ES2821771T3 - Tratamiento de la intolerancia al gluten y afecciones relacionadas - Google Patents

Tratamiento de la intolerancia al gluten y afecciones relacionadas Download PDF

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Abstract

Una composición para el uso en el tratamiento o inhibición de la intolerancia al gluten en donde dicha composición comprende la nepentesina recombinante seleccionada de nepentesina I recombinante, nepentesina II recombinante, una sal de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento de la intolerancia al gluten y afecciones relacionadas
Campo de la invención
En la presente descripción se proporcionan composiciones para usar en el tratamiento o inhibición de la intolerancia al gluten y afecciones relacionadas, tal como la enfermedad celíaca.
Antecedentes de la invención
La ingestión de trigo, cebada, centeno y posiblemente avena, que contienen gluten, puede causar respuestas autoinmunes anormales, tales como enfermedad celíaca, alergia al trigo y dermatitis herpetiforme, en individuos intolerantes al gluten. El gluten es una mezcla de moléculas de proteína de prolamina y glutenina ricas en glutamina y prolina. La mayoría de los individuos que tienen respuestas autoinmunes anormales expresan las moléculas DQ2 o DQ8 del antígeno leucocitario humano (HLA). Las reacciones autoinmunes resultan en el desarrollo de atrofia de las vellosidades de la mucosa del intestino delgado con hiperplasia de la cripta e inflamación de la mucosa. Los síntomas de la enfermedad celíaca pueden variar de un individuo a otro, y pueden incluir uno o más de fatiga, diarrea crónica, estreñimiento, mala absorción de nutrientes, pérdida de peso, distensión abdominal, anemia, así como también, un riesgo sustancialmente mayor para el desarrollo de osteoporosis y neoplasias intestinales (linfoma y carcinoma).
El tratamiento para la intolerancia al gluten comúnmente implica una dieta estricta sin gluten de por vida. Sin embargo, la dieta sin gluten es inconveniente, restrictiva y el gluten es difícil de evitar. Por lo tanto, se necesitan tratamientos alternativos efectivos para la intolerancia al gluten.
Se sabe que varias especies bacterianas causan infección del tracto gastrointestinal. Aunque el tratamiento actual para tales infecciones depende en gran medida de los antibióticos, se encuentra que un número creciente de infecciones bacterianas son resistentes al menos a algunos antibióticos. Además, algunas especies de bacterias forman endosporas que las hacen especialmente difíciles de erradicar. Las proteasas gástricas tal como la pepsina generalmente no pueden matar las endosporas, por ejemplo, debido a la incapacidad de romper la capa proteica que protege la endospora. Por lo tanto, se necesitan tratamientos alternativos efectivos para la infección bacteriana. Rey y otros (2016) Scientific Reports 6, 20980 aborda la eficiencia proteolítica en la terapia de degradación enzimática para la enfermedad celíaca. Kadek y otros (2014) Protein Expression and Purification 95, 121-128 describe la expresión y caracterización de la proteasa aspártica vegetal nepentesina-1 de Nepenthes gracilis. Athauda y otros (2004) Biochem J 381,295-306 describe la caracterización enzimática y estructural de la nepentesina. Takahashi (2012) Handbook of Proteolytic Enzymes Vol 1 y 2, 3ra Edición páginas 125-128 proporciona una visión general de la nepentesina. Kubota y otros (2010) Bioscience Biotechnology Biochemistry 74 (11), 2323-2326 describe los perfiles de estabilidad de la nepentesina en urea y clorhidrato de guanidina. Hatano y otros (2008) Journal of Proteome Research 7 (2), 809-816 describe el análisis de proteoma del fluido de la jarra de la planta insectívora Nepenthes alata. Rey y otros (2012) Molecular & Cellular Proteomics 12 (2), 464-472 describe la nepentesina de las copas de mono para la espectroscopía de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio. An y otros (2002) Planta 214 (5), 661-667 describe la expresión de proteinasas aspárticas en las jarras de la planta carnívora Nepenthes alata. Mazorra-Manzano y otros (2010) Phytochem 71 (5-6), 515-523 describe la caracterización de la estructura-función de la proteinasa A1 aspártica recombinante de Arabidopsis thaliana. Stepniak y otros (2006) Am J Physiol 291, G621-G629 describe la degradación del gluten con una prolil endoproteasa recientemente identificada. El documento US 2012/225050 describe métodos para mejorar la salud intestinal. El documento EP 2090662 describe un proceso para la producción de un producto químico fino en un organismo. Takahasji y otros (2005) Curr Prot Pep Sci 6, 513-525 describe las características enzimáticas y estructurales de la nepentesina.
Resumen de la invención
Esta invención se refiere al descubrimiento de que la enzima nepentesina posee una alta actividad proteolítica para escindir proteínas y oligopéptidos (incluido el gluten), especialmente a pH bajo (por ejemplo, aproximadamente 2 a 3). La nepentesina (EC 3.4.23.12) es una proteasa aspártica de origen vegetal que puede aislarse o concentrarse a partir de una variedad de fuentes vegetales, tales como las secreciones de la jarra de Nepenthes, una planta carnívora insectívora, comúnmente conocida como copas de mono en regiones tropicales. Tokes y otros, Digestive Enzymes Secreted by the Carnivorous Plant Nepenthes macferlanei L., Planta (Berl.) 119, 39-46 (1974). Se ha encontrado que la actividad de la nepentesina es aproximadamente 1000 veces mayor que la de la pepsina (EC 3.4.23.1), una enzima presente en el estómago de los humanos, en parte responsable de la degradación de las proteínas de los alimentos en péptidos. También se ha encontrado que la nepentesina tiene una especificidad mucho más relajada que la pepsina, escindiendo eficientemente después de la mayoría de los residuos de aminoácidos con la excepción de los residuos de aminoácidos G, S, T, V, I y W. Notablemente, escinde después de los residuos de aminoácidos K, R y P. En comparación, la pepsina presenta una escisión de alta eficiencia para los residuos de aminoácidos hidrofóbicos F, L y M, pero la escisión después de los residuos de aminoácidos P, H, K y R está esencialmente prohibida.
La nepentesina tiene dos isoformas conocidas: nepentesina I (se sabe que tiene dos variantes: nepentesina la y nepentesina Ib) y II. Se encuentra que ambas isoformas tienen una mayor afinidad de escisión por los aminoácidos P y Q que la pepsina. Sorprendentemente, se ha descubierto que la combinación de nepentesina I y nepentesina II tiene una afinidad de escisión ligeramente diferente a la nepentesina I sola. Específicamente, el extracto que comprende nepentesina I y nepentesina II escinde más eficientemente después del aminoácido Q en el lado N-terminal de la gliadina y el aminoácido P en el lado C-terminal de la gliadina que la nepentesina I sola.
La intolerancia al gluten y las afecciones y síntomas asociados, tales como la enfermedad celíaca y/o la dermatitis herpetiforme, son causadas por la respuesta inmune anormal del paciente al gluten en la mucosa del intestino delgado. Ciertos componentes del gluten son resistentes a la escisión por peptidasas gástricas y pancreáticas tales como la pepsina, la tripsina, la quimotripsina y similares. Si bien no desea estar sujeto a ninguna teoría, se contempla que la degradación del gluten a péptidos no tóxicos por la nepentesina antes de llegar al tracto intestinal de un paciente disminuye los niveles de proteínas o péptidos del gluten tóxico que ingresan al intestino delgado. Como la nepentesina es estable en ácido, es compatible con el pH del estómago y digiere el gluten para modular la intolerancia al gluten de un paciente o afecciones o síntomas relacionados.
Dada su alta actividad a pH bajo y su amplio espectro de actividad, la nepentesina es especialmente útil para digerir las proteínas del gluten en el estómago. La degradación del gluten a péptidos no tóxicos también se conoce como desintoxicación del gluten. Si bien no desea estar sujeto a ninguna teoría, se contempla que la degradación del gluten, que se compone de proteínas ricas en prolina y glutamina, a péptidos no tóxicos puede lograrse de manera más eficiente con la nepentesina que con enzimas estomacales tal como la pepsina.
Esta descripción se refiere además al uso de la nepentesina, tal como la nepentesina I y/o nepentesina II y derivados de las mismas en el tratamiento de infecciones bacterianas del tracto gastrointestinal. Dada su alta actividad a pH bajo y su amplio espectro de actividad, la nepentesina es útil en el tratamiento de infecciones bacterianas del tracto gastrointestinal. Sin limitarse a la teoría, se cree que la nepentesina es más eficiente que las enzimas estomacales para alterar las paredes celulares bacterianas y las capas de endosporas.
En un aspecto, se proporciona una composición para usar en el tratamiento o inhibición de la intolerancia al gluten en donde dicha composición comprende nepentesina recombinante seleccionada de nepentesina I recombinante, nepentesina II recombinante, una sal de la misma, o cualquier combinación de las mismas. En una modalidad, la nepentesina I recombinante se administra a dicho paciente. En una modalidad, la nepentesina II recombinante se administra a dicho paciente. En una modalidad, se administra una mezcla de nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante a dicho paciente.
En una modalidad de la descripción, la nepentesina, tal como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma, se administra como un aditivo alimentario de tal manera que la nepentesina o el derivado de la misma se combina con alimentos que contienen gluten para modular o inhibir las afecciones asociadas con la intolerancia al gluten. La nepentesina o un derivado de la misma puede usarse solo o en combinación con dicho alimento. En un aspecto de la descripción, se usa nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, se usa nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, se usa una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
En una modalidad, dicha intolerancia al gluten da como resultado enfermedad celíaca, alergia al trigo, sensibilidad al gluten y/o dermatitis herpetiforme. En un aspecto de la descripción, la nepentesina I o un derivado de la misma se administra a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, la nepentesina II o un derivado de la misma se administra a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, se administra una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas a dicho paciente.
En cualquier caso, la nepentesina, tales como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma, puede administrarse al paciente antes, simultáneamente o poco después del consumo de un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten. En un aspecto de la descripción, la nepentesina I o un derivado de la misma se administra a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, la nepentesina II o un derivado de la misma se administra a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, se administra una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas a dicho paciente.
En otro aspecto de la descripción, se proporcionan métodos para modular la intolerancia al gluten o una afección asociada, tal como enfermedad celíaca, alergia al trigo, sensibilidad al gluten o dermatitis herpetiforme, en un paciente que lo necesite, que comprende tratar un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten con una cantidad efectiva de nepentesina antes del consumo por parte del paciente. En un aspecto de la descripción, dicho alimento se trata con una cantidad efectiva de nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, dicho alimento se trata con una cantidad efectiva de nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, dicho alimento se trata con una cantidad efectiva de una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
En otro aspecto de la descripción, se proporcionan alimentos o composiciones que comprenden nepentesina, tales como nepentesina I y/o nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, dicho alimento o composición comprende nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, dicho alimento o composición comprende nepentesina II o un derivado del mismo. En un aspecto de la descripción, dicho alimento o composición comprende una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición para optimizar la escisión de una proteína del gluten en un residuo de prolina, que comprende una mezcla de nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante. En un aspecto de la descripción, se proporciona una composición para optimizar la escisión de una proteína del gluten en un residuo de glutamina, que comprende una mezcla de nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende gluten fragmentado, en donde la composición se enriquece en fragmentos del gluten producidos por escisión del gluten en un residuo de prolina del gluten. En un aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende gluten fragmentado, en donde la composición se enriquece en fragmentos del gluten producidos por escisión del gluten en un residuo de glutamina.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para digerir proteínas que comprende gluten, el método que comprende poner en contacto dichas proteínas con una cantidad efectiva de nepentesina I y/o nepentesina II.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para producir nepentesina recombinante, tal como nepentesina I y/o nepentesina II o un derivado de la misma, el método que comprende expresar en un organismo huésped elegido una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha nepentesina u homólogo de la misma y la secuencia de ácido nucleico se ha insertado en un vector diseñado adecuadamente; para obtener dicha nepentesina o un homólogo de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende nepentesina recombinante o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina I recombinante o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina II recombinante o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es una mezcla de nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante o derivados de las mismas.
En otro aspecto de la descripción, se proporcionan métodos para prevenir o tratar infecciones bacterianas o parasitarias del tracto gastrointestinal en un paciente, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de nepentesina, tal como nepentesina I y/o nepentesina II o un derivado de la misma a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, la nepentesina I o un derivado de la misma se administra a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, la nepentesina II o un derivado de la misma se administra a dicho paciente. En un aspecto de la descripción, se administra una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas a dicho paciente.
Estos y otros aspectos de la invención se describirán adicionalmente en el texto que sigue.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra las preferencias de escisión de la nepentesina en (A) el lado P1 o N-terminal del sitio de escisión y en (B) el lado P1' o C-terminal del sitio de escisión. Los datos se agrupan de acuerdo con el tipo de aminoácido y se comparan con una representación similar de los datos de la pepsina de Hamuro y otros. Specificity of immobilized porcine pepsin in H/D exchange compatible conditions. Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046 (2008). Las barras negras indican la digestión con nepentesina y las barras grises la digestión con pepsina. El % de escisión representa el número de divisiones observadas en el residuo dado, con relación al número total de residuos dados en el conjunto. Los datos de la nepentesina se obtuvieron a partir de digestiones de seis proteínas desnaturalizadas, como se describió en el Ejemplo 2.
La Figura 2 muestra un mapa de la secuencia del péptido compuesto XRCC4, organizado de acuerdo con el tipo de dominio. Los péptidos se obtuvieron mediante el uso de digestión con pepsina a cuatro diferentes relaciones enzima:sustrato (65:1 a 520:1, gris claro/juego de barras superior), y mediante el uso de digestión con nepentesina a cuatro diferentes relaciones enzima:sustrato (0,0075: 1 a 0,38: 1, conjunto de barras gris oscuro/inferior).
La Figura 3 muestra la puntuación promedio de MASCOT de los péptidos obtenidos después de la digestión con nepentesina, agrupados por aminoácidos C-terminales. El número de péptidos usados para cada cálculo está asociado con el aminoácido terminal, arriba de la barra. Los péptidos se obtuvieron de las digestiones de seis proteínas desnaturalizadas, como se describió en el Ejemplo 2.
La Figura 4 muestra los cromatogramas de iones peptídicos (PIC) de XRCC4 digeridos con (A) nepentesina y (B) pepsina en un intervalo de relaciones enzima:sustrato (que se muestra en la leyenda). Los PIC para la digestión enzimática se generaron a partir de la misma carga de masa del sustrato en la columna.
La Figura 5 muestra la longitud promedio de todos los péptidos identificados a partir de una digestión con nepentesina de gliadina del trigo, mediante el uso de LC-MS/MS, después de 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos a 37 °C. Se usó un límite de confianza del 95 % (p<0,05) en las puntuaciones para eliminar la identificación de falsos positivos. La desviación estándar relativa de la longitud del péptido se muestra en la figura insertada.
La Figura 6 muestra el número de péptidos identificados por LC-MS/MS después de una digestión de 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos a 37 °C, agrupados por longitud. Datos como en la Figura 5.
La Figura 7 muestra los mismos datos que la Figura 5, como una probabilidad de obtener una cierta longitud después de una digestión de 10, 60, 120, 360 u 810 minutos a 37 °C.
La Figura 8 muestra las preferencias de escisión de la nepentesina en (A) el lado P1 o N-terminal del sitio de escisión y en (B) el lado P1' o C-terminal del sitio de escisión. Las barras de la izquierda para cada residencia indican la digestión con extracto de nepentesina, las barras del medio indican la digestión con extracto de nepentesina purificado y las barras de la derecha con nepentesina recombinante I. El % de escisión representa el número de divisiones observadas en el residuo dado, en relación con el número total de péptidos presentes. Los datos de nepentesina se obtuvieron a partir de digestiones de gliadina, como se describió en el Ejemplo 9.
La Figura 9 muestra una alineación de las secuencias de proteínas para la nepentesina I de Nepenthes mirabilis, Nepenthes gracilis, Nepenthes alata, Zea mays y Oryza sativa, y nepentesina II de Nepenthes mirabilis, Nepenthes gracilis, Zea mays y Oryza sativa.
La Figura 10 muestra un árbol filogenético que indica la relación de las proteínas nepentesina entre diferentes especies.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder dicha descripción en virtud de una invención anterior.
La práctica de la presente descripción emplea, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (que incluye técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, por ejemplo, en las siguientes publicaciones. Véase, por ejemplo, Sambrook y Russell eds. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ra edición (2001); la serie CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel y otros. eds. (2007)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc., N.Y.); PCR 1: A PRACTICAL APPROa Ch (M. MacPherson y otros. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999)); CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (R.I. Freshney 5ta edición (2005)); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed. (1984)); Mullis y col. Patente de Estados Unidos Núm. 4.683.195; NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (M.L.M. Anderson (1999)); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1984)); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press (1986)); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller y M. P. Calos eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory); GENE TRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS (S.C. Makrides ed. (2003)) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London (1987)); WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (L.A. Herzenberg y otros. eds (1996)).
Como se usa en la descripción y las reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.
Como se usa en la presente descripción, el término "que comprende" pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. "Que consiste esencialmente en' cuando se usa para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. Por ejemplo, una composición que consiste esencialmente en los elementos como se definió en la presente descripción no excluiría otros elementos que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. "Consiste en" significará excluir más que pequeñas cantidades de otros ingredientes y pasos sustanciales del método recitados. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención.
Como se usa en la presente descripción, el término "gluten" generalmente se refiere a las proteínas presentes en el trigo o especies de granos relacionadas, incluidas la cebada y el centeno, que tienen un efecto nocivo potencial para ciertos individuos. Las proteínas del gluten incluyen gliadinas tales como a-gliadinas, p-gliadinas, Y-gliadinas y wgliadinas, que son proteínas monoméricas y gluteninas que son una mezcla altamente heterogénea de agregados de subunidades de alto peso molecular y subunidades de bajo peso molecular mantenidas juntas por enlaces disulfuro. Se han caracterizado muchas proteínas del gluten de trigo, véase, por ejemplo, Woychik y otros, Amino Acid Composition of Proteins in Wheat Gluten, J. Agric. Food Chem., 9(4), 307-310 (1961). El término gluten, como se usa en la presente descripción, también incluye oligopéptidos que pueden derivarse de la digestión humana normal de proteínas del gluten a partir de alimentos que contienen gluten y causan una respuesta inmune anormal. Algunos de estos oligopéptidos son resistentes a las enzimas digestivas normales. Se cree que el gluten, incluidas las proteínas y los oligopéptidos mencionados anteriormente, actúan como antígenos para las células T en la celiaquía en pacientes con intolerancia al gluten.
El término "nepentesina" se refiere a la proteasa aspártica que tiene el número de la Comisión de Enzimas EC 3.4.23.12, e incluye todas las isoformas y variantes de nepentesina tales como nepentesina I y nepentesina II, y nepentesina recombinante, y sus sales. Las sales se refieren a aquellas sales formadas por nepentesina con una o más bases o uno o más ácidos que retienen la efectividad biológica y las propiedades de la nepentesina libre, y que no son biológicamente o de otra manera indeseables. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, pero que no se limitan a, las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero que no se limitan a, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, N-piperidina, piperidina, piperidina, piperidina, epiperidina y similares. Los ácidos que pueden formar sales incluyen, pero que no se limitan a, ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares.
Los derivados de la nepentesina de la descripción incluyen equivalentes biológicos, fragmentos y nepentesina extendida, y sus sales, que retienen la actividad proteolítica. En algunas modalidades de la descripción, los derivados de la nepentesina incluyen equivalentes biológicos de la nepentesina. Los "equivalentes biológicos" incluyen aquellos que tienen al menos aproximadamente 80 % de homología o identidad o alternativamente, al menos aproximadamente 85 %, o alternativamente al menos aproximadamente 90 %, o alternativamente al menos aproximadamente 95 %, o alternativamente 98 % de homología con la nepentesina, o alternativamente un polipéptido o proteína codificado por un polinucleótido que hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos que codifica la nepentesina o su complemento, mientras mantiene la estructura deseada y exhibe al menos parte de la actividad proteolítica de la nepentesina.
En algunas modalidades de la descripción, el derivado de la nepentesina es un fragmento de nepentesina que tiene al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos de la proteína de nepentesina completa, o al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos, o que comprende 100 o más aminoácidos contiguos, hasta la proteína completa de nepentesina. Los derivados de la nepentesina de la descripción también incluyen la nepentesina que tiene secuencias adicionales.
En algunas modalidades de la descripción, un derivado de nepentesina tiene al menos aproximadamente 10 % de la actividad proteolítica de la nepentesina, o al menos aproximadamente 50 %, o al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 90 % de la actividad proteolítica de la nepentesina o 100 % o más de la actividad proteolítica de la nepentesina.
Como se usa en la presente descripción, el término "equivalente biológico del mismo" pretende ser sinónimo de "equivalente del mismo" que, cuando se refiere a una proteína, anticuerpo, polipéptido o ácido nucleico de referencia, pretende aquellos que tienen una homología mínima mientras mantienen la estructura o funcionalidad deseada. En una modalidad alternativa de la descripción, el término "equivalente biológico de' un polinucleótido se refiere a uno que hibrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido de referencia o su complemento. A menos que se mencione específicamente en la presente descripción, se contempla que cualquier polinucleótido, polipéptido o proteína mencionado en el presente documento también incluya sus equivalentes. Por ejemplo, un equivalente pretende al menos aproximadamente el 80 % de homología o identidad y, alternativamente, al menos aproximadamente el 85 %, o alternativamente al menos aproximadamente el 90 %, o alternativamente al menos aproximadamente el 95 %, o alternativamente el 98 % por ciento, o alternativamente el 99 % por ciento homología o identidad de secuencia y exhibe actividad biológica sustancialmente equivalente a la proteína de referencia, polipéptido o ácido nucleico.
Un polinucleótido o una región polinucleotídica (o un polipéptido o región polipeptídica) que tiene un cierto porcentaje (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) de "identidad de secuencia" con otra secuencia significa que, cuando está alineado, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son iguales en la comparación de las dos secuencias. La alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse mediante el uso de programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, Eds.
1987) Suplemento 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferentemente, los parámetros predeterminados se usan para la alineación. Un programa de alineación es el BLAST, mediante el uso de parámetros predeterminados. Los ejemplos de los programas incluyen BLASTN y BLASTP, mediante el uso de los siguientes parámetros predeterminados: Código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambos; corte = 60; expectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank Cd S traducciones SwissProtein SPupdate PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/BLAST.
Los vectores de expresión adecuados incluyen vectores capaces de expresar un polinucleótido unido operativamente a un elemento regulador, tal como una región promotora y/o un potenciador que es capaz de regular la expresión de tal ADN. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula huésped apropiada, da como resultado la expresión del ADN insertado. Los vectores de expresión apropiados incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que permanecen episomales o aquellos que se integran en el genoma de la célula huésped.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico no cromosómico que comprende un replicón intacto de modo que el vector puede replicarse cuando se coloca dentro de una célula, por ejemplo, mediante un proceso de transformación. Los vectores pueden ser virales o no virales. Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, herpesvirus, papovirus o virus modificados de forma natural. Los ejemplos de vectores no virales para llevar ácido nucleico incluyen ADN desnudo; ADN en complejo con lípidos catiónicos, solos o en combinación con polímeros catiónicos; liposomas aniónicos y catiónicos; complejos y partículas de ADN-proteína que comprenden ADN condensado con polímeros catiónicos tales como polilisina heterogénea, oligopéptidos de longitud definida y polietilenimina, en algunos casos contenidos en liposomas; y el uso de complejos ternarios que comprenden un virus y polilisina-ADN.
El vector no viral puede incluir un plásmido que comprende un polinucleótido heterólogo capaz de ser liberado a una célula diana, in vitro, in vivo o ex vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés y puede estar operativamente unido a uno o más elementos reguladores y puede controlar la transcripción de la secuencia de ácido nucleico de interés. Como se usa en la presente descripción, un vector no necesita ser capaz de replicarse en la célula o sujeto diana final. El término vector puede incluir vector de expresión y vector de clonación.
"Homología" o "identidad" o "similitud" se refiere a la similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede determinarse al comparar una posición en cada secuencia que puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, las moléculas son homólogas en esa posición. Un grado de homología entre secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 % de identidad, o alternativamente menos del 25 % de identidad, con una de las secuencias de la presente descripción.
"Hibridación" se refiere a reacciones de hibridación que pueden realizarse en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica: véanse, por ejemplo, las ediciones de Sambrook y Russell. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra edición. Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (donde SSC es 0,15 M de NaCl y 15 mM de tampón citrato) y su equivalente mediante el uso de otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida de 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas y lavados de duración creciente, frecuencia creciente o concentraciones de tampón decrecientes.
En una modalidad de la descripción, "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un compuesto que da como resultado la prevención o mejora de los síntomas en un paciente o un resultado biológico deseado, por ejemplo, signos clínicos mejorados, inicio tardío de la enfermedad, etc. La cantidad efectiva puede ser determinada por un experto en la técnica. El nivel de dosificación seleccionado puede depender de la gravedad de la afección a tratar, y la afección y el historial médico previo del paciente a tratar. Sin embargo, está dentro de la habilidad de la técnica comenzar las dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.
La "administración concurrente" o tratamiento conjunto, como se usa en la presente descripción, incluye la administración de los agentes juntos, o antes o después de cada uno.
El término "modular" o "modulación" significa cualquier tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto, tal como un mamífero, que incluye:
• prevenir o proteger contra la enfermedad o trastorno, es decir, al causar que la reacción biológica anormal o los síntomas no se desarrollen;
• inhibir la enfermedad o trastorno, es decir, detener o suprimir el desarrollo de reacciones biológicas anormales y/o síntomas clínicos; y/o
• aliviar la enfermedad o trastorno que es, causar la regresión de reacciones biológicas anormales y/o síntomas clínicos.
Como se usa en la presente descripción, el término "prevenir" se refiere al tratamiento profiláctico de un paciente que lo necesita. El tratamiento profiláctico puede lograrse al proporcionar una dosis apropiada de un agente terapéutico a un sujeto en riesgo de sufrir una dolencia, lo que evita así sustancialmente la aparición de la enfermedad.
Como se usa en la presente descripción, el término "afección" se refiere a un estado de enfermedad para el que se usan los compuestos, composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a mamíferos e incluye humanos y mamíferos no humanos. En modalidades particulares de la descripción en la presente descripción, el paciente o sujeto es un ser humano.
El término "aproximadamente" cuando se usa antes de un valor numérico indica que el valor puede variar dentro de un intervalo razonable, tal como ± 5 %, ± 1 % y ± 0,2 %.
II. Métodos
En un aspecto de la descripción, se proporcionan los métodos para modular la intolerancia al gluten en un paciente con intolerancia al gluten, el método que comprende administrar una cantidad efectiva de nepentesina, tal como nepentesina I y/o nepentesina II, o un derivado de la misma a dicho paciente.
En una modalidad de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra como un aditivo alimentario de manera que la nepentesina o un derivado de la misma se combina con alimentos que contienen gluten para modular o inhibir las afecciones asociadas con la intolerancia al gluten. La nepentesina o un derivado de la misma puede usarse solo o en combinación con dicho alimento.
En otro aspecto de la descripción, se proporcionan los métodos para modular una afección mediada por intolerancia al gluten en un paciente, el método que comprende administrar una cantidad efectiva de nepentesina o un derivado de la misma a dicho paciente. Tales afecciones incluyen, a modo de ejemplo, solo la enfermedad celíaca, la alergia al trigo, la sensibilidad al gluten y la dermatitis herpetiforme. La nepentesina o un derivado de la misma puede administrarse al paciente antes de, simultáneamente con, o poco después de la ingestión de un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten.
En algunas modalidades, la nepentesina, tal como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma, se administra al paciente antes de la ingestión por parte del paciente del alimento que comprende gluten o sospechoso de comprender gluten. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra dentro de un período en el que la nepentesina o el derivado de la misma es al menos parcialmente efectiva (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 50 %, 70 %, 90 % de la actividad original) en la degradación del gluten en los alimentos que el paciente ingiere. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra no más de aproximadamente 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o 30 minutos antes de que el paciente ingiera los alimentos.
En algunas modalidades, la nepentesina o un derivado de la misma se administra al paciente simultáneamente con la ingestión por parte del paciente del alimento que comprende gluten o sospechoso de comprender gluten. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra con el alimento, tal como un ingrediente o aditivo al alimento. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra por separado del alimento.
En algunas modalidades, la nepentesina o un derivado de la misma se administra al paciente poco después de la ingestión por parte del paciente del alimento que comprende gluten o sospechoso de comprender gluten. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra dentro de un período en el que al menos parte (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 50 %, 70 %, 90 %) del gluten en el alimento está todavía en el estómago del paciente. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra no más de 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o 30 minutos después de la ingestión del alimento por parte del paciente.
En otro aspecto de la descripción, se proporcionan los métodos para prevenir o tratar infecciones bacterianas o parasitarias del tracto gastrointestinal en un paciente, el método que comprende administrar una composición que comprende una cantidad efectiva de nepentesina o un derivado de la misma a dicho paciente. Solo a modo de ejemplo, tales infecciones bacterianas pueden ser causadas por bacterias tales como Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Helicobacter pylori, Salmonella, Campylobacter, E. coli, Shigella, Clostridium difficile, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulin Campylobacter jejuni y Listeria monocytogenes. En un aspecto de la descripción, dicha composición comprende nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, dicha composición comprende nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, dicha composición comprende una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
C. difficile son flora intestinal natural en un pequeño subconjunto de la población. Sin embargo, la mayoría de las personas están expuestas a C. difficile como pacientes en un hospital, hogar de ancianos o centro similar al ingerir esporas de la bacteria. C. difficile puede invadir el tracto gastrointestinal en afecciones oportunistas, generalmente debido al tratamiento con un antibiótico de amplio espectro que destruye la flora intestinal normal. La bacteria libera toxinas que pueden causar hinchazón, diarrea y dolor abdominal intenso. Las infecciones por C. difficile son la causa más común de colitis pseudomembranosa, que en casos raros progresan a megacolon tóxico potencialmente mortal. La tasa de C. difficile es adquirida por un número significativo de pacientes con estadías prolongadas en el hospital: se estima que la adquisición es del 13 % en pacientes con estadías hospitalarias de hasta dos semanas y del 50 % en aquellos con estadías hospitalarias de más de cuatro semanas. Clabots, CR; Johnson, S; Olson, MM; Peterson, LR; Gerding, DN (septiembre de 1992). "Acquisition of Clostridium difficile by hospitalized patients: evidence for colonized new admissions as a source of infection". Journal of Infectious Diseases 166 (3): 561-7.
Se ha encontrado que Helicobacter vive en el revestimiento del tracto gastrointestinal superior, así como también en el hígado de mamíferos y algunas aves. H. pylori infecta hasta el 50 % de la población humana y puede ser patógeno para los humanos. H. pylori está fuertemente asociada con úlceras pépticas, gastritis crónica, duodenitis y cáncer de estómago. Otras especies de Helicobacter también se han asociado con estas afecciones, incluidas H. suis, H. felis, H. bizzozeronii y H. salomonis.
En un aspecto de la descripción, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención a un paciente que se sabe que tiene o se sospecha que tiene una infección del tracto gastrointestinal. En otro aspecto de la descripción, la composición se administra a un paciente en riesgo de infectarse, por ejemplo, un paciente con una hospitalización prolongada y/o un paciente al que se le receta un antibiótico de amplio espectro.
Típicamente, la nepentesina tal como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma se administra en una cantidad que es segura y suficiente para producir el efecto deseado de la desintoxicación del gluten o el tratamiento de la infección bacteriana. La dosis de los compuestos de nepentesina o derivados la misma puede variar en dependencia de muchos factores, tales como la nepentesina particular o sus derivados administrados, la sensibilidad del paciente al gluten, la cantidad y los tipos de alimentos ingeridos que contienen gluten, las propiedades farmacodinámicas, el modo de administración, la edad, la salud y el peso del receptor, la naturaleza y la extensión de los síntomas, la frecuencia del tratamiento y el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, y la tasa de depuración del compuesto. Un experto en la técnica puede determinar la dosis apropiada en función de los factores anteriores. Los compuestos pueden administrarse inicialmente en una dosis adecuada que puede ajustarse según sea necesario, en dependencia de la respuesta clínica. La cantidad de nepentesina tal como nepentesina I y/o nepentesina II o un derivado de la misma que será efectiva en el tratamiento de una enfermedad correlacionada o causada por una infección con bacterias patógenas, por ejemplo, puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar basadas en la presente descripción. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para ayudar a identificar rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del profesional y las circunstancias de cada sujeto.
La dosificación o el régimen de dosificación de un paciente adulto puede ajustarse proporcionalmente para niños y lactantes, y también puede ajustarse para otra administración u otros formatos, en proporción, por ejemplo, al peso molecular o la respuesta inmune. La administración o los tratamientos pueden repetirse a intervalos apropiados, a discreción del médico.
En general, la nepentesina o un derivado de la misma se administra cuando es necesario, tal como cuando el paciente consumirá o está consumiendo o ha consumido un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten, o si tiene o se sospecha que tiene una infección bacteriana. Alternativamente, una composición farmacéutica que comprende nepentesina o un derivado de la misma puede administrarse a un paciente que la necesite. En cualquier caso, puede administrarse en dosis de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal por día, o aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 g por dosis para una persona promedio. En algunas modalidades, la nepentesina o un derivado de la misma puede administrar a 0,001, 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 o 1000 mg/kg de peso corporal por día, y oscila entre dos de estos valores (incluidos los puntos finales). En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma puede administrarse a 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 700 mg, 1 g, 10 g, 20 g, 50 g, 70 g, 100 g por dosis, y oscila entre dos de estos valores (incluidos los puntos finales). En algunas modalidades de la descripción, puede administrarse una, dos, tres veces, etc. al día, en dependencia de la cantidad de veces que el paciente ingiera un alimento que contenga gluten, o en dependencia del tipo, la gravedad o el riesgo de infecciones bacterianas o parasíticas.
Los compuestos de esta invención pueden administrarse como el único agente activo o pueden administrarse en combinación con otros agentes (simultáneamente, secuencialmente o por separado, o mediante formulación conjunta), incluidos otros compuestos que demuestran la misma o similar actividad terapéutica y que se determina que son seguros y eficaces para tal administración combinada.
En algunas modalidades, la nepentesina o un derivado de la misma se administra con otra enzima, tal como una proteasa gástrica (por ejemplo, pepsina y pepsinógeno), otra proteasa aspártica, tal como las descritas por Chen y otros, Aspartic proteases gene family in rice: Gene structure and expression, predicted protein features and phylogenetic relation, Gene 442:108-118 (2009), y enzimas tales como la prolil endopeptidasa (PEP), dipeptidil peptidasa IV (DPP IV), y dipeptidil carboxipeptidasa (DCP) o cisteína peptisasa B descritas en la Petente de EE.UU Núm. 7,910,541.
En algunas modalidades, la nepentesina se administra al paciente con otro agente. Los ejemplos no limitantes de agentes que pueden administrarse con la nepentesina incluyen los inhibidores de la transglutaminasa tisular, agentes antiinflamatorios tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa (por ejemplo, compactina, lovastatina, simvastatina, pravastatina y atorvastatina), antagonistas de los receptores de leucotrienos (por ejemplo, montelukast y zafirlukast), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib), inhibidores de la p38 Ma P quinasa (por ejemplo, BIRB-796); agentes estabilizadores de mastocitos tale como el cromoglicato de sodio (cromolina), pemirolast, proxicromil, repirinast, doxantrazol, amlexanox, nedocromil y probicromil, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos tales como agentes antihistamínicos (por ejemplo, acrivastina, cetirizina, desloratadina, ebastina, fexofenadina, levocetirizina, loratadina y mizolastina), inhibidores de la transglutaminasa 2 (TG2), agentes anti-TNFa y antibióticos.
En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina se administra conjuntamente con un antibiótico, tal como una penicilina, una cefalosporina, un carbapenem, una polimixina, una rifamicina, una lipiarmicina, una quinolona, una sulfonamida, un p-lactama, una fluoroquinolona, un glucopéptido, un cetólido, una lincosamida, una estreptogramina, un aminoglucósido, un macrólido, una tetraciclina, un lipopéptido cíclico, una glicilciclina o una oxazolidinona. Los antibióticos en estas clases son conocidos en la técnica.
En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina se administra conjuntamente con un agente antiinfeccioso (por ejemplo, un triazol o anfotericina antifúngica). Estos pueden incluir carbapenems, por ejemplo, meropenem o imipenem, para ampliar la efectividad terapéutica.
También se describe en la presente descripción el uso de la nepentesina o un derivado de la misma en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una de las afecciones y enfermedades mencionadas anteriormente.
Composiciones
La nepentesina tal como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma puede administrarse en una variedad de composiciones solas o con portadores o diluyentes o ingredientes dietéticos apropiados farmacéuticamente aceptables.
En consecuencia, en otro aspecto de la descripción, se proporciona en la presente descripción una composición que comprende nepentesina o un derivado de la misma. En algunas modalidades de la descripción, la composición es una composición comestible. En algunas modalidades de la descripción, la composición es un suplemento dietético. En algunas modalidades de la descripción, la composición es una composición farmacéutica. En algunas modalidades de la descripción, la composición es un alimento o aditivo alimentario. Las composiciones pueden formularse en formas sólidas, semisólidas o líquidas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, inyecciones, geles y microesferas. La administración de la nepentesina o un derivado de la misma puede lograrse de varias maneras, por ejemplo, por administración oral.
En algunas modalidades de la descripción, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular de la descripción, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos.
Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva de nepentesina o un derivado de la misma, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada del portador para proporcionar la forma de administración adecuada al sujeto. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
Para la administración oral, la nepentesina o un derivado de la misma puede usarse sola o en combinación con los aditivos apropiados para hacer tabletas, polvos, gránulos, cápsulas, jarabes, líquidos, suspensiones, etc. Por ejemplo, las formas orales sólidas de nepentesina o un derivado de la misma pueden estar preparadas con aditivos convencionales, desintegradores, lubricantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes aromatizantes. Los ejemplos no limitantes de excipientes incluyen lactosa, manitol, almidón de maíz, almidón de papa, celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz, carboximetilcelulosa de sodio, talco, estearato de magnesio, sabores y colores. En algunas modalidades de la descripción, la formulación libera nepentesina o un derivado de la misma en el estómago del paciente, de manera que el gluten puede ser degradado por la nepentesina o derivado de la misma.
La nepentesina o un derivado de la misma puede liofilizarse a partir de una solución acuosa opcionalmente en presencia de tampones apropiados (por ejemplo, tampones de fosfato, citrato, histidina, imidazol) y excipientes (por ejemplo, crioprotectores tales como sacarosa, lactosa, trehalosa). Los pasteles liofilizados pueden mezclarse opcionalmente con excipientes y hacerse en diferentes formas.
En otro aspecto de la descripción, se proporcionan los métodos para tratar la intolerancia al gluten o una afección asociada, tal como enfermedad celíaca, alergia al trigo, sensibilidad al gluten y dermatitis herpetiforme, en un paciente que lo necesite, que comprende tratar un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten con una cantidad efectiva de nepentesina o un derivado de la misma antes del consumo por parte del paciente. En algunas modalidades de la descripción, el alimento se combina con una cantidad efectiva de nepentesina o un derivado de la misma durante su preparación, preferentemente después de cualquier etapa de calentamiento.
En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se administra como un aditivo alimenticio junto con un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten, tal como pan, pasta, cereal y similares, hechos de trigo, centeno y cebada, etc. En algunas modalidades de la descripción, se agrega nepentesina o un derivado de la misma como ingrediente en dicho alimento. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma se dispersa en un alimento antes del consumo, opcionalmente a un pH donde está inactivo, tal como un pH de aproximadamente 5 o superior. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma puede prepararse o incorporarse en un polvo, un producto para untar, un aerosol, una salsa, un baño, una crema batida, etc., que puede aplicarse al alimento que contiene gluten cuando la comida está siendo consumida por un paciente. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma puede convertirse en formas que apelan al apetito propio, tales como caramelos, chicles, suplementos dietéticos, jarabes, etc. para una fácil administración. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o un derivado de la misma puede mezclarse con alimentos comunes, tales como azúcar, sal, aderezos para ensaladas, especias, queso, mantequilla, margarinas, productos para untar, mantequilla, mantecas para freír, mayonesas, productos lácteos, mantequillas de nueces, mantequillas de semillas, mantequillas de almendra, mantequilla de maní, etc. Preferentemente, los alimentos o aditivos que comprenden nepentesina no requieren calentamiento antes de ser ingeridos por un paciente, de manera que la posible pérdida de actividad de la nepentesina o un derivado de la misma debido a la temperatura elevada pueda ser minimizada.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un producto alimenticio que comprende nepentesina o un derivado de la misma. En algunas modalidades de la descripción, el producto alimenticio comprende gluten o se sospecha que comprende gluten, tal como productos de panadería (por ejemplo, pasteles, magdalenas, rosquillas, pasteles, panecillos y pan), pastas, galletas, chips de tortilla, cereales, etc. hechos de trigo, centeno y cebada. En algunas modalidades de la descripción, el producto alimenticio puede consumirse con otro producto alimenticio que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten. Los ejemplos no limitantes de tales alimentos incluyen un polvo, un producto para untar, un aerosol, una salsa, una crema batida, dulces, goma de mascar, jarabe, azúcar, sal, aderezo para ensaladas, especias, queso, mantequilla, margarinas, productos para untar, mantequilla, manteca para freír, mayonesas, productos lácteos, mantequillas de nueces, mantequillas de semillas, mantequillas, mantequilla de maní, etc.
En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina o derivado de la misma se mezcla con alimentos, o se usa para tratar previamente alimentos que contienen gluten. La nepentesina presente en los alimentos puede ser enzimáticamente activa para reducir el nivel del gluten en los alimentos antes o durante la ingestión.
En algunas modalidades de la descripción, la composición (tal como la composición farmacéutica o composición comestible) o producto alimenticio comprende de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 % de nepentesina. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina en la composición (tal como la composición farmacéutica o composición comestible) o producto alimenticio es aproximadamente 0,01 %, aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, o aproximadamente el 95 % de la composición total o producto alimenticio, o un rango entre dos de los valores (incluidos los puntos finales).
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición para optimizar la escisión de una proteína del gluten en un residuo de prolina, que comprende una mezcla de nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante. En un aspecto de la descripción, se proporciona una composición para optimizar la escisión de una proteína del gluten en un residuo de glutamina, que comprende una mezcla de nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante. En algunas modalidades de la descripción, la composición es al menos aproximadamente 20 %, 50 %, 2 veces, 5 veces o 10 veces más efectiva para escindir una proteína del gluten en un residuo de prolina en comparación con una composición que comprende una misma cantidad o concentración de ya sea nepentesina I o nepentesina II sola. En algunas modalidades de la descripción, la composición es al menos aproximadamente 20 %, 50 %, 2 veces, 5 veces o 10 veces más efectiva para escindir una proteína del gluten en un residuo de glutamina en comparación con una composición que comprende una misma cantidad o concentración de ya sea nepentesina I o nepentesina II sola.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición para optimizar la escisión de una proteína en un residuo de aminoácido, tal como H, K, R, D, E, S, T y/o N. En algunas modalidades de la descripción, la composición es al menos aproximadamente 20 %, 50 %, 2 veces, 5 veces o 10 veces más efectiva para escindir una proteína en un residuo o aminoácidos de aminoácidos dados en comparación con una composición que comprende una misma cantidad o concentración de nepentesina I o nepentesina II sola. En algunas modalidades de la descripción, la composición es al menos aproximadamente 10 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 1400 veces, o 2000 veces o más, más efectiva en la escisión de una proteína en un residuo de aminoácido dado en comparación a una composición que comprende una misma cantidad o concentración de pepsina. En algunas modalidades de la descripción, el residuo es un residuo que puede escindirse con pepsina. En algunas modalidades de la descripción, el residuo es un residuo que no es escindido eficientemente por la pepsina.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende gluten fragmentado, en donde la composición se enriquece en fragmentos del gluten producidos por escisión del gluten en un residuo de prolina del gluten. En un aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende gluten fragmentado, en donde la composición se enriquece en fragmentos del gluten producidos por escisión del gluten en un residuo de glutamina. En algunas modalidades de la descripción, los fragmentos del gluten producidos por la escisión del gluten en un residuo de prolina del gluten son al menos 2 veces, 5 veces o 10 veces los fragmentos del gluten producidos por la escisión del gluten en un residuo de prolina del gluten por una composición que comprende una misma cantidad o concentración de nepentesina I o nepentesina II sola. En algunas modalidades de la descripción, los fragmentos del gluten producidos por la escisión del gluten en un residuo de glutamina del gluten son al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces los fragmentos del gluten producidos por la escisión del gluten en un residuo de glutamina del gluten por una composición que comprende una misma cantidad o concentración de nepentesina I o nepentesina II sola.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición para optimizar la escisión de una proteína en otros residuos de aminoácidos, tal como H, K, R, D, E, S, T y/o N. En algunas modalidades de la descripción, los fragmentos de proteína producidos por la escisión de la proteína en un residuo o residuos de aminoácidos dados de la proteína son al menos 2 veces, 5 veces o 10 veces los fragmentos de proteína producidos por la escisión de la proteína en el residuo de aminoácido dado de la proteína mediante una composición que comprende una misma cantidad o concentración de nepentesina I o nepentesina II sola. En algunas modalidades de la descripción, los fragmentos de proteína producidos por la escisión de la proteína en un residuo de aminoácido dado de la proteína son al menos aproximadamente 10 veces, 50 veces, 500 veces, 1000 veces, 1400 veces o 2000 veces o mayor de los fragmentos de proteína producidos por la escisión de la proteína en el residuo de aminoácido dado de la proteína por una composición que comprende una misma cantidad o concentración de pepsina. En algunas modalidades de la descripción, el residuo es un residuo que puede escindirse con pepsina. En algunas modalidades de la descripción, el residuo es un residuo que no es escindido eficientemente por la pepsina.
Métodos de Preparación
La nepentesina puede concentrarse (o extraerse) o purificarse mediante métodos conocidos, tales como filtración o purificación por afinidad basada en pepstatina inmovilizada, de una fuente natural, tal como las secreciones de la jarra de plantas insectívoras tal como Nepenthes. La nepentesina I y II se encuentra en cantidades relativamente pequeñas en las secreciones naturales de las plantas. La producción de nepentesina I y/o nepentesina II puede aumentarse, por ejemplo, mediante el uso de tecnologías de bioingeniería para crear plantas transgénicas que expresen y/o secreten cantidades aumentadas de nepentesina I o nepentesina II, o un derivado de la misma.
Además de aislarse de una fuente vegetal, la nepentesina tal como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma puede prepararse por síntesis química. La síntesis química puede lograrse mediante el acoplamiento de los aminoácidos de acuerdo con la secuencia de la nepentesina. Varios métodos de acoplamiento de péptidos y aparatos sintéticos de péptidos comerciales están disponibles para sintetizar péptidos o proteínas, por ejemplo, sintetizadores automáticos de Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, Beckman y otros fabricantes.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para preparar nepentesina mediante el uso de sistemas de producción recombinantes mediante la transformación o transfección de una célula con el ADN y/o el ARN mensajero de la nepentesina para que la célula sea capaz de producir nepentesina. Por ejemplo, la nepentesina puede producirse mediante el establecimiento de sistemas huésped-vector en organismos tales como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Lactobacillus, Bacilli, Aspergilli y cultivos de células vegetales, tal como células de tabaco, etc.
También se describen los vectores y células huésped, tales como E. coli, que comprenden polinucleótidos y composiciones que contienen cualquiera de los polinucleótidos o polipéptidos.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para producir nepentesina recombinante tal como nepentesina I y/o nepentesina II o un derivado de la misma que comprende expresar en un organismo huésped elegido una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha nepentesina u homólogo de la misma, e insertar la secuencia de ácido nucleico en un vector diseñado apropiadamente. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende nepentesina recombinante tal como nepentesina I y/o nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina I o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina II o un derivado de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o derivados de las mismas.
La nepentesina tiene dos isoformas conocidas: nepentesina I (se sabe que tiene dos variantes, nepentesina Ia y nepentesina Ib) y II. Las secuencias de la nepentesina y la secuenciación de nucleótidos del ADNc que codifica la nepentesina son conocidas en la técnica, por ejemplo, descritas en Athauda SB y otros, Enzymic and structural characterization of nepenthesin, a unique member of a novel subfamily of aspartic proteinases, Biochem. J. 381:295-306 (2004). Se han descrito secuencias de ARNm de la nepentesina I de varias especies, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (Número de Acceso de GenBank JX494401), Nepenthes gracilis (Número de Acceso de GenBank AB114914) y Nepenthes alata (Número de Acceso de GenBank AB266803). Se han descrito secuencias de ARNm de la nepentesina de varias especies, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (Número de Acceso de GenBank JX494402), Nepenthes gracilis (Número de Acceso de GenBank AB114915) y Zea mays (Número de Acceso de GenBank NM_001147869). Se han descrito secuencias de proteínas de la nepentesina I de varias especies, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (Número de Acceso de GenBank k AFV26024), Nepenthes gracilis (Número de Acceso de GenBank BAD07474), Nepenthes alata (Número de Acceso de GenBank BAF98915) y Zea mays (Secuencia de Referencia NCBI: NP_001150925). Se han descrito secuencias de proteínas de la nepentesina II de varias especies, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (Número de Acceso de GenBank AFV26025), Nepenthes gracilis (Número de Acceso de GenBank BAD07475) y Zea mays (Secuencia de Referencia NCBI: NP_ 001149229). Se ha descrito una proteína nepentesina I putativa para Oryza sativa (Número de Acceso de GenBank BAD38020). Se ha descrito una proteína nepentesina II putativa para Oryza sativa (Número de Acceso de GenBank BAD82000).
La alineación de secuencia de las proteínas nepentesina conocidas (y las proteínas putativas) se muestra en la Figura 9, con las puntuaciones de alineación por pares correspondientes en la Tabla 1. En la Figura 10 se muestra un árbol filogenético que representa los datos. Athauda y col. además, compara las nepentesinas con las proteasas aspárticas típicas relacionadas. Athauda y col. predijo la estructura del esqueleto de la nepentesina Ia basándose en la estructura de la pepsina porcina A (se predijo que la nepentesina Ib y II serían esencialmente las mismas que la nepentesina Ia). Los residuos putativos catalíticos de ácido aspártico se conservaron con base a este análisis.
En algunas modalidades de la descripción, la biosíntesis de nepentesina puede lograrse al transformar una célula con un vector que comprende un ADNc que codifica la nepentesina I, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 1, Número de Acceso de GenBank JX494401, Número de Acceso de GenBank AB114914 o Número de Acceso de GenBank AB266803. En algunas modalidades de la descripción, la biosíntesis de nepentesina puede lograrse al transformar una célula con un vector que comprende una secuencia homologa a un ADNc que codifica la nepentesina
I, cuya secuencia codifica una proteína con actividad de proteasa. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 60 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 70 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 80 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 85 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 90 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 95 % de homología a un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos
aproximadamente 96 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 97 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 98 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 99 % de homología con un ADNc que codifica la nepentesina I.
En algunas modalidades de la descripción, la biosíntesis de nepentesina puede lograrse al transformar una célula con
un vector que comprende un ADNc que codifica la nepentesina II, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos del Número
de Acceso de GenBank JX494402 o del Número de Acceso de GenBank AB114915. En algunas modalidades de la
descripción, la biosíntesis de nepentesina puede lograrse al transformar una célula con un vector que comprende una
secuencia homóloga a un ADNc que codifica la nepentesina II, cuya secuencia codifica una proteína con actividad de
proteasa. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 60 % de homología con un ADNc que codifica la
nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 70 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 80 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 85 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 90 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 95 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 96 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 97 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 98 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 99 % de homología con un ADNc que codifica
la nepentesina II.
La nepentesina sintética tal como la nepentesina I y/o la nepentesina II o un derivado de la misma puede concentrarse
o purificarse de acuerdo con métodos conocidos, tales como aquellos para aislar la nepentesina o un derivado de la
misma del líquido de la planta insectívora.
En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética
comprende al menos 20 % en peso de nepentesina o un derivado de la misma. En algunas modalidades de la
descripción, el producto de proteína aislado comprende al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %,
aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % en peso de nepentesina o un derivado de la misma. En algunas
modalidades de la descripción, el producto de proteína aislado comprende al menos el 99 % en peso de nepentesina
0 un derivado de la misma.
En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende sustancialmente solo nepentesina
I. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende sustancialmente solo
nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de
nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 100:1. En algunas modalidades de la descripción, la
nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente
90:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina
1 a nepentesina II de al menos aproximadamente 70:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina
recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 60:1. En
algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a
nepentesina II de al menos aproximadamente 50:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina
recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 40:1. En
algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a
nepentesina II de al menos aproximadamente 30:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina
recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 20:1. En
algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a
nepentesina II de al menos aproximadamente 10:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina
recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 5:1. En
algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a
nepentesina II de al menos aproximadamente 4:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina
recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 3:1. En
algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a
nepentesina II de al menos aproximadamente 2:1. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina
recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:1. En
algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a
nepentesina II de al menos aproximadamente 1:2. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:3. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:4. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:5. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:10. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:20. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:30. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:40. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:50. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:60. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:70. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:80. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:90. En algunas modalidades de la descripción, la nepentesina recombinante comprende una relación de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:100.
En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende una proteína que es al menos aproximadamente 70 % homóloga a la nepentesina I y retiene la actividad de proteasa. La proteína puede ser al menos aproximadamente el 80% homóloga a la nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente el 85 % homóloga a la nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente el 90 % homóloga a la nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente 95 % homóloga a nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente 96 % homóloga a nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente 97 % homóloga a nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente 98 % homóloga a nepentesina I. La proteína puede ser al menos aproximadamente el 99 % homóloga a la nepentesina I.
En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende una proteína que es al menos aproximadamente 70 % homóloga a la nepentesina II y retiene la actividad de proteasa. La proteína puede ser al menos aproximadamente 80 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 85 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 90 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 95 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 96 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 97 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 98 % homóloga a la nepentesina II. La proteína puede ser al menos aproximadamente 99 % homóloga a la nepentesina II.
En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 10 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 20 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 30 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 40 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 50 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 60 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 70 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente 80 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 90 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con más del 100 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I.
En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 10 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 20 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 30 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente 40 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente 50 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 60 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 70 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente el 80 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con al menos aproximadamente 90 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas modalidades de la descripción, el producto proteico comprende la nepentesina o un derivado de la misma con más de aproximadamente el 100 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II.
III. Ejemplos
A menos que se indique de cualquier otra manera, las abreviaturas usadas en toda la descripción tienen los siguientes significados:
g = gramo
kDa = kiloDalton
kg = kilogramo
l = litro
LC = cromatografía líquida
mg = miligramo
min = minuto
ml = mililitro
mM = milimolar
MS = espectrometría de masas
nM = nanomolar
pM = picomolar
s.d. = desviación estándar
pCi = microcurie
pg microgramo
pL = microlitro
pM = micromolar
pm = micrómetro
°C = grado Celsius
Estos símbolos de una letra tienen el siguiente significado cuando representan aminoácidos:
A = Alanina
R = Arginina
N = Asparagina
D = Ácido aspártico
C = Cisteína
E = Ácido glutámico
Q = Glutamina
G = Glicina
H = Histidina
I = Isoleucina
L = Leucina
K = Lisina
M = Metionina
F = Fenilalanina
P = Prolina
S = Serina
T = Treonina
W = Triptófano
Y = Tirosina
V = Valina
Ejemplo 1
Preparación del Extracto de Nepentesina
Sustancias Químicas
El agua y el acetonitrilo, el HPLC de Burdick y Jackson, se compraron de VWR. El ácido fórmico, Tris, glicina se compraron de Sigma Aldrich.
Cultivo de plantas
Los trasplantes de Nepenthes rafflesiana, Nepenthes ampularia, Nepenthes mirabilis y Nepenthes globosa se compraron de Keehns Carnivores ( http://www.keehnscarnivores.ca ). Estos fueron en macetas con corteza de madera, perlita, turba y humus (40, 35, 10, 5 % respectivamente). Las condiciones de crecimiento implicaron 14 horas de luz por día, 80 % de humedad y temperatura en el intervalo de 23-28 °C con 2 a 3 riegos por semana. Tras la madurez de la planta insectívora, las plantas se alimentaron con una o dos Drosophila por jarra y el fluido de la jarra se cosechó una semana después. Las jarras y sus secreciones se dejaron recuperar durante una semana antes de una segunda ronda de alimentación y extracción.
Preparación del extracto
Se colectó el fluido de la jarra de las cuatro especies de plantas y se combinó. El fluido crudo de la jarra se clarificó primero a través de un filtro de 0,22 pm, luego se concentró de 80 a 100 veces mediante el uso de un filtro con valor corte de 10 kDa de peso molecular Amicon Ultra centrifugal (ambos de Millipore). Antes de su uso en digestiones, el concentrado se activó con ácido con 100 mM de Glicina HCl (pH 2,5) durante 3 horas, luego se lavó 3 veces con 100 mM de Glicina HCl (pH 2,5) en el dispositivo de filtración, mediante el uso de un volumen de fluido 10X para cada lavado). El aislado final se volvió a diluir a una concentración de 11X con base en el muestreo original del fluido de la jarra.
Caracterización del extracto del fluido de la Jarra
Las secreciones fluidas de la planta insectívora se concentraron y las enzimas de digestión se activaron por reducción de pH (pH 2,5). El impacto del proceso de enriquecimiento y la activación en el proteoma del fluido se determinó mediante el uso de métodos proteómicos. Primero, para confirmar la presencia de la enzima nepentesina, el concentrado inactivo se separó por SDS-PAGE. Siete zonas de gel contiguas con tinción muy débil de coomassie se digirieron con tripsina y se analizaron mediante nanoLCMS/MS mediante el uso de métodos estándar. No se espera que sea un catálogo completo del proteoma fluido activado, pero el análisis confirmó la presencia de la proteasa aspártica nepentesina I/II, así como también una glucanasa, quitinasa, carboxipeptidasa y peroxidasa de origen vegetal, más niveles modestos de Drosophila y contaminación bacteriana. La baja complejidad del proteoma del fluido es consistente con análisis recientes, Hatano N, Hamada T (2012) Proteomic analysis of secreted protein induced by a component of prey in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata. Journal of Proteomics 3;75(15):4844-52 (Epub 15 de Junio de 2012), pero la nepentesina-I se encontró distribuida en un intervalo de masas mucho más amplio en este análisis (40-70 kDa). El fluido activado con ácido se procesó y analizó de manera similar. El proceso de activación redujo el rendimiento proteico global y también pareció simplificar la composición. Además de nepentesina-I, solo se evidencia una contaminación menor de queratina y actina. Estos análisis apuntan a la baja complejidad del fluido enriquecido, donde la nepentesina es el componente principal. La concentración de proteína total del fluido activado y enriquecido 80X se midió mediante un ensayo de BCA para ser 22 ng/pL. Este valor es consistente con un estudio anterior que describe el enriquecimiento del fluido. Tokes ZA, y otros, Digestive Enzymes Secreted by Carnivorous Plant Nepenthes-Macferlanei-L. Planta 119(1):39-46 (1974).
Ejemplo 2
Mapeo de las Digestiones de Proteínas por Extracto de Pepsina y Nepentesina
Mapeo de la digestión de nepentesina por espectrometría de masas
El extracto de nepentesina se preparó como en el Ejemplo 1.
Las digestiones de proteínas se llevaron a cabo en solución mediante el uso de un sistema de muestreo automático y dispensador LEAP HTX-PAL diseñado para aplicaciones de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX), y los datos se colectaron con un espectrómetro de masas AB Sciex Triple-TOF 5600 QqTOF. Los péptidos se identificaron mediante el uso de Mascot (v2.3) a partir de datos de MS/MS. Brevemente, se mezclaron 8 pL de proteína 8 pM (dominios XCTCC4, XLF, Ligasa IV-tándem BRCT, PNK, mioglobina o citocromo C) con 10 pL de fluido concentrado 11x durante 2 minutos a 10 °C. La mioglobina y el citocromo C se compraron de Sigma. Después de la dilución a una concentración de sustrato de 1 pM, se inyectaron 15 pL en el sistema de LC de fase reversa frío (4 °C) conectado al espectrómetro de masas. Los péptidos quedaron atrapados en una identificación de 5 cm y 200 pm i.d. Columna monolítica Onyx C18 (Phenomenex Inc.) y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo del 3 % al 40 % en 10 minutos. Los péptidos detectados en estos análisis se seleccionaron para la fragmentación por CID en adquisiciones múltiples dependientes de información de espectros MS/MS, similar a la estrategia de fraccionamiento en fase gaseosa. Blonder J, y otros, Proteomic investigation of natural killer cell microsomes using gas-phase fractionation by mass spectrometry.
Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1698(1):87-95 (2004). Se buscaron espectros frente a una base de datos en miniatura que contenía las secuencias para las seis proteínas. Los resultados de la secuencia fueron verificados manualmente.
Resultados
Se digirieron una serie de proteínas con el fluido enriquecido bajo condiciones adecuadas para experimentos HDX-MS. La especificidad de la digestión del concentrado se caracterizó en las posiciones PI y P1' (Figura 1), para respaldar una comparación con estudios similares aplicados a la pepsina. Hamuro Y, y otros, Specificity of immobilized porcine pepsin in H/D exchange compatible conditions. Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046 (2008). En este ejemplo, la relación enzima/sustrato fue 1:85 con base en el supuesto de que toda la proteína medida en el fluido enriquecido es la nepentesina, a pesar de que algunas proteínas contaminantes estaban obviamente presentes.
Los datos de la nepentesina representan una evaluación de 1612 residuos y, aunque no son tan extensos como los datos de correspondientes de la pepsina (13766 residuos), la diversidad de secuencias es suficientemente alta en el conjunto de proteínas para garantizar una comparación a nivel de las posiciones PI y P1'. La mayor especificidad para la pepsina parece estar en la posición PI. Presenta una escisión de alta eficiencia para los residuos hidrofóbicos F, L y M, pero la escisión después de P, H, K y R está esencialmente prohibida. La nepentesina se escinde después de la mayoría de los residuos con la excepción de G, S, T, V, I y W. Es compatible con una alta tasa de escisión después de los residuos esperados de pepsina P1, pero también en los residuos prohibidos en la digestión de pepsina, especialmente K, R y P En la posición P1', la pepsina muestra una preferencia por los residuos hidrofóbicos en general, incluido cualquier residuo con aromaticidad. Por el contrario, la nepentesina demuestra poca selectividad en la posición P1', excepto quizás contra G, P y H. En general, la nepentesina demuestra una especificidad significativamente relajada en la posición PI en relación con la pepsina, y proporciona una indicación de muy alta eficiencia.
Ejemplo 3
Mapeo de las Digestiones de la Proteína Multidominio, XRCC4, por Extracto de Pepsina y Nepentesina
Intercambio de HD de un complejo involucrado en la reparación de daños en el ADN
El extracto de nepentesina se preparó como en el Ejemplo 1.
Las soluciones de reserva de XRCC4 (1-200) con BRCT y XRCC4 (longitud total) con BRCT se diluyeron en tampón (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5) a concentraciones equimolares (10 pM) y se incubaron a 4 °C durante un mínimo de 30 min para promover la formación del complejo. Las muestras se mantuvieron a 4 °C hasta el análisis HDX. Las alícuotas se deuteraron durante 2 min a 20 °C con la adición de D2O (25 % v/v). Luego se digirieron alícuotas de dos maneras. En la primera estrategia de digestión, la deuteración de proteínas se inactivó al agregar la muestra para enfriar a 100 mM de glicina-HCl (pH 2,5), y la solución de proteína inactivada se inyectó en un microrreactor de pepsina. Este microrreactor se instaló en el sistema HTX-PAL entre la válvula del inyector y la columna C18. Las proteínas digeridas se capturaron en la columna capilar monolítica C18 y se eluyeron en el espectrómetro de masas. Todos los elementos fluídicos, incluido el microrreactor, se enfriaron a 4 °C para minimizar el intercambio de deuterio durante el tiempo de análisis (<15 min). En la segunda estrategia de digestión, una cantidad equivalente de proteína deuterada fue apagada y digerida simultáneamente con 3 o 5 pL de fluido nephentes 11X durante 3 o 5 minutos, respectivamente, a 10 °C. La muestra se inyectó en el sistema LC frío conectado al espectrómetro de masas.
Se realizaron mediciones de desplazamiento de masa por réplicas (4 o más) y se hizo referencia a ellas para controlar los estados proteicos: XRCC4 libre (1-200), XRCC4 libre (longitud total) y LigIV-BRCT libre. El nivel promedio de deuterio para cada péptido se determinó mediante el uso de Mass Spec Studio (manuscrito en preparación), que es una reconstrucción de Hydra v1.5. Slysz GW, y otros, Hydra: software for tailored processing of H/D exchange data from MS or tandem MS analyses. Bmc Bioinformatics 10 (2009). Las perturbaciones en los cambios de masa se consideraron significativas si (a) pasaron una prueba t de dos colas (p<0,05) mediante el uso de las desviaciones estándar agrupadas de los análisis de cada estado, (b) pasaron un análisis de distribución para evitar la superposición espectral y (c) excedieron un valor de cambio de umbral (± 2 s.d.) con base en una medición del ruido de cambio y asumiendo su distribución normal Bennett MJ, y otros, Discovery and Characterization of the Laulimalide-Microtubule Binding Mode by Mass Shift Perturbation Mapping. Chemistry & Biology 17(7):725-734 (2010).
Resultados
Para determinar si la especificidad relajada se traduce en una mejora en el mapeo de las secuencias para aplicaciones HDX-MS, se perfiló XRCC4 de longitud completa, una proteína que contiene un dominio globular y un tallo helicoidal extendido, y un C-terminal largo desordenado. Hammel M, y otros, XLF Regulates Filament Architecture of the XRCC4. Ligase IV Complex. Structure 18(11):1431-1442 (2010); y Junop MS, y otros, Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining. Embo J 19(22):5962-5970 (2000). Tales proteínas multidominio son difíciles de abarcar en un solo protocolo de digestión y, en particular, las regiones intrínsecamente desordenadas tienden a digerir mal con pepsina, ya que están relativamente agotadas en residuos hidrofóbicos y enriquecidas en prolina y residuos cargados. Dunker AK, y otros. Intrinsically disordered protein. Journal of Molecular Graphics & Modelling 19(1):26-59 (2001). Los mapas de la pepsina y la nepentesina para esta proteína se muestran en la Figura 2. En esta comparación, se realizó un mapeo exhaustivo para ambas enzimas, mediante el uso de un intervalo de diferentes cantidades de proteasas, y experimentos recursivos de MS/MS. La nepentesina proporciona una cobertura superior de la proteína de longitud completa: 357 péptidos para la nepentesina (barras de color gris oscuro) en comparación con 187 para la pepsina (barras de color gris claro). (La longitud promedio del péptido de 11 residuos fue la misma para ambas enzimas). Ambas enzimas representan las regiones globular y del tallo con una gran cantidad de péptidos superpuestos, pero la complementariedad proporcionada por la nepentesina es evidente. Por ejemplo, la nepentesina ofrece una cobertura considerablemente más profunda de una región de lámina p en el dominio globular (residuos 1 -30). La región C-terminal desordenada también está cubierta en mayor medida y a un nivel de redundancia considerablemente más alto. Cada residuo en esta región de cola desordenada recibe una cobertura de 16X mediante el uso de la nepentesina y solo una cobertura de 4,7X con la pepsina.
La existencia de cualquier sesgo en la detección de los péptidos se explora al seleccionar la puntuación promedio de búsqueda como la métrica (Figura 3). El enfoque enfatiza la confianza en la identificación de la secuencia como el medio principal por el cual se definen los mapas de secuencia. Un delineador es R. Las puntuaciones más altas para los péptidos que terminan en R probablemente reflejan una combinación de mayor intensidad promedio de péptidos y mejor fragmentación, lo cual es consistente con lo que sabemos de la proteómica ascendente basada en tripsina. Warwood S, y col. Guanidination chemistry for qualitative and quantitative proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry 20(21):3245-3256 (2006).
Ejemplo 4
Digestión de XRCC4 con Varias Relaciones de Enzima a Sustrato
La eficiencia de la enzima se examinó con mayor detalle. En la Figura 4 se muestra el grado en que el mapa de masa peptídica podría variarse o ajustarse simplemente al alterar la relación enzima/sustrato. La carga de nepentesina se varió en un intervalo de 50 veces para las digestiones en solución. Para el experimento con la pepsina, se usó pepsina inmovilizada en un formato de suspensión en lugar de pepsina libre para evitar una extensa autólisis de la pepsina. La carga enzimática se varió en un intervalo de 8 veces; cantidades menores condujeron a intensidades peptídicas pobres y cantidades mayores no tuvieron efecto en el mapa. Se descubrió que la nepentesina generaba un perfil de autólisis muy bajo incluso en las cargas más altas. Se usó un cromatograma de iones peptídicos agregados (PIC) como medida de la digestión efectiva. La comparación de las distribuciones relativamente similares encontradas en 0,38:1 (nepentesina: sustrato) con 520:1 (pepsina:sustrato) representa una mejora notable de 1400 veces en la eficiencia de la nepentesina sobre la pepsina en aplicaciones similares a HDX.
La digestión de la nepentesina podría ajustarse más fácilmente de fragmentos grandes a pequeños al variar la carga enzimática y generar una representación variable de XRCC4. Esto se demuestra en la Figura 4A por la transición en el PIC de tiempos de retención largos a baja carga a tiempos de retención cortos a alta carga. Esta transición se correlacionó con la longitud media del péptido para los péptidos más abundantes que cambian de >12 a baja carga enzimática a 10 a alta carga enzimática. Por el contrario, la carga variable de pepsina no alteró significativamente el PIC o la longitud promedio del péptido (Figura 4B). Un microrreactor de pepsina de flujo forzado puede mejorar la sintonización, pero probablemente no generará fragmentos más pequeños.
Ejemplo 5
Digestión de Gliadina por Extracto de Nepentesina
Las digestiones de gliadina por la nepentesina se realizaron en solución mediante el uso de un automuestreador LEAP HTX-PAL y un sistema de dispensación diseñado para aplicaciones de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX). Los datos se colectaron mediante el uso de un espectrómetro de masas AB Sciex Triple-TOF 5600 QqTOF. Los péptidos se identificaron mediante el uso de Mascot (v2.3) a partir de datos de MS/MS. En resumen, se mezclaron 12 pmoles de gliadina cruda (comprada en Sigma Aldrich) con 2 pL de extracto concentrado 100x, producido como se describió en el Ejemplo 1. Después de la digestión, se inyectó todo el volumen en un sistema LC de fase reversa conectado al espectrómetro de masas. Los péptidos quedaron atrapados en una identificación de 7 cm y 150 pm i.d. Columna Magic C18 y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo del 10 % al 40 % de 10 o 30 minutos. Los péptidos detectados en estos análisis se seleccionaron para la fragmentación de CID en adquisiciones múltiples dependientes de información de espectros MS/MS. Se buscaron espectros en una base de datos en miniatura que contenía las secuencias de todas las proteínas gliadina de trigo (a, p, y, w) identificadas más la glutenina de bajo y alto peso molecular. La Figura 5 muestra la longitud promedio de todos los péptidos identificados a partir de la digestión con la nepentesina de la gliadina del trigo, mediante el uso de LC-MS/MS, después de 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos a 37 °C. Se usó un límite de confianza del 95 % (p<0,05) en las puntuaciones para eliminar la identificación de falsos positivos. La desviación estándar relativa de la longitud del péptido se muestra en la figura insertada.
La Figura 6 muestra el número de péptidos identificados por LC-MS/MS después de una digestión de 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos a 37 °C, agrupados por longitud. Datos como en la Figura 5.
La Figura 7 muestra los mismos datos que la Figura 5, como una probabilidad de obtener una cierta longitud después de una digestión de 10, 60, 120, 360 u 810 minutos a 37 °C.
Ejemplo 6
Purificación del Extracto de Nepentesina
Purificación del extracto
La pepstatina inmovilizada con sefarosa en una columna ID de 50 x 2 cm se equilibró en 20 mM de Glicina-HCl, pH 2,5-3. El fluido de la jarra filtrado (preparado como se describió en el Ejemplo 1) se sometió a un ciclo dos veces a través de la columna, y la columna se lavó con 100 ml de tampón de equilibrio (20 mM de glicina HCl, pH 2,5). La columna se eluyó con bicarbonato de amonio 100 mM, pH 8,7 y se colectaron las fracciones. Para preservar la actividad enzimática máxima, el pH se redujo a 4 justo después de la recolección de la fracción con glicina HCl 2 M, pH 2,5. La actividad se verificó mediante el uso de un ensayo de digestión, y las fracciones más activas se combinaron y concentraron hasta aproximadamente 80x, con base al volumen de fluido original.
Ejemplo 7
Nepentesina I Recombinante
El gen para la nepentesina I (véase la SEQ ID NO: 1; que codifica los residuos de aminoácidos 20-413, de N. gracilis, sin la secuencia señal de la planta) se preparó a partir del ADNc de la nepentesina I, y se colocó entre los sitios de restricción Ndel y HindIII. Esta secuencia se clonó en el pET21a, mediante el uso de la ADN ligasa T4 (1 U) (New England Bio, NEB), el tampón de la ADN ligasa T4 (NEB), ATP (0,5 mM) (NEB), 0,5 pg de vector pET21a y 2 pg del ADNc de la nepentesina I. Esto se incubó a 18 °C durante 4 horas. La mezcla de ligación (5 pL) se añadió a 200 pL de células competentes NovaBlue y se incubó en hielo durante 15 minutos. Las células se transformaron por choque térmico (45 segundos a 42 °C, luego inmediatamente en hielo, con 1 ml de medio LB) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, y se sembraron en placa con antibióticos (tetraciclina y ampicilina). Después de confirmar la presencia del gen en varias colonias blancas, se eligió una colonia representativa para maxiprep. El plásmido recombinante resultante pET21a/R.NepI se transformó en E. coli C41 por choque térmico como anteriormente, para expresión bajo inducción por IPTG. Aquí, las células se hicieron crecer hasta un OD660 de 0,6 y se indujeron con 0,1 mM de IPTG durante cuatro horas a 37 °C. La proteína expresada fue a cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión se aislaron de la siguiente manera. Se centrifugaron las células, se añadió tampón de lisis de sacarosa (25 % sacarosa, 50 mM de TrisCl pH 7,4, 1 mM de EDTA, 1 mM de NaN3, e inhibidores de proteasas), y las células se sometieron a cuatro rondas de congelación/descongelación y sonicación. Esto fue seguido por la adición de ADNasa y ARNasa durante 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. La preparación se centrifugó (~15 min. a 5000 x g) para sedimentar los cuerpos de inclusión y los fragmentos de membrana. Este sedimento se resuspendió en tampón Tritón (50 mM de TrisCl pH 7,4, 10 mM de NaCI, 1 mM de p-mercaptoetanol, 1 mM de NaN3, 0,5 % de Tritón X100 inhibidores de proteasas) y sonicación realizada en hielo. Esto se centrifugó una vez más, para sedimentar los cuerpos de inclusión, y el sedimento se lavó dos veces sobre hielo (con mezcla y sonicación) en un tampón libre de Tritón (50 mM de TrisCl, pH 7,4, 10 mM de NaCI, 1 mM de p-mercaptoetanol, 1 mM de NaN3, inhibidores de proteasas).
El sedimento de proteínas se sometió luego a plegamiento de nuevo. Se suspendió 1 g de cuerpos de inclusión en 1 I de 50 mM de CAPS pH 10,5, 8 M de urea, 1 mM de EDTA, 1 mM de glicina, 500 mM de NaCI, 300 mM de pmercaptoetanol y se agitó durante 1 hora. La suspensión se dializó contra 50 mM de Tris, pH 11, dos veces durante 1 hora a la vez, seguido de un día de diálisis contra 50 mM de Tris, pH 7,5, y finalmente, diálisis contra tampón fosfato con 300 mM de NaCl, pH 7,0.
La solución se centrifugó a alta velocidad (10 000 x g durante 15 minutos) para eliminar cualquier proteína no replegada, y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,22 pm. La nepentesina I se activó a pH 2,5 (glicina-HCl) durante la noche a 4 °C. Los rendimientos varían de 10 a 100 mg de proteína plegada activada, que comienzan desde 1 l de cultivo celular.
Ejemplo 8
Nepentesina II Recombinante
El ADNc de la nepentesina II (de N. gracilis, sin la secuencia señal de la planta) se usó para preparar el ADNc de la nepentesina II. Esta secuencia se clonó en el pET21a entre los sitios de restricción Ndel y HindIII, mediante el uso de la ADN ligasa T4 (1 U) (New England Bio, NEB), el tampón de ADN ligasa T4 (NEB), ATP (0,5 mM) (NEB), 0,5 pg del vector pET21a y 2 pg del ADNc de la nepentesina II. Esto se incubó a 18 °C durante 4 horas. La mezcla de ligación (5 pL) se añadió a 200 pL de células competentes NovaBlue y se incubó en hielo durante 15 minutos. Las células se transformaron por choque térmico (45 segundos a 42 °C, luego inmediatamente en hielo, con 1 ml de medio LB) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, y se sembraron en placa con antibióticos (tetraciclina y ampicilina). Después de confirmar la presencia del gen en varias colonias blancas, se eligió una colonia representativa para maxiprep. El plásmido recombinante resultante pET21a/R.NepI se transformó en E. coli C41 por choque térmico como anteriormente, para expresión bajo inducción por IPTG. Aquí, las células se hicieron crecer hasta un OD660 de 0,6 y se indujeron con 0,1 mM de IPTG durante cuatro horas a 37 °C. La proteína expresada fue a cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión se aislaron de la siguiente manera. Se centrifugaron las células, se añadió tampón de lisis de sacarosa (25 % de sacarosa, 50 mM de TrisCl pH 7,4, 1 mM de EDTA, 1 mM de NaN3, e inhibidores de proteasas), y las células se sometieron a cuatro rondas de congelación/descongelación y sonicación. Esto fue seguido por la adición de ADNasa y ARNasa durante 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. La preparación se centrifugó (~15 min. a 5000 x g) para sedimentar los cuerpos de inclusión y los fragmentos de membrana. Este sedimento se resuspendió en tampón Tritón (50 mM de TrisCl pH 7,4, 10 mM de NaCl, 1 mM de p-mercaptoetanol, 1 mM de NaN3, 0,5 % de Tritón X 100 inhibidores de proteasas) y la sonicación se realizó en hielo. Esto se centrifugó una vez más, para sedimentar los cuerpos de inclusión, y el sedimento se lavó dos veces sobre hielo (con mezcla y sonicación) en un tampón libre de Tritón (50 mM de TrisCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, 1 mM de p-mercaptoetanol, 1 mM de NaN3, inhibidores de proteasas).
El sedimento de proteínas se sometió luego a plegamiento de nuevo. Se suspendió 1 g de cuerpos de inclusión en 1 l de 50 mM de CAPS pH 10,5, 8 M de urea, 1 mM de EDTA, 1 mM de glicina, 500 mM de NaCl, 300 mM de pmercaptoetanol y se agitó durante 1 hora. La suspensión se dializó contra 50 mM de Tris pH 11 dos veces durante 1 hora a la vez, seguido de un día de diálisis contra 50 mM de Tris pH 7,5, y finalmente, diálisis contra tampón fosfato con 300 mM de NaCl, pH 7,0.
La solución se centrifugó a alta velocidad (10 000 x g durante 15 minutos) para eliminar cualquier proteína no replegada, y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,22 pm. La nepentesina II se activó a pH 2,5 (glicina-HCl) durante la noche a 4 °C. Los rendimientos varían de 10 a 100 mg de proteína plegada activada, que comienzan desde 1 l de cultivo celular.
Ejemplo 9
Mapeo de las Digestiones de Gliadina por la Nepentesina
El extracto de nepentesina se preparó como se describió en el Ejemplo 1. El extracto de nepentesina purificado se preparó como se describió en el Ejemplo 6. La nepentesina recombinante I se preparó como se describió en el Ejemplo 7.
La digestión con gliadina se realizó como se describió en el Ejemplo 5, excepto que la relación de sustrato a enzima fue de aproximadamente 1000:1. La gliadina se digirió a 37 °C durante 2 horas con extracto de nepentesina, extracto de nepentesina purificado o nepentesina I recombinante.
La gliadina es una clase de proteínas que se encuentran en el trigo y otros granos de cereales. Las gliadinas están altamente enriquecidas en residuos de prolina y glutamina. Se determinó que la nepentesina I recombinante digiere la proteína gliadina de manera muy efectiva a pH 2-3. La preferencia de escisión por PI de la nepentesina I recombinante es muy similar a la del extracto fluido concentrado, así como también a la fracción purificada del extracto (Figura 8A). Sorprendentemente, el extracto mostró una mayor preferencia por la glutamina que el extracto purificado o la nepentesina I recombinante.
La preferencia de escisión por PI de la nepentesina I recombinante es muy similar a la del extracto fluido concentrado, así como también a la fracción purificada del extracto (Figura 8B). Sorprendentemente, el extracto mostró una mayor preferencia por la prolina que el extracto purificado o la nepentesina I recombinante.
El extracto contiene tanto nepentesina I como II, pero la estrategia de purificación recupera la nepentesina II mucho menos activa que la nepentesina I. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que la escisión aumentada en la posición P1 de glutamina y la posición P1' de prolina por el extracto se debe a la nepentesina II y/o a la sinergia entre la nepentesina I y la nepentesina II.
Ejemplo 10
Comparación de proteínas nepentesina
Las secuencias conocidas y putativas de proteínas de las proteínas nepentesina se alinearon mediante el uso de Clustal 2.1 Multiple Sequence Alignment. Las secuencias de la nepentesina I fueron: Nepenthes mirabilis (Número de Acceso de GenBank AFV26024), Nepenthes gracilis (Número de Acceso de GenBank BAD07474), Nepenthes alata (Número de Acceso de GenBank BAF98915), Zea mays (Secuencia de Referencia de NCBI: NP_001150925) y Oryza sativa (Número de Acceso de GenBank BAD38020). Las secuencias de la nepentesina II fueron: Nepenthes mirabilis (Número de Acceso de GenBank AFV26025), Nepenthes gracilis (Número de Acceso de GenBank BAD07475), Zea mays (Secuencia de Referencia de NCBI: NP_001149229) y Oryza sativa (Número de Acceso de GenBank BAD82000). La alineación resultante se muestra en la Figura 9. La Figura 10 muestra un árbol filogenético que indica la relación de las proteínas nepentesina entre diferentes especies. La Tabla 1 muestra las puntuaciones de la alineación por pares entre cada secuencia.
Tabla 1
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para el uso en el tratamiento o inhibición de la intolerancia al gluten en donde dicha composición comprende la nepentesina recombinante seleccionada de nepentesina I recombinante, nepentesina II recombinante, una sal de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde dicha nepentesina recombinante se administra en dosis de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal por día.
3. La composición para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha nepentesina recombinante se administra en dosis de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 o 1000 mg/kg de peso corporal por día.
4. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se administra con otro agente seleccionado de: un inhibidor de la transglutaminasa tisular, un agente antiinflamatorio, un antagonista del receptor de leucotrienos, un inhibidor de la COX-2, un inhibidor de la MAP quinasa p38, un agente estabilizador de mastocitos, un agente antiulcerosos, un agente antialérgico, un inhibidor de transglutaminasa 2 (TG2), un agente anti-TNF-a y un antibiótico.
5. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se administra con otra enzima seleccionada de una proteasa gástrica, una proteasa aspártica y una prolil endopeptidasa, dipeptidil peptidasa IV (DPP IV), dipeptidil carboxipeptidasa (DCP) y cisteína proteinasa B.
6. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha intolerancia al gluten da como resultado enfermedad celíaca, alergia al trigo, sensibilidad al gluten y/o dermatitis herpetiforme.
7. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la nepentesina recombinante es una mezcla de nepentesina I y nepentesina II recombinantes.
8. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la nepentesina recombinante es nepentesina recombinante I.
9. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la nepentesina recombinante es nepentesina II recombinante.
10. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la administración de dicha composición es por administración oral.
11. La composición para el uso de la reivindicación 10, en donde dicha composición se administra antes de la ingestión de un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten; con la ingestión de un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten; o después de la ingestión de un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten.
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