CN109562187A - 具有增强的抗癌功效的低聚乳酸缀合物和胶束 - Google Patents

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Abstract

本技术一般涉及紫杉醇、雷帕霉素、司美替尼和其它抗癌剂的低聚乳酸缀合物，含有此类缀合物的胶束组合物，以及制备和使用此类组合物治疗各种癌症的方法。具体来说，提供了低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含2至24个乳酸亚基，并通过酯键连接至紫杉醇或紫杉醇衍生物的7‑羟基的氧、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的40‑羟基和司美替尼或司美替尼衍生物的2'‑羟基上。包含水和胶束的组合物可容易制备，其中所述胶束包含含有聚乳酸的聚合物和低聚乳酸缀合物。还提供了抑制或杀死癌细胞和治疗紫杉醇、雷帕霉素和/或司美替尼癌症的方法。

Description

具有增强的抗癌功效的低聚乳酸缀合物和胶束
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月14日提交的美国临时专利申请第62/307,830号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
政府权利
本发明是在美国国立卫生研究院给予的AI101157的政府支持下完成的。政府对本发明有一定的权利。
技术领域
本公开通常涉及紫杉烷(诸如紫杉醇及其衍生物)、mTOR抑制剂(诸如雷帕霉素及其衍生物)、MEK抑制剂(诸如司美替尼及其衍生物)及其组合的低聚乳酸缀合物。与紫杉醇、雷帕霉素和/或司美替尼的标准制剂相比，该缀合物可配制在合成胶束中以在癌症的治疗中提供优异的溶解性、较低的毒性和/或增强的功效。
背景技术
紫杉醇、雷帕霉素和司美替尼为用于治疗多种癌症的有效化学治疗剂，并具有如下所示的结构。
由于其水溶性有限，抗癌药物诸如紫杉醇、雷帕霉素和司美替尼通常用专用溶媒配制用于肠胃外给药，该专用溶媒包括溶剂如(CrEL)、DMSO和/或乙醇。从患者耐受性的角度来看，这种非水溶剂通常是不可取的。例如，CrEL已知会引起超敏反应和过敏反应，并且在给药前需要患者服用抗组胺剂和类固醇。胶束组合物被认为是一些水溶性差和细胞毒性药物的更安全的替代递送溶媒。然而，这种组合物往往载药量低、稳定性差，导致体内广泛的生物分布和低肿瘤暴露药物。
发明内容
本技术提供紫杉烷(诸如紫杉醇(o(LA)n-PTX)和紫杉醇衍生物(例如多西紫杉醇))、mTOR抑制剂(诸如雷帕霉素(o(LA)n-RAP)和雷帕霉素衍生物(例如依维莫司))和MEK抑制剂(诸如司美替尼(o(LA)n-SEL)和司美替尼衍生物(例如比尼替尼(binimetinib)、GDC-0623和ARRY-300))的低聚乳酸缀合物。该低聚乳酸通常包含2至24个乳酸亚基，并通过酯键与紫杉醇或紫杉醇衍生物的7-羟基的氧、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的40-羟基和司美替尼或司美替尼衍生物的2'-羟基连接。
在各个方面，本技术提供了低聚乳酸与紫杉醇或紫杉醇衍生物、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和/或司美替尼或司美替尼衍生物的缀合物，其具有增强的溶解度和功效。本文提供的该缀合物可配制成胶束，作为用于治疗癌症的药物组合物和药物。还提供了该缀合物在制备药物制剂和药物中的用途。
附图说明
图1A显示了说明本技术的低聚(乳酸)n-紫杉醇缀合物与聚(环氧乙烷)-嵌段-聚(乳酸)(PEG-b-PLA)胶束的应用的示意图：负载、释放和反咬(backbiting)转化以获得抗癌活性。图1B显示了说明本缀合物的说明性实施例的可能的反咬降解机制的化学方案。
图2A和2B显示了o(LA)8-PTX缀合物(2A)和o(LA)16-PTX缀合物(2B)及其在1:1CH3CN/10mM PBS中、37℃、pH 7.4下温育0、4、12、96和168小时后的反咬转化产物的反相HPLC色谱图。
图3提供了用于制备o(LA)n-PTX缀合物的说明性合成方案。
图4显示了PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX从PEG-b-PLA胶束体外释放的时间过程(平均值±SD，n＝3)。
图5A和5B分别显示了o(LA)8-PTX缀合物转化为o(LA)6-PTX、o(LA)4-PTX、o(LA)2-PTX、o(LA)1-PTX和PTX的时间过程的图(平均值±SD，n＝3)(5A)和o(LA)16-PTX缀合物转化为o(LA)14-PTX、o(LA)12-PTX、o(LA)10-PTX、o(LA)8-PTX、o(LA)6-PTX、o(LA)4-PTX、o(LA)2-PTX、o(LA)1-PTX和PTX的时间过程的图(平均值±SD，n＝3)(5B)。
图6显示了PTX、o(LA)2-PTX、o(LA)8-PTX和o(LA)16-PTX缀合物对人A549非小肺癌细胞的体外细胞毒性。柱：四次测定的平均值；误差棒，SD；**。与游离形式和胶束形式的PTX相比，o(LA)8-PTX，p<0.01。
图7A显示了o(LA)8-PTX缀合物在PEG-b-PLA胶束中转化为o(LA)6-PTX、o(LA)4-PTX、o(LA)2-PTX和PTX的时间过程(平均值±SD，n＝3)。图7B显示了o(LA)16-PTX缀合物在PEG-b-PLA胶束中转化为o(LA)14-PTX、o(LA)4-PTX、o(LA)12-PTX和o(LA)10-PTX的时间过程(平均值±SD，n＝3)。
图8A显示了在A549异种移植肿瘤模型中PTX或o(LA)8-PTX缀合物(20mg/kg)PEG-b-PLA胶束(9％载药量)的体内抗肿瘤功效。小鼠每周接受3次注射，然后休息一周，持续3个周期(平均值±SEM，n＝3–4)。误差棒，SEM；***，p<0.001，并且图8B显示了用PTX或o(LA)8-PTX缀合物(20mg/kg)PEG-b-PLA胶束(9％载药量)处理的小鼠的相对体重。误差棒：SEM；**，p<0.01。
图9A提供了用于制备o(LA)n-RAP缀合物的说明性合成方案。图9B提供了用于制备o(LA)n-SEL缀合物的说明性合成方案。
图10A和10B显示了o(LA)8-RAP缀合物(10A)和o(LA)8-SEL缀合物(10B)(0.5mg/mL)及其在1:1CH3CN/10mM PBS中、37℃、pH 7.4下以预定的时间间隔在168小时内温育后的反咬转化产物的反相HPLC色谱图。
图11A和11B分别显示了o(LA)8-RAP缀合物转化为o(LA)6-RAP、o(LA)4-RAP、o(LA)2-RAP和RAP的时间过程的图(平均值±SD，n＝3)(11A)和o(LA)8-SEL缀合物转化为o(LA)6-SEL、o(LA)4-SEL、o(LA)2-SEL和SEL的时间过程的图(平均值±SD，n＝3)(11B)。
图12A显示了RAP胶束和o(LA)8-RAP缀合物胶束(12A)对人A549非小细胞肺癌细胞的体外细胞毒性。图12B显示了SEL、o(LA)8-SEL缀合物和o(LA)8-RAP缀合物胶束(12B)对人A549非小肺癌细胞的体外细胞毒性。
具体实施方式
以下术语贯穿始终以以下定义使用。
如本文和所附权利要求中所使用的，除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述元素的背景下(特别是在以下权利要求的上下文中)诸如“一(a)”和“一(an)”和“该(the)”之类的单个物品和类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独的值的简写方法，并且每个单独的值被并入说明书中，如同在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明实施例，而不对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未声明的元素是必不可少的。
如本文所用，“约”将为本领域技术人员所理解的，并且在某种程度上根据其使用的上下文而变化。如果该术语的使用对于本领域技术人员来说是不清楚的，则考虑到使用其的上下文，“约”将意味着高达该特定术语的正负10％。
本技术提供药物组合物和药物，其包含本文公开的化合物(药物和/或药物缀合物)和胶束的任一个实施例和药学上可接受的载体或一种或多种赋形剂。该组合物可用于本文所述的方法和治疗中。该药物组合物可包含有效量的本文公开的本技术化合物的任一实施例。在任何上述实施例中，该有效量可根据受试者确定。“有效量”是指产生预期效果所需的化合物、缀合物、胶束或组合物的量。有效量的一个实例包括产生治疗(药物)用途的可接受毒性和生物利用度水平的量或剂量，该用途包括但不限于治疗癌症或心血管疾病(如再狭窄)。如本文所用，“受试者”或“患者”为哺乳动物(诸如猫、狗)、啮齿动物或灵长类动物。典型的受试者为人，并且优选地，为患有对紫杉醇敏感的癌症即能够用有效量的紫杉醇治疗的癌症的人。术语“受试者”和“患者”可互换使用。
在一个方面，本技术提供了低聚乳酸与紫杉醇和紫杉醇衍生物的缀合物。如本文所用，“紫杉醇衍生物”为保留紫杉醇的碳环/氧杂环丁烷骨架(即紫杉烷骨架)但含有至少一个除7-羟基以外的修饰侧链的化合物。本技术的紫杉醇衍生物显示出抗癌活性。例如，多西紫杉醇是一种紫杉醇衍生物，其含有C-13侧链的修饰，其中叔丁氧基羰基氨基代替3'-位的苯甲酰氨基。其它紫杉醇衍生物是本领域技术人员已知的，且包括但不限于Farina,V.，《紫杉酚及其衍生物的化学和药理学(The chemistry and pharmacology of Taxol andits derivatives)》，爱思唯尔(Elsevier)，纽约，1995(通过引用并入本文)中描述的那些。与未缀合的紫杉醇和紫杉醇衍生物相比，本缀合物和胶束表现出增强的溶解性、稳定性和抗癌功效。图1A示意性地说明了本技术的低聚乳酸缀合物的一个实施例，其负载至胶束中和从胶束中释放、该缀合物随后降解以提供紫杉醇。
在一个方面，本技术提供了低聚乳酸与雷帕霉素和雷帕霉素衍生物的缀合物。如本文所用，“雷帕霉素衍生物”或“雷帕霉素类似物(rapalog)”是保留雷帕霉素的大环内酯环但含有至少一个修饰的侧链，同时保留C-40位上的游离羟基或与C-40位键合的修饰侧链上连接的游离羟基的化合物(例如，依维莫司})。本技术的雷帕霉素衍生物显示出抗癌活性。例如，依维莫司是具有以下结构的雷帕霉素衍生物。其它雷帕霉素衍生物是本领域技术人员已知的，包括但不限于Wander,S.等人，《临床肿瘤学中的下一代mTOR抑制剂：通路复杂性如何影响治疗策略(Next-generation mTOR inhibitors in clinical oncology:howpathway complexity informs therapeutic strategy)》，《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》121(4),1231-1241(2011)(通过引用并入本文)中描述的那些。与未缀合的雷帕霉素和雷帕霉素衍生物相比，本缀合物和胶束表现出增强的溶解性、稳定性和抗癌功效。类似于低聚乳酸的C-7紫杉醇缀合物的行为，雷帕霉素及其衍生物的C-40低聚乳酸缀合物可负载至胶束中并从胶束中释放出来并降解以提供雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。
在一个方面，本技术提供了低聚乳酸与司美替尼和司美替尼衍生物的缀合物。如本文所用，“司美替尼衍生物”是保留司美替尼的6,5-稠合环系但含有至少一个修饰侧链同时在C-2'位置保留游离羟基的化合物(例如，比尼替尼、GDC-0623和ARRY-300)。本技术的司美替尼衍生物表现出抗癌活性。例如，比尼替尼和GDC-0623是具有以下结构的司美替尼衍生物。其它司美替尼衍生物是本领域技术人员已知的，包括但不限于Jokinen,E.等人，《MEK和PI3K对实体瘤的抑制：基本原理和目前的证据(MEK and PI3K inhibition in solidtumors:rationale and evidence to date)》，《肿瘤内科治疗新进展(Ther.Adv.Med.Oncol.)》，7(3),170-180(2015)(通过引用并入本文)中描述的那些。与未缀合的司美替尼和司美替尼衍生物相比，本缀合物和胶束表现出增强的溶解性、稳定性和抗癌功效。类似于低聚乳酸的C-7紫杉醇缀合物的行为，司美替尼及其衍生物的C-2'低聚乳酸缀合物可负载至胶束中并从胶束中释放出来并降解以提供司美替尼或司美替尼衍生物。
在本缀合物中，低聚乳酸是乳酸的线性聚酯，并通过酯键与紫杉醇或紫杉醇衍生物的7-羟基的氧连接(本文中为“7-低聚乳酸缀合物”)、与雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的40-羟基的氧连接(本文中为“40-低聚乳酸缀合物”)，和/或与司美替尼或司美替尼衍生物的2'-羟基的氧连接(本文中为“2'-低聚乳酸缀合物”)。在这种低聚乳酸缀合物中，低聚乳酸通常包括2至24个乳酸亚基。本领域技术人员将理解，本缀合物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个乳酸亚基或前述值中任何两个之间的一系列亚基。例如，该低聚乳酸可包括4至20、6至18或2至10个乳酸亚基。在一些实施例中，该缀合物具有式I、II和/或III中所示的结构：
其中n在每次出现时为2至24的单个整数或为选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24中的任何两个值之间并包括该任何两个值的范围。在一些实施例中，n在每次出现时为4至20的单个整数。在一些实施例中，n在每次出现时为6至18的单个整数。在一些实施例中，该低聚乳酸是D,L-低聚乳酸。在其它实施例中，其为L-低聚乳酸，在另一些实施例中，其为D-低聚乳酸。
本技术的缀合物有利地在体内用作紫杉醇、雷帕霉素和司美替尼的前药。在模拟体内条件下，即接近中性的pH下，低聚乳酸侧链主要以控制的逐步方式自降解，而非随机水解，且其不依赖于例如酯酶。虽然不希望受到理论的限制，但如图1B所示，该缀合物的降解被认为是通过“反咬”机制发生的，其中低聚乳酸末端的游离羟基攻击由相邻乳酸亚基的羰基形成的酯键。以这种方式释放乳酰乳酸酯二聚体直至仅一个或两个乳酸亚基保持与药物/药物衍生物连接；最后两个亚基经历缓慢的反咬，并且随着时间的推移仅缓慢水解。该逐步机制与o(LA)8-PTX和o(LA)16-PTX(参见图2A和2B)、o(LA)8-RAP(参见图10A)和o(LA)8-SEL(参见图10B)随时间的体外降解所观察到的HPLC谱一致。
本文公开的7-低聚乳酸缀合物可通过使具有游离7-羟基的紫杉醇或紫杉醇衍生物与偶联剂和具有2至24个乳酸亚基的单-O-甲硅烷基化的低聚乳酸接触来制备。类似地，40-低聚乳酸和2'-低聚乳酸可分别通过使具有游离40-羟基的雷帕霉素或雷帕霉素衍生物或具有游离2'-羟基的司美替尼或司美替尼衍生物与偶联剂和具有2至24个乳酸亚基的单-O-甲硅烷基化的低聚乳酸接触来制备。仅举例来说，图3、9A和9B显示了制备本缀合物的方法的说明性实施例。在图3中，紫杉醇的2'-羟基通过使紫杉醇与甲硅烷基化试剂(诸如叔丁基二甲基甲硅烷基氯)反应来保护，任选地，在催化剂(诸如咪唑)的存在下，在极性非质子溶剂(诸如DMF)中。使用偶联剂在合适的有机溶剂中将被保护的紫杉醇与羟基保护的低聚乳酸中间体偶联。类似地，在图9A和9B中，使用偶联剂在合适的有机溶剂中将雷帕霉素和司美替尼与羟基保护的低聚乳酸中间体偶联。合适的偶联剂包括碳二亚胺诸如DCC和EDCI。合适的有机溶剂包括卤化溶剂(例如二氯甲烷、氯仿)、乙酸烷基酯(例如乙酸乙酯)或其它极性非质子溶剂(例如DMF)。该偶联反应通常还包括催化剂，例如4-(二甲基氨基)-吡啶对甲苯磺酸盐(DPTS)或4-(二甲基-氨基)吡啶(DMAP)。在一些实施例中，该羟基保护的低聚乳酸为O-甲硅烷基化的低聚乳酸，例如O-叔丁基二甲基甲硅烷基(OTBS)低聚乳酸或O-三乙基甲硅烷基(OTES)低聚乳酸。虽然可使用其它已知的羟基保护基团，但是紫杉醇2'羟基和低聚丙交酯羟基上的甲硅烷基可方便地用氟化物除去。例如，图3显示了在乙酸和THF中TBS基团用四丁基氟化铵脱保护提供了所需的缀合物，和图9A和9B显示了TES基团用氢氟酸和吡啶脱保护提供了所需的缀合物。
单分散单-O-甲硅烷基化低聚乳酸可使用已知方法制备，诸如环状丙交酯(包括环状L-丙交酯)的开环，然后保护-偶联-脱保护顺序，以提供单官能低聚物，例如，分别使用TBS醚或TES醚和苄基酯作为羟基和羧酸基团的保护基团。其它合适的三有机甲硅烷基氯化物试剂可用于代替叔丁基二甲基甲硅烷基氯和三乙基氯硅烷，诸如，但不限于，三甲基甲硅烷基氯、异丙基-二甲基氯硅烷、氯三苄基硅烷、氯三丁基硅烷、氯三异丙基硅烷、氯三己基硅烷、氯三异丁基硅烷和氯三苯基硅烷。除苄基酯外，还可使用与甲硅烷基正交的任何酯。或者，单分散低聚乳酸可通过传统聚合技术制备，然后通过反相柱色谱或凝胶过滤分离。
另一方面，本技术提供了由水、含聚乳酸的聚合物和游离紫杉醇/紫杉醇衍生物、游离雷帕霉素/雷帕霉素衍生物和游离司美替尼/司美替尼衍生物的3-药物组合形成的胶束的水性组合物。如本文所用，术语“游离的”是指未缀合的药物/药物衍生物。这种胶束通常比仅负载游离紫杉醇/紫杉醇衍生物、游离雷帕霉素/雷帕霉素衍生物或游离司美替尼/司美替尼衍生物的相应胶束更稳定(参见表2)。
与仅负载游离药物/药物衍生物相比，包括游离紫杉醇/紫杉醇衍生物、游离雷帕霉素/雷帕霉素衍生物和游离司美替尼/司美替尼衍生物的3-药物组合的胶束可具有更高的载药量(参见表1-2)。例如，在胶束中单独负载仅约1wt％游离司美替尼，其在短时间(约5分钟)后沉淀。相反，负载在具有游离紫杉醇和游离雷帕霉素的胶束中的游离司美替尼具有大于6wt％的载药量，同时胶束稳定性增加(参见表1和2)。在一些实施例中，相对于胶束的质量，游离紫杉醇/紫杉醇衍生物的负载量可为约1wt％至约10wt％，包括约2wt％至约6wt％。在一些实施例中，相对于胶束的质量，游离雷帕霉素/雷帕霉素衍生物的负载量可为约1wt％至约10wt％，包括约1wt％至约4wt％。在一些实施例中，相对于胶束的质量，游离司美替尼/司美替尼衍生物的负载量可为约1wt％至约10wt％，包括约4wt％至约8wt％。相对于胶束的质量，胶束中总游离药物负载量的实例可为约5wt％至约20wt％，包括约7wt％、约10wt％、约13wt％、约15wt％、约18wt％，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。
另一方面，本技术提供了由水、含聚乳酸的聚合物和任何本低聚乳酸-药物/药物衍生物缀合物(即，紫杉醇/紫杉醇衍生物缀合物、雷帕霉素/雷帕霉素衍生物缀合物，和/或司美替尼/司美替尼衍生物缀合物)形成的胶束的水性组合物。这种胶束通常比具有游离药物/药物衍生物的相应胶束更稳定。例如，如图4所示，由聚(乙二醇)-嵌段-聚乳酸和o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX中的一种形成的胶束释放该缀合物比其释放游离紫杉醇更缓慢。在一些实施例中，本技术提供由水、含聚乳酸的聚合物和紫杉醇/紫杉醇衍生物缀合物、雷帕霉素/雷帕霉素衍生物缀合物和司美替尼/司美替尼衍生物缀合物的3-药物组合形成的胶束的水性组合物。
在本技术的一些实施例中，该胶束包括嵌段共聚物PEG-b-PLA(也称为PEG-PLA)。该聚(乳酸)嵌段可包括(D-乳酸)、(L-乳酸)、(D,L-乳酸)或其组合。各种形式的PEG-b-PLA可商购获得，诸如来自魁北克省蒙特利尔的Polymer Source公司，或它们可根据本领域技术人员熟知的方法制备。该聚(乙二醇)嵌段的分子量可为约1000至约35000g/mol，或在所述范围内约500g/mol的任何增量。(本文中提到的所有聚合物分子量将被理解为重均分子量。)例如，该PEG嵌段的分子量可为1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。合适的聚(乳酸)嵌段可具有约1000至约15000g/mol的分子量，或在所述范围内的约500g/mol的任何增量。例如，该PEG嵌段的分子量可为1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、12000、12500、13000、13500、14000、14500、15000，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。该PEG嵌段可以终止于烷基(诸如甲基(例如甲氧基醚))或任何合适的保护基团、封端基团或封闭基团。在一些实施例中，PEG-b-PLA的聚(乙二醇)嵌段的分子量为约1000至约35000g/mol，并且PEG-b-PLA的聚(乳酸)嵌段的分子量为约1000至约15000g/mol。在一些实施例中，聚(乙二醇)嵌段的分子量为约1500至约14000g/mol，并且聚(乳酸)嵌段的分子量为约1500至约7000g/mol。
本公开的胶束可使用各种嵌段尺寸的PEG-b-PLA聚合物(例如，上述范围内的嵌段尺寸)和各种比例制备。例如，PEG:PLA比可为约1:10至约10:1，或在所述范围内的任何整数比例，包括但不限于1:5、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1和5:1。例如，该PEG-PLA聚合物的重均分子量(Ma)可包括但不限于2K-2K、3K-5K、5K-3K、5K-6K、6K-5K、6K-6K、8K-4K、4K-8K、12K-3K、3K-12K、12K-6K、6K-12K(分别为PEG-PLA)或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。
一个合适的含PLA聚合物为包含约1-3kDa(例如约2K道尔顿)的嵌段、比例约为50:50的PEG-PLA。这种方法的使用导致胶束中药物缀合负载的高水平。PEG-PLA分子量的其它具体实例包括4.2K-b-1.9K、5K-b-10K、12K-b-6K、2K-b-1.8K，以及下面实例中描述的那些。可用的其它合适的两亲性嵌段共聚物描述于美国专利第4,745,160号(Churchill等人)和第6,322,805号(Kim等人)中。药物-聚合物比例可为约1:20至约2:1，或在所述范围内的任何整数比例。合适的药物-聚合物比例的具体实例包括但不限于约2:1、约3:2、约1.2:1、约1:1、约3:5、约2:5、约1:2、约1:5、约1:7.5、约1:10、约1:20或在任何前述值之间并包括任何前述值的范围。
本技术的胶束可负载各种量的(包括大量的)本文所述的缀合物，特别是与仅具有游离药物/药物缀合物的相同胶束相比。例如，相对于胶束的质量，缀合物的负载量可为约2wt％至约60wt％。相对于胶束的质量，胶束中缀合物负载量的实例包括约3wt％、约4wt％、约5wt％、约10wt％、约15wt％、约20wt％、约25wt％、约30wt％、约35wt％、约40wt％、约45wt％、约50wt％、约55wt％或约60wt％，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。在一些实施例中，(紫杉醇/紫杉醇衍生物的)7-低聚乳酸缀合物的负载量可为约5wt％至约60wt％，包括约8wt％至约55wt％，(雷帕霉素/雷帕霉素衍生物的)40-低聚乳酸缀合物的负载量可为约5wt％至约50wt％，包括约7wt％至约45wt％，和/或(司美替尼/司美替尼衍生物的)2'-低聚乳酸缀合物的负载量可为约2wt％至约30wt％，包括约4wt％至约25wt％。
胶束中每种缀合物的负载量也可用浓度表示。例如，相对于组合物中水的体积，每种缀合物的浓度可为约0.5mg/mL至约40mg/mL。相对于组合物中水的体积，可通过本技术获得的每种缀合物浓度的实例包括约0.6mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL或约40mg/mL，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。在一些实施例中，7-低聚乳酸缀合物的浓度可为约1至约15mg/mL或甚至约2至约12mg/mL，40-低聚乳酸缀合物的浓度可为约1至约20mg/mL或甚至约1.5至约10mg/mL，和/或2'-低聚乳酸缀合物的浓度可为约0.5至约15mg/mL或甚至约1至约10mg/mL。
胶束中每种缀合物的负载量也可用负载效率表示。例如，相对于胶束的质量，每种缀合物的负载效率可为约25wt％至约100wt％。相对于胶束的质量，胶束中的缀合物负载效率的实例包括约30wt％、约35wt％、约40wt％、约45wt％、约50wt％、约55wt％、约60wt％、约65wt％、约70wt％、约75wt％、约80wt％、约85wt％、约90wt％、约95wt％、约99wt％或约100wt％，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。在一些实施例中，7-低聚乳酸缀合物的负载效率可为至少约85wt％，包括约90wt％至约100wt％，40-低聚乳酸缀合物的负载效率可为至少约75wt％，包括约80wt％至约90wt％，和/或2'-低聚乳酸缀合物的负载效率可为至少约25wt％，包括约30wt％至约55wt％。
在一些实施例中，本技术提供包含水和胶束的组合物，该胶束包括PEG-b-PLA和本文所述的7-低聚乳酸缀合物、40-低聚乳酸缀合物和2'-低聚乳酸缀合物中的至少一种，其中，相对于胶束的质量，7-低聚乳酸缀合物在胶束中的负载量为约1wt％至约60wt％，40-低聚乳酸缀合物的负载量为约1wt％至约50wt％，和/或2'-低聚乳酸缀合物的负载量为约1wt％至约30wt％；PEG-b-PLA的聚(乙二醇)嵌段的分子量为约1500至约14000g/mol，PEG-b-PLA的聚(乳酸)嵌段的分子量为约1500至约7000g/mol。这种组合物可包括本文所述的任何载药量(包括例如约5wt％至约60wt％，或约1至约15mg/mL或甚至约2至约12mg/mL)的任何7-低聚乳酸缀合物、(约5wt％至约50wt％，或约1至约20mg/mL或甚至约2至约10mg/mL)任何40-低聚乳酸缀合物和(约2wt％至约30wt％，或约1至约15mg/mL或甚至约2至约15mg/mL)任何2'-低聚乳酸缀合物。在一些实施例中，该组合物可包括任何如本文所述的7-低聚乳酸缀合物、40-低聚乳酸缀合物和2'-低聚乳酸缀合物。
存在于溶剂中的两亲性聚合物的两亲性单链以高于临界胶束浓度(CMC)的量聚集成胶束、具有疏水内部的核心冠状结构和亲水性外部或壳。药物或缀合物负载的PEG-b-PLA胶束的质子NMR光谱研究表明，虽然该胶束容易在水性环境中形成，但它们在有机溶剂如DMSO中分解。本胶束组合物通常基本上不含有机溶剂，例如，基于组合物的重量，小于约2wt％的乙醇、二甲基亚砜、蓖麻油和蓖麻油衍生物(即，聚乙氧基化的樟脑化合物诸如聚氧乙烯蓖麻油)。在一些实施例中，有机溶剂的量小于约1wt％，小于约0.5wt％，小于约0.1wt％或基本上不含可检测量的有机溶剂。
PEG-b-PLA胶束可以如下面本部分以及下面实例中所述制备。本文所述的胶束组合物可通过将水与含聚乳酸的聚合物和紫杉醇、雷帕霉素和司美替尼的3-药物/药物衍生物组合的混合物混合来制备。在另一个实施例中，本文所述的胶束组合物可通过将水与含聚乳酸的聚合物和至少一种本文所述的药物/药物衍生物缀合物的混合物混合来制备。在一些实施例中，该含聚乳酸的聚合物为PEG-b-PLA。
以下给出的程序仅仅是说明性的。如本领域技术人员容易认识到的，每种都可以根据所需的制备规模而有所不同。制备程序A、B和D的一个优点在于它们不需要如在程序C中那样透析胶束溶液。可以使用的其它方法包括水包油乳液和在Gaucher等人《控释杂志(J.Controlled Release)》109(2005)169-188所述的那些。
制备程序A：简单均衡。在一个实施例中，胶束制备可以如下进行。将PEG-b-PLA和至少一种如本文所述的低聚乳酸缀合物溶解在合适的水混溶性溶剂(诸如乙腈或二甲基乙酰胺)，任选混合和/或超声处理。该缀合物可相对于低聚乳酸是单分散的，或者可具有一系列不同长度的低聚乳酸。然后例如在减压下除去溶剂以提供聚合物-药物薄膜。将温热的无菌水(约50℃至约70℃)加入到该聚合物-药物缀合物膜中，并使混合物冷却。在加入温水后形成包封缀合物的聚合物胶束，然后可以例如通过过滤分离。
制备程序B：简单均衡。将至少一种如本文所述的药物缀合物和PEG-b-PLA(比例为例如1:7至1:10)溶解在2.5-5mL乙腈中。将该混合物混合并超声处理5分钟。然后通过在约60℃下旋转蒸发除去溶剂以提供膜。向该油中加入热(约60℃)去离子水，使溶液冷却至约23℃。然后在1.5mL微量管中、在约15000rpm下将该溶液离心约5分钟以除去沉淀物。收集上清液并通过0.2μm PTFE过滤器过滤。然后可以将分离的胶束在4℃下长时间储存。
制备程序C：透析。在另一个实施例中，胶束可以通过以下透析程序负载和形成。将PEG-b-PLA和至少一种如本文所述的所需比例的药物缀合物(例如，在1:20至20:1之间不等)溶解在水混溶性溶剂(诸如二甲基乙酰胺)中。然后将该混合物加入到3500MWCO管(Spectra/)透析袋中的水溶液(诸如0.9％盐水)中，随后形成胶束，掺入药物缀合物。然后可以将该胶束混合物离心(例如，以约16000rpm离心5分钟)以沉淀任何未掺入的药物缀合物。然后可以对上清液进行纳米过滤，并且可以使用HPLC进行分析，例如使用UV和RI检测模式(参见Yasugi等人《控释杂志(J.Control.Release)》1999,62,99-100中所述的技术)。
制备程序D：冷冻干燥。负载在PEG-b-PLA胶束中的至少一种本文所述的药物缀合物可以通过从叔丁醇-水混合物中冷冻干燥来制备。例如，可将2-20mg PEG4000-b-PLA2200(加拿大蒙特利尔的Advanced Polymer Materials公司)和1.0mg如本文所述的缀合物在60℃溶解于1.0mL叔-丁醇中，然后在剧烈混合下在60℃加入1.0mL预热的双蒸水。使该混合物在-70℃的干冰/乙醇冷却浴中冷冻。然后可以在隔板型冷冻干燥器中在-20℃搁板入口温度下进行冷冻干燥72小时，整个实验中在100微巴下。然后可以将冻干饼用1.0mL的0.9％盐水溶液在60℃下再水合，离心，通过0.22μm再生纤维素过滤器过滤，并通过HPLC分析。
类似地，负载有游离药物的PEG-b-PLA胶束可以如制备程序A-D中的任何一种所述来制备，以及如下文实施例中所述的通过用紫杉醇/紫杉醇衍生物、雷帕霉素/雷帕霉素衍生物和司美替尼/司美替尼衍生物的3-游离药物组合取代缀合物来制备。
一旦制备，胶束-缀合物或胶束-药物组合物可在冷藏下长时间储存，优选在低于约5℃的温度下储存。约-20℃至约4℃的温度被发现是储存大多数胶束-缀合物和胶束-药物组合物的适宜条件。例如，本缀合物负载胶束的水溶液可在约4℃下储存。如本文所述的冷冻干燥的胶束组合物可在-20℃下储存较长时间，然后再水化。使用棕色玻璃小瓶或其它不透明容器来保护该胶束组合物免受光照可以进一步延长该组合物的有效期。
另一方面，本技术提供抑制或杀死对紫杉醇或紫杉醇衍生物、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和/或司美替尼或司美替尼衍生物敏感的癌细胞的方法，其包含使该细胞与有效抑制或致死量的本文所述的任何组合物接触。在一些此类方法中，该接触在体外或体内进行。还提供了治疗方法，其包括给患有对紫杉醇或紫杉醇衍生物、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物、和/或司美替尼或司美替尼衍生物敏感的癌症的哺乳动物施用有效量的本文所述的任何胶束组合物。紫杉醇敏感性癌症、雷帕霉素敏感性癌症和司美替尼敏感性癌症的实例包括脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、血管肉瘤和白血病。在一些实施例中，该癌症为乳腺癌或肺癌。在一些实施例中，如本文所公开的两种或三种药物/药物衍生物或药物/药物衍生物缀合物的有效量是协同的，例如，它们具有超过相加作用或产生不能单独由药物或药物缀合物产生的效果。
在本文所述的本技术的任何实施例中，药物组合物可以单位剂型包装。该单位剂型可有效治疗癌症或再狭窄。通常，包括本技术的组合物的单位剂量将根据患者的考虑因素而不同。这些考虑因素包括例如年龄、方案、病症、性别、疾病程度、禁忌症、伴随治疗等。基于这些考虑因素的示例性单位剂量也可由本领域技术人员调整或修改。例如，包含本技术化合物的患者的单位剂量可以为1×10–4g/kg至1g/kg，优选为1×10–3g/kg至1.0g/kg。本技术化合物的剂量也可为0.01mg/kg至100mg/kg，或优选为0.1mg/kg至10mg/kg。
含有紫杉醇或紫杉醇衍生物、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和/或司美替尼或司美替尼衍生物的缀合物的胶束组合物可如本文所述制备并用于治疗癌症和心血管疾病。本文所述的缀合物和组合物可用于制备治疗再狭窄或癌症(诸如白血病、血管肉瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、脑癌(例如神经胶质瘤)、腺癌或肝细胞瘤)的制剂和药物。此类组合物可为例如颗粒、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、悬浮液或溶液的形式。本组合物可以配制用于各种给药途径，例如，通过肠胃外、直肠、鼻、阴道给药，或通过植入的基质或储库，或通过药物涂层支架或基于球囊的递送用于再狭窄。肠胃外或全身给药包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内和肌肉内注射。以下剂型是作为实例给出的，其不应被解释为限制本技术。
可注射剂型通常包括溶液或水性悬浮液或水包油悬浮液，其可使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂制备。可注射剂型可为溶液相或悬浮液形式，其用溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或溶媒包括无菌水、林格氏溶液或等渗盐水溶液。
对于注射，该药物制剂和/或药物可为适于用如上所述的适宜溶液重构的膜或粉末。这些的实例包括但不限于冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、无定形粉末、颗粒、沉淀物或颗粒。对于注射，该制剂可任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和这些的组合。在一些实施例中，可注射制剂包括等渗剂(例如，NaCl和/或右旋糖)、缓冲剂(例如磷酸盐)和/或防腐剂。
除了上述那些代表性剂型之外，药学上可接受的赋形剂和载体通常是本领域技术人员已知的，并因此包括在本技术中。此类赋形剂和载体描述于例如《雷明顿制药科学(Remingtons Pharmaceutical Sciences)》Mack Pub.公司，新泽西州(1991)中，其通过引用并入本文。
如下所述，本技术的制剂可设计为短效、速释、长效和缓释。因此，该药物制剂也可配制用于控释或缓释。
可根据受试者的病情、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、剂量间隔、给药途径、排泄速率和游离药物/缀合物的组合来调整具体剂量。含有有效量的任何上述剂型都在常规实验的范围内，因此，完全在本技术的范围内。仅举例来说，这种剂量可用于向患者施用有效量的游离药物/缀合物，且可包括约10mg/m2、约20mg/m2、约30mg/m2、约40mg/m2、约50mg/m2、约75mg/m2、约100mg/m2、约125mg/m2、约150mg/m2、约200mg/m2、约250mg/m2、约300mg/m2，或前述值中的任何两个值之间并且包括该任何两个值的范围。这些量可如本文所述肠胃外给药，并且可以在一段时间内进行，包括但不限于5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时、15小时、20小时、24小时或前述值之间并包括任何前述值的范围。给药频率可有所不同，例如，每1天、每2天、每3天、每周、每10天、每2周一次，或者包括任何前述频率之间并包括任何前述频率的范围。
对于本文所述的每个指示症状，与安慰剂治疗或其它合适的对照受试者相比，实验的受试者将表现出由受试者的病症引起或与之相关的一种或多种症状的10％、20％、30％、50％或更高的减少、高达75-90％，或95％或更高的减少。
在相关方面，提供了用于治疗受试者的方法，其中该方法涉及将本技术组合物的任一个实施例施用于患有癌症或心血管疾病的受试者。在该方法中，该癌症可为白血病、血管肉瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、脑癌(例如神经胶质瘤)、腺癌或肝细胞瘤。
在该方法的任何实施例中，该方法可包括施用药物组合物，其中该药物组合物包括本技术的缀合物或含有游离药物或缀合物的胶束的任一实施例以及药学上可接受的载体。
提供本文的实例以说明本技术的优点并进一步帮助本领域技术人员制备或使用本技术的缀合物和胶束组合物、其药物组合物、衍生物、代谢物、前药、外消旋混合物或互变异构形式。就游离药物/缀合物包括可电离的紫杉醇、雷帕霉素、司美替尼或其衍生物的游离药物/缀合物来说，也可使用盐，例如药学上可接受的盐。本文的实例还提供以便更全面地说明本技术的优选方面。实例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的本技术的范围。实例可包括或结合上述本技术的任何变型或方面。上面描述的变型或方面还可进一步包括或结合本技术的任何或所有其它变型或方面。
实例
材料所有化学品均购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)并按原样使用。分析级有机溶剂和所有其它试剂购自Fisher Scientific(宾夕法尼亚州匹兹堡)。PTX购自LCLaboratories(马萨诸塞州沃本)。PEG-b-PLA购自Advanced Polymer Materials公司(加拿大蒙特利尔)：PEG和PLA的Mn分别为4000和2200g/mol；PDI 1.05。A549人肺腺癌细胞购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)并在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中于37℃、5％CO2培养箱中生长。
仪器质子核磁共振(1H NMR)数据在Varian Unity-Inova双通道400MHz NMR光谱仪(加利福尼亚州帕洛阿尔托)上记录，调节温度为25℃。相对于CDCl3在7.26ppm处的残余质子化溶剂共振，以百万分率(ppm)报告化学位移(δ)。使用威斯康星大学麦迪逊分校化学系化学仪器中心的Waters LCT(ESI-TOF)获得质谱数据。样品从10mM NH4OAc/CH3CN溶液中喷射。使用配备有LC-20AT泵、SIL-20AC HT自动进样器、CTO-20AC柱温箱和SPD-M20A二极管阵列检测器的Shimadzu Prominence HPLC系统(日本岛津)进行反相HPLC(RP-HPLC)分析。通过Waters Symmetry ShieldTM RP18柱(4.6mm×250mm，5μm，)分离样品。在0.8mL/min的流速、25℃的柱温和227nm的UV检测波长下注入10μL样品。o(LA)n-PTX转化产物的分离在梯度模式下用含有100％CH3CN作为溶剂A的有机相和含有100％milliQ水作为溶剂B的水相进行。按如下使用梯度洗脱：0分钟，50％溶剂A和50％溶剂B；35分钟，95％溶剂A和5％溶剂B；和40分钟平衡。通过动态光散射法(DLS)测量PEG-b-PLA胶束的流体动力学直径，该方法采用Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments公司，英国)，25℃，173°的检测角和He-Ne离子激光器作为光源(4mW，633nm)。在测量之前，用milliQ水或PBS(10mM，pH 7.4)稀释PEG-b-PLA胶束溶液以提供约0.1mg/mL的PEG-b-PLA水平，并将1mL每种样品置于一次性施胶比色皿(sizing cuvette)(BRAND聚苯乙烯比色皿)中。使用累积量法对相关函数进行曲线拟合，并分别用Stokes-Einstein方程和相关函数的斜率计算PEG-b-PLA胶束的z-平均直径和多分散指数(PDI)。所有测量重复三次。
叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)-o(LA)n的合成。简言之，通过环状L-丙交酯的开环合成单分散TBS-o(LA)8和TBS-o(LA)16，然后进行保护-脱保护以提供单官能低聚物，分别使用TBS醚和苄基酯作为羟基和羧酸基团的保护基团(参见Takizawa,K.等人《高分子科学杂志A辑高分子化学(J.Polym.Sci.A Polym.Chem.)》46,5977-5990(2008)(通过引用并入本文))。通过单官能低聚物的选择性逐步酯缀合，然后进行正交脱保护，分别得到TBS-o(LA)8和TBS-o(LA)16。TBS-o(LA)8的1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝5.26-5.05(m,7H),4.40(q,J＝6.6Hz,1H),1.69-1.37(m,24H),0.90(s,9H),0.11(s,3H),0.08(s,3H)；1H NMR of TBS-LA16(400MHz,CDCl3):δ＝5.23-5.09(m,15H),4.40(q,J＝6.1Hz,1H),1.71-1.34(m,48H),0.90(s,9H),0.11(s,3H),0.08(s,3H)。
三乙基甲硅烷基(TES)-o(LA)n的合成。简言之，通过保护-脱保护合成单分散TES-o(LA)8，得到单官能低聚物，分别使用TES醚和苄基酯作为羟基和羧酸基团的保护基团。通过单官能低聚物的选择性逐步酯缀合，然后正交脱保护得到TES-o(LA)8。(收率：99％)。TES-o(LA)8的1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.19-5.12(m,7H),4.40(q,J＝7.0Hz,6H),1.59-1.54(m,21H),1.45(d,J＝6.5Hz,3H),0.96(t,J＝7.5Hz,9H),0.62(q,J＝8.0Hz,6H)。
低聚乳酸苄酯，Bn-o(LA)n的合成。通过锡(II)-乙基己酸酯(Sn(Oct)2)引发多分散Bn-o(LA)n的合成。例如，在平均聚合度为8的情况下，将环状L-丙交酯与苯甲醇以4:1的摩尔比混合。将混合物在130℃下搅拌直至熔融。随后，加入0.01w/w％的Sn(Oct)2的甲苯溶液(100mg/mL)。将该混合物在130℃下搅拌4小时，并使其冷却至室温，得到多分散的Bn-o(LA)n。使用C18反相柱色谱，通过CombiFlash Rf 4x系统纯化单分散Bn-o(LA)n。应用0.1％甲酸中的乙腈在和0.1％甲酸中的水进行梯度洗脱。将纯化的产物减压浓缩，得到无色液体。(收率：Bn-O(LA)8，约8-12％)。预期1H NMR和MS数据与所需产物一致。
2'-TBS-PTX的合成。如先前在Forrest,M.L.等人《药学研究(Pharm.Res.)》25,194-206(2008)；Ali,S.等人《抗癌药物(Anti-Cancer Drugs)》12,117-128(2001)(均通过引用并入本文)中报道的那样，稍作修改，合成2'-TBS-PTX。将叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBSCl)(90mg，0.6mmol)和咪唑(Im)(82mg，1.2mmol)溶解于PTX(250mg，0.3mmol)的无水DMF(2.0mL)溶液中。将该反应混合物在室温下在氩气下搅拌过夜。将过量的乙酸乙酯(40mL)倒入该反应混合物中，然后用H2O(1×40mL)和饱和NH4Cl(1×40mL)溶液洗涤。然后收集有机层，用MgSO4干燥并过滤。减压除去溶剂，并通过CombiFlash Rf 4x系统(内布拉斯加州林肯市)使用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱纯化所得浓缩物。减压浓缩该纯化产物，得到白色固体(收率：88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.27-7.29(m,15H),7.07(d,J＝9.0Hz,1H),6.36-6.20(m,2H),5.74(d,J＝9.0Hz,1H),5.69(d,J＝7.5Hz,1H),4.98(d,J＝9.4Hz,1H),4.66(s,1H),4.43(d,J＝5.5Hz,1H),4.33(d,J＝8.1Hz,1H),4.22(d,J＝8.8Hz,1H),3.83(d,J＝7.5Hz,1H),2.63-2.51(m,4H),2.49-2.35(m,2H),2.23(s,3H),2.13(dd,J＝8.8,14.9Hz,1H),1.97-1.85(m,4H),1.69(s,3H),1.24(s,3H),1.14(s,3H),0.80(s,9H),-0.04(s,3H),-0.29(s,3H)。
2'-TBS-PTX-o(LA)n-TBS的合成。将1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)(60mg，0.3mmol)和4-(二甲基氨基)-吡啶对甲苯磺酸盐(DPTS)(15mg，0.05mmol)加入到含有2'-TBS-PTX(200mg，0.2mmol)和TBS-o(LA)8(300mg，0.2mmol)或TBS-o(LA)16(420mg，0.2mmol)的无水CH2Cl2(5.0mL)中。将该反应混合物在室温下在氩气下搅拌过夜。过滤所得混合物并用H2O(1×10mL)和饱和NaHCO3(1×10mL)溶液洗涤。然后收集有机层，用MgSO4干燥并过滤。减压除去溶剂，并通过CombiFlash Rf 4x系统使用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱纯化所得浓缩物。将该纯化产物在减压下浓缩，得到白色固体(产率：2'-TBS-PTX-o(LA)8-TBS，20％；2'-TBS-PTX-o(LA)16-TBS，24％)。2'-TBS-PTX-o(LA)8-TBS的1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.18-7.28(m,15H),7.08(d,J＝9.2Hz,1H),6.33(s,1H),6.24(t,J＝9.2Hz,1H),5.79-5.68(m,2H),5.64-5.53(m,1H),5.24-5.06(m,7H),4.95(d,J＝9.4Hz,1H),4.66(s,1H),4.44-4.36(m,1H),4.34(d,J＝8.8Hz,1H),4.21(d,J＝8.4Hz,1H),3.96(d,J＝6.6Hz,1H),2.68-2.54(m,4H),2.42(dd,J＝9.8,15.1Hz,1H),2.21-2.10(m,4H),1.97(s,3H),1.93-1.84(m,1H),1.82(br,3H),1.67-1.39(m,24H),1.19(s,3H),1.16(s,3H),0.90(s,9H),0.80(s,9H),0.10(s,3H),0.08(s,3H),-0.03(s,3H),-0.30(s,3H)；2'-TBS-PTX-o(LA)16-TBS的1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.16-7.28(m,15H),7.10-7.05(m,1H),6.33(s,1H),6.29-6.19(m,1H),5.72(s,2H),5.65-5.55(m,1H),5.23-5.06(m,15H),4.99-4.90(m,1H),4.66(d,J＝1.6Hz,1H),4.43-4.36(m,1H),4.36-4.31(m,1H),4.26-4.18(m,1H),3.99-3.91(m,1H),2.57(s,4H),2.48-2.35(m,1H),2.19-2.09(m,4H),1.97(s,3H),1.93-1.83(m,1H),1.81(s,3H),1.67-1.37(m,48H),1.19(s,3H),1.15(s,3H),0.90(s,9H),0.79(s,9H),0.10(s,2H),0.08(s,2H),-0.03(s,3H),-0.30(s,3H)。
o(LA)n-PTX缀合物的合成。向2'-TBS-PTX-o(LA)8-TBS(85mg，0.06mmol)或2'-TBS-PTX-o(LA)16-TBS(120mg，0.06mmol)的无水THF溶液(2mL)中逐渐加入乙酸(72mg，1.2mmol)和四丁基氟化铵(TBAF)(1.0M THF溶液)(63mg，0.24mmol)。将该反应混合物在室温下在氩气下搅拌过夜。将过量的乙酸乙酯(40mL)倒入该反应混合物中，并用饱和NaHCO3(2×40mL)溶液、5wt％柠檬酸水溶液(2×40mL)和H2O(1×40mL)洗涤。然后收集有机层，用MgSO4干燥并过滤。减压除去溶剂，并通过CombiFlash Rf 4x系统使用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱纯化所得浓缩物。将该纯化产物在减压下浓缩，得到白色固体(产率：o(LA)8-PTX，70％；o(LA)16-PTX，72％)。o(LA)8-PTX的1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.17-7.31(m,15H),7.01(d,J＝8.9Hz,1H),6.29(s,1H),6.23-6.13(m,1H),5.85-5.75(m,1H),5.68(d,J＝7.0Hz,1H),5.62-5.47(m,1H),5.33-5.02(m,7H),4.91(d,J＝8.5Hz,1H),4.79(dd,J＝2.5,4.9Hz,1H),4.38-4.33(m,1H),4.32(d,J＝8.3Hz,1H),4.19(d,J＝7.8Hz,1H),3.92(d,J＝6.8Hz,1H),3.54(d,J＝4.9Hz,1H),2.67-2.55(m,2H),2.38(s,3H),2.33(d,J＝8.1Hz,1H),2.15(s,3H),1.84(s,4H),1.81(s,3H),1.64-1.46(m,24H),1.20(s,3H),1.16(s,3H).ESI-TOF：C71H83NO30[M+NH4]+的m/z计算值：1447.5；实测值：1447.2。o(LA)16-PTX的1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.21-7.30(m,15H),7.09-6.95(m,1H),6.29(s,1H),6.23-6.11(m,1H),5.84-5.75(m,1H),5.73-5.65(m,1H),5.61-5.49(m,1H),5.33-5.04(m,15H),4.91(d,J＝9.4Hz,1H),4.84-4.74(m,1H),4.40-4.33(m,1H),4.33-4.29(m,1H),4.23-4.16(m,1H),3.92(d,J＝6.6Hz,1H),3.55(d,J＝5.3Hz,1H),2.71-2.53(m,2H),2.38(s,3H),2.33(d,J＝8.0Hz,1H),2.15(s,3H),1.84(s,4H),1.81(s,3H),1.66-1.45(m,48H),1.20(s,3H),1.16(s,3H).ESI-TOF：C95H115NO46[M+Na]+的m/z计算值：2029.3；实测值：2029.4。
o(LA)n-RAP-TES缀合物的合成。将1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)(100mg，0.49mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(12mg，0.10mmol)加入到含有RAP(298mg，0.33mmol)和TES-o(LA)8(254mg，0.36mmol)的无水CH2Cl2(5mL)中。将该反应混合物在室温下在氩气下搅拌过夜，并通过TLC确定反应完成。减压浓缩所得混合物，并通过CombiFlash Rf 4x系统使用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱纯化所得残余物。减压浓缩该纯化产物，得到RAP-o(LA)8-TES(296mg，产率：57％)。RAP-40-o(LA)8–TES的1H NMR(500MHz,CDCl3,主旋转异构体):δ6.38(dd,J＝10.5,15.0Hz,1H),6.30(dd,J＝10.0,15.0Hz,1H),6.14(dd,J＝10.0,15.0Hz,1H),5.96(d,J＝11.0Hz,1H),5.54(dd,J＝9.0,15.0Hz,1H),5.41(d,J＝9.5Hz,1H),5.28(d,J＝6.0Hz,1H),5.19-5.11(m,8H),4.77(s,1H),4.71(ddd,J＝5.0,9.5,11.5Hz,1H),4.40(q,J＝6.5Hz,1H),4.17(d,J＝6.0Hz,1H),3.74(d,J＝6.0Hz,1H),3.57(d,J＝14.0Hz,1H),3.37(s,3H),3.33(s,3H),3.14(s,3H),2.71(dd,J＝6.0,17.0Hz,1H),1.51(d,J＝7.0Hz,3H),1.50(d,J＝7.0Hz,3H),1.09(d,J＝6.5Hz,3H),1..05(d,J＝6.5Hz,3H),0.99-0.94(m,15H),0.90(d,J＝7.0Hz,3H),0.63(q,J＝8.0Hz,6H)。
o(LA)n-RAP缀合物的合成。向RAP-o(LA)8-TES(272mg，0.17mmol)的THF(9mL)溶液中依次加入吡啶(0.41mL，5.08mmol)和HF/Pyr(0.13mL，5.08mmol，70％HF)。将该反应混合物在室温下在氩气下搅拌1小时，然后用饱和NaHCO3水溶液淬灭。将该混合物用EtOAc(3x40mL)萃取，并将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩，得到粗混合物，将其通过CombiFlash Rf 4x系统用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱纯化，得到纯的o(LA)8-RAP缀合物，其为白色固体(219mg，87％)。o(LA)8-RAP的1H NMR(500MHz,CDCl3,主旋转异构体):δ6.38(dd,J＝10.5,14.5Hz,1H),6.31(dd,J＝10.0,15.0Hz,1H),6.14(dd,J＝10.0,15.0Hz,1H),5.96(d,J＝11.0Hz,1H),5.54(dd,J＝9.0,15.0Hz,1H),5.41(d,J＝9.5Hz,1H),5.28(d,J＝6.5Hz,1H),5.24-5.11(m,8H),4.77(s,1H),4.71(ddd,J＝5.0,9.0,11.5Hz,1H),4.18(d,J＝6.0Hz,1H),3.74(d,J＝5.5Hz,1H),3.67(q,J＝7.0Hz,1H),3.57(d,J＝20.5Hz),3.37(s,3H),3.33(s,3H),3.14(s,3H),2.71(dd,J＝5.5,17.0Hz,1H),2.66(d,J＝6.0Hz,1H),2.57(dd,J＝5.5,17.0Hz,1H),1.09(d,J＝6.5Hz,3H),1.05(d,J＝7.0Hz,3H),0.99(d,J＝6.5Hz,3H),0.95(d,J＝6.5Hz,3H),0.90(d,J＝7.0Hz,3H)。
o(LA)n-SEL缀合物的合成。在室温和氩气下，向SEL(153mg，0.33mmol)和TES-o(LA)8(260mg，0.38mmol)的DMF(3.3mL)溶液中依次加入HOBT(75mg，0.50mmol)、DCC(103mg，0.50mmol)和DMAP(12mg，0.10mmol)。搅拌过夜后，将该反应减压浓缩，得到粗混合物，将其通过CombiFlash Rf 4x系统使用己烷和乙酸乙酯的梯度洗脱进一步纯化，得到纯o(LA)8-SEL缀合物(176mg，51％)。o(LA)8-SEL的1H NMR(500MHz,CDCl3):δ10.25(s,1H),7.99(s,1H),7.93(s,1H),7.52(d,J＝2.0Hz,1H),7.14(dd,J＝2.0,9.0Hz,1H),6.65(s,1H),6.36(dd,J＝2.0,9.0Hz,1H),5.24-5.09(m,7H),4.38-4.31(m,2H),4.23-4.19(m,1H),4.07-4.06(m,2H),3.93(s,3H),2.70(d,J＝6.0Hz,1H),1.60-1.48(m,24H).HRMS(QTOF MS ESI)C41H48BrClFN4O19[M+H]+m/e计算值：1035.1749，实测值：1035.1758。
o(LA)8-PTX缀合物的还原性降解。如先前在Magri,N.F.等人《有机化学杂志(J.Org.Chem)》51,3239-3242(1986)(通过引用并入本文)中报道的那样，实现了o(LA)8-PTX在C-13位的还原性降解。简言之，在氩气下用Bu4NBH4(1.2mg，14μmol)处理o(LA)8-PTX(10mg，7μmol)或PTX(6mg，7μmol)的无水CH2Cl2(2mL)溶液2小时。加入一滴乙酸终止反应，然后在真空下除去溶剂。将残留的固体重新溶解在CH3CN中并通过RP-HPLC分析。从o(LA)8-PTX的降解产物中收集所需的(1S,2R)-N-(2,3-二羟基-1-苯基-丙基)-苯甲酰胺(DPPB)和o-LA8缀合的浆果赤霉素III(OLA8Bac)级分并通过质谱分析。结果与仅在PTX的7-OH位置偶联o(LA)8一致。DPPB的ESI-TOF：C16H17NO3[M+Na]+的m/z计算值：294.1；实测值：294.1。o(LA)8Bac的ESI-TOF：C55H70O27[M+NH4]+的m/z计算值：1180.4；实测值：1180.6。
含有PTX、o(LA)8-PTX和o(LA)16-PTX的PEG-b-PLA胶束的制备和表征。如先前在Shin,H.等人《分子药剂学(Mol.Pharm.)》8,1257-1265(2011)(通过引用并入本文)中报道的薄膜水合方法将PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX负载至PEG-b-PLA胶束中。简言之，将PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX(1.0mg)和PEG-b-PLA(10.0mg)溶于圆底烧瓶中的1.0mL CH3CN中；使用旋转蒸发器在60℃下通过减压除去CH3CN以获得干燥的薄膜。通过加入无菌水或PBS(10mM，pH 7.4)溶解该聚合物膜，然后以13000rpm离心5分钟并无菌过滤(0.22μm(纽约州科宁市)。通过RP-HPLC定量PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX的水溶解度、载药效率和载药量。通过将负载在PEG-b-PLA胶束中的PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX的水平除以用于药物负载的初始药物或缀合物水平来计算载药效率。基于PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX的重量除以PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX加PEG-b-PLA胶束的总重量计算载药量。类似地，制备并表征含有RAP、o(LA)8-RAP、SEL或o(LA)8-SEL的PEG-b-PLA胶束。
o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物在CH3CN/PBS混合物中和在PBS中的PEG-b-PLA胶束中的转化。通过RP-HPLC分析o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX在CH3CN和PBS(10mM，pH 7.4)的(1:1)混合物中的转化。将o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX(1.0mg/mL)的溶液置于1.5mLEppendorf管中，并在37℃下在温度调节的水浴(GCA公司，伊利诺斯州)中温育。在预定时间点抽取20μL溶液，并用180μL CH3CN稀释。类似地，测量o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX在PEG-b-PLA胶束(1.0mg/mL，在水中)的转化率。在预定时间点抽取20μL溶液，离心，过滤(0.22μm)并用180μL CH3CN稀释。样品制备后立即进行RP-HPLC分析。计算o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX的降解动力学的一级常数。o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX的转化用标准偏差评价至少三次。类似地，进行了o(LA)8-RAP和o(LA)8-SEL的转化。
体外释放研究。将PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物负载至PEG-b-PLA胶束中后，使用PBS溶液(10mM，pH 7.4)将样品稀释至0.5mg/mL，并将2.5mL稀释的胶束溶液加载到具有MWCO 20K的Slide-A-LyzerTM透析盒(Thermo Scientific，马萨诸塞州)中。将四个透析盒置于37℃的Corning Hotplate Stirrer(纽约州科宁市)上的4L PBS溶液(10mM，pH 7.4)中。采样时间间隔为0、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72小时。在每个时间点，取出100μL样品，并将透析盒补充100μL新鲜PBS溶液(10mM，pH 7.4)。在2、4、8、12、24和48小时用4L新鲜缓冲液替换外部培养基以接近沉降条件。通过RP-HPLC分析测定PEG-b-PLA胶束中剩余的PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX的量，并且计算随着时间药物释放百分比以及一级速率常数。
体外细胞毒性研究。通过CellTiter-细胞活力检测(Promega，威斯康星州)研究PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX(游离和胶束相关)对A549非小肺癌细胞系的细胞毒性。将细胞以1500个细胞/100μL/孔的接种密度接种到96孔板中，并在37℃、5％CO2培养箱中，RPMI 1640培养基中培养24小时。将PTX、o(LA)2-PTX或o(LA)8-PTX溶解于DMSO中，而含有PEG-b-PLA胶束的PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX在PBS溶液(10mM，pH 7.4)中溶解。将各自加入孔中以达到0.1、1、10、100和1000nM的终浓度。在所有药物水平下，培养基中DMSO的最终水平<0.1％。用稀释的DMSO或PBS在培养基中培养的细胞作对照。将药物处理的细胞置于5％CO2的37℃培养箱中72小时。吸出各孔中的培养基，并加入在无血清RPMI培养基中的100μL 20％(v/v)CellTiter-Blue试剂，然后在37℃、5％CO2气氛中温育1.5小时。在激发和发射分别为560和590nm下，通过SpectraMax M2读板仪(Molecular Devices，加利福尼亚州)测量荧光强度。通过使用用于Windows的GraphPad Prism版本5.00(GraphPad Software，加利福尼亚州)测定半数最大抑制药物浓度(IC50)。类似地，考察了RAP、o(LA)8-RAP、SEL和o(LA)8-SEL(游离和胶束相关)对A549非小肺癌细胞系的细胞毒性。
体内抗肿瘤功效。所有动物实验均在威斯康星大学麦迪逊分校的实验动物护理和使用委员会批准的方案下根据机构和NIH实验动物护理和使用指南进行。从威斯康星大学麦迪逊分校医学与公共卫生学院的实验室动物资源中获得6-8周龄的雌性无胸腺裸鼠(每只20-25g)。将小鼠圈养在通风笼中，自由获取水和食物，并在肿瘤细胞注射前适应1周。在胰蛋白酶消化后从亚融合培养物中收获A549细胞(100μL无血清RPMI 1640培养基中的2×106个细胞)，并皮下注射到每只小鼠的右胁腹中。当肿瘤体积达到约150mm3时，将小鼠随机分成3个治疗组(n＝3-4/组)：负载有PTX的PEG-b-PLA胶束，20mg/kg；负载有o(LA)8-PTX的PEG-b-PLA胶束，20mg/kg PTX当量；和空白的PEG-b-PLA胶束。通过尾静脉施用药物缀合物，每周注射3次，然后休息1周，在12周时间内共计3个周期。在整个研究过程中监测体重和肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：V＝(a×b2)/2，其中V为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
数据分析。进行5％显著性水平的t检验或5％显著性水平的单向ANOVA以用于统计学分析。所有数据分析均使用适用于Windows的GraphPad Prism 5.00版(GraphPadSoftware，加利福尼亚州)进行。
结果。
含有PTX、RAP、SEL及其o(LA)n-缀合物的PEG-b-PLA胶束的表征。含有PTX、o(LA)8-PTX缀合物或o(LA)16-PTX缀合物的PEG-b-PLA胶束的理化性质总结于表1A中。含有RAP或o(LA)8-RAP缀合物的PEG-b-PLA胶束的理化性质总结于表1B中。含有SEL或o(LA)8-SEL缀合物的PEG-b-PLA胶束的理化性质总结于表1C中。
表1A含有PTX、o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物的PEG-b-PLA胶束的理化性质。
a)在每种制剂中使用10mg PEG-b-PLA。(平均值±SD，n＝3)
PEG-b-PLA胶束将PTX的水溶解度从约10mg/L增加至0.9mg/mL，形成平均流体动力学直径为30.5nm和8.6％载药量的胶束。然而，通过药物负载中所用PTX的初始水平增加6倍未能实现PTX的水溶性的增加。相反，PTX的负载效率低，约为21％，并且PEG-b-PLA胶束的载药量在载药量为11.2％时趋于稳定。值得注意的是，含有PTX的PEG-b-PLA胶束在室温下不稳定，在不到2小时内沉淀。相比之下，PEG-b-PLA胶束的o(LA)8-PTX缀合物的载药量分别从8.7％增加至37.1％和54.5％，在缀合物的初始水平上分别增加了6倍和12倍，并且负载效率为约100％。含有37.1％和54.5％的o(LA)8-PTX缀合物的PEG-b-PLA胶束的流体动力学直径分别增加至58.8nm和100nm。对于PEG-b-PLA胶束，o(LA)16-PTX缀合物的载药量也高于PTX，在水中为约39％和6.2mg/mL。值得注意的是，含有o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物的PEG-b-PLA胶束在37℃下稳定超过72小时，表明o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物溶解的热力学稳定性。在9％载药量和30nm的粒径下，PEG-b-PLA胶束在体外快速释放PTX，导致PTX沉淀<4小时(图4)。相比之下，o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物自PEG-b-PLA胶束的体外释放(图4)是逐渐的，t1/2分别为14.2小时和26.5小时，表明通过调节o(LA)n链长度可控制缀合物释放。这些结果表明，低聚乳酸作为本缀合物和PEG-b-PLA胶束之间的相容剂起作用，导致与PTX相比载药量、物理稳定性和药物释放的改善。
表1B含有RAP或o(LA)8-RAP缀合物的PEG-b-PLA胶束的理化性质。
PEG-b-PLA胶束的RAP载药量为6.4％，并且在11.5％的载药量下趋于稳定，具有23％的低载药效率。相比之下，PEG-b-PLA胶束的o(LA)8-RAP缀合物的载药量更高，从7.3％增加至13.6％和43.9％，载药效率大于80％。含有13.6％和43.9％的o(LA)8-RAP缀合物的PEG-b-PLA胶束的流体动力学直径分别增加至60.8nm和96nm。值得注意的是，含有7.3％和13.6％o(LA)8-RAP的PEG-b-PLA胶束在37℃下稳定超过24小时，表明o(LA)8-RAP缀合物在体外溶解的热力学稳定性。相反，所有含有未缀合的RAP的PEG-b-PLA胶束在不到24小时内释放RAP。这些结果表明，低聚乳酸作为本缀合物和PEG-b-PLA胶束之间的相容剂起作用，导致与RAP相比载药量和物理稳定性的改善。
表1C含有SEL或o(LA)8-SEL缀合物的PEG-b-PLA胶束的理化性质。
PEG-b-PLA胶束的SEL载药量为1％，载药效率非常低，为5％。相比之下，PEG-b-PLA胶束的o(LA)8-SEL缀合物的载药量更高，从4.1％增加至9.9％和23.5％，载药效率大于30％。含有9.9％和2.5％的o(LA)8-SEL缀合物的PEG-b-PLA胶束的流体动力学直径分别增加至126nm和101nm。值得注意的是，含有4.1％o(LA)8-RAP的PEG-b-PLA胶束在37℃下稳定超过24小时，表明o(LA)8-SEL缀合物在体外溶解的热力学稳定性。相反，含有未缀合的SEL的PEG-b-PLA胶束不稳定，并且SEL在约5分钟内沉淀出来。这些结果表明，低聚乳酸作为本缀合物和PEG-b-PLA胶束之间的相容剂起作用，导致与SEL相比载药量和物理稳定性的改善。
含有未缀合的PTX、SEL和RAP的3-药物组合的PEG-b-PLA胶束的表征。含有PTX、SEL和RAP的PEG-b-PLA胶束作为3合1胶束的理化性质总结于表2中。如表1C中所提供的，PEG-b-PLA胶束的SEL载药量非常低，为1％，载药效率低，为5％。另外，含有未缀合的SEL的PEG-b-PLA胶束不稳定，并且SEL在约5分钟内沉淀出来。相反，当共同负载PTX和RAP时，SEL在PEG-b-PLA胶束中以6.3％成功负载。出乎意料的是，当共同负载时，PTX、RAP和SEL均达到100％的载药效率。这些结果表明，与PEG-b-PLA胶束中的单独载药相比，3-药物组合在PEG-b-PLA胶束的共同负载改善了载药量和物理稳定性。
表2含有PTX、SEL和RAP的PEG-b-PLA胶束作为3合1胶束的理化性质。
a)使用21mg PEG4000-b-PLA2200聚合物。
o(LA)8-PTX、o(LA)16-PTX、o(LA)8-RAP和o(LA)8-SEL缀合物的转化。在乙腈和PBS缓冲液(pH 7.4，10mM)的1:1混合物中，为获得溶解度，o(LA)8-PTX缀合物在约23分钟洗脱，并且在转化时，其产生了一系列明确的峰，洗脱时间更短，接近PTX的洗脱时间，约12分钟(图2A)。主要峰被指定为o(LA)8-PTX的偶数降解产物，其在反咬时失去乳酰乳酸酯：o(LA)6-PTX、o(LA)4-PTX、o(LA)2-PTX和PTX，而明显较小的峰对应于来自随机水解的奇数降解产物。将o(LA)8-PTX缀合物、偶数降解产物和o(LA)1-PTX的相对面积(％)对时间作图(图5A)。o(LA)8-PTX缀合物转化的t1/2为约7.3小时，产生o(LA)2-PTX作为主要种类，并且在较小程度上产生o(LA)1-PTX和PTX超过300小时。类似地，o(LA)16-PTX缀合物基于反相HPLC分析产生了反咬降解曲线(图2B、5B)：t1/2为7.4小时，且偶数降解产物主要为o(LA)2-PTX。另一方面，PEG-b-PLA胶束中o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物的转化显著减慢：t1/2分别为157小时和315小时(图7A和7B)，与非极性环境(PLA核心)中受阻的反咬反应一致。o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物在水溶液中的转化似乎通过反咬反应快速进行，但在水中的PEG-b-PLA胶束中缓慢进行。因此，PEG-b-PLA胶束可以稳定携带o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物，并且在释放时，o(LA)8-PTX或o(LA)16-PTX缀合物经历快速反咬，主要产生o(LA)2-PTX，并且在较小程度上产生o(LA)1-PTX和PTX。类似地，图10A和11A提供o(LA)8-RAP的转换，并且图10B和11B提供o(LA)8-SEL的转换。
o(LA)8-PTX、o(LA)16-PTX、o(LA)8-RAP和o(LA)8-SEL缀合物的体外和体内抗癌活性。PTX是一种有效的抗癌剂，作为微管稳定剂，在非小细胞肺癌的治疗中发挥着重要作用。相应地，对于人A549非小癌细胞系，PTX具有低IC50值，为2.0nM(图6)。游离形式的o(LA)8-PTX具有略高的IC50值，为8.9nM，反映了转化所需的时间。o(LA)8-PTX和o(LA)16-PTX作为胶束的IC50值约高7倍，约15nM，反映了从PEG-b-PLA胶束释放所需的时间(超过72小时)。值得注意的是，由反咬产生的主要种类o(LA)2-PTX在体外与PTX等效。因此，紫杉醇在7-OH位置的2个乳酸亚基不干扰微管稳定化，将o(LA)2-PTX、o(LA)1-PTX和PTX定义为生物活性物质。相反，2'-OH酯缀合物需要完全转化回PTX以获得细胞毒性。总之，o(LA)8-PTX缀合物的反咬产生细胞毒性种类，主要为o(LA)2-PTX，而不依赖于转化酯酶，从而实现PEG-b-PLA胶束的新型前药策略。类似地，图12A和12B提供了RAP胶束、o(LA)8-RAP胶束、SEL、o(LA)8-SEL和o(LA)8-SEL胶束组合物的细胞毒性。
在每周尾静脉注射20mg/kg的剂量后，在A549异种移植物模型中评估含有PTX或o(LA)8-PTX前药的PEG-b-PLA胶束的体内抗癌功效(图8)。由于其临床相关性(每周3次注射和一周休息×3次循环)，评估PTX或o(LA)8-PTX缀合物的每周IV注射方案。使用含有20mg/kg PTX的PEG-b-PLA胶束，A549肿瘤的生长与溶媒对照的肿瘤生长平行约2周，随后在治疗期间肿瘤生长抑制超过71天并延迟肿瘤生长。相比之下，含有20mg/kg的o(LA)8-PTX缀合物的PEG-b-PLA胶束在每周治疗期间减少肿瘤体积超过71天而没有复发直至120天(图8)。出乎意料的是，就体重变化而言，o(LA)8-PTX缀合物的毒性也低于PTX(图8)。
PTX酯前药通常是水溶性的，并且毒性较小，但作为抗癌剂活性较低。然而，就A549异种移植模型中的反咬转化、物理稳定性、较低毒性和较高抗肿瘤功效而言，本PEG-b-PLA胶束缀合物为独特的抗癌组合物。鉴于本缀合物相对于PTX的体外释放较慢，预期这些缀合物将PTX分布减少至非靶组织，(通过EPR效应)增加肿瘤暴露并通过反咬进行肿瘤内转化。含有本缀合物的小尺寸的PEG-b-PLA胶束(例如，对于o(LA)8-PTX，约30nm)有利于EPR效应，并且PTX的低Cmax使得该缀合物有利于低宿主毒性，特别是与含有PTX的PEG-b-PLA胶束相比(参见Cabral,H.等人《自然·纳米技术(Nat.Nanotechnol.)》6,815-823(2011))。
PTX、SEL和RAP单独和组合的体外抗癌活性。表3显示组合中的PTX、RAP和SEL的IC50值低于单独的药物，表明3-药物组合似乎在体外实现协同作用。
表3用于A549NSCLC细胞系，PTX、SEL和RAP的单独的、2-药物组合和3-药物组合的IC50值和组合指数分析。
等效内容
虽然已经说明和描述了某些实施例，但是本领域技术人员在阅读前述说明书后可以对本技术的缀合物和胶束或本文所述的衍生物、前药或药物组合物进行改变、等效替换和其它类型的改变。上面描述的每个方面和实施例也可以包括或结合关于任何或所有其它方面和实施例公开的这些变型或方面。
本技术也不限于本文描述的特定方面，其旨在作为本技术的个别方面的单个说明。在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，根据前述描述，本技术范围内的功能等效方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。应理解，本技术不限于特定的方法、缀合物、试剂、化合物、组合物、标记化合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不是限制性的。因此，本说明书仅被认为是示例性的，本技术的广度、范围和精神仅由所附权利要求书、其中的定义及其任何等效物表示。
本文说明性描述的实施例可适当地在缺少本文未具体公开的任何要素、限定的情况下实施。因此，例如，术语“包含”，“包括”，“含有”等应当被广泛地理解而不受限制。另外，本文所用术语和表达已被用作描述而非限制的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到，在所要求保护的技术的范围内可以进行各种修改。另外，短语“基本上由……组成”将被理解为包括具体叙述的那些元素和那些不会实质上影响所要求保护的技术的基本和新颖特征的其它元素。短语“由……组成”排除了未指定的任何元素。
另外，在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。落入通用公开内容中的每个较窄物种和亚属群也构成本发明的一部分。这包括本发明通过附带条件或负面限制从该属中删除任何主题的一般描述，无论本文是否具体叙述了该排除的材料。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性示例，本文所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括所引用的数字并且指代可以随后分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。
本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其它文献(例如，期刊、文章和/或教科书)均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请、授权专利和其它文献被具体和单独地指出通过引用整体并入。如果通过引用并入的文本中包含的定义与本公开中的定义相矛盾，那么该包含的定义被排除在外。
在以下权利要求中阐述了其它实施例，以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围。

Claims (33)

1.一种紫杉醇或紫杉醇衍生物的7-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含2至24个乳酸亚基，并通过酯键与所述紫杉醇或紫杉醇衍生物的7-羟基的氧连接。
2.如权利要求1所述的7-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含4至20个乳酸亚基。
3.如权利要求1或权利要求2所述的7-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含6至18个乳酸亚基。
4.如权利要求1至3中任一项所述的7-低聚乳酸缀合物，其包含紫杉醇或多西紫杉醇。
5.一种雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的40-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含2至24个乳酸亚基，并通过酯键与所述雷帕霉素或雷帕霉素衍生物的40-羟基的氧连接。
6.如权利要求5所述的40-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含4至20个乳酸亚基。
7.如权利要求5或权利要求6所述的40-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含6至18个乳酸亚基。
8.如权利要求5至7中任一项所述的40-低聚乳酸缀合物，其包含雷帕霉素或依维莫司。
9.一种司美替尼或司美替尼衍生物的2'-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含2至24个乳酸亚基，并通过酯键与所述司美替尼或司美替尼衍生物的2'-羟基的氧连接。
10.如权利要求9所述的2'-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含4至20个乳酸亚基。
11.如权利要求9或权利要求10所述的2'-低聚乳酸缀合物，其中所述低聚乳酸包含6至18个乳酸亚基。
12.如权利要求9至11中任一项所述的2'-低聚乳酸缀合物，其包含司美替尼、比尼替尼或GDC-0623。
13.一种包含水和胶束的组合物，所述胶束包含含有聚乳酸的聚合物和如权利要求1至12中任一项所述的7-低聚乳酸缀合物、40-低聚乳酸缀合物和2'-低聚乳酸缀合物中的一种或多种。
14.如权利要求13所述的组合物，其中相对于所述胶束的质量，所述7-低聚乳酸缀合物的负载量为约5wt％至约60wt％，所述40-低聚乳酸缀合物的负载量为约5wt％至约50wt％，和/或所述2'-低聚乳酸缀合物的负载量为约2wt％至约30wt％。
15.如权利要求13或权利要求14所述的组合物，其中相对于所述组合物中所述水的体积，所述7-低聚乳酸缀合物的浓度为约0.6mg/mL至约40mg/mL，所述40-低聚乳酸缀合物的浓度为约1mg/mL至约20mg/mL，和/或所述2'-低聚乳酸缀合物的浓度为约0.5mg/mL至约15mg/mL。
16.如权利要求13至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含7-低聚乳酸缀合物、40-低聚乳酸缀合物和2'-低聚乳酸缀合物。
17.如权利要求13至16中任一项所述的组合物，其中基于所述组合物的重量，所述组合物包含小于约2wt％的乙醇、二甲基亚砜、蓖麻油和蓖麻油衍生物。
18.如权利要求13至17中任一项所述的组合物，其中所述胶束包含聚(乙二醇)-嵌段-聚乳酸(PEG-b-PLA)。
19.如权利要求18所述的组合物，其中PEG-b-PLA的聚(乙二醇)嵌段的分子量为约1,000至约35,000g/mol，并且PEG-b-PLA的聚(乳酸)嵌段的分子量为约1,000至约15,000g/mol。
20.如权利要求18或19中任一项所述的组合物，其中所述聚(乙二醇)嵌段的分子量为约1,500至约14,000g/mol，并且聚(乳酸)嵌段的分子量为约1,500至约7,000g/mol。
21.一种包含水和胶束的组合物，所述胶束包含PEG-b-PLA和如权利要求1至12中任一项所述的7-低聚乳酸缀合物、40-低聚乳酸缀合物和2'-低聚乳酸缀合物、或其两种或更多种的组合，其中
相对于所述胶束的质量，所述胶束中7-低聚乳酸缀合物的负载量为约1wt％至约60wt％，所述40-低聚乳酸缀合物的负载量为约1wt％至约50wt％，所述2'-低聚乳酸缀合物的负载量为约1wt％至约30wt％，或其两种或更多种的组合；并且
所述PEG-b-PLA的聚(乙二醇)嵌段的分子量为约1,500至约14,000g/mol，并且所述PEG-b-PLA的聚(乳酸)嵌段的分子量为约1,500至约7,000g/mol。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包含所述7-低聚乳酸缀合物、所述40-低聚乳酸缀合物和所述2'-低聚乳酸缀合物。
23.一种制备如权利要求1至4中任一项所述的7-低聚乳酸缀合物的方法，其包括使具有游离7-羟基的紫杉醇或紫杉醇衍生物与偶联剂和具有2至24个乳酸亚基的单-O-甲硅烷基化的低聚乳酸接触。
24.一种制备如权利要求5至8中任一项所述的40-低聚乳酸缀合物的方法，其包括使具有游离40-羟基的雷帕霉素或雷帕霉素衍生物与偶联剂和具有2至24个乳酸亚基的单-O-甲硅烷基化的低聚乳酸接触。
25.一种制备如权利要求9至12中任一项所述的2'-低聚乳酸缀合物的方法，其包括使具有游离2'-羟基的司美替尼或司美替尼衍生物与偶联剂和具有2至24个乳酸亚基的单-O-甲硅烷基化的低聚乳酸接触。
26.一种制备如权利要求13至22中任一项所述的组合物的方法，其包括：
将水与含有聚乳酸的聚合物和所述7-低聚乳酸缀合物、所述40-低聚乳酸缀合物和所述2'-低聚乳酸缀合物中的一种或多种的混合物结合，使得胶束掺入所述7-低聚乳酸缀合物、所述40-低聚乳酸缀合物和所述2'-低聚乳酸缀合物形式中的一种或多种；以及
其中所述低聚乳酸包含2至24个乳酸亚基。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述含有聚乳酸的聚合物为PEG-b-PLA。
28.一种抑制或杀死对紫杉醇或紫杉醇衍生物、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和/或司美替尼或司美替尼衍生物敏感的癌细胞的方法，其包括使所述细胞与有效抑制或致死量的如权利要求13至22中任一项所述的组合物接触。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述接触是体外的。
30.一种治疗方法，其包括给予患有对紫杉醇或紫杉醇衍生物、雷帕霉素或雷帕霉素衍生物和/或司美替尼或司美替尼衍生物敏感的癌症的哺乳动物有效量的如权利要求13至22中任一项所述的组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌症选自脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、血管肉瘤或白血病。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌或肺癌。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述组合物通过注射给药。
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