JPH07242698A - 好中球遊走に必須な細胞膜抗原蛋白質 - Google Patents
好中球遊走に必須な細胞膜抗原蛋白質Info
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- JPH07242698A JPH07242698A JP5666294A JP5666294A JPH07242698A JP H07242698 A JPH07242698 A JP H07242698A JP 5666294 A JP5666294 A JP 5666294A JP 5666294 A JP5666294 A JP 5666294A JP H07242698 A JPH07242698 A JP H07242698A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 好中球遊走に必須な細胞膜抗原蛋白質を提供
する。 【構成】 ヒト好中球の遊走を阻害する機能を有するモ
ノクローナル抗体の対応抗原であってＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分子量約１５０ＫＤａ、等電点約４．０の理化学的性
質を有する好中球膜蛋白質。 【効果】 同対応抗原分子の構造を解明し、抗体の認識
部位を同定することによって、新たな抗炎症剤の標的と
なるペプチドのシークエンスを明らかにすることができ
る。また、同対応抗原分子は、好中球の関与する病態
（自己免疫疾患、腎炎、心筋梗塞、ＡＲＤＳ等）を治療
する薬物の分子標的となり得るものであり、また好中球
の遊走を阻止する抗体をヒト型に変換し、治療薬として
用いることを可能にする。この対応抗原の分子レベルの
解析を通してリガンド依存性の好中球遊走というダイナ
ミックな現象に深い洞察を与えることができる。
する。 【構成】 ヒト好中球の遊走を阻害する機能を有するモ
ノクローナル抗体の対応抗原であってＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分子量約１５０ＫＤａ、等電点約４．０の理化学的性
質を有する好中球膜蛋白質。 【効果】 同対応抗原分子の構造を解明し、抗体の認識
部位を同定することによって、新たな抗炎症剤の標的と
なるペプチドのシークエンスを明らかにすることができ
る。また、同対応抗原分子は、好中球の関与する病態
（自己免疫疾患、腎炎、心筋梗塞、ＡＲＤＳ等）を治療
する薬物の分子標的となり得るものであり、また好中球
の遊走を阻止する抗体をヒト型に変換し、治療薬として
用いることを可能にする。この対応抗原の分子レベルの
解析を通してリガンド依存性の好中球遊走というダイナ
ミックな現象に深い洞察を与えることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト好中球（neutroph
il）の遊走（chemotaxis) を強く抑制する機能を有する
モノクローナル抗体の対応抗原である新規好中球膜蛋白
質に関するものであり、更には、ヒト好中球の遊走を阻
害する機能を有するＴＭ３１６抗体が特異的に反応する
抗原であって当該好中球が関与する自己免疫疾患、腎
炎、心筋梗塞、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）等の病
態を治療する薬剤の分子標的となり得るヒト好中球細胞
膜に局在する好中球遊走に必須な細胞膜表面機能分子の
高度精製膜蛋白質に関するものである。
il）の遊走（chemotaxis) を強く抑制する機能を有する
モノクローナル抗体の対応抗原である新規好中球膜蛋白
質に関するものであり、更には、ヒト好中球の遊走を阻
害する機能を有するＴＭ３１６抗体が特異的に反応する
抗原であって当該好中球が関与する自己免疫疾患、腎
炎、心筋梗塞、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）等の病
態を治療する薬剤の分子標的となり得るヒト好中球細胞
膜に局在する好中球遊走に必須な細胞膜表面機能分子の
高度精製膜蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に、ヒト顆粒球（glanulocyte ）の
一種の好中球は、種々の炎症性疾患の際に疾患局所から
放出される可溶性遊走因子に反応して活性化し、炎症部
位へ遊走して、ファゴサイト−シス（食作用）ならびに
活性酸素、蛋白分解酵素及びサイトカイン等の遊離によ
り組織破壊をきたす働きを有することが知られている。
従って、当該好中球遊走の分子機構を解明し、炎症性疾
患における当該好中球遊走を分子レベルで理解すること
は、好中球が関与する炎症性疾患に対する特異的な抗炎
症剤を理論的に設計する上において不可欠な要件であ
り、また、好中球の遊走抑制を作用機序とする治療薬剤
の新たな標的分子を同定することにおいても重要である
と云える。
一種の好中球は、種々の炎症性疾患の際に疾患局所から
放出される可溶性遊走因子に反応して活性化し、炎症部
位へ遊走して、ファゴサイト−シス（食作用）ならびに
活性酸素、蛋白分解酵素及びサイトカイン等の遊離によ
り組織破壊をきたす働きを有することが知られている。
従って、当該好中球遊走の分子機構を解明し、炎症性疾
患における当該好中球遊走を分子レベルで理解すること
は、好中球が関与する炎症性疾患に対する特異的な抗炎
症剤を理論的に設計する上において不可欠な要件であ
り、また、好中球の遊走抑制を作用機序とする治療薬剤
の新たな標的分子を同定することにおいても重要である
と云える。
【０００３】従来においても、好中球の細胞膜上に発現
する機能的な膜蛋白質として、例えば、Ｆｃガンマレセ
プター（Feit, H.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA79, 3275, 1982）、補体成分３ｂ（Ｃ３ｂ）レセプ
ター（Gerdes, G. et al., Immunology 45, 645, 1982
）、白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）（Sanchez
-Madrid, F. et at., J. Exp. Med. 158, 1785, 1983
）、Ｃ３ｂｉレセプター（Beller, D.I. et al ., J.
Exp. Med. 156, 1000, 1982）、ｐ１５０／９５（Sanch
ez-Madrid, F. et al., J. Exp. Med. 158, 1785, 1983
）、ＣＤ１１ｂ（Corbi, A.L. et al., J. Biol. Che
m. 263, 12403, 1988 、 Sanchez-Madrid, F. et al.,
J. Exp. Med. 158, 1785, 1983）等が知られている。
する機能的な膜蛋白質として、例えば、Ｆｃガンマレセ
プター（Feit, H.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA79, 3275, 1982）、補体成分３ｂ（Ｃ３ｂ）レセプ
ター（Gerdes, G. et al., Immunology 45, 645, 1982
）、白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）（Sanchez
-Madrid, F. et at., J. Exp. Med. 158, 1785, 1983
）、Ｃ３ｂｉレセプター（Beller, D.I. et al ., J.
Exp. Med. 156, 1000, 1982）、ｐ１５０／９５（Sanch
ez-Madrid, F. et al., J. Exp. Med. 158, 1785, 1983
）、ＣＤ１１ｂ（Corbi, A.L. et al., J. Biol. Che
m. 263, 12403, 1988 、 Sanchez-Madrid, F. et al.,
J. Exp. Med. 158, 1785, 1983）等が知られている。
【０００４】また、これらの好中球上の膜蛋白質と結合
するモノクローナル抗体についても研究されている（Br
eard, J. et al., J. Immunol. 124, 1943, 1980、 Kle
banoff, S. J. et al., J. Immunol. 134, 153, 1985、
Lebin T. W. et al., J. Immunol. 130, 1833, 1983、
Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exp. Med. 158, 178
5, 1983、 Todd, R. F. et al., Hybridoma 1, 329, 19
82 ）。更には、好中球に結合して、その遊走活性を阻
害するモノクローナル抗体ＮＣＤ１（Thomas, G.et a
l., J. Immunol. 127, 1355, 1981）やＮＣＤ３（Thoma
s, G. et al., J.Immunol. 127, 2241, 1981）等も報告
されているが、これらのうちの多くのモノクローナル抗
体に関しては研究は十分に進んでいないのが現状であ
る。従って、この細胞表面分子の構造を明らかにするこ
とは、多くの炎症、及び好中球の関与する病態における
全く新しい抗炎症療法又は免疫増強療法等の基礎を確立
する上できわめて重要な課題であると云える。
するモノクローナル抗体についても研究されている（Br
eard, J. et al., J. Immunol. 124, 1943, 1980、 Kle
banoff, S. J. et al., J. Immunol. 134, 153, 1985、
Lebin T. W. et al., J. Immunol. 130, 1833, 1983、
Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exp. Med. 158, 178
5, 1983、 Todd, R. F. et al., Hybridoma 1, 329, 19
82 ）。更には、好中球に結合して、その遊走活性を阻
害するモノクローナル抗体ＮＣＤ１（Thomas, G.et a
l., J. Immunol. 127, 1355, 1981）やＮＣＤ３（Thoma
s, G. et al., J.Immunol. 127, 2241, 1981）等も報告
されているが、これらのうちの多くのモノクローナル抗
体に関しては研究は十分に進んでいないのが現状であ
る。従って、この細胞表面分子の構造を明らかにするこ
とは、多くの炎症、及び好中球の関与する病態における
全く新しい抗炎症療法又は免疫増強療法等の基礎を確立
する上できわめて重要な課題であると云える。
【０００５】本発明者らは、これまでの好中球遊走に関
する一連の研究の過程の中で、補体成分５ａ（Ｃ５
ａ），Ｎ−フォルミル−メチオニル−ロイシル−フェニ
ルアラニン（ＦＭＬＰ），培養リンパ球上清、細菌菌成
体等の種々の遊走因子(chemotactic factor)によるヒト
好中球の遊走を濃度依存的に強く抑制(inhibition)する
モノクローナル抗体であるＴＭ３１６を作成している
（Shimizu A. et al., Scand. J. Immunol. 28, 675-68
5, 1988 ）。同抗体は、これらの遊走因子刺激による好
中球細胞内におけるカルシウム濃度上昇、活性酸素産
生、リソゾーム顆粒放出は抑制せず、好中球の遊走のみ
を特異的に抑制する機能を有する。すなわち、同抗体
は、遊走因子による受容体刺激−好中球遊走と云う一連
の情報伝達機構の後期（Effector側）に働く細胞表面分
子の、遊走活性に必須な機能ドメイン(domain)に結合
し、その機能を抑制することによって種々の遊走因子に
よる好中球遊走反応(Neutrophil chemotactic reactio
n) を抑制する機能を有するものと考えられる。また、
同抗体の対応抗原は、好中球の活性化に伴い細胞内から
細胞膜に展開する動的分子であり、例えば、慢性関節リ
ウマチの炎症関節内では細胞膜上の発現が著しく亢進し
ていると云った現象が見られる。
する一連の研究の過程の中で、補体成分５ａ（Ｃ５
ａ），Ｎ−フォルミル−メチオニル−ロイシル−フェニ
ルアラニン（ＦＭＬＰ），培養リンパ球上清、細菌菌成
体等の種々の遊走因子(chemotactic factor)によるヒト
好中球の遊走を濃度依存的に強く抑制(inhibition)する
モノクローナル抗体であるＴＭ３１６を作成している
（Shimizu A. et al., Scand. J. Immunol. 28, 675-68
5, 1988 ）。同抗体は、これらの遊走因子刺激による好
中球細胞内におけるカルシウム濃度上昇、活性酸素産
生、リソゾーム顆粒放出は抑制せず、好中球の遊走のみ
を特異的に抑制する機能を有する。すなわち、同抗体
は、遊走因子による受容体刺激−好中球遊走と云う一連
の情報伝達機構の後期（Effector側）に働く細胞表面分
子の、遊走活性に必須な機能ドメイン(domain)に結合
し、その機能を抑制することによって種々の遊走因子に
よる好中球遊走反応(Neutrophil chemotactic reactio
n) を抑制する機能を有するものと考えられる。また、
同抗体の対応抗原は、好中球の活性化に伴い細胞内から
細胞膜に展開する動的分子であり、例えば、慢性関節リ
ウマチの炎症関節内では細胞膜上の発現が著しく亢進し
ていると云った現象が見られる。
【０００６】このように、好中球遊走に必須な細胞膜表
面機能分子であって、好中球の細胞表面に存在する同抗
原分子の実体を解明し、上記遊走を阻害する機能を有す
る抗体の認識部位を同定すると共に、更には、新たな抗
炎症剤の標的となる対応抗原分子のペプチドのシークエ
ンスを明らかにすることはきわめて重要なことであり、
これまで、その解明が強く要請されている状況にあっ
た。
面機能分子であって、好中球の細胞表面に存在する同抗
原分子の実体を解明し、上記遊走を阻害する機能を有す
る抗体の認識部位を同定すると共に、更には、新たな抗
炎症剤の標的となる対応抗原分子のペプチドのシークエ
ンスを明らかにすることはきわめて重要なことであり、
これまで、その解明が強く要請されている状況にあっ
た。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このような状況を踏ま
え、本発明者らは、同抗原分子の生化学的及び理化学的
な性質を明らかにし、この分子を精製し、その実体を解
明することを目標として鋭意検討を積み重ねた結果、ヒ
ト好中球の遊走を阻害する機能を有するモノクローナル
抗体と特異的に反応する同抗体対応抗原の好中球膜蛋白
質を高度に精製することに成功すると共に、当該蛋白質
が従来知られている好中球膜蛋白質とは異なる新しい蛋
白質であることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
え、本発明者らは、同抗原分子の生化学的及び理化学的
な性質を明らかにし、この分子を精製し、その実体を解
明することを目標として鋭意検討を積み重ねた結果、ヒ
ト好中球の遊走を阻害する機能を有するモノクローナル
抗体と特異的に反応する同抗体対応抗原の好中球膜蛋白
質を高度に精製することに成功すると共に、当該蛋白質
が従来知られている好中球膜蛋白質とは異なる新しい蛋
白質であることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００８】本発明は、ヒト好中球の遊走を阻害する機
能を有するモノクローナル抗体の対応抗原の新規好中球
膜蛋白質を提供することを目的とするものである。
能を有するモノクローナル抗体の対応抗原の新規好中球
膜蛋白質を提供することを目的とするものである。
【０００９】また、本発明は、好中球の遊走に必須な細
胞膜表面機能分子である、ＴＭ３１６抗体が特異的に反
応する抗原の蛋白質を同定することを目的とするもので
ある。
胞膜表面機能分子である、ＴＭ３１６抗体が特異的に反
応する抗原の蛋白質を同定することを目的とするもので
ある。
【００１０】また、本発明は、好中球の遊走機能の解明
と新たな抗炎症剤の標的となる細胞表面機能分子の構造
を解明することを目的とするものである。
と新たな抗炎症剤の標的となる細胞表面機能分子の構造
を解明することを目的とするものである。
【００１１】また、本発明は、同抗原分子の生化学的及
び理化学的な性状を明らかにし、この分子を高度に精製
することを目的とするものである。
び理化学的な性状を明らかにし、この分子を高度に精製
することを目的とするものである。
【００１２】更に、本発明は、ＴＭ３１６抗体が特異的
に認識する好中球の細胞膜表面機能分子を精製し、当該
分子の蛋白質構造を明らかにすることを副次的な目的と
するものである。
に認識する好中球の細胞膜表面機能分子を精製し、当該
分子の蛋白質構造を明らかにすることを副次的な目的と
するものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明における、ヒト好
中球の遊走を強く抑制する機能を有するモノクローナル
抗体としては、ＴＭ３１６抗体が好適なものとして使用
される。当該ＴＭ３１６抗体は、後述する参考例に具体
的に示されるように、ヒト単核球系培養細胞ＴＨＰ−１
（Tsuchiya S. et al., Int. J. Cancer 26, 171, 198
0）をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、脾細胞をマウスミ
エローマ細胞株Ｘ６３ＡＧ８．６５３と細胞融合させて
作成したモノクローナル抗体であり、当該ＴＭ３１６抗
体の性状はＩｇＭ、κ型で、ヒト顆粒球とは反応する
が、リンパ球、単球とは反応しないことが知られている
（Shimizu A. et al. ，Scand. J. Immunol. 28, 675-6
85, 1984）。本発明の当該ＴＭ３１６対応抗原の好中球
膜蛋白質の精製の過程においては、同抗体を使用したウ
エスタンブロッティングを指標としたものが好適に使用
される。
中球の遊走を強く抑制する機能を有するモノクローナル
抗体としては、ＴＭ３１６抗体が好適なものとして使用
される。当該ＴＭ３１６抗体は、後述する参考例に具体
的に示されるように、ヒト単核球系培養細胞ＴＨＰ−１
（Tsuchiya S. et al., Int. J. Cancer 26, 171, 198
0）をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、脾細胞をマウスミ
エローマ細胞株Ｘ６３ＡＧ８．６５３と細胞融合させて
作成したモノクローナル抗体であり、当該ＴＭ３１６抗
体の性状はＩｇＭ、κ型で、ヒト顆粒球とは反応する
が、リンパ球、単球とは反応しないことが知られている
（Shimizu A. et al. ，Scand. J. Immunol. 28, 675-6
85, 1984）。本発明の当該ＴＭ３１６対応抗原の好中球
膜蛋白質の精製の過程においては、同抗体を使用したウ
エスタンブロッティングを指標としたものが好適に使用
される。
【００１４】一方、本発明の精製蛋白質の出発材料とし
ては、好中球ミクロソーム画分が好適なものとして使用
されるが、当該好中球ミクロソーム画分は、例えば、次
のようにして調製したものが使用される。すなわち、ヘ
パリン採血により得た全血中の赤血球をデキストランに
より凝集、除去し、上清を遠心し、好中球分画ペレット
を調製し、次いで、後述する実施例に具体的に示される
ように、当該好中球分画ペレットを破砕し、遠心して核
酸成分を除去して、膜蛋白画分のミクロソーム画分を調
製し、これを界面活性剤で抽出し、可溶化して得られる
可溶化物を遠心し、その上清（可溶化ミクロソーム）を
精製の出発材料とする方法が好適なものとして例示され
る。
ては、好中球ミクロソーム画分が好適なものとして使用
されるが、当該好中球ミクロソーム画分は、例えば、次
のようにして調製したものが使用される。すなわち、ヘ
パリン採血により得た全血中の赤血球をデキストランに
より凝集、除去し、上清を遠心し、好中球分画ペレット
を調製し、次いで、後述する実施例に具体的に示される
ように、当該好中球分画ペレットを破砕し、遠心して核
酸成分を除去して、膜蛋白画分のミクロソーム画分を調
製し、これを界面活性剤で抽出し、可溶化して得られる
可溶化物を遠心し、その上清（可溶化ミクロソーム）を
精製の出発材料とする方法が好適なものとして例示され
る。
【００１５】次に、好中球膜蛋白質の精製手段について
は、レクチンカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換
カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマ
トグラフィーを組み合わせてなる精製方法が好適なもの
として使用されるが、本発明者らが検討したところによ
れば、いくつかの予備実験から、具体的には、例えば、
以下のものが高度精製蛋白質を得るための精製方法とし
て基本的に有効であることが分かった。 （１）ＷＧＡ（コムギ胚芽レクチン）カラム （２）陰イオン交換ＦＰＬＣ用カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ
（Ｔｏｓｏ社製） （３）ＣＧ５０陽イオン交換カラム
は、レクチンカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換
カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマ
トグラフィーを組み合わせてなる精製方法が好適なもの
として使用されるが、本発明者らが検討したところによ
れば、いくつかの予備実験から、具体的には、例えば、
以下のものが高度精製蛋白質を得るための精製方法とし
て基本的に有効であることが分かった。 （１）ＷＧＡ（コムギ胚芽レクチン）カラム （２）陰イオン交換ＦＰＬＣ用カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ
（Ｔｏｓｏ社製） （３）ＣＧ５０陽イオン交換カラム
【００１６】従って、本発明においては、出発材料とし
て上記の如く調製される好中球ミクロソーム画分を使用
し、基本的には、これらのカラムクロマトグラフィーを
用いて精製処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動（ＰＡＧＥ）で展開し、ウエスタンブロッテ
ィングを行うことにより高度精製蛋白質を得る方法が代
表的なものとして例示される。また、これらのカラムに
よる精製段階では、ウエスタンブロッティングの結果、
糖蛋白質であるＴＭ３１６対応抗原は広くスメア状に広
がっており、くっきりとしたバンドを形成しないことが
あることから、更に、二次元電気泳動により二次元に展
開する方法を使用することにより高レベルの精製を行う
ことができる。
て上記の如く調製される好中球ミクロソーム画分を使用
し、基本的には、これらのカラムクロマトグラフィーを
用いて精製処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動（ＰＡＧＥ）で展開し、ウエスタンブロッテ
ィングを行うことにより高度精製蛋白質を得る方法が代
表的なものとして例示される。また、これらのカラムに
よる精製段階では、ウエスタンブロッティングの結果、
糖蛋白質であるＴＭ３１６対応抗原は広くスメア状に広
がっており、くっきりとしたバンドを形成しないことが
あることから、更に、二次元電気泳動により二次元に展
開する方法を使用することにより高レベルの精製を行う
ことができる。
【００１７】本発明の精製蛋白質は、前記の如く、ヘパ
リン採血した全血中のヒト顆粒球から分離した好中球ミ
クロソーム画分を出発材料として使用し、上記好中球の
遊走を阻害する機能を有するモノクローナル抗体を用い
たウエスタンブロッティングを指標として、上記各種の
カラムクロマトグラフィー、及び二次元電気泳動等の精
製手段を組み合わせた精製方法により高度に精製するこ
とができるが、かかる精製方法は、当該精製手段に限定
されるものではなく、それと同効のものであれば他の精
製手段を適宜組み合わせて使用することも可能であるこ
とは云うまでもない。
リン採血した全血中のヒト顆粒球から分離した好中球ミ
クロソーム画分を出発材料として使用し、上記好中球の
遊走を阻害する機能を有するモノクローナル抗体を用い
たウエスタンブロッティングを指標として、上記各種の
カラムクロマトグラフィー、及び二次元電気泳動等の精
製手段を組み合わせた精製方法により高度に精製するこ
とができるが、かかる精製方法は、当該精製手段に限定
されるものではなく、それと同効のものであれば他の精
製手段を適宜組み合わせて使用することも可能であるこ
とは云うまでもない。
【００１８】本発明においては、後述する実施例に具体
的に示されるように、上記精製方法に従って、好中球膜
蛋白質の分子量１５０ＫＤａ付近をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
て精製すると、分子量約１５０ＫＤａの部分に一本のバ
ンドが認められ、これをフィルターに転写し、ＴＭ３１
６抗体による免疫染色を行うと同部が染色され、本発明
の精製蛋白質標品の分子量は約１５０ＫＤａであること
が確認された。また、同蛋白質をイモービリン（immobi
line）とＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて二次元に展開したと
ころ、ＰＩ約４．０スポットのみが染色され、本発明の
蛋白質標品の等電点(isoelectric point) は約４．０で
あることが確認された。
的に示されるように、上記精製方法に従って、好中球膜
蛋白質の分子量１５０ＫＤａ付近をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
て精製すると、分子量約１５０ＫＤａの部分に一本のバ
ンドが認められ、これをフィルターに転写し、ＴＭ３１
６抗体による免疫染色を行うと同部が染色され、本発明
の精製蛋白質標品の分子量は約１５０ＫＤａであること
が確認された。また、同蛋白質をイモービリン（immobi
line）とＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて二次元に展開したと
ころ、ＰＩ約４．０スポットのみが染色され、本発明の
蛋白質標品の等電点(isoelectric point) は約４．０で
あることが確認された。
【００１９】本発明に係る好中球膜蛋白質の理化学的性
質を以下に示す。 （１）分子量：約１５０ＫＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （２）等電点：約４．０ （３）特性：好中球の遊走を強く抑制(inhibition)する
モノクローナル抗体（ＴＭ３１６抗体）に対する特異的
反応性を有する。
質を以下に示す。 （１）分子量：約１５０ＫＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （２）等電点：約４．０ （３）特性：好中球の遊走を強く抑制(inhibition)する
モノクローナル抗体（ＴＭ３１６抗体）に対する特異的
反応性を有する。
【００２０】本発明者らが検討したところによれば、前
記の如く、本発明に係るＴＭ３１６対応抗原の好中球膜
蛋白質は、ヒト顆粒球ミクロソーム画分に存在する分子
量約１５０ＫＤａ、等電点約４．０の蛋白質であること
が分かった（図１）。このように、ＴＭ３１６対応抗原
分子はきわだって酸性の蛋白質であり、遊走に関与する
ヒト顆粒球膜蛋白質等として既に報告されているＣＤ１
１ｂ、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、Ｃ３ｂｉ、ｐｌ５０／９
５等（J. Clin. Invests. 72, 171, 1983 、 Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80, 5699, 1983、The Journal of B
iological chemistry Vol. 263, No.25, 12403-12411,
1988、及び J. Exp. Med. Vol. 158, 1785-1803, 1983
）のいずれのものとも等電点等の理化学的性質が異な
るものであり、従って、同対応抗原の好中球膜蛋白質
は、これまで知られているものとはその性質を異にする
新規の蛋白質であると考えられる。
記の如く、本発明に係るＴＭ３１６対応抗原の好中球膜
蛋白質は、ヒト顆粒球ミクロソーム画分に存在する分子
量約１５０ＫＤａ、等電点約４．０の蛋白質であること
が分かった（図１）。このように、ＴＭ３１６対応抗原
分子はきわだって酸性の蛋白質であり、遊走に関与する
ヒト顆粒球膜蛋白質等として既に報告されているＣＤ１
１ｂ、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、Ｃ３ｂｉ、ｐｌ５０／９
５等（J. Clin. Invests. 72, 171, 1983 、 Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80, 5699, 1983、The Journal of B
iological chemistry Vol. 263, No.25, 12403-12411,
1988、及び J. Exp. Med. Vol. 158, 1785-1803, 1983
）のいずれのものとも等電点等の理化学的性質が異な
るものであり、従って、同対応抗原の好中球膜蛋白質
は、これまで知られているものとはその性質を異にする
新規の蛋白質であると考えられる。
【００２１】また、ＴＭ３１６対応抗原は、図２に示す
ように、ＷＧＡカラムに吸着し、ＮＡＧ（Ｎ−アセチル
グルコサミン）で溶出された。従って、同対応抗原は、
ＮＡＧ含有糖鎖を持つ糖蛋白質であると考えられる。ま
た、図１Ｂのウエスタンブロッティングにみられるよう
に、同対応抗原は、分子量１５０ＫＤａ付近に広い分子
量にわたって認められるが、この知見も同蛋白質が多様
な糖鎖を結合していることで説明できる可能性が高い。
このウエスタンブロッティング陽性画分を更に陰イオン
交換カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ社製）を用いて
精製したところ（図３）、後述する実施例に具体的に記
載したように、同対応抗原は、カラムに吸着し、約０．
２ＭのＮａＣｌで溶出された。
ように、ＷＧＡカラムに吸着し、ＮＡＧ（Ｎ−アセチル
グルコサミン）で溶出された。従って、同対応抗原は、
ＮＡＧ含有糖鎖を持つ糖蛋白質であると考えられる。ま
た、図１Ｂのウエスタンブロッティングにみられるよう
に、同対応抗原は、分子量１５０ＫＤａ付近に広い分子
量にわたって認められるが、この知見も同蛋白質が多様
な糖鎖を結合していることで説明できる可能性が高い。
このウエスタンブロッティング陽性画分を更に陰イオン
交換カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ社製）を用いて
精製したところ（図３）、後述する実施例に具体的に記
載したように、同対応抗原は、カラムに吸着し、約０．
２ＭのＮａＣｌで溶出された。
【００２２】これらの精製段階での各フラクションの銀
染色、及び対応するフラクションのウエスタンブロッテ
ィング（図４）に示されるように、フラクション８、９
にほぼ均一に精製された分子量１５０ＫＤａの蛋白質
（図４Ａ；銀染色）、及び同じ分子量のＴＭ３１６抗体
による染色像（図４Ｂ；ウエスタンブロッティング）が
認められた。この精製段階でＴＭ３１６対応抗原はほぼ
均一に精製されたと考えられる。更に、例えば、精製画
分をＴＣＡ沈澱にて濃縮後、Ｕｒｅａ，２−ＭＥ（meca
ptoethanol）にて同対応抗原の二次構造を破壊し、陽イ
オン交換樹脂ＣＧ５０を用いて最終段階の精製を行うこ
とにより、高度精製蛋白質標品を得ることができる。当
該サンプルは同対応抗原の高度精製蛋白質であり、その
Ｎ−末端、内部アミノ酸配列の構造レベルの解析をする
標品として好適なものである。
染色、及び対応するフラクションのウエスタンブロッテ
ィング（図４）に示されるように、フラクション８、９
にほぼ均一に精製された分子量１５０ＫＤａの蛋白質
（図４Ａ；銀染色）、及び同じ分子量のＴＭ３１６抗体
による染色像（図４Ｂ；ウエスタンブロッティング）が
認められた。この精製段階でＴＭ３１６対応抗原はほぼ
均一に精製されたと考えられる。更に、例えば、精製画
分をＴＣＡ沈澱にて濃縮後、Ｕｒｅａ，２−ＭＥ（meca
ptoethanol）にて同対応抗原の二次構造を破壊し、陽イ
オン交換樹脂ＣＧ５０を用いて最終段階の精製を行うこ
とにより、高度精製蛋白質標品を得ることができる。当
該サンプルは同対応抗原の高度精製蛋白質であり、その
Ｎ−末端、内部アミノ酸配列の構造レベルの解析をする
標品として好適なものである。
【００２３】
【実施例】以下、実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるも
のではない。 参考例 ＴＭ３１６抗体産生ハイブリドーマの樹立とＴＭ３１６
抗体の取得 ヒト好中球表面上の抗原蛋白質を認識するＴＭ３１６抗
体は下記のようにして得た。ヒト単核球系白血病細胞Ｔ
ＨＰ−１(Tsuchiya S. et al., Int. J. Cancer 26, 17
1, 1980)をＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ免疫し、４日
後にマウスを屠殺して脾細胞を得た。得られた脾細胞と
マウスミエローマ細胞株Ｘ６３Ａｇ８．６５３をポリエ
チレングリコールを用いた常法により融合させた。融合
させて得られたハイブリドーマの培養上清を、多核白血
球を固定した９６ウェルタイタープレート（テルモ社
製）に加え室温にて３０分間反応させ、三回洗浄後、ウ
サギ抗マウスＩｇＭＩｇＧ型抗体をコートしたヒツジ赤
血球懸濁液を添加した。赤血球懸濁液の沈降のパターン
により多核白血球を認識するハイブリドーマクローンを
選択し、更に好中球の遊走阻害能を指標にしてハイブリ
ドーマＴＭ３１６を樹立した。
するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるも
のではない。 参考例 ＴＭ３１６抗体産生ハイブリドーマの樹立とＴＭ３１６
抗体の取得 ヒト好中球表面上の抗原蛋白質を認識するＴＭ３１６抗
体は下記のようにして得た。ヒト単核球系白血病細胞Ｔ
ＨＰ−１(Tsuchiya S. et al., Int. J. Cancer 26, 17
1, 1980)をＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ免疫し、４日
後にマウスを屠殺して脾細胞を得た。得られた脾細胞と
マウスミエローマ細胞株Ｘ６３Ａｇ８．６５３をポリエ
チレングリコールを用いた常法により融合させた。融合
させて得られたハイブリドーマの培養上清を、多核白血
球を固定した９６ウェルタイタープレート（テルモ社
製）に加え室温にて３０分間反応させ、三回洗浄後、ウ
サギ抗マウスＩｇＭＩｇＧ型抗体をコートしたヒツジ赤
血球懸濁液を添加した。赤血球懸濁液の沈降のパターン
により多核白血球を認識するハイブリドーマクローンを
選択し、更に好中球の遊走阻害能を指標にしてハイブリ
ドーマＴＭ３１６を樹立した。
【００２４】ハイブリドーマＴＭ３１６をＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの腹腔内へ移植し、得られた腹水から精製マウス
モノクローナル抗体ＴＭ３１６を得た（Shimizu A. et
al.,Scand. J. Immunol. 28, 675, 1988)。マウスモノ
クローナル抗体ＴＭ３１６はＩｇＭ、κ型であり、ヒト
好中球とは反応するが、リンパ球及び単球とは反応しな
い。本発明者らが、既に報告したように、ＴＭ３１６抗
体はＣ５ａ、ＦＭＬＰ、ＬＤＣＦ（リンパ球培養上清）
などの各種好中球遊走因子による好中球遊走を濃度依存
的に強く阻害するが、ＦＭＬＰ、コンカナバリンＡ、ホ
ルボールエステル、カルシウムイムノフォア等の種々の
刺激による好中球の活性酸素産生、化学発光あるいはリ
ソゾーム顆粒放出を抑制しない。
マウスの腹腔内へ移植し、得られた腹水から精製マウス
モノクローナル抗体ＴＭ３１６を得た（Shimizu A. et
al.,Scand. J. Immunol. 28, 675, 1988)。マウスモノ
クローナル抗体ＴＭ３１６はＩｇＭ、κ型であり、ヒト
好中球とは反応するが、リンパ球及び単球とは反応しな
い。本発明者らが、既に報告したように、ＴＭ３１６抗
体はＣ５ａ、ＦＭＬＰ、ＬＤＣＦ（リンパ球培養上清）
などの各種好中球遊走因子による好中球遊走を濃度依存
的に強く阻害するが、ＦＭＬＰ、コンカナバリンＡ、ホ
ルボールエステル、カルシウムイムノフォア等の種々の
刺激による好中球の活性酸素産生、化学発光あるいはリ
ソゾーム顆粒放出を抑制しない。
【００２５】実施例１ 好中球からのＴＭ３１６抗体対応抗原の精製 （１）好中球ミクロソーム画分の調製 健常人より血液を採取し、ただちにヘパリン処理後、全
血中の赤血球をデキストラン／フィコール法（Shimizu
A. et al., Scand. J. Immunol. 28, 675, 1988)によっ
て凝集させ、除去した。その上清を遠心分離し、ヒト好
中球分画ペレットを得た。分離した好中球を０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ７．２）（以下、バッファーＡという）に懸濁
し、超音波破砕機（トミイセイコウ社製）を用いて超音
波破砕した。これを８００ｘｇにて１０分間遠心分離
し、核酸成分を含む沈降画分を取り除いて上清を得た。
次いで、この上清を１０5 ｘｇにて３０分間遠心分離
し、沈澱（ミクロソーム画分）を得た。
血中の赤血球をデキストラン／フィコール法（Shimizu
A. et al., Scand. J. Immunol. 28, 675, 1988)によっ
て凝集させ、除去した。その上清を遠心分離し、ヒト好
中球分画ペレットを得た。分離した好中球を０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ
ー（ｐＨ７．２）（以下、バッファーＡという）に懸濁
し、超音波破砕機（トミイセイコウ社製）を用いて超音
波破砕した。これを８００ｘｇにて１０分間遠心分離
し、核酸成分を含む沈降画分を取り除いて上清を得た。
次いで、この上清を１０5 ｘｇにて３０分間遠心分離
し、沈澱（ミクロソーム画分）を得た。
【００２６】この好中球ミクロソーム画分を、二次元電
気泳動に付した。すなわち、イモービリン（Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｎｅ，ｐＨ４−７）（ファルマシア社製）を担体
とする等電点電気泳動で一次元目の展開を行った後、
７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で二次元目の展開をした。これを銀染色
法により常法に従って染色した。この結果を図１Ａに示
す。
気泳動に付した。すなわち、イモービリン（Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｎｅ，ｐＨ４−７）（ファルマシア社製）を担体
とする等電点電気泳動で一次元目の展開を行った後、
７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で二次元目の展開をした。これを銀染色
法により常法に従って染色した。この結果を図１Ａに示
す。
【００２７】更に、好中球ミクロソーム画分を泳動試料
として、前記の参考例に記載したＴＭ３１６抗体を用い
たウエスタンブロット法（Shimizu A. et al., Scand.
J. Immunol. 28, 675, 1988)を行った。常法により、好
中球ミクロソーム画分を７．５％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で展開して、ニトロセルロース膜（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ & Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写
し、これをＴＭ３１６抗体産生ハイブリドーマの培養上
清を用いて、室温にて１時間インキュベートした後、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．
４）にて二回洗浄した。市販のペルオキシダーゼ標識ウ
サギ抗マウスＩｇＭＩｇＧ型抗体（カッペル社製）を１
０００倍希釈し二次抗体として用い、室温にて１時間反
応させ、上記バッファーにて洗浄後、ヂアミノベンチジ
ン（同仁社製）を基質として発色させた。この結果を図
１Ｂに示す。
として、前記の参考例に記載したＴＭ３１６抗体を用い
たウエスタンブロット法（Shimizu A. et al., Scand.
J. Immunol. 28, 675, 1988)を行った。常法により、好
中球ミクロソーム画分を７．５％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で展開して、ニトロセルロース膜（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ & Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写
し、これをＴＭ３１６抗体産生ハイブリドーマの培養上
清を用いて、室温にて１時間インキュベートした後、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．
４）にて二回洗浄した。市販のペルオキシダーゼ標識ウ
サギ抗マウスＩｇＭＩｇＧ型抗体（カッペル社製）を１
０００倍希釈し二次抗体として用い、室温にて１時間反
応させ、上記バッファーにて洗浄後、ヂアミノベンチジ
ン（同仁社製）を基質として発色させた。この結果を図
１Ｂに示す。
【００２８】図１Ａ及び図１Ｂから、二次元電気泳動で
得られる多くのスポットのうち分子量１５０ＫＤａ、等
電点４．０付近に出現する幅広い酸性蛋白質がＴＭ３１
６抗体により認識されることが明らかとなった。以上の
結果から、ＴＭ３１６抗体に認識される対応抗原の蛋白
質は、ＣＤ１１ｂあるいはＣＤ１１ｃといった既知の分
子と異なった分子であることが確認された。
得られる多くのスポットのうち分子量１５０ＫＤａ、等
電点４．０付近に出現する幅広い酸性蛋白質がＴＭ３１
６抗体により認識されることが明らかとなった。以上の
結果から、ＴＭ３１６抗体に認識される対応抗原の蛋白
質は、ＣＤ１１ｂあるいはＣＤ１１ｃといった既知の分
子と異なった分子であることが確認された。
【００２９】（２）小麦胚芽レクチンカラムによるクロ
マトグラフィー 上記（１）にて調製した好中球ミクロソーム画分を５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度になるよう上記バッファーＡに懸濁し
た。これに、最終濃度が０．５％の界面活性剤Ｎｏｎｉ
ｄｅｎｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）（シグマ社製）を加
えて可溶化した。可溶化した好中球ミクロソーム画分を
１０5 ｘｇにて、３０分間遠心分離し、上清を得た。小
麦胚芽レクチン（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｌｅｃｔｉ
ｎ：ＷＧＡ）カラム（ホウネン株式会社製）を上記バッ
ファーＡで平衡化し、可溶化好中球ミクロソーム画分試
料をＷＧＡカラムにかけた。吸着した蛋白質の溶出は、
０．３Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）（シグ
マ社製）を含むバッファーＡで行った。溶出曲線を図２
Ａに示す。溶出された画分をＴＭ３１６抗体を用いる上
記ウエスタンブロット法で染色した（図２Ｂ）。その結
果、ＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質は０．３Ｍ ＮＡ
Ｇを含むバッファーＡで溶出されたことが確認され、Ｔ
Ｍ３１６抗体が認識する蛋白質は、ＮＡＧ含有糖鎖を有
することが明らかとなった。また、図２Ｂに示されるよ
うに、同蛋白質は分子量１５０ＫＤａ付近に広く認めら
れることからも、同蛋白質が糖鎖構造を持つことが確認
された。
マトグラフィー 上記（１）にて調製した好中球ミクロソーム画分を５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度になるよう上記バッファーＡに懸濁し
た。これに、最終濃度が０．５％の界面活性剤Ｎｏｎｉ
ｄｅｎｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）（シグマ社製）を加
えて可溶化した。可溶化した好中球ミクロソーム画分を
１０5 ｘｇにて、３０分間遠心分離し、上清を得た。小
麦胚芽レクチン（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｌｅｃｔｉ
ｎ：ＷＧＡ）カラム（ホウネン株式会社製）を上記バッ
ファーＡで平衡化し、可溶化好中球ミクロソーム画分試
料をＷＧＡカラムにかけた。吸着した蛋白質の溶出は、
０．３Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）（シグ
マ社製）を含むバッファーＡで行った。溶出曲線を図２
Ａに示す。溶出された画分をＴＭ３１６抗体を用いる上
記ウエスタンブロット法で染色した（図２Ｂ）。その結
果、ＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質は０．３Ｍ ＮＡ
Ｇを含むバッファーＡで溶出されたことが確認され、Ｔ
Ｍ３１６抗体が認識する蛋白質は、ＮＡＧ含有糖鎖を有
することが明らかとなった。また、図２Ｂに示されるよ
うに、同蛋白質は分子量１５０ＫＤａ付近に広く認めら
れることからも、同蛋白質が糖鎖構造を持つことが確認
された。
【００３０】（３）陰イオン交換樹脂カラムによるクロ
マトグラフィー 上記（２）で得られたＴＭ３１６抗体が認識する画分を
０．５％ ＮＰ−４０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌバッファー（ｐＨ７．２）により４倍に希釈し、陰イ
オン交換カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ社製）にか
けた。カラムに吸着した蛋白質は、ＮａＣｌの直線的濃
度勾配で溶出させた。この結果を図３に示す。図３から
明らかなように、ＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質は
０．２ＭＮａＣｌ付近に溶出された。０．２Ｍ ＮａＣ
ｌで溶出された画分を、更に、上記銀染色法及びＴＭ３
１６抗体を用いる上記ウエスタンブロット法により分析
した。この結果を図４に示す。図４Ａ（銀染色）では、
フラクション８、９に均一なバンドとして観察される分
子量約１５０ＫＤａの蛋白質が、また、図４Ｂ（ウエス
タンブロット法）では、同じ分子量にＴＭ３１６抗体の
染色像が認められた。従って、この段階でＴＭ３１６抗
体に認識される蛋白質は均一なまでに精製されたと云え
る。
マトグラフィー 上記（２）で得られたＴＭ３１６抗体が認識する画分を
０．５％ ＮＰ−４０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌバッファー（ｐＨ７．２）により４倍に希釈し、陰イ
オン交換カラムＤＥＡＥ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏ社製）にか
けた。カラムに吸着した蛋白質は、ＮａＣｌの直線的濃
度勾配で溶出させた。この結果を図３に示す。図３から
明らかなように、ＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質は
０．２ＭＮａＣｌ付近に溶出された。０．２Ｍ ＮａＣ
ｌで溶出された画分を、更に、上記銀染色法及びＴＭ３
１６抗体を用いる上記ウエスタンブロット法により分析
した。この結果を図４に示す。図４Ａ（銀染色）では、
フラクション８、９に均一なバンドとして観察される分
子量約１５０ＫＤａの蛋白質が、また、図４Ｂ（ウエス
タンブロット法）では、同じ分子量にＴＭ３１６抗体の
染色像が認められた。従って、この段階でＴＭ３１６抗
体に認識される蛋白質は均一なまでに精製されたと云え
る。
【００３１】（４）陽イオン交換樹脂カラムによるバッ
チ処理 上記（３）で得られたＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質
を６％ テトラクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈澱させ、エー
テルで洗浄した後、８Ｍ尿素、５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００（和光純薬社製）及び０．５％２−メルカプトエ
タノールを含む２５０ｍＭ ピリジンアセテート（ｐＨ
５．０）（シグマ社製）に溶解した。その後、同液で平
衡化した陽イオン交換レジン樹脂ＣＧ−５０アンバーラ
イト（オルガノ社製）を用いてバッチ処理した。本条件
下において、ＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質は、非吸
着画分である上清に存在した。なお、本実施例における
ＴＭ３１６抗体の対応抗原分子の精製工程を図５に示
す。以上の結果、本対応抗原の蛋白質は、分子量がＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで約１５０ＫＤａ、等電点が約４．０であ
り、クロマトグラフィー上での挙動を含めて既知の分子
とは異なった生化学的、理化学的性質を有している従来
知られていない新しい分子であることが確認された。
チ処理 上記（３）で得られたＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質
を６％ テトラクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈澱させ、エー
テルで洗浄した後、８Ｍ尿素、５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００（和光純薬社製）及び０．５％２−メルカプトエ
タノールを含む２５０ｍＭ ピリジンアセテート（ｐＨ
５．０）（シグマ社製）に溶解した。その後、同液で平
衡化した陽イオン交換レジン樹脂ＣＧ−５０アンバーラ
イト（オルガノ社製）を用いてバッチ処理した。本条件
下において、ＴＭ３１６抗体が認識する蛋白質は、非吸
着画分である上清に存在した。なお、本実施例における
ＴＭ３１６抗体の対応抗原分子の精製工程を図５に示
す。以上の結果、本対応抗原の蛋白質は、分子量がＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで約１５０ＫＤａ、等電点が約４．０であ
り、クロマトグラフィー上での挙動を含めて既知の分子
とは異なった生化学的、理化学的性質を有している従来
知られていない新しい分子であることが確認された。
【００３２】
【発明の効果】前記の如く、ヒト顆粒球の一種の好中球
は種々の炎症性疾患において病変局所から放出される可
溶性遊走因子に反応して活性化し、炎症部位へ遊走し
て、組織破壊をもたらす。従って、当該好中球遊走の分
子機構を解明することは、好中球が関与する炎症性疾患
に対する特異的な抗炎症剤を理論的に設計する上できわ
めて有用なものである。ヒト好中球の遊走を阻害する機
能を有するモノクローナル抗体（ＴＭ３１６抗体）は、
対応抗原の遊走活性に必須な機能ドメインに結合しその
機能を抑制することによって種々の遊走因子による好中
球遊走反応を抑制すると考えられる。従って、本発明の
好中球細胞膜の高度精製蛋白質は、同対応抗原分子の構
造を解明し、抗体の認識部位を同定することを可能にす
るものであり、それによって、新たな抗炎症剤の標的と
なるペプチドのシークエンスを明らかにすることを可能
にするものである。
は種々の炎症性疾患において病変局所から放出される可
溶性遊走因子に反応して活性化し、炎症部位へ遊走し
て、組織破壊をもたらす。従って、当該好中球遊走の分
子機構を解明することは、好中球が関与する炎症性疾患
に対する特異的な抗炎症剤を理論的に設計する上できわ
めて有用なものである。ヒト好中球の遊走を阻害する機
能を有するモノクローナル抗体（ＴＭ３１６抗体）は、
対応抗原の遊走活性に必須な機能ドメインに結合しその
機能を抑制することによって種々の遊走因子による好中
球遊走反応を抑制すると考えられる。従って、本発明の
好中球細胞膜の高度精製蛋白質は、同対応抗原分子の構
造を解明し、抗体の認識部位を同定することを可能にす
るものであり、それによって、新たな抗炎症剤の標的と
なるペプチドのシークエンスを明らかにすることを可能
にするものである。
【００３３】更に、上述したように、同対応抗原分子
は、好中球の関与する病態（自己免疫疾患、腎炎、心筋
梗塞、ＡＲＤＳ等）を治療する薬物の分子標的となり得
るものであり、また、好中球の遊走を阻止する抗体をヒ
ト型に変換し、治療薬として用いることを可能とするも
のである。また、この対応抗原の分子レベルの解析を通
してリガンド依存性の好中球遊走というダイナミックな
現象に深い洞察を与えることができる。
は、好中球の関与する病態（自己免疫疾患、腎炎、心筋
梗塞、ＡＲＤＳ等）を治療する薬物の分子標的となり得
るものであり、また、好中球の遊走を阻止する抗体をヒ
ト型に変換し、治療薬として用いることを可能とするも
のである。また、この対応抗原の分子レベルの解析を通
してリガンド依存性の好中球遊走というダイナミックな
現象に深い洞察を与えることができる。
【図１】好中球ミクロソーム画分の二次元電気泳動の銀
染色（Ａ）及びウエスタンブロッティング（Ｂ）を示
す。
染色（Ａ）及びウエスタンブロッティング（Ｂ）を示
す。
【図２】ＴＭ３１６対応抗原の蛋白質のＷＧＡカラムク
ロマトグラフィーによる溶出（Ａ）及びウエスタンブロ
ッティング（Ｂ）を示す。
ロマトグラフィーによる溶出（Ａ）及びウエスタンブロ
ッティング（Ｂ）を示す。
【図３】ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグラフィーに
よる溶出を示す。
よる溶出を示す。
【図４】精製ＴＭ３１６対応抗原の銀染色（Ａ）及びウ
エスタンブロッティング（Ｂ）を示す。
エスタンブロッティング（Ｂ）を示す。
【図５】本実施例におけるＴＭ３１６対応抗原の精製工
程を示す。
程を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＳ Ｎ
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒト好中球の遊走を阻害する機能を有す
るモノクローナル抗体の対応抗原であってＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動で分子量約１５０ＫＤａ、等電
点約４．０の理化学的性質を有する好中球膜蛋白質。 - 【請求項２】 ヒト好中球の遊走を阻害する機能を有す
るＴＭ３１６抗体が特異的に反応する抗原である請求項
１記載の好中球膜蛋白質。 - 【請求項３】 好中球ミクロソーム画分をレクチンカラ
ムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにて
精製処理することによって製造される請求項１又は請求
項２記載の好中球膜蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5666294A JPH07242698A (ja) | 1994-03-02 | 1994-03-02 | 好中球遊走に必須な細胞膜抗原蛋白質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5666294A JPH07242698A (ja) | 1994-03-02 | 1994-03-02 | 好中球遊走に必須な細胞膜抗原蛋白質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07242698A true JPH07242698A (ja) | 1995-09-19 |
Family
ID=13033613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5666294A Pending JPH07242698A (ja) | 1994-03-02 | 1994-03-02 | 好中球遊走に必須な細胞膜抗原蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07242698A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10697982B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-06-30 | Merck Patent Gmbh | Methods of evaluating quality of a chromatography media which binds anti-A or anti-B antibodies |
| US10697983B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-06-30 | Merck Patent Gmbh | Methods of evaluating quality of media suitable for removing anti-A or anti-B antibodies |
-
1994
- 1994-03-02 JP JP5666294A patent/JPH07242698A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10697982B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-06-30 | Merck Patent Gmbh | Methods of evaluating quality of a chromatography media which binds anti-A or anti-B antibodies |
| US10697983B2 (en) | 2015-09-08 | 2020-06-30 | Merck Patent Gmbh | Methods of evaluating quality of media suitable for removing anti-A or anti-B antibodies |
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