EP3291904A1 - Composition enrichie en immunoglobulines polyclonales anti-a et/ou anti-b - Google Patents

Composition enrichie en immunoglobulines polyclonales anti-a et/ou anti-b

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EP3291904A1
EP3291904A1 EP16723306.3A EP16723306A EP3291904A1 EP 3291904 A1 EP3291904 A1 EP 3291904A1 EP 16723306 A EP16723306 A EP 16723306A EP 3291904 A1 EP3291904 A1 EP 3291904A1
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EP
European Patent Office
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polyclonal human
human immunoglobulins
immunoglobulins
composition
polyclonal
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16723306.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Paolantonacci
Catherine De Coupade
Stéphane BOYER
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LFB SA
Original Assignee
LFB SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man

Definitions

  • the present invention is in the field of reference products used for the characterization of therapeutic concentrates of polyclonal immunoglobulins. It relates to a composition highly enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal immunoglobulins, a process for the preparation of such a composition, as well as the use of the composition for the preparation of a positive control which is useful in a method of assaying the anti-A and / or anti-B activity of a human normal immunoglobulin concentrate, and using the composition for determining the blood group of a subject.
  • Normal human immunoglobulins are used in the treatment of more and more pathologies. They are used as substitution therapy in primary (congenital deficiency) or secondary (chronic lymphocytic leukemia, myeloma, infections after bone marrow transplant, recurrent bacterial infections in children infected with VI H) deficiency deficiencies of antibodies.
  • ITP idiopathic thrombocytopenic purpura
  • NMM multifocal motor neuropathy
  • IPDC chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuritis
  • anti-A and anti-B immunoglobulins are present in too large proportions in normal human immunoglobulins, they are likely to cause accidental haemolysis, potentially severe, in treated patients carrying antigens A and / or B .
  • IVIG normal human intravenous immunoglobulins
  • TIA indirect antiglobulin test
  • TIA has a high degree of variability and is also likely to underestimate the anti-A and anti-B activity of normal human immunoglobulins (Thorpe et al., Biologicals, 2005 Jun; 2): 111 -6).
  • the TIA test is based on the use of an antiglobulin, that is to say immunoglobulins of animal origin specifically recognizing human immunoglobulins.
  • an antiglobulin that is to say immunoglobulins of animal origin specifically recognizing human immunoglobulins.
  • the ability of antiglobulin to agglutinate group A or B cells coated with anti-A or anti-B immunoglobulin is likely to be saturated by the concomitant presence of a high concentration of human immunoglobulins directed against other antigens than those of blood groups A and B.
  • Thorpe et al. developed a direct agglutination method, without the use of antiglobulin, in which papain-treated A or B red blood cells are used. contact with serial half dilutions of a solution of normal human immunoglobulins at 5% (50 g / l), in a microtiter plate with V wells. After centrifugation, the plate is inclined at an angle of about 70 ° for about 4-5 minutes. In case of agglutination, the cell pellet remains stuck to the bottom of the V-well, forming a well rounded point. If not, the non-agglutinated pellet slides along the V-well wall, thereby generating a droplet-like form (Thorpe et al., Biologicals, 2005 Jun, 33 (2): 111 -6).
  • a negative control (fraction 07/308) consisting of normal human immunoglobulins at 5% (50 g / l) purified from plasma of donors of all AB blood groups, the plasma of which does not contain anti-inflammatory immunoglobulins. A and anti-B.
  • a positive control (fraction 07/306), consisting of normal human immunoglobulins at 5% (50 g / l) known to possess anti-A and anti-B activity above the average of normal human immunoglobulins, but not producing no agglutination of erythrocytes A or B at a dilution of 1/64 in the previously developed direct agglutination method.
  • a limiting positive control (fraction 07/310), consisting of fraction 07/306, to which were added amounts of an anti-A murine monoclonal antibody (BRIC 145) and a murine anti-B monoclonal antibody (BGRL 1) as this control produces agglutination of erythrocytes A or B for a dilution of at most 1/64 in the previously developed direct agglutination method.
  • Tests carried out with these controls have shown that they can make it possible to standardize the agglutination tests for anti-A and anti-B immunoglobulins, to verify that the tests used are sufficiently specific and sensitive, and to facilitate identification. batches of normal human immunoglobulins whose anti-A and anti-B activity exceeds that tolerated by the health authorities.
  • IVIG must now be free of agglutination of A and B cells at 1/64 dilution of an initial concentration solution of 50 g / l (5%), in a particular direct agglutination test corresponding to that developed by Thorpe et al. (European Pharmacopoeia, Chapter 2.6.20 as revised by Supplement 7.2 of January 2011).
  • the positive controls mentioned above have their drawbacks, and in particular the limiting positive control, supposed to possess anti-A and anti-B activity corresponding to the limit accepted by the health authorities. Indeed, as indicated by Thorpe et al., One of the main flaws of this limiting positive control is its limited availability. In particular, because of its insufficient availability, the use of this product is currently recommended only to check the anti-A and anti-B activity of normal human immunoglobulin concentrates with anti-A anti-A activity.
  • the anti-A and anti-B immunoglobulins present in this limiting positive control are of murine and non-human origin, and are in addition monoclonal and non-polyclonal, unlike the anti-A and anti-B immunoglobulins present in the concentrates. normal human immunoglobulins. These two differences can lead to underestimating or overestimating the anti-A and anti-B activity of normal human immunoglobulins, which is undesirable in both cases.
  • plasma fractionators In order to avoid accidental haemolysis without reducing donor pools that may be used, plasma fractionators have developed methods for removing anti-A and anti-B immunoglobulins from their normal human immunoglobulin concentrates.
  • WO01 / 27623 and WO2007 / 077365 describe the use of different affinity chromatography supports specifically binding to anti-A and anti-B immunoglobulins to eliminate anti-A and anti-B immunoglobulins from biological compositions, especially from normal human immunoglobulin concentrates.
  • the non-adsorbed fraction not comprising anti-A and anti-B immunoglobulins is recovered by percolation for further processing and conditioning.
  • the anti-A anti-A affinity chromatography column is then regenerated by washes which are removed.
  • the anti-A and anti-B immunoglobulin fraction adsorbed during the affinity chromatography step therefore corresponds to a lost fraction.
  • the inventors have demonstrated that the anti-A and anti-B polyclonal immunoglobulin fraction adsorbed on the affinity chromatography column for the purpose of eliminating anti-A and anti-immunoglobulins.
  • B and obtained by assembling two column wash fractions, can be used to prepare a new positive control useful for calibrating agglutination tests for anti-A and anti-B immunoglobulins and for reliably detecting batches.
  • This new positive control has the advantage of being composed of the same anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins as those which may be present in a variable amount in normal human immunoglobulin concentrates.
  • this new positive control could be produced in sufficient quantities to allow its routine use as a limiting positive control in all agglutination tests for anti-human immunoglobulins.
  • a and anti-B normal human immunoglobulin concentrates are provided.
  • the present invention thus relates to a composition
  • a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, characterized in that at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are polyclonal human anti-A and / or anti-human immunoglobulins.
  • the polyclonal human immunoglobulins represent at least 85% by weight of the total proteins of the composition.
  • At least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are anti-A polyclonal human immunoglobulins. In another advantageous embodiment, at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are anti-B polyclonal human immunoglobulins. In yet another advantageous embodiment, the composition comprises both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins, and the ratio by weight polyclonal human anti-A immunoglobulins on anti-B polyclonal human immunoglobulins ( anti-A / anti-B) is between 1/10 and 10/1.
  • the composition comprising both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins is enriched in anti-A polyclonal human immunoglobulins, and therefore has a weight ratio of anti-A polyclonal human immunoglobulins.
  • anti-B (anti-A / anti-B) polyclonal human immunoglobulins ranging from 2/1 to 10/1.
  • the composition comprising both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins is enriched in anti-B polyclonal human immunoglobulins, and therefore has a weight ratio of polyclonal anti-human immunoglobulins to A on anti-B (anti-A / anti-B) polyclonal human immunoglobulins comprised between 1/10 and 1/2.
  • the composition comprising both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins is balanced in both types of immunoglobulins, and thus has a weight ratio of polyclonal anti-human immunoglobulins to A on anti-B (anti-A / anti-B) polyclonal human immunoglobulins of between 3/10 and 7/10, advantageously between 4/1 and 6/10.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a composition according to the invention, comprising the following steps:
  • the method advantageously comprises the following steps:
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins, and
  • the method advantageously comprises the following steps:
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins, and
  • the specific ligand of anti-A polyclonal human immunoglobulins is advantageously chosen from oligosaccharides representative of group A antigens of types 1, 2, 3 and 4.
  • the specific ligand for anti-B polyclonal human immunoglobulins is advantageously chosen from oligosaccharides representative of group B antigens of type 1, 2, 3 and 4.
  • the support used in step a) and / or in step d) is advantageously in the form:
  • a polymeric membrane the membrane being grafted with the ligand or ligands of interest.
  • the particles are advantageously incorporated into a gel or a resin, which is used as a matrix of an affinity chromatography column.
  • the polymeric membrane can be included in an affinity chromatography column.
  • the human plasma batch or the human plasma fraction enriched in polyclonal human immunoglobulins are then adsorbed on the affinity chromatography column, and the adsorbed fraction is eluted and recovered.
  • the polymer of the particles or of the membrane is advantageously chosen from cellulose and its derivatives, agarose, dextran, polyacrylates, polystyrene, polyacrylamide, polymethacrylamide, copolymers of styrene and divinylbenzene, or mixtures of these polymers. .
  • the ligand of interest is advantageously grafted on the polymer particles or on the polymeric membrane by means of a spacer.
  • the invention further relates to a composition obtainable by a preparation process according to the invention.
  • the invention also relates to the use of a composition according to the invention as a positive control in a method for assaying the anti-A or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins.
  • the invention also relates to the use of a composition according to the invention for the preparation of a positive control and / or a limiting positive control for use in a method for assaying the anti-A activity or anti-B composition comprising polyclonal human immunoglobulins.
  • the invention also relates to a method for preparing a positive control for use in a method for assaying the anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, comprising the steps of :
  • composition comprising polyclonal human immunoglobulins having anti-A activity and / or anti-B activity below a given limit value in said assay method, and
  • the invention also relates to a process for the preparation of a below-limit positive control, a limiting positive control or a positive control above the limit for use in a method for assaying anti-tumor activity. And / or anti-B of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, comprising the following steps:
  • composition comprising polyclonal human immunoglobulins having anti-A activity and anti-B activity below a given limit value in said assay method
  • composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are anti-A polyclonal human immunoglobulins and / or a composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are anti-human polyclonal immunoglobulins.
  • -B to obtain different compositions enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins,
  • step b) the assay by said assay method of the anti-A and / or anti-B activity of the compositions enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins obtained in step b), and
  • composition enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins having anti-A and / or anti-B activity in said lower assay method to obtain a positive control below the limit
  • a limit positive control to obtain a limit positive control
  • a positive control greater than the limit to the said limit value.
  • the invention further relates to a positive control (sub-limit positive control, limiting positive control, or positive control greater than the limit) for use in a method for assaying for anti-A and / or anti- B of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, obtainable by one of the methods according to the invention for the preparation of a positive control described above.
  • a positive control sub-limit positive control, limiting positive control, or positive control greater than the limit
  • the invention finally relates to the use of a composition characterized in that at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins or a composition obtainable by the process according to the invention in a test for determining the blood group of a subject.
  • the inventors have demonstrated that the fraction of anti-A and / or anti-B polyclonal immunoglobulins adsorbed on the affinity chromatography column for the purpose of eliminating anti-A immunoglobulins and / or anti-B may be used to prepare a new positive control useful for calibrating agglutination tests for anti-A and / or anti-B immunoglobulins and for reliably detecting batches of normal human immunoglobulins with anti-B activity. A and / or anti-B higher than the limits accepted by the health authorities.
  • This new positive control has the advantage of being composed of the same polyclonal human anti-A and / or anti-B immunoglobulins as those which may be present in variable amounts in normal human immunoglobulin concentrates. Moreover, in view of the growing amount of normal human immunoglobulins produced each year, this new positive control could be produced in sufficient quantities to allow its systematic use as a limiting positive control in all agglutination tests for anti - A and / or anti - B immunoglobulins of normal human immunoglobulin concentrates.
  • Antibody or "immunoglobulin” means a molecule comprising at least one binding domain to a given antigen and a constant domain comprising an Fc fragment capable of binding to the FcR receptors.
  • polyclonal human immunoglobulin is meant a composition of human immunoglobulins directed against a number of distinct antigens, and comprising, for each recognized antigen, a plurality of distinct immunoglobulins capable of recognizing said antigen, generally at several distinct epitopes.
  • Such polyclonal human immunoglobulins are generally purified from the plasma of one or preferably more than one donor (this is referred to as a pool of donors). Therapeutic normal human immunoglobulins are thus purified from plasma pools of generally at least 1000 donors.
  • anti-A polyclonal human immunoglobulin or "anti-A immunoglobulin” is meant polyclonal human immunoglobulins recognizing blood group A antigens.
  • Bood group A antigens or “A antigens” are characterized by the presence of a trisaccharide comprising an N-acetylgalactosamine (abbreviated herein as “GalNAc”) linked to a galactose (abbreviated herein as “Gaal”), itself bound to a fucose (abbreviated herein as “ Fuc "), according to the following sequence: GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal.
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • Fuc fucose
  • This trisaccharide can itself be attached by its central galactose to other sugars, the number and the assembly of which varies according to the type of antigen A, as indicated in Table 1 below for type A antigens. 1 to 4, and the presence or absence as well as the nature of a Lewis antigen.
  • Table 1 Structure of different types of antigen of the blood group A.
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • Fuc fucose
  • Gal galactose
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • G le glucose
  • R support (oligosaccharide, glycoprotein, glycolipid). The group A trisaccharide is indicated in bold.
  • anti-B polyclonal human immunoglobulin or "anti-B immunoglobulin” is meant polyclonal human immunoglobulins recognizing blood group B antigens.
  • Bood group B antigens or “B antigens” are characterized by the presence of a trisaccharide comprising a first galactose linked to a second galactose, itself linked to a fucose, according to the following sequence: Galal - 3 (Fuca1 -2) Gal.
  • This trisaccharide can itself be attached by its central galactose to other sugars, the number and the assembly of which varies according to the type of antigen B, as indicated in Table 2 below for type B antigens. 1 to 4, and the presence or absence as well as the nature of a Lewis antigen.
  • Table 2 Structure of different types of antigen of blood group B.
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • Fuc fucose
  • Gal galactose
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • G le glucose
  • R support (oligosaccharide, glycoprotein, glycolipid). The group B trisaccharide is indicated in bold.
  • Fraction of human plasma enriched in polyclonal human immunoglobulins means any fraction of human plasma that can be obtained by fractionation of human plasma and the percentage by weight of polyclonal immunoglobulins relative to the total proteins of the fraction is greater than to that of human plasma. Such fractions are advantageously obtained by fractionation of plasma pools of at least 1000 donors.
  • They may in particular include any part or subpart of the plasma which has been the subject of one or more purification steps and in particular, the supernatant of cryoprecipitated plasma, plasma cryoprecipitate (delivered or not in suspension), the fractions I at V obtained by ethanolic fractionation (according to the method of Cohn or Kistler & Nitschmann), the supernatant and the precipitate obtained after precipitation with caprylic acid and / or caprylate, the filtrates, or any fraction enriched with immunoglobulins (eluates of chromatographies and / or non-adsorbed fractions) by chromatographic separation, as described in particular in WO99 / 64462 and WO02 / 092632, and more particularly in WO02 / 092632.
  • oligosaccharide representing blood group A antigens is meant any oligosaccharide comprising the trisaccharide characteristic of blood group A antigens as defined above.
  • GalNAcal -3 Fuca1 -2) Gal.
  • Such an oligosaccharide may further comprise other sugars present in the antigens blood group A defined above.
  • such an oligosaccharide may also be chosen from tetrasaccharides, pentasaccharides and hexasaccharides derived from the group A, type 1, 2, 3 or 4 antigens described above and comprising the characteristic trisaccharide GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal:
  • Type 1 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Galp1 -3GlcNAc,
  • Type 3 or 4 GalNAcal -3 (Fuca1-2) Gai i -3GalNAc
  • Type 1 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal1 -3GlcNAc p1 -3Gal,
  • Type 2 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -4GlcNAc p1 -3Gal,
  • Type 3 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal,
  • Type 4 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc p1 -3Gal,
  • Type 1 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc
  • Type 2 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal1 -4GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc
  • o Type 3 GalNAcal - 3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc
  • Type 4 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal1 -3GalNAc p1 -3Gala1 -4Gal.
  • the oligosaccharide may also comprise repeats of the characteristic GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal trisaccharide, or tetrasaccharides, pentasaccharides and hexasaccharides derived from the type 1, 2, 3 or 4 Group A antigens described above.
  • the specific ligand for immunoglobulins recognizing antigens of blood group A is the characteristic trisaccharide GalNAcal -3 (Fuca1-2) Gal.
  • oligosaccharide representing antigens of blood group B is meant any oligosaccharide comprising the trisaccharide characteristic of antigens of blood group B as defined above. : Galal -3 (Fuca1 -2) Gal. Such an oligosaccharide may further comprise other sugars present in the blood group B antigens defined above.
  • such an oligosaccharide may also be chosen from tetrasaccharides, pentasaccharides and hexasaccharides derived from group B, type 1, 2, 3 or 4 antigens described above and comprising the characteristic trisaccharide Galal -3 (Fuca1 -2) Gal:
  • Type 1 Gala1 -3 (Fuca1 -2) Galp1 -3GlcNAc,
  • Type 2 Gala1 -3 (Fuca1 -2) Galp1 -4GlcNAc,
  • Type 3 or 4 Gala1 -3 (Fuca1-2) Galp1 -3GalNAc
  • Type 3 Gala1 -3 (Fuca1 -2) Galp1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc
  • o Type 4 Gala1 -3 (Fuca1 -2) Gal1 -3GalNAc p1 -3Gala1 -4Gal.
  • the oligosaccharide may also comprise repeats of the characteristic Gala1-3 (Fuca1-2) Gal trisaccharide, or tetrasaccharides, pentasaccharides, and hexasaccharides derived from the type 1, 2, 3, or 4 B-group antigens described above.
  • the specific ligand of immunoglobulins recognizing antigens of blood group B is the characteristic trisaccharide Galal -3 (Fuca1 -2) Gal.
  • a reference to "a" specific ligand of anti-A or anti-B polyclonal human immunoglobulins includes the possibility of using either a single type of ligand specific for anti-A or anti-B polyclonal human immunoglobulins (that is to say that all the ligands grafted on the support have the same chemical structure), or several different types of ligands (that is to say of different chemical structure) specific (s) polyclonal human immunoglobulins anti -A or anti-B.
  • each ligand of given chemical structure that can be used is necessarily grafted several times on the support, so that the polyclonal human anti-A or anti-B immunoglobulins can be retained by the support.
  • One skilled in the art knows which ligand density should be used to allow optimal adsorption of anti-A or anti-B polyclonal human immunoglobulins on the support.
  • positive control of a method for assaying anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins is meant a composition of polyclonal human immunoglobulins comprising polyclonal human anti-A immunoglobulins. and / or anti-B.
  • Regulatory authorities require that normal human immunoglobulin compositions have anti-A activity and anti-B activity less than a limit value, set at a given time, but may vary over time and changes in regulatory authorities.
  • the expression “positive control” covers three types of positive controls, referred to in the present description as “positive control less than the limit”, “positive control, respectively. limit “, and” positive control above the limit ", each of these positive controls being of interest in a method for assaying for anti-A and / or anti-B activity.
  • lower-the-limit positive control of a method for assaying anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins is meant a positive control comprising an amount of polyclonal human immunoglobulins.
  • anti-A and / or anti-B generating in the assay method an activity value below a predefined limit value.
  • Such a limit value may in particular correspond to the maximum value of anti-A and / or anti-B activity accepted by the health authorities of a country for normal human immunoglobulins intended for administration to humans by any route of administration. administration, especially intravenously or intramuscularly or subcutaneously.
  • limiting positive control of a method for assaying anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins is meant a positive control comprising a quantity of polyclonal human anti-A immunoglobulins. and / or anti-B generating in the assay method an activity value equal to a predefined limit value.
  • Such a limit value may in particular correspond to the maximum value of anti-A and / or anti-B activity accepted by the health authorities of a country for normal human immunoglobulins intended for administration to humans by any route of administration. administration, especially intravenously or intramuscularly or subcutaneously.
  • Such a limiting positive control is useful in particular to determine whether or not a therapeutic concentrate has an anti-A and / or anti-B activity lower than the maximum limit value accepted by the health authorities.
  • anti-A and / or anti-B By “above-the-limit positive control" of a method for assaying anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins is meant a positive control comprising a quantity of polyclonal human immunoglobulins.
  • anti-A and / or anti-B generating in the assay method an activity value higher than a predefined limit value.
  • a limit value may in particular correspond to the maximum value of anti-A and / or anti-B activity accepted by the health authorities of a country for normal human immunoglobulins intended for administration to humans by any route of administration. administration, especially intravenously or intramuscularly or subcutaneously.
  • Such a positive control above the limit is useful in particular to verify that the assay performed has proceeded satisfactorily, such a witness must always have a anti-A and / or anti-B activity greater than the chosen limit value. It can also be used to determine whether a therapeutic concentrate is close to the maximum limit value accepted by health authorities or well above that limit.
  • Anti-A or Anti-B polyclonal human immunoglobulin compositions are useful in particular to verify that the assay performed has proceeded satisfactorily, such a witness must always have a anti-A and / or anti-B activity greater than the chosen limit value. It can also be used to determine whether a therapeutic concentrate is close to the maximum limit value accepted by health authorities or well above that limit.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, characterized in that at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, advantageously at least 85% at least 86%. %, at least 87%, more preferably at least 88%, at least 89%, still more preferably at least 90%, at least 91%, at least 92% at least 93%, at least 94%, or at least 95% %, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are polyclonal human anti-A and / or anti-B immunoglobulins.
  • the weight percentage of the anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins among total polyclonal human immunoglobulins of a composition comprising purified polyclonal human immunoglobulins can be measured by purifying the composition by affinity chromatography on a graft-donated column. ligands specific for anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins, and relating the weight of immunoglobulins adsorbed on the column and the weight of total immunoglobulins.
  • composition is not purified in immunoglobulins, a preliminary step of purification of total immunoglobulins then makes it possible to measure the percentage by weight of anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins among the total polyclonal human immunoglobulins.
  • compositions according to the invention are preferably purified, and the polyclonal human immunoglobulins advantageously represent at least 85%, advantageously at least 86%, at least 87%, more advantageously at least 88%, at least 89%, even more advantageously at least 90%, at least 91%, at least 92% at least 93%, at least 94% or at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% in at least weight of the total proteins of the composition.
  • compositions according to the invention may comprise polyclonal human immunoglobulins of a single isotype (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, advantageously IgG or IgM, preferably IgG) or several isotypes.
  • the polyclonal human immunoglobulins present in the compositions according to the invention are predominantly (at least 90%, advantageously at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94% more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, still more preferably at least 98%, at least 99% by weight, weight) IgG.
  • the compositions according to the invention are advantageously enriched in IgG2 subclass immunoglobulins compared to normal human immunoglobulin concentrates.
  • the IgG compositions according to the invention are advantageously characterized in that at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least less than 70%, at least 75%, or even at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins of IgG isotype present in the composition are immunoglobulins of subclass IgG2, advantageously measured by nephelemetry and / or by spectrography and / or by subclass ELISA kit (ie by nephelemetry, by spectrography, by subclass ELISA kit, or by several of these methods, for example by nephelemetry and by spectrography, or by each of these three methods).
  • the IgG compositions according to the invention advantageously have a weight ratio of IgG 2 / IgG 1 of at least 0.8, at least 0.9, advantageously at least 1, at least 1.1, at least 1, 2, at least 1, 3, at least 1, 4, at least 1, 5, at least 1, 6, at least 1, 7, at least 1, 8, at least 1, 9 or at least 2 at least 2.5, at least 3, at least 3.1, at least 3.2, at least 3.3, at least 3.4, at least 3.5, at least 3.6, at least 3 , 7, at least 3.8, at least 3.9, or even at least 4, advantageously measured by nephelemetry and / or by spectrography and / or by subclass ELISA assay kit (ie by nephelometry, by spectrography, by kit Subclass ELISA, or by several of these methods, for example by nephelemetry and spectrography, or by each of these three methods).
  • the polyclonal human immunoglobulins present in the compositions according to the invention are predominantly (at least 90%, advantageously at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, more preferably at least 95%, at least 96%, at least 97%, still more preferably at least 98%, at least 99% by weight) IgM.
  • At least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, preferably at least 85% at least 86%, at least 87%, more preferably at least 85%. less 88%, at least 89%, even more advantageously at least 90%, at least 91%, at least 92% at least 93%, at least 94%, or at least 95%, at least 96%, at least 97% %, at least 98%, or at least 99% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are anti-A polyclonal human immunoglobulins, as defined above.
  • At least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, preferably at least 85% at least 86%, at least 87%, more preferably at least 88%, at least 89%, even more preferably at least 90%, at least 91%, at least 92% at least 93%, at least 94%, or at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are anti-B polyclonal human immunoglobulins, as defined above.
  • the composition comprises both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins, and in that the weight ratio anti-A polyclonal human immunoglobulins on anti-human polyclonal immunoglobulins -B (anti-A / anti-B) is between 1/10 and 10/1.
  • the composition comprising both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins is enriched in anti-A polyclonal human immunoglobulins, and therefore has a weight ratio of anti-A polyclonal human immunoglobulins.
  • anti-B (anti-A / anti-B) polyclonal human immunoglobulins ranging from 2/1 to 10/1.
  • the composition comprising both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins is enriched in anti-B polyclonal human immunoglobulins, and therefore has a weight ratio of polyclonal anti-human immunoglobulins to A on anti-B (anti-A / anti-B) polyclonal human immunoglobulins comprised between 1/10 and 1/2.
  • the composition comprising both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins is balanced in both types of immunoglobulins, and thus has a weight ratio of polyclonal anti-human immunoglobulins to A on anti-B (anti-A / anti-B) polyclonal human immunoglobulins of between 3/10 and 7/10, advantageously between 4/10 and 6/10.
  • the composition enriched in anti-A polyclonal human immunoglobulins according to the invention may have an anti-A activity enriched by a factor of at least 4, advantageously at least 5. at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least minus 50, at least 55, at least 60, at least 65, at least 70, at least 75, at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 100, at least 125, at least 150 at least 175, at least 200, at least 400, at least 400, at least 500, at least 500, at least 400, at least 400, at least minus 1000, at least 1500, at least 2000, at least 2500, at least 3000, at least 4000, at least 5000, at least 6000, at least 7000, at least 8000, at least 9000, or at least 10000 in relation to a reference Im lyophil
  • the composition enriched in anti-B polyclonal human immunoglobulins according to the invention may have an anti-B activity enriched by a factor of at least 4, advantageously at least 5. at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, at least 60, at least 65, at least 70, at least 75, at least 80, at least 85, at least 90, at least 95, at least 100, at least 125, at least 250, at least 300, at least 350, at least 400, at least 450, at least 500, at least 700, at least 800, at least 900, at least 1000, at least 1500, at least 2000, at least 2500, at least 3000, at least 4000, at least 5000, at least 6000, at least 7000, at least 8000, at least 9,000, at least 10,000, at least 11,000, at least 12,000
  • the composition may comprise both anti-A polyclonal human immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins and has a ratio (anti-A activity / anti-activity).
  • -B between 1/10 and 10/1, in particular between 1/9 and 9/1, between 1/8 and 8/1, between 1/7 and 7/1, between 1/6 and 6/1, between 1/5 and 5/1, between 1/4 and 4/1, between 1/3 and 3/1, even between 1/2 and 2/1 or between 0.6 and 1, 5.
  • the anti-A activity and the anti-B activity are determined using an activity assay method (in particular one of those described below, and in particular the flow cytometry method described here) and expressed in arbitrary units with respect to the same reference standard (standard EDQM ref Y0001688 or freeze-dried human normal immunoglobulin drug).
  • the ratio (anti-A activity / anti-B activity) and the ratio (anti-B activity / anti-A activity) are calculated on the basis of anti-A and anti-B activity results obtained in tests performed in accordance with parallel, with the same method of activity assay (in particular one of those described below, and in particular the method of flow cytometry described here) and expressed in arbitrary units with respect to the same reference standard (standard EDQM ref Y0001688 or freeze-dried human normal immunoglobulin drug).
  • compositions according to the invention are purified and are advantageously concentrated.
  • the compositions according to the invention are concentrated according to any technique known to those skilled in the art, for example by using an ultrafiltration membrane, a centrifugation, a dialysis, or several of these steps.
  • compositions according to the invention have a concentration sufficient to allow successive dilutions of the composition for use as a standard range in an appropriate assay method, for example the indirect Coombs test, the agglutination method. direct, flow cytometry, or by several of these methods (for example, the indirect Coombs test and the direct agglutination method, the indirect Coombs test and flow cytometry; direct agglutination method and flow cytometry; or each of these three methods).
  • an appropriate assay method for example the indirect Coombs test, the agglutination method. direct, flow cytometry, or by several of these methods.
  • the concentrated compositions according to the invention exhibit an indirect Coombs test result (described below) greater than 1/64, advantageously greater than 1/128, greater than 1/256, greater than 1/512, greater than 1/1024, greater than 1/2048, even greater than 1/4096, to allow successive dilutions of the composition to make it a standard range in the indirect Coombs test method.
  • An indirect Coombs test result greater than 1 / N means that the result of the indirect Coombs test is negative at a dilution of the sample at 1 / N.
  • the compositions according to the invention concentrate have a result with the direct agglutination method (described below) greater than 1/64, advantageously greater than 1/128, greater than 1/256 , greater than 1/512, greater than 1/1024, greater than 1/2048, or even greater than 1/4096, to allow successive dilutions of the composition to make a standard range in the direct agglutination method.
  • a direct agglutination test result greater than 1 / N means that the result with the direct agglutination method is negative at a dilution of the sample at 1 / N.
  • the compositions according to the invention concentrate a result with the flow cytometry method (described below) greater than 1/64, advantageously greater than 1/128, greater than 1/256 , greater than 1/512, greater than 1/1024, greater than 1/2048, or even greater than 1/4096, to allow successive dilutions of the composition to make a standard range in the flow cytometry method.
  • flow cytometry test result greater than 1 / N it is meant that the result with the flow cytometry method is negative at a dilution of the sample at 1 / N.
  • the concentrated compositions according to the invention exhibit a concentration of anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins greater than 1 g / L, greater than 1.5 g / L, greater than 2 g / l. L, greater than 5 g / L, greater than 10 g / L, greater than 15 g / L, greater than 20 g / L, or even greater than 50 g / L.
  • compositions according to the invention can be obtained from more or less purified fractions of human plasma comprising polyclonal immunoglobulins by various purification methods.
  • the present invention thus relates to a method for preparing a composition according to the invention, comprising the following steps: a) adsorption of a batch of human plasma or a fraction of human plasma enriched with human immunoglobulins polyclonal on a support grafted by a specific ligand of anti-A polyclonal human immunoglobulins and / or a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins,
  • the present invention therefore relates to a process for preparing a composition according to the invention, comprising the following steps:
  • the present invention therefore relates to a method for preparing a composition according to the invention, comprising the following steps:
  • compositions according to the invention is based on a step of specific adsorption of anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins on a substrate grafted with a specific ligand of these immunoglobulins, which are then eluted.
  • a step of specific adsorption of anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins on a substrate grafted with a specific ligand of these immunoglobulins which are then eluted.
  • the process for the preparation of the compositions according to the invention is integrated in a more general method for the purification of therapeutic normal human immunoglobulins (recovery of fractions which have hitherto been eliminated) and is therefore implemented on a polyclonal human immunoglobulin fraction prepurified.
  • This prepurified polyclonal human immunoglobulin fraction advantageously contains a polyclonal human immunoglobulin content of at least 80%, advantageously at least 81%, at least 82%, more preferably at least 83%, at least 84%, even more preferably at at least 85%, at least 86%, at least 87% at least 88%, at least 89% or at least 90%, at least 91%, or at least 92% by weight of the total protein of the fraction.
  • the fraction of prepurified polyclonal human immunoglobulins may in particular have been obtained by chromatographic separation, in particular according to the purification methods of polyclonal human immunoglobulins described in WO99 / 64462 and WO02 / 092632, and more particularly in WO02 / 092632.
  • the prepurified polyclonal human immunoglobulin fraction is obtained by pre-purification by a step of precipitation of lipid contaminants from a blood plasma or an IgG-enriched blood plasma fraction, and a single chromatography step on an anion exchange resin carrier carried out at alkaline pH, with a selective elution of IgG in one step by an appropriate buffer at a pH of between 4 and 7.
  • the prepurification by a step of precipitation of lipid contaminants consists of a step precipitation with caprylic acid.
  • the pre-purified polyclonal human immunoglobulin fraction may also have undergone a biological security step (viral elimination and / or viral inactivation, in particular by a solvent-detergent treatment), a concentration step (in particular by ultrafiltration), and / or a sterilizing filtration step.
  • a biological security step viral elimination and / or viral inactivation, in particular by a solvent-detergent treatment
  • concentration step in particular by ultrafiltration
  • sterilizing filtration step may also have undergone a biological security step (viral elimination and / or viral inactivation, in particular by a solvent-detergent treatment), a concentration step (in particular by ultrafiltration), and / or a sterilizing filtration step.
  • the support may be any suitable carrier capable of being chosen by those skilled in the art for adsorbing polyclonal human anti-A and / or anti-B immunoglobulins.
  • Such a support used in step a) is advantageously in the form:
  • a polymeric membrane grafted with the ligand or ligands of interest.
  • the support may thus in particular be in the form of particles grafted by the ligand or ligands of interest.
  • the particles are advantageously of spherical or oblong shape, they may especially be balls. These particles generally have an average size of about 0.1 ⁇ to about 1000 ⁇ , preferably about 20 to about 50 ⁇ , more preferably about 50 to about 200 ⁇ , more preferably about 70 ⁇ . ⁇ at about 120 ⁇ in diameter. They may consist of polymer or inorganic materials (such as silica or glass for example).
  • the particles are porous.
  • the polymer may be natural or non-natural (synthetic or semisynthetic), organic or inorganic (preferably the polymer will be organic), crosslinked or uncrosslinked (preferably the polymer will be crosslinked).
  • the polymer is a crosslinked organic polymer.
  • the polymer may especially be chosen from cellulose and its derivatives, agarose, dextran, polyacrylates, polystyrene, polyacrylamide, polymethacrylamide, copolymers of styrene and divinylbenzene, or mixtures of these polymers.
  • the polymer is cellulose, and the particles are preferably porous cellulose beads. More preferably, it is crosslinked cellulose.
  • the support may also be in the form of a polymeric membrane, the membrane being grafted with the ligand or ligands of interest.
  • the polymer of the membrane may be selected from the polymers mentioned above for the polymer particles.
  • the particles are advantageously incorporated in a gel or a resin, which is used as a matrix of an affinity chromatography column.
  • the polymeric membrane can be included in an affinity chromatography column.
  • the human plasma batch or the human plasma fraction enriched in polyclonal human immunoglobulins are then adsorbed on the affinity chromatography column, and the adsorbed fraction is eluted and recovered.
  • an affinity chromatography column is not essential, and other modes of adsorption, dissociation and harvesting can be used.
  • the specific ligand for anti-A polyclonal human immunoglobulins may be any suitable molecule known to those skilled in the art and binding to anti-A polyclonal human immunoglobulins as defined above and not not binding to other immunoglobulins.
  • a ligand is advantageously chosen from oligosaccharides representative of group A, type 1, 2, 3 and 4 antigens, and in particular from the following oligosaccharides:
  • Trisaccharide GalNAca1-3 (Fuca1 -2) Gal;
  • Type 1 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Galp1 -3GlcNAc,
  • Type 1 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Galp1 -3GlcNAc p1 -3Gal,
  • Type 2 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Gal1 -4GlcNAc p1 -3Gal,
  • Type 3 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal,
  • Type 4 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc p1 -3Gal,
  • Type 1 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Galp1 -3GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc
  • Type 2 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Gal1 -4GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc
  • o Type 3 GalNAca1 -3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc
  • Type 4 GalNAcal -3 (Fuca1 -2) Gal61 -3GalNAc B1 -3Gala1 -4Gal.
  • the specific ligand of anti-B polyclonal human immunoglobulins may be any appropriate molecule known to those skilled in the art and binding to anti-B polyclonal human immunoglobulins as defined above and not not binding to other immunoglobulins.
  • a ligand is advantageously chosen from oligosaccharides representative of group B antigens of type 1, 2, 3 and 4, and in particular from the following oligosaccharides:
  • Trisaccharide Gala1-3 (Fuca1 -2) Gal;
  • Type 3 Gala1-3 (Fuca1 -2) Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc
  • Type 4 Gala1-3 (Fuca1-2) Gal61 -3GalNAc 61 -3Gala1 -4Gal.
  • the support may be grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and / or with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • the support is grafted only by a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins.
  • the support is grafted only by a specific ligand of anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • the support is grafted with a specific ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • a mixture of supports grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and supports grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins in respective proportions generally between 25/75 ( v / v) and 75/25 (v / v), and in particular 50/50 (v / v).
  • particles grafted with the ligand (s) of interest when particles grafted with the ligand (s) of interest are used, a mixture of particles grafted with a specific ligand of the ligands can be used.
  • the particles grafted with a specific ligand of the anti-A polyclonal human immunoglobulins and the particles grafted with a specific ligand of anti-B polyclonal human immunoglobulins are mixed in respective proportions generally between 25/75 (v / v).
  • v / v 75/25 (v / v), and especially 50/50 (v / v).
  • a support comprising particles grafted with both a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • a mixture it is also possible to use a mixture:
  • the ligand of interest is advantageously grafted onto the polymer particles or on the polymeric membrane by means of a spacer, which makes it possible to reduce the steric hindrance and to make the trisaccharide characteristic of antigens A or B more accessible to immunoglobulins likely to adsorb on the support.
  • a spacer may be any appropriate group known to those skilled in the art to allow the grafting of the ligand of interest and therefore in particular of oligosaccharides on a support of interest, in particular the polymers described above.
  • the spacer typically comprises at least one C, O, N, or S atom, and will most often include at least one of the following chemical functions: ether (-O-), thioether (-S-), amino (-NH -), carboxy - (- COO- or -OCO-), amide (-CONH- or -HNOC-).
  • the spacer may in particular have a structure chosen from: wherein each of X1 and X2 is independently selected from 0, S, and NH; and each of Ra, Rb, Rc, and Rd is independently selected from H, OH, and methyl.
  • R1 is a linear or branched, preferably linear, C4-C6 alkyl group.
  • R 1 is a C 5 alkyl group.
  • R2 is a linear or branched, preferably linear, C3-C8 alkyl group.
  • R2 is a C3 alkyl group.
  • the ligands (which are preferably trisaccharides as described above) are grafted to the particles or to the membrane by a spacer according to the formula: (particle / membrane) -NH-C5Hio-
  • the coupling between the particle or the membrane and the spacer, on the one hand, and the coupling between the spacer and the specific ligand of the anti-A polyclonal human immunoglobulins or the specific ligand of the anti-B polyclonal human immunoglobulins can be realized. by any appropriate chemical synthesis protocol known to those skilled in the art.
  • the particle or membrane may carry an -NH-R1 -COOH arm.
  • it is ⁇ -aminocaproic acid (where R 1 is a pentyl group).
  • the particle can then be activated using bifunctional reagents such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dibromo- and dichloropropanol, dibromobutane, ethylene glycol diglycidylether, butanediol diglycidylether, divinylsulfone, and the like. allyl glycidyl ether, and allyl bromide.
  • the bifunctional reagent is capable of reacting with both the particles / membrane and the NH-R1 -COOH arm.
  • the heterofunctional allyl compounds such as allyl bromide, are preferred bifunctional reagents and make it possible to obtain an activated matrix.
  • ligands representing the blood group A and / or B antigens are then immobilized on the activated particle / membrane carrying the -NH-R1 -COOH arm via a linker group -NH-R2-, where R2 is a C3 alkyl group.
  • -C8 linear or branched, preferably linear.
  • the COOH function of the -NH-R1 -COOH arm carried by the particle / membrane is reacted with the NH 2 function of the NH 2 -R 2 -ligosaccharide ligand, by the use of a type of condensation agent.
  • substrates grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins which may be used in the context of the invention are the following: Glycosorb ABO A (Sepharose matrix on which is grafted the trisaccharide characteristic of the antigen A, Glycorex Transplantation AB, Lund, Sweden), AUotran A (trisaccharide characteristic of FF Sepharose-grafted polyadrylamide, Lectinity Corp), HyperCel IsoA (cross-linked cellulose particles grafted with the trisaccharide characteristic of the A antigen , Pall).
  • Glycosorb ABO A Sepharose matrix on which is grafted the trisaccharide characteristic of the antigen A
  • Glycorex Transplantation AB Glycorex Transplantation AB, Lund, Sweden
  • AUotran A trisaccharide characteristic of FF Sepharose-grafted polyadrylamide, Lectinity Corp
  • substrates grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins which may be used in the context of the invention are the following: Glycosorb ABO B (Sepharose matrix on which is grafted the trisaccharide characteristic of antigen B, Glycorex Transplantation AB, Lund, Sweden), AUotran B (trisaccharide characteristic of B-grafted Sepharose FF by polyacrylamide, Lectinity Corp), HyperCel IsoB (crosslinked cellulose particles grafted with the trisaccharide characteristic of B antigen , Pall).
  • Glycosorb ABO B Sepharose matrix on which is grafted the trisaccharide characteristic of antigen B, Glycorex Transplantation AB, Lund, Sweden
  • AUotran B trisaccharide characteristic of B-grafted Sepharose FF by polyacrylamide, Lectinity Corp
  • HyperCel IsoB crosslinked cellulose particles grafted with the tri
  • a substrate ligated with a specific ligand of anti-A polyclonal human immunoglobulins and with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins a mixture of a polyclonal human immunoglobulin-specific ligand-specific support will generally be used.
  • anti-A as described above and a specific ligand-grafted anti-B polyclonal human immunoglobulin support as described above.
  • particles grafted with the ligand (s) of interest when particles grafted with the ligand (s) of interest are used, it is possible to use a mixture of particles grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and particles grafted with a ligand specific for anti-human polyclonal immunoglobulins. -B to prepare a gel and fill an affinity chromatography column. It is also possible to use one of the particles grafted with both a polyclonal anti-A human immunoglobulin specific ligand and with a specific anti-B polyclonal human immunoglobulin specific ligand to prepare a gel and fill an affinity chromatography column. In another embodiment, it is also possible to use a mixture:
  • Particles grafted at the same time by a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and by a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins and Particles grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins and / or particles grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • the batch of human plasma or the fraction of human plasma enriched with polyclonal human immunoglobulins is adsorbed in step a) on the chromatography column under any condition appropriate known to those skilled in the art, including any condition recommended by the manufacturer of the chromatography medium, depending on the support chosen.
  • Percolation of the batch of human plasma or the fraction of human plasma enriched in polyclonal human immunoglobulins on the column may in particular be implemented.
  • the unadsorbed fraction is advantageously recovered for other subsequent uses.
  • the adsorbed fraction is then dissociated and recovered using one or more washes of the column with one or more appropriate elution buffers.
  • An acidic elution buffer for example a glycine-HCl buffer, pH between 2 and 4 and / or a basic elution buffer (for example a glycine-NaOH solution, pH between 10 and 12) may in particular be used.
  • the composition thus obtained may, in addition, be subjected to one or more subsequent optional steps, such as: a step of neutralization of the composition (pH adjustment between 3 and 9, preferably between 4 and 5, one or more additional purification steps, a concentration step (for example by ultrafiltration), at least one inactivation step (solvent-detergent treatment for example) or viral elimination (nanofiltration for example), or a combination of several of these steps.
  • the method according to the invention as described above makes it possible to obtain a composition of polyclonal human immunoglobulins recognizing, for at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, advantageously at least 85% at least 86%, at least 87%, more preferably at least 88%, at least 89%, even more preferably at least 90%, at least 91%, at least 92% at least 93%, at least at least 96%, or at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition of the blood group A and B antigens.
  • step a) When the support used in step a) is grafted solely by a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins, anti-A polyclonal human immunoglobulins are retained, and the composition obtained then comprises anti-A polyclonal human immunoglobulins.
  • step a) when the support used in step a) is grafted solely by a specific ligand of anti-B polyclonal human immunoglobulins, the Anti-B polyclonal human immunoglobulins are retained, and the composition obtained then comprises anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • the purified composition then comprises a mixture of human immunoglobulins.
  • polyclonal anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins In polyclonal human immunoglobulins purified from plasma pools, the proportion of polyclonal human anti-A immunoglobulins and anti-B polyclonal human immunoglobulins depend on the initial donor population. In fact, differences in the percentage of distribution of the different blood groups exist according to the donor populations.
  • the method advantageously comprises the following steps:
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins, and
  • Steps a) to c) are identical to those described above for the preparation of a composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are polyclonal human anti-A immunoglobulins. and / or anti-B.
  • the conditions of adsorption, storage of the unadsorbed fraction and dissociation and harvest of the adsorbed fraction may be similar to those described above.
  • Steps d) and e) are aimed at specifically isolating polyclonal human anti-A immunoglobulins.
  • a substrate ligated with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins is used so that all the anti-B polyclonal human immunoglobulins are adsorbed onto the support.
  • Anti-A polyclonal human immunoglobulins can thus be recovered directly (step e)), leading to the production of a composition specifically enriched in anti-A polyclonal human immunoglobulins.
  • the conditions of step d) are adapted to allow the adsorption on the support of all anti-B polyclonal human immunoglobulins, for example by adjusting the gel volume and / or the residence time.
  • the support used in step d) is an affinity chromatography column comprising as support a membrane or a particle gel grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins
  • the adsorption conditions may be similar to those described above for step a).
  • the unadsorbed fraction is then directly recovered in step e).
  • the method advantageously comprises the following steps:
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins, and
  • the method advantageously comprises the following steps:
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with an immunoglobulin specific ligand recognizing the antigens of the blood group A, and
  • Steps a) to c) are identical to those described above for the preparation of a composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are polyclonal human anti-A immunoglobulins. or anti-B.
  • the conditions for adsorption, storage of the unadsorbed fraction and dissociation and harvesting of the adsorbed fraction may be similar to those described above.
  • Steps (d) and (e) are aimed at specifically isolating anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • a substrate ligated with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins is used so that all the anti-A polyclonal human immunoglobulins are adsorbed on the support.
  • Anti-B polyclonal human immunoglobulins can thus be recovered directly (step e)), resulting in a composition specifically enriched with anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • the conditions of step d) are adapted to allow the adsorption on the support of all anti-B polyclonal human immunoglobulins, for example by adjusting the gel volume and / or the residence time.
  • the support used in step d) is an affinity chromatography column comprising as support a membrane or a gel of particles grafted with a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins
  • the adsorption conditions may be similar to those described above for step a).
  • the unadsorbed fraction is then directly recovered in step e).
  • the method advantageously comprises the following steps:
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with a ligand specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins, and
  • the batch of human plasma or the fraction of human plasma enriched in polyclonal human immunoglobulins (fraction of pre-purified polyclonal human immunoglobulins) not adsorbed in step a) is used in a method of preparation of human polyvalent immunoglobulins.
  • This particular embodiment of the invention advantageously allows the preparation at a time
  • composition specifically enriched in anti - A polyclonal human immunoglobulins
  • composition specifically enriched with anti - B polyclonal human immunoglobulins.
  • the process for preparing a purified anti-A immunoglobulin composition therefore comprises the following steps: a) adsorption of a fraction of pre-purified polyclonal human immunoglobulins onto a support grafted with a specific ligand of anti-B polyclonal human immunoglobulins and by a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins,
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with an immunoglobulin specific ligand recognizing the antigens of the blood group B, and
  • the process for preparing a purified anti-A immunoglobulin composition thus comprises the following steps: a) adsorption of a pre-purified polyclonal human immunoglobulin fraction, in particular a fraction of human plasma enriched with polyclonal human immunoglobulins from an alkaline pH anion exchange chromatography, on a support ligated with a ligand specific for anti - B polyclonal human immunoglobulins and with a ligand specific for anti - A polyclonal human immunoglobulins,
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with an immunoglobulin specific ligand recognizing the antigens of the blood group B, and
  • the process for preparing a purified anti-B immunoglobulin composition therefore comprises the following steps: a) adsorption of a prepurified polyclonal human immunoglobulin fraction on a grafted support by a specific ligand of anti-B polyclonal human immunoglobulins and by a ligand specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins,
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with an immunoglobulin specific ligand recognizing the antigens of the blood group A, and
  • the process for preparing a purified anti-B immunoglobulin composition therefore comprises the following steps: a) adsorption of a pre-purified polyclonal human immunoglobulin fraction, in particular a fraction of human plasma enriched with polyclonal human immunoglobulins from an alkaline pH anion exchange chromatography, on a support ligated with a ligand specific for anti - B polyclonal human immunoglobulins and with a ligand specific for anti - A polyclonal human immunoglobulins, b) recovering the non-adsorbed fraction for use in a process for purifying a polyvalent human immunoglobulin concentrate depleted in anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins,
  • step c) adsorbing the composition obtained in step c) on a substrate grafted with an immunoglobulin specific ligand recognizing the antigens of the blood group A, and
  • the process for preparing a purified anti-A immunoglobulin composition and a purified anti-B immunoglobulin composition thus comprises the following steps:
  • step c) adsorption of a part of the composition obtained in step c) on a substrate grafted with an immunoglobulin specific ligand recognizing the antigens of blood group B, and harvesting of the non-adsorbed fraction enriched in anti-A
  • step c) adsorption of the other part of the composition obtained in step c) on a substrate grafted with a ligand specific for immunoglobulins recognizing antigens of blood group A, and harvesting of the non-adsorbed fraction enriched in anti-B.
  • This particularly advantageous embodiment makes it possible to optimize the retained and non-retained fractions of the affinity chromatography using ligands specific for anti-B polyclonal human immunoglobulins and ligands specific for anti-A polyclonal human immunoglobulins.
  • the supports and ligands used in steps a) and d) and / or e) can be selected from those described above. above for the general process for the preparation of a composition enriched in anti-A and anti-B immunoglobulins.
  • the invention further relates to a composition obtainable by one of the preparation methods according to the invention as described above.
  • compositions according to the invention are particularly useful for the preparation of a positive control (below-limit positive control, limiting positive control or positive control greater than the limit) useful in a method for assaying anti-A activity and or anti-B of a concentrate of normal human immunoglobulins, which does not have the disadvantages of the positive control and / or the positive limit control available to date (fractions 07/306 and 07/310), that is, that is to say, which comprises human and polyclonal and non-murine and monoclonal anti-A and / or anti-B immunoglobulins and which can be prepared in sufficient amounts.
  • a positive control below-limit positive control, limiting positive control or positive control greater than the limit
  • a concentrate of normal human immunoglobulins which does not have the disadvantages of the positive control and / or the positive limit control available to date (fractions 07/306 and 07/310), that is, that is to say, which comprises human and polyclonal and non-murine and monoclonal anti-A and / or anti
  • the present invention relates to the use of a composition according to the invention as a positive control in a method for assaying the anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising immunoglobulins. polyclonal human.
  • the invention also relates to the use of a composition according to the invention for the preparation of a positive control (sub-limit positive control, limiting positive control or positive control greater than the limit) intended to be used in a method assay for the anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins.
  • a positive control sub-limit positive control, limiting positive control or positive control greater than the limit
  • the invention also relates to a method for preparing a positive control for use in a method for assaying the anti-A and / or anti-B activity of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, comprising the following steps :
  • composition comprising polyclonal human immunoglobulins having anti-A activity and anti-B activity below a given limit value in said assay method, and
  • the invention also relates to a method for preparing a positive control (below-limit positive control, limiting positive control, or positive control above the limit) for use in a method for assaying anti-A activity. and / or anti-B of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, comprising the following steps:
  • composition comprising polyclonal human immunoglobulins having anti-A activity and anti-B activity below a given limit value in said assay method
  • composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are polyclonal human anti-A immunoglobulins and / or composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are anti-B polyclonal human immunoglobulins, to obtain different compositions enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins,
  • step b) the assay by said assay method of the anti-A and / or anti-B activity of the compositions enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins obtained in step b), and
  • composition enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins having anti-A and / or anti-B activity in said lower assay method to obtain a positive control below the limit
  • equal to obtain a limit positive control
  • greater to obtain a positive control greater than the limit
  • a positive control (below-limit positive control, limiting positive control, or positive control above the limit) may be prepared by the above method for any method of assay for anti-A and / or anti-B activity. of interest, and for any limit value of interest.
  • a positive control (below-limit positive control, limiting positive control, or positive control above the limit) may be prepared by the above method for either of the methods of assaying the activity.
  • anti-A and / or anti-B which are generally used:
  • TIA indirect antiglobulin test
  • TIA indirect Coombs test
  • Detection of the agglutination of red blood cells in the presence of anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins can be made by various methods, more or less precise.
  • agglutination is read visually by detecting the presence of a precipitate.
  • the TIA test is the old test recommended by the health authorities for the determination of the anti-A and / or anti-B activity of normal human immunoglobulin therapeutic concentrates.
  • papain treated A or B red blood cells are contacted with serial half dilutions of an immunoglobulin solution.
  • 5% normal human (50 g / l) in a microtiter plate with V wells. After centrifugation, the plate is tilted at an angle of about 70 ° for about 4-5 minutes.
  • the cell pellet remains stuck to the bottom of the V-well, forming a well rounded point. Otherwise, the non-agglutinated pellet slides along the V-well wall, thereby creating a droplet-like shape.
  • the direct agglutination method is the new test recommended by the health authorities for the determination of the anti-A and / or anti-B activity of normal human immunoglobulin therapeutic concentrates.
  • a cytometry test uses an F (ab ') 2 labeled with a fluorescent marker.
  • the limit value for which the limiting positive control is prepared may be any limit value of anti-A and / or anti-B activity of interest. In particular, this may be the maximum value of anti-A and / or anti-B activity accepted by health authorities in a country or region of the world.
  • this limit value can therefore be chosen advantageous.
  • this limit value is subject to change by the health authorities depending on the monitoring of haemolysis accidents that may occur in the future on the basis of therapeutic concentrates meeting this limit value.
  • the method described above can then be implemented again to prepare a new limit positive control, adapted to the new limit set by the health authorities.
  • a range of sub-limit positive controls with increasing anti-A and / or anti-B activity but below the limit set by health authorities could help establish whether a therapeutic concentrate is close to the limit. the maximum limit accepted by health authorities or well below this limit.
  • a range of positive controls above the limit with increasing anti-A and / or anti-B activities but all above the limit set by the health authorities could establish whether a therapeutic concentrate is close the maximum limit accepted by the health authorities or well above this limit.
  • a composition comprising polyclonal human immunoglobulins having anti-A activity and anti-B activity below a given limit value in said assay method (starting composition) is provided, to which increasing amounts of a composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are anti-A polyclonal human immunoglobulins and / or a composition according to the invention.
  • step b) in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are anti-B polyclonal human immunoglobulins are added in step b) to obtain different compositions enriched in polyclonal human anti-A immunoglobulins and / or anti-B.
  • the starting composition may be free of anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins (for example by appropriate selection of the plasma donors used), or may comprise anti-A and / or anti-human polyclonal immunoglobulins.
  • B provided that its anti-A activity and its anti-B activity is lower than the limit value chosen in the chosen assay method.
  • such a starting composition can in particular be a composition of polyclonal human immunoglobulins purified and depleted in anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins, obtained for example as described in WO2007 / 077365.
  • this starting composition preferably has an immunoglobulin concentration equal to or greater than that recommended in the test for anti-A and anti-B activity required by the health authorities (50 g / L, ie 5% at this level). day).
  • step b) increasing amounts of a composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are polyclonal human immunoglobulins anti-A and / or d a composition according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition according to the invention are anti-B polyclonal human immunoglobulins are added to obtain different compositions enriched to a greater or lesser extent with immunoglobulins polyclonal human anti-A and / or anti-B.
  • step c) the anti-A and / or anti-B activity of the compositions enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins obtained in step b) is tested by the chosen assay method. initially.
  • the composition enriched in anti-A and / or anti-B polyclonal human immunoglobulins having anti-A and / or anti-B activity is selected in said lower assay method (to obtain a control positive lower than the limit), equal (to obtain a limit positive control), or greater (to obtain a positive control greater than the limit) to the limit value initially chosen.
  • steps a) to c) may be implemented again until the composition having an anti-A and / or anti-B activity greater than the limit value initially selected is obtained.
  • the steps a) c) can be implemented again until the composition having an anti-A and / or anti-B activity lower than the initially chosen limit value is obtained.
  • steps a) to c) can be carried out. again until the composition having anti-A and / or anti-B activity is equal to the initially chosen limit value is obtained.
  • compositions tested in step c) have a lower anti-A and / or anti-B activity, equal to or greater than the limit value initially chosen, those skilled in the art will be able to adapt the amounts of composition according to the invention to be added in step b) so as to be able to select the positive control of interest.
  • the invention further relates to a positive control (sub-limit positive control, limiting positive control, or positive control greater than the limit) for use in a method for assaying for anti-A and / or anti- B of a composition comprising polyclonal human immunoglobulins, obtainable by the method according to the invention for the preparation of a positive control (below - limit positive control, limit positive control, or positive control above the limit) described above.
  • a positive control sub-limit positive control, limiting positive control, or positive control greater than the limit
  • compositions according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are polyclonal human anti-A immunoglobulins may further be used in a blood group test of a subject.
  • compositions according to the invention in which at least 80% by weight of the polyclonal human immunoglobulins present in the composition are anti-B polyclonal human immunoglobulins may further be used in a test for determination of the blood group of a subject .
  • the compositions according to the invention are then brought into contact with the red blood cells of a subject whose blood group is to be determined, and the blood group is determined as follows:
  • composition comprising at least 80% of anti-A polyclonal human immunoglobulins, but not by the composition comprising at least
  • composition comprising at least 80% of anti-B polyclonal human immunoglobulins but not by the composition comprising at least 80% of anti-A polyclonal human immunoglobulins: the patient is in a group
  • the patient is of group AB, no agglutination by any of the two compositions: the patient is of group O.
  • compositions according to the invention will advantageously be supplemented by a search for specific antibodies in the serum of the patient.
  • EXAMPLE 1 Preparation of a polyclonal human immunoglobulin composition, enriched with anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins A first composition of polyclonal human immunoglobulins according to the invention, enriched with anti-A and anti-polyclonal human immunoglobulins B has been prepared.
  • a purified polyclonal human immunoglobulin composition was prepared from a plasma pool according to the method described in WO02 / 092632.
  • This purified polyclonal human immunoglobulin composition was then adsorbed onto a gel-filled 1 mL affinity chromatography column comprising a mixture of porous crosslinked cellulose beads grafted with the trisaccharide characteristic of group A antigens (column A). and porous crosslinked cellulose beads grafted with the trisaccharide characteristic of group B antigens (column B), in proportions of 50/50 respectively.
  • a gel-filled 1 mL affinity chromatography column comprising a mixture of porous crosslinked cellulose beads grafted with the trisaccharide characteristic of group A antigens (column A). and porous crosslinked cellulose beads grafted with the trisaccharide characteristic of group B antigens (column B), in proportions of 50/50 respectively.
  • the unadsorbed fraction is recovered for further processing to prepare a polyclonal human immunoglobulin therapeutic concentrate free of anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • fraction of interest in the context of the present invention is then obtained by assembling two elution fractions:
  • composition was then analyzed by the usual technologies to determine the concentration of IgG, IgA and IgM, the levels of polymers, dimers, monomers and immunoglobulin fragments.
  • the anti-A and anti-B activity of the composition was also analyzed by the method described in WO2007 / 077365 and compared to that of a freeze-dried normal human immunoglobulin.
  • IgG 9.20 g / L (Subclasses: IgG1: 65%, IgG2: 30%, IgG3: 3%, IgG4: 2%)
  • the anti-A activity and the anti-B activity are expressed in arbitrary units relative to a freeze-dried normal human immunoglobulin, a product considered as a reference set of 1.
  • Normal human immunoglobulin lyophilized is a product human normal immunoglobulins, having a marketing authorization in France.
  • the freeze-dried normal human immunoglobulin therefore has for the anti-A and anti-B a negative result in the Coombs direct test at 1/64 dilution as required by the regulatory authorities.
  • composition obtained by the process according to the invention has an anti-A activity and an anti-B activity approximately 600 times greater than the polyvalent normal human immunoglobulins of lyophilized normal human immunoglobulin (therapeutic concentrate of polyclonal human immunoglobulins). ).
  • Example 2 Preparation of polyclonal human immunoglobulin compositions, enriched with anti-A polyclonal human immunoglobulins or anti-B polyclonal human immunoglobulins The inventors then sought to separate polyclonal human anti-A immunoglobulins from anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • Example 1 In order to separate anti-A polyclonal human immunoglobulins from anti-B polyclonal human immunoglobulins, two aliquots of the composition obtained in Example 1 were subjected to two distinct treatments: In order to obtain a purified composition of human immunoglobulins purified polyclonal anti-A, a 1 aliquot was adsorbed pay over a 1 ml_ affinity chromatography column filled with a gel of crosslinked porous cellulose beads grafted with the characteristic trisaccharide Group B antigens (column 1). The charge was 1.2 mg of polyclonal human anti-A and anti-B immunoglobulin purified per ml of gel. The contact time was set at 2 minutes.
  • the unadsorbed fraction was recovered for further analysis.
  • the unadsorbed fraction was recovered for further analysis.
  • the passage of the composition obtained in Example 1 on column 1 makes it possible to obtain a purified composition of anti-A immunoglobulins by harvesting the unadsorbed fraction.
  • the results shown in Table 3 show that all anti-A immunoglobulins are adsorbed on column 2, with no anti-A activity being detected in the unadsorbed fraction. It has only a very strong anti-B activity. Indeed, with respect to the anti-B activity of 638.7 AU of the composition obtained in Example 1, the non-adsorbed fraction on column 2 has an anti-B activity of 4248 AU, or about 6.7 more than the composition obtained in Example 1.
  • the passage of the composition obtained in Example 1 on column 2 (grafted with the trisaccharide characteristic of antigens A) makes it possible to obtain a purified composition of anti-B immunoglobulin by harvesting the unadsorbed fraction.
  • the purified composition of anti-A immunoglobulin is obtained by harvesting the unadsorbed fraction on a column carrying the trisaccharide characteristic of the B antigens.
  • the operating conditions are optimized so that all the anti-B immunoglobulins bind to an anti-B immunoglobulin. trisaccharide carrier column characteristic of B antigens.
  • the purified composition of anti-B immunoglobulin is obtained by harvesting the unadsorbed fraction at a column carrying the trisaccharide characteristic of the antigens A.
  • the operating conditions are optimized so that all the anti-A immunoglobulins are bind to a column carrying the trisaccharide characteristic of antigens A.
  • the purified compositions of anti-A immunoglobulin and / or anti-B immunoglobulin can be used as a positive control in a method for assaying the anti-A and / or anti-B activity of an immunoglobulin composition.
  • polyclonal human polyclonal human.
  • Example 3 Characterization of polyclonal human immunoglobulin compositions, enriched in anti-A polyclonal human immunoglobulins or anti-B polyclonal human immunoglobulins, obtained in Example 2
  • composition of human immunoglobulin polyclonal anti-A and anti-B obtained by eluting the adsorbed fraction with a 1 st chromatographic step in Example 1 was concentrated by ultrafiltration on a membrane PELLICON 2, 30kDa, 0, 1 m 2 (Merck Millipore®).
  • Anti-A polyclonal human immunoglobulin compositions or anti-B polyclonal human immunoglobulins were concentrated by ultrafiltration at using a 50 cm 2 PELLICON XL Biomax membrane, 30kDa (Merck Millipore®) and then reconcentrated 10 times by centrifugation on Amicon Ultra, Ultracel membrane (Merck Millipore®).
  • the compositions are then characterized more finely with regard to the distribution of the various IgG subclasses, the IgG integrity (percentages of monomers, dimers, polymers, and fragments), and their activity with respect to group red blood cells.
  • blood O (not carrying A antigens or B antigens), blood group A red blood cells (antigen A carriers, but no B antigens), and blood group B red blood cells (antigen carriers B, but no antigens A).
  • IglV intravenously
  • IgG subclasses The distribution of IgG subclasses was measured by three distinct methods: nephelemetry, mass spectrography, and electroluminescence (MSD).
  • Nephelemetry The principle of nephelometric assay is based on the fluid phase reaction of an antigen with a specific antibody.
  • the insoluble antibody-antigen complex formed causes turbidity, which is measured by a nephelometric technique, the principle of which is as follows: when a light beam passes through a turbid medium, part of the light is deviated from its trajectory (phenomenon of diffusion).
  • the measurement by means of a photoreceptor of the light scattered at a certain angle with respect to the incident beam makes it possible to quantify the disorder by an electrical signal.
  • the relationship between the antigen concentration and the electrical signal obtained for a constant antibody concentration is described by the HEIDELBERGER-KENDALL curve.
  • the measurement domain is located in the ascending part of the curve corresponding to an excess of antibody.
  • Nephelometric measurements were performed with a BNII nephelometer (SIEMENS) with Software Version 2.5 / F.
  • Enzymatic proteolysis and glycolysis were obtained by incubating 10 ⁇ l of the sample at a concentration of 10 mg / ml in phosphate buffered saline at 100 ⁇ l of Ides and 100 ⁇ l of IgGZero enzymes for 1 hour at 37 ° C.
  • the reduction of the digested IgGs was carried out by adding 35 ⁇ l of denaturation buffer (8M guanidine-HCl, 0.1M Tris-HCl, pH 7.5) and 5 ⁇ l of a 200 mM solution of DTT. The preparation was incubated at 50 ° C for 30 minutes.
  • the separation of the Fc / 2 fragments was performed on an Acquity system (Waters, Milford, MA, USA) coupled to a UV detector and an electrospray mass spectrometer (Synapt G2S, Waters, Milford, MA, USA). About 20 ⁇ g of the sample was injected onto a Pursuit diphenyl column 150 mm ⁇ 2.0 mm (Agilent, Santa Clara, Calif., USA) equilibrated at 70 ° C. and operating at a flow rate of 200 ⁇ / min. .
  • Electroluminescence detection uses markers that emit light when electrochemically stimulated. Background noise is minimal because the pacing mechanism (electricity) is decoupled from the signal (light). The markers are stable, non-radioactive and emit light at -620 nm, eliminating quenching problems. Few compounds interfere with electroluminescent markers. Multiple excitation cycles of each marker amplify the light signal level and increase the sensitivity.
  • Meso Scale Discovery (MSD) technology was used, following the manufacturer's recommendations. This technology relies on the use of microplates with carbon electrodes integrated at the bottom of the wells.
  • IgG Integrity Quantification of polymeric, dimeric, monomeric forms and possible IgG degradation products (fragments) were measured by two distinct methods: SDS-PAGE and High Performance Protein Exclusion Chromatography (HPSEC).
  • SDS-PAGE The samples were analyzed by SDS-PAGE gel electrophoretic migration in a MULTIPHOR (GE) system. 2 ⁇ g of sample are added to 3 ⁇ of 250 mM Tris buffer, pH 7.5, 5% SDS (+1.5 ⁇ NuPAGE Reducing Agent (10x) reductant - Invitrogen Ref NP0004 for reducing conditions). After stirring, the sample is heated at 95 ° C for 3 minutes just prior to deposition on ExcelGel SDS Homogeneous 12.5% gel. The following migration method is used:
  • the gel is contacted with the staining solution (50% methanol, 7% acetic acid, 0.1% CBB) with stirring for 30 minutes. min, then with the decolorization solution 1 (50% methanol, 7% acetic acid) with stirring for 5 min, then the decolorization solution 2 (5% methanol, 7% acetic acid) with stirring until a clear background is obtained and homogeneous.
  • the staining solution 50% methanol, 7% acetic acid, 0.1% CBB
  • the decolorization solution 1 50% methanol, 7% acetic acid
  • the decolorization solution 2 5% methanol, 7% acetic acid
  • the gel is contacted for 30 minutes with the fixing solution (250 ml of 40% ethanol, 10% acetic acid in PPI water), with moderate stirring on a stirrer. then for 30 minutes with the sensitizing solution (75 ml of absolute ethanol + 17 g of sodium acetate + 10 ml of sodium thiosulphate, qs 250 ml of PPI + 1 water, 25 ml of extemporaneous glutardialdehyde) with stirring , before being rinsed 3 x 5 min in PPI water.
  • the fixing solution 250 ml of 40% ethanol, 10% acetic acid in PPI water
  • the sensitizing solution 75 ml of absolute ethanol + 17 g of sodium acetate + 10 ml of sodium thiosulphate, qs 250 ml of PPI + 1 water, 25 ml of extemporaneous glutardialdehyde
  • the gel is then brought into contact for 20 min with the AgNO 3 solution (10% AgNO 3 in 250 ml + 100 ⁇ l of extemporaneous formaldehyde) with stirring, before being rinsed for 2 x 1 min in PPI water.
  • the gel is then brought into contact with the developing solution (6.25 g of sodium carbonate in 250 ml of PPI water + 50 ⁇ l of extemporaneous formaldehyde), and the coloration is allowed to develop (2 to 5 min maximum). with stirring.
  • the development is stopped by removing the solution and putting the gel in contact with the EDTA solution (3.65 g of EDTA in 250 ml of PPI water) for 10 min minimum.
  • HPSEC This technique allows to separate proteins according to their molecular size.
  • a DIONEX Ultimate 3000 system with Superdex Tricorn 200 10/300 GL column (GE Healthcare Ref 17-5175-01) was used. The following analysis conditions were used:
  • the assay of the anti-A or anti-B activity on erythrocytes A, B or O was carried out by the cytometry test using a F (ab ') 2 labeled with a fluorescent marker, as described in FIG. Example 2 of the application WO2007 / 077365.
  • a suspension of erythrocytes at 40 ⁇ 10 6 red blood cells / ml is prepared in 1% PBS / BSA. 50 ⁇ l of this suspension is deposited in a 96-well round-bottomed microplate (2.10 6 red cells / well). Dilution ranges of standards (freeze-dried normal human immunoglobulin or reference Y0001688 of EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare)) are carried out. 50 ⁇ l of a standard dilution or a test sample are added to the 50 ⁇ of red blood cells in the microplate, which is covered with an adhesive film and incubated for 2 hours at 37 ° C. ⁇ 2 ° C. with shaking.
  • the activity is expressed in arbitrary units relative to the standard (reference Y0001688 of the EDQM or drug (freeze-dried normal human immunoglobulin)) reported in 1.
  • the results are shown in Table 4 below, and show that the anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins obtained in Example 1 after elution of the total polyclonal human immunoglobulin fraction adsorbed on a chromatography column.
  • the trisaccharide carrier affinity characteristic of Group A antigens and the trisaccharide characteristic of Group B antigens are enriched in IgG2 with respect to the composition of polyclonal human immunoglobulins depleted in anti-A and anti-B polyclonal human immunoglobulins.
  • anti-A polyclonal human immunoglobulin compositions or human immunoglobulins anti-B polyclonal fractions are characterized by lgG2 isotype enrichment.
  • composition of immunoglobulins Composition of immunoglobulins

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Abstract

La présente invention concerne une composition fortement enrichie en immunoglobulines polyclonales anti-A et/ou anti-B, comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, caractérisée en ce qu'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B. Elle concerne également un procédé de préparation d'une telle composition, ainsi que l'utilisation de la composition pour la préparation d'un témoin positif utile dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'un concentré d'immunoglobulines humaines normales, et l'utilisation de la composition pour la détermination du groupe sanguin d'un sujet.

Description

COMPOSITION ENRICHIE EN IMMUNOGLOBULINES POLYCLONALES ANTI-A
ET/OU ANTI-B
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine des produits de référence utilisés pour la caractérisation des concentrés thérapeutiques d 'immunoglobulines polyclonales. Elle concerne une composition fortement enrichie en immunoglobulines polyclonales anti-A et/ou anti-B, un procédé de préparation d 'une telle composition, ainsi que l'utilisation de la composition pour la préparation d 'un témoin positif utile dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'un concentré d'immunoglobulines humaines normales, et l'utilisation de la composition pour la détermination du groupe sanguin d 'un sujet. ART ANTERIEUR
Les immunoglobulines humaines normales (immunoglobulines humaines polyvalentes purifiées à partir de pools de plasma d'au moins 1000 donneurs) sont utilisées dans le traitement de pathologies de plus en plus nombreuses. Elles sont notamment utilisées comme traitement de substitution dans les déficits immunitaires primaires (déficits congénitaux) ou secondaires (leucémie lymphoïde chronique, myélome, infections après greffe de moelle osseuse, infections bactériennes récidivantes chez l'enfant infecté par le VI H) avec défaut de production d 'anticorps. Elles sont également utilisées en tant que traitement immunomodulateur dans différentes pathologies autoimmunes, telles que le purpura thrombopénique idiopathique (PTI ), la rétinochoroïdite de Birdshot, le syndrome de Guillain-Barré, la neuropathie motrice multifocale (NMM), les polyradiculonévrites inflammatoires démyélinisantes chroniques (PIDC), ou dans la maladie de Kawasaki.
Cette utilisation grandissante nécessite un approvisionnement toujours plus important en immunoglobulines humaines normales. Cela conduit à l'utilisation de pools toujours plus grands de donneurs. Une proportion non négligeable des donneurs est de groupe sanguin O, et leur plasma contient par conséquent des immunoglobulines anti-A et anti- B, dirigées contre les antigènes des groupes sanguins A et B. Par ailleurs, les donneurs de groupe sanguin A possèdent généralement des immunoglobulines anti-B et les donneurs de groupe sanguin B des immunoglobulines anti-A. Seuls les donneurs de groupe sanguin AB ne possèdent pas d'immunoglobulines anti-A et anti-B, mais ceux-ci sont peu nombreux.
Or, lorsque les immunoglobulines anti-A et anti-B sont présentes en proportions trop importantes dans les immunoglobulines humaines normales, celle-ci sont susceptibles de provoquer des hémolyses accidentelles, potentiellement sévères, chez les patients traités porteurs des antigènes A et/ou B.
Par conséquent, les autorités de santé requièrent que les immunoglobulines humaines normales soient testées vis-à-vis de l'activité d'agglutination des hématies des groupes sanguins A et B, et imposent des limites quant à cette activité. Ainsi, pendant longtemps, selon la pharmacopée européenne, les immunoglobulines humaines normales par voie intraveineuse (IVIG) ne devaient pas présenter d'agglutination des hématies A et B à la dilution 1 /64 d'une solution de concentration initiale de 30 g/l (soit 3%), dans un test indirect à l'antiglobuline (TIA, également appelé test de Coombs indirect).
Cependant, il a ensuite été montré que le test TIA possède une forte variabilité et est en outre susceptible de sous-estimer l'activité anti-A et anti-B des immunoglobulines humaines normales (Thorpe et al. Biologicals. 2005 Jun;33(2):111 -6). En effet, le test TIA repose sur l'utilisation d'une antiglobuline, c'est-à-dire d'immunoglobulines d'origine animale reconnaissant spécifiquement les immunoglobulines humaines. Or, la capacité de l'antiglobuline à agglutiner les hématies de groupe A ou B revêtues d'immunoglobulines anti-A ou anti-B est susceptible d'être saturée par la présence concomitante d'une forte concentration d'immunoglobulines humaines dirigées contre d'autres antigènes que ceux des groupes sanguins A et B. Afin de limiter cette variabilité, Thorpe et collaborateurs ont développé une méthode d'agglutination directe, sans utilisation d'antiglobuline, dans laquelle des hématies A ou B traitées à la papaïne sont mises en contact avec des dilutions au demi en série d'une solution d'immunoglobulines humaines normales à 5% (50 g/l), dans une microplaque avec des puits en V. Après centrifugation, la plaque est inclinée à un angle d'environ 70° pendant environ 4-5 minutes. En cas d'agglutination, le culot de cellules reste collé au fond du puits en V, formant un point bien rond. Dans le cas contraire, le culot de cellules non agglutiné glisse le long de la paroi du puits en V, générant ainsi une forme de type gouttelette (Thorpe et al. Biologicals. 2005 Jun;33(2):111 -6).
Bien que conduisant à des résultats moins variables que le test TIA, cette méthode manquait encore de témoins positifs et négatifs. Pour pallier ce manque, Thorpe et collaborateurs ont ensuite développé trois produits d'immunoglobulines humaines de référence, destinés à calibrer la méthode d'agglutination directe précédemment développée (Thorpe et al. Vox Sang. 2009 Aug;97(2): 160-8 ; Thorpe et al. Pharmeur Bio Sci Notes. 2010 Apr;2010(1 ):39-50 ; Document WHO/BS/08.2091 téléchargeable à l'adresse http://apps.who.int/iris/handle/10665/69970?locale=fr):
• un témoin négatif (fraction 07/308), constitué d'immunoglobulines humaines normales à 5% (50 g/l) purifiées à partir de plasma de donneurs tous de groupe sanguin AB, dont le plasma ne contient pas d'immunoglobulines anti-A et anti-B. • un témoin positif (fraction 07/306), constitué d 'immunoglobulines humaines normales à 5% (50 g/l) connues pour posséder une activité anti-A et anti-B supérieure à la moyenne des immunoglobulines humaines normales, mais ne produisant pas d'agglutination d'hématies A ou B à une dilution de 1 /64 dans la méthode d'agglutination directe précédemment développée.
• Un témoin positif limite (fraction 07/310), constitué de la fraction 07/306, à laquelle ont été ajoutés des quantités d'un anticorps monoclonal murin anti-A (BRIC 145) et d'un anticorps monoclonal murin anti-B (BGRL 1 ) telles que ce témoin produit une agglutination d'hématies A ou B pour une dilution d'au plus 1 /64 dans la méthode d'agglutination directe précédemment développée.
Les tests réalisés avec ces témoins ont montré que ceux-ci peuvent permettre de standardiser les tests d'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et anti-B, de vérifier que les tests utilisés sont suffisamment spécifiques et sensibles, et de faciliter l'identification des lots d'immunoglobulines humaines normales dont l'activité anti-A et anti-B excède celle tolérée par les autorités de santé.
Suite à ces travaux, les trois témoins mentionnés ci-dessus ont été adoptés comme réactifs de référence par la pharmacopée européenne, par l'organisation mondiale de la santé (OMS) et par la Food and Drug Administration (FDA), et la limite d'activité anti-A et anti-B des IVIG dans la pharmacopée européenne a été revue : les IVIG doivent désormais ne pas présenter d'agglutination des hématies A et B à la dilution 1 /64 d'une solution de concentration initiale de 50 g/l (5%), dans un test d'agglutination directe particulier correspondant à celui développé par Thorpe et collaborateurs (Pharmacopée européenne, chapitre 2.6.20 tel que révisé par le supplément 7.2 de janvier 2011 ). Cependant, les témoins positifs mentionnés ci-dessus ont leurs inconvénients, et en particulier le témoin positif limite, censé posséder une activité anti-A et anti-B correspondant à la limite acceptée par les autorités de santé. En effet, comme indiqué par Thorpe et collaborateurs, un des principaux défauts de ce témoin positif limite est sa disponibilité limitée. Notamment, du fait de sa disponibilité insuffisante, l'utilisation de ce produit n'est à ce jour recommandée que pour vérifier l'activité anti-A et anti-B des concentrés d'immunoglobulines humaines normales possédant une activité anti-A anti-B supérieure à celle de la fraction 07/306 (témoin positif, IVIG à 5% avec une activité anti-A et anti-B supérieure à la moyenne mais inférieure aux limites fixées par les autorités de santé) (Thorpe et al. Vox Sang. 2009 Aug;97(2): 160-8 ; Thorpe et al. Pharmeur Bio Sci Notes. 2010 Apr;2010(1 ):39-50). Ainsi, la disponibilité limitée du seul témoin positif limite existant à ce jour ne permet pas son utilisation systématique dans les tests d'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et anti-B des concentrés d'immunoglobulines humaines normales.
De plus, les immunoglobulines anti-A et anti-B présentes dans ce témoin positif limite sont d'origine murine et non humaine, et sont en outre monoclonales et non polyclonales, contrairement aux immunoglobulines anti-A et anti-B présentes dans les concentrés d'immunoglobulines humaines normales. Ces deux différences peuvent conduire à sous-estimer ou surestimer l'activité anti-A et anti-B d'immunoglobulines humaines normales, ce qui n'est pas souhaitable dans les deux cas.
Il existe donc un besoin pour de nouveaux témoins positifs permettant de calibrer les tests d'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et anti-B et de détecter de façon fiable les lots d'immunoglobulines humaines normales ayant une activité anti-A et anti- B supérieure aux limites acceptées par les autorités de santé.
Dans le but d'éviter les hémolyses accidentelles sans réduire les pools de donneurs susceptibles d'être utilisés, les fractionneurs de plasma ont développé des procédés pour éliminer les immunoglobulines anti-A et anti-B de leurs concentrés d'immunoglobulines humaines normales.
Ainsi, WO01 /27623 et WO2007/077365 décrivent l'utilisation de différents supports de chromatographie d'affinité se liant spécifiquement aux immunoglobulines anti-A et anti- B pour éliminer les immunoglobulines anti-A et anti-B de compositions biologiques, notamment de concentrés d'immunoglobulines humaines normales. La fraction non adsorbée ne comprenant pas d'immunoglobulines anti-A et anti-B est récupérée par percolation, pour traitement et conditionnement ultérieur. La colonne de chromatographie d'affinité anti-A anti-B est ensuite régénérée par des lavages qui sont éliminés. La fraction d'immunoglobulines anti-A et anti-B adsorbée lors de l'étape de chromatographie d'affinité correspond donc aujourd'hui à une fraction perdue.
RESUME DE L'INVENTION
Or, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en évidence que la fraction d'immunoglobulines polyclonales anti-A et anti-B adsorbée sur la colonne de chromatographie d'affinité visant à éliminer les immunoglobulines anti-A et anti-B, et obtenue par assemblage de deux fractions de lavage de la colonne, peut être utilisée pour préparer un nouveau témoin positif utile pour calibrer les tests d'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et anti-B et pour détecter de façon fiable les lots d'immunoglobulines humaines normales ayant une activité anti-A et anti-B supérieure aux limites acceptées par les autorités de santé. Ce nouveau témoin positif a l'avantage d'être constitué des mêmes immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B que celles susceptibles d'être présentes en quantité variable dans les concentrés d'immunoglobulines humaines normales. De plus, au vu de la quantité grandissante d'immunoglobulines humaines normales produites chaque année, ce nouveau témoin positif pourrait être produit dans des quantités suffisantes pour permettre son utilisation systématique comme témoin positif limite dans tous les tests d'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et anti-B des concentrés d'immunoglobulines humaines normales. Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, caractérisée en ce qu'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B. Avantageusement, les immunoglobulines humaines polyclonales représentent au moins 85% en poids des protéines totales de la composition.
Dans un mode de réalisation avantageux, au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A. Dans un autre mode de réalisation avantageux, au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, la composition comprend à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et le rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) est compris entre 1 /10 et 10/1 .
Dans un mode de réalisation, la composition comprenant à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, et possède donc un rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) compris entre 2/1 et 10/1 .
Dans un autre mode de réalisation, la composition comprenant à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et possède donc un rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) compris entre 1 /10 et 1 /2.
Dans un autre mode de réalisation, la composition comprenant à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est équilibrée dans les deux types d 'immunoglobulines, et possède donc un rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) compris entre 3/10 et 7/10, avantageusement entre 4/1 0 et 6/10. L'invention concerne également un procédé de préparation d 'une composition selon l'invention, comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle, et
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
Lorsqu 'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
Lorsqu 'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A est avantageusement choisi parmi les oligosaccharides représentatifs des antigènes du groupe A de type 1 , 2, 3 et 4.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est avantageusement choisi parmi les oligosaccharides représentatifs des antigènes du groupe B de type 1 , 2, 3 et 4.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le support utilisé à l'étape a) et/ou à l'étape d) se présente avantageusement sous la forme :
a) de particules (notamment de particules de polymère) greffées par le ou les ligands d 'intérêt, ou
b) d'une membrane polymérique, la membrane étant greffée par le ou les ligands d 'intérêt. Les particules sont avantageusement incorporées dans un gel ou une résine, qui est utilisé comme matrice d 'une colonne de chromatographie d 'affinité. De même, la membrane polymérique peut être incluse dans une colonne de chromatographie d 'affinité. Le lot de plasma humain ou la fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sont alors adsorbés sur la colonne de chromatographie d 'affinité, et la fraction adsorbée est éluée et récupérée.
Le polymère des particules ou de la membrane est avantageusement choisi parmi la cellulose et ses dérivés, l'agarose, le dextran, les polyacrylates, le polystyrène, le polyacrylamide, le polyméthacrylamide, les copolymères de styrène et divinylbenzène, ou les mélanges de ces polymères.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le ligand d 'intérêt est avantageusement greffé sur les particules de polymères ou sur la membrane polymérique par l'intermédiaire d 'un espaceur.
L'invention concerne en outre une composition susceptible d 'être obtenue par un procédé de préparation selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention comme témoin positif dans une méthode de dosage de l'activité anti-A ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales.
L'invention concerne également l'utilisation d 'une composition selon l'invention pour la préparation d'un témoin positif et/ou d 'un témoin positif limite destinés à être utilisés dans une méthode de dosage de l'activité anti-A ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales.
L'invention concerne également un procédé de préparation d 'un témoin positif destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, comprenant les étapes suivantes :
a) la fourniture d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales possédant une activité anti-A et/ou une activité anti-B inférieures à une valeur limite donnée dans ladite méthode de dosage, et
b) l'ajout d 'une composition selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé de préparation d 'un témoin positif inférieur à la limite, d 'un témoin positif limite ou d'un témoin positif supérieur à la limite, destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, comprenant les étapes suivantes :
a) la fourniture d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales possédant une activité anti-A et une activité anti-B inférieures à une valeur limite donnée dans ladite méthode de dosage,
b) l'ajout de quantités croissantes d 'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti- A et/ou d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, pour obtenir différentes compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B,
c) le dosage par ladite méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B des compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti- B obtenues à l'étape b), et
d) la sélection de la composition enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B ayant une activité anti-A et/ou anti-B dans ladite méthode de dosage inférieure (pour obtenir un témoin positif inférieur à la limite), égale (pour obtenir un témoin positif limite) ou supérieure (pour obtenir un témoin positif supérieur à la limite) à ladite valeur limite.
L'invention concerne en outre un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite, ou témoin positif supérieur à la limite) destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, susceptible d'être obtenu par l'un des procédés selon l'invention de préparation d'un témoin positif décrits ci-dessus.
L'invention concerne enfin l'utilisation d'une composition caractérisée en ce qu'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B ou d'une composition susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention dans un test de détermination du groupe sanguin d'un sujet.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en évidence que la fraction d'immunoglobulines polyclonales anti-A et/ou anti-B adsorbée sur la colonne de chromatographie d'affinité visant à éliminer les immunoglobulines anti-A et/ou anti-B peut être utilisée pour préparer un nouveau témoin positif utile pour calibrer les tests d'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et/ou anti-B et pour détecter de façon fiable les lots d'immunoglobulines humaines normales ayant une activité anti-A et/ou anti-B supérieure aux limites acceptées par les autorités de santé. Ce nouveau témoin positif a l'avantage d'être constitué des mêmes immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B que celles susceptibles d'être présentes en quantité variable dans les concentrés d'immunoglobulines humaines normales. De plus, au vu de la quantité grandissante d'immunoglobulines humaines normales produites chaque année, ce nouveau témoin positif pourrait être produit dans des quantités suffisantes pour permettre son utilisation systématique comme témoin positif limite dans tous les tests d 'agglutination pour les immunoglobulines anti-A et/ou anti-B des concentrés d 'immunoglobulines humaines normales.
Définitions Par « anticorps » ou « immunoglobuline », on entend une molécule comprenant au moins un domaine de liaison à un antigène donné et un domaine constant comprenant un fragment Fc capable de se lier aux récepteurs FcR.
Par « immunoglobulines humaines polyclonales », on entend une composition d 'immunoglobulines humaines dirigées contre de nombreux antigènes distincts, et comprenant, pour chaque antigène reconnu, une pluralité d 'immunoglobulines distinctes capables de reconnaître ledit antigène, généralement au niveau de plusieurs épitopes distincts. De telles immunoglobulines humaines polyclonales sont généralement purifiées à partir du plasma d 'un ou de préférence de plusieurs donneurs (on parle alors d 'un pool de donneurs). Les immunoglobulines humaines normales thérapeutiques sont ainsi purifiées à partir de pools de plasma de généralement au moins 1000 donneurs.
Par « immunoglobulines humaines polyclonales anti-A » ou « immunoglobulines anti-A », on entend des immunoglobulines humaines polyclonales reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A. Les « antigènes du groupe sanguin A » ou « antigènes A » sont caractérisés par la présence d 'un trisaccharide comprenant une N-acétylgalactosamine (abrégé dans la présente description en « GalNAc ») liée à un galactose (abrégé dans la présente description en « Gai »), lui-même lié à un fucose (abrégé dans la présente description en « Fuc »), selon la séquence suivante : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal.
Ce trisaccharide peut être lui-même attaché par son galactose central à d 'autres sucres, dont le nombre et l'assemblage varie en fonction du type d 'antigène A, comme indiqué dans le Tableau 1 ci-dessous pour les antigènes A de type 1 à 4, et de la présence ou l'absence ainsi que la nature d'un antigène de Lewis.
Tableau 1 . Structure de différents types d'antigène du groupe sanguin A.
GalNAc : N-acétylgalactosamine, Fuc : fucose, Gai : galactose, GlcNAc : N- acétylglucosamine, G le : glucose, R : support (oligosaccharide, glycoprotéine, glycolipide). Le trisaccharide déterminant du groupe A est indiqué en gras.
Par « immunoglobulines humaines polyclonales anti-B » ou « immunoglobulines anti-B », on entend des immunoglobulines humaines polyclonales reconnaissant les antigènes du groupe sanguin B. Les « antigènes du groupe sanguin B » ou « antigènes B » sont caractérisés par la présence d'un trisaccharide comprenant un premier galactose lié à un second galactose, lui-même lié à un fucose, selon la séquence suivante : Galal - 3(Fuca1 -2)Gal.
Ce trisaccharide peut être lui-même attaché par son galactose central à d'autres sucres, dont le nombre et l'assemblage varie en fonction du type d'antigène B, comme indiqué dans le Tableau 2 ci-dessous pour les antigènes B de type 1 à 4, et de la présence ou l'absence ainsi que la nature d'un antigène de Lewis.
Tableau 2. Structure de différents types d'antigène du groupe sanguin B.
GalNAc : N-acétylgalactosamine, Fuc : fucose, Gai : galactose, GlcNAc : N- acétylglucosamine, G le : glucose, R : support (oligosaccharide, glycoprotéine, glycolipide). Le trisaccharide déterminant du groupe B est indiqué en gras.
Par « fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales », on entend toute fraction du plasma humain susceptible d'être obtenue par fractionnement du plasma humain et dont le pourcentage en poids des immunoglobulines polyclonales par rapport aux protéines totales de la fraction, est supérieur à celui du plasma humain. De telles fractions sont avantageusement obtenues par fractionnement de pools de plasma d'au moins 1000 donneurs. Elles peuvent notamment inclure toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification et notamment, le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis ou non en suspension), les fractions I à V obtenues par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), le surnageant et le précipité obtenus après précipitation à l'acide caprylique et/ou au caprylate, les filtrats, ou toute fraction enrichie en immunoglobulines (éluats de chromatographies et/ou fractions non adsorbées) par séparation chromatographique, comme décrit notamment dans W099/64462 et WO02/092632, et plus particulièrement dans WO02/092632. Par « ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A », on entend une molécule se liant aux immunoglobulines humaines polyclonales anti-A telles que définies ci-dessus et ne se liant pas aux autres immunoglobulines. De tels ligands peuvent notamment être choisis parmi les oligosaccharides représentant les antigènes du groupe sanguin A. Par « oligosaccharide représentant les antigènes du groupe sanguin A », on entend tout oligosaccharide comprenant le trisaccharide caractéristique des antigènes du groupe sanguin A tel que défini ci-dessus : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal. Un tel oligosaccharide peut en outre comprendre d'autres sucres présents dans les antigènes du groupe sanguin A définis ci-dessus. Notamment, outre le trisaccharide GalNAcal - 3(Fuca1 -2)Gal, un tel oligosaccharide peut également être choisi parmi les tétrasaccharides, pentasaccharides et hexasaccharides dérivés des antigènes du groupe A de type 1 , 2, 3 ou 4 décrits ci-dessus et comprenant le trisaccharide caractéristique GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal :
• Tétrasaccharides :
o Type 1 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc,
o Type 2 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Galp1 -4GlcNAc,
o Type 3 ou 4 : GalNAcal -3(Fuca1-2)Gai i -3GalNAc
· Pentasaccharides :
o Type 1 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 2 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 3 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal,
o Type 4 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc p1 -3Gal,
· Hexasaccharides :
o Type 1 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc, o Type 2 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc, o Type 3 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc, o Type 4 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc p1 -3Gala1 -4Gal. L'oligosaccharide peut également comprendre des répétitions du trisaccharide caractéristique GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal, ou des tétrasaccharides, pentasaccharides et hexasaccharides dérivés des antigènes du groupe A de type 1 , 2, 3 ou 4 décrits ci- dessus.
Avantageusement, le ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A est le trisaccharide caractéristique GalNAcal -3(Fuca1 - 2)Gal.
Par « ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B », on entend une molécule se liant aux immunoglobulines humaines polyclonales anti-B telles que définies ci-dessus et ne se liant pas aux autres immunoglobulines. De tels ligands peuvent notamment être choisis parmi les oligosaccharides représentant les antigènes du groupe sanguin B. Par « oligosaccharide représentant les antigènes du groupe sanguin B », on entend tout oligosaccharide comprenant le trisaccharide caractéristique des antigènes du groupe sanguin B tel que défini ci-dessus : Galal -3(Fuca1 -2)Gal. Un tel oligosaccharide peut en outre comprendre d'autres sucres présents dans les antigènes du groupe sanguin B définis ci-dessus. Notamment, outre le trisaccharide Galal - 3(Fuca1 -2)Gal, un tel oligosaccharide peut également être choisi parmi les tétrasaccharides, pentasaccharides et hexasaccharides dérivés des antigènes du groupe B de type 1 , 2, 3 ou 4 décrits ci-dessus et comprenant le trisaccharide caractéristique Galal -3(Fuca1 -2)Gal :
• Tétrasaccharides : Type 1 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc,
Type 2 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -4GlcNAc,
Type 3 ou 4 : Gala1 -3(Fuca1-2)Galp1 -3GalNAc
Pentasaccharides :
o Type 1 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 2 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 3 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal,
o Type 4 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gai i -3GalNAc β1 -3Gal,
Hexasaccharides :
o Type 1 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc,
o Type 2 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc,
o Type 3 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc, o Type 4 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc p1 -3Gala1 -4Gal.
L'oligosaccharide peut également comprendre des répétitions du trisaccharide caractéristique Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal, ou des tétrasaccharides, pentasaccharides et hexasaccharides dérivés des antigènes du groupe B de type 1 , 2, 3 ou 4 décrits ci- dessus.
Avantageusement, le ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin B est le trisaccharide caractéristique Galal -3(Fuca1 -2)Gal.
Dans toute la présente description, une référence à « un » ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B inclut la possibilité d'utiliser soit un seul type de ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti- A ou anti-B (c'est-à-dire que tous les ligands greffés sur le support ont la même structure chimique), soit plusieurs types de ligands distincts (c'est-à-dire de structure chimique différente) spécifique(s) des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B. En revanche, il convient de comprendre que chaque ligand de structure chimique donnée susceptible d'être utilisé est nécessairement greffé plusieurs fois sur le support, de façon à ce que les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B puissent être retenues par le support. L'homme du métier sait quelle densité de ligand doit être utilisée pour permettre une adsorption optimale des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B sur le support.
Par « témoin positif » d'une méthode de dosage d'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, on entend une composition d 'immunoglobulines humaines polyclonales comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B.
Les autorités réglementaires requièrent que les compositions d 'immunoglobulines humaines normales aient une activité anti-A et une activité anti-B inférieure à une valeur limite, fixée à un temps donné, mais susceptible de varier au cours du temps et des modifications des exigences des autorités réglementaires. Pour une valeur limite donnée d'activité anti-A et/ou anti-B, l'expression « témoin positif » recouvre trois types de témoins positifs, appelés respectivement dans la présente description « témoin positif inférieur à la limite », « témoin positif limite », et « témoin positif supérieur à la limite », chacun de ces témoins positifs présentant un intérêt dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B.
Par « témoin positif inférieur à la limite » d'une méthode de dosage d'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, on entend un témoin positif comprenant une quantité d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B générant dans la méthode de dosage une valeur d'activité inférieure à une valeur limite prédéfinie. Une telle valeur limite peut notamment correspondre à la valeur maximale d'activité anti-A et/ou anti-B acceptée par les autorités de santé d'un pays pour les immunoglobulines humaines normales destinées à une administration chez l'homme par toute voie d'administration, notamment par voie intraveineuse ou intramusculaire ou sous-cutanée. De tels témoins positifs inférieurs à la limite sont utiles notamment pour vérifier que le dosage réalisé s'est déroulé de façon satisfaisante, un tel témoin devant systématiquement posséder une activité anti-A et/ou anti-B inférieure à la valeur limite choisie. Il peut également permettre d'établir si un concentré thérapeutique se trouve proche de la valeur limite maximale acceptée par les autorités de santé ou bien très en-dessous de cette limite. Par « témoin positif limite » d'une méthode de dosage d'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, on entend un témoin positif comprenant une quantité d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B générant dans la méthode de dosage une valeur d'activité égale à une valeur limite prédéfinie. Une telle valeur limite peut notamment correspondre à la valeur maximale d'activité anti-A et/ou anti-B acceptée par les autorités de santé d'un pays pour les immunoglobulines humaines normales destinées à une administration chez l'homme par toute voie d'administration, notamment par voie intraveineuse ou intramusculaire ou sous-cutanée. Un tel témoin positif limite est utile notamment pour déterminer si un concentré thérapeutique possède bien ou non une activité anti-A et/ou anti-B inférieure à la valeur limite maximale acceptée par les autorités de santé.
Par « témoin positif supérieur à la limite » d'une méthode de dosage d'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, on entend un témoin positif comprenant une quantité d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B générant dans la méthode de dosage une valeur d'activité supérieure à une valeur limite prédéfinie. Une telle valeur limite peut notamment correspondre à la valeur maximale d'activité anti-A et/ou anti-B acceptée par les autorités de santé d'un pays pour les immunoglobulines humaines normales destinées à une administration chez l'homme par toute voie d'administration, notamment par voie intraveineuse ou intramusculaire ou sous-cutanée. Un tel témoin positif supérieur à la limite est utile notamment pour vérifier que le dosage réalisé s'est déroulé de façon satisfaisante, un tel témoin devant systématiquement posséder une activité anti-A et/ou anti-B supérieure à la valeur limite choisie. Il peut également permettre de déterminer si un concentré thérapeutique se trouve proche de la valeur limite maximale acceptée par les autorités de santé ou bien très au-dessus de cette limite. Compositions d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B
La présente invention concerne une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, caractérisée en ce qu'au moins 80%, au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91%, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B.
Le pourcentage en poids des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti- B parmi les immunoglobulines humaines polyclonales totales d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales purifiées peut être mesuré en purifiant la composition par chromatographie d'affinité sur une colonne greffée par des ligands spécifiques des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B, et en faisant le rapport entre le poids d'immunoglobulines adsorbées sur la colonne et le poids des immunoglobulines totales. Si la composition n'est pas purifiée en immunoglobulines, une étape préalable de purification des immunoglobulines totales permet ensuite de mesurer le pourcentage en poids des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B parmi les immunoglobulines humaines polyclonales totales.
Les compositions selon l'invention sont de préférence purifiées, et les immunoglobulines humaines polyclonales représentent avantageusement au moins 85%, avantageusement au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91%, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des protéines totales de la composition.
Les compositions selon l'invention peuvent comprendre des immunoglobulines humaines polyclonales d'un seul isotype (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, avantageusement IgG ou IgM, de préférence IgG) ou de plusieurs isotypes. Cependant, dans un mode de réalisation préféré, les immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans les compositions selon l'invention sont majoritairement (à au moins 90%, avantageusement au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, plus avantageusement au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, encore plus avantageusement au moins 98%, au moins 99% en poids) des IgG. Dans ce cas, les compositions selon l'invention sont avantageusement enrichies en immunoglobulines de sous-classe lgG2 par rapport aux concentrés d'immunoglobulines humaines normales. En particulier, les compositions d'IgG selon l'invention sont avantageusement caractérisées en ce qu'au moins 40%, au moins 45%, au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 75%, voire au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales d 'isotype IgG présentes dans la composition sont des immunoglobulines de sous-classe lgG2, avantageusement mesuré par néphélémétrie et/ou par spectrographie et/ou par kit ELISA de dosage des sous classes (i.e par néphélémétrie, par spectrographie, par kit ELISA de dosage des sous classes, ou par plusieurs de ces méthodes, par exemple par néphélémétrie et par spectrographie, ou par chacune de ces trois méthodes). Alternativement ou en outre, les compositions d'IgG selon l'invention ont avantageusement un ratio en poids lgG2/lgG1 d'au moins 0,8, au moins 0,9, avantageusement au moins 1 , au moins 1 ,1 , au moins 1 ,2, au moins 1 ,3, au moins 1 ,4, au moins 1 ,5, au moins 1 ,6, au moins 1 ,7, au moins 1 ,8, au moins 1 , 9, voire au moins 2, au moins 2,5, au moins 3, au moins 3,1 , au moins 3,2, au moins 3,3, au moins 3,4, au moins 3,5, au moins 3,6, au moins 3,7, au moins 3,8, au moins 3,9, voire au moins 4, avantageusement mesuré par néphélémétrie et/ou par spectrographie et/ou par kit ELISA de dosage des sous classes (i.e par néphélémétrie, par spectrographie, par kit ELISA de dosage des sous classes, ou par plusieurs de ces méthodes, par exemple par néphélémétrie et par spectrographie, ou par chacune de ces trois méthodes).
Dans un autre mode de réalisation préféré, les immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans les compositions selon l'invention sont majoritairement (à au moins 90%, avantageusement au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, plus avantageusement au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, encore plus avantageusement au moins 98%, au moins 99% en poids) des IgM.
Dans un mode de réalisation avantageux, au moins 80%, au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91%, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, telles que définies ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, au moins 80%, au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91%, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, telles que définies ci-dessus. Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, la composition comprend à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et en ce que le rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti- A/anti-B) est compris entre 1 /10 et 10/1.
Dans un mode de réalisation, la composition comprenant à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, et possède donc un rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) compris entre 2/1 et 10/1.
Dans un autre mode de réalisation, la composition comprenant à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et possède donc un rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) compris entre 1 /10 et 1 /2.
Dans un autre mode de réalisation, la composition comprenant à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est équilibrée dans les deux types d'immunoglobulines, et possède donc un rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (anti-A/anti-B) compris entre 3/10 et 7/10, avantageusement entre 4/10 et 6/10.
Alternativement ou en combinaison avec les pourcentages ou rapports en poids mentionnés ci-dessus, la composition enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A selon l'invention peut posséder une activité anti-A enrichie d'un facteur au moins 4, avantageusement au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 35, au moins 40, au moins 45, au moins 50, au moins 55, au moins 60, au moins 65, au moins 70, au moins 75, au moins 80, au moins 85, au moins 90, au moins 95, au moins 100, au moins 125, au moins 150, au moins 175, au moins 200, au moins 250, au moins 300, au moins 350, au moins 400, au moins 450, au moins 500, au moins 600, au moins 700, au moins 800, au moins 900, au moins 1000, au moins 1500, au moins 2000, au moins 2500, au moins 3000, au moins 4000, au moins 5000, au moins 6000, au moins 7000, au moins 8000, au moins 9000, voire au moins 10000 par rapport à une référence Immunoglobulines humaines normales lyophilisées ou à une référence EDQM.
Alternativement ou en combinaison avec les pourcentages ou rapports en poids mentionnés ci-dessus, la composition enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B selon l'invention peut posséder une activité anti-B enrichie d'un facteur au moins 4, avantageusement au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9, au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 35, au moins 40, au moins 45, au moins 50, au moins 55, au moins 60, au moins 65, au moins 70, au moins 75, au moins 80, au moins 85, au moins 90, au moins 95, au moins 100, au moins 125, au moins 150, au moins 175, au moins 200, au moins 250, au moins 300, au moins 350, au moins 400, au moins 450, au moins 500, au moins 600, au moins 700, au moins 800, au moins 900, au moins 1000, au moins 1500, au moins 2000, au moins 2500, au moins 3000, au moins 4000, au moins 5000, au moins 6000, au moins 7000, au moins 8000, au moins 9000, au moins 10000, au moins 11000, au moins 12000, au moins 13000, au moins 14000, au moins 15000, au moins 16000, au moins 17000, au moins 18000, voire au moins 19000 par rapport à une référence Immunoglobulines humaines normales lyophilisées ou à une référence EDQM.
Alternativement ou en combinaison avec les pourcentages ou rapports en poids mentionnés ci-dessus, la composition peut comprendre à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et possède un rapport (activité anti-A/ activité anti-B) compris entre 1 /10 et 10/1 , notamment entre 1 /9 et 9/1 , entre 1 /8 et 8/1 , entre 1 /7 et 7/1 , entre 1 /6 et 6/1 , entre 1 /5 et 5/1 , entre 1 /4 et 4/1 , entre 1 /3 et 3/1 , voire entre 1 /2 et 2/1 ou entre 0,6 et 1 ,5.
L'activité anti-A et l'activité anti-B sont déterminées à l'aide d'une méthode de dosage d'activité (notamment l'une de celles décrites ci-dessous, et en particulier la méthode de cytométrie en flux décrite ici) et exprimées en unités arbitraires vis-à-vis du même standard de référence (standard EDQM ref Y0001688 ou médicament immunoglobuline humaine normale lyophilisée).
Le rapport (activité anti-A/ activité anti-B) et le rapport (activité anti-B/ activité anti- A) sont calculés sur la base de résultats d'activité anti-A et anti-B obtenus dans des tests réalisés en parallèle, avec la même méthode de dosage d'activité (notamment l'une de celles décrites ci-dessous, et en particulier la méthode de cytométrie en flux décrite ici) et exprimés en unités arbitraires vis-à-vis du même standard de référence (standard EDQM ref Y0001688 ou médicament immunoglobuline humaine normale lyophilisée).
Les compositions selon l'invention sont purifiées et sont avantageusement concentrées. Avantageusement, les compositions selon l'invention sont concentrées selon toute technique connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant une membrane d'ultrafiltration, une centrifugation, une dialyse, ou plusieurs de ces étapes.
De manière encore plus avantageuse, les compositions selon l'invention présentent une concentration suffisante pour permettre les dilutions successives de la composition pour leur utilisation comme gamme étalon dans une méthode de dosage appropriée, par exemple le test de Coombs indirect, la méthode d'agglutination directe, la cytométrie en flux, ou par plusieurs de ces méthodes (par exemple, le test de Coombs indirect et la méthode d'agglutination directe ; le test de Coombs indirect et la cytométrie en flux ; la méthode d'agglutination directe et la cytometrie en flux ; ou chacune de ces trois méthodes).
De manière avantageuse, les compositions selon l'invention concentrées présentent un résultat au test de Coombs indirect (décrit ci-dessous) supérieur à 1 /64, avantageusement supérieur à 1 /128, supérieur à 1 /256, supérieur à 1 /512, supérieur à 1 /1024, supérieur à 1 /2048, voire supérieur à 1 /4096, afin de permettre les dilutions successives de la composition pour en faire une gamme étalon dans la méthode de dosage en test de Coombs indirect. Par résultat au test de Coombs indirect supérieur à 1 /N, on entend que le résultat du test de Coombs indirect est négatif à une dilution de l'échantillon à 1 /N.
Alternativement ou en outre, de manière avantageuse, les compositions selon l'invention concentrées présentent un résultat avec la méthode d'agglutination directe (décrite ci-dessous) supérieur à 1 /64, avantageusement supérieur à 1 /128, supérieur à 1 /256, supérieur à 1 /512, supérieur à 1 /1024, supérieur à 1 /2048, voire supérieur à 1 /4096, afin de permettre les dilutions successives de la composition pour en faire une gamme étalon dans la méthode d'agglutination directe. Par résultat au test d'agglutination direct supérieur à 1 /N, on entend que le résultat avec la méthode d'agglutination directe est négatif à une dilution de l'échantillon à 1 /N.
Alternativement ou en outre, de manière avantageuse, les compositions selon l'invention concentrées présentent un résultat avec la méthode de cytométrie en flux (décrite ci-dessous) supérieur à 1 /64, avantageusement supérieur à 1 /128, supérieur à 1 /256, supérieur à 1 /512, supérieur à 1 /1024, supérieur à 1 /2048, voire supérieur à 1 /4096, afin de permettre les dilutions successives de la composition pour en faire une gamme étalon dans la méthode de cytométrie en flux. Par résultat au test de cytométrie en flux supérieur à 1 /N, on entend que le résultat avec la méthode cytométrie en flux est négatif à une dilution de l'échantillon à 1 /N.
De manière encore plus avantageuse, les compositions selon l'invention concentrées présentent une concentration en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B supérieure à 1 g/L, supérieure à 1 ,5 g/L, supérieure à 2 g/L, supérieure à 5 g/L, supérieure à 10 g/L, supérieur à 15 g/L, supérieur à 20 g/L, voire supérieur à 50 g/L.
Préparation des compositions selon l'invention
Les compositions selon l'invention peuvent être obtenues à partir de fractions plus ou moins purifiées du plasma humain comprenant des immunoglobulines polyclonales par différents procédés de purification.
Dans un deuxième aspect, la présente invention concerne donc un procédé de préparation d'une composition selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : a) adsorption d'un lot de plasma humain ou d'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle, et
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc un procédé de préparation d 'une composition selon l'invention, comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle, et
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc un procédé de préparation d 'une composition selon l'invention, comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle, et
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
La préparation des compositions selon l'invention repose sur une étape d 'adsorption spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B sur un support greffé par un ligand spécifique de ces immunoglobulines, qui sont ensuite éluées. Avantageusement, il est possible de partir directement du plasma ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales, plus ou moins purifiée en immunoglobulines humaines polyclonales.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de préparation des compositions selon l'invention s'intègre dans un procédé plus général de purification d 'immunoglobulines humaines normales thérapeutiques (récupération de fraction jusqu'ici éliminées) et est donc mis en œuvre sur une fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée. Cette fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée contient avantageusement une teneur en immunoglobulines humaines polyclonales d'au moins 80%, avantageusement au moins 81 %, au moins 82%, plus avantageusement au moins 83%, au moins 84%, encore plus avantageusement au moins 85%, au moins 86%, au moins 87% au moins 88%, au moins 89%, voire au moins 90%, au moins 91 %, ou au moins 92% en poids des protéines totales de la fraction.
Comme indiqué ci-dessus, la fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée peut notamment avoir été obtenue par séparation chromatographique, notamment selon les procédés de purification d'immunoglobulines humaines polyclonales décrits dans W099/64462 et WO02/092632, et plus particulièrement dans WO02/092632. Dans ce cas, la fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée est obtenue par prépurification par une étape de précipitation de contaminants lipidiques à partir d'un plasma sanguin ou d'une fraction de plasma sanguin enrichie en IgG, et une étape de chromatographie unique sur un support de résine échangeuse d'anions effectuée à pH alcalin, avec une élution sélective des IgG en une étape par un tampon approprié à pH compris entre 4 et 7. Avantageusement, la prépurification par une étape de précipitation de contaminants lipidiques consiste en une étape de précipitation à l'acide caprylique.
Lorsqu'une fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée est utilisée à l'étape a) du procédé selon l'invention décrit ci-dessus, la fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée peut en outre avoir subi une étape de sécurisation biologique (élimination virale et/ou d"inactivation virale, notamment par un traitement solvant-détergent), une étape de concentration (notamment par ultrafiltration), et/ou une étape de filtration stérilisante.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le support peut être tout support approprié susceptible d'être choisi par l'homme du métier pour adsorber des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et /ou anti-B.
Un tel support utilisé à l'étape a) se présente avantageusement sous la forme :
a) de particules (notamment de particules de polymère) greffées par le ou les ligands d'intérêt, ou
b) d'une membrane polymérique, la membrane étant greffée par le ou les ligands d'intérêt.
Le support peut ainsi notamment se présenter sous la forme de particules greffées par le ou les ligands d'intérêt. Les particules sont avantageusement de forme sphérique ou oblongue, il peut s'agir notamment de billes. Ces particules ont généralement une taille moyenne d'environ 0,1 μιη à environ 1000 μιη, de préférence d'environ 20 à environ 50 0 μιη, de préférence encore d'environ 50 à environ 200 μιη, de préférence encore d'environ 70 μιη à environ 120 μιη de diamètre. Elles peuvent être constituées de polymère ou de matières inorganiques (comme la silice ou le verre par exemple). Avantageusement, les particules sont poreuses.
Dans un mode de réalisation avantageux, il s'agit de particules de polymère. Le polymère peut être naturel ou non-naturel (synthétique ou hémisynthétique), organique ou inorganique (de préférence le polymère sera organique), réticulé ou non réticulé (de préférence le polymère sera réticulé). Avantageusement, le polymère est un polymère organique réticulé. Le polymère peut notamment être choisi parmi la cellulose et ses dérivés, l'agarose, le dextran, les polyacrylates, le polystyrène, le polyacrylamide, le polyméthacrylamide, les copolymères de styrène et divinylbenzène, ou les mélanges de ces polymères.
Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est de la cellulose, et les particules sont de préférence des billes de cellulose poreuses. De préférence encore, il s'agit de cellulose réticulée.
Le support peut également se présenter sous la forme d'une membrane polymérique, la membrane étant greffée par le ou les ligands d'intérêt. Le polymère de la membrane peut être choisi parmi les polymères mentionnés ci-dessus pour les particules de polymère.
Les particules sont avantageusement incorporées dans un gel ou une résine, qui est utilisé comme matrice d'une colonne de chromatographie d'affinité. De même, la membrane polymérique peut être incluse dans une colonne de chromatographie d'affinité. Le lot de plasma humain ou la fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sont alors adsorbés sur la colonne de chromatographie d'affinité, et la fraction adsorbée est éluée et récupérée. Cependant, bien que préférée, l'utilisation d'une colonne de chromatographie d'affinité n'est pas essentielle, et d'autres modes d'adsorption, de dissociation et de récolte peuvent être utilisés.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A peut être toute molécule appropriée connue de l'homme du métier et se liant aux immunoglobulines humaines polyclonales anti-A telles que définies ci-dessus et ne se liant pas aux autres immunoglobulines. Un tel ligand est avantageusement choisi parmi les oligosaccharides représentatifs des antigènes du groupe A de type 1 , 2, 3 et 4, et notamment parmi les oligosaccharides suivants :
Trisaccharide : GalNAca1-3(Fuca1 -2)Gal ;
Tétrasaccharides :
o Type 1 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc,
o Type 2 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc,
o Type 3 ou 4 : GalNAca1 -3(Fuca1-2)Gal 1 -3GalNAc
Pentasaccharides :
o Type 1 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 2 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 3 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal,
o Type 4 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc p1 -3Gal,
Hexasaccharides :
o Type 1 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc, o Type 2 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc, o Type 3 : GalNAca1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc, o Type 4 : GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal61 -3GalNAc B1 -3Gala1 -4Gal.
Dans un procédé de préparation selon l'invention, le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B peut être toute molécule appropriée connue de l'homme du métier et se liant aux immunoglobulines humaines polyclonales anti-B telles que définies ci-dessus et ne se liant pas aux autres immunoglobulines. Un tel ligand est avantageusement choisi parmi les oligosaccharides représentatifs des antigènes du groupe B de type 1 , 2, 3 et 4, et notamment parmi les oligosaccharides suivants :
· Trisaccharide : Gala1-3(Fuca1 -2)Gal ;
• Tétrasaccharides :
o Type 1 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc,
o Type 2 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc,
o Type 3 ou 4 : Gala1 -3(Fuca1-2)Gal 1 -3GalNAc
· Pentasaccharides :
o Type 1 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 2 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3Gal,
o Type 3 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal,
o Type 4 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gai i -3GalNAc β1 -3Gal,
· Hexasaccharides :
o Type 1 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Galp1 -3GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc,
o Type 2 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -4GlcNAc p1 -3GalB1 -4Glc,
o Type 3 : Gala1 -3(Fuca1 -2)Gal 1 -3GalNAc a1 -3Gal61 -4GlcNAc, o Type 4 : Gala1 -3(Fuca1-2)Gal61 -3GalNAc 61 -3Gala1 -4Gal.
A l'étape a) du procédé selon l'invention tel que décrit ci-dessus, le support peut être greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Dans un mode de réalisation, le support n'est greffé que par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A.
Dans un autre mode de réalisation, le support n'est greffé que par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B.
Dans encore un autre mode de réalisation, le support est greffé à la fois par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Dans ce cas, on utilisera avantageusement un mélange de supports greffés par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et de supports greffés par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, dans des proportions respectives généralement comprises entre 25/75 (v/v) et 75/25 (v/v), et notamment de 50/50 (v/v). Notamment, lorsque des particules greffées par le(s) ligands d'intérêt sont utilisées, on peut utiliser un mélange de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B pour préparer un gel et remplir une colonne de chromatographie d'affinité. Dans ce cas, les particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et les particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B sont mélangées dans des proportions respectives généralement comprises entre 25/75 (v/v) et 75/25 (v/v), et notamment de 50/50 (v/v). Dans un autre mode de réalisation, il est également possible d'utiliser un support comprenant des particules greffées à la fois par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Dans un autre mode de réalisation, il est également possible d'utiliser un mélange :
• de particules greffées à la fois par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et
• de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Dans un procédé de préparation selon l'invention, le ligand d'intérêt est avantageusement greffé sur les particules de polymères ou sur la membrane polymérique par l'intermédiaire d'un espaceur, ce qui permet de réduire l'encombrement stérique et de rendre le trisaccharide caractéristique des antigènes A ou B plus accessible aux immunoglobulines susceptibles de s'adsorber sur le support. Un tel espaceur peut être tout groupement approprié connu de l'homme du métier pour permettre le greffage du ligand d'intérêt et donc notamment d'oligosaccharides sur un support d'intérêt, notamment les polymères décrits ci-dessus.
L'espaceur comprend typiquement au moins un atome de C, O, N, ou S, et comprendra le plus souvent au moins une des fonctions chimiques suivantes : éther (-0-), thioéther (-S-), amino (-NH-), carboxy -(-COO- ou -OCO-), amide (-CONH- ou -HNOC-).
Il peut notamment être choisi parmi :
• -(CH2)mX(CH2)n- ou -(CH2)mX1 (CH2)nX2(CH2)p-, où X, X1 , et X2 sont chacun indépendamment l'un de l'autre choisi parmi 0, S, NH, et une liaison covalente; m, n, et p sont chacun indépendamment 0, 1 , 2, 3, 4, 5, ou 6 ; et 1 , 2, ou 3 des atomes d'hydrogène peuvent être remplacés par un nombre équivalent de groupes OH et/ou méthyle.
L'espaceur peut notamment avoir une structure choisie parmi : où chacun de X1 et X2 est choisie indépendamment parmi 0, S, et NH; et chacun de Ra, Rb, Rc, and Rd est choisie indépendamment parmi H, OH, et méthyle.
• 'une des structures suivantes :
• Les espaceurs de formule -NH-R1 -C0NH-R2-, dans laquelle R1 est un groupe alkyle en C4-C6, R2 est un groupe alkyle en C3-C8, et ledit espaceur est lié par sa fonction aminé (en gras ci-dessus) au support.
Dans ce cas, R1 est un groupe alkyle en C4-C6, linéaire ou ramifié, de préférence linéaire. De préférence, R1 est un groupe alkyle en C5.
R2 est un groupe alkyle en C3-C8, linéaire ou ramifié, de préférence linéaire. De préférence, R2 est un groupe alkyle en C3.
Dans un mode de réalisation préféré, les ligands (qui sont de préférence des trisaccharides tels que décrits plus haut) sont greffés aux particules ou à la membrane par un espaceur selon la formule : (particule/membrane)-NH-C5Hio-
CO-NH-C3H6-(ligand).
Le couplage entre la particule ou la membrane et l'espaceur, d'une part, et le couplage entre l'espaceur et le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B peut être réalisé par tout protocole de synthèse chimique approprié connu de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, la particule ou la membrane peut porter un bras -NH-R1 -COOH. De préférence il s'agit d'acide ε-aminocaproïque (où R1 est un groupe pentyle). De manière classique, la particule peut alors être activée en utilisant des réactifs bifonctionnels tels que l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, le dibromo- et le dichloropropanol, le dibromobutane, l'éthylène glycol diglycidyléther, le butanediol diglycidylether, la divinylsulfone, l'allylglycidyléther, et le bromure d'allyle. Le réactif bifonctionnel est capable de réagir à la fois avec les particules/la membrane et le bras - NH-R1 -COOH. Les composés hétérofonctionnels allyle, tels que le bromure d'allyle, sont des réactifs bifonctionnels préférés et permettent d'obtenir une matrice activée.
Pour certains supports solides, tels que la cellulose, les composites contenant un hydrogel ou d'autres matériaux présentant des groupes hydroxyles, il est avantageux de déprotoner les groupes hydroxyles avec une source d'hydroxyde, par exemple, avant la réaction avec un réactif bifonctionnel. Les ligands représentant les antigènes des groupes sanguins A et/ou B sont ensuite immobilisés sur la particule/la membrane activée portant le bras -NH-R1 -COOH via un groupe lieur -NH-R2-, où R2 est un groupe alkyle en C3-C8, linéaire ou ramifié, de préférence linéaire. Pour cela, la fonction COOH du bras -NH-R1 -COOH portée par la particule/la membrane est mis à réagir avec la fonction NH2 du ligand NH2-R2- oligosacccharide, par la mise en œuvre d'un agent de condensation de type N- éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1 ,2-dihydroquinoline (EEDQ).
Des exemples de supports greffés par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention sont les suivants : Glycosorb ABO A (matrice Sepharose sur laquelle est greffé le trisaccharide caractéristique de l'antigène A, Glycorex Transplantation AB, Lund, Suède), AUotran A (trisaccharide caractéristique de l'antigène A greffé à une matrice Sepharose FF par du polyacrylamide, Lectinity Corp), HyperCel IsoA (particules de cellulose réticulée greffées par le trisaccharide caractéristique de l'antigène A, Pall). Des exemples de supports greffés par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention sont les suivants : Glycosorb ABO B (matrice Sepharose sur laquelle est greffé le trisaccharide caractéristique de l'antigène B, Glycorex Transplantation AB, Lund, Suède), AUotran B (trisaccharide caractéristique de l'antigène B greffé à une matrice Sepharose FF par du polyacrylamide, Lectinity Corp), HyperCel IsoB (particules de cellulose réticulée greffées par le trisaccharide caractéristique de l'antigène B, Pall). Lorsqu'on souhaite utiliser un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, on utilisera généralement un mélange d'un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A tel que décrit ci-dessus et d'un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B tel que décrit ci-dessus. Notamment, lorsque des particules greffées par le(s) ligands d'intérêt sont utilisées, on peut utiliser un mélange de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B pour préparer un gel et remplir une colonne de chromatographie d'affinité. On peut également utiliser un des particules greffées à la fois par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B pour préparer un gel et remplir une colonne de chromatographie d'affinité. Dans un autre mode de réalisation, il est également possible d'utiliser un mélange :
• de particules greffées à la fois par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et • de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Lorsque la purification de la composition selon l'invention est réalisée par chromatographie d'affinité, le lot de plasma humain ou la fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales est adsorbé à l'étape a) sur la colonne de chromatographie dans toute condition appropriée connue de l'homme du métier, notamment toute condition recommandée par le fabricant du support de chromatographie, en fonction du support choisi. Une percolation du lot de plasma humain ou de la fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur la colonne peut notamment être mise en œuvre. La fraction non adsorbée est avantageusement récupérée pour d'autres usages ultérieurs. La fraction adsorbée est ensuite dissociée et récupérée à l'aide d'un ou plusieurs lavages de la colonne par un ou plusieurs tampons d'élution appropriés. Un tampon d'élution acide (par exemple un tampon glycine-HCl, pH entre 2 et 4 et/ou un tampon d'élution basique (par exemple une solution de glycine- NaOH, pH entre 10 et 12) peuvent notamment être utilisés. La composition ainsi obtenue peut en outre être soumises à une ou plusieurs étapes optionnelles ultérieures, telles que : une étape de neutralisation de la composition (ajustement du pH entre 3 et 9, préférentiellement entre 4 et 5, une ou plusieurs étapes de purification additionnelles, une étape de concentration (par exemple par ultrafiltration), au moins une étape d'inactivation (traitement solvant-détergent par exemple) ou d'élimination virale (nanofiltration par exemple), ou une combinaison de plusieurs de ces étapes.
Le procédé selon l'invention tel que décrit ci-dessus permet d'obtenir une composition d 'immunoglobulines humaines polyclonales reconnaissant pour au moins 80%, au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91%, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition les antigènes des groupes sanguins A et B.
Lorsque le support utilisé à l'étape a) est greffé uniquement par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sont retenues, et la composition obtenue comprend alors des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A.
Alternativement, lorsque que le support utilisé à l'étape a) est greffé uniquement par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B sont retenues, et la composition obtenue comprend alors des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B.
Lorsque le support utilisé à l'étape a) est greffé à la fois par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, la composition purifiée comprend alors un mélange d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Dans les immunoglobulines humaines polyclonales purifiées à partir de pools de plasma, la proportion d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B dépend de la population initiale de donneurs. En effet, des différences de pourcentage de répartition des différents groupes sanguins existent en fonction des populations de donneurs. Ces variations peuvent donc se retrouver dans les compositions d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B selon l'invention. Afin d 'obtenir soit une composition purifiée d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, soit une composition purifiée d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, les inventeurs ont mis au point de nouveaux procédés de purification.
Ainsi, afin de préparer une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80%, au moins 81 %, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
Les étapes a) à c) sont identiques à celles décrites ci-dessus pour la préparation d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B. Notamment, les conditions d 'adsorption, de mise en réserve de la fraction non adsorbée et de dissociation et de récolte de la fraction adsorbée peuvent être similaires à celles décrites ci-dessus.
Les étapes d) et e) visent à isoler spécifiquement les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A. Pour ce faire, on utilise à l'étape d) un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B afin que soient adsorbées sur le support toutes les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A peuvent ainsi être récupérées directement (étape e)), conduisant à l'obtention d 'une composition spécifiquement enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A. De manière avantageuse, les conditions de l'étape d) sont adaptées pour permettre l'adsorption sur le support de toutes les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, par exemple en adaptant le volume de gel et/ou le temps de résidence. Lorsque le support utilisé à l'étape d) est une colonne de chromatographie d 'affinité comprenant comme support une membrane ou un gel de particule greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, les conditions d 'adsorption peuvent être similaires à celles décrites précédemment pour l'étape a). La fraction non adsorbée est alors directement récupérée à l'étape e).
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention visant à préparer une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80%, au moins 81 %, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, et
e) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
De manière alternative, afin de préparer une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80%, au moins 81 %, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
Les étapes a) à c) sont identiques à celles décrites ci-dessus pour la préparation d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B. Notamment, les conditions d 'adsorption, de mise en réserve de la fraction non adsorbée et de dissociation et de récolte de la fraction adsorbée peuvent être similaires à celles décrites ci-dessus.
Les étapes d) et e) visent à isoler spécifiquement les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. Pour ce faire, on utilise à l'étape d) un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A afin que soient adsorbées sur le support toutes les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A. Les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B peuvent ainsi être récupérées directement (étape e)), conduisant à l'obtention d 'une composition spécifiquement enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B. De manière avantageuse, les conditions de l'étape d) sont adaptées pour permettre l'adsorption sur le support de toutes les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, par exemple en adaptant le volume de gel et/ou le temps de résidence. Lorsque le support utilisé à l'étape d) est une colonne de chromatographie d 'affinité comprenant comme support une membrane ou un gel de particules greffées par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, les conditions d 'adsorption peuvent être similaires à celles décrites précédemment pour l'étape a). La fraction non adsorbée est alors directement récupérée à l'étape e).
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention visant à préparer une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80%, au moins 81 %, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, avantageusement au moins 85% au moins 86%, au moins 87%, plus avantageusement au moins 88%, au moins 89%, encore plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92% au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, ou au moins 99% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et
e) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le lot de plasma humain ou la fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales (fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée) non adsorbée à l'étape a) est utilisé dans un procédé de préparation d 'immunoglobulines polyvalentes humaines. Ce mode de réalisation particulier de l'invention permet avantageusement la préparation à la fois
d 'un concentré d 'immunoglobulines polyvalentes humaines, dépiété en anti-A et en anti-B,
d 'une composition spécifiquement enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, et
- d 'une composition spécifiquement enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé de préparation d'une composition purifiée en immunoglobulines anti-A comprend donc les étapes suivantes : a) adsorption d 'une fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) récupération de la fraction non adsorbée pour l'utilisation dans un procédé de purification d'un concentré d 'immunoglobulines humaines polyvalentes dépiété en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée à l'étape a),
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin B, et
e) récolte de la fraction non adsorbée. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé de préparation d'une composition purifiée en immunoglobulines anti-A comprend donc les étapes suivantes : a) adsorption d'une fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée, en particulier d'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales issue d 'une chromatographie échangeuse d 'anions à pH alcalin, sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) récupération de la fraction non adsorbée pour l'utilisation dans un procédé de purification d'un concentré d 'immunoglobulines humaines polyvalentes dépiété en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée à l'étape a),
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin B, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé de préparation d'une composition purifiée en immunoglobulines anti-B comprend donc les étapes suivantes : a) adsorption d 'une fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) récupération de la fraction non adsorbée pour l'utilisation dans un procédé de purification d'un concentré d 'immunoglobulines humaines polyvalentes dépiété en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée à l'étape a),
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé de préparation d'une composition purifiée en immunoglobulines anti-B comprend donc les étapes suivantes : a) adsorption d'une fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée, en particulier d'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales issue d 'une chromatographie échangeuse d 'anions à pH alcalin, sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, b) récupération de la fraction non adsorbée pour l'utilisation dans un procédé de purification d'un concentré d 'immunoglobulines humaines polyvalentes dépiété en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée à l'étape a),
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A, et
e) récolte de la fraction non adsorbée. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé de préparation d 'une composition purifiée en immunoglobulines anti-A et d 'une composition purifiée en immunoglobulines anti-B comprend donc les étapes suivantes :
a) adsorption d 'une fraction d 'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) récupération de la fraction non adsorbée pour l'utilisation dans un procédé de purification d'un concentré d 'immunoglobulines humaines polyvalentes dépiété en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée à l'étape a),
d) adsorption d 'une partie de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin B, et récolte de la fraction non adsorbée enrichie en anti-A, e) adsorption de l'autre partie de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A, et récolte de la fraction non adsorbée enrichie en anti-B.
Ce mode de réalisation particulièrement avantageux permet de valoriser de manière optimale les fractions retenues et non retenues de la chromatographie d'affinité utilisant des ligands spécifiques des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et des ligands spécifiques des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A.
Dans les procédés de préparation de compositions spécifiquement enrichies en immunoglobulines anti-A ou en immunoglobulines anti-B décrits ci-dessus, les supports et ligands utilisés aux étapes a) et d) et/ou e) peuvent être choisis parmi ceux décrits ci-dessus pour le procédé général de préparation d 'une composition enrichie en immunoglobulines anti-A et anti-B.
L'invention concerne en outre une composition susceptible d 'être obtenue par l'un des procédés de préparation selon l'invention tels que décrits ci-dessus. Témoins positifs destinés à être utilisés dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales
Les compositions selon l'invention sont utiles notamment pour la préparation d'un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite ou témoin positif supérieur à la limite) utile dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'un concentré d'immunoglobulines humaines normales, qui ne présente pas les inconvénients du témoin positif et/ou du témoin positif limite disponibles à ce jour (fractions 07/306 et 07/310), c'est-à-dire qui comprend des immunoglobulines anti-A et/ou anti-B humaines et polyclonales et non murines et monoclonales, et qui puisse être préparé dans des quantités suffisantes.
Ainsi, dans un troisième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition selon l'invention comme témoin positif dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales.
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite ou témoin positif supérieur à la limite) destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un témoin positif destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, comprenant les étapes suivantes :
a) la fourniture d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales possédant une activité anti-A et une activité anti-B inférieures à une valeur limite donnée dans ladite méthode de dosage, et
b) l'ajout d'une composition selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite, ou témoin positif supérieur à la limite) destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, comprenant les étapes suivantes :
a) la fourniture d'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales possédant une activité anti-A et une activité anti-B inférieures à une valeur limite donnée dans ladite méthode de dosage,
b) l'ajout de quantités croissantes d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti- A et/ou d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, pour obtenir différentes compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B,
c) le dosage par ladite méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B des compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti- B obtenues à l'étape b), et
d) la sélection de la composition enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B ayant une activité anti-A et/ou anti-B dans ladite méthode de dosage inférieure (pour obtenir un témoin positif inférieur à la limite), égale (pour obtenir un témoin positif limite), ou supérieure (pour obtenir un témoin positif supérieur à la limite) à ladite valeur limite.
Un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite, ou témoin positif supérieur à la limite) peut être préparé par le procédé ci-dessus pour toute méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'intérêt, et pour toute valeur limite d'intérêt.
Notamment, un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite, ou témoin positif supérieur à la limite) peut être préparé par le procédé ci-dessus pour l'une ou l'autre des méthodes de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B qui sont généralement utilisées :
(i) une méthode appelée test indirect à l'antiglobuline (TIA, également appelé test de Coombs indirect), qui repose sur l'utilisation d'une antiglobuline (c'est-à-dire d 'immunoglobulines d'origine animale reconnaissant spécifiquement les immunoglobulines humaines) pour révéler les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou anti-B fixées aux hématies de groupe sanguin A ou B.
La détection de l'agglutination des hématies en présence d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B peut être faite par différentes méthodes, plus ou moins précises.
Dans le test TIA usuel, l'agglutination est lue de manière visuelle, par détection de la présence d'un précipité.
Le test TIA est l'ancien test recommandé par les autorités de santé pour le dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B des concentrés thérapeutiques d'immunoglobulines humaines normales.
(ii) une méthode appelée méthode d'agglutination directe, développée par Thorpe et collaborateurs (Thorpe et al. Vox Sang. 2009 Aug;97(2): 160-8 ; Thorpe et al. Pharmeur Bio Sci Notes. 2010 Apr;2010(1 ):39-50 ; Document WHO/BS/08.2091 téléchargeable à l'adresse http://apps.who.int/iris/handle/10665/69970?locale=fr).
Dans cette méthode, des hématies A ou B traitées à la papaïne sont mises en contact avec des dilutions au demi en série d'une solution d'immunoglobulines humaines normales à 5% (50 g/l), dans une microplaque avec des puits en V. Après centrifugation, la plaque est inclinée à un angle d'environ 70° pendant environ 4-5 minutes. En cas d'agglutination, le culot de cellules reste collé au fond du puits en V, formant un point bien rond. Dans le cas contraire, le culot de cellules non agglutiné glisse le long de la paroi du puits en V, générant ainsi une forme de type gouttelette.
La méthode d'agglutination directe est le nouveau test recommandé par les autorités de santé pour le dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B des concentrés thérapeutiques d'immunoglobulines humaines normales.
(iii) Un test en cytométrie utilise un F(ab')2 marqué par un marqueur fluorescent.
Après ajout du F(ab')2 marqué et lavage du F(ab')2 non lié, l'intensité moyenne de fluorescence dans l'échantillon est mesurée et comparée à celle d'un ou plusieurs échantillons de référence. Une description plus précise de ce test est décrite dans la demande WO2007/077365.
La valeur limite pour laquelle le témoin positif limite est préparé peut être toute valeur limite d'activité anti-A et/ou anti-B d'intérêt. En particulier, il peut s'agir de la valeur maximale d'activité anti-A et/ou anti-B acceptée par les autorités de santé dans un pays ou une région du monde. Actuellement, d'après les critères de la pharmacopée européenne, de l'OMS et de la FDA, les concentrés thérapeutiques d'immunoglobulines humaines normales doivent ne pas présenter d'agglutination des hématies A et B à la dilution 1 /64 d'une solution de concentration initiale de 50 g/l (5%), dans un test d'agglutination directe particulier correspondant à celui développé par Thorpe et collaborateurs (Pharmacopée européenne, chapitre 2.6.20), et cette valeur limite peut donc être choisie de façon avantageuse. Il convient toutefois de noter que cette valeur limite est susceptible d'être modifiée par les autorités de santé en fonction de la surveillance des accidents d'hémolyses qui pourraient se produire dans le futur sur la base de concentrés thérapeutiques respectant cette valeur limite. Le procédé décrit ci- dessus pourra alors être à nouveau mis en œuvre pour préparer un nouveau témoin positif limite, adapté à la nouvelle limite fixée par les autorités de santé.
En outre, d'autres témoins positifs peuvent être utiles à l'homme du métier. Par exemple, une gamme de témoins positifs inférieurs à la limite avec des activités anti-A et/ou anti-B croissantes mais inférieures à la valeur limite fixée par les autorités de santé pourrait permettre d'établir si un concentré thérapeutique se trouve proche de la limite maximale acceptée par les autorités de santé ou bien très en-dessous de cette limite. De même, une gamme de témoins positifs supérieurs à la limite avec des activités anti-A et/ou anti-B croissantes mais toutes supérieures à la valeur limite fixée par les autorités de santé pourrait permettre d'établir si un concentré thérapeutique se trouve proche de la limite maximale acceptée par les autorités de santé ou bien très au-dessus de cette limite. A l'étape a) du procédé ci-dessus, une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales possédant une activité anti-A et une activité anti-B inférieures à une valeur limite donnée dans ladite méthode de dosage (composition de départ) est fournie, à laquelle des quantités croissantes d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou d'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B sont ajoutées à l'étape b) pour obtenir différentes compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B.
La composition de départ peut être dépourvue d 'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B (par exemple par une sélection appropriée des donneurs de plasmas utilisés), ou peut comprendre des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B, à condition que son activité anti-A et son activité anti- B soit inférieure à la valeur limite choisie dans la méthode de dosage choisie. Lorsque la valeur limite et la méthode de dosage choisies correspondent à celles prescrites par les autorités réglementaires, une telle composition de départ peut notamment être une composition d 'immunoglobulines humaines polyclonales purifiée et déplétée en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B, obtenue par exemple comme décrit dans WO2007/077365. La présence des immunoglobulines humaines polyclonales ne reconnaissant pas les antigènes A et B est destinée à conserver dans le témoin positif limite la même concentration en immunoglobulines totales que dans la composition dont l'activité anti-A ou anti-B sera ensuite testée par la méthode de dosage. En particulier, cette composition de départ possède de préférence une concentration en immunoglobulines égale ou supérieure à celle préconisée dans le test d 'activité anti-A et anti-B requis par les autorités de santé (50 g/L, soit 5% à ce jour).
A l'étape b), des quantités croissantes d 'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou d 'une composition selon l'invention dans laquelle au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition selon l'invention sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B sont ajoutées pour obtenir différentes compositions enrichies de façon plus ou moins importante en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B.
A l'étape c), l'activité anti-A et/ou anti-B des compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B obtenues à l'étape b) est testée par la méthode de dosage choisie initialement.
Enfin, à l'étape d), on sélectionne la composition enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B ayant une activité anti-A et/ou anti-B dans ladite méthode de dosage inférieure (pour obtenir un témoin positif inférieur à la limite), égale (pour obtenir un témoin positif limite), ou supérieure (pour obtenir un témoin positif supérieur à la limite) à la valeur limite choisie initialement.
Si on cherche à préparer un témoin positif supérieur à la limite et qu'aucune des compositions testées n'a une activité anti-A et/ou anti-B supérieure à la valeur limite choisie initialement, les étapes a) à c) peuvent être mises en œuvre à nouveau jusqu'à ce que la composition ayant une activité anti-A et/ou anti-B supérieure à la valeur limite choisie initialement soit obtenue.
A l'inverse, si on cherche à préparer un témoin positif inférieur à la limite et qu'aucune des compositions testées n'a une activité anti-A et/ou anti-B inférieure à la valeur limite choisie initialement, les étapes a) à c) peuvent être mises en œuvre à nouveau jusqu'à ce que la composition ayant une activité anti-A et/ou anti-B inférieure à la valeur limite choisie initialement soit obtenue.
Enfin, si on cherche à préparer un témoin positif limite et qu'aucune des compositions testées n'a une activité anti-A et/ou anti-B égale à la valeur limite choisie initialement, les étapes a) à c) peuvent être mises en œuvre à nouveau jusqu'à ce que la composition ayant une activité anti-A et/ou anti-B égale à la valeur limite choisie initialement soit obtenue.
En particulier, selon que les compositions testées à l'étape c) ont une activité anti-A et/ou anti-B inférieure, égale ou supérieure à la valeur limite choisie initialement, l'homme du métier saura adapter en conséquence les quantités de composition selon l'invention à ajouter à l'étape b) de façon à pouvoir sélectionner le témoin positif d 'intérêt.
L'invention concerne en outre un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite, ou témoin positif supérieur à la limite) destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, susceptible d 'être obtenu par le procédé selon l'invention de préparation d 'un témoin positif (témoin positif inférieur à la limite, témoin positif limite, ou témoin positif supérieur à la limite) décrit ci-dessus. Diagnostic des groupes sanguins
Les compositions selon l'invention dans lesquelles au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A peuvent en outre être utilisées dans un test de détermination du groupe sanguin d 'un sujet.
De même, les compositions selon l'invention dans lesquelles au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B peuvent en outre être utilisées dans un test de détermination du groupe sanguin d'un sujet. Les compositions selon l'invention sont alors mises en contact avec les hématies d'un sujet dont on cherche à déterminer le groupe sanguin, et le groupe sanguin est déterminé de la façon suivante :
• agglutination par la composition comprenant au moins 80% d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, mais pas par la composition comprenant au moins
80% d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B : le patient est de groupe A.
• agglutination par la composition comprenant au moins 80% d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B mais pas par la composition comprenant au moins 80% d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A : le patient est de groupe
B.
• agglutination par la composition comprenant au moins 80% d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par la composition comprenant au moins 80% d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B : le patient est de groupe AB, · pas d'agglutination par aucune des deux compositions : le patient est de groupe O.
Cette méthode de détermination des groupes sanguins à l'aide des compositions selon l'invention sera avantageusement complétée par une recherche des anticorps spécifiques dans le sérum du patient.
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d'une composition d'immunoglobulines humaines polyclonales, enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B Une première composition d'immunoglobulines humaines polyclonales selon l'invention, enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B a été préparée.
Matériels et méthodes
Une composition d'immunoglobulines humaines polyclonales purifiée a été préparée à partir d'un pool de plasma selon le procédé décrit dans la demande WO02/092632.
Cette composition d'immunoglobulines humaines polyclonales purifiée a ensuite été adsorbée sur une colonne de chromatographie d'affinité de 1 mL remplie par un gel comprenant un mélange de billes de cellulose réticulée poreuses greffées par le trisaccharide caractéristique des antigènes de groupe A (colonne A) et de billes de cellulose réticulée poreuses greffées par le trisaccharide caractéristique des antigènes de groupe B ( colonne B), dans des proportions respectives de 50/50 La charge était de 1 ,8 kg de composition d'immunoglobulines humaines polyclonales purifiée par litre de gel. Le temps de contact a été fixé à 2 minutes.
La fraction non adsorbée est récupérée pour traitement ultérieur afin de préparer un concentré thérapeutique d'immunoglobulines humaines polyclonales dépourvu d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B.
La fraction d'intérêt dans le cadre de la présente invention est alors obtenue par assemblage de deux fractions d'élution :
• Une 1ere élution de la colonne de chromatographie par un tampon acide (glycine 0.1M pH3),
· Une 2eme élution de la colonne de chromatographie par un tampon basique (glycine 0.1M pH11 ),
suivi d'une neutralisation de la fraction d'assemblage (ajustement du pH à 7).
Cette composition a ensuite été analysée par les technologies usuelles pour déterminer la concentration en IgG, IgA et IgM, les taux de polymères, dimères, monomères et fragments d'immunoglobulines.
L'activité anti-A et anti-B de la composition a également été analysée par la méthode décrite dans WO2007/077365 et comparée à celle d'une Immunoglobuline humaine normale lyophilisée.
Résultats
La composition purifiée d'immunoglobulines humaines polyclonales de départ, qui a été adsorbée sur la colonne de chromatographie d'affinité anti-A et anti-B possède les caractéristiques suivantes :
• Protéines totales : 10,0 g/L
• IgG : 9,20 g/L (Sous classes : lgG1 : 65% ; lgG2 : 30% ; lgG3 : 3% ; lgG4 : 2%)
• IgA : < 0,013 g/L
• IgM : < 0,009 g/L
• DTM (distribution de taille moléculaire) :
o Polymères : < 0,4%
o Dimères : 5,4%
o Monomères : 93,5%
o Fragments : < 1 ,0% Suite à l'étape de chromatographie d'affinité anti-A et anti-B, la fraction d'assemblage des deux élutions successives par un tampon acide puis par un tampon basique possède les caractéristiques suivantes :
• IgG : 0,34 g/L
• IgA : 0,015 g/L • IgM : < 6,3 mg/L
• Anti-A : 622,3 UA*
• Anti-B : 638,7 UA*
• DTM (distribution de taille moléculaire) :
o Polymères : 0,1 %
o Dimères : 2,9 %
o Monomères : 95,6 %
o Fragments : 1 ,3 % A ce stade, l'activité anti-A et l'activité anti-B sont exprimées en unités arbitraires rapportées à une Immunoglobuline humaine normale lyophilisée, produit considéré comme référentiel mis à 1. L'Immunoglobuline humaine normale lyophilisée, est un produit immunoglobulines normales humaines, disposant d'une autorisation de mise sur le marché en France. L'Immunoglobuline humaine normale lyophilisée, présente donc pour les anti-A et anti-B un résultat négatif au test de Coombs direct à la dilution 1 /64 comme requis par les Autorités Réglementaires. Ainsi, la composition obtenue par le procédé selon l'invention possède une activité anti-A et une activité anti-B environ 600 fois plus importante que les immunoglobulines humaines normales polyvalentes de l'Immunoglobuline humaine normale lyophilisée (concentré thérapeutique d 'immunoglobulines humaines polyclonales).
Conclusions
Les résultats présentés ci-dessus montrent qu'il est possible d'obtenir une composition purifiée d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B par récolte de la fraction d'une composition d'immunoglobulines humaines polyclonales sur une colonne de chromatographie d'affinité porteuse de ligands reconnaissant spécifiquement les anticorps anti-A et anti-B.
Exemple 2 : Préparation de compositions d'immunoglobulines humaines polyclonales, enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B Les inventeurs ont ensuite cherché à séparer les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B.
Matériels et méthodes
Afin de séparer les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, deux aliquots de la composition obtenue à l'Exemple 1 ont été soumis à deux traitements distincts : Afin d'obtenir une composition purifiée d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A purifiée, un 1er aliquot a été adsorbé sur une colonne de chromatographie d'affinité de 1 ml_ remplie par un gel de billes de cellulose réticulée poreuses greffées par le trisaccharide caractéristique des antigènes de groupe B (colonne 1 ). La charge était de 1 ,2 mg de composition d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B purifiée par ml_ de gel. Le temps de contact a été fixé à 2 minutes.
La fraction non adsorbée a été récupérée pour analyses ultérieures.
Afin d'obtenir une composition purifiée d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B purifiée, un 2eme aliquot a été adsorbé sur une colonne de chromatographie d'affinité de 1 mL remplie par un gel de billes de cellulose réticulée poreuses greffées par le trisaccharide caractéristique des antigènes de groupe A (colonne 2). La charge était de 1 ,2 mg de composition d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B purifiée par mL de gel. Le temps de contact a été fixé à 2 minutes.
La fraction non adsorbée a été récupérée pour analyses ultérieures.
Résultats
Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3. Concentration en IgG et activités anti-A et anti-B de la fraction non adsorbée. *UA = unités arbitraires par rapport au médicament Immunoglobuline humaine normale lyophilisée rapporté à 1.
Les résultats présentés dans le Tableau 3 montrent que toutes les immunoglobulines anti-B sont adsorbées sur la colonne 1 , aucune activité anti-B n'étant détectée dans la fraction non adsorbée. Celle-ci possède uniquement une très forte activité anti-A. En effet, par rapport à l'activité anti-A de 622,3 UA de la composition obtenue à l'Exemple 1 , la fraction non adsorbée sur la colonne 1 possède une activité anti-A de 7323 UA, soit environ 11 ,8 fois plus que la composition obtenue à l'Exemple 1 .
Ainsi, le passage de la composition obtenue à l'Exemple 1 sur la colonne 1 (greffée par le trisaccharide caractéristique des antigènes B) permet d'obtenir une composition purifiée d'immunoglobulines anti-A par récolte de la fraction non adsorbée. De manière similaire, les résultats présentés dans le Tableau 3 montrent que, toutes les immunoglobulines anti-A sont adsorbées sur la colonne 2, aucune activité anti-A n'étant détectée dans la fraction non adsorbée. Celle-ci possède uniquement une très forte activité anti-B. En effet, par rapport à l'activité anti-B de 638,7 UA de la composition obtenue à l' Exemple 1 , la fraction non adsorbée sur la colonne 2 possède une activité anti-B de 4248 UA, soit environ 6,7 fois plus que la composition obtenue à l' Exemple 1 . Ainsi, le passage de la composition obtenue à l' Exemple 1 sur la colonne 2 (greffée par le trisaccharide caractéristique des antigènes A) permet d 'obtenir une composition purifiée d 'immunoglobulines anti-B par récolte de la fraction non adsorbée. Conclusions
Les résultats présentés ci-dessus montrent que l'utilisation d'une deuxième étape de chromatographie d'affinité avec une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes A ou du trisaccharide caractéristique des antigènes B permet de séparer les immunoglobulines anti-A des immunoglobulines anti-B, et ainsi d 'obtenir des compositions purifiées d 'immunoglobulines anti-A ou d 'immunoglobulines anti-B.
La composition purifiée d 'immunoglobulines anti-A est obtenue par récolte de la fraction non adsorbée à une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes B. En effet, les conditions opératoires sont optimisées de façon que toutes les immunoglobulines anti-B se lient à une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes B.
De même, la composition purifiée d'immunoglobulines anti-B est obtenue par récolte de la fraction non adsorbée à une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes A. En effet, les conditions opératoires sont optimisées de façon que toutes les immunoglobulines anti-A se lient à une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes A.
Pour obtenir une composition purifiée d 'immunoglobulines anti-A à partir de la composition obtenue à l' Exemple 1 , il est donc nécessaire de récolter la fraction non adsorbée d 'une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes B.
De même, pour obtenir une composition purifiée d 'immunoglobulines anti-B à partir de la composition obtenue à l' Exemple 1 , il est donc nécessaire de récolter la fraction non adsorbée d 'une colonne porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes A.
Les compositions purifiées d 'immunoglobulines anti-A et/ou d 'immunoglobulines anti-B peuvent être utilisées en tant que témoin positif dans une méthode dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d'une composition d'immunoglobulines humaines polyclonales. Exemple 3 : Caractérisation des compositions d'immunoglobulines humaines polyclonales, enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, obtenues dans l'Exemple 2
La composition d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B obtenue par élution de la fraction adsorbée d'une 1ere étape de chromatographie dans l'Exemple 1 a été concentrée par ultrafiltration sur une membrane PELLICON 2, 30kDa, de 0,1 m2 (Merck Millipore®). Les compositions d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (fractions non adsorbées obtenues à l'issue de la 2eme étape de chromatographie de l'Exemple 2), ont été concentrées par ultrafiltration à l'aide d'une membrane PELLICON XL Biomax, 30kDa, de 50 cm2 (Merck Millipore®) puis reconcentrées 10 fois par centrifugation sur Amicon Ultra, membrane Ultracel(Merck Millipore®) . Les compositions sont ensuite caractérisées plus finement concernant la répartition des différentes sous-classes d'IgG, l'intégrité des IgG (pourcentages de monomères, dimères, polymères, et fragments), et leur activité vis-à- vis d'hématies de groupe sanguin O (ne portant ni les antigènes A ni les antigènes B), d'hématies de groupe sanguin A (porteuses d'antigènes A, mais pas d'antigènes B), et d'hématies de groupe sanguin B (porteuses d'antigènes B, mais pas d'antigènes A). La même caractérisation a été réalisée sur une composition d'immunoglobulines humaines normales administrée par voie intraveineuse (IglV) déplétée en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B.
Méthodes de caractérisation
Répartition des sous-classes d'IgG
La répartition des sous-classes d'IgG a été mesurée par trois méthodes distinctes : néphélémétrie, spectrographie de masse, et électroluminescence (MSD).
Néphélémétrie : Le principe de dosage par néphélémétrie est fondé sur la réaction en phase fluide d'un antigène avec un anticorps spécifique. Le complexe anticorps- antigène insoluble formé provoque une turbidité, que l'on mesure par une technique néphélémétrique, dont le principe est le suivant : lorsqu'un faisceau lumineux traverse un milieu trouble, une partie de la lumière est déviée de sa trajectoire (phénomène de diffusion). La mesure au moyen d'un photorécepteur de la lumière diffusée selon un certain angle par rapport au faisceau incident, permet de quantifier le trouble par un signal électrique. La relation entre la concentration d'antigène et le signal électrique obtenu, pour une concentration d'anticorps constante est décrite par la courbe de HEIDELBERGER-KENDALL. Le domaine de mesure se situe dans la partie ascendante de la courbe correspondant à un excès d'anticorps. Les mesures de néphélémétrie ont été réalisées avec un néphélémètre BNII (SIEMENS) avec Logiciel Version 2.5/F.
Spectrographie de masse (LC-MS) : Cette méthode permet la quantification et la caractérisation des sous-classes et allotypes d'IgG. La cystéine protéinase de Streptococcus pyogenes (IdeS) clive spécifiquement les IgG humaines dans la région charnière. Les fragments Fc/2 générés à partir des sous-classes IgGs sont séparés par chromatographie et les différents allotypes de chaque sous-classe sont caractérisés par spectrométrie de masse.
La protéolyse enzymatique et la glycolyse ont été obtenus en incubant 10 μΐ de l'échantillon à une concentration de 10 mg / ml dans un tampon phosphate salin à 100 Ul de Ides et 100 Ul d'enzymes IgGZero pendant 1 heure à 37° C. La réduction des IgG digérées a été réalisée en ajoutant 35 μΐ de tampon de dénaturation (guanidine-HCl 8M, Tris-HCl 0,1M, pH 7,5) et 5 μΐ d'une solution à 200 mM de DTT. La préparation a été incubée à 50° C pendant 30 minutes.
La séparation des fragments Fc/2 a été effectuée sur un système Acquity (Waters, Mil gué, MA, USA) couplé à un détecteur UV et un spectromètre de masse électrospray (Synapt G2S, Waters, Milford, MA, USA). Environ 20 μg de l'échantillon ont été injectés sur une colonne Pursuit diphényl 150 mm x 2,0 mm (Agilent, Santa Clara, CA, USA) équilibrée à 70° C et fonctionnant à un débit d'écoulement de 200 μΐ/min. Un gradient d'élution a été appliqué en utilisant un solvant A (0,1 % de TFA dans l'eau) et un solvant B (90% de MeCN, 10% d'eau et 0,1 % de TFA), après une élution isocratique à 10% de B pendant 5 min, B a été porté à 38% pendant 10 min et à 44% pendant 48 minutes supplémentaires. La colonne a ensuite été lavée pendant 4 min à 80% de B, et en outre équilibrée pendant 9 min à 10% de B. Le spectromètre de masse a été utilisé dans le mode de résolution positive et les données ont été enregistrées pour des m/z de 200 à 2000. Les spectres de masse de protéines ont été déconvolués à l'aide du logiciel MassLynx.
Electroluminescence (MSD) : la détection par électroluminescence utilise des marqueurs qui émettent de la lumière lorsqu'ils sont stimulés électrochimiquement. Le bruit de fond est minimal parce que le mécanisme de stimulation (électricité) est découplé du signal (lumière). Les marqueurs sont stables, non-radioactifs et émettent de la lumière à -620 nm, éliminant les problèmes de quenching. Peu de composés interfèrent avec les marqueurs électroluminescents. Des cycles d'excitation multiple de chaque marqueur amplifient le niveau de signal lumineux et permettent d'augmenter la sensibilité. La technologie Meso Scale Discovery (MSD) a été utilisée, en suivant les recommandations du fabricant. Cette technologie repose sur l'utilisation de microplaques comprenant des électrodes de carbone intégrées au fond des puits.
Intégrité des IgG La quantification des formes polymériques, dimériques, monomériques ainsi que les éventuels produits de dégradation (fragments) des IgG a été mesurée par deux méthodes distinctes : SDS-PAGE et chromatographie d'exclusion de taille haute performance (HPSEC). SDS-PAGE : Les échantillons ont été analysés par migration électrophorétique sur gel SDS-PAGE en système MULTIPHOR (GE). 2 μg d'échantillon sont ajoutés à 3 μΐ de tampon Tris 250 mM, pH 7,5, SDS 5% (+1 ,5 μΐ de réductant NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) - Invitrogen Réf. NP0004 pour les conditions réductrices). Après agitation, l'échantillon est chauffé à 95° C pendant 3 minutes juste avant le dépôt sur un gel ExcelGel SDS Homogeneous 12.5%. La méthode de migration suivante est utilisée :
- pour 1 gel entier : 600 V ; 50 mA ; 30 W pendant 1 h30 ;
- pour 2 gels entiers : 600 V ; 100 mA ; 60 W pendant 1 h30.
Pour la révélation au CBB (Bleu de Coomassie Brillant, BioRad Réf. 161 -0406), le gel est mis en contact avec la solution de coloration (Méthanol 50%, Acide Acétique 7%, 0,1% CBB) sous agitation pendant 30 min, puis avec la solution de décoloration 1 (Méthanol 50%, Acide Acétique 7%) sous agitation pendant 5 min, puis la solution de décoloration 2 (Méthanol 5%, Acide Acétique 7%) sous agitation jusqu'à obtenir un fond clair et homogène. Quand le gel est suffisamment décoloré, le gel est mis en eau.
Pour la révélation au nitrate d'argent, les gel est mis en contact pendant 30 min avec la solution de fixation (250 ml d'éthanol 40%, acide acétique 10% dans de l'eau PPI), sous agitation modérée sur un agitateur, puis pendant 30 min avec la solution de sensibilisation (75 ml d'éthanol absolu + 17 g d'acétate de sodium + 10 ml de thiosulfate de sodium, qsp 250 ml d'eau PPI+ 1 ,25 ml de glutardialdehyde extemporané) sous agitation, avant d'être rincé 3 x 5 min en eau PPI. Le gel est alors mis en contact pendant 20 min avec la solution d'AgN03 (10% AgN03 dans 250 ml + 100 μΐ de formaldéhyde extemporané) sous agitation, avant d'être rincé 2 x 1 min en eau PPI. Le gel est ensuite mis en contact avec la solution de développement (6,25 g de carbonate de sodium dans 250 mL d'eau PPI + 50 μΐ de formaldéhyde extemporané), et on laisse la coloration se développer (2 à 5 min maximum) sous agitation. Le développement est stoppé en éliminant la solution et en mettant le gel en contact avec la solution d'EDTA (3,65 g d'EDTA dans 250 mL d'eau PPI) pendant 10 min minimum.
HPSEC : Cette technique permet de séparer les protéines selon leur taille moléculaire. Un système DIONEX Ultimate 3000 avec une colonne Superdex Tricorn 200 10/300 GL (GE Healthcare Réf. 17-5175-01 ) a été utilisé. Les conditions d'analyse suivantes ont été utilisées :
• Débit : 0,4ml/min
• Phase Mobile : Tampon PBS
· Température Injecteur : 5° C ° 2° C
• Température Colonne : Température Ambiante
• Longueur d'onde de détection : 280 nm
• Volume injecté : cf. § 5.3.1 , 5.3.2, 5.3.3
• Temps d'acquisition : 60 min
Les chromatogrammes sont intégrés et des aires relatives sont calculées par le logiciel Chromeleon en %, selon la formule : Aire relative du pic Y = (aire pic Y x 100)/ aire totale Activité des compositions
Le dosage de l'activité anti-A, ou anti-B sur des hématies A, B ou 0 a été réalisé par le test en cytométrie utilisant un F(ab')2 marqué par un marqueur fluorescent, tel que décrit à l'exemple 2 de la demande WO2007/077365.
Brièvement, une suspension d'hématies à 40.106 hématies/ml est préparée en PBS/BSA 1%. 50 il de cette suspension est déposée dans une micro plaque 96 puits à fond rond (2.106 hématies/puits). Des gammes de dilution des standards (Immunoglobuline humaine normale lyophilisée ou référence Y0001688 de l'EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare)) sont réalisées. 50 μΐ d'une dilution de standard ou d'un échantillon à tester sont ajoutés aux 50 μΐ d'hématies dans la microplaque, qui est recouverte d'un film adhésif et incubée 2 heures à 37°C ± 2°C sous agitation. Après trois lavages en PBS/BSA 1%, le conjugué F(ab')2 de chèvre anti-humain marqué par un marqueur fluorescent et ajouté et la plaque est incubée 20 à 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Après 3 lavages, les dilutions de standard et les échantillons sont repris dans 200 μΐ de PBS/BSA 1%. Les échantillons sont alors analysés en cytométrie en flux (Beckman Coulter FC500). La lecture est effectuée sur 50 000 événements et l'appareil calcul automatiquement l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de chaque point de gamme ou échantillon. L'IMF est rapportée en fonction de la concentration en standard et l'équation de la droite de régression est obtenue au moyen du logiciel Excel. Puis, pour chaque échantillon, la concentration en équivalent standard est obtenue en utilisant l'équation linéaire de la droite de régression.
L'activité est exprimée en unités arbitraires par rapport au standard (référence Y0001688 de l'EDQM ou médicament (immunoglobuline humaine normale lyophilisée)) rapporté à 1.
Résultats
Répartition des sous-classes d'IgG
Les résultats sont présentés dans le Tableau 4 ci-dessous, et montrent que les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B obtenues dans l'Exemple 1 après élution de la fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales totales adsorbée sur une colonne de chromatographie d'affinité porteuse du trisaccharide caractéristique des antigènes de groupe A et du trisaccharide caractéristique des antigènes de groupe B, sont enrichies en lgG2 par rapport à la composition d'immunoglobulines humaines polyclonales déplétées en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B. C'est également le cas, de façon encore plus prononcée, pour les compositions d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-A ou d'immunoglobulines humaines polyclonales anti-B (fractions non adsorbées obtenues à l'issue de la 2eme étape de chromatographie de l'Exemple 2). Ainsi, les immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et les immunoglobulines humaines polyclonales anti-B d'isotype IgG sont caractérisées par un enrichissement en isotype lgG2.
Tableau 4. Concentration et répartition des sous-classes d'IgG parmi les différentes compositions testées
Intégrité des IgG
Les résultats de SDS-PAGE et de HPSEC sont synthétisés dans le Tableau 5 ci-dessous. Les résultats obtenus montrent que les immunoglobulines sont intègres à plus de 87% pour toutes les compositions testées. Composition d'immunoglobulines
Référence
humaines polyclonales anti-A et Produits
anti-B (Exemple 1 )
SDS-Page
intégrité IgG 89,60%
HPSEC
Polymères 2 -
Polymères 1 0,50%
Dimères 7,30%
Monomères 90,90%
Fragments 1 ,30%
Composition d'immunoglobulines Composition d'immunoglobulines
Référence
humaines polyclonales anti-A humaines polyclonales anti-B Produits
(Exemple 2) (Exemple 2)
SDS-Page SDS-Page
intégrité IgG 87,00% 87,80%
HPSEC HPSEC
Polymères 2 0,70% -
Polymères 1 0,50% 8,30%
Dimères 3,00% 3,10%
Monomères 94,40% 87,30%
Fragments 1 ,30% 1 ,40%
Tableau 5. Intégrité des immunoglobulines dans les compositions testées. ND : non déterminé.
Activité vis-à-vis des hématies
Les résultats sont présentés dans le Tableau 6 ci-dessous, exprimés en unités arbitraires par rapport au standard de référence EDQM ou au médicament Immunoglobuline humaine normale lyophilisée, rapportés à 1 .
Composition d'immunoglobulines Composition
Référence humaines normales déplétée en d'immunoglobulines humaines
Produits immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B polyclonales anti-A et anti-B (Exemple 1 )
Ref Ref
Immunoglobuline Immunoglobuline
Cytométrie Ref EDQM Ref EDQM
humaine normale humaine normale
lyophilisée lyophilisée
Activité
0,17 0,75 251 ,36 930,24
Hématies A
Activité
0,07 0,43 344,06 1271 ,81
Hématies B
Activité
0 0 0 0
Hématies 0
Rapport anti-
2,43 1 ,74 0,73 0,73
A/anti-B
Rapport anti-
0,41 0,57 1 ,37 1 ,37
B/anti-A
Composition
Composition d'immunoglobulines
Référence d'immunoglobulines humaines
humaines polyclonales anti-A
Produits polyclonales anti-B
(Exemple 2)
(Exemple 2)
Ref Ref
Immunoglobuline Immunoglobuline
Cytométrie Ref EDQM Ref EDQM
humaine normale humaine normale
lyophilisée lyophilisée
Activité
2801 ,73 11043,7 0 0
Hématies A
Activité
0 0 4923,24 19326,71
Hématies B
Activité
0 0 0 0
Hématies 0
Tableau 6. Activité de la composition testée dans le test de cytométrie vis-à-vis des hématies de groupe sanguin O, A et B. *UA = unités arbitraires par rapport au standard de référence EDQM ou au médicament Immunoglobuline humaine normale lyophilisée rapporté à 1 .
Ces résultats confirment qu'il est possible d'obtenir, par le procédé décrit ici, des compositions purifiées :
• fortement enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et possédant une forte activité anti-A mais pas d'activité anti-B, ou
· fortement enrichies en en immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et possédant une forte activité anti-B mais pas d'activité anti-A. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Thorpe SJ, Fox BJ, Dolman CD, Thorpe R. Anti-A and anti-B activity in batches of différent intravenous immunoglobulin products determined using a direct haemagglutination method. Biologicals. 2005 Jun;33(2):1 11 -6.
Thorpe SJ, Fox B, Sharp G, Heath AB, Behr-Gross ME, Terao E, Virata-Theimer ML, Yu MW. International collaborative study to evaluate candidate référence reagents to standardise haemagglutination testing for anti-A and anti-B in normal intravenous immunoglobulin products. Vox Sang. 2009 Aug;97(2): 160-8.
Thorpe SJ, Fox B, Sharp G, Heath AB, Behr-Gross ME, Terao E, Virata-Theimer ML, Yu MW. International collaborative study to establish référence préparations to standardise haemagglutination testing for anti-A and anti-B in normal intravenous immunoglobulins by the direct method. Pharmeur Bio Sci Notes. 2010 Apr;2010(1 ):39- 50.
WHO/BS/08.2091
W099/64462
WO01 /27623
WO02/092632
WO2007/077365

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, caractérisée en ce qu'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti- B.
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que les immunoglobulines humaines polyclonales représentent au moins 85% en poids des protéines totales de la composition.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A.
4. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'au moins 80% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisée en ce qu'elle possède une activité anti-A ou une activité anti-B enrichie d'un facteur au moins 4 par rapport à une référence EDQM ou à des immunoglobulines humaines normales lyophilisées.
6. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce la composition comprend à la fois des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et en ce que le rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est compris entre 1 /10 et 10/1.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 , 2 et 6, caractérisée en ce qu'elle possède un rapport (activité anti-A/ activité anti-B) compris entre 1 /10 et 10/1.
8. Composition selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est compris entre 2/1 et 10/1.
9. Composition selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est compris entre 1 /10 et 1 /2.
10. Composition selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport en poids immunoglobulines humaines polyclonales anti-A sur immunoglobulines humaines polyclonales anti-B est compris entre 3/10 et 7/10, avantageusement entre 4/10 et 6/10.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle présente une concentration en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B supérieure à 1 g/L.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce qu'au moins 90% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales présentes dans la composition sont des IgG.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'au moins 40% en poids des immunoglobulines humaines polyclonales d 'isotype IgG présentes dans la composition sont de sous-classe lgG2.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle possède un ratio en poids lgG2/lgG1 d'au moins 0,8.
15. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d'un lot de plasma humain ou d'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle, et
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée.
16. Procédé de préparation d'une composition selon la revendication 3 ou la revendication 5, comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d'un lot de plasma humain ou d'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
17. Procédé de préparation d 'une composition selon la revendication 4 ou la revendication 5, comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d 'un lot de plasma humain ou d 'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) mise en réserve de la fraction non adsorbée pour une utilisation ultérieure éventuelle,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée,
d) adsorption de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A, et
e) récolte de la fraction non adsorbée.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 5 à 17, caractérisé en ce que le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A comprend le trisaccharide GalNAcal -3(Fuca1 -2)Gal.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 5 à 18, caractérisé en ce que le ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B comprend le trisaccharide Galal -3(Fuca1 -2)Gal.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 5 à 19, caractérisé en ce que le support utilisé à l'étape a) et/ou à l'étape d) se présente sous la forme :
a) de particules, avantageusement de particules de polymère, greffées par le ou les ligands d 'intérêt, ou
b) d'une membrane polymérique, la membrane étant greffée par le ou les ligands d 'intérêt.
21 . Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le polymère des particules ou de la membrane est choisi parmi la cellulose et ses dérivés, l'agarose, le dextran, les polyacrylates, le polystyrène, le polyacrylamide, le polyméthacrylamide, les copolymères de styrène et divinylbenzène, ou les mélanges de ces polymères.
22. Procédé selon la revendication 20 ou la revendication 21 , caractérisé en ce que le ou les ligands d 'intérêt sont greffés sur les particules de polymères ou sur la membrane polymérique par l'intermédiaire d'un espaceur.
23. Composition susceptible d 'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 5 à 22.
24. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 comprenant les étapes suivantes :
a) adsorption d'une fraction d'immunoglobulines humaines polyclonales prépurifiée, en particulier d'une fraction de plasma humain enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales issue d 'une chromatographie échangeuse d 'anions à pH alcalin, sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-B et par un ligand spécifique des immunoglobulines humaines polyclonales anti-A,
b) récupération de la fraction non adsorbée pour l'utilisation dans un procédé de purification d'un concentré d 'immunoglobulines humaines polyvalentes dépiété en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et anti-B,
c) dissociation et récolte de la fraction adsorbée à l'étape a),
d) adsorption d 'une partie de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin B, et récolte de la fraction non adsorbée enrichie en anti-A, e) adsorption de l'autre partie de la composition obtenue à l'étape c) sur un support greffé par un ligand spécifique des immunoglobulines reconnaissant les antigènes du groupe sanguin A, et récolte de la fraction non adsorbée enrichie en anti-B.
25. Utilisation d 'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et 23 comme témoin positif dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales.
26. Utilisation d 'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 et 23 pour la préparation d 'un témoin positif destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales.
27. Procédé de préparation d'un témoin positif inférieur à la limite, d'un témoin positif limite, ou d 'un témoin positif supérieur à la limite destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, comprenant les étapes suivantes : a) la fourniture d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales possédant une activité anti-A et une activité anti-B inférieures à une valeur limite donnée dans ladite méthode de dosage,
b) l'ajout de quantités croissantes d 'une composition selon la revendication 3 et/ou d 'une composition selon la revendication 4 et/ou d 'une composition selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 pour obtenir différentes compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B,
c) le dosage par ladite méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B des compositions enrichies en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti- B obtenues à l'étape b), et
d) la sélection de la composition enrichie en immunoglobulines humaines polyclonales anti-A et/ou anti-B ayant une activité anti-A et/ou anti-B dans ladite méthode de dosage inférieure (pour obtenir un témoin positif inférieur à la limite), égale (pour obtenir un témoin positif limite), ou supérieure (pour obtenir un témoin positif supérieur à la limite) à ladite valeur limite.
28. Témoin positif destiné à être utilisé dans une méthode de dosage de l'activité anti-A et/ou anti-B d 'une composition comprenant des immunoglobulines humaines polyclonales, susceptible d 'être obtenu par le procédé selon la revendication 27.
29. Utilisation d 'une composition selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, ou d 'une composition susceptible d 'être obtenue par le procédé selon la revendication 16 ou la revendication 17, dans un test de détermination du groupe sanguin d'un sujet.
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