
[Ejemplo de referencia 12] Examen de los efectos del anticuerpo de unión dependiente de Ca sobre la permanencia en plasma del antígeno utilizando ratones normales
(12-1) Prueba in vivo con ratones normales
A un ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Japan), se le administró hsIL-6R (receptor de IL-6 humano soluble preparado en el ejemplo de referencia 3) solo o se administraron receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti­ receptor de IL-6 humano simultáneamente para examinar la cinética del receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano in vivo. Se administró una dosis individual (10 ml/kg) de la solución de receptor de IL-6 humano soluble (5 pg/ml) o una mezcla de receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en la vena caudal. Se utilizaron los H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 y FH4-IgG1 anteriores como anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano.
La concentración del receptor de IL-6 humano soluble en todas las mezclas es de 5 pg/ml. Las concentraciones del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano varían con los anticuerpos: 0,1 mg/ml para H54/L28-IgG1 y 10 mg/ml para 6RL#9-IgG1 y FH4-IgG1. En ese momento, se pensó que la mayoría de los receptores de IL-6 humanos solubles se unen al anticuerpo porque el anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano contra el receptor de IL-6 humano soluble existe en una cantidad suficiente o excesiva. Se recogieron muestras de sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1,2, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración. Las muestras de sangre obtenidas se centrifugaron inmediatamente durante 15 minutos a 4 °C y 12.000 rpm para separar el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
(12-2) Determinación de la concentración de anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano en plasma en ratones normales mediante ELISA
La concentración en plasma del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en un ratón se determinó mediante ELISA. En primer lugar, se distribuyó un fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti-IgG humana (específico de cadena y) (SIGMA) en una placa Nunc-Immuno, MaxiSoup (Nalge Nunc International), y se permitió que reposara sin alteraciones durante una noche a 4 °C para preparar una placa de fase sólida anti-IgG humana. Las muestras de la curva de calibración a una concentración en plasma de 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02 o 0,01 pg/ml y las muestras de medición de plasma de ratón diluidas 100 veces o más se distribuyeron cada una en la placa de fase sólida anti-IgG humana, seguido de incubación durante 1 hora a 25 °C. Posteriormente, se dejó que la placa reaccionara con un anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) durante 1 hora a 25 °C, seguido de reacción con estreptavidina-poliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) durante 0,5 horas a 25 °C. La reacción cromogénica se realizó utilizando como sustrato el sustrato de micropocillos HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories). Después de detenerse la reacción cromogénica mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm de la solución de color utilizando un lector de microplacas. La concentración en plasma en el ratón se calculó a partir de la absorbancia de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los cambios en las concentraciones en plasma de los anticuerpos H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 y FH4-IgG1, en los ratones normales después de la administración intravenosa, medidas como se ha descrito anteriormente, se muestran en la fig. 42.
(12-3) Determinación de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble mediante un método de electroquimioluminiscencia
La concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en un ratón se determinó mediante un método de electroquimioluminiscencia. Una muestra de la curva de calibración del receptor de IL-6 humano soluble preparada a 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 o 31,25 pg/ml y una muestra de medición de plasma de ratón diluida 50 veces o más, se mezclaron con un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) rutenado con NHS éster eon sulfomarcador (Meso Scale Discovery), un anticuerpo anti-IL-6 R humano biotinilado (R&D) y tocilizumab (cadena pesada SEQ ID NO: 109, cadena ligera SEQ ID NO: 83), seguido de reacción durante una noche a 4 °C. En ese momento, el tampón de ensayo contenía EDTA 10 mM para reducir la concentración de Ca libre en la muestra y disociar casi todos los receptores de IL-6 humanos solubles en la muestra de 6RL#9-IgG1 o FH4-IgG1 para unirse al tocilizumab añadido. Posteriormente, dicho líquido de reacción se distribuyó en una placa de estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Además, después de lavar cada pocillo de la placa que se dejó reaccionar durante 1 hora a 25 °C, se distribuyó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) en cada pocillo. Inmediatamente, el líquido de reacción se sometió a medición utilizando un lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). La concentración del receptor de IL-6 humano soluble se calculó a partir de la respuesta de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los cambios de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en el ratón normal después de la administración intravenosa, determinada como se ha descrito anteriormente, se muestran en la fig. 43.
Como resultado, la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble fue muy rápida cuando el receptor de IL-6 humano soluble se administró solo, mientras que la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble se retardó significativamente cuando el receptor de IL-6 humano soluble se administró simultáneamente con H54/L28-IgG1, un anticuerpo convencional que no tiene capacidad de unión dependiente de Ca al receptor de IL-6 humano soluble. Por el contrario, la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble se aceleró significativamente cuando el receptor de IL-6 humano soluble se administró simultáneamente con 6RL#9-IgG1 o FH4-IgG1 que tiene una capacidad de unión dependiente de Ca de 100 veces o más al receptor de IL-6 humano soluble. Las concentraciones en plasma del receptor de IL-6 humano soluble un día después de la administración simultánea del receptor de IL-6 humano soluble con 6RL#9-IgG1 y FH4-IgG1 se redujeron 39 veces y 2 veces, respectivamente, en comparación con la administración simultánea con H54/L28-IgG1. Por tanto, se confirmó que los anticuerpos de unión dependiente de calcio eran capaces de acelerar la desaparición de antígenos del plasma.
[Ejemplo de referencia 13] Ensayos para mejorar el efecto de aceleración de la eliminación de antígenos de un anticuerpo con unión a antígeno dependiente de Ca (preparación de anticuerpos)
(13-1) Acerca de la unión del anticuerpo IgG a FcRn
Los anticuerpos IgG tienen un tiempo de permanencia en plasma más largo como resultado de la unión a FcRn. La unión entre IgG y FcRn se observa solo en una condición ácida (pH 6,0). Por el contrario, la unión es casi indetectable en una condición neutra (pH 7,4). Un anticuerpo IgG se capta en células de manera inespecífica. El anticuerpo vuelve a la superficie celular mediante unión a FcRn endosómico en condición ácida endosómica y después se disocia de FcRn en condición neutra del plasma. Cuando la unión a FcRn en la condición ácida se pierde al introducir mutaciones en la región Fc IgG, el tiempo de permanencia del anticuerpo en plasma se ve notablemente afectado porque el anticuerpo ya no se recicla al plasma desde el endosoma.
Un método presentado para mejorar la permanencia en plasma de un anticuerpo IgG es mejorar la unión a FcRn en condiciones ácidas. Se introducen mutaciones de aminoácidos en su región Fc de un anticuerpo IgG para mejorar su unión a FcRn en condiciones ácidas. Esto aumenta la eficacia del reciclaje del anticuerpo IgG al plasma desde el endosoma, lo que da lugar a una mejora de la permanencia en plasma del anticuerpo IgG. Al introducir la sustitución de aminoácidos, se considera importante no aumentar la unión a FcRn en condiciones neutras. Los anticuerpos IgG que se unen a FcRn en condiciones neutras pueden volver a la superficie celular mediante la unión a FcRn en la condición ácida del endosoma, pero los anticuerpos IgG no se disocian del FcRn en plasma en condiciones neutras y no se reciclan al plasma y, por tanto, se pensó que la permanencia en plasma de los anticuerpos IgG estaba alterada de forma inversa.
Por ejemplo, como se describe en Dalí' Acqua et al. (J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180), la permanencia en plasma del anticuerpo IgG1 que se permitió que se uniera al FcRn de ratón en una condición neutra (pH 7,4) se agravó como resultado de la introducción de una sustitución de aminoácidos en un ratón. Además, como se describe en Yeung et al. (J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671), Datta-Mannan et al. (J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717) y Dall' Acqua et al. (J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180), también se observa que las variantes de anticuerpos IgG1 cuya unión a FcRn humano en una condición ácida (pH 6,0) se mejora mediante la introducción de una sustitución de aminoácidos se unen a FcRn humano en condiciones neutras (pH 7,4). Como se ha descrito, la permanencia en plasma de dicho anticuerpo administrado a un mono cinomolgo no mejoró, sin mostrar ningún cambio en la permanencia en plasma. Por tanto, en tecnología de ingeniería de anticuerpos para mejorar las funciones de los anticuerpos, se han realizado esfuerzos para mejorar la permanencia en plasma del anticuerpo aumentando su unión al FcRn humano en condiciones ácidas sin aumentar su unión al FcRn humano en una condición neutra (pH 7,4). En otras palabras, no se ha publicado ningún informe sobre las ventajas de los anticuerpos IgG 1 cuya unión a FcRn humano en una condición neutra (pH 7,4) aumenta mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos en la región Fc.
Los anticuerpos que se unen a un antígeno de una manera dependiente de Ca son extremadamente útiles, debido a que tienen un efecto de acelerar la desaparición del antígeno soluble y la unión repetida de una sola molécula de anticuerpo al antígeno soluble. Se examinó un método para mejorar la unión a FcRn en una condición neutra (pH 7,4) como método para mejorar adicionalmente el efecto acelerador sobre la desaparición de antígenos.
(13-2) Preparación de anticuerpos de unión al receptor de IL-6 humano dependientes de Ca que tienen capacidad de unión a FcRn en condiciones neutras
Se introdujo una mutación de aminoácidos en las regiones Fc de FH4-IgG1 y 6RL#9-IgG1 que tienen una capacidad de unión a antígeno dependiente de calcio y H54/L28-IgG1 que no tiene capacidad de unión a antígeno dependiente de calcio (utilizado como control) para preparar variantes que tengan una capacidad de unión a FcRn en una condición neutra (pH 7,4). La mutación de aminoácidos se introdujo mediante un método conocido en la técnica usando PCR. De manera específica, se prepararon FH4-N434W (cadena pesada SEQ ID NO: 110, cadena ligera SEQ ID NO: 95), 6RL#9-N434W (cadena pesada SEQ ID NO: 111, cadena ligera SEQ ID NO: 93) y H54/L28-N434W (cadena pesada SEQ ID NO: 112, cadena ligera SEQ ID NO: 97) con Asn (un aminoácido en la posición 434 representada por la numeración EU) sustituido por Trp en la región constante de cadena pesada de IgG1. Se preparó un vector de expresión de células animales en el que se insertó un polinucleótido que codifica una variante con la sustitución de aminoácidos utilizando el equipo de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene) mediante el método descrito en las instrucciones adjuntas. La expresión y purificación del anticuerpo y la medición de la concentración se realizaron según el método descrito en el ejemplo de referencia 6.
[Ejemplo de referencia 14] Examen del efecto de acelerar la desaparición de anticuerpos de unión dependientes de Ca utilizando ratones normales
(14-1) Prueba in vivo con ratones normales
A un ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Japan), se le administró hsIL-6R (receptor de IL-6 humano soluble preparado en el ejemplo de referencia 3) solo o se administraron receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti­ receptor de IL-6 humano simultáneamente para examinar la cinética del receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano in vivo. Se administró una dosis individual (10 ml/kg) de solución de receptor de IL-6 humano soluble (5 pg/ml) o una mezcla de receptor de IL-6 humano soluble y anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano en la vena caudal. Los anteriores H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W y FH4-N434W se utilizaron como anticuerpos anti­ receptor de IL-6 humano.
La concentración del receptor de IL-6 humano soluble en todas las mezclas es de 5 pg/ml. Las concentraciones del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano varían con los anticuerpos: preparados a 0,042 mg/ml para H54/L28-N434W, 0,55 mg/ml para 6RL#9-N434W y 1 mg/ml para FH4-N434W. En ese momento, se pensó que la mayoría de los receptores de IL-6 humanos solubles se unen al anticuerpo porque el anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano contra el receptor de IL-6 humano soluble existe en una cantidad suficiente o excesiva. Se recogieron muestras de sangre a los 15 minutos, 7 horas y 1, 2, 4, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración. Las muestras de sangre se centrifugaron inmediatamente durante 15 minutos a 4 °C y 12.000 rpm para separar el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador ajustado a -20 °C o menos hasta el momento de la medición.
(14-2) Determinación de la concentración de anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano en plasma en ratones normales mediante ELISA
La concentración en plasma de anticuerpo anti-receptor de IL-6 human en un ratón se determinó mediante ELISA como se describe en el ejemplo de referencia 12. Los cambios de las concentraciones en plasma de los anticuerpos, H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W y FH4-N434W, en los ratones normales después de la administración intravenosa medida como se ha descrito anteriormente se muestran en la fig. 44.
(14-3) Determinación de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble mediante un método de electroquimioluminiscencia
La concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en un ratón se determinó mediante un método de electroquimioluminiscencia. Una muestra de la curva de calibración del receptor de IL-6 humano soluble preparada a 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 o 31,25 gg/ml y una muestra de medición de plasma de ratón diluida 50 veces o más, se mezclaron con un anticuerpo monoclonal anti-IL-6R humano (R&D) rutenado con NHS éster eon sulfomarcador (Meso Scale Discovery) y un anticuerpo anti-IL-6R humano biotinilado (R&D), seguido de reacción durante una noche a 4 °C. En ese momento, el tampón de ensayo contenía EDTA 10 mM para reducir la concentración de Ca libre en la muestra y disociar casi todos los receptores de IL-6 humanos solubles en la muestra de 6RL#9-N434W o FH4-N434W para que existan en estado libre. Posteriormente, dicho líquido de reacción se distribuyó en una placa de estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). Además, después de lavar cada pocillo de la placa que se dejó reaccionar durante 1 hora a 25 °C, se distribuyó tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) en cada pocillo. Inmediatamente, el líquido de reacción se sometió a medición utilizando un lector SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). La concentración del receptor de IL-6 humano soluble se calculó a partir de la respuesta de la curva de calibración utilizando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los cambios de la concentración en plasma del receptor de IL-6 humano soluble en el ratón normal después de la administración intravenosa determinada como se ha descrito anteriormente se muestran en la fig. 45.
Como resultado, en comparación con la administración del receptor de IL-6 humano soluble solo, la administración simultánea del receptor de IL-6 humano soluble con el anticuerpo H54/L28-N434W que tiene actividad de unión a FcRn a pH 7,4 y no tiene actividad de unión dependiente de Ca al receptor de IL-6 humano soluble tuvo una desaparición significativamente retardada del receptor de IL-6 humano soluble. Por el contrario, la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble se aceleró cuando el receptor de IL-6 humano soluble se administró simultáneamente con el anticuerpo 6RL#9-N434W o FH4-N434W que tiene capacidad de unión dependiente de Ca de 100 veces o más al receptor de IL-6 humano soluble y actividad de unión a FcRn a pH 7,4, en comparación con la administración del receptor de IL-6 humano soluble solo. Las concentraciones en plasma del receptor de IL-6 humano soluble un día después de la administración simultánea del receptor de IL-6 humano soluble con el anticuerpo 6RL#9-N434W y FH4-N434W se redujeron 3 veces y 8 veces, respectivamente, en comparación con la administración del receptor de IL-6 humano soluble solo. Como resultado, se confirmó que la desaparición del antígeno del plasma podría acelerarse adicionalmente transmitiendo actividad de unión a FcRn a pH 7,4 a un anticuerpo que se une al antígeno de una manera dependiente de calcio.
Se confirmó que el anticuerpo 6RL#9-IgG1 o FH4-IgG1 que tiene actividad de unión dependiente de Ca de 100 veces o más al receptor de IL-6 humano soluble aumenta la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble, en comparación con el anticuerpo H54/L28-IgG1 que no tiene actividad de unión dependiente de Ca al receptor de IL-6 humano soluble. Se confirmó que el anticuerpo 6RL#9-N434W o FH4-N434W que tiene actividad de unión dependiente de Ca de 100 veces o más al receptor de IL-6 humano soluble y actividad de unión a FcRn a pH 7,4 acelera más fuertemente la desaparición del receptor de IL-6 humano soluble, en comparación con la administración del receptor de IL-6 humano soluble solo. Estos datos sugieren que un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera dependiente de Ca se disocia del antígeno en el endosoma, de manera similar a un anticuerpo que se une al antígeno de una manera dependiente del pH.
[Ejemplo de referencia 15] Exploración de secuencias de la línea germinal humana que se unen al ion de calcio
(15-1) Anticuerpo que se une al antígeno de manera dependiente de calcio
Los anticuerpos que se unen a un antígeno de manera dependiente de Ca (anticuerpos de unión a antígeno dependientes de Ca) son aquellos cuyas interacciones con el antígeno cambian con la concentración de calcio. Se cree que un anticuerpo de unión a antígeno dependiente de Ca se une a un antígeno a través del ion de calcio. Por tanto, los aminoácidos que forman un epítopo en el lado del antígeno son aminoácidos con carga negativa que pueden quelar iones de calcio o aminoácidos que pueden ser un aceptor de enlaces de hidrógeno. Estas propiedades de los aminoácidos que forman un epítopo permiten la dirección a un epítopo distinto de las moléculas de unión, que se generan mediante la introducción de histidinas y se unen a un antígeno de manera dependiente del pH. Se cree que el uso de moléculas de unión a antígeno que tienen propiedades de unión a antígeno dependientes de calcio y del pH permite la formación de moléculas de unión a antígeno que pueden dirigirse individualmente a diversos epítopos que tienen amplias propiedades. Por tanto, si se construye una población de moléculas que contienen un motivo de unión a calcio (biblioteca de Ca), a partir de la cual se obtienen moléculas de unión a antígeno, se cree que se obtienen de forma eficaz anticuerpos de unión a antígeno dependientes de Ca.
(15-2) Adquisición de secuencias de línea germinal humana
Un ejemplo de la población de moléculas que contienen un motivo de unión a calcio es un ejemplo en el que dichas moléculas son anticuerpos. En otras palabras, una biblioteca de anticuerpos que contiene un motivo de unión a calcio puede ser una biblioteca de Ca.
No se ha informado de anticuerpos de unión a iones de calcio que contengan secuencias de línea germinal humana.
Por tanto, las secuencias de línea germinal de anticuerpos que tienen secuencias de línea germinal humana se clonaron utilizando como molde ADNc preparado a partir de poliARN de bazo fetal humano (Clontech) para evaluar si los anticuerpos que tienen secuencias de línea germinal humana se unen al ion de calcio. Los fragmentos de ADN clonados se insertaron en vectores de expresión de células animales. Las secuencias de nucleótidos de los vectores de expresión construidos se determinaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Las SEQ ID se muestran en la tabla 34. Por PCR, los polinucleótidos que codifican las SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3), SEQ ID NO: 8 (Vk4) y SEQ ID NO: 4 (Vk5) se ligaron a un polinucleótido que codifica la región constante de cadena Kappa natural (SEQ ID NO: 100). Los fragmentos de ADN ligados se insertaron en vectores de expresión de células animales. Asimismo, los polinucleótidos que codifican las SEQ ID NO: 113 (Vk1), SEQ ID NO: 114 (Vk2), SEQ ID NO: 115 (Vk3), SEQ ID NO: 116 (Vk4) y SEQ ID NO: 117 (Vk5) se ligaron mediante PCR a un polinucleótido que codifica un polipéptido (SEQ ID NO: 11) que tiene una supresión de dos aminoácidos en el extremo C de IgG1. Los fragmentos de ADN resultantes se insertaron en vectores de expresión de células animales. Las secuencias de las variantes construidas se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica.
[Tabla 34]
Figure imgf000165_0001
(15-3) Expresión y purificación de anticuerpos
Los vectores de expresión de células animales construidos en los que se han insertado los fragmentos de ADN que tienen los cinco tipos de secuencias de la línea germinal humana se introdujeron en células animales. Se llevó a cabo expresión de anticuerpos mediante el siguiente método. Se suspendieron células de FreeStyle 293-F (Invitrogen) procedentes de células de riñón fetal humano en el medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) y se sembraron en placas a una densidad celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Los plásmidos preparados se introdujeron en las células mediante un método de lipofección. Las células se cultivaron durante cuatro días en una incubadora de CO2 (37 °C, CO2 al 8 %, 90 rpm). Del sobrenadante de cultivo preparado como se ha descrito anteriormente, se purificaron los anticuerpos utilizando el rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbancia a 280 nm de las soluciones de anticuerpo purificadas utilizando un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de extinción calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411 -2423).
(15-4) Evaluación de anticuerpos que tienen secuencias de línea germinal humana para determinar su actividad de unión a iones de calcio
Los anticuerpos purificados se evaluaron para determinar su actividad de unión a iones de calcio. La temperatura intermedia de desnaturalización térmica (valor de Tm) se midió mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) como indicador para examinar la unión de ion de calcio al anticuerpo (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). La temperatura intermedia de desnaturalización térmica (valor de Tm) es un indicador de la estabilidad. Se vuelve más alto cuando una proteína se estabiliza mediante la unión a iones de calcio, en comparación con el caso donde no se une ningún ion de calcio (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Se evaluó la actividad de unión del ion de calcio al anticuerpo examinando los cambios en el valor de Tm del anticuerpo dependiendo de los cambios en la concentración de iones de calcio en la solución de anticuerpo. El anticuerpo purificado se sometió a diálisis (EasySEP, TOMY) utilizando una solución externa de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM y CaCl22 mM (pH 7,4) o Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM y CaCl23 pM (pH 7,4). La medición de DSC se realizó a una velocidad de calentamiento de 240 °C/h desde 20 a 115 °C utilizando como sustancia de prueba una solución de anticuerpo preparada a aproximadamente 0,1 mg/ml con el dializado. Las temperaturas intermedias de desnaturalización térmica (valores de Tm) de los dominios Fab de cada anticuerpo, calculadas a partir de la curva de desnaturalización obtenida por DSC, se muestran en la tabla 35.
[Tabla 35]
Figure imgf000166_0001
El resultado mostró que los valores de Tm de los dominios Fab de anticuerpos que tienen la secuencia de Vk1, Vk2, Vk3 o Vk4 no variaron dependiendo de la concentración de iones de calcio en las soluciones que contienen dominios Fab. Al mismo tiempo, el valor de Tm para el dominio Fab del anticuerpo que tiene la secuencia Vk5 varió dependiendo de la concentración de iones de calcio en la solución que contiene dominios Fab. Esto demuestra que la secuencia de Vk5 se une al ion de calcio.
[Ejemplo de referencia 16] Evaluación de la secuencia de Vk5 humana (hVk5)
(16-1) Secuencia de hVk5
La única secuencia de hVk5 registrada en la base de datos de Kabat es la secuencia de hVk5-2. En lo sucesivo en la presente memoria, hVk5 y hVk5-2 se utilizan como sinónimos. El documento WO2010/136598 describe que la proporción de abundancia de la secuencia de hVk5-2 en la secuencia de línea germinal es de 0,4 %. También se han realizado otros informes en los que la proporción de abundancia de la secuencia de hVk5-2 en la secuencia de línea germinal es de 0-0,06 % (J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86; Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). Como se ha descrito anteriormente, ya que la secuencia de hVk5-2 es una secuencia de baja frecuencia de aparición en la secuencia de línea germinal, se pensó que era ineficaz obtener un anticuerpo de unión a calcio a partir de una biblioteca de anticuerpos que consiste en secuencias de línea germinal humana o linfocitos B obtenidos al inmunizar un ratón que expresa anticuerpos humanos. Por tanto, se consideró posible diseñar una biblioteca de Ca que contenga una secuencia de hVk5-2 humana. Sin embargo, se desconoce la realización de la posibilidad porque no se ha publicado ningún informe sobre las propiedades físicas de la secuencia de hVk5-2.
(16-2) Construcción, expresión y purificación de una forma no glucosilada de la secuencia de hVk5-2
La secuencia de hVk5-2 tiene una secuencia para N glucosilación en el aminoácido de la posición 20 (numeración de Kabat). Las cadenas de azúcar unidas a proteínas presentan heterogeneidad. Por tanto, es deseable perder la glucosilación desde el punto de vista de la homogeneidad de la sustancia. En este contexto, se construyó la variante hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 118) en la que el resto de Asn (N) en la posición 20 (numeración de Kabat) se sustituye por Thr (T). La sustitución de aminoácidos se llevó a cabo mediante un método conocido por los expertos en la técnica utilizando el equipo de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene). Se insertó un ADN que codifica la variante hVk5-2_L65 en un vector de expresión animal. El vector de expresión animal en el que se ha insertado el ADN construido que codifica la variante hVk5-2_L65, en combinación con un vector de expresión animal que tiene un inserto para expresar CIM_H (SEQ ID NO: 117) como una cadena pesada, se introdujo en células animales mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 6. El anticuerpo que comprende hVk5-2_L65 y CIM_H, que se expresó en células animales en las que se habían introducido los vectores, se purificó mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 6.
(16-3) Evaluación del anticuerpo que tiene la secuencia de hVk5-2 no glucosilada para determinar las propiedades físicas
El anticuerpo aislado que tiene la secuencia modificada hVk5-2_L65 se analizó mediante cromatografía de intercambio iónico para probar si es menos heterogéneo que el anticuerpo que tiene la secuencia original hVk5-2 antes de la modificación. El procedimiento de cromatografía de intercambio iónico se muestra en la tabla 36. El resultado del análisis mostró que hVk5-2_L65 modificado en el sitio de glucosilación era menos heterogéneo que la secuencia original hVk5-2, como se muestra en la fig. 46.
[Tabla 36]
Figure imgf000167_0001
A continuación, se evaluó si el anticuerpo que comprende la secuencia de hVk5-2_L65 menos heterogénea se une al ion de calcio mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 15. El resultado mostró que el valor de Tm para el dominio Fab del anticuerpo que tiene hVk5-2_L65 con el sitio de glucosilación alterado también varió dependiendo de la concentración de iones de calcio en las soluciones de anticuerpos, como se muestra en la tabla 37. De manera específica, se ha demostrado que el dominio Fab del anticuerpo que tiene hVk5-2_L65 con el sitio de glucosilación alterado se une al ion de calcio.
[Tabla 37]
Figure imgf000167_0002
[Ejemplo de referencia 17] Evaluación de la actividad de unión a iones de calcio de moléculas de anticuerpo que tienen la secuencia de CDR de la secuencia de hVk5-2
(17-1) Construcción, expresión y purificación de anticuerpos modificados que tienen una secuencia de CDR de la secuencia de hVk5-2
La secuencia de hVk5-2_L65 es una secuencia con aminoácidos alterados en un sitio de glucosilación en el marco conservado de la secuencia de Vk5-2 humana. Como se describe en el ejemplo de referencia 16, se ha demostrado que el ion de calcio se unía incluso después de la alteración del sitio de glucosilación. Al mismo tiempo, desde el punto de vista de la inmunogenicidad, en general, es deseable que la secuencia de marco conservado sea una secuencia de línea germinal. Por tanto, los presentes inventores evaluaron si una secuencia de marco conservado de anticuerpo podría sustituirse con la secuencia de marco conservado de una secuencia de línea germinal no glucosilada manteniendo al mismo tiempo la actividad de unión a iones de calcio del anticuerpo.
Se ligaron polinucleótidos que codifican secuencias sintetizadas químicamente que comprenden una secuencia de marco conservado alterada de la secuencia de hVk5-2, hVk1, hVk2, hVk3 o hVk4 (CaVk1 (SEQ ID NO: 119), CaVk2 (SEQ ID NO: 120) CaVk3 (SEQ ID NO: 121) o CaVk4 (SEQ ID No : 122), respectivamente) mediante pCr a un polinucleótido que codifica la región constante (SEQ ID NO: 100) de la cadena Kappa natural. Los fragmentos de ADN ligados se insertaron en vectores de expresión de células animales. Las secuencias de las variantes construidas se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Cada plásmido construido como se ha descrito anteriormente se introdujo en células animales en combinación con un plásmido en el que se ha insertado un polinucleótido que codifica la cadena pesada CIM_H (SEQ ID NO: 117) mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 6. Las moléculas de anticuerpo expresadas de interés se purificaron a partir de medios de cultivo de las células animales en las que se han introducido los plásmidos.
(17-2) Evaluación de anticuerpos alterados que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 para determinar su actividad de unión a iones de calcio
Se evaluó si el ion de calcio se une a anticuerpos alterados que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 y las secuencias de marco conservado de secuencias de línea germinal distintas de hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 y hVk4) mediante el método descrito en el ejemplo 6. El resultado de la evaluación se muestra en la tabla 38. Se reveló que el valor de Tm del dominio Fab de cada anticuerpo alterado variaba dependiendo de la concentración de iones de calcio en las soluciones de anticuerpos. Esto demuestra que los anticuerpos que tienen una secuencia de marco conservado distinta de las secuencias de marco conservado de la secuencia hVk5-2 también se unen al ion de calcio.
[Tabla 38]
Figure imgf000168_0001
Se demostró que la temperatura de desnaturalización térmica (valor de T m), como indicador de la estabilidad térmica, del dominio Fab de cada anticuerpo alterado para tener la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 y la secuencia de marco conservado de una secuencia de línea germinal distinta de la secuencia hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 o hVk4) era mayor que la del dominio Fab del anticuerpo original que tiene la secuencia hVk5-2. Este resultado muestra que los anticuerpos que tienen la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 y la secuencia de marco conservado de hVk1, hVk2, hVk3 o hVk4 no solo tienen actividad de unión a iones de calcio, sino que también son moléculas excelentes desde el punto de vista de la estabilidad térmica.
[Ejemplo de referencia 18] Identificación del sitio de unión a iones de calcio en la secuencia de hVk5-2 de línea germinal humana
(18-1) Diseño del sitio de mutación en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2
Como se describe en el ejemplo de referencia 17, también se ha demostrado que los anticuerpos que tienen la cadena ligera resultante de la introducción del dominio de CDR de la secuencia hVk5-2 en la secuencia de marco conservado de una secuencia de línea germinal diferente se unen al ion de calcio. Este resultado sugiere que en hVk5-2 se ubica un sitio de unión a iones de calcio dentro de su CDR. Los aminoácidos que se unen al ion de calcio, es decir, quelato de ion de calcio, incluyen aminoácidos con carga negativa y aminoácidos que pueden ser un aceptor de enlaces de hidrógeno. Por tanto, se probó si los anticuerpos que tienen una secuencia de hVk5-2 mutante con una sustitución de un resto de Asp (D) o Glu (E) por un resto de Ala (A) en la secuencia de CDR de la secuencia de hVk5-2 se unen al ion de calcio.
(18-2) Construcción de secuencias de hVk5-2 variantes con sustitución de Ala y expresión y purificación de anticuerpos
Se prepararon moléculas de anticuerpos para comprender una cadena ligera con sustitución de un resto de Asp y/o Glu por un resto de Ala en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2. Como se describe en el ejemplo de referencia 16, la variante no glucosilada hVk5-2_L65 presentó unión a iones de calcio y se supuso que era equivalente a la secuencia hVk5-2 con respecto a la unión a iones de calcio. En este ejemplo, se introdujeron sustituciones de aminoácidos en hVk5-2_L65 como secuencia molde. Las variantes construidas se muestran en la tabla 39. Las sustituciones de aminoácidos se llevaron a cabo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como utilizando el equipo de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene), PCR o el equipo de clonación de PCR In fusion Advantage (TAKARA) para construir vectores de expresión para cadenas ligeras alteradas que tienen una sustitución de aminoácidos.
[Tabla 39]
Figure imgf000168_0002
Las secuencias de nucleótidos de los vectores de expresión construidos se confirmaron mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Los vectores de expresión construidos para las cadenas ligeras alteradas se introdujeron de manera transitoria, en combinación con un vector de expresión para la cadena pesada CIM_H (SEQ ID NO: 117), en células de la línea HEK293H procedente de células de riñón fetal humano (Invitrogen) o FreeStyle293 (Invitrogen) para expresar anticuerpos. De los sobrenadantes de cultivo obtenidos, se purificaron los anticuerpos utilizando el rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbancia a 280 nm de las soluciones de anticuerpo purificadas utilizando un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de extinción calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(18-3) Evaluación de la actividad de unión a iones de calcio de anticuerpos que tienen una sustitución de Ala en la secuencia de hVk5-2
Se probó si los anticuerpos purificados obtenidos se unen al ion de calcio mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 15. Los resultados se muestran en la tabla 40. Se reveló que algunos anticuerpos que tienen sustitución de un resto de Asp o Glu en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 con un resto Ala que no puede estar implicado en la unión o quelación de iones de calcio tienen un dominio Fab cuya Tm no varió por la concentración de iones de calcio en las soluciones de anticuerpos. Se demostró que los sitios de sustitución en los que la sustitución de Ala no alteró la Tm (posiciones 32 y 92 (numeración de Kabat)) eran muy importantes para la unión de ion de calcioanticuerpo.
[Tabla 40]
Figure imgf000169_0001
[Ejemplo de referencia 19] Evaluación de la actividad de unión a iones de calcio de anticuerpos que tienen la secuencia hVk1 con motivo de unión a iones de calcio
(19-1) Construcción de una secuencia de hVk1 con motivo de unión a iones de calcio y expresión y purificación de anticuerpos
El resultado descrito en el ejemplo de referencia 18 sobre la actividad de unión a calcio del sustituto de Ala demuestra que los restos de Asp o Glu en la secuencia de CDR de la secuencia hVk5-2 eran importantes para la unión a calcio. Por tanto, los presentes inventores evaluaron si un anticuerpo puede unirse al ion de calcio cuando los restos en las posiciones 30, 31, 32, 50 y 92 (numeración de Kabat) solos se introdujeron en una secuencia de región variable de línea germinal diferente. De manera específica, la variante LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 131) se construyó sustituyendo los restos en las posiciones 30, 31, 32, 50, y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia hVk1 por los restos en las posiciones 30, 31, 32, 50 y 92 (numeración de Kabat) en la secuencia hVk5-2 (una secuencia de línea germinal humana). De manera específica, se probó si los anticuerpos que tienen una secuencia hVk1 en la que se han introducido solo 5 restos de la secuencia hVk5-2 pueden unirse al calcio. Las variantes se produjeron mediante el mismo método que se describe en el ejemplo de referencia 17. La variante de cadena ligera resultante LfVk1_Ca y LfVk1 que tiene la secuencia hVk1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 132) se coexpresaron con la cadena pesada CIM_H (SEQ ID NO: 117). Los anticuerpos se expresaron y purificaron mediante el mismo método que se describe en el ejemplo de referencia 18.
(19-2) Evaluación de la actividad de unión a iones de calcio de anticuerpos que tienen la secuencia hVk1 humana con motivo de unión a iones de calcio
Se evaluó si el anticuerpo purificado preparado como se ha descrito anteriormente se une al ion de calcio mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 15. Los resultados se muestran en la tabla 41. El valor de Tm del dominio Fab del anticuerpo que tiene LfVk1 con una secuencia de hVk1 no varió dependiendo de la concentración de calcio en las soluciones de anticuerpos. Al mismo tiempo, la Tm del anticuerpo que tiene la secuencia LfVk1_Ca se desplazó 1 °C o más al cambiar la concentración de calcio en las soluciones de anticuerpos. Por tanto, se mostró que el anticuerpo que tiene LfVk1_Ca se une al calcio. El resultado descrito anteriormente demuestra que no es necesaria la secuencia de CDR completa de hVk5-2, mientras que los restos introducidos para construcción solo de la secuencia LfVk1_Ca son suficientes para la unión al ion de calcio.
[Tabla 41]
Figure imgf000170_0001
[Ejemplo de referencia 20] Diseño de una población de moléculas de anticuerpos (biblioteca de Ca) con un motivo de unión a iones de calcio introducido en la región variable para obtener eficazmente anticuerpos de unión que se unen al antígeno de manera dependiente de la concentración de Ca
Los motivos de unión a calcio preferidos incluyen, por ejemplo, la secuencia hVk5-2 y la secuencia de CDR, así como restos en las posiciones 30, 31,32, 50 y 92 (numeración de Kabat). Otros motivos de unión a calcio incluyen el motivo de mano EF que poseen las proteínas de unión a calcio (p. ej., calmodulina) y lectina de tipo C (p. ej., ASGPR).
La biblioteca de Ca consiste en regiones variables de cadena ligera y pesada. Se utilizó una secuencia de anticuerpo humano para la región variable de cadena pesada y se introdujo un motivo de unión a calcio en la región variable de cadena ligera. La secuencia de hVk1 se seleccionó como secuencia molde de la región variable de cadena ligera para introducir un motivo de unión a calcio. Se mostró que un anticuerpo que contiene una secuencia LfVk1_Ca obtenida al introducir la secuencia de CDR de hVk5-2 (uno de los motivos de unión a calcio) en la secuencia hVk1 se une a iones de calcio, como se muestra en el ejemplo de referencia 19. Se permitió que aparecieran múltiples aminoácidos en la secuencia molde para diversificar las moléculas de unión a antígeno que constituyen la biblioteca. Las posiciones expuestas en la superficie de una región variable que probablemente interactúe con el antígeno se seleccionaron como aquellas donde se permite la aparición de múltiples aminoácidos. De manera específica, las posiciones 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91,92, 93, 94 y 96 (numeración de Kabat) se seleccionaron como restos flexibles.
Se determinó el tipo y la frecuencia de aparición de los restos de aminoácidos que posteriormente se permitió que aparecieran. Se analizó la frecuencia de aparición de aminoácidos en los restos flexibles de las secuencias hVk1 y hVk3 registradas en la base de datos de Kabat (KABAT, E.A. ETAL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Según los resultados del análisis, el tipo de aminoácidos que se permitió que aparecieran en la biblioteca de Ca se seleccionaron entre aquellos con mayor frecuencia de aparición en cada posición. En ese momento, también se seleccionaron aminoácidos cuya frecuencia de aparición se determinó como baja según los resultados del análisis para evitar el sesgo de las propiedades de los aminoácidos. La frecuencia de aparición de los aminoácidos seleccionados se determinó en referencia a los resultados del análisis de la base de datos de Kabat.
Una biblioteca de Ca que contiene un motivo de unión a calcio con énfasis en la diversidad de secuencia para contener múltiples aminoácidos en cada resto distinto del motivo se diseñó como una biblioteca de Ca teniendo en cuenta los aminoácidos y la frecuencia de aparición establecida como se ha descrito anteriormente. Los diseños detallados de la biblioteca de Ca se muestran en las tablas 1 y 2 (representando las posiciones en cada tabla la numeración EU). Además, si la posición 92 representada por la numeración de Kabat es Asn (N) para las frecuencias de aparición de los aminoácidos como se ha descrito en las tablas 1 y 2, la posición 94 puede ser Leu (L) en lugar de Ser (S).
[Ejemplo de referencia 21] Preparación de una biblioteca de Ca
Una genoteca de regiones variables de cadena pesada de anticuerpos se amplificó mediante PCR utilizando un ARN poli A preparado a partir de PBMC humanas y ARN poli A humano comercial, etc. como molde. Como se describe en el ejemplo de referencia 20, para las regiones variables de cadena ligera del anticuerpo, se diseñaron regiones variables de cadena ligera que aumentan la frecuencia de aparición de anticuerpos que mantienen un motivo de unión a calcio y pueden unirse a un antígeno de una manera dependiente de la concentración de calcio. Además, para restos de aminoácidos entre los restos flexibles distintos de aquellos con un motivo de unión a calcio introducido, se diseñó una biblioteca de regiones variables de cadena ligera de anticuerpos con aminoácidos distribuidos uniformemente de alta frecuencia de aparición en anticuerpos humanos naturales con referencia a la información de frecuencia de aparición de aminoácidos en anticuerpos humanos naturales (KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Una combinación de las genotecas de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos generadas como se describe anteriormente, se insertó en un vector fagémido para construir una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos que presenta dominios Fab que consisten en secuencias de anticuerpos humanos (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100). Para la construcción de la biblioteca, se utilizaron una parte conectora que conecta el Fab del fagémido con la proteína pIII del fago y las secuencias de una biblioteca de presentación en fagos con una secuencia de escisión de tripsina insertada entre los dominios N2 y CT del gen de la proteína pIII del fago auxiliar. Las secuencias de las partes de genes de anticuerpos aisladas de E. coli, en las que se introdujo la genoteca de anticuerpos, se identificaron para obtener información de secuencia para 290 clones. La distribución de aminoácidos diseñada y la distribución de aminoácidos en las secuencias identificadas se muestran en la fig. 52. Se construyó una biblioteca que contenía diversas secuencias correspondientes a la distribución de aminoácidos diseñada.
[Ejemplo de referencia 22] Examen de la actividad de unión a iones de calcio de moléculas contenidas en la biblioteca de Ca
(22-1) Actividad de unión a iones de calcio de moléculas contenidas en la biblioteca de Ca
Como se describe en el ejemplo de referencia 14, la secuencia de hVk5-2 que se demostró que se une a iones de calcio es una secuencia de baja frecuencia de aparición en la secuencia de línea germinal. Por tanto, se pensó que era ineficaz obtener un anticuerpo de unión a calcio a partir de una biblioteca de anticuerpos que consiste en secuencias de línea germinal humana o de linfocitos B obtenidos al inmunizar un ratón que expresa anticuerpos humanos. Como resultado, se construyó una biblioteca de Ca en el ejemplo de referencia 21. Se examinó la presencia o ausencia de un clon que mostraba unión a calcio a la biblioteca de Ca construida.
(22-2) Expresión y purificación de anticuerpos
Los clones incluidos en la biblioteca de Ca se insertaron en plásmidos de expresión de células animales. Los anticuerpos se expresaron mediante el siguiente método. Se suspendieron células de FreeStyle 293-F (Invitrogen) procedentes de células de riñón fetal humano en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) y se sembraron en placas a una densidad celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Los plásmidos preparados se introdujeron en las células mediante un método de lipofección. Las células se cultivaron durante cuatro días en una incubadora de CO2 (37 °C, CO2 al 8 %, 90 rpm). Del sobrenadante de cultivo preparado como se ha descrito anteriormente, se purificaron los anticuerpos utilizando el rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se midió la absorbancia a 280 nm de soluciones de anticuerpo purificadas utilizando un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpos se calcularon a partir de los valores determinados utilizando un coeficiente de extinción calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411 -2423).
(22-3) Evaluación de la unión de iones de calcio de los anticuerpos obtenidos
Se determinó si el anticuerpo purificado obtenido como se ha descrito anteriormente se une a iones de calcio mediante el método descrito en el ejemplo de referencia 6. Los resultados se muestran en la tabla 42. El valor de Tm de los dominios Fab de múltiples anticuerpos contenidos en la biblioteca de Ca varió con la concentración de iones de calcio, que muestra la presencia de moléculas de unión a iones de calcio.
[Tabla 42]
Figure imgf000171_0001
[Ejemplo de referencia 23] Diseño de biblioteca de anticuerpos de unión dependiente del pH
(23-1) Método para adquirir anticuerpos de unión dependiente del pH
El documento WO2009/125825 describe un anticuerpo de unión a antígeno dependiente del pH cuyas propiedades se modifican en regiones de pH neutro y ácido mediante la introducción de una histidina en una molécula de unión a antígeno. El anticuerpo de unión dependiente del pH descrito se obtiene mediante modificación para sustituir una parte de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno de interés por una histidina. Para obtener un anticuerpo de unión dependiente del pH de manera más eficaz sin obtener preliminarmente la molécula de unión al antígeno de interés para modificar, un método puede ser obtener una molécula de unión a antígeno que se une a un antígeno deseado de una población de moléculas de unión a antígeno (denominada biblioteca de His) con una histidina introducida en la región variable (más preferiblemente, una región potencialmente implicada en la unión a antígeno). Puede ser posible obtener de manera eficaz una molécula de unión a antígeno que tenga las propiedades deseadas a partir de una biblioteca de His, porque la histidina aparece con más frecuencia en las moléculas de unión a antígeno de la biblioteca de His que en las de las bibliotecas de anticuerpos convencionales.
(23-2) Diseño de una población de moléculas de anticuerpos (biblioteca de His) con un resto de histidina introducido en su región variable para adquirir de manera eficaz anticuerpos de unión que se unen al antígeno de una manera dependiente del pH
En primer lugar, las posiciones para introducir una histidina se seleccionaron en una biblioteca de His. El documento WO2009/125825 describe la generación de anticuerpos de unión a antígeno dependientes del pH mediante la sustitución de restos de aminoácidos en las secuencias de anticuerpos de receptor de IL-6, IL-6 y receptor de IL-31 con una histidina. Además, se generaron anticuerpos anti-lisozima de clara de huevo (FEBS Letter 11483, 309, 1 ,85­ 88) y antihepcidina (documento WO2009/139822) que tenían una capacidad de unión a antígeno dependiente del pH mediante la sustitución de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión a antígeno con histidinas. Las posiciones donde se introdujeron histidinas en el anticuerpo del receptor de IL-6, anticuerpo de IL-6, anticuerpo del receptor de IL-31, anticuerpo de lisozima de clara de huevo y anticuerpo de hepcidina se muestran en la tabla 43. Las posiciones mostradas en la tabla 43 pueden enumerarse como posiciones candidatas que pueden controlar la unión antígeno-anticuerpo. Además, aparte de la posición mostrada en la tabla 43, también se consideró que las posiciones que probablemente tengan contacto con el antígeno eran adecuadas para la introducción de histidinas.
[Tabla 43]
Figure imgf000172_0001
En la biblioteca de His que consiste en regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, se utilizó una secuencia de anticuerpo humano para la región variable de cadena pesada y se introdujeron histidinas en la región variable de cadena ligera. Las posiciones enumeradas anteriormente y las posiciones que pueden estar implicadas en la unión a antígeno, es decir, posiciones 30, 32, 50, 53, 91, 92 y 93 (numeración de Kabat, Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) en la cadena ligera se seleccionaron como posiciones para introducir histidinas en la biblioteca de His. Además, la secuencia de Vk1 se seleccionó como secuencia molde de la región variable de cadena ligera para introducir histidinas. Se permitió que aparecieran múltiples aminoácidos en la secuencia molde para diversificar las moléculas de unión a antígeno que constituyen la biblioteca. Las posiciones expuestas en la superficie de una región variable que probablemente interactúe con el antígeno se seleccionaron como aquellas donde se permite la aparición de múltiples aminoácidos. De manera específica, las posiciones 30, 31,32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 y 96 de la cadena ligera (numeración de Kabat, Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) se seleccionaron como restos flexibles.
Se determinó el tipo y la frecuencia de aparición de los restos de aminoácidos que posteriormente se permitió que aparecieran. Se analizó la frecuencia de aparición de aminoácidos en los restos flexibles en las secuencias hVkl y hVk3 registradas en la base de datos de Kabat (KABAT, E.A. ETAL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Según los resultados del análisis, el tipo de aminoácidos que se permitió que aparecieran en la biblioteca de His se seleccionaron entre aquellos con mayor frecuencia de aparición en cada posición. En ese momento, también se seleccionaron aminoácidos cuya frecuencia de aparición se determinó como baja según los resultados del análisis para evitar el sesgo de las propiedades de los aminoácidos. La frecuencia de aparición de los aminoácidos seleccionados se determinó en referencia a los resultados del análisis de la base de datos de Kabat.
Como bibliotecas de His, la biblioteca de His 1, que está fijada para incorporar necesariamente una única histidina en cada CDR, y la biblioteca de His 2, que tiene más énfasis en la diversidad de secuencias que la biblioteca de His 1, se diseñaron teniendo en cuenta los aminoácidos y la frecuencia de aparición establecidos como se ha descrito anteriormente. Los diseños detallados de las bibliotecas de His 1 y 2 se muestran en las tablas 3 y 4 (representando las posiciones en cada tabla la numeración de Kabat). Ser (S) en la posición 94 puede excluirse si la posición 92 representada por la numeración de Kabat es Asn (N) para la frecuencia de aparición de los aminoácidos como se ha descrito en las tablas 3 y 4.
[Ejemplo de referencia 24] Preparación de una biblioteca de presentación en fagos para anticuerpos humanos (biblioteca de His 1) para obtener un anticuerpo que se une al antígeno de una manera dependiente del pH.
Una genoteca de regiones variables de cadena pesada de anticuerpos se amplificó mediante PCR utilizando un ARN poli A preparado a partir de PBMC humanas y ARN poli A humano comercial como molde. Una genoteca de regiones variables de cadena ligera de anticuerpos diseñada como biblioteca de His 1 como se describe en el ejemplo 1 se amplificó utilizando PCR. Se insertó una combinación de las genotecas de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos generadas como se ha descrito anteriormente en un vector de fagémido para construir una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos que presenta dominios Fab que consisten en secuencias de anticuerpos humanos. Para el método de construcción, se utilizó Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100 como referencia. Para la construcción de la biblioteca, se utilizaron una región conectora que conecta el Fab del fagémido con la proteína pIII del fago y las secuencias de una biblioteca de presentación en fagos con una secuencia de escisión de tripsina insertada entre los dominios N2 y CT del gen de la proteína pIII del fago auxiliar. Se identificaron secuencias de las partes de genes de anticuerpos aisladas de E. co lien las que se introdujo la genoteca de anticuerpos y se obtuvo información de secuencia para 132 clones. La distribución de aminoácidos diseñada y la distribución de aminoácidos de las secuencias identificadas se muestran en la fig. 53. Se construyó una biblioteca que contenía diversas secuencias correspondientes a la distribución de aminoácidos diseñada.
[Ejemplo de referencia 25] Preparación de una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos (biblioteca de His 2) para obtener anticuerpos que se unen al antígeno de una manera dependiente del pH
Una genoteca de regiones variables de cadena pesada de anticuerpos se amplificó mediante PCR utilizando un ARN poli A preparado a partir de PBMC humanas y ARN poli A humano comercial como molde. Como se describe en el ejemplo de referencia 23, de las partes de cadena ligera de las regiones variables de anticuerpos, las que tienen mayor frecuencia de aparición de restos de histidina con un alto potencial de ser una región de contacto con el antígeno, están diseñadas para aumentar la frecuencia de aparición de anticuerpos que tienen una capacidad de unión a antígeno dependiente del pH. Además, para restos de aminoácidos distintos de los que tienen histidinas introducidas entre los restos flexibles, se diseña una biblioteca de regiones variables de cadena ligera de anticuerpos con aminoácidos distribuidos uniformemente de alta frecuencia de aparición identificados utilizando la información de frecuencia de aparición de aminoácidos en anticuerpos humanos naturales. Se sintetizó una genoteca de regiones variables de cadena ligera de anticuerpos diseñada como se ha descrito anteriormente. Una biblioteca puede sintetizarse comercialmente por consignación. Se insertó una combinación de las genotecas de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos generadas como se ha descrito anteriormente en un vector de fagémido para construir una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos que presenta dominios Fab que consisten en secuencias de anticuerpos humanos por un método conocido (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100). Se secuenció una parte de gen de anticuerpo aislada de E. coli con una genoteca de anticuerpos introducida como se describe en el ejemplo de referencia 24.
[Ejemplo de referencia 26] Efectos de combinación de la modificación de la unión selectiva a FcYRIIb con otras sustituciones de aminoácidos de la región Fc
Se intentó mejorar adicionalmente la selectividad para FcYRIIb modificando la variante con Pro en la posición 238 (numeración EU) sustituida por Asp que tiene selectividad mejorada para FcYRIIb como se encuentra en el ejemplo 14.
En primer lugar, con respecto a IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 80) que se obtiene introduciendo la modificación de sustituir Pro en la posición 238 (numeración EU) de IL6R-G1d por Asp, se preparó la variante IL6R-G1d-v4 (SEQ ID NO: 172) en la que Leu en la posición 328 (numeración EU) se sustituyó por Glu para mejorar la selectividad por FcYRIIb como se describe en el ejemplo 14. Se preparó IL6R-G1d-v4 expresado en combinación con IL6R-L (SEQ ID NO: 83), que se utilizó como cadena L, como se describe en el ejemplo de referencia 2. Un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de IL6R-G1d-v4 como cadena H del anticuerpo obtenido aquí se describe como IgG1-v4. Las actividades de unión a FcYRIIb de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 e IgG1-v4, examinadas como se describe en el ejemplo 14, se muestran en la tabla 44. Las modificaciones en la tabla representan las introducidas en IL6R-G1d.
[Tabla 44]
Figure imgf000174_0001
De los resultados de la tabla 44, ya que L328E mejora la actividad de unión a FcYRIIb en 2,3 veces en comparación con IgG1, se anticipó que al combinarlo con P238D que mejora de manera similar la actividad de unión de FcYRIIb en 4,8 veces en comparación con IgG 1 aumentaría adicionalmente el grado de mejora de la actividad de unión a FcYRIIb; sin embargo, en realidad, la actividad de unión a FcYRIIb de la variante que contiene una combinación de estas alteraciones se redujo a 0,47 veces en comparación con la de IgG1. Este resultado es un efecto que no se podía predecir a partir de las alteraciones respectivas.
De manera análoga, en IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 80) producida al introducir en IL6R-G1d la alteración producida al sustituir Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp, se introdujeron las sustituciones de Ser en la posición 267 (indicada por la numeración EU) por Glu y de Leu en la posición 328 (indicada por la numeración EU) por Phe como se describe en el ejemplo 14 que mejoran la actividad de unión a FcYRIIb, y la variante IL6R-G1d-v5 (SEQ ID NO: 173) se preparó según el método del ejemplo de referencia 2. El anticuerpo obtenido que tiene la secuencia de aminoácidos derivada de IL6R-G1d-v5 como la cadena H del anticuerpo se ha denominado IgG1-v5. Las actividades de unión a FcYRIIb de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3 e IgG1-v5 evaluadas según el método del ejemplo 14, se muestran en la tabla 45.
Se introdujo S267E/L328F que es la modificación con un efecto potenciador sobre FcYRIIb en el ejemplo 14 en la variante P238D. Los cambios en las actividades de unión a FcYRIIb antes y después de introducir esta alteración se muestran en la tabla 45.
[Tabla 45]
Figure imgf000174_0002
De los resultados de la tabla 45, ya que S267E/L328F mejora la actividad de unión a FcYRIIb en 408 veces en comparación con IgG 1, se anticipó que al combinarlo con P238D que mejora de manera similar la actividad de unión a FcYRIIb en 4,8 veces en comparación con IgG1 aumentaría adicionalmente el grado de mejora de la actividad de unión a FcYRIIb; sin embargo, en realidad, de manera similar al ejemplo anterior, la actividad de unión a FcYRIIb de la variante que contiene una combinación de estas alteraciones se mejoró solo 12 veces en comparación con la de IgG 1. Este resultado también es un efecto que no se podía predecir a partir de los efectos de las alteraciones respectivas.
Estos resultados mostraron que, aunque la sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp solo mejora la actividad de unión de FcYRIIb, el efecto no se manifiesta cuando se combina con otras alteraciones que mejoran la actividad de unión a FcYRIIb. Una razón para esto puede ser que la estructura de la interfaz para la interacción entre Fc y FcyR se cambia al introducir la sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp y los efectos de las alteraciones observadas en el anticuerpo de origen natural ya no se reflejan en los resultados. Por consiguiente, se consideró extremadamente difícil crear un Fc con excelente selectividad para FcYRIIb utilizando un Fc que comprende la sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp como molde, ya que no se pudo aplicar la información sobre los efectos de las alteraciones obtenida con anticuerpos de origen natural.
[Ejemplo de referencia 27] Análisis exhaustivo de la unión a FcYRIIb de variantes introducidas con una alteración en la parte de bisagra además de la alteración P238D
Como se muestra en el ejemplo de referencia 26, en un Fc producido al sustituir Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp en una IgG1 humana de origen natural, no se pudo obtener un efecto combinatorio anticipado incluso combinándolo con otra alteración que se predice que aumentará adicionalmente la unión a FcYRIIb a partir del análisis de anticuerpos de origen natural. Por lo tanto, para encontrar variantes que mejoren adicionalmente la unión a FcYRIIb, se introdujeron de manera exhaustiva modificaciones en el Fc alterado producido al sustituir Pro en la posición 238 (indicado por la numeración EU) por Asp. IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174) se produjo introduciendo una alteración de sustitución de Met en la posición 252 (indicado por la numeración EU) por Tyr y una alteración de sustitución de Asn en la posición 434 (indicada por la numeración EU) por Tyr en IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79) que se utilizó como cadena H del anticuerpo. Asimismo, se preparó IL6R-F652 (SEQ ID NO: 175) introduciendo una alteración de la sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp en IL6R-F11. Se prepararon plásmidos de expresión que contenían una secuencia de cadena H de anticuerpo para cada una de las secuencias de cadena H de anticuerpo producidas al sustituir la región cercana al resto en la posición 238 (indicada por la numeración EU) (posiciones 234 a 237 y 239 (indicadas por la numeración EU)) en IL6R-F652 cada una con 18 aminoácidos excluyendo los aminoácidos originales y Cys. Se utilizó IL6R-L (SEQ ID NO: 83) como una cadena L de anticuerpo común para todos los anticuerpos. Estas variantes se expresaron y purificaron mediante el método del ejemplo de referencia 2. Estas variantes de Fc se denominan variantes de PD. Las interacciones de cada variante de PD con FcYRIIa tipo R y FcYRIIb se evaluaron exhaustivamente mediante el método del ejemplo 14.
Se produjo una figura que muestra los resultados del análisis de la interacción con los FcYR respectivos según el siguiente método. El valor obtenido al dividir el valor de la cantidad de unión de cada variante de PD a cada FcyR por el valor para la cantidad de unión a FcYR del anticuerpo previamente alterado que se utiliza como control (IL6R-F652/IL6R-L, que tiene una alteración de sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp y después multiplicar el resultado por 100, se mostró como el valor relativo de la actividad de unión de cada variante de PD a cada FcyR. El eje horizontal muestra los valores relativos de la actividad de unión a FcYRIIb de cada variante de PD y el eje vertical muestra los valores relativos de los valores de actividad de unión a FcYRIIa tipo R de cada variante de PD (fig. 55).
Como resultado, se descubrió que la unión a FcYRIIb de once tipos de alteraciones estaba mejorada en comparación con el anticuerpo antes de introducir alteraciones y tienen los efectos de mantener o mejorar la unión a FcYRIIa tipo R. Las actividades de estas once variantes para unirse a FcYRIIb y FcYRIIa R se resumen en la tabla 46. En la tabla, la SEQ ID NO se refiere a la SEQ ID NO de la cadena H de la variante evaluada y la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174).
[Tabla 46]
Figure imgf000175_0001
Figure imgf000176_0001
La fig. 56 muestra los valores relativos para la actividad de unión a FcYRIIb obtenidos al introducir adicionalmente las once alteraciones anteriores en una variante que porta la alteración P238D y los valores relativos para la actividad de unión a FcYRIIb de una variante obtenida al introducir las alteraciones en un Fc que no contiene el P238D. Estas once alteraciones mejoraron la cantidad de unión a FcYRIIb en comparación con antes de la introducción cuando se introdujeron adicionalmente en la variante P238D. Por el contrario, se observó el efecto de reducir la unión a FcYRIIb para ocho de esas alteraciones excepto G237F, G237W y S239D, cuando se introdujeron en la variante que no contiene P238D (GpH7-B3/GpL16-k0) utilizada en el ejemplo 14. El ejemplo de referencia 26 y estos resultados mostraron que, en función de los efectos de la introducción de alteraciones en una IgG1 de origen natural, es difícil predecir los efectos de combinar e introducir las mismas alteraciones en la variante que contiene la alteración P238D. En otras palabras, no habría sido posible descubrir que estas ocho alteraciones identificadas esta vez sin esta investigación que introduce las mismas alteraciones se combinan e introducen en la variante que contiene la alteración P238D.
Los resultados de medir los valores de KD de las variantes indicadas en la tabla 46 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb y FcYRIIIaV por el método del ejemplo 14 se resumen en la tabla 47. En la tabla, la SEQ ID NO se refiere a la SEQ ID NO de la cadena H de la variante evaluada y la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174). El molde utilizado para producir IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*). Asimismo, KD(IIaR)/KD(IIb) y KD(IIaH)/KD(IIb) en la tabla, respectivamente, muestran el valor obtenido al dividir el valor de KD de cada variante para FcYRIIaR por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb y el valor obtenido al dividir el valor de KD de cada variante para FcYRIIaH por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb. KD(IIb) del polipéptido original/KD(IIb) del polipéptido alterado se refiere a un valor obtenido al dividir el valor de Kd del polipéptido original para FcYRIIb por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb. Además, la tabla 47 muestra los valores de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de cada variante/valores de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original. Aquí, el polipéptido original se refiere a una variante que tiene IL6R-F11 (SEq ID NO: 27) como cadena H. Se determinó que, debido a la unión débil de FcyR a IgG, era imposible analizar con precisión mediante análisis cinético y, por tanto, las celdas rellenas de gris en la tabla 47 muestran valores calculados utilizando la ecuación 5 del ejemplo 14.
[Ecuación 5]
KD = C x Rmáx/(Req - RI) - C
La tabla 47 muestra que todas las variantes mejoraron su afinidad por FcYRIIb en comparación con IL6R-F11 y el intervalo de mejora fue de 1,9 a 5,0 veces. La relación del valor de KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de KD de cada variante para FcYRIIb y la relación del valor de KD de cada variante para FcYRIIaH/valor de KD de cada variante para FcYRIIb representan una actividad de unión a FcYRIIb relativa a la actividad de unión a FcYRIIaR y actividad de unión a FcYRIIaH, respectivamente. Es decir, estos valores muestran el grado de selectividad de unión de cada variante para FcYRIIb y un valor mayor indica una mayor selectividad de unión para FcYRIIb. Para el polipéptido original IL6R-F11/IL6R-L, la relación del valor de KD para FcYRIIaR/valor de KD para FcYRIIb y la relación del valor de KD para FcYRIIaH/valor de KD para FcYRIIb son ambas 0,7 y, por consiguiente, todas las variantes de la tabla 47 mostraron mejora de la selectividad de unión para FcYRIIb en comparación con el polipéptido original. Cuando el valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante/valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original es 1 o más, esto significa que la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante tiene unión equivalente o reducida en comparación con la unión por la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original. Ya que este valor fue de 0,7 a 5,0 para las variantes obtenidas esta vez, se puede decir que la unión por la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de las variantes obtenidas esta vez fue casi igual o disminuyó en comparación con el polipéptido original. Estos resultados mostraron que, en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas esta vez han mantenido o disminuido las actividades de unión a FcYRIIa tipo R y tipo H y han mejorado la selectividad para FcYRIIb. Asimismo, en comparación con IL6R-F11, todas las variantes tenían menor afinidad por FcYRIa y FcYRIIIaV.
[Tabla 47]
Figure imgf000177_0001
[Ejemplo de referencia 28] Análisis cristalográfico de rayos X de un complejo formado entre un Fc que contiene P238D y una región extracelular de FcYRIIb
Como se ha indicado antes en el ejemplo de referencia 27, aunque se introduce una alteración que se predice a partir del análisis de anticuerpos IgG1 de origen natural que mejora la actividad de unión a FcYRIIb o la selectividad para FcYRIIb en un Fc que contiene P238D, se descubrió que la actividad de unión a FcYRIIb disminuía, y la razón de esto puede ser que la estructura en la interfaz de interacción entre Fc y FcYRIIb cambia debido a la introducción de P238D. Por lo tanto, para buscar la razón de este fenómeno, se dilucidó la estructura tridimensional del complejo formado entre un Fc IgG1 que contiene la mutación P238D (en lo sucesivo en la presente memoria, Fc (P238D)) y la región extracelular de FcYRIIb mediante análisis cristalográfico de rayos X, y esto se comparó con la estructura tridimensional del complejo formado entre el Fc de una IgG 1 de origen natural (en lo sucesivo en la presente memoria, Fc(TS)) y la región extracelular de FcYRIIb, y se compararon los modos de unión. Se han realizado múltiples informes sobre la estructura tridimensional de un complejo formado entre una región extracelular Fc y una FcyR; y se han analizado las estructuras tridimensionales del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIIb (Nature, 2000, 400: 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276: 16469-16477), el complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcyRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108: 12669-126674) y el complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIa (J. Imunol. 2011, 187: 3208­ 3217). Aunque no se ha analizado la estructura tridimensional del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb, se conoce la estructura tridimensional de un complejo formado con Fc(TS) para FcYRIIa y las regiones extracelulares de FcYRIIa y FcYRIIb coinciden en 93 % en su secuencia de aminoácidos y tienen homología muy alta. Por tanto, la estructura tridimensional del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb se predijo mediante modelado utilizando la estructura cristalina del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIa.
La estructura tridimensional del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb se determinó mediante análisis cristalográfico de rayos X a una resolución de 2,6 Á. La estructura obtenida como resultado de este análisis se muestra en la fig. 57. La región extracelular de FcYRIIb está unida entre dos dominios CH2 de Fc y esto era similar a las estructuras tridimensionales de los complejos formados entre Fc(TS) y la región extracelular respectiva de FcYRIIIa, FcYRIIIb o FcYRIIa analizados hasta ahora.
A continuación, para una comparación detallada, se superpusieron la estructura cristalina del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb y la estructura modelo del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb mediante el ajuste de mínimos cuadrados basado en las distancias de los pares de átomos Ca con respecto a la región extracelular de FcYRIIb y el dominio A de CH2 de Fc (fig. 58). En ese caso, el grado de superposición entre los dominios B de CH2 de Fc no fue satisfactorio y se encontraron diferencias conformacionales en esta parte. Asimismo, utilizando la estructura cristalina del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb y la estructura modelo del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb, se extrajeron pares de átomos que tienen una distancia de 3,7 Á o menos entre la región extracelular de FcYRIIb extraída y el dominio B de CH2 de Fc y se compararon para comparar la interacción interatómica entre FcYRIIb y el dominio B de CH2 de Fc(TS) con la interacción interatómica entre FcYRIIb y Fc(P238D). Como se muestra en la tabla 48, las interacciones interatómicas entre el dominio B de CH2 de Fc y FcYRIIb en Fc(P238D) y Fc(TS) no coincidieron.
[Tabla 48]
Figure imgf000178_0001
Figure imgf000179_0001
Asimismo, las estructuras detalladas alrededor de P238D se compararon superponiendo la estructura cristalina de rayos X del complejo de Fc(P238D)/dominio extracelular de FcYRIIb en la estructura modelo del complejo de Fc(TS)/dominio extracelular de FcYRIIb utilizando el método de mínimos cuadrados basado en la distancia atómica de Ca entre los dominios A y B de CH2 de Fc solo. Como la posición del resto de aminoácido en la posición 238 (numeración EU), es decir, una posición de mutagénesis de Fc (P238D), está alterada con respecto a Fc (TS), se ha descubierto que la estructura en bucle alrededor del resto de aminoácido en la posición 238 a continuación de la región bisagra es diferente entre Fc (P238D) y Fc (TS) (fig. 59). Pro en la posición 238 (numeración EU) se ubica originalmente dentro de Fc (TS), que forma un núcleo hidrófobo con restos alrededor de la posición 238. Sin embargo, si Pro en la posición 238 (numeración EU) se modifica a Asp altamente hidrófilo y con carga, la presencia del resto de Asp alterado en un núcleo hidrófobo es energéticamente desfavorable con respecto a desolvatación. Por lo tanto, en Fc(P238D), para cancelar esta situación energéticamente desfavorable, el resto de aminoácido en la posición 238 (indicada por la numeración EU) cambia su orientación hacia el lado del disolvente y esto puede haber provocado este cambio en la estructura de bucle cerca del resto de aminoácido en la posición 238. Asimismo, ya que este bucle no está lejos de la región bisagra reticulada por un enlace S-S, su cambio estructural no se limitará a un cambio local y afectará al posicionamiento relativo del dominio A y el dominio B de FcCH2. Como resultado, las interacciones interatómicas entre FcYRIIb y el dominio B de CH2 de Fc han cambiado. Por lo tanto, no pudieron observarse efectos predichos cuando se combinaron alteraciones que mejoran la selectividad y la actividad de unión hacia FcYRIIb en una IgG de origen natural con un Fc que contiene la alteración P238D.
Asimismo, como resultado de cambios estructurales debido a la introducción de P238D en el dominio A de CH2 de Fc, se ha encontrado un enlace de hidrógeno entre la cadena principal de Gly en la posición 237 (indicada por la numeración EU), que está adyacente a P238D mutado, y Tyr en la posición 160 en FcYRIIb (fig. 60). El resto en FcYRIIa que corresponde a esta Tyr 160 es Phe; y cuando la unión es a FcYRIIa, no se forma este enlace de hidrógeno. Teniendo en cuenta que el aminoácido en la posición 160 es una de las pocas diferencias entre FcYRIIa y FcYRIIb en la interfaz de interacción con Fc, se supone que la presencia de este enlace de hidrógeno que es específico para FcYRIIb ha conducido a una mejora de la actividad de unión a FcYRIIb y una disminución de la actividad de unión a FcYRIIa en Fc(P238D) y una mejora de su selectividad. Asimismo, en el dominio B de CH2 de Fc, se observa una interacción electrostática entre Asp en la posición 270 (indicada por la numeración EU) y Arg en la posición 131 en FcYRIIb (fig. 61). En FcYRIIa tipo H, que es uno de los alotipos de FcYRIIa, el resto correspondiente a Arg en la posición 131 de FcYRIIb es His y, por lo tanto, no puede formar esta interacción electrostática. Esto puede explicar por qué la actividad de unión a Fc(P238D) se reduce en FcYRIIa tipo H en comparación con FcYRIIa tipo R. Las observaciones basadas en dichos resultados del análisis cristalográfico de rayos X mostraron que el cambio de la estructura de bucle junto a P238D debido a la introducción de P238D y el cambio consiguiente en el posicionamiento relativo del dominio provoca la formación de nuevas interacciones que no se encuentran en la unión de los IgG y FcyR de origen natural y esto podría conducir a un perfil de unión selectiva de variantes P238D para FcYRIIb.
[Expresión y purificación de Fc(P238D)]
Se preparó un Fc que contenía la alteración P238D de la siguiente manera. En primer lugar, la Cys en la posición 220 (indicada por la numeración EU) de hIL6R-IgG1-v1 (SEQ ID NO: 80) se sustituyó por Ser. A continuación, la secuencia genética de Fc(P238D) desde Glu en la posición 236 (indicada por la numeración EU) hasta su extremo C se clonó mediante PCR. Utilizando esta secuencia genética clonada, se llevaron a cabo producción de vectores de expresión y expresión y purificación de Fc(P238D) según el método de los ejemplos de referencia 1 y 2. La Cys en la posición 220 (indicada por la numeración EU) forma un enlace disulfuro con Cys de la cadena L en IgG 1 general. La cadena L no se coexpresa cuando se prepara Fc solo y, por lo tanto, el resto de Cys se sustituyó por Ser para evitar la formación de enlaces disulfuro innecesarios.
[Expresión y purificación de la región extracelular de FcYRIIb]
La región extracelular de FcYRIIb se preparó según el método del ejemplo 14.
[Purificación del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb]
A 2 mg de la muestra de la región extracelular de FcYRIIb obtenida para su uso en cristalización, se añadieron 0,29 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-2622) expresado y purificado de Escherichia co licomo proteína de fusión de glutatión S-transferasa. Se dejó que esta permaneciera a temperatura ambiente durante tres días en tampón de Bis-Tris 0,1 M a pH 6,5 y se escindió el oligosacárido ligado a N, excepto para W-acetilglucosamina unida directamente a Asn de la región extracelular de FcYRIIb. A continuación, la muestra del dominio extracelular de FcYRIIb sometida a tratamiento de escisión de carbohidratos, que se concentró mediante ultrafiltración con 5000 PCPM, se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300) utilizando una columna equilibrada en HEPS 20 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,05 M. Asimismo, a la fracción de la región extracelular de FcYRIIb escindida en carbohidratos obtenida, se añadió Fc(P238D) de modo que la relación molar de la región extracelular de FcYRIIb estuviera presente en un ligero exceso. La mezcla concentrada por ultrafiltración con 10.000 PCPM se sometió a purificación mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300) utilizando una columna equilibrada en HEPS 20 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,05 M. Por tanto, se obtuvo una muestra del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb.
[Cristalización del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb]
Utilizando la muestra del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb que se concentró a aproximadamente 10 mg/ml por ultrafiltración con 10.000 PCPM, se llevó a cabo cristalización del complejo mediante el método de difusión de vapor de gota en reposo. Se utilizó Hydra II Plus One (MATRIX) para cristalización; y para una solución de depósito que contenía Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 al 17 %, acetato de amonio 0,2 M y D-Galactosa al 2,7 % (p/v), se produjo una gota de cristalización mezclando en una relación de solución de depósito: muestra de cristalización = 0,2 pl: 0,2 pl. Se dejó que la gota de cristalización después del sellado permaneciera a 20 °C y se obtuvieron de este modo cristales delgados en forma de placa.
[Medición de datos de difracción de rayos X de un cristal de complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb]
Uno de los cristales individuales obtenidos del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb se sumergió en una solución de Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 al 20 %, acetato de amonio, D-galactosa al 2,7 % (p/v), etilenglicol al 22,5 % (v/v). El cristal individual se extrajo de la solución utilizando un alfiler con un pequeño bucle de nailon unido y se congeló en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X del cristal se midieron en la instalación de radiación de sincrotrón Photon Factory BL-1A en la Organización de investigación de aceleradores de alta energía. Durante la medición, el cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178 °C para mantenerlo en un estado congelado y se recogieron un total de 225 imágenes de difracción de rayos X utilizando el detector Quantum 270 CCD (ADSC) unido a una línea de haz con rotación del cristal 0,8° cada vez. Se realizaron determinación de parámetros celulares, indexación de puntos de difracción y procesamiento de datos de difracción de las imágenes de difracción obtenidas utilizando el programa Xia2 (paquete de programas informáticos CCP4), paquete XDS (Walfgang Kabsch) y Scala (paquete de programas informáticos CCP4); y, finalmente, se obtuvieron datos de intensidad de difracción del cristal hasta una resolución de 2,46 Á. El cristal pertenece al grupo espacial P21 y tiene los siguientes parámetros de celda; a = 48,85 Á, b = 76,01 Á, c = 115,09 Á, a = 90°, p = 100,70 °, y = 90°.
[Análisis cristalográfico de rayos X del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb]
La estructura cristalina del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb se determinó mediante el método de sustitución molecular utilizando el programa Phaser (paquete de programas informáticos CCP4). A partir del tamaño de la red cristalina obtenida y el peso molecular del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb, se predijo que el número de complejos en la unidad asimétrica sería uno. De las coordenadas estructurales del código de PDB: 3SGJ que es la estructura cristalina del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIIa, las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 239-340 de la cadena A y las posiciones 239-340 de la cadena B se tomaron como coordenadas separadas y se establecieron respectivamente como modelos para buscar los dominios CH2 de Fc. Las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 341-444 de la cadena A y las posiciones 341-443 de la cadena B se tomaron como un solo conjunto de coordenadas de las mismas coordenadas estructurales del código de PDB: 3SGJ; y esto se estableció como un modelo de búsqueda de los dominios CH3 de Fc. Por último, a partir de las coordenadas estructurales del código de PDB: 2FCB que es una estructura cristalina de la región extracelular de FcYRIIb, las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 6-178 de la cadena A se tomaron y se establecieron como modelo para buscar la región extracelular de FcYRIIb. La orientación y posición de cada modelo de búsqueda en la red cristalina se determinaron en el orden del dominio CH3 de Fc, región extracelular de FcYRIIb y dominio CH2 de Fc, basado en la función de rotación y la función de traducción para obtener el modelo inicial de la estructura cristalina del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb. Cuando se realizó refinamiento de cuerpo rígido que mueve los dos dominios CH2 de Fc, los dos dominios CH3 de Fc y la región extracelular de FcYRIIb en el modelo inicial obtenido, el factor de fiabilidad cristalográfica, el valor de R se convirtió en 40,4 % y el valor de R libre se convirtió en 41,9 % para datos de intensidad de difracción de 25 Á a 3,0 Á en este punto. Asimismo, se llevó a cabo refinamiento estructural utilizando el programa Refmac5 (paquete de programas informáticos CCP4) y revisión del modelo para observar los mapas de densidad electrónica cuyo coeficiente tiene 2Fo-Fc o Fo-Fc, que se calculan en función del factor estructural Fo determinado experimentalmente, el factor estructural Fc calculado y la fase calculada utilizando el modelo, mediante el programa Coot (Paul Emsley). Se llevó a cabo refinamiento del modelo repitiendo estas etapas. Por último, como resultado de la incorporación de moléculas de agua en el modelo basado en los mapas de densidad electrónica que utilizan 2Fo-Fc o Fo-Fc como coeficiente, y el siguiente refinamiento, el factor de fiabilidad cristalográfica, los valores de R y el valor de R libre del modelo que contiene 4846 átomos distintos de hidrógeno se convirtieron en 23,7 % y 27,6 % para 24291 datos de intensidad de difracción de resolución de 25 Á a 2,6 Á, respectivamente.
[Producción de una estructura modelo del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb]
Según las coordenadas estructurales del código de PDB: 3RY6 que es una estructura cristalina del complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIa, se utilizó la función Build Mutants del programa Discovery Studio 3.1 (Accelrys) para introducir mutaciones para hacer coincidir la secuencia de aminoácidos de FcYRIIb en FcYRIIa en estas coordenadas estructurales. En ese caso, el nivel de optimización se estableció en alto, el radio de corte se estableció en 4,5, se generaron cinco modelos y el que tenía la mejor puntuación de energía de entre ellos se estableció como la estructura modelo para el complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIb.
[Ejemplo de referencia 29] Análisis de unión a FcyR de variantes de Fc cuyos sitios de alteración se determinaron en función de las estructuras cristalinas.
Según los resultados del análisis cristalográfico de rayos X en el complejo formado entre Fc(P238D) y la región extracelular de FcYRIIb obtenido en el ejemplo de referencia 28, se construyeron variantes mediante la introducción exhaustiva de alteraciones en sitios del Fc alterado que tienen sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp que se predijo que afectarían a la interacción con FcYRIIb (restos de las posiciones 233, 240, 241,263, 265, 266, 267, 268, 271,273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 y 334 (indicadas por la numeración EU)), y se examinó si pueden obtenerse combinaciones de alteraciones que mejoran adicionalmente la unión a FcYRIIb además de la alteración P238D.
Se produjo IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) introduciendo en IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79) producido en el ejemplo 14, la alteración producida al sustituir Lys en la posición 439 (indicada por la numeración EU) por Glu. A continuación, se produjo IL6R-BF648 introduciendo en IL6R-B3, la alteración producida al sustituir Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp. Se utilizó IL6R-L (SEQ ID NO: 83) como cadena L de anticuerpo común. Estas variantes de anticuerpos expresadas se purificaron según el método del ejemplo de referencia 2. La unión de estas variantes de anticuerpos a cada uno de los FcyR (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcYRIIb y FcYRIIIa tipo V) se evaluó exhaustivamente mediante el método del ejemplo 14.
Se produjo una figura según el siguiente método para mostrar los resultados del análisis de las interacciones con los FcyR respectivos. El valor de la cantidad de unión de cada variante a cada FcyR se dividió por el valor de la cantidad de unión del anticuerpo de control previamente alterado (IL6R-BF648/IL6R-L, alteración mediante la sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp) a cada FcyR y el valor obtenido se multiplicó después por 100 y se mostró como el valor de la actividad de unión relativa de cada variante a cada FcyR. El eje horizontal muestra el valor de la actividad de unión relativa de cada variante a FcYRIIb y el eje vertical muestra el valor de la actividad de unión relativa de cada variante a FcYRIIa tipo R (fig. 62).
Como se muestra en la fig. 62, los resultados muestran que, de todas las alteraciones, se descubrió que 24 tipos de alteraciones mantienen o potencian la unión a FcYRIIb en comparación con el anticuerpo previamente alterado. La unión de estas variantes a cada uno de los FcYR se muestra en la tabla 49. En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). El molde utilizado para producir IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*).
[Tabla 49]
Figure imgf000182_0001
Los resultados de medir los valores de KD de las variantes mostradas en la tabla 49 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb y FcYRIIIa tipo V por el método del ejemplo 14 se resumen en la tabla 50. En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). El molde utilizado para producir IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*). Asimismo, KD(IIaR)/KD(IIb) y KD(IIaH)/KD(IIb) en la tabla, respectivamente, representan el valor obtenido al dividir el valor de KD de cada variante para FcYRIIaR por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb y el valor obtenido al dividir el valor de KD de cada variante para FcYRIIaH por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb. KD(IIb) del polipéptido original/KD(IIb) del polipéptido alterado se refiere al valor obtenido al dividir el valor de KD del polipéptido original para FcYRIIb por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb. Además, el valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de cada variante/valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original se muestran en la tabla 50. Aquí, el polipéptido original se refiere a la variante que tiene IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) como cadena H. Se determinó que, debido a la unión débil de FcyR a IgG, era imposible analizar con precisión mediante análisis cinético y, por tanto, las celdas rellenas de gris en la tabla 50 muestran valores calculados utilizando la ecuación 5 del ejemplo 14.
[Ecuación 5]
KD = C x Rmáx/(Req - RI) - C
La tabla 50 muestra que, en comparación con IL6R-B3, todas las variantes mostraron mejora de la afinidad por FcYRIIb y el intervalo de mejora fue de 2,1 a 9,7 veces. La relación del valor de KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de KD de cada variante para FcYRIIb y la relación del valor de KD de cada variante para FcYRIIaH/valor de KD de cada variante para FcYRIIb representan una actividad de unión a FcYRIIb relativa a la actividad de unión a FcYRIIaR y actividad de unión a FcYRIIaH, respectivamente. Es decir, estos valores muestran el grado de selectividad de unión de cada variante para FcYRIIb y un valor mayor indica una mayor selectividad de unión para FcYRIIb. Ya que la relación del valor de KD para FcYRIIaR/valor de KD para FcYRIIb y la relación del valor de KD para FcYRIIaH/valor de KD para FcYRIIb en el polipéptido original IL6R-B3/IL6R-L fueron 0,3 y 0,2, respectivamente, todas las variantes de la tabla 50 mostraron mejora de la selectividad de unión para FcYRIIb en comparación con el polipéptido original. Cuando el valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante/valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original es 1 o más, esto significa que la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante tiene unión equivalente o disminuida en comparación con la unión por la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original. Ya que este valor fue de 4,6 a 34,0 para las variantes obtenidas esta vez, se puede decir que, en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas esta vez habían reducido la unión por la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH. Estos resultados mostraron que, en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas esta vez han mantenido o disminuido las actividades de unión a FcYRIIa tipo R y tipo H, han potenciado la actividad de unión a FcYRIIb mejorada y han mejorado la selectividad para FcYRIIb. Asimismo, en comparación con IL6R-B3, todas las variantes tenían menor afinidad por FcYRIa y FcYRIIIaV.
[Tabla 50]
Figure imgf000184_0001
Con respecto a las variantes prometedoras entre las variantes de combinación obtenidas, los factores que conducen a sus efectos se estudiaron utilizando la estructura cristalina. La fig. 63 muestra la estructura cristalina del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb. En esta figura, la cadena H situada en el lado izquierdo es la cadena A de Fc y la cadena H situada en el lado derecho es la cadena B de Fc. Aquí, se puede ver que el sitio en la posición 233 (indicada por la numeración EU) en la cadena A de Fc está ubicado cerca de Lys en la posición 113 de FcYRIIb. Sin embargo, en esta estructura cristalina, la cadena lateral E233 está en una condición de movilidad considerablemente alta y su densidad electrónica no se observa bien. Por lo tanto, la alteración producida al sustituir Glu en la posición 233 (indicada por la numeración EU) por Asp conduce a disminución del grado de libertad de la cadena lateral ya que la cadena lateral se acorta en un carbono. Como resultado, la pérdida de entropía cuando se forma una interacción con Lys en la posición 113 de FcYRIIb puede disminuir y, en consecuencia, se especula que esto contribuye a mejorar la energía libre de unión.
De manera análoga, la fig. 64 muestra el entorno cerca del sitio en la posición 330 (indicado por la numeración EU) en la estructura del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb. Esta figura muestra que el entorno alrededor del sitio en la posición 330 (indicada por la numeración EU) de la cadena A de Fc de Fc (P238D) es un entorno hidrofílico compuesto por Ser en la posición 85, Glu en la posición 86, Lys en la posición 163 y similares de FcYRIIb. Por lo tanto, se especula que la alteración producida al sustituir Ala en la posición 330 (indicada por la numeración EU) por Lys o Arg contribuye a fortalecer la interacción con Ser en la posición 85 o Glu en la posición 86 en FcYRIIb.
La fig. 65 representa las estructuras de Pro en la posición 271 (indicada por la numeración EU) de la cadena B de Fc después de superponer las estructuras cristalinas del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb y el complejo de Fc(TS)/región extracelular de FcYRIIIa mediante el ajuste de mínimos cuadrados basado en las distancias de pares de átomos Ca con respecto a la cadena B de Fc. Estas dos estructuras encajan bien, pero tienen diferentes estructuras tridimensionales de Pro en la posición 271 (indicada por la numeración EU). Cuando también se tiene en cuenta la densidad electrónica débil alrededor de esta área en la estructura cristalina del complejo de Fc(P238D)/región extracelular de FcYRIIb, se sugiere que existe la posibilidad de que Pro en la posición 271 (indicada por la numeración EU) en Fc(P238D)/FcYRIIb provoque una gran tensión en la estructura, alterando de este modo la estructura de bucle para lograr una estructura óptima. Por lo tanto, la alteración producida al sustituir Pro en la posición 271 (indicada por la numeración EU) por Gly da flexibilidad a esta estructura de bucle y se especula que contribuye a mejorar la unión al reducir la barrera energética cuando se permite que se forme una estructura óptima durante la interacción con FcYRIIb.
[Ejemplo 30] Examen del efecto combinatorio de alteraciones que potencian la unión a FcYRIIb cuando se combinan con P238D.
De las alteraciones obtenidas en los ejemplos de referencia 27 y 29, las que potenciaron la unión a FcYRIIb o mantuvieron la unión a FcYRIIb y mostraron efectos de supresión de la unión a otros FcyR se combinaron entre sí y se examinó su efecto.
Se introdujeron alteraciones particularmente buenas seleccionadas de las tablas 46 y 49 en la cadena H del anticuerpo IL6R-BF648 de una manera similar al método del ejemplo de referencia 29. Se utilizó IL6R-L como cadena L de anticuerpo común, los anticuerpos expresados se purificaron según el método del ejemplo 12. La unión a cada uno de los FcyR (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcYRIIb y FcYRIIIa tipo V) se evaluó exhaustivamente mediante el método del ejemplo 14.
Según el siguiente método, se calcularon las actividades de unión relativas para los resultados del análisis de interacciones con los FcyR respectivos. El valor de la cantidad de unión de cada variante a cada FcyR se dividió por el valor de la cantidad de unión del anticuerpo de control previamente alterado (IL6R-BF648/IL6R-L con sustitución de Pro en la posición 238 (indicada por la numeración EU) por Asp a cada FcyR y se multiplicó por 100; y después se mostró el valor como el valor de la actividad de unión relativa de cada variante a cada FcyR (tabla 51).
En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). El molde utilizado para producir IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*).
[Tabla 51]
Figure imgf000186_0001
Figure imgf000187_0001
Los resultados de medir los valores de KD de las variantes mostradas en la tabla 51 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb y FcYRIIIa tipo V por el método del ejemplo 14 se resumen en las tablas 51-2 y 52-2. En la tabla, la alteración se refiere a la alteración introducida en IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). El molde utilizado para producir IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, se indica con un asterisco (*). Asimismo, KD(IIaR)/KD(IIb) y KD(IIaH)/KD(IIb) en la tabla, respectivamente, representan el valor obtenido al dividir el valor de KD de cada variante para FcYRIIaR por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb y el valor obtenido al dividir el valor de KD de cada variante para FcYRIIaH por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb. KD(IIb) del polipéptido original/KD(IIb) del polipéptido alterado se refiere al valor obtenido al dividir el valor de KD del polipéptido original para FcYRIIb por el valor de KD de cada variante para FcYRIIb. Además, el valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de cada variante/valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original se muestran en las tablas 51 -2 y 52-2. Aquí, el polipéptido original se refiere a la variante que tiene IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) como cadena H. Se determinó que, debido a la unión débil de FcyR a IgG, era imposible analizar con precisión mediante análisis cinético y, por tanto, las celdas rellenas de gris en las tablas 51 -2 y 52-2 muestran valores calculados utilizando la ecuación 5 del ejemplo 14.
[Ecuación 5]
KD = C x Rmáx/(Req - RI) - C
Las tablas 51 -2 y 52-2 muestran que, en comparación con IL6R-B3, todas las variantes mostraron mejora de la afinidad por FcYRIIb y el intervalo de mejora fue de 3,0 a 99,0 veces. La relación del valor de KD de cada variante para FcYRIIaR/valor de KD de cada variante para FcYRIIb y la relación del valor de KD de cada variante para FcYRIIaH/valor de KD de cada variante para FcYRIIb representan una actividad de unión a FcYRIIb relativa a la actividad de unión a FcYRIIaR y actividad de unión a FcYRIIaH, respectivamente. Es decir, esos valores muestran el grado de selectividad de unión de cada variante para FcYRIIb y un valor mayor indica una mayor selectividad de unión para FcYRIIb. Ya que la relación del valor de KD para FcYRIIaR/valor de KD para FcYRIIb y la relación del valor de KD para FcYRIIaH/valor de KD para FcYRIIb del polipéptido original IL6R-B3/IL6R-L fueron 0,3 y 0,2, respectivamente, todas las variantes de las tablas 51-2 y 52-2 mostraron mejora de la selectividad de unión para FcYRIIb en comparación con el polipéptido original. Cuando el valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante/valor de KD para la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original es 1 o más, esto significa que la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de una variante tiene unión equivalente o disminuida en comparación con la unión por la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH del polipéptido original. Ya que este valor fue de 0,7 a 29,9 para las variantes obtenidas esta vez, se puede decir que la unión por la más fuerte de las actividades de unión a FcYRIIaR y FcYRIIaH de las variantes obtenidas esta vez fue casi equivalente o disminuyó en comparación con la del polipéptido original. Estos resultados mostraron que, en comparación con el polipéptido original, las variantes obtenidas esta vez han mantenido o disminuido las actividades de unión a FcYRIIa tipo R y tipo H, han potenciado la actividad de unión a FcYRIIb mejorada y han mejorado la selectividad para FcYRIIb. Asimismo, en comparación con IL6R-B3, todas las variantes tenían menor afinidad por FcYRIa y FcyRII IaV.
[Tabla 52-1]
Figure imgf000189_0001
La tabla 52-2 es una tabla de continuación de la tabla 52-1.
[Tabla 52-2]
Figure imgf000190_0001

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG humano de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es
(i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) es 2 o más; o
(ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una cuya actividad de unión a un receptor Fcy activador es menor que la actividad de unión de una región Fc de la IgG humana de tipo silvestre al receptor Fcy activador, en donde la actividad de unión se refiere a la KD.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc en uno cualquiera o más aminoácidos de las posiciones 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 y 329 como se indica mediante la numeración EU.
3. El método de la reivindicación 2, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc como se indica mediante la numeración EU en uno cualquiera o más de:
el aminoácido de la posición 234 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr y Trp;
el aminoácido de la posición 235 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val y Arg;
el aminoácido de la posición 236 por uno cualquiera de Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro y Tyr;
el aminoácido de la posición 237 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr y Arg;
el aminoácido de la posición 238 por uno cualquiera de Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp y Arg;
el aminoácido de la posición 239 por uno cualquiera de Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr y Arg;
el aminoácido de la posición 265 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 266 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 267 por uno cualquiera de Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 269 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 270 por uno cualquiera de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 271 por uno cualquiera de Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 295 por uno cualquiera de Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 296 por uno cualquiera de Arg, Gly, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 297 por Ala;
el aminoácido de la posición 298 por uno cualquiera de Arg, Gly, Lys, Pro, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 300 por uno cualquiera de Arg, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 324 por Lys o Pro;
el aminoácido de la posición 325 por uno cualquiera de Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr y Val; el aminoácido de la posición 327 por uno cualquiera de Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
el aminoácido de la posición 328 por uno cualquiera de Arg, Asn, Gly, His, Lys y Pro;
el aminoácido de la posición 329 por uno cualquiera de Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y Arg;
el aminoácido de la posición 330 por Pro o Ser;
el aminoácido de la posición 331 por uno cualquiera de Arg, Gly y Lys; o
el aminoácido de la posición 332 por uno cualquiera de Arg, Lys y Pro.
4. Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es
(i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) es 2 o más; o
(ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 gM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una que tiene una mayor actividad de unión a un receptor Fcy inhibidor que a un receptor Fcy activador, en donde la actividad de unión se refiere a KD, en donde el receptor Fcy inhibidor es FcYRIIb humano y en donde el receptor Fcy activador es FcYRIa humano, FcYRIIa(R) humano, FcYRIIa(H) humano, FcYRIIIa(V) humano o FcYRIIIa(F) humano.
5. El método de la reivindicación 4, en donde dicha modificación comprende sustituir el aminoácido de la posición 238 o 328 indicado por la numeración EU.
6. El método de la reivindicación 5, en donde dicha modificación comprende sustituir el aminoácido de la posición 238 por Asp o el aminoácido de la posición 328 por Glu indicado por la numeración EU.
7. El método de la reivindicación 5 o 6, en donde dicha modificación comprende sustituir uno o más aminoácidos cualesquiera de:
el aminoácido de la posición 233 por Asp;
el aminoácido de la posición 234 por Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 237 por uno cualquiera de Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp y Tyr;
el aminoácido de la posición 239 por Asp;
el aminoácido de la posición 267 por uno cualquiera de Ala, Gln y Val;
el aminoácido de la posición 268 por uno cualquiera de Asn, Asp y Glu;
el aminoácido de la posición 271 por Gly;
el aminoácido de la posición 326 por uno cualquiera de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser y Thr;
el aminoácido de la posición 330 por uno cualquiera de Arg, Lys y Met;
el aminoácido de la posición 323 por uno cualquiera de Ile, Leu y Met; y
el aminoácido de la posición 296 por Asp; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la región Fc comprende uno o más aminoácidos que son diferentes de los aminoácidos de la región Fc nativa en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 de dicha región Fc como se indica por la numeración EU.
9. El método de la reivindicación 8, en donde los aminoácidos de dicha región Fc indicados por la numeración EU son una combinación de uno o más de:
Met en la posición de aminoácido 237;
Ile en la posición de aminoácido 248;
uno cualquiera de Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 250;
uno cualquiera de Phe, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 252;
Thr en la posición de aminoácido 254;
Glu en la posición de aminoácido 255;
uno cualquiera de Asn, Asp, Glu y Gln en la posición de aminoácido 256;
uno cualquiera de Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr y Val en la posición de aminoácido 257;
His en la posición de aminoácido 258;
Ala en la posición de aminoácido 265;
Ala o Glu en la posición de aminoácido 286;
His en la posición de aminoácido 289;
Ala en la posición de aminoácido 297;
Gly en la posición de aminoácido 298;
Ala en la posición de aminoácido 303;
Ala en la posición de aminoácido 305;
uno cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 307;
uno cualquiera de Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln y Thr en la posición de aminoácido 308;
uno cualquiera de Ala, Asp, Glu, Pro y Arg en la posición de aminoácido 309;
uno cualquiera de Ala, His e Ile en la posición de aminoácido 311;
Ala o His en la posición de aminoácido 312;
Lys o Arg en la posición de aminoácido 314;
uno cualquiera de Ala, Asp e His en la posición de aminoácido 315;
Ala en la posición de aminoácido 317;
Val en la posición de aminoácido 332;
Leu en la posición de aminoácido 334;
His en la posición de aminoácido 360;
Ala en la posición de aminoácido 376;
Ala en la posición de aminoácido 380;
Ala en la posición de aminoácido 382;
Ala en la posición de aminoácido 384;
Asp o His en la posición de aminoácido 385;
Pro en la posición de aminoácido 386;
Glu en la posición de aminoácido 387;
Ala o Ser en la posición de aminoácido 389;
Ala en la posición de aminoácido 424;
uno cualquiera de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp y
Tyr en la posición de aminoácido 428;
Lys en la posición de aminoácido 433;
uno cualquiera de Ala, Phe, His, Ser, Trp y Tyr en la posición de aminoácido 434; y
uno cualquiera de His, Ile, Leu, Phe, Thr y Val en la posición de aminoácido 436.
10. Un método para prolongar la permanencia en plasma de un anticuerpo o para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG humano que comprende un dominio de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno varía dependiendo de la concentración de iones y una región Fc que tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en comparación con el anticuerpo IgG humano de tipo silvestre, en donde la concentración de iones es
(i) concentración de iones de hidrógeno (pH), en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a un pH ácido y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a un pH neutro determinado como KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) es 2 o más; o
(ii) concentración de iones de calcio, en donde la proporción entre el valor de KD para la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración baja de iones de calcio y el valor de KD de la unión a antígeno del anticuerpo a una concentración alta de iones de calcio determinada como KD (Ca 3 pM)/KD (Ca 2 mM) es 2 o más, comprendiendo dicho método la modificación de dicha región Fc en una que no forma un heterocomplejo que comprende dos moléculas de FcRn y una molécula de receptor Fcy activador a pH 7,4 modificando dicha región Fc en una en la que uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc tiene mayor actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 en relación con un polipéptido que constituye la región Fc de la IgG humana de tipo silvestre y el otro tiene la actividad de unión a FcRn humano a pH 7,4 de la IgG humana de tipo silvestre en donde la actividad de unión es KD.
11. El método de la reivindicación 10, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido en una o más cualesquiera de las posiciones 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 y 436 como se indica por la numeración EU en la secuencia de aminoácidos de uno de los dos polipéptidos que constituyen dicha región Fc.
12. El método de la reivindicación 11, en donde dicha modificación comprende sustituir un aminoácido de dicha región Fc en uno cualquiera o más de:
el aminoácido de la posición 237 por Met;
el aminoácido de la posición 248 por Ile;
el aminoácido de la posición 250 por Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 252 por Phe, Trp o Tyr;
el aminoácido de la posición 254 por Thr;
el aminoácido de la posición 255 por Glu;
el aminoácido de la posición 256 por Asn, Asp, Glu o Gln;
el aminoácido de la posición 257 por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr o Val;
el aminoácido de la posición 258 por His;
el aminoácido de la posición 265 por Ala;
el aminoácido de la posición 286 por Ala o Glu;
el aminoácido de la posición 289 por His;
aminoácido de a posición 297 por Ala;
aminoácido de a posición 298 por Gly;
aminoácido de a posición 303 por Ala;
aminoácido de a posición 305 por Ala;
aminoácido de la posición 307 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp o Tyr; aminoácido de a posición 308 por Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln o Thr;
aminoácido de a posición 309 por Ala, Asp, Glu, Pro o Arg;
aminoácido de a posición 311 por Ala, His o Ile;
aminoácido de a posición 312 por Ala o His;
aminoácido de a posición 314 por Lys o Arg;
aminoácido de a posición 315 por Ala, Asp o His;
aminoácido de a posición 317 por Ala;
aminoácido de a posición 332 por Val;
aminoácido de a posición 334 por Leu;
aminoácido de a posición 360 por His;
aminoácido de a posición 376 por Ala;
aminoácido de a posición 380 por Ala;
aminoácido de a posición 382 por Ala;
aminoácido de a posición 384 por Ala;
aminoácido de a posición 385 por Asp o His;
aminoácido de a posición 386 por Pro;
aminoácido de a posición 387 por Glu;
aminoácido de a posición 389 por Ala o Ser;
aminoácido de a posición 424 por Ala;
aminoácido de a posición 428 por Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr; aminoácido de a posición 433 por Lys;
aminoácido de a posición 434 por Ala, Phe, His, Ser, Trp o Tyr; y
aminoácido de la posición 436 por His, Ile, Leu, Phe, Thr o Val; en donde los aminoácidos se indican por la numeración EU.
ES12764620T 2011-03-30 2012-03-30 Permanencia de moléculas de unión a antígeno en plasma sanguíneo y método para modificar la inmunogenicidad Active ES2831048T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2011/001888 WO2011122011A2 (en) 2010-03-30 2011-03-30 Antibodies with modified affinity to fcrn that promote antigen clearance
PCT/JP2011/072550 WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2011-09-30 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
PCT/JP2012/054624 WO2012115241A1 (ja) 2011-02-25 2012-02-24 FcγRIIb特異的Fc抗体
PCT/JP2012/058603 WO2012133782A1 (ja) 2011-03-30 2012-03-30 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2831048T3 true ES2831048T3 (es) 2021-06-07

Family

ID=46932459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12764620T Active ES2831048T3 (es) 2011-03-30 2012-03-30 Permanencia de moléculas de unión a antígeno en plasma sanguíneo y método para modificar la inmunogenicidad

Country Status (9)

Country Link
JP (2) JP6496702B2 (es)
KR (1) KR102168731B1 (es)
CN (1) CN103703129A (es)
CA (1) CA2831770C (es)
ES (1) ES2831048T3 (es)
MX (1) MX2013011366A (es)
RU (1) RU2013148116A (es)
SG (1) SG194076A1 (es)
WO (1) WO2012132067A1 (es)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
ES2566957T3 (es) 2007-09-26 2016-04-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
TWI564021B (zh) 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
MX365235B (es) 2010-11-30 2019-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno.
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
DK2728002T3 (da) 2011-06-30 2022-04-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Heterodimeriseret polypeptid
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
US20150056182A1 (en) 2011-11-30 2015-02-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
TW202015731A (zh) * 2012-02-24 2020-05-01 日商中外製藥股份有限公司 經FcγRIIB促進抗原消失之抗原結合分子
MX371442B (es) 2012-08-24 2020-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANTE DE LA REGION FC ESPECIFICA PARA FCyRIIB.
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
EP3783017A1 (en) * 2013-04-02 2021-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CA2963760A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Yoshinao Ruike Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
EA201791754A1 (ru) 2015-02-05 2019-01-31 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ ЗАВИСЯЩИЙ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН, ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ, IL-8-СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
AU2017325654A1 (en) 2016-08-02 2019-02-14 Visterra, Inc. Engineered polypeptides and uses thereof
CA3026050A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
KR20200006526A (ko) * 2017-03-28 2020-01-20 리브젠 바이오파마 홀딩스 리미티드 종양 미세 환경에서 면역 반응을 향상시키기 위한 치료제 및 방법
CN106831995A (zh) * 2017-03-31 2017-06-13 北京百特美博生物科技有限公司 新型双特异性抗体及其用途
CN116333129A (zh) * 2017-05-25 2023-06-27 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
US10391156B2 (en) * 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
US20210190764A1 (en) 2017-10-20 2021-06-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring cellular uptake of molecules
EP3765494A4 (en) 2018-03-15 2022-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-DENGUE VIRUS ANTIBODIES WITH CROSS-REACTIVITY AGAINST ZIKA VIRUS AND METHODS OF USE
SG11202003531WA (en) 2018-08-10 2020-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-cd137 antigen-binding molecule and utilization thereof
US20220054583A1 (en) * 2018-09-11 2022-02-24 Anbition S.R.L. Peptides and medical uses thereof
CN113906042A (zh) 2019-04-10 2022-01-07 中外制药株式会社 用于纯化fc区修饰抗体的方法
MX2021015763A (es) * 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptidos.
CN110412289B (zh) * 2019-07-25 2022-08-02 北京美迪阿姆科技发展有限公司 抑制性t细胞及筛选方法和抑制自身免疫反应中的应用
PE20221661A1 (es) 2019-12-18 2022-10-26 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-ccl2 biespecificos
JP7373588B2 (ja) 2019-12-27 2023-11-02 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
JPWO2022044248A1 (es) 2020-08-28 2022-03-03
WO2022166720A1 (zh) * 2021-02-05 2022-08-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用
CN117500829A (zh) 2021-06-18 2024-02-02 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ccl2抗体
CA3220353A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of anti-ctla-4 antibody
CN117616123A (zh) 2021-06-25 2024-02-27 中外制药株式会社 抗ctla-4抗体
CN113967489B (zh) * 2021-10-21 2023-04-28 中国热带农业科学院分析测试中心 甲基对硫磷微流控纸基检测芯片、制备及检测方法、应用
CN115873126A (zh) * 2021-11-26 2023-03-31 深圳科兴药业有限公司 人生长激素融合蛋白及其制备和用途
CN114898802B (zh) * 2022-07-14 2022-09-30 臻和(北京)生物科技有限公司 基于血浆游离dna甲基化测序数据的末端序列频率分布特征确定方法、评价方法及装置

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
CN101987870B (zh) 2004-07-15 2013-07-03 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
RU2445366C2 (ru) 2007-09-28 2012-03-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против глипикана-3 с улучшенными кинетическими показателями в плазме
EP3575317A1 (en) * 2007-12-26 2019-12-04 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
TWI564021B (zh) * 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
WO2010058860A1 (ja) * 2008-11-18 2010-05-27 株式会社シノテスト 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬
JP4885308B2 (ja) * 2009-03-19 2012-02-29 中外製薬株式会社 改良された抗体分子を含有する製剤
EP2233500A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
EP2445936A1 (en) * 2009-06-26 2012-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format

Also Published As

Publication number Publication date
CA2831770C (en) 2024-06-04
CA2831770A1 (en) 2012-10-04
JP2021074002A (ja) 2021-05-20
MX2013011366A (es) 2014-05-12
JP7288466B2 (ja) 2023-06-07
RU2013148116A (ru) 2015-05-10
WO2012132067A1 (ja) 2012-10-04
SG194076A1 (en) 2013-11-29
KR20140015501A (ko) 2014-02-06
JP6496702B2 (ja) 2019-04-03
KR102168731B1 (ko) 2020-10-23
JP2017079740A (ja) 2017-05-18
CN103703129A (zh) 2014-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7288466B2 (ja) 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
JP6826620B2 (ja) 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
US20230140797A1 (en) ANTIGEN-BINDING MOLECULE FOR PROMOTING DISAPPEARANCE OF ANTIGEN VIA Fc GAMMA RIIB
AU2012233313B2 (en) Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
AU2012317418B2 (en) Antigen-binding molecule for promoting elimination of antigens
RU2799423C1 (ru) Способ изменения удержания в плазме и иммуногенности антигенсвязывающей молекулы
JP2023106564A (ja) 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
RU2772771C1 (ru) Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов