ES2804251T3 - Conjugados y micelas de ácido oligoláctico con eficacia anticáncer mejorada - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o un derivado de paclitaxel en el que el ácido oligo-láctico comprende de 2 a 24 subunidades de ácido láctico y está unido a través de un enlace éster al oxígeno del 7-hidroxilo del paclitaxel o derivado de paclitaxel con actividad anti cáncer que retiene el esqueleto carbocíclico/oxetano del paclitaxel, pero contiene al menos una cadena lateral modificada distinta del 7-hidroxilo.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados y micelas de ácido oligoláctico con eficacia anticáncer mejorada
Campo
La presente divulgación se refiere a un conjugado de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o un derivado de paclitaxel, opcionalmente en combinación con inhibidores de mTOR, tales como la rapamicina y sus derivados, inhibidores de MEK, tales como selumetinib y derivados de los mismos.
Los conjugados se pueden formular en micelas sintéticas para proporcionar una solubilidad superior, menor toxicidad y/o eficacia mejorada en el tratamiento de cáncer en comparación con formulaciones estándar de paclitaxel, rapamicina, y/o selumetinib.
Antecedentes
El paclitaxel, la rapamicina y el selumetinib son agentes quimioterapéuticos potentes útiles en el tratamiento de una variedad de cánceres y tienen las estructuras que se muestran a continuación.
Figure imgf000002_0001
Debido a su limitada solubilidad en agua, medicamentos contra el cáncer tales como paclitaxel, rapamicina, y selumetinib se formulan comúnmente para la administración parenteral con vehículos especializados que incluyen disolventes tales como Cremophor® EL (CrEL), DMSO, y/o etanol. Tales disolventes no acuosos son a menudo indeseables desde el punto de vista de la tolerabilidad del paciente. Por ejemplo, se sabe que CrEL induce reacciones de hipersensibilidad y anafilaxia, y requiere tratamiento del paciente con antihistamínicos y esteroides antes de la administración. Las composiciones de micelas se han propuesto como vehículos de suministro alternativos más seguros para algunos fármacos citotóxicos poco solubles en agua. Sin embargo, tales composiciones a menudo sufren de baja carga de fármaco y poca estabilidad, lo que lleva a una biodistribución in vivo generalizada y una baja exposición tumoral al fármaco.
El documento US2011/143993 se refiere a péptidos que se unen selectivamente a antígenos expuestos en enfermedades o disfunciones vasculares, identificadas mediante selección por afinidad de una biblioteca de fagos. El documento US2011/143993 enseña que los ligandos son útiles cuando se unen a un sustrato para estar en contacto con superficies endoteliales, especialmente aquellas en las que se utiliza la administración de fármacos, como después de la angioplastia, con la liberación de un depósito de administración de fármacos en un dispositivo médico como un stent, o por administración intravenosa en forma de nanopartículas o micropartículas, para dirigir o aumentar la adhesión a las superficies endoteliales. La tecnología de nanopartículas se puede utilizar para tratar la vasculatura lesionada. El documento US2011/143993 enseña que las nanopartículas específicas también son útiles en el tratamiento de otras enfermedades y trastornos tales como enfermedades e indicaciones oncológicas y regenerativas.
Resumen de la invención
La presente tecnología proporciona conjugados de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel (o(LA)n-PTX) y derivados de paclitaxel (por ejemplo, docetaxel); El ácido oligoláctico comprende de 2 a 24 subunidades de ácido láctico y está unido a través de un enlace éster al oxígeno del 7-hidroxilo del paclitaxel o derivado de paclitaxel.
En varios aspectos, la presente tecnología proporciona conjugados de ácido oligoláctico y derivados de paclitaxel o paclitaxel, que tiene una mayor solubilidad y eficacia. Los conjugados proporcionados en el presente documento pueden formularse en micelas como composiciones farmacéuticas y medicamentos para su uso en el tratamiento del cáncer. También se proporciona el uso de los conjugados en la preparación de formulaciones farmacéuticas y medicamentos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra un esquema que ilustra el uso de conjugados de oligo(ácido láctico)n-paclitaxel de la presente tecnología con micelas de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(ácido láctico) (PEG-ó-PLA): carga, liberación y conversión de retroacción para la actividad anticancerígena. La figura 1B muestra un esquema químico que ilustra un probable mecanismo de degradación de retroacción para una realización ilustrativa de los presentes conjugados.
La figura 2A y 2B muestran cromatogramas de HPLC de fase inversa de conjugado (2A) o(LA)8-PTX y conjugado (2B) o(LA)16-PTXy sus productos de conversión de retroacción después de la incubación en 1:1 CH3CN/10 mM PBS a 37 °C, pH 7.4 a las 0, 4, 12, 96 y 168 horas.
La figura 3 proporciona un esquema sintético ilustrativo para producir conjugados o(LA)n-PTX.
La figura 4 muestra el curso temporal para la liberación in vitro de PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX a partir de micelas de PEG-ó-PLA (media DE, n=3).
La figura 5A y 5B muestran, respectivamente, un gráfico que muestra el curso de tiempo de la conversión del conjugado o(LA)8-PTX en o(LA)6-PTX, o(LA)4-PTX, o(LA)2-PTX, o(LA)r PTX y PTX (media DE, n=3) (5A) y un gráfico que muestra el curso temporal de la conversión del conjugado o(LA)16-PTX en o(LA)14-PTX, o(LA)12-PTX, o(LA)10-PTX, o(LA)8-PTX, o(LA)6-PTX, o(LA)4-PTX, o(LA)2-PTX, o(LA)1 -PTX y PTX (media DE, n=3) (5B).
La figura 6 muestra citotoxicidad in vitro de conjugados de PTX, o(LA)2-PTX, o(LA)8-PTX, y o(LA)16-PTX contra células de cáncer de pulmón no microcíticas A549 humanas. Columnas: media de determinaciones cuadruplicadas; barras, DE; **. p <0.01 para o(LA)8-PTX en comparación con PTX para formas libres y micelas.
La figura 7A muestra el curso temporal de la conversión del conjugado o(LA)8-PTX en micelas de PEG-b-PLA en o(LA)6-PTX, o(LA)4-PTX, o(LA)2-PTX y PTX (media DE, n=3).
La figura 7B muestra el curso temporal de la conversión del conjugado o(LA)16-PTX en micelas PEG-b-PLA en o(LA)14-PTX, o(LA)4-PTX, o(LA)12 -PTX y o(LA)10-PTX (media DE, n=3).
La figura 8A muestra la eficacia antitumoral in vivo del PTX u conjugado o(LA)8-PTX (20 mg/kg) como micelas PEG-b-PLA (carga del 9 %) en un modelo de tumor de xenoinjerto A549. Los ratones recibieron 3 inyecciones semanales seguidas de una semana de descanso durante 3 ciclos (media EEM, n = 3-4). Barras, SEM; ***, p <0.001, y la FIG.
8B muestra el peso corporal relativo de ratones tratados con PTX u conjugado o(LA)8-PTX (20 mg/kg) como micelas PEG-b-PLA (carga del 9 %). Barras: SEM; **, p <0.01.
La figura comparativa 9A proporciona un esquema sintético ilustrativo para producir conjugados o(LA)n-RAP. La FIG. Comparativa 9B proporciona un esquema sintético ilustrativo para producir conjugados o(LA)n-SEL.
La figura comparativa 10Ay 10B muestran cromatogramas de HPLC de fase inversa de o(LA)8-RAP conjugado (10A) y o(LA)8-SEL conjugado (10B) (0.5 mg/ml) y sus productos de conversión de retroacción tras incubación en 1:1 CH3CN/PBS 10 mM a 37 °C, pH 7.4 a intervalos de tiempo predeterminados durante 168 horas.
La figura comparativa 11A y 11B muestran respectivamente, un gráfico que muestra el curso de tiempo de la conversión del conjugado o(LA)8-RAP en o(LA)6-RAP, o(LA)4-RAP, o(LA)2-RAP y RAP (media DE, n=3) (11A) y un gráfico que muestra el curso de tiempo de la conversión del conjugado o(LA)8-SEL en o(LA)6-SEL, o(LA)4-SEL, o(LA)2-SEL y SEL (media DE, n=3) (11B).
La figura comparativa 12A muestra citotoxicidad in vitro de micelas RAP y micelas de conjugado de o(LA)8-RAP (12A) contra células de cáncer de pulmón no microcíticas A549 humanas. La figura 12B muestra citotoxicidad in vitro de SEL, conjugado o(LA)8-Sel, y micelas de conjugado o(LA)8-RAP (12b) contra las células no microcíticas humanas A549 de cáncer de pulmón.
Descripción detallada
Los siguientes términos se usan a lo largo de la especificación como se define a continuación.
Tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, los artículos singulares tales como “un” y “una” y “el” y referentes similares en el contexto de la descripción de los elementos (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) han de ser interpretado para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. La mención de los rangos de valores en el presente documento solo pretende servir como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique lo contrario en el presente, y cada valor por separado se incorpora a la especificación como si se mencionara individualmente en el presente. Todos los métodos descritos en este documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en este documento, tiene la intención de iluminar mejor las realizaciones y no plantea una limitación en el alcance de las reivindicaciones a menos que se indique lo contrario. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica que cualquier elemento no reclamado es esencial.
Como se usa en el presente documento, “aproximadamente” será entendido por las personas de experiencia ordinaria en la técnica y variará en cierta medida dependiendo del contexto en el que se utiliza. Si hay usos del término que no son claros para las personas con habilidades ordinarias en la técnica, dado el contexto en el que se usa, “aproximadamente” significará hasta más o menos 10 % del término particular.
La presente tecnología proporciona composiciones farmacéuticas y medicamentos que comprenden cualquiera de una de las realizaciones de los compuestos (fármacos y/o conjugados de fármacos) y las micelas divulgadas en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable o uno o más excipientes. Las composiciones pueden usarse en los métodos divulgados en este documento y las composiciones pueden usarse en los tratamientos divulgados en este documento. La composición farmacéutica puede incluir una cantidad efectiva de cualquiera de una de las realizaciones de los compuestos de la presente tecnología divulgada en el presente documento. En cualquiera de las realizaciones anteriores, la cantidad efectiva puede determinarse en relación con un sujeto. “Cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de un compuesto, conjugado, micela o composición requerida para producir un efecto deseado. Un ejemplo de una cantidad efectiva incluye cantidades o dosis que producen niveles aceptables de toxicidad y biodisponibilidad para uso terapéutico (farmacéutico) que incluyen, entre otros, el tratamiento de cánceres o enfermedades cardiovasculares como la reestenosis. Como se usa en este documento, un “sujeto” o “paciente” es un mamífero, como un gato, un perro, un roedor o un primate. Típicamente, el sujeto es un ser humano y, preferiblemente, un ser humano que padece un cáncer sensible al paclitaxel, es decir, un cáncer capaz de tratamiento con una cantidad eficaz de paclitaxel. Los términos “sujeto” y “paciente” se pueden utilizar indistintamente.
La presente tecnología proporciona conjugados de ácido oligoláctico con derivados de paclitaxel y paclitaxel. Como se usa en el presente documento, un “derivado de paclitaxel” es un compuesto que retiene el esqueleto carbocíclico/oxetano de paclitaxel (es decir, el esqueleto de taxano) pero contiene al menos una cadena lateral modificada distinta del 7-hidroxilo. Los derivados de paclitaxel de la presente tecnología exhiben actividad anticancerígena. Por ejemplo, docetaxel es un derivado de paclitaxel que contiene una modificación de la cadena lateral C-13 en la que el t-butiloxicarbonilamino reemplaza al benzamido en la posición 3'. Los expertos en la técnica conocen otros derivados de paclitaxel e incluyen, entre otros, los descritos en Farina, V., “The chemistry and pharmacology of Taxol and its derivatives”, Elsevier, Nueva York, 1995. Los presentes conjugados y las micelas exhiben una solubilidad, estabilidad y eficacia anticancerígenas mejoradas en comparación con los derivados de paclitaxel y paclitaxel no conjugados. La figura 1A ilustra esquemáticamente para una realización de la presente tecnología los conjugados de ácido oligoláctico, su carga y liberación de micelas y la posterior degradación de los conjugados para proporcionar paclitaxel.
Como se usa en este documento, un “derivado de rapamicina” o “rapálogo” es un compuesto que retiene el anillo de lactona macrocíclico de la rapamicina, pero contiene al menos una cadena lateral modificada al tiempo que conserva un grupo hidroxilo libre en la posición C-40 o un hidroxilo libre unido a una cadena lateral modificada unida a la posición C-40 (por ejemplo, everolimus). Los derivados de rapamicina divulgados en el presente documento inhiben la actividad anticancerígena. Por ejemplo, everolimus es un derivado de rapamicina con la estructura a continuación. Los expertos en la técnica conocen otros derivados de la rapamicina e incluyen, entre otros, los descritos en Wander, S., et al., “Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology: how pathway complexity informs therapeutic strategy”, J Clin. Invest., 121 (4), 1231-1241 (2011). Los presentes conjugados y micelas exhiben una solubilidad, estabilidad y eficacia anticancerígenas mejoradas en comparación con la rapamicina y los derivados de rapamicina no conjugados. Similar al comportamiento de los conjugados de paclitaxel C-7 de ácido oligoláctico, los conjugados de ácido oligoláctico C-40 de rapamicina y sus derivados pueden ser cargados y liberados de las micelas y degradarse para proporcionar rapamicina o derivados de rapamicina.
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Como se usa en el presente documento, un “derivado selumetinib” es un compuesto que conserva el sistema de anillo 6,5-fusionado de selumetinib, pero contiene al menos una cadena lateral modificada al tiempo que conserva un grupo hidroxilo libre en la posición C-2' (por ejemplo, binimetinib, GDC-0623 y ARRY-300). Los derivados de selumetinib divulgados en este documento exhiben actividad anticancerígena. Por ejemplo, binimetiniby GDC-0623 son derivados de selumetinib con las siguientes estructuras. Los expertos en la materia conocen otros derivados de selumetinib e incluyen, entre otros, los descritos en Jokinen, E. y col., “MEK and PI3K inhibition in solid tumors: rationale and evidence to date”, Ther. Adv. Medicina. Oncol., 7 (3), 170-180 (2015). Los presentes conjugados y micelas exhiben una mayor solubilidad, estabilidad y eficacia anticancerígena en comparación con los derivados selumetinib y selumetinib no conjugados. Similar al comportamiento de los conjugados de ácido oligoláctico C-7 paclitaxel, los conjugados de ácido oligoláctico C-2' de selumetinib y sus derivados pueden cargarse y liberarse de las micelas y degradarse para proporcionar selumetinib o derivados de selumetinib.
Figure imgf000005_0002
En los presentes conjugados, ácido oligoláctico es un poliéster lineal de ácido láctico y está unido a través de un enlace éster al oxígeno del 7-hidroxilo del paclitaxel o derivado de paclitaxel (en el presente documento el “conjugado de ácido 7-oligoláctico”), En tales conjugados de ácido oligoláctico, el ácido oligoláctico incluye 2 a 24 subunidades de ácido láctico. Los expertos en la materia entenderán que los presentes conjugados pueden tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 subunidades de ácido láctico o un rango de subunidades entre cualquiera de los dos valores anteriores. Por ejemplo, el ácido oligoláctico puede incluir de 4 a 20, de 6 a 18 o de 2 a 10 subunidades de ácido láctico. En algunas realizaciones, los conjugados tienen la estructura que se muestra en la fórmula I:
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en donde n en cada aparición es individualmente un número entero de 2 a 24 o un rango entre e incluyendo dos valores seleccionados de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24. En algunas realizaciones, n en cada aparición es individualmente un número entero de 4 a 20. En algunas realizaciones, n en cada aparición es individualmente un número entero de 6 a 18. En algunas realizaciones, el ácido oligoláctico es ácido D, L-oligoláctico. En otros es ácido L-oligoláctico, y en otros, es ácido D-oligoláctico.
Los conjugados de la presente tecnología sirven ventajosamente como profármacos para paclitaxel in vivo. En condiciones que imitan a las condiciones in vivo, es decir, un pH casi neutro, la cadena lateral de ácido oligoláctico se autodegrada predominantemente de forma controlada por etapas en lugar de por hidrólisis aleatoria y es independiente de, por ejemplo, esterasas. Si bien no desea estar limitado por la teoría, como se muestra en la FIG. 1B, se cree que la degradación de los conjugados se produce por un mecanismo de “retroacción” en el que el grupo hidroxilo libre en el extremo del ácido oligoláctico ataca el enlace éster formado por el carbonilo de la subunidad de ácido láctico adyacente. De esta manera, los dímeros de lactoillactato se liberan hasta que solo una o dos subunidades de ácido láctico permanecen unidas al fármaco/derivado del fármaco; Las últimas dos subunidades están sujetas a una retroacción lenta y solo se hidrolizan lentamente con el tiempo. Este mecanismo escalonado es coherente con los perfiles de HPLC observados para la in vitro degradación con el tiempo de o(LA)a-PTX y o(LA)16-PTX (véanse las figuras 2A y 2B), o(LA)8-RAP (ver la figura comparativa 10A), y o(LA)8-SEL (ver la figura comparativa 10B).
El conjugado de ácido 7-oligoláctico divulgado en el presente documento puede prepararse poniendo en contacto paclitaxel o un derivado de paclitaxel que tiene un grupo 7-hidroxilo libre con un agente de acoplamiento y un ácido oligoláctico mono-O-sililado tiene de 2 a 24 subunidades de ácido láctico. A modo de ejemplo solamente, la FIG. 3, muestra realizaciones ilustrativas de métodos para preparar los presentes conjugados. En la Fig. 3, el 2'-hidroxilo de paclitaxel se protege haciendo reaccionar paclitaxel con un agente de sililación tal como cloruro de t-butildimetilsililo, opcionalmente en presencia de un catalizador tal como imidazol en un disolvente aprótico polar tal como DMF. El paclitaxel protegido se acopla a un intermedio de ácido oligoláctico protegido con hidroxilo usando un reactivo de acoplamiento en un disolvente orgánico adecuado. De manera similar, en las FIGS 9A y 9B comparativas, la rapamicina y el selumetinib se acoplan a un intermedio de ácido oligoláctico protegido con hidroxilo usando un reactivo de acoplamiento en un disolvente orgánico adecuado. Los agentes de acoplamiento adecuados incluyen carbodiimidas tales como DCC y EDCI. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen disolventes halogenados (por ejemplo, diclorometano, cloroformo), acetato de alquilo (por ejemplo, acetato de etilo) u otro disolvente aprótico polar (por ejemplo, DMF). La reacción de acoplamiento típicamente también incluirá un catalizador tal como 4-(dimetilamino)-piridinio p-toluenosulfonato (DPTS) o 4-(dimetil-amino)piridina (DMAP). En algunas realizaciones, el ácido oligoláctico protegido con hidroxilo es ácido oligoláctico O-sililado, por ejemplo, O-t-butildimetilsililo (OTBS) o ácido oligoláctico O-trietilsililo (OTES). Si bien pueden usarse otros grupos protectores de hidroxilo conocidos, los grupos sililo en el hidroxilo de paclitaxel 2' y en el hidroxilo de oligolactida se eliminan convenientemente con fluoruro. Por ejemplo, la FIG. 3 muestra que la desprotección de los grupos TBS con fluoruro de tetrabutilamonio en ácido acético y THF proporciona el conjugado deseado y las FIGS comparativas. 9A y 9B muestran que la desprotección del grupo TES con ácido fluorhídrico y piridina proporciona los conjugados.
El ácido oligoláctico mono-O-sililado monodisperso puede prepararse usando métodos conocidos tales como la apertura del anillo de lactida cíclica (incluida la L-lactida cíclica) seguido de secuencias de protección-acoplamientodesprotección para proporcionar oligómeros monofuncionales, por ejemplo, usando éter TBS o Éter TES y éster bencílico como grupos protectores para grupos hidroxilo y ácido carboxílico, respectivamente. Otros agentes de cloruro de triorganosililo adecuados pueden ser utilizados en lugar de cloruro de t-butildimetilsililo y trietilclorosilano, tal como, pero no limitados a, cloruro de trimetilsililo, i-propil-dimetilclorosilano, clorotribenzilsilano, clorotributilsilano, clorotriisopropilsilano, clorotrihexilsilano, clorotriisobutilsilano y clorotrifenilsilano. Además del éster bencílico, o cualquier éster ortogonal a los grupos sililo también se puede usar. Alternativamente, los ácidos oligolácticos monodispersos pueden prepararse mediante técnicas de polimerización tradicionales seguidas de separación por cromatografía en columna de fase inversa o filtración en gel.
Se divulgan en el presente documento composiciones acuosas de micelas formadas a partir de agua; polímeros que contienen ácido poliláctico; y la combinación de 3 fármacos de un derivado de paclitaxel/paclitaxel libre, un derivado de rapamicina/rapamicina libre y un derivado de selumetinib/selumetinib libre. Como se usa en el presente documento, el término “ libre” se refiere al fármaco no conjugado/derivados del fármaco. Dichas micelas son típicamente más estables que las micelas correspondientes cargadas individualmente con derivados de paclitaxel/paclitaxel libres, derivados de rapamicina/rapamicina libres o derivados de selumetinib/selumetinib libres (véasela Tabla 2).
Las micelas, que incluyen la combinación de 3 fármacos de paclitaxel libre/derivado de paclitaxel, rapamicina libre/rapamicina derivado, y un derivado libre selumetinib/selumetinib son capaces de mayor carga de fármaco que cuando los fármacos libres/derivados de fármacos se cargan solo (ver Tablas 1-2). Por ejemplo, el selumetinib libre se carga solo en micelas a solo aproximadamente 1 % en peso y precipita después de un corto período de tiempo (aproximadamente 5 minutos). Por el contrario, el selumetinib libre cargado en micelas con paclitaxel libre y rapamicina libre tiene una carga de fármaco de más del 6 % en peso con una mayor estabilidad de las micelas (ver Tablas 1 y 2). En algunas realizaciones, la carga de derivados de paclitaxel/paclitaxel libres puede ser de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 10 % en peso, incluyendo aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 6 % en peso con respecto a la masa de las micelas. En algunas realizaciones, la carga de rapamicina/derivados de rapamicina libres puede ser de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 10 % en peso, incluyendo aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 4 % en peso con respecto a la masa de las micelas. En algunas realizaciones, la carga de derivados de selumetinib/selumetinib libres puede ser de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 10 % en peso, incluyendo aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 8 % en peso con respecto a la masa de las micelas. Los ejemplos de carga de fármaco libre total en las micelas pueden ser de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, incluyendo aproximadamente 7 % en peso, aproximadamente 10 % en peso, aproximadamente 13 % en peso, aproximadamente 15 % en peso, aproximadamente 18 % en peso, con respecto a la masa de las micelas, o un rango entre e incluyendo cualquiera de los dos valores anteriores.
En otro aspecto, la presente tecnología proporciona composiciones acuosas de micelas formadas a partir de agua, los polímeros que contienen ácido poliláctico y el paclitaxel/conjugados derivados de paclitaxel divulgados en este documento. Opcionalmente, las composiciones acuosas también comprenden conjugados de rapamicina/derivado de rapamicina, y/o conjugados de selumetinib/derivado de selumetinib. Tales micelas son generalmente más estables que las micelas correspondientes con el fármaco libre/derivados del fármaco. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 4, las micelas formadas a partir de ácido poli(etilenglicol)-Wogue-poliláctico y uno de o(LA)s -PTX u o(LA)16-PTX, liberan los conjugados mucho más lentamente que liberan paclitaxel libre. En algunas realizaciones, la presente tecnología proporciona composiciones acuosas de micelas formadas a partir de agua, polímeros que contienen ácido poliláctico y la combinación de 3 fármacos de un conjugado derivado de paclitaxel/paclitaxel, un conjugado derivado de rapamicina/rapamicina y un conjugado selumetinib/derivado de selumetinib.
En algunas realizaciones de la presente tecnología, las micelas incluyen el copolímero de bloques, PEG-6-PLA (también conocido como PEG-PLA). El bloque de poli (ácido láctico) puede incluir (ácido D-láctico), (ácido L-láctico), (ácido D,L-láctico) o combinaciones de los mismos. Varias formas de PEG-6-PLA están disponibles comercialmente, tales como Polymer Source, Inc., Montreal, Quebec, o pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos en la materia. El peso molecular del bloque de poli(etilenglicol) puede ser de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 35.000 g/mol, o cualquier incremento de aproximadamente 500 g/mol dentro de dicho intervalo. (Todos los pesos moleculares de polímeros a los que se hace referencia en este documento se entenderán como pesos moleculares promedio en peso). Por ejemplo, el peso molecular del bloque PEG puede ser 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000,7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16.000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30.000, 31,000, 32,000, 33,000, 34,000, 35,000 o un rango entre e incluyendo cualquiera de los dos valores anteriores. Los bloques adecuados del poli (ácido láctico) pueden tener pesos moleculares de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15,000 g/mol, o cualquier incremento de aproximadamente 500 g/mol dentro de dicho intervalo. Por ejemplo, el peso molecular del bloque PeG puede ser 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6.000, 6,500, 7,000, 7,5000, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13.000. 13.500.14.000.14.500.15.000, o un rango entre cualquiera de los dos valores anteriores. El bloque PEG puede terminar en un grupo alquilo, tal como un grupo metilo (por ejemplo, un metoxi éter) o cualquier grupo protector, de protección o de bloqueo adecuado. En algunas realizaciones, el peso molecular del bloque de poli(etilenglicol) de PEG-6-PLA es de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 35.000 g/mol y el peso molecular del bloque de poli(ácido láctico) de PEG-6-PLA es de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 15,000 g/mol. En algunas realizaciones, el peso molecular del bloque de poli(etilenglicol) es de aproximadamente 1,500 a aproximadamente 14.000 g/mol, y el peso molecular del bloque de poli(ácido láctico) es de aproximadamente 1,500 a aproximadamente 7.000 g/mol.
Las micelas de la presente divulgación se pueden preparar usando polímeros PEG-6-PLA de una variedad de tamaños de bloque (por ejemplo, un tamaño de bloque dentro de un intervalo descrito anteriormente) y en una variedad de proporciones. Por ejemplo, la relación PEG:PLA puede ser de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, o cualquier relación de enteros dentro de dicho rango, incluidos, entre otros, 1:5, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1 y 5:1. Por ejemplo, los pesos moleculares promedio en peso (Ma ) de los polímeros PEG-PLA pueden incluir, entre otros, 2K-2K, 3K-5K, 5K-3K, 5K-6K, 6K-5K, 6K-6K, 8K-4K, 4K-8K, 12K-3K, 3K-12K, 12K-6K, 6K-12K (PEG-PLA, respectivamente) o un rango entre cualquiera de los dos valores anteriores.
Un polímero PLA que contiene adecuado es un PEG-PLA que incluye bloques de alrededor de 1-3 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2K Daltons) en una relación aproximada de 50:50. El uso de este procedimiento dio como resultado altos niveles de carga de fármaco-conjugado en las micelas. Otros ejemplos específicos de pesos moleculares de PEG-PLA incluyen 4.2K-b-1.9K; 5K-b-10K; 12K-b-6K; 2K-b-1.8K, y los descritos en los ejemplos a continuación. Otros copolímeros de bloques amfifílicos adecuados que pueden usarse se describen en la patente de EE.UU. Nos.
4,745,160 (Churchill et al.) Y 6.322.805 (Kim et al.). La relación de fármaco a polímero puede ser de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 2:1, o cualquier relación entera dentro de dicho intervalo. Los ejemplos específicos de relaciones adecuadas de fármaco-polímero incluyen, pero sin limitación, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:2, aproximadamente 1.2:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 3:5, aproximadamente 2:5, aproximadamente 1:2, alrededor de 1:5; aproximadamente 1:7.5; aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:20 o un rango entre e incluyendo cualquiera de los valores anteriores.
Las micelas de la presente tecnología se pueden cargar con una amplia gama de cantidades, incluyendo cantidades elevadas, de los conjugados descritos en este documento, especialmente en comparación con las mismas micelas con conjugados de fármaco libre/fármaco solo. Por ejemplo, la carga de los conjugados puede ser de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 60 % en peso con respecto a la masa de las micelas. Los ejemplos de carga de conjugado en las micelas incluyen aproximadamente 3 % en peso, aproximadamente 4 % en peso, aproximadamente 5 % en peso, aproximadamente 10 % en peso, aproximadamente 15 % en peso, aproximadamente 20 % en peso, aproximadamente 25 % en peso, aproximadamente 30 % en peso, aproximadamente 35 % en peso, aproximadamente 40 % en peso, aproximadamente 45 % en peso, aproximadamente 50 % en peso, aproximadamente 55 % en peso, o aproximadamente 60 % en peso con respecto a la masa de las micelas, o un rango entre dos de los valores anteriores. En algunas realizaciones, la carga del conjugado de ácido 7-oligoláctico (de paclitaxel/derivado de paclitaxel) puede ser de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, incluyendo aproximadamente 8 % en peso a aproximadamente 55 % en peso, la carga de conjugado de ácido 40-oligoláctico (de rapamicina/derivado de rapamicina) puede ser de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, incluyendo aproximadamente 7 % en peso a aproximadamente 45 % en peso, y/o la carga del conjugado de ácido 2'-oligoláctico (de selumetinib/selumetinib derivado) puede ser de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 30 % en peso incluyendo aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 25 % en peso.
La carga de cada conjugado en las micelas también puede expresarse en términos de concentración. Por ejemplo, la concentración de cada conjugado puede ser de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml con respecto al volumen de agua en la composición. Los ejemplos de cada concentración de conjugado que puede obtenerse con la presente tecnología incluyen aproximadamente 0.6, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 35 m g/m l, 0 aproximadamente 40 mg/ml con respecto al volumen de agua en la composición, o un rango entre e incluyendo cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas realizaciones, la concentración del conjugado de ácido 7-oligoláctico puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mg/ml o incluso de aproximadamente 2 a aproximadamente 12 mg/ml, la concentración del conjugado de ácido 40-oligoláctico puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/ml o incluso aproximadamente 1.5 a aproximadamente 10 mg/ml, y/o la concentración del conjugado de ácido 2'-oligoláctico puede ser de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 15 mg/ml o incluso de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/ml.
La carga de cada conjugado en las micelas también se puede expresar en términos de eficiencia de carga. Por ejemplo, la eficiencia de carga de cada conjugado puede ser de aproximadamente 25 % en peso a aproximadamente 100 % en peso con respecto a la masa de las micelas. Los ejemplos de eficiencia de carga conjugada en las micelas incluyen aproximadamente 30 % en peso, aproximadamente 35 % en peso, aproximadamente 40 % en peso, aproximadamente 45 % en peso, aproximadamente 50 % en peso, aproximadamente 55 % en peso, aproximadamente 60 % en peso, aproximadamente 65 % en peso, aproximadamente 70 % en peso, aproximadamente 75 % en peso, aproximadamente 80 % en peso, aproximadamente 85 % en peso, aproximadamente 90 % en peso, aproximadamente 95 % en peso, aproximadamente 99 % en peso, o aproximadamente 100 % en peso con respecto a la masa de las micelas, o un rango entre e incluyendo cualquiera de los dos valores anteriores. En algunas realizaciones, la eficiencia de carga del conjugado de ácido 7-oligoláctico puede ser al menos aproximadamente 85 % en peso, incluyendo aproximadamente 90 % en peso a aproximadamente 100 % en peso, la eficiencia de carga del conjugado de ácido 40-oligoláctico puede ser de al menos aproximadamente 75 % en peso % que incluye de aproximadamente 80 % en peso a aproximadamente 90 % en peso, y/o la eficacia de carga del conjugado de ácido 2'-oligoláctico puede ser al menos aproximadamente 25 % en peso que incluye de aproximadamente 30 % en peso a aproximadamente 55 % en peso.
En algunas realizaciones, la presente tecnología proporciona composiciones que comprenden agua y una micela incluyendo PEG-b-PLAy el conjugado de ácido 7-oligoláctico de un paclitaxel o un derivado de paclitaxel se divulga en el presente documento, en el que la carga del conjugado de ácido 7-oligoláctico en la micela es de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, con respecto a la masa de las micelas; el peso molecular del bloque de poli(etilenglicol) del PEG-b-PLA es de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 14.000 g/mol; y el peso molecular del poli(ácido láctico) bloque del PEG-b-PLA es de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 7.000 g/mol. Opcionalmente, las composiciones también pueden comprender uno o más de los conjugados de ácido 40-oligoláctico y los conjugados de 2'-oligoláctico descritos en el presente documento, en el que la carga del conjugado de ácido 40-oligoláctico es de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso; y/o la carga del conjugado de ácido 2'-oligoláctico es de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 30 % en peso con respecto a la masa de las micelas. Dichas composiciones pueden incluir cualquiera de las cargas de fármaco descritas en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, o aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mg/ml o incluso aproximadamente 2 a aproximadamente 12 mg/ml de cualquiera de los 7 conjugados de ácido oligoláctico; aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, o aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/ml o incluso aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mg/ml de cualquiera de los conjugados de ácido 40-oligoláctico; y aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, o aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mg/ml o incluso aproximadamente 2 a aproximadamente 15 mg/ml de cualquiera de los conjugados de ácido 2'-oligoláctico; En algunas realizaciones, la composición puede incluir cualquiera de los conjugados de ácido 7-oligoláctico, como se describe en el presente documento. La composición también puede incluir opcionalmente uno o más de los conjugados de ácido 40-oligoláctico, y los conjugados de ácido 2'-oligoláctico divulgados en el presente documento.
Cadenas individuales amfifílicas de polímeros amfifílicos presentes en un disolvente en una cantidad por encima de la concentración micelar crítica (CMC) agregado en una micela, una estructura de núcleo-coronal con un interior hidrófobo y exterior hidrófilo o cubierta. Los estudios espectroscópicos de RMN de protón de fármacos o conjugados de micelas de PEG-b-PLA cargadas que, si bien las micelas se forman fácilmente en entornos acuosos, se descomponen en disolventes orgánicos como DMSO. Las presentes composiciones de micelas típicamente están sustancialmente libres de solventes orgánicos, por ejemplo, menos de aproximadamente 2 % en peso de etanol, dimetilsulfóxido, aceite de ricino y derivados del aceite de ricino (es decir, compuestos de alcanfor polietoxilados tales como Cremophor EL) basado en el peso de la composición. En algunas realizaciones, la cantidad de disolvente orgánico es inferior a aproximadamente 1 % en peso, inferior a aproximadamente 0.5 % en peso, inferior a aproximadamente 0.1 % en peso o esencialmente libre de cantidades detectables de disolventes orgánicos.
Las micelas de PEG-b-PLA se pueden preparar como se describe a continuación en esta sección, así como a continuación en los Ejemplos. La composición de micelas descritas en el presente documento puede prepararse combinando agua con una mezcla de un polímero que contiene ácido poliláctico y la combinación de 3 fármacos/derivado de fármaco de paclitaxel, rapamicina y selumetinib. En otra realización, la composición de micelas descritas en el presente documento puede prepararse combinando agua con una mezcla de un polímero que contiene ácido poliláctico y al menos uno de los conjugados de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o derivado de paclitaxel descrito en este documento. En algunas realizaciones, el polímero que contiene ácido poliláctico es PEG-b-PLA.
Los procedimientos dados a continuación son solamente ilustrativos. Cada uno puede variarse de acuerdo con la escala de preparación deseada, como reconocería fácilmente un experto en la materia. Una ventaja de los Procedimientos preparatorios A, B y D es que no requieren diálisis de una solución de micelas, como en el Procedimiento C. Otros procedimientos que pueden usarse incluyen emulsiones de aceite en agua y los descritos por Gaucher et al., J. Controlled Release, 109 (2005) 169-188.
Procedimiento preparatorio A: equilibrio simple. En una realización, la preparación de micelas se puede llevar a cabo como sigue. El PEG-b-PLA y al menos uno de los conjugados de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o derivado de paclitaxel como se describe en este documento se disuelve en un disolvente miscible en agua adecuado, como acetonitrilo o dimetilacetamida, con mezcla y/o sonicación opcional. El (los) conjugado(s) pueden estar monodispersados con respecto al ácido oligoláctico o pueden tener una gama de ácidos oligolácticos de diferentes longitudes. Luego se elimina el disolvente, por ejemplo, a presión reducida para proporcionar una película delgada de fármaco polimérico. Se agrega agua estéril tibia (aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C) a la película de conjugado polímero-fármaco y la mezcla se deja enfriar. Los conjugados que encapsulan las micelas poliméricas se forman tras la adición de agua tibia y luego se pueden aislar, por ejemplo, por filtración.
Procedimiento preparatorio B: equilibrio simple. Al menos uno de los conjugados de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o derivado de paclitaxel como se describe en este documento y PEG-b-PLA (en una proporción de, por ejemplo 1:7 a 1:10) se disuelve en 2.5-5 ml de acetonitrilo. La mezcla se mezcla y se somete a sonicación durante cinco minutos. Luego se elimina el solvente por evaporación rotatoria a aproximadamente 60°C para proporcionar una película. Se agrega agua caliente desionizada (~60 °C) al aceite y la solución se deja enfriar a ~23°C. La solución se centrifuga para eliminar el sedimento en un microtubo de 1.5 ml, a -15,000 rpm durante - 5 minutos. El sobrenadante se recoge y se filtra a través de un filtro PTFE de 0.2 |im de. Las micelas aisladas se pueden almacenar durante largos períodos de tiempo a 4 °C.
Procedimiento preparatorio C: diálisis. En otra realización, las micelas pueden cargarse y formarse mediante el siguiente procedimiento de diálisis. El PEG-b-PLA y al menos uno de los conjugados de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o derivado de paclitaxel como se describe en el presente documento de la proporción deseada (por ejemplo, que varía de 1:20 a 20:1) se disuelven en un disolvente miscible en agua, tal como dimetilacetamida. La mezcla se agrega luego a una solución acuosa, como una solución salina al 0.9 %, en una bolsa de diálisis de tubo de 3500 MWCO (Spectra/Por®), con lo cual se forman las micelas, incorporando el (los) conjugado(s) del fármaco. La mezcla de micelas se puede centrifugar (por ejemplo, a -16,000 rpm durante 5 minutos) para precipitar cualquier conjugado(s) de fármaco no incorporado. El sobrenadante puede luego nanofiltrarse, y el análisis puede llevarse a cabo usando HPLC, tal como con los modos de detección UV y RI (véanse las técnicas descritas por Yasugi et al., J. Control. Release, 1999, 62, 99-100).
Procedimiento preparatorio D: liofilización. Al menos uno de los conjugados de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o derivado de paclitaxel como se describe en este documento cargado en una micela de PEG-b-PLA se puede preparar por liofilización de una mezcla de tertbutanol-agua. Por ejemplo, 2-20 mg de PEG4000-b-PLA2200 (Advanced Polymer Materials Inc., Montreal, Canadá) y 1.0 mg de uno o varios conjugados como se describe en este documento se pueden disolver en 1.0 ml de tert-butanol a 60 °C, seguido de la adición de 1.0 ml de agua doblemente destilada precalentada a 60 °C con agitación vigorosa. La mezcla se deja congelar en hielo seco/baño de enfriamiento con etanol a -70 °C. La liofilización se puede realizar en un liofilizador de estante a -20 °C de temperatura de entrada del estante durante 72 h a 100 mBar durante todo el experimento. La torta liofilizada puede rehidratarse con 1.0 ml de solución salina al 0.9 % a 60 °C, centrifugarse, filtrarse a través de un filtro de 0.22 |im de celulosa regenerada y analizarse por HPLC.
De manera similar, las micelas PEG-b-PLA cargadas con fármacos libres se pueden preparar como se describe en cualquiera de los Procedimientos preparatorios AD, así como a continuación en los Ejemplos sustituyendo el conjugado(s) con la combinación de 3 fármacos libres de paclitaxel/derivado de paclitaxel, rapamicina/derivado de rapamicina y selumetinib/derivado de selumetinib.
Una vez preparadas, las composiciones de conjugado de micelas o fármacos de micelas pueden almacenarse durante períodos prolongados de tiempo bajo refrigeración, preferiblemente a una temperatura inferior a aproximadamente 5 °C. Se han mantenido temperaturas entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente 4 °C. Se encontró que son condiciones adecuadas para el almacenamiento de la mayoría de las composiciones de fármaco-micelas y conjugado de micelas. Por ejemplo, las soluciones acuosas de las presentes micelas cargadas con conjugado pueden almacenarse a aproximadamente 4 °C. Las composiciones de micelas liofilizadas como se describen en la presente memoria pueden almacenarse a -20 °C durante períodos prolongados y luego rehidratarse. El uso de viales de vidrio marrón u otros recipientes opacos para proteger las composiciones de micelas de la luz puede extender aún más la vida útil efectiva de las composiciones.
En otro aspecto, la presente tecnología proporciona métodos para inhibir o matar células cancerosas sensibles al paclitaxel o un derivado de paclitaxel, que comprende poner en contacto las células in vitro con una cantidad inhibidora o letal efectiva de cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento. También se proporciona una cantidad efectiva de una composición que comprende agua y una micela que comprende un polímero que contiene ácido poliláctico y el conjugado de ácido 7-oligoláctico divulgado en el presente documento para su uso en el tratamiento de un cáncer sensible al paclitaxel o un derivado de paclitaxel. Ejemplos de paclitaxel sensible, los cánceres incluyen tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, angiosarcoma y leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama o cáncer de pulmón. En algunas realizaciones, las cantidades efectivas de dos o tres fármaco/derivado de fármaco o conjugado de fármaco/derivado de fármaco como se divulga en el presente documento son sinérgicas, por ejemplo, tienen un efecto más que aditivo o producen efectos que no pueden producirse por un fármaco o un conjugado de fármaco solo.
En cualquiera de las realizaciones de la presente tecnología descrita en el presente documento, la composición farmacéutica puede envasarse en forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es efectiva en el tratamiento de un cáncer o reestenosis. Generalmente, una dosis unitaria que incluye una composición de la tecnología actual variará dependiendo de las consideraciones del paciente. Tales consideraciones incluyen, por ejemplo, edad, protocolo, afección, sexo, extensión de la enfermedad, contraindicaciones, terapias concomitantes y similares. Una dosis unitaria ejemplar basada en estas consideraciones también puede ser ajustada o modificada por un médico experto en la materia. Por ejemplo, una dosis unitaria para un paciente que comprende un compuesto de la presente tecnología puede variar de 1 x 10'4 g/kg a 1 g/kg, preferiblemente, 1 x 10-3 g/kg a 1.0 g/kg. La dosificación de un compuesto de la presente tecnología también puede variar de 0.01 mg/kg a 100 mg/kg o, preferiblemente, de 0.1 mg/kg a 10 mg/kg.
Las composiciones de micelas que contienen conjugados de paclitaxel o derivados de paclitaxel pueden prepararse como se describe en el presente documento y pueden usarse para el tratamiento de cánceres y enfermedades cardiovasculares. Los conjugados y las composiciones descritas en este documento pueden usarse para preparar formulaciones y medicamentos para su uso en el tratamiento de la reestenosis o un cáncer, como leucemia, angiosarcoma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro (como gliomas), adenocarcinomas o hepatomas. Dichas composiciones pueden estar en forma de, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, cápsulas, jarabes, supositorios, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las composiciones actuales pueden formularse para diversas vías de administración, por ejemplo, mediante administración parenteral, rectal, nasal, vaginal, o mediante matriz o depósito implantado, o para reestenosis, mediante stent recubierto con fármaco o suministro basado en balón. La administración parenteral o sistémica incluye, pero no se limita a, inyecciones subcutáneas, intravenosas, intraperitoneales e intramusculares. Las siguientes formas de dosificación se dan a modo de ejemplo y no deben interpretarse como limitantes de la tecnología de la presente invención.
Las formas de dosificación inyectables generalmente incluyen soluciones o suspensiones acuosas o suspensiones de aceite en agua que pueden prepararse usando un agente dispersante o humectante adecuado y un agente de suspensión. Las formas inyectables pueden estar en fase de solución o en forma de suspensión, que se prepara con un solvente o diluyente. Los solventes o vehículos aceptables incluyen agua esterilizada, solución de Ringer o una solución salina acuosa isotónica.
Para la inyección, la formulación farmacéutica y/o medicamento puede ser una película o polvo adecuado para la reconstitución con una solución apropiada como se describió anteriormente. Ejemplos de estos incluyen, pero no se limitan a, polvos liofilizados, secados por rotación o secados por pulverización, polvos amorfos, gránulos, precipitados o partículas. Para inyección, las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizadores, modificadores de pH, tensioactivos, modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de estos. En algunas realizaciones, las formulaciones inyectables incluyen un agente de isotonicidad (por ejemplo, NaCl y/o dextrosa), tampón (por ejemplo, fosfato) y/o un conservante.
Además de las formas de dosificación representativas descritas anteriormente, los excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables son generalmente conocidos por los expertos en la técnica y, por lo tanto, se incluyen en la presente tecnología actual. Dichos excipientes y vehículos se describen, por ejemplo, en Mack Pub “Remingtons Pharmaceutical Sciences”. Co., Nueva Jersey (1991).
Las formulaciones de la presente tecnología pueden diseñarse para ser de acción corta, de liberación rápida, de acción prolongada y de liberación sostenida como se describe a continuación. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas también pueden formularse para liberación controlada o para liberación lenta.
Las dosis específicas pueden ajustarse dependiendo de las condiciones de la enfermedad, la edad, el peso corporal, las condiciones generales de salud, el sexo y la dieta del sujeto, los intervalos de dosis, las rutas de administración, la tasa de excreción y las combinaciones de fármacos/conjugados libres. Cualquiera de las formas de dosificación anteriores que contienen cantidades efectivas están dentro de los límites de la experimentación de rutina y, por lo tanto, dentro del alcance de la tecnología de la presente invención. Solo a modo de ejemplo, tales dosis pueden usarse para administrar cantidades efectivas de los fármacos/conjugados libres al paciente y pueden incluir aproximadamente 10 mg/m2, aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 30 mg/m2, aproximadamente 40 mg/m2, aproximadamente 50 mg/m2, aproximadamente 75 mg/m2, aproximadamente 100 mg/m2, aproximadamente 125 mg/m2, aproximadamente 150 mg/m2, aproximadamente 200 mg/m2, aproximadamente 250 mg/m2, aproximadamente 300 mg/m2, o un rango entre e incluyendo cualquiera de los dos valores anteriores. Dichas cantidades pueden administrarse por vía parenteral como se describe en el presente documento y pueden tener lugar durante un período de tiempo que incluye, entre otros, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 20 horas, 24 horas o un rango entre cualquiera de los valores anteriores. La frecuencia de administración puede variar, por ejemplo, una vez al día, por 2 días, por 3 días, por semana, por 10 días, por 2 semanas, o un rango entre e incluyendo cualquiera de las frecuencias anteriores.
Para cada una de las condiciones indicadas en el presente documento descritas, los sujetos de prueba exhibirán una reducción del 10 %, 20 %, 30 %, 50 % o más, hasta una reducción del 75-90 %, o 95 % o más, en una o más síntomas causados por, o asociados con, el trastorno en el sujeto, en comparación con los sujetos de control tratados con placebo u otros sujetos adecuados.
En un aspecto relacionado, se proporciona una cantidad eficaz de una composición que comprende agua y una micela que comprende un polímero que contiene ácido poliláctico y el conjugado de ácido 7-oligoláctico divulgado en el presente documento para su uso en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad cardiovascular. El cáncer puede ser leucemia, angiosarcoma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro (como los gliomas), adenocarcinomas o hepatomas.
En cualquiera de las realizaciones de la composición para uso puede implicar la administración de una composición farmacéutica, donde la composición farmacéutica incluye uno o más del conjugado de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o un derivado de paclitaxel como se divulga en el presente documento, así como un portador farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos en el presente documento se proporcionan para ilustrar las ventajas de la presente tecnología y para ayudar adicionalmente a una persona de habilidad ordinaria en la técnica a preparar o usar los conjugados y composiciones de micelas de la presente tecnología, composiciones farmacéuticas, derivados, metabolitos, profármacos, mezclas racémicas o formas tautoméricas de las mismas. En la medida en que los fármacos/conjugados libres incluyen fármacos/conjugados libres de paclitaxel ionizable, y opcionalmente rapamicina, selumetinib o derivados de los mismos, también se pueden usar sales tales como sales farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos en el presente documento también se presentan para ilustrar más completamente los aspectos preferidos de la presente tecnología. Los ejemplos no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente tecnología, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos pueden incluir o incorporar cualquiera de las variaciones, aspectos o aspectos de la presente tecnología descrita anteriormente. Las variaciones, aspectos o aspectos descritos anteriormente también pueden incluir o incorporar las variaciones de cualquiera o todas las demás variaciones, aspectos o aspectos de la presente tecnología.
Ejemplos
Materiales. Todos los productos químicos se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se usaron tal como se recibieron. Los solventes orgánicos de grado analítico y todos los demás reactivos fueron adquiridos de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). PTX se adquirió de LC Laboratories (Woburn, MA). PEG-b-PLA se adquirió de Advanced Polymer Materials Inc. (Montreal, Canadá): Mn de PEG y PLA fue de 4.000 y 2.200 g/mol, respectivamente; PDI 1.05. Las células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 se compraron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, penicilina 100 UI/ml, 100 |ig/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM en CO2 al 5 % en incubador a 37 °C.
Instrumentación. Los datos de resonancia magnética nuclear de protones (1H RMN) se registraron en un espectrómetro de RMN Varian Unity-Inova de dos canales a 400 MHz (Palo Alto, CA) con temperatura regulada a 25 °C. Se informaron cambios químicos (8) en partes por millón (ppm) con respecto a la resonancia de solvente protonado residual a 7.26 ppm para CDCh. Los datos de espectrometría de masas se obtuvieron usando el Waters LCT (ESI-TOF) en el Centro de Instrumentación Química en el Departamento de Química, Universidad de Wisconsin-Madison. Se rociaron muestras de una solución de 10 mM de NH^Ac/CH aCN. El análisis por HPLC de fase inversa (RP-HPLC) se llevó a cabo utilizando un sistema de HPLC Shimadzu Prominence (Shimadzu, Japón) equipado con una bomba LC-20AT, un inyector automático SIL-20AC HT, un horno de columna CTO-20AC y un Sp D- Detector de diodos M20A. De la muestra se separa por una columna Waters Symmetry Shield™ RP18 (4.6 mm x 250 mm, 5 |im, 100 Á).10 |il de muestra se inyectaron a una velocidad de flujo de 0.8 ml/min, temperatura de la columna a 25 C y longitud de onda de detección UV a 227 nm. La separación de los productos de conversión o(LA)n -PTX se realizó en modo gradiente con una fase orgánica que contenía 100 % de CH3CN como disolvente A, y una fase acuosa que contenía un 100 % de agua miliQ como disolvente B. La elución en gradiente se empleó de la siguiente manera: 0 min, 50 % de solvente A y 50 % de solvente B; 35 min, 95 % de solvente A y 5 % de solvente B; y 40 min para equilibrar. Los diámetros hidrodinámicos de las micelas PEG-b-PLA se midieron por dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Inc., Reino Unido) a 25 °C con un ángulo de detección de 173 ° y un láser de iones He-Ne como fuente de luz (4 mW, 633 nm). Antes de las mediciones, las soluciones de micelas de PEG-b-PLA se diluyeron con agua milliQ o PBS (10 mM, pH 7.4) para proporcionar el nivel de PEG-b-PLA a ~ 0.1 mg/ml y se colocaron 1 ml de cada muestra en una cubeta de tamaño desechable (BRAND Polystyrene Cuvettes). El método acumulativo se utilizó para ajustar la función de correlación, y el diámetro promedio z y el índice de polidispersidad (PDI) de las micelas PEG-b-PLA se calcularon a partir de la ecuación de Stokes-Einstein y la pendiente de la función de correlación, respectivamente. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Síntesis de terf-butildimetilsililo (TBS)-o(LA)n. Brevemente, TBS-o(LA)8 monodispersos y TBS-o(LA)16 se sintetizaron mediante la apertura del anillo de L-lactida cíclica, seguido de protección-desprotección para proporcionar oligómeros monofuncionales, usando éter TBS y éster bencílico como grupos protectores para hidroxilo. y grupos de ácido carboxílico, respectivamente (ver Takizawa, K., et al., J. Polym. Sci. A Polym. Chem., 46, 5977-5990 (2008)). La conjugación selectiva por etapas del éster de oligómeros monofuncionales, seguida de la desprotección ortogonal proporciona TBS-o(LA)8 y TBS-o(LA)16 , respectivamente. 1H RMN de TBS-o(LA)8 (400 MHz,CDCl3 ): 8 = 05/26 a 05/05 (m, 7 H), 4.40 (q, J = 6.6 Hz, 1 H), 1.69 - 1.37 (m, 24 H), 0.90 (s, 9 H), 0.11 (s, 3 H), 0.08 (s, 3 H); 1H RMN de TBS-LA16 (400 MHz, CDCl3): 8 = 05/23 a 05/09 (m, 15 H), 4.40 (q, J = 6.1 Hz, 1 H), 1.71 - 1.34 (m, 48 H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.08 (s, 3H).
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Síntesis de trietilsililo (TES)-o(LA)n. Brevemente, el monodisperso TES-o(LA)8 se sintetizó mediante protección desprotección para proporcionar oligómeros monofuncionales, usando éter TES y éster bencílico como grupos protectores para grupos hidroxilo y ácido carboxílico, respectivamente. La conjugación selectiva de éster por etapas de oligómeros monofuncionales, seguida de la desprotección ortogonal proporciona TES-o(LA)8. (Rendimiento: 99 %). 1H RMN de TES-o(LA)8 (500 MHz,CDCh ): 8 5.19 hasta 5.12 (m, 7H), 4.40 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 1.59-1.54 (m, 21H), 1.45 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.96 (t, J = 7.5 Hz, 9H), 0.62 (q, J = 8.0 Hz, 6H).
Síntesis de bencil oligo lactato, Bn-o(LA)n. La síntesis del Bn-o(LA)n polidisperso se inició con estaño(II)-etilhexanoato (Sn(Oct)2). Por ejemplo, a un grado medio de polimerización de 8, la L-lactida cíclica se mezcló con alcohol bencílico en una relación molar de 4 a 1. La mezcla se agitó a 130 °C hasta que se fundió. Posteriormente, 0.01 % p/p de Sn(Oct)2 se añadió en tolueno (100 mg/ml). La mezcla se agitó a 130 °C durante 4 horas y se dejó enfriar a temperatura ambiente, para obtener Bn-o(LA)n polidisperso. Bn-o(LA)n monodisperso se purificó a través de un sistema de CombiFlash Rf 4x usando cromatografía en columna de fase inversa C18. Se aplicó la elución en gradiente de acetonitrilo en ácido fórmico al 0.1 % y agua en ácido fórmico al 0.1 %. El producto purificado se concentró a presión reducida para proporcionar un líquido incoloro. (Rendimiento: ~8-12 % para Bn-O(LA)8). Se espera que los datos 1H RMN y MS sean consistentes con el producto deseado.
Síntesis de 2'-TBS-PTX. El 2'-TBS-PTX se sintetizó como se informó previamente con una ligera modificación en Forrest, ML, et al., Pharm. Res., 25, 194-206 (2008); Ali, S., et al., Anti-Cancer Drugs, 12, 117-128 (2001). El cloruro de tert-butildimetilsililo (TBSCl) (90 mg, 0.6 mmol) y el imidazol (Im) (82 mg, 1.2 mmol) se disolvieron en una solución seca de DMF (2.0 ml) de PTX (250 mg, 0.3 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón. Una cantidad en exceso de acetato de etilo (40 ml) se vertió en la mezcla de reacción y seguido de lavado con H2O (1 x 40 ml) y saturado NH4O (1 x 40 ml) solución. A continuación, se recolectó la capa orgánica, se secó sobre MgSO4 y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida y el concentrado resultante se purificó mediante un sistema CombiFlash Rf 4x (Lincoln, NE) usando elución en gradiente de hexano y acetato de etilo. El producto purificado se concentró a presión reducida para proporcionar un sólido blanco (Rendimiento: 88 %). 1H RMN (400 MHz, CDCla): 8 = 8.27 a 7.29 (m, 15 H), 7.07 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 6.36 -6.20 (m, 2 H), 5.74 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 5.69 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 4.98 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 4.66 (s, 1 H), 4.43 (d, J = 5.5 Hz, 1 H), 4.33 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 4.22 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 3.83 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 2.63 - 2.51 (m , 4 H), 2.49 - 2.35 (m, 2 H), 2.23 (s, 3 H), 2.13 (dd, J = 8.8 , 14.9 Hz, 1 H), 1.97 - 1.85 (m, 4 H), 1.69 ( s, 3 H), 1.24 (s, 3 H), 1.14 (s, 3 H), 0.80 (s, 9 H), -0.04 (s, 3 H), -0.29 (s, 3 H).
Síntesis de 2'-TBS-PTX-o(LA)n-TBS. 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (60 mg, 0.3 mmol) y 4-(dimetilamino)-piridinio p toluenosulfonato (DPTS) se añadieron a (15 mg, 0.05 mmol) CH2Cl2 seco (5.0 ml) que contiene 2 '-TBS-PTx (200 mg, 0.2 mmol) y TBS-o(LA)s (300 mg, 0.2 mmol) o TBS-o(LA)16 (420 mg, 0.2 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón. La mezcla resultante se filtró y se lavó con H2O (1 x 10 ml) y solución de NaHCO3 (1 x 10 ml) saturada. A continuación, se recolectó la capa orgánica, se secó sobre MgSO4 y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida y el concentrado resultante se purificó a través de un sistema CombiFlash Rf 4x usando gradiente de elución de hexano y acetato de etilo. El producto purificado se concentró a presión reducida para proporcionar un sólido blanco (Rendimiento: 20 % para 2 '-TBS-PTX-o(LA)b-TBS y 24 % para 2'-TBS-PTX-o(LA)16-TBS). 1H RMN de 2'-TBS-PTX-o(LA)s-TBS (400 MHz,CDCla): 8 = 8.18 a 7.28 (m, 15 H), 7.08 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 6.33 (s, 1 H), 6.24 (t, J = 9.2 Hz, 1 H), 5.79 - 5.68 (m, 2 H), 5.64 - 5.53 (m, 1 H), 5.24 - 5.06 (m, 7 H), 4.95 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 4.66 (s, 1 H), 4.44 - 4.36 (m, 1 H), 4.34 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.21 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.96 (d, J = 6.6 Hz, 1 H), 2.68 - 2.54 (m, 4 H), 2.42 (dd, J = 9.8, 15.1 Hz, 1 H), 2.21 - 2.10 ( m, 4 H), 1.97 (s, 3 H), 1.93 - 1.84 (m, 1 H), 1.82 (br, 3 H), 1.67 - 1.39 (m, 24 H), 1.19 (s, 3 H), 1.16 (s, 3 H), 0.90 (s, 9 H), 0.80 (s, 9 H), 0.10 (s, 3 H), 0.08 (s, 3 H), -0.03 (s, 3 H), - 0.30 (s, 3 H); 1H RMN de 2'-TBS-PTX-O (LA)16-TBS (400 MHz,CDCl3): 8 = 8.16 a 7.28 (m, 15 H), 7.10 a 7.5 (m, 1 H), 6.33 (s , 1 H), 6.29 - 6.19 (m, 1 H), 5.72 (s, 2 H), 5.65 - 5.55 (m, 1 H), 5.23 - 5.06 (m, 15 H), 4.99 - 4.90 (m, 1 H), 4.66 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 4.43 - 4.36 (m, 1 H), 4.36 - 4.31 (m, 1 H), 4.26 - 4.18 (m, 1 H), 3.99 -3.91 ( m, 1 H), 2.57 (s, 4 H), 2.48-2.35 (m, 1 H), 2.19-2.09 (m, 4 H), 1.97 (s, 3 H), 1.93- 1.83 (m, 1 H), 1.81 (s, 3 H), 1.67 - 1.37 (m, 48 H), 1.19 (s, 3 H), 1.15 (s, 3 H), 0.90 (s, 9 H), 0.79 (s, 9 H), 0.10 (s, 2 H), 0.08 (s, 2 H), -0.03 (s, 3 H), -0.30 (s, 3 H).
Síntesis del conjugado (LA)n-PTX. A una solución de 2'-TBS-PTX-o(LA)s-TBS (85 mg, 0.06 mmol) o 2'-TBSPTX-o(LA)16-TBS (120 mg, 0.06 mmol) en THF seco (2 ml), se añadieron gradualmente ácido acético (72 mg, 1.2 mmol) y fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) (solución de THF 1.0 M) (63 mg, 0.24 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente 2 bajo argón. El exceso de cantidad de acetato de etilo (40 ml) se vertió en la mezcla de reacción y se lavó con solución saturada de NaHCO3 (2 x 40 ml), 5 % en peso de ácido cítrico acuoso (2 x 40 ml) y H2O (1 x 40 ml). A continuación, se recolectó la capa orgánica, se secó sobre MgSO4 y se filtró. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el concentrado resultante se purificó mediante un sistema CombiFlash Rf 4x usando elución en gradiente de hexano y acetato de etilo. El producto purificado se concentró a presión reducida para proporcionar un sólido blanco (Rendimiento: 70 % para o(LA)s-PTX y 72 % para o(LA)16-PTX). 1H RMN de o(LA)s-PTX (400 MHz, CDCla): 8 = 8.17 - 7.31 (m, 15 H), 7.01 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 6.29 (s, 1 H), 6.23 - 6.13 (m, 1 H), 5.85 - 5.75 (m, 1 H), 5.68 (d, J = 7.0 Hz, 1 H), 5.62 - 5.47 (m, 1 H), 5.33 - 5.02 (m , 7 H), 4.91 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 4.79 (dd, J = 2.5, 4.9 Hz, 1 H), 4.38-4.33 (m, 1 H), 4.32 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 4.19 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 3.92 (d, J =6.8 Hz, 1 H), 3.54 (d, J = 4.9 Hz, 1 H), 2.67-2.55 (m , 2 H), 2.38 (s, 3 H), 2.33 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 2.15 (s, 3 H), 1.84 (s, 4 H), 1.81 (s, 3 H), 1.64 - 1.46 (m, 24 H), 1.20 (s, 3 H), 1.16 (s, 3 H). ESI-TOF: m/z calculado para C71H83NO30. [M NH4]+:1447.5; encontrado 1447.2. 1H RMN de o(LA)-,6-PTX (400 MHz,CDCh): 8 = 8.21 a 7.30 (m, 15 H), 7.09 - 6.95 (m, 1 H), 6.29 (s, 1 H), 6.23-6.11 (m, 1 H), 5.84-5.75 (m, 1 H), 5.73-5.65 (m, 1 H), 5.61 - 5.49 (m, 1 H), 5.33-5.04 (m, 15 H), 4.91 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 4.84 - 4.74 (m, 1 H), 4.40 - 4.33 (m, 1 H), 4.33 - 4.29 (m, 1 H), 4.23 - 4.16 (m, 1 H), 3.92 (d, J = 6.6 Hz, 1 H), 3.55 (d, J = 5.3 Hz, 1 H), 2.71 - 2.53 (m, 2 H), 2.38 (s, 3 H), 2.33 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 2.15 (s, 3 H), 1.84 (s, 4 H), 1.81 (s, 3 H), 1.66-1.45 (m, 48 H), 1.20 (s, 3 H ), 1.16 (s, 3 H). ESI-TOF: m/z calculado C95H115NO46. [M+Na]+: 2029.3; encontrado 2029.4.
Síntesis del conjugado o(LA)n-RAP-TES. Se añadieron 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (100 mg, 0.49 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (DmA p ) (12 mg, 0.10 mmol) para secar CH2Cl2 (5 ml) que contenía Ra P (298 mg, 0.33 mmol) y TES-o(LA)s (254 mg, 0.36 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón y se determinó que se completaba por TLC. La mezcla resultante se concentró a presión reducida y el residuo se purificó a través de un sistema CombiFlash Rf4x usando gradiente de elución de hexano y acetato de etilo. El producto purificado se concentró a presión reducida para proporcionar RAP-o(LA)s-TES (296 mg, rendimiento: 57 %). 1H RMN de RAP- 40-o(LA)s-TES (500 MHz, CDCh, rotámero principal): 86.38 (dd, J = 10.5, 15.0 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 10.0, 15.0 Hz, 1H), 6.14 (dd, J = 10.0, 15.0 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.54 (dd, J = 9.0, 15.0 Hz, 1H), 5.41 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.19-5.11 (m, 8H), 4.77 (s, 1H), 4.71 (ddd, J = 5.0, 9.5, 11.5 Hz, 1H ), 4.40 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 2.71 (dd, J = 6.0, 17.0 Hz, 1H), 1.51 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.50 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.09 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 1..05 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.99-0.94 (m, 15H), 0.90 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.63 (q, J = 8.0 Hz, 6H).
Síntesis del conjugado o(LA)n -RAP. A una solución de RAP-o(LA)s-TES (272 mg, 0.17 mmol) en THF (9 ml) se le añadió piridina (0.41 ml, 5.08 mmol) y HF/Pyr(0.13 ml, 5.08 mmol, 70 % HF) sucesivamente. La mezcla de reacción se agitó 1 hora a temperatura ambiente en atmósfera de argón y después se inactivó con solución acuosa saturada de NaHCO3. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 40 ml) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución salina, se secó con Na2 SO4 anhidro, se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar una mezcla bruta que se purificó a través de un Sistema CombiFlash Rf 4x usando gradiente de elución de hexano y acetato de etilo para proporcionar conjugado puro (LA)8-RAP como un sólido blanco (219 mg, 87 %). 1H RMN de o(LA)s-RAP (500 MHz, CDCl3, rotámero principal): 86.38 (dd, J =10.5, 14.5 Hz, 1H), 6.31 (dd, J =10.0, 15.0 Hz, 1H ), 6.14 (dd, J = 10.0, 15.0 Hz, 1H), 5.96 (d, J =11.0 Hz, 1H), 5.54 (dd, J = 9.0, 15.0 Hz, 1H), 5.41 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 5.24-5.11 (m, 8H), 4.77 (s, 1H), 4.71 (ddd, J = 5.0, 9.0, 11.5 Hz, 1H), 4.18 (d , J = 6.0 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.67 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 20.5 Hz), 3.37 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 2.71 (dd, J = 5.5, 17.0 Hz, 1H), 2.66 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 2.57 (dd, J = 5.5, 17.0 Hz , 1H), 1.09 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 1.05 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.99 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.95 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 7.0 Hz, 3H).
Síntesis del conjugado o(LA)n-SEL. A una solución de SEL (153 mg, 0.33 mmol) y TES-o(LA)s (260 mg, 0.38 mmol) en DMF (3.3 ml) se le añadió HOBT (75 mg, 0.50 mmol), Dc C (103 mg, 0.50 mmol) y DmAp (12 mg, 0.10 mmol) sucesivamente a temperatura ambiente bajo argón. La reacción se concentró a presión reducida después de agitar durante la noche para proporcionar una mezcla cruda que se purificó adicionalmente a través de un sistema CombiFlash Rf 4x usando elución en gradiente de hexano y acetato de etilo para proporcionar conjugado o(LA)s-SEL puro (176 mg, 51 %) 1H RMN de O(LA)s-Sel (500 MHz,CDCla): 810.25 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.52 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 6.36 (dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 1H), 5.24-5.09 (m, 7H), 4.38-4.31 (m, 2H), 4.23-4.19 (m, 1H), 4.07-4.06 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 2.70 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 1.60-1.48 (m, 24H) HRMS (QTOF MS ESI) m/e calculado para C41H48BrClFN4O-ig [M+H]+ 1035.1749, encontrado 1035.1758.
Degradación reductora del conjugado o(LA)s-PTX. La degradación reductora de o(LA)s-PTX en la posición C-13 se logró como se informó previamente en Magri, N.F., et al., J. Org. Chem., 51, 3239-3242 (1986) (incorporado en el presente documento como referencia). En resumen, o(LA)s-PTX (10 mg, 7 |imol) o PTX (6 mg, 7 |imol) en CH2Cl2 (2 ml) seco se trató con Bu4NBH4 (1.2 mg, 14 mmol) durante 2 h bajo argón. Se añadió una gota de ácido acético para terminar la reacción, seguido de la eliminación del disolvente al vacío. El sólido residual se redisolvió en CH3CN y se analizaron por RP-HPLC. Las fracciones deseadas de (1S,2R)-W-(2,3-dihidroxi-1-fenil-propil)-benzamida (DPPB) y o­ LAs baccatina III conjugada con (OLAsBac) se recogieron de productos de degradación de o(LA)s-PTX y analizado por espectrometría de masas. Los resultados fueron consistentes con el acoplamiento de o(LA)8 únicamente en la posición 7-OH de PTX. ESI-TOF de DPPB: m/z calculado para C16H17NO3 [M+Na]+: 294.1; encontrado 294.1. ESI-TOF de o(LA)8Bac: m/z calculado para C55H70O27 [M NH4]+: 1180.4; encontrado 1180.6.
Preparación y caracterización de micelas PEG-b-PLA que contienen PTX, o(LA)8-PTX y o(LA)16-PTX. PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX se cargaron en micelas PEG-b-PLA usando un método de hidratación de película delgada como se informó previamente en Shin, H., et al., Mol. Pharm., 8, 1257-1265 (2011) (incorporado en el presente documento como referencia). Brevemente, PTX, o(LA)8-PTX o o(LA)16-PTX (1.0 mg) y PEG-b-PLA (10.0 mg) se disolvieron en 1.0 ml de CH3CN en un matraz de fondo redondo; CH3CN se eliminó mediante presión reducida usando un evaporador rotatorio a 60 °C para lograr una película delgada seca. La película polimérica se disolvió mediante la adición de agua estéril o PBS (10 mM, pH 7.4), seguido de centrifugación durante 5 minutos a 13,000 rpm y filtración estéril (0.22 |im (Coring, NY)). La solubilidad acuosa, la eficiencia de carga de fármacos y el contenido de carga de fármacos de PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX se cuantificaron por RP-HPLC. La eficacia de la carga del fármaco se calculó dividiendo el nivel de PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX cargado en micelas de PEG-b-PLA por el fármaco inicial o nivel conjugado utilizado para la carga del fármaco. El contenido de carga del fármaco se calculó en función del peso de PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX dividido por el peso total de PTX, o(LA)8-PTX o o(LA)16-PTX más micelas PEG-b-PLA. De forma similar, micelas de PEG-b -PLA que contenían RAP, o(LA)8-RAP, SEL u o(LA)8se prepararon y caracterizaron las-SEL.
Conversión de conjugados o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX en una mezcla CH3CN/PBS y en micelas PEG-b-PLA en PBS. La conversión de o(LA)b-Pt X u o(LA)16-PTX en una mezcla (1:1) de CH3CN y Pb S (10 mM, pH 7.4) se analizó por RP-HPLC. Las soluciones de o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX (1.0 mg/ml) se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml y se incubaron a 37 °C en un baño de agua con temperatura ajustada (GCA Corporation, IL). Se extrajo 20 |iL de solución en puntos de tiempo predeterminados, y se diluyó por 180 |iL de CH3CN. De forma similar, se midió la conversión de o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX en micelas PEG-b-PLA (1.0 mg/ml en agua). Se extrajo 20 |iL de solución en puntos de tiempo predeterminados, se centrifugó, se filtró (0.22 |im) y se diluyó por 180 |iL de CH3CN. El análisis RP-HPLC se realizó inmediatamente después de la preparación de la muestra. Las constantes de primer orden se calcularon para la cinética de degradación de o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX. La conversión de o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX se evaluó al menos tres veces con desviación estándar. De forma similar, se realizó la conversión de o(LA)8-RAP y o(LA)8-SEL.
Estudios de liberación in vitro. Después de cargar el conjugado PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)i6-PTX en micelas PEG-b-PLA, las muestras se diluyeron a 0.5 mg/ml utilizando una solución de PBS (10 mM, pH 7.4) y 2.5 Se cargaron ml de solución micelar diluida en un casete de diálisis Slide-A-Lyzer™ con MWCO 20K (Thermo Scientific, MA). Se colocaron cuatro casetes de diálisis en 4 L de solución de PBS (10 mM, pH 7.4) en un agitador de placa caliente Corning (Corning, NY) a 37 °C. Los intervalos de tiempo de muestreo fueron 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 y 72 h. En cada punto de tiempo, se extrajo una muestra de 100 |il, y los casetes se rellenaron con 100 |il de solución de PBS fresca (10 mM, pH 7.4). El medio externo se reemplazó con 4 L de tampón fresco a las 2, 4, 8, 12, 24 y 48 h para aproximarse a las condiciones del sumidero. La cantidad de PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX restante en las micelas de PEG-b-PLA se determinó mediante análisis RP-HPLC, y el porcentaje de liberación del fármaco se calculó con el tiempo junto con las constantes de tasa de primer orden.
Estudios de citotoxicidad in vitro. La citotoxicidad de PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX (libre y asociada a micelas) contra las estirpes celulares de carcinoma de pulmón no microcítico A549 se investigó mediante el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue® (Promega, WI). Las células se sembraron en una placa de 96 pozos a una densidad de siembra de 1.500 células/100 |il/pozo y se cultivaron en medio RPMI 1640 a 37 °C en 5 % de CO2 incubadora durante 24 h. PTX, o(LA)2-PTX u o(LA)8-PTX se disolvió en DMSO, mientras que las PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX que contenían micelas PEG-b-PLA estaban en un Solución de PBS (10 mM, pH 7.4). Cada uno se agregó a los pozos para alcanzar concentraciones finales de 0.1, 1, 10, 100 y 1000 nM. El nivel final de DMSO en el medio fue < 0.1 % en todos los niveles de fármacos. Las células cultivadas con DMSO o PBS diluido en medio se usaron como controles. Se colocaron las células tratadas con fármaco en un incubador a 5 % de CO2 a 37 °C durante 72 h. El medio de cada pozo se aspiró y 100 |iL se añadieron de 20 % (v/v) de reactivo CellTiter-Blue en medio RPMI libre de suero, seguido de incubación a 37 °C en 5 % CO2 de durante 1.5 h. La intensidad de fluorescencia se midió mediante un lector de placas Spectra Max M2 (Molecular Devices, CA) con excitación y emisión a 560 y 590 nm, respectivamente. La concentración de fármaco inhibidor medio máxima (IC50) se determinó usando Graph Pad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, CA). De manera similar, se investigó la citotoxicidad de RAP, o(LA)8-RAP, s El , y o(LA)8 -SEL (libre y asociada a micelas) contra una estirpe celular de carcinoma de pulmón no microcítico A549.
La eficacia antitumoral in vivo. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Wisconsin-Madison de acuerdo con la orientación institucional y de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se adquirieron ratones sin pelo atímicos hembra de 6 - 8 semanas de edad (20 - 25 g cada uno) de recursos de animales de laboratorio en la Facultad de Medicina y Salud Pública de la Universidad de Wisconsin-Madison. Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas con libre acceso al agua y a los alimentos y se aclimataron durante 1 semana antes de la inyección de células tumorales. Las células A549 (2 x 106 células en 100 |il de medio RPM11640 sin suero) se recogieron de cultivos subconfluentes después de la tripsinización y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. Cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 150 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos de tratamiento (n = 3-4/grupo): micelas PEG-b-PLA cargadas con PTX a 20 mg/kg, micelas PEG-b-PLA cargadas con o(LA)8-PTX- a 20 mg/kg de equivalentes de PTX, y micelas de PEG-b-PLA vacías. Los conjugados de fármacos se administraron a través de la vena de la cola durante 3 inyecciones semanales, seguidas de un período de descanso de 1 semana, totalizando 3 ciclos durante un período de 12 semanas. El peso corporal y el volumen del tumor fueron monitoreados en el transcurso del estudio. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula: V = (a x b2)/2, donde V es el volumen del tumor, a es la longitud del tumor, b es el ancho del tumor.
Análisis de datos. Se realizó una prueba t de Student con un nivel de significación del 5 % o ANOVA unidireccional con un nivel de significación del 5 % para el análisis estadístico. Todos los análisis de datos se realizaron con GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, CA).
Resultados
Caracterización de micelas PEG-b-PLA que contienen PTX, RAP, SEL y conjugados o(LA)n de los mismos. Las propiedades fisicoquímicas de las micelas PEG-b-PLA que contienen PTX, conjugado o(LA)8 -PTX o conjugado o(LA)16-PTX se resumen en la Tabla 1A. Las propiedades fisicoquímicas de las micelas PEG-b-PLA que contienen el conjugado RAP u o(LA)8-RAP se resumen en la Tabla 1B. Las propiedades fisicoquímicas de las micelas PEG-b-PLA que contienen el conjugado SEL u o(LA)8-SEL se resumen en la Tabla 1C.
Tabla 1A. Propiedades fisicoquímicas de las micelas PEG-b-PLA que contienen conjugado PTX, o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX.
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Las micelas de PEG-b-PLA aumentaron la solubilidad en agua de PTX de ca. 10 mg/L a 0.9 mg/ml, formando micelas con un diámetro hidrodinámico promedio a 30.5 nm y 8.6 % de carga de fármaco. Sin embargo, no se logró un aumento en la solubilidad en agua de PTX por un aumento de 6 veces en el nivel inicial de PTX utilizado en la carga de fármacos. En cambio, la eficiencia de carga de PTX fue baja, ca. 21 %, y la carga de fármacos para las micelas PEG-b-PLA se estabilizó en 11.2 % de carga de fármacos. En particular, las micelas de PEG-b-PLA que contienen PTX eran inestables a temperatura ambiente, precipitando en menos de 2 horas. Por el contrario, la carga de fármacos del conjugado o(LA)s-PTX para las micelas PEG-b-PLA aumentó de 8.7 a 37.1 y 54.5 % con un aumento de 6 y 12 veces en el nivel inicial de conjugado, respectivamente, y la eficiencia de carga fue ca. 100 % El diámetro hidrodinámico de las micelas PEG-b-PLA que contienen conjugado o(LA)s -PTX a 37.1 % y 54.5 %, aumentó a 58.8 nm y 100 nm, respectivamente. La carga de fármacos del conjugado o(LA)16 -PTX también fue mayor que PTX para las micelas de PEG-b-PLA, ca. 39 % y 6.2 mg/ml en agua. En particular, las micelas de PEG-b-PLA que contienen conjugado o(LA)s-PTX u o(LA)16-PTX fueron estables a 37 °C durante más de 72 horas, lo que indica estabilidad termodinámica para solubilización de conjugado o(LA)s-PTX u o(LA)16-PTX. Con una carga de fármaco del 9 % y un tamaño de partícula a 30 nm, las micelas de PEG-b-PLA liberaron rápidamente PTX in vitro, dando como resultado la precipitación de PTX < 4 horas (Figura 4). Por el contrario, la liberación in vitro de conjugado o(LA)s-PTX u o(LA)16 -PTX a partir de micelas PEG-b-PLA (Figura 4) fue gradual, con t-i/2 = 14.2 y 26.5 horas, respectivamente, que indica el control de la liberación de conjugado mediante el ajuste de lao (LA)n longitud de la cadena. Estos resultados muestran que el ácido oligoláctico actúa como un compatibilizador entre los presentes conjugados y las micelas de PEG-b-PLA, dando como resultado mejoras en la carga del fármaco, la estabilidad física y la liberación del fármaco en comparación con el PTX.
Tabla comparativa 1B. Propiedades fisicoquímicas de las micelas PEG-b-PLA que contienen conjugado RAP u o(LA)s-RAP.
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La carga de fármaco RAP para las micelas de PEG-b-PLA fue del 6.4 % y se estabilizó con una carga de fármaco del 11.5 % con una baja eficiencia de carga del fármaco del 23 %. Por el contrario, la carga del fármaco del conjugado o(LA)8-RAP para las micelas de PEG-b-PLA fue mayor y aumentó de 7.3 a 13.6 y 43.9 % y una eficiencia de carga de más del 80 %. El diámetro hidrodinámico de las de micelas de PEG-b-PLA que contienen conjugado o(LA)8-RAP a 13.6 % y 43.9 %, aumentó a 60.8 nm y 96 nm, respectivamente. En particular, las micelas de PEG-b-PLA que contienen 7.3 % y 13.6 % de o(LA)8-RAP fueron estables a 37 °C durante más de 24 horas, lo que indica estabilidad termodinámica para la solubilización o(LA)8 del conjugado-RAP in vitro. En contraste, todas las micelas de PEG-b-PLA que contienen RAP no conjugado liberaron RAP en menos de 24 horas. Estos resultados muestran que el ácido oligoláctico actúa como un compatibilizador entre los presentes conjugados y las micelas de PEG-b-PLA, dando como resultado mejoras en la carga de fármacos y la estabilidad física en comparación con RAP.
Tabla comparativa 1C. Propiedades fisicoquímicas de las micelas PEG-b-PLA que contienen conjugado SEL o o(LA)8-SEL.
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La carga de fármaco SEL para las micelas PEG-b-PLA fue del 1 % con una eficiencia de carga de fármaco muy baja del 5 %. Por el contrario, la carga del fármaco del conjugado o(LA)8-SEL para las micelas de PEG-b-PLA fue mayor y aumentó de 4.1 a 9.9 y 23.5 % y una eficiencia de carga de más de 30 %. El diámetro hidrodinámico de las micelas PEG-b-PLA que contienen el conjugado o(LA)8-SEL a 9.9 % y 2.5 %, aumentó a 126 nm y 101 nm, respectivamente. En particular, las micelas de PEG-b-PLA que contienen 4.1 % de o(LA)8-RAP fueron estables a 37 °C durante más de 24 horas, lo que indica estabilidad termodinámica para la o(LA)8 solubilización del conjugado-SEL in vitro. En contraste, las micelas de PEG-b-PLA que contenían SEL no conjugado eran inestables y SEL precipitó en aproximadamente 5 minutos. Estos resultados muestran que el ácido oligoláctico actúa como un compatibilizador entre los presentes conjugados y las micelas de PEG-b-PLA, dando como resultado mejoras en la carga de fármacos y la estabilidad física en comparación con SEL.
Caracterización de micelas PEG-b-PLA que contienen la combinación de 3 fármacos de PTX no conjugado, SEL y RAP. Las propiedades fisicoquímicas de las de micelas PEG-b-PLA que contienen PTX, SEL y RAP como una micela 3 en 1 se resumen en la Tabla 2. Como se proporciona en la Tabla 1C, la carga del fármaco SEL para las micelas de PEG-b -PLA fue muy baja a 1 % con baja eficiencia de carga de fármacos del 5 %. Además, las micelas de PEG-b-PLA que contienen SEL no conjugado eran inestables y SEL se precipitó en aproximadamente 5 minutos. En contraste, SEL se cargó con éxito al 6.3 % en micelas PEG-b-PLA cuando se cargó conjuntamente con PTX y RAP. Sorprendentemente, cuando se cargaron conjuntamente, PTX, RAP y SEL lograron una eficiencia de carga de medicamentos del 100 %. Estos resultados muestran que la carga conjunta de la combinación de 3 fármacos con micelas de PEG-b-PLA proporciona mejoras en la carga de fármacos y la estabilidad física en comparación con la carga individual de fármacos en las micelas de PEG-b-PLA.
Tabla 2. Propiedades fisicoquímicas de las de micelas PEG-b-PLA que contienen PTX, SEL y RAP como una micela 3 en 1.
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Conversión de conjugados o(LA)8-PTX, o(LA)16-PTX, o(LA)8-RAP, y o(LA)8-SEL. En una mezcla 1:1 de acetonitrilo y tampón PBS (pH 7.4, 10 mM), utilizada para ganar solubilidad, el conjugado o(LA)8-PTX se eluyó a aprox. 23 minutos, y después de la conversión, produjo una serie de picos bien definidos con tiempos de elución más cortos, acercándose al tiempo de elución de PTX, ca. 12 minutos (figura 2A). Los picos principales se asignaron a productos de degradación de número par de o(LA)8-PTXtras la pérdida de lactoil lactatotras la retroacción: o(LA)6-PTX, o(LA)4-PTX, o(LA)2-PTX y PTX, mientras que los picos notablemente más pequeños correspondieron a productos de degradación de números impares por hidrólisis aleatoria. El área relativa (%) del conjugado o(LA)8-PTX, los productos de degradación de número par y o(LA)1 -PTX se representaron frente al tiempo (figura 5A). El t-i/2 para la conversión del conjugado o(LA)8-PTX fue de aprox. 7.3 horas, produciendo o(LA)2-PTX como la especie principal y en menor medida o(LA)1-PTX y PTX durante 300 horas. De manera similar, el conjugado o(LA)16-PTX generó un perfil de degradación retroalimentación basado en el análisis de HPLC de fase inversa (Figuras 2B, 5B): t 1/2 = 7.4 horas e incluso productos de degradación numérica, principalmente o(LA)2-PTX. Por otro lado, la conversión de conjugados o(LA)8-PTX u o(LA)16 -PTX en micelas PEG-b-PLA disminuyó considerablemente: t 1/2 = 157 y 315 horas, respectivamente (Figuras 7A y 7B), consistente con la reacción de retroacción obstaculizada en un entorno no polar (núcleo PLA). La conversión de conjugados o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX en una solución acuosa parece proceder rápidamente mediante una reacción de retroexcavación, pero lentamente en micelas PEG-b-PLA en agua. Por lo tanto, las micelas de PEG-b-PLA pueden transportar de manera estable o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX conjugado, y al liberarse, conjugado o(LA)8-PTX u o(LA)16-PTX sufre una rápida retroacción, generando principalmente o(LA)2-PTX y, en menor medida, o(LA)1-PTX y PTX. De manera similar, las Figs. 10Ay 11A, proporcionan la conversión de o(LA)8-RAP, y las FIGS. 10B y 11B proporcionan la conversión de o(LA)8-SEL.
La actividad anticancerígena in vitro e in vivo de conjugados o(LA)8-PTX, o(LA)16-PTX, o(LA)8-RAP y o(LA)8-SEL. PTX es un potente agente anticancerígeno como estabilizador de microtúbulos, y desempeña un papel central en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no microcíticas. En consecuencia, PTX tenía un bajo valor IC50 de 2.0 nM para la estirpe celular no microcítica de cáncer humano A549 (Fig. 6). El valor IC50 de o(LA)8-PTX en la forma libre tiene un valor más alto de 8.9 nM, lo que refleja el tiempo necesario para la conversión. El IC50 valores de o(LA)8-PTX y o(LA)16-PTX como micelas fueron aproximadamente 7 veces mayor, ca. 15 nM, lo que refleja el tiempo necesario para la liberación de micelas PEG-b-PLA (más de 72 horas). En particular, o(LA)2-PTX, la especie principal generada por la retroacción, fue equipotente con PTX in vitro. Por lo tanto, 2 unidades de ácido láctico en la posición 7-OH del paclitaxel no interfieren con la estabilización de los microtúbulos, definiendo o(LA)2-PTX, o(LA)1-PTX y PTX como especies bioactivas. Por el contrario, los conjugados de éster2'-OH requieren una conversión completa a PTX para la citotoxicidad. En resumen, la retroacción del conjugado o(LA)8-PTX genera especies citotóxicas, principalmente o(LA)2-PTX, sin depender de la conversión de esterasas, lo que permite una nueva estrategia de profármacos para las micelas PEG-b-PLA. Las figuras comparativas 12Ay 12B, proporcionan la citotoxicidad de las composiciones de micelas RAP, o(LA)8-RAP, SEL, o(LA)8-SEL y micelas o(LA)8-SEL.
La eficacia anticancerígena in vivo de las de micelas PEG-b-PLA que contienen profármacos PTX u o(LA)8-PTX se evaluó en un modelo de xenoinjerto A549 después de la inyección semanal en la vena de la cola a una dosis de 20 mg/kg (Figura 8) es un programa semanal de inyección IV para el conjugado evaluado PTX u o(LA)8-PTX debido a su relevancia clínica (3 inyecciones semanales y una semana de descanso x 3 ciclos). Con las micelas PEG-b-PLA que contienen PTX a 20 mg/kg, el crecimiento de los tumores A549 fue paralelo al crecimiento tumoral del control del vehículo durante aproximadamente 2 semanas, seguido de la inhibición del crecimiento tumoral durante el tratamiento durante 71 días y el crecimiento tumoral retardado. Por el contrario, las micelas de PEG-b-PLA que contienen o(LA)8 conjugado de-PTX a 20 mg/kg disminuyeron los volúmenes tumorales durante el tratamiento semanal durante 71 días sin recaída hasta 120 días (Figura 8). Sorprendentemente, el conjugado o(LA)8-PTX también fue menos tóxico que PTX en términos de cambio de peso corporal (figura 8).
Los profármacos de éster de PTX a menudo son solubles en agua y menos tóxicos, pero menos activos como agentes anticancerígenos. Sin embargo, los presentes conjugados con micelas de PEG-b-PLA son composiciones anticancerígenas únicas en términos de conversión de retroacción, estabilidad física, menor toxicidad y mayor eficacia antitumoral en un modelo de xenoinjerto A549. Dada una más lenta in vitro liberación de los presentes conjugados frente a PTX, se espera que estos conjugados reduzcan la distribución de PTX en el tejido no objetivo, aumenten la exposición tumoral (a través del efecto EPR) y experimenten la conversión intratumoral mediante retroacción. El pequeño tamaño de las micelas PEG-b-PLA que contienen los presentes conjugados (por ejemplo, Aproximadamente 30 nm para o(LA)8-PTX) es favorable para el efecto EPR, y la baja Cmax de PTX provocó que los conjugados favorezcan bajo toxicidad del huésped, especialmente en comparación con las micelas de PEG6-PLA que contienen PTX (véase Cabral, H., etal., Nat. Nanotechnol, 6, 815-823(2011)).
La in vitro actividad anticancerígena de PTX, SEL y RAP sola y en combinación. La Tabla 3 muestra el valor IC50 de PTX, RAP, y SEL en combinación es inferior a los fármacos solos que indican que la combinación de 3 fármacos parece lograr la sinergia in vitro.
Tabla 3. Valores de IC50 y análisis de índice de combinación de PTX, SEL y RAP como solos, combinación de 2 fármacos y combinación de 3 fármacos para la línea celular A549 NSCLC
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de ácido 7-oligoláctico de paclitaxel o un derivado de paclitaxel en el que el ácido oligo-láctico comprende de 2 a 24 subunidades de ácido láctico y está unido a través de un enlace éster al oxígeno del 7-hidroxilo del paclitaxel o derivado de paclitaxel con actividad anti cáncer que retiene el esqueleto carbocíclico/oxetano del paclitaxel, pero contiene al menos una cadena lateral modificada distinta del 7-hidroxilo.
2. El conjugado de ácido 7-oligoláctico de la reivindicación 1 en el que el ácido oligoláctico comprende de 4 a 20 subunidades de ácido láctico; opcionalmente en el que el ácido oligoláctico comprende de 6 a 18 subunidades de ácido láctico.
3. El conjugado de ácido 7-oligoláctico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende paclitaxel o docetaxel.
4. Una composición que comprende agua y una micela que comprende un polímero que contiene ácido poliláctico y el conjugado de ácido 7-oligoláctico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. La composición de la reivindicación 4, en la que la carga del conjugado de ácido 7-oligoláctico es de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, con respecto a la masa de las micelas.
6. La composición de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en la que la concentración del conjugado de ácido 7-oligoláctico es de aproximadamente 0.6 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, con respecto al volumen del agua en la composición.
7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que la composición comprende menos de aproximadamente 2 % en peso de etanol, dimetilsulfóxido, aceite de ricino y derivados de aceite de ricino en base al peso de la composición.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que la micela comprende ácido poli(etilenglicol) -bloque-poliláctico en (PEG-6-PLA);
opcionalmente en el que el peso molecular de poli (etilenglicol) bloque de PEG-6-PLA es de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 35,000 g/mol y el peso molecular de poli (ácido láctico) bloque de PEG-6-PLA es de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 15,000 g/mol.
9. Una composición que comprende agua y una micela que comprende PEG-6-PLA y el conjugado de ácido 7-oligoláctico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que
la carga del conjugado de ácido 7-oligoláctico en la micela es de aproximadamente 1 % en peso hasta aproximadamente 60 % en peso, con respecto a la masa de las micelas; y
el peso molecular de poli (etilenglicol) bloque del PEG-6-PLA es de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 14.000 g/mol, y el peso molecular de poli (ácido láctico) bloque del PEG-6-PLA es de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 7.000 g/mol.
10. Un método de hacer que el conjugado de ácido 7-oligoláctico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende poner en contacto el paclitaxel o el derivado de paclitaxel que tiene un grupo 7-hidroxilo libre con un agente de acoplamiento y un ácido oligoláctico mono-O-sililado que tiene de 2 a 24 subunidades de ácido láctico.
11. Un método para prepararla composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9 que comprende: combinar agua con una mezcla de un polímero que contiene ácido poliláctico y el conjugado de ácido 7-oligoláctico; y en el que el ácido oligoláctico comprende de 2 a 24 subunidades de ácido láctico.
12. Un método para inhibir o eliminar células cancerosas sensibles al paclitaxel o un derivado de paclitaxel que comprende poner en contacto las células in vitro con una cantidad inhibidora o letal efectiva de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9.
13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para uso en terapia.
14. Una cantidad efectiva de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para usar en el tratamiento de un cáncer sensible al paclitaxel o un derivado de paclitaxel, generalmente en el que el cáncer se selecciona de tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, angiosarcoma o leucemia.
15. La composición para uso de la reivindicación 14 en la que la composición se administra por inyección.
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