CN108138202A - 用于在酵母中产生蛾信息素的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及在酵母细胞中使用去饱和酶和脂酰辅酶A还原酶产生(Z)‑11‑十六碳烯‑1‑醇的方法。本申请也公开了在酵母细胞中产生(Z)‑11‑十六碳烯醛的方法。本申请也公开了在酵母细胞中产生乙酸(Z)‑11‑十六碳烯‑1‑基酯的方法。本申请还提供了用于实施本发明方法的核酸构建体和酵母细胞以及信息素组合物。
Description
技术领域
本申请公开了在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法。本申请也公开了在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯醛的方法。本申请也公开了在酵母细胞中产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的方法。本申请还提供了用于实施本发明方法的核酸构建体和酵母细胞以及信息素组合物。
背景技术
害虫综合治理(IPM)预期将在提高作物产量、减少对环境的影响和实现有机食品生产方面发挥重要作用。IPM采用替代性害虫防治方法，如使用信息素进行交配干扰，使用信息素进行大量诱捕，使用有益昆虫等。
信息素构成了一类多样的化学物质，昆虫(相似的其他生物体)使用该化学物质在不同情况下与同一物种的个体进行沟通交流，这包括交配吸引、报警、标迹和聚集。作为安全且环境友好的农药替代品，与远距离配偶发现相关的昆虫信息素已经在农业和林业应用中用于监测和防治害虫。
用于害虫防治的信息素可以分为四类：性信息素、聚集信息素、产卵驱避信息素和报警信息素。在2013年，性信息素是最大的产品段，其占据全球IPM信息素市场收入的64.8％。性信息素广泛用于害虫监测和害虫防治，所述害虫防治通过交配干扰(例如在苹果园和桃园中，在森林中)和大量诱捕(例如，在温室中保护番茄)进行。当少量信息素释放到空气中并阻止雄性找到雌性时，发生交配干扰，最终导致停止繁殖和昆虫侵袭的瓦解。聚集信息素用于吸引雄性和雌性害虫两者，因此用于大量诱捕。当使用有吸引力的诱饵捕捉昆虫时，大量诱捕有助于保持其种群密度低于经济危害阈值。
只有在20世纪80年代末开始工业规模合成信息素之后，昆虫信息素应用于害虫防治才成为可能。尽管如此，化学合成信息素的价格仍然较高，且成为扩大它们在农业和林业中应用的主要障碍。化学生产信息素的另一个缺点是需要有毒化学品用作前体、催化剂和溶剂，并且在纯化过程中产生大量的有机废物。
信息素目前是通过基于复杂的化学合成工艺来生产的，使得产品极其昂贵而不能在农业和林业的许多潜在应用中被广泛使用。
与化学生产方法相比，生物生产方法有若干优点。首先，所有的反应都是在发酵罐中在环境温度通过工程细胞进行的，替代了需要不同前体、催化剂和条件(通常是高温和高压)的多个化学反应步骤。而且，工程细胞使用诸如糖或植物油的廉价可再生材料，而不是使用多种昂贵的专用化学品作为前体。虽然化学反应经常受限于低特异性，因此需要中间体化合物的纯化和终产物的高度纯化，但是通过酶进行的生物反应通常是特异性非常高的且副产物的形成受限，从而减少了用于纯化的有机溶剂和其他有毒化学品的使用。而且，通常对于信息素活性重要的特定立体化学可能非常难以通过化学方法实现，而酶促方法可以利用对顺式或反式异构体之一具有特异性的酶。
因此，需要用于生产昆虫信息素的生物方法。与化学合成相比，除了成本较低的益处之外，发酵方法本身具有较低的危险性且较为环境友好。
发明内容
本发明如权利要求书所限定。
本申请中提供了在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-脐橙螟蛾(Amyelois transitella)Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾(Spodoptera littoralis)Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎(Agrotis segetum)Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ IDNO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-选自下组各项的形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、和Has_FAR(SEQ ID NO:12)或它们的变体，所述变体与Har_FAR(SEQID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、或Has_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少75％的同源性，例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；
ii)从所述酵母细胞表达所述Δ11-去饱和酶和所述FAR；和
iii)在培养基中培养所述酵母细胞，
由此
-所述Δ11-去饱和酶能够将至少部分所述十六碳酰辅酶A转化为(Z)11-十六碳烯酰辅酶A；并且
-所述FAR能够将至少部分所述(Z)11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醇，
从而获得滴度为至少0.2mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
在另一方面，本发明涉及在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯醛的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)、粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-形成醛的脂酰辅酶A还原酶(FAR’)；
ii)从所述酵母细胞表达所述Δ11-去饱和酶和所述FAR’；和
iii)在培养基中培养所述酵母细胞，
由此
-所述Δ11-去饱和酶将至少部分所述十六碳酰辅酶A转化为(Z)11-十六碳烯酰辅酶A；并且
-所述FAR’将至少部分所述(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醛，
从而获得(Z)-11-十六碳烯醛。
在又另一方面，本发明涉及可通过本申请公开的方法获得的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
在又另一方面，本发明涉及可通过本申请公开的方法获得的(Z)-11-十六碳烯醛。
在又另一方面，本发明涉及可通过本申请公开的方法获得的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
在又另一方面，本发明涉及包含可通过本申请公开的方法获得的(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的信息素组合物。
在又另一方面，本发明涉及如本申请定义的信息素组合物用于监测害虫的存在和/或干扰害虫交配的用途。
在又另一方面，本发明涉及监测害虫的存在或干扰害虫交配的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过本发明方法产生(Z)-11-十六碳烯醇和任选的(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，
ii)将由此获得的所述(Z)-11-十六碳烯醇和任选的(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯配制成信息素组合物，和
iii)采用所述信息素组合物作为害虫综合治理组合物。
在又另一方面，本发明涉及包含以下一者或多者的核酸构建体：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
在又另一方面，本发明涉及包含以下一者或多者的酵母细胞：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
在又另一方面，本发明涉及能能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)、粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-选自下组各项的形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、和Has_FAR(SEQ ID NO:12)或它们的变体，所述变体与Har_FAR(SEQID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、或Has_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少75％的同源性，例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
在又另一方面，本发明涉及能能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)、粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-脂酰辅酶A还原酶(FAR)。
在又另一方面，本发明涉及成套试剂盒，其包括本申请公开的酵母细胞和/或核酸构建体以及使用说明书。
附图说明
图1.异源(Z)-11-十六碳烯-1-醇途径。FAA：脂酰辅酶A合成酶，Δ11FAD：Δ11-脂酰辅酶A去饱和酶，FAR：形成醇的脂酰辅酶A还原酶；FAR’：形成醛的脂酰辅酶A还原酶，AcT：乙酰基转移酶；1：棕榈酸，2：十六碳酰辅酶A，3：(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A，4：(Z)-11-十六碳烯-1-醇，5：乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基-酯，6：(Z)-11-十六碳烯醛。
图2.在补料分批发酵过程中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇。X轴显示以mg/L为单位的(Z)-11-十六碳烯-1-醇滴度，Y轴显示以小时为单位的发酵时间。(A)通过整合单个基因拷贝获得的滴度(菌株ST3705)。(B)通过整合多个基因拷贝获得的滴度(菌株ST5262)。
图3.质粒pCfB3465的载体图谱。该载体编码Atrd11、Hs_FAR和URA3基因的表达盒。该表达由耶氏解脂酵母(Y.lipolytica)内源启动子(Pr)驱动。表达盒的两侧是500bp的基因组DNA序列(IntB_up和IntB_down)，由此允许位点特异性整合到耶氏解脂酵母基因组中。
定义
生物农药：“生物农药”一词是“生物学农药”的缩写，是指借助于捕食关系、寄生关系或化学关系的几种害虫治理性干预类型。在欧盟，生物农药已经定义为“基于微生物或天然产物的农药形式”。在美国，EPA将其定义为“包括防治害虫的天然存在的物质(生物化学农药)、防治害虫的微生物(微生物农药)、以及由含有添加的遗传物质的植物(植物嵌入式保护剂)或PIP产生的杀虫物质”。本申请更特别地涉及包含天然产物或天然存在的物质的生物农药。它们通常是通过培养和浓缩天然存在的生物体和/或其代谢物而产生的，包括细菌和其他微生物、真菌、线虫、蛋白质等。通常认为它们是害虫综合治理(IPM)计划的重要组成部分，它们作为合成化学植物保护产品(PPP)的替代品已经受到很多实践上的关注。《生物防治剂手册》(Manual of Biocontrol Agents)(2009：以前的《生物农药手册》(Biopesticide Manual))对可用的生物农药(以及其他基于生物学的防治)产品进行了综述。
害虫：如本申请中使用的，术语“害虫”应指生物体，特别是动物，特别是在农业或家畜生产的背景下有害于人类或人类关注物的那些。害虫是指对动物或植物、人类或人类关注物、家畜、人类建筑、野生生态系统等的蔓延性的或多产性的、有害的、麻烦的、有毒的、破坏性的、造成滋扰的任何活的生物体。该术语常常与相关术语害兽(vermin)、杂草、植物寄生虫和动物寄生虫以及病原体有交集。某种生物体在一种环境中可能是害虫，而在另一种环境中却是有益的、驯化的或可接受的。
具体实施方式
本申请涉及在酵母细胞中产生蛾信息素、特别是(Z)-11-十六碳烯-1-醇、(Z)-11-十六碳烯醛、和乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的方法，以上物质是下列生物中的昆虫性信息素的组分：大菜螟(Crocidolomia binotalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、玉米螟(粉茎螟(Sesamia nonagrioides))、洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactyla)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、二化螟(Chilosuppressalis)和其他蛾类。本发明人使用本申请所述的方法已经能够获得出乎意料的高滴度的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
(Z)-11-十六碳烯-1-醇的产生
本申请公开了从酵母细胞产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法。本发明人设计了作为例子在图1中加以概述的异源途径。十六碳酰辅酶A是脂肪酸代谢中的天然脂肪酸中间体。十六碳酰辅酶A通过Δ11-脂酰去饱和酶(Δ11FAD)转化为(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A，进而通过形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)转化为(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
在第一方面，本申请因此涉及在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)、粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-选自下组各项的形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、和Has_FAR(SEQ ID NO:12)或它们的变体，所述变体与Har_FAR(SEQID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、或Has_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少75％的同源性，例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；
ii)从所述酵母细胞表达所述Δ11-去饱和酶和所述FAR；和
iii)在培养基中培养所述酵母细胞，
由此
-所述Δ11-去饱和酶能够将至少部分所述十六碳酰辅酶A转化为(Z)11-十六碳烯酰辅酶A；并且
-所述FAR能够将至少部分所述(Z)11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醇，
从而获得滴度为至少0.2mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
因此，本申请提供了在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-选自下组各项的Δ11-去饱和酶：脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ IDNO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)和粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-选自下组各项的形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、和Has_FAR(SEQ ID NO:12)或它们的变体，所述变体与Har_FAR(SEQID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、或Has_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少75％的同源性，例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；
ii)从所述酵母细胞表达所述Δ11-去饱和酶和所述FAR；和
iii)在培养基中培养所述酵母细胞，
由此
-所述Δ11-去饱和酶能够将至少部分所述十六碳酰辅酶A转化为(Z)11-十六碳烯酰辅酶A；并且
-所述FAR能够将至少部分所述(Z)11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醇，
从而获得滴度为至少0.2mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
酵母细胞
在本发明方法的第一步骤中，提供了能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞。
任何能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞都可以用于产生本申请所述的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
在一些实施方案中，所述酵母的属选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。在一些实施方案中，所述酵母的属是酵母属或耶氏酵母属。
酵母细胞可以选自下组各项：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、产油油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。在优选的实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞或耶氏解脂酵母细胞。
脂酰辅酶A合成酶(FAA)(EC 2.3.1.86)
术语‘脂酰辅酶A合成酶’、‘脂酰辅酶A合酶’和‘FAA’在本申请中可互换使用。
十六碳酰辅酶A是脂肪酸生物合成的关键中间体，其也可以作为脂质降解的中间体而合成。通过过表达参与脂质生物合成的的基因诸如I型或II型脂肪酸合酶、和/或通过过表达乙酰辅酶A羧化酶、或通过改善乙酰辅酶A前体的供应，可以增强十六碳酰辅酶A的生物合成。还可以经由来自十六烷酸(棕榈酸)的脂酰辅酶A合成酶形成十六烷酰辅酶A，所述十六烷酸可以在培养基中提供或在细胞内通过硫酯酶合成。在能够代谢脂肪酸的生物体中通常存在FAA活性。它可以由几种冗余酶(redundant enzyme)编码。因此在一些实施方案中，酵母细胞还能够表达FAA。在酵母细胞中编码所述FAA活性的核酸可以天然存在于所述酵母细胞的基因组中，或者可以通过基因工程或基因组编辑引入。因此，在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入异源核酸来编码FAA活性。编码所述FAA的异源核酸可以是经密码子优化的，或者可以包含可有助于改善FAA活性的特征。例如，可以修饰所述异源核酸，从而编码修饰的FAA。这样的修饰包括但不限于：引入定位信号、功能获得或功能失去突变、蛋白与标记或标签(如荧光标签)的融合、插入诱导型启动子、引入赋予增加的稳定性和/或半衰期的修饰。
引入编码FAA活性的异源核酸可以通过本领域已知的方法进行。本领域技术人员将认识到，这样的方法包括但不限于：基于克隆的方法和基于同源重组的方法。克隆方法可能涉及设计和构建用于生物体如大肠杆菌(Escherichia coli)中的质粒。质粒可以是整合载体或非整合载体。无需克隆的方法包括基于同源重组的方法，例如适配子介导的PCR或缺口修复。这样的方法通常导致异源核酸整合到酵母细胞的基因组中。
在一个实施方案中，FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或它们的变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或Yl_FAA(SEQ ID NO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。因而在一个实施方案中，所述酵母细胞是酿酒酵母细胞，并且所述FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或其变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。在另一个实施方案中，所述酵母细胞是耶氏解脂酵母细胞，并且所述FAA是Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或其变体，所述变体与Yl_FAA(SEQ ID NO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。在另一个实施方案中，所述酵母细胞是酿酒酵母细胞，并且所述FAA是Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或其变体，所述变体与Yl_FAA(SEQ IDNO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。在又另一个实施方案中，所述酵母细胞是耶氏解脂酵母细胞，并且所述FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或其变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述FAA是Sc_FAA2(SEQ ID NO:47)。
Δ11-脂酰去饱和酶(Δ11 FAD)(EC 1.14.19.5)
在本申请中，术语‘Δ11-脂酰辅酶A去饱和酶’、‘Δ11-去饱和酶’、‘Δ11-脂酰去饱和酶’和‘Δ11FAD’可互换使用，并且均指的是具有EC编号1.14.19.5的EC酶。
在本发明方法中，所述酵母细胞还能够表达Δ11脂酰去饱和酶(Δ11FAD)，所述酶能够催化至少部分十六碳酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A(图1)。本发明人已经发现，来自脐橙螟蛾的Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体非常适合于催化这个步骤。在一些实施方案中，所述Δ11FAD与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
另一种适合的Δ11-去饱和酶是棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体。在一些实施方案中，所述Δ11FAD与Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在其他实施方案中，所述Δ11-去饱和酶是黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQID NO:43)或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体。在一些实施方案中，所述Δ11FAD与As_Δ11(SEQ ID NO:43)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在其他实施方案中，所述Δ11-去饱和酶是粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体。在一些实施方案中，所述Δ11FAD与Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述Δ11FAD可以催化在先前的生物合成步骤中产生的所有十六碳酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A。
形成醇的脂酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.84)
术语‘形成醇的脂酰辅酶A还原酶’、‘脂酰辅酶A还原酶’和‘FAR’在本申请中可互换使用。
(Z)-11-十六碳烯-1-醇的生物合成途径中的下一个步骤是通过形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)将至少部分(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯-1-醇。能够催化此转化的FAR可以催化两个连续的还原反应；首先，将脂酰辅酶A还原成脂肪醛；其次，将脂肪醛进一步还原成脂肪醇。
能够催化这种反应的FAR是具有EC编号1.2.1.84的形成醇的脂酰辅酶A还原酶。
在一些实施方案中，所述FAR选自下组各项：Har_FAR(SEQ ID NO:8，来自棉铃虫的FAR)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16，来自亚曲夜蛾(Heliothis subflexa)的FAR)、和Has_FAR(SEQID NO:12，来自烟青虫(Helicoverpa assulta)的FAR)，或其具有至少75％的同源性的变体。
在一个实施方案中，所述FAR是Har_FAR(SEQ ID NO:8，来自棉铃虫的FAR)或其与Har_FAR具有至少75％的同源性的变体，例如与Har_FAR(SEQ ID NO:8)具有至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在另一个实施方案中，所述FAR是Hs_FAR(SEQ ID NO:16，来自亚曲夜蛾的FAR)或其与Hs_FAR具有至少75％的同源性的变体，例如与Hs_FAR(SEQ ID NO:16)具有至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在又另一个实施方案中，所述FAR是Has_FAR(SEQ ID NO:12，来自烟青虫的FAR)或其与Has_FAR具有至少75％的同源性的变体，例如与Has_FAR具有至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述FAR能够催化在先前的生物合成步骤中产生的所有(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醇。
本申请提供的酵母细胞优选地能够合成十六碳酰辅酶A，并且还能够表达如上所述的Δ11-去饱和酶和FAR。
在一些实施方案中，正如本领域已知的，例如如果编码这些酶的基因由诱导型启动子控制，则可以诱导Δ11-去饱和酶和/或FAR的表达。将酵母细胞在适合的条件下培养，例如在本领域技术人员已知的适当培养基中和适当温度。适合的支持酵母生长的培养基是本领域已知的，并且包括但不限于：未限定的完全培养基如YEPD(或YPD，酵母浸膏蛋白胨葡萄糖)；限定的完全培养基，如SC(合成完全培养基)；限定的营养缺陷型培养基(drop-outmedium)，如缺乏一种或多种元素如氨基酸或诱导剂的SD(合成葡萄糖培养基)；或由盐、维生素和碳源组成的矿物质培养基等。
滴度
本申请公开的方法产生滴度为至少0.2mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。在一些实施方案中，通过本发明方法产生的(Z)-11-十六碳烯-1-醇的滴度为至少0.25mg/L，例如至少0.3mg/L、例如至少0.4mg/L、例如至少0.5mg/L、例如至少0.75mg/L、例如至少1mg/L、例如至少1.5mg/L、例如至少2.5mg/L、例如至少5.0mg/L、例如至少10mg/L、例如至少15mg/L、例如至少20mg/L、例如25mg/L、例如至少50mg/L、例如至少100mg/L、例如至少250mg/L、例如至少500mg/L、例如至少750mg/L、例如至少1g/L、例如至少2g/L、例如至少3g/L、例如至少4g/L、例如至少5g/L、例如至少6g/L、例如至少7g/L、例如至少8g/L、例如至少9g/L、例如至少10g/L或更高。
确定滴度的方法是本领域已知的。
在一个实施方案中，11-去饱和酶是SEQ ID NO:2阐述的Atr_Δ11或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体，并且FAR是SEQ ID NO:8阐述的Har_FAR或其与Har_FAR具有至少75％的同源性的变体。在具体实施方案中，Har_FAR的变体如SEQ ID NO:10所阐述。
在一个实施方案中，11-去饱和酶是SEQ ID NO:2阐述的Atr_Δ11或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体，并且FAR是SEQ ID NO:16阐述的Hs_FAR或其与Hs_FAR具有至少75％的同源性的变体。在具体实施方案中，Hs_FAR的变体如SEQ ID NO:16所阐述。
在一个实施方案中，11-去饱和酶是SEQ ID NO:2阐述的Atr_Δ11或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体，并且FAR是SEQ ID NO:12阐述的Has_FAR或其与Has_FAR具有至少75％的同源性的变体。在具体实施方案中，Has_FAR的变体如SEQ ID NO:12所阐述。
在另一个实施方案中，11-去饱和酶是SEQ ID NO:43阐述的As_Δ11或其与As_Δ11具有至少70％的同源性的变体，并且FAR是SEQ ID NO:8阐述的Har_FAR或其与Har_FAR具有至少75％的同源性的变体。在具体实施方案中，Har_FAR的变体如SEQ ID NO:10所阐述。
在另一个实施方案中，11-去饱和酶是SEQ ID NO:41阐述的Sl_Δ11或其与Sl_Δ11具有至少70％的同源性的变体，并且FAR是SEQ ID NO:8阐述的Har_FAR或其与Har_FAR具有至少75％的同源性的变体。在具体实施方案中，Har_FAR的变体如SEQ ID NO:10所阐述。
在另一个实施方案中，11-去饱和酶是SEQ ID NO:45阐述的Tni_Δ11或其与Tni_Δ11具有至少70％的同源性的变体，并且FAR是SEQ ID NO:45阐述的Har_FAR或其与Har_FAR具有至少75％的同源性的变体。在具体实施方案中，Har_FAR的变体如SEQ ID NO:10所阐述。
乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的产生
虽然本申请提供了产生(Z)-11-十六碳烯醇的方法，但是也可能有用的是进一步将所述(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为相应的乙酸酯，即，乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。因而在一些实施方案中，本发明方法进一步包括将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的步骤。
在一些实施方案中，这通过进一步从所述酵母细胞表达乙酰基转移酶(AcT，EC2.3.1.84)或过表达内源乙酰基转移酶来完成，其中所述乙酰基转移酶能够将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，由此进一步产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
在本申请中，术语“乙酰基转移酶”、“醇O-乙酰基转移酶”和“AcT”可互换使用。
在其他实施方案中，至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇到乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的转化是以化学方法完成的。本领域技术人员知晓如何将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。例如，可以将乙酰氯添加到(Z)-11-十六碳烯-1-醇中并在混合后在室温培养。
在一些实施方案中，所述乙酰基转移酶是SEQ ID NO:39的AcT(Atf1，酿酒酵母AcT)或其与Sc_Atf1具有至少75％的同源性的变体，例如与SEQ ID NO:39具有至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，产生具有至少0.2mg/L滴度的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。在一些实施方案中，通过本发明方法产生的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的滴度为至少0.25mg/L，例如至少0.3mg/L、例如至少0.4mg/L、例如至少0.5mg/L、例如至少0.75mg/L、例如至少1mg/L、例如至少1.5mg/L、例如至少2.5mg/L、例如至少5.0mg/L、例如至少10mg/L、例如至少15mg/L、例如至少20mg/L、例如25mg/L、例如至少50mg/L、例如至少100mg/L、例如至少250mg/L、例如至少500mg/L、例如至少750mg/L、例如至少1g/L、例如至少2g/L、例如至少3g/L、例如至少4g/L、例如至少5g/L、例如至少6g/L、例如至少7g/L、例如至少8g/L、例如至少9g/L、例如至少10g/L或更高。
确定滴度的方法是本领域已知的。
编码Δ11-去饱和酶、FAR、FAA、AcT的核酸构建体
应该理解，在整个本申请中，术语“编码活性的核酸”应指能够编码具有所述活性的肽、蛋白质或其片段的核酸分子。这样的核酸分子可以是可读框或基因或其片段。核酸构建体也可以是一组核酸分子，它们一起可以编码具有所需活性的几种肽、蛋白质或其片段。术语“所需活性”应指以下活性之一：Δ11-去饱和酶活性、FAR活性、FAA活性和/或AcT活性。一种或多种所需活性的性质将取决于希望用本发明方法获得的期望产物的性质。
在本发明方法的一些实施方案中，编码每种本发明活性(即Δ11-去饱和酶、FAR、FAA和/或AcT)的每种核酸可包含在酵母细胞的基因组内或包含在酵母细胞中所含的载体内。
在一些实施方案中，编码每种本发明活性的每种核酸可以整合到所述酵母细胞的基因组中，这是因为所述核酸编码天然蛋白质，或者因为它已经通过基因组工程或基因组编辑或通过杂交不同配合类型的酵母细胞而整合到其中。用于整合核酸的方法是本领域熟知的。因此，在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入异源核酸来编码所需活性。编码所述活性的异源核酸可以是经密码子优化的，或者可以包含可有助于改善所述活性的特征。例如，可以修饰所述异源核酸，从而编码修饰的FAA。这样的修饰包括但不限于：引入定位信号、功能获得或功能失去突变、蛋白与标记或标签(如荧光标签)的融合、插入诱导型启动子、引入赋予增加的稳定性和/或半衰期的修饰。
编码所需活性的异源核酸的引入可以通过本领域已知的方法进行。本领域技术人员将认识到，这样的方法包括但不限于：基于克隆的方法和基于同源重组的方法。克隆方法可能涉及设计和构建用于生物如大肠杆菌中的质粒。质粒可以是整合载体或非整合载体。无需克隆的方法包括基于同源重组的方法，例如适配子介导的PCR或缺口修复。这样的方法通常导致异源核酸整合到酵母细胞的基因组中。
编码所需活性的核酸可以以高拷贝数存在。
在一些实施方案中，Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:1具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:1具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:40具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:40具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:40具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:42具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:42具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:42具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:44具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:44具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，FAR活性由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性的核酸序列。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:7具有至少97％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性的核酸序列。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:11具有至少96％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性的核酸序列。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:15具有至少97％的同源性。
在一些实施方案中，FAA活性由与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ IDNO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:34具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:34或36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:36具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，FAA活性由与SEQ ID NO:46相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:46具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，AcT活性由与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:38具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:38具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:38具有至少90％的同源性。
本申请接下来公开了如上所述的在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，其中：
-Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAR由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAA由内源核酸序列编码。
本申请还公开了如上所述的在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，其中：
-Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAR由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAA由与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列编码。
本申请还公开了产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯和/或(Z)-11-十六碳烯醇的方法，其中：
-Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码；和/或
-FAR由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码；和/或
-FAA由与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列编码；和/或
-AcT由与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码。
本申请还公开了产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯和/或(Z)-11-十六碳烯醇的方法，其中：
-Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAR由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAA由与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列编码；并且
-AcT由与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码。
(Z)-11-十六碳烯醛的产生
虽然本申请提供了产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的方法，但是可能有用的是进一步将所述(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为相应的醛，即，(Z)-11-十六碳烯醛。因而在一些实施方案中，所述方法可进一步包括将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为(Z)-11-十六碳烯醛的步骤，由此进一步产生(Z)-11-十六碳烯醛。
在一些实施方案中，将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为(Z)-11-十六碳烯醛的步骤是化学转化步骤。所述化学转化基于是将(Z)-11-十六碳烯-1-醇氧化为(Z)-11-十六碳烯醛。进行此转化的方法是本领域已知的。优选的方法是环境友好的，并将危险废物的量减到最少。
因此，在一些实施方案中，化学转化可以不用金属，从而避免有毒的基于重金属的试剂如氧化锰、氧化铬(Jones ox.PDC,PCC)或钌化合物(TPAP,Ley-Griffith ox.)。在一些实施方案中，转化不涉及有关活化二甲基亚砜的反应，例如Swern氧化或Pfitzner-Moffat类型。这样的反应可能涉及不可避免地形成难以从目标产物中除去的痕量强烈气味的有机硫化合物如二甲基硫醚。
在一些实施方案中，该方法包括戴斯-马丁反应(Yadav等人，2004，Meyer等人，1994)。
在其他实施方案中，化学转化包括在水性/有机两相条件下用次氯酸钠进行氧化(Okada等人，2014；Tamura等人，2012；Li等人，2009)。
在一些实施方案中，化学氧化可以在含有25％吡啶的二氯甲烷的介质中用1-氯苯并三唑进行(Ferrell和Yao，1972)。
或者，可以通过醇脱氢酶以酶促方法进行(Z)-11-十六碳烯-1-醇到(Z)-11-十六碳烯醛的氧化。本领域技术人员将知道如何进行酶促氧化。例如，可以通过使纯化的酶、细胞提取物或全细胞与(Z)-11-十六碳烯醇接触来进行酶促氧化。
回收
可能期望回收通过本申请公开的方法获得的产物。因而本发明方法可以包括回收(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基-酯的另外的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括回收(Z)-11-十六碳烯醇的步骤。在其他实施方案中，所述方法包括回收乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的步骤。
用于回收通过本发明获得的产物的方法是本领域已知的，并且可以包括用疏水性溶剂例如癸烷、己烷或植物油进行萃取。
(Z)-11-十六碳烯醛的产生
在另一方面，本申请涉及在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯醛的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQ ID NO:43)、粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-形成醛的脂酰辅酶A还原酶(FAR’)；
ii)从所述酵母细胞表达所述Δ11-去饱和酶和所述FAR’；和
iii)在培养基中培养所述酵母细胞，
由此
-所述Δ11-去饱和酶将至少部分所述十六碳酰辅酶A转化为(Z)11-十六碳烯酰辅酶A；并且
-所述FAR’将至少部分所述(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醛，
从而获得(Z)-11-十六碳烯醛。
酵母细胞
本申请还涉及产生(Z)-11-十六碳烯醛的方法。在第一步骤中，提供了能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞。
任何能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞都可以用于产生本申请所述的(Z)-11-十六碳烯醛。
在一些实施方案中，所述酵母的属选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。在一些实施方案中，所述酵母的属是酵母属或耶氏酵母属。
酵母细胞可以选自下组各项：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、产油油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。在优选的实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞或耶氏解脂酵母细胞。
脂酰辅酶A合成酶(FAA)
十六碳酰辅酶A是脂肪酸代谢的天然中间体，其可进一步通过FAA由棕榈酸(外部添加或通过硫酯酶在细胞内合成)转化为十六碳酰辅酶A而生成。在能够代谢脂肪酸的生物中通常存在FAA活性。它可以由几种冗余酶编码。因此在一些实施方案中，酵母细胞还能够表达FAA。在酵母细胞中编码所述FAA活性的核酸可以天然存在于所述酵母细胞的基因组中，或者可以通过基因工程或基因组编辑引入。因此，在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入异源核酸来编码FAA活性。编码所述FAA的异源核酸可以是经密码子优化的，或者可以包含可有助于改善FAA活性的特征。例如，可以修饰所述异源核酸，从而编码修饰的FAA。这样的修饰包括但不限于：引入定位信号、功能获得或功能失去突变、蛋白与标记或标签(如荧光标签)的融合、插入诱导型启动子、引入赋予增加的稳定性和/或半衰期的修饰。
编码FAA活性的异源核酸的引入可以通过本领域已知的方法进行。本领域技术人员将认识到，这样的方法包括但不限于：基于克隆的方法和基于同源重组的方法。克隆方法可能涉及设计和构建用于生物如大肠杆菌中的质粒。质粒可以是整合载体或非整合载体。无需克隆的方法包括基于同源重组的方法，例如适配子介导的PCR或缺口修复。这样的方法通常导致异源核酸整合到酵母细胞的基因组中。
在一个实施方案中，FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或它们的变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或Yl_FAA(SEQ ID NO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。因而在一个实施方案中，所述酵母细胞是酿酒酵母细胞，并且所述FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或其变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。在另一个实施方案中，所述酵母细胞是耶氏解脂酵母细胞，并且所述FAA是Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或其变体，所述变体与Yl_FAA(SEQ ID NO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。在另一个实施方案中，所述酵母细胞是酿酒酵母细胞，并且所述FAA是Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或其变体，所述变体与Yl_FAA(SEQ IDNO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。在又另一个实施方案中，所述酵母细胞是耶氏解脂酵母细胞，并且所述FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或其变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述FAA是Sc_FAA2(SEQ ID NO:47)。
Δ11-脂酰去饱和酶(EC 1.14.19.5)
所述酵母细胞还能够表达Δ11脂酰去饱和酶(Δ11FAD)，所述酶能够催化至少部分十六碳酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A。本发明人已经发现，来自脐橙螟蛾的Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)或其与Atr_Δ11具有至少70％的同源性的变体非常适合于催化这个步骤。在一些实施方案中，所述Δ11FAD与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述Δ11FAD与Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述Δ11FAD与As_Δ11(SEQ ID NO:43)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述Δ11FAD与Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述Δ11FAD能够催化在先前的生物合成步骤中产生的所有十六碳酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A。
形成醛的脂酰辅酶A还原酶EC 1.2.1.50(FAR’)
通过形成醛的脂酰辅酶A还原酶(FAR’)可以将至少部分(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11十六碳烯醛，而非产生十六碳烯-1-醇。能够催化这种转化的酶可以催化一种还原反应，在这种还原反应中将脂酰辅酶A还原为脂肪醛。这样的酶是形成醛的脂酰辅酶A还原酶，在本申请中也称为FAR'或形成醛的FAR，其EC编号为1.2.1.50。它们催化下列反应：
长链酰基辅酶A+NADPH＝长链醛+NADP++辅酶A，其中术语“长链”表示具有16-22个碳原子的链。
因而提供的酵母细胞能够合成十六碳酰辅酶A，并且还能够表达Δ11-去饱和酶和形成醛的FAR，所述形成醛的FAR催化如上所述的一步还原。在一些实施方案中，正如本领域已知的，例如如果编码这些酶的基因由诱导型启动子控制，则可以诱导Δ11-去饱和酶和/或形成醛的FAR的表达。将酵母细胞在适合的条件下培养，例如在本领域技术人员已知的适当培养基中和在适当温度。适合的支持酵母生长的培养基是本领域已知的，并且包括但不限于：未限定的完全培养基如YEPD(或YPD，酵母浸膏蛋白胨葡萄糖)；限定的完全培养基，如SC(合成完全培养基)；或限定的营养缺陷型培养基(drop-out medium)，如缺乏一种或多种元素如氨基酸或诱导剂的SD(合成葡萄糖培养基。
滴度
本申请公开的方法产生滴度为至少0.1mg/L的(Z)-11-十六碳烯醛。在一些实施方案中，通过本发明方法产生的(Z)-11-十六碳烯醛的滴度为至少0.2mg/L，例如至少0.25mg/L、例如至少0.3mg/L、例如至少0.4mg/L、例如至少0.5mg/L、例如至少0.75mg/L、例如至少1mg/L、例如至少1.5mg/L、例如至少2.5mg/L、例如至少5.0mg/L、例如至少10mg/L、例如至少15mg/L、例如至少20mg/L、例如25mg/L、例如至少50mg/L、例如至少100mg/L、例如至少250mg/L、例如至少500mg/L、例如至少750mg/L、例如至少1g/L、例如至少2g/L、例如至少3g/L、例如至少4g/L、例如至少5g/L、例如至少6g/L、例如至少7g/L、例如至少8g/L、例如至少9g/L、例如至少10g/L或更高。
确定滴度的方法是本领域已知的。
编码Δ11-去饱和酶、FAR’、FAA、AcT的核酸
在本发明用于产生(Z)-11-十六碳烯醛的方法的一些实施方案中，编码每种本发明活性(即Δ11-去饱和酶、FAA或形成醛的FAR)的每种核酸可以包含在酵母细胞的基因组内或包含在酵母细胞中所含的载体内。
在一些实施方案中，编码每种本发明活性的每种核酸可以整合到所述酵母细胞的基因组中，这是因为所述核酸编码天然蛋白质，或者因为它已经通过基因组工程或基因组编辑或通过杂交不同配合类型的酵母细胞而整合到其中。用于整合核酸的方法是本领域熟知的。因此，在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入异源核酸来编码所需活性。编码所述活性的异源核酸可以是经密码子优化的，或者可以包含可有助于改善所述活性的特征。例如，可以修饰所述异源核酸，从而编码修饰的FAA。这样的修饰包括但不限于：引入定位信号、功能获得或功能失去突变、蛋白与标记或标签(如荧光标签)的融合、插入诱导型启动子、引入赋予增加的稳定性和/或半衰期的修饰。
编码所需活性的异源核酸的引入可以通过本领域已知的方法进行。本领域技术人员将认识到，这样的方法包括但不限于：基于克隆的方法和基于同源重组的方法。克隆方法可能涉及设计和构建用于生物如大肠杆菌中的质粒。质粒可以是整合载体或非整合载体。无需克隆的方法包括基于同源重组的方法，例如适配子介导的PCR或缺口修复。这样的方法通常导致异源核酸整合到酵母细胞的基因组中。
编码所需活性的核酸可以以高拷贝数存在。
在一些实施方案中，所述Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:1相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:1具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。优选地，Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:1相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码。
在其他实施方案中，所述Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:40相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:40具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。优选地，Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:40相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码。
在其他实施方案中，所述Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:42相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:42具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。优选地，Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:42相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码。
在其他实施方案中，所述Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。优选地，Δ11-去饱和酶活性由与SEQ ID NO:44相同或具有至少90％的同源性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，FAA活性由与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ IDNO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，FAA活性由与SEQ ID NO:46相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:46具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
本申请接下来公开了如上所述的在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯醛的方法，其中：
-Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAR'选自能够催化脂酰辅酶A一步还原为脂肪醛的FAR；并且
-FAA由内源核酸序列编码。
本申请还公开了如上所述的在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，其中：
-Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码；并且
-FAR'选自能够催化脂酰辅酶A还原为脂肪醛并且进一步将脂肪醛还原为脂肪醇的FAR；
-FAA由与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，FAR’是具有EC编号1.2.1.50的酶。
回收
可能期望回收通过本申请公开的方法获得的产物。因而本发明方法可以包括回收(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基-酯的另外的步骤。
用于回收通过本发明获得的产物的方法是本领域已知的，并且可以包括用疏水性溶剂例如癸烷、己烷或植物油进行萃取。
核酸构建体
本申请还涉及包含以下一者或多者的核酸构建体：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:1具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:1具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:40具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:40具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:40具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:42具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:42具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:42具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:44具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:44具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列与SEQ IDNO:7具有至少97％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列与SEQ IDNO:11具有至少96％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列与SEQ IDNO:15具有至少97％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:34具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:36具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:36具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:36具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:38具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:38具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:38具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:34相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:34相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:34相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:44具有至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体进一步包含与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:38具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
一个或多个核酸序列中的至少一个可以受诱导型启动子的控制。
在一些实施方案中，核酸构建体是载体，例如整合载体或复制型载体。在一个实施方案中，载体是高拷贝复制型载体。
包含在本发明的核酸构建体内的每个核酸序列可以存在于多个拷贝中。在一些实施方案中，所述核酸序列中的至少一个存在于至少2个拷贝中，例如存在于至少3个拷贝、例如至少4个拷贝、例如至少5个拷贝、例如至少10个拷贝、例如至少20个拷贝、例如至少30个拷贝、例如至少40个拷贝、例如至少50个拷贝、例如至少60个拷贝、例如至少70个拷贝、例如至少80个拷贝、例如至少90个拷贝、例如至少100个拷贝、例如至少125个拷贝、例如至少150个拷贝、例如至少175个拷贝、例如至少200个拷贝中。在一些实施方案中，所有核酸序列都存在于至少2个拷贝中，例如存在于至少3个拷贝、例如至少4个拷贝、例如至少5个拷贝、例如至少10个拷贝、例如至少20个拷贝、例如至少30个拷贝、例如至少40个拷贝、例如至少50个拷贝、例如至少60个拷贝、例如至少70个拷贝、例如至少80个拷贝、例如至少90个拷贝、例如至少100个拷贝、例如至少125个拷贝、例如至少150个拷贝、例如至少175个拷贝、例如至少200个拷贝中。
核酸构建体也可以是PCR产物或合成的DNA分子。
酵母细胞
本申请还提供了可用于本申请公开的任何方法的酵母细胞。所述酵母细胞包含以下一者或多者：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和/或
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列；和/或
与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述酵母细胞包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述酵母细胞包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述酵母细胞包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
如上详细说明，所述一个或多个核酸序列可以包含在所述酵母细胞的基因组内或包含在所述酵母细胞中所含的核酸构建体内。在一些实施方案中，所述酵母细胞包含至少一种如上所述的核酸构建体。
优选地，所述酵母细胞能够合成十六碳酰辅酶A并且可用于产生如本申请所述的(Z)-11-十六碳烯-1-醇和/或(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
在一些实施方案中，所述酵母的属选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。在一些实施方案中，所述酵母的属是酵母属或耶氏酵母属。
酵母细胞可以选自下组各项：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、产油油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。在优选的实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞或耶氏解脂酵母细胞。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:1具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:1具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:40具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:40具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:40具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:42具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:42具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:42具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:44具有至少81％的同源性，例如与SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:44具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列与SEQ IDNO:7具有至少97％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列与SEQ IDNO:11具有至少96％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列是与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列与SEQ IDNO:15具有至少97％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:34具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:36具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:36具有至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQ ID NO:36具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:34具有至少70％的同源性，例如与SEQ ID NO:38具有至少75％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。在优选的实施方案中，所述核酸序列与SEQID NO:38具有至少90％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列；和
-与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:1、SEQID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:34相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:7相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:7具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:34相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:11相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:11具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:34相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少90％的同源性，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；
-与SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:15具有至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:36具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
在一些实施方案中，所述核酸构建体进一步包含与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:38具有至少70％、例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
信息素组合物
本申请还提供了包含(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的信息素组合物。(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯中的至少一种优选地可通过上文公开的方法获得。
在一些实施方案中，所述信息素组合物包含(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，其中Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯中的至少一种可通过上文公开的方法获得。
因而，本发明方法可进一步包括将回收的(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯配制成信息素组合物的步骤。本发明信息素组合物可用作害虫综合治理产品，可用于监测害虫存在的方法或干扰害虫交配的方法。
本申请公开的信息素组合物可用作生物农药。可以将这样的组合物喷洒或分配在培养物上、田间或果园中。正如本领域已知，也可以将它们浸泡到例如橡胶隔片上，或与其他组分混合。这可以导致交配干扰，由此阻止害虫繁殖，或者可以与诱捕装置联合用于诱捕害虫。可以使用本发明信息素组合物防治的害虫的非限制性实例为：棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、二化螟(Chilo suppressalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、大菜螟(Crocidolomia binotalis)、欧洲玉米螟(粉茎螟(Sesamianonagrioides))、醋栗透翅蛾(Synanthedon tipuliformis)和洋蓟羽蛾(Platyptiliacarduidactylal)。因而，在培养物上使用本发明组合物可以获得作物产量增加，同时基本上没有环境影响。
在本发明信息素组合物中的(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的相对量可根据作物的性质和/或待防治的害虫而变化；也可能存在地理差异。确定最佳相对量因此可能需要常规优化。
用作驱避剂的组合物的实例可见于：Kehat和Dunkelblum，1993(对于棉铃虫)；Alfaro等人，2009(对于二化螟)；Eizaguirre等人，2002(对于粉茎螟)；Wu等人，2012(对于小菜蛾)；Bari等人，2003(对于洋蓟羽蛾)。
所述信息素组合物因而可以包含1％到100％的(Z)-11-十六碳烯醇、1％到100％的(Z)-11-十六碳烯醛和1％到100％的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
在一些实施方案中，所述信息素组合物可以进一步包含一种或多种另外的化合物，例如液体或固体载体或基质。例如，适合的载体或基质包括植物油、精制矿物油或其馏分、橡胶、塑料、二氧化硅、硅藻土、蜡基质和纤维素粉。
所述信息素组合物可以配制为本领域已知的形式。例如，它可以是溶液、凝胶、粉末的形式。可以配制信息素组合物，使其易于分配，正如本领域已知的。
成套试剂盒
本申请还提供了包含如本申请所述的酵母细胞和/或核酸构建体、以及使用说明书的成套试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含可用于本申请所述方法中的酵母细胞。在其他实施方案中，所述试剂盒包含可用于基因改造用于本申请所述方法的酵母细胞的核酸构建体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含如本申请所述的酵母细胞和核酸构建体。
实施例
实施例1：质粒和菌株的构建
来自脐橙螟蛾(SEQ ID NO:1)、黄地老虎(SEQ ID NO:42)、棉贪夜蛾(SEQ ID NO:40)、和粉纹夜蛾(SEQ ID NO:44)的编码Δ11-去饱和酶的四种基因由GeneArt(LifeTechnologies)在经密码子优化形式的酿酒酵母中合成。来自黄地老虎(SEQ ID NO:3)、棉铃虫(SEQ ID NO:7)、烟青虫(SEQ ID NO:11)、和亚曲夜蛾(SEQ ID NO:15)的编码脂酰还原酶的四种基因也由GeneArt(Life Technologies)在密码子优化形式的酿酒酵母中合成。另外表达了几种脂酰还原酶，其中在其C端的ER滞留信号改变。将来自棉铃虫的脂酰还原酶修饰为使得其假定的内源KKSYE信号由来自酿酒酵母的HDEL信号替代(SEQ ID NO:9)。将来自亚曲夜蛾的脂酰还原酶修饰为使得其假定的内源EKKT信号由HDEL信号(来自酿酒酵母)替代(SEQ ID NO:17)。将来自烟青虫的脂酰还原酶修饰为使得其假定的内源KKTTNK信号由HDEL信号(来自酿酒酵母)替代(SEQ ID NO:13)。编码酿酒酵母醇乙酰基转移酶(AcT)ATF1的基因是从酿酒酵母菌株CEN.PK102-5B的基因组DNA制备物中扩增的。
DNA片段通过PCR使用带有EasyClone-可配伍突出端的引物扩增，如文献中所述(Jensen等人，2014)。引物列于表1中，DNA片段列于表2中。PCR混合物含有32μl水、10μl高保真聚合酶缓冲液(5x)、1μl dNTP(10mM)、1μl Pfu7x聚合酶、2.5μl正向引物(10μM)、2.5μl反向引物(10μM)和1μl DNA模板，并使用以下PCR程序：94℃进行2分钟，对[94℃进行15秒、63℃进行20秒、68℃进行1分30秒]进行30个循环，68℃进行2分钟，在10℃暂停。在含有(iNtRON Biotechnology)的1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。从凝胶切下正确大小的PCR产物，并使用凝胶和PCR纯化试剂盒(Macherey-Nagel)将其纯化。
表1：引物。
表2：通过PCR使用指定模板和引物获得的DNA片段。
基础整合载体EasyClone 2.0pCfB2190(XI-2-loxP-KlLEU2syn)、pCfB2228(XII-4-loxP-SpHIS5syn)、和pCfB2190(XI-2-loxP-KlLEU2syn)有记载(Stovicek等人，2015)。用于多重整合的载体EasyCloneMulti pCfB2047(pTY2-KlURA3-TAG)有记载(Maury等人，2016)。另外，我们构建了整合载体pCfB2912(XI-5-loxP-NatMXsyn)。使用BB0593和BB0598(分别为原始载体骨架和诺尔丝菌素抗性基因)通过如2015年Stovicek等人所述的USER融合构建质粒pCfB2912。
所有基础整合载体均用AsiSI(Fermentas)在37℃线性化2小时，然后用Nb.BsmI(New England Biolabs)在65℃切刻1小时。将所得含有粘状末端的载体通过凝胶电泳分离，切下，并使用凝胶和PCR纯化试剂盒(Macherey-Nagel)进行凝胶纯化。通过以下方案通过USER克隆将DNA片段克隆到如此制备的载体中：将1μl线性化质粒、1μl启动子片段、1.5μl基因片段、1μl高保真聚合酶缓冲液(5x)和0.5μl USER酶(New England Biolabs)混合，在37℃培养25分钟，并在25℃培养25分钟。将反应转化到化学感受态大肠杆菌DHα细胞中，并将细胞放置在含有100mg/L氨苄青霉素的LysogenyBroth(LB)琼脂平板上。将平板在37℃培养过夜，并通过菌落PCR筛选所得菌落。从大肠杆菌过夜培养物纯化质粒，通过测序证实正确的克隆。表3中列出了构建的整合载体。
表3：整合表达载体。
整合表达载体用NotI(Fermentas)线性化，并使用醋酸锂方案转化到酿酒酵母中(Gietz和Schiestl，2007)。在酵母营养缺陷型(drop-out)合成平板(Sigma-Aldrich)上选择阳性转化子。通过菌落PCR证实将表达构建体正确整合到酿酒酵母的基因组中。
实施例2：在酿酒酵母中过表达来自脐橙螟蛾的Δ11-去饱和酶和脂酰辅酶A还原酶的四种变体时产生(Z)-11-十六碳烯醇
我们构建了酿酒酵母菌株，其过表达脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶和具有天然C端或HDEL C端的脂酰辅酶A还原酶的四种变体(表4)。检测了每个菌株的三个单独分离株产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的获得能力。在具有透气盖的24深孔微量滴定板(EnzyScreen)中，将单独的菌落接种在3ml缺乏组氨酸和亮氨酸的酵母营养缺陷型合成液体培养基中，将其在30℃在250rpm振荡下培养过夜。在合成完全培养基中培养对照亲本菌株CEN.PK102-5B。第二天，将60μl的预培养物转移到具有透气盖的96深孔微量滴定板(EnzyScreen)中的540μl矿物质培养基中。矿物质培养基的组成有记载(Jensen等人，2014)。对于对照菌株，培养基中补加了240mg/L亮氨酸、76mg/L组氨酸和20mg/L尿嘧啶；对于其他菌株，培养基中补加了20mg/L尿嘧啶。将微量滴定板在30℃在250rpm振荡下培养48小时。在取样进行OD后，向剩余的495ul培养物中加入等体积的癸烷。用来自EnzyScreen的由Viton制成的盖子覆盖该板(避免有机溶剂吸收到盖子中)，并将该板以250rpm振荡10分钟。将所得乳液转移到4mL玻璃小瓶中，用盖子封闭，涡旋20秒并在4000xg离心35秒。移除下层(水)相，向剩余的癸烷相中加入0.1g Na2SO4。将混合物涡旋10秒，并将澄清的有机相转移到玻璃小瓶中进行GC-MS分析。在与质量选择检测器HP 5973偶联的Hewlett Packard 6890GC上进行GC-MS分析。GC装有INNOWax柱(30m×0.25mm×0.25μm)，使用氦气作为载气(平均速度：33cm/s)。以电子轰击模式(70eV)操作MS，在m/z为30至400之间扫描，在220℃以不分流模式设置注射器。烘箱温度设定为80℃保持1分钟，然后以10℃/分钟的速率升至210℃，随后在210℃保持15分钟，然后以10℃/分钟的速率升至230℃，随后在230℃保持20分钟。通过与实验室收集可得的参考化合物的保留时间和质谱比较来鉴定化合物。
通过记录的总离子流(TIC)对化合物进行定量化。通过Agilent ChemStation软件和iWork号分析数据。基于0mg/L到15mg/L范围的(Z)-11-十六碳烯-1-醇标准品的校准曲线，计算(Z)-11-十六碳烯-1-醇的浓度。标准品购自Pherobank(Wageningen,Netherlands)。
引入来自脐橙螟蛾的Δ11-去饱和酶和来自棉铃虫或亚曲夜蛾或烟青虫的脂酰辅酶A还原酶使得酿酒酵母能够以1-3.9mg/L的滴度合成(Z)-11-十六碳烯-1-醇(表4)。以前的研究已经报道，当在酿酒酵母中表达AseΔ11和Ase_FAR时，获得了(Z)-11-十六碳烯-1-醇的产生(等人，2013)。然而，我们的结果表明，Ase_FAR具有非常低的活性，与Har_FAR、Hs_FAR或Has_FAR相比远不适合于产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
表4：为用脂酰辅酶A还原酶的不同变体产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇而进行基因改造的酿酒酵母菌株。
实施例3：在酿酒酵母中过表达来自棉铃虫的脂酰辅酶A还原酶和Δ11-去饱和酶的四种变体时产生(Z)-11-十六碳烯醇
为了鉴定具有最高活性的菌株，我们构建了酿酒酵母菌株，其过表达具有修饰C端的棉铃虫脂酰辅酶A还原酶和Δ11-去饱和酶的四种变体(表5)。检测了每个菌株的两个单独分离株产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的获得能力。
在带有labocap金属盖(Lüdiswiss,Flawil,Switzerland)的12ml玻璃管(Duran,Wertheim,Germany)中，将单独的菌落接种在5ml的具有8％葡萄糖的酵母浸膏-蛋白胨-葡萄糖(YPD)培养基(10g/L酵母浸膏、20g/L蛋白胨、80g/L右旋葡萄糖)中，并在30℃在250rpm振荡下培养过夜。第二天将过夜培养物离心，弃去上清液，将沉淀物(pellet)重悬于补加有20mg/L尿嘧啶的2mL适时补料(feed-in-time，FIT)培养基中。适时补料培养基购自m2p-labsGmbH(Baesweiler,Germany)。其即将在使用前补加0.5％的酶溶液和1％的维生素溶液。将所述管在30℃在250rpm振荡下培养40小时。为了萃取，将1mL培养物转移到4mL玻璃小瓶中，添加10μL内标物原料(在100％乙醇中的1μg/μL(Z)-10-庚烷-1-基甲基酯)。用小片铝箔覆盖所述小瓶，我们用针在铝箔盖中刺穿形成小孔。将样品涡旋并置于-80℃储存以备分析。将样品在冻干系统(Freezone6和Stoppening盘式干燥机，Labconco,Kansas City，USA)中在-40℃冻干，然后加入1mL的2:1氯仿:甲醇以破坏细胞。将混合物涡旋45秒，并在室温放置4小时。在氮气流下缓慢蒸发有机溶剂。加入1ml己烷，将样品涡旋10秒钟，离心，将200μl转移到新的玻璃小瓶中。如实施例2中所述进行GC-MS分析。根据内标物和校准曲线计算(Z)-11-十六碳烯-1-醇的浓度。
所有四个测试的菌株都产生了产物(Z)-11-十六碳烯-1-醇，但使用来自脐橙螟蛾的Δ11-去饱和酶所得结果明显优于其他，产生约7mg/L的滴度。由于改进的培养和萃取方案，菌株ST3706的滴度高于实施例2所得。
表5：为用Δ11-去饱和酶不同变体产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇而进行基因改造的酿酒酵母菌株。
实施例4：通过整合脂酰辅酶A还原酶的多个拷贝改进(Z)-11-十六碳烯-1-醇的产生
我们构建酿酒酵母菌株，其过表达来自脐橙螟蛾的Δ11-去饱和酶和来自棉铃虫的脂酰辅酶A还原酶Har_FAR。将Har_FAR基因以单个拷贝(ST3705)或多个拷贝(ST5262)整合到基因组中。将ST3705接种到5ml含8％葡萄糖的YPD培养基(10g/L酵母浸膏、20g/L蛋白胨、80g/L右旋葡萄糖)中，并将ST5262接种到5ml缺乏尿嘧啶的合成完全培养基中。将这两个菌株都在带有labocap金属盖(Lüdiswiss,Flawil,Switzerland)的12ml玻璃管(Duran,Wertheim,Germany)中培养，并在30℃在250rpm振荡下培养过夜。第二天将过夜培养物离心，弃去上清液，将沉淀物重悬于2mL适时补料(FIT)培养基中。对于菌株ST3705，培养基补加有20mg/L尿嘧啶。适时补料培养基购自m2p-labs GmbH(Baesweiler，Germany)。其即将在使用前补加0.5％的酶溶液和1％的维生素溶液。将所述管在30℃在250rpm振荡下培养40小时。如实施例3中所述进行样品萃取。多个Har_FAR基因拷贝的整合使产量增加八倍(表6)。
表6：为用不同基因拷贝数的脂酰还原酶产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇而进行基因改造的酿酒酵母菌株。
实施例5：在补料分批发酵中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇
针对在补料分批发酵中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇测试菌株ST3705。将约1ml菌株ST3705的低温培养物接种到在500ml带挡板的摇瓶中的150ml不含亮氨酸和组氨酸的合成完全培养基(SC leu-his-)中，在30℃在250rpm振荡下培养24小时。接种物如下浓缩(up-concentrated)：离心培养物，移除100ml上清液，将细胞重悬于剩余的50ml液体中。该细胞悬液用于接种到1L Sartorius生物反应器中的500mL发酵培养基(6g/L KH2PO4、4g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4*7H2O、1ml/L消泡剂204、4ml/L痕量金属(Jensen,2013)、2ml/L维生素(Jensen,2013)、和32mg/L尿嘧啶)中。反应器操作条件为30℃、以1L/min曝气和以800rpm搅拌。用2M KOH使pH保持在5。进料溶液由500ml的200g/L葡萄糖组成。将100ml进料溶液加入到反应器中，开始发酵。24小时后，采用5g/h的恒定进料速率并在整个发酵过程中维持该速率。
针对在补料分批发酵中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇测试菌株ST5262。将菌株ST5262接种到在2L带挡板的烧瓶中的不含尿嘧啶的100mL双倍浓缩合成完全培养基(2xSCura-)中，并在28℃在250rpm振荡下培养24小时。加入另外400mL的2xSC ura-，并在相同条件下继续培养另外48小时。为了制备用于发酵的浓缩接种物，将细胞离心，重悬于50mL剩余的上清液中。该细胞悬液用于接种到1L Sartorius生物反应器中的500mL发酵培养基(6g/LKH2PO4、6g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4*7H2O、1ml/L消泡剂204、4ml/L痕量金属(Jensen,2013)、2ml/L维生素(Jensen,2013))中。反应器操作条件为30℃、以1.5L/min曝气和以800rpm搅拌。通过将氧气自动混合到空气中将溶解氧控制在20％以上。用10％KOH使pH保持在5。进料溶液由补加有0.5ml消泡剂204的500ml的330g/L右旋葡萄糖组成。将约20ml的进料溶液加入到反应器中，开始发酵。进料速率设定为5g/h。从发酵开始的第17小时进料速率增加到7.5g/h，从发酵开始的第34小时进料速率进一步增加到10g/h。在第60小时，进料速率降至3g/h，直到在第100小时收获培养物为止，此时全部进料均被消耗。
通过用注射器从反应器出口抽出几毫升培养基进行取样，将样品转移到塑料管中，保持在-20℃，直到进行(Z)-11-十六碳烯-1-醇萃取为止。萃取和GC-MS分析按实施例3中所述进行。菌株ST3705的最终产生滴度为20mg/L(图2A)，菌株ST5262的最终产生滴度为189mg/L(图2B)。
实施例6：在耶氏解脂酵母中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇
我们测试了在表达脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶和亚曲夜蛾脂酰辅酶A还原酶的耶氏解脂酵母中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇。将编码脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(SEQ ID NO:2)和亚曲夜蛾脂酰辅酶A还原酶(SEQ ID NO:16)的基因克隆到耶氏解脂酵母表达载体中，产生质粒pCfB3465(图3)。在转化到耶氏解脂酵母中之前，将表达质粒用NotI线性化。使用醋酸锂方案(Chen,1997)将线性化的质粒转化到耶氏解脂酵母GB20菌株(Angerer,2014)中。在缺乏尿嘧啶的合成完全(SC)培养基上选择阳性转化体。通过菌落PCR证实将表达构建体整合到耶氏解脂酵母基因组中。
在带有labocap金属盖(Lüdiswiss,Flawil,Switzerland)的12ml玻璃管(Duran,Wertheim,Germany)中，将每个菌株的一个单独克隆接种在5ml含有8％葡萄糖的YPD培养基(10g/L酵母浸膏、20g/L蛋白胨、80g/L右旋葡萄糖)中，将其在30℃在250rpm振荡下培养过夜。第二天，将过夜培养物离心，弃去上清液，将沉淀重悬于2ml限氮培养基(2.9g/L(NH4)2SO4、1.7g/LYNB(不含氨基酸和硫酸铵，240mg/L亮氨酸，76mg/L赖氨酸)和61g/L甘油)中。对于菌株ST3683，培养基补加有20mg/L尿嘧啶。将培养物在30℃培养48小时，并以250rpm振荡。萃取和GC-MS分析按实施例3中所述进行。表达脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶和亚曲夜蛾脂酰辅酶A还原酶的耶氏解脂酵母菌株ST3844产生了1.7mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇(表7)。
表7：菌株和(Z)-11-十六碳烯-1-醇滴度
实施例7：乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的产生
我们构建了菌株ST3581用于产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，该菌株表达脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶、亚曲夜蛾脂酰辅酶A还原酶和酿酒酵母醇乙酰基转移酶AcT。
在带有labocap金属盖(Lüdiswiss,Flawil,Switzerland)的12ml玻璃管(Duran,Wertheim,Germany)中，将ST3581和对照菌株ST3330(其不会过表达醇乙酰基转移酶)的单独菌落接种在5ml含有8％葡萄糖的YPD培养基(10g/L酵母浸膏、20g/L蛋白胨、80g/L右旋葡萄糖)中，将其在30℃在250rpm振荡下培养过夜。第二天，将过夜培养物离心，弃去上清液，将沉淀重悬于含有20g/L葡萄糖的2ml限氮矿物质培养基(1.25g/L(NH4)2SO4、14.4g/LKH2PO4、0.5g/L MgSO4*7H2O、2mL/L痕量金属溶液(Jensen,2013)、1mL/L维生素溶液(Jensen,2013))中。将培养物在30℃培养48小时，并以250rpm振荡。萃取和GC-MS分析按实施例3中所述进行。ST358产生了1.68mg/L的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，而在对照菌株ST3330中没有观察到产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯(表8)。
表8：菌株和乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯滴度。
序列
SEQ ID NO:1–脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
Atggttccaaacaagggttcctctgatgttttgtctgaacattctgaaccacaattcaccaagttgattgctccacaagctggtccaagaaagtacaaaatcgtttacagaaacttgttgaccttcggttactggcatttgtctgctgtttatggtttgtacttgtgtttcacttgtgctaagtgggctactattttgttcgctttcttcttgtacgttatcgccgaaattggtattactggtggtgctcatagattatgggctcatagaacttacaaagccaagttgccattggaaatcttgttgttgatcatgaactccattgccttccaagatactgcttttacttgggctagagatcatagattgcatcacaagtactctgatactgatgctgatccacataatgctactagaggtttcttctactctcatgttggttggttgttggttaagaaacacccagaagttaaggctagaggtaagtacttgtctttggatgacttgaagaacaaccctttgttgaagttccaaaagaagtacgccattttggtcattggtactttgtgctttttgatgccaactttcgttccagtttacttttggggtgaaggtatttctactgcctggaacattaacttgttaagatacgtcatgaacttgaacatgacctttttggttaactccgctgctcatatttttggtaacaagccatacgataagtctatcgcctctgttcaaaacatctctgtttctttggctactttcggtgaaggtttccataactaccatcatacttatccatgggattacagagctgctgaattgggtaacaatagattgaatatgaccaccgccttcattgatttctttgcttggattggttgggcctacgatttgaaatctgttccacaagaagctattgctaagagatgtgctaaaactggtgatggtactgatatgtggggtagaaagagatga
SEQ ID NO:2-脐橙螟蛾Δ-11-去饱和酶的氨基酸序列(翻译)
MVPNKGSSDVLSEHSEPQFTKLIAPQAGPRKYKIVYRNLLTFGYWHLSAVYGLYLCFTCAKWATILFAFFLYVIAEIGITGGAHRLWAHRTYKAKLPLEILLLIMNSIAFQDTAFTWARDHRLHHKYSDTDADPHNATRGFFYSHVGWLLVKKHPEVKARGKYLSLDDLKNNPLLKFQKKYAILVIGTLCFLMPTFVPVYFWGEGISTAWNINLLRYVMNLNMTFLVNSAAHIFGNKPYDKSIASVQNISVSLATFGEGFHNYHHTYPWDYRAAELGNNRLNMTTAFIDFFAWIGWAYDLKSVPQEAIAKRCAKTGDGTDMWGRKR
SEQ ID NO:3-黄地老虎脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atgccagtcttgacttctagagaagacgaaaaattgtccgtcccagaattttacgctggtaagtctatttttgttaccggtggtactggtttcttgggtaaggtttttatcgaaaagttgttgtactgctgcccagatatcgataagatctacatgttgatcagagaaaaaaagaacttgtccatcgacgaaagaatgtccaagtttttggatgaccctttgttctccagattgaaagaagaaagaccaggtgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattaccgctcctaatttgggtttgtctgctgaaaacgaaagaatcttgttggaaaaggtcagtgtcattattaactctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaattgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgttgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctccaccgcttactctaatgcttcttctgatagaattgtcgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatatggatcaagtttatcaattggttaaggacggtgtcactgaagaagaaaccgaaagattattgaacggtttgccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaacatcaaacttacgttccaaccattatcatcagaccatctgttgttgcctccattaaggatgaacctattagaggttggttgtgtaattggtttggtgctactggtatttctgttttcactgctaagggtttgaacagagttttgttgggtaaagcctctaacatcgttgatgttatcccagttgattacgttgccaacttggttatagttgctggtgctaaatctggtggtcaaaagtctgatgaattgaaaatctacaactgctgctcctctgactgtaatccagttactttgaagaagatcatcaaagaattcaccgaagataccatcaagaacaagtcccatattatgccattgccaggttggttcgtttttactaagtacaaatggttgttgactttgttgaccatcatcttccaaatgttgccaatgtatttggccgatgtttacagagtcttgaccggtaaaattccaagatatatgaagttgcaccacttggtcattcaaaccagattgggtattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaagaccgatagagtcagagaattattcggttctttgtccttggccgaaaaacacatgtttccatgtgatccatcttccattgattggaccgattacttgcaatcttactgctatggtgtcagaagattcttagaaaagaagaagtaa
SEQ ID NO:4-黄地老虎脂酰还原酶的氨基酸序列
MPVLTSREDEKLSVPEFYAGKSIFVTGGTGFLGKVFIEKLLYCCPDIDKIYMLIREKKNLSIDERMSKFLDDPLFSRLKEERPGDLEKIVLIPGDITAPNLGLSAENERILLEKVSVIINSAATVKFNEPLPIAWKINVEGTRMLLALSRRMKRIEVFIHISTAYSNASSDRIVVDEILYPAPADMDQVYQLVKDGVTEEETERLLNGLPNTYTFTKALTEHLVAEHQTYVPTIIIRPSVVASIKDEPIRGWLCNWFGATGISVFTAKGLNRVLLGKASNIVDVIPVDYVANLVIVAGAKSGGQKSDELKIYNCCSSDCNPVTLKKIIKEFTEDTIKNKSHIMPLPGWFVFTKYKWLLTLLTIIFQMLPMYLADVYRVLTGKIPRYMKLHHLVIQTRLGIDFFTSHSWVMKTDRVRELFGSLSLAEKHMFPCDPSSIDWTDYLQSYCYGVRRFLEKKK
SEQ ID NO:5–其中信号肽改变为KKYR的棉铃虫脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcactttttggatgatcctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcacagatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacatttcttggaaaaaaagtacagataa
SEQ ID NO:6-信号肽改变为KKYR的棉铃虫脂酰还原酶的氨基酸序列
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SEQ ID NO:7-棉铃虫脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcactttttggatgatcctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcacagatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacatttcttggaaaaaaaaagctacgaataa
SEQ ID NO:8-棉铃虫脂酰还原酶
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SEQ ID NO:9-信号肽改变为HDEL的棉铃虫脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcactttttggatgatcctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcacagatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacatttcttggaacatgatgaattgtaa
SEQ ID NO:10-信号肽改变为HDEL的棉铃虫脂酰还原酶
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SEQ ID NO:11-烟青虫脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaagatcttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcaatttttggatgaccctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcattcctcttacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtatgtttttacaaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacacttcttggaaaaaaagactaccaacaagtaa
SEQ ID NO:12-烟青虫脂酰还原酶的氨基酸序列
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKIFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLSVSERIKQFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAATVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPADIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAIKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSYIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSKSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYVFTKYKWLVLLLTILFQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSPADKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEKKTTNK
SEQ ID NO:13-信号肽改变为HDEL的烟青虫脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaagatcttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcaatttttggatgaccctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcattcctcttacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtatgtttttacaaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcacctctcattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccaaccgatattaactggacccattacattcaagattactgctggggtgttagacacttcttggaacatgatgaattgtaa
SEQ ID NO:14-信号肽改变为HDEL的烟青虫脂酰还原酶的氨基酸序列
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKIFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLSVSERIKQFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAATVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPADIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAIKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSYIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSKSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYVFTKYKWLVLLLTILFQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTSHSWVMKADRVRELFASLSPADKYLFPCDPTDINWTHYIQDYCWGVRHFLEHDEL
SEQ ID NO:15-亚曲夜蛾脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcactttttggatgatcctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcaccaaccattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccagtcaacatcaattggagacaatatatccaagattactgctggggtgttagacatttcttggaaaaaaagacttaa
SEQ ID NO:16-亚曲夜蛾脂酰还原酶的氨基酸序列
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLSVSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAATVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPADIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAIKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSKSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTILFQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTNHSWVMKADRVRELFASLSPADKYLFPCDPVNINWRQYIQDYCWGVRHFLEKKT
SEQ ID NO:17-信号肽改变为HDEL的亚曲夜蛾脂酰还原酶的经酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
atggttgtcttgacctccaaagaaactaagccatctgttgctgaattttacgctggtaagtctgttttcattactggtggtactggtttcttgggtaaggttttcattgaaaagttgttgtactcctgcccagatatcggtaatatctacatgttgatcagagaaaagaagggtttgtccgtttccgaaagaatcaagcactttttggatgatcctttgttcaccagattgaaagaaaaaagaccagccgacttggaaaagatcgttttgattccaggtgatattactgctccagatttgggtattacctccgaaaacgaaaagatgttgatcgaaaaggtcagtgtcattattcattctgctgctaccgttaagttcaacgaaccattgccaactgcttggaagattaacgttgaaggtactagaatgatgttggccttgtctagaagaatgaagagaatcgaagttttcatccatatctctaccgcttacactaacaccaacagagaagttgttgacgaaatcttgtatccagctccagctgatattgatcaagttcaccaatatgttaaggacggtatctctgaagaagaaactgaaaaaatcttgaacggtagaccaaacacttacactttcactaaggctttgaccgaacatttggttgctgaaaatcaagcttacgttccaaccattatcgttagaccatcagttgttgctgccattaaggatgaacctattaagggttggttgggtaattggtatggtgctacaggtttgactgtttttactgctaagggtttgaacagagttatctacggtcactcttctaacatcgttgatttgatcccagttgattacgttgccaacttggttattgctgctggtgctaaatcttctaagtctactgaattgaaggtctacaactgctgttcttctgcttgtaacccaattactatcggtaagttgatgtccatgtttgctgaagatgctatcaagcaaaagtcttacgctatgccattgccaggttggtacatttttactaagtacaagtggttggtcttgttgttgaccattttgttccaagttattccagcctacattaccgacttgtacagacatttgattggtaagaacccaagatatatcaagttgcaatccttggtcaatcaaaccagatcctccattgatttcttcaccaaccattcttgggttatgaaggctgatagagtcagagaattattcgcttctttgtctccagcagataagtacttgtttccatgtgatccagtcaacatcaattggagacaatatatccaagattactgctggggtgttagacatttcttgcatgatgaattgtaa
SEQ ID NO:18-信号肽改变为HDEL的亚曲夜蛾脂酰还原酶的氨基酸序列
MVVLTSKETKPSVAEFYAGKSVFITGGTGFLGKVFIEKLLYSCPDIGNIYMLIREKKGLSVSERIKHFLDDPLFTRLKEKRPADLEKIVLIPGDITAPDLGITSENEKMLIEKVSVIIHSAATVKFNEPLPTAWKINVEGTRMMLALSRRMKRIEVFIHISTAYTNTNREVVDEILYPAPADIDQVHQYVKDGISEEETEKILNGRPNTYTFTKALTEHLVAENQAYVPTIIVRPSVVAAIKDEPIKGWLGNWYGATGLTVFTAKGLNRVIYGHSSNIVDLIPVDYVANLVIAAGAKSSKSTELKVYNCCSSACNPITIGKLMSMFAEDAIKQKSYAMPLPGWYIFTKYKWLVLLLTILFQVIPAYITDLYRHLIGKNPRYIKLQSLVNQTRSSIDFFTNHSWVMKADRVRELFASLSPADKYLFPCDPVNINWRQYIQDYCWGVRHFLHDEL
SEQ ID NO:34-Sc_FAA1DNA序列；mRNA编码序列。
ATGGTTGCTCAATATACCGTTCCAGTTGGGAAAGCCGCCAATGAGCATGAAACTGCTCCAAGAAGAAATTATCAATGCCGCGAGAAGCCGCTCGTCAGACCGCCTAACACAAAGTGTTCCACTGTTTATGAGTTTGTTCTAGAGTGCTTTCAGAAGAACAAAAATTCAAATGCTATGGGTTGGAGGGATGTTAAGGAAATTCATGAAGAATCCAAATCGGTTATGAAAAAAGTTGATGGCAAGGAGACTTCAGTGGAAAAGAAATGGATGTATTATGAACTATCGCATTATCATTATAATTCATTTGACCAATTGACCGATATCATGCATGAAATTGGTCGTGGGTTGGTGAAAATAGGATTAAAGCCTAATGATGATGACAAATTACATCTTTACGCAGCCACTTCTCACAAGTGGATGAAGATGTTCTTAGGAGCGCAGTCTCAAGGTATTCCTGTCGTCACTGCCTACGATACTTTGGGAGAGAAAGGGCTAATTCATTCTTTGGTGCAAACGGGGTCTAAGGCCATTTTTACCGATAACTCTTTATTACCATCCTTGATCAAACCAGTGCAAGCCGCTCAAGACGTAAAATACATAATTCATTTCGATTCCATCAGTTCTGAGGACAGGAGGCAAAGTGGTAAGATCTATCAATCTGCTCATGATGCCATCAACAGAATTAAAGAAGTTAGACCTGATATCAAGACCTTTAGCTTTGACGACATCTTGAAGCTAGGTAAAGAATCCTGTAACGAAATCGATGTTCATCCACCTGGCAAGGATGATCTTTGTTGCATCATGTATACGTCTGGTTCTACAGGTGAGCCAAAGGGTGTTGTCTTGAAACATTCAAATGTTGTCGCAGGTGTTGGTGGTGCAAGTTTGAATGTTTTGAAGTTTGTGGGCAATACCGACCGTGTTATCTGTTTTTTGCCACTAGCTCATATTTTTGAATTGGTTTTCGAACTATTGTCCTTTTATTGGGGGGCCTGCATTGGTTATGCCACCGTAAAAACTTTAACTAGCAGCTCTGTGAGAAATTGTCAAGGTGATTTGCAAGAATTCAAGCCCACAATCATGGTTGGTGTCGCCGCTGTTTGGGAAACAGTGAGAAAAGGGATCTTAAACCAAATTGATAATTTGCCCTTCCTCACCAAGAAAATCTTCTGGACCGCGTATAATACCAAGTTGAACATGCAACGTCTCCACATCCCTGGTGGCGGCGCCTTAGGAAACTTGGTTTTCAAAAAAATCAGAACTGCCACAGGTGGCCAATTAAGATATTTGTTAAACGGTGGTTCTCCAATCAGTCGGGATGCTCAGGAATTCATCACAAATTTAATCTGCCCTATGCTTATTGGTTACGGTTTAACCGAGACATGCGCTAGTACCACCATCTTGGATCCTGCTAATTTTGAACTCGGCGTCGCTGGTGACCTAACAGGTTGTGTTACCGTCAAACTAGTTGATGTTGAAGAATTAGGTTATTTTGCTAAAAACAACCAAGGTGAAGTTTGGATCACAGGTGCCAATGTCACGCCTGAATATTATAAGAATGAGGAAGAAACTTCTCAAGCTTTAACAAGCGATGGTTGGTTCAAGACCGGTGACATCGGTGAATGGGAAGCAAATGGCCATTTGAAAATAATTGACAGGAAGAAAAACTTGGTCAAAACAATGAACGGTGAATATATCGCACTCGAGAAATTAGAGTCCGTTTACAGATCTAACGAATATGTTGCTAACATTTGTGTTTATGCCGACCAATCTAAGACTAAGCCAGTTGGTATTATTGTACCAAATCATGCTCCATTAACGAAGCTTGCTAAAAAGTTGGGAATTATGGAACAAAAAGACAGTTCAATTAATATCGAAAATTATTTGGAGGATGCAAAATTGATTAAAGCTGTTTATTCTGATCTTTTGAAGACAGGTAAAGACCAAGGTTTGGTTGGCATTGAATTACTAGCAGGCATAGTGTTCTTTGACGGCGAATGGACTCCACAAAACGGTTTTGTTACGTCCGCTCAGAAATTGAAAAGAAAAGACATTTTGAATGCTGTCAAAGATAAAGTTGACGCCGTTTATAGTTCGTCTTAA
SEQ ID NO:35–Sc_FAA1氨基酸序列
MVAQYTVPVGKAANEHETAPRRNYQCREKPLVRPPNTKCSTVYEFVLECFQKNKNSNAMGWRDVKEIHEESKSVMKKVDGKETSVEKKWMYYELSHYHYNSFDQLTDIMHEIGRGLVKIGLKPNDDDKLHLYAATSHKWMKMFLGAQSQGIPVVTAYDTLGEKGLIHSLVQTGSKAIFTDNSLLPSLIKPVQAAQDVKYIIHFDSISSEDRRQSGKIYQSAHDAINRIKEVRPDIKTFSFDDILKLGKESCNEIDVHPPGKDDLCCIMYTSGSTGEPKGVVLKHSNVVAGVGGASLNVLKFVGNTDRVICFLPLAHIFELVFELLSFYWGACIGYATVKTLTSSSVRNCQGDLQEFKPTIMVGVAAVWETVRKGILNQIDNLPFLTKKIFWTAYNTKLNMQRLHIPGGGALGNLVFKKIRTATGGQLRYLLNGGSPISRDAQEFITNLICPMLIGYGLTETCASTTILDPANFELGVAGDLTGCVTVKLVDVEELGYFAKNNQGEVWITGANVTPEYYKNEEETSQALTSDGWFKTGDIGEWEANGHLKIIDRKKNLVKTMNGEYIALEKLESVYRSNEYVANICVYADQSKTKPVGIIVPNHAPLTKLAKKLGIMEQKDSSINIENYLEDAKLIKAVYSDLLKTGKDQGLVGIELLAGIVFFDGEWTPQNGFVTSAQKLKRKDILNAVKDKVDAVYSSS
SEQ ID NO:36-Yl_FAA DNA序列；mRNA编码序列。
SEQ ID NO:37-Yl_FAA氨基酸序列
MVGYTISSKPVSVEVGPAKPGETAPRRNVIAKDAPVVFPDNDSSLTTVYKLFKKYAEINSERKAMGWRDTIDIHVETKQVTKVVDGVEKKVPKEWKYFEMGPYKWLSYKEALKLVHDYGAGLRHLGIKPKEKMHIYAQTSHRWMLSGLASLSQGIPIVTAYDTLGEEGLTRSLQETNSVIMFTDKALLSSLKVSLKKGTDLRIIIYGGDLTPDDKKAGNTEIDAIKEIVPDMKIYTMDEVVALGREHPHPVEEVDYEDLAFIMYTSGSTGVPKGVVLQHKQILASVAGVTKIIDRSIIGNTDRLLNFLPLAHIFEFVFEMVTFWWGASLGYGTVKTISDLSMKNCKGDIRELKPTIMVGVPAVWEPMRKGILGKIKELSPLMQRVFWASFAAKQRLDENGLPGGSILDSLIFKKVKDATGGCLRYVCNGGAPVSVDTQKFITTLICPMLIGCGLTETTANTTIMSPKSYAFGTIGEPTAAVTLKLIDVPEAGYFAENNQGELCIKGNVVMKEYYKNEEETKKAFSDDGYFLTGDIAEWTANGQLRIIDRRKNLVKTQNGEYIALEKLETQYRSSSYVANLCVYADQNRVKPIALVIPNEGPTKKLQSLGVDSDDWDAVCSNKKVVKAVLKDMLDTGRSLGLSGIELLQGIVLLPGEWTPQNSYLTAAQKLNRKKIVDDNKKEIDECYEQS
SEQ ID NO:38:酿酒酵母ATF1DNA序列；mRNA编码序列。
SEQ ID NO:39:酿酒酵母Atf1氨基酸序列
MNEIDEKNQAPVQQECLKEMIQNGHARRMGSVEDLYVALNRQNLYRNFCTYGELSDYCTRDQLTLALREICLKNPTLLHIVLPTRWPNHENYYRSSEYYSRPHPVHDYISVLQELKLSGVVLNEQPEYSAVMKQILEEFKNSKGSYTAKIFKLTTTLTIPYFGPTGPSWRLICLPEEHTEKWKKFIFVSNHCMSDGRSSIHFFHDLRDELNNIKTPPKKLDYIFKYEEDYQLLRKLPEPIEKVIDFRPPYLFIPKSLLSGFIYNHLRFSSKGVCMRMDDVEKTDDVVTEIINISPTEFQAIKANIKSNIQGKCTITPFLHVCWFVSLHKWGKFFKPLNFEWLTDIFIPADCRSQLPDDDEMRQMYRYGANVGFIDFTPWISEFDMNDNKENFWPLIEHYHEVISEALRNKKHLHGLGFNIQGFVQKYVNIDKVMCDRAIGKRRGGTLLSNVGLFNQLEEPDAKYSICDLAFGQFQGSWHQAFSLGVCSTNVKGMNIVVASTKNVVGSQESLEELCSIYKALLLGP
SEQ ID NO:40:Sl_Δ11-去饱和酶DNA序列；mRNA编码序列。
GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAGAATCGGCCCGTGGAGTTGGCCTTCATTTTCAGTCTTATCTCTCGGTGTTATGGTAGTCACTTATATCGGTATTAAAATAAGTGAATAAGGCTTGTAAAAATGGCGCAATGTGTACAAACAACAACGATTTTGGAACAAAAAGAAGAGAAAACAGTAACTTTGCTGGTACCTCAAGCGGGAAAGAGGAAGTTTGAAATTGTGTATTTTAATATCATCACCTTCGCTTACTGGCATATAGCTGGACTATATGGCCTTTATTTGTGCTTCACTTCAACAAAATGGGCGACAGTTTTATTCTCATTCTTTCTATTCGTCGTAGCAGAAGTAGGGGTCACGGCTGGCTCCCACAGACTTTGGTCGCATAAAACTTACAAAGCAAAACTACCTTTACAAATTCTGCTAATGGTGATGAATTCCCTTGCATTTCAAAACACAGTCATTGATTGGGTGAGAGACCATCGACTCCATCATAAGTATAGCGACACTGATGCCGATCCCCATAATGCCTCCCGAGGATTTTTCTATTCGCACGTCGGTTGGCTGCTTGTGAGAAAACACCCTGATGTCAAGAAACGAGGAAAGGAAATTGATATATCTGATATTTACAACAATCCGGTACTGAGGTTCCAGAAGAAGTACGCAATTCCTTTCATCGGGGCAGTTTGTTTCGTCTTACCAACATTGATACCGGTTTACGGTTGGGGAGAAACCTGGACTAATGCCTGGCACGTCGCCATGCTGCGGTACATTATGAACCTTAACGTCACCTTCCTGGTCAACAGCGCTGCTCATATATATGGAAAGAGACCTTATGACAAGAAGATCCTACCATCTCAAAACATAGCTGTGTCCATTGCAACCTTTGGGGAAGGTTTCCATAATTATCATCATGTATTTCCATGGGATTATCGCGCAGCTGAACTTGGAAATAACAGTTTGAATTTCCCTACGAAATTTATTGATTTCTTTGCGTGGATCGGATGGGCGTATGACCTAAAGACTGTTTCGAAAGAAATGATAAAACAAAGGTCAAAAAGAACTGGTGATGGAACTAATCTATGGGGGTTAGAAGATGTGGATACCCCGGAGGATTTAAAAAATACAAAAGGCGAATAGGCAAACCCTTAAACTCAAACAGTGAGGTTTAATGTGATATTTAGAATTAGAATTAATTTATTTGAAATTAAATGAAGGTTTTGGATAACTGTTTTTAATAATAAAAATAGTTTTTCGATTAAATTCCTTAGATTATTTTAAAGGAAATGTATAAGGTACTCGCGTGGTTAGCAACCCAGCAGTCCCTGTTTATCTGTTTTTATGAATTTATTCTATGAATGTAGATGTCGCATGAAATTTTAAAATGTTGCATTTGTATAATTTTACTTATGAATAAATAAATTTATTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:41:Sl_Δ11-去饱和酶氨基酸序列
MAQCVQTTTILEQKEEKTVTLLVPQAGKRKFEIVYFNIITFAYWHIAGLYGLYLCFTSTKWATVLFSFFLFVVAEVGVTAGSHRLWSHKTYKAKLPLQILLMVMNSLAFQNTVIDWVRDHRLHHKYSDTDADPHNASRGFFYSHVGWLLVRKHPDVKKRGKEIDISDIYNNPVLRFQKKYAIPFIGAVCFVLPTLIPVYGWGETWTNAWHVAMLRYIMNLNVTFLVNSAAHIYGKRPYDKKILPSQNIAVSIATFGEGFHNYHHVFPWDYRAAELGNNSLNFPTKFIDFFAWIGWAYDLKTVSKEMIKQRSKRTGDGTNLWGLEDVDTPEDLKNTKGE
SEQ ID NO:42:As_Δ11-去饱和酶DNA序列；mRNA编码序列。
ATGGCTCAAGGTGTCCAAACAACTACGATATTGAGGGAGGAAGAGCCGTCATTGACTTTCGTGGTACCTCAAGAACCGAGAAAGTATCAAATCGTGTACCCAAACCTTATCACATTTGGGTACTGGCATATAGCTGGTTTATACGGGCTATATTTGTGCTTTACTTCGGCAAAATGGCAAACAATTTTATTCAGTTTCATGCTCGTTGTGTTAGCAGAGTTGGGAATAACAGCCGGCGCTCACAGGTTATGGGCCCACAAAACATATAAAGCGAAGCTTCCCTTACAAATTATCCTGATGATACTGAACTCCATTGCCTTCCAAAATTCCGCCATTGATTGGGTGAGGGACCACCGTCTCCATCATAAGTACAGTGACACTGATGCAGACCCTCACAATGCTACTCGTGGTTTCTTCTATTCTCATGTTGGATGGTTGCTCGTAAGAAAACATCCAGAAGTCAAGAGACGTGGAAAGGAACTTGACATGTCTGATATTTACAACAATCCAGTGCTGAGATTTCAAAAGAAGTATGCTATACCCTTCATCGGGGCAATGTGCTTCGGATTACCAACTTTTATCCCTGTTTACTTCTGGGGAGAAACCTGGAGTAATGCTTGGCATATCACCATGCTTCGGTACATCCTCAACCTAAACATTACTTTCCTGGTCAACAGTGCTGCTCATATCTGGGGATACAAACCTTATGACATCAAAATATTGCCTGCCCAAAATATAGCAGTTTCCATAGTAACCGGCGGCGAAGTTTCCATAACTACCACCACGTTTTTTCCTTGGGATTATCGTGCAGCAGAATTGGGGAACAATTATCTTAATTTGACGACTAAGTTCATAGATTTCTTCGCTTGGATCGGATGGGCTTACGATCTTAAGACGGTGTCCAGTGATGTTATAAAAAGTAAGGCGGAAAGAACTGGTGATGGGACGAATCTTTGGGGTTTAGAAGACAAAGGTGAAGAAGATTTTTTGAAAATCTGGAAAGACAATTAA
SEQ ID NO:43:As_Δ11-去饱和酶氨基酸序列
MAQGVQTTTILREEEPSLTFVVPQEPRKYQIVYPNLITFGYWHIAGLYGLYLCFTSAKWQTILFSFMLVVLAELGITAGAHRLWAHKTYKAKLPLQIILMILNSIAFQNSAIDWVRDHRLHHKYSDTDADPHNATRGFFYSHVGWLLVRKHPEVKRRGKELDMSDIYNNPVLRFQKKYAIPFIGAMCFGLPTFIPVYFWGETWSNAWHITMLRYILNLNITFLVNSAAHIWGYKPYDIKILPAQNIAVSIVTGGEVSITTTTFFPWDYRAAELGNNYLNLTTKFIDFFAWIGWAYDLKTVSSDVIKSKAERTGDGTNLWGLEDKGEEDFLKIWKDN
SEQ ID NO:44:Tni_Δ11-去饱和酶DNA序列；mRNA编码序列。
ATGGCTGTGATGGCTCAAACAGTACAAGAAACGGCTACAGTGTTGGAAGAGGAAGCTCGCACAGTGACTCTTGTGGCTCCAAAGACAACGCCAAGGAAATATAAATATATATACACCAACTTTCTTACATTTTCATATGCGCATTTAGCTGCATTATACGGACTTTATTTGTGCTTCACCTCTGCGAAATGGGAAACATTGCTATTCTCTTTCGTACTCTTCCACATGTCAAATATAGGCATCACCGCAGGGGCTCACCGACTCTGGACTCACAAGACTTTCAAAGCCAAATTGCCTTTGGAAATTGTCCTCATGATATTCAACTCTTTAGCCTTTCAAAACACGGCTATTACATGGGCTAGAGAACATCGGCTACATCACAAATACAGCGATACTGATGCTGATCCCCACAATGCGTCAAGAGGGTTCTTCTACTCGCATGTTGGCTGGCTATTAGTAAAAAAACATCCCGATGTCCTGAAATATGGAAAAACTATAGACATGTCGGATGTATACAATAATCCTGTGTTAAAATTTCAGAAAAAGTACGCAGTACCCTTAATTGGAACAGTTTGTTTTGCTCTTCCAACTTTGATTCCAGTCTACTGTTGGGGCGAATCGTGGAACAACGCTTGGCACATAGCCTTATTTCGATACATATTCAATCTTAACGTGACTTTCCTAGTCAACAGTGCTGCGCATATCTGGGGGAATAAGCCTTATGATAAAAGCATCTTGCCCGCTCAAAACCTGCTGGTTTCCTTCCTAGCAAGTGGAGAAGGCTTCCATAATTACCATCACGTCTTTCCATGGGATTACCGCACAGCAGAATTAGGGAATAACTTCCTGAATTTGACGACGCTGTTCATTGATTTTTGTGCCTGGTTTGGATGGGCTTATGACTTGAAGTCTGTATCAGAGGATATTATAAAACAGAGAGCTAAACGAACAGGTGACGGTTCTTCAGGGGTCATTTGGGGATGGGACGACAAAGACATGGACCGCGATATAAAATCTAAAGCTAACATTTTTTATGCTAAAAAGGAATGA
SEQ ID NO:45:Tni_Δ11-去饱和酶氨基酸序列
MAVMAQTVQETATVLEEEARTVTLVAPKTTPRKYKYIYTNFLTFSYAHLAALYGLYLCFTSAKWETLLFSFVLFHMSNIGITAGAHRLWTHKTFKAKLPLEIVLMIFNSLAFQNTAITWAREHRLHHKYSDTDADPHNASRGFFYSHVGWLLVKKHPDVLKYGKTIDMSDVYNNPVLKFQKKYAVPLIGTVCFALPTLIPVYCWGESWNNAWHIALFRYIFNLNVTFLVNSAAHIWGNKPYDKSILPAQNLLVSFLASGEGFHNYHHVFPWDYRTAELGNNFLNLTTLFIDFCAWFGWAYDLKSVSEDIIKQRAKRTGDGSSGVIWGWDDKDMDRDIKSKANIFYAKKE
SEQ ID NO:45:Sc_FAA DNA序列；mRNA编码序列。
atggccgctccagattatgcacttaccgatttaattgaatcggatcctcgtttcgaaagtttgaagacaagattagccggttacaccaaaggctctgatgaatatattgaagagctatactctcaattaccactgaccagctaccccaggtacaaaacatttttaaagaaacaggcggttgccatttcgaatccggataatgaagctggttttagctcgatttataggagttctctttcttctgaaaatctagtgagctgtgtggataaaaacttaagaactgcatacgatcacttcatgttttctgcaaggagatggcctcaacgtgactgtttaggttcaaggccaattgataaagccacaggcacctgggaggaaacattccgtttcgagtcgtactccacggtatctaaaagatgtcataatatcggaagtggtatattgtctttggtaaacacgaaaaggaaacgtcctttggaagccaatgattttgttgttgctatcttatcacacaacaaccctgaatggatcctaacagatttggcctgtcaggcctattctctaactaacacggctttgtacgaaacattaggtccaaacacctccgagtacatattgaatttaaccgaggcccccattctgatttttgcaaaatcaaatatgtatcatgtattgaagatggtgcctgatatgaaatttgttaatactttggtttgtatggatgaattaactcatgacgagctccgtatgctaaatgaatcgttgctacccgttaagtgcaactctctcaatgaaaaaatcacatttttttcattggagcaggtagaacaagttggttgctttaacaaaattcctgcaattccacctaccccagattccttgtatactatttcgtttacttctggtactacaggtttacctaaaggtgtggaaatgtctcacagaaacattgcgtctgggatagcatttgctttttctaccttcagaataccgccagataaaagaaaccaacagttatatgatatgtgttttttgccattggctcatatttttgaaagaatggttattgcgtatgatctagccatcgggtttggaataggcttcttacataaaccagacccaactgtattggtagaggatttgaagattttgaaaccttacgcggttgccctggttcctagaatattaacacggtttgaagccggtataaaaaatgctttggataaatcgactgtccagaggaacgtagcaaatactatattggattctaaatcggccagatttaccgcaagaggtggtccagataaatcgattatgaattttctagtttatcatcgcgtattgattgataaaatcagagactctttaggtttgtccaataactcgtttataattaccggatcagctcccatatctaaagataccttactatttttaagaagcgccttggatattggtataagacagggctacggcttaactgaaacttttgctggtgtctgtttaagcgaaccgtttgaaaaagatgtcggatcttgtggtgccataggtatttctgcagaatgtagattgaagtctgttccagaaatgggttaccatgccgacaaggatttaaaaggtgaactgcaaattcgtggcccacaggtttttgaaagatattttaaaaatccgaatgaaacttcaaaagccgttgaccaagatggttggttttccacgggagatgttgcatttatcgatgcaaaaggtcgcatcagcgtcattgatcgagtcaagaactttttcaagctagcacatggtgaatatattgctccagagaaaatcgaaaatatttatttatcatcatgcccctatatcacgcaaatatttgtctttggagatcctttgaagacatttttagttggcatcgttggtgttgatgttgatgcagcgcaaccgattttagctgcaaagcacccagaggtgaaaacgtggactaaggaagtgctagtagaaaacttaaatcgtaataaaaagctaaggaaggaatttttaaacaaaattaataaatgcatcgatgggctacaaggatttgaaaaattgcacaacatcaaagtcggacttgagcctttgactctcgaggatgatgttgtgacgccaacttttaaaataaagcgtgccaaagcatcaaaattcttcaaagatacattagaccaactatacgccgaaggttcactagtcaagacagaaaagctttag
SEQ ID NO:47:Sc_FAA2氨基酸序列
MAAPDYALTDLIESDPRFESLKTRLAGYTKGSDEYIEELYSQLPLTSYPRYKTFLKKQAVAISNPDNEAGFSSIYRSSLSSENLVSCVDKNLRTAYDHFMFSARRWPQRDCLGSRPIDKATGTWEETFRFESYSTVSKRCHNIGSGILSLVNTKRKRPLEANDFVVAILSHNNPEWILTDLACQAYSLTNTALYETLGPNTSEYILNLTEAPILIFAKSNMYHVLKMVPDMKFVNTLVCMDELTHDELRMLNESLLPVKCNSLNEKITFFSLEQVEQVGCFNKIPAIPPTPDSLYTISFTSGTTGLPKGVEMSHRNIASGIAFAFSTFRIPPDKRNQQLYDMCFLPLAHIFERMVIAYDLAIGFGIGFLHKPDPTVLVEDLKILKPYAVALVPRILTRFEAGIKNALDKSTVQRNVANTILDSKSARFTARGGPDKSIMNFLVYHRVLIDKIRDSLGLSNNSFIITGSAPISKDTLLFLRSALDIGIRQGYGLTETFAGVCLSEPFEKDVGSCGAIGISAECRLKSVPEMGYHADKDLKGELQIRGPQVFERYFKNPNETSKAVDQDGWFSTGDVAFIDAKGRISVIDRVKNFFKLAHGEYIAPEKIENIYLSSCPYITQIFVFGDPLKTFLVGIVGVDVDAAQPILAAKHPEVKTWTKEVLVENLNRNKKLRKEFLNKINKCIDGLQGFEKLHNIKVGLEPLTLEDDVVTPTFKIKRAKASKFFKDTLDQLYAEGSLVKTEKL
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Claims (47)
1.一种在酵母细胞中产生(Z)-11-十六碳烯-1-醇的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-选自下组各项的Δ11-去饱和酶：脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQID NO:43)和粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-选自下组各项的形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、和Has_FAR(SEQ ID NO:12)或它们的变体，所述变体与Har_FAR(SEQ IDNO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、或Has_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少80％的同源性，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；
ii)从所述酵母细胞表达所述Δ11-去饱和酶和所述FAR；和
iii)在培养基中培养所述酵母细胞，
由此
-所述Δ11-去饱和酶能够将至少部分所述十六碳酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A；并且
-所述FAR能够将至少部分所述(Z)-11-十六碳烯酰辅酶A转化为(Z)-11-十六碳烯醇，
从而获得滴度为至少0.2mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
2.权利要求1的方法，其中所述酵母细胞的属选自下组各项：酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酵母选自下组各项：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、产油油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酵母还能够表达脂酰合成酶(FAA)。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述FAA是Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或Yl_FAA(SEQ ID NO:37)或它们的变体，所述变体与Sc_FAA1(SEQ ID NO:35)或Yl_FAA(SEQ ID NO:37)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述滴度为至少0.25mg/L，例如至少0.3mg/L、例如至少0.4mg/L、例如至少0.5mg/L、例如至少0.75mg/L、例如至少1mg/L、例如至少1.5mg/L、例如至少2.5mg/L、例如至少5.0mg/L、例如至少10mg/L、例如至少15mg/L、例如至少20mg/L、例如25mg/L、例如至少50mg/L、例如至少100mg/L、例如至少250mg/L、例如至少500mg/L、例如至少750mg/L、例如至少1g/L、例如至少2g/L、例如至少3g/L、例如至少4g/L、例如至少5g/L、例如至少6g/L、例如至少7g/L、例如至少8g/L、例如至少9g/L、例如至少10g/L或更高。
7.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：通过表达乙酰基转移酶或通过化学转化将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述乙酰基转移酶是从所述酵母细胞表达的异源乙酰基转移酶(AcT)或从所述酵母细胞过表达的内源乙酰基转移酶，其中所述乙酰基转移酶能够将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，由此进一步产生乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述乙酰基转移酶是Sc_Atf1(SEQ ID NO:39)或其变体，所述变体与Sc_Atf1(SEQ ID NO:39)具有至少75％的同源性、例如至少80％的同源性、例如至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的步骤为化学转化步骤。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中编码Atr_Δ11、FAR、FAA或AcT的基因包含在所述酵母细胞的基因组内或包含在所述酵母细胞中所含的载体内。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中编码Atr_Δ11、FAR、FAA或AcT的基因中的至少一者以高拷贝数存在。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中编码Atr_Δ11、FAR、FAA或AcT的基因中的至少一者受诱导型启动子的控制。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中编码Atr_Δ11、FAR、FAA或AcT的基因中的至少一者是针对所述酵母细胞经密码子优化的。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中：
-所述Δ11-去饱和酶由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQID NO:42或SEQ ID NO:44具有至少85％的同源性、例如至少90％的同源性、例如至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性；和/或
-FAR由与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或与SEQ ID NO:7具有至少90％的同源性、与SEQ ID NO:11具有至少90％的同源性、或与SEQ ID NO:15具有至少90％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15具有至少91％的同源性、例如至少92％的同源性、例如至少93％的同源性、例如至少94％的同源性、例如至少95％的同源性、例如至少96％的同源性、例如至少97％的同源性、例如至少98％的同源性、例如至少99％的同源性、例如100％的同源性；和/或
-FAA由与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36相同或具有下述同源性的核酸序列编码：与SEQID NO:34具有至少％的同源性、例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；和/或
-AcT由与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码，例如至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
16.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括将至少部分(Z)-11-十六碳烯-1-醇转化为(Z)-11-十六碳烯醛的步骤，所述步骤为化学转化步骤。
17.前述权利要求中任一项的方法，所述方法进一步包括回收(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯的步骤。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯通过用疏水性溶剂例如癸烷、己烷或植物油萃取来回收。
19.权利要求18的方法，所述方法进一步包括将回收的(Z)-11-十六碳烯醇、(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯配制成信息素组合物的步骤。
20.权利要求19的方法，其中所述信息素组合物包含1％到100％的(Z)-11-十六碳烯醇、1％到100％的(Z)-11-十六碳烯醛和1％到100％的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
21.权利要求19到20中任一项的方法，其中所述信息素组合物进一步包含一种或多种另外的化合物，所述化合物例如为液体或固体载体或基质。
22.一种信息素组合物，其包含可通过前述权利要求中任一项的方法获得的(Z)-11-十六碳烯-1-醇、(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
23.根据权利要求22的信息素组合物，其包含1％到100％的(Z)-11-十六碳烯醇、1％到100％的(Z)-11-十六碳烯醛和1％到100％的乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯。
24.根据权利要求22到23中任一项的信息素组合物，所述组合物进一步包含一种或多种另外的化合物，所述化合物例如为液体或固体载体或基质。
25.权利要求19到24中任一项所述的信息素组合物用于监测害虫的存在和/或干扰害虫交配的用途。
26.一种监测害虫的存在或干扰害虫交配的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过权利要求1到21中任一项的方法产生(Z)-11-十六碳烯醇和任选的(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯，
ii)将所述(Z)-11-十六碳烯醇和任选的(Z)-11-十六碳烯醛和/或乙酸(Z)-11-十六碳烯-1-基酯配制为信息素组合物，和
iii)采用所述信息素组合物作为害虫综合治理组合物。
27.一种核酸构建体，其包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
28.根据权利要求27的核酸构建体，进一步包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或与SEQ ID NO:34具有至少65％的同源性或与SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36具有至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
29.根据权利要求27到28中一项的核酸构建体，进一步包含与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
30.根据权利要求27到29中任一项的核酸构建体，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个受诱导型启动子的控制。
31.根据权利要求27到30中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体是载体，例如整合载体或复制型载体。
32.根据权利要求27到31中任一项的核酸构建体，其中所述载体是高拷贝复制型载体。
33.根据权利要求27到32中任一项的核酸构建体，其中所述一个或多个核酸序列存在于多个拷贝中，例如至少2个拷贝，例如至少3个拷贝、例如至少4个拷贝、例如至少5个拷贝、例如至少10个拷贝、例如至少20个拷贝、例如至少30个拷贝、例如至少40个拷贝、例如至少50个拷贝、例如至少60个拷贝、例如至少70个拷贝、例如至少80个拷贝、例如至少90个拷贝、例如至少100个拷贝、例如至少125个拷贝、例如至少150个拷贝、例如至少175个拷贝、例如至少200个拷贝。
34.根据权利要求27到33中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体是PCR产物或合成DNA分子。
35.一种酵母细胞，其包含：
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44相同或具有至少80％的同源性的核酸序列，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性；和
-与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％的同源性的核酸序列，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同源性。
36.根据权利要求35的酵母细胞，其进一步包含与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
37.根据权利要求35到36中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步包含与SEQID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列，例如至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
38.根据权利要求35到37中任一项的酵母细胞，其中所述核酸序列中的一个或多个包含在所述酵母细胞的基因组内或包含在所述酵母细胞中所含的核酸构建体内。
39.根据权利要求35到38中任一项的酵母细胞，所述酵母细胞包含至少一种根据权利要求27到34中任一项的核酸构建体。
40.一种能够合成十六碳酰辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞还能够表达：
-选自下组各项的Δ11-去饱和酶：脐橙螟蛾Δ11-去饱和酶(Atr_Δ11；SEQ ID NO:2)、棉贪夜蛾Δ11-去饱和酶(Sl_Δ11；SEQ ID NO:41)、黄地老虎Δ11-去饱和酶(As_Δ11；SEQID NO:43)和粉纹夜蛾Δ11-去饱和酶(Tni_Δ11；SEQ ID NO:45)或它们的变体，所述变体与Atr_Δ11(SEQ ID NO:2)、Sl_Δ11(SEQ ID NO:41)、As_Δ11(SEQ ID NO:43)、或Tni_Δ11(SEQ ID NO:45)具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性、例如至少71％的同源性、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性，和
-选自下组各项的形成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)：Har_FAR(SEQ ID NO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、和Has_FAR(SEQ ID NO:12)或它们的变体，所述变体与Har_FAR(SEQ IDNO:8)、Hs_FAR(SEQ ID NO:16)、或Has_FAR(SEQ ID NO:12)具有至少80％的同源性，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性的变体。
41.根据权利要求40的酵母细胞，其还能够表达FAA。
42.根据权利要求40到41中任一项的酵母细胞，其中所述FAA由与SEQ ID NO:34或SEQID NO:36相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码，例如与SEQ ID NO:34或SEQ IDNO:36具有至少65％的同源性，例如至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
43.根据权利要求40到42中任一项的酵母细胞，其还能够表达乙酰基转移酶。
44.根据权利要求43的酵母细胞，其中所述乙酰基转移酶由与SEQ ID NO:38相同或具有至少65％的同源性的核酸序列编码，例如至少70％的同源性，例如至少71％的同源性，例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如100％的同源性。
45.权利要求40到44中任一项的酵母细胞，其还能够产生(Z)-11-十六碳烯醇。
46.根据权利要求40到45中一项的酵母细胞，其能够产生滴度为至少0.2mg/L的(Z)-11-十六碳烯-1-醇。
47.一种成套试剂盒，其包括根据权利要求40到46中任一项的酵母细胞和/或根据权利要求27到34中任一项的核酸构建体、以及使用说明书。
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