RU2741087C2 - Слитые с fgf21 белки длительного действия и содержащая их фармацевтическая композиция - Google Patents

Слитые с fgf21 белки длительного действия и содержащая их фармацевтическая композиция Download PDF

Info

Publication number
RU2741087C2
RU2741087C2 RU2018119141A RU2018119141A RU2741087C2 RU 2741087 C2 RU2741087 C2 RU 2741087C2 RU 2018119141 A RU2018119141 A RU 2018119141A RU 2018119141 A RU2018119141 A RU 2018119141A RU 2741087 C2 RU2741087 C2 RU 2741087C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
pro
leu
ser
gly
val
Prior art date
Application number
RU2018119141A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2018119141A (ru
RU2018119141A3 (ru
Inventor
Дзун Хван КИМ
Сеиоунг ЛИМ
Миндзи СЕО
Хиун Хо ЧОИ
Дохун КИМ
Ми Киеонг ДЗУ
Дзу-Йоунг ПАРК
Биунг Хиун ЧОИ
Дзун Киунг ЛИ
Дзонг Гиун КИМ
Су Йоун НАМ
Original Assignee
Юхан Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020150150574A external-priority patent/KR102668200B1/ko
Application filed by Юхан Корпорейшн filed Critical Юхан Корпорейшн
Publication of RU2018119141A publication Critical patent/RU2018119141A/ru
Publication of RU2018119141A3 publication Critical patent/RU2018119141A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2741087C2 publication Critical patent/RU2741087C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам на основе фактора роста фибробластов 21 (FGF21), и может быть использовано в медицине для лечения FGF21-ассоциированных расстройств, выбранных из группы, состоящей из диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита. Слитый белок содержит мутантный FGF21 и Fc-область иммуноглобулина, причем мутантный белок FGF21 соединен с Fc-областью иммуноглобулина посредством пептидного линкера из 10-30 аминокислотных остатков, где линкер соединен с С-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21. Также предложены нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор и клетка-хозяин для получения слитого белка FGF21-Fc рекомбинантным путем. Изобретение обеспечивает получение слитого белка на основе FGF21, с улучшенными сроком действия in vivo, стабильностью и фармакологической эффективностью. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 табл., 7 пр., 12 ил.

Description

Область техники, в которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21) с улучшенным сроком действия in vivo, стабильностью белка и фармакологической активностью, и к содержащей его фармацевтической композиции.
Уровень техники
Фактор роста фибробластов 21 (FGF21), синтезируемый в печени, является гормоном, который, как известно, играет важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов. FGF21 демонстрирует фармакологическое действие в печени, адипоцитах, β-клетках поджелудочной железы, гипоталамусе в головном мозге и мышечных тканях, где экспрессируются как FGF21-специфический рецептор, т.е. FGF рецептор, так и комплекс β-клото. Сообщалось, что у нечеловекообразных приматов и в мышиных моделях различных диабетических и метаболических заболеваний FGF21 может понижать уровни глюкозы в крови независимо от инсулина, уменьшать массу тела, и снижать концентрации триглицеридов и липопротеинов низкой плотности (LDL) в крови. Кроме того, благодаря эффекту улучшения чувствительности к инсулину, FGF21 обладает потенциалом для развития в качестве нового терапевтического средства для лечения диабета и ожирения (см. WO2003/011213).
Соответственно, для разработки нового противодиабетического лекарственного средства на основе FGF21 предпринимались попытки улучшить его биологическую активность и стабильность in vivo путем конструирования мутантов FGF21 на основе последовательности FGF21 дикого типа путем замещения, введения и делеции некоторых аминокислот (см. WO2010/065439). Однако, поскольку FGF21 имеет очень короткий период полувыведения, это оказалось проблематичным, если он используется непосредственно в качестве биотерапевтического агента (Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635). Период полувыведения FGF21 in vivo составляет от 1 до 2 часов у мышей и от 2,5 до 3 часов у обезьян. Поэтому для использования FGF21 в его нынешней форме в качестве терапевтического агента для лечения диабета требуется ежедневное введение.
Сообщалось о различных подходах в попытке увеличить период полувыведения in vivo рекомбинантных белков FGF21. Один из таких примеров состоит в связывании полиэтиленгликоля (ПЭГ), т.е. полимерного материала, с FGF21 с целью увеличения его молекулярной массы, тем самым ингибируя почечную экскрецию и увеличивая время удерживания in vivo (см. WO2012/066075). В другом подходе пытаются улучшить период полувыведения посредством его слияния с жирной кислотой, которая связывается с альбумином человека (см. WO2012/010553). В дополнительном примере пытаются увеличить период полувыведения при сохранении фармакологической активности, эквивалентной фармакологической активности FGF21 дикого типа, путем образования агонистического антитела, которое специфически связывается с рецептором FGF человека отдельно или в виде комплекса с β-клото (см. WO2012/170438). В другом примере период полувыведения был улучшен путем получения длительно действующих слитых белков, в которых Fc-область IgG слита с молекулой FGF21 (см. WO2013/188181).
Среди различных технологий, доступных для создания лекарственных средств длительного действия, широко используется технология слияния Fc, поскольку она имеет меньше недостатков, наблюдаемых при других подходах, таких как индуцирование иммунного ответа или токсичность, при увеличении периода полувыведения in vivo. Для разработки Fc-слитого белка FGF21 в качестве терапевтического лекарственного средства длительного действия должны быть выполнены следующие условия.
Во-первых, снижение активности in vitro, вызванное слиянием, должно быть сведено к минимуму. В активности FGF21 участвуют и N-конец, и C-конец FGF21. В этом отношении известно, что деятельность слитых белков FGF21 значительно варьирует в зависимости от местоположения слияния. Соответственно, активность Fc-слитых FGF21 слитых белков, в которых мутации введены в FGF21, может изменяться в зависимости от наличия/отсутствия или местоположения слияния. Во-вторых, фармакокинетический профиль, делающий возможным введение с интервалом один раз в неделю у людей, должен быть реализован за счет увеличения периода полувыведения in vivo путем слияния. В-третьих, учитывая, что после введения биофармацевтических препаратов у большинства пациентов может ожидаться иммуногенность, риск иммуногенности, связанный с линкером слияния или мутацией, должен быть сведен к минимуму. В-четвертых, не должно быть проблем со стабильностью, возникающих из-за положения слияния или введения мутации. В-пятых, поскольку нежелательные иммунные ответы могут возникать в зависимости от изотипов слитого иммуноглобулина, необходимо решение для предотвращения таких ответов.
О попытке разработать длительно действующий слитый белок путем связывания Fc-области иммуноглобулина G (IgG) с молекулой FGF21 уже сообщалось (см. WO 2013/188181). В случае одной структуры Fc-FGF21, где Fc слит с N-концом FGF21 дикого типа, в то время как нет четкой разницы в активности in vitro по сравнению с FGF21 дикого типа, период полувыведения, как известно, весьма короткий вследствие деградации белка in vivo. Чтобы решить эту проблему, была предпринята попытка улучшить период полувыведения in vivo путем введения нескольких мутаций в определенных локализациях FGF21, чтобы противостоять деградации белка. Однако с введением множественных мутаций риск иммуногенности может увеличиться. Напротив, известно, что в случае структуры FGF21-Fc, где Fc слит с C-концом молекулы FGF21, наблюдается значительное снижение активности, вызванное слиянием на этом сайте по сравнению со структурой Fc-FGF21.
Авторы настоящего изобретения пытались улучшить физиологическую активность и стабильность FGF21 и обнаружили, что фармакологическая эффективность FGF21 может быть улучшена, а воздействие in vivo и период полувыведения FGF21 могут быть увеличены без ущерба для активности in vitro при введении мутации в конкретную локализацию FGF21 и область Fc иммуноглобулина, связанную с ним, тем самым совершив настоящее изобретение.
Раскрытие изобретения
Техническая задача
Целью настоящего изобретения является получение слитого белка, содержащего мутантный белок FGF21, с улучшенным сроком действия in vivo, стабильностью белка и фармакологической эффективностью.
Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей слитый белок.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, экспрессионного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор.
Решение задачи
Настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему мутантный белок FGF21 и Fc-область иммуноглобулина, при этом мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):
(1) замена аминокислот в позициях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 42);
(2) замена аминокислот в позициях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 43);
(3) замена аминокислот в позициях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 44);
(4) замена аминокислоты в позиции 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
(5) замена аминокислоты в позиции 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
(6) замена аминокислоты в позиции 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E, наряду с одной или более мутациями (1)-(5) выше; и
(7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.
В дополнение, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, для лечения диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита.
Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, экспрессионному вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяина, содержащей экспрессионный вектор.
Полезные результаты изобретения
Слитый белок согласно настоящему изобретению, полученный посредством связывания Fc-области человеческого иммуноглобулина с мутантным белком FGF21, имеет улучшенные срок действия, стабильность белка и фармакологическую эффективность in vivo. В дополнение, фармацевтическую композицию, содержащую слитый белок в качестве активного ингредиента, можно использовать в качестве терапевтического агента для диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита. В частности, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению имеет преимущество длительного интервала между введениями вследствие повышенной стабильности in vivo слитого белка FGF21 по сравнению с интервалом между введениями традиционной фармацевтической композиции, содержащей белок FGF21.
Краткое описание чертежей
ФИГ. 1A-1C представляют собой графики, демонстрирующие результаты измерения активности in vitro слитых белков, содержащих мутантные белки FGF21 (здесь и далее в документе, «слитый мутантный белок FGF21»), посредством применения клеточной линии HEK293, в которой сверхэкспрессируется человеческий β-клото. Никакие варианты белка, слитого с мутантным FGF21, не показали значительного снижения активности вследствие введения мутаций.
ФИГ. 2A и 2B представляют собой графики, демонстрирующие результаты измерения активности in vitro слитых мутантных белков FGF21 в зависимости от линкеров, которые соединяют N-конец FGF21 с Fc-областью, посредством применения клеточной линии HEK293, в которой сверхэкспрессируется человеческий β-клото. Никакие варианты белка, слитого с мутантным FGF21, не показали значительного снижения активности, хотя наблюдались небольшие различия в отношении активности в зависимости от линкерной последовательности.
ФИГ. 3 представляет собой график, демонстрирующий результаты измерения активности in vitro RGE (Amgen), Fc-FGF21 (Lilly) и DFD1, с использованием клеточной линии HEK293, в которой сверхэкспрессируется человеческий β-клото. DFD1 и RGE (Amgen) имеют сходную активность, тогда как Fc-FGF21 (Lilly) имеет активность in vitro в два раза выше, чем другие белки.
ФИГ. 4 демонстрирует график, сравнивающий стабильность DFD4 со стабильностью DFD13 с целью подтверждения действия мутации EIRP (в FGF21) на стабильность слитого белка. Было подтверждено, что DFD13 имеет более низкий показатель высокомолекулярных агрегатов (HMW%) на начальной стадии и в момент времени более чем 2 недели по сравнению с DFD4, что указывает на то, что введение мутации EIRP повышает стабильность белка, слитого с мутантным FGF21, тем самым значительно уменьшая HMW%.
ФИГ. 5 представляет собой график, демонстрирующий концентрацию каждого белка в крови в течение 96 часов после подкожного введения слитых мутантных белков FGF21. Данные показаны в виде средних значений и стандартного отклонения.
ФИГ. 6 представляет собой график, демонстрирующий уровни глюкозы в крови в мышиной модели ob/ob после однократной подкожной инъекции DFD18, DFD72, DFD74 или Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 и DFD74 все имели эффект постепенного снижения уровней глюкозы в крови. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего (S.E.M.).
ФИГ. 7 демонстрирует график, показывающий изменения массы тела в мышиной модели ob/ob со дня введения к 14му дню после однократной подкожной инъекции DFD18, DFD72, DFD74 или Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 и DFD74 все имели эффект снижения массы тела по сравнению с группой, обработанной PBS. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
ФИГ. 8 демонстрирует графики, показывающие изменения уровней гликированного гемоглобина в мышиной модели ob/ob в день введения (1ый день) и на 16ый день после однократной подкожной инъекции DFD18, DFD72, DFD74 или Fc-FGF21 (Lilly). DFD18, DFD72 и DFD74 все вызвали снижение уровня гликированного гемоглобина на 16ый день по сравнению с уровнями гликированного гемоглобина в день введения. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
ФИГ. 9 представляет собой график, демонстрирующий уровни глюкозы в крови в мышиной модели HFD/STZ после однократной подкожной инъекции DFD72 или DFD74. И DFD72, и DFD74 имели эффект постепенного снижения уровней глюкозы в крови. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
ФИГ. 10 демонстрирует графики, показывающие изменения массы тела в мышиной модели HFD/STZ со дня введения к 14му дню после однократной подкожной инъекции DFD72 или DFD74. И DFD72, и DFD74 имели эффект снижения массы тела по сравнению группой, обработанной PBS. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
ФИГ. 11 демонстрирует графики, показывающие изменения уровней гликированного гемоглобина в мышиной модели HFD/STZ на 1ый день и 13ый день после однократной подкожной инъекции DFD72 или DFD74. Было показано, что обработка как DFD72, так и DFD74 привела к большему уменьшению уровней гликированного гемоглобина по сравнению с группой, обработанной PBS. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
ФИГ. 12 демонстрирует графики, показывающие изменения массы тела, измеренные в мышиной модели алиментарного ожирения со дня введения к 14му дню после однократного введения DFD18. DFD18 оказал превосходное влияние на снижение массы тела. Данные показаны в виде средних значений и стандартной ошибки среднего.
Наилучший способ осуществления изобретения
Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21) и Fc-область иммуноглобулина, при этом мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(7):
(1) замена аминокислот в позициях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 42) (здесь и далее «EIRP»);
(2) замена аминокислот в позициях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 43) (здесь и далее «TGLEAV»);
(3) замена аминокислот в позициях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 44) (здесь и далее «TGLEAN»);
(4) замена аминокислоты в позиции 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N (здесь и далее «G170N»);
(5) замена аминокислоты в позиции 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N (здесь и далее «G174N»);
(6) замена аминокислоты в позиции 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E (здесь и далее «A180E»), наряду с одной или более мутациями (1)-(5) выше; и
(7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.
Белок FGF21 дикого типа, гормон, известный как играющий важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов, может быть получен от млекопитающих, таких как люди, мыши, свиньи, обезьяны и т.д., предпочтительно от людей. Более предпочтительно, белок FGF21 дикого типа может представлять собой человеческий белок FGF21 дикого типа, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
Мутацией, включенной в мутантные белки FGF21, предпочтительно может быть любая мутация из EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N; комбинация любой одной мутации из TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутации EIRP; комбинация любой одной мутации из EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутации A180E; или комбинация любой одной мутации из TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N, мутации EIRP и мутации A180E. Более того, мутантные белки FGF21 могут иметь конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или C-конце удалена (удалены) по сравнению с белком FGF21 дикого типа. Более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, представленную любой одной из SEQ ID NO: 6-23. Еще более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, представленную любой одной из SEQ ID NO: 6-23 и дополнительно имеют конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или C-конце удалена (удалены) по сравнению с белком FGF21 дикого типа.
В слитом белке аминокислотный остаток N мутантного белка FGF21, введенный посредством мутации, может быть гликированным.
В рамках изобретения, термин «Fc-область», «Fc-фрагмент» или «Fc» относится к белку, который содержит константный участок 1 тяжелой цепи (CH1), константный участок 2 тяжелой цепи (CH2) и константный участок 3 тяжелой цепи (CH3) иммуноглобулина, но не содержит вариабельные области тяжелых и легких цепей, и константный участок 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Кроме того, в рамках изобретения, термин «мутантная Fc-область» относится к Fc-области, полученной посредством замещения части аминокислоты (аминокислот) Fc-области или посредством комбинирования Fc-областей различных типов.
Fc-область иммуноглобулина может представлять собой всю Fc-область, составляющую антитело, ее фрагмент или мутантную Fc-область. Кроме того, Fc-область содержит молекулу в форме мономера или мультимера, и дополнительно может содержать шарнирную область константного участка тяжелой цепи. Мутантная Fc-область может быть модифицирована для предотвращения расщепления в шарнирной области. Более того, шарнирная последовательность Fc может иметь замену в нескольких аминокислотных последовательностях для уменьшения антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). В дополнение, часть аминокислотной последовательности шарнирной последовательности Fc может быть замещена для ингибирования реаранжировки Fab-области. Остаток лизина на C-конце Fc может быть удален.
Предпочтительно, Fc-областью иммуноглобулина может быть любая из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD; или гибридная Fc, которая представляет собой их комбинацию. Кроме того, гибридная Fc может содержать область IgG4 и область IgD. Кроме того, гибридная Fc-область может содержать часть шарнирной последовательности и CH2 IgD Fc, и CH2 и CH3 последовательности IgG4 Fc.
В дополнение, Fc-фрагмент согласно настоящему изобретению может быть в форме гликозилированной цепи дикого типа, более гликозилированной цепи, чем дикого типа, менее гликозилированной, цепи чем дикого типа, или дегликозилированной цепи. Увеличение, уменьшение или удаление гликозилированной цепи может осуществляться обычным способом, известным в данной области, таким как химический метод, ферментативный метод и метод генной инженерии с использованием микроорганизмов.
Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена SEQ ID NO: 24 или 25. В дополнение, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена SEQ ID NO: 26.
Кроме того, слитый белок может дополнительно содержать линкер.
Слитый белок может быть в форме, в которой мутантный белок FGF21 непосредственно соединен с N-концом или C-концом Fc-области иммуноглобулина, или мутантный белок FGF21 соединен с Fc-областью иммуноглобулина через линкер.
В таком случае, линкер может быть соединен с N-концом, C-концом или свободным радикалом Fc-фрагмента, а также может быть соединен с N-концом, C-концом или свободным радикалом мутантного белка FGF21. Когда линкер представляет собой пептидный линкер, соединение может произойти в любой области. Например, для формирования слитого белка Fc-области иммуноглобулина и мутантного белка FGF21 линкер может быть соединен с С-концом Fc-области иммуноглобулина и N-коном мутантного белка FGF21.
Когда линкер и Fc экспрессируют отдельно, а затем соединяют, линкер может представлять собой сшивающий агент, известный в данной области. Примеры сшивающего агента могут включать 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, имидоэфиры, включая сложный эфир N-гидроксисукцинимида, такой как 4-азидосалициловая кислота и дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис (сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, но без ограничения.
Кроме того, линкер может представлять собой пептид. Предпочтительно, линкером может быть пептид, состоящий из 10-30 аминокислотных остатков.
Кроме того, к концу линкера может быть прикреплен дополнительно аланин. Предпочтительно линкер может представлять собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную любым из SEQ ID NO: от 2 до 5.
Слитый белок может находиться в форме, в которой димер или мультимер мутантных белков FGF21, в которых один или несколько мутантных белков FGF21 связаны между собой, связаны с Fc-областью иммуноглобулина. Кроме того, слитый белок может находиться в форме димера или мультимера, в котором связаны две или более Fc-областей иммуноглобулина, при этом Fc-области иммуноглобулина имеют связанный с ними мутантный белок FGF21.
Кроме того, слитый белок может быть пептидом, который предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 27-39. Более предпочтительно слитый белок, содержащий мутантный белок FGF21, может представлять собой пептид, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36, 37 или 39.
Иммуногенность, описанная выше (7), может быть прогнозирована обычным способом, известным в данной области. Например, потенциальную иммуногенность белка можно скринировать с использованием, например, методов iTope™ и TCED™.
Кроме того, мутации для минимизации иммуногенности могут быть разработаны обычным способом, известным в данной области. Например, когда иммуногенность наблюдается при проведении анализа EpiScreen™ для оценки потенциальной иммуногенности, аминокислотные последовательности, индуцирующие иммуногенность, могут быть идентифицированы посредством картирования эпитопов Т-клеток, а мутанты с минимизированной иммуногенностью могут быть сконструированы посредством прогнозирования in silico.
Слитый белок может иметь форму, с которой один или несколько биологически активных белков (связан) связаны друг с другом. Биологически активный белок может быть выбран из группы, состоящей из инсулина, C-пептида, лептина, глюкагона, гастрина, желудочного ингибиторного полипептида (GIP), амилина, кальцитонина, холецистокинина, пептида YY, нейропептида Y, костного морфогенетического белка-6 (BMP-6), костного морфогенетического белка-9 (BMP-9), оксинтомодулина, окситоцина, глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), иризина, белка, содержащего домен фибронектина типа III-5 (FNDC5), апелина, адипонектина, C1q и белка, связанного с фактором некроза опухоли (семейство CTRP), резистина, висфатина, оментина, ретинолсвязывающего белка-4 (RBP-4), глицентина, ангиопоэтина, интерлейкина-22 (IL -22), эксендина-4 и гормона роста. Предпочтительно биологически активный белок может быть выбран из GLP-1, его мутанта и эксендина-4.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, для лечения FGF21-ассоциированных расстройств.
В рамках изобретения, термин «FGF21-ассоциированное расстройство» может включать ожирение, диабет типа I и типа II, панкреатит, дислипидемию, неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), неалкогольный стеатогепатит (NASH), резистентность к инсулину, гиперинсулинемию, нарушение толерантности к глюкозе, гипергликемию, метаболический синдром, острый инфаркт миокарда, артериальную гипертензию, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, заболевание периферических артерий, апоплексию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, заболевание почек, осложнения диабета, невропатию, парез желудка, расстройство, связанное с серьезной инактивацией мутации в рецепторе инсулина и другими нарушения обмена веществ. Предпочтительно, FGF21-ассоциированное расстройство может быть диабетом, ожирением, дислипидемией, метаболическим синдромом, неалкогольной жировой болезнью печени, безалкогольным стеатогепатитом или сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Кроме того, фармацевтическая композиция дополнительно может содержать фармацевтический носитель. Фармацевтический носитель может быть любым носителем при условии, что он является нетоксичным материалом, подходящим для доставки антител пациентам. Например, в качестве носителя могут быть включены дистиллированная вода, спирт, жиры, воски и неактивные твердые вещества. Также в фармацевтическую композицию могут быть включены фармацевтически приемлемые адъюванты (буферизирующие агенты, диспергаторы). В этих готовых формах концентрация слитого белка может сильно различаться.
Более конкретно, фармацевтическая композиция может содержать материал готовой формы для изменения, поддержания или сохранения рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проницаемости композиции. Примерами подходящего материала готовой формы могут быть аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные агенты, антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, сульфит натрия или бисульфит натрия), буферизирующие агенты (например, бораты, бикарбонаты, трис-HCl, цитрат, фосфат или другие органические кислоты), наполнители (например, маннитол или глицин), хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)), комплексообразующие агенты (например, кофеин, поливинилпирролидион, β-циклодекстрин или гидроксипропил-β-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкоза, манноза или декстрин), белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин), красители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (например, поливинилпирролидон), полипептиды с низкой молекулярной массой, солеобразующие противоионы (например, натрий), консерванты (например, бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, (например, глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (например, маннит или сорбит), суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества или увлажнители (например, плюроники; PEG; сорбитановый эфир; полисорбат, например, полисорбат 20 или полисорбат 80; тритон; трометамин; лецитин; холестерин или тилоксапол), улучшители стабильности (например, сахароза или сорбитол), улучшители роста (например, галогениды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или хлорид калия или маннитол, сорбитол), средства доставки, разбавители, эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты, но без ограничения ими.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения связанных с FGF21 расстройств, включая введение слитого белка больному, нуждающемуся в такой профилактике или лечении. Этот способ включает, в частности, введение эффективного количества слитого белка настоящего изобретения млекопитающему, имеющему симптом диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жирной болезни печени, неалкогольного стеатогепатита или сердечно-сосудистых заболеваний, которые представляют собой FGF21-ассоциированные расстройства.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым способом. Композиция согласно настоящему изобретению может быть доставлена животному непосредственно (например, топически, путем введения в области ткани посредством инъекции, трансплантации или местного введения) или системно (например, путем перорального или парентерального введения) с помощью любого подходящего средства. Когда композицию согласно настоящему изобретению вводят парентерально через внутривенное, подкожное, офтальмическое, интраперитонеальное, внутримышечное, пероральное, ректальное, интраорбитальное, внутримозговое, внутричерепное, интраспинальное, внутрижелудочковое, интратекальное, интрацистернальное, интракапсулярное, интраназальное или аэрозольное введение, композиция предпочтительно является водной или может включать часть физиологически применимой для организма жидкой суспензии или раствора. Соответственно, носитель или несущую среду можно добавить к композиции и доставлять пациенту при условии, что он является физиологически применимым. Поэтому в качестве носителя обычно может быть включен физиологически приемлемый солевой раствор, такой как текучая среда организма для готовых форм.
Кроме того, частота введения может варьировать в зависимости от фармакокинетических параметров слитого белка в готовых формах, подлежащих использованию. Как правило, врачи будут вводить композицию до тех пор, пока вводимая доза не достигнет желаемого эффекта. Соответственно, композиция может вводиться в виде единичной дозы, по меньшей мере двух доз с временными интервалами (могут содержать или не содержать одинаковое количество целевого слитого белка) или вводиться путем непрерывной инъекции через трансплантационное устройство или катетер. Точность добавления соответствующей вводимой дозы обычно может обеспечиваться специалистами в данной области, и соответствует объему работы, обычно выполняемой ими.
Кроме того, предпочтительная разовая доза слитого белка у людей может составлять от 0,01 мкг/кг до 100 мг/кг массы тела и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 10 мг/кг массы тела. Хотя это оптимальное количество, разовая доза может варьировать в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, или наличия/отсутствия побочных эффектов. Тем не менее, оптимальная вводимая доза может быть определена посредством проведения обычного эксперимента. Введение слитого белка может быть осуществлено посредством периодической болюсной инъекции, внешнего резервуара (например, внутривенного мешка) или непрерывного внутривенного, подкожного или внутрибрюшинного введения из внутреннего источника (например, биоэродируемого имплантата).
В дополнение, слитый белок согласно настоящему изобретению можно вводить больному-реципиенту наряду с другими биологически активными молекулами. Оптимальная комбинация слитого белка и другой молекулы (молекул), дозированные формы и оптимальные дозы могут быть определены посредством обычного эксперимента, хорошо известного в данной области.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок.
В рамках изобретения, термин «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, которую выделяют из приблизительно по меньшей мере 50% белков, липидов, углеводов или других материалов, обнаруженных в природе, при выделении из клетки-источника полных нуклеиновых кислот; которая функционально связана с полинуклеотидом, который не связан в природе; или который является частью более крупной полинуклеотидной последовательности и не встречается в природе. Предпочтительно, в молекулах выделенной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению по существу не присутствуют какие-либо другие загрязненные нуклеиновые кислоты или другие загрязняющие вещества, которые обнаруживаются в естественной среде и тормозят использование нуклеиновых кислот в получении полипептидов или лечении, диагностике, профилактике или исследовании.
В таком случае выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок, вследствие избытка кодонов могут иметь разные последовательности друг с другом. Кроме того, до тех пор, пока выделенная нуклеиновая кислота может продуцировать слитый белок, выделенная нуклеиновая кислота может быть соответствующим образом модифицирована, или к N-концу или С-концу выделенной нуклеиновой кислоты в соответствии с желаемыми целями может быть добавлен нуклеотид.
Выделенная нуклеиновая кислота может содержать, например, нуклеотидную последовательность, представленную любым из SEQ ID NO: 45-57.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок, содержащий мутантный белок FGF21 и Fc-область иммуноглобулина
В рамках изобретения, термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, которая подходит для трансформации клетки-хозяина и направляет или контролирует экспрессию вставленной гетерогенной последовательности нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор содержит линейную нуклеиновую кислоту, плазмиду, фагемид, космиду, РНК-вектор, вирусный вектор и их аналоги. Примеры вирусного вектора включают ретровирус, аденовирус и аденоассоциированный вирус, но без ограничения ими.
В рамках изобретения, термин «экспрессия гетерогенной последовательности нуклеиновой кислоты» или «экспрессия» целевого белка относится к транскрипции вставленной последовательности ДНК, трансляции мРНК-транскрипта и выработки продукта слитого с Fc белка, антитела или фрагмента антитела.
Полезным экспрессионным вектором может быть RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) или его мутант. Полезный экспрессионный вектор может включать промотор человеческого цитомегаловируса (ЦМВ) для промоции непрерывной транскрипции гена-мишени в клетке млекопитающего и сигнальную последовательность полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота для повышения уровня посттранскрипционной стабильности РНК. В иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессионный вектор представляет собой pAD15, который является модифицированным вектором RcCMV.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор.
В рамках изобретения, термин «клетка-хозяин» относится к прокариотической клетке или эукариотической клетке, в которую может быть введен рекомбинантный экспрессионный вектор. В рамках изобретения, термин «трансформированный» или «трансфицированный» относится к введению нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку с помощью различных технологий, известных в данной области.
Соответствующая клетка-хозяин может быть трансформирована или трансфицирована ДНК-последовательностью настоящего изобретения и может быть использована для экспрессии и/или секреции белка-мишени. Примеры подходящей клетки-хозяина, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают иммортализированные клетки гибридомы, клетки миеломы NS/0, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки CAP (клетки, полученные из амниотической жидкости человека) и клетки COS.
Далее иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны со ссылкой на примеры. Однако эти примеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы во многих различных формах, и объем настоящего изобретения не должен истолковываться как ограниченный примерами, изложенными в настоящем описании.
Вариант осуществления изобретения
Пример получения 1. Получение и очистка слитого белка, содержащего мутантный белок FGF21
Пример получения 1-1. Получение экспрессионных векторов для экспрессии мутантных белков FGF21
С целью улучшения стабильности, активности и фармакокинетических профилей FGF21 в структуре Fc-FGF21, были проведены исследования мутации FGF21.
Конкретно, мутантные белки были разработаны для области LLLE (аминокислоты в позициях от 98 до 101 от N-конца белка FGF21) и области GPSQG (аминокислоты в позициях от 170 до 174 от N-конца белка FGF21) и сайта А180, которые, как ожидается, будут существенно влиять на активность белка на основе трехмерного структурного анализа белков FGF21.
В таблице 1 ниже перечислены положение, информация о последовательности, целевой и ожидаемый эффект каждой мутации, вводимой в белок FGF21, (в таблице 1 N относится к гликозилированному аспарагину (N)). Кроме того, в таблице 2 ниже перечислены мутантные белки FGF21, содержащие мутации, описанные в таблице 1.
[Таблица 1]
Последовательность Позиция Оригинальная последовательность Мутированная последовательность Мишень Ожидаемый эффект
EIRP 98-101 LLLE EIRP Замена FGF19 последовательностью Улучшение стабильности и фармакокинетики
TGLEAV 170-174 GPSQG TGLEAV Замена FGF19 последовательностью Улучшение фармакокинетики
TGLEAN 170-174 GPSQG TGLEAN Замена FGF19 последовательностью и добавление N-гликозилирования Улучшение фармакокинетики
G170N 170 G N Точечная мутация и добавление N-гликозилирования Улучшение фармакокинетики
G174N 174 G N Точечная мутация и добавление N-гликозилирования Улучшение фармакокинетики
A180E 180 A E Точечная мутация Улучшение фармакокинетики
[Таблица 2]
SEQ ID NO Последовательность мутантного белка FGF21
6 FGF21 (EIRP)
7 FGF21 (TGLEAV)
8 FGF21 (TGLEAN)
9 FGF21 (G170N)
10 FGF21 (G174N)
11 FGF21 (EIRP, TGLEAV)
12 FGF21 (EIRP, TGLEAN)
13 FGF21 (EIRP, G170N)
14 FGF21 (EIRP, G174N)
15 FGF21 (EIRP, A180E)
16 FGF21 (TGLEAV, A180E)
17 FGF21 (TGLEAN, A180E)
18 FGF21 (G170N, A180E)
19 FGF21 (G174N, A180E)
20 FGF21 (EIRP, TGLEAV, A180E)
21 FGF21 (EIRP, TGLEAN, A180E)
22 FGF21 (EIRP, G170N, A180E)
23 FGF21 (EIRP, G174N, A180E)
Экспрессирующие векторы были получены для экспрессии аминокислот трех компонентов: слитого носителя, линкера и мутанта FGF21 в этом порядке от N-конца до С-конца. В таблице 3 ниже перечислены код материала каждого слитого с мутантом белка FGF21, последовательность мутаций, введенных в FGF21, последовательность слитого носителя и последовательность линкера (в таблице 3 N относится к гликозилированному аспарагину (N)).
[Таблица 3]
SEQ ID NO Код материала Последовательность мутации FGF21 Слитый носитель Линкерная последовательность
27 DFD1 EIRP, TGLEAV hyFc (SEQ ID NO: 26) C (SEQ ID NO: 2)
28 DFD3 TGLEAV hyFc (SEQ ID NO: 26) AKA (SEQ ID NO: 3)
29 DFD4 TGLEAV hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
30 DFD5 TGLEAN hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
31 DFD6 G170N hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
32 DFD6 (E. coli) G170N hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
33 DFD7 G174N hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
34 DFD9 нет hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
35 DFD13 EIRP, TGLEAV hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
36 DFD18 EIRP, TGLEAV, A180E hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
37 DFD72 EIRP, TGLEAN, A180E hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
38 DFD73 EIRP, G170N hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
39 DFD74 EIRP, G170N, A180E hyFc (SEQ ID NO: 26) GS3 (SEQ ID NO: 4)
40 RGE (Amgen) L98R, P171G, A180E Мутант IgG1Fc GS3 (SEQ ID NO: 4)
41 Fc-FGF21 (Lilly) X Мутант IgG4Fc (SEQ ID NO: 25) GS3A (SEQ ID NO: 5)
С целью получения белков, слитых с мутантным FGF21, нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из мутантных белков FGF21, были синтезированы путем консультирования с Bioneer Corporation (Корея), основываясь на аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности рестрикционных ферментов NheI и NotI добавляли к 5'-концу и 3'-концу нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из мутантных белков FGF21, и инициирующий кодон для трансляции белка и лидерная последовательность (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), способная секретировать экспрессированный белок наружу клетки, были вставлены рядом с последовательностью рестрикционного фермента на 5'-конце. Терминирующий кодон был вставлен рядом с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует каждый из слитых с мутантным FGF21 белков. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из слитых с мутантным FGF21 белков, клонировали в экспрессионный вектор pTrans-empty с использованием двух рестрикционных ферментов NheI и NotI. Экспрессионный вектор pTrans-empty, который имеет простую структуру, включающую промотор CMV, полученный из pUC ориджин репликации, полученный из SV40 ориджин репликации, и ген, устойчивый к ампициллину, был приобретен у CEVEC Pharmaceuticals (Германия).
В случае слитых белков DFD6 (E. coli) и RGE (Amgen) нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый слитый белок, вводили в экспрессионный вектор pET30a для экспрессии в E. coli.
Пример получения 1-2. Конструирование плазмидной ДНК для экспрессии белков, слитых с мутантным FGF21
Чтобы получить большое количество плазмидной ДНК, которая должна использоваться для экспрессии, E. coli трансформировали каждым из экспрессионных векторов, сконструированных в Примере получения 1-1. Клетки E. coli, клеточные стенки которой были ослаблены, трансформировали каждым экспрессионным вектором через тепловой шок, а трансформанты высевали на пластины с LB для получения колоний. Полученные таким образом колонии инокулировали в среду LB, культивировали при 37°C в течение 16 часов, и каждую культуру E. coli, содержащую каждый экспрессирующий вектор, получали в объеме 100 мл. Полученную таким образом E. coli центрифугировали для удаления культуральной среды, а затем для разрушения клеточных стенок добавляли растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, Cat No. 12963), в результате чего получали суспензию ДНК, в которой были разделены белки и ДНК. Плазмидную ДНК очищали от суспензии ДНК, полученной таким образом, используя колонку для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК идентифицировали с помощью электрофореза в агарозном геле, и концентрации и чистоту измеряли с использованием устройства NanoDrop (Thermo scientific, Nanodrop Lite). Полученную таким образом ДНК использовали для экспрессии.
Пример получения 1-3. Экспрессия слитых белков в клетках CAP-T
Линии клеток человека трансфицировали каждым типом плазмидной ДНК, полученным в примере получения 1-2. Каждый тип плазмидной ДНК трансдуцировали в CAP-T-клетки (CEVEC), которые культивировали в среде PEM (Life technologies) с использованием раствора PEI (Polyplus, Cat. No.:101-10N). Смешанный раствор ДНК и раствор PEI смешивали с суспензией клеток с использованием экспрессионной среды Freestyle293 (Invitrogen), культивировали при 37°C в течение 5 часов и добавляли среду PEM. После культивирования при 37°С в течение 5-7 дней культуру центрифугировали для удаления клеток и получали супернатант, содержащий слитые с мутантным FGF21 белки.
Пример получения 1-4. Экспрессия и очистка белков, слитых с мутантным FGF21 в E. coli
Штамм BL21 (DE3) E. coli трансформировали каждой плазмидной ДНК, экспрессирующей слитые белки DFD6 (E. coli) и RGE (Amgen). Трансформированную E. coli, экспрессирующую каждый слитый белок, инокулировали в 20 мл среды LB, культивировали при 37°C в течение 15 часов со встряхиванием, а затем часть культуральной среды инокулировали в 100 мл среды LB и культивировали при 37°C в течение 16 часов со встряхиванием. По завершении культивирования культуру центрифугировали, получая пеллеты E.coli, а затем для получения телец включения клетки разрушали с помощью клеточного разрушителя высокого давления.
Полученные тельца включения очищали путем промывки и элюирования с последующим процессом реконфигурации белка. В частности, полученные тельца включения промывали 2-3 раза буферным раствором (рН 8,0), содержащим 0,5% Triton X-100, 50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА и 0,1 М NaCl для удаления бактериального белка, и затем ресуспендировали в 8 М мочевины, содержащей 8 М мочевины, 50 мМ Трис и 1 мМ DTT. Так как белки в буфере с 8 М мочевины были полностью денатурированы, процесс реконфигурации белка выполнялся следующим образом.
Для начала буфер с 8 М мочевины постепенно разбавляли 20 мМ буферным раствором глицина (рН 9,0) для удаления мочевины и от концентрации 2 М до концентрации 80 мкМ добавляли CuSO4 для индуцирования стабильной укладывания белка. Белок, завершающий процесс реконфигурации, суспендировали в буферном растворе PBS (рН 7,4), и для удаления примесей суспензию фильтровали с помощью фильтра 0,22 мкм, а затем загружали в колонку для аффинной хроматографии с белком А. Колонку промывали 1X PBS-буферным раствором (pH 7,4), а затем для получения слитого белка DFD6 (E. coli) белки элюировали, используя 100 мМ буферный раствор глицина (рН 3,0).
В случае слитого белка RGE (Amgen), белок, завершающий процесс реконфигурации, суспендировали в 50 мМ буферном растворе Трис (рН 8,0), для удаления примесей суспензию фильтровали с помощью фильтра 0,22 мкм, а затем загружали в колонку с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 μm, Thermo Fisher Scientific). Колонку промывали 50 мМ буферным раствором Трис (рН 8,0), затем добавляли 50 мМ буферный раствор Трис (рН 8,0) вдоль концентрационного градиента для элюирования слитого белка RGE (Amgen). Слитый белок RGE (Amgen), полученный с помощью анионообменной смолы, смешивали с сульфатом аммония до концентрации 1 М, а затем очищали, используя колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием (Phenyl sepharose FF, GE Healthcare). Более конкретно, колонку промывали 50 мМ буферным раствором Трис (pH 8,0), содержащим 1 М сульфата аммония, 50 мМ буферный раствор Трис(рН 8,0) вводили вдоль градиента концентрации, и элюированные фракции анализировали с помощью 10%-ного электрофореза в трис-глициновом геле. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R с мягким встряхиванием, а фракции, содержащие белок, слитый с мутантным FGF21, с высокой степенью чистоты собирали, а затем диализировали в течение ночи при 4°C с использованием итогового буферного раствора (1X PBS, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4). По завершении диализа полученный белковый основной раствор концентрировали при 3000 об/мин, используя фильтр центрифугирования с отсечкой 30000 МВт при 4°С. Концентрацию слитого с мутантным FGF21 белка измеряли с помощью количественного анализа BCA.
Пример получения 1-5. Очистка белков, слитых с мутантным FGF21
Колонку для аффинной хроматографии на белке А (GE Healthcare) уравновешивали 1X буферным раствором PBS (pH 7,4). Супернатант культуры, содержащий каждый слитый с мутантным FGF21 белок, полученный в примере получения 1-3, фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкм, а затем загружали в колонку для аффинной хроматографии на белке А. Колонку промывали 1X PBS-буферным раствором (pH 7,4), а затем белки элюировали, используя 100 мМ буферный раствор глицина (рН 3,0). Слитые белки, полученные посредством аффинной хроматографии, очищали с использованием колонки с анионообменной смолой (POROS® HQ 50 μm, Thermo Fisher Scientific). Колонку с анионообменной смолой уравновешивали 50 мМ буферным раствором Трис (рН 8,0) до того, как слитые с мутантным FGF21 белки элюировались из колонки. В частности, после промывания колонки 50 мМ буферным раствором Трис (рН 8,0) 50 мМ буферный раствор трис(рН 8,0) распределяли вдоль градиента концентрации и анализировали элюированные фракции. Каждую элюированную фракцию анализировали с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC-HPLC) и собирали фракции, включающие слитые с мутантным FGF21 белки с высокой степенью чистоты. Концентрацию и количественный анализ проводили в соответствии со способами, описанными в примере получения 1-4.
Экспериментальный Пример 1. Активность in vitro слитых белков
Экспериментальный Пример 1-1. Действие мутаций FGF21 на активность белка
Измеряли активность in vitro слитых белков DFD4, DFD5, DFD6, DFD6 (E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 и DFD74, полученных в примере получения 1.
Более конкретно, активность in vitro слитых с FGF21 белков оценивали с использованием клеточной линии HEK293 (Yuhan Corporation, Korea), которая была модифицирована для сверхэкспрессии человеческого β-клото, корецептора FGF21. Для оценки активности концентраты, содержащие слитые белки, полученные в примерах получения 1-4 и 1-5, подвергали трехкратному серийному разведению в концентрации 3 мкМ. После культивирования в состоянии дефицита сыворотки в течение 5 часов клеточную линию, сверхэкспрессирующую человеческий β-клото, обрабатывали разбавленными слитыми белками в течение 20 минут и затем лизировали путем добавления буфера для цитолиза (Cisbio/Cat# 64ERKPEG) при перемешивании при 60 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор клеточного лизата смешивали с антителами (Cisbio/Cat # 64ERKPEG), которые могли обнаруживать внеклеточную сигнальную киназу (ERK) и фосфорилированную ERK, и смесь сохраняли при комнатной температуре в течение 2 часов. Флуоресценцию определяли с помощью флуорометрического детектора (TECAN/GENiosPro). Активность слитых белков определяли путем сравнения их значений EC50.
Как показано на ФИГ. 1A-1C, было подтверждено, что активность in vitro слитых белков, полученных путем введения мутационных последовательностей в белок FGF21 дикого типа, не ингибировалась, а активность каждого слитого белка была сходна между собой. Было также подтверждено, что через образец DFD6 (E. coli), экспрессированный в E. coli, и образец DFD6, экспрессированный в клетках животных, активность in vitro слитых белков, полученных путем введения мутации N-гликозилирования в белок FGF21 дикого типа, не была ингибирована.
Экспериментальный Пример 1-2. Действие линкерной последовательности на активность белка
Измеряли активность in vitro слитых белков DFD1, DFD3, DFD4 и DFD13, полученных в примере получения 1.
Более конкретно, измеряли активность FGF21 слитых белков посредством применения концентратов, содержащих слитые белки, полученные в примере получения 1-5 в соответствии со способами, описанными в Экспериментальном Примере 1-1. Результаты представлены на ФИГ. 2A и 2B.
Было подтверждено, что никакой слитый с мутантным FGF21 белок не показал значительного снижения активности, хотя была показана небольшая разница в активности в зависимости от линкерной последовательности, как показано на фиг. 2А и 2В.
Экспериментальный Пример 1-3. Результаты экспериментов для DFD1, RGE (Amgen) и Fc-FGF21 (Lilly)
Измеряли активность in vitro слитого белка DFD1, полученного в примере получения 1, и контрольных белков RGE (Amgen) и Fc-FGF21 (Lilly).
Более конкретно, активность FGF21 слитых белков измеряли с использованием концентратов, содержащих слитые белки, полученные в примере получения 1-5, и контрольных белков в соответствии со способами, описанными в экспериментальном примере 1-1. Результаты представлены на ФИГ. 3.
Было подтверждено, что DFD1 и A (Amgen) обладают сходной активностью in vitro, тогда как Fc-FGF21 (Lilly) обладает активностью in vitro в два раза выше, чем у других белков, как показано на фиг. 3.
Экспериментальный Пример 2. Оценка стабильности слитых белков
Экспериментальный Пример 2-1. Экспериментальный способ для оценки стабильности
Чтобы измерить количество агрегатов белка на начальном этапе получения образца, высокомолекулярные агрегаты (% HMW) количественно определяли с использованием метода размерной эксклюзионной хроматографии (SEC-HPLC). Результаты представлены на ФИГ. 4.
Более конкретно, для метода SEC-HPLC использовалась колонка TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL. Колонку уравновешивали путем пропускания буферного раствора (1X PBS, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4) со скоростью потока 1 мл/мин. Основные растворы белков DFD4 и DFD13, полученные в примерах получения 1-5, концентрировали до целевой концентрации 20 мг/мл или выше при 3000 об/мин, используя фильтр центрифугирования с отсечкой 30000 МВт при 4°С. После измерения концентрации каждого образца посредством количественного анализа ВСА образцы разбавляли буферным раствором (1X PBS, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4) до конечной концентрации 20 мг/мл. Для измерения начальных % HMW DFD4 и DFD13 20 мг/мл образцов разбавляли буферным раствором (1X PBS, 1 мМ EDTA, pH 7,4) до конечной концентрации 1 мг/мл, и каждый образец в объеме 100 мкл анализировали посредством колонки SEC-HPLC.
Для оценки стабильности каждого образца % HMW образцов измеряли с использованием метода SEC-HPLC на 4ый, 8ой и 14ый дни при их хранении при 5°C, 25°C и 37°C в течение двух недель.
Как показано на фиг. 4, было подтверждено, что DFD13 имеет меньшее количество высокомолекулярных агрегатов (HMW%) на начальном этапе и до 2 недель по сравнению с DFD4, что указывает на то, что введение мутации EIRP повышает стабильность FGF21, тем самым значительно уменьшая HMW.
Экспериментальный Пример 2-2. Результаты, описывающие стабильность
С целью исследования влияния мутации EIRP, введенной в исходную последовательность LLLE (98-101) FGF21, на стабильность, стабильность DFD4 (SEQ ID NO: 29) и DFD13 (SEQ ID NO: 35) измеряли в соответствии с методами, описанными в экспериментальном примере 2-1. Результаты анализа для образца нулевого часа (начальная стадия, день 0) и 4-, 8- и 14-дневных образцов DFD4 и DFD13 суммированы в таблице 4 ниже (в таблице 4 ND означает «не обнаружено»).
[Таблица 4]
Стабильность DFD4 и DFD13 в течение 2 недель при концентрации 20 мг/мл (%HMW)
DFD4 DFD13
День 5°C 25°C 37°C 5°C 25°C 37°C
0 0,91 0,56
4 4,25 11,64 5,12 0,36 0,34 0,84
8 6,16 9,99 4,87 N.D. N.D. N.D.
14 8,15 8,83 4,71 N.D. N.D. 0,32
Как показано в таблице 4, количество % HMW на начальной стадии (день 0) составило 0,91% для DFD4 и 0,56% для DFD13. Через 2 недели количество %HMW увеличилось до 8,83% для DFD4, но оно не наблюдалось в DFD13 при условии хранения при 25°C. Было показано, что DFD13 имеет более низкую долю %HMW на начальной стадии и через 2 недели по сравнению с DFD4, что указывает на то, что доля %HMW мутантного слитого белка FGF21 значительно снизилась вследствие введения мутации EIRP.
Экспериментальный Пример 3. Фармакокинетическая оценка слитых белков
Экспериментальный Пример 3-1. Экспериментальный способ фармакокинетической оценки
Шестинедельных самцов мышей ICR, приобретенных у Orient BIO (Корея), разделили на группы (n=3/время взятия образцов крови), чтобы они имели одинаковые средние значения массы тела за один день до медикаментозного лечения, и подкожно вводили один раз с соответствующим образцом 1 мг/кг (2 мг/кг для RGE). Затем образцы крови собирали через 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 и 96 часов после инъекции, соответственно. Концентрацию интактного полноразмерного белка FGF21 в крови измеряли с использованием набора ELISA с интактным человеческим FGF21 (F1231-K01, Eagle Biosciences, США), который обладает иммунореактивностью к N-концу и С-концу белка FGF21. Измеряли концентрации образцов в крови, собранных до 96 часов после подкожной инъекции каждого слитого белка мышам, и рассчитали фармакокинетические параметры каждого образца.
Экспериментальный Пример 3-2. Оценка фармакокинетической активности
На основании графика, показывающего концентрации каждого белка в крови в зависимости от времени после подкожного введения слитых белков мышам (ФИГ.5), рассчитывали фармакокинетические параметры. Данные приведены в таблице 5 ниже.
[Таблица 5]
Параметры DFD4 DFD5 DFD6 DFD7 DFD9 DFD13 DFD18 DFD72 DFD73 DFD74 DFD6 (E.coli) RGE*
Tmax (час) 12 12 12 4 4 12 12 8 8 8 8 12
Cmax (нг/мл) 1288 1732 2868 696 384 1070 3428 2962 3296 3996 1399 9921
AUClast
(нг·ч/мл)		 25856 40706 100107 14118 4656 28785 104230 115977 123511 206634 37269 325747
Полувыведение (час) 5,5 8,0 14,9 19,7 17,4 7,1 11,0 14,4 16,6 26,0 9,1 12,9
Фармакокинетический профиль каждого слитого белка сравнивали и оценивали на основании значения площади под кривой (AUC), указывающей степень воздействия лекарственного средства.
Как показано в таблице 5, при сравнении DFD4 с DFD13, а DFD6 с DFD73, было установлено, что введение последовательности EIRP приводит приблизительно к 10-20% увеличению значения AUC. При сравнении DFD9 с DFD4, введение TGLEAV привело приблизительно к 6-кратному увеличению значения AUC.
Кроме того, мутации TGLEAN, G170N и G174N разработаны для продления периода полувыведения путем введения N-гликозилирования в С-конец FGF21, который, как известно, протеолизирован in vivo. Увеличение AUC вследствие введения N-гликозилирования было подтверждено путем сравнения мутантов с каждым контрольным материалом. С целью подтверждения эффекта улучшения AUC вследствие введения N-гликозилирования, значение AUC для DFD6 (E. coli), продуцируемого E. coli, который не имеет гликозилирования, сравнивали с величиной AUC у DFD6, продуцируемого клеточной линией человека. DFD6, продуцируемый клеточной линией человека, показал увеличение AUC в 3 раза или выше по сравнению с DFD6 (E. coli), продуцируемым E. coli, что продемонстрировало улучшение фармакокинетического профиля вследствие гликозилирования.
A180E представляет собой мутацию, описанную в WO 2009/149171, принадлежащей Amgen Inc. Когда мутацию A180E дополнительно вводили в мутант DFD13 или DFD73, содержащий мутацию TGLEAV или G170N, соответственно, полученный мутант DFD18 или DFD74, соответственно, показывал приблизительное увеличение в 2-3 раза величины AUC.
Таким образом, было подтверждено, что по сравнению с DFD9, слитым белком FGF21 дикого типа, фармакокинетические параметры улучшились за счет введения различных мутаций и их комбинаций. Слитый белок, демонстрирующий наиболее улучшенное значение AUC, представлял собой DFD74, содержащий мутации EIRP, G170N и A180E, которые продемонстрировали приблизительно 45-кратное улучшение AUC по сравнению с DFD9. Более того, рассматривая RGE (Amgen) в дозе 2 мг/кг массы тела, DFD74 может иметь более высокую степень воздействия препарата по сравнению с RGE. Общие эффекты улучшения фармакокинетики вследствие мутаций суммированы в таблице 6 ниже.
[Таблица 6]
Мутационная последовательность Позиция мутации Контрольный материал vs улучшенный материал Оценка фармакокинетических параметров
EIRP 98-101 DFD4 vs DFD13 Улучшение AUC
DFD6 vs DFD73
TGLEAV 170-174 DFD9 vs DFD4 Улучшение AUC
TGLEAN 170-174 DFD9 vs DFD5 Улучшение AUC
G170N 170 DFD9 vs DFD6 Улучшение AUC
DFD6 (E. coli) vs DFD6 Улучшение AUC
G174N 174 DFD9 vs DFD7 Улучшение AUC
A180E 180 DFD13 vs DFD18 Улучшение AUC
DFD73 vs DFD74 Улучшение AUC
Экспериментальный Пример 4. Оценка активности слитых белков у мышей ob/ob
Экспериментальный Пример 4-1. Экспериментальный способ для оценки активности у мышей ob/ob
Мыши ob/ob, характеризующиеся как демонстрирующие гипергликемию, резистентность к инсулину, гиперфагию, стеатоз печении, ожирение вследствие генетического дефицита лептина, широко используются для изучения диабета типа 2. Самцы мышей ob/ob (Harlan, USA) были приобретены у Raonbio (Корея). В момент поступления этим мышам было от 5 до 6 недель, а во время лекарственной терапии после 3 недель адаптации им было от 8 до 9 недель. Мышей разделили на группы (n=8/группа) с целью наличия сходных средних значений массы тела и уровня глюкозы в хвостовой крови за один день до лекарственной терапии (день 0), и образцы подкожно однократно вводили в соответствии с каждой из их соответствующих дозировок. Забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко (DPBS, Gibco, США) вводили в качестве обработки носителем, а концентрацию глюкозы в крови измеряли с использованием глюкометра GlucoDr (All Medicus, Корея). Уровни глюкозы в крови не натощак и массу тела измеряли каждый день до 14-го дня после введения. До введения и после теста в каждой группе также измеряли уровни гликированного гемоглобина. Уровни гликированного гемоглобина рассчитывали с использованием набора DCA 2000 HbA1c (Siemens, 5035C).
Экспериментальный Пример 4-2. Оценка активности у мышей ob/ob
Изменения уровня глюкозы в крови натощак и массы тела у самцов мышей ob/ob наблюдались после однократной подкожной инъекции 30 или 100 нмоль/кг DFD18 и DFD72, или 10, 30 или 100 нмоль/кг DFD74.
Было подтверждено, что DFD18, DFD72 и DFD74 все имеют эффект понижения уровня глюкозы в крови в зависимости от дозы. Сравнивая три агента при высокой дозе 100 нмоль/кг, DFD72 и DFD74 показали улучшенное действие на снижение уровня глюкозы в крови, чем DFD18 (ФИГ. 6). Кроме того, Fc-FGF21 (Lilly), который использовался в качестве контрольного материала в тесте, был менее эффективным при снижении уровня глюкозы в крови по сравнению с DFD18, DFD72 и DFD74 при одинаковом уровне дозы (30 нмоль/кг).
Что касается влияния на снижение массы тела, сравнивая три агента при высокой дозе 100 нмоль/кг, DFD72 был наиболее эффективным у мышей ob/ob, приводя к приблизительно 6% снижению массы тела, DFD18 был следующим наиболее эффективным, а затем DFD74 (ФИГ. 7).
После окончания теста измеряли уровни гликированного гемоглобина, показывающего средние значения глюкозы в крови, и в каждой тестовой группе анализировали изменения среднего значения глюкозы крови. Все обработанные группы, за исключением контрольной группы, обработанной контрольным белком Fc-FGF21 (Lilly), показали отрицательные значения в разнице до введения и после теста, что подтвердило эффективность тестируемых белков по сравнению с контрольным материалом в снижении глюкозы крови (ФИГ. 8).
Экспериментальный Пример 5. Оценка активности слитых белков у мышей HFD/STZ
Экспериментальный Пример 5-1. Экспериментальный способ для оценки активность у мышей HFD/STZ
Влияние слитых с мутантным FGF21 белков на снижение уровня глюкозы в крови и массы тела сравнивали и оценивали в другой диабетической модели-модели HFD/STZ. Традиционные мышиные модели ожирения, индуцированного диетой (индуцированного питанием посредством 60 ккал% диеты с высоким содержанием жиров у мышей C57BL/6 в течение восьми недель или более) имеют слабые признаки гипергликемии и диабета, хотя они и вызывают резистентность к инсулину. Мыши HFD/STZ, которые могут нивелировать дефекты в обычных мышиных моделях ожирения, индуцированного диетой, способны продуцировать дисфункциональные β-клетки в поджелудочной железе и уменьшать секрецию инсулина в результате диеты с высоким содержанием жиров (HFD) и введения низкого уровня стрептозотоцина (STZ), и поэтому полезны для фармакологических исследований диабета 2 типа.
Более конкретно, с целью индуцирования мышиной модели HFD/STZ, мышей C57BL/6 (Japan SLC) кормили 60 ккал% диетой с высоким содержанием жиров в течение восьми недель, а затем для индуцирования дисфункции β-клеток поджелудочной железы каждый день в течение 3 дней интраперитонеально вводили 50 мг/кг STZ (Sigma, 85882). После питания диетой с высоким содержанием жиров в течение дополнительных 2 недель мышей с уровнями глюкозы в крови натощак 200 мг/дл или выше использовали для теста. Мышей разделили на группы (n=6/группа) с целью наличия сходных средних значений массы тела и уровня глюкозы в хвостовой крови за один день до лекарственной терапии (день 0), и образцы подкожно однократно вводили в соответствии с каждой из их соответствующих дозировок. Забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко (DPBS, Gibco, США) вводили в качестве обработки носителем, а концентрацию глюкозы в крови измеряли с использованием глюкометра GlucoDr (All Medicus, Корея). Уровни глюкозы в крови не натощак и массу тела измеряли каждый день до 14-го дня после введения. До введения и после теста в каждой группе также измеряли уровни гликированного гемоглобина. Уровни гликированного гемоглобина рассчитывали с использованием набора DCA 2000 HbA1c (Siemens, 5035C).
Экспериментальный Пример 5-2. Оценка активности у мышей HFD/STZ
Изменения уровня глюкозы в крови натощак и массы тела у самцов мышей HFD/STZ наблюдали после однократной подкожной инъекции 10 нмоль/кг DFD72 или DFD74.
Что касается изменений уровня глюкозы в крови натощак, было подтверждено, что DFD72 и DFD74 оказывают сходное влияние на снижение уровня глюкозы в крови, а эффект снижения уровня глюкозы в крови сохраняется до 10-го дня после введения, а затем теряется с метаболизмом лекарственных препаратов после 10-го дня (фиг.9). DFD72 продемонстрировал более продолжительное действие, чем DFD74, в отношении изменений уровня глюкозы в крови натощак после 10-го дня после введения.
Что касается влияния на снижение массы тела вследствие введения мутантных белков FGF21, было подтверждено, что как DFD72, так и DFD74 оказывают сходное влияние на снижение массы тела примерно на 5%, и эффект исчезает после 10-го дня после введения (ФИГ. 10).
После окончания теста измеряли уровни гликированного гемоглобина, показывающего среднее значение глюкозы в крови, и были проанализированы изменения среднего уровня глюкозы в крови в каждой тестовой группе. В то время как группа носителя имела увеличение на 0,25 уровней гликированного гемоглобина, группа, обработанная DFD74, имела увеличение на 0,1, а группа, обработанная DFD72, имела уменьшение на 0,27 (ФИГ. 11).
Экспериментальный Пример 6. Активность слитых белков у мышей с ожирением, индуцированным диетой
Экспериментальный Пример 6-1. Экспериментальный способ оценки активности у мышей с ожирением, индуцированным диетой
Эффект снижения массы тела DFD18, слитого с мутантным FGF21 белка, оценивали у мышей с ожирением, вызванным диетой. Для модели ожирения, вызванного диетой, мышей C57BL/6J закупили в Central Lab. Animal Inc. и кормили пищей с высоким содержанием жиров, содержащей 60 ккал% жира (исследуемая диета) в течение 8-12 недель. Мышей разделили на группы (n=8/группа) с целью наличия сходных средних значений массы тела за один день до лекарственной терапии (день 0), а затем подкожно однократно вводили 30 нмоль/кг образцов. Изменения массы тела сравнивали с группой, обработанной носителем (PBS).
Экспериментальный Пример 6-2. Активность белка у мышей с ожирением, индуцированным диетой
Для изменения массы тела с течением времени в мышиной модели ожирения, индуцированного диетой, после однократного введения 30 нмоль/кг DFD18, было подтверждено, что эффект снижения массы продолжается на 10-й день после введения, а максимальное снижение массы (около 18%) было на 11-й день после введения, которое сохранялось к 14-му дню (ФИГ. 12).
Экспериментальный Пример 7. Прогнозирование и оценка иммуногенности
Экспериментальный Пример 7-1. Метод прогнозирования иммуногенности и результаты
Чтобы предсказать потенциальную иммуногенность слитых с мутантным FGF21 белков, для каждого белка проводили анализ иммуногенности in silico.
Более конкретно, потенциальную иммуногенность белков подвергали быстрому скринингу с использованием методов iTopeTM и TCEDTM (Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools, BioDrugs, 2010). Что касается двух методов, то Т-клеточный эпитоп может быть более точно предсказан по сравнению с аналитическим методом silico, который зависит только от анализа связывания MHC класса II.
Экспериментальный Пример 7-2. Метод оценки ex vivo иммуногенности и результаты
С целью оценки потенциальной иммуногенности слитых с мутантным FGF21 белков был проведен анализ EpiScreenTM (Increased brain bio-distribution and chemical stability and decreased immunogenicity of an engineered variant of GDNF, Exp Neurol, 2015). При выявлении иммуногенности аминокислотные последовательности, индуцирующие иммуногенность, могут быть идентифицированы посредством картирования эпитопов Т-клеток, а деиммунизированные мутанты с минимизированной иммуногенностью могут быть сконструированы и получены с помощью прогнозирования in silico для повторной оценки иммуногенности.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> YUHAN CORPORATION
<120> СЛИТЫЕ С FGF21 БЕЛКИ ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
<130> PCB608053YUH
<150> KR 2015/0150574
<151> 2015-10-28
<160> 57
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> человеческий FGF21
<400> 1
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 2
Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly
1 5 10 15
Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu
20 25 30
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 3
Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 6
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 7
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 7
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 8
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 8
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 9
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 9
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 10
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 10
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 11
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 11
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 12
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 12
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 13
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 13
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 14
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 14
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 15
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 15
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 16
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 16
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 17
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 17
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 18
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 18
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 19
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 19
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 20
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 20
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 21
<211> 182
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 21
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 22
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 22
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 23
<211> 181
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 23
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 24
<211> 229
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Human IgG4 Fc
<400> 24
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 25
<211> 228
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант человеческой IgG4 Fc
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 26
<211> 223
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант гибридной Fc
<400> 26
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 27
<211> 435
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 27
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala
210 215 220
Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly
225 230 235 240
Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu His Pro Ile
245 250 255
Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg
260 265 270
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile
275 280 285
Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser
290 295 300
Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly
305 310 315 320
Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr
325 330 335
Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile
340 345 350
Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro
355 360 365
Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg
370 375 380
Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro
385 390 395 400
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
405 410 415
Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser
420 425 430
Tyr Ala Ser
435
<210> 28
<211> 422
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 28
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ala
210 215 220
Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly
225 230 235 240
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
245 250 255
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
260 265 270
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
275 280 285
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
290 295 300
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
305 310 315 320
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
325 330 335
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
340 345 350
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
355 360 365
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
370 375 380
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
385 390 395 400
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
405 410 415
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 29
<211> 420
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 29
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
325 330 335
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro
405 410 415
Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 30
<211> 420
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 30
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
325 330 335
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro
405 410 415
Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 31
<211> 419
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 31
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
325 330 335
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
405 410 415
Tyr Ala Ser
<210> 32
<211> 419
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 32
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
325 330 335
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
405 410 415
Tyr Ala Ser
<210> 33
<211> 419
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 33
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
325 330 335
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser Pro Ser
405 410 415
Tyr Ala Ser
<210> 34
<211> 419
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 34
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
325 330 335
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
405 410 415
Tyr Ala Ser
<210> 35
<211> 420
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 35
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu
325 330 335
Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro
405 410 415
Ser Tyr Ala Ser
420
<210> 36
<211> 420
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 36
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu
325 330 335
Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro
405 410 415
Ser Tyr Glu Ser
420
<210> 37
<211> 420
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 37
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu
325 330 335
Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro
405 410 415
Ser Tyr Glu Ser
420
<210> 38
<211> 419
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 38
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu
325 330 335
Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
405 410 415
Tyr Ala Ser
<210> 39
<211> 419
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> модифицированный вариант FGF21, связанный с гибридной Fc
<400> 39
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
225 230 235 240
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
245 250 255
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
260 265 270
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
275 280 285
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
290 295 300
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu
325 330 335
Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
340 345 350
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
355 360 365
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu
370 375 380
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
385 390 395 400
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
405 410 415
Tyr Glu Ser
<210> 40
<211> 423
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> REG(Amgen)
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly
245 250 255
Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu
260 265 270
Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp
275 280 285
Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val
290 295 300
Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro
305 310 315 320
Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser
325 330 335
Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu
340 345 350
Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg
355 360 365
Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu
370 375 380
Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro
385 390 395 400
Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln Gly
405 410 415
Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
420
<210> 41
<211> 424
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> FGF21, связанный с Fc(lilly)
<400> 41
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Ala His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe
245 250 255
Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln
260 265 270
Thr Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala
275 280 285
Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro
290 295 300
Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln
305 310 315 320
Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala
325 330 335
Cys Ser Phe Arg Glu Asp Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln
340 345 350
Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asp Lys Ser Pro
355 360 365
His Arg Lys Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro
370 375 380
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln
385 390 395 400
Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Leu Val Glu Pro Ser
405 410 415
Gln Leu Arg Ser Pro Ser Phe Glu
420
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 42
Glu Ile Arg Pro
1
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 43
Thr Gly Leu Glu Ala Val
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 44
Thr Gly Leu Glu Ala Asn
1 5
<210> 45
<211> 1305
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD1
<400> 45
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tttacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag ccaaggctac cacagcaccc gccactaccc ggaacaccgg tagaggggga 720
gaggaaaaga agaaagagaa ggaaaaagag gaacaggagc atcccatccc tgactccagt 780
cctctcctgc aattcggggg ccaagtccgg cagcggtacc tctacacaga tgatgctcag 840
cagacagaag cccacctgga gatcagggag gatgggaccg tggggggcgc tgctgaccag 900
agccccgaaa gtctcctgca gctgaaagcc ttgaagcctg gagttattca aatcttggga 960
gtcaagacta gtaggttcct gtgccagcgg ccagatgggg ccctgtatgg atctctccat 1020
tttgaccctg aggcctgcag cttccgggag gagatcagac ccgacggata caatgtttac 1080
cagtccgaag cccacggcct ccctctgcat ctgcccggga acaagtctcc tcaccgggac 1140
cctgccccca gaggacctgc tcgcttcctg ccactcccag gcctgccccc cgcattgcct 1200
gagccacccg gaatcctggc cccccagccc cctgatgtgg gatcctctga ccctctgagc 1260
atggtgacag gcctggaggc cgtgagaagc cccagctacg cttcc 1305
<210> 46
<211> 1266
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD3
<400> 46
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag ccaaggctac cacagcaccc gccactacca gaaacacagg caggggggga 720
catcccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 780
ctctacacag atgatgctca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacc 840
gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagcct 900
ggagttattc aaatcttggg agtcaagact agtaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 960
gccctgtatg gatctctcca ttttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 1020
gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tccctctgca tctgcccggg 1080
aacaagtctc ctcaccggga ccctgccccc agaggacctg ctcgcttcct gccactccca 1140
ggcctgcccc ccgcattgcc tgagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccctgatgtg 1200
ggatcctctg accctctgag catggtgaca ggcctggagg ccgtgagaag ccccagctac 1260
gcttcc 1266
<210> 47
<211> 1260
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD4
<400> 47
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gacaggcctg gaggccgtga gaagccccag ctacgcttcc 1260
1260
<210> 48
<211> 1260
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD5
<400> 48
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gacaggcctg gaggccaaca gaagccccag ctacgcttcc 1260
1260
<210> 49
<211> 1257
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD6
<400> 49
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gaacccttcc cagggcagaa gccccagcta cgcttcc 1257
<210> 50
<211> 1257
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD6_E-coli
<400> 50
gagaccaaaa ccccggaatg cccttcgcat acgcagcctt tgggtgtctt tctctttcca 60
ccaaagccga aagatacgct tatgatctct cgtacgccag aagttacctg cgtagtggtc 120
gatgtttcac aggaagatcc cgaagtacag tttaattggt acgtagacgg tgtagaagtc 180
cataatgcta aaacaaaacc gagagaagaa cagtttaatt caacgtatcg ggtggttagc 240
gttctgaccg ttctgcatca agattggctg aacgggaaag aatataaatg caaagtaagc 300
aataaagggc tgccaagctc tatcgaaaag actatatcca aggcaaaagg acaaccacgt 360
gagccgcaag tttacacatt gcctccatct caggaggaaa tgacaaaaaa tcaggtttcg 420
ttaacctgtc ttgttaaggg tttttatcct agtgatattg cagttgaatg ggaatcaaat 480
ggtcagccgg aaaacaatta taaaactact ccgcctgttc tagattctga cggttcattc 540
ttcttgtatt cgcggctcac tgttgataaa tctcgttggc aggagggtaa tgtattcagc 600
tgtagcgtta tgcacgaagc actgcacaac cattacaccc agaaaagctt gagcttaagc 660
ctgggtaaag gtggtggtgg tagtggtgga ggaggttcag gtggtggtgg tagccatcct 720
atcccagata gttctccgct tctgcagttt gggggtcaag tgcgacaacg ttatctgtat 780
actgatgatg cacagcaaac cgaagcacat cttgaaattc gtgaagacgg tacagttgga 840
ggtgcagcag atcaatcccc ggagtcgctg ttacagttga aagcgctgaa accgggtgtt 900
atacagattc tgggtgttaa aacatcacgt tttctttgtc agcgtcccga tggggcttta 960
tatgggtctc tgcatttcga cccagaagct tgttcttttc gtgaactgct tctggaagac 1020
ggctataatg tttatcaaag tgaagcacat ggtctgccat tacatctgcc gggtaacaaa 1080
tcaccacacc gtgatcctgc accgagaggt ccagctcgtt ttttacctct gcccggtcta 1140
cccccggcat tacccgaacc acctgggatt ctggcaccgc aaccgcctga tgttggaagc 1200
agtgatccgt taagtatggt taacccgagt cagggtagga gccccagcta tgcgtca 1257
<210> 51
<211> 1257
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD7
<400> 51
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gggaccttcc cagaacagaa gccccagcta cgcttcc 1257
<210> 52
<211> 1257
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD9
<400> 52
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gggaccttcc cagggcagaa gccccagcta cgcttcc 1257
<210> 53
<211> 1260
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD13
<400> 53
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggaggagat cagacccgac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gacaggcctg gaggccgtga gaagccccag ctacgcttcc 1260
1260
<210> 54
<211> 1260
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD18
<400> 54
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggaggagat cagacccgac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gacaggcctg gaggccgtga gaagccccag ctacgagtcc 1260
1260
<210> 55
<211> 1260
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD72
<400> 55
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggaggagat cagacccgac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gacaggcctg gaggccaaca gaagccccag ctacgagtcc 1260
1260
<210> 56
<211> 1257
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD73
<400> 56
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggaggagat cagacccgac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gaacccttcc cagggcagaa gccccagcta cgcttcc 1257
<210> 57
<211> 1257
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DFD74
<400> 57
gagaccaaga cacctgaatg tccaagtcac actcagcctc tgggagtgtt tctcttccca 60
cctaagccca aggataccct tatgatttct aggacacctg aggtgacctg cgtcgttgtg 120
gacgtgagtc aagaggaccc agaggtccag tttaactggt atgttgacgg cgtggaagtg 180
cataatgcaa aaactaaacc ccgcgaggaa caattcaatt caacctaccg ggtcgtttct 240
gtgttgacag tgctgcatca agattggctg aacgggaagg agtataagtg taaagtcagt 300
aataagggac tcccctctag tatcgaaaaa actatttcaa aggccaaagg ccagcctaga 360
gagccacagg tgtacaccct tcctccatcc caagaggaga tgacaaagaa ccaggtgtct 420
ctgacttgtc tcgtgaaggg gttctaccct agtgacatcg ctgtcgaatg ggagtcaaac 480
ggacagccag agaataatta taagacaact cctcccgttc tggattctga cggcagcttc 540
tttctgtact ctaggcttac tgtggacaaa agtcgctggc aagaagggaa cgtcttttca 600
tgttctgtta tgcacgaggc cttgcacaat cattatacac agaagtctct gagtctctca 660
ctgggcaaag gcgggggagg cagcggggga ggcgggtccg gaggcggggg atctcatccc 720
atccctgact ccagtcctct cctgcaattc gggggccaag tccggcagcg gtacctctac 780
acagatgatg ctcagcagac agaagcccac ctggagatca gggaggatgg gaccgtgggg 840
ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc ctgcagctga aagccttgaa gcctggagtt 900
attcaaatct tgggagtcaa gactagtagg ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg 960
tatggatctc tccattttga ccctgaggcc tgcagcttcc gggaggagat cagacccgac 1020
ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac ggcctccctc tgcatctgcc cgggaacaag 1080
tctcctcacc gggaccctgc ccccagagga cctgctcgct tcctgccact cccaggcctg 1140
ccccccgcat tgcctgagcc acccggaatc ctggcccccc agccccctga tgtgggatcc 1200
tctgaccctc tgagcatggt gaacccttcc cagggcagaa gccccagcta cgagtcc 1257
<---

Claims (18)

1. Слитый белок для лечения FGF21-ассоциированных расстройств, выбранных из группы, состоящей из диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита, содержащий мутантный белок фактор роста фибробластов 21 (FGF21) и Fc-область иммуноглобулина, причем Fc-область иммуноглобулина представляет собой любую из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD или гибридную Fc, содержащую их комбинацию,
причем мутантный белок FGF21 содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из следующих мутаций (1)-(3) и (5):
(1) замена аминокислот в позициях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 42);
(2) замена аминокислот в позициях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 43);
(3) замена аминокислот в позициях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 44); и
(5) замена аминокислоты в позиции 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
причем мутантный белок FGF21 соединен с Fc-областью иммуноглобулина посредством линкера, и линкер представляет собой пептид, состоящий из 10-30 аминокислотных остатков, причем линкер соединен с С-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21, и причем белок FGF21 дикого типа в (1)-(3) и (5) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
2. Слитый белок по п.1, в котором аминокислотный остаток N мутантного белка FGF21, введенный посредством мутации, гликозилирован.
3. Слитый белок по п.1, в котором мутантный белок FGF21 имеет аминокислотную последовательность, представленную любой одной из SEQ ID NO: 6-8, 10-17 и 19-23.
4. Слитый белок по п.1, в котором линкер имеет аминокислотную последовательность, представленную любой одной из SEQ ID NO: 2-5.
5. Слитый белок по п.1, в котором гибридная Fc содержит IgG4 область и IgD область.
6. Слитый белок по п.1, в котором слитый белок имеет аминокислотную последовательность представленную SEQ ID NO: 36.
7. Слитый белок по п.1, в котором слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
8. Слитый белок по п.1, в котором слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
9. Фармацевтическая композиция для лечения FGF21-ассоциированных расстройств, выбранных из группы, состоящей из диабета, ожирения, дислипидемии, метаболического синдрома, неалкогольной жировой болезни печени или неалкогольного стеатогепатита, содержащая эффективное количество слитого белка по любому из пп.1-8 и фармацевтический носитель.
10. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-8.
11. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10.
12. Клетка-хозяин для экспрессии и/или секреции слитого белка по любому из пп.1-8, содержащая экспрессионный вектор по п.11, причем клетка-хозяин не является клеткой эмбриона человека.
RU2018119141A 2015-10-28 2016-10-28 Слитые с fgf21 белки длительного действия и содержащая их фармацевтическая композиция RU2741087C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150150574A KR102668200B1 (ko) 2015-10-28 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR10-2015-0150574 2015-10-28
PCT/KR2016/012288 WO2017074117A1 (en) 2015-10-28 2016-10-28 Long-acting fgf21 fusion proteins and pharmaceutical composition comprising same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2018119141A RU2018119141A (ru) 2019-12-02
RU2018119141A3 RU2018119141A3 (ru) 2020-03-24
RU2741087C2 true RU2741087C2 (ru) 2021-01-22

Family

ID=58630685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018119141A RU2741087C2 (ru) 2015-10-28 2016-10-28 Слитые с fgf21 белки длительного действия и содержащая их фармацевтическая композиция

Country Status (21)

Country Link
US (2) US11142557B2 (ru)
EP (2) EP3744731A1 (ru)
JP (2) JP7303629B2 (ru)
CN (1) CN108290937B (ru)
AU (2) AU2016346864B2 (ru)
BR (1) BR112018008676A2 (ru)
CA (1) CA3003109A1 (ru)
CY (1) CY1123307T1 (ru)
DK (1) DK3368554T3 (ru)
ES (1) ES2815540T3 (ru)
HK (1) HK1257375A1 (ru)
HR (1) HRP20201392T1 (ru)
HU (1) HUE051036T2 (ru)
LT (1) LT3368554T (ru)
MX (1) MX2018005194A (ru)
PT (1) PT3368554T (ru)
RS (1) RS60725B1 (ru)
RU (1) RU2741087C2 (ru)
SI (1) SI3368554T1 (ru)
WO (1) WO2017074117A1 (ru)
ZA (1) ZA201802002B (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016346870B2 (en) 2015-10-28 2021-04-22 Yuhan Corporation Dual function proteins and pharmaceutical composition comprising same
LT3368554T (lt) 2015-10-28 2020-09-25 Yuhan Corporation Ilgo veikimo fgf21 sulieti baltymai ir juos apimanti farmacinė kompozicija
BR112019009581A2 (pt) * 2016-11-10 2019-10-08 Yuhan Corp composição farmacêutica para evitar ou tratar hepatite, fibrose hepática, e cirrose hepática que compreende proteínas de fusão
EA201992516A1 (ru) * 2017-04-21 2020-04-09 Юхан Корпорейшн Способ получения бифункциональных белков и их производных
MX2020002206A (es) * 2017-09-08 2020-07-20 Bristol Myers Squibb Co Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (fgf-21) modificado para usarse en metodos para tratar la esteatohepatitis no alcoholica (nash).
JP2021528422A (ja) * 2018-06-21 2021-10-21 サノフイＳａｎｏｆｉ 最適化された活性比を有するｆｇｆ２１化合物／ｇｌｐ−１ｒアゴニストの組合せ
CN108635571B (zh) * 2018-07-19 2021-10-22 西安交通大学医学院第一附属医院 鸢尾素(irisin)在制备预防及治疗重症急性胰腺炎药物中的应用
CN111195234B (zh) * 2018-11-16 2022-08-26 鲁南制药集团股份有限公司 一种重组FGF21-Fc融合蛋白冻干粉制剂
CN109836486B (zh) * 2019-01-30 2020-09-08 北京双因生物科技有限公司 成纤维生长因子21变体、其融合蛋白及其用途
US20220064244A1 (en) * 2019-03-05 2022-03-03 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. A polypeptide molecule and application thereof
TW202337914A (zh) * 2019-04-23 2023-10-01 南韓商Ｌｇ化學股份有限公司 融合多肽及其用途與製備方法、核酸分子、重組載體、重組細胞以及用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法
US20230090114A1 (en) * 2020-01-31 2023-03-23 89Bio Ltd. Methods for promoting weight loss
EP4308610A1 (en) * 2021-03-19 2024-01-24 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Uses of fgf21 polypeptides and fusion polypeptides thereof
CN113198002A (zh) * 2021-05-12 2021-08-03 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种用于治疗非酒精性脂肪肝的肝细胞因子bmp9
CN117677640A (zh) * 2021-07-05 2024-03-08 上海翰森生物医药科技有限公司 一种融合蛋白及其医药用途
CN113717269B (zh) * 2021-08-31 2022-04-19 赣江中药创新中心 一种重组的变体fgf21蛋白及其制备方法和应用
WO2023245543A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-28 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Uses of fgf21 fusion proteins

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010129600A2 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2013033452A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating type 1 diabetes using fgf21
US20130129724A1 (en) * 2011-09-26 2013-05-23 Irm Llc Dual function proteins for treating metabolic disorders
WO2013131091A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
US20140243503A1 (en) * 2008-06-04 2014-08-28 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
EA020843B1 (ru) * 2009-02-03 2015-02-27 Амуникс Оперейтинг Инк. Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции
WO2015038938A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents and compositions thereof

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
WO1990002175A1 (en) 1988-08-16 1990-03-08 Novo Nordisk A/S A method of producing polypeptides by culturing eukaryotic cells in the presence of protease inhibitors
US5851800A (en) 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR100758755B1 (ko) 2003-06-12 2007-09-14 일라이 릴리 앤드 캄파니 Ｇｌｐ-1 유사체 융합 단백질
US20070265200A1 (en) * 2004-03-17 2007-11-15 Eli Lilly And Company Glycol Linked Fgf-21 Compounds
DK2126106T3 (en) 2007-02-23 2017-12-04 Sk Chemicals Co Ltd Process for the preparation and purification of Factor VIII and its derivatives
EP2162472B1 (en) * 2007-05-30 2013-02-27 Postech Academy-Industry- Foundation Immunoglobulin fusion proteins
EP3260129A1 (en) 2007-08-03 2017-12-27 Eli Lilly and Company An fgf-21 compound and a glp-1 compound for use in the treatment of obesity
MX341149B (es) * 2008-10-10 2016-08-09 Amgen Inc Mutantes fgf21 y uso de los mismos.
WO2010065439A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
PE20120358A1 (es) * 2009-05-05 2012-04-26 Amgen Inc Mutantes fgf21 y usos de los mismos
EP2440235A1 (en) 2009-06-11 2012-04-18 Novo Nordisk A/S Glp-1 and fgf21 combinations for treatment of diabetes type 2
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
EP2526117B1 (en) * 2010-01-22 2015-05-06 Novo Nordisk A/S Process for preparing fgf-21 with low degree of o-glycosylation
CN103124562A (zh) * 2010-06-08 2013-05-29 诺沃—诺迪斯克有限公司 Fgf21的类似物和衍生物
JP6069198B2 (ja) 2010-07-20 2017-02-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｎ末端が修飾されたｆｇｆ２１化合物
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
US20130302343A1 (en) * 2011-01-04 2013-11-14 Charité Universitätsmedizin Berlin Modulators of il-12 and/or il-23 for the prevention or treatment of alzheimer's disease
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
TWI513705B (zh) * 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
WO2014130659A1 (en) * 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
CN114805533A (zh) 2014-10-24 2022-07-29 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
JP6933983B2 (ja) * 2015-06-23 2021-09-08 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 衛生化飲料水と共に使用するためのビタミンｅを含有するイソオキサゾリン溶液
AU2016346870B2 (en) * 2015-10-28 2021-04-22 Yuhan Corporation Dual function proteins and pharmaceutical composition comprising same
LT3368554T (lt) 2015-10-28 2020-09-25 Yuhan Corporation Ilgo veikimo fgf21 sulieti baltymai ir juos apimanti farmacinė kompozicija
CN105288592A (zh) 2015-11-02 2016-02-03 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备肝纤维化治疗药物中的应用
BR112019009581A2 (pt) * 2016-11-10 2019-10-08 Yuhan Corp composição farmacêutica para evitar ou tratar hepatite, fibrose hepática, e cirrose hepática que compreende proteínas de fusão
WO2018166461A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Dual-target fusion proteins comprising the fc portion of an immunoglobulin
EA201992516A1 (ru) 2017-04-21 2020-04-09 Юхан Корпорейшн Способ получения бифункциональных белков и их производных

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140243503A1 (en) * 2008-06-04 2014-08-28 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
EA020843B1 (ru) * 2009-02-03 2015-02-27 Амуникс Оперейтинг Инк. Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции
WO2010129600A2 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof
WO2013033452A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating type 1 diabetes using fgf21
US20130129724A1 (en) * 2011-09-26 2013-05-23 Irm Llc Dual function proteins for treating metabolic disorders
WO2013131091A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
WO2015038938A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 The California Institute For Biomedical Research Modified therapeutic agents and compositions thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369. *
MAEDA Y. et al., Engineering of functional chimeric protein G-Vargula Luciferase, Analytical biochemistry, 1997, v. 249, n. 2, p.147-152. *
ORLANDO M., Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES), Inauguraldissertation, Giesen, 2003, p.166. *
ORLANDO M., Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES), Inauguraldissertation, Giesen, 2003, p.166. CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369. MAEDA Y. et al., Engineering of functional chimeric protein G-Vargula Luciferase, Analytical biochemistry, 1997, v. 249, n. 2, p.147-152. *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE051036T2 (hu) 2021-01-28
KR20170049319A (ko) 2017-05-10
JP7303629B2 (ja) 2023-07-05
AU2016346864A1 (en) 2018-05-10
JP7453943B2 (ja) 2024-03-21
US11142557B2 (en) 2021-10-12
EP3744731A1 (en) 2020-12-02
JP2021184727A (ja) 2021-12-09
RU2018119141A (ru) 2019-12-02
HK1257375A1 (zh) 2019-10-18
AU2021204115A1 (en) 2021-07-15
RU2018119141A3 (ru) 2020-03-24
CA3003109A1 (en) 2017-05-04
CN108290937B (zh) 2022-03-08
LT3368554T (lt) 2020-09-25
EP3368554A1 (en) 2018-09-05
CN108290937A (zh) 2018-07-17
US20180305428A1 (en) 2018-10-25
JP2018534929A (ja) 2018-11-29
WO2017074117A1 (en) 2017-05-04
ES2815540T3 (es) 2021-03-30
MX2018005194A (es) 2018-07-06
ZA201802002B (en) 2019-05-29
EP3368554B1 (en) 2020-08-05
BR112018008676A2 (pt) 2018-11-27
PT3368554T (pt) 2020-09-10
RS60725B1 (sr) 2020-09-30
US20220002367A1 (en) 2022-01-06
AU2016346864B2 (en) 2021-03-18
EP3368554A4 (en) 2019-06-19
SI3368554T1 (sl) 2020-10-30
HRP20201392T1 (hr) 2020-11-27
CY1123307T1 (el) 2021-12-31
DK3368554T3 (da) 2020-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2741087C2 (ru) Слитые с fgf21 белки длительного действия и содержащая их фармацевтическая композиция
US20220002368A1 (en) Dual function proteins comprising fgf21 mutant protein and pharmaceutical composition comprising same
JP6250714B2 (ja) Ｆｇｆ２１突然変異体及びその使用
US11179440B2 (en) Pharmaceutical composition containing FGF21 mutant fusion protein and method for treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis
KR20160088656A (ko) 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US20180280474A1 (en) Treatment of bile acid disorders
KR102668200B1 (ko) 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
RU2795548C2 (ru) Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени, включающая слитые белки
KR102670157B1 (ko) 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
JP2024075620A (ja) 長時間作用型ｆｇｆ２１融合タンパク質およびそれを含む医薬組成物
KR20240078629A (ko) 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
NZ794313A (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
NZ794312A (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins