ES2811760T3 - Derivados de 5-fluorouridina - Google Patents

Abstract

Compuesto representado por la fórmula (I) **(Ver fórmula)** en donde X es un grupo de fórmula (III) **(Ver fórmula)** en donde R1 se selecciona entre H, **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** y restos de terpeno cíclico, sustituido o sin sustituir, en donde R7 y R8 se selecciona independientemente entre alquilo C1 a C30, n es un número entero que varía de 1 a 4; y a es un número entero que varía de 1 a 20; R2 es H; o R2 es un monofosfato, difosfato, Tri-fosfato o resto fosforamidita; o R2 es -Y-X o -Y-L-Y1-X; Y e Y1 son independientemente uno del otro un enlace sencillo o un resto de conexión funcional seleccionado entre el grupo que consiste en éster de ácido carboxílico, amidas de ácido carboxílico, uretano, éter, grupo amino, éster de fosfato, tioéster, tioamidas y tioéter, X es un compuesto coloidal activo (CA) seleccionado ente el grupo que consiste en amilasas, amilopectinas, acemannans, arabinogalactanos, galactomananos, galactoglucomananos, xantanos, carragenina, citosano, almidón, almidón modificado, ácido hialurónico y ácido hialurónico desacetilado, o X es un marcador de fluorescencia (FA) seleccionado entre el grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina, rodamina y 2-aminopiridina, colorantes de carbocianina, colorantes bodipy y colorantes de cumarina o X es un resto polinucleotídico que tiene hasta 50 residuos de nucleótidos; L es un enlazador por medio del cual Y y X están unidos covalentemente y es un resto que comprende de 1 a 30 átomos de carbono los cuales pueden estar saturados o insaturados, cíclicos o alicíclicos, ramificados o sin ramificar y los cuales pueden estar sustituidos o interrumpidos por heteroátomos; R5 y R6 representan independientemente uno del otro un resto alquilo C1-C28 el cual opcionalmente puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o uno o más seleccionados entre el grupo que consiste en: éster, amida, ácido carboxílico, tioéster, tioamidas y tioéter; o R5 y R6 representan independientemente uno del otro un resto alquilo C1-C28 sustituidos con uno o más restos seleccionados entre el grupo -Y-X o -Y-L-Y1-X; con la condición de que el compuesto comprenda al menos dos cadenas, cada una de las cuales tiene 4 o más átomos de carbono.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de 5-fluorouridina

La presente invención se refiere a derivados de 5-fluorouracilo representados por la fórmula (I), a composiciones farmacéuticas que comprenden dicho derivado y a su uso en el tratamiento del cáncer, así como un proceso para preparar el derivado de 5-fluorouracilo representado por la fórmula (I).

Los documentos GB 2 168 353 y GB 2 168 350 describen un esteroide que está conectado a una base de 5-fluorouracilo a través de un resto 5'-monofosfato.

El documento JP 05097887 describe 2'-desoxi-p-D-ribunucleósidos de derivados de 5-fluorouracilo que llevan un resto de aminoácido así como un método para la producción de los mismos.

El documento JP 57128699 describe derivados farmacológicamente activos de p-D-ribonucleósido de 5-fluorouracilo que llevan un resto éster monofosfato.

El documento JP 10218893 describe la preparación de oligonucleótidos que tienen un resto 5-fluorouracilo estando enlazado a cianofosforamidita.

Sin embargo, ninguna de las citas mencionadas anteriormente describe compuestos que comprenden al menos dos cadenas de carbono, cada una de las cuales tiene 4 o más carbonos que están enlazados linealmente como se describe en la presente invención.

El análogo fluorado de uracilo, fluorouracilo (5-fluorouracilo, 5-Fluoruracilbiosyn®, Fluoruracil-GRY®, 5-FU HEXAL®, 5-FU Lederle® etc.) es uno de los antimetabolitos tumorales más antiguos. Se ha desarrollado en la década de 1950. Desde entonces, el fluorouracilo se ha empleado para el tratamiento de diversos tumores sólidos, tales como carcinomas de próstata, pancreático, de colon, rectal, de mama, de hígado, de cabeza, de cuello y de vejiga. En la célula, el fluorouracilo se convierte en los nucleótidos activos 5'-monofosfato de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUMP), 5'-trifosfato de 5'-fluorouridina (5-FUTP) y 5'-trifosfato de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdUTP). El metabolismo es muy complejo. El fluorouracilo se convierte primero por fosforibosil transferasa en 5'-monofosfato de 5-fluorouridina (5-FUMP), que se fosforila por medio de nucleótido quinasas a través del 5'-difosfato (5-FUDP) para formar el 5'-trifosfato (5-FUTP). El nucleótido 5-FUTP se incorpora por las ARN polimerasas en el ARN en lugar de UTP y de esta manera interfiere con la función del ARN. El metabolito 5-FUDP se convierte con la ayuda de ribonucleótido reductasa en 5-FdUDP, que después se fosforila por la nucleósido difosfato quinasa para formar 5-FdUTP. El 5-FdUTP también puede incorporarse al ADN como un bloque de construcción falso por las ADN polimerasas. La retirada de los nucleótidos incorrectos por la uracilo glicosilasa da como resultado roturas de cadena sencilla de ADN, lo que conduce a la inhibición de la síntesis de ADN, fragmentación de ADN y finalmente apoptosis. La desfosforilación de 5-FdUTP por medio de dUTPasa forma el tercer metabolito activo monofosfato de 5-fluorodesoxiuridina (5-FdUMP). Inhibe la timidilato sintasa (TS), que cataliza la metilación reductora de monofosfato de desoxiuridina (dUMP) a monofosfato de desoxitimidina (dTMP) junto con el cofactor 5,10-metilentetrahidrofolato. Después de la unión de 5-FdUMP a TS, la enzima se bloquea en un complejo terciario (TS, 5-FdUMP y folato), por lo que se inhibe la metilación en el C-5. Esto da como resultado la inhibición de la síntesis de ADN.

El desoxinucleósido floxuridina (5-fluoro-2'-desoxiuridina, 5-FUdR) es un profármaco de 5-fluorouracilo. La bioactivación de la misma es más sencilla porque se fosforila por la timidina quinasa en el metabolito activo 5-FdUMP. La floxuridina sirve para tratar el carcinoma colorrectal metastásico. Como el fluorouracilo, tiene una biodisponibilidad oral muy baja y, por lo tanto, se administra como una inyección intraarterial. Como la floxuridina en realidad no tiene ventaja sobre el 5-FU, hoy en día solo se usa raramente. En las últimas décadas, se han desarrollado profármacos de fluorouracilo aplicables por vía oral que también permiten que el fármaco sea guiado selectivamente a las células tumorales. El profármaco de fluorouracilo doxifluridina (5'-desoxi-5-fluorouridina) se convierte por la timidina fosforilasa (TP) en 5-fluorouracilo (5-FU), que cataliza la fosforólisis de los nucleósidos de pirimidina. Dado que esta enzima está presente en concentraciones más altas en el tumor en comparación con las células normales, el fármaco exhibe una actividad selectiva del tumor. Sin embargo, tras la administración oral, la doxifluridina provoca toxicidad gastrointestinal grave (diarrea), porque el 5-fluorouracilo ya se libera en el tracto gastrointestinal. Es por eso que la doxifluridina no puede emplearse clínicamente. El carbamato de fluoropirimidina capecitabina (N(4)-pentiloxicarbonil-5'-desoxi-5-fluorocitidina, Xeloda®) es el primer profármaco de 5-fluorouracilo administrado por vía oral aprobado. Debido a su mayor lipofilia que se debe al grupo pentiloxicarbonilo, se absorbe muy rápidamente como profármaco en el tracto gastrointestinal. Posteriormente, se metaboliza en un proceso enzimático de tres etapas para formar 5-fluorouracilo. La cadena lateral se escinde en el hígado por una carboxil esterasa. En lo sucesivo, la 5'-desoxi-5-fluorocitidina (5'-DFCR) formada se convierte en 5'-desoxi-5-fluorouridina (5'-DFUR, doxifluridina), mediante citidina desaminasa en el hígado y en el tumor. Debido a la ausencia del grupo 5'-hidroxi, este metabolito no puede convertirse en nucleótidos de fluorouracilo por las nucleósido quinasas. En la última etapa de activación, el 5-fluorouracilo se forma a partir de 5'-DFUR por medio de timidina fosforilasa. Las enzimas citidina desaminasa y timidina fosforilasa son más abundantes en muchos tumores (concentraciones 3-10 veces aumentadas). Por lo tanto, la activación de la capecitabina en las células tumorales se realiza de manera más eficaz en comparación con las células normales, lo que conduce al enriquecimiento selectivo de 5-fluorouracilo en el tumor. La capecitabina se emplea para el tratamiento del carcinoma colorrectal metastásico. Se pudo observar una mejor tasa de respuesta en comparación con el 5-fluorouracilo en los estudios clínicos. Además, la capecitabina también se emplea en el carcinoma de mama avanzado o metastásico. Los pacientes reciben 1250 mg/m2 de superficie corporal dos veces al día durante dos semanas, seguido de una semana de descanso de terapia. Los efectos secundarios más frecuentes incluyen trastornos gastrointestinales y eritrodisestesia palmoplantar (reacción cutánea mano-pie); la mielosupresión raramente se produce. El derivado de tetrahidrofurilo tegafur (ftorafur, 5-fluoro-1-(tetrahidro-2-furil) uracilo) es otro profármaco de 5-FU aplicable por vía oral, desarrollado ya en la década de 1960 en la Unión Soviética por S. Hiller. Este medicamento contiene una mezcla racémica de isómeros R y S. El tegafur se metaboliza por el sistema del citocromo P450 en el hígado o por medio de la pirimidin nucleósido fosforilasa para formar 5-fluorouracilo. Sin embargo, debido a su grave toxicidad gastrointestinal, cardio y neurotoxicidad, el tegafur se usa solamente en combinación con uracilo (UFT®) e inhibidores de la dihidropirimidina deshidrogenasa. La forma activa 5-fluorouracilo se metaboliza en el hígado muy rápidamente saturando el doble enlace por medio de la dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) para formar 5,6-dihdyro-5-fluorouracilo y se inactiva de esta manera. UFT® contiene tegafur y uracilo en una relación molar de 1:4. El uracilo es un sustrato natural de DPD y tiene una mayor afinidad por esta enzima que el 5-fluorouracilo. Inhibe competitivamente el DPD y, por lo tanto, ralentiza la degradación de 5-FU. La vida media del fluorouracilo se prolonga de ese modo (10­ 14 horas en lugar de 10-30 minutos) y su nivel plasmático y biodisponibilidad aumentan significativamente. El cofactor tetrahidrofolato de 5,10-metileno es necesario para la timidilato sintasa. Por lo tanto, la citotoxicidad del fluorouracilo y las fluoropirimidinas puede mejorarse mediante la administración simultánea de ácido folínico (leucovorina, LV, 5-formil-THF) o folinato de calcio. El ácido folínico es un precursor que se convierte intracelularmente en tetrahidrofolato de 5,10-metileno. La combinación de UFT® y folinato de calcio es más tolerable que el 5-FU y el ácido folínico, y los efectos secundarios tóxicos son menos frecuentes. Junto con el folinato de calcio, UFT® sirve para la terapia primaria del carcinoma colorrectal metastásico. La coadministración de inhibidores de DPD, tales como eniluracilo (5-etiniluracilo) y 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina (CDHP), también puede aumentar la citotoxicidad de los derivados de fluoropirimidina. La formulación S-1 también contiene oxonato de potasio además de CDHP y tegafur, que inhibe la fosforiboxilación del fluorouracilo en el tracto gastrointestinal. Esto puede disminuir la toxicidad gastrointestinal. Los inhibidores de DPD se examinan en combinación con 5-fluorouracilo, capecitabina y tegafur en estudios clínicos.

El 5-fluorouracilo, así como su ^-D-ribo-(la ) y 2'-desoxi-i6-D-ribonucleósidos (1b) (Esquema 1) poseen actividad antitumoral contra diversos tipos de carcinomas, particularmente de la mama y el tracto gastrointestinal.

Adicionalmente, se han obtenido resultados positivos en el tratamiento tópico de la queratosis premaligna de la piel y los carcinomas de células basales [A. Albert, "Selective T oxicity - The physico-chemical basis of therapy", Chapman y Hall, Londres, Nueva York, 7a edición, 1985, pp. 60, 125 - 126; C. Heidelberger, L. Griesbach, O. Cruz, R. Schnitzer, F. Gruenberg, Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 1958, 97, 470].

El uso intratecal de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (1b) se ha estudiado para la diseminación meníngea de tumores cerebrales malignos y se ha descubierto que este nucleósido tiene una excelente actividad antitumoral y una neurotoxicidad mínima [M. Yamada, H. Nakagawa, M. Fukushima, K. Shimizu, T. Hayakawa, K. Ikenaka, J. Neuro-Oncology 1998, 37, 115].

Se ha preparado una gran cantidad de profármacos lipófilos de 5-fluorouracilo y sus nucleósidos y se ha descubierto que poseen propiedades antitumorales útiles. Además Ftorafur y sus derivados recientemente ácido 5-fluoro-5'-uridílico, mono[2-(deciloxi)-3-(dodecilsulfanil)-propil]éster y sus sales (Fosfluridina, Tidoxil) se han usado para el tratamiento de enfermedades proliferativas intraepiteliales [documento US 7.378.401]. Además se describe la síntesis de derivados cíclicos y acíclicos O-2',3'-cetales de la 5-fluorouridina citostática [E. Malecki, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2010, 93, 1500-1512; E. Malecki, F. Ye, H. Reuter, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2009, 92, 1923-1932.] Se han descrito derivados de 5-fluorouridina altamente liposolubles que exhiben una excelente actividad antitumoral [documento EP 0588317]. Además se describen liposomas e inmunoliposomas que contienen derivados antitumorales de 5'-succinil- y 5'-palmitoil-5-fluorouridina [P. Crosasso et al., J. of Pharmaceutical Sciences, 1997, 86/7), 832-839.]

Sin embargo, los fármacos cancerostáticos a base de 5-fluorouridina conocidos en la técnica anterior padecen una captación y permeabilidad de membrana suficiente y efectiva, así como un efecto cancerostático suficiente.

Por lo tanto, fue un objeto de la presente invención proporcionar fármacos anticancerígenos que tengan una absorción y permeabilidad de membrana mejoradas, así como un efecto cancerostático mejorado. En particular, fue un objeto de la presente invención proporcionar un fármaco contra el cáncer mejorado y más eficaz.

Se ha encontrado sorprendentemente que los derivados de 5-fluorouracilo específicamente lipofilizados conducen a fármacos que tienen una actividad anticancerígena mejorada.

Una primera realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (I)

en donde X es un grupo de fórmula III

en donde

R¹ se selecciona entre H, -(CH²-CH=C(CH³))ⁿ-CH³ y -(CH²)^a-N(R⁷)(R⁸) y restos de terpeno cíclico, sustituido o sin sustituir,

en donde R⁷ y R⁸ se selecciona independientemente entre alquilo C¹ a C³⁰,

n es un número entero que varía de 1 a 4; y

a es un número entero que varía de 1 a 20;

R² es H; o

R² es un monofosfato, difosfato, trifosfato o resto fosfoamidita; o

R² es -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

Y e Y¹ son independientemente uno del otro un enlace sencillo o un resto de conexión funcional seleccionado entre el grupo que consiste en éster de ácido carboxílico, amidas de ácido carboxílico, uretano, éter, grupo amino, éster de fosfato, tioéster, tioamidas y tioéter;

X es un compuesto coloidal activo (CA) seleccionado ente el grupo que consiste en amilasas, amilopectinas, acemannans, arabinogalactanos, galactomananos, galactoglucomananos, xantanos, carragenina, citosano, almidón, almidón modificado, ácido hialurónico y ácido hialurónico desacetilado, o

X es un marcador de fluorescencia (FA) seleccionado entre el grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina, rodamina y 2-aminopiridina, colorantes de carbocianina, colorante bodipy y colorantes de cumarina, o

X es un resto polinucleotídico que tiene hasta 50 residuos de nucleótidos, preferentemente de 10 a 25 nucleótidos, especialmente un polinucleótido que tiene un efecto antisentido o antígeno;

L es un enlazador por medio del cual Y y X están unidos covalentemente y es un resto que comprende de 1 a 30 átomos de carbono los cuales pueden estar saturados o insaturados, cíclicos o alicíclicos, ramificados o sin ramificar y los cuales pueden estar sustituidos o interrumpidos por heteroátomos;

R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ el cual opcionalmente puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o uno o más grupos funcionales seleccionados entre el grupo que consiste en: éster, amida, ácido carboxílico, tioéster, tioamidas y tioéter; o

R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ sustituidos con uno o más restos seleccionados entre el grupo -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

con la condición de que el compuesto comprenda al menos dos cadenas, cada una de las cuales tiene 4 o más átomos de carbono, preferentemente 6 o más, más preferentemente 8 o más átomos de carbono.

El compuesto de la invención comprende al menos dos cadenas las cuales tienen cada una 4 o más átomos de carbono que pueden ser cadenas de carbono en las que los átomos de carbono están unidos linealmente. Las cadenas pueden no ser parte de un sistema cíclico. Las cadenas generalmente no están interrumpidas por heteroátomos.

En una realización preferida R¹ no es H.

en donde R⁷ y R⁸ se seleccionan independientemente entre una cadena C¹ a C³⁰ la cual puede estar saturada o insaturada, preferentemente un alquilo C¹ a C³⁰, preferentemente alquilo C⁴ a C²⁴, más preferentemente alquilo C⁸ a C²² y especialmente C¹² a C¹⁸; o una cadena C² a C³⁰ que tiene uno o más enlaces dobles de carbono-carbono y/o triples de carbono-carbono; y

"a" es un número entero que varía de 1 a 20, preferentemente de 2 a 18, más preferentemente de 3 a 12 o de 4 a 8. Sin embrago, el resto de unión que une el átomo de nitrógeno con los sustituyentes R⁷ y R⁸ al resto de 5-fluorouracilo también puede ser una cadena de carbono insaturada que tiene de 2 a 20 átomos de carbono y uno o más dobles enlaces carbono-carbono y triples carbono-carbono. El sustituyente ejemplar de la siguiente fórmula: puede sintetizarse por diversas rutas sintéticas.

El Esquema 2 muestra varias rutas sintéticas para precursores que pueden unirse al resto 5-fluorouracilo.

Esquema 2

Como puede verse en el Esquema 2, pueden obtenerse diversos precursores para la conexión con el átomo de nitrógeno del resto 5-fluorouracilo por diferentes rutas sintéticas. En una realización preferida de la presente invención, el sustituyente R¹ es un sustituyente de doble cadena. Los sustituyentes de doble cadena se pueden obtener como se refleja en el Esquema 2.

En un primer aspecto, la dioctadecil amina se hace reaccionar con bromoacetato de metilo en presencia de dibenzo-[18]-corona-6 que conduce al éster metílico puro con un rendimiento casi cuantitativo. El éster'puede reducirse con LiAlH⁴ para dar el alcohol.

Para extender el espaciador entre el grupo hidroxilo y el nitrógeno que lleva las cadenas de carbono, la dioctadecilamina se puede hacer reaccionar con acrilato de metilo, lo que da como resultado un rendimiento casi cuantitativo para el éster que se redujo aún más con LiAlH⁴ para dar un derivado de aminopropanol lipofílico.

En otro aspecto, la dioctadecilamina se hizo reaccionar con anhídrido succínico para dar el ácido que se puede convertir en el éster metílico por reacción con sulfato de dimetilo en presencia de K²CO³. El éster metílico puede entonces reducirse con LiAlH⁴ produciendo el alcohol extendido adicional, es decir, un derivado de 4-aminobutanol lipofilizado.

En una reacción adicional, la dioctadecilamina puede alquilarse con 1,4-diclorobut-2-ina en presencia de Na²CO³ en benceno.

En el siguiente Esquema 3 se describen diversas rutas sintéticas para obtener un precursor de cadena sencilla o un precursor de cadena doble con diferentes cadenas para la sustitución del resto 5-fluorouracilo. El precursor de cadena sencilla reflejado en el Esquema 3 está interrumpido por un heteroátomo (N) o un grupo funcional (amida; NHCO).

Como se puede ver en el Esquema 3, los precursores de cadena simple de lípidos se pueden obtener mediante la reacción de octadecilamina con anhídrido succínico que conduce al ácido que se puede reducir con LiAlH⁴ en THF a temperatura ambiente, lo que conduce a la reducción del grupo carboxílico solamente, pero no del resto amida y da como resultado el amidoalcohol con un rendimiento del 82 %. Sin embargo, el reemplazo de THF por Et²O da como resultado un aminoalcohol con un alto rendimiento del 84 %. La reacción posterior de aminoalcohol con bromuro de propargilo da como resultado el alcalino de doble cadena con un rendimiento del 61 %.

Sorprendentemente, se ha encontrado que las cadenas de carbono lipofílicas que comprenden un grupo funcional hidroxilo o un haluro se pueden introducir regioselectivamente en el derivado de 5-fluorouracilo. Los grupos lipofílicos pueden posicionarse principalmente en la base heterocíclica o en el resto glucónico y pueden introducirse por diversos métodos, por ejemplo mediante alquilación catalizada por bases con haluros de alquilo.

La reacción de derivados de 5-fluorouracilo sin protección con alquilos, alquenos o alcalinos halogenados se puede realizar en DMF/K²CO³ (alquilación directa) y conduce a la alquilación del átomo de nitrógeno no sustituido en el anillo de 5-fluorouracilo.

Preferentemente, el átomo de nitrógeno no sustituido en el anillo de 5-fluorouracilo está sustituido por un precursor halógeno sustituido con la condición de que los grupos hidroxilo presentes en el derivado de 5-fluorouracilo estén protegidos por grupos protectores. Los grupos protectores adecuados son conocidos por el experto en la materia. Son ejemplos, dimetoxitritilo (DMT) y un grupo terc-butil-dimetilsililo. Sorprendentemente, se ha encontrado que el precursor lipofílico funcional hidroxilo (como los aminoalcoholes reflejados en los Esquemas 2 y 3) puede hacerse reaccionar selectivamente con el átomo de nitrógeno no sustituido del derivado de 5-fluorouracilo mediante una reacción de Mitsunobu. Esta reacción se lleva a cabo protegiendo primero cualquier grupo hidroxilo que pueda estar presente en el derivado de 5-fluorouracilo.

La reacción de Mitsunobu se lleva a cabo generalmente haciendo reaccionar el alcohol y el derivado de 5-fluorouracilo que comprende el átomo de nitrógeno del anillo no sustituido en presencia de trifenilfosfina y dicarboxilato de diisopropilazo (DIAD).

En una realización de la invención, R¹ comprende uno o más enlaces dobles de carbono-carbono y/o uno o más enlaces triples de carbono-carbono. En una realización preferida particular, R1 comprende dos o más, especialmente 2 a 6, tales como 2 a 4 dobles enlaces carbono-carbono.

En una realización especialmente preferida, los sustituyentes se obtienen de la naturaleza. Los sustituyentes adecuados derivados naturalmente tienen una estructura obtenida a partir de terpenos. Cuando los terpenos se modifican químicamente, como por oxidación o reordenamiento del esqueleto de carbono, los compuestos resultantes generalmente se denominan terpenoides. En una realización preferida, R1 es un terpenoide cíclico o alicíclico, preferentmente un terpenoide que tiene de 8 a 36 átomos de carbono.

Los terpenos se seleccionan preferentmente entre monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, sesterterpenos, triterpenos y sesquaterpenos.

Los monoterpenos o monoterpenoides adecuados que pueden ser acíclicos o cíclicos se seleccionan del grupo que consiste en geraniol, limoneno, pinen, bornileno, nerol.

Los sesquiterpenos sesquiterpenoides adecuados que pueden ser acíclicos o cíclicos pueden seleccionarse entre farnesol.

Los sesterterpenos o sesterterpenoides adecuados se seleccionan entre geranilfarnesol.

Los diterpenos o diterpenoides adecuados se pueden seleccionar del grupo que consiste en ácido abiético, afidicolina, cafestol, cembreno, ferruginol, forskolina, guanacastepeno A, kahweol, labdano, lagochilin, dsclareno, estemareno, esteviol, taxadieno (precursor de taxol), tiamulina, geranilgeraniol y fitol.

De acuerdo con una realización especialmente preferida de la invención, R1 se selecciona del grupo que consiste en geranilo, farnesilo, nerilo y fililo.

De acuerdo con un aspecto adicional R1 se selecciona entre H,

y

y restos terpeno sustituidos o sin sustituir, en donde

R⁷ y R⁸ se selecciona independientemente entre alquilo C¹ a C³⁰,

n es un número entero que varía de 1 a 4, preferentemente n es 1 o 2; y

a es un número entero que varía de 1 a 20, preferentemente de 2 a 18.

En una realización preferida R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ el cual opcionalmente puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o grupos funcionales. Preferentemente, el uno o más heteroátomos se seleccionan del grupo que consiste en O, S y N. Además, el uno o más grupos funcionales se seleccionan del grupo que consiste en éster, amida, ácido carboxílico, tioéster, tioamidas y tioéter.

En el presente documento se describe una realización en donde R⁵ y R⁶ forman un anillo que tiene al menos 5 miembros, preferentmente un anillo que tiene de 5 a 8 átomos de carbono y en donde el anillo puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o grupos funcionales y en donde el uno o más heteroátomos se seleccionan de O, S y N. Preferentemente, el uno o más grupos funcionales se seleccionan de éster, amida, ácido carboxílico, tioéster, tioamidas y tioéter.

Preferentemente, Y e Y¹ son grupos de conexión funcionales que se seleccionan independientemente entre un grupo que consiste en éster de ácido carboxílico, amidas de ácido carboxílico, uretano, éter, grupo amino, tioéster, tioamidas y tioéter.

De acuerdo con la realización preferida, el heteroátomo o heteroátomos se seleccionan entre O, S y N.

En otro aspecto de la invención, el enlazador L es un resto que comprende de 1 a 30 átomos de carbono que pueden ser saturados o insaturados, cíclicos o alicíclicos, ramificados o no ramificados y que pueden estar sustituidos o interrumpidos por heteroátomos. Preferentemente, el enlazador L se selecciona entre alcandiilos C² a C²⁰, preferentemente se selecciona entre etileno o propileno.

En otro aspecto de la invención, el enlazador L es un resto saturado o insaturado que tiene de 1 a 30, preferentemente de 2 a 20 átomos de carbono, más preferentemente una cadena de carbono que puede estar sustituida y/o interrumpida por uno o más grupos funcionales seleccionados de éster de ácido carboxílico, éster de fosfato, amidas de ácido carboxílico, uretano, éter y grupos amina. L también puede comprender restos cíclicos.

De acuerdo con un enlazador preferido, L es alcandiilo, preferentemente alcandiiilo C¹-C²⁰; alquendiilo, preferentemente un alquendiilo C²-C²⁰; alquindiilo, preferentemente un alquindiilo C²-C²⁰; resto arilo, resto aralquilo y resto heterocíclico.

Preferentemente, el alcandiilo representa un grupo alcandiilo de cadena lineal o ramificada unido por dos átomos de carbono diferentes a la molécula, preferentemente representa un alcandiiilo C^1-12 de cadena lineal o de cadena ramificada, particularmente, de manera preferente representa alcandiilo C^1-6 de cadena lineal o de cadena ramificada; por ejemplo, metandiilo (--CH²--), 1,2-etanodiilo (--CH²-CH²--), 1,1-etanodiilo ((-CH(CH³)--), 1,1-, 1,2-, 1,3-propanodiilo y 1,1-, 1,2-, 1,3-, 1,4-butanodiilo, con preferencia particular dada a metandiilo, 1,1-etanodiilo, 1,2-etanodiilo, 1,3-propanodiilo, 1,4-butanodiilo.

Además, preferentemente el alquendiilo representa un grupo alquendiilo de cadena lineal o ramificada unido por dos átomos de carbono diferentes a la molécula, preferentemente representa un alquendiilo C^2-6 de cadena lineal o de cadena ramificada; por ejemplo, --CH=CH--, --CH=C(CH³)--, --CH=CH-CH²--, --C(CH³)=CH-CH²--,-CH=C(CH^a)--CH²--, --CH=CH-C(CH³)H--, --CH=CH-CH=CH--, --C(CH³)=CH-CH=CH--, --CH=C(CH³)-CH=CH--, con preferencia particular dada a --CH=CH-CH²--, --CH=CH-CH=CH--.

El resto arilo preferentemente representa un grupo hidrocarburo aromático, preferentemente un grupo hidrocarburo aromático C^6-10; por ejemplo, fenilo, naftilo, especialmente fenilo, el cual puede estar emocionalmente sustituido.

El resto aralquilo indica un "Arilo" unido a un "Alquilo" y representa, por ejemplo, bencilo, a-metilbencilo, 2-feniletilo, a,a-dimetilbencilo, especialmente bencilo.

El resto heterocíclico representa un sistema de anillo saturado, parcialmente saturado o aromático que contiene al menos un heteroátomo. Preferentemente, los heterociclos consisten en 3 a 11 átomos en el anillo, de los cuales 1-3 átomos en el anillo son heteroátomos. Los heterociclos pueden estar presentes como un sistema de anillo sencillo o como sistemas de anillo bicíclicos o tricíclicos; preferentemente como sistema de anillo sencillo o como sistema de anillo bencinado. Los sistemas de anillos bicíclicos o tricíclicos pueden formarse por anulación de dos o más anillos, por un átomo puente, por ejemplo, oxígeno, azufre, nitrógeno o por un grupo puente, por ejemplo, alcandiilo o alquendiilo. Un heterociclo puede estar sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en oxo (=O), halógeno, nitro, ciano, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilalquilo, halogenalquilo, arilo, ariloxi, arilalquilo. Ejemplos de restos heterocíclicos son: pirrol, pirrolina, pirrolidina, pirazol, pirazolina, pirazolidina, imidazol, imidazolina, imidazolidina, triazol, triazolina, triazolidina, tetrazol, furano, dihidrofurano, tetrahidrofurano, furazano (oxadiazol), dioxolano, tiofeno, dihidrotiofeno, tetrahidrotiofeno, oxazol, oxazolina, oxazolidina, isoxazol, isoxazolina, isoxazolidina, tiazol, tiazolina, tiazlolidina, isotiazol, istotiazolina, isotiazolidina, tiadiazol, tiadiazolina, tiadiazolidina, piridina, piperidina, piridazina, pirazina, piperazina, triazina, pirano, tetrahidropirano, tiopirano, tetrahidrotiopirano, oxazina, tiazina, dioxina, morfolina, purina, pterina, y los correspondientes heterociclos bencilatados, por ejemplo, indol, isoindol, cumarina, cumaronacinolina, isocinolina, cinolina y similares.

Los heteroátomos son átomos distintos de carbono e hidrógeno, preferentemente nitrógeno (N), oxígeno (O) o azufre (S).

En una realización preferida de la presente invención, el enlazador L¹ es un alcandiilo C¹-C¹⁰, preferentemente un alcandiilo C²-C⁶ , especialmente etan-1,2-diilo (etileno) o propan-1,2-diilo o propan-1,3-diilo.

Específicamente, X es un compuesto coloidal activo (CA) seleccionado ente el grupo que consiste en amilasas, amilopectinas, acemannans, arabinogalactanos, galactomananos, galactoglucomananos, xantanos, carragenina, ácido hialurónico, ácido hialurónico desacetilado, citosano, almidón y almidón modificado.

En una realización preferida, X es un almidón modificado que se selecciona del grupo que consiste en almidones de hidroxialquilo, almidones esterificados, almidones de carboxialquilo, almidón de hidroxialquil carboxialquilo, hidroxialquil almidón aminado, almidón de hidroxialquil carboxialquil aminado y carboxialquil almidón aminado. En una realización particularmente preferida, dicho almidón modificado se selecciona de hidroxietilalmidón o hidroxietilalmidón aminado o carboximetil almidón o carboximetil almidón.

Por lo general, el compuesto coloide activo (CA) tiene un peso molecular promedio de 20.000 a 800.000 daltons, preferentemente de 25.000 a 500.000 daltons, especialmente de 30.000 a 200.000 daltons.

Los almidones modificados adecuados tienen preferentemente un grado de sustitución, DS, del almidón modificado, especialmente hidroxietilalmidón, de 0,2 a 0,8, preferentemente de 0,3 a 0,6.

De acuerdo con una realización alternativa, X es un marcador de fluorescencia que se selecciona del grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina, rodamina y 2-aminopiridina, colorantes de carbociamina y colorantes bodipy.

En el presente documento se desvela un compuesto representado por la fórmula (I)

en donde X se selecciona entre el grupo de fórmulas (II) o (III)

en donde

R¹ es H o una cadena C¹-C⁵⁰ la cual puede ser ramificada o lineal y que puede estar saturada o insaturada y que opcionalmente puede estar interrumpida y/o sustituida por uno o más heteroátomos (Het 1) y/o grupos funcionales (G 1); o

R¹ es un resto C³-C²⁸ el cual comprende al menos una estructura cíclica y que puede estar saturada o insaturada y que opcionalmente puede estar interrumpida y/o sustituida por uno o más heteroátomos (Het1) y grupos funcionales (G1);

R² es H; o

R² es un monofosfato, difosfato, trifosfato o resto fosfoamidita; o

R² es -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

Y e Y¹ son independientemente uno del otro un enlace simple o un resto de conexión funcional,

X es un compuesto coloide-activo (CA) o un marcador de fluorescencia (FA) o un resto polinucleotídico que tiene hasta 50 residuos de nucleótidos, preferentemente de 10 a 25 nucleótidos, especialmente un polinucleótido que tiene un efecto antisentido o antígeno; L es un enlazador por medio del cual Y y X están unidos covalentemente; R³ y R⁴ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ el cual opcionalmente puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o grupos funcionales; o

R³ y R⁴ forman un anillo que tiene al menos 5 miembros, preferentemente un anillo que tiene de 5 a 8 átomos de carbono y en el que el anillo puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o grupos funcionales; o

R³ y R⁴ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ sustituidos con uno o más restos seleccionados entre el grupo -Y-X o -Y-L-Y¹-X; o

R³ y R⁴ representan independientemente cada uno del otro -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ el cual opcionalmente puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o grupos funcionales; o

R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ sustituidos con uno o más restos seleccionados entre el grupo -Y-X o -Y-L-Y¹-X; o

R⁵ y R⁶ forman un anillo que tiene al menos 5 miembros, preferentemente un anillo que tiene de 5 a 18 átomos de carbono y en el que el anillo puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o grupos funcionales;

y/o uno o más restos seleccionados entre el grupo -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

R⁵ y R⁶ representan independientemente cada uno del otro -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

en donde los heteroátomos (Het1) se seleccionan entre el grupo que consiste en O, S y H;

el grupo o grupos funcionales se seleccionan de manera preferente independientemente entre éster, amida, ácido carboxílico, tioéster, tioamidas y tioéter;

Y e Y1 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en éster del ácido carboxílico, amidas de ácido carboxílico, uretano, éter, grupos amino, tioéster, tioamidas y tioéter;

L se selecciona entre el grupo que consiste en etileno y propileno;

X es un compuesto activo coloide seleccionado del grupo que consiste en amilasas, amilopectinas, acemannans, arabinogalactanos, galactomananos, galactoglucomananos, xantanos, carragenina, citosano, almidón, ácido hialurónico de almidón modificado y ácido hialurónico desacetilado, o un marcador de fluorescencia seleccionado del grupo que consiste en isocianato de fluoresceína, ficoeritrina, rodamina y 2-aminopiridina, colorantes de carbocianina, colorantes bodipy y colorantes de cumarina.

De acuerdo con un aspecto adicional, en el presente documento se desvela un compuesto (I) representado por la siguiente fórmula (Ila)

De acuerdo con la realización preferida, el compuesto (I) de la invención puede representarse mediante la siguiente fórmula (Illa):

en donde

R¹ se selecciona entre el grupo que consiste en H, farnesilo, fitilo, nerilo y abietilo;

R² se selecciona entre el grupo que consiste en H, Atto 488, (MeO²)Tr-, -SiMe^2tBu y un resto fosforamidita; R⁵ y R⁶ se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en metilo, propilo, nonilo, 4-oxobutilideno, citosano y Atto 488.

Una realización adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención.

Especialmente la composición farmacéutica es adecuada para su uso en el tratamiento del cáncer, especialmente seleccionado de tumores del tracto gastrointestinal, por ejemplo, cáncer de colon humano HT29, cáncer de mama, queratosis premaligna de la piel y basales de todos los carcinomas.

Una realización adicional de la presente invención es un proceso para preparar un compuesto representado por la fórmula (I)

en donde

R¹ se selecciona entre -(CH²-CH=C(CH³))ⁿ-CH³ y -(CH²)^a-N(R⁷)(R⁸) y restos de terpeno cíclico, sustituido o sin sustituir,

en donde

R⁷ y R⁸ se selecciona independientemente entre alquilo C¹ a C³⁰,

n es un número entero que varía de 1 a 4; y

a es un número entero que varía de 1 a 20;

X es un grupo de fórmula (III) como se definió anteriormente que comprende las siguientes etapas:

proporcionar un compuesto de fórmula (IA) e introducir grupos protectores para grupos hidroxilo, si están presentes

b) convertir un alcohol de la fórmula R1-OH en una reacción de tipo Mitsunobu con el compuesto (IA) y

c) opcionalmente, retirar los grupos protectores.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de la invención, R1-OH se selecciona del grupo que consiste en nerol, fitol, eicosapentaenol y docosahexaenol.

En un aspecto ejemplar de la invención, la lipofilización biomimética de 5-fluorouridina se ha llevado a cabo mediante el uso de terpenoles fitol así como nerol que están acoplados a N(3) del nucleósido aplicando condiciones de reacción de Mitsunobu. Nerol es un monoterpeno que se encuentra en muchos aceites esenciales como la hierba de limón y el lúpulo. El diterpeno fitol es, entre otras cosas, un componente de la clorofila con la cual este último está incrustado en las membranas tilacoides de los cloroplastos.

El Esquema 4 que sigue muestra una secuencia de reacción ejemplar para la lipofilación del derivado 5-fluoruoracilo

(1) mediante la reacción de Mitsunobu.

Sorprendentemente, ha encontrado que las reacciones de Mitsunobu entre un alcohol y el nucleósido conducen preferente y predominantemente a un producto alquilado en base principal, si el nucleósido está completamente protegido en el resto glucónico.

Además, tal reacción requiere un valor pKbh+ del educto nucleosídico que oscila entre 0 y 14. La 5-fluorouridina (1a) o sus derivados que tienen un pKbh+ = 8,0 ± 0,1 es, por lo tanto, adecuada para las alquilaciones de Mitsunobu. El Esquema 4 muestra que el compuesto 1a se ha protegido primero en los hidroxilos 2', 3' por reacción con heptan-4-ona en presencia de ortoformiato de etilo y HCl 4 M en 1,4-dioxano y se obtuvo el compuesto 2b. Esto se había preparado antes y posee una estabilidad ácida adecuadamente alta en el grupo cetal [t = 130 min en HCl ac.

1 N/MeCN, 1:1, (v/v)]. Después, el último se puede proteger en el grupo 5'-OH con un residuo 4-monometoxifenilmetilo ( ^ 3). Este intermedio se sometió después a alquilaciones de Mitsunobu con fitol o nerol (PPh³ , DEAD, THF, 0 °C) el cual dio los compuestos 4a, b. Posteriormente, ambos se destritilaron en ácido dicloroacético al 4 % en diclorometano a temperatura ambiente durante 10 min, lo que condujo a los compuestos 5a, b los cuales poseen valores de logP significativamente mejorados en comparación con la 5-fluorouridina (1a: logP = -1,34 ± 0,46; 4a: logP = 12,5 ± 0,63;

5b: logP = 7,65 ± 0,65). Después, los últimos se fosforilaron para dar las fosforamiditas 6a, b.

En el siguiente esquema 5, se muestra una forma adicional de lipofilizar los derivados de 5-fluorouracilo usando el diterpeno cíclico abietol 14.

Esquema 5

El siguiente esquema 6 muestra otras formas ejemplares de obtener derivados de 5-fluorouracilo lipofilizados.

Esquema 6

En una realización preferida adicional, el compuesto de la presente invención comprende un compuesto coloidal activo (CA) que está unido al resto 5-fluorouridina preferentemente a través de un resto de conexión funcional, tal como un éster. Los compuestos coloides activos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en citosano, hidroxietil almidón y carboxietil almidón.

En una realización ejemplar, el compuesto 28a se saponificó in situ para producir el ácido 37. El éster 28a fue, además, alquilado con bromuro de farnesilo para dar el éster lipofilizado 29a el cual también podría ser saponificado al ácido 38. Los compuestos mencionados se reflejan en el siguiente esquema 7.

(R) La notación se refiere al centro estereogénico en el átomo de carbono actal

Esquema 7

Ambos ácidos (37, 38) se pueden acoplar al quitosano, ya sea con un P^m , 12.000 Da (pH: 3,5 a 5,0) o con un P^m de 1.100 Da (pH: 5,0) -(grado de desacetilación, 97,5 % o 75 %, respectivamente) por acoplamiento EDC en solución acuosa (pH 4,0 - 5). Después de una diálisis intensiva contra agua (durante 2 días), los conjugados resultantes 39, 40 se secaron por liofilización, y su concentración de ligando se determinó por espectrofotometría UV después de la hidrólisis completa en HCl ac. 6 N durante 1 hora. El siguiente esquema 8 muestra los productos de acoplamiento ejemplares 39 y 40.

en donde n, x, y y z son números enteros los cuales varían independientemente de 1 a 10000, preferentemente de 2 a 1000, más preferentemente de 5 a 500, especialmente de 8 a 100.

En una realización preferida adicional, el compuesto de la presente invención está representado por la fórmula (IIIa)

en donde

R1 es H;

R2 es H;

R5 y R6 se seleccionan independientemente entre metilo y -Y-L-Y1-X, con la condición de que cuando R5 es metilo que R6 sea -Y-L-Y1-X;

Y cuando R5 es -Y-L-Y1-X que R6 sea metilo;

Y es un enlace sencillo;

L es una cadena de carbono que comprende 2 átomos de carbono, preferentemente etileno;

Y1 es un resto amida; y

X es citosano.

Un aspecto adicional de la invención es un quitosano al que se une la 5-fluorouridina y que está presente en forma de lámina. Preferentemente, la lámina de quitosano es una lámina dúctil y resistente a la rotura.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la lámina de quitosano puede prepararse disolviendo el derivado de quitosano que lleva el derivado de 5'-fluorouracilo en una mezcla de agua, un ácido débil y un alcohol. En una realización preferida, el disolvente puede ser una mezcla de, por ejemplo, agua, ácido fórmico y metanol. El quitosano usado puede tener un peso molecular promedio que varía de 10 kDa a 250 kDa, por ejemplo 14 kDa, 34 kDa, 82 kDa o 20 - 200 kDa. La solución que comprende el derivado de quitosano disuelto se puede verterse en una placa adecuada, secarse, neutralizarse con una solución acuosa diluida de NaOH y se lava con agua para obtener las láminas de quitosano dúctiles y resistentes a la rotura de acuerdo con la invención que llevan derivados de fluorouracilo 5' de acuerdo con la invención.

Además, se prefiere una realización de la presente invención en donde las láminas de quitosano de acuerdo con la invención se usan en el tratamiento tópico de enfermedades dermatológicas o como almohadillas para heridas. En una realización preferida adicional de la presente invención, el derivado de 5-fluoruridina se une a la lámina de quitosano de tal manera que puede liberarse en condiciones controladas. La degradación puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. Una enzima adecuada es, por ejemplo, quitosanasa de Streptomyces sp. 174. La estabilidad ácida de las láminas de acuerdo con la invención puede medirse a través de HPLC RP-18.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención es un apósito para heridas que comprende un compuesto de la invención que tiene un compuesto coloidal activo (resto), preferentemente un resto de quitosano o quitina.

Esquema 8

En un enfoque adicional los ácidos 37 y 38 se acoplaron secuencialmente con el colorante fluorescente Atto-488® (como butanoato) a quitosano (1,1 kDa) para dar los oligómeros 11 y 12 que resultaron ambos ser solubles en agua. El esquema 9 muestra los productos de acoplamiento ejemplares 11 y 12.

en donde n, x, y y z, así como w son números enteros que varían independientemente de 1 a 10000, preferentemente de 2 a 1000, más preferentemente de 5 a 500, especialmente 8 a 100.

Esquema 9

Síntesis de lipooligonudeótidos e incorporación a una bicapa

La fosforamidita 27 se usó para preparar los siguientes oligonucleótidos con un nucleolípido adjunto 19c de acuerdo con métodos conocidos por el experto en la materia:

5'-d(19c-Cy5-TAG GTC AAT ACT)-3' 33

5'-d(19c-TAG GTC AAT ACT)-3' 34

3'-d(ATC CAG TTA TGA)-5' 35

El oligómero marcado con cianina-5 33 se usó para estudiar la eficiencia de incorporación de la incorporación de la bicapa lipídica con respecto a la velocidad y la estabilidad. El oligómero 34 se usó para estudiar la formación dúplex entre este lipooligonucleótido y su cadena complementaria 35 en la bicapa lipídica - capa límite de la fase acuosa usando SYBR Green como tinte fluorescente intercalante.

Parte experimental

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Las siguientes realizaciones o revelaciones que quedan fuera del alcance de dichas reivindicaciones solo están destinadas a fines ilustrativos así como comparativos.

General. Todos los productos químicos se compraron de Sigma-Aldrich (D-Deisenhofen) o de TCI - Europe (B-Zwijndrecht). Los disolventes eran de calidad de laboratorio y se destilaron antes de su uso. TLC: láminas de aluminio, gel de sílice 60 F254Capa de 0,2 mm (Merck, Alemania). P.f. Büchi SMP-20, sin corregir. Espectros UV: Espectrofotómetro Cary 1E (Varian, D-Darmstadt). Espectros NMR: Espectrómetro AMX-500 (Bruker, D-Rheinstetten); 1H: 500,14 MHz, 13C: 125,76 MHz y 31P: 101,3 MHz. Los desplazamientos químicos se dan en ppm en relación con TMS como patrón interno para núcleos de 1H y 13C y 85 % H3PO4 externo; valores J en Hz. Los espectros de ESI EM se midieron en un instrumento Bruker Daltronics Esquire HCT (Bruker Daltronics, D-Leipzig); La ionización se realizó con una sol. de ácido fórmico ac. al 2 %. Los análisis elementales (C, H, N) de compuestos cristalizados se realizaron en un instrumento VarioMICRO (Fa. Elementar, D-Hanau). Los valores de logP se calcularon usando el conjunto de programas ChemSketch (versión 12.0, proporcionada por Advanced Chemistry Developments Inc.; Toronto, Canadá; http://www.acdlabs.com. Los oligonucleótidos se sintetizaron, se purificaron y se caracterizaron (MALDI-TOF EM) por Eurogentec (Eurogentec SA, Liege Science Park, B-Seraing).

RP-18 HPLC. La RP-18 HPLC se llevó a cabo en una columna RP-18 de 250 x 4 mm (Merck, Alemania) en un aparato de HPLC Merck-Hitachi con una bomba (Modelo 655A-12) conectada con una válvula de proporción, un monitor de longitud de onda variable (Modelo 655 A), un controlador (Modelo L-5000) y un integrador (Modelo D-2000). Disolvente: MeCN/0,1 M EtsNH+OAc-(35:65, v/v, pH 7,0).

Incorporación de oligonucleótidos en bicapas artificiales. La incorporación de los oligonucleótidos en bicapas artificiales se realizó en una mezcla de lípidos de 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y 1 -palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) (8:2, p/p, 100 mg/ml de n-decano). Para la preparación de las bicapas horizontales, se usaron portaobjetos planos (lonovation GmbH, D-Osnabrück). Estos portaobjetos contienen cámaras para los compartimentos cis y trans, así como el acceso a los electrodos (véase la Figura 1). El cuerpo principal de los portaobjetos contiene una lámina de PTFE (espesor, 25 pm) con una abertura de ~100 pm de diámetro. Esta lámina separa la cámara en los compartimientos cis y trans que solo están conectados por la abertura. Después de cargar la cámara con tampón (KCI 250 mM, MOPS/TRIS 10 mM, pH 7), los compartimientos cis y trans se unieron con electrodos de Ag/AgCl - embebidos en agarosa/KCl 3 M). Después, una sol. de la mezcla de lípidos POPC/POPE (0,2 pl) se aplica sobre la abertura de la lámina de PTFE usando una jeringa Hamilton (Hamilton, CH-Bonaduz). Una pequeña jaula de Faraday protege la bicapa y los electrodos del ruido eléctrico de HF. A continuación, una bicapa se crea automáticamente usando un sistema de perfusión (Bilayer Explorer V01, Ionovation GmbH, D-Osnabrück). La formación de una bicapa estable se controló tanto usando ópticamente un microscopio de barrido láser (Insight Cell 3D, Evotec Technologies GmbH, D-Hamburg) así como eléctricamente por mediciones de capacidad. Cuando se obtuvo una bicapa estable (capacidad, 50 - 75 pF), la correspondiente sol. oligonucleotídica (50 nM, 4 pl) se inyectó en el compartimento cis del chip. Durante un tiempo de incubación de 25 min la integridad de la bicapa se controló electrofisiológicamente usando un USB EPC 10 en la gradilla con un amplificador de pinzamiento zonal (software: Patchmaster, HEKA Elektronik Dr. Schulze GmbH, D-Lambrecht). Las imágenes ópticas de las fluctuaciones de fluorescencia se obtuvieron con un microscopio de escaneo láser confocal (Insight Cell 3D, Evotec Technologies GmbH, D-Hamburg), equipado con un láser He-Ne (543 nm), un objetivo de inmersión en agua 40x (UApo 340, 40x, NA = 1,15, Olympus, J-Tokio) y un detector de fotodiodos Avalanche (SPCM-AQR-13-f C, Perkin-Elmer Optoelectronics, Fremont, EE.UU.). La irradiación de fluorescencia se obtuvo con una potencia láser de 200 ± 5 pW. Los escaneos 2D y 3D se realizaron escaneando el punto confocal en la dirección XY con un escáner de haz giratorio y el movimiento del objetivo en la dirección Z. El movimiento en ambas direcciones se piezo controló, lo que permite un posicionamiento preciso de nanómetros. Para las imágenes 2D (escaneos Z, Figuras 2 y 3) el plano confocal se movió en etapas de 100 nm.

A partir de las señales de fluorescencia de moléculas individuales que pasan el volumen de excitación, pueden calcularse las constantes de difusión. Para determinar los tiempos de difusión de los oligonucleótidos fluorescentes dentro y cerca de la bicapa, se midieron en cinco posiciones diferentes por encima, por debajo y dentro de la capa. En cada punto, se tomaron cinco mediciones durante 30 s, cada una. En resumen, cada protocolo de medición fue como sigue: (i) una exploración de referencia de la bicapa estable (vacía); (ii) adición de la muestra con 25 min de incubación, seguido de una serie de escaneos; (iii) series de escaneo adicionales, cada uno después de una perfusión 1., 2. y 3. (60 s, cada uno).

Preparación de compuestos

i)

La 5-Fluorouridina (1a) está disponible comercialmente en (TCI-Europe, B-Zwijndrecht).

ii) 5-Fluoro-1-((3aR4R6R6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dimetiltetrahidro-furo[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (19a).

Se suspendió 5-fluorouridina anhidra (1a, 1,0 g, 3,82 mmol, se secó durante 48 h a 75 °C sobre CaCh a alto vacío) en acetona seca (200 ml). A esta suspensión se le añadió ácido p-toluenosulfónico unido a polímero (15,24 g, 38,1 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Después, el ácido unido al polímero se filtró y el filtrado se evaporó a un pequeño volumen, con lo que cristalizó el producto bruto. Este se filtró y se volvió a cristalizar a partir de CHCl3/MeOH, 97:3, v/v) para dar 1,12 g (97 %) de 19a puro en forma de agujas incoloras. TLC (gel de sílice, CHC^b ): F^r 0,77. P.f. 196-197 °C. RMN 1H ((D6)DMSO): 11,866 (d, 4J(NH, F) = 5,0, NH); 8,182 (d, 3J(F, H-C(6)) = 7,0, H-C(6)); 5,840 (d, 3J(H-C(1', H-C(2')) = 1,5, H-C(1')); 4,887 (dd, 3J(H-C(2'), H-C(1')) = 2,5, 3J(H-C(2'), H-C(3')) = 6,5, H-C(2')); 4,767 (dd, 3J(H-C(3'), H-C(4')) = 3,5, 3J(H-C(3'), H-C(2')) = 6,5, H-C(3')); 4,114 (Vq, 3J(H-C(4'), H-C(3')) = 3,5, 3J(HC(4'); H²C(5')) = 4,0, H-C(4')); 3,642 (dd, ³J(H^a-C(5'), H-C(4')) = 4,0, ²J(H^a-C(5'), H^b-C(5')) = -12, H^a-C(5')); 3,588 (dd, ²J(H^b-C(5'), H-C(4')) = 4,5, ³J(H^b-C(5'), H^a-C(5') = -12, H^b-C(5')), 1,493 (s, 3 H^endo-C(a')), 1,296 (s, 3H^exo-C(a)). RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 157,02 (d, ²J(C(4), F) = 26,2, C(4)); 148,947 (C(2)); 139,898 (d, ¹J(C(5), F) = 230,14, C(5)); 125,782 (d, ²J(C(6), F) = 34,6, C(6)); 112,91 (C(acetal)); 90,948 (C(1')); 86,502 (C(4')); 83,740 (C(2')); 80,215 (C(3')); 61,127 (C(5')); 26,982 (C^endo(a')); 25,147 (C^exo(a)). HR IEN EM: m/z calculado para C¹²H¹⁶FN²O⁶ (MH⁺), 303,914; encontrado m/z 305,10.

iii) 1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((Bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-2,2-dimetiltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)-5-fluoropirimidin-2,4(1H, 3H)-diona (20).

(MeO)²Tr: Dimetoxitrifenilmetilo

El compuesto 19a (317,3 mg, 1,05 mmol) se secó por evaporación repetida con piridina anhidra y después se disolvió en piridina seca (6 ml). Después, se añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo (397,5 mg, 1,15 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h en atmósfera de N² a temperatura ambiente. Posteriormente, la reacción se interrumpió mediante la adición de 30 ml de una solución ac. al 5 % de NaHCO³. La mezcla se lavó tres veces con CHCb (50 ml, cada vez), las capas orgánicas combinadas se secaron (Na²SO⁴), se filtraron y se evaporaron a sequedad. El residuo oleoso se sometió a cromatografía (gel de sílice, columna: 6,5 x 13 cm, CHCb/MeOH, 98:2, v/v) para dar 207 mg (32 %) de 20 incoloro. TLC (gel de sílice, CHCb/MeOH, 98:2, v/v): F^r 0,37. RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 11,891 (d, ⁴J(NH, F) = 4,0, NH); 8,02 (d, ³J(F, H-C(6)) = 7,0, H-C(6)); 7,394-7,367, 7,305-7,205, 6,883-6,854 (3 m, 13 H, H-C(tritilo)); 5,840 (d, ³J(H-C(1', H-C(2')) = 1,5, H-C(1')); 4,969 (dd, ³J(H-C(2'), H-C(1')) = 2,0, ³J(H-C(2'), H-C(3')) = 6,5, H-C(2')); 4,685 (dd, ³J(H-C(3'), H-C(4')) = 4,5, ³J(H-C(3'), H-C(2')) = 6,0, H-C(3')); 4,143 (Vq, ³J(H-C(4'), H-C(3')) = 3,0, ³J(H-C(4'); H²C(5')) = 4,0, H-C(4')); 3,736, 3,732 (2 s, 2 OCH³); 3,310 (dd, ³J(H^a-C(5'), H-C(4')) = 6,9, ²J(H^a-C(5'), H^b-C(5')) = -10,5, H^a-C(5')); 3,120 (dd, ²J(H^b-C(5'), H-C(4')) = 3,3, ³J(H^b-C(5'), H^a-C(5') = -10,5, H^b-C(5')); 1,470 (s, 3 H^endo-C(a')), 1,268 (s, 3H^exo-C(a)). RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 158,054, 158,026 (2 x C(5")); 156,90 (d, ²J(C(4), F) = 26,2, C(4)); 148,775 (C(2)); 144,607 (C(7")); 139,849 (d, ¹J(C(5), F) = 231,4, C(5)); 135,99 (C(2"); 135,284, 135,225 (2 x C(9")); 129,591, 129,533 (2 x C(8")); 127,704, 127,540 (2 x C(3")); 126,616 C(10")); 126,368 (d, ²J(C(6), F) = 34,5, C(6)); 113,218 (C(acetal)); 113,102 (C(4")); 91,511 (C(1')); 85,690 (C(4')); 85,396 (C(1")); 83,483 (C(2')); 80,223 (C(3')); 63,737 (C(5')); 54,926, 54,905 (2 x OCH³); 26,898 (C^endo(a')); 25,152 (C^exo(a)). HR IEN EM: m/z calculado para C³³H³³FN²O⁸ (MH⁺ ), 604,622; encontrado m/z 604,481.

iv) 1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (23).

Se disolvió 5-fluorouridina anhidra (1a, 1,048 g, 4 mmol) en DMF anhidra (24 ml) y se añadió carbonato potásico seco (1,44 g, 10,64 mmol). Después de agitarse durante 10 min a temperatura ambiente, se añadió gota a gota bromuro de farnesilo (1,4 ml, 4,4 mmol) en atmósfera de N². La mezcla de reacción se agitó durante un adicional de 24 h a temperatura ambiente. Después, el carbonato potásico se retiró por filtración y se lavó con diclorometano. El filtrado se evaporó y se secó durante una noche a alto vacío. El residuo se sometió a cromatografía (gel de sílice, 6,5 x 15 cm, CH²Cl²/MeOH, 9:1, v/v) para dar el compuesto 23 (0,78 g, 43 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (gel de sílice, columna: 6,5 x 15 cm, CH²Ch/MeOH, 9:1, v/v): F^r 0,57. UV (MeOH): A^max, 267 nm (£, 8,800 M^-1 cm^-1). RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 8,381 (d, ³J(F, H-C(6)) = 7,0, H-C(6)); 5,787 (dd, ³J(H-C(1', H-C(2')) = 1,5, ⁵J(H-C(1'), F) = 4,5, H-C(1')); 5,388 (d, ³J(HO-C(2'), H-C(2')) = 5,0, HO-C(2')); 5,249 (t, ³J(HO-C(5'), H²-C(5')) = 4,5, HO-C(5')); 5,130 (t, ³J(H-C(2"), H-C(1") = 6,5, H-C(2")); 5,082 (m, 3H, ³J(HO-C(3'), H-C(3') = 5,5, HO-C(3'), H²-C(1 ")); 4,407 (m, 2H, 3J = 5,5, H-C(6"), H-C(10")); 4,043-3,977 (m, 2H, H-C(2'), H-C(3')); 3,871 (Vquint, ³J(H-C(4'), H-C(3') = 5,0, ³J(H-C(4'), H²C(5 ') = 2,5, H-C(4')); 3,704 (ddd, ³J(H^a-C(5'), H-C(4')) = 4,5, ²J(H^a-C(5'), H^b-C(5')) = -12,0, ³ J (H^a-C(5'), HO-C(5')) = 2,5, H^a-C(5')); 3,592 (ddd, ³J(H^b-C(5'), H-C(4')) = 5,0, ²J(H^b-C(5'), H^a-C(5')) = -12,0, ³ J (H^b-C(5'), HO-C(5')) = 3,0, H^b-C(5')); 2,057­ 1,888 (m, 8H, H²-C(8"), H²-C(9"), H²-C(5"), H²-C(4")); 1,741 (s, 3H, H-C(13")); 1,629 (s, 3H, H-C(14")); 1,548 (s, 3H, H-C(15")); 1,535 (s, 3H, H-C(12")). RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 156,073 (d, ²J(C(4), F) = 26,2, C(4)); 148,931 (C(2)); 139,364 (d, ¹ J(C(5), F) = 231,4, C(5)); 139,344 C(3")); 134,534 (C(7")); 130,537 (C(11")); 124,004 (C(6")); 123,432 (d, ²J(C(6), F) = 35,0, C(6)); 118,170 (C(2")); 89,250 (C(4')); 84,550 (C(1')); 73,845 (C(3')); 69,028 (C(2')); 60,046 (C(5')); 39,108, 38,999, 38,838 (C(1"), C(4"), C(8")); 26,099 (C(5"), 25,645 (C(9")); 25,369 (C(12")); 17,426 (C(15")); 16,076 (C(13")); 15,706 (C(14")). HR IEN EM: m/z calculado para C²⁴H³⁶FN²O⁶ (MH⁺), 466,543; encontrado, 467,10; 335,2 (N(3)-farnesil-5-fluorouracilo). Anal. calc. para C²⁴H³⁵FN²O⁶ (466,543): C, 61,79; H, 7,56; N, 6,00. Encontrado: C, 61,53; H, 7,38; N, 5,86.

v) 5-Fluoro-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dimetiltetrahidrofuro-[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (24).

El compuesto 23 (0,25 g, 0,5 mmol) se suspendió en acetona anhidra y se añadió el ácido p-tolueno sulfónico (1,0 g, 2,5 mmol) unido a polímero. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El ácido unido al polímero se retiró por filtración y el filtrado se evaporó y se secó durante la noche a alto vacío. La cromatografía (gel de sílice, columna: 6,5 x 15 cm, CH2Ch/MeOH, 95:5, v/v) dio, después de la evaporación de la zona principal, el compuesto 24 (780 mg, 43 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (gel de sílice, CH2Ch/MeOH, 95:5, v/v): Fr 0,57. UV (MeOH): Amax, 267 nm (^e, 8,900 M-1 cm-1). HR IEN EM: m/z calculado para C27H40FN2O6 (MH+), 507,61; encontrado, 507,60; 335,2 (N(1)-famesil-5-fluorouracilo).

vi) 5-Fluoro-2',3'-O-(1-propilbutilidena)uridina (19b)

Para la preparación y análisis del compuesto 19b véase: E. Malecki, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2010, 93, 1500.

vii) 5-Fluoro-1-((3aR, 4R, 6R, 6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dipropiltetrahidrofuro-[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (25).

Se disolvió 5-fluoro-2',3'-O-(1-propilbutilideno)uridina (19b) (358,3 mg, 1 mmol) en DMF anhidra (6 ml) y se añadió carbonato potásico seco (360 mg, 2,6 mmol). Después de agitarse durante 10 min, se añadió gota a gota bromuro de farnesilo (0,35 mmol, 1,1 mmol) en atmósfera de N². Se continuó agitando a temperatura ambiente durante 24 h adicionales. Posteriormente, el carbonato potásico se retiró por filtración y se lavó con CH²Ch. El filtrado se evaporó y el residuo se secó durante una noche a alto vacío. La cromatografía (gel de sílice, columna: 6,5 x 15 cm, CH²Ch, 95:5, v/v) dio el compuesto 25 (285 mg, 51 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (gel de sílice, CH²Ch/MeOH, 95:5, v/v): F^r 0,71. UV (MeOH): A^max, 267 nm (e, 11,340 M^-1 cm^-1).

Anal. calc. para C³¹H⁴⁷FN²O⁶ (562,713): C, 66,17; H, 8,82, N, 4,98. Encontrado: C, 66,12; H, 8,39; N, 4,82.

viii) 5-Fluoro-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dinoniltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (19c).

Se disolvió 5-fluorouridina (1a, 1,0 g, 3,82 mmol) en DMF anhidra (15 ml) y se añadió nonadecan-10-ona (2,16 g, 7,64 mmol). Después de la adición de HC(OEt)³ (1,0 g, 5,73 mmol) y HCl 4 M en 1,4-dioxano (3,4 ml), la mezcla de reacción se agitó durante 48 h a temperatura ambiente. Después, la mezcla se repartió entre CHCb (350 ml) y una sol ac. sat. de NaHCO³ (50 ml). La capa orgánica se lavó tres veces con agua (100 ml, cada vez) y las capas ac. se volvieron a extraer con CH²C^h (25 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na²SO⁴), se filtraron y se evaporaron. El residuo se secó durante una noche a alto vacío y después se sometió a cromatografía (gel de sílice, columna: 6 x 12 cm, CH²C^h /MeOH, 95:5, v/v) para dar el compuesto 19c (1,38 g, 68 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (gel de sílice, CH²C^b /MeOH, 95:5, v/v): F^r 0,56. UV (MeOH): A^max, 265 nm (£, 9,860 M^-1 cm^-1). Anal. calc. para C²⁸H⁴⁷FN²O⁶ (526,681): C, 63,85; H, 8,99; N, 5,32. Encontrado: C, 63,78; H, 8,80; N, 5,15.

ix) 2-Cianoetil-(((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-2,2-dinoniltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)metil)diisopropil-fosforamidita (27).

Se disolvió el 19c anhidro (205,4 mg, 0,39 mmol) en CH²Cb seco (15 ml). Después, se añadieron etildiisopropilamina (base de Hünig, 125 pl, 0,72 mmol) y (cloro)(2-cianoetoxi)(diisopropilamino)fosfina (156 pl, 0,69 mmol) en atmósfera de N². La mezcla de reacción se agitó durante 15 min a temperatura ambiente y después, se añadió una solución ac. al 5 % enfriada en hielo de NaHCO³ (12 ml). La mezcla se extrajo tres veces con CH²Cl² frío, las capas orgánicas combinadas se secaron (Na²SO⁴), se filtraron y se evaporaron en un evaporador rotatorio (temperatura del baño, 25 °C). La cromatografía (gel de sílice, columna: 2 x 8 cm, CH²Ch/acetona, 8:2, v/v) dio una zona principal a partir de la cual se obtuvo el compuesto 27 (210 mg, 74 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (MeOH/acetona, 8:2, v/v): F^r, 0,96. HR IEN EM: m/z calculado para C³⁷H⁶⁴FN²O⁷P (MH⁺), 727,899; encontrado, 727,658. RMN ³¹P (CDCl^a): 150,73, 149,75.

x) (((3aR,4R, 6R, 6aR)-6-(5-Fluoro-2,4-dioxo-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il)-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-2,2-dipropil-tetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)metil)diisopropilfosforamidita de 2-cianoetilo (26).

El compuesto 25 anhidro (256 mg, 0,45 mmol) se fosforiló en 5' usando etildiisopropilamina (base de Hünig, 147 pl, 0,85 mmol) y (doro)(2-cianoetoxi)(diisopropilamino)fosfina (181 pl, 0,80 mmol) y se trató como se describe para el compuesto 7. La cromatografía (gel de sílice, columna: 2 x 8 cm, CH2Cl2/MeOH, 8:2, v/v) dio una zona principal a partir de la cual se obtuvo el compuesto 26 (208 mg, 60 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (CH2Ch/MeOH, 8:2, v/v): F^r, 0,95. HR IEN EM: m/z calculado para C40H64FN4O7P (MH+), 763,931; encontrado, 763,65. RMN 31P (CDCla): 149,86, 149,71.

xi)

El compuesto 21 se preparó de acuerdo con E. Malecki, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2010, 93, 1500.

xii) 2-Cianoetildiisopropilfosforamidita de 5-fluoro-1-[(4’R,6’R)-2’,3 ’,4 ’,5 ’-tetrahidro-6’-(hidroximetil)espiro[ciclopentadecano-1,2’-furo[3,4-d][1,3]dioxol]-4’-il]pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (22).

El compuesto 21 anhidro (256 mg, 0,45 mmol) se fosforiló en 5' usando etildiisopropilamina (base de Hünig, 147 pl, 0,85 mmol) y (doro)(2-cianoetoxi)(diisopropilamino)fosfina (181 pl, 0,80 mmol) y se trató como se describe para el compuesto 27. La cromatografía (gel de sílice, columna: 2 x 8 cm, CH2Ch/MeOH, 8:2, v/v) dio una zona principal a partir de la cual se obtuvo el compuesto 22 (208 mg, 60 %) en forma de un aceite incoloro. TLC (CH2Ch/MeOH, 8:2, v/v): Fr, 0,95. RMN 31P (CDCla): 149,56, 149,41.

xiii) El compuesto 28a se preparó de acuerdo con E. Malecki, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2010, 93, 1500.

xiv) 2', 3'-O-[( 1R)-4-etoxi-1-metil-4-oxobutilideno]-5-fluoro-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il]uridina (29a).

El éster 28a (500 mg, 1,29 mmol) se disolvió en DMF anhidra (11,5 ml). En atmósfera de N² se añadió K²CO³ (0,685 g, 4,97 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 min a temp. ambiente. Después, se añadió gota a gota bromuro de farnesilo (0,39 ml,1,42 mmol) durante 2 h. Después de agitarse durante una noche, la mezcla de reacción se filtró y el residuo se lavó con una pequeña cantidad de CH²Cl². Los filtrados combinados se evaporaron a sequedad en alto vacío durante una noche. El residuo oleoso se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (columna: 5 x 7,5 cm). La elución con CH²Cl² (125 ml) seguido por CH²Ch/MeOH (95:5, v/v, 500 ml) proporcionó una zona principal la cual se evaporó para dar el compd. 29a en forma de un aceite incoloro. TLC (gel de sílice, CH²Ch/MeOH 95:5, v/v): F^r 0,73. Rm N ¹H (D⁶-DMSO): 8,204 (d, ³J(H-C(6),F) = 7,0, H-C(6)); 5,881 (d, ³J(1',2') = 2,0, H-C(1’)); 5,197 (t, ³J(HO-C(5'), H-C(5') = 5,0, HO-C(5')); 5,126 (t, ³J(2",1") = 7,5, H-C(2")); 5,043 (m, H²-C(1")); 4,911 (dd, ³ J(2',1') = 3,5, ³J(2',3') = 6,5, H-C(2')); 4,797 (dd, ³J(3',2') = 6,5, ³J(3',4') = 3,0, H-C(3')); 4,404-4,391 (m, 2H, H-C(6"), H-C(10")); 4,149 (m, H-C(4')); 4,057 (q, 3J = 7,0, CH²(éster)); 3,650-3,583 (m, CH²(5')); 2,416 (t, 3J = 7,0, CH²-C=O); 2,051-1,887 (5 m, 10H, H²-C(4"), H²-C(5"), H²-C(8"), H²-C(9"), CH²(éster)); 1,738 (s, H^a-C(13")); 1,629 (s, H^a-C(14")); 1,548 (s, H^a-C(15")); 1,533 (s, H³-C(12")); 1,269 (s, CH³(acetal)); 1,190 (t, ³ J = 7,0, CH³(éster). RMN ¹³C (D⁶DMSO): 172,432 (C=O); 156,102 (d, ²J(C(4),F) = 26,2, C(4)); 148,710 (C(2)); 139,354 (d, ¹ J(C(5),F) = 228,9, C(5)); 139,382 (C(3")); 134,536 (C(7")); 130,550 (C(11")); 124,373 (d, ²J(C(6),F) = 34,7, C(6)); 124,006 (C(6")); 123,486 (C(10")); 118,122 (C(2")); 113,623 (C(acetal)); 91,785 (C(1 '); 86,564 (C(4')); 83,988 (C(2')); 80,224 (C(4')); 61,073 (C(5')); 59,823 (CH²(éster)); ~ 38,0 (3 señales, superpuesta por señales de disolvente, C(1"), C(4"), C(8")); 33,342 (CH²-C=O); 28,103 (CH²(acetal)); 26,108 (C(5")); 25,617 (C(9"); 25,369 (C(12")); 23,479 (CH³(acetal)); 17,420 (C(15")); 16,089 (C(14")); 15,700 (C(13"); 13,968 (CH³(éster)). HR IEN EM: m/z calculado para C³¹H⁴⁶FN²O^a (MH⁺), 593,696; encontrado, 593,40; 335,2 [N(3)-farnesil-5-fluorouracilo].

xv)

El compuesto 30a se preparó de acuerdo con E. Malecki, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2010, 93, 1500.

xvi) 2',3'-O-Ciclododecano-1,1-diil-5-fluoro-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il]uridina (31a).

El cetal 30a (563,5 mg, 1,086 mmol) se disolvió en DMF anhidra. En atmósfera de N² se añadió K²CO³ (390 mg, 2,82 mmol) y la suspensión se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. Después, se añadió gota a gota bromuro de farnesilo (0,33 ml, 1,19 mmol) dentro de 2 h. Después de agitarse durante la noche la mezcla de reacción se filtró y los residuos sólidos se lavaron con una pequeña cantidad de CH²C^h . Los filtrados combinados se evaporaron a sequedad en alto vacío durante una noche. El residuo oleoso se sometió a cromatografía (gel de sílice, columna: 6 x 10 cm). La elución con CH²C^h /MeOH (97:3, v/v) dio una zona principal a partir de la cual el compuesto 31a se aisló en forma de un aceite incoloro (85 %). TLC (gel de sílice, CH²C^h /MeOH (97:3, v/v): F^r = 0,57. RMN ¹H (D⁶-DMSO): 8,240 (d, ³J(H-C(6),F) = 7,0, H-C(6)); 5,901 (d, ³J(1',2') = 2,4, H-C(1')); 5,20 (s a, HO-C(5')); 5,126 (t, ³J(2",1") = 6,6, H-C(2")); 5,041 (d, ³J(1",2") = 6,0, H²-C(1")); 4,848 (dd, ³J(2',1') = 3,5, ³J(2',3') = 6,5, H-C(2')); 4,754 (dd, ³J(3',2') = 6,5, ³J(3',4') = 3,0, H-C(3')); 4,405-4,392 (m, 2H, H-C(6"), H-C(10")); 4,137 (Vq, ³J(4',3') = 3,5, ³J(4',5' y 5") = 3,5, H-C(4')); 3,652-3,563 (V octett, ²J(5',5") = - 15, H²-C(5 ')); 2,044-1,886 (4 m, H²-C(8"), H²-C(9"), H²-C(5"), H²-C(4")); 1,738 (m, 5 H, H^a-C(13"), 2 H^endo -C(a')); 1,629 (s, H³-C(14")); 1,562-1,533 (3 m, 8 H, H³C(15"), H³-C(12"), 2 H^exo - C(a)); 1,448 (m, 2 H^endo-C(P')); 1,326-1,307 (m, 16 H, 8 x H²-C(cetal)). RMN ¹³C (D⁶DMSO): 156,056 (d, ²J(C(4),F) = 26,0, C(4)); 148,720 (C(2)); 139,367 (d, ¹J(C(5),F) = 228,9, C(5)); 139,321 (C(3")); 134,493 (C(7")); 130,492 (C(11")); 124,346 (d, ²J(C(6),F) = 34,7, C(6)); 123,984 (C(6")); 123,586 (C(10")); 118,112 (C(2")); 117,025 (C(acetal)); 91,815 (C(1')); 86,656 (C(4')); 83,602 (C(2')); 80,076 (C(3')); 61,107 (C(5')); 38,953, 38,927, 38,271 (C(1"), C(4"), C(8")); 33,300 (C(a')); 30,301 (C(a)); 25,923 (C(5")); 25,430 (C(9")); 25,195 (C(12")); 17,218 (C(15")); 15,904 (C(14")); 15,500 (C(13")); 25,487, 25,372, 25,170, 24,972, 21,759, 21,522, 21,393, 19,623, 19,510 (9 CH²). HR IEN EM: m/z calculado para C³⁶H⁵⁶FN²O⁶ (MH⁺ ), 631,830; encontrado, 631,50; 335,2 [N(3)-farnesil-5-fluorouracilo].

xvii) Acoplamiento de nucleolípidos seleccionados de 5-Fluorouridina con 6,8,8-trimetil-2-oxo-6,7,8,9-tetrahidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-3-carboxilato-[9(6H)-il]butanoato de etilo [= Atto-425 N(9)-butanoato]( 32 ).

Cinco derivados de nucleolípidos seleccionados de 5-fluorouridina, que transportan restos lipofílicos en la posición N(3) y/o en la 0-2',3' (19c, 28a - 31a, esquema de fórmula 10) se han marcado con el fluoruro de cumarina Atto-425 ® el cual se acopló como butanoato N(9) al 5'-hidroxilo del nucleolípido correspondiente. Estos compuestos se prepararon para la determinación posterior de la actividad cancerostática de los nucleolípidos correspondientes. En este contexto, se prepararon otros dos nucleolípidos (29a y 31a) a partir de precursores descritos en un manuscrito anterior [E. Malecki, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta 2010, 93, 1500]. Su farnesilación siguió el protocolo descrito para el compuesto 25 (esquema 6).

El acoplamiento de 19c, 28a - 31a con el derivado de fluoroforo se realizó aplicando la reacción Steglich (DCC, dimetilaminopiridina). Los productos se purificaron por cromatografía en columna de gel de sílice y se caracterizaron por espectroscopía de fluorescencia, así como por espectrometría de masas HR IEN.

El siguiente esquema 10 muestra los derivados resultantes que están conectados a un fluoróforo.

Esquema 10

Las esterificaciones de Steglich se realizaron todas de forma análoga pero con ligeras modificaciones entre cada compuesto. Los productos apropiados se aislaron como mezclas diastereoisoméricas debido al centro estereogénico en C(6) del fluoróforo.

xviii) 5’-O-{4-[3-Etoxicarbonil)-6,8,8-trímetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-9(6H)-il]butanoil}-5-fluoro-2',3'-O-(1-nonildecilideno)uridina (19e).

Se disolvió Atto-425 N(9)-butanoato (5 mg, 12,244 ^mol) en CH²CI² anhidro (1,5 ml), y se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,6 mg, 0,01244 mmol), disuelta en CH²O ² (0,5 ml) y el compd. 19c (6,55 mg, 12,44 ^mol), disuelto en CH²O ² (1,3 ml) en atmósfera de N² y se enfriaron en un baño de hielo. A continuación, se añadió gota a gota diciclohexil-carbodiimida (DCC, 2,57 mg, 12,44 mmol), disuelta en CH²O ² (0,11 ml) durante 45 min. Después de 5 min, la sol. se dejó calentar hasta temp. ambiente y se continuó agitando durante una noche con exclusión de luz. La reacción se controló por TLC (CH²C^h -MeOH, 93:7, v/v). Después de la adición de 30 % en moles adicionales de DMAP, DCC, así como del compd. 2c se continuó agitando durante un 48 h totalmente. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía repetida sobre gel de sílice 60 (columna, 2 x 21,5 cm, CH²Cl²-MeOH, 98:2, v/v) para obtener el compuesto 21b en un rendimiento cuantitativo en forma de un sólido de color verde fluorescente (~ 13,3 mg). TLC (gel de sílice, CH²C^h /MeOH, 93:7, v/v): F^r = 0,88. HR IEN EM: m/z calculado para C⁵⁰H⁷²FN³O¹¹, 910,119; encontrado: 911,1 (MH⁺), 932,9 (MNa⁺), 630,4 (MNa⁺ - nonildecilideno), 608,4 (MH⁺ - nonildecilideno). Espectroscopía de fluorescencia: A^max (irradiación), 426 nm; A^max (emisión), 465 nm.

xix) 5'-O-{4-[3-(etoxicarbonil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-9(6H)-il]butanoil}-2’,3 ’-O-[(1R)-4-etoxi- 1-metil-4-oxobutilideno]-5-fluorouridina (28b).

Se disolvió Atto-425 N(9)-butanoato (5 mg, 12,244 ^mol) en CH²CI² anhidro (1,5 ml), y se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,6 mg, 0,01244 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,5 ml) y el compd. 28a (4,83 mg, 12,44 ^mol) en atmósfera de N² y enfriándose en un baño de hielo. A continuación, se añadieron gota a gota diciclohexilcarbo-diimida (DCC, 2,57 mg, 12,44 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,11 ml) durante 45 min. Después de 5 min, la sol. se dejó calentar hasta temp. ambiente y se continuó agitando durante una noche en exclusión de luz. La reacción se controló por TLC (CH²Cl²-MeOH, 9:1, v/v). El producto apareció como dos puntos fluorescentes. Después de la adición de 30 % en moles adicionales de DMAP, DCC, así como del compd. 28a se continuó agitando durante 48 h totalmente. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice 60 (columna, 2 x 15 cm, CH²Cl²-MeOH, 93:7, v(v) para obtener el compuesto 28b en un rendimiento cuantitativo en forma de un sólido verde fluorescente (~ 9,6 mg). TLC (gel de sílice, CH²Ch/MeOH, 9:1, v/v): F^r = 0,85 y 0,75. HR IEN EM: m/z calculado para C³⁸H⁴⁶FN³O¹³ (MH⁺), 772,783; encontrado, 772,82; 794,4 (MNa⁺), 630,4 (MNa⁺ - levulinato de etilo), 449,4 (MH⁺ - Atto-425 N(9)-butanoato). Espectroscopia de fluorescencia: A^max (irradiación), 426 nm; A^max (emisión), 462 nm.

xx) 5’-O-{4-[3-(Etoxicarbonil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-9(6H)-il]butanoil}-2’,3 ’-O-[( 1R)-4-etoxi-1-metil-4-oxobutilideno]-5-fluoro-3-[(2E, 6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il]uridina (29b).

Se disolvió Atto-425 N(9)-butanoato (5 mg, 12,244 ^mol) en CH²Cl² anhidro (1,5 ml) y se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,6 mg, 0,01244 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,5 ml) y el compd. 29a (7,37 mg, 12,44 |jmol), disuelto en CH²CI² (1,3 ml) en atmósfera de N² y enfriándose en un baño de hielo. A continuación, se añadió gota a gota diciclohexil-carbodiimida (DCC, 2,57 mg, 12,44 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,11 ml) durante 45 min. Después de 5 min, la sol. se dejó calentar hasta temp. ambiente y se continuó agitando durante una noche con exclusión de luz. La reacción se controló por TLC (CH²Cl²-MeOH, 95:5, v/v). Después de la adición de 30 % en moles adicionales de DMAP, DCC, así como del compd. 29a se continuó agitando durante un 48 h totalmente. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía repetida sobre gel de sílice 60 (columna, 2 x 23 cm, CH²Cl²-MeOH, 96:4, v/v) para obtener el compuesto 29b (7,7 mg, 63,4 %) en forma de un sólido fluorescente. TLC (gel de sílice, CH²C^b /MeOH, 95:5, v/v): F^r = 0,83 y 0,64. HR IEN EM: m/z calculado para C⁵³H⁷⁰FN³O¹³, 976,134; encontrado: 976,6 (MH⁺), 999,1 (MNa⁺), 608,5 (MH⁺ - atto- 425 N(9)-butanoato). Espectroscopía de fluorescencia: A^max (irradiación), 426 nm; A^max (emisión), 460 nm.

xxi) 2’,3 ’-O-Ciclododecano-1, 1-diil-5’-O-{4-[3-(etoxicarbonil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-9(6H)-il]butanoil}-5-fluorouridina (30b).

Se disolvió Atto-425 N(9)-butanoato (5 mg, 12,244 jm ol) en CH²C^b anhidro (1,5 ml) y se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,72 mg, 0,01244 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,6 ml) y el compd. 30a (6,37 mg, 14,93 jmol), disuelto en CH2Cl2 (1,8 ml) en atmósfera de N² y enfriándose en un baño de hielo. Debido a la insuficiente solubilidad de los reactivos, se añadió MeCN (1 ml). A continuación, se añadió gota a gota diciclohexil-carbodiimida (DCC, 3,08 mg, 14,93 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,13 ml) durante 45 min. Después de agitarse durante 5 min, la sol. se dejó calentar hasta temp. ambiente y se continuó agitando durante una noche con exclusión de luz. La reacción se controló por TLC (CH²Cl²-MeOH, 93:7, v/v). Después de la adición de 10 % en moles adicionales de DMAP, DCC, así como del compd. 30a se continuó agitando durante un 48 h totalmente. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice 60 (columna, 2 x 15,5 cm, CH²Cl²-MeOH, 94:6, v/v) para obtener el compuesto 30b (9,5 mg, 94,6 %) en forma de un sólido fluorescente. TLC (gel de sílice, CH²C^b /MeOH, 93:7, v/v): F^r = 0,84 y 0,75. HR IEN EM: m/z calculado para C⁴³H⁵⁶FN³O¹¹, 809,917; encontrado: 810,5 (MH⁺), 832,5 (MNa⁺), 630,5 (MNa⁺ - ciclododecanilo), 608,5 (MH⁺ - ciclododecanilo). Espectroscopía de fluorescencia: A^max (irradiación), 426 nm; A^max (emisión), 460 nm.

xxii) 2,3’-O-Ciclododecano-1, 1-diil-5’-O-{4-[3-(etoxicarbonil)-6,8,8-trimetil-2-oxo-7,8-dihidro-2H-pirano[3,2-g]quinolin-9(6H)-il]butanoil}-5-fluoro-3-[(2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il]uridina (31b).

Se disolvió Atto-425 N(9)-butanoato (5 mg, 12,244 |jmol) en CH²CI² anhidro (1,5 ml) y se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,6 mg, 0,01244 mmol), disuelta en CH²C^h (0,5 ml) y el compd. 31a (7,85 mg, 12,44 jmol), disuelto en CH2Cl2 (1,3 ml) en atmósfera de N² y enfriándose en un baño de hielo. A continuación, se añadió gota a gota diciclohexil-carbodiimida (DCC, 2,57 mg, 12,44 mmol), disuelta en CH²Cl² (0,11 ml) durante 45 min. Después de 5 min, la sol. se dejó calentar hasta temp. ambiente y se continuó agitando durante una noche con exclusión de luz. La reacción se controló por TLC (CH²C^h -MeOH, 96:4, v/v). Después de la adición de 30 % en moles adicionales de DMAP, DCC, así como del compd. 31a se continuó agitando durante un 48 h totalmente. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice 60 (columna, 2 x 25,5 cm, CH²Cl²-MeOH, 98:2, v/v) para obtener el compuesto 31b (10,9 mg, 86,6 %) en forma de un sólido fluorescente. TLC (gel de sílice, CH²C^h /MeOH, 95:5, v/v): F^r = 0,88 y 0,68. HR IEN EM: m/z calculado para C⁵⁸H⁸⁰FN³O¹¹, 1014,268; encontrado: 1015,3 (MH⁺ ), 1036,7 (MNa⁺), 630,4 (MNa⁺ - ciclododecanilo), 608,4 (MH⁺ - ciclododecanilo). Espectroscopía de fluorescencia: A^max (irradiación), 426 nm; A^max (emisión), 460 nm.

xxiii) 5-Fluoro-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(((4-metoxifenil)difenilmetoxi)-metil)-2,2-dipropiltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)pirimidin-2,4(1H, 3H)-diona ( 3 )

El compuesto 19b (0,5 g; 1,4 mmol) se evaporó tres veces a partir de piridina anhidra y después se disolvió en piridina anhidra (4 ml). El cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo (0,53 g; 1,67 mmol) se añadió en atmósfera de N². La mezcla de reacción se agitó durante 18 h a temperatura ambiente y después, la reacción se interrumpió mediante la adición de MeOH (3,5 ml). Después de 10 min, se añadió una solución acuosa al 5 % de NaHCO³ enfriada con hielo y la mezcla se extrajo tres veces con CH²Cl² (80 ml, cada vez). Las capas orgánicas combinadas se secaron durante 30 min (Na²SO⁴), se filtraron y se evaporaron a alto vacío produciendo una espuma incolora. La cromatografía del residuo (gel de sílice 60H, columna: 1 x 14 cm, CH²Ch/MeOH, 97:3) proporcionó una zona principal a partir de la cual el compuesto 3 (0,8 g, 91 %) se aisló en forma de una espuma incolora. F^r (CH²Cl^2/MeoH, 97:3) 0,60. UV (MeOH): 270 (9,000). RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 11,86 (s, H-N(3)); 8,05 (d, ³J(H-C(6), F) = 4,0, H-C(6)); 7,39 - 7,19 (m, H-C(3"), H-C(8"), H-C(9"), H-C(10")); 6,87 (d, ³ J(H-C(4"), H-C(3") = 9,0, H-C(4")); 5,80 (s, H-C(1')); 4,99 - 4,97 (m, H-C(2')); 4,66 - 4,64 (m, H-C(3')); 4,17 - 4,14 (m, H-C(4')); 3,74 (s, OCH³(6")); 3,34 - 3,31 (m, ²J(H^a-C(5’), H^p-C(5’) = -10,25, H²-C(5')); 3,14 - 3,12 (m, ²J(H^p-C(5’), H^a-C(5’) = -5,25, H²-C(5')); 1,66 -1,63 (m, H²-C(a')); 1,50 - 1,47 (m, H²-C(a)); 1,43 - 1,36 (m, H²-C(P')); 1,28 - 1,21 (m, H²-C(P)); 0,91 (t, ²J(H^a-C(Y’), H^b-C(Y’)) = - 7,5, (H^a-C(Y’), Hc-C(y’)) = - 7,0, Hs-C(y’)); 0,85 (t, ²J(H^a-C(y), H^b-C(Y)) = - 7,0, (H^a-C(Y), Hc-C(y)) = - 7,5, Hs-C(y)). RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 158,17 (C(5")); 156,99 (d, ²J(C(4), F) = -26,28, C(4)); 148,83 (C(2)); 144,05 (C(7"); 139,87 (d, ¹J(C(5), F) = 231,50, C(5)); 134,68 (C(2")); 129,89 - 127,35 (m, C(3"), C(8"), C(9"), C(10")); 126,82 (d, ²J(C(6), F) = -5,40, C(6)); 116,79 (C(cetal)); 113,12 (C(4")); 91,85 (C(1")); 85,94 (C(4’)); 85,62 (C(1’)); 83,62 (C(2’)); 80,66 (C(3’)); 64,08 (C(5’)); 54,92 (C(6")); 38,67 (C(a’)); 38,55 (C(a)); 16,88 (C(p’)); 16,27 (C(p)); 14,05 (C(y’)); 14,02 (C(y)). Anal. calc. para C³⁶H²⁹FN²O⁷ (630,702): C, 68,56; H, 6,23; N, 4,44. Encontrado: C, 68,85; H, 6,03; N, 4,23.

xxiv) 5-Fluoro-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(((4-metoxifenil)difenilmetoxi)-2,2-dipropiltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)-3-((7R, 11R)-3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-1-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona ( 4a (E+Z))

El compuesto 3 (1 g; 1,59 mmol) se disolvió en THF anhidro (10,6 ml). Después de la adición de fitol (0,61 ml; 1,59 mmol) y Ph³P (0,62 g; 2,38 mmol), la mezcla de reacción se agitó durante 5 min a temp. ambiente en atmósfera de N² y con exclusión de luz. Después, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió gota a gota una sol. al 40 % de dietilazodicarboxilato (DEAD) en tolueno (0,69 ml; 2,38 mmol) dentro de 1 min. después de 5 min adicionales de agitación a 0 °C la mezcla se dejó calentar a temp. ambiente y se continuó agitando durante 2 h. Después de la evaporación del disolvente a alto vacío (45 °C) el residuo se purificó por cromatografía repetida sobre gel de sílice (1.

columna: 2 x 25 cm, EtOAc/éter de petróleo, 1:13; 2. columna: 2 x 18 cm, EtOAc/éter de petróleo, 15:75, cada disolvente con un 1 % de Et³N). Rendimiento 1,1 g (76 %) de espuma incolora. F^r (EtOAc/éter de petróleo, 1:7) 0,55/0,60 (isómeros E/Z). UV (MeOH): 270 (9,000). RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 8,16 (d, ³J(H-C(6)cis, F) = 6,5, H-C(6)cis));

8.25 (d, ³J(H-C(6)trans, F) = 6,5, H-C(6)trans)); 7,38 - 7,21 (m, 12H, 2 x H- C(3"), 4 x H-C(8"), 4 x H-C(9"), 2 x H-C(10")); 6,84 (d, 2H, ³J(H-C(4"), H-C(3")) = 9,0, 2 x H-C(4")); 5,84 (s, H-C(1')); 4,99 - 4,97 (m, 2H, H-C(2'), H-C(2"'));

4,67 - 4,63 (m, H-C(3'); 4,36 (d, ³J(H-C(1"')cis, H-C(2"')) = 5,0, H-C(1"')cis); 4,33 (d, ³J(H-C(1’” )trans, H-C(2''')) = 5,0,

H-C(1'")trans); 4,21 - 4,18 (m, H-C(4')); 3,72 (s, 3H, H^a-C(6")); 3,35 - 3,32 (m, H^a-C(5’)); 3,15 - 3,09 (m, H^p-C(5')); 2,07

(t, 2H, ³J(H-C(4"')cis, H-C(5''')) = 7,5, H-C(4'")cis); 1,87 (t, 2H, ³J(H-C(4"')trans, H-C(5''')) = 7,5, H-C(4''')trans); 1,67 (s,

3H, H^a-C(20"')); 1,66 - 1,63 (m, 2H, H²-C(a')); 1,51 - 1,43 (m, 3H, H²-C(a), H- C(15"')); 1,42 - 1,30 (m, 6H, H²-C(P’), H²-C(5'"), H-C(7'"), H-C(11'")); 1,28 - 0,98 (m, 16H, H²-C(P), H²-C(6'''), H²-C(8"'), H²-C(9'''), H²-C(10"'), H²-C(12'''), H²-C(13"'), H²-C(14"')); 0,91 (t, 3H, ²J((H^a-C(Y’), H^b-C(Y')), ((H^a-C(Y'), Hc-C(y'))) = -7,0, Hs-C(y')); 0,84 (t, 3H, ²J((H^a-C(Y),

H^b-C(Y)), ((H^a-C(Y), H^c-C(Y))) = -7,0, Hs-C(y)). 0,83 - 0,78 (m, 12H, H^a-C(16'^” ), H^a-C(17'” ), H^a-C(18"'), H^a-C(19"')). RMN

¹³C ((D⁶)DMSO): 158,15 (C(5")); 156,09 (d, ²J(C(4), F) = -25,78, C(4); 148,60 (d, ⁴J(C(2), F) = 6,28, C(2)); 144,03 (C(7")); 139,35 (d, J(C(5), F) = 229,76, C(5)); 139,84 (s, C(3"')cis; 139,56 (s, C(3"')trans); 134,67 (C(2")); 129,86 -126,74 (m, C(3"), C(8"), C(9"), C(10")); 125,55 (d, ²J(C(6), F) = -32,82, C(6)); 117,83 (C(2'")); 116,71 (C(cetal)); 113,05 (C(4")); 93,22 (C(4')); 86,33 (C(1")); 85,95 (C(1')); 83,74 (C(2')); 80,82 (C(3')); 64,13 (C(5')); 54,88 (C(6")); 39,00 (C(1"')); 38,66 (C(a')); 38,54 (C(a)); 36,65-36,51(m, C(6'''), C(8'''), C(10"'), C(12''')); 35,81, 35,70 (2s, C(7'''), C(11’” ));

27.25 (C(15''')); 24,27 (C(5''')); 24,01 (C(9"')); 23,62 (C(13''')); 22,41, 22,32 (2s, C(16"'), C(17"')); 19,48, 19,43 (2s, C(18"'), C(19"')); 16,88 (C(P')); 16,27 (C(P)); 15,85 (C(20"')); 14,05 (C(y')); 14,02 (C(y)). Anal. calc. para C⁵⁶H⁷⁷FN²O⁷ (909,218): C, 73,98; H, 8,54; N, 3,08. Observado: C, 73,75; H, 8,57; N, 2,73.

xxv) 3-((Z)-3,7-Dimetilocta-2,6-dien-1-il)-5-fluoro-1-((3aR,4R, 6R, 6aR)-6-(((4-metoxifenil)difenilmetoxi)metil)-2,2-dipropiltetrahidrofuro-[3,4d][1,3]dioxol-4-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (4b)

El compuesto 3 (1 g; 1,59 mmol) se disolvió en THF anhidro (11 ml) y se hizo reaccionar con nerol (0,28 ml;

1,59 mmol), Ph³P (0,62 g; 2,38 mmol) y dietilazodicarboxilato (40 % en tolueno, 0,69 ml; 2,38 mmol) como se describe para el compd. 4a. La purificación del producto en bruto se realizó mediante cromatografía (gel de sílice 60, columna:

2 x 30 cm, EtOAc/éter de petróleo 1:13, que contenía un 1 % de Et³N). A partir de la zona principal, el compd. 4b

(0,98 g, 79 %) se aisló en forma de un aceite incoloro tras la evaporación del disolvente. Fr (EtOAc/éter de petróleo,

1:7) 0,42. UV (MeOH): 270 (11,500).

RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 8,15 (d, ³J(H-C(6), F) = 6,0, H-C(6)); 7,38 - 7,20 (m, 12H, H-C(3"), H-C(8"), H-C(9"), H-C(10"));

6,85 (d, 2H, ³J(H-C(4"), H-C(3")) = 9,0, 2 x H-C(4")); 5,84 (s, H-C(1')); 5,12 (t, ^ (H -C p "’), H-C(1''')) = 6,0, H-C(2"'));

5,01 - 5,00 (2s, 2H, H-C(2’), H-C(6"’)); 4,66 (t, ³J(H-C(3’), H-C(4’)) = 4,5, H-C(3’)); 4,30 (yquint, 2H, J ^{^} -C^{^} ’^” ), H-C(2"’)) = 7,5, H²-C(1’’’)); 4,22 - 4,20 (m, H-C(4’)); 3,73 (s, 3H, H³-C(6")); 3,35 - 3,31 (m, H^a-C(5’)); 3,13 - 3,11 (m, H^p-C(5’)); 2,14 - 2,05 (m, 4H, H²-C(4’’’), H²-C(5"’)); 1,67 - 1,59 (m, 11H, H²-C(a’), H³-C(8"’), H³-C 1,46 (m, 2H, H²-C(a)); 1,43 - 1,41 (m, 2H, H²-C(P’)); 1,27 - 1,22 (m, 2H, (m, 2H, H²-C(P)); 0,92 C(y’)), ((H^a-C(Y’), H^c-C(Y’))) = -7,0, H3-C(y’)); 0,87 (t, 3H, ²J((H^a-C(Y), H^b-C(Y)), ((H^a-C(Y), Hc-C(y))) = -7,0, H3-C(y)).

RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 158,16 (C(3")); 156,13 (d, ² J (C(4), F) = -25,09, C(4)); 148,64 (C(7")); 144,05 (d, ⁴J(C(2), F) =

25,09, (C(2)); 148,64 (C(7")); 144,05 (d, ²J( C(5), F) = 229,6, C(5)); 139,37 (C(3")); 134,70 (C(2")); 131,06 (C(7’’’));

129,88 - 126,77 (C(3"), C(8"), C(9"), C(10")); 125,69 (d, ¹ J(C(6), F) = 32,57, C(6)); 123,84 (C(2’’’)); 118,78 (C(6’’’));

116,69 (C(cetal)); 113,07 (C(4")); 93,41 (C(4’)); 86,19 (C(1")); 85,95 (C(1’)); 83,76 (C(2’)); 80,86 (C(3’)); 64,22 (C(5’));

54,89 (C(6")); 38,93 (C(1’’’)); 38,69 (C(a’)); 38,54 (C(a)); 31,56 (C(4’’’)); 26,27 (C(5’’’)); 25,37 (C(9’’’ 22,85 (C(10’’’));

17,39 (C(8’’’); 16,90 (C(P’)); 16,24 (C(P)); 14,02 (C(y’), C(y)). Anal. calc. para C⁴⁶H⁵⁵FN²O⁷ * 0,5 C⁶H¹² (809,0164): C, 72,68; H, 7,54: N, 3,46. Encontrado: C, 72,48; H, 7,43; N, 3,28.

xxvi) 5-Fluoro-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dipropiltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)-3-((7R,11R)-3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-1-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-diona ( 5a (E+Z)).

El compuesto 4a (E+Z) (200 mg; 0,22 mmol) se aisló en CH²Cl² (4,5 ml). Después, se añadieron gota a gota 4,5 ml de una sol. al 4 % de un ácido dicloroacérico en CH²Cl². La mezcla de reacción se agitó durante 10 min a temp. ambiente y después se lavó con H²O hasta que el acuoso reacciona neutro. Las capas se separaron por centrifugación y la fase orgánica se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en un pequeño volumen de EtOAc, se adsorbió hasta una pequeña cantidad de gel de sílice y se aplicó en la parte superior de una columna cromatográfica (gel de sílice, columna: 2 x 15 cm, EtOAc/éter de petróleo, 1:4). A partir de la zona principal, el compd. 5a (87 mg, 62 %). F^r (EtOAc/éter de petróleo, 1:4) 0,41. UV (MeOH): 270 (10,600). RMN ¹H ((D⁶) DMSO): 8,23 (d, ³J(H-C(6), F) = 6,5, H-C(6)); 5,89 (s, H-C(1’)); 5,18 - 5,11 (m, 2H, H-C(5’), H-C(2")); 4,90 - 4,88 (m, 2H, H-C(2’), H-C(2")); 4,78 - 4,76 (m, H-C(3’); 4,40 (d, ³J(H-C(1")cis, H-C(2")) = 5,0, H-C(1")cis); 4,39 (d, ³J(H-C(1")trans, H-C(2")) = 5,0, H-C(1")trans); 4,15 -4,14 (m, H-C(4’)); 3,62 - 3,60 (m, H^a-C(5’)); 3,59 - 3,57 (m, Hp-C(5’)); 2,12 (t, 2H, ³J(H-C(4")cis, H-C(5")) = 7,5, H-C(4")cis); 1,92 (t, 2H, ³J(H-C(4")trans, H-C(5")) = 7,5, H-C(4") trans); 1,71 (s, 3H, H³-C(20")); 1,68 - 1,65 (m, 2H, H²-C(a’)); 1,53 - 1,47 (m, 3H, H²-C(a), H-C(15")); 1,46 - 1,31 (m, 6H, H²-C(P’), H²-C(5"), H-C(7"), H-C(11")); 1,29 - 1,04

(m, 16H, H²-C(P), H²-C(6"), H²-C(8"), H²-C(9"), H²-C(10"), H²-C(12"), H²-C(13"), H²-C(14")); 0,91 (t, C(y’)), (H^a-C(Y’), H^c-C(Y’)) = -7,5, H3-C(y’)); 0,86 (t, 3H, ²J(H^a-C(Y), H^b-C(Y)), (H^a-C(Y), Hc-C(y)) =-7,5, H3-C(y)); 0,85 -0,80 (m, 12H, H³-C(16"), H³-C(17"), H³-C(18"), H³-C(19")). RMN ¹³C ((D⁶) DMSO): 157,88 (d, ²J(C(4), F) = -46,38, C(4)); 148,71 (d, ⁴J(C(2), F) = 3,77, C(2)); 139,33 (d, ¹J(C(5), F) = 228,75,C(5)); 140,04 (s, C(3")cis); 139,64 (s, C(3")trans); 124,50 (d, ²J(C(6), F) = -34,58, C(6)); 118,68 (s, C(2")cis); 117,95 (s, C(2")trans); 116,37 (C(cetal)); 92,05

(C(4’)); 86,88 (C(1’)); 84,07 (C(2’)); 80,52 (C(3’)); 61,16 (C(5’)); 38,71 (C(1")); 38,59 (C(a’)); 38,53 (C(a)); 36,59 - 36,50

(m, C(6"), C(8"), C(10"), C(12")); 35,79, 35,68 (2s, C(7"), C(11")); 27,25 (C(15")); 24,23 (C(5")); 24,23 (C(9")); 24,00 (C(13")); 22,43, 22,34 (2s, C(16"), C(17")); 19,50, 19,45 (2s, C(18"), C(19")); 16,91 (C(P')); 16,24 (C(P)); 15,94 (C(20")); 14,06 (C(y')); 14,02 (C(y)). Anal. calc. para C³⁶H⁶¹FN²O⁶ (636,878): C, 67,89; H, 9,65; N, 4,40. Encontrado: C, 67,61; H, 9,79; N, 4,29. logP = 12,5 ± 0,63.

xxvii) 3-((Z)-3,7-Dimetilocta-2,6-dien-1-il)-5-fluoro-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dipropiltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)pirimidin-2,4(1H, 3H)-diona (5b).

El compuesto 4b (1,25 g; 1,63 mmol) se destritiló y se purificó como se describe para el compd. 5a. La cromatografía en columna (gel de sílice, columna: 2 x 7,5 cm, EtOAc/éter de petróleo, 1:4) dio una zona principal a partir de la cual el compd. 5b (0,528 g, 66 %) se obtuvo en forma de un aceite incoloro) tras la evaporación del disolvente. F^r (EtOAc/éter de petróleo, 1:4) 0,25. UV (MeOH): 270 nm (s= 9900). RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 8,23 (d, ³J(H-C(6), F) = 7,0, H-C(6)); 5,90 (s, H-C(1')); 5,18 - 5,13 (m, 3H, H-C(2'), H-C(2"), H-C(6")); 4,90 - 4,88 (m, H-OC(5')); 4,77 - 4,75 (m, H-C(3)); 4,40 (d, 2H, ³J(H²-C(1"), H-C(2")) = 7,0, H²-C(1")); 4,15 (q, ³J((H-C(4'), H-C(3')), (H-C(4'), H²-C(5')) = 3,5, H-C(4')); 3,62 - 3,57 (m, 2H, H²-C(5')); 2,18 - 2,06 (m, 4H, H²-C(4"), H²-C(5")); 1,68 - 1,66 (m, 8H, H²-C(a'), H^a-C(9"), H³-C(10")); 1,59 (s, 3H, H^a-C(8")); 1,53 - 1,49 (m, 2H, H²-C(a)); 1,44 - 1,39 (m, 2H, H²-C(P')); 1,30 - 1,52 (m, 2H, (m, 2H, H²-C(P)); 0,93 (t, 3H, ²J((H^a-C(Y'), H^b-C(Y')), ((H^a-C(Y'), Hc-C(y'))) = -7,0, H^a-C(Y')); 0,91 (t, 3H, ²J((H^a-C(Y), H^b-C(Y)), ((H^a-C(Y), H^c-C(Y))) = -7,0, Hs-C(y)). RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 156,10 (d, ²J(C(4), F) = -25,65, C(4)); 148,73 (C(2)); 139,35 (d, ²J(C(5), F) = 228,76, C(5)); 139,52 (C(3")); 131,06 (C(7")); 124,48 (d, ¹J(C(6), F) = 34,83, C(6)); 123,84 (C(2")); 118,93 (C(6")); 116,38 (C(cetal)); 92,07 (C(4')); 86,89 (C(1')); 84,10 (C(2')); 80,54 (C(3')); 61,20 (C(5')); 38,73 (C(a')); 38,60 (C(a)); 31,56 (C(4")); 25,93 (C(5")); 25,36 (C(9")); 22,87 (C(10")); 17,39 (C(8"); 16,92 (C(P')); 16,24 (C(P)); 14,02 (C(y')); 13,97 (C(y)). Anal. calc. para C²⁶H³⁹FN²O⁶ (494,596): C, 63,14; H, 7,95; N, 5,66. Encontrado: C, 63,08; H, 8,13; N, 5,69. logP = 7,65 ± 0,65.

xxviii) 2-Cianoetil(((3aR,4R,6R, 6aR)-6-(5-fluodo-2,4-dioxo-3-((7R, 11R)-3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-1-il)-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-2,2-dipropil-tetrahidrofuro-[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)metil)diisopropilfosforamidita (6a (E+Z)).

El compuesto 5a (E+Z) (0,2 g; 0,314 mmol) se evaporó tres veces a partir de CH²Cl² anhidro y después se disolvió en CH²Cl² anhidro (12 ml). A continuación, se añadieron diisopropiletilamina (base de Hünig, 101,5 pl; 0,597 mmol) y 2-cianoetil-diisopropilclorofosfina (126 pl; 0,565 mmol) en atmósfera de N². La mezcla de reacción se agitó a temp. ambiente durante exactamente 15 min. Después de la adición de una sol. ac. al 5 % de NaHCO³ enfriada con hielo (10 ml) la mezcla se extrajo tres veces con CH²Cl² (5 ml, cada vez). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na²SO⁴ durante 1 min en atmósfera de N² y con enfriamiento. Después de la filtración, la solución se evaporó a sequedad. El residuo se sometió a cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, columna: 2 x 10 cm, CH²Ch/acetona, 85:15) dentro de aprox. 20 min. La evaporación de la zona principal, proporcionó el compd. 6a (0,178 g, 68 %) en forma de un aceite incoloro tras la evaporación del disolvente. F^r (CH²Ch/acetona, 85:15): 0,96. RMN ³¹P (CDCb): 149,93; 149,75.

xxix) 2-Cianoetil(((3aR,4R,6R, 6aR)-6-(3-((Z)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-il)-5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-2,2-dipropiltetrahidrofuro-[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)metil)diisopropilfosforamidita (6b).

El compuesto 5b (0,2 g; 0,405 mmol) se fosfitilató y se purificó como se describe para el compd. 5a. Rendimiento: 255 mg (91 %) del compd. 6b en forma de un aceite incoloro. F^r (CH²Ch/acetona, 85:15): 0,96. RMN ³¹P (CDCb): 149,84; 149,66.

xxx) Síntesis e incorporación de bicapa.

La fosforamidita 27 se usó para preparar los siguientes oligonucleótidos con un nucleolípido adjunto 19c:

5'-d(19c-Cy5-TAG GTC AAT ACT)-3' 33

5'-d( 19c-TAG GTC AAT ACT)-3' 34

3'-d(ATC CAG TTA TGA)-5' 35

El oligómero marcado con cianina-5 33 se usó para estudiar la eficiencia de incorporación de la incorporación de la bicapa lipídica con respecto a la velocidad y la estabilidad. El oligómero 34 se usó para estudiar la formación dúplex entre este lipooligonucleótido y su cadena complementaria 35 en la bicapa lipídica - capa límite de la fase acuosa usando SYBR Green como tinte fluorescente intercalante.

xxxi) Etiquetado a pequeña escala del compuesto 19c con la N-hidroxisuccinimida

Éster de Eterneon 480® ( ^ 36). El Eterneon 480® (5 mg; 0,0095 mmol) y el compd. 19c (5,3 mg; 0,0095 mmol) se disolvieron ambos en MeCN (1,5 ml, cada vez). La sol. del 19c se añadió gota a gota a la sol. de fluoroforo en atmósfera de N² y con exclusión de luz dentro de 5 min. La mezcla de reacción se agitó durante 26 h a temperatura ambiente. El producto se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice, columna: 2 x 19 cm, CH²C^h /MeOH, 99:1). El producto aislado 36 formó un sólido de color rojo intenso. F^r (CH²C^h /MeOH, 99:1) 0,5.

xxxii) 5-Fluoro-1((3aR, 4R, 6R, 6aR)-6-(hidroximetil)-2,2-dipentadecanil-tetrahidro-furo[3,4-d][1,3]dioxol-4-il)pirimidin-2,4(1H,3H)-dona (19d).

A 5-fluorouridina anhidra (1 g, 3,82 mmol) in THF (30 ml) se le añadió ácido tosílico (0,156 g; 0,9 mmol), hentriacontan-15-ona (0,37 g, 8,22 mmol) y trietilortoformato (0,7 ml, 4,01 mmol) en THF (aprox. 30 ml). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 24 h. Después, la reacción se interrumpió mediante la adición de Et3N (0,22 ml, 1,59 mmol) y la mezcla se vertió en una sol. ac. al 5 % de NaHCO3 enfriada con hielo (20 ml) y se agitó durante 15 min. Después, la capa acuosa se lavó con CH²CI² ; la capa orgánica se separó y se secó (Na²SO⁴), se filtró y se evaporó. El residuo se trituró con MeOH. El precipitado se retiró por filtración y se secó durante una noche a alto vacío. Rendimiento:

0,258 g (0,4 mmol, 49 %). TLC (gel de sílice, CH²C^b :MeOH; 95:5): F^r = 0,6. RMN ¹H ((D⁶)DMSO): 11,688 (s, NH);

8,107 (d, ³J(F, H-C(6) = 7,0, H-C(6)); 5,848 (d, ³J(1’,2’) = 1,3, H-C(1')); 5,015 (t, ³J(HO-C(5’),CH²(5’)) = 5,0, HO-C(5'));

4,881 (dd, ³J(2’,1’) = 2,5, ³J(2’,3’) = 6,5, H-C(2')); 4,761 (dd, ³J(3’,2’) = 6,5, ³J(3’,4’) = = 3,0, H-C(3')); 4,101 (^dd, ³J(4’,3’) = 3,5, ³J(4’,5’) = 7,5, H-C(4’)); 3,612 (m, J^{a b} = -12,0, CH²(5’)); 1,681 (m, 2H^endo-C(a’)); 1,533 (m, 2H^exo-C(a));

1,398 (m, 2H^endo-C(P’)); 1,286 (m, 25 x CH²); 0,865 (m, 2 x CH³). RMN ¹³C ((D⁶)DMSO): 156,722 (d, ²J(F, C(4)) = 26,3, C(4)); 148,690 (C(2)); 139,662 (d, ¹J(F, C(5)) = 230,0, C(5)); 125,504 (d, ²J(F, C(6)) = 35,8, C(6)); 116,471 (C(acetal));

90,938 (C(1’)); 86,507 (C(4’)); 83,708 (C(3’)); 80,296 (C(2’)); 61,075 (C(5’)); 36,307 (C(a’)); 36,065 (C(a)); 30,897, 28,767, 28,711, 28,592, 28,567, 28,469, 28,442, 28,268, 23,164, 22,616, 21,654, (CH²); 13,451 (2 x CH³).

xxiii) Síntesis in situ de ácido 3-[(2S,4S,6S)-4-(5-fluoro-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-6-(hidroximetil)-2-metiltetrahidrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-2-il]propanoico (37) y acoplamiento a citosano (1,1 kDa o 12,0 kDa) ( ^ 39).

El éster 28a (1,15 g, 2,97 mmol) se disolvió en EtOH/NaOH ac. 1 N (35 ml, 1:1, v/v) y se agitó a temp. ambiente durante

30 min. Después, la mezcla de reacción se neutralizó mediante la adición de Amberlite IR-120 (forma H⁺). Después de la filtración de la resina de intercambio iónico y el lavado con EtOH/H²O (1:1, 10 ml, dos veces), los filtrados combinados se evaporaron a sequedad para producir el ácido 37 como un sólido ligeramente parduzco (rendimiento:

95 %) el cual se acopló a los diferentes citosanos sin purificación adicional. {37: TLC (gel de sílice, CH²C^b /MeOH, 9:1, v/v): F^r = 0,3. RMN ¹H (D⁶DMSO): 11,90 (s, 1H, NH); 7,90 (d, 1H, ³J(H-C(6), F) = 7,0, H-C(6)); 5,82 (d, 1H, ³J(H-C(1’),

H-C(2’)) = 1,2, H-C(1’)); 5,20 (t, 1H, ³J(C(5’)-OH, H-C(5’)) = 5,0, C(5’)-OH); 4,84 (dd, 1H, ³J(H-C(2’), H-C(1’)) = 3,0,

³J(H-(2’), H-C(3’)) = 7,0, H-C(2’)); 4,77 (dd, 1H, ³J(H-C(3’), H-C(2’)) = 6,5, ³J(H-C(3’), H-C(4’)) = 3,5, H-C(3’)); 4,06 (yq,

1H, ³J(H-C(4’), H-C(3’)) = 3,5, ³J(H-C(4’), H²C-(5’)) = 4,0, H-C(4’)); 3,63-3,55 (m, 2H, H²C(5’)); 2,13 (t, 2H, 3J = 7,0,

CH²-C=O); 1,95 (t, 2H, 3J = 7,0, CH²); 1,23 (s, 3H, CH^s-acetal). HR IEN EM: m/z calc (MNa⁺), 382,274. Encontrado: 382,10}.

A) Acoplamiento del ácido 37 a citosano-1,1 kDa ( ^ 39). El citosano [P^m, 1,1 kDa, desacetilación al 97,5 %, 50 mg, 0,045 mmol) se disolvió en ácido acético diluido (pH 5,0, 20 ml). A esta sol. se le añadió el ácido 37 (155 mg, 0,405 mmol). La suspensión se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Después, se añadió clorhidrato de

N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 158 mg, 0,85 mmol), disuelta en una pequeña cantidad de H²O.

La mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente y después se dializó durante contra agua (1 I, cada vez; tubo de diálisis, corte de PM: 1.000 Da) durante 3 días (3 cambios). Después, el contenido del tubo de diálisis se liofilizó hasta sequedad para obtener el biopolímero 39 modificado. Para la determinación de la concentración de ligando, el producto 39 (1 mg) se disolvió en agua (1 ml) y se midió la extinción. La concentración de ligando se calculó usando el coeficiente de extinción de 28a (12,400 M^{' 1} cirr¹). Los resultados se resumen en la tabla 3.

B) Acoplamiento del ácido 37 a quitosano-12.0 kDa a varios valores de pH ( ^ 39). Se disolvieron cinco muestras de quitosano [P^m , 12,0 kDa, desacetilación al 75 %, 100 mg, cada una] en soluciones ac. diluídas de ácido acético, el pH de las cuales se ajustó a pH 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 y 5,5, respectivamente. Posteriormente, a cada sol. se le añadió el ácido 37 (44,7 mg, 0,117 mmol, cada uno) y las mezclas se agitaron durante 30 min a temp. ambiente. Después, se añadió EDC (67 mg, 0,35 mmol) a cada solución y se continuó agitando durante una noche. A continuación, todas las muestras fueron dializadas contra agua (1 I, cada una; tubo de diálisis, corte de PM: 3.500 Da) durante

3 días (3 cambios). El contenido de cada tubo de diálisis se liofilizó a sequedad para obtener el biopolímero 39 modificado. Para la determinación de la concentración de ligando (i) citosano no modificado, (ii) el compuesto 39

(1 mg, cada uno) así como (iii) el compuesto 37 (785 |jg) se hidrolizaron completamente en ácido clorhídrico ac.

6 N (5 ml, cada uno) durante 1 h a 100 °C. Cada sol. resultante se diluyó con agua hasta un volumen de 50 ml, cada una. Las absorbancias UV de las soluciones diluidas se midieron después a 268 nm, y la concentración de ligando se calculó a partir de las absorbancias UV correspondientes (véase por ejemplo, T. Wada et al., J. Bioactive Compat. Polym. 1994, 9, 429). Los resultados se resumen en la tabla 3.

C) Acoplamiento secuencial del ácido 37 y del colorante Atto-488 N(9)-butanoato a citosano-(1,1 kDa) a {Oligo[(8)^{x -}co-(7)^y-co-(9)^z-co-(10)^w] ⁿ, 11}.

Se disolvió citosano [P^m , 1,1 kDa, desacetilación al 97,5 %, 50 mg, 0,045 mmol) en ácido acético diluido (pH, 5,0,

20 ml). A continuación, se disolvió Atto-488-butanoato (1 mg) en una pequeña cantidad de agua y se añadió al ácido

37 (0,24 mg). La mezcla se añadió a la sol. de citosano y se agitó durante 15 min a temp. ambiente con exclusión de luz. A continuación, se disolvió EDC (0,72 mg) en una pequeña cantidad de H²O y se añadió a la mezcla de reacción.

Después de agitarse durante 1,5 h, se añadió la porción principal del compuesto 37 (51,5 mg) y se continuó agitando durante 15 min.Después, se añadió otra porción de EDC (51,6 mg) - disuelta en una pequeña cantidad de agua - y se continuó agitando durante una noche. La diálisis contra agua (1 I, cada vez; tubo de diálisis, corte de PM: 1.000 Da) durante 3 días (3 cambios), seguido de liofilización dio el polímero 11. La concentración de ligando se determinó como se describe anteriormente; los resultados se resumen en la Tabla 3.

2',3'-O-[(1R)-4-Etoxi-1-metil-4-oxobutilideno]-5-fluoro-3-[(2E, 6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-il]uridina (29a).

El éster 28a (500 mg, 1,29 mmol) se disolvió en DMF anhidra (11,5 ml). En atmósfera de N² se añadió K²CO³ (0,685 g,

4,97 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 min a temp. ambiente. Después, se añadió gota a gota bromuro de farnesilo (0,39 ml,1,42 mmol) durante 2 h. Después de agitarse durante una noche, la mezcla de reacción se filtró y el residuo se lavó con una pequeña cantidad de CH²Cl². Los filtrados combinados se evaporaron a sequedad en alto vacío durante una noche. El residuo oleoso se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (columna: 5 x 7,5 cm). La elución con CH²Cl² (125 ml) seguido por CH²Cl^2/MeOH (95:5, v/v, 500 ml) proporcionó una zona principal la cual se evaporó para dar el compd. 29a en forma de un aceite incoloro. TLC (gel de sílice, CH²Cl^2/MeOH 95:5, v/v): F^r 0,73. RMN ¹H (D⁶-DMSO): 8,204 (d, ³J(H-C(6),F) = 7,0, H-C(6)); 5,881 (d, ³J(1’,2’) = 2,0, H-C(1’)); 5,197 (t, ³J(HO-C(5'), H-C(5') = 5,0, HO-C(5')); 5,126 (t, ³J(2",1") = 7,5, H-C(2")); 5,043 (m, H²-C(1")); 4,911 (dd, ³J(2',1') = 3,5, ³J(2',3') = 6,5, H-C(2')); 4,797 (dd, ³J(3',2') = 6,5, ³J(3',4') = 3,0, H-C(3')); 4,404-4,391 (m, 2H, H-C(6"), H-C(10")); 4,149 (m, H-C(4')); 4,057 (q, 3J = 7,0, CH²(éster)); 3,650-3,583 (m, CH²(5')); 2,416 (t, ³ J = 7,0, CH²-C=O); 2,051-1,887 (5 m, 10H, H²-C(4"), H²-C(5"), H²-C(8"), H²-C(9"), CH²(éster)); 1,738 (s, H^a-C(13")); 1,629 (s, H^a-C(14")); 1,548 (s, H^a-C(15")); 1,533 (s, H³-C(12")); 1,269 (s, CH³(acetal)); 1,190 (t, ³ J = 7,0, CH³(éster). RMN ¹³C (D⁶DMSO): 172,432 (C=O); 156,102 (d, ²J(C(4),F) = 26,2, C(4)); 148,710 (C(2)); 139,354 (d, ¹J(C(5),F) = 228,9, C(5)); 139,382 (C(3")); 134,536 (C(7")); 130,550 (C(11")); 124,373 (d, ²J(C(6),F) = 34,7, C(6)); 124,006 (C(6")); 123,486 (C(10")); 118,122 (C(2")); 113,623 (C(acetal)); 91,785 (C(1'); 86,564 (C(4')); 83,988 (C(2')); 80,224 (C(4')); 61,073 (C(5')); 59,823 (CH²(éster)); ~ 38,0 (3 señales, superpuesta por señales de disolvente, C(1"), C(4"), C(8")); 33,342 (CH²-C=O); 28,103 (CH²(acetal)); 26,108 (C(5")); 25,617 (C(9"); 25,369 (C(12")); 23,479 (CH³(acetal)); 17,420 (C(15")); 16,089 (C(14")); 15,700 (C(13"); 13,968 (CH³(éster)). HR IEN EM: m/z calculado para C³¹H⁴⁶FN²O⁸ (MH⁺), 593,696; encontrado, 593,40; 335,2 [N(3)-farnesil-5-fluorouracilo].

Síntesis in situ del ácido 38 y acoplamiento al citosano (1,1 kDa) (40). El ácido N(3)-farnesilado 38 se preparó a partir de su éster precursor 29a como se describe para el ácido 37 a partir del 29a (489 mg, 0,825 mmol) y usando una mezcla de EtOH (10 ml) y NaOH ac. 1 N (5 ml). Después de 30 min de agitación a temp. ambiente la mezcla se neutralizó mediante la adición de Amberlite IR 120, forma H+), se filtró, se lavó con EtOH/H2O, 1:1) y se evaporó a sequedad dando el ácido 38 en rendimiento cuantitativo como su sal de sodio.

A continuación, se disolvió citosano (1,1 kDa, 50 mg, 0,045 mmol) en cualquiera de los ácido acético ac. (pH 5,0, 20 ml) (I; produciendo una baja concentración de ligando) o en una mezcla de ácido acético ac. (pH 5,0)/1,4-dioxano (20 ml, 1:1, (v/v)) (ii; produciendo una concentración alta de ligando). Después de la adición del ácido 38 (237,6 mg, 0,405 mmol), la mezcla se agitó durante 15 a temperatura ambiente. Después se añadió EDC (158 mg) - disuelta en una pequeña cantidad de H²O - y se continuó agitando durante una noche. El resultante se dializó contra agua (1 I, cada uno; tubo de diálisis, corte de PM: 1.000 Da) durante 3 días (3 cambios), seguido por liofilización dando el polímero 40. Su concentración de ligando se determinó como se ha descrito anteriormente; los resultados se resumen en la Tabla 3.

Preparación de láminas de quitosano.

Para las preparaciones exitosas de láminas de quitosano, se suspendieron los quitosanos secados por congelación en la mezcla de disolventes correspondiente (Tabla 1), se agitó lentamente durante 30 min a temperatura ambiente y posteriormente se desgasificó por ultrasonidos durante 30 s. Ocasionalmente se retiraron pequeñas burbujas de aire con la ayuda de un alfiler. Después, las soluciones claras fueron vertidas en placas Petri y se almacenaron durante la noche a temperatura ambiente. Después de 16 h las placas Petri se calentaron durante 1 h en un horno de secado al vacío a 30 - 40 °C. Después, las láminas se cubrieron con una solución de NaOH 1 N ac. y se almacenó durante 10 min. Después de la retirada de la solución alcalina, las láminas se lavaron intensamente con H²O. Pueden almacenarse en H²O durante varios días hasta su uso.

Tabla 1. Condiciones de reacción para la preparación de láminas de quitosano.

Entrada Mⁿ H²O Hac HCOOH MeOH Relación v/v/v PEG PEG Propiedades de [kDa]/cantidad [ml] [ml] [ml] [ml] de disolventes 200 6000 la lámina [mg] -ml] [g]

E 14,0/100 8 1 - 1 8:1:1 dúctil, a prueba de rotura J 82,0/500 40 5 - 5 8:1:1 - - superficie lisa K 82,0/500 40 5 - 5 8:1:1 5 - dúctil, a prueba de rotura P₁) 20-200/400 24 - 8 8 6:2:2 - - dúctil, a prueba de rotura Q₂) 20-200/400 24 - 8 8 6:2:2 - - dúctil, a prueba de rotura T 20-200/400 24 - 8 8 6:2:2 - 0,3 turbio, a prueba de rotura 1). La mezcla se vertió en una sola placa Petri, dando como resultado en una lámina de = 1 mm de espesor. 2) La mezcla se dividió de forma equitativa entre dos placas Petri con láminas de ” 0,5 mm de espesor.________________

Acoplamiento del ácido 37 a láminas de quitosano y determinación de las concentraciones de ligando.

Para la inmovilización covalente del ácido 37 a láminas de quitosano (Tabla 2) el compuesto 37 (158 mg, 0,4 mmol o 79 mg, 0,2 mmol) se disolvió en H²O (10 ml) que había sido ligeramente acidificado (pH 4 o 5, véase la Tabla 4) con AcOH. A continuación, se colocó la lámina de quitosano correspondiente (10 x 10 x 1 mm) en la solución y se añadió p-dioxano (10 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Después, se añadió clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC, 158 mg, 0,85 mmol) y se continuó la agitación durante la noche. La lámina se lavó con H²O, se transfirió a un tubo de diálisis (masa de corte, 3.000 Da), cargado con H²O y se dializó contra H²O (1 I, 3 días, 3 cambios). Las láminas se secaron a 25 °C en un horno de secado al vacío durante la noche.

Tabla 2. Condiciones de reacción del acoplamiento del compuesto 37 a láminas de quitosano.

lámina cantidad de 37 [mmol] pH tiempo [días] ^{concentración de ligando [mg de ligando/g} _{de lámina]}

P 0,4 5,0 1 44,5

Q 0,4 4,0 2 94,8

Q 0,2 4,0 4 69,6

Q 0,2 5,0 4 96,3

Para la determinación de la concentración de ligando de los conjugados secos, las láminas de quitosano correspondientes (Tabla 2, 1 mg, cada una) así como 1 mg de la lámina de quitosano y el ácido no acoplados 37 (785 |jg) se suspendieron en ácido clorhídrico 6 N ac. (20 ml, cada uno). Las alícuotas de 5 ml, cada una, se calentaron a 100 °C durante 1,5 h, tras lo cual las láminas entraron completamente en disolución. Después de enfriar a temperatura ambiente, cada solución se diluyó con H²O (5 ml), y se midió su absorbancia UV a 268 nm. Las concentraciones de ligando resultantes se dan en la Tabla 2.

Difusión de Rodamina B a través de láminas de quitosano

Además, la difusión del tinte hidrosoluble Rodamina B a través de las láminas de quitosano de los experimentos J, K, Q y T se midió usando una célula de difusión Franz sencilla (Figura 9).

El dispositivo de difusión consiste en dos compartimentos de 1,5 ml de volumen, cada uno, entre los cuales se corrigió la lámina de quitosano correspondiente (de los experimentos J, K, Q, y T). El compartimento izquierdo (célula donadora) se llenó con la solución de Rodamina B acuosa, la otra (célula aceptora) con H²O puro. Cada 4 minutos se retiró el contenido de la cámara aceptora con una jeringa Hamilton y se registró su espectro Vis, cuyos resultados se muestran en la Figura 10.

Escisión ácida del conector O-2',3'-cetal de 28a y degradación de 5-fluorouridina unida a quitosano por quitosanasa de Streptomyces sp.174.

Se midió tanto la hidrólisis ácida del resto O-2',3'-cetal del éster 28a como también la degradación catalizada por quitosanasa de la 5-fluorouridina unida a la lámina de quitosano. La estabilidad ácida se determinó incubando el compuesto 28a (2 mg) en HCl/MeCN acuoso 1 N 1:1 (v/v), neutralización por Et3N y posterior análisis por HPLC RP-18 como se describió anteriormente (Figura 12).

Degradación de 5-fluorouridina unida a la lámina de quitosano por quitosanasa de Streptomyces sp. 174

Se estudió la degradación de la 5-fluorouridina unida a la lámina de quitosano por la quitosanasa de Streptomyces sp.174 usando el método anteriormente descrito de célula de difusión de Franz. Para este fin, en primer lugar, se colocó una pieza (4 x 4 x 1 mm) de la lámina del experimento P (Tabla 2) en la cámara donadora de la célula de Franz en H²O. Los dos compartimentos estaban separados por una membrana de diálisis hinchada (masa de corte: 1.000 Da). Después de cargar la cámara aceptora con H²O, se añadió quitosanasa (5 j l de una suspensión enzimática, 30 U/mg de proteína) a la cámara donadora que contenía la lámina en blanco. La célula entera se colocó a 37 °C en un horno. La inspección del contenido celular después de 2 días mostró que la lámina estaba completamente solubilizada.

La degradación catalizada por enzimas (5 j l de una suspensión de quitosanasa, 30 U/mg de proteína) de una lámina cargada con 5-FU (Tabla 2, 4^a entrada, pieza de 4 x 4 x 1 mm) fue investigada. Para este fin, se midió la absorbancia UV a 268 nm de la solución acuosa de la cámara receptora a intervalos dentro de un período de 10 días y se representó frente al tiempo (Figura 14).

Acoplamiento secuencial del ácido 38 y el colorante Atto-488 N(9)-butanoato a Quitosano-(1,1 kDa) a Oligo[(8)^x-co-(7)^y-co-(9)^z-co-(10)^w] ⁿ, 12}. Quitosano [M^w, 1,1 kDa, 97,5 % de desacetilación, 50 mg, 0,045 mmol) se disolvió en ácido acético diluido (pH, 5,0)/1,4-dioxano (1:1, (v/v), 20 ml). A continuación, El atto-488-butanoato (1 mg) se disolvió en una pequeña cantidad de agua y se añadió al ácido. 38 (0,365 mg), disuelto en un pequeño volumen de H2O/1,4-dioxano (1:1). Ambas soluciones se combinaron y se agitaron durante 15 min a temperatura ambiente con exclusión de la luz. A continuación, EDC (0,770 mg), disuelto en una pequeña cantidad de H²O, se añadió y se continuó agitando durante 1 h. Posteriormente, la porción principal del ácido 38 (157,9 mg) se añadió y, después de 15 minutos más, una segunda porción de EDC (51,6 mg, disuelto en un pequeño volumen de H2O). Después, la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se realizó diálisis (corte de MW: 1.000 Da) durante 3 días (3 cambios) bajo exclusión de luz. La liofilización dio el polímero 12; su concentración de ligando se determinó como se describió anteriormente, y los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Condiciones de reacción y concentración de ligando de derivados de 5-fluorouridina unidos a quitosano. Quitosano pH (ac. Ligando o ligandos (derivado de Concentración de ligando [mg de derivado de 5-HAc) 5-FU), tinte Atto) FU/g de quitosano modificado]

1,1 kDa 5,0 (28a) 443,5

1,1 kDa 5,0 (28a), (Atto-488) 212,1

1,1 kDa 5,0 (29a) 383,0; 1412,4a)

1,1 kDa 5,0 (28a), (Atto-488) 606,7a)

12 kDa 5,5 (28a) 0

12 kDa 5,0 (28a) 86,8

12 kDa 4,5 (28a) 85,7

12 kDa 4,0 (28a) 141,6

12 kDa 3,5 (28a) 7,3

a) Las reacciones de acoplamiento se realizaron en una mezcla de ac. HAc/1,4-dioxano (1,1, v/v).

1) Incorporación del compuesto marcado con Eterneon (36) en una bicapa artificial

Las mediciones de la incorporación de los derivados preparados se han llevado a cabo con el aparato. "lonovation Explorer" de Ionovation GmbH, Alemania, que está equipado con un microscopio de fluorescencia invertido convencional y una unidad de perfusión controlada por ordenador, así como un vehículo desechable, de muestra microfluídico transparente óptico con capacidades de perfusión. Un "Puerto Bicapa" da acceso directo a la bicapa lipídica, mientras que ambos lados de la bicapa pueden perfundirse a través del canal cis y trans. Los pozos de calibración permiten experimentos de control óptico cuando sea necesario. Una configuración detallada del aparato se describe en E.Werz, et. al. Chemistry & Biodiversity, Vol. 9, 2012, 272-281. Las medidas en el compuesto 36 se reflejan en las siguientes figuras:

Figura 1-1: Escaneo Z de una bicapa vacía

Figura 1-2: Escaneo Z después de la inyección de una sol. diluida de 36 en MeCN (1 j l ) en el compartimento cis del portaobjetos y desgarrado de la bicapa.

Figura 1-3: Escaneo Z después de 5 min de incubación. Masificación lenta de agregados en el anillo de teflón. Figura 1-4: Escaneo Z después de 5 min adicionales de incubación. La mayoría de los agregados están cubriendo el anillo de teflón.

Figura 1-5: Repetición del experimento como se refleja en la Figura 1-1. Escaneo Z de la bicapa vacía.

Figura 1-6: Escaneo Z después de la inyección de una solución MeCN de 36 (1 j l ) al compartimento cis del portaobjetos y 5 min de incubación.

La Figura 1-2 muestra que tras la inyección de una solución diluida de MeCN del compuesto 36 en el compartimiento cis de la bicapa deslice la bicapa se rasga de una vez. Como resultado, compuesto 36 forma agregados de alto peso molecular (micelas) que se acumulan lentamente en el anillo de apertura recubierto de teflón (Figura 1-2, 1-3 y 1-4). Las mediciones de espectroscopía de correlación de fotones (PCS) con un ángulo de dispersión de 90° dan una distribución de tamaño (distribución Poisson) de las partículas resultantes con valores medios entre aprox. 600 y 1200 nm. En un segundo experimento, una solución concentrada de 36 en MeCN se inyectó en el compartimento cis del portaobjetos de bicapa. En este caso se observó que durante un tiempo de incubación de 5 min el nucleolípido marcado con colorante se inmoviliza dentro de la bicapa (Figuras 1-5 y 1-6).

Figura 2 muestra las intensidades relativas de brillo de la bicapa antes y después de la adición del compuesto 36.

2. La lipofilidad de diversos derivados como se muestra en la Tabla 4

La lipofilidad de diversos derivados de 5-fluorouridina se ha estudiado ya que la lipofilidad tiene entre otros una influencia en la incorporación en oligo(2'-desoxinucleótidos). La lipofilidad de los nuevos derivados de nucleósidos hidrófobos se ha estudiado de dos maneras diferentes: (i) se calcularon los valores logP de los compuestos (Tabla 4) y comparado con los del nucleósido no modificado 1a, (ii) las movilidades cromatográficas de los compuestos se midieron en términos de tiempos de retención (tR en min) por HPLC RP-18.

La Tabla 4 muestra el registro calculado PAGS así como los correspondientes valores tR valores de los diversos compuestos. Puede verse que los valores log P calculados abarcan más de diez órdenes de magnitud.

Tabla 4. Log P calculados y Tiempos de retención de HPLC RP-18 de derivados de 5-fluorouridina hidrófobos.

Comp. Log P calc. HPLC RP-18 tR [min]

1a, 5-fluorouridina - 1,34 ± 0,46 1

19a + 0,50 ± 0,56 inestable

23 + 6,26 ± 0,62 27

24 + 7,56 ± 0,67 24

19c + 9,00 ± 0,56 > 600

25 + 9,68 ± 0,67 87

3. Oligonucleótidos lipófilos y su inserción en bicapa.

Las fosforoamiditas 26 y 27 - junto con una ocianina-3 fosforoamidita - se usaron para preparar dos oligonucleótidos con las siguientes secuencias:

5'-d[(25)-(Cy-3)-TAG GTC AAT ACT] (41)

5'-d[(19c)-(Cy-3)-TAG GTC AAT ACT] (42).

Los oligómeros se caracterizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF. El análisis EM reveló que durante el registro del espectro el oligómero 4 l - preparado con un resto colgante de 5-fluorouridina N (3)-farnesilada (25) - se sometió a una desprenilación inducida por ácido de la cadena lateral de sesquiterpeno por un resto de isopreno produciendo un oligómero que lleva un derivado de nucleótido de 5-fluorouridina N(3)-geranilado. Esto fue sorprendente ya que los presentes inventores han sintetizado con éxito simultáneamente los oligómeros correspondientes que llevan restos de nucleótidos con timidina N(3)farnesilada colgante o N(1)-farnesilatos inosina; en esos casos no se observó escisión del resto sesquiterpeno durante el análisis MALDI TOF que señala una influencia electrónica de largo alcance del sustituyente de flúor en la cadena lateral de farnesilo.

Inserción de bicapa. La inserción de los oligonucleótidos 41 y 42 se probó en membranas bicapa artificiales compuestas de POPE/POPC (8:2, p/p) en n-decano (100 mg/ml) en una configuración como se describe en E.Werz, et. al. Chemistry & Biodiversity, Vol. 9, 2012, 272-281.

La configuración es una cámara bicapa horizontal en donde la cámara contiene dos compartimentos (Cis y Trans) que están separados por una delgada película de PTFE. La película está perforada por un orificio de 100 pm, que es la única conexión entre el compartimento trans y cis. Cuando se pinta una solución lipídica sobre el orificio, se forma una bicapa espontáneamente. La distancia desde la bicapa al cubreobjetos es de 100 pm. Por lo tanto, la membrana es accesible por un objetivo de agua de alta apertura numérica. Los electrodos en cis y trans permiten grabaciones electrofisiológicas de la bicapa. Los compartimientos cis y trans tienen un volumen de tampón de 100 pl. La membrana se extiende por la abertura en la película de PTFE. La interfaz de la película y la bicapa está unida por el toro que contiene el disolvente y los lípidos a granel.

Las siguientes Figuras muestran los resultados de las mediciones en donde la Figura 3 refleja las mediciones relacionadas con la inserción de la bicapa de 5'-d[25)-(Cy-3)-TAG GTC AAT ACT] (41) y la Figura 4 refleja la inserción bicapa de 5'-d[(19c)-(Cy-3)-TAG GTC AAT ACT] (42).

Figura 3-1: Vista lateral en bicapa vacía

Figura 3-2: Vista inclinada en bicapa vacía

Figura 3-3: Vista lateral en bicapa después de la adición de 41

Figura 3-4: Vista inclinada en bicapa después de la adición de 41

Figura 3-5: Vista lateral en bicapa cargada después de 1. Perfusión

Figura 3-6: Vista inclinada en bicapa cargada después de 1. Perfusión

Figura 3-7: Vista lateral en bicapa cargada después de 2. Perfusión

Figura 3-8: Vista inclinada en bicapa cargada después de 2. Perfusión

Figura 4-1: Vista lateral en bicapa vacía

Figura 4-2: Vista inclinada en bicapa vacía

Figura 4-3: Vista lateral en bicapa después de la adición de 42

Figura 4-4: Vista inclinada en bicapa después de la adición de 42

Figura 4-5: Vista lateral en bicapa cargada después de 1. Perfusión

Figura 4-6: Vista inclinada en bicapa cargada después de 1. Perfusión

Figura 4-7: Vista lateral en bicapa cargada después de 2. Perfusión

Figura 4-8: Vista inclinada en bicapa cargada después de 2. Perfusión

De las Figuras 3-1 a 3-8 y 4-1 a 4-8 puede verse que ambos oligonucleótidos lipofilizados se incorporan con éxito en la bicapa artificial. La comparación del brillo de las capas, sin embargo, muestra claramente que el oligómero 42 que lleva un resto nucleolípido de doble cola se inserta mejor. En este caso, incluso varias perfusiones de 60 s, cada una, no conducen a una eliminación significativa del conjugado de la bicapa en el caso del oligómero 41 el brillo de la capa disminuye después de dos perfusiones

Determinación de los tiempos de difusión de oligonucleótidos

La figura 5 muestra una construcción esquemática del tablero para la determinación de los tiempos de difusión de oligonucleótidos.

Los tiempos de difusión (|js) de 41 y 42 se midieron, tanto sin como en presencia de una bicapa artificial. Para la determinación de los tiempos de difusión libre, la solución de oligómero correspondiente (50 nM) se diluyó de modo que en el volumen de medición confocal (~ 10'15 l) solo una molécula fluorescente estaba presente. Cada medición se realizó diez veces durante 30 s, cada una. Para determinar los tiempos de difusión de los oligonucleótidos lipofilizados (41,42) en presencia de una bicapa de cinco posiciones de medición se eligieron por encima, por debajo y en la bicapa fueron elegidos. Esto fue necesario porque la bicapa está flotando dentro de ciertos límites, lo que hace que sea más difícil dirigirse a ello exactamente (Figura 5, puntos de medición 1-5). Cada medición se realizó (i) registrando datos de referencia de una bicapa blanco estable, (ii) por la adición de la muestra de oligonucleótidos y una incubación posterior de 25 min, seguido del registro de los datos, (iii) registrando otras series de datos después de la perfusión de las cámaras. La Tabla 5 resume los resultados.

Tabla 5. Tiempos de difusión ( js ) de 41 y 42 sin y en presencia de una bicapa lipídica. Muestra Tiempo de difusión libre [ps]

tampón 45,70 ± 10,25

41 279,67 ± 141,08

42 390,39 ± 249,05

Tiempos de difusión en presencia de una bicapa [ps] en el punto de medición 3 (Figura 6)

Bicapa vacía 829,88 ± 124,90

41 33547 ± 16751, después de perfusión 1.

42 12866 ± 1364, después de perfusión 2.

42 75952 ± 8201, después de 1 perfusión

42 53868 ± 1623, después de perfusión 2.

42 19891 ± 3266, después de perfusión 3.

Puede verse que el tiempo de difusión libre del oligómero con un derivado de 5-fluorouridina de doble cadena (42) exhibe un tiempo de difusión libre significativamente más largo que el oligómero 41 que apunta a la formación de un agregado de alto peso molecular del nucleolípido. También cerca de una bicapa lipídica el oligonucleótido con un resto 19c en el extremo 5' se incorpora más fuertemente en la bicapa y exhibe, por lo tanto, un tiempo de difusión significativamente mayor en comparación con 41.

Pruebas oncológicas

Líneas celulares y condiciones de cultivo

Los experimentos in vitro se realizaron usando la línea celular HT-29 (carcinoma de colon humano) (DSMZ, GmbH, Braunschweig, Alemania). Las células se cultivaron en 90 % de RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS), penicilina 100 U/ml, 0,1 mg/ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5 % de CO2 y 95 % de aire; el medio se cambió cada 48 h.

Sustancias bajo prueba

Se han probado los siguientes derivados de 5-fluorouridina:

28a denotado como 5-FU-A (comparativo)

30a denotado como 5-FU-B (comparativo)

19c denotado como 5-FU-C (de acuerdo con la invención)

29a denotado como 5-FU-D (de acuerdo con la invención) y

31a denotado como 5-FU-E (comparativo)

5-FU-A:

Ċ

5 Determinación de la viabilidad/supervivencia de 5-FU y derivados

1 x 104 HT-29 humanas en 100 |jl de medio/pocillo se sembraron en placas de 96 pocilios (BD Falcon™, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Alemania). Después de 24 h, se cambió el medio y se probaron diferentes concentraciones de moléculas derivadas de 5-fluorouracilo, 5-fluorouridina y 5-fluorouridina (10, 20, 40 u 80 jM). Después de 24, 48 o 72 h de incubación, la viabilidad/supervivencia se midió con el reactivo PrestoBlue™ (Invitrogen-Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemania). El reactivo PrestoBlue™ es más sensible que alamarBlue®, que es un indicador redox de la actividad enzimática ampliamente usado en la detección de la viabilidad/citotoxicidad de todo el organismo (1-6). PrestoBlue™ se añadió directamente a las células en el medio de cultivo a una concentración final del 10 %. En lo sucesivo las placas se devolvieron a la incubadora. 30 min, 1 h, 2 h, 3 h y 4 h después de la adición de PrestoBlue™ se midió la densidad óptica (DO) a 570 nm y 600 nm (como referencia) con un lector ELISA SUNRISE (Tecan, Salzburgo, Austria). Los resultados se expresan en % de supervivencia [DO 570/600 nm de muestras x 100/DO 570/600 nm de control sin sustancias)]. Como control (= 100 % de viabilidad) las células se cultivaron con medio solo (es decir, sin adición de sustancias de prueba). El software Sigma Plot se usó para llevar a cabo análisis estadísticos mediante la prueba t de Student no apareada. Los datos se presentan como la media ± SEM. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Pruebas oncológicas Los resultados se reflejan en las Figuras 6 a 8

Figura 6: Viabilidad/supervivencia de la línea celular de carcinoma de colon humano HT-29 después de 24 h de incubación con 5-fluorouridina (5-FU), sus derivados 5-FU-A, -B. -C, -D o -E o 5-fluorouracilo como control. Los valores se dan en % de supervivencia del control (sin tratamiento/medio solo; = 100 % de supervivencia), como media ± SEM; p, significancia frente al control sin tratamiento, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. N=4 experimentos independientes, usando 4-6 pocillos por tratamiento y experimento.

Figura 7: Viabilidad/supervivencia de la línea celular de carcinoma de colon humano HT-29 después de 48 h de incubación con 5-fluorouridina (5-FU), sus derivados 5-FU-A, -B. -C, -D o -E o 5-fluorouracilo como control. Los valores se dan en % de supervivencia del control (sin tratamiento/medio solo; = 100 % de supervivencia), como media ± SEM; p, significancia frente al control sin tratamiento, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. N=4 experimentos independientes, usando 4-6 pocillos por tratamiento y experimento.

Figura 8: Viabilidad/supervivencia de la línea celular de carcinoma de colon humano HT-29 después de 72 h de incubación con 5-fluorouridina (5-FU), sus derivados 5-FU-A, -B. -C, -D o -E o 5-fluorouracilo como control. Los valores se dan en % de supervivencia del control (sin tratamiento/medio solo; = 100 % de supervivencia), como media ± SEM; p, significancia frente al control sin tratamiento, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. N=4 experimentos independientes, usando 4-6 pocillos por tratamiento y experimento.

Como puede verse en los resultados de las pruebas oncológicas, los compuestos de la invención 29a y 31a demuestran una actividad significativamente mayor contra las células de carcinoma que los compuestos comparativos y la 5-fluorouridina y el 5-fluorouracilo.

La Figura 9 y la Figura 9b muestran la célula de difusión de Franz, que consiste en dos cámaras de Teflón de 1,5 ml de volumen cada una, usadas en las pruebas de difusión de Rodamina B a través de las láminas de quitosano de acuerdo con la invención como se describe anteriormente.

La Figura 10 muestra la superposición en serie de los espectros Vis del contenido de la célula aceptora después de pasar la lámina de quitosano del experimento J (Tabla 2).

La Figura 11 muestra la absorbancia de Rodamina B a 550 nm como una función del tiempo. Como puede observarse, en todos los casos se observó un aumento logístico. La duración de la fase de retraso está correlacionada con el grosor de las láminas.

Para todos los gráficos se calcularon las curvas de regresión así como las ecuaciones lineales de las tangentes en sus puntos de inflexión. Las pendientes de estas tangentes se definen como las tasas de difusión correspondientes. La Tabla 6 resume los resultados.

Tabla 6. Tasas de difusión de Rodamina B a través de láminas de quitosano. Las láminas de los experimentos K y T ___________________________ se fabricaron en presencia de polietilenglicol.___________________________

Lámina del experimento Velocidad de difusión [AA550/min]

J 0,0266

K 0,0346

Q 0,0457

T 0,0530

A partir de la Tabla 6 puede verse que la adición de polietilenglicol mejora significativamente la velocidad de difusión del colorante a través de la lámina de quitosano. Esto está en línea con los resultados de los microscopios electrónicas de trama que exhiben una estructura mucho más porosa de las láminas preparadas en presencia de PEG.

La figura 12 muestra los perfiles de HPLC RP-18 de las reacciones de hidrólisis de 28a en HCl acuoso/MeCN 1:1 (v/v). La zona de migración más rápida contiene siempre 5-fluorouridina pura, la zona de migración más lenta el cetal residual 28a. El valor de la semivida se calculó gráficamente a partir de una gráfica de la integral de pico de ambos, los cetales residuales y la 5-fluorouridina frente al tiempo de reacción (Figura 13). Tras la hidrólisis ácida solo se formaron el nucleósido y no 5-fluorouracilo.

La Figura 13 muestra el gráfico de las mediciones de HPLC de la figura 12 frente al tiempo. El valor de la semivida se calculó gráficamente a partir de la gráfica. Como puede observarse, la vida media del éster 28a en condiciones ácidas asciende a “ 300 min.

La Figura 14 muestra la degradación catalizada por quitosanasa de un conjugado de lámina de 5-FU-quitosano. La figura muestra la absorbancia (268 nm) del contenido de la célula aceptora de la célula de difusión (Figura 5) como una función del tiempo. La flecha indica la adición de una segunda porción de quitosanasa.

Como puede verse de la Figura 14, después de 4 días la absorbancia de la solución en la cámara receptora se volvió constante. En este momento se añadió una alícuota adicional de suspensión enzimática (5 jl), sobre el cual la absorbancia aumentó aún más. Este resultado podría deberse a una pérdida de actividad enzimática después del largo tiempo de reacción a 37 °C y/o por una inhibición significativa del producto de la enzima. Después de un tiempo de degradación total de 240 h, ambos compartimentos de la célula de difusión muestran la misma absorbancia a 268 nm, lo que indica el final de la reacción.

La Figura 15-1 muestra una lámina de quitosano según la presente invención, fabricada a partir de un material con un peso molecular de 20 - 200 kDa. Una inspección cualitativa desvela que la lámina es relativamente resistente a la tracción y al desgarro y presenta una baja rugosidad de la superficie.

La Figura 15-2 muestra una imagen REM de la lámina de quitosano que se muestra en la Figura 15-1.

La figura 16 muestra la imagen REM de una lámina de quitosano que se ha fabricado en presencia de PEG 6000.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto representado por la fórmula (I)

en donde X es un grupo de fórmula (III)

en donde R1 se selecciona entre H,

y

y

restos de terpeno cíclico, sustituido o sin sustituir,

en donde

R⁷ y R⁸ se selecciona independientemente entre alquilo C¹ a C³⁰,

n es un número entero que varía de 1 a 4; y

a es un número entero que varía de 1 a 20;

R² es H; o

R² es un monofosfato, difosfato, Tri-fosfato o resto fosforamidita; o

R² es -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

Y e Y¹ son independientemente uno del otro un enlace sencillo o un resto de conexión funcional seleccionado entre el grupo que consiste en éster de ácido carboxílico, amidas de ácido carboxílico, uretano, éter, grupo amino, éster de fosfato, tioéster, tioamidas y tioéter,

X es un compuesto coloidal activo (CA) seleccionado ente el grupo que consiste en amilasas, amilopectinas, acemannans, arabinogalactanos, galactomananos, galactoglucomananos, xantanos, carragenina, citosano, almidón, almidón modificado, ácido hialurónico y ácido hialurónico desacetilado, o

X es un marcador de fluorescencia (FA) seleccionado entre el grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina, rodamina y 2-aminopiridina, colorantes de carbocianina, colorantes bodipy y colorantes de cumarina o X es un resto polinucleotídico que tiene hasta 50 residuos de nucleótidos;

L es un enlazador por medio del cual Y y X están unidos covalentemente y es un resto que comprende de 1 a 30 átomos de carbono los cuales pueden estar saturados o insaturados, cíclicos o alicíclicos, ramificados o sin ramificar y los cuales pueden estar sustituidos o interrumpidos por heteroátomos;

R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ el cual opcionalmente puede estar sustituido o interrumpido por uno o más heteroátomos y/o uno o más seleccionados entre el grupo que consiste en: éster, amida, ácido carboxílico, tioéster, tioamidas y tioéter; o

R⁵ y R⁶ representan independientemente uno del otro un resto alquilo C¹-C²⁸ sustituidos con uno o más restos seleccionados entre el grupo -Y-X o -Y-L-Y¹-X;

con la condición de que el compuesto comprenda al menos dos cadenas, cada una de las cuales tiene 4 o más átomos de carbono.

2. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el átomo o átomos se seleccionan entre O, S y N.

3. Compuesto de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 o 2 en donde el resto L se selecciona entre alcandiilos C² a C²⁰.

4. El compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que dicho almidón modificado se selecciona entre el grupo que consiste en hidroxialquil almidones, almidones esterificados, almidones de carboxialquilo, almidón de hidroxialquil carboxialquilo, hidroxialquil almidón aminado, almidón de hidroxialquil carboxialquil aminado y carboxialquil almidón aminado.

5. El compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que dicho resto X como compuesto coloide activo tiene un peso molecular promedio de 20.000 a 800.000 Dalton.

6. Composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en una o más de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento del cáncer.

8. Proceso para preparar un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 representado por la fórmula (I)

en donde

R1 se selecciona entre

y

y

restos de terpeno cíclico, sustituido o sin sustituir,

en donde

R⁷ y R⁸ se selecciona independientemente entre alquilo Cⁱ a C³⁰,

n es un número entero que varía de 1 a 4; y

a es un número entero que varía de 1 a 20;

X es como se define en al menos una de las reivindicaciones anteriores que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar un compuesto de fórmula (IA) e introducir grupos protectores para grupos hidroxilo, si están presentes

b) convertir un alcohol de la fórmula R1-OH en una reacción de tipo Mitsunobu con el compuesto (IA) y c) retirar los grupos protectores, si están presentes.