ES2776524T3 - Aparato de fluidos para manipulación de ondas acústicas superficiales de muestras de fluidos, uso de aparatos de fluidos y proceso para la fabricación de aparatos de fluidos - Google Patents

Abstract

Un aparato de fluidos para la manipulación de al menos una muestra de fluido (134), incluyendo el aparato: una superficie de manipulación para la ubicación de la muestra de fluido (134); una capa de material de generación de onda acústica de superficie (SAW) (102), en donde la capa de material de generación de SAW (102) no tiene la forma de una sola capa de cristal, una estructura de electrodo de transductor (112) dispuesta en la capa de material de generación de SAW (102) para proporcionar las SAW en la superficie de manipulación para la interacción con la muestra de fluido (134), caracterizado por que la superficie de manipulación comprende una pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) para afectar la transmisión, la distribución y/o el comportamiento de SAW en la superficie de manipulación, comprendiendo dicha pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) una disposición periódica bidimensional, y en donde la pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) se extienden al menos parcialmente en la capa de material de generación de SAW (102) y cruzan la superficie de la capa de material de generación de SAW (102).

Description

DESCRIPCIÓN

Aparato de fluidos para manipulación de ondas acústicas superficiales de muestras de fluidos, uso de aparatos de fluidos y proceso para la fabricación de aparatos de fluidos

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un aparato de fluidos, usos de dicho aparato y procesos para la fabricación de dicho aparato. De particular, pero no necesariamente exclusivo, interés es la manipulación de muestras de fluido en un contexto de microfluidos. La invención tiene particular, pero no exclusiva, aplicación en la manipulación de gotas líquidas, por ejemplo, en ensayos, análisis, diagnósticos y síntesis médicos, veterinarios y químicos y en la producción de reactivos y productos químicos.

La presente invención se refiere además a métodos para lisar células y al uso de un aparato de fluidos para lisar células en una muestra de fluido. La invención se refiere además a métodos para nebulizar muestras de fluido y al uso de un aparato de fluidos para nebulizar una muestra de fluido. Esto es de interés, por ejemplo, en el tratamiento de una muestra para espectrometría de masas y otras técnicas analíticas. La invención se refiere además a métodos para calentar muestras de fluidos y al uso de un aparato de fluidos para calentar una muestra de fluidos. Aún más, la invención se refiere a métodos para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra usando un aparato de fluidos correspondiente, opcionalmente incluyendo el calentamiento de la muestra.

Técnica relacionada

Los dispositivos de microfluidos son bien conocidos por manejar y analizar pequeños volúmenes de fluidos. Por ejemplo, el documento WO 2005/100953 divulga un sistema para medir la viscosidad de fluidos. Los fluidos se mueven a lo largo de conductos de microfluidos utilizando una bomba térmica.

Enfoques alternativos para el manejo de líquidos microfluidos incluyen el uso de dispositivos de ondas acústicas de superficie, como se describe en el documento US 2007/0140041. En ese documento, se divulga el problema de mezclar dos corrientes de microfluidos en un colector, ya que en las dimensiones de los microfluidos, algunos líquidos fluyen a través del flujo laminar, y la falta de turbulencia dificulta la mezcla. Por consiguiente, el documento US 2007/0140041 busca mejorar la mezcla entre dos flujos de fluidos en un colector de microfluidos utilizando ondas acústicas de superficie (SAW). Un transductor SAW está ubicado en contacto con el colector para promover la mezcla de las corrientes de fluido en la unión del colector.

Las ondas acústicas de superficie (SAW, siendo las más comunes las ondas de Rayleigh) son ondas acústicas que pueden provocar que se desplacen a lo largo de la superficie de un material. Las ondas acústicas superficiales se pueden formar convenientemente en la superficie de un material piezoeléctrico mediante la aplicación de una señal eléctrica adecuada a una disposición de electrodos en la superficie del material piezoeléctrico. Una disposición de electrodos adecuada utiliza electrodos interdigitados, donde un primer electrodo tiene una disposición de dedos de electrodo paralelos que tienen una separación regular entre los dedos. Un segundo electrodo correspondiente de forma similar tiene dedos que sobresalen en los espacios entre los dedos del primer electrodo. La combinación de la disposición del electrodo y el material piezoeléctrico forma un transductor.

Los transductores de SAW son conocidos particularmente por su uso en filtros de frecuencia en dispositivos de telecomunicaciones tales como teléfonos móviles. En tal filtro, hay un transductor de entrada y un transductor de salida. La señal de entrada se aplica al transductor de entrada, para formar una serie de SAW que se propagan al transductor de salida. En el transductor de salida, las SAW se convierten de nuevo en una señal eléctrica. Por ejemplo, Dogheche et al [E. Dogheche, V. Sadaune, X. Lansiaux, D. Remiens, y T. Gryba "Thick LiNbO³ layers on diamond-coated silicon for surface acoustic wave filters" Applied Physics Letters Vol. 81, n.° 7 (12 de agosto de 2002) página 1329] divulga la fabricación de películas piezoeléctricas para filtros SAW. Normalmente, dichos filtros se forman utilizando sustratos piezoeléctricos conocidos tales como cuarzo, LiTaO³ o LiNbO³. Sin embargo, la formación de patrones de electrodos interdigitados adecuados en la superficie de tales sustratos mediante fotolitografía convencional mientras se proporciona un filtro operable hasta frecuencias de telecomunicaciones adecuadas es difícil. Por consiguiente, Dogheche et al. formaron capas piezoeléctricas de LiNbO³ gruesas (alrededor de 1 pm de espesor) sobre silicio recubierto de diamante y demostraron su funcionamiento como filtros SAW a 293 MHz.

También se ha observado que es posible proporcionar estructuras cuasi cristalinas para manipular las SAW. Se ha demostrado que es posible usar varias estructuras de banda fónica para afectar un frente de onda acústica generado en un material piezoeléctrico. Por ejemplo, Wu et al [Wu, T.T., Z.G. Huang, y S.Y. Liu, "Surface acoustic wave band gaps in micro-machined air/silicon phononic structures - theoretical calculation and experiment" Zeitschrift Fur Kristallographie, 2005. 220 (9-10): pág. 841-847] discuten sus investigaciones sobre los espacios de banda fonónica en estructuras formadas por micromecanizado de silicio con una disposición cuadriculada de orificios. El transductor se formó con electrodos interdigitados que tienen dedos paralelos. Además, Wu et al [Wu, T.T., L.C. Wu, y Z.G. Huang, "Frequency band-gap measurement of two-dimensional air/silicon phononic crystals using layered slanted finger interdigital transducers" Journal of Applied Physics, 2005. 97(9): pág. 7] divulgan los resultados de investigaciones usando un cristal fonónico similar usando electrodos con dedos interdigitados no paralelos en forma de abanico. Además, en un artículo puramente teórico, Kuo y Ye [Kuo, C.H. y Z. Ye, "Sonic crystal lenses that obey the lensmaker's formula" Journal of Physics D-Applied Physics, 2004. 37(15): pág. 2155-2159] discuten las propiedades de las estructuras que podrían usarse para enfocar las ondas acústicas.

El término "cristal fonónico" se utiliza como analogía a un "cristal fotónico". En un cristal fotónico, una estructura periódica provoca reflejos debido a la dispersión de la luz incidente, permitiendo así la interferencia entre la luz reflejada y la luz incidente a medida que se propaga a través del "cristal" (que generalmente está formado por una disposición de materiales dieléctricos basados en una matriz regular, tal como un reflector de Bragg), en una o más longitudes de onda y ángulos de incidencia. Esta interferencia se manifiesta como una prevención de la propagación de la luz a través del cristal en una determinada longitud de onda (o rango de longitudes de onda) y dirección. De este modo, hay un "intervalo de banda" de frecuencias en el que la luz no puede propagarse a través del cristal fotónico. Un cristal fonónico, por analogía, tiene una disposición periódica de discontinuidades o variaciones en las propiedades mecánicas del material o materiales que componen el cristal fonónico. Dicho cristal fonónico puede evitar que las ondas acústicas o mecánicas de longitud de onda específica se propaguen a través del cristal. Como las SAW se pueden formar a frecuencias muy definidas, varios grupos han estudiado el efecto de los cristales fonónicos en la propagación de SAW.

Mohammadi et al (2007) [Mohammadi, S., et al., "Complete phononic bandgaps and bandgap maps in twodimensional silicon phononic crystal plates" Electronics Letters, 2007. 43(16): pág. 898-899] divulga la formación de estructuras de separación de banda fonónicas completas usando una matriz cuadrada de orificios o una matriz hexagonal de orificios en una placa de silicio. En una publicación del mismo grupo, Mohammadi et al (2008) [Mohammadi, S., et al., "Evidence of large high frequency complete phononic band gaps in silicon phononic crystal plates" Applied Physics Letters, 2008. 92(22): pág. 3] analiza la formación de grandes espacios de banda fonónica completa utilizando una matriz hexagonal de orificios a través de una placa de silicio.

Olsson et al [Olsson, R.H., et al., "Microfabricated VHF acoustic crystals and waveguides" Sensors and Actuators a-Physical, 2008. 145: pág. 87-93] divulga la formación de bandas acústicas en una estructura formada mediante la inclusión de conjuntos periódicos de dispersores de tungsteno en una matriz de sílice. Las guías de onda para las ondas acústicas se proporcionan eliminando los dispersores seleccionados a lo largo de una ruta deseada.

Vasseur et al [Vasseur, J.O. et al., 2008. Bandas prohibidas absolutas y guiado de ondas en placas de cristal fotónicas de dos dimensiones. Physical Review B (Condensed Matter and Materials Physics), 77(8), 085415-15] expuso un estudio de huecos de banda fonónicos en una placa de cristal fonónico bidimensional formada por conjuntos de cilindros de un primer material en una placa de un segundo material.

El documento US 2008/0211602 divulga un dispositivo de onda acústica con una capa piezoeléctrica con electrodos transductores formados sobre un sustrato, habiendo un espejo acústico omnidireccional formado entre la capa piezoeléctrica y el sustrato.

Otros trabajadores han utilizado SAW en la manipulación de líquidos. Por ejemplo, Renaudin et al [A. Renaudin, P. Tabourier, V. Zhang, J.C. Camart and C. Druon "SAW nanopump for handling droplets in view of biological applications" Sensors and Actuators B, 113, 2006, pág. 389] informan sobre la fabricación y el desarrollo de un dispositivo SAW para microfluidos para aplicaciones biológicas. Las SAW a aproximadamente 20 MHz son generadas por transductores de electrodos interdigitados colocados sobre un sustrato piezoeléctrico LiNbO³. Las gotas se transportan a lo largo de la superficie del transductor donde se proporcionan micropistas hidrofílicas entre las áreas hidrofóbicas. Además, el mismo grupo de investigación [Renaudin, A. et al., 2009. Monitorización de microgotas accionadas por SAW en vista de aplicaciones biológicas. Sensors and Actuators B: Chemical, 138(1), 374-382] establece un método para determinar la posición de la gota usando señales de eco detectadas por transductores interdigitados.

Du et al [Du, X.Y. et al., 2009. Bombas de microfluidos que emplean ondas acústicas de superficie generadas en películas finas de ZnO. Journal of Applied Physics, 105(2), 024508-7] proponen el uso de películas delgadas de ZnO sobre sustratos de Si para formar bombas microfluídicas de superficie accionadas por ondas acústicas.

Frommelt et al [Frommelt, T. et al., 2008. Patrones de flujo y transporte en corrientes de ondas acústicas de superficie de Rayleigh: método de elementos finitos combinados y numéricos de trazado de rayos respecto a experimentos. Ultrasonics, Ferroelectrics and Frequency Control, IEEE Transactions on, 55(10), 2298-2305] investigan los patrones de flujo de líquido y transporte de partículas dentro de una gota sometida a ondas acústicas superficiales.

Shi et al [Shi, J. et al., 2008. Focalización de micropartículas en un canal de microfluido con ondas acústicas de superficie de soporte (SSAW). Lab on a Chip, 8(2), 221-223] proponen el uso de transductores interdigitados opuestos para formar una disposición alineada de cuentas que se mueven a lo largo de un canal.

Wu y Chang [Wu, T. & Chang, I., 2005. Actuación y detección de microgotas usando transductores interdigitales de dedos inclinados. Journal of Applied Physics, 98(2), 024903-7] divulgan el movimiento de las gotas en un sustrato SAW mediante el control de la señal aplicada a los transductores interdigitados que tienen los dedos dispuestos en una configuración inclinada.

Tan et al [Tan, M.K., J.R. Friend, y L.Y. Yeo, "Microparticle collection and concentration via a miniature surface acoustic wave device" Lab on a Chip, 2007. 7(5): pág. 618-625] divulga el uso de SAW para recoger micropartículas tales como partículas de polen en una gota de agua. Se transporta una gota de agua a lo largo de un transductor SAW a través de una vía fluida. También se ha descrito la concentración de micropartículas en gotas por aplicación asimétrica de ondas acústicas de superficie. Las técnicas descritas para romper la simetría de una onda acústica de superficie implican alinear una gota en el borde de un transductor interdigital de electrodo paralelo [A. Zhang W. Liu, Z. Jiang y J. Fei, Appl. Acoust., 2009, 70, 1137-1142.], posicionando un gel para absorber parcialmente la reflexión de las ondas acústicas superficiales (de manera que solamente parte de la gota está en la ruta de transmisión) [H. Li, J.R. Friend and L.Y.

Yeo, Biomed. Microdev., 2007, 9, 647-656], o usando un IDT más complejo que enfoca la onda acústica superficial [R Shilton, M. Tan y L. Yeo, y J. Friend, J. Appl. Phys., 2008, 104, 014910] utilizando transductores circulares con una frecuencia fija y vía de excitación.

Bennes et al [J. Bennes, S Alzuage, F. Cherioux, S. Ballandras, P. Vairac, J-F Manceau y F. Bastien, "Detection and high-precision positioning of liquid droplets using SAW systems" IEEE Transactions on Ultrasonics Ferroelectrics and Frequency Control, 2007, 54(10): p. 2146-2151] divulgan la detección y el posicionamiento de gotas usando SAW. Los dispositivos SAW utilizados están formados por sustratos de niobato de litio (LiNbO³ cortado (XY1)/128°). Bennes et al explican que las gotas se mueven debido a la refracción de las sierras entrantes a lo largo de la superficie del sustrato en la interfaz aire/líquido, produciendo una fuerza resultante que puede tener un componente dirigido a lo largo de la superficie del sustrato. El sustrato de LiNbO³ se trata para hacerlo hidrófobo; esto aumenta el ángulo de contacto con una gota acuosa y disminuye la fuerza requerida para mover la gota por interacción con las SAW.

El documento WO 02071051 divulga la eyección acústica de muestras biomoleculares para espectrometría de masas.

El documento WO 2007/128046 A1 divulga el uso de un transductor SAW para atomizar una gota de líquido de un sustrato acoplado a un transductor piezoeléctrico mediante una capa de acoplamiento de fluido, formando así nanocristales de zeolita.

Los sistemas de fluidos pueden ser útiles en el análisis de muestras biológicas, por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico de punto de atención y biosensores portátiles. Sin embargo, las muestras biológicas presentan un desafío particular para la manipulación y análisis de muestras en fluídica, particularmente microfluídica. La preparación de muestras biológicas es a menudo compleja, involucrando múltiples etapas. En particular, para una muestra biológica que contiene células, la molécula de interés puede ser una molécula intracelular, de modo que la preparación de la muestra requiere una etapa de disrupción celular para hacer que las moléculas intracelulares sean accesibles para el análisis y aplicaciones tales como inmunodiagnósticos y detección de patógenos.

Hay varias formas de romper las células para liberar moléculas intracelulares para su análisis. Las células están encerradas por una bicapa lipídica llamada membrana plasmática (también conocida como membrana celular o membrana citoplasmática), que define los límites de la célula. La disrupción celular por ruptura de la membrana plasmática se denomina lisis celular, y esto puede lograrse mediante varios métodos químicos y físicos.

Un procedimiento típico de lisis química implica numerosas etapas, incluyendo la adición de agentes líticos (por ejemplo, enzimas, detergentes), lavado (generalmente usando etapas de centrifugación) y elución de las muestras procesadas para su posterior análisis. Los procedimientos de lisis física incluyen calentamiento y métodos mecánicos, tales como agitación con partículas pequeñas (por ejemplo, cuentas de vidrio) y sonicación (o ultrasonidos). La sonicación generalmente implica transmitir energía mecánica, a través de una sonda sumergida que oscila con alta frecuencia, a una solución que contiene células en suspensión, y la cavitación resultante (la creación y el colapso de burbujas microscópicas) rompe las células en la muestra.

Los procedimientos químicos de lisis celular se han integrado en los sistemas microfluídicos [P. Sethu, M. Anahtar, L. L. Moldawer, R. G. Tompkins, y M. Toner, Dispositivo de microfluidos de flujo continuo para lisis de eritrocitos rápida, Anal. Chem. 2004, 76, 6247-6253; X. Chen, D. F. Cui y C. C. Liu, Lisis celular en línea y extracción de ADN en un biochip de microfluido fabricado por tecnología de sistema microelectromecánico, Electrophoresis 2008, 29, 1844-1851]. Sin embargo, estos métodos requieren agentes líticos, que pueden diluir significativamente la molécula de interés y comprometer así la sensibilidad de las etapas de detección posteriores. Estos métodos también requieren un engorroso sistema de conducción de líquidos para mover los líquidos alrededor del chip, lo cual no es práctico para aplicaciones de punto de atención. La eliminación de los agentes líticos y/o eluyentes puede ser necesaria para el procesamiento o análisis aguas abajo de la muestra, por ejemplo, porque estos agentes inhiben las reacciones (por ejemplo, la amplificación de ácidos nucleicos basada en PCR) o porque comprometen la molécula de interés.

Se han desarrollado técnicas para la lisis de células sin químicos en muestras en plataformas microfluídicas. Estas incluyen calentamiento [S. Baek, J. Min y J.-H. Park, Calentamiento por inducción inalámbrica en un dispositivo microfluido para lisis celular, Lab on a Chip, 2010, 10, 909-917], aplicando un campo eléctrico [D. W. Lee, Y.-H. Cho, Un dispositivo eléctrico de lisis celular continuo que utiliza una baja tensión de C^c para el transporte y la ruptura celular, Sensors and Actuators B, 2007, 124, 84-89], o usando fuerzas mecánicas para romper las células por la acción combinada de campos magnéticos [J. Siegrist R. Gorkin, M. Bastien, G. Stewart, R. Peytavi, H. Kido, M. Bergeron y M. Madou, Validación de una plataforma centrífuga de lisis y homogeneización de muestras microfluídicas para extracción de ácido nucleico con muestras clínicas, Lab on a Chip, 2010, 10, 363 - 371], mediante el uso de estructuras de filtro [D. Di Carlo, K.-H. Jeong y L. P. Lee, Lisis celular mecánica sin reactivos mediante púas a nanoescala en microcanales para la preparación de muestras, Lab on a Chip, 2003, 3, 287-291] o por ultrasonidos [M. T. Taylor, P. Belgrader, B. J. Furman, F. Pourahmadi, G. T. A. Kovacs y M. A. Northrup, Lisificación de esporas bacterianas por sonicación a través de una interfaz flexible en un sistema microfluídico, Analytical Chemistry 2001, 73, 492-496 y M.T. Taylor, Aparato y método para la disrupción rápida de células o virus, WO03055976 (Cepheid, Inc.)].

Sin embargo, el calor, los campos eléctricos o la cavitación pueden comprometer las moléculas de interés. La lisis eléctrica puede integrarse en un chip de microfluidos con otras funciones [J. Cheng, E. L. Sheldon, L. Wu, A. Uribe, L. O. Gerrue, J. Carrino, M. J. Heller, J. P. O'Connell, Preparación y análisis de hibridación de ADN/ARN de E. coli en chips bioelectrónicos microfabricados, Nature Biotechnology, 1998, 16, 541-546], pero otros métodos de lisis física requieren la adición de accionamientos externos en el sistema para mover los fluidos alrededor del chip, de manera similar a las plataformas de lisis basadas en productos químicos. Esta ha sido una dificultad particular que obstaculiza el desarrollo de soluciones totalmente integradas de "muestra a respuesta" para el diagnóstico molecular [P. Yager, T. Edwards, E. Fu, K Helton, K. Nelson, M. R. Tam y B. H. Weigl, Tecnologías de diagnóstico de microfluidos para la salud pública mundial, Nature, 2006, 442, 412-418].

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el trabajo expuesto en el documento PCT/GB2010/001600 (no publicado el 2 de febrero de 2011, pero publicado como WO2011/023949 el 3 de marzo de 2011). En esa solicitud de patente, se divulga un aparato de fluidos en el que se manipula una muestra fluida utilizando ondas acústicas de superficie (SAW). La transmisión, la distribución y/o el comportamiento de las SAW se ve afectada por una disposición de elementos de dispersión de ondas acústicas de superficie (SAW) en el aparato.

En el documento PCT/GB2010/001600, las SAW se generan utilizando una estructura de electrodo de transductor interdigitado en una oblea de cristal único de LiNbO³ piezoeléctrica de propagación en X de 128°. Las obleas de cristal único de LiNbO³ son caras. Por lo tanto, la divulgación en el documento PCT/GB2010/001600 es permitir el acoplamiento entre la oblea monocristalina piezoeléctrica de LiNbO³ y un superestrato extraíble, las SAW generadas por la oblea monocristalina piezoeléctrica de LiNbO³ se transmiten al superestrato a través de un medio de acoplamiento. Es entonces el superestrato que proporciona una superficie de manipulación de la muestra y la disposición requerida de los elementos de dispersión de SAW. La ventaja de esto es que se puede permitir que la muestra contamine solo el superestrato y no la oblea monocristalina piezoeléctrica de LiNbO³. A continuación, se puede eliminar el superestrato y la oblea monocristalina piezoeléctrica de LiNbO³ se puede reutilizar con un nuevo sustrato y una nueva muestra. Esto es rentable, dado que el superestrato puede fabricarse de manera relativamente eficiente, por ejemplo, mediante moldeo.

Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que el aparato descrito anteriormente, aunque ventajoso en muchos aspectos, es susceptible de alguna mejora. En particular, el rendimiento del aparato puede depender en gran medida de la alineación entre el transductor piezoeléctrico y los elementos de dispersión sAw en el superestrato. En la situación en la que el usuario controla la alineación (por ejemplo, al reemplazar un superestrato con un superestrato nuevo), el rendimiento posterior del aparato puede ser difícil de predecir. Además, el rendimiento del dispositivo depende de manera similar del acoplamiento entre el transductor piezoeléctrico y el superestrato. Con todo esto en mente, todavía se prefiere usar dicho aparato en aplicaciones de diagnóstico y otras aplicaciones, en las que el aparato no puede ser utilizado de manera realista más de una vez, debido a posibles problemas de contaminación.

La presente invención pretende solucionar al menos uno de estos problemas. Preferentemente, la presente invención reduce, mejora, evita o incluso supera al menos uno de estos problemas.

Por consiguiente, en un primer aspecto preferido, la presente invención proporciona un aparato de fluidos como se expone en la reivindicación 1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un uso de un aparato de fluidos como se expone en la reivindicación 14.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la fabricación de un aparato de fluidos como se expone en la reivindicación 16.

Ahora se expondrán características preferidas u opcionales de la invención. Estas pueden aplicarse individualmente o en cualquier combinación con cualquier aspecto de la invención, a menos que el contexto exija lo contrario.

Los inventores consideran (sin desear estar limitados por la teoría) que las SAW tienden a refractarse al menos parcialmente en la muestra de fluido. Esta refracción se debe a que la muestra de fluido tiene, en general, una velocidad de propagación diferente para las SAW en comparación con el sustrato. Esto produce transmisión en la muestra de fluido. Por consiguiente, se considera que este es el origen del movimiento de la muestra bajo la influencia de las SAW.

Es posible que la muestra de fluido tenga la forma de una gota, por ejemplo, una gota tal como una gota de microfluido. Sin embargo, otras disposiciones son posibles para la muestra de fluido, por ejemplo, un canal de fluido, o un fluido retenido en una cámara. En la siguiente discusión, se utiliza el término "gota", pero como se analizó anteriormente, se pretende que la invención no se limite necesariamente a la manipulación de gotas.

El fluido puede comprender un líquido. Además, el fluido puede comprender una o más partículas. Por ejemplo, el fluido puede ser un líquido que contiene partículas sólidas (o sustancialmente sólidas). De particular interés son los fluidos que comprenden una suspensión de partículas sólidas en un vehículo líquido.

El volumen de la muestra de fluido depende de la aplicación del aparato. Por ejemplo, el volumen de la muestra de fluido puede ser de al menos 1 picolitro. Más preferentemente, el volumen de la muestra de fluido es de al menos 10 picolitros, al menos 100 picolitros o al menos 500 picolitros. Se contemplan mayores volúmenes, por ejemplo, al menos 1 nanolitro, al menos 10 nanolitros, al menos 100 nanolitros o al menos 500 nanolitros. Volúmenes aún más grandes son posibles en algunas aplicaciones, por ejemplo, al menos 1 microlitro o al menos 10 microlitros. El límite superior preferido para el volumen de la muestra de fluido es de aproximadamente 5 mililitros, más preferiblemente aproximadamente 1 mililitro, aún más preferiblemente aproximadamente 0,1 mililitros.

La superficie de manipulación puede tratarse para proporcionarle hidrofobicidad. Por ejemplo, un ángulo de contacto entre una gota de agua y una región plana de la superficie de manipulación no puede ser inferior a 65 grados.

La capa de material de generación de SAW se puede formar a partir de cualquier material adecuado para generar ondas acústicas de superficie. Se pueden generar SAW, por ejemplo, mediante un proceso piezoeléctrico, mediante un proceso magnetostrictivo, mediante un proceso electroestrictivo, mediante un proceso ferroeléctrico, mediante un proceso piroeléctrico, o mediante un proceso electromagnético. Lo más preferido es que la capa de material de generación SAW se forme a partir de una capa piezoeléctrica. En la divulgación que se establece a continuación, se utiliza el término "capa piezoeléctrica", pero se entiende aquí que se aplicarían consideraciones similares a las capas de material de generación de SAW formadas, por ejemplo, de materiales magnetostrictivos. Por lo tanto, a menos que el contexto exija lo contrario, las características opcionales establecidas en relación con la "capa piezoeléctrica" deben entenderse como que se aplican de manera más general a la capa de material de generación SAW, cuando está formado de cualquier material adecuado.

Los presentes inventores consideran que la invención no se limita necesariamente a la manipulación de una muestra de fluido. Las muestras que pueden considerarse sólidas o sustancialmente sólidas (por ejemplo, heces) pueden manipularse utilizando el aparato, de la manera expuesta con más detalle a continuación.

Preferentemente, la capa piezoeléctrica se forma sobre un soporte. El soporte puede simplemente proporcionar soporte mecánico para la capa piezoeléctrica. El soporte puede estar formado de material plástico. En el proceso de fabricación del aparato, el soporte puede retirarse si el resto del aparato es autoportante.

La estructura del electrodo del transductor puede formarse sobre o debajo de la capa piezoeléctrica. Sin embargo, preferiblemente la estructura del electrodo del transductor está al menos parcialmente incrustada en la capa piezoeléctrica. Esto se prefiere para que sea posible que la superficie de la estructura del electrodo del transductor sea continua con la superficie de la capa piezoeléctrica. Esto permite simplificar la construcción del aparato, y puede permitir características de flujo mejoradas de la muestra de fluido en el aparato. Preferentemente, la estructura del electrodo del transductor tiene una disposición de electrodos interdigitados. En algunas realizaciones, se prefiere que el transductor sea sintonizable, de modo que la posición lateral del tren de emisión de SAW sea móvil. Por ejemplo, la disposición inclinada interdigitada de electrodos sugerida por Wu y Chang [Wu, T. & Chang, I., 2005. Actuación y detección de microgotas usando transductores interdigitales de dedos inclinados. Journal of Applied Physics, 98(2), 024903-7] puede usarse para el transductor. Las disposiciones inclinadas interdigitadas de electrodos adecuados para su uso en la presente invención se describen con más detalle a continuación.

La superficie de manipulación puede ser una superficie de un superstrato acoplado a la capa piezoeléctrica. En ese caso, preferiblemente el superestrato está permanentemente acoplado a la capa piezoeléctrica, en el sentido de que no es extraíble de la capa piezoeléctrica sin dañar el aparato. Preferentemente, el superestrato se forma en registro con la capa piezoeléctrica, determinándose este registro en el momento de la fabricación del dispositivo. El superestrato puede formarse sobre o debajo de la capa piezoeléctrica. El superestrato puede ser una película formada en la capa piezoeléctrica. La película puede tener un espesor de 5 pm o menos, más preferiblemente un espesor de 1 pm o menos. El superestrato aquí también puede funcionar como soporte para la capa piezoeléctrica. Por ejemplo, el superestrato puede ser la capa de soporte sobre la cual se deposita la capa piezoeléctrica durante la etapa de deposición. Debe tenerse en cuenta que el soporte puede, durante el uso, estar ubicado arriba o debajo de la capa piezoeléctrica.

Sin embargo, preferiblemente la superficie de manipulación es una superficie de la capa piezoeléctrica. Esto se prefiere porque evita la necesidad de la formación de un superestrato en registro con la capa piezoeléctrica. En algunas circunstancias, la superficie de la capa piezoeléctrica puede tratarse para hacerla compatible con la muestra de fluido de interés. En estas circunstancias, la capa piezoeléctrica incluye capas piezoeléctricas tratadas en superficie y pasivadas en superficie. Previamente, con el uso de transductores piezoeléctricos monocristalinos, se ha considerado antieconómico permitir la contaminación de la superficie piezoeléctrica con la muestra, ya que esto puede significar que el transductor piezoeléctrico no puede reutilizarse.

Sin embargo, los presentes inventores se han dado cuenta de que es posible fabricar dispositivos adecuados usando capas piezoeléctricas sin cristal único, utilizando procesos de deposición de capa piezoeléctrica que son adecuados para la fabricación económica de procesamiento en masa. La superficie de manipulación puede extenderse, por ejemplo, la longitud completa y/o el ancho completo y/o la altura completa del aparato. En este caso, un extremo largo y/o un extremo ancho y/o un extremo alto del aparato pueden dispersar adicionalmente las ondas acústicas de la superficie. Sin embargo, preferiblemente el al menos un elemento de dispersión de SAW está formado interiormente de una envoltura exterior de la superficie de manipulación definida por la longitud total y/o el ancho completo y/o la altura total del aparato.

En algunas realizaciones, el al menos un elemento de dispersión de SAW incluye un cambio gradual en la altura de la superficie de manipulación. El elemento de dispersión de SAW puede incluir una cresta formada en la superficie de manipulación. El elemento de dispersión de SAW puede incluir una ranura formada en la superficie de manipulación. Más generalmente, el al menos un elemento de dispersión SAW puede incluir un cambio que se extiende linealmente en el perfil de la superficie de manipulación.

Se proporcionan una pluralidad de elementos de dispersión de SAW. Estos preferiblemente cooperan para proporcionar el efecto requerido en la transmisión, distribución y/o comportamiento de SAW en la superficie de manipulación.

Los elementos de dispersión de SAW tienen una disposición basada en una disposición periódica. La disposición periódica es una disposición bidimensional. La naturaleza periódica puede ser, por ejemplo, simetría traslacional y/o simetría rotacional. El término "basado en" se usa aquí porque se considera que la disposición no necesita ser precisamente periódica. Además, la disposición puede desplazarse deliberadamente de una disposición periódica verdadera para proporcionar un efecto específico sobre las ondas acústicas de la superficie. Por ejemplo, la disposición puede desplazarse progresivamente desde una disposición periódica verdadera con distancia desde un cierto punto de partida en la disposición. Además, la disposición puede incluir una o más áreas o líneas de periodicidad defectuosa en la disposición periódica. En algunos casos, la periodicidad se puede variar en medio de un solo cristal mediante el uso de gradientes, sobre el cual se varía el paso y/o el tamaño de los elementos. Esta variación en la periodicidad puede tener aplicaciones en guía de ondas o lentes (enfocando la potencia acústica).

Normalmente, la disposición periódica es un patrón bidimensional, en que la periodicidad se extiende en dos dimensiones. Patrones periódicos adecuados incluyen patrones reticulares simétricos traslacionales tales como tetragonal, cuadrado, trigonal, hexagonal, Otros patrones periódicos adecuados incluyen patrones rotacionalmente simétricos, por ejemplo, tener una simetría rotacional de menos de 360 grados.

Los elementos de dispersión de SAW se forman al menos parcialmente dentro de la capa piezoeléctrica. Por consiguiente, en la siguiente discusión sobre los elementos de dispersión de SAW, se describen con referencia a la capa piezoeléctrica.

Los elementos de dispersión de SAW pueden ser elementos que proporcionan una interfaz capaz de una dispersión significativa de SAW. Preferentemente, en la interfaz, hay un cambio brusco en el módulo elástico (por ejemplo, el módulo de Young) "visto" por las SAW. Esto se puede lograr formando cada elemento de dispersión a partir de un material diferente en comparación con el material de la capa piezoeléctrica, teniendo el material diferente normalmente una densidad diferente en comparación con el material de la capa piezoeléctrica. Por ejemplo, uno o más de los elementos de dispersión pueden estar formados por un vacío en la superficie de la capa piezoeléctrica. El vacío puede estar lleno de gas, por ejemplo, lleno de aire. Como alternativa, el vacío puede llenarse con un material sólido o líquido diferente en comparación con el material del resto de la capa piezoeléctrica. Llenar el vacío con un material sólido de contraste (por ejemplo, que contrasta mecánicamente, estructuralmente o funcionalmente) es deseable, porque permite que la capa piezoeléctrica se forme con una superficie lisa, por lo tanto, permitiendo que la gota se mueva a través de la disposición de elementos de dispersión si es necesario. El contraste en las propiedades mecánicas entre la capa piezoeléctrica y los elementos de dispersión puede modificarse durante el uso, por ejemplo, mediante la aplicación de un estímulo externo tal como calor.

Los elementos de dispersión preferiblemente se cruzan con la superficie de la capa piezoeléctrica. Esto se prefiere, ya que son para dispersar ondas acústicas de superficie, que son predominantemente fenómenos superficiales. Sin embargo, los elementos de dispersión pueden extenderse a una profundidad distinta de cero en la capa piezoeléctrica. Por ejemplo, pueden extenderse al menos un 5 % en el espesor de la capa piezoeléctrica. Pueden extenderse más allá de esto, por ejemplo, al menos un 10 %, al menos un 20 % o más en el espesor de la capa piezoeléctrica. En algunas circunstancias, los elementos de dispersión pueden extenderse a través del espesor completo de la capa piezoeléctrica, aunque una profundidad de aproximadamente la mitad del espesor de la capa piezoeléctrica es ventajosa.

Los elementos de dispersión pueden ser hoyos en la capa piezoeléctrica. Como alternativa, los elementos de dispersión pueden ser pilares verticales de la superficie de la capa piezoeléctrica.

Normalmente, los elementos de dispersión son de forma cilíndrica (por ejemplo, circular u ovalada cilíndrica), o pueden ser de forma prismática o poligonal. Como alternativa, los elementos de dispersión pueden ser crestas o ranuras en la capa piezoeléctrica. Tales formas pueden tener una forma recta, pero alternativamente puede tener una forma curva o angulada. Como se ha analizado anteriormente, un elemento de dispersión puede tomar la forma de un escalón en la superficie de la capa piezoeléctrica.

Preferentemente, la superficie de manipulación incluye al menos una zona de dispersión y al menos una zona de manipulación de muestras. Los elementos de dispersión de SAW pueden estar dispuestos en la zona de dispersión, proporcionando la zona de dispersión en uso una transmisión diferente, distribución y/o comportamiento de ondas acústicas de superficie en comparación con la zona de manipulación de muestras.

La disposición de los elementos de dispersión de SAW proporciona preferiblemente, en efecto, una estructura de cristal fonónico que interactúa o afecta el campo acústico en la superficie de manipulación. Los elementos de dispersión pueden proporcionar varios efectos en las SAW. Además del efecto de concentración mencionado anteriormente, los elementos de dispersión pueden reflejar (o reflejar parcialmente) las SAW, y/o pueden difractar (o difractar parcialmente) las SAW, y/o pueden refractar (o refractar parcialmente) las SAW. De manera adicional o alternativa, puede haber patrones de interferencia permanentes de SAW en la superficie del sustrato. Por ejemplo, la disposición del elemento de dispersión concentra preferiblemente de manera efectiva las SAW en una región de la superficie de manipulación.

Los elementos de dispersión pueden tener un espacio vecino más cercano de elemento a elemento de al menos 10 |jm. Esto es adecuado para SAW en la región de MHz (por ejemplo, de frecuencia de alrededor de 100 MHz). Más preferentemente, este espacio es de al menos 20 jm, al menos 40 jm, al menos 60 jm, al menos 80 jm, o al menos 100 jm. Este espacio puede ser como máximo de 5 mm (correspondiente a SAW de frecuencia relativamente baja), más preferentemente como máximo 4 mm, más preferentemente como máximo 3 mm, más preferentemente como máximo 2 mm, más preferentemente como máximo 1 mm, más preferentemente como máximo 0,9 mm, a lo sumo 0,8 mm, a lo sumo 0,7 mm, a lo sumo 0,6 mm. Por ejemplo, se ha demostrado que es adecuado un espacio vecino más cercano de elemento a elemento en el rango de 200-500 jm. Para frecuencias más altas, por ejemplo, en el intervalo de GHz, se contemplan espacios más pequeños, por ejemplo, en el rango de al menos 1 jm.

Preferentemente, la manipulación de la muestra de fluido incluye uno o más de: movimiento de la muestra a lo largo de la zona de manipulación de la muestra; división de la muestra; combinación de dos o más muestras; atomización de la muestra desde la zona de manipulación de la muestra; calentamiento de la muestra; concentración de especies en la muestra; mezcla de la muestra; clasificación de muestras de fluidos; clasificación de partículas o células dentro de muestras de fluidos.

Preferentemente, la manipulación de la gota incluye el movimiento de la gota a lo largo de la zona de manipulación de la muestra. La zona de manipulación de la muestra puede definir una pista para el movimiento de gotas. De manera adicional o alternativa, La manipulación de la gota incluye la atomización de la gota desde la zona de manipulación de la muestra.

Cuando se manipulan dos o más gotas usando el aparato, es posible que las gotas tengan diferentes características, por ejemplo, composición diferente, temperatura diferente, diferente viscosidad, diferentes especies arrastradas (por ejemplo, material biológico, partículas, soluto, etc.). En este caso, la manipulación de las gotas puede incluir la mezcla de las gotas. La mezcla se puede lograr moviendo las gotas a lo largo de las pistas correspondientes a una zona de mezcla, donde las gotas se encuentran y se mezclan para formar una o más gotas mixtas. La gota mezclada puede entonces moverse hacia adelante desde la zona de mezcla a lo largo de una pista adicional.

El funcionamiento del aparato puede permitir la división de una gota en dos o más gotas hijas. Cada gota hija se puede transportar hacia adelante a lo largo de las pistas respectivas o a lo largo de la misma pista.

La pista aquí define la ruta prevista para la gota. La pista puede ser recta, curvada, doblada, angulada, ahorquillada, dividida o unida con otra pista. La pista puede estar provista de una superficie hidrofílica, normalmente delimitada por una o más áreas hidrofóbicas. En el caso de una muestra acuosa, esto puede ayudar a limitar la gota a la pista. La operación del aparato puede permitir además la concentración de una especie en una o más gotas. Esto se puede lograr, por ejemplo, al permitir que las SAW interactúen con la gota para calentar la gota, acelerando así la evaporación del solvente. Como alternativa, el campo acústico puede controlarse mediante una disposición apropiada de elementos de dispersión y un control adecuado de la señal de activación a los transductores para conducir la especie preferentemente hacia una parte de la gota. Por ejemplo, se puede configurar una cavidad acústica para proporcionar una disposición de onda estacionaria, que se ha demostrado que proporciona concentración de partículas [Shi, J. et al., 2008. Focalización de micropartículas en un canal de microfluido con ondas acústicas de superficie de soporte (SSAW). Lab on a Chip, 8(2), 221-223]. Calentar sin promover deliberadamente la evaporación es de interés por derecho propio, por ejemplo, para aplicaciones de PCR (reacción en cadena de polimerasa) para ADN o ARN.

La operación del aparato también puede permitir la concentración de una especie en una o más gotas al inducir la transmisión dentro de la gota, cuya transmisión concentra especies en un lugar dentro de la gota. En el contexto de la presente invención, este tipo de concentración puede denominarse "centrifugación" (aunque no represente una centrifugación verdadera) ya que produce un depósito de especies en forma de "cuenta" dentro del "sobrenadante" de la gota líquida, y puede separar partículas en el muestra fluida de la fase fluida. Esta concentración se puede lograr al proporcionar SAW a la gota para inducir la transmisión rotacional en la gota, por ejemplo, proporcionando SAW a la gota asimétricamente (es decir, de tal manera que la distribución de las SAW sea asimétrica con respecto al centro de la huella de la gota). Preferentemente, la superficie de manipulación incluye una disposición de elementos de dispersión de SAW dispuestos para dispersar las SAW proporcionadas en la superficie de manipulación en una configuración para inducir la transmisión por rotación en la gota. La gota se puede colocar en la superficie de manipulación en una posición relativa a los elementos de dispersión de SAW de modo que las SAW estén parcialmente dispersadas por los elementos de dispersión y la gota reciba las SAW distribuidas asimétricamente con respecto al centro de la huella de la gota.

La zona de manipulación de muestra puede incluir al menos un sensor de gotas. El sensor de gotas puede operar para detectar la presencia de una gota. Uno o más sensores de gotas pueden estar dispuestos secuencialmente para detectar la presencia de una gota a lo largo de una pista. De esta manera, el aparato puede operar para detectar el movimiento de una gota a lo largo de una pista. La detección de gotas se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando la ubicación del eco como lo discutieron Renaudin et al [Renaudin, A. et al., 2009. Monitorización de microgotas accionadas por SAW en vista de aplicaciones biológicas. Sensors and Actuators B: Chemical, 138(1), 374-382]. Como alternativa, La detección de gotas puede llevarse a cabo utilizando medios de formación de imágenes, tal como una cámara.

El sustrato puede tener más de una zona de manipulación de muestras. Se puede proporcionar una serie de zonas de manipulación de muestras, en comunicación entre las mismas, la gota se transfiere de una zona de manipulación de muestras a la siguiente. Como un ejemplo, una primera zona de manipulación de muestras puede proporcionar movimiento de gotas desde una primera ubicación a una segunda ubicación. Una segunda zona de manipulación de muestras puede proporcionar una etapa de mezcla donde la gota, recibida desde la primera zona de manipulación de muestras, se mezcla (por ejemplo, con otra gota o simplemente se mezcla para mezclar su propio contenido) y puede proporcionar un movimiento hacia adelante de la gota mezclada. Una tercera zona de manipulación de muestras puede proporcionar una etapa de atomización donde la gota mezclada, recibida desde la segunda zona de manipulación de muestras, se atomiza. Esta etapa de atomización puede ser para el análisis de la gota, por ejemplo, usando un espectrómetro de masas. En este caso, se proporcionan disposiciones adecuadas de elementos de dispersión para cada zona, para afectar el campo acústico en cada zona de una manera adecuada para promover la funcionalidad requerida de cada zona. De este modo, más generalmente, el aparato puede tener una serie de zonas de manipulación de muestras, en comunicación entre las mismas, la muestra de fluido es transferible desde una zona de manipulación de muestras a la siguiente. Se prefiere que se proporcionen las zonas de dispersión correspondientes para lograr la transferencia de la muestra de fluido.

La capa de material piezoeléctrico puede ser una lámina (por ejemplo, una lámina autoportante) de material piezoeléctrico. Un material adecuado es LiNbO³. Se pueden utilizar otros materiales ferroeléctricos, por ejemplo PZT, BaTiO³, SbTiO³ o ZnO. Aún más, materiales como SiO² (cuarzo), AIN, LiTaO³, A^O³ GaAs, SiC o fluoruro de polivinilideno (PVDF) se pueden usar.

En algunas aplicaciones, se prefiere enfáticamente que la muestra de fluido esté protegida de la contaminación externa. Además, en la misma o en otras aplicaciones, se prefiere que la muestra de fluido esté protegida del usuario para proteger al usuario. Por consiguiente, preferiblemente el aparato incluye al menos un canal cerrado para la muestra de fluido, estando el canal limitado en al menos un lado por la superficie de manipulación.

En algunas realizaciones, el lado opuesto del canal puede estar limitado por una superficie de encapsulación pasiva. Puede proporcionarse una superficie adecuada mediante una capa de encapsulación.

En otras realizaciones, dos o más lados del canal pueden estar delimitados por una superficie de manipulación, cada superficie de manipulación está adaptada para estar provista de SAW para la interacción con la muestra de fluido en el canal. Cada superficie de manipulación puede tener al menos un elemento de dispersión SAW para afectar la transmisión, distribución y/o comportamiento de SAW en la superficie de manipulación, como se ha expuesto anteriormente.

Por ejemplo, el aparato puede tener:

una primera capa piezoeléctrica y una estructura de electrodo de transductor asociada;

una primera superficie de manipulación en la que se proporcionan SAW desde la primera capa piezoeléctrica; una segunda capa piezoeléctrica y una estructura de electrodo de transductor asociada; y

una segunda superficie de manipulación en la que se proporcionan SAW desde la segunda capa piezoeléctrica, en el que las superficies de manipulación primera y segunda definen entre las mismas un canal para la muestra de fluido.

El canal puede estar limitado en sus lados laterales para encerrar la ruta de flujo de la muestra de fluido.

De esta manera, el aparato puede proporcionarse en forma de un dispositivo estructurado laminado. Esta estructura laminada permite que el aparato se fabrique mediante técnicas de procesamiento en masa.

Proporcionar al canal superficies de manipulación en lados opuestos aumenta el control sobre la manipulación del fluido en el canal. Una o las dos superficies de manipulación pueden incluir elementos de dispersión de SAW como se establece anteriormente. Las superficies de manipulación pueden tener sustancialmente la misma disposición de elementos de dispersión de SAW. Estos elementos de dispersión de SAW pueden estar dispuestos sustancialmente en registro entre sí, o pueden estar desplazados entre sí. Como alternativa, las superficies de manipulación pueden tener diferentes disposiciones de elementos de dispersión de SAW, tales como elementos de dispersión de SAW de diferente periodicidad, forma diferente, etc. Las diferentes disposiciones de los elementos de dispersión de SAW se pueden compensar entre sí, o se pueden ubicar para oponerse entre sí. Las estructuras de electrodos del transductor de la primera y segunda capa piezoeléctrica pueden ser activadas por una señal común. Sin embargo, puede preferirse conducir estos electrodos a través de señales separadas, para poder proporcionar un control cuidadoso de la distribución de SAW en el aparato. El control independiente de los electrodos puede permitir que se apliquen diferentes procesos de manipulación a la muestra. Por ejemplo, localizar conjuntos de electrodos de manera que se proporcionen las SAW a lo largo de diferentes direcciones en el aparato permite el control vectorial del movimiento de la muestra.

El aparato puede incluir además al menos un sensor. El sensor puede estar ubicado en la superficie de manipulación de fluido. El sensor puede ser operable para detectar, por ejemplo, temperatura, conductividad y/o presencia o ausencia de una muestra de fluido.

El aparato puede incluir al menos un calentador. El calentador puede operar para generar SAW que, a su vez, generan calor debido a la absorción por al menos parte del aparato. De manera adicional o alternativa, el calentador puede incluir un elemento calefactor resistivo. Este puede proporcionarse en la superficie de manipulación de muestra. La incorporación de un calentador en el aparato permite que el aparato se use de manera fiable para PCR. El aparato puede incluir además al menos un depósito. El al menos un depósito puede proporcionarse en la capa piezoeléctrica. Adicionalmente o alternativamente, el al menos un depósito puede proporcionarse en una capa de encapsulación (si está presente) del dispositivo. Preferentemente, el depósito está provisto de una abertura que proporciona comunicación fluida con la superficie de manipulación. De esta manera, se pueden almacenar reactivos útiles en el depósito y proporcionarlos a la superficie de manipulación (y, por lo tanto, a la muestra) durante la operación del aparato.

El aparato puede incluir además al menos una abertura. Por ejemplo, se puede proporcionar una abertura sobre los elementos de dispersión de SAW. Esto puede permitir que la muestra escape del aparato. Esto es de particular utilidad cuando los elementos de dispersión de SAW cooperan para nebulizar la muestra, en cuyo caso la muestra nebulizada puede escapar del aparato a través de la abertura. El aparato puede usarse luego como un aparato de suministro de muestra para un dispositivo analítico tal como un espectrómetro de masas.

Preferentemente, la capa piezoeléctrica se forma usando un proceso de deposición seleccionado del grupo que consiste en: pulverización catódica, impresión en tamiz, fundición, rasqueta, recubrimiento por inmersión, deposición de solución y electroforesis.

En el caso de deposición de solución, el precursor se puede calentar (por ejemplo, mediante calentamiento por microondas) para promover la cristalización. Esto se explica, por ejemplo, en Yang et al (2009) [C. Yang et al., "Solution-processed flexible ZnO transparent thin-film transistors with a polymer gate dielectric fabricated by microwave heating", Nanotechnology, vol. 20, n.° 46, p. 465201,2009], la pulverización de RF del material piezoeléctrico se describe en Pál et al (2009) [E. Pál, T. Seemann, V. Zollmer, M. Busse, y I. Dékány, "Hybrid ZnO/polymer thin films prepared by RF magnetron sputtering", Colloid and Polymer Science, vol. 287, n.° 4, páginas 481-485, 2009], por ejemplo, sobre un sustrato polimérico. la pulverización sobre otros sustratos se divulga en Du et al (2007) [X. Y. Du et al., "ZnO film for application in surface acoustic wave device", Journal of Physics: Conference Series, vol. 76, pág. 012035, 2007].

La capa piezoeléctrica puede tener la forma de un material compuesto. En ese caso, preferiblemente las partículas de un material piezoeléctrico pueden mantenerse en un material matricial. Preferentemente, el material matriz es un material polimérico. Convenientemente, el material matricial puede ser un material fotosensible, por ejemplo, un fotorresistente. Esto permite que el material compuesto se modele con mucha precisión a la forma deseada. Patrones complejos (por ejemplo, disposiciones de elementos de dispersión de SAW en forma de estructura fonónica) se pueden formar en el material compuesto.

Preferentemente, la capa piezoeléctrica puede tener un espesor de al menos 1 pm. Más preferentemente, la capa piezoeléctrica tiene un espesor de al menos 2 pm, o al menos 5 pm o al menos 10 pm. La capa piezoeléctrica preferiblemente tiene un espesor de no más de 500 pm, más preferentemente no más de 400 pm, más preferentemente no más de 300 pm, más preferentemente no más de 200 pm, más preferentemente no más de 100 pm.

Los inventores consideran (sin desear estar limitados por la teoría) que las ondas acústicas superficiales tienden a refractarse al menos parcialmente en la muestra de fluido. Esta refracción se debe a que la muestra de fluido tiene, en general, una velocidad de propagación diferente para las SAW en comparación con el sustrato. Esto produce transmisión en la muestra de fluido. Se considera que la aplicación de SAW a una superficie de manipulación que contacta una muestra de fluido puede crear una estructura específica de ondas de presión y tensiones de corte en la muestra. Estas ondas de presión y tensiones de corte pueden romper mecánicamente las células contenidas en la muestra para efectuar la lisis celular. Se considera que, en las realizaciones preferidas de la presente invención, la lisis celular mediada por SAW puede lograr eficiencias superiores al 95 %, lo cual es muy favorable en comparación con los métodos químicos y mecánicos conocidos de lisis celular.

Se prefiere que la muestra de fluido sea una muestra líquida que contenga células (o al menos una célula). Además, se prefiere que la muestra de fluido sea una muestra líquida acuosa que contiene células. En una realización preferente, la muestra de fluido consiste o comprende sangre, y por lo tanto contiene células sanguíneas. Sin embargo, como se ha mencionado antes, es posible que la muestra sea sólida o sustancialmente sólida. Por ejemplo, la muestra puede contener solo una pequeña proporción en volumen de líquido. Las muestras sustancialmente sólidas adecuadas incluyen heces.

Se prefiere que la muestra de fluido tenga la forma de una gota, por ejemplo, una gota tal como una gota de microfluido. Sin embargo, otras disposiciones son posibles para la muestra de fluido, por ejemplo, un canal de fluido, o un fluido retenido en una cámara, en la forma establecida anteriormente. En la siguiente discusión, se utiliza el término "gota", pero como se analizó anteriormente, se pretende que la invención no se limite necesariamente a la lisis de células en gotas.

El volumen de la gota puede ser de al menos 1 picolitro. Por ejemplo, el volumen de la gota puede ser de al menos 10 picolitros, al menos 100 picolitros o al menos 500 picolitros. El volumen de la gota puede ser mayor, por ejemplo, al menos 1 nanolitro, al menos 10 nanolitros, al menos 100 nanolitros o al menos 500 nanolitros. Preferiblemente, la gota es más grande, por ejemplo, al menos 1 microlitro, al menos 2 microlitros, a 5 microlitros, al menos 10 microlitros, al menos 15 microlitros, al menos 20 microlitros, al menos 25 microlitros o al menos 50 microlitros. El límite superior preferido para el volumen de la gota es de aproximadamente 5 mililitros, más preferiblemente aproximadamente 1 mililitro, aún más preferiblemente aproximadamente 0,1 mililitros.

Preferentemente, las gotas adecuadas para la lisis celular usando la presente invención tienen un volumen en el intervalo de 0,1 a 100 microlitros, o de 1 a 50 microlitros. Más preferentemente, se usan gotas adecuadas de volumen 5-25 microlitros.

El volumen de la gota se puede ajustar de acuerdo con el área de contacto entre la gota y la superficie de manipulación. Por ejemplo, el volumen de la gota se puede ajustar para variar el ángulo de contacto (por ejemplo, en el caso de que la gota se limite a un área de muestra de fluido particular, ver más abajo). Preferentemente, el ángulo de contacto (es decir, el ángulo incluido entre la superficie de manipulación y la tangente a la superficie de la gota en la manipulación, medido en un plano que contiene la superficie normal a la del sustrato) no es inferior a 65 grados, no menos de 75 grados, no menos de 85 grados, o no menos de 95 grados. Preferiblemente, el ángulo de contacto es 65-115 grados, o más preferiblemente 95-115 grados.

La superficie de manipulación puede estar provista de un área de muestra de fluido en forma de una zona de fijación de muestra de fluido. Preferiblemente, la zona de fijación de la muestra de fluido se proporciona en forma de un punto, para fijar una gota de muestra de fluido a la superficie de manipulación. De este modo, el perímetro de la zona de fijación de la muestra de fluido puede delinear una línea de fijación de la muestra de fluido. Preferentemente, la zona de fijación de la muestra de fluido es un área hidrofílica, para fijar una muestra de fluido acuoso a la superficie de manipulación. Más preferentemente, la zona de fijación de la muestra de fluido es un área hidrofílica en forma de mancha, para fijar una gota acuosa a la superficie de manipulación. El área hidrofílica se puede formar, por ejemplo, de niobato de litio (LiNbOa), silicio (oblea de Si), óxido de zinc (ZnO), óxido de silicio (SO²), vidrio o plásticos (polímeros o copolímeros, por ejemplo, con un resto de polietilenglicol, PEG). Estos pueden modificarse aún más mediante un proceso químico específico, como una silanización (por ejemplo, con aminopropiltrietoxisilano), poli-L-lisina, o PEG o una combinación de procesos. El área hidrofílica puede estar rodeada por una zona hidrofóbica, que se puede formar, por ejemplo, de silano tal como 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilano, octadeciltriclorosilano, o un revestimiento similar al teflón (deposición de C4F8). La zona de fijación de la muestra de fluido también puede estar formada por estructuras físicas, por ejemplo, la zona de fijación puede formarse como un pozo en la superficie de manipulación. La zona de fijación puede estar formada por una pared o paredes que definen el perímetro de la zona de fijación, qué pared o paredes pueden formarse a partir de pilares, o de elementos de dispersión (es decir, elementos que contribuyen a una propiedad fonónica de la superficie del sustrato), por ejemplo, pilares que actúan como elementos de dispersión. La zona de fijación de la muestra de fluido no es esencial para la lisis celular, pero puede evitar que la gota se mueva cuando las ondas acústicas de la superficie la golpean a altas potencias y puede facilitar el ajuste del área de contacto entre la muestra de fluido y la superficie de manipulación para variar el ángulo de contacto.

La zona de fijación de la muestra de fluido tiene preferiblemente un ancho o diámetro de (o tiene un ancho o diámetro en el rango de hasta) aproximadamente 1 milímetro, aproximadamente 2 milímetros, aproximadamente 3 milímetros, aproximadamente 4 milímetros, o aproximadamente 5 milímetros.

El tamaño (por ejemplo, ancho, ancho máximo permitido, o diámetro) y/o la forma de la zona de fijación de la muestra de fluido pueden variar para variar el ángulo de contacto y las propiedades de tensión superficial en la línea de fijación de la muestra de fluido para un volumen de muestra de fluido particular, y de ese modo influir en la propagación de la onda de presión desde la SAW incidente a través de la muestra, tal que una célula en la muestra de fluido se lisa.

La concentración de células en la muestra de fluido puede ajustarse para optimizar la lisis celular. Preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 5 millones de células/mililitro o menos, aproximadamente 3 millones de células/mililitro o menos, aproximadamente 1 millones de células/mililitro o menos, aproximadamente 500.000 células/mililitro o menos, o aproximadamente 100.000 células/mililitro o menos.

La muestra de fluido puede consistir o comprender una muestra biológica tal como sangre, saliva u orina. Por ejemplo, la muestra de líquido puede ser sangre completa. Preferentemente, la muestra de fluido es sangre diluida, por ejemplo, sangre entera diluida en PBS. La dilución de la muestra expresada como muestra: el diluyente puede ser aproximadamente 1:10 o mayor (factor de dilución 0,1 o menor), aproximadamente 1:25 o mayor (factor de dilución 0,05 o menor), 1:50 o mayor (factor de dilución 0,02 o menor), o 1:100 o mayor (factor de dilución 0,01 o menor).

Los presentes inventores han demostrado que las condiciones necesarias para la lisis celular se pueden lograr usando varias diferentes plataformas y configuraciones de SAW. La presente invención proporciona así múltiples rutas para integrar la preparación de muestras biológicas en un ensayo completo en un microchip.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores actuales creen que, por ejemplo, enfocando la potencia acústica de las SAW en una posición dentro de una muestra de fluido que contiene células, es posible crear campos de presión acústica y transmisión dentro de la muestra que lisan las células.

Preferentemente, se proporcionan ondas acústicas superficiales a la superficie del sustrato en contacto con una gota de tal manera que se induce una corriente rotacional en la gota de muestra de fluido. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los inventores actuales creen que la transmisión rotacional da como resultado la creación de uno o más vórtices en la muestra, y, bajo condiciones apropiadas, las presiones y las tensiones de corte cerca del centro de un vórtice son suficientes para lisar las células.

La transmisión rotativa puede inducirse en la gota proporcionando las SAW a la gota de manera asimétrica en relación con la gota, es decir, proporcionando las SAW de manera que golpeen la gota de forma asimétrica. Al causar una asimetría en las SAW con respecto a la gota, un momento angular y, por lo tanto, rotación, se induce en la gota. El término "asimétrico" aquí se refiere a la distribución de las sierras con respecto a la gota.

Se proporciona un ejemplo de una distribución asimétrica adecuada donde la ruta SAW se superpone de forma incompleta con la huella de la gota en la superficie de manipulación, como se describe a continuación.

El término "haz" de SAW se utiliza en este documento para definir el tren de emisión, o ruta, de ondas acústicas de superficie proporcionadas en una superficie de sustrato. Los términos haz de SAW, tren de emisión de SAW y ruta de SAW se usan aquí de manera intercambiable. El ancho del haz de SAW se define teóricamente por la abertura del transductor que emite el haz de SAW. La abertura de un transductor es la parte del transductor que resuena para emitir un haz de SAW. En el contexto de la presente invención, el ancho lateral de una abertura de un transductor se toma para definir el ancho lateral del haz de SAW. Para un transductor interdigitado de electrodo paralelo, la abertura es normalmente la extensión lateral de la región de superposición entre los dedos del electrodo (ver w, figura 6). En este contexto, el borde del haz de SAW está alineado lateralmente con el borde de la abertura IDT a lo largo de la dirección de propagación de las SAW. Si bien se entiende que en realidad el borde de un haz de SAW no es necesariamente afilado, como se explica posteriormente, para los propósitos de la presente invención, un borde de un haz de SAW se define como un borde longitudinal nocional en alineación lateral con un borde de una abertura de transductor. Se entiende que la amplitud de las SAW disminuye con la distancia lateral desde el borde del haz de SAW.

Para que una gota entre en contacto con una superficie de manipulación para formar una huella de gota en la superficie de manipulación, se puede inducir un flujo rotacional en la gota proporcionando SAW en la superficie del sustrato de modo que la trayectoria de SAW se solape parcialmente con la huella de la gota (al menos en términos de la posición del borde nocional de la ruta de SAW con respecto a la gota). Una gota puede tener una huella aproximadamente circular, por ejemplo, y la ruta de SAW puede superponerse con un segmento de la huella. Una ruta de SAW puede superponerse con aproximadamente un 10 - 90 % de la huella de la gota. Se puede proporcionar una SAW en la superficie del sustrato de manera que la trayectoria de la SAW se superponga con aproximadamente el 50 % de la huella de la gota, en el que el borde de la ruta de SAW pasa cerca del centro de la gota.

Preferentemente, las SAW se proporcionan en la superficie de manipulación mediante una disposición de transductor (por ejemplo, un transductor interdigital de electrodos paralelos) y la gota se coloca en la superficie de manipulación en una posición relativa a la disposición del transductor de modo que la gota reciba las SAW distribuidas de forma asimétrica con respecto al centro de la gota. Por ejemplo, la gota puede desplazarse longitudinalmente pero alinearse lateralmente con respecto a un borde de una abertura de una disposición de transductor interdigital (IDT), en el que dicho borde de la abertura define un borde de un tren de emisión de SAW, de modo que la gota se encuentre solo parcialmente en el tren de emisión de SAW proporcionado por la disposición de IDT.

De manera adicional o alternativa, las SAW se proporcionan en la superficie de manipulación mediante una disposición de transductor para la cual es posible controlar la posición lateral del tren de emisión de SAW con respecto a la disposición del transductor, por ejemplo, ajustando la frecuencia de entrada. En esta realización, la gota se coloca en la superficie de manipulación y la posición lateral del tren de emisión de SAW se sintoniza en una posición en la superficie de manipulación de tal manera que la gota reciba las SAW distribuidas asimétricamente con respecto al centro de la gota. La disposición del transductor puede ser un IDT inclinado (también conocido como IDT de dedo inclinado) para el cual la posición lateral del tren de emisión de SAW puede ajustarse variando la frecuencia de entrada. Una ventaja de esta realización es que no requiere un posicionamiento preciso de la gota sobre la superficie del sustrato, dado que la posición lateral del tren de emisión de SAW en la superficie de manipulación se puede ajustar en relación con la de la gota. En caso de un IDT inclinado, es más difícil definir un borde nocional del tren de emisión de SAW, dado que la amplitud de las SAW a través del tren de emisión puede disminuir de forma relativamente gradual lateralmente desde un máximo central del tren de emisión. En este caso, el borde nocional del tren de emisión de SAW puede considerarse como la posición lateral a la mitad del ancho total de la distribución de amplitud de SAW en la dirección lateral.

No es necesariamente esencial que las SAW induzcan la transmisión rotacional para lograr la lisis celular. Los campos de presión necesarios para la lisis celular pueden inducirse utilizando una amplia gama de geometrías de SAW, abarcando ondas estacionarias también. Los inventores creen que es posible usar SAW para lisar las células dentro de una gota, sin necesariamente crear una transmisión rotacional o un vórtice dentro de la gota, enfocando la potencia acústica en una posición dentro de la gota.

Además, no es necesariamente esencial que las SAW se proporcionen a la gota asimétricamente para que se logre la transmisión por rotación. La lisis celular se puede lograr cuando se forman múltiples vórtices en configuraciones en las que la SAW golpea la gota de una manera más simétrica. Por ejemplo, es posible diseñar un aparato de fluidos para lograr múltiples vórtices reproducibles en gotas de muestras de fluidos, por ejemplo, al incluir disposiciones de elementos de dispersión o estructuras fonónicas (también conocidas como redes fonéticas o cristales fonónicos) en la superficie de manipulación.

Los aparatos desechables son especialmente útiles para el análisis de muestras biológicas. Los aparatos desechables pueden reducir la contaminación cruzada de muestras en aplicaciones de diagnóstico en el punto de atención y pueden reducir la contaminación de muestras con especies que pueden comprometer la molécula de interés (por ejemplo, ARNasa, donde el ARN mensajero es la molécula de interés).

Para los propósitos de la presente invención, la potencia de entrada de la onda acústica de superficie puede estar entre -19 dBm y 0 dBM, entre alrededor de -14 dBm y alrededor de -6 dBm, alrededor de -14 dBm o más, alrededor de -12 dBm o más, alrededor de -10 dBm o más, alrededor de - 9 dBm o más, alrededor de -8 dBm, alrededor de -7 dBm, o alrededor de -6 dBm o más.

Para los dispositivos descritos en este documento en relación con las realizaciones de la presente invención, la potencia relacionada que llega al IDT se puede obtener utilizando la tabla a continuación. La potencia que llega al IDT se calcula convirtiendo el valor de potencia de entrada, expresado en dBm, a un valor expresado en W y multiplicando el valor de W por 5000 (la amplificación por el amplificador).

Los presentes inventores encontraron que para un tipo de célula particular a una concentración particular, si se usa una potencia relativamente baja, las células se concentran en el centro de la gota sin lisar, y si se usa una potencia relativamente alta, se logra la lisis celular. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los presentes inventores creen que tal aumento en el poder aumenta las presiones y las tensiones de corte en la gota de tal manera que las células en la gota son aplastadas y lisas. Por consiguiente, se prefiere proporcionar SAW a una gota que contiene células y aumentar progresivamente la potencia de entrada, aumentando así progresivamente la potencia de las SAW, hasta que se logre la lisis celular. De esta forma, para un conjunto dado de condiciones, las células se pueden lisar utilizando la potencia mínima necesaria para lograr la lisis celular en esas condiciones. Por ejemplo, las células de un tipo particular se pueden lisar utilizando la potencia mínima necesaria para lograr la lisis celular para ese tipo de célula.

La frecuencia de la onda acústica de superficie puede estar en el rango de aproximadamente 10 kHz a aproximadamente 1 GHz, preferiblemente de aproximadamente 1 MHz a aproximadamente 100 MHz, más preferiblemente de aproximadamente 5 MHz a aproximadamente 50 MHz, más preferiblemente de aproximadamente 5 MHz a aproximadamente 20 MHz, más preferiblemente de aproximadamente 15 MHz a aproximadamente 5 MHz, más preferiblemente entre aproximadamente 13 MHz y aproximadamente 9 MHz. La frecuencia de la onda acústica superficial puede ser de aproximadamente 12 MHz, aproximadamente 11 MHz, aproximadamente 10 MHz, o aproximadamente 9 MHz.

Para los propósitos de la presente invención, la SAW se puede proporcionar en la superficie del sustrato durante aproximadamente 0,1 segundos o más. La SAW se puede proporcionar durante aproximadamente 0,1-60 segundos. Preferentemente, la SAW se proporciona durante aproximadamente 1 segundo o menos, aproximadamente 2 segundos o menos, o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o 35 segundos o menos.

Los presentes inventores encontraron que la eficiencia de la lisis celular se ve afectada por varios factores, incluyendo la tensión superficial de la gota, el ángulo de contacto de la gota sobre la superficie del sustrato, la concentración de células en la gota, la potencia de la SAW y la cantidad de tiempo durante la cual la SAW se proporciona a la gota. La combinación óptima de valores para cada factor puede depender del tipo de célula. La persona experta, ajustando estas variables en combinación o aisladamente, basado en la enseñanza proporcionada en el presente documento, es capaz de proporcionar condiciones en las que se puede lograr la lisis celular.

El término célula se usa en el presente documento para referirse a cualquier tipo de célula, incluyendo células eucariotas y procariotas. En el contexto de la presente invención, una célula es preferiblemente una célula eucariota. Una célula puede ser una célula animal, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula sanguínea, tal como un eritrocito). Una célula puede ser la de un organismo unicelular, (por ejemplo, un tripanosoma), que puede ser un protozoo o un protista. En algunas realizaciones, la célula es una célula de un patógeno, por ejemplo, un protozoo patógeno, protista o bacteria. Una célula puede tener una pared celular, o puede ser sin pared (es decir, sin una pared celular).

Una muestra de fluido puede contener una mezcla de células o tipos de células. Los presentes inventores han descubierto que la potencia mínima suficiente para lisar las células puede variar según el tipo de célula. Por ejemplo, bajo condiciones particulares (por ejemplo, concentración celular, ángulo de contacto de gota) una potencia específica puede ser suficiente para lisar células de un primer tipo, pero insuficiente para lisar células de un segundo tipo. Bajo tales condiciones, si se aplica una SAW de esa potencia específica a una gota que contiene una mezcla de células del primer y segundo tipo, la lisis celular se logrará para las células del primer tipo pero no para las células del segundo tipo. Por consiguiente, las SAW pueden aplicarse a una muestra de fluido que contiene una mezcla de tipos de células para lisar diferencialmente células de diferentes tipos. El "tipo" de célula diferente puede significar diferentes grupos taxonómicos, por ejemplo, diferentes dominios (el tipo de célula eucariota es diferente al tipo de célula procariota), reinos (por ejemplo, el tipo de célula animal es diferente del tipo de célula fúngica), diferentes tipos físicos o fisiológicos (por ejemplo, un leucocito es un tipo de célula diferente de un eritrocito). En particular, diferentes tipos de células son células que se pueden lisar de manera diferencial (por ejemplo, un primer tipo de célula se lisa más fácilmente que un segundo tipo de célula, es decir, bajo un conjunto dado de condiciones experimentales, la potencia más baja necesaria para lograr la lisis celular para el primer tipo de célula es menor que la potencia más baja necesaria para lograr la lisis celular para el segundo tipo de célula).

El término lisis celular se usa en el presente documento para referirse a cualquier tipo de disrupción celular. En particular, la lisis celular se usa para referirse a la disrupción celular que resulta en la liberación de moléculas intracelulares al medio extracelular, por ejemplo, por ruptura de la membrana plasmática. La lisis celular abarca la ruptura de la membrana plasmática, y puede abarcar la ruptura de las membranas del compartimento intracelular (por ejemplo, orgánulos) como la envoltura nuclear y las membranas mitocondriales externa e interna. La lisis celular es normalmente una ruptura completa e irreversible de la membrana plasmática, resultando en muerte celular. En el contexto de la presente invención, sin embargo, la lisis celular puede abarcar la poración de la membrana celular, donde la membrana plasmática se rompe de manera incompleta (es decir, la membrana plasmática se rompe de manera temporal y reversible). Tal poración puede mejorar ciertos ensayos como ELISA, de manera similar a la descrita en Borthwick et al [Kathryn A. J. Borthwick, Tracey E. Love, Martin B. McDonnell y W. Terence Coakley, Mejora de la inmunodetección del antígeno de esporas bacterianas por cavitación ultrasónica, Anal. Chem. 2005, 77, 7242-7245].

El término molécula intracelular o molécula intracelular de interés incluye macromoléculas (proteína, ADN, lípidos, polisacárido) moléculas pequeñas (por ejemplo, ATP, ADP. cAMP, glutatión, aminoácidos, oligosacáridos, monosacáridos) incluyendo metabolitos y moléculas de señalización. El término molécula intracelular abarca cualquier molécula que tenga un resto intracelular de interés (por ejemplo, una proteína transmembrana). Una molécula de interés se ve comprometida si la estructura de la molécula se vuelve significativamente diferente de su estructura nativa o estructura intracelular, por ejemplo, de modo que la molécula sea menos susceptible de análisis (por ejemplo, un epítopo requerido para el análisis inmunológico ya no está presente o se ha vuelto inmunológicamente inaccesible). El término "comprometido" como se usa en el presente documento abarca la desnaturalización (por ejemplo, de una proteína de interés) y la degradación (por ejemplo, hidrólisis de un polinucleótido, polipéptido o polisacárido de interés).

Otras características opcionales de la invención se exponen a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una vista esquemática en planta de un formato de superficie de manipulación típico adecuado para usarse con la presente invención, mostrando una zona de manipulación de muestras de tipo "embudo".

La figura 2 muestra una vista en planta esquemática de otro formato de superficie de manipulación típico adecuado para usarse con la presente invención, mostrando una zona de manipulación de muestras de tipo "guía de onda".

La figura 3 muestra una vista en planta esquemática de otro formato de superficie de manipulación típico adecuado para usarse con la presente invención, mostrando una zona de manipulación de muestras de tipo "combinación".

Las figuras 4 y 5 muestran imágenes micrográficas de una secuencia de video capturada en una gota, vista desde el lado, en superestratos acoplados a un transductor piezoeléctrico. La figura 4 muestra una gota sobre una superficie de silicio sin elementos de dispersión de SAW. La figura 5 muestra una gota en un superestrato que tiene una disposición de elementos de dispersión de SAW.

La figura 6 muestra una vista en planta de una estructura de electrodo de transductor para usarse con una realización de la invención. La superposición del electrodo w es de 15 mm, el ancho del dedo para cada electrodo es de 170 pm y el paso del dedo p es de 330 pm.

La figura 7 muestra una vista en planta esquemática de una superficie de manipulación adecuada para su uso en una realización de la invención, incluyendo dimensiones típicas (pero no limitantes).

Las figuras 8-11 muestran una serie de tramas consecutivas de metraje de video micrográfico de la operación de un aparato de manipulación de fluidos. Estas imágenes muestran claramente que la energía acústica está siendo enfocada y reflejada.

La figura 12 muestra la curva de dispersión para una placa libre, con velocidad de fase en función de la frecuencia de excitación.

La figura 13 muestra una vista esquemática de un aparato de fluidos. Se muestra un superestrato fonónico separable en forma de cono fonónico acoplado a un sustrato de niobato de litio que comprende un IDT. La fuente de alimentación es de 5 W (8 a 20 MHz).

La figura 14 muestra el tamaño de las gotas expulsadas durante la nebulización realizada (a) en un sustrato fonónico acoplado a una disposición de transductor piezoeléctrico, y (b) directamente en la superficie de la disposición de transductor piezoeléctrico.

Las figuras 15(a), (b) y (c) muestran imágenes microscópicas secuenciales del movimiento de una gota entre las cavidades de un cono fonónico.

La figura 16 muestra la estructura de banda de una red fonónica para uso con realizaciones de la invención. La banda prohibida está en el rango de frecuencia de 7,5 MHz a aproximadamente 15 MHz.

La figura 17 muestra (a) una representación esquemática de un dispositivo que incluye un IDT inclinado, para el cual la posición lateral del tren de emisión de SAW depende de la frecuencia de entrada; y (b) un gráfico que muestra la relación entre la frecuencia de entrada y la posición de SAW, calculada teóricamente (línea) y determinada experimentalmente en un transductor de niobato de litio (área sombreada horizontalmente) y en un cubreobjetos de sustrato separable (área sombreada verticalmente). El recuadro de la figura 23(b) muestra la magnitud del parámetro S¹¹.

Las figuras 18-25 ilustran realizaciones preferidas de aparatos fluídicos según la presente invención.

Las figuras 26-28 ilustran los usos de las realizaciones preferidas de la invención (en diferentes formas) para la preparación de muestras nebulizadas para espectrometría de masas.

Las figuras 29-37 ilustran realizaciones preferidas adicionales de aparatos fluídicos según la presente invención. Las figuras 38 y 39 ilustran el efecto de diferentes frecuencias de operación en la distribución de SAW en una superficie de manipulación de muestras.

La figura 40 muestra un gráfico de temperatura de una muestra frente a la potencia aplicada.

La figura 41 muestra el efecto del ciclo de temperatura controlando la potencia aplicada.

Las figuras 42-50 ilustran los diferentes formatos para la superficie de manipulación de muestra con el fin de controlar la temperatura mediante la absorción controlada de SAW.

La figura 51 muestra una vista en planta esquemática de una capa SU-8 formada sobre un sustrato de vidrio, con una abertura ubicada para permitir que un transductor (no mostrado) se acople al sustrato de vidrio, formándose un reflector fonónico en la capa SU-8 como una matriz cuadrada de orificios en la capa SU-8.

La figura 52 muestra un gráfico del desplazamiento de la superficie (medido por un vibrómetro) a lo largo de la línea 1-2 en la figura 51.

La figura 53 muestra una imagen microscópica de una gota que contiene partículas, sometiéndose a SAW permanentes, haciendo que las partículas se agreguen en anillos concéntricos.

Las figuras 54-56 muestran imágenes microscópicas secuenciales de la centrifugación de partículas en una gota, debido a la aplicación de SAW (desde la derecha en las imágenes) y al efecto de sombreado de una estructura fonónica (matriz cuadrada de pilares SU-8 sobre un sustrato de vidrio).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas, más características opcionales

Más antecedentes y consideraciones técnicas generales

Se sabe que las tecnologías microfluídicas pueden permitir el control preciso de la entrega de reactivos, fármacos y metabolitos a células individuales o a grupos de células. Dichos métodos pueden usarse para el descubrimiento de nuevos medicamentos o para administrar reactivos y muestras en tecnologías de diagnóstico.

A pesar de los rápidos avances en las tecnologías microfluídicas, o llamadas "Lab-on-a-Chip" en la última década, han habido, sin embargo, pocos métodos nuevos para generar flujo de fluidos dentro de los canales de microescala. La mayoría de los métodos existentes para crear dicho flujo se basan en generar una diferencia de presión para impulsar el flujo (en particular mediante el uso de varias formas de bombas mecánicas). Todos estos métodos dependen de interconexiones externas desde el chip a la bomba, con frecuencia, el proceso de conexión es uno de los más desafiantes.

Otros métodos alternativos actualmente en uso implican el uso de un fenómeno conocido como bombeo electrocinético (incluyendo electro-osmosis o dielectroforesis) para conducir el fluido bajo control eléctrico. En todos los casos, sin embargo, estas técnicas requieren la implementación de transductores planos metálicos dentro de los microcanales. Si bien estas conexiones eléctricas al chip dan como resultado un flujo de fluido, todo el chip, incluidos los transductores, se elimina al final de cada ensayo. De este modo, ni bombeo mecánico accionado a presión, ni electrocinética, permiten al usuario la capacidad de interrogar y mover el fluido de manera "sin contacto", a bajo coste.

Los presentes inventores han desarrollado nuevas técnicas para la manipulación de gotas en el régimen microfluídico. Estas técnicas se basan en el uso de ondas acústicas de superficie (SAW) generadas en un dispositivo piezoeléctrico, tal como un dispositivo basado en niobato de litio, LiNbO³.

Una onda de Raleigh es un sistema de cizallamiento compresivo acoplado donde el movimiento longitudinal y el transversal están desfasados 90°. Los presentes inventores han demostrado que es posible propagar tales ondas longitudinales de Raleigh (un ejemplo de SAW) desde el dispositivo piezoeléctrico, a través de un medio de acoplamiento (que puede, por ejemplo, ser agua o un aceite) en un sustrato de chip microfluídico desechable delgado hecho de plástico, vidrio u otro material adecuado. Asombrosamente, las ondas transportan suficiente energía para conducir posteriormente los fluidos sobre el sustrato desechable. Aunque el dispositivo piezoeléctrico de LiNbO³ es, en sí mismo, relativamente caro, en este formato es una plataforma reutilizable, y es solo el sustrato el que se elimina después de un uso (generalmente único). El único contacto físico para el accionamiento de la gota es a través del medio entre el LiNbO³ y el chip desechable. Los inventores han descubierto además que es posible usar la superficie del propio dispositivo piezoeléctrico como la superficie de manipulación de la muestra, y disponer elementos de dispersión SAW adecuados en la superficie de manipulación de la muestra. La ventaja de este enfoque es que el acoplamiento entre el transductor y la superficie de manipulación de la muestra está asegurado y la alineación entre el transductor y la superficie de manipulación de la muestra se fija durante la fabricación del aparato.

Cuando las ondas de Raleigh se propagan desde un dispositivo piezoeléctrico a un sustrato (por ejemplo, un chip delgado) acoplado a la superficie del dispositivo piezoeléctrico, las ondas acústicas resultantes en el sustrato pueden describirse como ondas de Lamb. Las ondas de Raleigh y las ondas de Lamb son tipos de ondas acústicas de superficie. El término onda acústica de superficie (SAW) se usa en el presente documento para describir tanto las ondas de Raleigh como las ondas de Lamb a menos que se indique lo contrario.

La funcionalidad de la plataforma puede, extenderse fácilmente más allá del simple bombeo de fluidos o gotas. Por ejemplo, microfabricando múltiples transductores SAW en el dispositivo piezoeléctrico, y a través de la actuación diferencial posterior de estos transductores, es posible manipular gotas en varias direcciones diferentes (lineal, ortogonal o en cualquier ángulo entre las mismas). Si fuese necesario, combinando diferentes componentes relativos de la generación de ondas de actuadores ortogonales, es posible permitir la división y la recombinación de gotas. Mediante un control adecuado de la distribución de SAW con respecto a la muestra, es posible lisar las células en el chip o atomizar las muestras para que puedan transportarse fuera del chip. Una aplicación particular es la creación de plumas de muestras atomizadas, que se puede capturar en embudos de iones para proporcionar una interfaz innovadora entre la biología de bajo volumen (por ejemplo, una sola célula) y la espectrometría de masas. Otros ejemplos de las aplicaciones del dispositivo implican la concentración selectiva de partículas con respecto a su tamaño o masa (es decir, su fraccionamiento). Esto puede apuntalar las aplicaciones de diagnóstico en la separación de vesículas, células y microorganismos.

Estructuras fonónicas

La figura 1 muestra un ejemplo esquemático de una superficie de manipulación de muestras en vista en planta. La superficie normalmente tiene una longitud de 20 mm y un ancho de 14 mm. El ejemplo de la figura 1 es un diseño de embudo, en el que la zona de manipulación de muestras 10 está limitada por una zona límite 12. La zona límite incluye una estructura de banda prohibida fonónica de orificios formados en la superficie. Los orificios están dispuestos en un patrón reticular cuadrado bidimensional. En este ejemplo, cada orificio tiene un radio de 176 pm. En este ejemplo, el espacio entre los centros de los orificios adyacentes es de 374 pm.

La figura 2 es similar a la figura 1, excepto que el diseño es un diseño de guía de onda.

La figura 3 es similar a la figura 1, excepto que el diseño es un diseño combinado.

En realizaciones preferentes de la invención, la superficie de manipulación de muestra mostrada en las figuras 1-3 es una superficie de una capa piezoeléctrica. Después de la fabricación de la capa, los elementos de dispersión de SAW pueden formarse recubriendo la superficie con una fotorresistencia adecuada y un patrón transferido a la resistencia mediante fotolitografía. El patrón puede consistir en una matriz cuadrada de orificios circulares dispuestos para proporcionar un embudo, una guía de onda con división o combinación de embudo y guía de onda, tal y como se muestra en las figuras 1-3, respectivamente.

El patrón fotorresistente se puede usar como una máscara de grabado en seco donde los orificios se graban a una profundidad de aproximadamente 230 pm o, más generalmente, una profundidad equivalente a aproximadamente la mitad del espesor de la capa piezoeléctrica. La capa piezoeléctrica puede limpiarse (por ejemplo, en acetona). La capa piezoeléctrica puede limpiarse nuevamente usando un tratamiento con plasma de oxígeno y luego sumergirse en una solución de heptano y un tri-cloro-tri-deca-fluoro-octilsilano para dar una superficie hidrófoba, ángulo de contacto > 65°.

Una estructura de electrodo transductor está dispuesta en la capa piezoeléctrica, por ejemplo, en el mismo lado de la capa piezoeléctrica que los elementos de dispersión de SAW (pero son posibles otras configuraciones, ver más adelante). La combinación de la estructura del electrodo y la capa piezoeléctrica se conoce como transductor interdigitado (IDT). En algunos experimentos de prueba sobre los cuales se fundó el presente trabajo, un IDT adecuado resonaba a una frecuencia de 6,18 MHz y se utilizaron SAW a esta frecuencia para las pruebas. Se utilizó un generador de señal programable para proporcionar una entrada de 6,18 MHz con una amplitud de -10 dBm (1 |jW) pulsada a 50 Hz a un amplificador con una ganancia de 40 dB para presentar aproximadamente 10 dBm (1 W) al IDT.

Para probar la movilidad y la atomización, el tamaño de gota era de aproximadamente 2 jl.

Durante las pruebas, cada una de las estructuras mostradas en las figuras 1-3 influyó en el movimiento de las gotas de agua sobre la superficie de manipulación de la muestra. La estructura que parece funcionar de manera más eficiente es el embudo (figura 1) y se cree que esto se debe principalmente al tamaño relativo de la estructura, aunque los inventores no desean estar obligados por la teoría a este respecto. El embudo eficientemente mueve y enfoca las gotas al punto focal del embudo independientemente del punto inicial de inicio de la gota en la zona de manipulación de muestras. Aunque las estructuras de prueba se pueden usar varias veces, su eficacia disminuyó con el uso, ya que puede ser difícil limpiar adecuadamente las manchas de gotas secas de la superficie de manipulación de muestras expuesta. Esto sugiere que el aparato debería, donde sea posible, usarse solo una vez y luego desecharse. De este modo, se prefiere fuertemente que el aparato se pueda fabricar de una manera que sea lo suficientemente eficiente como para permitir la eliminación del aparato de esta manera.

La estructura de la guía de ondas (figura 2) proporciona guía de las gotas de agua y reduce o elimina el desplazamiento de la trayectoria de las gotas en la superficie de manipulación de muestras que se observaría sin la zona de borde. Por lo general, no se observa división de las gotas, aunque se puede observar movimiento en cualquiera de las divisiones de la guía de ondas.

La estructura de combinación (figura 3) proporciona el enfoque de las gotas a la estructura de la guía de ondas y también se puede observar el tránsito a lo largo de la estructura.

La atomización de las gotas de agua se puede lograr en todas las estructuras mostradas en las figuras 1-3. Esto se trata a continuación en mayor detalle.

Las figuras 4 y 5 muestran imágenes micrográficas de una secuencia de video capturada en una gota, vista desde el lado, en superestratos acoplados de forma desmontable a un dispositivo piezoeléctrico. La figura 4 muestra una gota sobre una superficie de silicio sin una zona de borde. La figura 5 muestra una gota sobre un sustrato que tiene una zona de borde con una estructura de separación de banda fonónica similar a la descrita anteriormente. La imagen en cada caso se toma aproximadamente 250 microsegundos después de que la onda acústica de superficie se encuentra con la gota. Tal y como puede verse, se transfiere más energía a la gota en la figura 5 que en la figura 4. Cada gota tiene un volumen de 1 jl. La potencia utilizada en estos experimentos fue de 0 dBm de entrada que suministró 5 W en el IDT. La frecuencia de excitación fue de 9,56 MHz. Las dimensiones de los sustratos fueron de 2 cm por 1,5 cm. La cantidad de fluido de acoplamiento entre el dispositivo piezoeléctrico y el sustrato se redujo a 4 jl, lo que proporcionó una capa de aproximadamente 13 jm de espesor. Los superestratos se colocaron en la misma posición y tenían el mismo espesor (450 jm).

Más detalles se exponen a continuación.

Las estructuras del electrodo del transductor pueden formarse en la capa piezoeléctrica, cada una tiene 20 pares de "dedos" de electrodos para formar transductores interdigitados (IDT). Los "dedos" del electrodo se ubicaron con aproximadamente 330 jm de paso p, 180 jm de ancho de dedo f, con una abertura de 15 mm w (superposición), véase la figura 6. La dirección de superposición de los dedos puede considerarse como una dirección transversal del IDT. Los electrodos pueden ser modelados usando un proceso de despegue donde después de la fotolitografía, usando máscaras de acetato, se deposita una capa de titanio de 20 nm de adhesión antes de 100 nm de oro sobre la oblea, El despegue se lleva a cabo en un vaso de precipitados con acetona para producir los electrodos IDT para el aparato.

Un generador de señal analógica Agilent MXG N5181A 250 KHz 1 GHz, junto con un Mini Circuits ZHL-5W-1, amplificador de 5-500 MHz, se puede usar para alimentar el dispositivo SAW. El amplificador puede ser alimentado por una fuente de alimentación dual TTi EX354D de 280 W que puede suministrar 3 A y ± 24 V CC. Se puede aplicar aproximadamente 1 W de potencia al IDT. La señal de accionamiento para el dispositivo SAW puede ser pulsada durante 20 ms cada 100 ms, para evitar el calentamiento excesivo (a menos que se desee un calentamiento excesivo, por ejemplo, para llevar a cabo la PCR - ver más abajo). Las gotas se pueden capturar a 62 tramas por segundo usando una cámara de alta velocidad (Red Lake M3), permitiendo visualizar la captura de atomización de pulsos individuales, cuando las ondas acústicas superficiales viajan a través de la gota.

La figura 7 muestra una vista en planta esquemática de la configuración de una superficie de manipulación para usarse con una realización de la invención. La dimensión de la superficie con diseño de cono es de aproximadamente 15 mm por 30 mm. La abertura para el cono es de 10 mm y el vértice es de aproximadamente 0,57 mm (correspondiente a dos orificios faltantes).

Para ilustrar la atomización, se pueden usar dos gotas de 1 pl de agua desionizada, una en el vértice del cono, la otra aproximadamente a 10 mm del vértice.

La estructura fonónica en la zona del borde consiste en una matriz cuadrada de orificios grabados en la superficie, a una profundidad aproximadamente a la mitad de la capa piezoeléctrica. Esta perturbación regular en el módulo de Young del material proporciona al material una propiedad de transmisión o reflexión acústica dependiente de la frecuencia.

Las gráficas de superficie de la intensidad del campo acústico de una estructura de cono fonónico que ilustra la intensidad a una frecuencia de 11,36 MHz y a una frecuencia de 11,56 MHz se muestran en las figuras 8 y 9 del documento WO2011/023949. Estas gráficas juntas muestran la efectividad de la estructura fonónica para confinar el campo acústico dependiendo de la frecuencia utilizada: un cambio de 200 KHz de 11,36 MHz a 11,56 MHz puede proporcionar un cambio de intensidad de 3 dB.

Los presentes inventores tenían como objetivo encontrar la frecuencia de resonancia del IDT para obtener la frecuencia más eficiente para atomizar las gotas desde la superficie de manipulación. En este caso, se encuentra que 12,85 MHz es la frecuencia resonante para el IDT y la atomización de gotas desde la superficie de manipulación. Sin embargo, esta frecuencia de operación puede no proporcionar una operación adecuada de las estructuras fonónicas en la zona fronteriza. Se observa que al reducir la frecuencia de excitación para la IDT a 12,64 MHz, se observa un aumento dramático en la atomización en las superficies con estructuras fonónicas. El aumento en la actividad del sustrato es más que suficiente para compensar cualquier disminución en la conductancia acústica IDT (la cantidad de energía eléctrica que se puede transformar en energía mecánica).

La longitud de onda del SAW depende del paso de un IDT. Sin embargo, el cambio observado en la respuesta acústica de la estructura fonónica indicaría un cambio en la longitud de onda de la SAW y, por lo tanto, una variación en el paso de los electrodos integrados. Esta variación puede ser una consecuencia del uso de máscaras de acetato para la creación de prototipos. Dichas máscaras pueden tener una variación en el espesor del electrodo que normalmente podría considerarse insignificante, pero parece que de hecho pueden ser significativos. Así, en efecto, los inventores usan un IDT con una gama de pasos que permite que se irradien varias longitudes de onda posibles. En una realización alternativa, el transductor utiliza una estructura de electrodo interdigitado inclinado. Esto luego se utiliza como una fuente sintonizable de SAW. Al inclinar los electrodos, la distancia entre electrodos cambia con la posición lateral a través de la estructura del electrodo. Esta disposición puede ser modelada por una serie de IDT con diferentes espacios entre electrodos. La posición de la SAW depende de la frecuencia de excitación utilizada. Es posible diseñar un dispositivo para su uso a una determinada longitud de onda operativa (frecuencia), pero generalmente siempre hay algunas desviaciones de los parámetros de diseño debido a las tolerancias de fabricación durante la fabricación. Como se muestra en el documento WO2011/023949, las estructuras fonónicas dependen mucho de la frecuencia/longitud de onda. Por lo tanto, variando la frecuencia de excitación ligeramente lejos de la frecuencia de operación predicha, es posible sintonizar un régimen operativo útil donde la longitud de onda SAW se desplaza lo suficiente como para permitir que el dispositivo funcione sustancialmente como se diseñó.

Análisis del aparato con transductor piezoeléctrico y superestrato separable

Se prefiere en las realizaciones de la presente invención que la superficie de manipulación de muestra sea, por ejemplo, una superficie de la capa piezoeléctrica en la que se generan y propagan las SAW. Sin embargo, los inventores han llevado a cabo trabajos preliminares detallados relacionados con el uso de un superestrato acoplado de forma desmontable a un solo transductor piezoeléctrico de cristal. Este trabajo es relevante para las realizaciones preferidas de la invención, porque muestra las consideraciones técnicas necesarias para el diseño y el funcionamiento del aparato.

Las figuras 8-11 muestran una serie de tramas consecutivos de imágenes de video capturadas bajo el microscopio de un aparato de manipulación de fluidos en funcionamiento. Estas imágenes muestran claramente que la energía acústica está siendo enfocada y reflejada.

En las figuras 8-11, se colocaron dos gotas de 1 pl sobre la superficie de manipulación. La primera gota está directamente en la ruta de la segunda gota, unos 10 mm detrás de la primera gota. En efecto, la segunda gota debería "robar" parte de la energía acústica antes de que la energía acústica pueda alcanzar la otra primera gota. A pesar de esto, la atomización se observó solo para la primera gota, en el vértice del cono fonónico. La longitud del sustrato en este caso fue de 30 mm. La potencia utilizada en este caso fue cinco veces menor que en los experimentos informados anteriormente.

Se ha observado atomización para gotas de 0,5 |jl a una potencia aplicada de 790 mW.

La figura 8 muestra el primero de una serie de tramas tomadas de una película capturada a 62 tramas por segundo. Esta primera imagen es justo antes de que un pulso ultrasónico de SAW llegue a las gotas a aproximadamente 4000 m/s. Se aplicó aproximadamente 1 W de potencia al IDT.

La figura 9 muestra las gotas irradiadas por las SAW con la segunda gota claramente agitada, pero no atomizada, mientras que la primera gota cerca del vértice del cono está atomizando (o más correctamente nebulizando).

La figura 10 muestra una trama en la que el impulso de 20 ms se ha detenido, pero se puede observar cierta oscilación libre en las gotas. Es interesante notar que la gota que se estaba atomizando estaba a la sombra de la segunda gota y normalmente experimentaría mucha menos radiación acústica, ya que la segunda gota absorbería una cantidad significativa de la energía de la onda de Rayleigh.

En la figura 11, las oscilaciones se han detenido y solo se puede ver la pluma expulsada de la primera gota. Esto ilustra la eficacia del dispositivo.

El diseño, la construcción y la investigación del dispositivo mostrado en las figuras 8-11 ahora se describirá con más detalle. Debe tenerse en cuenta que el dispositivo utilizado en las figuras 8-11 era un superestrato extraíble acoplado a un transductor piezoeléctrico a través de un medio de acoplamiento.

Las ondas acústicas superficiales se generaron en la oblea piezoeléctrica de LiNbO³ mediante un transductor interdigitado (IDT) y se propagaron como ondas de Rayleigh, de manera no dispersiva con una sola velocidad. La frecuencia de resonancia, fo, está directamente relacionada con la velocidad de onda de Rayleigh en el material, Cr, (3996 m/s), la longitud de onda de SAW A y el paso de los electrodos interdigitados, D, según la ecuación (1):

l = C- f = 2D (1) Jo

Las ondas de Rayleigh se acoplan en un sustrato en forma de lámina o placa (a la cual se le puede llamar chip o lámina de sustrato), a través de una delgada película intermedia de agua. Como una placa libre, el sustrato admite varios modos de propagación, denominados ondas de Lamb (nombradas después de Lamb, el primero en realizar el análisis). Hay dos clases distintas de modos de propagación de ondas de Lamb, simétrico y antisimétrico, eso se puede resolver usando las ecuaciones de frecuencia de Rayleigh-Lamb (2) y (3).

üífl 4fc2 pq

( q2- k 2) 2, modos simétricos (2)

-( ¥ )

modos asimétricos (3 ') ^'

donde

con d el espesor de la placa, y Cl (8433 m/s) y Ct (4563 m/s) las velocidades longitudinal y transversal, respectivamente.

Estas ecuaciones trascendentales, con muchas soluciones reales, revelan que las ondas de Lamb son dispersivas, como la velocidad de fase, Cfase, es una función del producto de espesor de frecuencia f x d. Por lo tanto, para una frecuencia fija, la longitud de onda y el modo propagado en la hoja de sustrato se pueden controlar a través de su grosor.

La figura 12 muestra la curva de dispersión para una placa libre, con velocidad de fase en función de la frecuencia de excitación. A 12,6 MHz, se pueden excitar dos modos asimétricos y tres simétricos. Las velocidades de fase de los modos de orden más bajo A⁰ y S⁰ son las más cercanas a la de la onda de Rayleigh que se propaga en la hoja de sustrato (Cfase, 3996 m/s), con los que trabajaron los inventores, y por lo tanto estos modos están excitados con preferencia a los de orden superior. Los inventores usaron estos datos, junto con criterios publicados previamente para estructuras de placas fonónicas [Djafari-Rouhani B et al. (2008) Separaciones de banda absolutas y guía de ondas en losas de cristal fonónicas independientes y soportadas. Fotónica y nanoestructuras - Fundamentos y aplicaciones 6: 32-37] para diseñar estructuras fonónicas para manipular fluidos.

Estas estructuras fonónicas fueron modeladas como simples problemas de difracción 2-D, donde se describieron las ondas acústicas utilizando una ecuación de onda de Helmholtz armónica en el tiempo (4), en el que una onda de presión, P, fue lanzada a la estructura (densidad p), en un rango de longitudes de onda calculadas a partir del número de onda de Lamb, k, en un producto particular (fd).

Los inventores desarrollaron estructuras fonónicas simples, donde la celosía comprende una serie de orificios, y donde todos los casos fueron tratados con condiciones de contorno de Neumann. Utilizando estos criterios de diseño, los inventores produjeron una serie de cristales fonónicos 2D de celosía cuadrada, que amplificó o dio forma al campo acústico, dentro de la hoja de sustrato. El cristal fonónico se utilizó para crear cavidades acústicas, que estaban excitadas a diferentes longitudes de onda, resultando en dispersión o reflejo de la energía. Esto puede enfocar la energía en regiones específicas del chip. Como consecuencia, la interacción entre la onda de Lamb y la red fonónica genera variaciones espaciales de la intensidad del campo acústico, asociado con los diferentes regímenes de propagación dentro del chip.

De manera significativa, la estructura fonónica mitiga las pérdidas de energía que se producen durante el acoplamiento de la onda acústica de la oblea de niobato de litio a la lámina de sustrato, que puede enfocar la potencia en regiones específicas del chip.

Las ondas de Lamb propagadas en el chip interactúan con la gota de líquido colocada en su superficie de manera similar a las ondas de Rayleigh en un material piezoeléctrico. En el caso de ondas de Rayleigh, la interacción con el líquido amortigua la onda de propagación superficial, que se descompone a medida que se propaga a lo largo de la superficie. Luego se denomina onda de Rayleigh con fugas e irradia una onda de compresión en el líquido, que no puede soportar ondas de corte. De manera similar, una gota de líquido colocada sobre el sustrato hace que las ondas de Lamb sean evanescentes, con la energía acústica refractada en el líquido en un ángulo denominado ángulo de Ralyeigh 9^r^, determinado por la ley de Snell (ecuación 5) que relaciona la velocidad de las ondas en sólido y líquido:

Dependiendo de la potencia aplicada, se pueden inducir diferentes regímenes fluídicos en la gota, desde la transmisión (acústica) donde se crea flujo volumétrico a lo largo de la gota por recirculación, a la desestabilización de la línea de contacto que resulta en movimiento de gotas, así como la nebulización y el chorro al romper la superficie libre de la gota en gotas más pequeñas. A continuación se describen con más detalle ejemplos del control espacial de la energía acústica sobre los diferentes regímenes en los superestratos fonónicos.

El dispositivo de SAW se fabricó en una oblea de LiNbO³ de 7,62 cm (3 pulgadas) con propagación en X de corte en Y de 128°, cada dispositivo constaba de 20 pares de electrodos para formar un transductor interdigitado (IDT) con un paso de 160 pm, un ancho de 80 pm y una abertura de 10 mm. Los IDT de SAW se modelaron mediante un proceso de despegue donde, después de la transferencia del patrón a una resistencia S1818, se evaporó una capa de adhesión de titanio de 20 nm antes de la deposición de 100 nm de oro. El despegue se realizó en acetona, para darse cuenta del patrón.

Se utilizó un generador de señal analógica MXG Agilent Technologies N5181A junto con un amplificador Mini Circuits ZHL-5W-1,5-500 MHz y una fuente de alimentación de ± 24 V CC, 3 A para alimentar el dispositivo de SAW. Para experimentos de nebulización, la señal de activación del dispositivo de SAW se pulsó durante 20 ms cada 100 ms, para evitar el calentamiento. Se tomaron imágenes de las gotas a 62 fps usando una cámara de alta velocidad Red Lake M3 montada en un microscopio vertical Leica, que permitió visualizar la captura de nebulización de las gotas, cuando las ondas acústicas superficiales viajaban a través de la gota. Los IDT se caracterizaron utilizando un analizador de red de la serie E5071C ENA de Agilent Technologies.

El superestrato se fabricó utilizando obleas de silicio con un grosor aproximado de 470 micrómetros. La oblea de Si de 10,16 cm (4 pulgadas) se recubrió con fotorresistencia AZ4562 y se modeló usando fotolitografía estándar. El patrón comprendía una matriz cuadrada (paso 203 micrómetros) de orificios circulares (radio 82 micrómetros) y se transfirió a la capa de resistencia. El patrón de fotorresistencia se transfirió luego al silicio usando grabado en seco (STS ICP) donde se grabaron los orificios. La oblea se limpió en acetona y se cortó para proporcionar los superestratos. La dimensión del superestrato estampado era de aproximadamente 20 mm por 30 mm. En el caso de la bocina acústica, la abertura para el cono se hizo de 10 mm para coincidir con la abertura del IDT y el vértice del cono tenía aproximadamente 1,22 mm de ancho. (En el caso del filtro centrífugo, descrito adicionalmente a continuación, se utilizó la misma matriz cuadrada de orificios circulares y se observó la actuación del fluido con cuentras de poliestireno de 10 micrómetros (Duke Scientific G1000). Se colocó un volumen de 5 microlitros de agua desionizada entre el sustrato y la superficie del transductor para proporcionar una capa de acoplamiento de aproximadamente 50 micrómetros de espesor para promover el acoplamiento de SAW.

Un esquema del dispositivo se muestra en la figura 13, que representa la aplicación de onda sinusoidal desde una fuente de energía de 5 W rf 20 (operable en el rango de 8 a 20 MHz) al transductor interdigitado (IDT) 22 que tiene una abertura de 10 mm para generar una onda de Rayleigh (SAW) 24. El SAW en la superficie de la oblea de LiNbO³ induce ondas de Lamb en el superestrato 26 acoplado a la superficie de la oblea de LiNbO³, donde la intensidad se centró en la gota 28 de 1 pl. Los electrodos del IDT tenían un paso de 160 micrómetros, anchos de electrodo de 80 micrómetros y una abertura de aproximadamente 10 mm. El cristal fonónico comprendía orificios de radio de 82 micrómetros con un paso de 203 micrómetros, para proporcionar un factor de relleno de 0,8, grabado en silicio [100] (donde la estructura estaba alineada en la dirección [011] de la oblea de silicio, la dirección de propagación de las ondas de Lamb fue paralela a la dirección [011]).

El superestrato fonónico se diseñó en forma de cono fonónico para enfocar la energía acústica, como una serie de pasos (o cavidades), cada característica resuena a una frecuencia particular y actúa como una cavidad de Fabry Perot [Qiu C, Liu Z, Mei J, Shi J (2005) Filtro acústico de selección de modo mediante el uso de túneles resonantes de cristales fonónicos dobles bidimensionales. Appl. Phys. Lett. 87:104101-104103; Wu TT, Hsu CH, Sun JH (2006) Diseño de una fuente acústica direccional altamente magnificada basada en la cavidad resonante de cristales fonónicos bidimensionales. Appl. Phys. Lett. 89:171912-171913].

Seis pasos, o cavidades, del cono fonónico fueron identificados. Los inventores revisaron imágenes micrográficas (no mostradas aquí) de una película capturada a 62 fps antes y durante la nebulización, con el dispositivo excitado a 12,6 MHz con una potencia aplicada de 1,25 W. Antes de la nebulización, con una gota en la cuarta cavidad, la gota estaba inactiva y su posición solo se podía ver a partir de reflejos de luz. A continuación, la gota en la cuarta cavidad se nebuliza, mientras que en una cavidad diferente se agitó, y así se hizo visible, pero no fue nebulizada. Las imágenes a las que se hace referencia aquí se muestran como las figuras 17b, c y d en el documento WO2011/023949.

Las ondas acústicas en la superficie del superestrato, dentro de la estructura fonónica se observaron utilizando interferometría de luz blanca, y las longitudes de onda medidas tanto en la oblea de LiNbO³ como en el superestrato dentro de la estructura fonónica. Los inventores eligieron una frecuencia de excitación del IDT, accionando la SAW, para excitar modos de cavidad particulares dentro del superestrato fonónico (es decir, las cavidades 1 a 6 mencionadas anteriormente). Por ejemplo, la cuarta cavidad acomodaba fácilmente el área de contacto de la gota y se excitaba a 12,6 MHz.

Se realizaron simulaciones de la estructura del cono fonónico cuando se excitó a 12,6 MHz y 13,2 MHz respectivamente. Las ondas estacionarias se desarrollan como consecuencia de que las paredes laterales actúan como una serie de etalones de Fabry Perot. Las ondas estacionarias en las cavidades son de hasta un orden de magnitud mayor que el campo acústico en un superestrato no modificado (un superestrato sin red fonónica), dependiendo de la frecuencia. Cada cavidad podría ser excitada a diferentes frecuencias, donde había un espacio de aproximadamente 300 KHz entre cada cavidad (es decir, entre las cavidades 1 y 2; entre las cavidades 2 y 3, etc.). Por ejemplo, la segunda cavidad mostró el factor de mejora más alto de aproximadamente 10 a 13,2 MHz, mientras que la cuarta cavidad mostró una mejora de aproximadamente 6 a una excitación de 12,60 MHz. El cono fonónico se modeló como un simple problema de difracción 2-D utilizando COMSOL Multiphysics v3.5a.

Las simulaciones mostraron que diferentes cavidades del dispositivo pueden ser excitadas a diferentes frecuencias. El dispositivo ha sido diseñado para que la estructura fonónica actúe como un reflector eficiente y se disipe poca energía en la red. Las simulaciones también muestran que la variación espacial en las intensidades acústicas, así como la generación de ondas estacionarias, eran perpendiculares a la dirección de propagación de las ondas de Lamb. Los cambios en la frecuencia de 0,6 MHz pueden proporcionar variaciones significativas en la intensidad del campo acústico, hecho corroborado experimentalmente.

El fenómeno de nebulización se ha estudiado más a fondo. Cuando se aplican potencias relativamente altas, la energía acústica supera la tensión superficial que fija la gota a la superficie de modo que se extiende en una película líquida y da lugar a ondas de resonancia capilar en el líquido que se determinan por la amortiguación viscosa interna y el forzado inercial de la gota. Estas ondas capilares tienen una longitud de onda del orden del diámetro de las gotas nebulizadas con volúmenes en el rango subpicolitro. Se ha monitorizado la nebulización de una gota de 1 microlitro que procede sobre el superestrato fonónico. La gota se colocó en una cavidad del superestrato fonónico del cono y se nebulizó usando SAW excitadas con una frecuencia de 12,6 MHz y una potencia de 4 W. La figura 14 muestra el tamaño de las gotas expulsadas durante la nebulización. La nebulización de las gotas de agua (1-2 microlitros) se realizó en el superestrato fonónico del cono acoplado a la disposición del transductor piezoeléctrico (figura 14a) o directamente en la superficie de la disposición del transductor piezoeléctrico (figura 14b) con frecuencias de excitación de alrededor de 12 MHz (+/-1,2 MHz). El tamaño de las gotas expulsadas se midió con un analizador de partículas Doppler de fase. El conjunto de datos de cada ejecución experimental (con múltiples ejecuciones por condición) se ajustó con una distribución de Weibull y los modos se extrajeron usando Matlab (R2010a, The Mathworks, Inc.). Un ejemplo de la distribución ajustada, superpuesta en el histograma, se muestra para una carrera por cada condición. Los valores presentados son el promedio de los modos obtenidos para cada condición con la desviación estándar. Curiosamente, estos datos también muestran que las gotas nebulizadas en un superestrato fonónico son más pequeñas que en el IDT. Sin embargo, la distribución del tamaño de gota fue más aguda cuando la nebulización se realizó directamente desde la superficie de la capa piezoeléctrica. Se observaron otros dos modos no asociados con la nebulización, con tamaños de gotas centrados alrededor de 50 pm y 150 pm, resultante de los fenómenos de chorro. El diámetro de las gotas nebulizadas de la superficie del superestrato fonético del cono se midió a 5,2 micrómetros (+/- 0,9 micrómetros), y no fue significativamente diferente de una nebulización en un superestrato no estructurado.

Sin embargo, una gran diferencia con el uso de un superestrato no estructurado radica en la gran variación en el grado de nebulización en el sustrato fonónico, que depende de dónde se colocó la gota dentro del cono. Este control espacial preciso del campo acústico también se ha visto experimentalmente. La excitación de la gota en la cuarta cavidad a 12,6 MHz resultó en nebulización, mientras no hay excitación a 10 mm de distancia, en cavidades dentro de la trompeta del cono. El control espacial de la energía acústica también permitió la colocación reproducible de la gota en el superestrato fonónico a medida que se alineaba con la cavidad excitada cuando se depositaba a su alrededor, como se describe adicionalmente a continuación.

También se observó movimiento de gotas y división, como se describe a continuación.

Cuando la radiación acústica aplicada o acoplada en el superestrato supera o es igual a la fuerza de deslizamiento Fs dada por la ecuación (6), se puede lograr el movimiento de la gota.

Fs = 2RyLG sen

En la ecuación (6) R es el radio de la gota, ^y es la tensión superficial y 0a y 0r son los ángulos de contacto de avance y retroceso de la caída cuando no se aplica ninguna onda acústica.

Al colocar una gota entre dos cavidades, una de los cuales es resonante, la variación espacial de las densidades de energía acústica, da como resultado fuerzas acústicas en la gota que se divide y/o mueve de la gota a medida que se mueve hacia la cavidad con la energía más alta. Al ajustar la fuerza y la frecuencia del campo en las cavidades, una con respecto a la otra, las gotas se dividirán simétricamente o asimétricamente. El proceso de movimiento o división de las gotas es accionado por ondas refractadas (una dirigida) y ondas reflejadas en la dirección opuesta (desde el cono fonónico). La movilidad de la gota se puede mejorar reduciendo la histéresis del ángulo de contacto, haciendo que la superficie sea hidrofóbica. Por ejemplo, se observó que una gota de agua de 5 microlitros se movía hacia adelante y hacia atrás entre 3 cavidades de un cono fonónico tratado con un silano hidrófobo. La figura 15 muestra el movimiento de una gota de agua de 5 microlitros entre tres cavidades de un cono fonónico, en diferentes momentos (a. 0 segundos; b. 0,2 segundos; c. 0,6 segundos), cuando la frecuencia de salida cambia de 12,23 MHz (a) a 12,43 MHz (c) con incrementos de 0,1 MHz.

La propagación de la SAW directamente en la oblea piezoeléctrica o un superestrato no estructurado acoplado a la oblea piezoeléctrica dio como resultado movimientos de gotas en la misma dirección que la SAW, mientras que en el superestrato fonónico, la gota se movió en la dirección opuesta a la SAW, aumentando la frecuencia de 12,23 MHz a 12,43 MHz (-3 dBm). Volvió a la misma posición disminuyendo la frecuencia de 12,43 MHz a 12,23 MHz.

Manipulación de muestras - "centrifugación"

La misma disposición de transductor como se describe anteriormente, utilizada para la nebulización, división o movimiento de gotas, puede usarse para crear una "centrífuga" en el chip (más correctamente "separador", como se ha analizado anteriormente, pero otros en la técnica usan el término "centrífuga"), mediante el uso de un superestrato diferente, acoplado a la disposición del transductor, como se describe a continuación. Se considera además que se puede crear una "centrífuga" en chip en la superficie de manipulación de muestra del aparato de la presente invención, cuando se tienen en cuenta las diferencias identificadas entre el uso de un superestrato fonónico separable y el uso de la superficie de la capa de material generador de SAW como superficie de manipulación de la muestra. En la discusión a continuación, la divulgación se concentra principalmente en el uso de un superestrato separable, pero la divulgación es correspondientemente aplicable a las realizaciones preferidas de la presente invención.

El dispositivo utilizado para la centrifugación de partículas dentro de las gotas de fluido se muestra esquemáticamente en la figura 20a del documento WO2011/023949. La disposición del transductor y del superestrato se hicieron como se describió anteriormente, excepto que la red fonónica se formó como un cuadrado, en lugar de como un cono.

La simulación (Comsol multiphysics 3.5a) investigó dónde se propagaba una onda de presión en el superestrato a 12,6 MHz y su retícula fonética rompe su simetría. Estos resultados muestran que la estructura fonónica genera una diferencia en las velocidades de la onda de Lamb inducida en el superestrato, rompiendo la simetría de la onda acústica e induciendo el momento angular dentro de la muestra. Los patrones de flujo resultantes concentran partículas dentro del líquido, debido a movimientos fluidos que tienen similitudes con los descritos por Batchelor [Batchelor GK (1951) Nota sobre una clase de soluciones de las ecuaciones de Navier-Stokes que representan un flujo rotativo simétrico constante. Q. J. Mech. Appl. Math. 4:29-41; Raghaven RV, Friend JR, Yeo LY (2010) Concentración de partículas mediante microcentrifugación impulsada acústicamente: visualización de flujo microPIV y estudios de modelado numérico. Microfluido. Nanofluido. 8:73-84].

La figura 16 muestra el intervalo de banda de la matriz fonónica cuadrada. La propagación de la onda se investigó utilizando el método de expansión de onda plana bidimensional [Hsu J y Wu T, (2006) Formulación eficiente para cálculos de estructura de banda de placas de cristal fonónico bidimensionales. Phys Rev. B, 74, 144303]. Tal y como entenderá el experto en la materia, este tipo de diagrama vectorial de onda reducida es una forma conveniente de describir los espacios de banda en estructuras simétricas. De este modo, en este ejemplo, donde un cristal fonónico tiene una simetría particular, no es necesario considerar todas las direcciones posibles de propagación de una onda en el cristal. Pero teniendo en cuenta la simetría de la estructura, solo es necesario considerar la propagación en un número reducido de direcciones; para una red cuadrada (como en este ejemplo) solo necesitamos tomar direcciones de 0 a pi/4 radianes (0 a 45 grados) con respecto a uno de los vectores de red recíprocos del cristal. La red recíproca es el mapa de Fourier del cristal (o su patrón de difracción), donde el vector de onda de una onda es la dirección de propagación con respecto a la red recíproca. Para materiales isotrópicos, solo es necesario considerar una dirección de propagación, o un vector de onda. El área prohibida corresponde al intervalo de banda absoluto de 7,67 MHz a 14,48 MHz. Estos datos complementan la simulación, que mostró la onda filtrada por la estructura fonónica cuando se propagó a 12,6 MHz.

Para comprender mejor los patrones de flujo generados por este tipo de estructura fonónica, los inventores exploraron el comportamiento de las cuentas dentro de estos flujos. Los resultados son visibles en los gráficos. 20c y 20d del documento WO2011/023949 y el texto asociado de ese documento que describe esos dibujos.

Como un ejemplo relevante de una aplicación biológica, se demostró la concentración de células sanguíneas de muestras de sangre diluida, como se muestra en la figura 22 del documento WO2011/023949 y es una descripción asociada en el documento WO2011/023949.

Los inventores han demostrado un nuevo concepto en microfluídica que muestra que las manipulaciones microfluídicas complejas, incluyendo, por ejemplo, la centrifugación de sangre, Se puede realizar en un chip fonónico desechable. La frecuencia de excitación de SAW se eligió para acoplarse a través de la interfaz transductorsuperestrato, donde se logró la manipulación de gotas. Las estructuras fonónicas interactúan con el campo acústico, proporcionando una excelente reflectividad o dispersión a las ondas acústicas entrantes. Los experimentos descritos en este documento muestran cómo la actuación de las gotas depende del diseño geométrico y el contraste elástico dentro del cristal fonónico, así como la frecuencia de la onda acústica y cómo se pueden producir en el chip varios diferentes movimientos de fluido en un chip desechable, incluyendo movimiento de gotas, dispersión, nebulización y centrifugación (sin necesidad de electrodos, canales o bombas, por ejemplo). Este método flexible y potente no requiere tecnologías complejas de interconexión, ni altas tensiones (como es el caso en muchas técnicas electrocinéticas). En el futuro, combinando diferentes estructuras fonónicas, será posible crear una "caja de herramientas" de diferentes funciones fluídicas (cada una modulada por la estructura geométrica y la frecuencia de la onda acústica). Al igual que en electrónica, donde se combinan diferentes componentes para crear un circuito, por lo que, combinaciones de redes fonónicas producirán sistemas microanalíticos complejos, en chip. Se reconoce que la disposición del transductor descrita aquí (es decir, una oblea piezoeléctrica de LiNbO³ de cristal único) es relativamente costosa. Una forma de mitigar esto es utilizar un superestrato desechable de bajo coste para el acoplamiento con la disposición del transductor. Sin embargo, un enfoque más preferido es fabricar un transductor piezoeléctrico desechable, con la superficie de manipulación de muestra formada en la capa piezoeléctrica, siendo la fabricación del transductor mucho más barata debido a que se evita el uso de un solo material piezoeléctrico de cristal.

En conclusión de esta sección relacionada con las estructuras fonónicas, las estructuras fonónicas pueden ser altamente selectivas en frecuencia y/o longitud de onda. Las estructuras fonónicas interactúan con el campo acústico si funcionan en el régimen operativo correcto, proporcionando buena reflectividad a las ondas acústicas entrantes. Se ha demostrado que tales estructuras se pueden usar para diseñar el campo acústico para proporcionar una manipulación mejorada (como la atomización) de las gotas de líquido desde la superficie del sustrato. Los procesos de manipulación aplicados a la muestra de fluido pueden ser uno o más de:

- movimiento

- mezcla (por ejemplo, dentro de una sola muestra de fluido)

- división de la muestra de fluido

- combinación dos o más muestras de fluidos

- clasificación de muestras de fluidos o partículas (o células) dentro de muestras de fluidos

- atomización

- concentración, incluyendo centrifugación

Además, las realizaciones de la presente invención permiten detectar muestras de fluido (por ejemplo, detectar la ubicación de una o más muestras de fluido) considerando la atenuación de ondas mecánicas recogidas por uno o más transductores en la capa piezoeléctrica.

Estructura del electrodo del transductor

Tal y como se ha comentado anteriormente, En algunas realizaciones preferidas de la presente invención, el transductor incluye una disposición inclinada interdigitada de electrodos, conocido como IDT inclinado o IDT de dedo inclinado.

Los IDT de dedo inclinado se utilizan en terminales de datos como filtros de banda media y banda ancha. Se ha descrito la teoría del uso de electrodos inclinados en microfluídica [Wu, T. & Chang, I., 2005. Actuación y detección de microgotas usando transductores interdigitales de dedos inclinados. Journal of Applied Physics, 98(2), 024903-7]. Sin embargo, no se ha demostrado la realización práctica de tales dispositivos, ya sea con gotas directamente en piezoeléctrico o en un superestrato separado (por ejemplo, desechable). Los inventores investigaron el uso de IDT inclinados en microfluídica, en particular, el uso de un IDT inclinado en combinación con un superestrato separable. La amplitud de SAW excitada por un IDT inclinado no es uniforme y se pueden obtener diferentes perfiles ajustando la frecuencia de entrada. La frecuencia de resonancia, f, depende del paso de los dedos D, y la velocidad del sonido en la oblea piezoeléctrica, c (Ecuación 1, anterior, reproducida en forma ligeramente diferente como la Ecuación 1* a continuación). Por consiguiente, para una frecuencia de entrada dada, la salida de SAW solo se genera cuando el espacio (D/2) entre el IDT satisface la capacidad de los electrodos para soportar la resonancia.

2 D = A = — Ecuación 1*

f

Los inventores fabricaron electrodos IDT divergentes donde tanto la separación del electrodo (D/2) como su ancho (D/2) variaron linealmente de 62,5 micrómetros a 125 micrómetros a lo largo de la abertura. Esto corresponde a longitudes de onda de 250 micrómetros a 500 micrómetros y un rango de frecuencias de 16 MHz a 8 MHz en una oblea de LiNbO³ de 7,62 cm (3 pulgadas) de propagación X de corte en Y de 128 grados, donde c = 3990 m/s. Se utilizaron diez pares de dedos de 15 mm de longitud. Los IDT se modelaron mediante un proceso de despegue. Después de transferir el patrón a una resistencia AZ4562, se evaporó una capa de adhesión de titanio de 20 nm antes de la deposición de 100 nm de oro.

El despegue se realizó luego en acetona, realizando el IDT. El parámetro S se midió para caracterizar el IDT y mostró una respuesta estable para frecuencias entre 8 MHz y 14 MHz (inserción de la figura 17b).

La figura 17a muestra una representación esquemática de la IDT inclinada con la propagación de la SAW en una oblea de niobato de litio para una frecuencia de entrada seleccionada de 13 MHz. Solo esa parte del IDT que admite la condición de resonancia está excitada, resultando en la propagación de una SAW con una abertura menor, en comparación con un electrodo IDT paralelo. De este modo, ajustando la frecuencia, fue posible controlar la posición lateral de la onda de excitación, como se muestra teórica y experimentalmente en la figura 17b.

La figura 17b muestra la frecuencia de entrada experimental necesaria para accionar una gota en la superficie de la oblea de LiNbO³, así como en un cubreobjetos acoplado a la oblea de LiNbO³, en función de la posición, y el cálculo teórico del centro de la ruta de SAW. Los resultados para la oblea de niobato de litio se muestran usando sombreado horizontal y los resultados del cubreobjetos se muestran usando sombreado vertical. La respuesta teórica se muestra usando una línea. El recuadro de la figura 17b muestra la magnitud del parámetro S obtenido con un analizador de red de la serie ENA de Agilent Technologies E5071C. Se utilizó un generador de señal analógica MX5 Agilent Technologies N5181A junto con un amplificador Mini Circuits ZHL-5W-1,5-500 MHz y una fuente de alimentación de 24 V CC, 3 A para alimentar el dispositivo de SAW.

La oblea se fijó con pasta térmica en un disipador de calor para evitar el sobrecalentamiento. La abertura se caracterizó para cada frecuencia de entrada a una potencia de -12 dBm, observando la agitación de una serie de gotas de 1 microlitro dispuestas frente al IDT. Los inventores demostraron que el mismo control espacial de la SAW, usando la frecuencia de excitación, puede extenderse a aplicaciones que implican el uso de un superestrato separable acoplado a la oblea de LiNbO³. En este caso, se utilizó un cubreobjetos de vidrio no modificado como el superestrato separable, y la posición de la sierra en el cubreobjetos a las frecuencias dadas se comparó directamente con la posición de la sierra en la oblea de niobato de litio nativo (figura 23b). Se encontró que el ancho lateral del haz de sAw a una frecuencia dada en el sustrato (cubreobjetos) era mayor (16 % en promedio) que el directamente en la oblea piezoeléctrica, debido a la difracción de la onda en el proceso del acoplamiento.

La posición lateral móvil del haz de SAW usando el IDT inclinado se usó para accionar una gota microfluídica. Los inventores demostraron que un IDT sintonizable puede proporcionar SAW a una gota para inducir un flujo rotacional en la gota, y por lo tanto centrifugar partículas en la gota para concentrarlas en el centro de la gota. Los resultados son visibles en las figuras 24 del documento WO2011/023949 y la descripción asociada en el documento WO2011/023949.

Lejos de limitarse a la concentración de partículas, Los IDT inclinados brindan la oportunidad de programar múltiples funciones con un solo electrodo. Los inventores demostraron que es posible mover, unir, mezclar y centrifugar una gota sobre un superestrato de vidrio ajustando la frecuencia de la señal de entrada. Los resultados se muestran en la figura 25 del documento WO2011/023949 y la descripción asociada del documento WO2011/023949.

Es posible integrar la formación de coloides en el chip con dispersión Raman de superficie mejorada (SERS) y dispersión Raman de resonancia mejorada de superficie (SERRS) para la detección de bioanalitos sensibles. Los inventores han demostrado que un iDt inclinado, en el que la posición lateral del tren de emisión de SAW depende de la frecuencia de entrada, se puede usar para diseñar funciones fluidas complejas directamente en un chip. Los inventores han demostrado el potencial de esta poderosa herramienta para manipular gotas y partículas dentro de las gotas. En contraste con las técnicas conocidas, Una clara ventaja de este método flexible radica en la capacidad de inducir la transmisión en una gota en una dirección elegida y en cualquier posición.

Si bien las técnicas conocidas también se limitan a variar la potencia de entrada para controlar la concentración de partículas, los inventores han demostrado que es posible controlar la concentración de partículas en una gota cambiando la posición de la SAW (es decir, moviendo la posición lateral del tren de emisión de SAW) y, por lo tanto, su región de interacción con la gota. Los inventores también demostraron que las tareas complejas se pueden programar secuencialmente en un solo dispositivo de IDT, demostrando que se pueden mover dos gotas, fusionar, mezclar y centrifugar en un superestrato (en este caso un superestrato de vidrio desechable). Este último ejemplo muestra la flexibilidad de la plataforma para operaciones fluídicas básicas necesarias en tecnologías de laboratorio en un chip.

En el campo de la microfluídica de SAW se ha informado que la onda de Rayleigh de SAW, que normalmente se propaga en la oblea piezoeléctrica, se puede acoplar en un superestrato desechable como una onda de Lamb, proporcionando una ruta clara por la cual la tecnología 'laboratorio en chip' se puede aplicar a bajo coste, diagnóstico de punto de atención. En esta configuración conocida, la excitación acústica superficial en la oblea piezoeléctrica generalmente se acopla al superestrato a través de una delgada interfaz de película líquida. Los inventores ahora han demostrado un nuevo concepto en la microfluídica de SAW, que combina el uso de un superestrato separable que está acoplado a una disposición de transductor que incluye, por ejemplo, un IDT de dedo inclinado. En los dispositivos descritos anteriormente, se utilizó un cubreobjetos de vidrio desechable como el superestrato separable. Los inventores han proporcionado un método poderoso por el cual es posible manejar gotas y partículas de una manera programable, y han demostrado, por ejemplo, movimiento de gotas, fusión y centrifugación, en el mismo superestrato, con solo la necesidad de cambiar la frecuencia de excitación de SAW para lograr un alto grado de integración funcional.

Manipulación de muestras - lisis celular

Los presentes inventores han demostrado el uso de ondas acústicas de superficie (SAW) para lisar células y sangre en gotas del tamaño de microlitros. La preparación de muestras es un componente clave de los sistemas de "laboratorio en chip" (LOC). Más particularmente, la lisis celular y el manejo de la sangre generalmente se requieren para una amplia gama de ensayos biológicos en aplicaciones de diagnóstico. Recientemente, las metodologías mecánicas libres de químicos superaron las limitaciones de traducir los procedimientos tradicionales, implicando agentes líticos y lavados posteriores, en plataformas microfluídicas, que surgió de los efectos perjudiciales de los químicos sobre las moléculas a analizar. Sin embargo, estas nuevas técnicas a menudo requieren sistemas externos impulsados por la presión que limitan su integración en sistemas LOC independientes, o el uso de altas energías (calor, electricidad o ultrasonidos) que pueden comprometer las moléculas. La presente invención hace uso de los campos de presión acústica y la corriente de líquido inducida en una gota por sAw . Los métodos según la presente invención llevados a cabo en muestras biológicas dieron como resultado la lisis de más del 99,8 % de todas las células en las muestras. La disponibilidad de material intracelular en la suspensión resultante se estudió con mediciones de absorbancia óptica y fue comparable a un procedimiento químico de laboratorio. Los presentes inventores también demostraron que las condiciones necesarias para la lisis se pueden lograr utilizando diferentes plataformas de SAW, proporcionando múltiples rutas para integrar la preparación de muestras en un ensayo completo en un microchip.

El trabajo relevante de los inventores sobre la lisis celular se muestra en el documento WO2011/023949, específicamente en relación con las figuras 26-30 del documento WO2011/023949 y la descripción asociada del documento WO2011/023949.

Realizaciones preferidas de la invención

Diversas realizaciones preferidas de la invención requieren que la muestra de fluido a manipular en el aparato esté contenida dentro del aparato. Esto es particularmente para evitar la posible contaminación del usuario. También se prefiere que el aparato sea robusto. Además, se prefiere particularmente que el aparato sea desechable (es decir, que funcione de manera rentable como un aparato de un solo uso). En tal aparato, es importante que las características de la superficie de manipulación se alineen de manera correcta y reproducible con respecto a las SAW y esto con respecto a la estructura del electrodo del transductor.

La configuración divulgada en el documento PCT/GB2010/001600 (presentada el 24 de agosto de 2010 por el mismo solicitante que la presente solicitud y publicada como WO2011/023949) utiliza un superestrato, acoplado de forma desmontable a un sustrato transductor. Se puede ejecutar un ensayo sobre el superestrato, transmitiéndose las SAW y propagándose a través de la superficie del superestrato. El superestrato puede ser un superestrato de un solo uso. Sin embargo, para aplicaciones exigentes como diagnósticos, tal aparato puede enfrentar desafíos. En particular, el acoplamiento entre el superestrato y el sustrato del transductor es crucial para transmitir la potencia. Un acoplamiento menos eficiente reduce el rendimiento. Un acoplamiento menos reproducible reduce aún más el rendimiento del dispositivo en términos de previsibilidad de operación. La alineación de las estructuras fonónicas en el superestrato con la emocionante apertura SAW que se propaga en el sustrato del transductor también tiene una influencia significativa en el rendimiento de la red fonónica. Limitar el superestrato implicaría más problemas de alineación.

En las realizaciones preferidas de la presente invención, las estructuras fonónicas (en forma de disposición de los elementos de dispersión de SAW), el actuador de SAW (generalmente un transductor interdigitado, IDT), y los fluidos (ya sea como canales o gotas) están en capas en un solo aparato. La forma de dicho aparato permite controlar la alineación de la superficie de manipulación de la muestra y la estructura del electrodo del transductor durante la fabricación del aparato. De manera similar, el acoplamiento entre el transductor y la superficie de manipulación puede hacerse fiable y eficiente. Además, la estructura del aparato se presta bien para ser fabricada a través de un proceso de fabricación en capas, lo que a su vez ayuda a permitir la producción en masa del aparato. Las técnicas de producción adecuadas se basan en la deposición de la capa de material generador de SAW (por ejemplo, la capa piezoeléctrica) mediante serigrafía, pulverización catódica, fundición, deposición de solución, rasqueta, depósito de electroforesis o laminado, por ejemplo. Estos procesos pueden tener lugar en un formato de carrete a carrete, por ejemplo. Una o más capas del aparato pueden estar formadas por un material relativamente barato, tal como plásticos o papel. Se pueden formar otras capas por deposición de capas (por ejemplo, serigrafía, pulverización catódica, fundición, laminado, etc., tal y como se ha mencionado antes).

La figura 18 muestra una vista en sección transversal esquemática a través de un aparato de fluidos de acuerdo con una realización de la invención. Una primera capa piezoeléctrica 102 está formada sobre un sustrato 104. El sustrato 104 puede formarse, por ejemplo, de plásticos (por ejemplo, PET, PC, etc.), y sirve para soportar la capa piezoeléctrica 102 durante su formación y también sirve para soportar el aparato como un todo en uso. En algunas realizaciones, el sustrato 104 no necesita estar presente, por ejemplo, donde el aparato es autosuficiente. La segunda capa piezoeléctrica 106 se encuentra en la parte inferior del segundo sustrato 108.

Las capas piezoeléctricas pueden estar formadas como un material compuesto, por ejemplo, con una capa de ZnO sobre un sustrato de SU-8 o cerámica. El material compuesto puede ser una dispersión de partículas piezoeléctricas en una matriz polimérica, descrita en mayor detalle a continuación. Como alternativa, las capas piezoeléctricas se forman cada una como una capa a granel, por ejemplo, de LiNbO³.

Las superficies de la primera y segunda capas piezoeléctricas son superficies de manipulación de muestras. Estas superficies entre las mismas entonces definen un canal 110 para una muestra de fluido.

La primera estructura de electrodo del transductor 112 está incrustada en la parte inferior de la primera capa piezoeléctrica 102. La estructura del electrodo del transductor tiene la forma de un electrodo interdigitado, tal y como se describe con mayor detalle anteriormente. De manera similar, la segunda estructura de electrodo de transductor 114 está incrustada en el lado superior de la segunda capa piezoeléctrica 106.

Una primera disposición de elementos de dispersión de SAW 116 se forma en la primera capa piezoeléctrica 102, desplazada longitudinalmente de la primera estructura de electrodo del transductor 112. Cada elemento de dispersión de SAW toma la forma de una cavidad formada en la capa piezoeléctrica. Los elementos de dispersión de SAW se pueden formar mediante grabado o estampado, por ejemplo. En realizaciones alternativas, cada elemento de dispersión de SAW puede estar formado por un material mecánicamente contrastante, por ejemplo, llenando una cavidad adecuada con un material de relleno. Un material de contraste mecánico adecuado puede ser un medio capilar (por ejemplo, líquido, gel, polímero, papel, etc.) u otro material (metal, polímero, compuesto, etc.). Una segunda disposición de elementos de dispersión de SAW 118 se forma de manera similar en la segunda capa piezoeléctrica 106. Cada elemento de dispersión de SAW se cruza con la superficie de manipulación de la muestra. La figura 19 muestra la vista a lo largo de la segunda A-A' en la figura 18, mostrando la geometría reticular regular de la disposición de los elementos de dispersión de SAW.

Las estructuras de electrodo del transductor 112, 114 pueden fabricarse mediante, por ejemplo, gofrado/litografía, pulverización catódica, electrodeposición, etc. El material de las estructuras de los electrodos puede ser cualquier material adecuado tal como oro, platino, etc.

La estructura del aparato mostrado en las figuras 18 y 19 pueden modificarse como se muestra en las figuras 20 y 21. En la figura 20 (dibujo superior), se puede usar una estructura de electrodo de transductor modificado 120, en la que el electrodo está incrustado en la parte inferior de la segunda capa piezoeléctrica 106. De esta manera, el electrodo se forma en la misma superficie que la superficie de manipulación de la muestra.

En la figura 20 (dibujo inferior), se puede usar una estructura de electrodo transductor modificada adicional 122, en la que el electrodo está incrustado en la segunda capa piezoeléctrica 106, de modo que se extiende a través del espesor de la segunda capa piezoeléctrica 106.

En la figura 21 (dibujo superior), los elementos de dispersión de SAW 124 se modifican en comparación con los elementos de dispersión de SAW 116 en las figuras 18 y 19. En la figura 21 (dibujo superior), los elementos de dispersión de SAW 124 se extienden a través del espesor de la primera capa piezoeléctrica 102.

En la figura 21 (dibujo inferior), los elementos de dispersión de SAW 126 también se modifican en comparación con los elementos de dispersión de VI 116 en las figuras 18 y 19. En la figura 21 (dibujo inferior), los elementos de dispersión de SAW 126 se extienden solo hasta aproximadamente la mitad del espesor de la primera capa piezoeléctrica 102.

El aparato de la figura 18 se puede operar aplicando la misma señal (o señales diferentes) a las estructuras de electrodo de transductor primera y segunda 112, 114 para generar SAW en las superficies de manipulación de muestra. Por lo tanto, una muestra de fluido ubicada en el canal 110 se somete a las SAW de la manera descrita anteriormente. Los elementos de dispersión de SAW 116, 118 interactúan con las SAW para afectar su transmisión o distribución, por ejemplo, y esto a su vez afecta la muestra de fluido. La forma en que las SAW afectan la muestra de fluido debido a su interacción con los elementos de dispersión de la SAW ya se ha discutido en detalle, y se describe más adelante en el contexto de las realizaciones preferidas.

Las figuras 22-25 muestran modificaciones de la estructura del aparato de la figura 18. Se usan números de referencia similares para características similares, y no se describen nuevamente aquí.

En el aparato mostrado en la figura 22, el canal 130 se forma entre la superficie de manipulación de muestra y una capa de encapsulación 132. La función de la capa de encapsulación 132 es simplemente encerrar el canal 130, para que el fluido pueda moverse a lo largo del canal por acción capilar, o mediante la acción de la SAW como una bomba.

En el aparato mostrado en la figura 23, la superficie de manipulación de la muestra queda expuesta. La gota 134 es localizable en la superficie de manipulación de muestra, para la interacción con las SAW (modificada por los elementos de dispersión de SAW 116) como se describió anteriormente.

La figura 24 muestra una modificación del aparato de la figura 23, en el que se forma una capa de pasivación 136 sobre la superficie superior de la capa piezoeléctrica 102. La capa de pasivación permite seleccionar el fluido de interés independientemente de cualquier preocupación sobre la interacción química entre la capa piezoeléctrica 102 y el fluido. La capa de pasivación toma esencialmente el papel del superestrato descrito anteriormente, pero en este caso, la capa de pasivación se fija en términos de posición sobre la capa piezoeléctrica en el momento de la fabricación del aparato y no se retira en uso y no está destinada a ser retirada.

La figura 25 muestra una modificación del dispositivo de la figura 22. En esta modificación, los elementos de dispersión de SAW 138 se extienden a través de la capa piezoeléctrica, a través del canal y hacia la capa de encapsulación 132. Como será evidente, se pueden hacer modificaciones similares al aparato mostrado en las figuras 31-34, 36-37. Los elementos de dispersión de SAW 138 aquí están formados del mismo material que la capa de encapsulación 132, pero podrían estar formados de un material diferente. Los elementos de dispersión de SAW, por lo tanto, proporcionan funcionalidad adicional, por ejemplo, atrapamiento o filtrado (trabajando como una membrana con un tamaño de poro específico), o puede alterar el flujo hidrodinámico de una manera que depende de su geometría. Por ejemplo, las cuentas de diferentes tamaños que pasan a lo largo del canal se desviarían de una manera específica de tamaño (Keith J. Morton et al. PNAS 2008 105 (21) 7434-7438; doi: 10.1073/pnas.0712398105)).

El diseño de la estructura del electrodo del transductor puede seleccionarse para controlar la abertura de las ondas acústicas. Esto es como se analizó anteriormente, con referencia a un IDT inclinado (en el que el espacio entre los dedos cambia a lo largo del ancho de la estructura del electrodo del transductor) o un IDT enfocado (en el que la energía se enfoca en un punto particular en el canal capilar - ver abajo).

Se pueden introducir otros transductores o electrodos eléctricos para estar en comunicación con la superficie de manipulación de muestras para que sirvan como medios de manipulación adicionales, tal como realizar dielectroforesis, realizar lisis y/o detectar partículas o moléculas o cuantificar el flujo. De manera adicional o alternativa, uno o más sensores pueden estar en comunicación con la superficie de manipulación de muestras. Los sensores adecuados incluyen sensores de impedancia, sensores electroquímicos, etc.

Las figuras 26-28 ilustran el uso del aparato para llevar a cabo la nebulización de la muestra. Se sabe que utiliza dispositivos de SAW para preparar muestras para análisis, por ejemplo, para espectrometría de masas. Véanse, por ejemplo Heron et al (2010) [S.R. Heron et al "Surface Acoustic Wave Nebulization of Peptides As a Microfluidic Interface for Mass Spectrometry" Anal. Chem. 2010, 82, 3985-3989], cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. El uso de dispositivos de SAW para nebulizar muestras de fluido para espectrometría de masas tiene varias ventajas sobre los enfoques conocidos de la ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) y la ionización por electroaspersión (ESI).

En la figura 26, el aparato de la figura 28 se usa para llevar a cabo la nebulización. El aparato se controla de modo que la muestra nebulizada 150 pueda salir del aparato desde el extremo del canal 110.

En la figura 27, el aparato de la figura 18 se modifica para proporcionar una sección abierta 154 del aparato, desde el que la muestra nebulizada 152 puede salir del aparato.

En las figuras 26 y 27, la muestra nebulizada se dirige a un espectrómetro de masas (no mostrado) u otro dispositivo analítico de fase gaseosa, para su posterior análisis.

En la figura 28, el aparato de la figura 18 se modifica adicionalmente para proporcionar un depósito para alimentar la nebulización de la muestra 156. Por lo tanto, el aparato opera como una bomba. La muestra 156 se mantiene en el depósito 158. En la manera indicada en la figura 26, el aparato se opera para proporcionar una pluma de nebulización 160 desde una salida del aparato. Se extrae una muestra adicional 156 a lo largo del canal de flujo en el aparato en la dirección mostrada por la flecha 162, para reemplazar la muestra perdida del aparato por nebulización.

Se entenderá que el aparato mostrado en las figuras 26-28 también se puede utilizar para proporcionar la evaporación de la muestra, además de o en lugar de nebulización. En cada uno de los aparatos, el canal 130 puede estar abierto o puede contener un medio capilar tal como papel.

El aparato ilustrado en las figuras 18-28 tiene la ventaja de la fabricación rentable y los materiales están disponibles. Tal como se ha explicado anteriormente, las estructuras fonónicas se pueden alinear con el transductor en el momento de la fabricación. Cuando se proporciona un canal cerrado, esto puede mitigar la contaminación y/o la evaporación. Las estructuras fonónicas pueden fabricarse para proporcionar adicionalmente estructuras fluídicas (por ejemplo, como en la figura 25). Además, y como se explica más adelante, es posible ubicar reactivos en el aparato para que los reactivos estén preenvasados en el aparato.

Las figuras 29-37 ilustran configuraciones adecuadas adicionales para aparatos de acuerdo con realizaciones de la invención. Características similares reciben los mismos números de referencia en estos dibujos y la descripción de características similares no se repite necesariamente.

En la figura 29, la capa piezoeléctrica 200 tiene la estructura de electrodo transductor 202 formada incrustada en el lado de la superficie de manipulación de muestras de la capa piezoeléctrica. Los elementos de dispersión de SAW, también formados en el lado de la superficie de manipulación de muestras de la capa piezoeléctrica, son en forma de cavidades abiertas 204.

La figura 30 es similar a la figura 29, excepto que la estructura del electrodo transductor 206 está formada incrustada en el lado opuesto al lado de la superficie de manipulación de muestra de la capa piezoeléctrica 200.

La figura 31 es similar a la figura 30, excepto que los elementos de dispersión de SAW, formados en el lado de la superficie de manipulación de muestras de la capa piezoeléctrica, son en forma de columnas verticales o pilares 208. Estos pueden estar formados del mismo material que la capa piezoeléctrica.

La figura 32 corresponde a una estructura formada tomando dos aparatos de acuerdo con la figura 30 e invirtiendo uno para oponerse a los elementos de dispersión de SAW a través del canal 210. Este aparato es similar al que se muestra en la figura 18.

El aparato que se muestra en la figura 33 difiere de la figura 32 en que la segunda capa piezoeléctrica tiene una disposición diferente de los elementos de dispersión de SAW 212. Los elementos de dispersión de SAW en la segunda capa piezoeléctrica tienen una periodicidad diferente y están desplazados de, los elementos de dispersión de SAW 214 en la primera capa piezoeléctrica. El efecto de esto es proporcionar una distribución más compleja de SAW en las superficies de manipulación de muestras y el control correspondiente sobre la manipulación de la muestra de fluido en el canal 210. Esta estructura tiene una utilidad particular donde el fluido de muestra está sujeto a la separación de fases de modo que una fase está en contacto con la superficie de manipulación de muestra de la primera capa piezoeléctrica y la otra fase está en contacto con la superficie de manipulación de muestras de la segunda capa piezoeléctrica. Dado que las dos fases en general pueden tener diferentes propiedades mecánicas, en general, es más conveniente utilizar diferentes disposiciones de elementos de dispersión de SAW para controlarlos.

El aparato mostrado en la figura 34 tiene una primera 216 y segunda 218 capas piezoeléctricas. Ambas capas tienen estructuras de electrodo de transductor asociadas, pero en el dibujo solo se muestra la primera estructura 220 de electrodo transductor. Entre las superficies de manipulación de muestra respectivas de la primera y segunda capas piezoeléctricas se define un canal de flujo de muestra 222. Los elementos de dispersión de SAW 224 y 226 están dispuestos para extenderse desde las capas piezoeléctricas primera y segunda, respectivamente. En la figura 34, los elementos de dispersión de SAW 224 y 226 tienen una periodicidad similar pero están desplazados entre sí de modo que las dos disposiciones de los elementos de dispersión de SAW están fuera de fase. En operación, los elementos de dispersión de SAW sirven tanto para afectar la propagación y distribución de las SAW en las superficies de manipulación de la muestra como también para afectar el flujo de fluido a lo largo del canal. Los elementos de dispersión de SAW proporcionan una matriz de pilares verticales. Esto puede proporcionar una función de separación, para separar un componente del fluido de muestra de otro componente del fluido de muestra. Por ejemplo, la disposición puede permitir la separación de una fase de otra en la muestra de fluido, generándose las diferentes fases, por ejemplo, durante la operación del aparato.

La figura 35 ilustra una realización adicional en la que el canal 230 se define entre una superficie de manipulación de muestra de la capa piezoeléctrica y una capa de encapsulación 232. Adicionalmente, se proporciona un sensor 234 en la superficie de manipulación de muestras. El sensor puede ser, por ejemplo, un sensor sensible para detectar SAW. Como alternativa, el sensor puede ser un sensor térmico (por ejemplo, para determinar la temperatura). Como alternativa, el sensor puede ser un sensor de conductividad (o impedancia). En particular, puede usarse un sensor de conductividad para determinar la presencia o ausencia de una muestra de fluido (conductor) en el canal 230. Alternativamente, el sensor puede ser un sensor electroquímico, tal como un sensor adaptado para detectar una reacción electroquímica predeterminada o un sensor de pH.

En otras realizaciones, el sensor 234 puede ser reemplazado por un actuador. Actuadores adecuados incluyen calentadores. En una realización, un calentador puede estar formado por un transductor que funciona para generar SAW que posteriormente se disipan en el aparato como calor. En otra realización, se puede proporcionar un calentador como elemento de calentamiento resistivo. A continuación se detallan más detalles sobre la incorporación de calentadores (en el contexto de la PCR).

La figura 36 ilustra un aparato de nebulización alternativo. La boquilla 236 está formada en la capa de encapsulación 232 y está ubicada en registro con la disposición de los elementos de dispersión de SAW. En operación, una muestra de fluido es nebulizada por el aparato y se le permite salir del aparato a través de la boquilla 236.

La figura 37 ilustra una modificación del aparato de la figura 35, en el que la capa piezoeléctrica tiene una cámara 240 formada en la misma y la capa de encapsulación tiene una cámara 242 formada en la misma. Los reactivos pueden almacenarse en estas cámaras, para usarse durante la operación del dispositivo, por ejemplo, para llevar a cabo un ensayo.

En realizaciones adicionales, la superficie de manipulación de la muestra puede modificarse para proporcionar sitios de unión para moléculas biológicas o especies de interés (por ejemplo, ADN, ARN, anticuerpos, etc.).

En cada una de las realizaciones analizadas anteriormente, la disposición de los elementos de dispersión de SAW comprende una matriz periódica de defectos (sustancialmente) puntuales para la dispersión de las SAW.

Los presentes inventores consideran que se puede obtener un efecto similar usando una cresta, canal (o más generalmente, paso lineal) en la superficie de manipulación de muestra para proporcionar efectos útiles en términos de distribución de SAW. Por ejemplo, un superestrato puede estar provisto de crestas que forman una forma de cono, para controlar una gota, en lugar de la matriz periódica de elementos de dispersión de SAW basados en cavidades.

El material para la capa piezoeléctrica (u otra capa de material generador de SAW) puede seleccionarse del grupo que consiste en LiNb¿³, PZT, BaTiܳ, SbTiܳ, ZnO, Siܲ, AIN, LiTaܳ, Al²Ü³ GaAs, SiC y fluoruro de polivinilideno (PVDF). De estos, de LiNbO³ o ZnO son particularmente preferidos.

Para formar el aparato de fluidos de manera compatible con el procesamiento en masa de coste relativamente bajo, es necesario considerar el uso de capas de material piezoeléctrico que no tienen la forma de un solo cristal. El crecimiento de cristales individuales a granel es costoso y la formación de películas delgadas epitaxiales generalmente requiere el uso de un sustrato de cristal único (también costoso). El crecimiento epitaxial también suele ser relativamente lento.

Por lo tanto, se prefiere formar la capa piezoeléctrica utilizando un proceso de deposición seleccionado del grupo que consiste en: pulverización catódica, impresión en tamiz, fundición, rasqueta, recubrimiento por inmersión, deposición de solución y electroforesis. Adicionalmente, es posible depositar imprimiendo una tinta que comprende partículas de material piezoeléctrico retenidas en una suspensión fluida.

Otros autores han producido una revisión de la formación de películas de ZnO para su uso en sensores biológicos basados en SAW, en Fu et al (2010) [Y. Q. Fu et al "Recent developments on ZnO films for acoustic wave biosensing and microfluidics applications: a review" Sensors and Actuators B: Chemical 143 (2010) 606-619]. En ese documento, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad, se discute la deposición de películas policristalinas de ZnO utilizando pulverización catódica con magnetrón rf. La pulverización se puede realizar a una temperatura relativamente baja (significativamente inferior a 200 °C). Dependiendo de las condiciones, se muestra que la película de ZnO puede formar una microestructura policristalina, amorfa, nanocristalina o microcristalina. Además, se muestra que películas policristalinas texturizadas son posibles. En función de esto, la persona experta puede fabricar capas piezoeléctricas adecuadas a partir de diferentes materiales piezoeléctricos sobre sustratos adecuados de acuerdo con el propósito específico al que se colocará el aparato de fluidos.

No es necesario utilizar solo materiales piezoeléctricos para la capa de material de generación de SAW. Hay una serie de enfoques para la generación de ultrasonidos que serán conocidos por la persona experta, por ejemplo, usando transductores piezoeléctricos, electromagnéticos o magnetostrictivos. Dichos transductores pueden operar en el régimen de GHz. Por ejemplo, se sabe que forma un dispositivo de SAW magnetoestrictivo, como se discutió en G. Scheerschmidt et al (2010) [G. Scheerschmidt et al "Resonance modes of magnetically generated surface waves in acoustic wave guide systems" Journal of Magnetism and Magnetic Materials 322 (2010) 1628-1630], cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Las figuras 38 y 39 ilustran el efecto de la frecuencia de SAW en el modo de operación del aparato. En la figura 38, una matriz fonónica se modela a una frecuencia de SAW de 12,62 MHz. El efecto de esto es establecer una distribución particular de SAW en la superficie de manipulación de la muestra. En la figura 39, la misma matriz fonónica se modela a una frecuencia de SAW de 9,45 MHz. El efecto de esto es establecer una distribución diferente de SAW en la superficie de manipulación de la muestra.

Control de temperatura

En una realización adicional, la presente invención es de interés para llevar a cabo ensayos o reacciones que requieren cambios de temperatura, y en particular que requieren ciclos térmicos.

El diagnóstico del punto de atención (POC) a menudo se basa en el análisis de ácidos nucleicos en muestras biológicas, para la detección de enfermedades específicas tal como la gripe o la clamidia. A pesar del aumento de la sensibilidad en sensores recientemente desarrollados, todavía existe la necesidad de amplificar las moléculas de interés antes de la detección para lograr relaciones significativas de señal a ruido. El método de elección sigue siendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus numerosas variantes, que dependen de las temperaturas del ciclo para activar las enzimas biológicas. Para realizar una PCR, la muestra se mezcla con enzimas que replican moléculas de ADN (polimerasa) basadas en una plantilla, que está hecho de la muestra y se agregaron secuencias cortas de ADN de cebador, usando nucleótidos añadidos a la mezcla de reacción. Algunas variantes, como la PCR isotérmica (PCR isotérmica mediada por bucle, LAMP, por ejemplo) no requieren ciclos, sino una temperatura constante.

Otras etapas de un ensayo POC pueden requerir calentamiento cuando se producen reacciones biológicas específicas. Por ejemplo, células del paciente, tal como linfocitos T, se pueden cultivar en un reactor calentado (37 °C) para expresar citocinas que se detectan como un biomarcador de infección latente de tuberculosis [kit Quantiferon, Cellestis, Australia].

Los sistemas de laboratorio en chip (LOC) se han desarrollado para realizar ciclos de temperatura o calentamiento, generalmente basado en calentadores de metal en la superficie de un microchip [Neuzil P. et al, Mol. BioSyst., 2006, 2, 292-298]. Además de traer restricciones de diseño rígidas, como su ubicación es fija, estos calentadores requieren una conexión eléctrica suplementaria y una fuente de alimentación, lo cual es un desafío para los sistemas POC que funcionan con baterías.

Es bien sabido que los transductores piezoeléctricos utilizados para generar las SAW o cualquier material por el que viajan las ondas, se calientan debido a pérdidas mecánicas por las vibraciones. En realidad, se dedica un gran esfuerzo en este campo a reducir este calor para evitar el fallo temprana del dispositivo. Este fenómeno se ha utilizado para calentar gotas de agua [Kondoh J. et al., Transacciones IEEE en ultrasonidos, ferroeléctrica y control de frecuencia, 52, 2005 1881-1883] con la intención de realizar PCR [Kondoh J. et al., Sensores y actuadores A 149 (2009) 292-297].

Los presentes inventores encuentran que el calor puede controlarse en una estructura fabricada en masa (o de hecho en un superestrato) utilizando la potencia aplicada a la excitación de la SAW. El calor generado por la SAW se disipa a través de un disipador de calor para enfriar la muestra y, por lo tanto, proporciona un medio para regular la temperatura. Estructuras fonónicas, con la capacidad de dar forma a la energía acústica, se puede usar para controlar el calentamiento de una muestra utilizando la frecuencia de excitación como un interruptor entre diferentes funciones. La energía acústica se puede canalizar hacia un elemento calefactor para una frecuencia, pero usado para otras funciones microfluídicas, con menos calor, a otras frecuencias.

Esta capacidad constituye otro módulo más en las funciones microfluídicas que se pueden realizar utilizando SAW, que facilita la integración de un ensayo biológico completo, de la preparación, amplificación y detección de la muestra, en una sola plataforma.

Los inventores realizaron pruebas basadas en superestratos y monocristales de LiNbO³, aunque el concepto se aplica de manera similar al uso de capas piezoeléctricas en forma de películas policristalinas, siendo la superficie de manipulación de la muestra la superficie de la capa piezoeléctrica. El superestrato se une con gel a la superficie IDT, que se sitúa sobre el disipador de calor.

A medida que aumenta la potencia en el dispositivo, la temperatura del superestrato aumenta, así como la de las muestras. En un ejemplo, se investigó el calentamiento de dos gotas de aceite mineral de 10 pl en un superestrato de silicio. La potencia utilizada aquí fue de -4 dBm a 19,13 MHz. El valor de emisividad utilizado por la cámara FUR (Fluke) fue de 0,95.

La temperatura de la muestra está vinculada a la potencia de la señal de excitación, como se muestra en la figura 40. Los resultados graficados en la figura 40 son para el calentamiento de una gota de agua de 10 pl en un sustrato de silicio a 9,77 MHz. La temperatura se observó con una cámara IR.

Usando la potencia como un mango para controlar la temperatura, se puede lograr un ciclo de temperatura. La figura 41 muestra el ciclo de temperatura de una gota de agua de 1 pl encapsulada en 10 pl de aceite en un sustrato de silicio para evitar la evaporación. Las temperaturas de la gota de agua en los ciclos son 98, 72 y 58 °C.

El calentamiento de materiales con ondas acústicas depende de la forma en que absorben la energía de las deformaciones. Los materiales blandos (bajo módulo de Young) deberían absorber más que los más duros, lo que se traduce en más calor. Confiando en la conducción de calor de la superficie de manipulación, este aumento de calor se difunde a una muestra colocada cerca.

Usando las estructuras fonónicas, entonces es posible proteger el área de material blando de las olas para reducir el calor en algunas frecuencias de excitación, mientras que las ondas pueden enfocarse en esa área en otras frecuencias, aumentando la temperatura. Esto proporciona un cambio entre una función de calentamiento mejorada y otras funciones microfluídicas, para las cual el calor puede no ser deseable (movimiento, centrifugación). Este principio se ilustra en las figuras 42 y 43, que muestran calentamiento dependiente de la frecuencia a través de un área de absorción 300. A la frecuencia f (figura 42), la onda acústica se propaga principalmente hacia la muestra 302, mientras que a la frecuencia f² (figura 43), se propaga hacia el área de absorción, resultando en un aumento de temperatura. A continuación se explican los medios adecuados para proporcionar diferentes intensidades de SAW (indicadas por el tamaño de las flechas 304, 306 en la figura 42).

Como se entenderá, el aparato incluye preferiblemente un sensor de temperatura para permitir el control dirigido de la generación de SAW para controlar la temperatura.

La distribución espacial de la energía acústica se puede controlar fácilmente utilizando un IDT inclinado o varias configuraciones fonónicas como se detalla en las figuras 44-50, para proporcionar calentamiento dependiente de la frecuencia.

En la figura 44, utilizando un IDT inclinado 308, la abertura de la SAW se puede localizar donde el espacio entre los dedos es compatible con la resonancia a una frecuencia particular. Aquí la frecuencia f (tren de SAW 310) se usa para calentar el material absorbente 300, mientras que la frecuencia f² (tren de SAW 312) se usa para activar la muestra 302. En este caso, f < f².

En la figura 45, el filtro fonónico 314 puede filtrar las ondas que se propagan a la frecuencia f¹, resultando en un calentamiento limitado al reducir la amplitud de las SAW que pueden alcanzar el material absorbente de calor 300, pero con la activación muestra, mientras que el calentamiento puede promoverse para la frecuencia f², fuera del hueco de banda de filtro como se muestra en la figura 46. Esta configuración tiene la ventaja de activar la muestra en ambas configuraciones, que podría promover la mezcla durante el calentamiento.

En las figuras 47 y 48, una lente fonónica 316 enfoca la onda acústica en diferentes posiciones para diferentes frecuencias f y f². El efecto de enfoque aumenta aún más el calentamiento.

En las figuras 49 y 50, para evitar la activación de la muestra 302 durante el calentamiento (por ejemplo, para cultivo celular), se puede usar una configuración de doble filtro, en el que el primer filtro 318 permite la transmisión de SAW de frecuencia f² pero bloquea las SAW de frecuencia f y el segundo filtro 320 permite la transmisión de SAW de frecuencia f¹ pero bloquea las SAW de frecuencia f².

La estructura cristalina fonónica en sí misma puede usarse como una estructura absorbente específica. Cuando se elige la frecuencia de excitación en el intervalo de banda de la estructura fonónica, las ondas se pueden dispersar dentro de la misma. Cuando la estructura fonónica está hecha de un material absorbente (blando), entonces esta dispersión da como resultado un mayor calentamiento, en comparación con el uso de una frecuencia fuera del hueco de banda. Dicha estructura fonónica se puede formar utilizando pilares de plástico (PDMS, poliestireno) u orificios rellenos con material blando en una matriz más rígida (PDMS en silicio, por ejemplo).

Procesamiento de muestras sólidas

Aunque los ensayos de diagnóstico comunes se realizan en analitos en fluidos corporales, tal como sangre u orina, debido a su accesibilidad, también hay un interés significativo en detectar analitos en muestras sólidas. Estos incluyen biopsias de tumores en varios tipos de cáncer o heces, donde la presencia de sangre puede ser un biomarcador para el cáncer de intestino, por ejemplo. Estas muestras sólidas son difíciles de procesar, especialmente en ensayos de punto de atención que a menudo se basan en microfluídica, ya que las muestras sólidas necesitan romperse. Otras metodologías que dependen de mediciones directas están limitadas por el hecho de que estas muestras son altamente heterogéneas, de modo que se necesitaría un muestreo múltiple en diferentes ubicaciones para evitar una alta tasa de resultados falsos positivos.

Los medios comunes para romper las muestras sólidas a menudo se basan en aplastarlas mecánicamente en una matriz líquida, utilizando fuerzas de corte de un flujo de líquido, agregando cuentas o aplicando gradientes de muy alta presión. Otro método utiliza energía acústica en el rango ultrasónico para romper el tejido y las células, mediante la inducción de cavitación [Timothy L. Hall et al., Transacciones IEEE en ultrasonidos, ferroeléctrica y control de frecuencia, 54, 2007, 569-575] o usando transmisión acústica junto con cuentas. Sin embargo, la mayoría de estas técnicas deben realizarse fuera de chip, limitando su aplicación en el entorno POC.

En otra realización de la invención, las SAW se usan para combinar la transmisión con vibraciones mecánicas para detectar analitos en muestras sólidas (o sustancialmente sólidas) tales como tejidos. Esto tiene la ventaja de homogeneizar rápidamente la muestra para aumentar la confianza en los resultados de la prueba de diagnóstico, y puede integrarse fácilmente con otras funciones microfluídicas.

Además de proporcionar vibraciones mecánicas del soporte y el tejido colocado en su superficie, resultando en tensiones de corte y presión, la SAW proporciona transmisión acústica en la matriz líquida de la muestra, mejorando la liberación del analito en la fase líquida para la detección. Este método puede estar libre de cavitación y, por lo tanto, es más suave para las biomoléculas de interés que podrían desnaturalizarse mediante técnicas ultrasónicas tradicionales, y no necesita soportes adicionales como cuentas que pueden necesitar separarse para un análisis posterior.

Las estructuras fonónicas se pueden usar para enfocar la energía acústica en áreas específicas del dispositivo para mejorar el procesamiento, como se ha descrito previamente. También se pueden usar como un soporte sólido para aumentar las tensiones de corte, de manera similar a un filtro o cuentas. Por ejemplo, se pueden utilizar matrices fonónicas de pilares en el centro de un canal o matrices fonónicas de orificios en una superficie.

Capa de material de generación de SAW compuesto

Es posible que el material de la capa de material de generación SAW tenga la forma de un compuesto. En una realización, las partículas piezoeléctricas se dispersan en una matriz polimérica para formar un material compuesto. El material compuesto se somete a polarización (la aplicación de un campo eléctrico alto) para orientar las partículas piezoeléctricas. Seguidamente, la aplicación de un campo eléctrico da como resultado la deformación de las partículas piezoeléctricas, que conduce a la deformación del material compuesto en su conjunto. La aplicación del campo eléctrico a una frecuencia adecuada conduce a la deformación que se propaga como una onda (por ejemplo, SAW).

Un protocolo adecuado para fabricar un material compuesto de ejemplo es el siguiente.

Protocolo para fabricar un material compuesto de ejemplo

Materiales: PZT en polvo (PZ26 Ferroperm, tamaño de partícula de aproximadamente 500 nm), Fotorresistente SU-8-50, IGEPAL CA630 (dispersante, Aldrich), acetato de propilenglicol metil éter (PGMEA).

Composiciones de destino: Fracción de volumen de sólidos en dispersión 40 % calculada como (PZT SU8)/(PZT+SU8+PGMEA). Fracción de volumen de PZT en la película final 40 % calculada como PZT/(PZT+SU8) Método de mezcla:

1. Añadir PZT, IGEPAL (1 % en peso con respecto a PZT) y exceso de PGMEA.

2. Usar el mezclador Silverson (8000 rpm durante 7 minutos) para romper los aglomerados y ayudar a la dispersión.

3. Centrifugar 2500 rpm durante 4 minutos.

4. Eliminar el exceso de PGMEA por decantación controlada.

5. Agregar el SU8-50 requerido.

6. Agitación manual y muestra de ultrasonidos (30 minutos) para ayudar a la distribución del polvo dentro del SU8-50 viscoso.

7. Antes de la colada, permitir que la dispersión permanezca para permitir que las burbujas escapen.

Método de fundición:

1. Los sustratos flexibles se aseguran a un portaobjetos de vidrio de soporte con cinta de poliimida para ayudar a mantenerlos nivelados.

2. Luego se aplican dos tiras paralelas de una cinta Nitto de baja adherencia (80 micrómetros de espesor) al sustrato para marcar el área de la fundición y proporcionar una altura de fundición efectiva para el "borde de separación".

3. Esta configuración es luego grabada con plasma O2/Ar durante 3 minutos a 20 W. (Nota: incluso los sustratos suministrados previamente grabados con plasma requirieron este tratamiento adicional antes de la colada, de lo contrario la dispersión no humedecería el sustrato).

4. Se aplican dos o tres gotas de la dispersión al sustrato entre la cinta Nitto, y el borde de un portaobjetos de vidrio limpio se usa como borde de expansión para moldear la película húmeda inicial de 80 micrómetros.

5. Secar parcialmente la película durante 2 minutos a 95 °C en placa caliente, despegar la cinta Nitto, luego secar en horno a 95 °C durante 20 minutos.

Curado UV:

1. La película seca se expuso intensamente durante 7 minutos (12 mW/cm2) en alineador de máscara UV.

2. Después de hornear la muestra 15 minutos en el horno a 95 °C.

Un espesor de película curado en seco típico alcanzado por este enfoque de fundición es de aproximadamente 14 micrómetros.

Método de sondeo de corona:

Altura del pasador desde el sustrato: aproximadamente 25 mm.

Voltaje aplicado para descarga audible/visual: aproximadamente 15 KV.

Campo aplicado a aproximadamente 105-110 °C

Campo eliminado < 65 °C (tiempo de enfriamiento de aproximadamente 30 minutos)

Cabe señalar que esta metodología de fabricación se puede manejar fácilmente a través de un proceso de carrete a carrete, conduciendo a una fabricación muy rentable. Esta rentabilidad permite utilizar todo el dispositivo como un elemento desechable.

Estructura y prueba

Cada muestra informada aquí usó una capa de 8 pm de SU-8 cargada con PZT (40 % en volumen) en un IDT con un ancho de dedo interdigitado y una separación de 60 pm, modelado utilizando procesos de carrete a carrete. En un primer dispositivo, el sustrato era una lámina delgada de PET. En un segundo dispositivo, el sustrato era una pieza de PMMA de 5 mm de espesor. En estos dispositivos, los electrodos se intercalaron entre el sustrato y la capa de material de generación de SAW.

Cada dispositivo tenía una resonancia fundamental a aproximadamente 30 MHz cuando se midió el parámetro S¹¹ usando un analizador de red vectorial (figura a continuación). La velocidad longitudinal del sonido para SU-8 es de aproximadamente 2880 m/s, aunque esto dependerá en cierta medida de la ruta de procesamiento, ya que el SU-8 puede tener un grado variable de reticulación. Este valor puede disminuir con la carga de minerales a frecuencias mucho más altas. La velocidad longitudinal del sonido para PZT es de aproximadamente 4300 m/s. Usando una regla simple de mezclas, la velocidad longitudinal del sonido para el compuesto es de aproximadamente 3400 m/s, que está en el rango del valor calculado de aproximadamente 3600 m/s de la medición S¹¹.

En las pruebas de estos dispositivos no estaba claro si se generaban SAW, pero la transducción estaba claramente presente. La muestra de PMMA mostró la mayor caída eléctrica a aproximadamente 45 MHz y esto se atribuye tanto a la excitación de otro modo (posiblemente un modo Sezawa) con una impedancia cercana a 50 O como a la mayor rigidez mecánica de ese sustrato debido a su espesor en relación con el dispositivo basado en PET, ya que las propiedades mecánicas de PET y PMMA son muy similares.

El material PZT/SU-8 era propenso al calentamiento dieléctrico, al igual que los IDT en PET sin material piezoeléctrico presente. Se observó que las muestras de PZT/SU-8 durarían más, probablemente debido a que la capa actúa como un disipador de calor. Usando una cámara Fluke IR, era muy evidente que el calentamiento puede inducirse fácilmente en el material, y más sorprendentemente de una manera muy localizada. La aplicación de una potencia de aproximadamente 0,1 W a 30 MHz a los electrodos interdigitados revela un calentamiento muy localizado por encima de los electrodos interdigitados, dando lugar a una temperatura de aproximadamente 77 °C en menos de 5 s. Sobre el área del electrodo, hubo una variación en la temperatura de más de 20 °C.

La cantidad de calentamiento fue proporcional a la cantidad de energía aplicada a los dispositivos. Un poco de calentamiento del PZT/SU-8 fue beneficioso, ya que mientras más tiempo se usaban estas muestras, cuanto mayor fue la actuación, se observó una gota de 5 pl colocada en la superficie del material activo. Se observaron SAW y transmisión posterior, basado en una línea observada de concentración de cuentas de vidrio recubiertas de plata de 1 micrómetro suspendidas en solución. Está claro que la PCR es una aplicación atractiva para una plataforma de dispositivo desechable.

Capa de estructura fonónica de polímero

Los dispositivos han sido fabricados y probados donde el cristal fonónico es una capa estampada de SU-8 sobre vidrio, con una matriz de celosía cuadrada de orificios o pilares. Se proporciona un espacio en la capa SU-8 para acoplar (a través de una capa adhesiva) al sustrato de vidrio un transductor de cristal único de LiNbO³ con una estructura de electrodo interdigitado formado en su superficie superior.

El sustrato de vidrio tenía un espesor de aproximadamente 1,5 mm, el transductor de cristal único de LiNbO³ tenía un espesor de aproximadamente 500 micrómetros y la capa SU-8 tenía un espesor de aproximadamente 100 micrómetros.

En primer lugar, se caracterizó un dispositivo que tenía una estructura fonónica en forma de orificios a través de la capa SU-8 utilizando un vibrómetro (Polytec GmbH). Se proporcionó un espacio relativamente grande para los electrodos interdigitados, para permitir que la onda mecánica superficial inducida en el LiNbO³ se extienda hasta la cara inferior del material. En este dispositivo, la cantidad de accionamiento mecánico en la superficie opuesta a donde se colocan los electrodos de excitación es menos de la mitad, todavía hay suficiente vibración mecánica disponible para hacer algún trabajo. La optimización del acoplamiento se puede llevar a cabo para aumentar la eficiencia de transferencia de las ondas acústicas del LiNbO³ al vidrio. Como parece haber una pérdida de inserción del 50 % entre el transductor y el sustrato, que se muestra como calentamiento localizado del área de contacto. Los datos del vibrómetro sugieren que, una vez acoplado, la transferencia de energía acústica a la capa SU-8 es relativamente eficiente.

El vibrómetro mide el desplazamiento de la superficie en varias posiciones del dispositivo. Las mediciones revelan que hay un aumento en el desplazamiento de la superficie en la superficie del SU-8 cerca de la abertura formada en el SU-8 para acomodar el transductor. Esto se atribuye al agrupamiento causado por la velocidad más lenta del sonido en SU-8 en relación con el vidrio. Sin embargo, más lejos de la abertura, este aumento se reduce rápidamente al mismo nivel que el observado para el vidrio.

Escaneando en paralelo al borde de la abertura, se observó un marcado aumento en la amplitud del desplazamiento entre la red fonética y la interfaz SU-8/vidrio. La red fonética y la interfaz SU-8/vidrio actúan como reflectores, creando una cavidad, donde el desplazamiento de la superficie causado por la amplitud de las ondas estacionarias parciales aumenta en relación con las SAW acopladas entrantes del transductor. Esto se ilustra en la figura 51, que muestra una vista esquemática en planta de la capa SU-8 y el borde de la abertura en la que se encuentra el transductor (no mostrado). La figura 52 muestra los resultados de una exploración de vibrómetro a lo largo de la línea entre las posiciones 1 y 2 en la superficie del SU-8. El gráfico muestra los desplazamientos verticales medidos (eje y - unidades arbitrarias) con la distancia (eje x - unidades arbitrarias). En la posición 1, las SAW no encuentran el reflector fonónico. Sin embargo, en la posición 2, las SAW encuentran el reflector fonónico y se forma una cavidad. Así, la estructura fonónica influye en la propagación de las SAW en la capa SU-8, porque un aumento significativo en el desplazamiento fuera del plano se mide en la cavidad (posición 2) en comparación con el exterior de la cavidad (posición 1).

Cuando se coloca una gota de agua que contiene cuentas de vidrio de 1 micrómetro dentro de la cavidad ilustrada en la figura 53, las cuentas se alinean en anillos concéntricos debido a las ondas estacionarias creadas. La figura 53 muestra este efecto en una gota de agua de 5 microlitros accionada con SAW a 6,5 MHz a 1,6 W de potencia aplicada.

A continuación, se fabricó un superestrato formado de vidrio que tenía una estructura fonónica de pilares SU-8 formados en la superficie superior del vidrio.

Usando este sistema, se muestra que se pueden centrifugar perlas de vidrio de 1 micrómetro en el centro de una gota de agua de 5 microlitros colocada en el borde de la red fonónica. Las figuras 54, 55 y 56 muestran imágenes microscópicas secuenciales de las cuentas de vidrio en la gota de agua activadas con una señal de excitación a 10,4 MHz con aproximadamente 1,26 W aplicada, Las SAW se aplican desde el lado derecho de cada imagen. Las SAW se filtran por la red fonónica de los pilares SU-8, impulsando los flujos rotacionales que resultan en centrifugación, con las partículas que finalmente se concentran en el centro de la gota, como se muestra en la figura 56.

Este trabajo demuestra la actuación microfluídica utilizando SAW que están conformadas fonéticamente por una estructura fonónica SU-8 formada en un superestrato de vidrio. Por lo tanto, este dispositivo forma la base de un dispositivo de diagnóstico de bajo costo que incorpora una etapa de concentración de partículas. El dispositivo se puede formar a bajo costo porque el vidrio se puede procesar a bajo coste, en comparación con el procesamiento de LiNbO³ u otros materiales piezoeléctricos.

Las realizaciones preferidas de la invención se han descrito a modo de ejemplo. Modificaciones de estas realizaciones, realizaciones adicionales y modificaciones de las mismas serán evidentes para la persona experta al leer esta divulgación y, como tales, están dentro del alcance de la presente invención, el cual aparece definido en las reivindicaciones adjuntas.

Abreviaturas

ATP Trifosfato de adenosina

ADP Difosfato de adenosina

cAMP Monosfato de adenosina cíclico

ELISA Ensayo inmunosorbente ligado a enzimas

IDT Transductor interdigitado (también conocido como transductor interdigital)

PBS Solución salina tamponada con fosfato

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

SAW Onda acústica superficial

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un aparato de fluidos para la manipulación de al menos una muestra de fluido (134), incluyendo el aparato: una superficie de manipulación para la ubicación de la muestra de fluido (134);

una capa de material de generación de onda acústica de superficie (SAW) (102), en donde la capa de material de generación de SAW (102) no tiene la forma de una sola capa de cristal,

una estructura de electrodo de transductor (112) dispuesta en la capa de material de generación de SAW (102) para proporcionar las SAW en la superficie de manipulación para la interacción con la muestra de fluido (134), caracterizado por que

la superficie de manipulación comprende una pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) para afectar la transmisión, la distribución y/o el comportamiento de SAW en la superficie de manipulación, comprendiendo dicha pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) una disposición periódica bidimensional, y en donde la pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) se extienden al menos parcialmente en la capa de material de generación de SAW (102) y cruzan la superficie de la capa de material de generación de SAW (102).

2. Un aparato de fluidos según la reivindicación 1, en el que la capa de material de generación de SAW (102) está formada de un material ferroeléctrico, un material piroeléctrico, un material piezoeléctrico o un material magnetoestrictivo.

3. Un aparato de fluidos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la estructura del electrodo de transductor (112) está incrustada al menos parcialmente en la capa de material de generación de SAW (102).

4. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el transductor es sintonizable, tal que la posición lateral de un tren de emisión SAW es móvil.

5. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la superficie de manipulación es una superficie de la capa de material de generación de SAW (102), opcionalmente cubierta con una película de pasivación superficial (136).

6. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se proporciona al menos un elemento de dispersión de SAW adicional, incluyendo dicho elemento de dispersión de SAW adicional un cambio que se extiende linealmente en el perfil de la superficie de manipulación.

7. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el material de la capa de material de generación de SAW (102) se selecciona del grupo que consiste en: material policristalino, material policristalino texturizado, material policristalino con textura biaxial, material microcristalino, material nanocristalino, material amorfo y material compuesto.

8. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el aparato incluye al menos un canal cerrado (110) para la muestra de fluido, estando el canal limitado en al menos un lado por la superficie de manipulación.

9. Un aparato de fluidos según la reivindicación 8, en el que el lado opuesto del canal (110) está limitado por una superficie de encapsulación pasiva.

10. Un aparato de fluidos según la reivindicación 8, en el que dos o más lados del canal (110) están delimitados por una superficie de manipulación, estando cada superficie de manipulación adaptada para estar provista de SAW para la interacción con la muestra de fluido en el canal, y en el que cada superficie de manipulación tiene opcionalmente al menos un elemento de dispersión de SAW (116) para afectar la transmisión, la distribución y/o el comportamiento de SAW en la superficie de manipulación.

11. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene:

una primera capa de material de generación de SAW (102) y una estructura de electrodo de transductor asociada (112);

una primera superficie de manipulación en la que se proporcionan SAW desde la primera capa de material de generación de SaW (102);

una segunda capa de material de generación de SAW (106) y una estructura de electrodo de transductor asociada (114); y

una segunda superficie de manipulación en la que se proporcionan SAW desde la segunda capa de material de generación de SAW (106),

en donde las superficies de manipulación primera y segunda definen entre las mismas un canal (110) para la muestra de fluido.

12. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el aparato incluye además al menos un depósito (158).

13. Un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el aparato incluye además al menos una abertura.

14. Uso de un aparato de fluidos para manipular al menos una muestra de fluido, estando el aparato de fluidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, estando ubicada dicha al menos una muestra de fluido (134) en la superficie de manipulación, y operando el aparato para proporcionar SAW en la superficie de manipulación para la interacción con la muestra de fluido (134).

15. Uso según la reivindicación 14, en el que la manipulación de la muestra de fluido incluye uno o más de: movimiento de la muestra a lo largo de la zona de manipulación de la muestra; división de la muestra; combinación de dos o más muestras; atomización de la muestra desde la zona de manipulación de la muestra; calentamiento de la muestra; concentración de especies en la muestra; mezcla de la muestra; clasificación de muestras de fluidos; clasificación de partículas o células dentro de muestras de fluidos.

16. Un proceso para fabricar un aparato de fluidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,

incluyendo el proceso formar la capa de material de generación de SAW (102) in situ sobre un soporte en una etapa de deposición de capa de material de generación de SAW y formar dicha pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) que comprende una disposición periódica bidimensional para que la pluralidad de elementos de dispersión de SAW (116) se extiendan al menos parcialmente en la capa de material de generación de SAW (102) y crucen la superficie de la capa de material de generación de SAW (102).

17. Un proceso según la reivindicación 16, en el que la capa de material de generación de SAW (102) se forma usando un proceso de deposición seleccionado del grupo que consiste en: pulverización, impresión en tamiz, fundición, rasqueta, recubrimiento por inmersión, deposición de solución y electroforesis.