ES2760948T3

ES2760948T3 - Métodos de evaluación de la calidad de un medio de cromatografía que une anticuerpos anti-A o anti-A

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Publication number: ES2760948T3
Application number: ES16187836T
Authority: ES
Inventors: Matthew T Stone; Nanying Bian; Santosh Rahane
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2020-05-18
Anticipated expiration: 2036-09-08
Also published as: KR101921907B1; EP3141556B1; CN106802352A; US20170067914A1; EP3141556A1; DK3141556T3; JP6348151B2; US10697982B2; CA2938549A1; AU2016219566A1; AU2016219566B2; CA2938549C; CN106802352B; KR20170030031A; JP2017053847A; SG10201606475SA

Abstract

Método para comparar la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad que contienen ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A unidos a un soporte sólido, comprendiendo el método las etapas de: (a) para cada una de las muestras de medios, proporcionar una disolución de anticuerpo IgM-A monoclonal purificado de concentración conocida C1 y volumen VM y una muestra de medio de cromatografía de afinidad de volumen VR; (b) incubar cada muestra de medio de cromatografía con la disolución de (a); (c) obtener un sobrenadante y medir la concentración C2 del anticuerpo IgM-A en el sobrenadante, para cada muestra de medio de cromatografía; (d) determinar la capacidad de unión estática de cada muestra de medio de cromatografía para el anticuerpo IgM-A, en donde la capacidad de unión estática se mide usando la ecuación**Fórmula** en donde las capacidades de unión estática de las muestras de medios se correlacionan con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-A de una muestra, proporcionando así una comparación de la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad diferentes.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de evaluación de la calidad de un medio de cromatografía que une anticuerpos anti-A o anti-A

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No.

62/215.423, fecha de presentación 8 de septiembre de 2015.

Antecedentes

El plasma humano enriquecido en inmunoglobulinas se usa para el tratamiento de muchos trastornos, así como para tratar ciertas deficiencias congénitas. Típicamente, el plasma humano se obtiene combinando el plasma de múltiples donantes, que tienen diferentes tipos de grupos sanguíneos. Los grupos sanguíneos se pueden dividir en 4 tipos principales. Grupo sanguíneo tipo A - tiene solo el antígeno A en los glóbulos rojos (y el anticuerpo B en el plasma); grupo sanguíneo tipo B - tiene solo el antígeno B en los glóbulos rojos (y el anticuerpo A en el plasma); grupo sanguíneo tipo AB - tiene los antígenos A y B en los glóbulos rojos (pero ni el anticuerpo A ni el B en el plasma); y grupo sanguíneo tipo O - no tiene antígenos A ni B en los glóbulos rojos (pero los anticuerpos A y B están en el plasma).

Es importante que los glóbulos rojos de una persona que tiene un antígeno de un tipo de grupo sanguíneo particular, tal como el A, nunca entren en contacto con los anticuerpos que se unirán a este antígeno, tales como los anticuerpos anti-antígeno A, porque el contacto con dichos anticuerpos daría como resultado la aglutinación y/o hemólisis de sus glóbulos rojos, lo que incluso puede dar como resultado la muerte. Por lo tanto, un receptor que tenga un grupo sanguíneo tipo A solo puede recibir plasma de un donante que tenga un grupo sanguíneo tipo A o un grupo sanguíneo tipo AB; un receptor que tenga un grupo sanguíneo tipo B solo puede recibir plasma de un donante que tenga un grupo sanguíneo tipo B o un grupo sanguíneo tipo AB; un receptor que tenga un grupo sanguíneo AB solo puede recibir plasma de un donante que tenga un grupo sanguíneo tipo AB; y un receptor que tenga un grupo sanguíneo tipo O se considera un receptor universal. La compatibilidad de los diferentes grupos sanguíneos es importante para el desarrollo de transfusiones de sangre y trasplantes de órganos seguros. Sin embargo, en el caso de los fármacos terapéuticos derivados de la sangre que se basan en la combinación de plasma sanguíneo de un gran número de personas para obtener un promedio consistente de componentes proteicos, resulta especialmente difícil garantizar que un receptor no reciba plasma incompatible.

Se han desarrollado una serie de enfoques para eliminar selectivamente los anticuerpos de tipos de grupos sanguíneos del plasma, incluidos los glóbulos rojos tratados térmicamente y con formalina (Vox Sang., 1967, 12, 75 77), Escherichia coli Os6:B7 tratada térmicamente que tiene antígenos A y B (Transfusion, 1972, 12, 98-102), polvo de estroma de glóbulos rojos, inmunoadsorbentes derivados de antígeno de estroma de glóbulos rojos (Chemical Soc. Rev., 1978, 7, 423-452) e inmunoadsorbentes de grupos sanguíneos A y B sintéticos (Rev. Fr. Transfus. Immunohematol. 1981, 24, 3, 281-287).

Los inmunoadsorbentes para cromatografía en fase sólida se han desarrollado como medios de cromatografía comerciales para el tratamiento de productos derivados de la sangre y también para la preparación de donantes antes del trasplante a un receptor incompatible con ABO. Una de las ventajas clave de emplear inmunoadsorbentes sintéticos es que se construyen sintéticamente en lugar de obtenerse de fuentes naturales y, por lo tanto, tienen propiedades más consistentes de un lote a otro.

Actualmente, algunos de los medios cromatográficos disponibles comercialmente con los ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A (antígeno A) y/o los ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B (antígeno B) incluyen el dispositivo Glycosorb-ABO (Glycorex Transplantation AB). Este dispositivo Glycosorb se usa para preparar donantes de órganos para el trasplante a pacientes que tienen tipos sanguíneos incompatibles. Los ligandos de antígenos del grupo sanguíneo del dispositivo Glycosorb-ABO se unen y eliminan los anticuerpos hacia los antígenos del grupo sanguíneo A (anti-A) y los anticuerpos hacia los antígenos del grupo sanguíneo B (anti-B) de la sangre de los donantes de órganos, lo que reduce el riesgo de rechazo de órganos.

Se ha descrito un método para comparar medios de cromatografía de afinidad para la unión de anticuerpos del grupo sanguíneo A midiendo el porcentaje de anticuerpos del grupo sanguíneo A extraídos del suero humano (Journal of Chromatography, 539 (1991), 307-314).

Uno de los principales desafíos en la utilización de medios de cromatografía para la purificación de productos derivados de la sangre es la ausencia de un método eficiente y reproducible para evaluar la calidad relativa de diferentes medios, p. ej., diferentes lotes del mismo tipo de medios o medios de diferentes fuentes o las mismas muestras de medios con el tiempo.

Resumen

Las realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a métodos para evaluar la calidad de un medio de cromatografía que contiene ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o ligando de antígenos del grupo sanguíneo B. Los métodos descritos en la presente memoria son especialmente útiles para estimar o evaluar la calidad del mismo tipo de medio de lote a lote, durante y después del uso y para optimizar los medios durante el desarrollo.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para comparar la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad, ambas conteniendo ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A unidos a un soporte sólido, donde el método comprende las etapas de:

(a) proporcionar dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad, cada una de volumen VR;

(b) incubar cada muestra con una disolución de anticuerpo IgM-A monoclonal purificado de concentración conocida C1 y volumen VM;

(c) obtener un sobrenadante para cada una de las muestras y medir la concentración C2 del anticuerpo IgM-A en cada sobrenadante; determinar la capacidad de unión estática de cada una de las muestras de medios de cromatografía de afinidad usando la siguiente ecuación.

[C1-C2]xVM

VR

en donde las capacidades de unión estática de las muestras de medios para IgM-A se correlacionan con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-A de una muestra, proporcionando así una comparación de la calidad de las dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad diferentes.

En otras realizaciones, se proporciona un método para comparar la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad, cada una de las cuales contiene ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B unidos a un soporte sólido, donde el método comprende las etapas de:

(b) incubar cada muestra con una disolución de anticuerpo IgM-B monoclonal purificado de concentración conocida C1 y volumen VM;

(c) obtener un sobrenadante para cada una de las muestras y medir la concentración C2 del anticuerpo IgM-B en cada sobrenadante; determinar la capacidad de unión estática de cada una de las muestras de medios de cromatografía de afinidad usando la siguiente ecuación.

[C1-C2] x VM

VR

en donde las capacidades de unión estática de las muestras de medios para IgM-B se correlacionan con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-B de una muestra, proporcionando así una comparación de la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad.

Una muestra de medios que tiene una mayor capacidad de unión para IgM-A o IgM-B, respecto a otras muestras con las que se compara, es de mejor calidad en comparación con las otras muestras de medios.

En algunas realizaciones según los métodos descritos en la presente memoria, el soporte sólido es un soporte sólido polimérico poroso o no poroso que comprende un polímero seleccionado del grupo que consiste en poliviniléter, polivinilalcohol, polimetacrilato, poliacrilato, poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilamida y policarbonato. En una realización particular, el soporte sólido es un soporte sólido basado en poliviniléter. En algunas realizaciones, el soporte sólido está en forma de lechos (p. ej., un lecho basado en poliviniléter).

En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, las diferentes muestras de medios de cromatografía de afinidad constituyen lotes diferentes del mismo tipo de medio.

En otras realizaciones, las diferentes muestras de medios de cromatografía de afinidad constituyen los mismos medios en diferentes etapas de uso.

En algunas realizaciones, los medios son capaces de eliminar anticuerpos anti-A o anti-B de una muestra seleccionada del grupo que consiste en sangre, productos sanguíneos, plasma, derivados de plasma e IVIG.

En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpo IgM-A o IgM-B en el sobrenadante se mide usando absorbancia a 280 nm.

También se proporcionan en la presente memoria métodos para evaluar la calidad de un medio de cromatografía de afinidad que contiene ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o ligando de antígenos del grupo sanguíneo B unido a un soporte sólido, después de la exposición del medio de cromatografía de afinidad a condiciones ácidas o alcalinas, el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cromatografía que tiene ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A o ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B unidos a un soporte sólido; (b) medir la capacidad de unión de los medios para un anticuerpo IgM-A purificado en el caso de un medio de ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o para un anticuerpo IgM-B purificado en el caso de un medio ligando de antígenos del grupo sanguíneo B; (c) exponer los medios a condiciones ácidas o alcalinas durante al menos 5 horas; y (d) medir la capacidad de unión de los medios para un anticuerpo IgM-A purificado en el caso de un medio de ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o para un anticuerpo IgM-B purificado en el caso de un medio de ligando de antígenos del grupo sanguíneo B; en donde una reducción en la capacidad de unión de los medios en la etapa (d) con respecto a la etapa (b) indica que la calidad de los medios se ha reducido después de la exposición a condiciones ácidas o alcalinas.

Las realizaciones descritas en la presente memoria también se pueden usar para determinar si un medio comprende ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A o ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B, donde el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio, donde se desconoce si el medio comprende ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A o ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B; (b) medir la capacidad de unión del medio desconocido para el anticuerpo IgM-A monoclonal purificado y por separado para el anticuerpo IgM-B monoclonal purificado; y (c) comparar la capacidad del medio desconocido para el anticuerpo monoclonal IgM-A purificado y el anticuerpo monoclonal IgM-B purificado; donde se determina que el medio desconocido comprende ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A, si tiene una mayor capacidad de unión para el anticuerpo IgM-A monoclonal en relación con la capacidad de unión para el anticuerpo IgM-B monoclonal, y se determina que el medio desconocido comprende ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B si tiene una mayor capacidad de unión para el anticuerpo IgM-B monoclonal en relación con la capacidad de unión para el anticuerpo IgM-A monoclonal.

En algunas realizaciones, se determina que un medio desconocido comprende ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A si tiene capacidad de unión para un anticuerpo IgM-A monoclonal y no tiene capacidad de unión para un anticuerpo IgM-B monoclonal. Por el contrario, se determina que un medio desconocido comprende ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B si tiene capacidad de unión para un anticuerpo IgM-B monoclonal y no tiene capacidad de unión para un anticuerpo IgM-A monoclonal.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un ligando de oligosacárido representativo, que se une a los anticuerpos anti-antígeno A.

La Figura 2 es un ligando oligosacárido representativo, que se une a los anticuerpos anti-antígeno B.

Descripción detallada

Recientemente, ha habido un interés creciente en la aplicación de medios de cromatografía inmunoadsorbentes sintéticos para la eliminación de IgG anti-A y anti-B de la inmunoglobulina intravenosa (IVIG), que consiste en anticuerpos IgG polivalentes concentrados extraídos de plasma combinado obtenido de varios donantes de sangre, a veces hasta mil o más de mil donantes de sangre. Durante el proceso de purificación de la IgG del plasma sanguíneo, los anticuerpos IgM anti-A y anti-B más grandes pueden separarse típicamente de los anticuerpos IgG más pequeños por fraccionamiento. Sin embargo, un porcentaje de los anticuerpos anti-A y anti-B generalmente está en forma de IgG que no puede distinguirse de los otros anticuerpos IgG solo por fraccionamiento. Por lo tanto, los concentrados terapéuticos de IVIG se criban típicamente usando un ensayo de aglutinación para monitorizar las concentraciones de anticuerpos IgG anti-A y anti-B con el fin de evitar la administración de IVIG con altas concentraciones de anticuerpos IgG anti-A y anti-B. Sin embargo, a pesar de esta precaución, todavía se sabe que las reacciones hemolíticas que pueden conducir a la muerte ocurren para aquellos receptores que tienen grupos sanguíneos de tipo A, B o AB (Transcripción de "Strategies to address hemolytic complications of immune globulin infusions," f Da Center for Biologics Evaluation and Research Public Workshop Washington, D.C. 28-29 de enero, 2014).

Los ensayos de aglutinación comunes se basan en el uso de glóbulos rojos vivos, que tienen vidas limitadas y la densidad de antígenos en la superficie celular generalmente varía de un lote a otro. La aglutinación también requiere diluciones en serie y se basa en una evaluación cualitativa (observaciones visuales o microscópicas) de la aglutinación celular. Un método más preciso para determinar las concentraciones de anticuerpos anti-A y anti-B emplea la citometría de flujo. Sin embargo, los métodos de citometría de flujo también usan glóbulos rojos vivos y son significativamente más complejos y requieren más tiempo que los ensayos de aglutinación. También se ha informado que los ensayos ELISA miden la concentración de anticuerpos anti-A y anti-B, sin embargo, esta técnica requiere un procedimiento con múltiples etapas relativamente complejo y reactivos de antígenos especializados.

Como se discutió anteriormente, los medios inmunoadsorbentes de cromatografía que contienen ligandos que se unen a anticuerpos anti-A o anti-B se consideran efectivos para la eliminación de dichos anticuerpos de productos derivados de la sangre, p. ej., plasma e IVIG. Sin embargo, actualmente, no hay buenos métodos disponibles que puedan usarse para la cualificación y validación de dichos medios, con el fin de evaluar su reproducibilidad y fiabilidad.

Es importante evaluar la calidad de lote a lote de los medios de cromatografía de ligando de antígenos del grupo sanguíneo con el fin de asegurar que el medio cumpla con las especificaciones de producción y los requisitos de calidad a lo largo de su vida útil. Además, también es importante evaluar dichos medios durante y después del uso, limpieza y desinfección para asegurarse de que conserva la capacidad de eliminar las impurezas previstas después de los procedimientos de uso, limpieza y desinfección. La capacidad de los medios de ligando de antígenos del grupo sanguíneo para unirse a las moléculas diana previstas generalmente se ha evaluado directamente midiendo la reducción en la concentración de anticuerpos policlonales de antígenos del grupo sanguíneo en productos derivados de la sangre antes y después del contacto con el medio de ligando de antígenos del grupo sanguíneo.

Como se evidencia en los Ejemplos en la presente memoria, la capacidad de los medios de ligando de antígenos anti-A y anti-B para un anticuerpo monoclonal IgM purificado se correlaciona con la capacidad de los medios para eliminar los anticuerpos del grupo sanguíneo A o los anticuerpos del grupo sanguíneo B, según sea el caso, de una alimentación IVIG. Este hallazgo fue bastante inesperado debido a las diferencias inherentes entre el tipo y el tamaño de las moléculas de IgG y de IgM. En otras palabras, la IgM tiene una estructura pentamérica y no se esperaría que la capacidad de unión de un medio para una molécula de IgM, que tiene una estructura pentamérica, se correlacione con la capacidad de ese medio para eliminar las moléculas de IgG que tienen una estructura monomérica. Además, como lo evidencian los Ejemplos descritos en la presente memoria, la capacidad de unión de un medio para un anticuerpo IgM murino es predictiva de su capacidad para eliminar un porcentaje de moléculas de IgG humana de una muestra, p. ej., una alimentación de IVIG, es decir, de una especie completamente diferente, lo que también fue inesperado.

La medición de la capacidad de los medios que contienen ligandos de antígenos del grupo sanguíneo para una molécula purificada (p. ej., IgM en este caso) tiene varias ventajas sobre los métodos descritos anteriormente, que se basan en gran medida en la medición de la eliminación de los anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo de los productos sanguíneos, que consume mucho tiempo y es difícil de reproducir. Por el contrario, las realizaciones descritas en la presente memoria se basan en medir la capacidad de unión para una molécula purificada que puede realizarse de manera más eficiente y reproducible en comparación con los métodos convencionales conocidos en la técnica.

Específicamente, los métodos descritos en la presente memoria no solo son más fácilmente reproducibles, ya que se pueden preparar concentraciones consistentes de los anticuerpos monoclonales para cada medición de capacidad, sino que los métodos descritos en la presente memoria tampoco requieren ningún equipo especializado (p. ej., para citometría de flujo) ni reactivos de antígenos del grupo sanguíneo especializados (p. ej., para ensayos basados en ELISA).

Con el fin de que las realizaciones descritas en la presente memoria puedan entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

I. Definiciones

El término "capacidad de unión" se refiere a la cantidad de una molécula que se une a un volumen definido de medio empaquetado en una columna y se opera en condiciones definidas. La capacidad de unión de un medio de cromatografía descrito en la presente memoria es la cantidad de anticuerpos anti-A o anti-B que puede unir el medio de cromatografía por volumen de medio a una tasa de flujo establecida.

En las realizaciones descritas en la presente memoria, el anticuerpo monoclonal IgM purificado se usa para evaluar la capacidad de unión de un medio de cromatografía adecuado para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B; y dicha capacidad de unión se correlaciona con la capacidad de dicho medio para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B. En otras palabras, la capacidad de unión de un medio de cromatografía para IgM se puede usar como un indicio para determinar la efectividad del medio para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B, según sea el caso. La capacidad de unión puede medirse como capacidad de unión estática o capacidad de unión dinámica.

El término "capacidad de unión estática" de un medio (p. ej., un medio de cromatografía) se define como la cantidad de una proteína unida por el medio dividida por el volumen del medio usado. Un método ejemplar para medir la capacidad de unión estática de un medio de cromatografía es el siguiente. Después de poner en contacto el medio de cromatografía con la disolución de proteína de concentración conocida, se permite que la disolución se incube con el medio para facilitar la unión de la proteína al medio de cromatografía. El tiempo de incubación puede variar (p. ej., de 5 minutos a 72 horas) y lo puede determinar fácilmente un experto en la técnica, p. ej., midiendo la concentración de la proteína en el sobrenadante periódicamente (p. ej., midiendo la absorbancia a 280 nm) hasta que no haya un cambio mensurable en la concentración en el sobrenadante. Una vez que se alcanza el equilibrio entre la proteína unida al medio de cromatografía y la que está en disolución, la concentración de la disolución de proteína se mide una vez más en el sobrenadante. La capacidad de unión estática se mide entonces mediante la cantidad de proteína de partida (antes de la incubación) menos la cantidad de proteína en el sobrenadante (después de la incubación) dividida por el volumen del medio usado.

La capacidad de unión estática de un medio de cromatografía particular generalmente está influenciada por la composición de la disolución de proteína, que incluye uno o más de los siguientes factores, p. ej., la concentración de la proteína, la cantidad de medio cromatográfico usado, la concentración de otros componentes en la disolución (sales, moléculas orgánicas, tampones), el pH de la disolución y la conductividad. También puede estar influenciada por la temperatura de la disolución de proteína. Todas estas variables generalmente se mantienen constantes con el fin de permitir la comparación de la capacidad de unión estática entre dos medios de cromatografía diferentes. El término "capacidad de unión estática" también puede denominarse "capacidad de unión de saturación" o "capacidad de unión máxima".

En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, la capacidad de unión estática de un medio que contiene ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o un medio que contiene ligando de antígenos del grupo sanguíneo B para un anticuerpo IgM monoclonal purificado se usa como un indicio para predecir o evaluar su capacidad para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B , según sea el caso, de una muestra (p. ej., una alimentación IVIG). Es especialmente útil comparar la capacidad de unión estática de dos lotes diferentes de medios o del mismo medio a lo largo del tiempo o medios de diferentes fuentes, ya que proporciona información sobre la calidad de los medios. En otras palabras, dado que la capacidad de unión para un anticuerpo IgM purificado se correlaciona con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B, según sea el caso, la capacidad de unión puede usarse para evaluar y comparar el rendimiento de diferentes lotes de un medio o el mismo medio a lo largo del tiempo o medios de diferentes fuentes. Por consiguiente, usando los métodos descritos en la presente memoria, un experto en la técnica o un usuario final en la técnica puede determinar fácilmente si un lote de medios presenta pérdida en su rendimiento (es decir, capacidad para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B) sobre otro lote del mismo tipo de medio, o a lo largo del tiempo, especialmente después de la limpieza y desinfección repetidas. Además, la medición de la capacidad de unión estática para IgM purificada también se puede usar para optimizar un medio durante el desarrollo.

En general, la capacidad de unión estática se puede calcular de la siguiente manera. Una muestra de medio de volumen VR se incuba con una disolución de anticuerpo IgM monoclonal purificado de concentración conocida C1 y volumen VM conocido (IgM-A en el caso del medio de ligando de antígenos del grupo sanguíneo A e IgM-B en el caso de medio de ligando de antígenos del grupo sanguíneo B); se obtiene un sobrenadante y se mide la concentración de anticuerpo IgM C2 en el sobrenadante; la capacidad de unión estática se calcula entonces usando la siguiente ecuación.

[C1-C2]xVM

VR

El término "capacidad de unión dinámica" se define como la cantidad de una proteína que se une a una columna de cromatografía en condiciones de flujo en el punto en que la concentración de la disolución de proteína que sale de la columna de cromatografía alcanza una cierta concentración, típicamente un porcentaje predeterminado de la concentración de partida. En la práctica, esto tiende a ser aproximadamente el 10 % de la concentración de partida. Esta masa de proteína se divide entonces por el volumen del medio en la columna de cromatografía.

La capacidad de unión dinámica de un medio de cromatografía particular generalmente está influenciada por la composición de la disolución de proteína, que incluye uno o más de los siguientes factores, p. ej., la concentración de la proteína, la concentración de otros componentes en la disolución (sales, moléculas orgánicas, tampones), el pH de la disolución, y la conductividad. La capacidad de unión dinámica también puede verse influenciada por la temperatura a la que se carga la columna y por la tasa de flujo a la que se carga la disolución de proteína en la columna. La disminución de la tasa de flujo de la disolución de proteína en la columna de cromatografía aumenta la capacidad de unión dinámica que se mide. A la inversa, el aumento de la tasa de flujo de la disolución de proteína en la columna de cromatografía disminuye la capacidad de unión dinámica que se mide. La capacidad de unión dinámica no debe exceder la capacidad de unión estática, ya que la capacidad dinámica de un medio de cromatografía está limitada por la tasa global de transferencia de masa.

El término "sobrenadante" se define como líquido que está por encima de los medios de cromatografía asentados. La disolución de sobrenadante puede obtenerse permitiendo que el medio de cromatografía en una suspensión de sólidos se asiente en el fondo de un recipiente o una columna. El proceso de asentamiento puede acelerarse sometiendo a la suspensión de sólidos del medio de cromatografía a centrifugación o mediante vibración. La disolución de sobrenadante se puede separar entonces del medio de cromatografía transfiriéndola mediante una pipeta, jeringa o bomba a un recipiente distinto. Además, también se puede obtener un sobrenadante filtrando una suspensión sólidos de medios de cromatografía a través de una membrana o material poroso.

El término "muestra" se define como la disolución que contiene al menos una proteína diana (p. ej., anticuerpo anti-A y/o anti-B en este caso) destinada a unirse a un medio de cromatografía, como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, la proteína diana es un anticuerpo o una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina es un anticuerpo de antígenos del grupo sanguíneo A (es decir, anticuerpo anti-A). En otras realizaciones, la inmunoglobulina es un anticuerpo de antígenos del grupo sanguíneo B (es decir, anticuerpo anti-B). Los ejemplos de muestras incluyen, pero no están limitados a, sangre, plasma, derivados del plasma, productos sanguíneos, alimentación de inmunoglobulinas intravenosas (IVIG).

El término "IgG", "inmunoglobulina", "Ig" o "anticuerpo" (usados indistintamente en la presente memoria) se refiere a una proteína que tiene una estructura básica de cuatro cadenas polipeptídicas que consiste en dos cadenas pesadas y dos ligeras, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por enlaces disulfuro intercatenarios, que tiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "inmunoglobulina de cadena única" o "anticuerpo de cadena única" (usados indistintamente en la presente memoria) se refiere a una proteína que tiene una estructura de dos cadenas polipeptídicas que consiste en una cadena pesada y una ligera, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por enlazadores peptídicos intercatenarios, que tiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (p. ej., que comprenden de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, mediante una lámina p plegada y/o un enlace disulfuro intracatenario. Los dominios se denominan en la presente memoria adicionalmente como "constantes" o "variables", basándose en la falta relativa de variación de secuencias dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "constante", o en la variación significativa dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de anticuerpos o polipéptidos a menudo se denominan indistintamente en la técnica como "regiones" de anticuerpos o polipéptidos. Los dominios "constantes" de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente como "regiones constantes de la cadena ligera", "dominios constantes de la cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de las cadenas pesadas de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones constantes de la cadena pesada", "dominios constantes de la cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones variables de la cadena ligera", "dominios variables de la cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de las cadenas pesadas de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones variables de la cadena pesada", "dominios variables de la cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH".

Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica o polimérica.

El término "IgM" o "Inmunoglobulina M", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a los anticuerpos con una estructura pentamérica, p. ej., los anticuerpos IgM que se encuentran en el suero sanguíneo. Con un peso molecular de aproximadamente 970 kDa, los anticuerpos IgM son considerablemente más grandes que los IgG que tienen una estructura monomérica y un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. A diferencia de los anticuerpos IgG que tienen 2 sitios de unión al antígeno, los anticuerpos IgM tienen 10 sitios de unión al antígeno. Los anticuerpos IgM son los principales responsables de la aglutinación de los glóbulos rojos cuando un receptor recibe una transfusión de sangre de un donante incompatible. Por ejemplo, una persona con un grupo sanguíneo A y que tiene anticuerpos IgM anti-B experimentará aglutinación tras la transfusión de un donante del grupo sanguíneo B. Los anticuerpos IgM grandes generalmente se pueden separar de los anticuerpos IgG más pequeños del plasma sanguíneo por fraccionamiento.

El término "cromatografía", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una técnica de separación dinámica que separa o elimina una molécula (p. ej., anticuerpos anti-A y/o anti-B en este caso) de otras moléculas de una muestra. Típicamente, en un método de cromatografía, una fase móvil (líquido o gas) transporta una muestra que contiene la molécula a separar o eliminar a través de un medio de fase estacionaria (normalmente sólido) (p. ej., un medio de cromatografía). Las diferencias de partición o afinidad respecto de la fase estacionaria separan la molécula de otros componentes de la muestra.

El término "cromatografía de afinidad", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un modo de cromatografía en el que una molécula a separar o eliminar (p. ej., anticuerpos anti-A y/o anti-B) se aísla por su interacción con otra molécula (p. ej., un ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o un ligando de antígenos del grupo sanguíneo B inmovilizado sobre un soporte sólido) que interacciona específicamente con la molécula a separar o eliminar. Un medio usado en cromatografía de afinidad se denomina medio de cromatografía de afinidad.

El término "medio" o "medio de cromatografía", tal y como se usa indistintamente en la presente memoria, se refiere a un soporte sólido que tiene un ligando de antígenos del grupo sanguíneo A y/o un ligando de antígenos del grupo sanguíneo B inmovilizado sobre él.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para evaluar la calidad de cualquier medio de cromatografía que sea adecuado para eliminar anticuerpos anti-A y/o anti-B, incluyendo los descritos en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/215.401, presentada el 8 de septiembre de 2015.

En las realizaciones descritas en la presente memoria, se usa una disolución de IgM purificada para evaluar la capacidad de unión de un medio de cromatografía que incluye un ligando de antígenos del grupo sanguíneo A o un ligando de antígenos del grupo sanguíneo B unido a un soporte sólido. En otras palabras, el anticuerpo IgM monoclonal purificado se usa como una molécula modelo para investigar la calidad de un medio de cromatografía adecuado para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B.

Los términos "anti-A" o "anticuerpos anti-A" se refieren a los anticuerpos que se unen a los antígenos del grupo sanguíneo A que se encuentran en la superficie de las células en individuos que tienen un grupo sanguíneo tipo A o grupo sanguíneo tipo AB. Por consiguiente, es deseable eliminar dichos anticuerpos en muestras derivadas de sangre (p. ej., sangre, productos sanguíneos, plasma, derivados del plasma o una alimentación de IVIG).

Los términos "anti-B" o "anticuerpos anti-B" se refieren a los anticuerpos que se unen a los antígenos del grupo sanguíneo B que se encuentran en la superficie de las células en individuos que tienen un grupo sanguíneo tipo B o un grupo sanguíneo tipo AB. Por consiguiente, es deseable eliminar dichos anticuerpos en muestras derivadas de sangre (p. ej., sangre, productos sanguíneos, plasma, derivados del plasma o una alimentación de IVIG).

El término "calidad de un medio", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de un medio de cromatografía para eliminar selectivamente una entidad indeseable (p. ej., anticuerpos anti-A o anti-B) de una muestra (p. ej., sangre, productos sanguíneos, plasma, derivados del plasma o una alimentación IVIG). Los métodos proporcionados en la presente memoria son especialmente útiles para evaluar y/o monitorizar la calidad relativa de diferentes medios (p. ej., diferentes lotes del mismo tipo de medio o el mismo tipo de medio de diferentes fuentes o muestras de medios o prototipos obtenidos durante el proceso de desarrollo o fabricación) midiendo su capacidad de unión para un anticuerpo IgM monoclonal purificado. En otras palabras, las capacidades de unión relativa de diferentes medios o muestras de medios para un anticuerpo IgM monoclonal purificado es indicativa de la capacidad de los medios para eliminar selectivamente anticuerpos anti-A o anti-B (es decir, calidad relativa de los medios o muestras de medios). Por consiguiente, la capacidad de unión de un medio para una molécula de IgM particular puede usarse para discernir la calidad general de los medios en relación con otros lotes de los mismos medios o la calidad de los mismos medios a lo largo del tiempo, p. ej., durante la fabricación, uso, limpieza y desinfección

Por lo tanto, un lote de medio diseñado para eliminar los anticuerpos anti-A que tiene una capacidad de unión más baja para un anticuerpo IgM-A purificado que un lote fabricado previamente de ese mismo tipo de medio sería de peor calidad en relación con el lote anterior, ya que se esperaría que eliminara un porcentaje menor de anticuerpos anti-A de una muestra. Por el contrario, un lote de medio diseñado para eliminar anticuerpos anti-A que tiene una capacidad de unión más alta para un anticuerpo IgM-A purificado que un lote fabricado previamente de ese mismo tipo de medio sería de mejor calidad en relación con el lote anterior, ya que se esperaría que eliminara un porcentaje mayor de anticuerpos anti-A de una muestra. De manera similar, un lote de medio que tiene una capacidad de unión más baja para un anticuerpo IgM-B purificado que un lote fabricado previamente de ese mismo tipo de medio sería de peor calidad en relación con el lote anterior, ya que se esperaría eliminara un porcentaje menor de anticuerpos anti-B de una muestra. Por el contrario, un medio que tenga una capacidad de unión más alta para un anticuerpo IgM-B purificado que un lote fabricado previamente de ese mismo tipo de medio sería de mejor calidad en relación con el lote anterior, ya que se esperaría que eliminara un porcentaje mayor de anticuerpos anti-B de una muestra.

En general, es necesario monitorizar la calidad de los medios de cromatografía durante su vida útil para garantizar que los medios conservan su capacidad de eliminar un porcentaje deseable de anticuerpos anti-A o anticuerpos anti-B de una muestra. Por ejemplo, la calidad de los medios de cromatografía puede verse afectada negativamente después de un uso repetido, p. ej., después de la exposición a condiciones severas de limpieza y/o desinfección, reduciendo su capacidad para eliminar un porcentaje particular de anticuerpos anti-A o anticuerpos anti-B de una muestra. La calidad de un lote de medio diseñado para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B se puede monitorizar midiendo su capacidad de unión para un anticuerpo IgM-A purificado o un anticuerpo IgM-B, respectivamente, antes y después de que el medio se haya usado repetidamente o expuesto a condiciones severas de limpieza y/o desinfección. Si la capacidad de unión de los medios para una IgM-A o IgM-B purificada se ha reducido en relación con el tiempo anterior en que se midió, esto indicaría que los medios ahora eliminarían un porcentaje menor de anticuerpos anti-A o anti-B.

Por consiguiente, los métodos descritos en la presente memoria son útiles para evaluar la calidad de un medio de cromatografía para la eliminación de anti-A o anti-B, a lo largo del tiempo, así como para comparar la calidad de dos lotes de medios separados.

Además, los métodos descritos en la presente memoria también pueden usarse para la optimización de un medio durante la fabricación o desarrollo. En otras palabras, se puede evaluar la capacidad de un medio prototipo para eliminar anticuerpos anti-A o anti-B, según sea el caso, simplemente determinando su capacidad de unión para un anticuerpo IgM purificado, y los medios se pueden mejorar u optimizar aún más, si es necesario, en función de su capacidad de unión para un anticuerpo IgM purificado. Por ejemplo, una vez que se hace un medio prototipo, la calidad de ese medio puede evaluarse usando los métodos descritos en la presente memoria, para determinar si necesita más optimización o modificaciones. De esta forma, varias iteraciones de los medios se pueden evaluar fácilmente para determinar la calidad durante el desarrollo, lo que da lugar a la versión final de los medios.

Además, los métodos descritos en la presente memoria también son útiles para diferenciar entre los medios de ligando de antígenos del grupo sanguíneo A y los medios de ligando de antígenos del grupo sanguíneo B. Es fácil para un operador o un usuario final confundir la identidad de los dos medios durante la fabricación y también cuando se usan, ya que los dos tipos de medios a menudo se fabrican y también se almacenan en la misma ubicación y parecen prácticamente idénticos en la inspección visual. Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan una forma de distinguir entre estos dos tipos de medios, es decir, cuando se desconoce si los medios se unen a los anticuerpos anti-A o anticuerpos anti-B. Por ejemplo, la identidad de un medio desconocido (es decir, si contiene ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A o ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B) se puede establecer comparando su capacidad para IgM anti-A monoclonal purificada y para IgM anti-B monoclonal purificada con las capacidades de todos los posibles medios conocidos para IgM anti-A monoclonal purificada y para IgM anti-B monoclonal purificada. Por consiguiente, se esperaría que un medio que contiene ligando de antígenos del grupo sanguíneo A muestre una capacidad de unión significativa para el anticuerpo IgM-A purificado y una capacidad de unión significativamente menor o insignificante para el anticuerpo IgM-B purificado. De manera similar, se esperaría que un medio que contiene ligando de antígenos del grupo sanguíneo B muestre una capacidad de unión significativa para el anticuerpo IgM-B purificado y una capacidad de unión significativamente menor o insignificante para el anticuerpo IgM-A purificado.

En algunas realizaciones, la capacidad de unión de un medio desconocido para IgM-A o IgM-B se puede comparar con la capacidad de unión de un medio conocido del mismo tipo para IgM-A o IgM-B (p. ej., de un lote diferente) para determinar si incluye ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A o ligandos de antígenos del grupo sanguíneo B.

II. Ejemplo de medio de antígeno de grupo sanguíneo

Los métodos descritos en la presente memoria son útiles para evaluar la calidad relativa de diferentes medios que se unen a los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo A o los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo B.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para evaluar cualquier medio comercialmente disponible o medio que se esté desarrollando, que se sabe que se une a los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo A o los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo B. Además, los métodos descritos en la presente memoria también pueden usarse para diferenciar entre tipos de medios, en el caso de que se desconozca si los medios se unen al anticuerpo de los antígenos del grupo sanguíneo A o al anticuerpo de los antígenos del grupo sanguíneo B.

Los ejemplos de medios que actualmente pueden estar disponibles comercialmente o han estado disponibles comercialmente en un momento incluyen, p. ej., la columna A y la columna B de Glycosorn ABO ofrecidas por Glycorex Transplantation AB (Solvegatan 41, 223 70 Lund, Suecia); Sefarosa-4B-AFF201 con los trisacáridos del grupo sanguíneo A, Sefarosa-FF-AFF101 con los trisacáridos del grupo sanguíneo A, Sefarosa-4B-AFF202 con los trisacáridos del grupo sanguíneo B y Sefarosa-FF-AFF102 con los trisacáridos del grupo sanguíneo B, ofrecidos por Dextra Laboratories Ltd (Science and Technology Centre, Earley Gate, Whiteknights Road, Reading, RG66BZ, Reino Unido); los medios Synsorb A y B, ofrecidos por Chembiomed Ltd (Edmonton, Alberta, Canadá); y los medios Allotran A y B ofrecidos por Lectinity Holding, Inc. (Moscú, Rusia). En general, cualquier medio puede evaluarse usando los métodos descritos en la presente memoria, que incluyen un ligando (típicamente un ligando basado en oligosacáridos) correspondiente a un epítopo de antígeno del grupo sanguíneo A o antígeno del grupo sanguíneo B unido directa o indirectamente (a través de un conector o un espaciador) a un soporte sólido. También se pueden encontrar medios ejemplares en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 62/215.401, presentada el 8 de septiembre de 2015. Los ligandos basados en oligosacáridos ejemplares se muestran a continuación.

Las abreviaturas usadas en la estructura se definen de la siguiente manera: Gal = D-galactosa, Fuc = L-fucosa, GalNAc = N-acetil-D-galactosamina, GlcNAc = N-acetil-D-glucosamina, R = el enlace del ligando al soporte sólido, aunque también se pueden usar enlaces en otras posiciones de la estructura del ligando.

Los ejemplos de ligandos de antígenos del grupo sanguíneo A incluyen, pero no están limitados a, moléculas que tienen las siguientes estructuras: antígeno trisacárido A (GalNAca1,3[Fuca1,2]Galp-R), antígeno tetrasacárido A Tipo 1 (GalNAca1,3[Fuca1,2]Galp1,3GlcNAcp1-R), antígeno tetrasacárido A Tipo 2 (GalNAca1,3[Fuca1,2] Galp1,4GlcNAcp1-R), antígeno tetrasacárido A Tipo 3 (GalNAca1,3[Fuca1,2]Galp1,3GalNAca1-R), y antígeno tetrasacárido A Tipo 4 (GalNAca1,3[Fuca1,2]Galp1,3GalNAcp1-R).

Los ejemplos de ligandos de antígenos del grupo sanguíneo tipo B incluyen moléculas que tienen las siguientes estructuras: antígeno trisacárido B (Gala1,3[Fuca1,2]Galp-R), antígeno tetrasacárido B Tipo 1 (Gala1,3[Fuca1,2]Galp1,3GlcNAcp1-R), antígeno tetrasacárido B Tipo 2 (Gala1,3[Fuca1,2]Galp1,4GlcNAcp1-R), antígeno tetrasacárido B Tipo 3 (Gala1,3[Fuca1,2]Galp1,3GalNAca1-R), y antígeno tetrasacárido B Tipo 4 (Gala1,3[Fuca1,2]Galp1,3GalNAcp1-R).

Uno o más de los ligandos mencionados anteriormente pueden unirse a un soporte sólido, dando como resultado de esta manera un medio de cromatografía que es adecuado para eliminar los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo A y/o del grupo sanguíneo B.

Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no están limitados a, alúmina, sílice, celita, cerámica, óxidos metálicos, vidrio poroso, vidrio de poro controlado, polímeros de carbohidratos, polisacáridos, agarosa, sefarosa, sefadex, dextrano, celulosa, almidón, quitina, zeolitas, polímeros sintéticos, polivinil éter, polietileno, polipropileno, poliestireno, nailon, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilamidas, poli(anhídrido maleico), membranas, fibras huecas y fibras. En algunas realizaciones, el soporte sólido es un soporte sólido polimérico y comprende un polímero seleccionado del grupo que consiste en poliviniléter, polivinilalcohol, polimetacrilato, poliacrilato, poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilamida y policarbonato. En una realización particular, el soporte sólido es un soporte sólido basado en poliviniléter. En algunas realizaciones, el soporte sólido está en forma de lechos (p. ej., un lecho basado en poliviniléter).

Es posible emplear una gran cantidad de grupos funcionales para facilitar la unión de un ligando a un soporte sólido. Los ejemplos no limitantes de dichos grupos funcionales incluyen amina, tiol, furano, maleimida, epoxi, aldehído, alqueno, alquino, azida, azlactona, carboxilo, ésteres activados, triazina y cloruro de sulfonilo. En una realización particular, se usa un grupo amina como grupo funcional.

El soporte sólido también puede modificarse y/o activarse para incluir uno o más de los grupos funcionales mencionados anteriormente que facilitan la inmovilización de un ligando o ligandos adecuados al soporte. En una realización particular, se usan grupos carboxilo y aldehído como grupos funcionales.

III. Ensayo para medir la capacidad de unión

Los métodos descritos en la presente memoria son útiles para evaluar la calidad relativa de los medios (p. ej., durante o después de un proceso de fabricación o después del uso) que se unen o se espera que se unan a los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo A o los anticuerpos de los antígenos del grupo sanguíneo B en una muestra, p. ej., sangre, un producto sanguíneo, plasma, derivados del plasma o una alimentación IVIG. Los métodos descritos en la presente memoria se basan, al menos en parte, en la medición de la capacidad de unión de los medios para una molécula de anticuerpo IgM-A o IgM-B monoclonal purificada con el fin de evaluar la calidad relativa de los medios, ya sea a lo largo del tiempo o cuando se comparan dos lotes diferentes de un medio o medios de diferentes fuentes. Por consiguiente, los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para diferenciar entre los diferentes lotes del mismo tipo de medio o el mismo lote de medio durante su vida útil de uso o incluso medios de diferentes fuentes.

En general, la capacidad de unión de un medio para una molécula particular (p. ej., un anticuerpo IgM) se puede medir como sigue. Una muestra que contiene la molécula se pone en contacto con un medio adecuado en condiciones apropiadas y durante un período de tiempo adecuado para facilitar la unión de la molécula al medio. Posteriormente, la molécula que está unida al medio se separa de la disolución de muestra restante y se mide la concentración de la molécula en la disolución de muestra restante (es decir, la concentración de molécula sin unir). La concentración de la molécula en disolución se puede determinar mediante varios métodos diferentes conocidos en la técnica. Por ejemplo, la absorbancia de la disolución se puede medir a una longitud de onda particular y la concentración de la molécula se puede calcular en combinación con el coeficiente de extinción de la molécula (p. ej., una proteína) a esa longitud de onda. Se puede medir la absorbancia de fluorescencia, UV o Raman para determinar la concentración de proteína. Además, la concentración de la molécula en disolución también se puede determinar por cromatografía analítica. La intensidad de la detección se correlaciona entonces con la concentración de la molécula.

En las realizaciones descritas en la presente memoria, se mide la capacidad de unión de un medio de ligando de grupo sanguíneo tipo A o un medio de ligando de grupo sanguíneo tipo B para una IgM monoclonal purificada, que luego es indicativo de cómo puede funcionar ese medio para la eliminación real de anticuerpos anti-A o anti-B, según sea el caso.

Las realizaciones se ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Síntesis de medios de cromatografía que contienen ligando de trisacárido de antígeno del grupo sanguíneo A

Este es un método ejemplar que puede usarse para fabricar un medio de ligando de antígeno del grupo sanguíneo A. Los medios de cromatografía que contienen ligando de trisacárido de antígeno del grupo sanguíneo A (TriA) se sintetizaron inmovilizando ligandos TriA sobre lechos basados en polivinil éter patentados (es decir, el soporte sólido usado en la presente memoria). La estructura específica del ligando TriA se representa en la Figura 1. El ligando TriA, en este caso, también incluye un conector con un grupo amina, que se usa para la inmovilización en los lechos base. Los lechos se activan para incluir un grupo reactivo tal como, p. ej., un grupo epoxi, carboxilo o aldehído, que es capaz de reaccionar con un grupo amina en el ligando. El ligando TriA se inmoviliza entonces sobre los lechos mediante una reacción de acoplamiento con el grupo de amina primaria (-NH2).

Ejemplo 2. Síntesis de medios de cromatografía que contienen ligando de trisacárido de antígeno del grupo sanguíneo B

En otro experimento, se preparó un medio de ligando de antígeno del grupo sanguíneo B de la siguiente manera. Los medios de cromatografía que contienen ligando de trisacárido de antígeno del grupo sanguíneo B (TriB) se sintetizaron inmovilizando ligandos TriB sobre lechos basados en polivinil éter patentados (es decir, el soporte sólido usado en la presente memoria). La estructura específica del ligando TriB se representa en la Figura 2. El ligando TriB, en este caso, también incluye un conector con un grupo amina, que se usa para la inmovilización en los lechos. Como en el caso del ligando TriA anterior, los lechos se activan para incluir un grupo reactivo tal como, p. ej., un grupo epoxi, un carboxilo o un aldehído, que es capaz de reaccionar con un grupo amina en el ligando. El ligando TriB se inmoviliza entonces sobre los lechos base mediante una reacción de acoplamiento con el grupo de amina primaria (-NH2).

Ejemplo 3. Purificación de anticuerpo IgM-A monoclonal murino

En las realizaciones descritas en la presente memoria, se usa un anticuerpo IgM monoclonal purificado como una molécula modelo para evaluar la calidad de un medio de cromatografía que se une a anticuerpos anti-A o anti-B. Este ejemplo describe un proceso para purificar un anticuerpo IgM-A monoclonal; aunque también pueden usarse otros procesos o dichos anticuerpos pueden obtenerse comercialmente.

El anticuerpo IgM monoclonal murino del antígeno del grupo sanguíneo A (anti-A) se purificó a partir de una alimentación clarificada de cultivo celular disponible comercialmente que contenía la IgM anti-A producida a partir del clon BIRMA-1 (Vox Sang., 1991, 61: 53-58) que se dializó en tampón PBS 10 mM (número de producto: j H-1L-BK, EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La alimentación del cultivo celular anti-A se filtró a través de una membrana de 0,22 micrómetros y se sometió a cromatografía de unión/elución en un medio que tenía ligandos de antígenos trisacáridos del grupo sanguíneo A (TriA) unidos al mismo, como se describe en el Ejemplo 1.

Se empaquetó una columna de 10 mm de diámetro hasta 64 mm con el medio de ligando Tri-A. La columna se equilibró con tampón PBS 10 mM (10 volúmenes de columna (VC) a 305,58 cm/h, 4,0 mL/min) y posteriormente se cargó con la alimentación clarificada de cultivo celular que contenía anti-A en PBS 10 mM (40 VC, 229,18 cm/h, 3,0 mL/min). La columna se lavó con tampón PBS 10 mM (5 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min), seguido de cloruro sódico 0,5 M en tampón PBS 10 mM (10 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min). Después, el anticuerpo IgM anti-A se eluyó de la columna con glicina 0,1 M a pH 2,7 (9 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min). La columna se lavó posteriormente con tampón PBS 10 mM (10 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min) y se limpió con hidróxido de sodio 0,5 M (10 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min) antes de otras operaciones.

Se añadió 1 mL de Tris base 2,0 M a 45 ml de la IgM anti-A eluida para aumentar el pH de la disolución a 6-7. La elución se dializó posteriormente en PBS 10 mM usando tubos de diálisis (Kits de ensayo de diálisis RC estándar, Spectra/Por® 1-3, 3,5K MWCO, ancho plano de 54 mm, número de serie: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220, EE. UU.). Después de la diálisis en PBS 10 mM, se descubrió que la disolución resultante de IgM anti-A monoclonal tenía una concentración de aproximadamente 1,1 mg/mL basada en un coeficiente de extinción de 1,50 a 280 nm, según lo determinado en base a la composición de aminoácidos del anticuerpo IgM.

Ejemplo 4. Purificación del anticuerpo IgM-B monoclonal murino

El anticuerpo IgM monoclonal murino del antígeno del grupo sanguíneo B (anti-B) se purificó a partir de una alimentación clarificada de cultivo celular disponible comercialmente que contenía la IgM anti-B producida a partir del clon LB-2 que se dializó en tampón PBS 10 mM (número de producto: JM-1L-BK, EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La alimentación del cultivo celular anti-B se filtró a través de una membrana de 0,22 micrómetros y se sometió a cromatografía de unión/elución en un medio que tenía ligandos de antígenos trisacáridos del grupo sanguíneo B (TriB) unidos al mismo, como se describe en el Ejemplo 2.

Se empaquetó una columna de 10 mm de diámetro hasta 64 mm con el medio de ligando TriB. La columna se equilibró con tampón PBS 10 mM (10 VC a 305,58 cm/h, 4,0 mL/min) y posteriormente se cargó con la alimentación clarificada de cultivo celular que contenía el anti-B monoclonal en PBS 10 mM (40 VC, 229,18 cm/h, 3,0 mL/min). La columna se lavó con tampón PBS 10 mM (5 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min), seguido de cloruro sódico 0,5 M en tampón PBS 10 mM (10 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min). Después, el anticuerpo anti-B se eluyó de la columna con glicina 0,1 M a pH 2,7 (9 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min). La columna se lavó posteriormente con tampón PBS 10 mM (10 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min) y se limpió con hidróxido de sodio 0,5 M (10 VC, 305,58 cm/h, 4,0 mL/min) antes de otras operaciones.

Se añadió 1 ml de Tris base 2,0 M a 45 ml del anti-B eluído para aumentar el pH de la disolución a 6-7. La elución se dializó en PBS 10 mM usando tubos de diálisis (Kits de ensayo de diálisis RC estándar, Spectra/Por® 1-3, 3,5K MWCO, ancho plano de 54 mm, número de serie: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220, EE. UU.). Después de la diálisis en PBS 10 mM, la disolución resultante de la IgM anti-B monoclonal murina tenía una concentración de aproximadamente 1,3 mg/mL basada en un coeficiente de extinción de 1,44 a 280 nm, según lo determinado en base a la composición de aminoácidos de la proteína.

Ejemplo 5. Capacidad de unión de los medios de cromatografía de ligando de antígenos trisacáridos del grupo sanguíneo A para el anticuerpo IgM-A monoclonal murino purificado como una medida de la calidad de los medios

Este es un ejemplo representativo que demuestra que la capacidad de unión de un medio de ligando de antígenos trisacáridos del grupo sanguíneo A (TriA) para un anticuerpo IgM-A monoclonal purificado puede usarse para evaluar las variaciones en la calidad entre lotes de los medios de cromatografía, p. ej., durante y después de la fabricación.

La concentración de ligandos TriA se varió durante la reacción de acoplamiento con el soporte sólido, que en este caso fueron los lechos basados en polivinil éter. Se esperaba que los lechos base tuvieran diferentes cantidades de ligandos TriA, lo que simula el tipo de variación que se espera durante el proceso de fabricación de los medios.

La concentración del ligando usada fue del orden de: Medio TriA no. 1 < Medio TriA no. 2 < Medio TriA no. 3. Se predijo que la capacidad de IgM sería la menor para el Medio TriA no. 1, seguida por el Medio TriA no. 2, y la mayor para el Medio TriA no. 3.

En este experimento, se midió la capacidad de unión estática de los tres medios de cromatografía que contenían ligando TriA para la IgM anti-A. Este valor se comparó con el porcentaje de eliminación de anticuerpos IgG anti-A de una alimentación IVIG Gammanorm al 16,5% (165 mg/mL, 20 x 20 mL, número de producto: 00357340, Octapharma AG).

Se llenó un conjunto de tubos de microcentrífuga de 2,0 mL con 0,35 mL de tampón PBS 10 mM o 0,50 mL de tampón PBS 10 mM para los controles. Posteriormente, se añadieron 0,15 mL de una suspensión al 10 % de los medios (15 |jL de volumen de medios) en tampón PBS 10 mM a los tubos de microcentrífuga, excepto los controles, seguido de la adición de 1,0 mL de una disolución de 1,0 mL de anticuerpo IgM anti-A monoclonal en tampón PBS 10 mM. Los tubos se dejaron rotar durante 4 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, los tubos de microcentrífuga se sometieron a centrifugación y el sobrenadante resultante se transfirió a dispositivos de filtración centrífuga con una membrana de 0,22 micrómetros. Los dispositivos se sometieron a centrifugación y luego se midió la absorbancia del filtrado a 280 nm. La absorbancia de la disolución de cada muestra se usó entonces para calcular la capacidad de unión estática de los medios para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal. La capacidad de unión estática de IgM anti-A se calculó en base a un coeficiente de extinción de 1,50 a 280 nm, que se estimó en base a la composición de aminoácidos de la proteína.

En otro experimento, se determinó el nivel de anticuerpo IgG policlonal del antígeno del grupo sanguíneo A (anti-A) en una alimentación IVIG representativa mediante un método de citometría de flujo establecido (Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505). Los glóbulos rojos de tipo A se incubaron con la alimentación de IVIG representativa durante un tiempo predeterminado, seguido de lavados exhaustivos. Después, las células se tiñeron con anti-IgG humana marcada con fluorescencia (Alexa Fluor® 488 AffiniPure Fragmento F(ab')2 de Cabra Anti-IgG Humana (H+L), número de pieza: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.), y se sometieron a citometría de flujo (Guava 5HT, EMD Millipore). Se usaron valores netos de intensidad de fluorescencia media (MFI) para comparar las concentraciones de IgG anti-A policlonal en la alimentación antes y después del contacto con el medio de ligando de trisacárido antígeno del grupo sanguíneo A que se sintetiza en el Ejemplo 1.

La capacidad de unión estática del anticuerpo IgM anti-A monoclonal se comparó entonces con el porcentaje de eliminación de anticuerpos anti-A de una alimentación IVIG con los mismos medios en las mismas condiciones.

Como se resume en la Tabla 1 a continuación, este experimento demuestra que la variación entre lotes de la capacidad de unión estática de los diversos medios de ligando TriA para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal se correlaciona con la variación entre lotes del porcentaje de eliminación de IgG anti-A de una alimentación IVIG en condiciones de unión estática. Se descubrió que los medios de ligando TriA con mayor capacidad para IgM anti-A monoclonal, eliminaban más anticuerpos IgG anti-A de una alimentación IVIG. También se descubrió que los medios de ligando TriA con menor capacidad de unión estática para IgM anti-A monoclonal, eliminaban menos anticuerpos IgG anti-A de una alimentación IVIG.

Este resultado fue inesperado debido a las diferencias en el tipo y la fuente de las dos moléculas, es decir, la IgM es monoclonal, tiene una estructura pentamérica más grande y es de origen murino, mientras que la IgG eliminada de la alimentación IVIG es policlonal, tiene una estructura monomérica más pequeña, y es de origen humano. Sobre la base de este resultado, se puede concluir que la capacidad de unión estática de los medios del ligando TriA para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal se puede usar como un indicio para evaluar la variación en la calidad entre lotes de un medio que elimina o se espera que elimine un porcentaje de anticuerpos anti-A de una muestra, p. ej., durante y después de la fabricación de los medios.

Tabla 1. Las capacidades de unión estática de tres medios TriA diferentes para IgM anti-A monoclonal y el porcentaje de eliminación de IgG anti-A de una alimentación IVIG.

Ejemplo 6. Capacidad de unión de los medios de ligandos de antígenos trisacáridos del grupo sanguíneo B para el anticuerpo IgM-B monoclonal murino purificado como una medida de la calidad de los medios

Este es un ejemplo representativo que demuestra que la capacidad de unión de un medio de ligandos de antígenos trisacáridos del grupo sanguíneo B (TriB) para un anticuerpo IgM-B monoclonal murino purificado se puede usar para evaluar las variaciones en la calidad de los medios entre lotes, p. ej., durante y después de la fabricación.

La concentración de ligandos TriB se varió durante la reacción de acoplamiento con el soporte sólido, que en este caso eran lechos basados en polvinil éter. Por lo tanto, se esperaba que los lechos tuvieran diferentes cantidades de ligandos TriB, lo que simula el tipo de variación que se espera durante el proceso de fabricación de los medios.

La concentración del ligando usada fue del orden de: Medio TriB no. 1 < Medio TriB no. 2 < Medio TriB no. 3. Por lo tanto, se esperaba que la capacidad de IgM seria la menor para el Medio TriB no. 1, seguida del Medio TriB no. 2, y la mayor para el Medio TriB no. 3.

En este experimento, se midió la capacidad de unión estática de los diversos medios de ligando TriB para el anticuerpo anti-B y se comparó el valor con el porcentaje de anticuerpo IgG anti-B eliminado de una alimentación IVIG Gammanorm al 16,5% (165 mg/mL, 20 x 20 mL, número de producto: 00357340, Octapharma AG).

Se llenó un conjunto de tubos de microcentrífuga de 2,0 mL con 0,35 mL de tampón PBS 10 mM o 0,50 mL de tampón PBS 10 mM para los controles. Se añadieron 0,15 mL de una suspensión al 10 % de los lechos basados en polivinil éter (15 pL de volumen de medio) en tampón PBS 10 mM a los tubos de microcentrífuga, excepto los controles. Posteriormente, se añadió a todos los tubos 1,0 mL de una disolución de de 1 mg/mL de anticuerpo IgM anti-B monoclonal en tampón PBS 10 mM. Los tubos se dejaron rotar durante 4 horas a temperatura ambiente. Después, los tubos de microcentrífuga se sometieron a centrifugación y entonces el sobrenadante se transfirió a dispositivos de filtración centrífuga con una membrana de 0,22 micrómetros. Los dispositivos se sometieron a centrifugación y se midió la absorbancia del filtrado a 280 nm. La absorbancia de la disolución de cada muestra se usó para calcular la capacidad de unión estática de los medios para el anticuerpo IgM anti-B monoclonal.

La capacidad de unión estática de la IgM anti-B se calculó en base a un coeficiente de extinción de 1,44 a 280 nm, estimado en base a la composición de aminoácidos de la proteína. La capacidad de unión estática del anticuerpo IgM anti-B monoclonal se comparó posteriormente con el porcentaje de eliminación de los anticuerpos IgG anti-B de una alimentación IVIG en condiciones de unión estática.

El nivel de anticuerpo IgG policlonal del antígeno del grupo sanguíneo B (anti-B) en una alimentación IVIG representativa se determinó mediante un método de citometría de flujo establecido (Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505). Los glóbulos rojos de tipo B se incubaron con una alimentación de IVIG representativa durante un tiempo predeterminado, seguido de lavados exhaustivos. Después, las células se tiñeron con anti-IgG humana marcada con fluorescencia (Alexa Fluor® 488 AffiniPure Fragmento F(ab)2 de Cabra Anti-IgG Humana (H+L), número de pieza: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.), y se sometieron a citometría de flujo (Guava 5HT, EMD Millipore). Se usaron valores netos de intensidad de fluorescencia media (MFI) para comparar las concentraciones de IgG antiB policlonal en la alimentación antes y después del contacto con el medio de ligando de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo B que se sintetiza en el Ejemplo 2.

Como se resume en la Tabla 2 a continuación, este experimento demuestra que la variación entre lotes de la capacidad de unión estática de los diversos medios de ligando TriB para el anticuerpo monoclonal IgM anti-B se correlaciona con la variación entre lotes del porcentaje de eliminación de IgG anti-B de una alimentación IVIG en condiciones de unión estática. Se descubrió que los medios de ligando TriB con mayores capacidades para la IgM anti-B monoclonal eliminaron más anticuerpos IgG anti-B de una alimentación IVIG. También se descubrió que los medios de ligando TriB con capacidades de unión estáticas más bajas para IgM anti-B monoclonal eliminaron menos anticuerpos IgG antiB de una alimentación IVIG.

Estos datos demuestran el descubrimiento inesperado de que la capacidad de unión estática de los medios del ligando TriB para un anticuerpo IgM anti-B monoclonal purificado se puede usar para evaluar la variación entre lotes de la calidad de los medios, p. ej., antes y después de la fabricación.

Tabla 2. Capacidad de tres medios TriB diferentes para IgM anti-B monoclonal y el porcentaje de IgG anti-B eliminada de una alimentación IVIG.

Ejemplo 7. Capacidad de unión del medio de ligando de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo A para un anticuerpo IgM-A monoclonal murino purificado como una forma de monitorizar la calidad del medio después de la exposición a condiciones de limpieza cáusticas

Este es un ejemplo representativo que demuestra que la capacidad de los medios de ligandos de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo A (TriA) para un anticuerpo IgM-A monoclonal murino purificado es un método útil para monitorizar la calidad de los medios después de la exposición a condiciones de limpieza cáusticas severas.

Se hizo fluir una disolución de hidróxido de sodio 1,0 M a 0,5 mL/min sobre columnas empaquetadas de medio de ligando TriA (5,0 mL, 1,0 cm de diámetro y 6,4 cm de longitud) a las 0 horas, 50 horas o 150 horas. Después, el medio se neutralizó con PBS 10 mM hasta que el pH de la disolución que salía de la columna era aproximadamente pH 7. Después, se midió la capacidad de unión estática de los tres medios de ligando TriA para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal y se comparó con el porcentaje de eliminación de IgG anti-A de una alimentación de IVIG usando los mismos medios.

Se llenó un conjunto de tubos de microcentrífuga de 2,0 mL con 0,35 mL de tampón PBS 10 mM o 0,50 mL de tampón PBS 10 mM para los controles. Se añadieron 0,15 mL de una suspensión al 10 % de los medios (15 pL de volumen de medio) en tampón PBS 10 mM a los tubos de microcentrífuga, excepto los controles. Posteriormente, se añadió a cada uno de los tubos 1,0 ml de una disolución de 1,0 mg/mL de anticuerpo IgM anti-A monoclonal en tampón PBS 10 mM. Los tubos se dejaron rotar durante 4 horas a temperatura ambiente. Los tubos de microcentrífuga se sometieron a centrifugación y el sobrenadante resultante se transfirió a dispositivos de filtración centrífuga con una membrana de 0,22 micrómetros. Los dispositivos se sometieron a centrifugación y se midió la absorbancia del filtrado a 280 nm. La absorbancia de la disolución de cada muestra se usó entonces para calcular la capacidad de unión estática de los medios para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal.

La capacidad de unión estática de IgM anti-A se calculó en base a un coeficiente de extinción de 1,50 a 280 nm, estimado en base a la composición de aminoácidos de la proteína. La capacidad de unión estática del anticuerpo IgM anti-A monoclonal se comparó entonces con el porcentaje de anticuerpos IgG anti-A eliminados de una alimentación IVIG en condiciones de unión estática usando los mismos medios.

La concentración de anticuerpos IgG policlonales de antígeno del grupo sanguíneo A en una alimentación IVIG representativa se determinó usando un método de citometría de flujo establecido (Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505). Los glóbulos rojos tipo A se incubaron con concentrados de IgG durante un tiempo predeterminado, seguido de lavados exhaustivos. Las células se tiñeron entonces con anti-IgG humanas marcadas con fluorescencia (Alexa Fluor® 488 AffiniPure Fragmento F(ab')2 de Cabra Anti-IgG Humana (H+L), número de pieza: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.), y se sometieron a citometría de flujo (Guava 5HT, EMD Millipore). Los valores netos de intensidad de fluorescencia media (MFI) se usaron para comparar las concentraciones de IgG anti-A en muestras antes y después del contacto con el medio de ligando de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo A.

Como se resume en la Tabla 3 a continuación, este experimento demuestra que las diferencias relativas en la capacidad de unión estática de los diversos medios de ligando TriA para IgM anti-A monoclonal se correlaciona con las diferencias relativas en el porcentaje de eliminación de IgG anti-A de una alimentación IVIG. Se observó que cuanto más tiempo estuvo expuesto el medio de ligando TriA a las condiciones de limpieza cáustica, se encontró que menor era su capacidad de unión estática para IgM anti-A monoclonal y se eliminó menos anticuerpo IgG anti-A de una alimentación IVIG.

Por consiguiente, la capacidad de unión estática de los medios de ligando TriA para la IgM anti-A monoclonal se puede usar para monitorizar la calidad de este tipo de medios después de la exposición a condiciones cáusticas.

Tabla 3. Capacidad de un medio de ligando TriA para IgM anti-A monoclonal y el porcentaje de eliminación de IgG anti-A de una alimentación IVIG después de la exposición a hidróxido de sodio 1,0 M durante varios períodos de tiempo.

Ejemplo 8. Capacidad de unión del medio de ligando de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo B para un anticuerpo IgM-B monoclonal murino purificado como una forma de monitorizar la calidad del medio después de la exposición a condiciones de limpieza cáusticas.

Este es un ejemplo representativo que demuestra que la capacidad del medio de ligando de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo B (TriB) para un anticuerpo IgM-B monoclonal murino purificado es un método útil para monitorizar la calidad del medio después de la exposición a condiciones de limpieza cáusticas severas.

Se hizo fluir una disolución de hidróxido de sodio 1,0 M a 0,5 mL/min sobre columnas empaquetadas de medio de ligando TriB (5,0 mL, 1,0 cm de diámetro y 6,4 cm de longitud) a las 0 horas, 50 horas o 150 horas. El medio se neutralizó entonces haciendo fluir PBS 10 mM a través de la columna hasta que el pH de la disolución que salía de la columna era aproximadamente pH 7. Después, se midió la capacidad de unión estática de los tres medios de ligando TriB para la IgM anti-B monoclonal y se comparó con el porcentaje de eliminación de IgG anti-B de una alimentación IVIG usando los mismos medios.

Se llenó un conjunto de tubos de microcentrífuga de 2,0 mL con 0,35 mL de tampón PBS 50 mM o 0,50 mL de tampón PBS 10 mM para los controles. Se añadieron 0,15 mL de una suspensión al 10 % de los medios (15 pL de volumen de medios) en tampón PBS 10 mM a los tubos de microcentrífuga, excepto los controles. Posteriormente, se añadió a cada uno de los tubos 1,0 mL de una disolución de 1,0 mg/mL de anticuerpo IgM anti-B monoclonal en tampón PBS 10 mM. Los tubos se dejaron rotar durante 4 horas a temperatura ambiente. Después, los tubos de microcentrífuga se sometieron a centrifugación y el sobrenadante resultante se transfirió a dispositivos de filtración centrífuga con una membrana de 0,22 micrómetros. Los dispositivos se sometieron a centrifugación y después se midió la absorbancia del filtrado a 280 nm. La absorbancia de la disolución de cada muestra se usó entonces para calcular la capacidad de unión estática de los medios para el anticuerpo IgM anti-B monoclonal. La capacidad de unión estática de IgM anti-B se calculó en base a un coeficiente de extinción de 1,44 a 280 nm, estimado en base a la composición de aminoácidos de la proteína. La capacidad de unión estática del anticuerpo IgM anti-B monoclonal se comparó entonces con el porcentaje de eliminación del anticuerpo IgG anti-B de una alimentación IVIG.

La concentración de anticuerpos IgG policlonales de antígeno del grupo sanguíneo B en una alimentación IVIG representativa se determinó usando un método de citometría de flujo establecido (Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505). Los glóbulos rojos de tipo B se incubaron con concentrados de IgG durante un tiempo predeterminado, seguido de lavados exhaustivos. Después, las células se tiñeron con anti-IgG humana marcada con fluorescencia (Alexa Fluor® 488 AffiniPure Fragmento F(ab')2 de Cabra Anti-IgG Humana (H+L), número de parte: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.), y se sometieron a citometría de flujo (Guava 5HT, EMD Millipore). Los valores netos de intensidad de fluorescencia media (MFI) se usaron para comparar las concentraciones de IgG anti-A policlonal en muestras antes y después del contacto con el medio de ligando de trisacárido antígeno del grupo sanguíneo A.

Como se resume en la Tabla 4 a continuación, este experimento demuestra que las diferencias relativas en la capacidad de unión estática de los diversos medios de ligando TriB para el anticuerpo IgM anti-B monoclonal purificado se correlaciona con las diferencias relativas en el porcentaje de eliminación de IgG anti-B de una alimentación IVIG. Se descubrió que la duración de tiempo que el medio ligando TriB estuvo expuesto a las condiciones de limpieza cáustica no influyó en gran medida en su capacidad de unión estática para la IgM anti-B monoclonal o la cantidad de anticuerpos IgG anti-B que se eliminaron de una alimentación IVIG bajo condiciones de unión estática. Los datos indican el resultado inesperado de que la capacidad de unión estática de los medios de ligando TriB para IgM anti-B monoclonal se puede usar para monitorizar la calidad de este tipo de medios.

Tabla 4. Capacidad de los medios del ligando TriB para la IgM anti-B monoclonal y el porcentaje de IgG anti-B eliminada de una alimentación IVIG después de la exposición a hidróxido de sodio 1,0 M durante varios períodos de tiempo.

Ejemplo 9. Distinción entre los medios del ligando de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo A y del grupo sanguíneo B midiendo sus capacidades de unión estática para anticuerpos IgM-A e IgM-B monoclonales murinos purificados, respectivamente

Este es un ejemplo representativo que demuestra que las capacidades de unión estática relativa de los medios de ligandos de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo A (TriA) y los medios de ligandos de antígeno trisacárido del grupo sanguíneo B (TriB) para los anticuerpos IgM-A e IgM-B monoclonales murinos, respectivamente, pueden usarse para diferenciar entre los dos tipos de medios.

La capacidad de diferenciar fácilmente entre los dos tipos de medios es útil, ya que los dos medios típicamente se usan juntos para la eliminación de anticuerpos anti-A y anti-B de los productos sanguíneos y plasma y se pueden mezclar fácilmente. La diferenciación se demostró midiendo la capacidad de unión estática de un medio de ligando TriA y un medio de ligando TriB tanto para IgM anti-A monoclonal como para IgM anti-B monoclonal.

Se llenó un conjunto de tubos de microcentrífuga de 2,0 mL con 0,35 mL de tampón PBS 50 mM o 0,50 ml de tampón PBS 50 mM para los controles. Se añadieron 0,15 mL de una suspensión al 10 % de los medios (15 pL de volumen de medios) en tampón PBS 50 mM a los tubos de microcentrífuga, excepto los controles. Posteriormente, se añadió a cada uno de los tubos 1,0 mL de una disolución de 1,0 mg/mL de anticuerpo IgM anti-A monoclonal en tampón PBS 50 mM o 1,0 mL de una disolución de 1,0 mg/mL de anticuerpo IgM antiB monoclonal en tampón PBS 50 mM. Los tubos se dejaron rotar durante 4 horas a temperatura ambiente. Después, los tubos de microcentrífuga se sometieron a centrifugación y el sobrenadante resultante se transfirió a dispositivos de filtración centrífuga con una membrana de 0,22 micrómetros. Los dispositivos se sometieron a centrifugación y después se midió la absorbancia del filtrado a 280 nm. La absorbancia de la disolución de cada muestra a 280 nm se usó para calcular la capacidad de unión estática de los medios para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal y el anticuerpo IgM anti-B monoclonal. Las capacidades de unión estática e IgM anti-A se calcularon en base a un coeficiente de extinción de 1,50 a 280 nm, estimado en base a la composición de aminoácidos de la proteína. La capacidad de unión estática de IgM anti-B se calculó en base a un coeficiente de extinción de 1,44 a 280 nm, estimado en base a la composición de aminoácidos de la proteína.

Como se resume en la Tabla 5 a continuación, este experimento demuestra que la identidad de los medios capaces de unirse a los anticuerpos anti-A o capaces de unirse a los anticuerpos anti-B puede diferenciarse midiendo su capacidad de unión tanto para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal como para el anticuerpo IgM anti-B monoclonal.

Se observó que los medios de ligando TriA tenían una capacidad de unión significativa para el anticuerpo IgM anti-A monoclonal mientras que tenían una capacidad de unión muy baja para el anticuerpo IgM anti-B monoclonal. Por el contrario, se observó que los medios de ligando TriB tenían una capacidad de unión significativa para el anticuerpo IgM anti-B monoclonal, mientras que tenían una capacidad de unión muy baja para la IgM anti-A monoclonal. De esta manera, los medios de ligando de antígeno A y los medios de ligando de antígeno B se pueden distinguir fácilmente, especialmente en casos, cuando se desconoce la identidad de dichas muestras de medios.

Tabla 5. Capacidad de los medios de ligando TriA y los medios de ligando TriB tanto para IgM anti-A monoclonal como para IgM anti-B monoclonal.

Ejemplo 10. Generación y evaluación de la calidad relativa de una mezcla de medios basada en las capacidades de unión para anticuerpos IgM-A o IgM-B monoclonales purificados

Como se observa en la presente memoria, la capacidad de unión relativa de un medio de antígeno del grupo sanguíneo A o un medio de antígeno del grupo sanguíneo B a anticuerpos IgM-A o IgM-B monoclonales purificados es un buen indicio para evaluar o predecir cómo dichos medios pueden funcionar realmente para la eliminación de anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo A o anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo B de una muestra (p. ej., sangre, producto sanguíneo, plasma o IVIG).

La capacidad de unión relativa de un medio de antígeno del grupo sanguíneo A para IgM-A monoclonal purificada y la capacidad de unión relativa de un medio de antígeno del grupo sanguíneo B para anticuerpos IgM-B podría usarse para generar una mezcla de ambos medios en la proporción correcta. que luego puede usarse para eliminar tanto los anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo A como los anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo B de una muestra en una etapa de cromatografía.

Esto es particularmente útil ya que, en general, las cantidades de anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo A y anticuerpos de antígenos del grupo sanguíneo B tienden a variar de una muestra a otra. Por lo tanto, una mezcla de medios que puede funcionar bien para la eliminación de dichos anticuerpos de una muestra puede no funcionar tan bien en el caso de otra muestra.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse para diseñar una mezcla de medios que funcionaría bien para una muestra, simplemente conociendo las cantidades de anticuerpos anti-A y anti-B en esa muestra.

Por ejemplo, dado que la capacidad de unión de un medio para el anticuerpo IgM monoclonal purificado se correlaciona con el porcentaje de eliminación de anticuerpos anti-A o anti-B de una muestra, una vez que se sabe el nivel o la cantidad de anticuerpos anti-A y anti-B en una muestra, se puede diseñar una mezcla de medios o medios, de modo que tenga una relación de los medios de antígeno del grupo sanguíneo A y un medio de antígeno del grupo sanguíneo B, que sería adecuada para eliminar una cantidad deseada de anticuerpos anti-A y/o anti-B de la muestra, en función de la capacidad de unión de las moléculas de IgM respectivas.

Los métodos descritos en la presente memoria también pueden usarse para determinar la calidad relativa de una mezcla de medios compuesta por medios que tienen ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A y medios que tienen ligandos de antígeno del grupo sanguíneo B.

Las diversas realizaciones descritas de la invención pueden usarse junto con una o más realizaciones diferentes a menos que sea técnicamente incompatible.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para comparar la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad que contienen ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A unidos a un soporte sólido, comprendiendo el método las etapas de:

(a) para cada una de las muestras de medios, proporcionar una disolución de anticuerpo IgM-A monoclonal purificado de concentración conocida C1 y volumen VM y una muestra de medio de cromatografía de afinidad de volumen VR;

(b) incubar cada muestra de medio de cromatografía con la disolución de (a);

(c) obtener un sobrenadante y medir la concentración C2 del anticuerpo IgM-A en el sobrenadante, para cada muestra de medio de cromatografía;

(d) determinar la capacidad de unión estática de cada muestra de medio de cromatografía para el anticuerpo IgM-A, en donde la capacidad de unión estática se mide usando la ecuación

[C1-C2]xVM

VR

en donde las capacidades de unión estática de las muestras de medios se correlacionan con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-A de una muestra, proporcionando así una comparación de la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad diferentes.

2. Método para comparar la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad que contienen ligandos de antígeno del grupo sanguíneo B unidos a un soporte sólido, comprendiendo el método las etapas de:

(a) para cada una de las muestras de medios, proporcionar una disolución de anticuerpo IgM-B monoclonal purificado de concentración conocida C1 y volumen VM y una muestra de medio de cromatografía de afinidad de volumen VR;

(b) incubar cada muestra de medio de cromatografía con la disolución de (a);

(c) obtener un sobrenadante y medir la concentración C2 del anticuerpo IgM-B en el sobrenadante, para cada muestra de medio de cromatografía;

(d) determinar la capacidad de unión estática de cada muestra de medio de cromatografía para el anticuerpo IgM-B, en donde la capacidad de unión estática se mide usando la ecuación

[C1-C2] xVM

VR

en donde las capacidades de unión estática de las muestras de medios se correlacionan con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-B de una muestra, proporcionando así una comparación de la calidad de dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad.

3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el soporte sólido es un soporte sólido polimérico poroso o no poroso que comprende un polímero seleccionado del grupo que consiste en poliviniléter, polivinilalcohol, polimetacrilato, poliacrilato, poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilamida y policarbonato.

4. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el soporte sólido es un soporte sólido poroso basado en poliviniléter.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el soporte sólido está en forma de lechos.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las dos o más muestras de medios de cromatografía de afinidad constituyen lotes diferentes de los mismos medios.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las diferentes muestras de medios de cromatografía de afinidad constituyen los mismos medios en diferentes estadios de uso.

8. El método según la reivindicación 1 y las reivindicaciones dependientes de la misma, en donde la capacidad de unión del medio ligando de antígeno del grupo sanguíneo A para el anticuerpo IgM-A monoclonal se correlaciona con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-A de una muestra.

9. El método según la reivindicación 2 o las reivindicaciones dependientes de la misma, en donde la capacidad de unión de los medios de ligando de antígeno del grupo sanguíneo B para el anticuerpo IgM-B monoclonal se correlaciona con su capacidad para eliminar anticuerpos anti-B de una muestra.

10. El método según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, productos sanguíneos, plasma, derivados de plasma y alimentación de inmunoglobulina intravenosa (IVIG).

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la medición de la concentración comprende determinar la absorbancia a 280 nm.

12. Un método para evaluar la calidad de un medio después de la exposición a condiciones ácidas o alcalinas, en donde el método comprende las etapas de:

(a) proporcionar un medio de cromatografía que tiene ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A o ligandos de antígeno del grupo sanguíneo B unidos a un soporte sólido;

(b) medir la capacidad de unión de los medios para un anticuerpo IgM-A purificado en el caso del anticuerpo de antígeno del grupo sanguíneo A o para un anticuerpo IgM-B purificado en el caso del anticuerpo de antígeno del grupo sanguíneo B;

(c) exponer los medios a condiciones ácidas o alcalinas durante al menos 5 horas; y

(d) medir la capacidad de unión de los medios para un anticuerpo IgM-A purificado en el caso del anticuerpo de antígeno del grupo sanguíneo A o para un anticuerpo IgM-B purificado en el caso del anticuerpo de antígeno del grupo sanguíneo B;

en donde una reducción en la capacidad de unión de los medios en (d) con respecto a (b) indica que la calidad de los medios ha disminuido después de la exposición a condiciones ácidas o alcalinas.

13. El método según la reivindicación 12, en donde una disminución en la calidad de los medios comprende una reducción en la capacidad de los medios para eliminar los anticuerpos anti-A o anti-B.

14. Método para determinar si un medio comprende ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A o ligandos de antígeno del grupo sanguíneo B, en donde el método comprende las etapas de:

(a) proporcionar un medio, en donde se desconoce si el medio comprende ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A o ligandos de antígeno del grupo sanguíneo B;

(b) medir la capacidad de unión de los medios desconocidos para el anticuerpo IgM-A monoclonal purificado y por separado para el anticuerpo IgM-B monoclonal purificado; y

(c) comparar la capacidad de los medios desconocidos para el anticuerpo IgM-A monoclonal purificado y el anticuerpo IgM-B monoclonal purificado;

en donde se determina que los medios desconocidos comprenden ligandos de antígeno del grupo sanguíneo A, si tienen una mayor capacidad de unión para el anticuerpo IgM-A monoclonal en relación con la capacidad de unión para el anticuerpo IgM-B monoclonal, y se determina que los medios desconocidos comprenden ligandos de antígeno del grupo sanguíneo B si tienen una mayor capacidad de unión para el anticuerpo IgM-B monoclonal en relación con la capacidad de unión para el anticuerpo IgM-A monoclonal.