KR102228410B1

KR102228410B1 - 램-웨이브 기반 분자진단 방법 및 진단용 소자

Info

Publication number: KR102228410B1
Application number: KR1020190015044A
Authority: KR
Inventors: 임채승; 남정훈; 장웅식
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-02-08
Filing date: 2019-02-08
Publication date: 2021-03-16
Also published as: KR102228410B9; KR20200097541A

Abstract

압전기판 상에 검체, 미세입자 및 증폭 반응액이 포함된 시료를 로딩하는 단계; 상기 압전기판에 작동 주파수를 갖는 교류전압을 인가하는 단계; 램-웨이브에 의해 상기 시료가 혼합되는 단계; 상기 검체를 증폭시키는 단계; 및 상기 혼합된 시료의 음향스트리밍(acoustic streaming)속도를 실시간으로 측정하는 단계; 를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단 방법으로, 상기 혼합된 시료의 점도와 상관되는 음향스트리밍(acoustic streaming)속도 변화로부터 진단대상의 유무를 판별하는, 램-웨이브 기반 분자진단 방법 및 분자진단용 소자를 제공한다.

Description

램-웨이브 기반 분자진단 방법 및 진단용 소자{Lamb-wave-based molecular diagnostic method and diagnostic device}

본 발명은 램-웨이브 기반의 분자진단 방법 및 진단용 소자에 관한 것으로, 구체적으로는, 압전기판 상에 램-웨이브를 생성하고, 검체, 미세입자 및 증폭 반응액이 포함된 시료가 등온증폭반응하면 음향스트리밍 속도 측정으로 진단대상의 유무를 판별하는 램-웨이브 기반 분자진단 방법 및 분자진단용 소자에 관한 것이다.

분자진단(Molecular Diagnosis) 또는 분자진단검사(Molecular Diagnostics)는 분자생물학적 기술을 이용하여 생체표지물질(특히 DNA 또는 RNA)을 검출하거나 분석하는 진단분야 혹은 기법을 의미하며, 특히 핵산진단과 유사한 의미로 사용되고 있다. 특히 1985년 중합효소연쇄반응이 개발된 이래로 사람을 비롯한 각종 감염균의 유전자 지도가 완성되는 등의 기술적 진보가 확립된 이래도 분자진단검사 기술이 비약적으로 발전하고 있다.

분자진단방법은 체액으로부터 샘플을 채취, 채취된 샘플의 유전자 추출, 중합효소연쇄반응을 이용한 증폭 및 분석에 이르는 4가지 단계로 구성된다. 분자진단법은 유전자 증폭과정을 거치기 때문에 극미량의 병원체에 대해서도 매우 높은 민감도 및 특이성을 갖는 정확한 진단이 가능하다. 하지만, 기존의 진단법의 수행을 위해서는 PCR 및 전기영동 등 고가의 분석 장비 및 시약을 사용하기 때문에 비용이 많이 들고, 복잡하고 전문적인 기술이 필요하기 때문에 숙력된 기술자에 의해서만 수행이 가능하다. 또한 분석 장비의 거대함으로 인해 각 생물 반응 단계의 통합이 어려와 분자 진단 과정에 샘플 오염의 가능성을 항상 내포하고 있으며, 분석 시간이 오래 걸리기 때문에 현장에서 유전자 진단을 하는데 한계를 보이고 있다

현재 분자진단에서 널리 시행되고 있는 분석물질의 표적 유전자 검사방법은 크게 표적 유전자의 발현 정도 및 유전자 개수(copy number)를 측정하는 상대 혹은 절대 정량적 방법(quantitative method)과 표적 유전자의 존재 유무 및 유전자형 (genotyping)을 분석하는 정성적 방법(qualitative method)으로 분류할 수 있다. 정량적 검사 중에서는 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)을 이용한 DNA 증폭기술이 대표적이며, 생명과학, 유전공학 및 의학 분야 등의 연구개발 및 진단 목적으로 DNA 증폭기술이 광범위하게 활용되고 있다.

구체적으로, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 살아있는 생물체를 이용하지 않으면서 DNA를 효소적으로 복제하기 위한 분자 생물학 기술로, PCR은 비할 데 없는 증폭(amplification)과 정밀 능력(precision capability)으로 인하여, 핵산 검출(nucleicacid detection)을 위한 선택 방법으로서 분자 생물학자들에 의해 인정받고 있다. 특히, 실시간 중합효소 연쇄반응 방법은 중합효소 연쇄반응 장치(thermal cycler) 와 분광형광광도계(spectrophotometer)가 일체화된 장치를 이용하는 것으로, PCR 과정 후 PCR 산물의 확인을 위한 별도의 전기영동과정 없이, 증폭 과정 중 실시간으로 표적 유전자의 증폭산물 생성과정을 모니터링하여 초기에 투입 혹은 존재하는 DNA 또는 RNA의 양을 분석하는 방법이다.

PCR은 의학과 생물학 연구소에서, 다양한 과제, 예를 들면, 유전 질환(hereditary disease)의 검출, 유전자 지문(genetic fingerprint)의 확인, 감염 질환(infectious disease)의 진단, 유전자의 클로닝(cloning), 친자확인검사(paternity testing), 유전자형(genotyping) 확인, 유전자 염기서열 (gene sequencing) 검사 그리고 DNA 컴퓨팅(computing)에 일상적으로 이용되고 있다.

주로 PCR 반응 후의 증폭 산물을 표적 마이크로어레이 칩과 혼성화하여, 칩 고체 표면에(유리, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 등) 고정된 여러 종류의 프로브(올리고염기, PNA 혹은 cDNA)와 결합하고, 결합 여부를 증폭 산물에 표지된 형광 물질 신호를 확인하는 방법으로 판단할 수 있어 다양한 형태의 유전자형 분석에 유용하나, 시험과정이 복잡하고 시간이 다소 많이 소요되는 단점을 가지고 있으며, 결과의 육안 확인이 불가능하여 별도의 형광 분석 장치를 필요로 하고 있다.

종래의 분자진단을 위한 기술은 높은 온도제어가 가능한 고가의 장비를 요하거나, 부가적인 형광처리단계 또는 전기영동단계와 같은 추가단계를 거쳐야만 확인이 가능했다. 또, 이러한 장비들은 장비 및 숙련된 실험자에 의해서만 측정이 가능하고, 실험실 셋업 이외의 현장 진단용 또는 자원이 제한된 환경에서는 활용이 불가능 하다는 한계가 존재한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 최근 이용되는 방법으로 마이크로 유체 어레이 칩(microfluidic array chip)시스템이 존재하지만, 이 방법은 마이크로 채널 또는 비드에서의 프라이머 고정화(primer immoblization) 및 전문가에 의한 비드 충전 공정(bead filling process)등의 고가의 기구와 시간 소모가 요구되는 준비공정을 필요한 문제점이 있다.

파동을 이용하여 분자진단을 하는 기술로는, 표면탄성파를 이용한 분자진단 응용기술이 보고된 바가 있다. 그러나, 상기 기술은 SAW 기반 PCR 장치에서 형광강도를 별도로 측정하여 PCR 산물을 평가하는 단계를 추가적으로 수행해야만 분자진단에 이용할 수 있는 번거로움이 있다. 또, SAW를 구동하기 위해서는, 반도체식각공정을 거쳐야 하므로, 이 과정에서 독성물질이 발생하게 되어 환경오염을 유발하는 문제가 여전히 존재한다.

최근에는 상기와 같은 분자진단 영역 중 감염체 질환의 경우 진단과 치료의 개념이 적용됨에 따라 분석물질의 표적 유전자 검사방법이 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 감염 정도 확인을 위한 유전자 수(copy number)의 정량적 정보, 혹은 감염체 종류 확인을 통해 적절한 치료제 처방을 위한 마이크로어레이 칩 활용 유전자형(genotyping)의 정성적 정보가 동시, 복합적으로 요구되고 있다. 이 목적에 따라 실시간 중합효소 연쇄반응과 마이크로어레이 칩 각각 독립적인 검사를 병행하여 이용하고 있다.

상기 검사방법들의 접목은 단순히 각 각의 방법들을 서로 다른 반응기에서 실험을 순차적으로 진행하고, 이를 분석하는 것으로, 여전히 많은 노동력과 시간이 요구되고, 불편함이 남아 있다.

또한, 이러한 분자진단을 하기 위해서는 유전자 추출 과정이 필요한데, 이후 추출된 DNA 검체를 수동으로 파이페팅(Pipetting) 또는 시료 주입 장치(Liquid handling module)을 사용하여 유전자 증폭을 위한 장비로 이동해야 하고, 이 자체가 별도의 장비로 존재하기 때문에 사용상의 불편함이 있다.

한국공개특허 제2008-7024545호, “액체 샘플의 흐름 특성의 변화를 모니터링하기 위한 방법 및 장치”, (공개일: 2008.12.16)

Amgad R. Rezk, James R. Friend and Leslie Y. Yeo, Lab on a Chip, 14, 1802-1805, 2014 Ghulam Destgeer, Byunghang Ha, Jinsoo Park and Hyung Jin Sung, Analytical Chemistry, 88, 3976-3981, 2016 Amgad R. Rezk and Leslie Y. Yeo, Journal of Microelectronics, Electronic Components and Materials, 46(4), 176-182, 2016 Sascha Meyer dos Santos, Anita Zom, Zeno Guttenberg, Bettina Picard-Willems, Christina Klaffling, Karen Nelson, Ute Klinkhardt and Sebastian Harder, Biomicrofluidics, 7(5), 056502, 2013

Moll J, Meyer dos Santos S, Hils B, Dornuf F, Meyer dos Santos IR, Singer OC, Ferreiros N, Labocha S, Blcher A, Harder S, Krozer V., International Journal of Clinical Pharmacology, 54(3), 177-184, 2016

본 발명의 목적은 압전기판 상에 검체, 미세입자 및 증폭 반응액이 포함된 시료를 로딩하는 단계, 상기 압전기판에 교류전압을 인가하는 단계, 램-웨이브에 의해 상기 시료가 혼합되는 단계, 상기 검체를 증폭시키는 단계 및 상기 혼합된 시료의 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도를 실시간으로 측정하는 단계를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단 방법으로, 상기 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도가 변화하면 진단대상 물질이 존재하는 것으로 판단하는, 램-웨이브 기반 분자진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시료가 고정되는 압전기판, 상기 압전기판의 양단에 구비되는 전극 및 상기 전극에 작동 주파수를 갖는 교류전압을 인가하여 상기 압전기판에 램-웨이브를 발생시키는 전압 인가부를 포함하고, 상기 램-웨이브에 의해 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도가 변화하면 진단대상 물질이 존재하는 것으로 판단하는, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 소자를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단용 키트를 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 압전기판 상에 검체, 미세입자 및 증폭 반응액이 포함된 시료를 로딩하는 단계, 상기 압전기판에 교류전압을 인가하는 단계, 램-웨이브에 의해 상기 시료가 혼합되는 단계, 상기 검체를 증폭시키는 단계 및 상기 혼합된 시료의 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도를 실시간으로 측정하는 단계를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단 방법으로, 상기 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도가 변화하면 진단대상 물질이 존재하는 것으로 판단하는, 램-웨이브 기반 분자진단 방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도는, 점도의 증가에 의해 변할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 점도는, DNA 하이드로겔의 형성에 의해 증가할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 램-웨이브 기반 분자진단 방법은, 개방형 챔버를 구비하는 단계; 및 상기 챔버 내부에 오일을 채우는 단계; 를 더 포함할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 증폭은, RCA(Rolling Circle Amplification) 증폭일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 미세입자는, 형광물질일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 진단대상은, 뎅기열, 말라리아, 메르스, 에볼라 및 지카로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 질환 또는 상기 질환의 원인균일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 시료가 고정되는 압전기판; 상기 압전기판의 양단에 구비되는 전극; 및 상기 전극에 작동 주파수를 갖는 교류전압을 인가하여 상기 압전기판에 램-웨이브를 발생시키는 전압 인가부; 를 포함하고, 상기 램-웨이브에 의해 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도가 변화하면 진단대상 물질이 존재하는 것으로 판단하는, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자가 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 전극은, 알루미늄 포일 또는 전도성 액체일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 압전기판은, 상기 시료가 로딩되는 적어도 하나의 웰이 구비될 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 압전기판은, 소수성 물질로 코팅된 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 소자는, 유체가 유동되는 공간을 구성하는 챔버를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 전술한 본 발명의 분자진단용 소자 중 어느 하나를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단용 키트가 제공된다.

본 발명을 이용하면 램-웨이브를 이용하여 신속하고 간편하게 진단대상 물질의 존재를 확인함으로써 진단이 가능하다. 구체적으로는, 진단하고자 하는 물질이 포함된 검체의 경우, 램-웨이브에 의해 등온증폭된 결과, DNA 하이드로겔이 생성되고, 이로 인한 음향스트리밍 속도 변화로부터 진단대상의 유무를 판별할 수 있다.

종래의 분자진단 방식과는 달리, 알루미늄 호일 또는 전도성 액체를 전극으로 이용하여 구성이 간단하고, 내부에 가시성을 가지는 미세입자를 추가함으로써, 육안으로도 점성의 증가를 확인할 수 있어 현장현시검사용으로 적합하다.

또한, 본 발명의 소자 또는 상기 소자가 포함된 키트는, 다중검출이 가능하도록 제작되어 동시에 여러가지 진단대상 물질의 유무를 판단하여 다중 분자진단으로 이용될 수도 있다.

더욱이, 본 발명을 이용하면 말라리아, 뎅기열, 메르스, 에볼라 및 지카와 같은 전염성 질병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있어, 환자의 추가 감염 예방 및 시의적절한 치료가 가능하게 할 수 있다.

그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 램-웨이브 기반 분자진단용 소자 및 이의 작동 원리를 개략적으로 나타낸 것이다
도 2는 접촉각에 따른 액적 내 부유된 입자의 음향스트리밍 속도 차이를 확인한 실험을 나타낸 것이다.
도 3은 RCA 증폭반응에 의한 음향스트리밍 속도 및 점도의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명을 이용하여 분자진단에 적용한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 액적 내부의 입자 이동거리 및 이동속도 측정 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

상기 압전기판은 전기에너지를 가했을 때 진동과 같은 기계적 에너지로 변환할 수 있도록 압전물질로 이루어진 기판으로서, 압전물질은 전기적 에너지와 기계적 에너지를 상호 변환할 수 있는 물질을 일컫는 용어로, 기계적인 압력을 가하면 전압이 발생하고, 전압을 가하면 기계적인 변형이 발생하는 압전효과를 일으킬 수 있는 물질을 의미한다. 따라서, 전기적인 에너지를 가하면 압전물질로 형성된 압전기판의 기계적 수축 또는 팽창의 발생으로 벌크탄성파, 표면탄성파 등이 발생할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 명세서에서 압전물질은 리튬나이오베이트(LiNbO3) 또는 쿼츠(Quartz)일 수 있다.

상기 램-웨이브는 플레이트 웨이브(Plate Wave)라고도 불리는 종파를 사용하는 탄성파의 일종으로, 판의 두께, 주파수 및 입사각 등에 따라 다양한 모드로 기판을 통해 진행하는 능력이 있는 파를 의미한다. 벌크탄성파로 분류되기도 하나, 벌크탄성파와는 달리 별도의 압전소자나 복잡한 미세전극 패터닝과정을 필요로 하지 않는 장점이 있는 파동이다. 이러한 램-웨이브 기반의 소자는, 압전기판 자체에 발생하는 파 또는 파가 발생하는 압전기판 상에 위치한 커버글라스 등의 표면을 따라 발생하는 파를 이용하게 된다. 램-웨이브 기반의 유체 및 입자 제어 기술은 비싸고 복잡한 미세전극 패터닝 공정이 불필요한 장점이 있어 많은 관심을 받는 기술로, 미세액적 내의 유동 발생을 통한 혼합, 미세액적의 젯팅 및 미세액적 내에 부유된 미세입자의 패터닝과 농축 등에 이용할 수 있고, 이에 기초하여 생화학적 연구 또는 임상 진단 등에 활용한 예로 혈액 응고가 있으며 비슷한 방식으로 항원-항체결합반응으로 응집이 유도되는 혈액형 분석법에도 활용이 가능하다.

상기 검체는 생체유래의 검체, 환경 유래의 검체, 금속, 화학물질, 의약품 일 수 있고, 이 때 생체는, 예컨대 인간, 비인간 동물, 식물일 수 있고, 상기 비인간 동물은, 예컨데 인간을 제외한 포유류, 어패류 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 생체 유래의 검체는 예컨대 뇨, 혈액, 모발, 탯줄, 타액, 땀, 눈물, 척수액 등일 수 있으며, 이 경우, 혈액검체는 예컨대 적혈구, 전혈, 혈청, 혈장 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 환경 유래의 검체는 예컨대 식품, 물, 토양, 대기, 공기 등일 수 있으며, 이 때, 상기 식품은, 예컨대 농산물 식품, 수산물 식품 또는 가공식품 등일 수 있고, 상기 물은 예컨대, 음료수, 지하수, 하천수, 해수, 생활 배수 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 금속은, 예컨대 Bi(비스무트), Hg(수은), Cd(카드뮴), Pd(팔라듐), Zn(아연), Tl(탈륨), Ag(은), Pb(납)과 같은 중금속 등일 수 있고, 상기 화학물질은, 예컨대 시약, 농약 또는 화장품 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로는 상기 검체, 미세입자 및 증폭 반응액이 혼합된 혼합물은 유체 형태임이 바람직하고, 더 구체적으로는 미세액적의 형태임이 더욱 바람직하다.

상기 진단대상 물질은, 감염성 원인균일 수 있다. 예컨대, 뎅기열, 말라리아(Plasmodium), 메르스 바이러스(MERS-Cov virus), 지카 바이러스, 에볼라 바이러스, 조류독감, 대장균, 사스(SARS), 용혈성 요독 증후군(hemolytic uremic syndrome) 및 혈변(bloddy diarrhea)(Escherichia coli O157:H7), 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 탄저병(Bacillus anthracis), 폐렴(Streptococcus pneumonia), 살모넬라(Salmonella), 간염(Hepatitis A,B,C,D 및 E virus), 야토병균(Francisella tularensis), 페스트균(Yersinia pestis), 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 출혈열(Ebola virus), 메르스 코로나 바이러스(MERS-Cov virus), 폐렴상구균, 장내구균, 포도상구균, 열대열원충, 및 결핵 중 어느 1종 이상의 감염성 원인균 유전자일 수 있다. 상기 감염성 원인균 유전자의 경우, 핵산 서열이 공지된 모든 병원균이 대상일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 진단대상은, 뎅기열 바이러스, 말라리아(Plasmodium), 메르스 바이러스(MERS-Cov virus), 에볼라 바이러스 및 지카 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 질환 또는 상기 질환의 원인균일 수 있다.

먼저 분석하고자 하는 검체가 포함된 시약을 압전기판 상에 로딩한다. 구체적으로는 압전기판 상에 적어도 하나의 웰(well)이 구비되어 있어, 상기 웰(well)에 시약을 로딩함이 바람직하며, 상기 시약에는 증폭에 필요한 증폭반응액이 포함됨이 가장 바람직하다.

상기 웰(well)은 증폭반응이 일어나는 동안 음향스트리밍 속도를 실시간으로 측정하기 위해 투명한 재질로 제작됨이 바람직하다. 더 구체적으로는, 상기 웰(well)을 제외한 압전기판의 표면은 소수성 물질로 코팅되어, 압전기판에 램-웨이브가 발생하는 경우에도 시료의 위치를 고정시킬 수 있다. 이러한 소수성 물질의 코팅을 통해 표면에너지를 제어하여 미세액적과 압전기판 사이의 접촉각을 조절함으로써 램-웨이브에 의한 영향을 최대로 받을 수 있도록 최적화 할 수도 있다. 그러나, 본 발명의 압전기판은 상기 소수성 물질의 코팅으로 제한되는 것은 아니며, 전술한 바와 동일한 효과를 위해 단면 테이프 기반의 웰을 제작하는 등 다양한 방법이 이용될 수도 있다.

상기 압전기판 상에 검체가 포함된 시약의 로딩되면, 압전기판에 작동 주파수를 갖는 교류 전압을 인가하여 램-웨이브를 발생시킨다. 상기 교류 전압을 인가하기 위해 상기 압전기판 상에는 전극이 구비될 수 있다.

가령, 압전기판의 양단에 알루미늄 포일을 접합시키거나, 전도성 페인트와 같은 전도성 액체로 그림을 그려 압전기판 상에 전극을 간단히 구비할 수도 있다. 이러한 전극의 구비는, 반도체 식각 공정을 통한 미세전극 패터닝 공정을 요하지 않으므로, 제작 공정이 단순하고, 제작비용이 저렴해 경제적일 수 있다.

상기 압전기판에 작동 주파수에 해당하는 교류전압을 인가하는 경우, 압전기판 자체의 기계적 수축 또는 팽창의 발생으로 기판에 파동이 발생하게 되면, 기판의 압전물질이 에너지 변환을 통하여 램-웨이브(Lamb-wave)가 발생시킬 수 있다. 이 때, 작동 주파수는 압전기판의 두께에 따라 하기 수식 1 및 2에 의해 산출된 값일 수 있다.

[수식 1]

f = c / λ

먼저, 상기 수식 1에서 f는 공진주파수, c는 압전기판의 두께에 따른 속도, λ는 램-웨이브 파장을 의미한다. 이 경우, 파장은 하기 수식 2에 의해 도출될 수 있으며, 하기 수식 2에서 T는 압전기판의 두께를 의미한다.

[수식 2]

T= λ/ 2

상기 수식 1 및 2에 의해 산출되는 주파수 및 전압조건은 소자에 포함되는 압전기판의 두께에 따라 상이할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같이 압전기판의 두께로부터 속도와 파장값을 산출하여 작동주파수를 확인할 수 있으므로, 본 발명에 이용되는 압전기판의 두께에 따라 적절한 작동주파수를 도출하여 상기 주파수에 해당되는 교류전압을 인가함으로써 압전기판에 램-웨이브를 발생시킬 수 있다.

일 측에 따르면, 램-웨이브 기반 분자진단 방법은, 개방형 챔버를 구비하는 단계; 및 상기 챔버 내부에 오일을 채우는 단계; 를 더 포함할 수 있다. 이 경우, 소자는, 유체가 유동되는 공간을 구성하는 상기와 같은 챔버가 더 구비된 것일 수 있다.

상기 개방형 챔버는, 시료의 액적방울을 덮어서 증폭과정 동안 시료가 증발하는 것을 막기 위한 오일을 채우는 용도로 구비되는 것일 수 있다. 예컨대, PDMS(polydimethylsiloxane)로 제작된 개방형 챔버(Open chamber)를 이용함이 바람직하나, 챔버의 소재 또는 형태가 특별히 제한될 바는 아니다.

본 발명의 분자진단 방법으로 상기 챔버 내부에 오일을 채우는 단계가 더 포함되는 경우, PDMS 개방형 챔버에 채워진 오일에 의해, 증폭과정 동안 시료 액적의 증발없이 램-웨이브 파에 의한 현상을 장시간 지속적으로 모니터링할 수 있다. 이 때, 채워지는 오일은 미네랄 오일과 같이 쉽게 증발 또는 산화가 되지않는 오일일 수 있으나, 액적의 증발을 막고 시료의 액적과 혼합되지 않는 것이면 될 뿐, 특별히 제한될 바는 아니다.

상기 램-웨이브에 의해 상기 시료가 혼합되는 단계는, 상술한 압전기판에 교류전압이 인가되면서 생성되는 램-웨이브 파에 의한 혼합을 의미한다.

전술한 내용으로 확인된 작동주파수를 갖는 교류전압을 압전기판에 인가하면, 압전기판에 램-웨이브 파가 발생되어, 압전기판에 로딩된 시료가 상기 램-웨이브에 의해 혼합된다. 시료에는 검체 및 증폭반응액이 혼합되어 있어, 혼합되면 검체의 증폭반응을 유도할 수 있다.

상기 검체를 증폭시키는 단계는, 압전기판에 교류전압이 인가되면서 램-웨이브가 발생하고, 파의 발생으로 기판에 로딩된 시료 내의 검체와 증폭 반응액이 서로 혼합되어 증폭이 진행되는 단계를 의미한다.

상기 증폭은, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용한 증폭을 의미하고, 자세히는 RCA 등온증폭임이 바람직하다. 이 때, 상기 RCA 등온증폭반응의 온도는 35℃ 이하임이 바람직하고, 구체적으로는 30 ℃ 이하 임이 가장 바람직다.

상기 증폭 반응액은, 주형까지 첨가되어 중합효소연쇄반응을 수행하기 위해 필요한 모든 성분들이 포함된 반응액을 의미한다. 일례로, 증폭 반응액은, 표적핵산, DNA 리가아제, 엔도뉴클라아제, DNA 폴리머라제가 포함됨이 바람직하나, 표적핵산의 종류에 따라 앞서 열거한 물질에 적절히 추가되거나 변경될 수 있다.

상기 RCA 증폭은, 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여 주형의 DNA가 연속적으로 합성되는 등온증폭방법이다. 이 때, 증폭되는 물질은 임의의 뉴클레오타이드와 같은 표적 유전자일 수 있으며, 상기 표적 유전자는 예컨대, 핵산 서열, 단일 또는 이중가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이 경우, 상기 핵산 서열은, dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등에 의해)로 만들어진 dsDNA, A-, B-, 또는 Z-DNA, 삼중-가닥 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 섞인 ssRNA 및 dsRNA, ssRNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등을 통해)로 만들어진 dsRNA, 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, 마이크로RNA, 또는 단백질 핵산(PNA)일 수 있다.

상기 DNA 하이드로겔은, DNA를 원료로 하는 하이드로겔을 의미하는 것으로, 하이드로겔이란 물을 저장할 수 있는 겔을 뜻한다. 종래의 하이드로겔은 고분자물질로 생성되었으나, 최근에는 DNA를 주원료로 하여 하이드로겔을 생성함으로써 다양한 의료용 분야에서 응용이 가능한 하이드로겔의 형성이 가능하다.

전술한 RCA등온증폭과정을 통해 생성되는 생성물에 의해 시료의 점도가 변할 수 있다. RCA 등온증폭의 결과로, 검체 유전자가 증폭되어 DNA 하이드로젤이 형성되면, DNA 하이드로젤은 증폭이 진행되는 동안 지속적으로 증가하여 샘플 액적의 점탄성을 증가시킨다. 젤 특유의 점탄성으로 인해 시료의 점도가 증가하게 된다. RCA 등온증폭이 진행되는 동안, 시료 내부에서 부유되는 미세입자의 속도는 액적의 점도가 증가함에 따라 점차 감소하게 된다.

검체가 진단대상 물질을 포함하는 경우, 진단하고자 하는 물질의 공지된 핵산염기서열에 상보적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 시료에 넣고 혼합하면, 상기 진단대상 물질이 증폭하게 되면서 DNA 단편들 간의 결합에 의해 DNA 젤화(gelation)가 진행된다. 상기 젤화(gelation)에 의해 시료 내의 점도가 높아지게 되면서, 상기 젤이 형성된 부분은 더 이상 내부에 유동하던 미세입자가 움직일 수 없게 된다.

상기 혼합된 시료의 음향스트리밍(acoustic streaming)속도 변화를 실시간으로 측정하는 단계는 전술한 증폭단계에 의해 혼합된 시료 내부에서 DNA 하이드로겔이 형성되면서 시료의 점도가 증가함에 따라 변화되는 음향스트리밍 속도를 측정하는 과정을 의미한다. 구체적으로는, 시료에 미세입자를 추가하여, 램-웨이브에 의해 액적 내부에 부유되는 미세입자의 유동속도를 분석하는 방법으로 측정된다. 가령, 특정 구간의 시간(Δ을 알고 있는 경우, 연속 촬영된 이미지를 통해 시료 내에 부유된 특정 미세입자(입자 a)의 이동거리(d_a)를 측정하여 속도를 평가할 수 있다. 입자 a의 속도(v_a)는 하기의 수식 3에 따라 산출될 수 있다.

[수식 3]

구체적으로는, 상기 수식 3의 입자 a의 이동거리(d_a)는 도 5와 같이 액적 내의 동일한 높이(현미경의 동일 초점거리)에 위치하는 입자들의 이동거리를 측정함으로써 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 명세서의 실시예를 포함하는 실험의 결과는 10초 간격으로 촬영된 2개의 연속된 이미지로부터 각각 다른 10개의 입자에 대하여 동일한 방식으로 구한 속도의 평균값을 나타낸 것으로, 이러한 속도 평가 방식은 고속 촬영이 가능한 고가의 이미지 캡쳐 센서를 별도로 요하지 않는 장점이 있다.

특히, 본 발명은 인가되는 전압 조건을 조절하여 램-웨이브에 의한 내부 음향 스트리밍 속도 조절이 가능하고, 조절된 범위 내에서 점성 변화에 따른 상대적인 속도 변화를 평가할 수 있으므로, 초당 24 내지 30 프레임의 촬영이 가능한 일반적인 휴대폰 혹은 USB 카메라만으로도 속도 평가가 가능하다는 점에서 휴대성 및 편의성이 증대된 특징이 있다.

일 측에 따르면, 상기 시료에 포함되는 미세입자는 형광물질일 수 있다. 이 경우, 램-웨이브에 의해 시료가 혼합되는 동안 형광입자는 내부에서 유동하게 되는데, 상기 형광입자의 형광특성에 의해 육안으로 유동성 확인이 용이한 장점이 있다.

일 경우로, 음향스트리밍 속도는 로딩된 시료의 액적과 기판의 접촉각에 따라 상이한 것일 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 접촉각을 크게 조절하면 높은 음향스크리밍 속도를 얻을 수 있다. 가령, 동일한 크기의 전압이 인가되는 경우, 낮은 전압에서도 접촉각을 조절하여 시료 액적 내부의 음향스트리밍 속도값을 빠르게 할 수 있으므로, 검체 및 증폭반응액이 포함된 시료의 혼합을 원할하게 할 수 있다. 즉, 혼합된 시료의 점성 변화량의 측정 범위가 더 넓어질 수 있으므로 동일한 환경조건에서 검체의 분석감도를 더 높일 수 있는 이점이 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 소자를 이용하면 인가되는 전압이 낮은 경우에도 검체의 분석감도를 높일 수 있고, 용액자체의 점도가 큰 고점도 시료의 경우에는 더 낮은 전력만으로도 분석이 가능할 수 있으므로 고점도 혈액을 이용한 진단이나 고점도 오일의 등급평가에도 활용할 수 있다.

도 2의 (b)와 같이 접촉각이 상이한 샘플 각각에 동일한 전압을 인가하면, 압전기판에 로딩한 시료의 액적과 기판의 접촉각이 클수록 동일한 전압을 인가시에 최대의 음향스트리밍 속도값이 측정됨을 확인할 수 있다. 보다 자세한 내용은, 후술하는 실시예를 통해 설명하도록 한다.

본 발명의 램-웨이브 기반 분자진단 방법을 이용하면, 측정된 음향스트리밍 속도의 변화로부터 진단대상의 유무를 판별할 수 있다. 이 때, 상기 음향스트리밍 속도 변화는 램-웨이브에 의해 혼합된 검체 및 증폭 반응액이 포함된 시료의 혼합물 점도와 상관되는 값으로, 상기 음향스트리밍 속도 변화를 분석함으로써 시료 내에 타깃 물질이 포함되어 있는지 유무를 확인할 수 있다.

가령, 댕기열 바이러스에 감염되었는지를 진단해야 하는 경우, 댕기열 바이러스 감염 의심 환자로부터 수득된 검체와 댕기열 바이러스의 유전자를 증폭시키는 중폭 반응액을 포함하는 시료를 압전기판의 웰에 로딩한 뒤, 작동 주파수를 갖는 교류전압을 인가하여 발생된 램-웨이브로 시료를 혼합시켜 증폭을 유도한다. 증폭반응이 진행되는 동안 음향스트리밍 속도를 측정하여 증폭산물의 생성여부를 확인할 수 있다. 이 때, 음향스트리밍 속도 변화가 거의 없다면, 상기 의심 환자는 댕기열 바이러스에 감염되지 않은 것으로 진단할 수 있고, 음향스트리밍 속도가 점차 감소하는 변화를 나타내는 경우, 환자는 댕기열 바이러스에 감염된 것으로 진단할 수 있다. 이 때, 속도가 감소하는 이유는 댕기열 바이러스에 특이적으로 결합하는 증폭용 프라이머 또는 프로브에 의해 생성되는 DNA 하이드로겔의 형성으로 인한 점도의 증가에 의한 결과로, 이 때, 실험적 오차를 감안하여 진단의 신뢰도를 높이기 위해서는, 속도의 변화량을 정량적으로 산출하여 특정 임계값 이상의 변화량 값이 산출되는 경우에는 진단대상이 검체에 포함되어 있는 것으로 진단됨이 바람직하다.

본 발명의 램-웨이브 기반 분자진단 방법에 의하면, 별도의 복잡한 전극 패터닝 공정 없이 알루미늄 호일, 전도성 액체 등을 이용하여 간편하게 압전기판에 램-웨이브를 발생시킬 수 있으며, 작동 주파수를 갖는 교류전압을 가하여 램-웨이브를 발생시켜 검체와 증폭반응액을 혼합할 수 있다. 이 때, 상기 시료에는 미세입자가 더 포함됨이 바람직하다. 이 때, 미세입자는 DNA 하이드로겔이 형성을 육안으로 확인하기 위해 시료에 포함되는 물질로, 바람직하게는 형광물질일 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.

전술한 바와 같이 본 발명의 압전기판에는 시료가 로딩되는 적어도 하나의 웰이 구비되어 있다. 이 때, 로딩된 시료가 반응 중에 램-웨이브에 의해 흐르거나 움직이는 경우를 방지하고자 웰을 제외한 압전기판은 소수성 물질로 코팅됨이 바람직하다.

위와 같이 구비된 전극에는, 전압 인가부가 연결될 수 있다. 상기 전압 인가부에 교류 전압을 인가하여 압전기판 자체에 램-웨이브가 발생할 수 있다. 구체적으로는, 상기 전압 인가부는 압전기판의 두께에 상응하는 작동 주파수를 갖는 교류 전압을 인가하고, 전압 인가부의 제어에 의해 교류 전압의 작동 주파수가 제어되어, 결과적으로 압전기판에 발생되는 램-웨이브가 제어될 수 있다. 램-웨이브의 제어는 전극에 인가되는 전압의 크기를 조절함으로써 가능할 수 있다. 그러나 전압의 크기는 압전기판에 로딩되는 시료의 부피, 부유시키는 미세입자의 크기나 부유농도, 압전기판의 두께 및 전극 간의 거리에 따라 상이할 수 있으므로, 소정의 조건 하에서 적정한 인가전압의 크기가 특정됨이 바람직하다.

일 측에 따르면, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자는, 유체가 유동되는 공간을 구성하는 챔버를 더 포함할 수 있다. 상기 공간은, 램-웨이브에 의해 압전기판 상에 로딩된 시료와 같은 유체가 유동되는 공간을 의미하고, 상기 공간이 구성된 소자는 증폭이 진행되는 동안 유체가 증발되는 현상을 완화시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 전술한 내용의 소자 중 어느 하나를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단용 키트가 제공된다. 이 때, 키트는 검체가 포함된 시약을 주입하여 검체의 병리학적인 변화를 통해 건강을 분석하거나 질환의 지표가 되는 물질을 조기에 검출하는 용도로 사용되는 장치로, 상기 키트는 공지된 진단용 키트 조성물 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다. 다만, 본 발명의 효과를 고려하면 현장현시검사에 적합하도록 최소한의 구성으로 소형화 되어 제작됨이 바람직하다.

보다 구체적인 설명은 이하의 실시예를 통해 후술하도록 한다.

실시예 1. 램-웨이브 기반 분자진단용 소자의 제작

도 1은, 본 발명의 램-웨이브 기반 분자진단용 소자 및 이의 작동원리를 개략적으로 도시한 것으로, 먼저, 도 1의 (a)는 양 측면에 알루미늄 테이프 전극이 구비된 압전기판을 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단용 소자의 개략도를 나타낸 것이다. 도 1 (a)의 소자는 DNA 증폭 과정에서 시료의 증발을 막기위해 PDMS 개방형 챔버를 사용하여 내부에 오일을 채웠다. 압전기판에 로딩되는 시료가 증폭반응 중에 움직이지 않도록, 압전기판의 표면을 마이크로스탬핑(Microstamping)방법을 사용하여 소수성 물질로 처리하였다. 구체적으로는, 직경 3mm인 원형의 웰(well)을 포함하는 스탬프에 소수성 물질을 옮겨, 기판과 접촉시킴으로써 압전기판에 소수성 물질을 코팅하였다.

도 1의 (b)는 본 발명의 램-웨이브 기반 분자진단용 소자를 구현한 것으로, 알루미늄 테이프 전극에 고주파(RF)신호를 인가하여 압전 기판 전체에 램-웨이브를 유도하였다. 이 때, 압전기판은 니오브산리튬(LiNbO₃)을 이용했다. 상기 소자의 주파수는 압전기판의 두께에 따라 전술한 수식 1의해 산출된 값을 이용하였으며, 이 경우, 생성되는 램-웨이브의 파장은 전술한 수식 2에 의해 확인되었다. 확인 결과, 압전기판이 3900m/s의 속도를 가지는 LiNbO3 기판인 경우, 연속적인 공진주파수 ((2n + 1) λ/ 2 (n = 0, 1, 2, ...)에 의해 전도성 액체로 이루어진 전극에 인가된 작동주파수는 173.3 MHz로 확인되었다.

RCA 등온증폭과정을 통해 생성되는 RCA 생성물에 의해 DNA 하이드로젤이 형성된다. DNA 하이드로젤은 증폭이 진행되는 동안 지속적으로 증가하여 샘플 액적의 점탄성이 증가시킨다. 상기 증폭과정이 진행되는 동안 램-웨이브에 의한 음향스트리밍의 속도 변화를 시각적으로 확인하기 위해, 시료에 포함되는 미세입자는 형광입자일 수 있다. 증폭이 진행되는 동안, 샘플 액적에 로딩된 형광입자가 부유되면, 도 1의 (c)와 같이 부유되는 입자에 의해 내부 유동이 생성된다. RCA 증폭이 진행되는 동안, 부유되는 입자의 속도는 액적의 점도가 증가함에 따라 점차 감소하게 된다.

실시예 2. 접촉각에 따른 시료 액적 내 부유된 입자의 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도 측정

실시예 1의 실험을 통해 제작된 램-웨이브 기반 분자진단용 소자를 이용하여 시료 액적 내부의 미세입자의 음향스트리밍 속도에 대한 액적의 접촉각의 영향을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.

실험은 접촉각이 각각 15°, 30°, 45°, 60°, 75°, 90 °인 샘플을 이용하였다. 도 2의 (a)와 같이 압전기판에 소수성 부분을 제외한 상대적으로 친수성인 웰(well)의 직경을 각각 다르게 제작하여, 10 μl의 시료를 로딩함으로써 다양한 접촉각을 형성하였다. 형성된 접촉각은 도 2의 (b)와 같이 USB 카메라 (800x 디지털 현미경, DMicroscope Inc.)를 이용하여 측면에서 촬영하여 측정했다. 측정된 접촉각은 각각 14.9 ± 0.4 °, 30.2 ± 0.3 °, 44.4 ± 0.5 °, 60.3 ± 0.4 °, 75.2 ± 0.3 ° 및 89.7 ± 0.2 °로 확인되었다. 이후, 전술한 방법으로 램-웨이브를 생성하여 각각의 시료 액적 내부의 물질을 혼합하고, 미세입자를 부유시켰다. 부유된 5μm 입자의 음향스트리밍 속도는 자유비디오분석 및 모델링 툴인 Tracker 5.0에 의해 분석되었다. 이 때, 평균 속도와 표준 편차는 6개 각각의 시료의 액적으로부터 측정된 값을 포함하였다. 그 결과, 도 2의 (c)에 도시한 바와 같이, 접촉각이 15 °에서 90 °로 증가함에 따라, 음향스트리밍 속도가 3.8μm/s에서 121.5μm/s로 증가했다. 접촉각이 작은 액적의 경우, 램-웨이브에 의해 유도된 액적의 압력구배가 낮아 음향스트리밍 속도가 감소하게 되는 것으로 확인되었다. 또, 접촉각이 최대인 90 °의 액적의 경우, 동일한 인가전압에서 가장 높은 음향스트리밍 속도가 나타났다.

실시예 3. RCA 증폭반응에 의한 음향스트리밍 속도와 점도의 상관관계 입증

시료 액적의 온도를 30°C이하로 유지하기 위해, 14-24V 범위의 전압을 인가하여 RCA등온증폭반응을 진행하였다. 증폭이 진행되는 동안, 열화상카메라를 이용하여 온도를 측정한 결과, 도 3의 (a)와 같았다. 도 3의 (a)의 왼쪽의 세로축을 기준으로 살펴보면, 전압을 14V에서 24V로 증가시키는 동안 온도가 약 25°C 에서 40°C로 증가하는 것을 확인할 수 있다.

시료와 기판의 접촉각이 90° 일 때, 최대의 음향스트리밍 속도를 달성하기 위한 10㎕ 시료 액적의 직경은 3.84mm였다. 또, 램-웨이브가 발생하기 전의 시료의 온도는 약 25°C였고, 14V의 인가전압시는 실온과 비슷한 수준인 약 25.4°C로 측정되었다. 인가전압을 17V로 증가시킨 경우, 평균온도는 약 30°C에 도달하고, 24V까지 증가시킨 경우에는 온도가 40°C까지 증가함을 확인하였다. 즉, 본 발명의 시료 액적의 온도를 30°C로 유지하기 위한 최적의 인가전압은 17V임을 확인할 수 있었다.

그림 3 (a)의 오른쪽의 세로축을 기준으로 살펴보면, 14V 내지 24V의 인가전압하에서 증폭이 진행되는 동안 시료 액적 내부에 부유된 미세입자의 음향스트리밍 속도를 확인할 수 있다. 음향스트리밍 속도(v)는 이론적으로 인가된 전압의 직교에(V²) 비례하여 14V일 때 101.4μm/s에서 24V에서 421.7㎛/s로 증가함을 확인할 수 있었다.

또, 부유된 미세입자의 음향스트리밍 속도에 미치는 점도 상승의 영향을 조사하기 위해, 1.4mPa·s에서 500mPa·s까지 여러 가지 점도의 글리세린 수용액 (G1345.1000, Duchefa Biochemie)을 준비하였다 (1.4, 14 , 100, 140, 200, 350 및 500 mPa · s).

실험의 최적화된 조건으로 추가적인 실험을 진행하기 위해, 접촉각 90° 및 시료온도 30°C를 만족시키기 위해, 시료액적의 직경은 3.84mm로, 인가전압은 17V로 고정시켰다.

그 결과, 도 3의 (b)와 같이, 시료의 점도가 1.4 mPa·s에서 500 mPa·s로 증가함에 따라 부유된 미세입자의 음향스트리밍 속도가 148.4 μm/s에서 5.85 μm/s로 감소하는 것으로 확인되었다. 다만, 점도가 500 mPa·s보다 높은 글리세린 용액에서 현탁 매질의 점도가 높기 때문에 부유된 미세입자의 음향스트리밍이 관찰되지 않아, 음향스트리밍 속도는 거의 0으로 확인되었다. 또, 1.4 mPa·s의 글리세린 용액에 부유된 미세입자의 음향스트리밍 속도는 17V에서 148.4 μm/s로 측정되었고, 상기 측정된 값은 증류수에 부유된 미세입자의 밀도와 거의 동일하였다(25 ℃에서 점도 ~ 0.9 mPa · s).

즉, 램-웨이브에 의한 음향스트리밍 속도는 y = 137.3-0.28x의 관계에 따라 액적 점도의 영향을 받음을 확인하였다.

실시예 4. 뎅기열 병원균 진단

본 발명의 램-웨이브 기반의 장치를 임상진단에 이용가능함을 증명하기 위해, RCA에 의한 뎅기 바이러스 분자증폭을 진행하고 이를 모니터링하였다. 음향스트리밍의 평균 속도 및 표준편차는 실험에 이용된 샘플 각각의 액적으로부터의 측정값을 포함하고, 음향스트리밍 속도는 각 샘플의 최대 속도에 의해 표준화되었다. 또, 증폭반응이 진행되는 약 60분간 모니터링 하는 사이 시료의 증발을 막기위해, PDMS 개방형 챔버에 미네랄 오일을 채워 모니터링을 진행하였다.

도 4의 (a)는 음성샘플 및 뎅기 병원균 올리고 뉴클레오타이드(약 100 pmol/μL)를 약 6 × 10^13 copy를 함유하는 뎅기 양성 샘플에 대한 시간에 따른 음향스트리밍 속도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 (a)에 도시된 바와 같이, 5분 간격으로 약 60분동안 음향스트리밍 속도를 측정한 결과, 처음 20분동안은 음성샘플과 뎅기 병원균 샘플 모두 거의 일정하게 음향스트리밍 속도가 유지되었으나, 뎅기 병원균 샘플은 이후 속도가 감소하는 것으로 나타났다.

이는 RCA 증폭과정이 진행됨에 따라, 뎅기 병원균 샘플의 증폭산물로 DNA 하이드로겔이 서서히 생성되어 시료 내부의 액적에 축적되고, 이로 인해 시료의 점탄성이 증가하여 음향스트리밍 속도는 지속적으로 감소하는 것으로 나타난 것으로 확인하였다. 램-웨이브 생성 30분 경과시, 음향스트리밍 속도는 초기 값의 약 82%까지 측정되었고, 램-웨이브 발생 60분 경과시, 음향스트리밍 속도는 초기 속도 대비 약 48%로 확인되었다. 이는 시료 액적의 점탄성이 증가되었음을 의미한다. 반면, 음성샘플의 경우에는, 시료 내부에 표적 DNA가 없으므로, RCA 생성물이 생성되지 않아, 내부에 DNA 하이드로겔이 형성되지 않았으므로 점성이 증가하지 않은 것을 확인하였다. 따라서, 음성샘플은 모니터링이 진행되는 60분간 음향스트리밍 속도가 거의 균일하게 유지되었고, 표준화 속도 또한 거의 1로 유지되었다.

램-웨이브 기반 DNA 증폭을 검증하기 위해, 뎅기 바이러스 음성샘플과 양성샘플을 이용하여 RCA 증폭반응을 통한 실시간 형광분석을 수행하였다. 안정적인 형광신호를 측정하기까지 약 20분이 소요되었고, 뎅기 병원균의 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 양성샘플에서는 점진적으로 증가된 형광강도가 나타났으나, 뎅기 병원균의 올리고 뉴클레오타이드가 없는 음성샘플에서는 형광강도가 증가하지 않았다.(도 4의 (b)) 또한, 상기 음성샘플 및 양성샘플의 RCA 혼합물을 30°C에서 8시간 동안 보관한 뒤, DNA 하이드로젤이 형성되었는지를 확인한 결과, 음성샘플에서는 하이드로겔이 확인되지 않았으나, 양성샘플에서는 DNA 하이드로겔이 형성됨이 확인되었다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

압전기판 표면을 소수성 물질로 코팅 처리하는 단계;
상기 압전기판 상에 검체, 미세입자 및 증폭 반응액이 포함된 시료를 로딩하는 단계;
상기 압전기판에 교류전압을 인가하는 단계;
램-웨이브에 의해 상기 시료가 혼합되는 단계;
상기 검체를 증폭시키는 단계; 및
상기 혼합된 시료의 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도를 실시간으로 측정하는 단계;
를 포함하는 램-웨이브 기반 분자진단 방법으로,
상기 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도가 변화하면 진단대상 물질이 존재하는 것으로 판단하고,
상기 전압은 14V 내지 24V 이고,
상기 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도는 상기 시료의 점도 증가에 의해 하기 식에 따라 변하며,
[식]
y = 137.3-0.28x (단, x는 시료의 점도, y는 음향스트리밍 속도)
상기 소수성 물질로 코팅 처리하는 단계에 의해 표면에너지를 제어하여 상기 시료의 미세액적과 압전기판 사이의 접촉각이 조절되는, 램-웨이브 기반 분자진단 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 점도는, DNA 하이드로겔의 형성에 의해 증가하는, 램-웨이브 기반 분자진단 방법.
제1항에 있어서,
개방형 챔버를 구비하는 단계; 및
상기 챔버 내부에 오일을 채우는 단계;
를 더 포함하는, 램-웨이브 기반 분자진단 방법.
제1항에 있어서,
상기 증폭은, RCA(Rolling Circle Amplification) 증폭인, 램-웨이브 기반 분자진단 방법.
제1항에 있어서,
상기 미세입자는, 형광물질인, 램-웨이브 기반 분자진단 방법.
제1항에 있어서,
상기 진단대상은, 뎅기열, 말라리아, 메르스, 에볼라 및 지카로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 질환의 원인균인, 램-웨이브 기반 분자진단 방법.
시료가 고정되는 압전기판;
상기 압전기판의 양단에 구비되는 전극; 및
상기 전극에 작동 주파수를 갖는 교류전압을 인가하여 상기 압전기판에 램-웨이브를 발생시키는 전압 인가부;
를 포함하고,
상기 전압은 14V 내지 24V이고,
상기 압전기판은 소수성 물질로 코팅된 것이고,
상기 소수성 물질의 코팅을 통해 표면에너지를 제어하여 상기 시료의 미세액적과 압전기판 사이의 접촉각이 조절되고,
상기 램-웨이브에 의해 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도가 변화하면 진단대상 물질이 존재하는 것으로 판단하고,
상기 음향스트리밍(acoustic streaming) 속도는 상기 시료의 점도 증가에 의해 하기 식에 따라 변하는, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자.
[식]
y = 137.3-0.28x (단, x는 시료의 점도, y는 음향스트리밍 속도)
제8항에 있어서,
상기 전극은, 알루미늄 포일 또는 전도성 액체인, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자.
제8항에 있어서,
상기 압전기판은, 상기 시료가 로딩되는 적어도 하나의 웰이 구비된, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자.
삭제
제8항에 있어서,
상기 소자는, 유체가 유동되는 공간을 구성하는 챔버를 더 포함하는, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자.
제8항에 있어서,
상기 진단대상은, 뎅기열, 말라리아, 메르스, 에볼라 및 지카로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 질환의 원인균인, 램-웨이브 기반 분자진단용 소자.
제8항 내지 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항의 소자를 포함하는, 램-웨이브 기반 분자진단용 키트.