ES2789823T3 - Procedimiento de producción de feromonas de polilla en levadura - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en: i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar: - una Δ11-desaturasa seleccionada de entre el grupo que consiste en Δ11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_Δ11; SEQ ID NO: 2), la Δ11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_Δ11; SEQ ID NO: 41), la Δ11-desaturasa de Agrotis segetum (As_Δ11; SEQ ID NO: 43) y la Δ11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_Δ11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_Δ11 (SEQ ID NO: 2), Sl_Δ11 (SEQ ID NO: 41), As_Δ11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_Δ11 (SEQ ID NO: 45), y - una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12), o una variante de las mismas con al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16) o Has_FAR (SEQ ID NO: 12); ii) expresar dicha Δ11-desaturasa y dicha FAR de dicha célula de levadura; e iii) incubar dicha célula de levadura en un medio, por lo cual - la Δ11-desaturasa es capaz de convertir al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y - dicha FAR es capaz de convertir al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenol, obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecen-1-ol con un título de al menos 0,2 mg/l, tal como al menos 0,25 mg/l, tal como al menos 0,3 mg/l, tal como al menos 0,4 mg/l, tal como al menos 0,5 mg/l, tal como al menos 0,75 mg/l, tal como al menos 1 mg/l, tal como al menos 1,5 mg/l, tal como al menos 2,5 mg/l, tal como al menos 5,0 mg/l, tal como al menos 10 mg/l, tal como al menos 15 mg/l, tal como al menos 20 mg/l, tal como 25 mg/l, tal como al menos 50 mg/l, tal como al menos 100 mg/l, tal como al menos 250 mg/l, tal como al menos 500 mg/l, tal como al menos 750 mg/l, tal como al menos 1 g/l, tal como al menos 2 g/l, tal como al menos 3 g/l, tal como al menos 4 g/l, tal como al menos 5 g/l, tal como al menos 6 g/l, tal como al menos 7 g/l, tal como al menos 8 g/l, tal como al menos 9 g/l, tal como al menos 10 g/l o más.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de feromonas de polilla en levadura
Campo técnico
En esta solicitud se divulgan procedimientos de producción de (Zj-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura. También se divulgan procedimientos de producción de (ZJ-11-hexadecenal en una célula de levadura. También se divulgan procedimientos de producción de acetato de (ZJ-11-hexadecen-1-il en una célula de levadura. La descripción también proporciona construcciones de ácidos nucleicos y células de levadura útiles para la realización de los presentes procedimientos, así como composiciones de feromonas.
Antecedentes
Se espera un manejo integrado de plagas (IPM) para desempeñar un papel importante, tanto para aumentar el rendimiento de los cultivos y para minimizar el impacto ambiental como para permitir la producción de alimentos orgánicos. El IPM emplea procedimientos alternativos de control de plagas, tales como la interrupción del apareamiento utilizando feromonas, la captura masiva utilizando feromonas, los insectos beneficiosos, etc.
Las feromonas constituyen un grupo de diversos productos químicos que los insectos (como otros organismos) utilizan para comunicarse con los individuos de la misma especie en varios contextos, incluyendo la atracción para lograr el apareamiento, alarma, marcado del rastro y agregación. Las feromonas de insectos asociadas con el hallazgo para lograr el apareamiento a largo plazo ya se utilizan en aplicaciones agrícolas y forestales para la supervisión y el control de plagas, como una alternativa segura y respetuosa con el medio ambiente a los pesticidas.
Las feromonas para el control de plagas se pueden dividir en cuatro categorías: feromonas sexuales, feromonas de agregación, feromonas de deterioro de la oviposición y feromonas de alarma. Las feromonas sexuales son el segmento más grande de productos que representan el 64,8 % de los ingresos globales del mercado de feromonas en IPM en 2013. Las feromonas sexuales son ampliamente utilizadas para la supervisión de plagas y para el control de plagas por la confusión sexual (por ejemplo, huertas de manzanos y melocotones, en bosques) y la captura masiva (por ejemplo, protección de los tomates en invernaderos). La confusión sexual se produce cuando se liberan feromonas al aire en pequeñas cantidades y se impide que los machos localicen a las hembras, lo cual conduce a un eventual cese de reproducción y colapso de la infestación por insectos. Las feromonas de agregación se utilizan para atraer tanto a plagas macho como hembra y, por ende, se aplican para la captura masiva. La captura masiva ayuda a mantener la densidad de población por debajo de umbral de daño económico cuando los insectos son capturados con cebos atractivos.
La aplicación de feromonas de insectos para el control de plagas posible solo después de síntesis de feromonas a escala industrial comenzó a finales de la década de 1980. Sin embargo, los precios de feromonas sintetizadas químicamente siguen siendo elevados y presentan una barrera importante para la expansión de su uso en la agricultura y la silvicultura. Otro inconveniente de la producción química de las feromonas es el requisito para los productos químicos tóxicos para ser utilizados como precursores, catalizadores y disolventes, y grandes cantidades de residuos orgánicos generados durante la purificación.
Las feromonas se producen actualmente por procedimientos basados en síntesis de química compleja, que hacen que los productos sean prohibitivamente caros para su uso generalizado en muchas de las aplicaciones potenciales en la agricultura y la silvicultura.
Hay varias ventajas de los procedimientos de producción biológica, en comparación con los procedimientos de producción química. En primer lugar, todas las reacciones se llevan a cabo por las células modificadas por ingeniería a temperatura ambiente en tanques de fermentación en lugar de múltiples etapas de reacción química que requieren diferentes precursores, catalizadores y condiciones (a menudo altas temperaturas y presiones). Además, las células modificadas por ingeniería utilizan materiales renovables baratos, tales como azúcares o aceites vegetales, en lugar de utilizar múltiples productos químicos especiales costosos como precursores. Mientras que las reacciones químicas a menudo sufren de baja especificidad, y por lo tanto requieren purificación de compuestos intermedios y extensa purificación del producto final, las reacciones biológicas llevadas a cabo por enzimas son normalmente muy específicas y la formación de subproductos es limitada, reduciendo de este modo el uso de disolventes orgánicos y otros productos químicos tóxicos para la purificación. Por otra parte, la química estereoespecífica, que a menudo es importante para la actividad de feromonas, puede ser muy difícil de lograr por procedimientos químicos, mientras que los procedimientos enzimáticos pueden tomar ventaja de enzimas específicas para uno de los isómeros cis o trans.
Ding y col., 2014 A plant factory for moth pheromone production, Nature Communications, vol. 5) divulgan la producción
de feromonas sexuales de polilla utilizando Nicotiana benthamiana como planta de producción.
Hagstrom y col, 2013 (A moth pheromone brewery: production of (Z)-11-hexadecenol by heterologous co-expression of two biosynthetic genes from a noctuid moth in a yeast cell factory, Microbial Cell Factories 12:125) divulgan la producción de (ZJ-11-hexadecenol en Saccharomyces cerevisiae por expresión heteróloga de una desaturasa de ácidos grasos y una acil reductasa grasa, con un título de 195 pg/l.
Por lo tanto, hay una necesidad de procesos biológicos para la producción de feromonas de insectos. Además de los beneficios de menor coste, los procesos de fermentación son inherentemente menos peligrosos y más respetuosos con el medio ambiente que la síntesis química.
Resumen
La invención es como se define en las reivindicaciones.
En esta solicitud se proporciona un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar:
- o la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43), la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43), o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y - o una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12), o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), o Has_FAR (SEQ ID NO: 12);
ii) expresar dicha A11-desaturasa y dicha FAR de dicha célula de levadura; e
iii) incubar dicha célula de levadura en un medio,
por lo cual
- o la A11-desaturasa es capaz de convertir al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y
- o dicha FAR es capaz de convertir al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenol, obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecen-1-ol con un título de al menos 0,2 mg/l.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecenal en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar:
- o la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_ A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43), la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y - o una acil-CoA reductasa grasa de formación de aldehído (FAR');
ii) expresar dicha A11-desaturasa y dicha FAR' de dicha célula de levadura; e
iii) incubar dicha célula de levadura en un medio,
por lo cual
- o la A11-desaturasa es capaz de convertir al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y
- o dicha FAR' convierte al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenal, obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecenal.
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a (Z)-11-hexadecen-1-ol obtenible por los procedimientos divulgados en esta solicitud.
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a (Z)-11-hexadecenal obtenible por los procedimientos divulgados en esta solicitud.
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il obtenible por los procedimientos divulgados en esta solicitud.
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a una composición de feromonas que comprende (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il obtenible por los procedimientos divulgados en esta solicitud. En aún otro aspecto, la descripción se refiere al uso de una composición de feromonas tal como se define en esta solicitud para supervisar la presencia de plagas y/o interrumpir el apareamiento de plagas.
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a un procedimiento de supervisión de la presencia de plagas o interrupción del apareamiento de plagas, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consiste en:
i) producir (Z)-11-hexadecenol y opcionalmente (Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il por los presentes procedimientos,
ii) formular dicho (Z)-11-hexadecenol y opcionalmente (Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il así obtenido en una composición de feromonas, y
iii) emplear dicha composición de feromonas como una composición de manejo integrado de plagas.
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a una construcción de ácidos nucleicos que comprende una o más de: - una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38. En aún otro aspecto, la descripción se refiere a una célula de levadura que comprende una o más de:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38. En aún otro aspecto, la descripción se refiere a una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula de levadura además capaz de expresar:
- la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43), la Al1-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y
- una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en
Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12) o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16) o Has_FAR (SEQ ID NO: 12).
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula de levadura además capaz de expresar:
- la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43), la Al1-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y
- una acil-CoA reductasa grasa (FAR).
En aún otro aspecto, la descripción se refiere a un kit de partes que comprende una célula de levadura y/o una construcción de ácidos nucleicos como se divulga en esta solicitud, e instrucciones de uso.
Descripción de los dibujos
Figura 1. Ruta heteróloga de (Z)-11-hexadecen-1-ol. FAA: acil-CoA sintetasa grasa, A11 FAD: acil-CoA A11-desaturasa grasa, FAR: acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol; FAR': acil-CoA reductasa grasa de formación de aldehído, AcT: acetiltransferasa; 1: ácido palmítico, 2: hexadecanoil-CoA, 3: (Z)-11-hexadecenoil-CoA, 4: (Z)-11-hexadecen-1-ol, 5: acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, 6: (Z)-11-hexadecenal.
Figura 2. Producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol durante la fermentación discontinua. El eje X muestra el título de (Z)-11-hexadecen-1-ol en mg/l, el eje Y muestra el tiempo de fermentación en horas. (A) Los títulos obtenidos con la integración de una sola copia del gen (cepa ST3705). (B) Los títulos obtenidos con la integración de múltiples copias del gen (cepa ST5262).
Figura 3. Mapa del plásmido vector pCfB3465. El vector codifica casetes de expresión para Atrd11, Hs_FAR, y el gen URA3. La expresión es estimulada desde promotores nativos (Pr) de Y. lipolytica. Los casetes de expresión están flanqueados por secuencias de ADN genómico (IntB_up e IntB_down) de 500 pb que permiten la integración específica del sitio en el genoma de Y. lipolytica.
Definiciones
Biopesticida: el término "biopesticida" es una contracción de "pesticida biológico" y se refiere a varios tipos de intervención de manejo de plagas: a través de relaciones predatorias, parásitas, o químicas. En la UE, los biopesticidas se han definido como "una forma de pesticida a base de microorganismos o productos naturales". En los e E.UU., son definidos por la EPA como "que incluyen sustancias de origen natural que controlan plagas (pesticidas bioquímicos), microorganismos que controlan plagas (pesticidas microbianos), y sustancias pesticidas producidas por plantas que contienen material genético añadido (protectores para plantas incorporados) o PIPs". La presente descripción se refiere más particularmente a biopesticidas que comprenden productos naturales o sustancias de origen natural. Por lo general son creados por el crecimiento y la concentración de organismos de origen natural y/o sus metabolitos que incluyen bacterias y otros microbios, hongos, nematodos, proteínas, etc. A menudo se considera que son componentes importantes de los programas de manejo integrado de plagas (IPM), y han recibido mucha atención práctica como sustitutos para los productos fitosanitarios químicos sintéticos (PPPs). The Manual of Biocontrol Agents (2009: formerly the Biopesticide Manual) da una revisión de productos insecticidas biológicos disponibles (y otra de control basado en biología).
Plaga: como se usa en esta solicitud, el término "plaga" se referirá a un organismo, en particular a un animal, perjudicial para los seres humanos o los intereses humanos, en particular en el contexto de la agricultura o la producción ganadera. Una plaga es cualquier organismo vivo que es invasivo o prolífico, perjudicial, molesto, nocivo, destructivo, una molestia para plantas o animales, seres humanos o intereses humanos, ganado, estructuras humanas, ecosistemas salvajes, etc. El término a menudo se superpone con los términos relacionados con los insectos, malas hierbas, plantas y parásitos y patógenos de los animales y plantas. Es posible para un organismo ser una plaga en un entorno, pero beneficioso, domesticado o aceptable en otro.
Descripción detallada
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
La presente descripción se refiere a procedimientos de producción de feromonas de polilla en una célula de levadura, en particular (Z)-11-hexadecen-1-ol, (Z)-11-hexadecenal, y acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, que son componentes de la feromona sexual de insectos de gran oruga de corazón de col Crocidolomia binotalis, polilla de espalda de diamante Plutella xylostella, polilla de la col Mamestra brassicae, gorgojo del tallo del maíz Sesamia nonagrioides, polilla de la pluma de alcachofa Platyptilia carduidactyla, gusano bellotero del algodón Helicoverpa armigera, gorgojo del tallo Chilo suppressalis y otras polillas. Los inventores han sido capaces de obtener sorprendentemente altos títulos de (Z)-11-hexadecen-1-ol utilizando los procedimientos descritos en esta solicitud.
Producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol
En esta solicitud se divulgan procedimientos de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol a partir de una célula de levadura.
Los inventores han diseñado una ruta heteróloga que se detalla en la figura 1 a modo de ejemplo. Hexadecanoil-CoA es un producto intermedio de ácidos grasos nativo en el metabolismo del ácido graso. Hexadecanoil-CoA se convierte en (Z)-11-hexadecenoil-CoA por una acil A11-desaturasa grasa (A11 FAD), que, a su vez, se convierte en (Z)-11-hexadecen-1-ol por una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR).
En un primer aspecto, la presente descripción se refiere por tanto a un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar:
- o la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43), la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y - o una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12) o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16) o Has_FAR (SEQ ID NO: 12);
ii) expresar dicha A11-desaturasa y dicha FAR de dicha célula de levadura; e
iii) incubar dicha célula de levadura en un medio,
por lo cual
- o la A11-desaturasa es capaz de convertir al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y
- o dicha FAR es capaz de convertir al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenol, obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecen-1-ol con un título de al menos 0,2 mg/l.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar:
- o una A11-desaturasa seleccionada de entre el grupo que consiste en A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID nO: 43) y la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11;
SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID
NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y
- o una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12) o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16) o Has_FAR (SEQ ID NO: 12);
ii) expresar dicha A11-desaturasa y dicha FAR de dicha célula de levadura; e
iii) incubar dicha célula de levadura en un medio,
por lo cual
- o la A11-desaturasa es capaz de convertir al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y
- o dicha FAR es capaz de convertir al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenol, obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecen-1-ol con un título de al menos 0,2 mg/l.
Célula de levadura
En la primera etapa del presente procedimiento, se proporciona una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA.
Cualquier célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA puede ser utilizada para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol como se describe en esta invención.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el género de dicha levadura se selecciona de entre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces. En algunas realizaciones de la presente descripción, el género de dicha levadura es Saccharomyces o Yarrowia.
La célula de levadura puede ser seleccionada de entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica.En realizaciones preferidas de la presente descripción, la célula de levadura es una célula Saccharomyces cerevisiae o una célula Yarrowia lipolytica.
Acil-CoA sintetasa grasa (FAA) (EC 2.3.1.86)
Los términos "acil-CoA sintetasa grasa'', acil-CoA sintasa grasa" y "FAA" serán utilizados en esta solicitud de manera intercambiable.
Hexadecanoil-CoA es un producto intermedio clave en la biosíntesis del ácido graso, y también se puede sintetizar como un producto intermedio de la degradación de lípidos. La biosíntesis de hexadecanoil-CoA se puede mejorar por la sobreexpresión de genes implicados en la biosíntesis de lípidos, tales como sintasas de ácidos grasos de tipo I o de tipo II, y/o por la sobreexpresión de acetil-CoA carboxilasa, o mediante la mejora del suministro del precursor de acetil-CoA. La hexadecanoil-CoA también se puede formar a través de acil-CoA sintetasa grasa a partir de ácido hexadecanoico (ácido palmítico), que se suministra o bien en el caldo o se sintetiza por tioesterasa intracelularmente. La actividad de FAA está normalmente presente en los organismos que son capaces de metabolizar los ácidos grasos. Puede estar codificada por varias enzimas redundantes. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, la célula de levadura es además capaz de expresar FAA. El ácido nucleico que codifica dicha actividad de FAA en la célula de levadura puede estar naturalmente presente en el genoma de dicha célula de levadura, o puede ser introducido por ingeniería genética o edición de genoma. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción la actividad de FAA está codificada por la introducción de un ácido nucleico heterólogo en la célula de levadura. El ácido nucleico heterólogo que codifica dicha FAA puede ser optimizado por codones, o puede comprender características que pueden ayudar a mejorar la actividad de FAA. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede ser modificado con el fin de codificar una FAA modificada. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la introducción de señales de localización, mutaciones por ganancia de función o pérdida de fusión, fusión de la proteína a un marcador o una etiqueta tal como una etiqueta fluorescente, inserción de un promotor inducible, introducción de modificaciones que confieren una mayor estabilidad y/o semivida.
La introducción del ácido nucleico heterólogo que codifica la actividad de FAA se puede realizar por procedimientos conocidos en la técnica. El experto en la materia reconocerá que tales procedimientos incluyen, pero no están limitados a: los procedimientos de clonación y procedimientos basados en la recombinación homóloga. Los procedimientos de
clonación pueden implicar el diseño y la construcción de un plásmido en un organismo tal como Escherichia coli.El plásmido puede ser un vector integrador o no integrador. Los procedimientos libres de clonación comprenden procedimientos basados en recombinación homóloga, tales como PCR mediada por adaptámeros o reparación de huecos. Tales procedimientos a menudo resultan en la integración del ácido nucleico heterólogo en el genoma de la célula de levadura.
En una realización de la presente descripción, la FAA es Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o Yl_FAA (SEQ ID NO: 37), o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología , tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o Yl_FAA (SEQ ID NO: 37). Por tanto, en una realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de S. cerevisiae y la FAA es Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35), o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología , tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35). En otra realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de Y. lipolytica y la FAA es Yl_FAA (SEQ ID NO: 37) o una variante de la misma que tiene al menos 75% de homología, tal como al menos 80% de homología, tal como al menos 85% de homología, tal como al menos 90% de homología, tal como al menos 91% de homología , tal como al menos 92% de homología, tal como al menos 93% de homología, tal como al menos 94% de homología, tal como al menos 95% de homología, tal como al menos 96% de homología, tal como al menos 97% de homología, tal como al menos 98% de homología, tal como al menos 99% de homología, tal como 100% de homología con Yl_FAA (SEQ ID NO: 37). En otra realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de S. cerevisiae y la FAA es Yl_FAA (SEQ ID NO: 37) o una variante de la misma que tiene al menos 75% de homología, tal como al menos 80% de homología, tal como al menos 85% de homología, tal como al menos 90% de homología, tal como al menos 91% de homología , tal como al menos 92% de homología, tal como al menos 93% de homología, tal como al menos 94% de homología, tal como al menos 95% de homología, tal como al menos 96% de homología, tal como al menos 97% de homología, tal como al menos 98% de homología, tal como al menos 99% de homología, tal como 100% de homología con Yl_FAA (SEQ ID NO: 37). En aún otra realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de Y. lipolytica y la FAA es Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología, tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAA es Sc_FAA2 (SEQ ID NO: 47).
Acil A11-desaturasa grasa (A11 FAD) (EC 1.14.19.5)
En la presente descripción, los términos "acil-CoA A11-desaturasa grasa", "A11-desaturasa ", "acil A11-desaturasa grasa" y "A11FAD" se utilizan indistintamente y se refieren todos a la enzima de EC que tiene un número EC 1.14.19.5.
En el presente procedimiento, la célula de levadura es además capaz de expresar una acil A11-desaturasa grasa (A11 FAD) que puede catalizar la conversión de al menos parte de la hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA (Figura 1). Los inventores han descubierto que la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2) o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11 es muy adecuada para catalizar esta etapa. En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2).
Otra A11-desaturasa adecuada es la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41) o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11. En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal
como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Sl_A11 (SEQ ID NO: 41).
En otras realizaciones de la presente descripción, la A11-desaturasa es la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43) o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11. En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con As_A11 (SEQ ID NO: 43).
En otras realizaciones de la presente descripción, la A11-desaturasa es la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11. En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Tni_A11 (SEQ ID NO: 45).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD puede catalizar la conversión de la totalidad de la hexadecanoil-CoA producida en la etapa biosintética anterior en (Z)-11-hexadecenoil-CoA.
Acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (EC 1.2.1.84)
Los términos "acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol", "acil-CoA reductasa grasa" y "FAR" serán utilizados en esta invención de manera intercambiable.
La siguiente etapa en la ruta de biosíntesis de (Z)-11-hexadecen-1-ol es la conversión de al menos parte de la (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecen-1-ol por una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR). Las FAR capaces de catalizar esta conversión pueden catalizar dos reacciones de reducción consecutivas; primero, la acil-CoA grasa se reduce a un aldehído graso; segundo, el aldehído graso se reduce aún más a un alcohol graso.
Las FAR capaces de catalizar tal reacción son acil-CoA reductasas grasas de formación de alcohol con un número EC 1.2.1.84.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAR se selecciona de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8, FAR de Helicoverpa armigera), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16, FAR de Heliothis subflexa), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12, FAR de Helicoverpa assulta), o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAR es Har_FAR (SEQ ID NO: 8, FAR de Helicoverpa armigera) o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología con Har_FAR, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAR es Hs_FAR (SEQ ID NO: 16, FAR de Heliothis subflexa), o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología con Hs_FAR, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal
como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Hs_FAR (SEQ ID NO: 16).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAR es Has_FAR (SEQ ID NO: 12, FAR de Helicoverpa assulta), o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Has_FAR, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Has_FAR.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAR puede catalizar la conversión de la totalidad de la (Z)-11-hexadecenoil-CoA producida en la etapa biosintética anterior en (Z)-11-hexadecenol.
La célula de levadura proporcionada en esta solicitud es preferentemente capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA y es además capaz de expresar una A11-desaturasa y una FAR como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión de la A11-desaturasa y/o de la FAR puede ser inducida, por ejemplo, si los genes que codifican estas enzimas están bajo el control de promotores inducibles, como se conoce en la técnica. La célula de levadura es incubada en condiciones adecuadas, tales como en un medio apropiado y a una temperatura apropiada como conoce un experto en la materia. Los medios adecuados que soportan el crecimiento de levaduras son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: medios completos no definidos, tales como YEPD (o YPD, extracto de levadura-peptona-dextrosa); medio completo definido, tal como SC (completo sintético); medio deficiente definido, tal como SD (dextrosa sintética) que carece de uno o más elementos tales como un aminoácido o un inductor; o medio mineral, que consiste en sales, vitaminas y una fuente de carbono, y otros. Título
En esta invención se divulgan procedimientos para producir (Z)-11-hexadecen-1-ol con un título de al menos 0,2 mg/l. En algunas realizaciones de la presente descripción, el título de (Z)-11-hexadecen-1-ol producido por los presentes procedimientos es de al menos 0,25 mg/l, tal como al menos 0,3 mg/l, tal como al menos 0,4 mg/l, tal como al menos 0,5 mg/l, tal como al menos 0,75 mg/l, tal como al menos 1 mg/l, tal como al menos 1,5 mg/l, tal como al menos 2,5 mg/l, tal como al menos 5,0 mg/l, tal como al menos 10 mg/l, tal como al menos 15 mg/l, tal como al menos 20 mg/l, tales como 25 mg/l, tal como al menos 50 mg/l, tal como al menos 100 mg/l, tal como al menos 250 mg/l, tal como al menos 500 mg/l, tal como al menos 750 mg/l, tal como al menos 1 g/l, tal como al menos 2 g/l, tal como al menos 3 g/l, tal como al menos 4 g/l, tal como al menos 5 g/l, tal como al menos 6 g/l, tal como al menos 7 g/l, tal como al menos 8 g/l, tal como al menos 9 g/l, tal como al menos 10 g/l o más.
Los procedimientos de determinación del título se conocen en la técnica.
En una realización de la presente descripción, la A11-desaturasa es Atr_A11 como se expone en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11 y la FAR es Har_FAR como se expone en SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Har_FAR. En una realización particular de la presente descripción, la variante de Har_FAR es como se expone en SEQ ID NO: 10.
En una realización de la presente descripción, la A11-desaturasa es Atr_A11 como se expone en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11 y la FAR es Hs_FAR como se expone en SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Hs_FAR. En una realización particular de la presente descripción, la variante de Hs_FAR es como se expone en SEQ ID NO: 16.
En una realización de la presente descripción, la A11-desaturasa es Atr_A11 como se expone en SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Atr_A11 y la FAR es Has_FAR como se expone en SEQ ID NO: 12 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Has_FAR. En una realización particular de la presente descripción, la variante de Has_FAR es como se expone en SEQ ID NO: 12.
En otra realización de la presente descripción, la A11-desaturasa es As_A11 como se expone en SEQ ID NO: 43 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con As_A11 y la FAR es Har_FAR como se expone en SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Har_FAR. En una realización
particular de la presente descripción, la variante de Har_FAR es como se expone en SEQ ID NO: 10.
En otra realización de la presente descripción, la A11-desaturasa es Sl_A11 como se expone en SEQ ID NO: 41 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Sl_A11 y la FAR es Har_FAR como se expone en SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Har_FAR. En una realización particular de la presente descripción, la variante de Har_FAR es como se expone en SEQ ID NO: 10.
En otra realización de la presente descripción, la A11-desaturasa es Tni_A11 como se expone en SEQ ID NO: 45 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de homología con Tni_A11 y la FAR es Har_FAR como se expone en SEQ ID NO: 45 o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Har_FAR. En una realización particular de la presente descripción, la variante de Har_FAR es como se expone en SEQ ID NO: 10.
Producción de acetato de (Z)-11 -hexadecen-1 -il
Si bien la presente descripción proporciona procedimientos de producción de (ZJ-11-hexadecenol, puede ser de interés convertir además dicho (ZJ-11-hexadecen-1-ol en el acetato correspondiente, es decir acetato de (ZJ-11-hexadecen-1-il. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, el presente procedimiento comprende además la etapa que consiste en convertir al menos parte de (ZJ-11-hexadecen-1-ol en acetato de (ZJ-11-hexadecen-1-il.
En algunas realizaciones de la presente descripción, esto se realiza expresando además una acetiltransferasa (AcT, EC 2.3.1.84) o sobreexpresando una acetiltransferasa nativa a partir de dicha célula de levadura, donde dicha acetiltransferasa es capaz de convertir al menos parte del (Z)-11-hexadecen-1-ol en acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, produciendo de esta manera además acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il.
En la presente descripción, los términos "acetiltransferasa", "alcohol O-acetiltransferasa" y "AcT" se utilizan indistintamente.
En otras realizaciones de la presente descripción, la conversión de al menos parte de (ZJ-11-hexadecen-1-ol en acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il se realiza químicamente. El experto en la materia sabe cómo convertir al menos parte de (ZJ-11-hexadecen-1-ol en acetato de (ZJ-11-hexadecen-1-il. Por ejemplo, el cloruro de acetilo se puede añadir al (Zj-11-hexadecen-1-ol y se incuba a temperatura ambiente después de la mezcla.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la acetiltransferasa es la AcT de SEQ ID NO: 39 (Atf1, la AcT de S. cerevisiae) o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología con Sc_Atf1, tal como al menos 76% , tal como al menos 77% , tal como al menos 78% , tal como al menos 79% , tal como al menos 80% , tal como al menos 81% , tal como al menos 82% , tal como al menos 83% , tal como al menos 84% , tal como al menos 85% , tal como al menos 86% , tal como al menos 87% , tal como al menos 88% , tal como al menos 89% , tal como al menos 90% , tal como al menos 91% , tal como al menos 92% , tal como al menos 93% , tal como al menos 94% , tal como al menos 95% , tal como al menos 96% , tal como al menos 97% , tal como al menos 98% , tal como al menos 99% , tal como 100% de homología con SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones de la presente descripción, acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il es producido con un título de al menos 0,2 mg/l. En algunas realizaciones de la presente descripción, el título de acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il producido por los presentes procedimientos es de al menos 0,25 mg/l, tal como al menos 0,3 mg/l, tal como al menos 0,4 mg/l, tal como al menos 0,5 mg/l, tal como al menos 0,75 mg/l, tal como al menos 1 mg/l, tal como al menos 1,5 mg/l, tal como al menos 2,5 mg/l, tal como al menos 5,0 mg/l, tal como al menos 10 mg/l, tal como al menos 15 mg/l, tal como al menos 20 mg/l, tal como 25 mg/l, tal como al menos 50 mg/l, tal como al menos 100 mg/l, tal como al menos 250 mg/l, tal como al menos 500 mg/l, tal como al menos 750 mg/l, tal como al menos 1 g/l, tal como al menos 2 g/l, tal como al menos 3 g/l, tal como al menos 4 g/l, tal como al menos 5 g/l, tal como al menos 6 g/l, tal como al menos 7 g/l, tal como al menos 8 g/l, tal como al menos 9 g/l, tal como al menos 10 g/l o más.
[0072]Los procedimientos de determinación del título se conocen en la técnica.
Construcciones de ácido nucleico que codifican A11-desaturasa, FAR, FAA, AcT
Se entenderá que en toda la presente descripción, el término "ácido nucleico que codifica una actividad" se referirá a una molécula de ácido nucleico capaz de codificar un péptido, una proteína o un fragmento de la misma que tiene dicha actividad. Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser marcos de lectura abiertos o genes o fragmentos de las mismas. La construcción de ácido nucleico también puede ser un grupo de moléculas de ácido nucleico que, en conjunto, pueden codificar varios péptidos, proteínas o fragmentos de las mismas que tienen una actividad de interés. El término "actividad de interés" se referirá a una de las siguientes actividades: actividades de desaturase A11, FAR, FAA y/o AcT. La naturaleza de la una o más actividades de interés dependerá de la naturaleza del producto deseado
que uno quiere obtener con los presentes procedimientos.
En algunas realizaciones de los presentes procedimientos, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican cada una de las presentes actividades, es decir, desaturase A11, FAR, FAA y/o AcT, puede estar comprendido dentro del genoma de la célula de levadura o dentro de un vector comprendida dentro de célula de levadura.
En algunas realizaciones de la presente descripción, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican cada una de las presentes actividades puede estar integrado en el genoma de dicha célula de levadura, ya sea porque el ácido nucleico codifica una proteína nativa, o porque se ha integrado en la misma por ingeniería genómica o edición de genoma o mediante el cruce de células de levadura de diferentes tipos de apareamiento. Los procedimientos de integración de un ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción la actividad de interés está codificada por la introducción de un ácido nucleico heterólogo en la célula de levadura. El ácido nucleico heterólogo que codifica dicha actividad puede ser optimizado por codones, o puede comprender características que pueden ayudar a mejorar la actividad. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede ser modificado con el fin de codificar una FAA modificada. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la introducción de señales de localización, mutaciones por ganancia de función o pérdida de fusión, fusión de la proteína a un marcador o una etiqueta tal como etiqueta fluorescente, inserción de un promotor inducible, introducción de modificaciones que confieren mayor estabilidad y/o semivida.
La introducción del ácido nucleico heterólogo que codifica la actividad de interés puede realizarse por procedimientos conocidos en la técnica. El experto en la materia reconocerá que tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a: los procedimientos de clonación y los procedimientos basados en la recombinación homóloga. Los procedimientos de clonación pueden implicar el diseño y la construcción de un plásmido en un organismo tal como Escherichia coli. El plásmido puede ser un vector integrador o no integrador. Los procedimientos libres de clonación comprenden procedimientos basados en recombinación homóloga, tales como PCR mediada por adaptámeros o reparación de huecos. Tales procedimientos a menudo resultan en la integración del ácido nucleico heterólogo en el genoma de la célula de levadura.
Los ácidos nucleicos que codifican las actividades de interés pueden estar presentes en un alto número de copias. En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 1, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 40, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 40. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 42, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 42. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos
80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 44. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID No: 11 o SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 97 % de homología con SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 96% de homología con SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 97 % de homología con SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36 tiene al menos 70 % de homología con SeQ ID NO: 34, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ iD NO: 34 o 36 tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de FAA está codificada por una secuencia de ácido
nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 46, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 46.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de AcT está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38 tiene al menos 70 % de homología con SEQ ID NO: 38, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 38. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 38.
Se deduce que en esta solicitud se divulga un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura como se ha descrito anteriormente, donde:
- la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15, y
- FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico nativo.
También se divulga en esta solicitud un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura como se ha descrito anteriormente, donde:
- La A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15, y
- FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36.
También se divulga en esta solicitud un procedimiento de producción de acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il y/o (Z)-11-hexadecenol, donde:
- La A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y/o
- FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y/o
- FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36; y/o
- AcT está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38.
También se divulga en esta solicitud un procedimiento de producción de acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il y/o (Z)-11-hexadecenol, donde:
- La A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y
- FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con
SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36; y
- AcT está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38.
Producción de fZ)-11-hexadecenal
Si bien la presente descripción proporciona procedimientos de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, puede ser de interés convertir además dicho (Z)-11-hexadecen-1-ol en el correspondiente aldehído, es decir (Z)-11-hexadecenal. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende además la etapa que consiste en convertir al menos parte del (Z)-11-hexadecen-1-ol en (Z)-11-hexadecenal, produciendo además de este modo (Z)-11-hexadecenal.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la etapa que consiste en convertir al menos parte de (Z)-11-hexadecen-1-ol en (Z)-11-hexadecenal es una etapa de conversión química. La conversión química se basa en la oxidación de (Z)-11-hexadecen-1-ol en (Z)-11-hexadecenal. Los procedimientos de realización de esta conversión son conocidos en la técnica. Los procedimientos preferidos son respetuosos con el medio ambiente y reducen al mínimo la cantidad de residuos peligrosos.
Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, la conversión química puede estar libre de metal, evitando reactivos a base de metales pesados tóxicos, tales como óxidos de manganeso, óxidos de cromo (ox. de Jones, PDC, PCC) o compuestos de rutenio (TPAP, ox. de Ley-Griffith). En algunas realizaciones de la presente descripción, la conversión no implica reacciones que implican sulfóxido de dimetilo activado, tal como la oxidación de Swern o el tipo Pfitzner-Moffat. Dichas reacciones pueden implicar la formación estereotípica de trazas de compuestos orgánicos de azufre que huelen intensamente, tales como sulfuro de dimetilo que puede ser difícil de eliminar del producto diana.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende una reacción de Dess-Martin (Yadav y col., 2004, Meyer y col., 1994).
En otras realizaciones de la presente descripción, la conversión química comprende la oxidación con hipoclorito de sodio bajo condiciones en dos fases acuosas/orgánicas (Okada y col, 2014; Tamura y col., 2012; Li y col., 2009). En algunas realizaciones de la presente descripción, la oxidación química se puede realizar con 1-clorobenzotriazol en un medio de cloruro de metileno que contiene 25 % de piridina (Ferrell y Yao, 1972).
Alternativamente, la oxidación de (Z)-11-hexadecen-1-ol a (Z)-11-hexadecenal se puede realizar enzimáticamente mediante alcohol deshidrogenasas. El experto en la materia sabrá cómo llevar a cabo la oxidación enzimática. Por ejemplo, la oxidación enzimática se puede llevar a cabo poniendo en contacto enzimas purificadas, extractos celulares o células enteras, con (Z)-11-hexadecenol.
Recuperación
Puede ser deseable recuperar los productos obtenidos por los procedimientos divulgados en esta solicitud. Por tanto, los presentes procedimientos pueden comprender una etapa adicional de recuperación de (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende una etapa de recuperación de (Z)-11-hexadecenol. En otras realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende una etapa de recuperación de acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il.
Los procedimientos de recuperación de los productos obtenidos por los presentes procedimientos son conocidos en la técnica y pueden comprender una extracción con un disolvente hidrófobo, tal como decano, hexano o un aceite vegetal.
Producción de (Z)-11-hexadecenal
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecenal en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar:
- o la A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43), la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 70% de homología, tal como al menos 71% de homología, tal como al menos 72% , tal como al menos 73% , tal como al menos 74% , tal como al menos 75% , tal como al menos 80% , tal como al menos 85% , tal como al menos 90% , tal como al menos 95% , tal como 100% de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y
- o una acil-CoA reductasa grasa de formación de aldehído (FAR');
ii) expresar dicha A11-desaturasa y dicha FAR' de dicha célula de levadura; e
iii) incubar dicha célula de levadura en un medio,
por lo cual
- o la A11-desaturasa convierte al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y - o dicha FAR' convierte al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenal, obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecenal.
Célula de levadura
La presente descripción también se refiere a procedimientos de producción de (Z)-11-hexadecenal. En una primera etapa, se proporciona una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA.
Cualquier célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA puede ser utilizada para producir (Z)-11-hexadecenal como se describe en esta solicitud.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el género de dicha levadura se selecciona de entre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces. En algunas realizaciones de la presente descripción, el género de dicha levadura es Saccharomyces o Yarrowia.
La célula de levadura puede ser seleccionada de entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae o una célula de Yarrowia lipolytica. Acil-CoA sintetasa grasa (FAA)
La Hexadecanoil-CoA es un producto intermedio natural del metabolismo de ácidos grasos, que además se puede generar a partir de ácido palmítico (ya sea añadido externamente o sintetizado dentro de las células por tioesterasa) a través de la conversión en hexadecanoil-CoA por FAA. La actividad de FAA está normalmente presente en los organismos que son capaces de metabolizar los ácidos grasos. Puede estar codificada por varias enzimas redundantes. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, la célula de levadura es además capaz de expresar FAA. El ácido nucleico que codifica dicha actividad de FAA en la célula de levadura puede estar naturalmente presente en el genoma de dicha célula de levadura, o puede ser introducido por ingeniería genética o edición de genoma. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción la actividad de FAA está codificada por la introducción de un ácido nucleico heterólogo en la célula de levadura. El ácido nucleico heterólogo que codifica dicha FAA puede ser optimizado por codones, o puede comprender características que pueden ayudar a mejorar la actividad de FAA. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede ser modificado con el fin de codificar una FAA modificada. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la introducción de señales de localización, mutaciones por ganancia de función o pérdida de fusión, fusión de la proteína a un marcador o una etiqueta tal como etiqueta fluorescente, inserción de un promotor inducible, introducción de modificaciones que confieren mayor estabilidad y/o semivida.
La introducción del ácido nucleico heterólogo que codifica la actividad de FAA puede realizarse por procedimientos conocidos en la técnica. El experto en la materia reconocerá que tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a: los procedimientos de clonación y los procedimientos basados en la recombinación homóloga. Los procedimientos de clonación pueden implicar el diseño y la construcción de un plásmido en un organismo tal como Escherichia coli. El plásmido puede ser un vector integrador o no integrador. Los procedimientos libres de clonación comprenden procedimientos basados en recombinación homóloga, tales como PCR mediada por adaptámeros o reparación de huecos. Tales procedimientos a menudo resultan en la integración del ácido nucleico heterólogo en el genoma de la célula de levadura.
En una realización de la presente descripción, la FAA es Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o YI_FAA (SEQ ID NO: 37, o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos
85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología , tal como al me 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos
95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al me 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o YI_FAA (SEQ ID NO: 37). Por tanto, en una realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de S. cerevisiae y la FAA es Sc_FAA1 (SEQ ID NO:35) o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología , tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35). En otra realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de Y. lipolytica y la FAA es Yl_FAA (SEQ ID NO: 37) o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología, tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con YI_FAA (SEQ ID NO: 37).
En otra realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de S. cerevisiae y la FAA es Yl_FAA
(SEQ ID NO: 37) o una variante de la misma que tiene al menos 75% de homología, tal como al menos 80% de homología, tal como al menos 85% de homología, tal como al menos 90% de homología, tal como al menos 91% de homología , tal como al menos 92% de homología, tal como al menos 93% de homología, tal como al menos 94% de homología, tal como al menos 95% de homología, tal como al menos 96% de homología, tal como al menos 97% de homología, tal como al menos 98% de homología, tal como al menos 99% de homología, tal como 100% de homología con Yl_FAA (SEQ ID NO: 37). En aún otra realización de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de Y. lipolytica y la FAA es Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o una variante de la misma que tiene al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología, tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAA es Sc_FAA2 (SEQ ID NO: 47).
Acil A11-desaturasa grasa (EC 1.14.19.5)
La célula de levadura es además capaz de expresar una acil A11-desaturasa grasa (A11 FAD) que puede catalizar la conversión de al menos parte de la hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA. Los inventores han descubierto que la A11 -desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2) o una variante de la misma que tiene al menos
70 % de homología con Atr_A11 es muy adecuada para catalizar esta etapa. En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos
72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos
86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos
71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos
75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos
89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Sl_A11 (SEQ ID NO: 41).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos
71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos
75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con As_A11 (SEQ ID NO: 43).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD tiene al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con Tni_A11 (SEQ ID NO: 45).
En algunas realizaciones de la presente descripción, la A11 FAD puede catalizar la conversión de la totalidad de la hexadecanoil-CoA producida en la etapa biosintética anterior en (Z)-11-hexadecenoil-CoA.
Acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol EC 1.2.1.50 (FAR')
En lugar de producir hexadecen-1-ol, al menos parte de la (Z)-11-hexadecenoil-CoA puede ser convertida en (Z)-11 hexadecenal por una acil-CoA reductasa grasa de formación de aldehído (FAR'). Las enzimas capaces de catalizar esta conversión pueden catalizar una reacción de reducción, donde la acil-CoA grasa se reduce a un aldehído graso. Tales enzimas son acil-CoA reductasas grasas de formación de aldehído, en esta solicitud también se hace referencia como FAR' o FAR de formación de aldehído, con un número EC 1.2.1.50. Catalizan la siguiente reacción:
acil-CoA de cadena larga NADPH = aldehído de cadena larga NADP+ coenzima A, donde el término "de cadena larga" designa cadenas con 16 a 22 átomos de carbono.
La célula de levadura proporcionada por tanto es capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA y es además capaz de expresar una A11-desaturasa y una FAR de formación de aldehído y catalizar una reducción de una etapa como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones de la presente descripción, se puede inducir la expresión de la A11 -desaturasa y/o de la FAR de formación de aldehídos, por ejemplo, si los genes que codifican estas enzimas están bajo el control de promotores inducibles, como se conoce en la técnica. La célula de levadura se incuba en condiciones adecuadas, tales como un medio apropiado y a una temperatura apropiada, como conoce un experto en la materia. Los medios adecuados que soportan el crecimiento de levaduras son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: medios completos no definidos, tales como YEPD (o YPD, extracto de levadura-peptona-dextrosa); medio completo definido, tal como SC (completo sintético); medio deficiente definido, tal como SD (dextrosa sintética) que carece de uno o más elementos tales como un aminoácido o un inductor.
Título
En esta solicitud se divulgan procedimientos para producir (Z)-11-hexadecenal con un título de al menos 0,1 mg/l. En algunas realizaciones de la presente descripción, el título de (Z)-11-hexadecenal producido por los presentes procedimientos es de al menos 0,2 mg/l, tal como al menos 0,25 mg/l, tal como al menos 0,3 mg/l, tal como al menos 0,4 mg/l, tal como al menos 0,5 mg/l, tal como al menos 0,75 mg/l, tal como al menos 1 mg/l, tal como al menos 1,5 mg/l, tal como al menos 2,5 mg/l, tal como al menos 5,0 mg/l, tal como al menos 10 mg/l, tal como al menos 15 mg/l, tal como al menos 20 mg/l, tales como 25 mg/l, tal como al menos 50 mg/l, tal como al menos 100 mg/l, tal como al menos 250 mg/l, tal como al menos 500 mg/l, tal como al menos 750 mg/l, tal como al menos 1 g/l, tal como al menos 2 g/l, tal como al menos 3 g/l, tal como al menos 4 g/l, tal como al menos 5 g/l, tal como al menos 6 g/l, tal como al menos 7 g/l, tal como al menos 8 g/l, tal como al menos 9 g/l, tal como al menos 10 g/l o más.
Los procedimientos de determinación del título se conocen en la técnica.
Ácidos nucleicos que codifican desaturase A11, FAR', FAA, AcT
En algunas realizaciones del presente procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecenal, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican cada una de las presentes actividades, es decir, A11-desaturasa, FAA o FAR de formación de aldehído, puede estar comprendida dentro del genoma de la célula de levadura o dentro de un vector comprendido dentro de la célula de levadura.
En algunas realizaciones de la presente descripción, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican cada una de las presentes actividades puede estar integrado en el genoma de dicha célula de levadura, ya sea porque el ácido nucleico codifica una proteína nativa, o porque se ha integrado en el mismo por ingeniería genómica o edición de genoma o mediante el cruce de células de levadura de diferentes tipos de apareamiento. Los procedimientos de integración de un ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción la actividad de interés está codificada por la introducción de un ácido nucleico heterólogo en la célula de levadura. El ácido nucleico heterólogo que codifica dicha actividad puede ser optimizado por codones, o puede comprender características que pueden ayudar a mejorar la actividad. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede ser modificado con el fin de codificar una FAA modificada. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la introducción de señales de localización, mutaciones por ganancia de función o pérdida de fusión, fusión de la proteína a un marcador o una etiqueta tal como etiqueta fluorescente, inserción de un promotor inducible, introducción de modificaciones que confieren mayor estabilidad y/o semivida.
La introducción del ácido nucleico heterólogo que codifica la actividad de interés puede realizarse por procedimientos conocidos en la técnica. El experto en la materia reconocerá que tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a: los procedimientos de clonación y los procedimientos basados en la recombinación homóloga. Los procedimientos de clonación pueden implicar el diseño y la construcción de un plásmido en un organismo tal como Escherichia coli. El plásmido puede ser un vector integrador o no integrador. Los procedimientos libres de clonación comprenden procedimientos basados en recombinación homóloga, tales como PCR mediada por adaptámeros o reparación de huecos. Tales procedimientos a menudo resultan en la integración del ácido nucleico heterólogo en el genoma de la célula de levadura.
Los ácidos nucleicos que codifican las actividades de interés pueden estar presentes en un alto número de copias.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 40, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 40. Preferentemente, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 42, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 42. Preferentemente, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 44. Preferentemente, la actividad de la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con
SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la actividad de FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 46, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 46.
Se deduce que en esta solicitud se divulga un procedimiento de producción de (ZJ-11-hexadecenal en una célula de levadura como se ha descrito anteriormente, donde:
- La A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- FAR' se selecciona de entre el grupo que consiste en FARs que son capaces de catalizar una reducción de una etapa de una acil-CoA grasa a un aldehído graso; y
- FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico nativo.
También se divulga en esta solicitud un procedimiento de producción de (ZJ-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura como se ha descrito anteriormente, donde:
- La A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- FAR' se selecciona de entre el grupo que consiste en FAR que son capaces de catalizar la reducción de una acil-CoA grasa a un aldehído graso, y la posterior reducción del aldehído graso a un alcohol graso;
- FAA está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la FAR' es una enzima con un número EC 1.2.1.50.
Recuperación
Puede ser deseable recuperar los productos obtenidos por los procedimientos divulgados en esta solicitud. Por tanto, los presentes procedimientos pueden comprender una etapa adicional de recuperación de (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il.
Los procedimientos de recuperación de los productos obtenidos por los presentes procedimientos son conocidos en la técnica y pueden comprender una extracción con un disolvente hidrófobo, tal como decano, hexano o un aceite vegetal.
Construcciones de ácido nucleico
La presente descripción también se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende una o más de: - una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de
homología con SEQ ID NO: 1, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 40, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 40. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 42, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 42. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 44. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ iD NO: 7 tiene al menos 97 % de homología con SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ iD NO: 11 tiene al menos 96 % de homología con SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ iD NO: 15 tiene al menos 97 % de homología con SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36 tiene al menos 70 % de homología con SeQ ID NO: 34, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como
al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36 tiene al menos 70 % de homología con SeQ ID NO: 36, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ iD NO: 38 tiene al menos 70 % de homología con SEQ ID NO: 38, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 38. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 38.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos
83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, las construcciones de ácido nucleico comprende además una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 38.
Al menos una de la una o más secuencias de ácido nucleico puede estar bajo el control de un promotor inducible. En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico es un vector tal como un vector integrador o un vector replicativo. En una realización de la presente divulgación, el vector es un vector replicativo con alto número de copias.
Cada una de las secuencias de ácido nucleico comprendida dentro de las presentes construcciones de ácido nucleico puede estar presente en múltiples copias. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las secuencias de ácido nucleico está presente en al menos 2 copias, tal como al menos 3 copias, tal como al menos 4 copias, tal como al menos 5 copias, tal como al menos 10 copias, tal como al menos 20 copias, tal como al menos 30 copias, tal como al menos 40 copias, tal como al menos 50 copias, tal como al menos 60 copias, tal como al menos 70 copias, tal como al menos 80 copias, tal como al menos 90 copias, tal como al menos 100 copias, tal como al menos 125 copias, tal como al menos 150 copias, tal como al menos 175 copias, tal como al menos 200 copias. En algunas realizaciones de la presente descripción, la totalidad de las secuencias de ácido nucleico está presente en al menos 2 copias, tal como al menos 3 copias, tal como al menos 4 copias, tal como al menos 5 copias, tales como al menos 10 copias, tal como al menos 20 copias, tal como al menos 30 copias, tal como al menos 40 copias, tal como al menos 50 copias, tal como al menos 60 copias, tal como al menos 70 copias, tal como al menos 80 copias, tal como al menos 90 copias, tal como al menos 100 copias, tal como al menos 125 copias, tal como al menos 150 copias, tales como al menos 175 copias, tal como al menos 200 copias.
Las construcciones de ácido nucleico también pueden ser un producto de PCR o una molécula de ADN sintética. Célula de levadura
También se proporciona en esta solicitud una célula de levadura que puede ser utilizada para cualquiera de los procedimientos divulgados en esta solicitud. La célula de levadura comprende uno o más de:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36; y/o
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones de la presente descripción, la célula de levadura comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la célula de levadura comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: : 34, o SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la célula de levadura comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, o SEQ ID NO: 36; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38. Como se ha detallado anteriormente, la una o más secuencias de ácido nucleico pueden estar comprendidas dentro del genoma de dicha célula de levadura o dentro de una construcción de ácido nucleico comprendida dentro de dicha célula de levadura. En algunas realizaciones de la presente descripción, la célula de levadura comprende al menos una construcción de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente.
Preferentemente, la célula de levadura es capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA y puede ser utilizada para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol y/o (ZJ-11-hexadecenal y/o acetato de (Z/)-11-hexadecen-1-il como se describe en esta solicitud.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el género de dicha levadura se selecciona de entre Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces. En algunas realizaciones de la presente descripción, el género de dicha levadura es Saccharomyces o Yarrowia.
La célula de levadura puede ser seleccionada de entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae o una célula de Yarrowia lipolytica. En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 1, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 40, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como
al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 40. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 42, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 42. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 81 % de homología con SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 44. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 44.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ iD NO: 7 tiene al menos 97 % de homología con SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ iD NO: 11 tiene al menos 96 % de homología con SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15 es una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ iD NO: 15 tiene al menos 97 % de homología con SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36 tiene al menos 70 % de homología con SeQ ID NO: 34, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36 tiene al menos 70 % de homología con SeQ ID NO: 36, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos
89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38 tiene al menos 70 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 38. En realizaciones preferidas de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 38.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 7, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %,
tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 11; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al
menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 34, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la construcción de ácido nucleico comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44 tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como al menos 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44;
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 15, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 15; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 36, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones de la presente descripción, las construcciones de ácido nucleico comprende además una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología con SEQ ID NO: 38, tal como al menos 70 %, tal como al menos 71 %, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 76 %, tal como al menos 77 %, tal como al menos 78 %, tal como al menos 79 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 38.
Composición de feromonas
En esta solicitud también se proporciona una composición de feromonas que comprende (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il. Al menos una de (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il puede obtenerse preferentemente por los procedimientos que se han divulgado anteriormente.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición de feromonas comprende (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal y acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, donde al menos uno de (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il se puede obtener por los procedimientos que se han divulgado en esta solicitud anteriormente.
Por consiguiente, los presentes procedimientos pueden comprender además la etapa que consiste en formular (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il recuperado en una composición de feromonas. Las presentes composiciones de feromonas pueden ser utilizadas como productos de manejo integrado de plagas, que se pueden utilizar en un procedimiento de supervisión de la presencia de plagas o en un procedimiento para interrumpir el apareamiento de la plaga.
Las composiciones de feromonas como se divulga en esta solicitud se pueden utilizar como biopesticidas. Tales composiciones pueden pulverizarse o distribuir en un cultivo, en un campo o en un huerto. Pueden también, como es conocido en la técnica, por ejemplo, ser empapadas en septos de goma, o mezcladas con otros componentes. Esto puede resultar en confusión sexual, impidiendo de este modo la reproducción de plagas, o puede utilizarse en combinación con un dispositivo de captura para atrapar las plagas. Ejemplos no limitantes de plagas contra las que se pueden utilizar las presentes composiciones de feromonas son: gusano bellotero del algodón (Helicoverpa armígera), gorgojo del tallo rayado (Chilo suppressalis), polilla de espalda de diamante (Plutella xylostella), polilla de la col (Mamestra brassicae), gran oruga de corazón de col (Crocidolomia binotalis), gorgojo del tallo del maíz europeo (Sesamia nonagrioides), polilla de alas transparentes corriente (Synanthedon tipuliformis) polilla de la pluma de alcachofa (Platyptilia carduidactylal).Por consiguiente, el uso de las presentes composiciones en un cultivo puede conducir a un mayor rendimiento de los cultivos, con un impacto sustancialmente no ambiental.
Las cantidades relativas de (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal y acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il en las presentes composiciones de feromonas puede variar dependiendo de la naturaleza del cultivo y/o de la plaga a controlar; también pueden existir variaciones geográficas. La determinación de las cantidades relativas óptimas puede, por tanto, requerir la optimización de la rutina.
Los ejemplos de composiciones utilizadas como repelentes se pueden encontrar en Kehat & Dunkelblum, 1993, para H. armigera, en Alfaro y col., 2009, para C. suppressalis, en Eizaguirre y col., 2002, para S. nonagrioides; en Wu y col., 2012, para P. xylostella; en Bari y col., 2003, para P. carduidactyla
La composición de feromonas puede comprender por tanto entre 1 y 100 % (Z )-11 -hexadecenol, entre 1 y 100 % (Z)-11-hexadecenal y entre 1 y 100 % acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición de feromonas puede comprender además uno o más compuestos adicionales, tales como un vehículo o sustrato líquido o sólido. Por ejemplo, vehículos o sustratos adecuados incluyen aceites vegetales, aceites minerales refinados o fracciones de los mismos, cauchos, plásticos, sílice, tierra de diatomeas, matriz de cera y polvo de celulosa.
La composición de feromonas se puede formular como se conoce en la técnica. Por ejemplo, puede encontrarse bajo la forma de una solución, un gel, un polvo. La composición de feromonas puede formularse de modo que pueda ser fácilmente distribuida, como se conoce en la técnica.
Kit de partes
En esta solicitud también se proporciona un kit de partes que comprende una célula de levadura, y/o una construcción de ácido nucleico como se describe en esta solicitud, y las instrucciones de uso.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el kit comprende una célula de levadura que puede ser utilizada en los procedimientos descritos en esta solicitud. En otras realizaciones de la presente descripción, el kit comprende una construcción de ácido nucleico que puede utilizarse para modificar por ingeniería una célula de levadura útil para los procedimientos descritos en esta solicitud. En algunas realizaciones de la presente descripción, el kit comprende una célula de levadura y una construcción de ácido nucleico como se describe en esta solicitud.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de plásmidos y cepas
Cuatro genes que codifican desaturasas A11 de A. transitella (SEQ ID NO: 1), A. segetum (SEQ ID NO: 42), S. littoralis (SEQ ID NO: 40), y T. ni (SEQ ID NO: 44) se sintetizaron por Geneart (Life Technologies) en versiones optimizadas por codones para S.cerevisiae. Cuatro genes que codifican las acil reductasas grasas de A. segetum (SEQ ID NO: 3), H. armigera (SEQ ID NO: 7), H. assulta (SEQ ID NO: 11), y H. subflexa (SEQ ID NO: 15) también se sintetizaron por Geneart (Life Technologies) en versiones optimizadas por codones para S.cerevisiae.Adicionalmente, varias acil reductasas grasas se expresaron con señales de retención ER alteradas en sus extremos C-terminales. La acil reductasa grasa de H.armigera fue modificada de modo que su señal KKSYE nativa putativa fue reemplazada con la señal HDEL de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 9). La acil reductasa grasa de H. subflexa fue modificada de modo que su señal EKKT nativa putativa fue reemplazada con HDEL (de S.cerevisiae) (SEQ ID NO: 17). La acil reductasa grasa de H. assulta fue modificada de modo que su señal KKTTNK nativa putativa fue reemplazada con HDEL (de S. cerevisiae) (SEQ ID NO: 13). El gen que codifica la alcohol acetiltransferasa (AcT) de S. cerevisiae ATF1 se amplificó a partir de la preparación de ADN genómico de la cepa de S. cerevisiae CEN.PK 102-5B. Los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR utilizando cebadores con nucleótidos protuberantes compatibles con EasyClone como se describe en (Jensen
y col., 2014). Los cebadores se enumeran en la Tabla 1 y los fragmentos de ADN se enumeran en la Tabla 2. La mezcla de PCR contenía 32 gl de agua, 10 gl de tampón polimerasa de alta fidelidad Phusion® (5x), 1 pl de dNTPs (10 mM), 1 gl de polimerasa Pfu7x, 2,5 gl de cebador directo (10 gM), 2,5 gl de cebador inverso (1o gM) y 1 gl de plantilla de ADN y se utilizó el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 2 min, 30 ciclos de [94 °C durante 15 s, 63 °C durante 20 s, 68 °C durante 1 min 30 s], 68 °C durante 2 min, pausa a 10 °C. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1 % que contenía Safe-Red® (iNtRON Biotechnology). Los productos de PCR del tamaño correcto se escindieron del gel y se purificaron utilizando el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel).
Tabla 1: Cebadores.
Tabla 2: fra mentos de ADN obtenidos or PCR utilizando la lantilla cebadores indicados.
Los vectores integradores básicos EasyClone 2.0 pCfB2190 (XI-2-IoxP-KILEU2syn), pCfB2228 (XII-4-IoxP-SpHIS5syn), y pCfB2190 (XI-2-IoxP-KILEU2syn) se describen en (Stovicek y col., 2015). Un vector para múltiples integraciones EasyCloneMulti pCfB2047 (pTY2-KIURA3-TAG) se describe en (Maury y col., 2016). Adicionalmente, se construyó un vector integrador pCfB2912 (XI-5-IoxP-NatMXsyn). El plásmido pCfB2912 se construyó mediante la fusión USER como se describe en Stovicek y col., 2015 utilizando BB0593 y BB0598, la cadena principal del vector original y el casete de resistencia a nourseotricina, respectivamente.
Todos los vectores integradores básicos se linealizaron con FastDigest® AsiSI (Fermentas) durante 2 horas a 37 °C y luego se fragmentaron con Nb.Bsml (New England Biolabs) durante 1 hora a 65 °C. Los vectores resultantes que contienen extremos cohesivos se separaron por electroforesis en gel, se escindieron y se purificaron con utilizando el gel NucleoSpin® y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel). Los fragmentos de a Dn fueron clonados en los vectores así preparados por clonación USER mediante el siguiente protocolo: 1 pl de plásmido linealizado, 1 pl de fragmento de promotor, 1,5 pl de fragmento de gen, 1 pl de tampón polimerasa de alta fidelidad Phusion® (5x), y 0,5 pl de enzima USER (New England Biolabs) se mezclaron y se incubaron a 37 °C durante 25 min y a 25 °C durante 25 min. La reacción se transformó en células DH alfa químicamente competentes de E. coli y las células se sembraron en placas de agar con caldo de Lisogenia (LB) con 100 mg/l de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C y las colonias resultantes se identificaron de manera selectiva por PCR de colonias. Los plásmidos se purificaron a partir cultivos de E. coli durante la noche y la clonación correcta se confirmó por secuenciación. Los vectores integradores construidos se enumeran en la Tabla 3.
Tabla 3: vectores de ex resión inte radores.
Los vectores de expresión integradores se linealizaron con Notl de FastDigest® (Fermentas) y se transformaron en S. cerevisiae utilizando un protocolo de litio-acetato (Gietz & Schiestl, 2007). Los transformantes positivos fueron seleccionados en placas deficientes sintéticas de levadura (Sigma-Aldrich). La integración correcta de las construcciones de expresión en el genoma de S. cerevisiae fue confirmada mediante PCR de colonias.
Ejemplo 2: Producción de (Z)-11-hexadecenol en S. cerevisiae tras la sobreexpresión de A11-desaturasa de Amyelois transitella y cuatro variantes de acil-CoA reductasa grasa
Se construyeron cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan A11-desaturasa de A. transitella y variantes de acil-CoA reductasas grasas con nativa o HDEL en el extremo C-terminal (Tabla 4). Tres aislados individuales de cada cepa se examinaron para determinar la capacidad adquirida para producir (Z)-11-hexadecen-1-ol. Las colonias individuales se inocularon en 3 ml de medio líquido deficiente sintético de levadura que carece de histidina y leucina en placas de microtitulación con 24 pocillos profundos con tapas penetrables al aire (EnzyScreen) y se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. La cepa parental de control CEN.PK102-5B se cultivó en medio completo sintético. Al siguiente día, 60 pl de pre-cultivo se transfirieron a 540 pl de medio mineral en placas de microtitulación con 96 pocillos profundos con tapas penetrables al aire (EnzyScreen). El medio mineral tenía la composición como se describe en (Jensen y col., 2014). Para la cepa de control, el medio fue suplementado con 240 mg/l de leucina, 76 mg/l de histidina y 20 mg/l de uracilo y el medio para las otras cepas fue suplementado con 20 mg/l de uracilo. Las placas de microtitulación se incubaron a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 48 horas. Después de tomar una muestra para DO, para los restantes 495 ul de cultivo, se añadió un volumen equivalente de decano. La placa se cubrió con una tapa fabricada de Viton de EnzyScreen (para evitar la absorción del disolvente orgánico en la tapa) y la placa se agitó durante 10 min a 250 rpm. La emulsión resultante se transfirió a un vial de vidrio de 4 ml, cerrado con una tapa, se
agitó en un vértex durante 20 s y se centrifugó durante 35 s a 4000 xg. La fase inferior (agua) se retiró y se añadió 0,1 g de Na2SO4 a la fase decano restante. La mezcla se agitó con vórtex durante 10 s y la fase orgánica transparente se transfirió a un vial de vidrio para análisis por GC-MS. Los análisis por GC-MS se realizaron en un GC de Hewlett Packard 6890 acoplado a un detector selectivo de masas de HP 5973. El GC estaba equipado con una columna de INNOWax (30 m x 0,25 mm x 0,25 |jm), y el helio fue usado como gas portador (velocidad media: 33 cm/s). La MS se hizo funcionar en el modo de impacto electrónico (70 eV), barrido entre m/z 30 y 400, y el inyector se configuró en el modo sin división a 220 °C. La temperatura del horno se fijó a 80 °C durante 1 min, luego se incrementó a una tasa de 10 °C/min a 210 °C, seguido de un mantenimiento a 210 °C durante 15 min, y luego aumentó a una tasa de 10 C/min a 230 °C seguido de un mantenimiento a 230 °C durante 20 min. Los compuestos se identificaron por comparación de los tiempos de retención y espectros de masas con los de los compuestos de referencia disponibles en la colección de laboratorio.
Los compuestos fueron cuantificados por la corriente de iones total (TIC) grabada. Los datos fueron analizados mediante el software Agilent ChemStation e iWork Numbers. La concentración de (Z)-11-hexadecen-1-ol se calculó sobre la base de la curva de calibración que varía del patrón de 0 mg/l a 15 mg/l de (Z)-11-hexadecen-1-ol. Los patrones se adquirieron en Pherobank (Wageningen, Países Bajos).
La introducción de la desaturase A11 de A. transitella y de una acil-CoA reductasa grasa de H. armígera o H. subflexa o H. assulta permitió que S. cerevisiae sintetizara (Z)-11-hexadecen-1-ol a un título de 1-3,9 mg/l (Tabla 4). Estudios previos han notificado anteriormente que la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol se obtuvo cuando se expresa AseA11 y Ase_FAR en S. cerevisiae (Hagstrom y col., 2013). Sin embargo, nuestros resultados muestran que Ase_FAR tiene una actividad muy baja y es mucho menos adecuada para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol que Har_FAR, Hs_FAR o Has_FAR.
Tabla 4: Cepas de S. cerevisiae modificadas por ingeniería para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol con diferentes variantes de acil-CoA reductasa rasa.
E jem plo 3: P roducción de (Z )-11-hexadecenol / en S. cerevisiae tras la sobreexpresión de la acil-CoA reductasa grasa de H. arm igera y cuatro variantes de A11-desaturasa
Se construyeron cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan la acil-CoA reductasa grasa de H. armigera con extremo C-terminal modificado y cuatro variantes de A11-desaturasa con el fin de identificar la una con la actividad más alta (Tabla 5). Tres aislados individuales de cada cepa se examinaron para determinar la capacidad adquirida para producir (z )-11 -hexadecen-1 -ol.
Colonias individuales se inocularon en 5 ml de medio de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) con glucosa al 8 % (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 80g/l de dextrosa) en tubos de vidrio de 12-ml (Duran, Wertheim, Alemania) con tapas labocap de metal (Lüdiswiss, Flawil, Suiza) y se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. Al día siguiente se centrifugó el cultivo durante la noche, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 2 ml de medio alimentado a tiempo (FIT) suplementado con 20 mg/L de uracilo. Los medios
alimentados a tiempo fueron adquiridos en m2p-labs GmbH (Baesweiler, Alemania). Se suplemento con 0,5 % de solución de enzima y 1 % de solución de vitaminas inmediatamente antes de su uso. Las placas de microtitulación se incubaron a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 40 horas. Para la extracción, 1 ml de cultivo se transfirió a un vial de vidrio de 4 ml y se añadieron 10 pl de solución madre de patrón interno (1pg/pl de éster (Z)-10-heptan-1-ilmetílico en etanol al 100 %). Los viales se cubrieron con pequeños trozos de papel de aluminio y se utilizó una aguja para perforar pequeños agujeros en las cubiertas de papel de aluminio. Las muestras se agitaron con vórtex y se colocaron a -80 °C para su almacenamiento hasta su análisis. Las muestras se liofilizaron en un sistema de liofilización (Freezone6 y secador de bandeja Stoppening, Labconco, Kansas City, EE.UU.) a40 °C, a continuación, se añadió 1 ml de cloroformo:metanol 2:1 para la disrupción de las células. La mezcla se agitó con vórtex durante 45 s y se dejó a temperatura ambiente durante 4 horas. Los disolventes orgánicos se evaporaron lentamente bajo una corriente de nitrógeno. 1 ml de hexano se añadió, las muestras se agitaron en vórtex durante 10 s, se centrifugaron y 200 pl se transfirieron a un nuevo vial de vidrio.El análisis por GC-MS se realizó como se describe en el Ejemplo 2. La concentración de (Z)-11-hexadecen-1-ol se calculó sobre la base de patrón interno y la curva de calibración.
El producto (Z)-11-hexadecen-1-ol fue producido por todas las cuatro cepas ensayadas, pero la A11-desaturasa de A. transitella era claramente superior a otras, dando como resultado un título de aproximadamente 7 mg/l. El título de la cepa ST3706 fue mayor que en el ejemplo 2, debido a la mejora del cultivo y el protocolo de extracción.
Tabla 5: Cepas de S. cerevisiae modificadas por ingeniería para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol con diferentes variantes de A11-desaturasa.
Ejemplo 4: Mejora de la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol por la integración de múltiples copias de la acil-CoA reductasa grasa
Se construyeron cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan A11-desaturasa de A. transitella y acil-CoA reductasa grasa de H. armigera en Har_FAR. El gen de Har_FAR se integra en una única copia (ST3705) o múltiples copias en el genoma (ST5262). ST3705 se inoculó en 5 ml de medio YPD con 8 % glucosa (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 80 g/l de dextrosa) y ST5262 se inoculó en 5 ml de medio completo sintético que carece de uracilo. Ambas cepas se cultivaron en tubos de vidrio de 12-ml (Duran, Wertheim, Alemania) con tapas labocap de metal (Lüdiswiss, Flawil, Suiza) y se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo durante la noche, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 2 ml de medio alimentado a tiempo (FIT). Para la cepa ST3705, el medio fue suplementado con 20 mg/l de uracilo. El medio alimentado a tiempo fue adquirido en m2p-labs GmbH (Baesweiler, Alemania). Se suplementó con 0,5 % de solución de enzima y 1 % de solución de vitaminas inmediatamente antes de su uso. Los tubos se incubaron a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 40 horas. La extracción de la muestra se realizó como se describe en el Ejemplo 3. La integración de múltiples copias de gen de Har_FAR aumentó la producción ocho veces (Tabla 6).
Tabla 6: Cepas de S. cerevisiae modificadas por ingeniería para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol con diferentes números de co ia de enes de acil-CoA reductasa rasa.
Ejemplo 5: Producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en fermentación discontinua
La cepa ST3705 fue probada para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en la fermentación discontinua. Se inoculó aproximadamente 1 ml del criocultivo de la cepa ST3705 en 150 ml de medio completo sintético sin leucina e histidina (SC leu-his-) en un matraz de agitación con deflector de 500 y se incubó con agitación a 250 rpm durante 24 horas a 30 °C. Al inóculo se le incrementó la concentración centrifugando el cultivo, eliminando 100 ml de sobrenadante y resuspendiendo las células en los 50 ml restantes de líquido. Esta suspensión celular se utilizó para inocular 500 ml de medio de fermentación (6 g/l de KH2PO4, 4 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 1 ml/l de antiespumante 204, 4 ml/l de metales traza (Jensen, 2013), 2 ml/l de vitaminas (Jensen, 2013), y 32 mg/l de uracilo) en un biorreactor de 1 l de Sartorius. Las condiciones de funcionamiento del reactor fueron 30 °C, aireación a 1 l/min, y agitación a 800 rpm. El pH se mantuvo a 5 con KOH 2 M. La solución de alimentación estaba compuesta por 500 ml de 200 g/l de glucosa. Se añadieron 100 ml de solución de alimentación al reactor para iniciar la fermentación. 24 horas más tarde, el caudal constante de 5 g/h se aplicó y se mantuvo durante toda la fermentación.
La cepa ST5262 fue probada para la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en la fermentación discontinua. La cepa ST5262 se inoculó en 100 ml de medio completo sintético de doble concentrado sin uracilo (2xSC ura-) en un matraz con deflector de 2 l y se incubó con agitación a 250 rpm durante 24 h a 28 °C. 400 ml adicionales de 2xSC ura- se añadieron y la incubación continuó en las mismas condiciones durante 48 horas adicionales. Para preparar un inóculo concentrado para la fermentación, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 50 ml del sobrenadante restante. Esta suspensión celular se utilizó para inocular 500 ml de medio de fermentación (6 g/l de KH2 PO4 , 6 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO4*7H2O, 1 ml/l de antiespumante 204, 4 ml/l de metales traza (Jensen, 2013), 2 ml/l de vitaminas (Jensen, 2013) en un biorreactor de 1 l de Sartorius. Las condiciones de funcionamiento del reactor fueron 30 °C, aireación a 1,5 l/min, y agitación a 800 rpm. El oxígeno disuelto se controló por encima de 20 % en la mezcla automática de oxígeno en el aire. El pH se mantuvo a 5 con KOH al 10 %. La solución de alimentación estaba compuesta por 500 ml de 330 g/l de dextrosa suplementada con 0,5 ml de antiespumante 204. Aproximadamente se añadieron 20 ml de solución de alimentación al reactor para iniciar la fermentación. El caudal se fijó a 5 g/h. El caudal se incrementó a 7,5 g/h a las 17 horas desde el inicio de la fermentación y posterior a 10 g/h a las 34 horas desde el inicio de la fermentación. El caudal se redujo a 3 g/h a las 60 horas hasta que el cultivo se recogió a las 100 horas, momento en el cual se consumió toda la alimentación.
El muestreo se realizó mediante la retirada de unos pocos ml de caldo con una jeringa a partir de una salida en el reactor, transfiriendo la muestra a un tubo de plástico, se mantuvo a -20 °C hasta la extracción de (Z)-11-hexadecen-1-ol. La extracción y el análisis por GC-MS se realizaron como se describe en el Ejemplo 3. El título final de producción para la cepa ST3705 fue de 20 mg/l (Figura 2A) y para la cepa ST5262 fue de 189 mg/l (Figura 2B).
Ejemplo 6: Producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en Yarrowia lipolytica
Se ensayó la producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en Y. lipolytica expresando A11-desaturasa de A. transitella y acil-CoA reductasa grasa de H. subflexa.Los genes que codifican una A11-desaturasa de A. transitella (SEQ ID NO: 2) y una acil-CoA reductasa grasa de H. subflexa (SEQ ID NO: 16) se clonaron en un vector de expresión de Y. lipolytica resultante en el plásmido pCfB3465 (Figura 3). Antes de la transformación en Y. lipolytica, el plásmido de expresión se linealizó con Notl. El plásmido linealizado se transformó en la cepa de Y. lipolytica GB20 (Angerer, 2014) utilizando un protocolo a base de litio-acetato (Chen, 1997). Los transformantes positivos fueron seleccionados en un medio completo sintético (SC) que carece de uracilo. La integración de la construcción de expresión en el genoma de Y. lipolytica fue confirmada por la PCR de colonias.
Se inoculó un clon individual de cada cepa en 5 ml de medio de YPD con un 8 % de glucosa (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 80 g/l de dextrosa) en tubos de vidrio de 12 ml (Duran, Wertheim, Alemania) con tapas labocap de metal (Lüdiswiss, Flawil, Suiza) y se incubó durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo durante la noche, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 2 ml de medio limitado de nitrógeno (2,9 g/l (NH4)2SO4, 1,7 g/l de YNB (sin aminoácidos y sulfato de amonio, 240 mg/l de leucina, 76 mg/l de lisina) y 61 g/l de glicerol). Para la cepa ST3683, el medio fue suplementado con 20 mg/l de uracilo. Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 30 °C y se agitaron a 250 rpm. La extracción y el análisis por GC-MS se realizaron como se describe en el Ejemplo 3. La cepa de Y. lipolytica ST3844 que expresa la desaturase A11 de A. transitella y la acil-CoA reductasa grasa de H. subflexa produjo 1,7 mg/l de (Z)-11-hexadecen-1-ol (Tabla 7).
Tabla 7: Cepas y títulos de (Z)-11-hexadecen-1-ol
E jem plo 7: Producción de acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il
Se construyó la cepa ST3581, que expresa A11-desaturasa de A. transitella, acil-CoA reductasa grasa de H. subflexa y alcohol acetiltransferasa AcT de S. cerevisiae para la producción de acetato de (ZJ-11-hexadecen-1-il.
Las colonias individuales de ST3581 y la cepa de control, ST3330, que no sobreexpresa la alcohol acetiltransferasa, se inocularon en 5 ml de medio de y Pd con 8 % de glucosa (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 80 g/l de dextrosa) en tubos de vidrio de 12 ml (Duran, Wertheim, Alemania) con tapas labocap de metal (Lüdiswiss, Flawil, Suiza) y se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo durante la noche, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 2 ml de medio mineral limitado con nitrógeno (1,25 g/l de (NH4)2SÜ4, 14,4 g/l de KH2 PO4 , 0,5 g/l de MgSÜ4*7H2O, 2 ml/l de solución de metales traza (Jensen, 2013), 1 ml/l de solución de vitaminas (Jensen, 2013)) con 20 g/l de glucosa. Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 30 °C y se agitaron a 250 rpm. La extracción y el análisis por GC-MS se realizaron como se describe en el Ejemplo 3. ST3581 produjo 1,68 mg/l de acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, mientras que no se pudo observar la producción de acetato de (Zj-11-hexadecen-1-il en la cepa de control ST3330 (Tabla 8).
Tabla 8: Ce as títulos de acetato de Z-11-hexadecen-1-il.
Secuencias
SEQ ID NO: 1 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de A11-desaturasa de A. transitella; secuencia de codificación de ARNm Atggttccaaacaagggttcctctgatgttttgtctgaacattctgaaccacaattcaccaagttgattgctccacaagctggt ccaagaaagtacaaaatcgtttacagaaacttgttgaccttcggttactggcatttgtctgctgtttatggtttgtacttgtgtttca cttgtgctaagtgggctactattttgttcgctttcttcttgtacgttatcgccgaaattggtattactggtggtgctcatagattatgg gctcatagaacttacaaagccaagttgccattggaaatcttgttgttgatcatgaactccattgccttccaagatactgctttta cttgggctagagatcatagattgcatcacaagtactctgatactgatgctgatccacataatgctactagaggtttcttctact ctcatgttggttggttgttggttaagaaacacccagaagttaaggctagaggtaagtacttgtctttggatgacttgaagaac aaccctttgttgaagttccaaaagaagtacgccattttggtcattggtactttgtgctttttgatgccaactttcgttccagtttactt ttggggtgaaggtatttctactgcctggaacattaacttgttaagatacgtcatgaacttgaacatgacctttttggttaactccg ctgctcatatttttggtaacaagccatacgataagtctatcgcctctgttcaaaacatctctgtttctttggctactttcggtgaag gtttccataactaccatcatacttatccatgggattacagagctgctgaattgggtaacaatagattgaatatgaccaccgc cttcattgatttctttgcttggattggttgggcctacgatttgaaatctgttccacaagaagctattgctaagagatgtgctaaaa ctggtgatggtactgatatgtggggtagaaagagatga
SEQ ID NO: 2 - Secuencia aminoácidos de deltal 1-desaturasa de A. transitella (traducción) MVPNKGSSDVLSEHSEPQFTKLIAPQAGPRKYKIVYRNLLTFGYWHLSAVYGLYLCFT CAKWATILFAFFLYVIAEIGITGGAHRLWAHRTYKAKLPLEILLLIMNSIAFQDTAFTWAR DHRLHHKYSDTDADPHNATRGFFYSHVGWLLVKKHPEVKARGKYLSLDDLKNNPLLK FQKKYAILVIGTLCFLMPTFVPVYFWGEGISTAWNINLLRYVMNLNMTFLVNSAAHIFG NKPYDKSIASVQNISVSLATFGEGFHNYHHTYPWDYRAAELGNNRLNMTTAFIDFFAW IGWAYDLKSVPQEAIAKRCAKTGDGTDMWGRKR
SEQ ID NO: 3 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de A. segetum; secuencia de codificación de ARNm atgccagtcttgacttctagagaagacgaaaaattgtccgtcccagaattttacgctggtaagtctatttttgttaccggtggta ctggtttcttgggtaaggtttttatcgaaaagttgttgtactgctgcccagatatcgataagatctacatgttgatcagagaaaa aaag aacttgtccatcg acg aaag aatg tccaag tttttgg atg accctttg ttctccag attg aaag aag aaag accagg tgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattaccgctcctaatttgggtttgtctgctgaaaacgaaagaatcttgttg gaaaaggtcagtgtcattattaactctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaattgcttggaagattaacgttga aggtactagaatgttgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctccaccgcttactctaatgc ttcttctgatagaattgtcgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatatggatcaagtttatcaattggttaaggacggt gtcactg aag aag aaaccg aaag attattg aacggtttgccaaacacttacactttcactaaggctttg accg aacatttg gttgctgaacatcaaacttacgttccaaccattatcatcagaccatctgttgttgcctccattaaggatgaacctattagaggtt ggttgtgtaattggtttggtgctactggtatttctgttttcactgctaagggtttgaacagagttttgttgggtaaagcctctaacat cgttgatgttatcccagttgattacgttgccaacttggttatagttgctggtgctaaatctggtggtcaaaagtctgatgaattga aaatctacaactgctgctcctctgactgtaatccagttactttgaagaagatcatcaaagaattcaccgaagataccatcaa gaacaagtcccatattatgccattgccaggttggttcgtttttactaagtacaaatggttgttgactttgttgaccatcatcttcca aatgttgccaatgtatttggccgatgtttacagagtcttgaccggtaaaattccaagatatatgaagttgcaccacttggtcatt caaaccagattgggtattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaagaccgatagagtcagagaattattcggttctttgtc cttggccgaaaaacacatgtttccatgtgatccatcttccattgattggaccgattacttgcaatcttactgctatggtgtcaga ag attcttag aaaag aag aag taa
SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos de acil reductasa grasa de A. segetum
MPVLTSREDEKLSVPEFYAGKSIFVTGGTGFLGKVFIEKLLYCCPDIDKIYMLIREKKNL SIDERMSKFLDDPLFSRLKEERPGDLEKIVLIPGDITAPNLGLSAENERILLEKVSVIINSA ATVKFNEPLPIAWKINVEGTRMLLALSRRMKRIEVFIHISTAYSNASSDRIVVDEILYPAP ADMDQVYQLVKDGVTEEETERLLNGLPNTYTFTKALTEHLVAEHQTYVPTIIIRPSVVA SIKDEPIRGWLCNWFGATGISVFTAKGLNRVLLGKASNIVDVIPVDYVANLVIVAGAKS GGQKSDELKIYNCCSSDCNPVTLKKIIKEFTEDTIKNKSHIMPLPGWFVFTKYKWLLTLL
TIIFQMLPMYLADVYRVLTGKIPRYMKLHHLVIQTRLGIDFFTSHSWVMKTDRVRELFG SLSLAEKHMFPCDPSSIDWTDYLQSYCYGVRRFLEKKK
SEQ ID NO: 5 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. armígera con péptido señal cambiado a KKYR secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag ggtttg tccgtttccg aaag aatcaagcactttttgg atg atcctttgttcaccag attg aaag aaaaaag accagccg actt ggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atg ttggccttg tctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca acagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcacagatatgttaaggacggtatctct gaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg ctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataag tacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacatttcttggaaa aaaagtacagataa
SEQ ID NO: 6 - Secuencia de aminoácidos de acil reductasa grasa de H. armigera con péptido señal cambiado a KKYR
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHRYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAI KDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSK STELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTILF QVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSPA DKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEKKYR
SEQ ID NO: 7 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. armígera; secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag gg tttg tccgtttccg aaag aatcaagcactttttgg atg atcctttgttcaccag attg aaag aaaaaag accagccg actt ggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atg ttggccttg tctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca acagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcacagatatgttaaggacggtatctct gaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg ctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataag tacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacatttcttggaaa aaaaaagctacgaataa
SEQ ID NO: 8 - Acil reductasa grasa de H. armigera
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHRYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAA IKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSS KSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTIL FQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSP ADKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEKKSYE
SEQ ID NO: 9 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. armígera con péptido señal cambiado a HDEL; secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag ggtttg tccgtttccg aaag aatcaagcactttttgg atg atcctttgttcaccag attg aaag aaaaaag accagccg actt ggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atgttggccttgtctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca
acagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcacagatatgttaaggacggtatctct gaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg ctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataag tacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacatttcttggaac atgatgaattgtaa
SEQ ID NO: 10 - Acil reductasa grasa de H. armigera con péptido señal cambiado a HDEL
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHRYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAI KDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSK STELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTILF QVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSPA DKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEHDEL
SEQ ID NO: 11 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. assulta; secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaagatcttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag ggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcaatttttggatgaccctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgact tgg aaaag atcgttttg attccagg tg atattactgctccag atttgggtattacctccg aaaacg aaaag atg ttg atcg aa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atg ttggccttg tctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca acagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctct g aag aag aaactg aaaaaatcttg aacgg tag accaaacacttacactttcactaaggctttg accg aacatttgg ttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcattcctcttacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg
ctatgccattgccaggttggtatgtttttacaaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataag tacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacacttcttggaaa aaaagactaccaacaagtaa
SEQ ID NO: 12 - Secuencia de aminoácidos de acil reductasa grasa de H. assulta
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKIFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKQFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAI KDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSYIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSK STELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYVFTKYKWLVLLLTIL FQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSP ADKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEKKTTNK
SEQ ID NO: 13 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. assulta con péptido señal cambiado a HDEL; secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaagatcttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag ggtttg tccgtttccg aaag aatcaagcaatttttgg atg accctttg ttcaccag attg aaag aaaaaag accagccg act tgg aaaag atcgttttg attccagg tg atattactgctccag atttgggtattacctccg aaaacg aaaag atg ttg atcg aa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atg ttggccttg tctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca acagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctct gaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcattcctcttacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg ctatgccattgccaggttggtatgtttttacaaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataag tacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacacttcttggaac atgatgaattgtaa
SEQ ID NO: 14 - Secuencia de aminoácidos de acil reductasa grasa de H. assulta con péptido señal cambiado a HDEL
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKIFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKQFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAI KDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSYIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSK STELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYVFTKYKWLVLLLTIL FQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSP ADKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEHDEL
SEQ ID NO: 15 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. subflexa; secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag gg tttg tccgtttccg aaag aatcaagcactttttgg atg atcctttgttcaccag attg aaag aaaaaag accagccg actt ggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atg ttggccttg tctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca acagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctct gaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg ctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcaccaaccattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataa gtacttgtttccatgtgatccagtcaacatcaattggagacaatatatccaagattactgctggggtgttagacatttcttggaa aaaaagacttaa
SEQ ID NO: 16 - Aminoácido de acil reductasa grasa de H. subflexa MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAA
IKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSS KSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTIL FQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTNHSWVMKADRVRELFASLSP ADKYLFPCDPVNINWRQYIQDYCWGVRHFLEKKT
SEQ ID NO: 17 - Secuencia de nucleótidos optimizada por codones en S. cerevisiae de acil reductasa grasa de H. subflexa con péptido señal cambiado a HDEL; secuencia de codificación de ARNm atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggt ttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaag gg tttg tccgtttccg aaag aatcaagcactttttgg atg atcctttgttcaccag attg aaag aaaaaag accagccg actt ggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaa aaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggt actag aatg atg ttggccttg tctag aag aatg aag ag aatcg aagttttcatccatatctctaccgcttacactaacacca acag ag aagttgttg acg aaatcttgtatccagctccagctg atattg atcaagttcaccaatatgttaagg acgg tatctct gaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgct gaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttg ggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgtt gatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaa ctgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacg ctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagccta cattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcc tccattgatttcttcaccaaccattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataa gtacttgtttccatgtgatccagtcaacatcaattggagacaatatatccaagattactgctggggtgttagacatttcttgcat gatgaattgtaa
SEQ ID NO: 18 - Secuencia de aminoácidos de acil reductasa grasa de H. subflexa con péptido señal cambiado a HDEL MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLS VSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAA TVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPA DIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAA IKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSS KSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTIL FQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTNHSWVMKADRVRELFASLSP ADKYLFPCDPVNINWRQYIQDYCWGVRHFLHDEL SEQ ID NO: 34 - Secuencia de ADN de Sc_FAA1; secuencia de codificación de ARNm
ATGGTTGCTCAATATACCGTTCCAGTTGGGAAAGCCGCCAATGAGCATGAAACTG CTCCAAGAAGAAATTATCAATGCCGCGAGAAGCCGCTCGTCAGACCGCCTAACAC AAAGT GTT CCACT GTTT AT G AGTTT GTT CT AGAGT GCTTT CAG AAG AACAAAAATT C AAATGCTATGGGTTGGAGGGATGTTAAGGAAATTCATGAAGAATCCAAATCGGTTA TGAAAAAAGTTGATGGCAAGGAGACTTCAGTGGAAAAGAAATGGATGTATTATGAA CT AT CGC ATT AT C ATT AT AATT C ATTT G ACO AATT G ACCG AT AT C AT GC AT G AAATT GGTCGTGGGTTGGTGAAAATAGGATTAAAGCCTAATGATGATGACAAATTACATCT TT ACGCAGCCACTT CT CACAAGTGG AT G AAG AT GTT CTT AGG AGCGCAGT CT CAA GGTATTCCTGTCGTCACTGCCTACGATACTTTGGGAGAGAAAGGGCTAATTCATTC TTTGGTGCAAACGGGGTCTAAGGCCATTTTTACCGATAACTCTTTATTACCATCCT T G AT CAAACCAGTGCAAGCCGCT CAAG ACGT AAAAT ACAT AATT CATTT CG ATT CC ATCAGTTCTGAGGACAGGAGGCAAAGTGGTAAGATCTATCAATCTGCTCATGATG CC AT C AAC AG AATT AAAG AAGTT AG ACCT G AT AT C AAG ACCTTT AGCTTT G ACG AC AT CTT G AAGCT AGGT AAAG AAT CCTGT AACG AAAT CG AT GTT C AT CC ACCT GGC AAGGATGATCTTTGTTGCATCATGTATACGTCTGGTTCTACAGGTGAGCCAAAGG GT GTT GT CTT G AAACATT CAAAT GTT GT CGC AGGT GTTGGTGGTGCAAGTTT G AAT GTTTT G AAGTTT GTGGGCAAT ACCG ACCGT GTT AT CT GTTTTTTGCCACT AGCT CA TATTTTTGAATTGGTTTTCGAACTATTGTCCTTTTATTGGGGGGCCTGCATTGGTTA TGCCACCGT AAAAACTTT AACT AGCAGCT CT GT GAG AAATT GT CAAGGT G ATTT GC AAGAATTCAAGCCCACAATCATGGTTGGTGTCGCCGCTGTTTGGGAAACAGTGAG AAAAGGG AT CTT AAACCAAATT G AT AATTTGCCCTT CCT CACCAAG AAAAT CTT CT G GACCGCGTATAATACCAAGTTGAACATGCAACGTCTCCACATCCCTGGTGGCGGC GCCTT AGG AAACTT GGTTTT CAAAAAAAT CAG AACTGCCACAGGTGGCCAATT AAG ATATTTGTTAAACGGTGGTTCTCCAATCAGTCGGGATGCTCAGGAATTCATCACAA ATTTAATCTGCCCTATGCTTATTGGTTACGGTTTAACCGAGACATGCGCTAGTACC ACCATCTTGGATCCTGCTAATTTTGAACTCGGCGTCGCTGGTGACCTAACAGGTT GT GTT ACCGT C AAACT AGTT G ATGTT G AAG AATT AGGTT ATTTTGCT AAAAAC AACC AAGGTGAAGTTTGGATCACAGGTGCCAATGTCACGCCTGAATATTATAAGAATGA GG AAG AAACTTCTCAAGCTTTAACAAGCGATGGTTGGTTCAAGACCGGTGACATC GGTGAATGGGAAGCAAATGGCCATTTGAAAATAATTGACAGGAAGAAAAACTTGG T C AAAAC AAT G AACGGT G AAT AT AT CGC ACT CGAG AAATT AGAGT CCGTTT ACAGA T CT AACG AAT AT GTTGCT AAC ATTT GT GTTT ATGCCG ACC AAT CT AAG ACT AAGCC AGTTGGT ATT ATT GT ACC AAAT C ATGCT CC ATT AACG AAGCTTGCT AAAAAGTTGG G AATT AT GG AACAAAAAG ACAGTT CAATT AAT AT CG AAAATT ATTTGGAGG ATGCA AAATT G ATT AAAGCT GTTT ATT CT G AT CTTTT G AAG AC AGGT AAAG ACC AAGGTTT G
GTTGGCATTGAATTACTAGCAGGCATAGTGTTCTTTGACGGCGAATGGACTCCAC AAAACGGTTTT GTT ACGT CCGCT C AG AAATT G AAAAG AAAAG AC ATTTT G AATGCT GT CAAAG AT AAAGTT G ACGCCGTTT AT AGTT CGT CTT AA
SEQ ID NO: 35 - Secuencia de aminoácidos de Sc_FAA1 MVAQYTVPVGKAANEHETAPRRNYQCREKPLVRPPNTKCSTVYEFVLECFQKNKNS NAMGWRDVKEIHEESKSVMKKVDGKETSVEKKWMYYELSHYHYNSFDQLTDIMHEI GRGLVKIGLKPNDDDKLHLYAATSHKWMKMFLGAQSQGIPVVTAYDTLGEKGLIHSLV QTGSKAIFTDNSLLPSLIKPVQAAQDVKYIIHFDSISSEDRRQSGKIYQSAHDAINRIKEV RPDIKTFSFDDILKLGKESCNEIDVHPPGKDDLCCIMYTSGSTGEPKGVVLKHSNVVA GVGGASLNVLKFVGNTDRVICFLPLAHIFELVFELLSFYWGACIGYATVKTLTSSSVRN CQGDLQEFKPTIMVGVAAVWETVRKGILNQIDNLPFLTKKIFWTAYNTKLNMQRLHIPG GGALGNLVFKKIRTATGGQLRYLLNGGSPISRDAQEFITNLICPMLIGYGLTETCASTTI LDPANFELGVAGDLTGCVTVKLVDVEELGYFAKNNQGEVWITGANVTPEYYKNEEET SQALTSDGWFKTGDIGEWEANGHLKIIDRKKNLVKTMNGEYIALEKLESVYRSNEYVA NICVYADQSKTKPVGIIVPNHAPLTKLAKKLGIMEQKDSSINIENYLEDAKLIKAVYSDLL KTGKDQGLVGIELLAGIVFFDGEWTPQNGFVTSAQKLKRKDILNAVKDKVDAVYSSS
SEQ ID NO: 36 - Secuencia de ADN de YI_FAA; secuencia de codificación de ARNm
atggtcggat acacaatttc ctcaaagccc gtgtcggtgg aggtcggccc cgccaagcct
61 ggcgagactg ccccccgacg aaacgtcatt gccaaggacg cccctgtcgt cttccccgac 121 aacgactcgt ccctgaccac cgtctacaag ctgttcaaaa agtacgccga gatcaacagc 181 gagcgaaagg ccatgggatg gcgagacacc atcgacatcc acgtggagac caaacaggtg 241 accaaggtcg tggacggagt ggagaagaag gtgcccaagg aatggaagta ctttgagatg 301 ggcccttaca agtggctctc atacaaggag gcccttaagc tggtccatga ttatggagct 361 ggtcttcgac acctcggaat caagcccaag gagaagatgc acatttacgc ccagacctcc 421 caccgatgga tgctctctgg cctggcttct ctgtctcagg gtattcccat tgtcactgcc 481 tacgacactc ttggagagga gggtctcact cgatctctcc aggagaccaa ctcggtcatc 541 atgtttaccg acaaggctct gctgagctct ctcaaggtct ctctcaagaa gggcaccgat 601 ctgcgaatca tcatctacgg aggtgatctg acccccgacg acaagaaggc cggaaacacg 661 gagattgacg ccatcaagga gattgttcca gatatgaaga tctacaccat ggacgaggtt 721 gtcgctctcg gccgagaaca cccccacccc gtggaggagg tcgactatga ggacctggcc 781 ttcatcatgt acacctctgg ttctaccggt gtccccaagg gtgtggttct gcagcacaag 841 cagatcctcg cctctgtggc cggtgtcacc aagatcattg accgatctat catcggcaac 901 acagaccggc ttctcaactt cctgcccctc gcacacattt tcgagtttgt gttcgagatg 961 gtcaccttct ggtggggtgc ttctctgggt tacggaaccg tcaagaccat ttccgatctg
1021 tccatgaaga actgtaaggg agacattcga gagctcaagc ccaccatcat ggtcggcgtt 1081 cccgctgtct gggaacctat gcgaaagggt attcttggca agatcaagga gctgtctcct
1141 ctgatgcagc gggtcttctg ggcctcattt gccgccaagc agcgtctcga cgagaacgga
1201 ctccctggtg gatctatcct cgactcgctc attttcaaga aggtcaagga cgccactgga
1261 ggctgtctcc gatacgtgtg taacggaggt gctccagtat ctgtcgacac ccagaagttc
1321 atcaccactc tcatctgtcc catgctgatt ggatgcggtc tgaccgagac tacagccaac
1381 accaccatca tgtcgcctaa atcgtacgcc tttggcacca ttggtgagcc caccgccgcc
1441 gtgaccctca agctcattga cgtgcctgaa gccggctact tcgccgagaa caaccaggga
1501 gagctgtgca tcaagggcaa cgtcgtgatg aaggagtact acaagaacga ggaggagacc
1561 aagaaggcgt tctccgacga tggctatttc ctcaccggtg atattgccga gtggaccgcc
1621 aatggccagc tcagaatcat tgaccgacga aagaacctcg tcaagaccca gaacggagag
1681 tacattgctc tggagaagct cgagacacag taccgatcgt cgtcgtacgt ggccaacctg
1741 tgtgtgtacg ccgaccagaa ccgagtcaag cccattgctc tggtcattcc taacgagggc
1801 cccaccaaga agcttgccca gagcttgggc gtcgattctg acgactggga cgccgtctgt
1861 tccaacaaaa aggtggtcaa ggctgtgctc aaggacatgc tcgataccgg ccgatctctg
1921 ggtctgtccg gcattgagct gctgcaaggc attgtgttgc tgcctggcga gtggactcct
1981 cagaacagct acctgactgc tgcccagaag ctcaaccgaa agaagattgt ggatgataac
2041 aagaaggaaa ttgatgagtg ctacgagcag tcttag
SEQ ID NO: 37 - Secuencia de aminoácidos de YI_FAA MVGYTISSKPVSVEVGPAKPGETAPRRNVIAKDAPVVFPDNDSSLTTVYKLFKKYAEIN SERKAMGWRDTIDIHVETKQVTKVVDGVEKKVPKEWKYFEMGPYKWLSYKEALKLV HDYGAGLRHLGIKPKEKMHIYAQTSHRWMLSGLASLSQGIPIVTAYDTLGEEGLTRSL QETNSVIMFTDKALLSSLKVSLKKGTDLRIIIYGGDLTPDDKKAGNTEIDAIKEIVPDMKI YTMDEVVALGREHPHPVEEVDYEDLAFIMYTSGSTGVPKGVVLQHKQILASVAGVTKII DRSIIGNTDRLLNFLPLAHIFEFVFEMVTFWWGASLGYGTVKTISDLSMKNCKGDIREL KPTIMVGVPAVWEPMRKGILGKIKELSPLMQRVFWASFAAKQRLDENGLPGGSILDSL IFKKVKDATGGCLRYVCNGGAPVSVDTQKFITTLICPMLIGCGLTETTANTTIMSPKSYA FGTIGEPTAAVTLKLIDVPEAGYFAENNQGELCIKGNVVMKEYYKNEEETKKAFSDDG YFLTGDIAEWTANGQLRIIDRRKNLVKTQNGEYIALEKLETQYRSSSYVANLCVYADQN RVKPIALVIPNEGPTKKLQSLGVDSDDWDAVCSNKKVVKAVLKDMLDTGRSLGLSGIE LLQGIVLLPGEWTPQNSYLTAAQKLNRKKIVDDNKKEIDECYEQS SEQ ID NO: 38: Secuencia de ADN de A T F 1 de S a cch a ro m yce s c e re v is ia e ; s e cu e n c ia de co d ifica c ió n m R N A
ATGAATGAAA TCGATGAGAA AAATCAGGCC CCCGTGCAAC AAGAATGCCT GAAAGAGATG ATTCAGAATG GGCATGCTCG GCGTATGGGA TCTGTTGAAG ATCTGTATGT TGCTCTCAAC AGACAAAACT TATATCGAAA CTTCTGCACA TATGGAGAAT TGAGTGATTA CTGTACTAGG GATCAGCTCA CATTAGCTTT GAGGGAAATC TGCCTGAAAA ATCCAACTCT TTTACATATT GTTCTACCAA CAAGATGGCC AAATCATGAA A ATT ATT ATO GCAGTTCCGA ATACTATTCA CGGCCACATC CAGTGCATGA TTATATTTCA GTATTACAAG AATTGAAACT GAGTGGTGTG GTTCTCAATG AACAACCTGA GTACAGTGCA GTAATGAAGC AAATATTAGA AGAATTCAAA AATAGTAAGG GTTCCTATAC TGCAAAAATT TTTAAACTTA CTACCACTTT GACTATTCCT TACTTTGGAC CAACAGGACC GAGTTGGCGG CTAATTTGTC TTCCAGAAGA GCACACAGAA AAGTGGAAAA AATTTATCTT TGTATCTAAT CATTGCATGT CTGATGGTCG GTCTTCGATC CACTTTTTTC ATGATTTAAG AGACGAATTA AAT AAT ATT A AAACTCCACC AAAAAAATTA GATTACATTT TCAAGTACGA GGAGGATTAC CAATTATTGA GGAAACTTCC AGAACCGATC GAAAAGGTGA TAGACTTTAG ACCACCGTAC TTGTTTATTC CGAAGTCACT TCTTTCGGGT TTCATCTACA ATCATTTGAG ATTTTCTTCA AAAGGTGTCT GTATGAGAAT GGATGATGTG GAAAAAACCG ATGATGTTGT CACCGAGATC ATCAATATTT CACCAACAGA ATTTCAAGCG ATTAAAGCAA ATATTAAATC AAATATCCAA GGTAAGTGTA CTATCACTCC GTTTTTACAT GTTTGTTGGT TTGTATCTCT TCATAAATGG GGTAAATTTT TCAAACCATT GAACTTCGAA TGGCTTACGG ATATTTTTAT CCCCGCAGAT TGCCGCTCAC AACTACCAGA TGATGATGAA ATGAGACAGA TGTACAGATA TGGCGCTAAC GTTGGATTTA TTGACTTCAC CCCCTGGATA AGCGAATTTG ACATGAATGA TAACAAAGAA AATTTTTGGC CACTTATTGA GCACTACCAT GAAGTAATTT CGGAAGCTTT AAGAAATAAA AAGCATCTCC ATGGCTTAGG GTTCAATATA CAAGGCTTCG TTCAAAAATA TGTGAACATT GACAAGGTAA TGTGCGATCG TGCCATCGGG AAAAGACGCG GAGGTACATT GTTAAGCAAT GTAGGTCTGT TTAATCAGTT AGAGGAGCCC GATGCCAAAT ATTCTATATG CGATTTGGCA TTTGGCCAAT TTCAAGGATC CTGGCACCAA GCATTTTCCT TGGGTGTTTG TTCGACTAAT GTAAAGGGGA TGAATATTGT TGTTGCTTCA ACAAAGAATG TTGTTGGTAG TCAAGAATCT CTCGAAGAGC TTTGCTCCAT TTACAAAGCT CTCCTTTTAG GCCCTTAG SEQ ID NO: 39: Secuencia de aminoácidos de A tf1 de S a cch a ro m yce s ce re v is ia e
MNEIDEKNQAPVQQECLKEMIQNGHARRMGSVEDLYVALNRQNLYRNFCTYGELSD YCTRDQLTLALREICLKNPTLLHIVLPTRWPNHENYYRSSEYYSRPHPVHDYISVLQEL KLSGVVLNEQPEYSAVMKQILEEFKNSKGSYTAKIFKLTTTLTIPYFGPTGPSWRLICLP EEHTEKWKKFIFVSNHCMSDGRSSIHFFHDLRDELNNIKTPPKKLDYIFKYEEDYQLLR KLPEPIEKVIDFRPPYLFIPKSLLSGFIYNHLRFSSKGVCMRMDDVEKTDDVVTEIINISP TEFQAIKANIKSNIQGKCTITPFLHVCWFVSLHKWGKFFKPLNFEWLTDIFIPADCRSQL PDDDEMRQMYRYGANVGFIDFTPWISEFDMNDNKENFWPLIEHYHEVISEALRNKKH LHGLGFNIQGFVQKYVNIDKVMCDRAIGKRRGGTLLSNVGLFNQLEEPDAKYSICDLA FGQFQGSWHQAFSLGVCSTNVKGMNIVVASTKNVVGSQESLEELCSIYKALLLGP SEQ ID NO: 40: Secuencia de ADN de SI_A11-desaturasa; secuencia de codificación de ARNm.
GGACACT G ACATGG ACT G AAGG AGT AG AG AAT CGGCCCGTGG AGTTGGCCTT CA TTTT C AGT CTT ATCTCTCGGT GTT ATGGT AGT C ACTT ATATCGGT ATT AAAAT AAGT GAATAAGGCTTGTAAAAATGGCGCAATGTGTACAAACAACAACGATTTTGGAACAA AAAG AAG AG AAAACAGT AACTTTGCT GGT ACCT CAAGCGGG AAAG AGG AAGTTT G AAATT GT GT ATTTT AAT AT CAT CACCTT CGCTT ACT GGCAT AT AGCTGG ACT AT AT G GCCTTT ATTT GTGCTT CACTT CAACAAAAT GGGCG ACAGTTTT ATT CT CATT CTTT C T ATT CGT CGT AGCAG AAGT AGGGGT CACGGCTGGCT CCCACAG ACTTTGGT CGCA T AAAACTT AC AAAGC AAAACT ACCTTT AC AAATT CT GCT AATGGT G AT G AATT CCCT TGC ATTT C AAAAC AC AGT CATT G ATTGGGT G AG AG ACO AT CG ACT CC AT CAT AAGT AT AGCG AC ACT G ATGCCG AT COCO AT AATGCCT CCCG AGG ATTTTT CT ATT CGC AC GTCGGTTGGCTGCTTGTGAGAAAACACCCTGATGTCAAGAAACGAGGAAAGGAAA TT G AT AT AT CT G AT ATTT AC AAC AAT CCGGT ACT G AGGTT CCAG AAG AAGT ACGC A ATT CCTTT CAT CGGGGCAGTTT GTTT CGT CTT ACCAACATT G AT ACCGGTTT ACGG TTGGGGAGAAACCTGGACTAATGCCTGGCACGTCGCCATGCTGCGGTACATTATG AACCTT AACGT CACCTT CCT GGT CAACAGCGCT GCT CAT AT AT AT GG AAAG AG ACO TT AT G ACAAG AAG AT CCT ACCAT CT CAAAACAT AGCT GT GT CCATTGCAACCTTT G GGG AAGGTTT CC AT AATT AT CAT CAT GT ATTT CC AT GGG ATT AT CGCGC AGCT G AA CTT GG AAAT AAC AGTTT G AATTT CCCT ACG AAATTT ATT G ATTT CTTT GCGTGGATC GGATGGGCGTATG ACCTAAAG ACTGTTTCG AAAG AAATGATAAAACAAAGGTCAA AAAGAACTGGTGATGGAACTAATCTATGGGGGTTAGAAGATGTGGATACCCCGGA GG ATTTAAAAAATACAAAAGGCG AATAGGCAAACCCTTAAACTCAAACAGTGAGGT TT AAT GT G AT ATTT AGAATT AG AATT AATTT ATTT G AAATT AAAT G AAGGTTTT GG AT AACT GTTTTT AAT AAT AAAAAT AGTTTTT CG ATT AAATT CCTT AG ATT ATTTT AAAGG AAAT GT AT AAGGT ACT CGCGTGGTT AGCAACCCAGCAGT CCCT GTTT AT CT GTTTT T AT G AATTT ATT CT AT G AAT GT AG AT GT CGCAT G AAATTTT AAAAT GTTGCATTT GT A T AATTTT ACTT AT G AAT AAAT AAATTT ATTTTT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAA
SEQ ID NO: 41: Secuencia de aminoácidos de SI A11-desaturasa
MAQCVQTTTILEQKEEKTVTLLVPQAGKRKFEIVYFNIITFAYWHIAGLYGLYLCFTSTK WATVLFSFFLFVVAEVGVTAGSHRLWSHKTYKAKLPLQILLMVMNSLAFQNTVIDWVR DHRLHHKYSDTDADPHNASRGFFYSHVGWLLVRKHPDVKKRGKEIDISDIYNNPVLRF QKKYAIPFIGAVCFVLPTLIPVYGWGETWTNAWHVAMLRYIMNLNVTFLVNSAAHIYGK RPYDKKILPSQNIAVSIATFGEGFHNYHHVFPWDYRAAELGNNSLNFPTKFIDFFAWIG WAYDLKTVSKEMIKQRSKRTGDGTNLWGLEDVDTPEDLKNTKGE
SEQ ID NO: 42: Secuencia de ADN de As_A11-desaturasa; secuencia de codificación de ARNm.
ATGGCTCAAGGTGTCCAAACAACTACGATATTGAGGGAGGAAGAGCCGTCATTGA CTTT CGTGGT ACCT C AAG AACCG AG AAAGT AT C AAAT CGTGT ACCC AAACCTT AT C ACATTTGGGT ACTGGCAT ATAGCTGGTTTAT ACGGGCTAT ATTTGTGCTTT ACTTC GGCAAAATGGCAAACAATTTTATTCAGTTTCATGCTCGTTGTGTTAGCAGAGTTGG GAATAACAGCCGGCGCTCACAGGTTATGGGCCCACAAAACATATAAAGCGAAGCT T CCCTT AC AAATT AT CCTG ATG AT ACT G AACT CC ATTGCCTT CC AAAATTCCGCC AT T G ATT GGGT G AGGG ACCACCGT CT CCAT CAT AAGT ACAGT G ACACT G ATGC AG AC CCT CACAAT GCT ACT CGT GGTTT CTT CT ATT CT CAT GTTGG ATGGTTGCTCGT AAG AAAAC AT CC AG AAGT C AAG AG ACGTGG AAAGG AACTT G AC AT GT CT G AT ATTT ACA ACAATCCAGTGCTGAGATTTCAAAAGAAGTATGCTATACCCTTCATCGGGGCAATG TGCTTCGGATTACCAACTTTTATCCCTGTTTACTTCTGGGGAGAAACCTGGAGTAA TGCTTGGCAT AT CACCATGCTT CGGT ACAT CCT CAACCT AAACATT ACTTT CCTGG TCAACAGTGCTGCTCATATCTGGGGATACAAACCTTATGACATCAAAATATTGCCT GCCCAAAAT AT AGCAGTTT CCAT AGT AACCGGCGGCG AAGTTT CCAT AACT ACCA CCACGTTTTTT CCTTGGG ATT AT CGTGCAGCAG AATT GGGG AACAATT AT CTT AAT TTGACGACTAAGTTCATAGATTTCTTCGCTTGGATCGGATGGGCTTACGATCTTAA GACGGTGTCCAGTGATGTTATAAAAAGTAAGGCGGAAAGAACTGGTGATGGGACG AAT CTTT GGGGTTT AGAAG ACAAAGGT G AAGAAG ATTTTTT G AAAAT CTGG AAAG A CAATTAA
SEQ ID NO: 43: Secuencia de aminoácidos de As_A11-desaturasa MAQGVQTTTILREEEPSLTFVVPQEPRKYQIVYPNLITFGYWHIAGLYGLYLCFTSAKW QTILFSFMLVVLAELGITAGAHRLWAHKTYKAKLPLQIILMILNSIAFQNSAIDWVRDHRL HHKYSDTDADPHNATRGFFYSHVGWLLVRKHPEVKRRGKELDMSDIYNNPVLRFQK KYAIPFIGAMCFGLPTFIPVYFWGETWSNAWHITMLRYILNLNITFLVNSAAHIWGYKPY
DIKILPAQNIAVSIVTGGEVSITTTTFFPWDYRAAELGNNYLNLTTKFIDFFAWIGWAYDL KTVSSDVIKSKAERTGDGTNLWGLEDKGEEDFLKIWKDN
SEQ ID NO: 44: Secuencia de ADN de Tni_A11-desaturasa; secuencia de codificación de ARNm.
ATGGCTGTGATGGCTCAAACAGTACAAGAAACGGCTACAGTGTTGGAAGAGGAAG CT CGCACAGT G ACT CTT GT GGCT CCAAAG ACAACGCCAAGG AAAT AT AAAT AT AT A T ACACCAACTTT CTT ACATTTT CAT ATGCGCATTT AGCTGCATT AT ACGG ACTTT AT TTGTGCTT CACCT CT GCG AAATGGG AAACATTGCT ATT CT CTTT CGT ACT CTT COA CAT GT CAAAT AT AGGCAT CACCGCAGGGGCT CACCG ACT CT GG ACT CACAAG ACT TT CAAAGCCAAATTGCCTTT GG AAATT GT CCT CAT G AT ATT CAACT CTTT AGCCTTT CAAAACACGGCT ATT ACAT GGGCT AGAGAACATCGGCT ACATCACAAAT ACAGCG AT ACT G ATGCTG AT CCCC AC AAT GCGT C AAG AGGGTT CTT CT ACT CGC AT GTTGG CTGGCT ATT AGT AAAAAAAC AT CCCG ATGTCCT G AAAT AT GG AAAAACT AT AG AC A TGTCGG ATGTAT AC AAT AAT CCTGT GTT AAAATTT C AG AAAAAGT ACGC AGT ACCC TT AATT GG AACAGTTT GTTTTGCT CTT CCAACTTT G ATT CCAGT CT ACT GTTGGGGC G AAT CGTGG AACAACGCTT GGCACAT AGCCTT ATTT CG AT ACAT ATT CAAT CTT AA CGTGACTTTCCTAGTCAACAGTGCTGCGCATATCTGGGGGAATAAGCCTTATGAT AAAAGCATCTTGCCCGCTCAAAACCTGCTGGTTTCCTTCCTAGCAAGTGGAGAAG GCTT CCAT AATT ACCAT CACGT CTTT CCAT GGG ATT ACCGCACAGCAG AATT AGGG AAT AACTT CCT G AATTT G ACG ACGCTGTT C ATT G ATTTTT GTGCCTGGTTT GG ATG GGCTT AT G ACTT G AAGT CT GT AT CAG AGG AT ATT AT AAAACAG AG AGCT AAACGAA CAGGT G ACGGTT CTT CAGGGGT CATTTGGGG ATGGG ACG ACAAAGACAT GG ACC GCG AT AT AAAAT CT AAAGCT AACATTTTTT ATGCT AAAAAGG AAT G A
SEQ ID NO: 45: Secuencia de aminoácidos de Tni_A11-desaturasa MAVMAQTVQETATVLEEEARTVTLVAPKTTPRKYKYIYTNFLTFSYAHLAALYGLYLCF TSAKWETLLFSFVLFHMSNIGITAGAHRLWTHKTFKAKLPLEIVLMIFNSLAFQNTAITW AREHRLHHKYSDTDADPHNASRGFFYSHVGWLLVKKHPDVLKYGKTIDMSDVYNNP VLKFQKKYAVPLIGTVCFALPTLIPVYCWGESWNNAWHIALFRYIFNLNVTFLVNSAAHI WGNKPYDKSILPAQNLLVSFLASGEGFHNYHHVFPWDYRTAELGNNFLNLTTLFIDFC AWFGWAYDLKSVSEDIIKQRAKRTGDGSSGVIWGWDDKDMDRDIKSKANIFYAKKE
SEQ ID NO: 45: Secuencia de ADN de Sc_FAA; secuencia de codificación de ARNm atggccgctccagattatgcacttaccgatttaattgaatcggatcctcgtttcgaaagtttgaagacaagattagccggtta caccaaaggctctgatgaatatattgaagagctatactctcaattaccactgaccagctaccccaggtacaaaacattttta aagaaacaggcggttgccatttcgaatccggataatgaagctggttttagctcgatttataggagttctctttcttctgaaaatc
tagtgagctgtgtggataaaaacttaagaactgcatacgatcacttcatgttttctgcaaggagatggcctcaacgtgactgt ttaggttcaaggccaattgataaagccacaggcacctgggaggaaacattccgtttcgagtcgtactccacggtatctaa aagatgtcataatatcggaagtggtatattgtctttggtaaacacgaaaaggaaacgtcctttggaagccaatgattttgttgt tgctatcttatcacacaacaaccctgaatggatcctaacagatttggcctgtcaggcctattctctaactaacacggctttgta cgaaacattaggtccaaacacctccgagtacatattgaatttaaccgaggcccccattctgatttttgcaaaatcaaatatgt atcatgtattgaagatggtgcctgatatgaaatttgttaatactttggtttgtatggatgaattaactcatgacgagctccgtatg ctaaatgaatcgttgctacccgttaagtgcaactctctcaatgaaaaaatcacatttttttcattggagcaggtagaacaagtt ggttgctttaacaaaattcctgcaattccacctaccccagattccttgtatactatttcgtttacttctggtactacaggtttaccta aaggtgtggaaatgtctcacagaaacattgcgtctgggatagcatttgctttttctaccttcagaataccgccagataaaag aaaccaacagttatatgatatgtgttttttgccattggctcatatttttgaaagaatggttattgcgtatgatctagccatcgggttt ggaataggcttcttacataaaccagacccaactgtattggtagaggatttgaagattttgaaaccttacgcggttgccctggt tcctagaatattaacacggtttgaagccggtataaaaaatgctttggataaatcgactgtccagaggaacgtagcaaata ctatattggattctaaatcggccagatttaccgcaagaggtggtccagataaatcgattatgaattttctagtttatcatcgcgt attgattgataaaatcagagactctttaggtttgtccaataactcgtttataattaccggatcagctcccatatctaaagatacc ttactatttttaagaagcgccttggatattggtataagacagggctacggcttaactgaaacttttgctggtgtctgtttaagcg aaccgtttgaaaaagatgtcggatcttgtggtgccataggtatttctgcagaatgtagattgaagtctgttccagaaatgggtt accatgccgacaaggatttaaaaggtgaactgcaaattcgtggcccacaggtttttgaaagatattttaaaaatccgaatg aaacttcaaaagccgttgaccaagatggttggttttccacgggagatgttgcatttatcgatgcaaaaggtcgcatcagcgt cattgatcgagtcaagaactttttcaagctagcacatggtgaatatattgctccagagaaaatcgaaaatatttatttatcatc atgcccctatatcacgcaaatatttgtctttggagatcctttgaagacatttttagttggcatcgttggtgttgatgttgatgcagc gcaaccgattttagctgcaaagcacccagaggtgaaaacgtggactaaggaagtgctagtagaaaacttaaatcgtaa taaaaagctaaggaaggaatttttaaacaaaattaataaatgcatcgatgggctacaaggatttgaaaaattgcacaac atcaaagtcggacttgagcctttgactctcgaggatgatgttgtgacgccaacttttaaaataaagcgtgccaaagcatca aaattcttcaaagatacattagaccaactatacgccgaaggttcactagtcaagacagaaaagctttag
SEQ ID NO: 47: Secuencia de aminoácidos de Sc FAA2
MAAPDYALTDLIESDPRFESLKTRLAGYTKGSDEYIEELYSQLPLTSYPRYKTFLKKQA VAISNPDNEAGFSSIYRSSLSSENLVSCVDKNLRTAYDHFMFSARRWPQRDCLGSRPI DKATGTWEETFRFESYSTVSKRCHNIGSGILSLVNTKRKRPLEANDFVVAILSHNNPE WILTDLACQAYSLTNTALYETLGPNTSEYILNLTEAPILIFAKSNMYHVLKMVPDMKFVN TLVCMDELTHDELRMLNESLLPVKCNSLNEKITFFSLEQVEQVGCFNKIPAIPPTPDSL YTISFTSGTTGLPKGVEMSHRNIASGIAFAFSTFRIPPDKRNQQLYDMCFLPLAHIFER MVIAYDLAIGFGIGFLHKPDPTVLVEDLKILKPYAVALVPRILTRFEAGIKNALDKSTVQR NVANTILDSKSARFTARGGPDKSIMNFLVYHRVLIDKIRDSLGLSNNSFIITGSAPISKDT LLFLRSALDIGIRQGYGLTETFAGVCLSEPFEKDVGSCGAIGISAECRLKSVPEMGYHA DKDLKGELQIRGPQVFERYFKNPNETSKAVDQDGWFSTGDVAFIDAKGRISVIDRVKN FFKLAHGEYIAPEKIENIYLSSCPYITQIFVFGDPLKTFLVGIVGVDVDAAQPILAAKHPE VKTWTKEVLVENLNRNKKLRKEFLNKINKCIDGLQGFEKLHNIKVGLEPLTLEDDVVTP TFKIKRAKASKFFKDTLDQLYAEGSLVKTEKL
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Claims (14)
1. Un procedimiento de producción de (Z)-11-hexadecen-1-ol en una célula de levadura, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) proporcionar una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula además capaz de expresar:
- una A11-desaturasa seleccionada de entre el grupo que consiste en A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID nO: 43) y la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_A11; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y
- una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12), o una variante de las mismas con al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16) o Has_FAR (SEQ ID NO: 12);
ii) expresar dicha A11-desaturasa y dicha FAR de dicha célula de levadura; e
iii) incubar dicha célula de levadura en un medio,
por lo cual
- la A11-desaturasa es capaz de convertir al menos parte de dicha hexadecanoil-CoA en (Z)-11-hexadecenoil-CoA; y
- dicha FAR es capaz de convertir al menos parte de dicha (Z)-11-hexadecenoil-CoA en (Z)-11-hexadecenol,
obteniendo de este modo (Z)-11-hexadecen-1-ol con un título de al menos 0,2 mg/l, tal como al menos 0,25 mg/l, tal como al menos 0,3 mg/l, tal como al menos 0,4 mg/l, tal como al menos 0,5 mg/l, tal como al menos 0,75 mg/l, tal como al menos 1 mg/l, tal como al menos 1,5 mg/l, tal como al menos 2,5 mg/l, tal como al menos 5,0 mg/l, tal como al menos 10 mg/l, tal como al menos 15 mg/l, tal como al menos 20 mg/l, tal como 25 mg/l, tal como al menos 50 mg/l, tal como al menos 100 mg/l, tal como al menos 250 mg/l, tal como al menos 500 mg/l, tal como al menos 750 mg/l, tal como al menos 1 g/l, tal como al menos 2 g/l, tal como al menos 3 g/l, tal como al menos 4 g/l, tal como al menos 5 g/l, tal como al menos 6 g/l, tal como al menos 7 g/l, tal como al menos 8 g/l, tal como al menos 9 g/l, tal como al menos 10 g/l o más.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el género de dicha célula de levadura se selecciona de entre el grupo que consiste en Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la levadura es seleccionada de entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus albidus, Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la levadura es además capaz de expresar una acil sintetasa grasa (Fa A), tal como Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o Yl_FAA (SEQ ID NO: 37) o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología, tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con Sc_FAA1 (SEQ ID NO: 35) o Yl_FAA (SEQ ID NO: 37).
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa que consiste en convertir al menos parte de (Z)-11-hexadecen-1-ol en acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il por expresión de una acetiltransferasa o por conversión química.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la acetiltransferasa es una acetiltransferasa (AcT) heteróloga expresada a partir de dicha célula de levadura o una acetiltransferasa nativa sobreexpresada a partir de dicha célula de levadura, donde dicha acetiltransferasa es capaz de convertir al menos
parte de (Z)-11-hexadecen-1-ol en acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, produciendo de este modo además acetato de
(Z)-11-hexadecen-1-il.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la acetiltransferasa es
Sc_Atf1 (SEQ ID NO: 39) o una variante de las mismas con al menos 75 % de homología, tal como al menos 80 % de
homología, tal como al menos 85 % de homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al men homología, tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al men homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al men homología, tal como al menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de
homología con Sc_Atf1 (SEQ ID NO: 39).
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:
- la A11-desaturasa está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de
homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44, tal como al menos 85 % de
homología, tal como al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 % de homología, tal como al menos 92 %
de homología, tal como al menos 93 % de homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos
95 % de homología, tal como al menos 96 % de homología, tal como al menos 97 % de homología, tal como al
menos 98 % de homología, tal como al menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y/o
- FAR está codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología con
SEQ ID NO: 7, al menos 90 % de homología con SEQ ID NO: 11 o al menos 90 % de homología con SEQ ID NO:
15, tal como al menos 91 % de homología, tal como al menos 92 % de homología, tal como al menos 93 % de
homología, tal como al menos 94 % de homología, tal como al menos 95 % de homología, tal como al menos
96% de homología, tal como al menos 97% de homología, tal como al menos 98% de homología, tal como al
menos 99 % de homología, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15;
y/o
- FAA es codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos % de homología, tal como
al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos
73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal
como al menos 90% , tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 34, o al menos 65 %
de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos
72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal
como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con SEQ
ID NO: 36; y/o
- AcT es codificada por una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 65 % de homología, tal
como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al
menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %,
tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 38.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa
que consiste en convertir al menos parte de (Z)-11-hexadecen-1-ol en (Z)-11-hexadecenal por conversión química.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo dicho
procedimiento además la etapa que consiste en recuperar (Z)-11-hexadecenol, (Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il, tal como por extracción con un disolvente hidrófobo, tal como decano, hexano o un aceite vegetal,
comprendiendo dicho procedimiento opcionalmente además la etapa que consiste en formular (Z)-11-hexadecen-1-ol,
(Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il recuperados en una composición de feromonas.
11. Un procedimiento de supervisión de la presencia de plagas o alteración del apareamiento de plagas,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
i) producir (Z)-11-hexadecenol por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y opcionalmente
(Z)-11-hexadecenal por el procedimiento de la reivindicación 9 y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il por el
procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8,
ii) formular dicho (Z)-11-hexadecenol y opcionalmente (Z)-11-hexadecenal y/o acetato de (Z)-11-hexadecen-1-il
como una composición de feromonas, y
iii) emplear dicha composición de feromonas como una composición de manejo integrado de plagas.
12. Una célula de levadura que comprende:
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 %,
tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
40, SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 44; y
- una secuencia de ácido nucleico idéntica a o que tiene al menos 90 % de homología, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de homología con SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 15.
13. Una célula de levadura capaz de sintetizar hexadecanoil-CoA, siendo dicha célula de levadura además expresada en:
- una A11-desaturasa seleccionada de entre el grupo que consiste en A11-desaturasa de Amyelois transitella (Atr_A11; SEQ ID NO: 2), la A11-desaturasa de Spodoptera littoralis (Sl_A11; SEQ ID NO: 41), la A11-desaturasa de Agrotis segetum (As_A11; SEQ ID NO: 43) y la A11-desaturasa de Trichoplusia ni (Tni_Al1; SEQ ID NO: 45) o una variante de las mismas con al menos 65 % de homología, tal como al menos 70 % de homología, tal como al menos 71 % de homología, tal como al menos 72 %, tal como al menos 73 %, tal como al menos 74 %, tal como al menos 75 %, tal como al menos 80 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Atr_A11 (SEQ ID NO: 2), Sl_A11 (SEQ ID NO: 41), As_A11 (SEQ ID NO: 43) o Tni_A11 (SEQ ID NO: 45), y
- una acil-CoA reductasa grasa de formación de alcohol (FAR) seleccionada de entre el grupo que consiste en Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16), y Has_FAR (SEQ ID NO: 12), o una variante de las mismas con al menos 80 % de homología, tal como al menos 85 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 95 %, tal como 100 % de homología con Har_FAR (SEQ ID NO: 8), Hs_FAR (SEQ ID NO: 16) o Has_FAR (SEQ ID NO: 12),
opcionalmente además capaz de expresar una FAA y/o una acetiltransferasa.
14. Un kit de partes que comprende una célula de levadura según la reivindicación 13, e instrucciones de uso.
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