ES2815540T3 - Proteínas de fusión de FGF21 de acción prolongada y composición farmacéutica que comprende las mismas - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que comprende una proteína mutante del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) y una región Fc de una inmunoglobulina, en donde la proteína mutante FGF21 comprende la siguiente mutación: (1) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 98 a 101 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de EIRP (SEQ ID NO: 42).
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión de FGF21 de acción prolongada y composición farmacéutica que comprende las mismas Campo técnico
La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una proteína mutante del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) con duración in vivo, estabilidad proteica y actividad farmacológica y una composición farmacéutica que comprende las mismas.
Antecedentes de la técnica
El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21), sintetizado en el hígado, es una hormona conocida por desempeñar un papel importante en la homeostasis de la glucosa y los lípidos. FGF21 exhibe acciones farmacológicas en el hígado, adipocitos, células p del páncreas, hipotálamo en el cerebro y los tejidos musculares, donde se expresan tanto un receptor específico de FGF21, es decir, el receptor de FGF, como el complejo p-klotho. Se ha informado que en modelos murinos y primates no humanos de diversas enfermedades diabéticas y metabólicas, FGF21 puede reducir los niveles de glucosa en sangre de una manera independiente de la insulina, reducir el peso corporal y reducir las concentraciones de triglicéridos y lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la sangre. De forma adicional, debido a su efecto de mejorar la sensibilidad a la insulina, FGF21 tiene potencial de desarrollo como un nuevo agente terapéutico para la diabetes y la obesidad (véase el documento WO2003/011213).
En consecuencia, para desarrollar un nuevo fármaco antidiabético basado en FGF21, se han hecho intentos para mejorar su actividad biológica y su estabilidad in vivo mediante la construcción de mutantes de FGF21 basados en la secuencia de FGF21 de tipo silvestre a través de sustitución, inserción y deleción de algunos aminoácidos (véase el documento WO2010/065439). Sin embargo, como FGF21 tiene una semivida muy corta, ha demostrado ser problemático si se usa directamente como agente bioterapéutico (Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635). La semivida in vivo de FGF21 es de 1 a 2 horas en ratones y de 2,5 a 3 horas en monos. Por lo tanto, para que FGF21 se use en su forma actual como agente terapéutico para la diabetes, se requiere la administración diaria.
Se han informado diversos enfoques para intentar aumentar la semivida in vivo de las proteínas recombinantes FGF21. Un ejemplo es enlazar polietilenglicol (PEG), es decir, un material polimérico, a FGF21 para aumentar su peso molecular, inhibiendo de esta manera la excreción renal y aumentando el tiempo de retención in vivo (véase el documento WO2012/066075). Otro enfoque intenta mejorar la semivida fusionándolo con un ácido graso, que se une a la albúmina humana (véase el documento WO2012/010553). Un ejemplo adicional intenta aumentar la semivida mientras se mantiene una actividad farmacológica equivalente a la del FGF21 de tipo silvestre mediante la generación de un anticuerpo agonista, que se une específicamente al receptor de FGF humano solo o como un complejo con pklotho (véase el documento WO2012/170438). En otro ejemplo, la semivida se mejoró mediante la preparación de proteínas de fusión de acción prolongada, en donde una región Fc de IgG se fusiona con una molécula de FGF21 (véase el documento WO2013/188181).
Entre las diversas tecnologías disponibles para crear fármacos de acción prolongada, la tecnología de fusión Fc se usa ampliamente porque tiene menos de las desventajas que se ven con otros enfoques, tales como inducir una respuesta inmunitaria o toxicidad mientras aumenta la semivida in vivo. Para el desarrollo de una proteína FGF21 fusionada con Fc como fármaco terapéutico de acción prolongada, deben satisfacerse las siguientes condiciones. Primero, debe minimizarse la disminución de la actividad in vitro provocada por la fusión. Tanto el extremo N como el extremo C de FGF21 están implicados en la actividad de FGF21. En este sentido, se sabe que las actividades de las proteínas de fusión de FGF21 varían enormemente dependiendo de la ubicación de la fusión. En consecuencia, las actividades de las proteínas de fusión FGF21 fusionadas con Fc, en donde se introducen mutaciones en FGF21, pueden alterarse dependiendo de la presencia/ausencia o la ubicación de la fusión. Segundo, un perfil farmacocinético que permita la administración en un intervalo de una vez por semana en seres humanos debe realizarse mediante el aumento de la semivida in vivo por la fusión. Tercero, considerando que puede esperarse inmunogenicidad en la mayoría de los pacientes después de la administración de biofármacos, debe minimizarse el riesgo de inmunogenicidad debido a un enlazador de fusión o una mutación. Cuarto, no debe haber problemas de estabilidad derivados de la posición de la fusión o la introducción de la mutación. Quinto, dado que pueden producirse respuestas inmunitarias no deseadas dependiendo de los isotipos de inmunoglobulina fusionada, es necesaria una solución para prevenir tales respuestas.
Ya se ha informado de un intento de desarrollar una proteína de fusión de acción prolongada enlazando la región Fc de una inmunoglobulina G (IgG) a una molécula de FGF21 (véase el documento WO 2013/188181). En el caso de una estructura Fc-FGF21, donde el Fc se fusiona con el extremo N del FGF21 de tipo silvestre, mientras que no hay una diferencia clara en la actividad in vitro en comparación con la del FGF21 de tipo silvestre, se sabe que la semivida es muy corta debido a la degradación de la proteína in vivo. Para abordar este problema, ha habido un intento de mejorar la semivida in vivo mediante la introducción de varias mutaciones en ubicaciones de sitios específicos de FGF21 para
resistir la degradación de proteínas. Sin embargo, el riesgo de inmunogenicidad puede aumentar con la introducción de múltiples mutaciones. Por el contrario, en el caso de una estructura FGF21-Fc, donde el Fc se fusiona con el extremo C de la molécula FGF21, se sabe que hay una disminución significativa en la actividad causada por la fusión en este sitio cuando se compara con la estructura Fc-FGF21.
Los presentes inventores se han esforzado por mejorar la actividad fisiológica y la estabilidad de FGF21 y han descubierto que la efectividad farmacológica de FGF21 puede mejorarse y la exposición y la semivida in vivo de FGF21 pueden aumentarse sin comprometer la actividad in vitro cuando se introduce una mutación en una ubicación particular de FGF21 y la región Fc de inmunoglobulina se enlaza a ella, completando de esta forma la presente invención. Divulgación de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de fusión que comprende una proteína mutante FGF21 con duración in vivo, estabilidad proteica y efectividad farmacológica mejoradas.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión, un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico y una célula hospedadora que comprende el vector de expresión.
Solución del problema
La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína mutante FGF21 y una región Fc de una inmunoglobulina, en donde la proteína mutante FGF21 comprende la siguiente mutación:
(1) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 98 a 101 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de EIRP (SEQ ID NO: 42).
Preferentemente, la proteína de fusión comprende además la siguiente mutación: una sustitución del aminoácido en la posición 180 del extremo N de la proteína FGF21 de tipo silvestre con el aminoácido E.
Más preferentemente, la proteína de fusión comprende además al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en las siguientes mutaciones:
(2) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de TGLEAV (SEQ ID NO: 43);
(3) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de TGLEAN (SEQ ID NO: 44);
(4) una sustitución de un aminoácido en la posición 170 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido N; y
(5) una sustitución de un aminoácido en la posición 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido N.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión para tratar la diabetes, obesidad, dislipidemia, síndrome metabólico, esteatosis hepática no alcohólica o esteatohepatitis no alcohólica.
Además, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión, un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico y una célula hospedadora que comprende el vector de expresión.
Efectos ventajosos de la invención
La proteína de fusión de la presente invención, preparada enlazando una región Fc de una inmunoglobulina humana a una proteína mutante FGF21, tiene duración in vivo, estabilidad proteica y efectividad farmacológica mejoradas. Además, una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión como un principio activo puede usarse como agente terapéutico para diabetes, obesidad, dislipidemia, síndrome metabólico, esteatosis hepática no alcohólica o esteatohepatitis no alcohólica. En particular, la composición farmacéutica de la presente invención tiene la ventaja de un intervalo de administración prolongado debido a la estabilidad aumentada in vivo de la proteína de fusión FGF21 en comparación con la de la composición farmacéutica convencional que comprende una proteína FGF21.
Breve descripción de los dibujos
Las FIGURAS 1A a 1C son gráficos que muestran los resultados de la medición de actividades in vitro de proteínas de fusión que incluyen proteínas mutantes FGF21 (en lo sucesivo en el presente documento, "proteína de fusión
mutante FGF21") mediante el uso de una línea celular HEK293 en la cual se sobreexpresa p-klotho humana. Ninguna variante de la proteína de fusión mutante de FGF21 mostró una disminución significativa en la actividad debido a la introducción de mutaciones.
Las FIGURAS 2A y 2B son gráficos que muestran los resultados de la medición de actividades in vitro de las proteínas de fusión mutantes FGF21 que dependen de enlazadores que conectan el extremo N de FGF21 a una región Fc usando la línea celular HEK293 en la cual se sobreexpresa p-klotho humana. Ninguna variante de la proteína de fusión mutante FGF21 mostró una disminución significativa en la actividad, aunque se observaron ligeras diferencias en términos de actividad dependiendo de la secuencia del enlazador.
La FIGURA 3 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de actividades in vitro de RGE (Amgen), Fc-FGF21 (Lilly) y DFD1 usando la línea celular HEK293 en la cual se sobreexpresa p-klotho humana. DFD1 y RGE (Amgen) tuvieron actividades similares, mientras que Fc-FGF21 (Lilly) tuvo una actividad in vitro dos veces mayor que las otras proteínas.
La FIGURA 4 muestra gráficos que comparan la estabilidad de DFD4 con la de DFD13 para confirmar el efecto de la mutación EIRP (en FGF21) en la estabilidad de la proteína de fusión. Se confirmó que DFD13 tenía una tasa más baja de agregados de alto peso molecular (HMW %) en la fase inicial y en un punto de tiempo de más de 2 semanas en comparación con DFD4, lo que indica que la introducción de la mutación EIRP mejora la estabilidad de la proteína de fusión mutante FGF21, reduciendo de esta manera el % de HMW significativamente.
La FIGURA 5 es un gráfico que muestra la concentración de cada proteína en la sangre durante 96 horas después de la administración subcutánea de proteínas de fusión mutantes FGF21. Los datos se indican como valores de media y desviación estándar.
La FIGURA 6 es un gráfico que muestra los niveles de glucosa en sangre en un modelo de ratón ob/ob después de una única inyección subcutánea de DFD18, DFD72, DFD74 o Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 y d Fd 74 tuvieron todos el efecto de reducir los niveles de glucosa en sangre de forma continua. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media (S.E.M.).
La FIGURA 7 muestra gráficos que indican los cambios en el peso corporal en el modelo de ratón ob/ob desde el día de la administración hasta el 14o día después de una única inyección subcutánea de DFD18, DFD72, DFD74 o Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 y DFD74 tuvieron todos el efecto de reducir el peso corporal en comparación con el grupo tratado con PBS. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media.
La FIGURA 8 muestra gráficos que indican los cambios en los niveles de hemoglobina glucosilada en el modelo de ratón ob/ob el día de la administración (1er día) y el 16o día después de una única inyección subcutánea de DFD18, DFD72, DFD74 o Fc-FGF21 (Lilly). DFDl8, DFD72 y DFD74 provocaron todos niveles reducidos de hemoglobina glucosilada en el 16o día en comparación con los del día de la administración. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media.
La FIGURA 9 es un gráfico que muestra los niveles de glucosa en sangre en el modelo de ratón HFD/STZ después de una única inyección subcutánea de DFD72 o DFD74. Tanto DFD72 como DFD74 tuvieron el efecto de reducir los niveles de glucosa en sangre de forma continua. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media.
La FIGURA 10 muestra gráficos que indican los cambios en los pesos corporales en el modelo de ratón HFD/STZ desde el día de la administración hasta el 14° día después de una única inyección subcutánea de DFD72 o DFD74. Tanto DFD72 como DFD74 tuvieron el efecto de reducir el peso corporal en comparación con el grupo tratado con PBS. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media.
La FIGURA 11 muestra gráficos que indican los cambios en los niveles de hemoglobina glucosilada en el modelo de ratón HFD/STZ en el 1er día y el 13o día después de una única inyección subcutánea de DFD72 o DFD74. Se demostró que tanto el tratamiento con DFD72 como con DFD74 dio como resultado una mayor reducción de los niveles de hemoglobina glucosilada en comparación con el grupo tratado con PBS. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media.
La FIGURA 12 muestra gráficos que indican los cambios en el peso corporal medidos en un modelo de ratón con obesidad inducida por la dieta desde el día de la administración hasta el 14o día después de la administración única de DFD18. DFD18 tuvo un efecto excelente sobre la reducción del peso corporal. Los datos se indican como valores de media y error estándar de la media.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle.
En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína mutante del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) y una región Fc de una inmunoglobulina, en donde la proteína mutante FGF21 comprende la siguiente mutación:
(1) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 98 a 101 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de EIRP (SEQ ID NO: 42) (en lo sucesivo en el presente documento, "EIRP").
Preferentemente, la proteína de fusión comprende además la siguiente mutación: una sustitución del aminoácido en la posición 180 del extremo N de la proteína FGF21 de tipo silvestre con el aminoácido E.
Más preferentemente, la proteína de fusión comprende además al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en las siguientes mutaciones:
(2) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de TGLEAV (SEQ ID NO: 43) (en lo sucesivo en el presente documento, "TGLEAV";
(3) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de TGLEAN (SEQ ID NO: 44) (en lo sucesivo en el presente documento, "TGLEAN";
(4) una sustitución de un aminoácido en la posición 170 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido N (en lo sucesivo en el presente documento, "G170N"); y
(5) una sustitución de un aminoácido en la posición 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido N (en lo sucesivo en el presente documento, "G174N").
La proteína FGF21 de tipo silvestre, una hormona conocida por desempeñar un papel importante en la homeostasis de la glucosa y los lípidos, puede ser una derivada de mamíferos tales como seres humanos, ratones, cerdos, monos, etc., preferentemente de seres humanos. Más preferentemente, la proteína FGF21 de tipo silvestre puede ser la proteína FGF21 humana de tipo silvestre que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.
También se describen proteínas mutantes FGF21 que tienen una cualquiera de las mutaciones de EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N y G174N. Una proteína mutante FGF21 de la invención puede tener una combinación de una cualquiera de las mutaciones de TGLEAV, TGLEAN, G170N y G174N y la mutación de EIRP. También se describen proteínas mutantes FGF21 que tienen una combinación de una cualquiera de las mutaciones de EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N y G174N y la mutación de A180E. Una proteína mutante FGF21 de la invención puede tener una combinación de una cualquiera de las mutaciones de TGLEAV, TGLEAN, G170N y G174N, la mutación de EIRP y la mutación de A180E. Adicionalmente, se describen proteínas mutantes FGF21 que pueden tener una conformación, en donde de 1 a 10 aminoácidos en el extremo N o el extremo C se elimina o eliminan en comparación con la proteína FGF21 de tipo silvestre. Las proteínas mutantes FGF21 de la invención pueden incluir una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 11 a 15 y 20 a 23. Se describen otras proteínas mutantes FGF21 que pueden incluir una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 7 a 10, 16 a 19 o una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 23 y además tienen una conformación, en donde de 1 a 10 aminoácidos en el extremo N o el extremo C se elimina o eliminan en comparación con la proteína FGF21 de tipo silvestre.
En la proteína de fusión, un resto de aminoácido N de la proteína mutante FGF21 introducido por una mutación puede estar glucosilado.
Como se usa en el presente documento, la expresión "región Fc", "Fragmento Fc", o "Fc" se refiere a una proteína, que incluye una región constante de cadena pesada 1 (CH1), una región constante de cadena pesada 2 (CH2) y una región constante de cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, pero no incluye regiones variables de las cadenas pesada y ligera y una región constante de cadena ligera 1 (CL1) de una inmunoglobulina. De forma adicional, como se usa en el presente documento, la expresión "mutante de la región Fc" se refiere a uno preparado sustituyendo parte de los aminoácido o aminoácidos de una región Fc o combinando regiones Fc de diferentes tipos.
La región Fc de inmunoglobulina puede ser una región Fc completa que constituye un anticuerpo, un fragmento del mismo o un mutante de la región Fc. De forma adicional, la región Fc incluye una molécula en forma de monómero o multímero y puede incluir además una región bisagra de la región constante de cadena pesada. El mutante de la región Fc puede modificarse para evitar la escisión en la región bisagra. Adicionalmente, la secuencia bisagra de la Fc puede tener una sustitución en algunas secuencias de aminoácidos para reducir la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Además, parte de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de bisagra de Fc puede sustituirse para inhibir la transposición de la región Fab. Puede retirarse un resto de lisina en el extremo C del Fc.
Preferentemente, la región Fc de la inmunoglobulina puede ser una cualquiera de las regiones Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgD; o un Fc híbrido, que es una combinación de los mismos. Además, el Fc híbrido puede incluir una región IgG4 y una región IgD. Además, la región Fc híbrida puede incluir parte de la secuencia bisagra y CH2 de un Fc de IgD, y secuencias CH2 y CH3 de Fc de IgG4.
Además, el fragmento Fc de la presente invención puede estar en forma de cadena glucosilada de tipo silvestre, más de cadena glucosilada que la de tipo silvestre, menos cadena glucosilada que la cadena de tipo silvestre o cadena desglucosilada. El aumento, la disminución o la retirada de la cadena glucosilada puede realizarse mediante un método convencional conocido en la técnica, tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética que usa microorganismos.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede estar representada por SEQ ID NO: 24 o 25.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede estar representada por SEQ ID NO: 26.
De forma adicional, la proteína de fusión puede comprender además un enlazador.
La proteína de fusión puede estar en la forma, en la cual la proteína mutante FGF21 está conectada directamente al extremo N o al extremo C de la región Fc de inmunoglobulina, o la proteína mutante FGF21 está conectada a la región Fc de inmunoglobulina mediante un enlazador.
En tal caso, el enlazador puede estar conectado al extremo N, al extremo C o un radical libre del fragmento Fc, y también, puede estar conectado al extremo N, al extremo C o un radical libre de la proteína mutante FGF21. Cuando el enlazador es un enlazador peptídico, la conexión puede producirse en cualquier región. Por ejemplo, el enlazador puede estar conectado al extremo C de la región Fc de inmunoglobulina y al extremo N de la proteína mutante FGF21 para formar una proteína de fusión de la región Fc de inmunoglobulina y la proteína mutante FGF21.
Cuando el enlazador y Fc se expresan por separado y después se conectan, el enlazador puede ser un agente de reticulación conocido en la técnica. Los ejemplos del agente de reticulación pueden incluir 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, imidoésteres incluyendo éster de N-hidroxisuccinimida tales como ácido 4-azidosalicílico y ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano, pero no se limitan a ellos.
Además, el enlazador puede ser un péptido. Preferentemente, el enlazador puede ser un péptido que consiste en 10 a 30 restos de aminoácidos.
Adicionalmente, la alanina puede unirse adicionalmente al final del enlazador. Preferentemente, el enlazador puede ser un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 5. La proteína de fusión puede estar en una forma en la cual un dímero o un multímero de proteínas mutantes FGF21, en el cual una o más proteínas mutantes FGF21 se enlazan juntas, está conectado a una región Fc de inmunoglobulina. De forma adicional, la proteína de fusión puede estar en forma de dímero o multímero en el cual se enlazan dos o más regiones Fc de inmunoglobulina, en el cual las regiones Fc de inmunoglobulina tienen la proteína mutante FGF21 conectada a las mismas.
De forma adicional, la proteína de fusión puede ser un péptido que preferentemente tiene una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 27 a 39. Más preferentemente, la proteína de fusión que incluye la proteína mutante FGF21 puede ser un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36, 37 o 39.
La inmunogenicidad de la proteína FGF21 de tipo silvestre puede predecirse mediante un método convencional conocido en la técnica. Por ejemplo, la inmunogenicidad potencial de una proteína puede detectarse usando, por ejemplo, los métodos iTope™ y TCED™.
Además, las mutaciones para minimizar la inmunogenicidad pueden diseñarse mediante un método convencional conocido en la técnica. Por ejemplo, cuando se observa inmunogenicidad al realizar un análisis EpiScreen™ para evaluar la inmunogenicidad potencial, las secuencias de aminoácidos que inducen la inmunogenicidad pueden identificarse mediante mapeo de epítopos de células T, y los mutantes con inmunogenicidad minimizada pueden diseñarse mediante predicción in silico.
La proteína de fusión puede tener una forma con la que una o más proteínas biológicamente activas se acopla o acoplan adicionalmente. La proteína biológicamente activa puede ser una seleccionada del grupo que consiste en insulina, péptido C, leptina, glucagón, gastrina, polipéptido inhibidor gástrico (GIP), amilina, calcitonina, colecistoquinina, péptido YY, neuropéptido Y, proteína morfogenética ósea-6 (BMP-6), proteína morfogenética ósea-9 (BMP-9), oxintomodulina, oxitocina, péptido similar al glucagón-1 (GLP-1), péptido similar al glucagón-2 (GLP-2), irisina, proteína 5 que contiene el dominio de tipo fibronectina III (FNDC5), apelina, adiponectina, C1q y proteína relacionada con el factor de necrosis tumoral (familia CTRP), resistina, visfatina, omentina, proteína de unión al retinol-4 (RBP-4), glicentina, angiopoyetina, interleucina-22 (IL-22), exendina-4 y hormona del crecimiento. Preferentemente, la proteína biológicamente activa puede ser una seleccionada de GLP-1, un mutante del mismo y exendina-4.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene la proteína de fusión para tratar trastornos asociados a FGF21.
Como se usa en el presente documento, la frase "trastorno asociado a FGF21" puede incluir obesidad, diabetes tipo I y tipo II, pancreatitis, dislipidemia, esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), esteatohepatitis no alcohólica (ENA), resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, infarto agudo de miocardio, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, ateroesclerosis, enfermedad arterial periférica, apoplejía, insuficiencia cardíaca, enfermedad cardíaca de las arterias coronarias, enfermedad renal, complicaciones diabéticas, neuropatía, gastroparesia, trastorno asociado a una mutación de inactivación grave en el receptor de insulina y otros trastornos metabólicos. Preferentemente, el trastorno asociado a FGF21 puede ser diabetes, obesidad, dislipidemia, síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico, esteatohepatitis no alcohólica o enfermedades cardiovasculares.
Además, la composición farmacéutica puede incluir además un vehículo farmacéutico. El vehículo farmacéutico puede ser cualquier vehículo siempre que sea un material no tóxico adecuado para administrar anticuerpos a los pacientes. Por ejemplo, pueden incluirse como vehículo agua destilada, alcohol, grasas, ceras y sólidos inactivos. También pueden incluirse en la composición farmacéutica adyuvantes farmacéuticamente aceptables (agentes tamponantes, dispersantes). En estas formulaciones, la concentración de la proteína de fusión puede variar mucho.
Específicamente, la composición farmacéutica puede contener un material de formulación para alterar, mantener o conservar el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o la permeabilidad de la composición. Los ejemplos del material de formulación adecuado pueden incluir aminoácidos (por ejemplo, glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), agentes anti-microorganismos, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, sulfito de sodio o bisulfito de sodio), agentes tamponantes (por ejemplo, borato, bicarbonatos, Tris-HCI, citrato, fosfato u otros ácidos orgánicos), agentes de carga (por ejemplo, manitol o glicina), agentes quelantes (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes complejantes (por ejemplo, cafeína, polivinilpirrolidiona, p-ciclodextrina o hidroxipropil-pciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa o dextrina), proteínas (por ejemplo, albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulina), agentes colorantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, polímeros hidrófilos (por ejemplo, polivinilpirrolidiona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sal (por ejemplo, sodio), conservantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (por ejemplo, glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o humectantes (por ejemplo, pluronics; PEG; éster de sorbitán; polisorbato, por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapol), mejoradores de la estabilidad (por ejemplo, sacarosa o sorbitol), mejoradores del crecimiento (por ejemplo, haluros de metales alcalinos, preferentemente, cloruro de sodio o cloruro de potasio; o manitol, sorbitol), vehículos de administración, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos, pero no se limitan a los mismos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión de la invención para su uso en un método para prevenir o tratar trastornos asociados a FGF21, incluyendo la administración de la proteína de fusión a un sujeto que necesite dicha prevención o tratamiento. Este método incluye, en particular, administrar una cantidad eficaz de la proteína de fusión de la presente invención a un mamífero que tiene un síntoma de diabetes, obesidad, dislipidemia, síndrome metabólico, esteatosis hepática no alcohólica, esteatohepatitis no alcohólica o enfermedades cardiovasculares que son trastornos asociados a FGF21.
La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por cualquier vía. La composición de la presente invención puede proporcionarse a un animal directamente (por ejemplo, por vía tópica, mediante la administración en áreas de tejido mediante inyección, trasplante o por administración tópica) o por vía sistémica (por ejemplo, por administración oral o parenteral) a través de cualquier medio apropiado. Cuando la composición de la presente invención se proporciona por vía parenteral a través de administración intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, intraorbital, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracistenal, intracapsular, intranasal o aerosol, la composición es preferentemente acuosa o puede incluir una porción de una suspensión o solución líquida corporal fisiológicamente aplicable. En consecuencia, el portador o vehículo puede añadirse a la composición y administrarse a un paciente ya que es fisiológicamente aplicable. Por lo tanto, generalmente puede incluirse una solución salina fisiológicamente apropiada como vehículo como un fluido corporal para formulaciones.
Además, la frecuencia de administración puede variar dependiendo de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de fusión en las formulaciones a usar. Normalmente, los médicos administrarán la composición hasta que se alcance una dosis de administración para lograr el efecto deseado. En consecuencia, la composición puede administrarse como una dosis unitaria, al menos dos dosis con intervalos de tiempo (pueden contener o no la misma cantidad de una proteína de fusión diana) o administradas mediante una inyección continua mediante un dispositivo de trasplante o catéter. Los expertos en la materia pueden realizar de forma rutinaria la precisión de la adición de una dosis de administración apropiada y corresponde al alcance del trabajo que realizan habitualmente.
De forma adicional, la dosis unitaria preferible de la proteína de fusión en humanos puede estar en un intervalo de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal y más preferentemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Aunque esta es la cantidad óptima, la dosis unitaria puede variar dependiendo de la enfermedad a tratar o la presencia/ausencia de efectos adversos. No obstante, la dosis de administración óptima puede determinarse realizando un experimento convencional. La administración de la proteína de fusión puede realizarse mediante una inyección periódica en bolo, un reservorio externo (por ejemplo, una bolsa intravenosa), o una administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal continua desde la fuente interna (por ejemplo, un implante bioerosionable).
Además, la proteína de fusión de la presente invención puede administrarse a un receptor objeto junto con otras moléculas biológicamente activas. La combinación óptima de la proteína de fusión y otra molécula o moléculas, las formas de dosificación y las dosis óptimas pueden determinarse mediante un experimento convencional bien conocido en la materia.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión.
Como se usa en el presente documento, la frase "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la presente invención, que está aislada de aproximadamente al menos el 50 % de proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales, descubierto en la naturaleza cuando los ácidos nucleicos totales se aíslan de una célula fuente; que está operativamente ligado a un polinucleótido que no está ligado por naturaleza; o que es parte de una secuencia polinucleotídica más grande y no se encuentra en la naturaleza. Preferentemente, en las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, sustancialmente no está presente ningún otro ácido nucleico contaminado u otros contaminantes que se descubran en el entorno natural e inhiban los usos de los ácidos nucleicos en la producción de polipéptidos o en el tratamiento, el diagnóstico, la prevención o la investigación.
En tal caso, las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la proteína de fusión pueden tener diferentes secuencias entre sí debido a la redundancia de codones. Adicionalmente, siempre que el ácido nucleico aislado pueda producir la proteína de fusión, el ácido nucleico aislado puede modificarse apropiadamente, o puede añadirse un nucleótido al extremo N o al extremo C del ácido nucleico aislado de acuerdo con los propósitos deseados.
El ácido nucleico aislado puede incluir, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 45 a 57.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada, que codifica la proteína de fusión que incluye una proteína mutante FGF21 y una región Fc de una inmunoglobulina.
Como se usa en el presente documento, la frase "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico, que es adecuado para la transformación de una célula hospedara y dirige o controla la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterogénea insertada. El vector de expresión incluye un ácido nucleico lineal, un plásmido, un fagémido, un cósmido, un vector de ARN, un vector vírico y análogos del mismo. Los ejemplos del vector vírico incluyen un retrovirus, un adenovirus y un virus adenoasociado, pero no se limitan a los mismos. Como se usa en el presente documento, el término "expresión de una secuencia heterogénea de ácidos nucleicos" o "expresión" de una proteína diana se refiere a la transcripción de una secuencia de ADN insertada, la traducción de una transcripción de ARNm y la producción de un producto de proteína de fusión Fc, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
Un vector de expresión útil puede ser RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) o un mutante del mismo. El vector de expresión útil puede incluir un promotor de citomegalovirus humano (CMV) para promover una transcripción continua de un gen diana en una célula de mamífero y una secuencia señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino para mejorar el nivel de estabilidad del ARN postranscripcional. En una realización ejemplar de la presente invención, el vector de expresión es pAD15, que es un vector modificado de RcCMV.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula procariota o eucariota en la cual puede introducirse un vector de expresión recombinante. Como se usa en el presente documento, el término "transformado" o "transfectado" se refiere a la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula mediante diversas tecnologías conocidas en la técnica.
Una célula hospedadora apropiada puede transformarse o transfectarse con una secuencia de ADN de la presente invención y puede usarse para la expresión y/o secreción de la proteína diana. Los ejemplos de la célula hospedadora apropiada que pueden usarse en la presente invención incluyen células de hibridoma inmortales, células de mieloma NS/0, células 293, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células CAP (células derivadas de líquido amniótico humano) y células COS.
En lo sucesivo en el presente documento, las realizaciones ejemplares de la presente invención se describirán con detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos de acuerdo con la presente invención pueden modificarse de muchas formas diferentes y el alcance de la presente invención no debe interpretarse como limitado a los ejemplos expuestos en el presente documento.
Modo para la invención
Ejemplo de Preparación 1. Preparación y purificación de proteína de fusión que contiene proteína mutante FGF21 Ejemplo de Preparación 1-1. Preparación de vectores de expresión para la expresión de proteínas mutantes FGF21
Para mejorar la estabilidad, la actividad y los perfiles farmacocinéticos del FGF21 en una estructura Fc-FGF21, se realizaron estudios de mutación de FGF21.
Específicamente, se diseñaron proteínas mutantes para la región LLLE (los aminoácidos en las posiciones 98 a 101 del extremo N de la proteína FGF21) y la región GPSQG (los aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de la proteína FGF21) y el sitio A180, que se esperaba que afectaran significativamente las actividades de las proteínas basándose en el análisis de la estructura en 3 dimensiones de las proteínas FGF21.
La posición, la información de secuencia, la diana y el efecto esperado de cada mutación introducida en la proteína FGF21 se enumeran en la Tabla 1 a continuación (en la Tabla 1, N se refiere a asparagina glucosilada (N)). Además, Las proteínas mutantes de FGF21 que incluyen las mutaciones descritas en la Tabla 1 se enumeran en la Tabla 2 a continuación.
T l 11
T l 21
Se prepararon vectores de expresión para expresar los aminoácidos de los tres componentes: vehículo de fusión,
enlazador y FGF21 mutante en este orden desde el extremo N al extremo C. El código de material de cada proteína de fusión mutante FGF21, secuencia de mutación introducida en FGF21, secuencia del portador de fusión y secuencia del enlazador se enumeran en la Tabla 3 a continuación (en la Tabla 3, N se refiere a asparagina glucosilada (N)).
T l 1
Para producir las proteínas de fusión mutantes FGF21, las secuencias de nucleótidos que codifican cada una de las proteínas mutantes de FGF21 se sintetizaron consultando con Bioneer Corporation (Corea) basándose en la secuencia de aminoácidos de cada proteína. Se añadieron secuencias de enzimas de restricción Nhel y Notl al extremo 5' y al extremo 3' de las secuencias de nucleótidos que codifican cada una de las proteínas mutantes FGF21 y un codón de inicio para la traducción de proteínas y una secuencia líder (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA) capaz de secretar la proteína expresada al exterior de una las células se insertaron junto a la secuencia de la enzima de restricción en el extremo 5'. Se insertó un codón de terminación junto a la secuencia de nucleótidos, que codifica cada una de las proteínas de fusión mutantes FGF21. La secuencia de nucleótidos que codifica cada una de las proteínas de fusión mutantes de FGF21 se clonó en un vector de expresión pTrans-empty utilizando las dos enzimas de restricción de Nhel y Notl. El vector de expresión pTrans-empty, que tiene una estructura sencilla que incluye un promotor CMV, un origen de replicación derivado de pUC, un origen de replicación derivado de SV40 y un gen resistente a ampicilina, se compró a CEVEC Pharmaceuticals (Alemania).
En el caso de las proteínas de fusión de DFD6 (E. coli) y RGE (Amgen), la secuencia de nucleótidos que codifica cada proteína de fusión se insertó en un vector de expresión pET30a para la expresión en E. coli.
Ejemplo de Preparación 1-2. Construcción de ADN plasmídico para la expresión de proteínas de fusión mutantes FGF21
Se transformó E. coli con cada uno de los vectores de expresión construidos en el Ejemplo de preparación 1-1 para obtener una gran cantidad de ADN plasmídico para su uso para la expresión. Las células de E. coli, cuyas paredes celulares estaban debilitadas, se transformaron con cada vector de expresión mediante choque térmico y los transformantes se sembraron en placas LB para obtener colonias. Las colonias obtenidas de esta manera se inocularon en medio LB, se cultivaron a 37 °C durante 16 horas y cada cultivo de E. coli que contenía cada vector de expresión se obtuvo en un volumen de 100 ml. La E. coli obtenida de esta manera se centrifugó para retirar el medio de cultivo, y después las soluciones P1, P2, P3 (QIAGEN, N.° de Cat.: 12963) se añadieron para romper las paredes celulares, obteniendo de esta manera una suspensión de ADN en la cual se separaron proteínas y ADN. El ADN plasmídico se purificó a partir de la suspensión de ADN así obtenida usando una columna de purificación de ADN Qiagen. El ADN plasmídico eluido se identificó mediante una electroforesis en gel de agarosa, y las concentraciones y purezas se midieron utilizando un dispositivo de nanogotas (Thermo Scientific, Nanodrop Lite). El ADN obtenido de
esta manera se usó para la expresión.
Ejemplo de Preparación 1-3. Expresión de proteínas de fusión en células CAP-T
Se transfectaron líneas celulares humanas con cada tipo de ADN plasmídico obtenido en el Ejemplo de Preparación 1-2. Cada tipo de ADN plasmídico se transdujo en células CAP-T (CEVEC), que se había cultivado en medio PEM (Life technologies), usando una solución de PEI (Polyplus, n.° de Cat.: 101-10N). La solución mixta de ADN y la solución de PEI se mezcló con la suspensión celular usando un medio de expresión Freestyle293 (Invitrogen), se cultivó a 37 °C durante 5 horas y se añadió medio PEM. Después de cultivar a 37 °C durante 5-7 días, el cultivo se centrifugó para retirar las células y se obtuvo un sobrenadante que incluía proteínas de fusión mutantes FGF21.
Ejemplo de Preparación 1-4. Expresión y purificación de proteínas de fusión mutantes FGF21 en E. coli
La cepa de E. coli BL21 (DE3) se transformó con cada ADN plasmídico que expresaba DFD6 (E. coli) y proteínas de fusión RGE (Amgen). La E. coli transformada que expresa cada proteína de fusión se inoculó en 20 ml de medio LB, se cultivó a 37 °C durante 15 horas con agitación y después se inoculó una porción del medio de cultivo en 100 ml de medio LB y se cultivó a 37 °C durante 16 horas con agitación. Tras la finalización del cultivo, el cultivo se centrifugó para obtener sedimentos de E. coli y después las células se rompieron usando un irruptor celular de alta presión para obtener cuerpos de inclusión.
Los cuerpos de inclusión obtenidos se purificaron mediante lavado y elución, seguido de un proceso de replegamiento de proteínas. Específicamente, los cuerpos de inclusión obtenidos se lavaron 2-3 veces con una solución tampón (pH 8,0) que contenía Triton X-100 al 0,5 %, Tris 50 mM, EDTA 1 mM y NaCl 0,1 M para retirar la proteína bacteriana y después se resuspendió en tampón de urea 8 M que contiene urea 8 M, Tris 50 mM y DTT 1 mM. Dado que las proteínas en tampón de urea 8 M estaban completamente desnaturalizadas, se realizó un proceso de replegamiento de proteínas como sigue.
Para empezar, el tampón de urea 8 M se diluyó gradualmente con una solución tampón de glicina 20 mM (pH 9,0) para retirar la urea y, a partir de la concentración de 2 M, se añadió CuSO4 a la concentración de 80 mM para inducir el plegamiento de proteínas estable. La proteína que completaba el proceso de replegamiento se suspendió en solución tampón PBS (pH 7,4) y la suspensión se filtró con un filtro de 0,22 mm para retirar las impurezas y después se cargó en una columna de cromatografía de afinidad de Proteína A. La columna se lavó con solución tampón de PBS 1X (pH 7,4) y después las proteínas se eluyeron usando solución tampón de glicina 100 mM (pH 3,0) para preparar la proteína de fusiónDFD6 (E. coli).
En el caso de la proteína de fusión RGE (Amgen), la proteína que completó el proceso de replegamiento se suspendió en solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0), la suspensión se filtró con un filtro de 0,22 mm para retirar las impurezas y después se cargó en una columna de resina de intercambio aniónico (POROS® HQ 50 mm, Thermo Fisher Scientific). La columna se lavó con solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0) y después se administró solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0) a lo largo del gradiente de concentración para eluir la proteína de fusión RGE (Amgen). La proteína de fusión RGE (Amgen) obtenida por la resina de intercambio aniónico se mezcló con sulfato de amonio a la concentración de 1 M y después se purificó usando una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (Phenyl Sepharose FF, GE Healthcare). Específicamente, la columna se lavó con solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0) que contenía sulfato de amonio 1 M, se administró una solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0) a lo largo del gradiente de concentración y las fracciones eluidas se analizaron mediante electroforesis en gel de Tris-glicina al 10 %. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R con agitación suave y las fracciones que contenían la proteína de fusión mutante FGF21 con alta pureza se recogieron y después se dializaron durante la noche a 4 °C usando una solución tampón final (1X PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4). Tras la finalización de la diálisis, la solución madre de proteína obtenida se concentró a 3.000 rpm usando un filtro de centrifugación de corte de 30.000 PMa 4 °C. La concentración de la proteína de fusión mutante FGF21 se midió mediante análisis cuantitativo de BCA.
Ejemplo de Preparación 1-5. Purificación de proteínas de fusión mutantes FGF21
La columna de cromatografía de afinidad de Proteína A (GE Healthcare) se equilibró con una solución tampón de PBS 1X (pH 7,4). El sobrenadante del cultivo que incluía cada proteína de fusión mutante FGF21 obtenida en el Ejemplo de preparación 1-3 se filtró con un filtro de 0,2 mm y después se cargó en una columna de cromatografía de afinidad de proteína A. La columna se lavó con una solución tampón de PBS 1X (pH 7,4) y después las proteínas se eluyeron usando una solución tampón de glicina 100 mM (pH 3,0). Las proteínas de fusión obtenidas por cromatografía de afinidad se purificaron usando una columna de resina de intercambio aniónico (POROS® HQ 50 mm, Thermo Fisher Scientific). La columna de resina de intercambio aniónico se equilibró con solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0), antes de eluir de la columna las proteínas de fusión mutantes FGF21. Específicamente, después de lavar la columna con solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0), Se dispensó solución tampón Tris 50 mM (pH 8,0) a lo largo del gradiente de concentración y se analizaron las fracciones eluidas. Cada fracción eluida se analizó usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y se recogieron las fracciones que incluían proteínas de fusión mutantes FGF21 con alta pureza. La concentración y el análisis cuantitativo se realizaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo de Preparación 1-4.
Ejemplo Experimental 1. Actividades in vitro de las proteínas de fusión
Ejemplo Experimental 1-1. Efecto de las mutaciones de FGF21 sobre la actividad de las proteínas
Se midieron las actividades in vitro de las proteínas de fusión DFD4, DFD5, DFD6, DFD6 (E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 y DFD74 preparadas en Ejemplo de Preparación 1.
Específicamente, las actividades de FGF21 in vitro de las proteínas de fusión se evaluaron usando una línea celular HEK293 (Yuhan Corporation, Corea) que se modificó para sobreexpresar p-klotho humano, un correceptor de FGF21. Para la evaluación de la actividad, los concentrados que contenían las proteínas de fusión preparadas en los Ejemplos de Preparación 1-4 y 1-5 se sometieron a una dilución en serie de 3 veces a una concentración de 3 mM. Después de haberse cultivado en un estado deficiente en suero durante 5 horas, la línea celular que sobreexpresa p-klotho humano se trató con las proteínas de fusión diluidas durante 20 minutos y después se lisó añadiendo tampón de citólisis (Cisbio/n.° de Cat 64ERKPEG) con agitación a 60 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución de lisado celular se mezcló con anticuerpos (Cisbio/n.° de Cat 64ERKPEG), que pueden detectar quinasa regulada por señal extracelular (ERK) y ERK fosforilada, y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas. La fluorescencia se detectó mediante un detector fluorométrico (TECAN/GENiosPro). Las actividades de las proteínas de fusión se midieron comparando sus valores de CE50.
Como se muestra en las FIGURAS 1A a 1C, se confirmó que las actividades in vitro de las proteínas de fusión preparadas mediante la introducción de secuencias de mutación en la proteína FGF21 de tipo silvestre no se inhibieron, y las actividades de cada proteína de fusión fueron similares entre sí. También se confirmó que a través de la muestra de DFD6 (E. coli) expresada en E. coli y la muestra DFD6 expresada en células animales, las actividades in vitro de las proteínas de fusión preparadas mediante la introducción de la mutación de N-glucosilación en la proteína FGF21 de tipo silvestre no se inhibieron.
Ejemplo Experimental 1-2. Efecto de la secuencia enlazadora sobre la actividad proteica
Se midieron las actividades in vitro de las proteínas de fusión DFD1, DFD3, DFD4 y DFD13 preparados en el Ejemplo de Preparación 1.
Específicamente, las actividades de FGF21 de las proteínas de fusión se midieron usando los concentrados que contenían las proteínas de fusión preparadas en el Ejemplo de Preparación 1-5 de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo Experimental 1-1. Los resultados se muestran en las FIGURAS 2A y 2B.
Se confirmó que ninguna proteína de fusión mutante FGF21 mostró una disminución significativa en la actividad, aunque se mostró una ligera diferencia en la actividad dependiendo de la secuencia del enlazador, como se muestra en las FIGURAS 2A y 2B.
Ejemplo Experimental 1-3. Resultados experimentales para DFD1, RGE (Amgen) y Fc-FGF21 (Lilly)
Se midieron las actividades in vitro de la proteína de fusión DFD1 preparada en el Ejemplo de Preparación 1 y las proteínas de control RGE (Amgen) y Fc-FGF21 (Lilly).
Específicamente, las actividades de FGF21 de las proteínas de fusión se midieron usando los concentrados que contenían las proteínas de fusión preparadas en el Ejemplo de Preparación 1-5 y las proteínas control de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo Experimental 1-1. Los resultados se muestran en la FIGURA 3.
Se confirmó que DFD1 y RGE (Amgen) tenían actividad in vitro similar, mientras que Fc-FGF21 (Lilly) tuvo una actividad in vitro dos veces mayor que las otras proteínas, como se muestra en la FIGURA 3.
Ejemplo Experimental 2. Evaluación de la estabilidad de las proteínas de fusión
Ejemplo Experimental 2-1. Método experimental para evaluar la estabilidad
Para medir la cantidad de agregados de proteínas en la fase inicial de preparación de la muestra, los agregados de alto peso molecular (% HMW) se cuantificaron usando un método de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC). Los resultados se muestran en la FIGURA 4.
Específicamente, se usó una columna TosoHaas modelo TSK-GEL G3000SWxl para el método SEC-HPLC. La columna se equilibró haciendo fluir una solución tampón (1X PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4) a un caudal de 1 ml/min. Las soluciones madre de proteína DFD4 y DFD13 preparadas en los Ejemplos de Preparación 1-5 se concentraron hasta una concentración diana de 20 mg/ml o superior a 3.000 rpm usando un filtro de centrifugación de corte de 30.000 PM a 4 °C. Después de la medición de la concentración de cada muestra mediante análisis cuantitativo de BCA, las muestras se diluyeron con una solución tampón (1X PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4) hasta una concentración final de
20 mg/ml. Para medir el % HMW inicial de DFD4 y DFD13, se diluyeron 20 mg/ml de las muestras con la solución tampón (1X PBS, EDTA 1 mM, pH 7,4) hasta una concentración final de 1 mg/ml, y cada muestra en un volumen de 100 ml se analizó mediante columna SEC-HPLC.
Para la evaluación de la estabilidad de cada muestra, el % HMW de las muestras se midió usando el método SEC-HPLC en el 4o, el 8o y el 14o días almacenándolas a 5 °C, 25 °C y 37 °C durante dos semanas.
Como se muestra en la FIGURA 4, se confirmó que DFD13 tenía una cantidad más baja de agregados de alto peso molecular (HMW %) en la fase inicial y hasta el punto de 2 semanas en comparación con DFD4, indicando que la introducción de la mutación EIRP mejora la estabilidad de la proteína de fusión mutante FGF21, reduciendo de esta manera el % de HMW significativamente.
Ejemplo Experimental 2-2. Resultados de estabilidad
Para investigar los efectos de la mutación EIRP introducida en la secuencia original LLLE (98-101) de FGF21 sobre la estabilidad, la estabilidad de DFD4 (SEQ ID NO: 29) y DFD13 (SEQ ID NO: 35) se midió de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo Experimental 2-1. Los resultados del análisis para la muestra de hora cero (fase inicial; Día 0) y las muestras de DFD4 y DFD13 almacenadas durante 4, 8 y 14 días se resumen en la Tabla 4 a continuación (en la Tabla 4, N.D. significa "no detectado").
T l 41
Como se muestra en la Tabla 4, la cantidad de % HMW en la fase inicial (día 0) fue el 0,91 % para DFD4 y el 0,56 % para DFD13. Después de 2 semanas, la cantidad de % HMW aumentó al 8,83 % para DFD4, pero no se observó en DFD13, en condiciones de almacenamiento a 25 °C. Se demostró que DFD13 tiene una tasa de % HMW más baja en la fase inicial y 2 semanas, en comparación con DFD4, lo que indica que la tasa de % HMW de la proteína de fusión mutante FGF21 disminuyó significativamente debido a la introducción de la mutación EIRP.
Ejemplo Experimental 3. Evaluación farmacocinética de proteínas de fusión
Ejemplo Experimental 3-1. Método experimental de evaluación farmacocinética
Se dividieron en grupos ratones ICR macho de seis semanas comprados en Orient BIO (Corea) (n = 3/tiempo de muestreo de sangre) para tener valores medios similares para el peso corporal un día antes del tratamiento con el fármaco y administrados por vía subcutánea una vez con una muestra respectiva a 1 mg/kg (2 mg/kg para RGE). Después se recolectaron muestras de sangre 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas después de la inyección, respectivamente. La concentración de proteína FGF21 de longitud completa intacta en la sangre se midió usando un kit ELISA FGF21 humano intacto (F1231-K01, Eagle Biosciences, EE.Uu .), que tiene inmunorreactividad al extremo N y al extremo C de la proteína FGF21. Se midieron las concentraciones de las muestras en sangre recogidas hasta 96 horas después de la inyección subcutánea de cada proteína de fusión en los ratones y se calcularon los parámetros farmacocinéticos de cada muestra.
Ejemplo Experimental 3-2. Evaluación de la actividad farmacocinética
Basándose en el gráfico que muestra las concentraciones de cada proteína en la sangre frente al tiempo después de la administración subcutánea de proteínas de fusión en ratones (FIGURA 5), se calcularon los parámetros farmacocinéticos. Los datos se muestran en la Tabla 5 a continuación.
El perfil farmacocinético de cada proteína de fusión se comparó y se evaluó en función del valor del área bajo la curva (AUC) que indica el grado de exposición al fármaco.
Como se muestra en la Tabla 5, al comparar DFD4 con DFD13 y DFD6 con DFD73, se determinó que la introducción de la secuencia EIRP dio como resultado un aumento aproximado del 10 al 20 % en el valor de AUC. Comparando DFD9 con DFD4, la introducción de TGLEAV dio como resultado un aumento aproximado de 6 veces en el valor de AUC.
Adicionalmente, las mutaciones de TGLEAN, G170N y G174N están diseñadas para extender la semivida al introducir N-glucosilación en el extremo C de FGF21, que se sabe que está proteolizado in vivo. El aumento de AUC debido a la introducción de N-glucosilación se confirmó comparando los mutantes con cada material de control. Para confirmar el efecto de mejora en el AUC debido a la introducción de N-glucosilación, el valor AUC para DFD6 (E. coli) producido por E. coli que no tiene glucosilación se comparó con el de DFD6 producido por una línea celular humana. DFD6 producida por la línea celular humana mostró un aumento de 3 veces o más en el valor AUC en comparación con DFD6 (E. coli) producida por E. coli, que demostró una mejora del perfil farmacocinético debido a la glucosilación. La A180E es una mutación descrita en el documento WO 2009/149171 propiedad de Amgen Inc. Cuando la mutación de A180E se introdujo además en el mutante DFD13 o DFD73, incluyendo la mutación de TGLEAV o G170N, respectivamente, el mutante resultante DFD18 o DFD74, respectivamente, mostró un aumento adicional aproximado de 2 a 3 veces en el valor de AUC.
En resumen, se confirmó que los parámetros farmacocinéticos mejoraron mediante la introducción de diversas mutaciones y combinaciones de las mismas, en comparación con DFD9, la proteína de fusión FGF21 de tipo silvestre. La proteína de fusión que mostró el valor AUC más mejorado fue DFD74 que contiene las mutaciones de EIRP, G170N y A180E, que mostró una mejora aproximada de 45 veces en el valor AUC en comparación con DFD9. Adicionalmente, considerando RGE (Amgen) a la dosis de 2 mg/kg de peso corporal, DFD74 puede tener un mayor grado de exposición al fármaco en comparación con RGE. Los efectos generales de la mejora en la farmacocinética debido a las mutaciones se resumen en la Tabla 6 a continuación.
T l 1
Ejemplo Experimental 4. Evaluación de la actividad de las proteínas de fusión en ratones ob/ob
Ejemplo Experimental 4-1. Método experimental para evaluar la actividad en ratones ob/ob
Los ratones ob/ob, caracterizados por exhibir hiperglucemia, resistencia a la insulina, hiperfagia, hígado graso y obesidad debido a una deficiencia genética en leptina, se usan ampliamente para el estudio de la diabetes tipo 2. Se adquirieron ratones ob/ob macho (Harlan, EE.UU.) de Raonbio (Corea). Estos ratones tenían de 5 a 6 semanas en el momento de la llegada y de 8 a 9 semanas en el momento del tratamiento con el fármaco después de 3 semanas de adaptación. Los ratones se dividieron en grupos (n=8/grupo) para tener valores medios similares para el peso corporal y los niveles de glucosa en sangre caudal un día antes del tratamiento con el fármaco (Día 0), y las muestras se administraron por vía subcutánea una vez de acuerdo con cada una de sus respectivas dosificaciones. Se administró solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), Gibco, EE.UU.) como tratamiento vehículo y se midió la concentración de glucosa en sangre usando un medidor de glucosa, GlucoDr (All Medicus, Corea). Los niveles de glucosa en ayunas y el peso corporal se midieron todos los días hasta el 14o día después de la administración. También se midieron los niveles de hemoglobina glucosilada en cada grupo antes de la administración y después de la prueba. Los niveles de hemoglobina glucosilada se calcularon usando un kit DCA 2000 HbAlc (Siemens, 5035C).
Ejemplo Experimental 4-2. Evaluación de actividad en ratones ob/ob
Los cambios en los niveles de glucosa en sangre y el peso corporal sin ayuno en ratones ob/ob macho se observaron después de una única inyección subcutánea de 30 o 100 nmol/kg de DFD18 y DFD72 o 10, 30 o 100 nmol/kg de DFD74.
Se confirmó que DFD18, DFD72 y DFD74 tuvieron todos el efecto de reducir el nivel de glucosa en sangre de una manera dependiente de la dosis. Comparando los tres agentes a la dosis alta de 100 nmol/kg, DFD72 y DFD74 mostraron un efecto mejorado en la reducción del nivel de glucosa en sangre que DFD18 (FIGURA 6). Además, Fc-FGF21 (Lilly) que se usó como un material control en la prueba, fue menos eficaz en la reducción del nivel de glucosa en sangre en comparación con DFD18, DFD72 y DFD74 al mismo nivel de dosis (30 nmol/kg).
En cuanto al efecto sobre la reducción del peso corporal, comparando los tres agentes a la dosis alta de 100 nmol/kg, DFD72 fue el más eficaz en ratones ob/ob dando como resultado una reducción aproximada del 6 % en el peso corporal y DFD18 fue el siguiente más eficaz, seguido de DFD74 (FIGURA 7).
Después de la finalización de la prueba, se midieron los niveles de hemoglobina glucosilada indicativos de los valores medios de glucosa en sangre y se analizaron los cambios en la glucosa en sangre media en cada grupo de prueba. Todos los grupos tratados excepto el grupo de control tratado con la proteína de control Fc-FGF21 (Lilly) mostraron valores negativos en las diferencias entre antes de la administración y después de la prueba, lo que confirmó la eficacia de las proteínas de prueba en comparación con el material control para reducir la glucosa en sangre (FIGURA 8). Ejemplo Experimental 5. Evaluación de la actividad de proteínas de fusión en ratones HFD/STZ
Ejemplo Experimental 5-1. Método experimental para evaluar la actividad en ratones HFD/STZ
Los efectos de las proteínas de fusión mutantes FGF21 sobre la reducción de la glucosa en sangre y el peso corporal se compararon y evaluaron en otro modelo diabético, el modelo de ratón HFD/STZ. Los modelos convencionales de ratones con obesidad inducida por la dieta (inducidos mediante la alimentación de ratones C57BL/6 con una dieta alta en grasas de 60 % kcal durante ocho semanas o más) tienen características hiperglucémicas y diabéticas débiles, aunque invocan resistencia a la insulina. Los ratones HFD/STZ, que pueden compensar los defectos en los modelos convencionales de ratones con obesidad inducida por la dieta, son capaces de producir células p disfuncionales en el páncreas y disminución de la secreción de insulina como resultado de una dieta alta en grasas (HFD) y la administración de estreptozotocina de bajo nivel (STZ) y, por lo tanto, son útiles para estudios farmacológicos de la diabetes tipo 2.
Específicamente, para inducir el modelo de ratón HFD/STZ, los ratones C57BL/6 (Japan SLC) se alimentaron con una dieta alta en grasas de 60 % kcal durante cuatro semanas y después se administraron 50 mg/kg de STZ (Sigma, 85882) por vía intraperitoneal todos los días durante 3 días para inducir la disfunción en las células p del páncreas. Después de alimentarse con la dieta alta en grasas durante 2 semanas adicionales, los ratones con niveles de glucosa en sangre sin ayuno de 200 mg/dl o más se usaron para la prueba. Los ratones se dividieron en grupos (n=6/grupo) para tener valores medios similares del peso corporal y los niveles de glucosa en sangre caudal un día antes del tratamiento con el fármaco (Día 0), y las muestras se administraron por vía subcutánea una vez de acuerdo con cada una de sus respectivas dosificaciones. Se administró solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), Gibco, EE.UU.) como tratamiento vehículo y se midió la concentración de glucosa en sangre usando un medidor de glucosa, GlucoDr (All Medicus, Corea). Los niveles de glucosa en ayunas y el peso corporal se midieron todos los días hasta el 14o día después de la administración. También se midieron los niveles de hemoglobina glucosilada en cada grupo antes de la administración y después de la prueba. Los niveles de hemoglobina glucosilada se calcularon usando un kit DCA 2000 HbAlc (Siemens, 5035C).
Ejemplo Experimental 5-2. Evaluación de la actividad en ratones HFD/STZ
Los cambios en los niveles de glucosa en sangre sin ayuno y los pesos corporales a lo largo del tiempo en ratones macho HFD/STZ se observaron después de una única inyección subcutánea de 10 nmol/kg de DFD72 o DFD74. Con respecto a los cambios en los niveles de glucosa en sangre sin ayuno, se confirmó que DFD72 y DFD74 tenían efectos similares en la disminución de los niveles de glucosa en sangre, y el efecto de disminución de la glucosa en sangre se mantuvo hasta el 10o día después de la administración y luego se pierde con el metabolismo de los medicamentos después del 10o día (FIGURA 9). DFD72 mostró un efecto más prolongado que DFD74 en términos de cambios en los niveles de glucosa en sangre sin ayuno después del 10o día después de la administración.
En cuanto al efecto sobre la reducción del peso corporal debido a la administración de proteínas mutantes FGF21, se confirmó que tanto DFD72 como DFD74 tenían efectos similares en la reducción del peso corporal en aproximadamente el 5 % y el efecto desapareció después del 10o día después de la administración (FIGURA 10). Después de la finalización de la prueba, se midieron los niveles de hemoglobina glucosilada indicativos del valor medio
Claims (15)
1. Una proteína de fusión que comprende una proteína mutante del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) y una región Fc de una inmunoglobulina,
en donde la proteína mutante FGF21 comprende la siguiente mutación:
(1) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 98 a 101 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de EIRP (SEQ ID NO: 42).
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la proteína mutante FGF21 comprende además la siguiente mutación:
(6) una sustitución de un aminoácido en la posición 180 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido E.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína mutante FGF21 comprende además al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en las siguientes mutaciones:
(2) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de TGLEAV (SEQ ID NO: 43);
(3) una sustitución de aminoácidos en las posiciones 170 a 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con una secuencia de aminoácidos de TGLEAN (SEQ ID NO: 44);
(4) una sustitución de un aminoácido en la posición 170 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido N; y
(5) una sustitución de un aminoácido en la posición 174 del extremo N de una proteína FGF21 de tipo silvestre con un aminoácido N.
4. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde un resto de aminoácido N de la proteína mutante FGF21 introducido por una mutación está glucosilado.
5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína FGF21 de tipo silvestre tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1.
6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 y 5, en donde la proteína mutante FGF21 tiene una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 11 a 15 y 20 a 23.
7. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína mutante FGF21 está conectada a la región Fc de la inmunoglobulina a través de un enlazador.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 7, en donde el enlazador está conectado al extremo C de la región Fc de la inmunoglobulina y al extremo N de la proteína mutante FGF21, preferentemente en donde el enlazador es un péptido que consiste en 10 a 30 restos de aminoácidos, además preferentemente en donde el enlazador tiene una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 5.
9. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la región Fc de la inmunoglobulina es una cualquiera de las regiones Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgD o un Fc híbrido que contiene una combinación de los mismos.
10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, en donde el Fc híbrido comprende una región IgG4 y una región IgD.
11. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 36, la SEQ ID NO: 37 o la s Eq ID NO: 39.
12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para el tratamiento de diabetes, obesidad, dislipidemia, síndrome metabólico, esteatosis hepática no alcohólica o esteatohepatitis no alcohólica.
13. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13.
15. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14.
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