KR20170030031A - 항-a 또는 항-b 항체에 결합하는 크로마토그래피 매질의 품질 평가 방법 - Google Patents

항-a 또는 항-b 항체에 결합하는 크로마토그래피 매질의 품질 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본원에 기재된 실시양태는 샘플로부터 항-A 또는 항-B 항체를 제거하기 위한 크로마토그래피 매질의 품질을 평가하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 정제된 단일클론성 IgM-A 및 IgM-B 항체의 사용을 적용한다.

Description

항-A 또는 항-B 항체에 결합하는 크로마토그래피 매질의 품질 평가 방법{METHODS OF EVALUATING QUALITY OF A CHROMATOGRAPHY MEDIA WHICH BINDS ANTI-A OR ANTI-B ANTIBODIES}
관련 출원의 교차참조
본 출원은 2015년 9월 8일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/215,423호를 우선권 주장하며, 그 전체 내용은 전체적으로 본 명세서에 포함된다.
면역글로불린이 풍부한 인간 혈장은 특정의 선천적 결핍을 치료하기 위해서 뿐만 아니라 다수의 질병을 치료하기 위해 사용된다. 전형적으로, 인간 혈장은 서로 다른 혈액형을 갖는 다수의 제공자로부터 얻은 혈장을 모아서 얻어진다. 혈액형은 4개의 주요 형으로 나뉠 수 있다. A형 혈액형 - 적혈구 상에서 A 항원(및 혈장에서는 B 항체) 만을 가짐; B형 혈액형 - 적혈구 상에서 B 항원(및 혈장에서는 A 항체) 만을 가짐; AB형 혈액형 - 적혈구 상에서 A 및 B 항원 모두 가짐(또 혈장에서는 A 항체도 B 항체도 가지지 않음); 및 O형 혈액형 - 적혈구 상에서 A 항원도 B 항원도 가지지 않음(및 혈장에서는 A 항체 및 B 항체 모두 가짐).
A와 같은 특정 혈액형 항원을 갖는 사람의 적혈구는 상기 항원에 결합하는 항-A 항원 항체와 같은 항체와는 결코 접촉하지 않는 것이 중요한데, 그러한 항체와의 접촉이 사망도 초래할 수 있는 적혈구의 응집 및/또는 용혈(hemolysis)반응을 유발할 것이기 때문이다. 따라서, A형 혈액형을 갖는 수혜자(recipient)는 A형 혈액형 또는 AB형 혈액형을 갖는 제공자로부터 받은 혈장만을 받을 수 있고; B형 혈액형을 갖는 수혜자는 B형 혈액형 또는 AB형 혈액형을 갖는 제공자(donor)로부터 받은 혈장만을 받을 수 있으며; AB형 혈액형을 갖는 수혜자는 AB형 혈액형을 갖는 제공자로부터 얻은 혈장만을 받을 수 있고; 또 O혈 혈액형을 갖는 수혜자는 만능 수혜자로 간주된다. 다른 혈액형의 호환성은 안전한 수혈과 장기 이식의 개발에 중요하다. 그러나, 일관된 단백질 성분 평균을 얻기 위하여 다수의 사람들로부터 혈장을 모으는 것에 의존하는 혈액 유도 치료 약제의 경우, 수혜자가 비적합성(non-compatible) 혈장을 받지 않도록 보장하는 것이 특히 어렵게 된다.
포르말린화된 열처리된 적혈구(Vox Sang., 1967, 12, 75-77), A 및 B 항원을 갖는 열처리된 대장균 O86:B7(Transfusion, 1972, 12, 98-102), 적혈구 기질(stroma) 분말, 적혈구 기질 항원 유래 면역흡착제(Chemical Soc. Rev., 1978, 7, 423-452), 및 합성 A형 및 B형 혈액형 면역흡착제(Rev. Fr. Transfus. Immunohematol. 1981, 24, 3, 281-287)를 비롯한 혈장으로부터의 혈액형 항체를 선택적으로 제거하기 위하여 다수의 방법이 개발되어 왔다.
고상 크로마토그래피 면역흡착제는 혈액 유래 생성물의 처리를 위해 또 ABO 부적합 수혜자(non-compatible recipient)에게 이식하기 전에 제공자의 제제에 대한 상업적 크로마토그래피 매질로서 개발되어 왔다. 합성 면역흡착제를 이용하는 주요한 이점 중의 하나는 이들이 천연 공급원으로부터 유도되는 대신 합성적으로 작성되므로 뱃치에서 뱃치로 보다 일관된 특성을 갖는 점이다.
현재, A형 혈액형 항원(A-항원) 리간드 및/또는 B형 혈액형 항원(B-항원) 리간드를 갖는 상업적으로 입수가능한 크로마토그래피 매질의 일부는 Glycosorb-ABO 장치(Glycorex Transplantation AB)를 포함한다. 이 Glycosorb 장치는 부적합 혈액형을 갖는 환자들에게 이식용 장기 제공자를 준비하기 위해 이용된다. Glycosorb-ABO 장치 중에서 혈액형 항원 리간드는 장기 제공자의 혈액으로부터 A형 혈액형 항원 항체(항-A) 및 B형 혈액형 항원 항체(항-B)를 결합하여 제거함으로써 장기 거부의 우려를 감소시킨다.
혈액 유래 생성물을 정제하기 위하여 크로마토그래피 매질을 이용하는데 있어 주요한 어려움 중의 하나는 서로 다른 매질, 예를 들어, 동일 유형의 매질의 서로 다른 뱃치 또는 다른 공급원으로부터의 매질 또는 시간 경과에 따른 동일 매질 샘플의 상대적 품질을 평가하는 효과적이고 재현가능한 방법이 부족한 것이다.
요약
본원에 기재된 실시양태는 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 함유하는 크로마토그래피 매질의 품질을 평가하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법은 동일 유형의 매질을 뱃치에서 뱃치로의 품질을 사용 중 또는 사용 후에 평가하고 또 개발하는 동안 매질을 최적화하는데 특히 유용하다.
일부 실시양태에서, 고형 지지체에 부착된 A형 혈액형 항원 리간드를 함유하는 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질을 비교하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 각각 부피(VR)를 갖는 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플을 제공하는 단계; (b) 각 샘플을 공지 농도(C1) 및 부피(VM)를 갖는 정제된 단일클론성(monoclonal) IgM-A 항체 용액과 함께 배양하는 단계; (c) 샘플 각각에 대한 상청액을 얻고 또 각 상청액 중의 IgM-A 항체의 농도(C2)를 측정하는 단계; (d) 다음 식
Figure pat00001
을 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질 샘플 각각의 정적 결합능(static binding capacity)을 결정하는 단계;를 포함한다:
식 중에서, IgM-A에 대한 매질 샘플의 정적 결합능은 샘플로부터 항-A 항체를 제거하는 이들의 능력과 관련되므로, 2개 이상의 상이한 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질 비교를 제공한다.
다른 실시양태에서, 고형 지지체에 부착된 B형 혈액형 항원 리간드를 각각 함유하는 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질을 비교하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 각각 부피(VR)를 갖는 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플을 제공하는 단계; (b) 각 샘플을 공지 농도(C1) 및 부피(VM)를 갖는 정제된 단일클론성 IgM-B 항체 용액과 함께 배양하는 단계; (c) 샘플 각각에 대한 상청액을 얻고 또 각 상청액 중의 IgM-B 항체의 농도(C2)를 측정하는 단계; (d) 다음 식
Figure pat00002
을 이용하여 친화성 크로마토그래피 매질 샘플 각각의 정적 결합능을 결정하는 단계;를 포함한다:
식 중에서, IgM-B에 대한 매질 샘플의 정적 결합능은 샘플로부터 항-B 항체를 제거하는 이들의 능력과 관련되므로, 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질의 비교를 제공한다.
비교되는 다른 샘플에 비하여 IgM-A 또는 IgM-B에 대해 더 높은 결합능을 갖는 매질 샘플은 다른 매질 샘플에 비교하여 더 우수한 품질의 것이다.
본원에 기재된 방법에 따른 일부 실시양태에서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 다공성 또는 비다공성 중합체성 고형 지지체이다. 특정 실시양태에서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르계(polyvinylether based) 고형 지지체이다. 일부 실시양태에서, 고형 지지체는 비드 형태(예를 들어, 폴리비닐 에테르계 비드)이다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 상이한 친화성 크로마토그래피 매질 샘플은 동일 유형의 매질의 서로 다른 뱃치(batch)를 구성한다.
다른 실시양태에서, 상이한 친화성 크로마토그래피 매질 샘플은 상이한 사용 단계에서 동일 매질을 구성한다.
일부 실시양태에서, 상기 매질은 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 및 IVIG(intravenous immunglogulin)로 구성된 군으로부터 선택된 샘플로부터 항-A 또는 항-B 항체를 제거할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상청액 중에서 IgM-A 또는 IgM-B 항체의 농도는 280 nm에서 흡광도(absorbance)를 이용하여 측정된다.
친화성 크로마토그래피 매질이 산 또는 알칼리 조건에 노출된 후, 고형 지지체에 부착된 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 함유하는 친화성 크로마토그래피 매질의 품질을 평가하는 방법이 본원에서 또한 제공되며, 상기 방법은 (a) 고형 지지체에 부착된 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 갖는 크로마토그래피 매질을 제공하는 단계; (b) A형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-A 항체에 대한 매질의 결합능 또는 B형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-B 항체에 대한 매질의 결합능을 측정하는 단계; (c) 매질을 산 또는 알칼리 조건에 적어도 5시간 동안 노출시키는 단계; 및 (d) A형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-A 항체에 대한 매질의 결합능 또는 B형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-B 항체에 대한 매질의 결합능을 측정하는 단계를 포함하고;
단계 (b)에 비교한 단계 (d)에서 매질의 결합능 감소는 매질의 품질이 산 또는 알칼리 조건에 노출된 이후 감소되었음을 나타낸다.
본원에 기재된 실시양태는 매질이 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는지 여부를 결정하기 위해서도 사용될 수 있고, 상기 방법은 (a) 매질이 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는지 여부가 알려져 있지 않은 매질을 제공하는 단계; (b) 정제된 단일클론성 IgM-A 항체 및 별개의 정제된 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 상기 미지 매질의 결합능을 측정하는 단계; 및 (c) 정제된 단일클론성 IgM-A 항체 및 정제된 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 상기 미지 매질의 능력을 비교하는 단계를 포함하며; 상기 미지 매질이 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 결합능과 비교하여 단일클론성 IgM-A 항체에 대하여 더 높은 결합능을 가지면, 상기 미지 매질은 A형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 것으로 결정되고, 또 상기 미지 매질이 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 결합능과 비교하여 단일클론성 IgM-B 항체에 대하여 더 높은 결합능을 가지면, 상기 미지 매질은 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 것으로 결정된다.
일부 실시양태에서, 미지 매질이 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 결합능을 가지고 또 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 결합능을 갖지 않으면, 미지 매질은 A형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 것으로 결정된다. 역으로, 미지 매질이 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 결합능을 갖고 또 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 결합능을 갖지 않으면, 미지 매질은 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 것으로 결정된다.
도 1은 항-A 항원 항체와 결합하는 대표적 올리고당 리간드이다.
도 2는 항-B 항원 항체와 결합하는 대표적 올리고당 리간드이다.
상세한 설명
최근 몇몇 혈액 제공자, 때때로 천명 또는 천명 이상의 혈액 제공자로부터 얻어서 모아진 혈장으로부터 추출된 농축된 다가 IgG 항체로 구성된 정맥주사용 면역글로불린(intravenous immunoglobulin: IVIG)으로부터 항-A 및 항-B IgG를 제거하기 위하여 합성 면역흡착성 크로마토그래피 매질을 적용하는데 관심이 증가되어 왔다. 혈장으로부터 IgG를 정제하는 공정 동안, 대형 항-A 및 항-B IgM 항체는 분별(fractionation)에 의해 소형 IgG 항체로부터 전형적으로 분리될 수 있다. 그러나, 상기 항-A 및 항-B 항체의 일부 퍼센트는 대개 분별 단독으로는 다른 IgG 항체로부터 구별될 수 없는 IgG 형태이다. 따라서, IVIG 치료 농축물은 고 농도의 항-A 및 항-B IgG 항체를 갖는 IVIG의 투여를 방지하기 위하여 항-A 및 항-B IgG 항체의 농도를 모니터링하는 응집 에세이를 이용하여 전형적으로 스크리닝된다. 그러나, 이러한 예방책에도 불구하고, 사망에 이르게 할 수 있는 용혈반응이 A형, B형, 또는 AB형 혈액형을 갖는 수혜자에서 여전히 생길 수 있는 것이 알려져 있다(Transcript for "Strategies to address hemolytic complications of immune globulin infusions," FDA Center for Biologics Evaluation and Research Public Workshop Washington, D.C. January 28-29, 2014).
보통의 응집 에세이는 제한된 수명을 갖고 또 세포 표면 상에서 항원의 밀도가 로트별(from lot to lot)로 일반적으로 다양한 살아있는 적혈구의 사용에 의존한다. 응집은 또한 계열희석(serial dilutions)을 필요로 하고 또 세포 응집의 정성 평가(육안 또는 현미경 관찰)에 의존한다. 항-A 및 항-B 항체의 농도를 결정하는 보다 정확한 방법은 플로우 사이토미트리(flow cytometry)를 적용한다. 그러나, 플로우 사이토미트리 방법 또한 살아있는 적혈구를 사용하여서 응집 에세이에 비하여 현저히 더 복잡하고 시간 소모적이다. ELISA 에세이는 항-A 및 항-B 항체의 농도를 측정하는 것으로 보고되어 있으나, 이 수법은 비교적 복잡한 다단계 과정 및 특수 항원 시약을 필요로 한다.
상기 논의한 바와 같이, 항-A 또는 항-B 항체와 결합하는 리간드를 함유하는 크로마토그래피 면역흡착성 매질은 혈액 유래 생성물, 예를 들어, 혈장 및 IVIG로부터 그러한 항체를 제거하는데 효과적인 것으로 간주된다. 그러나, 현재, 이들의 재현성 및 신뢰성을 평가하기 위하여, 그러한 매질의 자격과 유효성에 대해 이용될 수 있는 양호한 방법이 아직 얻어지지 않고 있다.
매질이 그 수명동안 제조 처방 및 물질 요건을 충족함을 보증하도록, 혈액형 항원 리간드 크로마토그래피 매질의 뱃치별(batch-to-batch) 품질을 평가하는 것이 중요하다. 또한, 매질을 사용, 세정 및 위생화(sanitization)하는 동안 및 후에, 매질이 이후의 사용, 세정 및 위생화 과정에서 목적하는 불순물 제거능을 유지하는지 확실히 하기 위하여 그러한 매질을 평가하는 것이 역시 중요하다. 목적하는 표적 분자에 결합하는 혈액형 항원 리간드 매질의 능력은 혈액형 항원 리간드 매질과 접촉하기 전후에 혈액 유래 생성물 중의 다중클론성 혈액형 항원 항체의 농도 감소를 측정하는 것에 의해 보통 직접적으로 평가되어 왔다.
본원의 실시예에 의해 분명한 바와 같이, 정제된 IgM 단일클론성 항체에 대한 항-A 및 항-B 항원 리간드 매질의 능력은 IVIG 공급물로부터 사정에 맞게 A형 혈액형 항체 또는 B형 혈액형 항체를 제거하는 매질의 능력과 관련된다. 이 발견은 IgG 및 IgM 분자의 유형과 크기 사이의 고유한 차이로 인하여 오히려 예상치 못한 것이었다. 다시 말해, IgM는 오량체 구조를 갖고 또 오량체 구조를 갖는 IgM 분자에 대한 매질의 결합능이 단량체 구조를 갖는 IgG 분자를 제거하는 매질의 능력과 관련될 것이라고 예상하지 않았을 것이다. 또한, 본원에 기재된 실시예에 의해 분명한 바와 같이, 쥐 IgM 항체에 대한 매질의 결합능은 샘플, 예를 들어, IVIG 공급물로부터, 즉, 완전히 상이한 종으로부터 얻은 인간 IgG 분자의 일정 부분(a percentage)을 제거하는 능력을 예고하는 것이며, 이는 예상치 못한 것이었다.
정제된 분자(예를 들어, 이 경우에서 IgM)에 대한 혈액형 항원 리간드 함유 매질의 능력을 측정하는 것은, 혈액 생성물로부터 혈액형 항원 항체의 제거를 측정하는 것에 대개 의존하는 시간 소모적이고 재현하기 어려운 이전에 기재된 방법들에 비하여, 몇 개의 이점을 갖는다. 대조적으로, 본원에 기재된 실시양태는 당해 분야에 공지된 통상의 방법에 비하여 더욱 효과적으로 또 재현가능하게 실시될 수 있는, 정제된 분자에 대한 결합능을 측정하는 것에 의존한다.
특히, 본원에 기재된 방법은 일관된 농도의 단일클론성 항체가 각 능력 측정용으로 제조될 수 있기 때문에 보다 용이하게 재현가능할 뿐만 아니라 본원에 기재된 방법은 또한 특수한 장비(예를 들어, 플로우 사이토미트리용) 또는 특수한 혈액형 항원 시약(예를 들어, ELISA를 기초한 에세이용)을 필요로 하지 않는다.
본원에 기재된 실시양태를 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명 전반을 통하여 기재된다.
I. 정의
용어 "결합능"은 컬럼에 팩킹되어 정의된 조건하에서 처리되는 매질의 소정 부피에 결합하는 분자의 양을 지칭한다. 본원에 기재된 크로마토그래피 매질의 결합능은 크로마토그래피 매질이 소정 유동 속도에서 매질 부피당 결합할 수 있는 항-A 또는 항-B 항체의 양이다.
본원에 기재된 실시양태에서, 정제된 IgM 단일클론성 항체는 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는데 적합한 크로마토그래피 매질의 결합능을 평가하기 위해 사용된다; 또 이러한 결합능은 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는 이러한 매질의 능력과 관련된다. 다시 말해, IgM에 대한 크로마토그래피 매질의 결합능은 사정에 맞게 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는 매질의 효능을 결정하는 지표로서 이용될 수 있다. 이 결합능은 정적 결합능 또는 동적 결합능으로서 측정될 수 있다.
용어 매질(예를 들어, 크로마토그래피 매질)의 "정적 결합능(static binding capacity)"은 사용된 매질의 부피로 나뉜 매질에 의해 결합된 단백질의 양으로 정의된다. 크로마토그래피 매질의 정적 결합능을 측정하는 예시적 방법은 다음과 같다. 크로마토그래피 매질을 공지 농도의 단백질 용액과 접촉시킨 후, 그 용액을 매질과 함께 배양시켜 크로마토그래피 매질에 대한 상기 단백질의 결합을 촉진시킨다. 배양 시간은 다양할 수 있고(예를 들어, 5분 내지 72시간) 또 상청액에서 측정가능한 농도 변화가 없을 때까지, 예를 들어, 상청액 중의 단백질의 농도를 주기적으로 측정하는 것에 의해(예를 들어, 280 nm에서 흡광도를 측정하는 것에 의해) 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다, 크로마토그래피 매질에 결합된 단백질과 상기 용액 중에서 균형이 도달하면, 상청액 중에서 단백질 용액의 농도를 다시 측정한다. 이어 정적 결합능은 사용된 매질의 부피로 나뉜, 단백질의 개시량(배양 전) - 상청액 중의 단백질의 양(배양 후)에 의해 측정된다.
특정 크로마토그래피 매질의 정적 결합능은 하나 이상의 다음 요소, 예를 들어, 단백질의 농도, 사용된 크로마토그래피 매질의 양, 용액 중의 다른 성분(염, 유기 분자, 완충제)의 양, 용액 pH, 및 도전성을 비롯한 단백질 용액의 조성에 의해 영향을 일반적으로 받는다. 정적 결합능은 또한 단백질 용액의 온도에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 이들 변수 모두는 2개의 상이한 크로마토그래피 매질 사이에서 정적 결합능의 대비를 허용하기 위하여 대개 일정하게 유지된다. 용어 "정적 결합능"은 "포화 결합능" 또는 "최대 결합능" 이라고도 지칭될 수 있다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 정제된 단일클론성 IgM 항체에 대한 A형 혈액형 항원 리간드 함유 매질 또는 B형 혈액형 항원 리간드 함유 매질의 정적 결합능은 샘플(예를 들어, IVIG 공급물)로부터 사정에 맞게 항-A 또는 항-B 항체를 제거하기 위한 능력을 예측하거나 또는 평가하는 지표로서 이용된다. 매질의 2개의 상이한 뱃치 또는 시간 경과에 따른 동일 매질 또는 다른 공급원으로부터 얻은 매질의 정적 결합능을 비교하는 것이 특히 유용한데, 이는 매질의 품질에 관한 정보를 제공하기 때문이다. 다시 말해, 정제된 IgM 항체에 대한 결합능은 사정에 맞게 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는 능력과 관련되기 때문에, 상기 결합능은 매질의 서로 다른 뱃치 또는 시간 경과에 따른 동일 매질 또는 다른 공급원으로부터 얻은 매질의 성능을 평가하고 비교하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법을 이용하여, 관련 기술분야의 당업자 또는 최종 사용자는 매질의 뱃치가 동일 유형의 매질의 다른 뱃치에 대해, 또는 시간 경과에 따라, 특히 반복되는 세정 및 위생화 이후에 그의 성능(즉, 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는 능력) 손실을 나타내는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 정제된 IgM에 대한 정적 결합능의 측정은 전개(development)하는 동안 매질을 최적화하기 위해 이용될 수 있다.
일반적으로, 정적 결합능은 다음과 같이 산출될 수 있다. 부피(VR)의 매질 샘플은 공지 농도(C1) 및 공지 부피(VM)의 정제된 단일클론성 IgM 항체 (A형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에 IgM-A 및 B형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에 IgM-B) 용액과 함께 배양된다; 상청액을 얻고 이 상청액에서 IgM 항체의 농도 C2를 측정한다; 이어 다음 식을 이용하여 정적 결합능을 산출한다.
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용어 "동적 결합능"은 크로마토그래피 컬럼을 나오는 단백질 용액의 농도가 특정 농도, 전형적으로 개시 농도의 소정 퍼센트에 도달하는 지점에서 유동 조건하에서의 크로마토그래피 컬럼에 의해 결합된 단백질의 양으로 정의된다. 실제로, 이것은 개시 농도의 약 10%에 상응한다. 이어 단백질의 중량은 크로마토그래피 컬럼 중의 매질의 부피로 나뉜다.
특정 크로마토그래피 매질의 동적 결합능은 하나 이상의 다음 요소, 예를 들어, 단백질의 농도, 용액 중의 다른 성분(염, 유기 분자, 완충제)의 양, 용액 pH, 및 도전성을 비롯한 단백질 용액의 조성에 의해서 보통 영향을 받는다. 동적 결합능은 컬럼이 로딩되는 온도에 의해 또 단백질 용액이 컬럼에 로딩되는 유동 속도에 의해 영향을 받을 수 있다. 단백질 용액을 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 유동 속도를 감소시키면 측정되는 동적 결합능을 증가시킨다. 역으로, 단백질 용액을 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 유동 속도를 증가시키면 측정되는 동적 결합능을 감소시킨다. 동적 결합능은, 크로마토그래피 매질의 동적 능력이 전체 질량 전달 속도에 의해 제한되기 때문에, 정적 결합능을 초과해서는 안된다.
용어 "상청액"은 침강된 크로마토그래피 매질 위의 액체로 규정된다. 상청액 용액은 슬러리 중의 크로마토그래피 매질이 용기 또는 컬럼의 바닥에 침강하게 하는 것에 의해 얻을 수 있다. 침강 공정은 크로마토그래피 매질의 슬러리를 원심분리 처리하거나 또는 진동에 의해 가속될 수 있다. 상기 상청액 용액은 피펫팅, 주사기, 또는 펌프를 통하여 별개 용기로 전달하는 것에 의해 크로마토그래피 매질로부터 분리될 수 있다. 또한, 상청액은 크로마토그래피 매질의 슬러리를 막 또는 다공성 물질을 통하여 여과하는 것에 의해 얻을 수 있다.
용어 "샘플"은 본원에 기재된 바와 같이 크로마토그래피 매질에 결합시키려 하는 적어도 하나의 표적 단백질(예를 들어, 이 경우에서는 항-A 또는 항-B 항체)을 함유하는 용액으로 정의된다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 단백질은 항체 또는 면역글로불린이다. 일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린은 A형 혈액형 항원 항체(즉, 항-A 항체)이다. 다른 실시양태에서, 상기 면역글로불린은 B형 혈액형 항원 항체(즉, 항-B 항체)이다. 샘플의 예는, 비제한적으로, 혈액, 혈장, 혈장 유도체, 혈액 생성물, 정맥주사용 면역글로불린(IVIG) 공급물을 포함한다.
용어 "IgG," "면역글로불린," "Ig" 또는 "항체"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 기본적 4개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 디설피드 결합에 의해 안정화(clarified)되며, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "단일-사슬 면역글로불린" 또는 "단일-사슬 항체"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진 2개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭하며, 상기 사슬은 예를 들어, 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화되며, 항원을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 용어 "도메인"은 예를 들어, β-플리티드 시트 및/또는 사슬간 디설피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예컨대 3 내지 4개 펩티드 루프 포함)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구형 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 본 발명에서는 "불변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 서열 변화의 상대적 결여, 또는 "가변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 현저한 변형을 기본으로 하여 "불변" 또는 "가변"으로도 칭한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 당해 분야에서 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로도 칭한다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로 칭한다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인이라 칭한다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 상호교환적으로 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인이라 칭한다.
면역글로불린 또는 항체는 단일클론성 또는 다중클론성일 수 있고 또 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "IgM" 또는 "면역글로불린 M"은 오량체 구조를 갖는 항체, 예를 들어, 혈청에서 발견되는 IgM 항체를 지칭한다. 대략 970 kDa의 분자량을 가지고 있어, IgM 항체는 단량체 구조를 갖고 또 대략 150 kDa의 분자량을 갖는 IgG 보다 상당히 더 큰 것으로 간주된다. 2개의 항원 결합 부위를 갖는 IgG 항체와 달리, IgM 항체는 10개의 항원 결합 부위를 갖는다. IgM 항체는 수혜자가 부적합 제공자로부터 수혈을 받을 때 적혈구의 응집에 주로 관여한다. 예를 들어, A형 혈액형이고 항-B IgM 항체를 갖는 사람은 B형 혈액형 제공자로부터 수혈받을 때 응집을 경험할 것이다. 대형 IgM 항체는 분별에 의해 혈장 중의 소형 IgG 항체로부터 일반적으로 분리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "크로마토그래피"는 샘플 중의 다른 분자로부터 분자(예를 들어, 이 경우에서 항-A 및/또는 항-B 항체)를 분리하거나 제거하는 동적 분리 수법을 지칭한다. 전형적으로, 크로마토그래피 방법에서, 이동상(액체 또는 가스)은 정지상(보통 고체) 매질(예를 들어, 크로마토그래피 매질)을 통하여 분리 또는 제거하려는 상기 분자를 함유하는 샘플을 수송한다. 분배의 차이 또는 정지상에 대한 친화성은 상기 분자를 샘플의 다른 성분으로부터 분리시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "친화성 크로마토그래피"는 분리되거나 또는 제거될 분자(예를 들어, 항-A 및/또는 항-B 항체)는 분리되거나 또는 제거될 분자와 특이적으로 상호작용하는 다른 분자(예를 들어, 고형 지지체에 고정화된 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드)와의 상호작용에 의해 단리되는 크로마토그래피 모드를 지칭한다. 친화성 크로마토그래피에 사용된 매질은 친화성 크로마토그래피 매질이라 칭한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "매질" 또는 "크로마토그래피 매질"은 A형 혈액형 항원 리간드 및/또는 B형 혈액형 항원 리간드가 위에 고정되어 있는 고형 지지체를 치칭한다.
본원에 기재된 방법은 2015년 9월 8일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/215,401호에 기재된 것을 비롯하여, 항-A 및/또는 항-B 항체를 제거하기에 적합한 크로마토그래피 매질의 품질을 평가하기 위해 이용될 수 있다.
본원에 기재된 실시양태에서, 정제된 IgM 용액은 고형 지지체에 부착된 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 크로마토그래피 매질의 결합능을 평가하기 위해 사용된다. 다시 말해, 정제된 IgM 단일클론성 항체는 항-A 또는 항-B 항체를 제거하기에 적합한 크로마토그래피 매질의 품질을 조사하기 위한 모델 분자로서 사용된다.
용어 "항-A" 또는 "항-A 항체"는 A형 혈액형 또는 AB형 혈액형을 갖는 개인에서 세포벽 상에서 발견되는 A형 혈액형 항원과 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, 혈액 유래 샘플(예를 들어, 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 또는 IVIG 공급물)에서 그러한 항체를 제거하는 것이 바람직하다.
용어 "항-B" 또는 "항-B 항체"는 B형 혈액형 또는 AB형 혈액형을 갖는 개인에서 세포 벽 상에서 발견되는 B형 혈액형 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, 혈액 유래 샘플(예를 들어, 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 또는 IVIG 공급물)에서 그러한 항체를 제거하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "매질의 품질"은 샘플(예를 들어, 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 또는 IVIG 공급물)로부터 바람직하지 않은 성분(예를 들어, 항-A 또는 항-B 항체)을 선택적으로 제거하는 크로마토그래피 매질의 능력을 지칭한다. 본원에 제공된 방법은 상이한 매질(예를 들어, 전개하는 동안 또는 제조 공정 중에 얻어지는 동일 유형의 매질의 서로 다른 뱃치 또는 서로 다른 공급원으로부터의 동일 유형의 매질 또는 매질 샘플 또는 프로토타입(protoypes)의 상대적 품질을 정제된 IgM 단일클론성 항체에 대한 이들의 결합능을 측정하는 것에 의해 평가 및/또는 모니터링하기에 특히 유용하다. 다시 말해, 정제된 단일클론성 IgM 항체에 대한 상이한 매질 또는 매질 샘플의 상대적 결합능은 항-A 또는 항-B 항체를 선택적으로 제거하려는 매질 능력(즉, 매질 또는 매질 샘플의 상대적 품질)의 지표이다. 따라서, 특정 IgM 분자에 대한 매질의 결합능은 동일 매질의 다른 뱃치에 대한 매질의 전반적 품질 또는 시간 경과, 예를 들어, 제조, 사용, 세정 및 위생화하는 동안의 동일 매질의 품질을 구분하기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 동일 유형의 매질의 뱃치의 이전에 제조된 뱃치에 비하여 정제된 IgM-A 항체에 대해 더 낮은 결합능을 갖는 항-A 항체를 제거하기 위해 고안된 매질의 뱃치는 샘플로부터 적은 퍼센트의 항-A 항체를 제거할 것으로 예상될 것이기 때문에 이전의 뱃치에 비교하여 불량한 품질일 것이다. 역으로, 동일 유형의 매질의 뱃치의 이전에 제조된 뱃치에 비하여 정제된 IgM-A 항체에 대해 더 높은 결합능을 갖는 항-A 항체를 제거하기 위해 고안된 매질의 뱃치는 샘플로부터 고 비율의 항-A 항체를 제거할 것으로 예상될 것이기 때문에 이전의 뱃치에 비교하여 더 우수한 품질일 것이다. 유사하게, 동일 유형의 매질의 뱃치의 이전에 제조된 뱃치에 비하여 정제된 IgM-B 항체에 대해 더 낮은 결합능을 갖는 항-A 항체를 제거하기 위해 고안된 매질의 뱃치는 샘플로부터 적은 퍼센트의 항-B 항체를 제거할 것으로 예상될 것이기 때문에 이전의 뱃치에 비교하여 불량한 품질일 것이다. 역으로, 동일 유형의 매질의 뱃치의 이전에 제조된 뱃치에 비하여 정제된 IgM-B 항체에 대해 더 높은 결합능을 갖는 항-B 항체를 제거하기 위해 고안된 매질의 뱃치는 샘플로부터 고 비율의 항-B 항체를 제거할 것으로 예상될 것이기 때문에 이전의 뱃치에 비교하여 더 우수한 품질일 것이다.
샘플로부터 바람직한 퍼센트의 항-A 항체 또는 항-B 항체를 제거하는 그의 능력을 매질이 유지하도록 보장하기 위하여 그 수명 동안 크로마토그래피 매질의 품질을 모니터링할 필요가 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 매질의 품질은 반복 사용 후, 예컨대, 가혹한 세정 및/또는 위생화 조건에 노출된 이후, 나쁜 영향을 받을 수 있어, 샘플로부터 특정 비율의 항-A 항체 또는 항-B 항체를 제거하는 그의 능력을 감소시킨다. 항-A 또는 항-B 항체를 제거하기 위해 고안된 매질의 뱃치의 품질은 매질이 반복적으로 사용되기 전 및 이후 또는 매질이 가혹한 세정 및/또는 위생화 조건에 노출되기 전 또는 이후에 정제된 IgM-A 항체 또는 IgM-B 항체 각각에 대한 결합능을 측정하는 것에 의해 모니터링될 수 있다. 정제된 IgM-A 또는 IgM-B에 대한 매질의 결합능이 이전 시간에 대비하여 감소하였다면, 이는 매질이 적은 퍼센트의 항-A 또는 항-B 항체를 제거할 것이라는 것을 나타낸다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 시간 경과에 따른 항-A 또는 항-B 제거를 위한 크로마토그래피 매질의 품질을 평가하기 위해서뿐만 아니라 매질의 2개의 별도 뱃치의 품질을 비교하는 데 유용하다.
또한, 본원에 기재된 방법은 제조하는 동안 또는 전개하는 동안 매질의 최적화를 위해 또한 이용될 수 있다. 다시 말해, 프로토타입 매질은 정제된 IgM 항체에 대한 결합능을 단순히 결정하는 것에 의해 사정에 맞게 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는 그의 능력에 대해 평가될 수 있고, 또 상기 매질은 필요하면, 정제된 IgM 항체에 대한 그의 결합능을 토대로 더 개선되거나 또는 최적화될 수 있다. 예를 들어, 일단 프로토타입 매질이 제조되면, 매질의 품질이 본원에 기재된 방법을 이용하여 평가될 수 있어, 추가의 최적화 또는 변형이 필요한지 여부를 결정한다. 이런 방식으로, 매질의 다양한 반복은 전개되는 동안 품질에 대해 용이하게 평가될 수 있어, 매질의 최종 버젼을 초래한다.
또한, 본원에 기재된 방법은 A형 혈액형 항원 리간드 매질과 B형 혈액형 항원 리간드 매질을 구별하는데 또한 유용하다. 작업자 또는 최종 사용자는 제조하는 동안 또는 제조될 때 2개 매질의 정체(identity)를 오인하기 쉬운데 이는 상기 2개 유형의 매질이 동일 위치에서 흔히 제조되고 또한 저장되어서 목측 감시시 실질적으로 동일하게 나타나기 때문이다. 본원에 기재된 방법은 이들 2개 유형의 매질 사이를 구별하는 방식을 제공하며, 즉, 매질이 항-A 항체 또는 항-B 항체와 결합하는지 여부가 미지일 때 이들을 구별하는 방식을 제공한다. 예를 들어, 미지 매질의 정체(즉, 매질이 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 함유하는지 여부)는 정제된 단일클론성 항-A IgM에 대한 결합능 및 정제된 단일클론성 항-B IgM에 대한 결합능을 정제된 단일클론성 항-A IgM 및 정제된 단일클론성 항-B IgM에 대한 모든 가능한 공지 매질의 결합능과 비교함으로써 확립될 수 있다. 따라서, A형 혈액형 항원 리간드를 함유하는 매질은 정제된 IgM-A 항체에 대한 현저한 결합능 및 정제된 IgM-B 항체에 대한 현저하게 낮은 또는 무시가능한 결합능을 나타낼 것이라 예상된다. 유사하게, B형 혈액형 항원 리간드를 함유하는 매질은 정제된 IgM-B 항체에 대한 현저한 결합능 정제된 IgM-A 항체에 대한 현저하게 낮은 또는 무시가능한 결합능을 나타낼 것이라 예상된다.
일부 실시양태에서, IgM-A 또는 IgM-B에 대한 미지 매질의 결합능은 IgM-A 또는 IgM-B(예를 들어, 상이한 뱃치로부터)에 대한 동일 유형의 공지 매질의 결합능과 비교되어 매질이 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는지 여부를 결정한다.
II. 예시적 혈액형 항원 매질
본원에 기재된 방법은 A형 혈액형 항원 항체 또는 B형 혈액형 항원 항체와 결합하는 상이한 매질의 상대적 품질을 평가하는데 유용하다.
본원에 기재된 방법은 A형 혈액형 항원 항체 또는 B형 혈액형 항원 항체와 결합하는 것으로 알려진 상업적으로 입수가능한 매질 또는 전개중인 매질을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법은 매질이 A형 혈액형 항원 항체 또는 B형 혈액형 항원 항체와 결합하는지 여부가 미지일 때 매질 유형 사이를 구별하기 위해서 또한 이용될 수 있다.
현재 상업적으로 입수가능한 또는 한때 상업적으로 입수가능하였던 매질의 예는 예를 들어, Glycorex Transplantation AB(Solvegatan 41, 223 70 Lund, Sweden)에 의해 제공된 Glycosorn ABO A-컬럼 및 B 컬럼; Dextra Laboratories Ltd(Science and Technology Centre, Earley Gate, Whiteknights Road, Reading, RG6 6BZ, United Kingdom)에 의해 제공된 A형 혈액형 삼당류 세파로오스-4B-AFF201, A형 혈액형 삼당류 세파로오스-FF-AFF101, B형 혈액형 삼당류 세파로오스-4B- AFF202, 및 B형 혈액형 삼당류 세파로오스-FF-AFF102; Chembiomed Ltd(Edmonton, Alberta, Canada)에 의해 제공된 Synsorb A 및 B 매질; 및 Lectinity Holding, Inc.(Moscow, Russia)에 의해 제공된 Allotran A 및 B 매질을 포함한다. 일반적으로, 임의 매질은 고형 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로(링커 또는 스페이서를 통하여) 부착된 A형 혈액형 항원 또는 B형 혈액형 항원의 항원결정인자(epitope)에 상응하는 리간드(전형적으로 올리고당계 리간드)를 포함하는, 본원에 기재된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 예시적 매질은 또한 2015년 9월 8일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/215,401호에서 찾아볼 수 있다.
예시적 올리고당계 리간드는 다음에 나타낸다. 구조에 이용된 약어는 다음과 같이 정의된다: Gal = D-갈락토오스, Fuc = L-푸코오스, GalNAc = N-아세틸-D-갈락토사민, GlcNAc = N-아세틸-D-글루코사민, R = 고형 지지체에 대한 리간드로부터 결합, 리간드 구조 상의 다른 위치에 있는 결합도 또한 사용될 수 있다.
A형 혈액형 항원 리간드의 예는, 비제한적으로, 다음 구조를 갖는 분자를 포함한다: 삼당류 항원 A(GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ-R), 사당류 항원 A 타입 1(GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GlcNAcβ1-R), 사당류 항원 A 타입 2(GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,4GlcNAcβ1-R), 사당류 항원 A 타입 3(GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GalNAcα1-R), 및 사당류 항원 A 타입 4(GalNAcα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GalNAcβ1-R).
B형 혈액형 항원 리간드의 예는 다음 구조를 갖는 분자를 포함한다: 삼당류 항원 B(Galα1,3[Fucα1,2]Galβ-R), 사당류 항원 B 타입 1(Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GlcNAcβ1-R), 사당류 항원 B 타입 2(Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,4GlcNAcβ1-R), 사당류 항원 B 타입 3(Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GalNAcα1-R), 및 사당류 항원 B 타입 4(Galα1,3[Fucα1,2]Galβ1,3GalNAcβ1-R).
하나 이상의 상술한 리간드는 적합한 고형 지지체에 부착될 수 있으므로, A형 혈액형 및/또는 B형 혈액형 항원 항체를 제거하기에 적합한 크로마토그래피 매질을 초래한다.
고형 지지체의 예는, 비제한적으로, 알루미나, 실리카, 셀라이트, 세라믹, 금속 산화물, 다공성 유리, 제어된 기공 유리, 탄수화물 중합체, 다당류, 아가로오스, 세파로오스, 세파덱스, 덱스트란, 셀룰로오스, 녹말, 키틴, 제올라이트, 합성 중합체, 폴리비닐 에테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리말레산 무수물, 막, 중공 섬유 및 섬유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고형 지지체는 중합체성 고형 지지체이고 또 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르계 고형 지지체이다. 일부 실시양태에서, 고형 지지체는 비드 형태(예를 들어, 폴리비닐 에테르계 비드)이다.
리간드를 고형 지지체에 부착하기 위하여 무수한 작용기를 적용할 수 있다. 이러한 작용기의 비제한적인 예는 아민, 티올, 푸란, 말레이미드, 에폭시, 알데히드, 알켄, 알킨, 아지드, 아즈락톤, 카르복실, 활성화 에스테르, 트리아진, 및 염화술포닐을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아민기가 작용기로 사용된다.
고형 지지체는 적합한 리간드 또는 리간드를 지지체에 고정화시키는 것을 실시하기 위하여 변성 및/또는 활성화되어 하나 이상의 상기 작용기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 카르복시 및 알데히드기가 작용기로 사용된다.
III. 결합능을 측정하기 위한 에세이
본원에 기재된 방법은 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 또는 IVIG 공급물 중의 A형 혈액형 항원 항체 또는 B형 혈액형 항원 항체와 결합하거나 또는 결합할 것으로 예상되는 매질의 상대적 품질(예를 들어, 제조 공정 중 또는 후 또는 사용 후)을 평가하는데 유용하다. 본원에 기재된 방법은, 시간 경과에 따라 또는 매질의 2개의 서로 다른 뱃치 또는 다른 공급원으로부터 얻은 매질을 비교할 때, 매질의 상대적 품질을 평가하기 위하여, 정제된 단일클론성 IgM-A 또는 IgM-B 항체 분자에 대한 매질의 결합능을 측정하는 것에 적어도 일부 의존한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 동일 유형의 매질의 서로 다른 뱃치 또는 사용 수명 동안 매질의 동일 뱃치 또는 상이한 공급원으로부터의 매질을 구별하기 위하여 사용될 수 있다.
일반적으로, 특정 분자(예를 들어, IgM 항체)에 대한 매질의 결합능은 다음과 같이 측정될 수 있다. 상기 분자를 함유하는 샘플을, 적합한 조건하에서 또 매질에 대한 분자의 결합을 용이하기에 적합한 시간 동안, 적합한 매질과 접촉시킨다. 그후, 매질에 결합된 분자는 잔류 샘플 용액으로부터 분리시키고 또 잔류 샘플 용액 중의 분자의 농도(즉, 미결합 분자의 농도)를 측정한다. 용액 중의 분자의 농도는 당해 분야에 공지된 몇 개의 상이한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 용액의 흡광도는 특정 파장에서 측정될 수 있고 또 분자의 농도는 상기 파장에서 분자(예를 들어, 단백질)의 흡광계수(extinction coefficient)와 함께 산출될 수 있다. 형광도, UV, 또는 라만 흡광도는 단백질 농도를 결정하기 위하여 측정될 수 있다. 또한, 용액 중의 분자의 농도는 분석 크로마토그래피에 의해서도 결정될 수 있다. 검출 세기는 분자의 농도와 관련된다.
본원에 기재된 실시양태에서, 정제된 단일클론성 IgM에 대한 A형 혈액형 리간드 매질 또는 B형 혈액형 리간드 매질의 결합능을 측정하며, 이는 상기 매질이 사정에 맞게 항-A 또는 항-B 항체의 실제 제거를 어떻게 실시하는지를 보여준다.
이하의 실시예에 의해 실시양태를 더욱 자세하게 설명하며, 이들은 제한을 의미해서는 안된다. 본원을 통하여 인용된 모든 참고서적, 특허 및 공개 특허 출원 뿐만 아니라 도면들의 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
실시예
실시예 1. A형 혈액형 항원 삼당류 리간드 함유 크로마토그래피 매질의 합성
A형 혈액형 항원 리간드 매질을 제조하기 위해 이용될 수 있는 예시적 방법이다. A형 혈액형 항원 삼당류(TriA) 리간드 함유 크로마토그래피 매질은 TriA 리간드를 독점적 폴리비닐 에테르계 비드(즉, 본원에 사용된 고형 지지체)에 고정화하는 것에 의해 합성하였다. TriA 리간드의 특정 구조는 도 1에 도시된다. 이 경우에서, TriA 리간드는 아민기를 갖는 링커를 또한 포함하며, 이는 베이스 비드 상에 고정화하기 위해 사용된다. 비드는 활성화되어 예를 들어, 에폭시, 카르복실 또는 알데히드기와 같은 반응성 기를 포함하며, 이는 리간드 상의 아민기와 반응할 수 있다. TriA 리간드는 일급 아민(-NH2) 기와의 커플링 반응에 의해 비드 상에 고정화된다.
실시예 2. B형 혈액형 항원 삼당류 리간드 함유 크로마토그래피 매질의 합성
다른 실험에서, B형 혈액형 항원 리간드 매질을 다음과 같이 제조하였다. B형 혈액형 항원 삼당류(TriB) 리간드 함유 크로마토그래피 매질은 TriB 리간드를 독점적 폴리비닐 에테르계 비드(즉, 본원에 사용된 고형 지지체)에 고정화하는 것에 의해 합성하였다. TriB 리간드의 특정 구조는 도 2에 도시된다. 이 경우, TriB 리간드는 아민기를 갖는 링커를 또한 포함하며, 이는 비드 상으로 고정화에 이용된다. 상술한 TriA 리간드에서와 같이, 상기 비드는 활성화되어 예를 들어, 에폭시, 카르복실 또는 알데히드기와 같은 반응성기를 포함하며, 이는 리간드 상의 아민기와 반응할 수 있다. TriB 리간드는 일급 아민(-NH2) 기와의 커플링 반응에 의해 베이스 비드 상에 고정화된다.
실시예 3. 쥐 단일클론성 IgM-A 항체의 정제
본원에 기재된 실시양태에서는, 정제된 단일클론성 IgM 항체를 모델 분자로 사용하여 항-A 또는 항-B 항체에 결합하는 크로마토그래피 매질의 품질을 평가하였다. 이 실시예는 단일클론성 IgM-A 항체를 정제하는 방법을 기재한다; 그러나 다른 방법도 또한 이용될 수 있거나 또는 그러한 항체는 상업적으로 입수할 수 있다.
A형 혈액형 항원 쥐 단일클론성 IgM 항체(항-A)는 10 mM PBS 완충액(제품 번호: JH-1L-BK, EMD 밀리포어 제조, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)에 투석시킨 클론 BIRMA-1(Vox Sang., 1991, 61: 53-58)로부터 생성된 항-A IgM을 함유하는 상업적으로 입수가능한 정화된 세포 배양 공급물로부터 정제되었다. 항-A 세포 배양 공급물을 0.22 미크론 막을 통하여 여과시키고 또 실시예 1에 기재된 바와 같이, A형 혈액형 항원 삼당류(TriA) 리간드가 부착되어 있는 매질 상에서 결합/용리(bind/elute) 크로마토그래피에 처리하였다.
직경 10 mm 컬럼에 Tri-A 리간드 매질을 64 mm까지 팩킹하였다. 이 컬럼을 10 mM PBS 완충액(10 컬럼 부피(CV), 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)에 의해 평형화시키고, 이어 10 mM PBS(40 CV, 229.18 cm/h, 3.0 mL/min)에 항-A를 함유하는 정화된 세포 배양 공급물을 로딩하였다. 상기 컬럼을 10 mM PBS 완충액(5 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)으로 세척한 다음, 10 mM PBS 완충액(10 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min) 중의 0.5M 염화 나트륨으로 세척하였다. 이어, 상기 컬럼으로부터 pH 2.7의 0.1 M 글리신(9 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)을 사용하여 항-A IgM 항체를 용리시켰다. 이어 상기 컬럼을 10 mM PBS 완충액(10 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)으로 세척하고 또 더 전개하기 전에 0.5 M 수산화나트륨(10 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)을 사용하여 스트리핑(stripped)하였다.
1 mL의 2.0 M Tris 염기를 45 mL의 항-A IgM 용출액에 부가하여 용액 pH를 6-7로 증가시켰다. 이러한 용리는 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por® 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 시리얼 번호: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220 USA)을 이용하여 10 mM PBS에 투석시켰다. 10 mM PBS에서 투석한 후, 단일클론성 항-A IgM의 생성 용액은 IgM 항체의 아미노산 조성을 기본으로 결정되는 바와 같은 280 nm에서 1.50의 흡광계수를 기본으로 하여, 약 1.1 mg/mL의 농도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4. 단일클론성 쥐 IgM-B 항체의 정제
B형 혈액형 항원 쥐 단일클론성 IgM 항체(항-B)는 10 mM PBS 완충액(제품 번호: JM-1L-BK, EMD 밀리포어 제조, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)에 투석시킨 클론 LB-2로부터 생성된 항-B IgM을 함유하는 상업적으로 입수가능한 정화된 세포 배양물로부터 정제하였다. 상기 항-B 세포 배양 공급물을 0.22 미크론 막을 통하여 여과시키고 또 실시예 2에 기재된 바와 같이 혈액형 항원 삼당류(TriB) 리간드가 부착된 매질 상에서 결합/용리 크로마토그래피 처리시켰다.
직경 10 mm 컬럼에 Tri-B 리간드 매질을 64 mm까지 팩킹하였다. 이 컬럼을 10 mM PBS 완충액(10 컬럼 부피(CV), 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)에 의해 평형화시키고, 이어 10 mM PBS(40 CV, 229.18 cm/h, 3.0 mL/min)에 항-A를 함유하는 정화된 세포 배양 공급물을 로딩하였다. 상기 컬럼을 10 mM PBS 완충액(5 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)으로 세척한 다음, 10 mM PBS 완충액(10 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min) 중의 0.5M 염화나트륨으로 세척하였다. 이어, 상기 컬럼으로부터 pH 2.7의 0.1 M 글리신(9 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)을 사용하여 항-A IgM 항체를 용리시켰다. 이어 상기 컬럼을 10 mM PBS 완충액(10 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)으로 세척하고 또 더 전개하기 전에 0.5 M 수산화나트륨(10 CV, 305.58 cm/h, 4.0 mL/min)을 사용하여 스트리핑(stripped)하였다.
1 mL의 2.0 M Tris 염기를 45 mL의 항-B IgM 용출액에 부가하여 용액 pH를 6-7로 증가시켰다. 이러한 용리는 투석관(Standard RC Dialysis Trial Kits, Spectra/Por® 1-3, 3.5K MWCO, 54 mm FLAT WIDTH, 시리얼 번호: 132725, Spectrum Laboratories, Inc. Rancho Dominguez, CA, 90220 USA)을 이용하여 10 mM PBS에 투석시켰다. 10 mM PBS에서 투석한 후, 단일클론성 항-B 쥐 IgM의 생성 용액은 IgM 항체의 아미노산 조성을 기본으로 결정되는 바와 같은 280 nm에서 1.44의 흡광계수를 기본으로 하여, 약 1.3 mg/mL의 농도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5. 매질 품질의 척도로서, 정제된 쥐 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 A형 혈액형 항원 삼당류 리간드 크로마토그래피 매질의 결합능
이는 정제된 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 A형 혈액형 항원 삼당류(TriA) 리간드 매질의 결합능이 예를 들어, 제조하는 동안 및 제조 후 크로마토그래피 매질의 뱃치별(batch-to-batch) 품질 변화를 평가하기 위하여 이용될 수 있는지를 나타내는 대표적 실시예이다.
TriA 리간드의 농도는, 이 경우에서 폴리비닐 에테르계 베이스 비드인 고형 지지체와의 커플링 반응 동안 변화될 수 있다. 베이스 비드는 상이한 양의 TriA 리간드를 가질 것으로 예시되었고, 이는 매질 제조 공정 동안 예상되는 변화 유형을 자극할 것이다.
사용된 리간드의 농도는 TriA 매질#1 < TriA 매질#2 < TriA 매질#3 순이었다. IgM 능력은 TriA 매질#1에 대해 최소이고, 이어 TriA 매질#2이며, TriA 매질#3에 대해 최대일 것으로 예상되었다.
이 실험에서는, 항-A IgM에 대한 3개의 TriA 리간드 함유 크로마토그래피 매질의 정적 결합능을 측정하였다. 이 값은 IVIG 공급물 Gammanorm 16.5%(165 mg/mL, 20 × 20 mL, 제품 번호: 00 357 340, Octapharma AG)로부터 항-A IgG 항체 제거 퍼센트와 비교하였다.
2.0 mL 마이크로원심분리관 세트에, 대조를 위해, 0.35 mL의 10 mM PBS 완충액 또는 0.50 mL의 10 mM PBS 완충액을 충전하였다. 이어, 10 mM PBS 완충액 중의 매질(15 μL 매질 부피)의 10% 현탁액 0.15 mL를, 대조군을 제외하고는, 마이크로원심분리관에 부가한 다음, 10 mM PBS 완충액 중의 1 mg/mL 항-A IgM 단일클론성 항체 용액 1.0 mL를 부가하였다. 상기 관들을 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 이어, 상기 마이크로원심분리관들을 원심분리 처리시키고 또 생성한 상청액을 0.22 미크론 막을 구비한 원심분리 여과 장치로 전달하였다. 이들 장치를 원심분리 처리한 다음 여액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 각 샘플의 용액 흡광도를 이용하여 항-A IgM 단일클론성 항체에 대한 매질의 정적 결합능을 산출하였다. 항-A IgM 정적 결합능은 280 nm에서 1.50의 흡광계수를 기본으로 하여 산출하였고, 이는 단백질의 아미노산 조성을 기본으로 하여 추정되었다.
다른 실험에서, 대표적 IVIG 공급물에서 A형 혈액형 항원 다중클론성 IgG 항체(항-A) 수준은 확립된 플로우 사이토메트리 방법(Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505)에 의해 결정하였다. A형 적혈구를 대표적 IVIG 공급물과 함께 소정 시간 동안 배양한 다음 광범위하게 세척하였다. 상개 세포들을 형광-라벨링된 항-인간 IgG(Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L), part number: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)을 이용하여 염색시키고, 또 플로우 사이토메트리(Guava 5HT, EMD Millipore)에 처리하였다. 네트 평균 형광 세기(Mean fluorescence intensity: MFI) 값들을 이용하여, 실시예 1에서 합성한 A형 혈액형 삼당류 항원 리간드 매질과 접촉하기 전후의, 공급물 중의 항-A 다중클론성 IgG 농도를 비교하였다.
항-A IgM 단일클론성 항체 정적 결합능은 동일 조건하에서 동일 매질을 사용하여 IVIG 공급물로부터 항-A 항체 제거 퍼센트와 비교하였다.
하기 표 1에 요약한 바와 같이, 이 실험은 항-A IgM 단일클론성 항체에 대한 다양한 TriA 리간드 매질의 정적 결합능에서 뱃치별 변화가, 정적 결합 조건하에서 IVIG 공급물로부터의 항-A IgG 제거 퍼센트의 뱃치별 변화와 상관관계가 있음을 나타낸다. 단일클론성 항-A IgM에 대한 능력이 높은 TriA 리간드 매질은 IVIG 공급물로부터 더 많은 항-A IgG 항체를 제거함이 밝혀졌다. 단일클론성 항-A IgM에 대한 능력이 낮은 TriA 리간드 매질은 IVIG 공급물로부터 더 적은 항-A IgG 항체를 제거함이 또한 밝혀졌다.
이 결과는 2개 분자의 유형 및 공급원에서 차이로 인하여 예상치 못한 것이었는데, 즉, IgM은 단일클론성이고, 대형 오량체 구조를 갖고, 또 쥐 기원인 것에 반하여, IVIG 공급물로부터 제거된 IgG는 다중클론성이고, 소형 단량체 구조를 갖고, 또 인간 기원이다. 이 결과를 기초로 하여, 항-A IgM 단일클론성 항체에 대한 TriA 리간드 매질의 정적 결합능은 예를 들어, 매질을 제조하는 동안 및 제조한 후 샘플로부터 일정 부분의 항-A 항체를 제거하는 또는 제거할 것으로 기대되는 매질의 뱃치별 품질 변화를 평가하는 것을 지표로 이용될 수 있다고 결론지을 수 있다.
단일클론성 항-A IgM 정적결합능 (mg/mL) IVIG 공급물로부터 항-A IgG의
제거 퍼센트
TriA 매질#1 1.6 65%
TriA 매질#2 8.6 93%
TriA 매질#3 12.9 101%
표 1. 단일클론성 항-A IgM에 대한 3개의 상이한 TriA 매질의 정적 결합능 및 IVIG 공급물로부터 항-A IgG 제거 퍼센트
실시예 6. 매질 품질의 척도로서, 정제된 쥐 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 B형 혈액형 항원 삼당류 리간드 매질의 결합능
이는 정제된 쥐 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 B형 혈액형 항원 삼당류(TriB) 리간드 매질의 결합능이 예를 들어, 매질을 제조하는 동안 및 제조한 후 매질의 뱃치별 품질 변화를 평가하기 위해 이용될 수 있음을 나타내는 대표적 실시예이다.
TriB 리간드의 농도는, 이 경우 폴리비닐 에테르계 비드인 고형 지지체와의 커플링 반응 동안 변화되었다. 따라서 상기 비드는 상이한 양의 TriB 리간드를 가질 것으로 예상되었고, 이는 매질 제조 공정 동안 예상되는 변화 유형을 자극할 것이다.
사용된 리간드의 농도는 TriB 매질#1 < TriB 매질#2 < TriB 매질#3 순이었다. 따라서, IgM 능력은 TriB 매질#1에 대해 최소이고, 이어 TriB 매질#2이며, TriB 매질#3에 대해 최대일 것으로 예상되었다.
이 실험에서는, 항-B 항체에 대한 다양한 TriB 리간드 매질의 정적 결합능을 측정하고 또 그 값을 IVIG 공급물 Gammanorm 16.5%(165 mg/mL, 20 × 20 mL, 제품 번호: 00 357 340, Octapharma AG)으로부터 항-B IgG 항체 제거 퍼센트와 비교하였다.
2.0 mL 마이크로원심분리관 세트에, 대조를 위해, 0.35 mL의 10 mM PBS 완충액 또는 0.50 mL의 10 mM PBS 완충액을 충전하였다. 이어, 10 mM PBS 완충액 중의 폴리비닐 에테르계 비드(15 μL 매질 부피)의 10% 현탁액 0.15 mL를, 대조군을 제외하고는, 마이크로원심분리관에 부가하였다. 이어, 10 mM PBS 완충액 중의 1 mg/mL 항-B IgM 단일클론성 항체 용액 1.0 mL를 모든 관에 부가하였다. 상기 관들을 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 이어, 상기 마이크로원심분리관들을 원심분리 처리시키고 또 생성한 상청액을 0.22 미크론 막을 구비한 원심분리 여과 장치로 전달하였다. 이들 장치를 원심분리 처리한 다음 여액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 각 샘플의 용액 흡광도를 이용하여 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 매질의 정적 결합능을 산출하였다.
항-A IgM 정적 결합능은 280 nm에서 1.44의 흡광계수를 기본으로 하여 산출하였고, 이는 단백질의 아미노산 조성을 기본으로 하여 추정되었다. 항-B IgM 단일클론성 항체 정적 결합능은 정적 결합 조건하에서 IVIG 공급물로부터 항-B 항체 제거 퍼센트와 비교하였다.
대표적 IVIG 공급물에서 B형 혈액형 항원 다중클론성 IgG 항체(항-B) 수준은 확립된 플로우 사이토메트리 방법(Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505)에 의해 결정하였다. B형 적혈구를 대표적 IVIG 공급물과 함께 소정 시간 동안 배양한 다음 광범위하게 세척하였다. 이들 세포를 형광-라벨링된 항-인간 IgG(Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L), part number: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)를 사용하여 염색시키고, 또 플로우 사이토메트리(Guava 5HT, EMD Millipore) 처리시켰다. 네트 평균 형광 세기(MFI) 값들을 이용하여, 실시예 2에서 합성한 B형 혈액형 삼당류 항원 리간드 매질과 접촉하기 전후의 공급물 중의 항-B 다중클론성 IgG 농도를 비교하였다.
하기 표 2에 요약한 바와 같이, 이 실험은 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 다양한 TriB 리간드 매질의 정적 결합능에서 뱃치별 변화가 정적 결합 조건하에서의 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 제거 퍼센트에서 뱃치별 변화와 상관관계 있음을 나타낸다. 단일클론성 항-B IgM에 대해 더 높은 능력을 갖는 TriB 리간드 매질은 IVIG 공급물로부터 더 많은 항-B IgG 항체를 제거함이 밝혀졌다. 단일클론성 항-B IgM에 대해 더 낮은 정적 결합능을 갖는 TriB 리간드 매질은 IVIG 공급물로부터 더 적은 항-B IgG 항체를 제거함도 또한 밝혀졌다.
이 데이터는 정제된 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 TriB 리간드 매질의 정적 결합능이 예를 들어, 매질 제조 전후의 매질 품질에서 뱃치별 변화를 평가하기 위해 이용될 수 있다는 예상치 못한 발견을 나타낸다.
단일클론성 항-B IgM 정적결합능 (mg/mL) IVIG 공급물로부터 항-B IgG의
제거 퍼센트
TriB 매질#1 2.1 82%
TriB 매질#2 7.4 93%
TriB 매질#3 13.5 96%
표 2. 단일클론성 항-B IgM에 대한 3개의 상이한 TriB 매질의 능력 및 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 제거 퍼센트
실시예 7. 가성 세척 조건에 노출된 이후 매질 품질을 모니터링하는 방식으로서, 정제된 쥐 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 A형 혈액형 항원 삼당류 리간드 매질의 결합능
이것은 정제된 쥐 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 A형 혈액형 항원 삼당류(TriA) 리간드 매질의 능력이 가혹한 가성 세척 조건에 노출된 후 매질의 품질을 모니터링하는 유용한 방법이라는 것을 나타내는 대표적 실시예이다.
1.0 M 수산화나트륨 용액을 TriA 리간드 매질(5.0 mL, 1.0 cm 직경 및 6.4 cm 길이)이 충전된 컬럼 상에 0.5 mL/ min로 0 시간, 50 시간, 또는 150 시간 흘러주었다. 상기 매질은 컬럼을 나온 용액의 pH가 대략 pH 7일때까지 10 mM PBS에 의해 중화시켰다. 항-A IgM 단일클론성 항체에 대한 3개 TriA 리간드 매질의 정적 결합능을 측정하고 또 동일 매질을 사용하여 IVIG 공급물로부터 항-A IgG 제거 퍼센트와 비교하였다.
2.0 mL 마이크로원심분리관 세트에, 대조를 위해, 0.35 mL의 10 mM PBS 완충액 또는 0.50 mL의 10 mM PBS 완충액을 충전하였다. 10 mM PBS 완충액 중의 매질(15 μL 매질 부피)의 10% 현탁액 0.15 mL를, 대조용을 제외하고는, 상기 마이크로원심분리관에 부가하였다. 이어, 10 mM PBS 완충액 중의 1.0 mg/mL 항-A IgM 단일클론성 항체 용액 1.0 mL를 상기 관 각각에 부가하였다. 이들 관을 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 상기 마이크로원심분리관을 원심분리처리시키고 또 생성한 상청액을 0.22 미크론 막을 구비한 원심분리 여과 장치로 전달하였다. 이들 장치를 원심분리처리시키고 또 여액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 각 샘플의 용액 흡광도를 이용하여 항-A IgM 단일클론성 항체에 대한 매질의 정적 결합능을 산출하였다.
항-A IgM 정적 결합능은 280 nm에서 1.50의 흡광계수를 기본으로 하여 산출하며, 이는 단백질의 아미노산 조성을 기본으로 하여 추정되었다. 항-A IgM 단일클론성 항체 정적 결합능은 정적 결합 조건하에서 동일 매질을 이용하여 IVIG 공급물로부터 항-A IgG 항체 제거 퍼센트와 비교하였다.
대표적 IVIG 공급물에서 A형 혈액형 항원 다중클론성 IgG 항체 농도는 확립된 플로우 사이토메트리 방법(Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505)을 이용하여 결정하였다. A형 적혈구를 IgG 농축물과 소정 시간 동안 배양한 다음, 광범위하게 세척하였다. 이들 세포를 형광-라벨링된 항-인간 IgGs(Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L), part number: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)에 의해 염색시키고, 또 플로우 사이토메트리(Guava 5HT, EMD Millipore) 처리하였다. 네트 평균 형광 세기(MFI) 값들을 이용하여, A형 혈액형 삼당류 항원 리간드 매질과 접촉하기 전후의 샘플에서 항-A 다중클론성 IgG 농도를 비교하였다.
하기 표 3에 요약한 바와 같이, 이 실험은 단일클론성 항-A IgM에 대한 다양한 TriA 리간드 매질의 정적 결합능에서의 상대적 차이가 IVIG 공급물로부터 항-A IgG 제거 퍼센트에서의 상대적 차이와 상관관계가 있음을 나타낸다. TriA 리간드 매질이 더 오랫동안 가성 세척 조건에 노출될 수록, 단일클론성 항-A IgM에 대한 정적 결합능이 더 낮고 또 IVIG 공급물로부터 항-A IgG 항체가 더 적은 것으로 관찰되었다.
따라서, 단일클론성 항-A IgM에 대한 TriA 리간드 매질의 정적 결합능은 가성 조건에 노출된 이후 상기 유형의 매질의 품질을 모티터링하기 위해 이용될 수 있다.
1.0M 수산화나트륨에
노출된 시간 (시간)		 단일클론성 항-A IgM
정적 결합능 (mg/mL)		 IVIG 공급물로부터
항-A IgG 제거 퍼센트
0 19.7 77%
50 18,1 65%
150 10.2 40%
표 3. 단일클론성 항-A IgM에 대한 TriA 리간드 매질의 능력 및 다양한 시간 동안 1.0 M 수산화나트륨에 노출된 이후 IVIG 공급물로부터 항-A IgG 제거 퍼센트
실시예 8. 가성 세척 조건에 노출된 후의 매질 품질을 모니터링하기 위한 방식으로서, 정제된 단일클론성 쥐 단일클론성 IgM-B에 대한 B형 혈액형 항원 삼당류 리간드 매질의 결합능
이것은 정제된 쥐 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 B형 혈액형 항원 삼당류(TriA) 리간드 매질의 능력이 가혹한 가성 세척 조건에 노출된 후 매질의 품질을 모니터링하는 방법이라는 것을 나타내는 대표적 실시예이다.
1.0 M 수산화나트륨 용액을, TriB 리간드 매질(5.0 mL, 1.0 cm 직경 및 6.4 cm 길이)이 충전된 컬럼 상에, 0.5 mL/ min로 0 시간, 50 시간, 또는 150 시간 흘러주었다. 상기 매질은 컬럼을 나온 용액의 pH가 대략 pH 7일때까지 10 mM PBS에 의해 중화시켰다. 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 3개 TriB 리간드 매질의 정적 결합능을 측정하고 또 동일 매질을 사용하여 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 제거 퍼센트와 비교하였다.
2.0 mL 마이크로원심분리관 세트에, 대조를 위해, 0.35 mL의 10 mM PBS 완충액 또는 0.50 mL의 10 mM PBS 완충액을 충전하였다. 10 mM PBS 완충액 중의 매질(15 μL 매질 부피)의 10% 현탁액 0.15 mL를, 대조용을 제외하고는, 상기 마이크로원심분리관에 부가하였다. 이어, 10 mM PBS 완충액 중의 1.0 mg/mL 항-B IgM 단일클론성 항체 용액 1.0 mL를 상기 관 각각에 부가하였다. 이들 관을 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 상기 마이크로원심분리관을 원심분리처리시키고 또 생성한 상청액을 0.22 미크론 막을 구비한 원심분리 여과 장치로 전달하였다. 이들 장치를 원심분리처리시키고 또 여액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 각 샘플의 용액 흡광도를 이용하여 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 매질의 정적 결합능을 산출하였다. 항-B IgM 정적 결합능은 280 nm에서 1.44의 흡광계수를 기본으로 하여 산출하며, 이는 단백질의 아미노산 조성을 기본으로 하여 추정되었다. 항-B IgM 단일클론성 항체 정적 결합능은 정적 결합 조건하에서 동일 매질을 이용하여 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 항체 제거 퍼센트와 비교하였다.
대표적 IVIG 공급물에서 B형 혈액형 항원 다중클론성 IgG 항체 농도는 확립된 플로우 사이토메트리 방법(Christensson, M. et al, Transfusion, 1996, 36, 500-505)을 이용하여 결정하였다. B형 적혈구를 IgG 농축물과 소정 시간 동안 배양한 다음, 광범위하게 세척하였다. 이들 세포를 형광-라벨링된 항-인간 IgG(Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Human IgG(H+L), part number: 109-546-088, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)에 의해 염색시키고, 또 플로우 사이토메트리(Guava 5HT, EMD Millipore) 처리하였다. 네트 평균 형광 세기(MFI) 값들을 이용하여, A형 혈액형 삼당류 항원 리간드 매질과 접촉하기 전후의 샘플에서 항-A 다중클론성 IgG 농도를 비교하였다.
하기 표 4에 요약한 바와 같이, 이 실험은 단일클론성 항-B IgM에 대한 다양한 TriB 리간드 매질의 정적 결합능에서의 상대적 차이가 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 제거 퍼센트에서 상대적 차이와 상관관계가 있음을 나타낸다. TriB 리간드 매질이 가성 세척 조건에 노출되는 시간의 길이는 단일클론성 항-B IgM에 대한 정적 결합능 또는 정적 결합 조건하에서 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 항체가 제거되는 양에 영향을 주지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이 데이터는 단일클론성 항-B IgM에 대한 TriB 리간드 매질의 정적 결합능을 이용하여 상기 유형의 매질의 품질을 모티터링할 수 있음을 나타낸다.
1.0M 수산화나트륨에
노출된 시간 (시간)		 단일클론성 항-B IgM
정적 결합능 (mg/mL)		 IVIG 공급물로부터
항-B IgG 제거 퍼센트
0 19.0 79%
50 18,9 76%
150 19.3 76%
표 4. 단일클론성 항-B IgM에 대한 TriA 리간드 매질의 능력 및 다양한 시간 동안 1.0 M 수산화나트륨에 노출된 이후 IVIG 공급물로부터 항-B IgG 제거 퍼센트
실시예 9. 정제된 쥐 단일클론성 항체 IgM-A 및 IgM-B 각각에 대한 정적 결합능을 측정하는 것에 의해 A형 혈액형 및 B형 혈액형 항원 삼당류 리간드 매질 사이의 구별
이것은 쥐 단일클론성 항체 IgM-A 및 IgM-B 각각에 대한 A형 혈액형 항원 삼당류(TriA) 리간드 매질 및 B형 혈액형 항원 삼당류(TriB) 리간드 매질의 상대적 정적 결합능이 2개 유형의 매질 사이의 차이를 구별하는데 이용될 수 있음을 보여주는 대표적 실시예이다.
2개 유형의 매질 사이를 용이하게 구별하는 능력은, 2개 매질이 혈액 및 혈장 생성물로부터 항-A 및 항-B 항체 제거를 위해 전형적으로 함께 사용되고 또 용이하게 혼합될 수 있기 때문에 유용하다. 단일클론성 항-A IgM 및 단일클론성 항-B IgM에 대한 TriA 리간드 매질 및 TriB 리간드 매질의 정적 결합능을 측정하는 것에 의한 구별을 나타내었다.
2.0 mL 마이크로원심분리관 세트는, 대조를 위해, 0.35 mL의 50 mM PBS 완충액 또는 0.50 mL의 50 mM PBS 완충액으로 충전하였다. 50 mM PBS 완충액 중의 매질(15 μL 매질 부피)의 10% 현탁액 0.15 mL를, 대조군을 제외하고는, 마이크로원심분리관에 부가하였다. 이어, 50 mM PBS 완충액 중의 1.0 mg/mL 항-A IgM 단일클론성 항체 용액 1.0 mL 또는 50 mM PBS 완충액 중의 1.0 mg/mL 항-B IgM 단일클론성 항체 용액 1.0 mL를 상기 관 각각에 부가하였다. 관들을 실온에서 4시간 동안 회전시켰다. 이어 마이크로원심분리관을 원심분리 처리시키고 또 생성한 상청액을 0.22 미크론 막을 구비한 원심분리 여과 장치에 전달하였다. 상기 장치들을 원심분리 처리한 다음, 여액의 흡광도를 280 nm에서 측정하였다. 280 nm에서 각 샘플의 용액 흡광도를 이용하여 항-A IgM 단일클론성 항체 및 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 매질의 정적 결합능을 산출하였다. 항-A IgM 정적 결합능은 280 nm에서 1.50의 흡광계수를 기초로 하여 산출되었고, 이는 단백질의 아미노산 조성을 기초로 하였다. 항-B IgM 정적 결합능은 280 nm에서 1.44의 흡광계수를 기초로 하여 산출되었고, 이는 단백질의 아미노산 조성을 기초로 추정되었다.
표 5에 요약한 바와 같이, 이 실험은 항-A 항체를 결합할 수 있는 또는 항-B 항체를 결합할 수 있는 매질의 정체가 항-A IgM 단일클론성 항체 및 항-B IgM 단일클론성 항체에 대한 결합능을 측정하는 것에 의해 구별될 수 있음을 나타낸다.
TriA 리간드 매질은 항-A IgM 단일클론성 항체에 대하여 현저한 결합능을 가지고 있는 반면에, 항-B IgM 단일클론성 항체에 대해서는 아주 낮은 결합능을 가짐이 관찰되었다. 대조적으로, TriB 리간드 매질은 항-B IgM 단일클론성 항체에 대해서는 현저한 결합능을 갖는 반면에, 항-A IgM 단일클론성에 대해서는 매우 낮은 결합능을 가짐이 관찰되었다. 이런 방식으로, A-항원 리간드 매질 및 B-항원 리간드 매질은 특히 예를 들어 이러한 매질 샘플의 정체가 알려지지 않았을 때 용이하게 구별될 수 있다.
단일클론성 항-A IgM 정적 결합능
(mg/mL)		 단일클론성 항-B IgM 정적 결합능
(mg/mL)
TriA 매질 21.1 0.3
TriB 매질 0.2 21.1
표 5. 단일클론성 항-A IgM 및 항-B 단일클론성 IgM에 대한 TriA 리간드 매질 및 TriB 리간드 매질의 능력
실시예 10. 정제된 IgM-A 또는 IgM-B 단일클론성 항체에 대한 결합능을 기본으로 한 매질 혼합물의 생성 및 상대적 품질의 평가
본원에서 관찰된 바와 같이, 정제된 단일클론성 IgM-A 또는 IgM-B 항체에 대한 A형 혈액형 항원 매질 또는 B형 혈액형 항원 매질의 상대적 결합능은 이러한 매질이 샘플(예를 들어, 혈액, 혈액 생성물, 혈장 또는 IVIG)로부터 A형 혈액형 항원 항체 또는 B형 혈액형 항원 항체 제거를 실질적으로 어떻게 실시하는지를 평가하거나 또는 예측하기 위한 양호한 지표이다.
정제된 단일클론성 IgM-A에 대한 A형 혈액형 항원 매질의 상대적 결합능 및 IgM-B 항체에 대한 B형 혈액형 항원 매질의 상대적 결합능은 양쪽 매질의 바른 비율의 혼합물을 생성하기 위해 이용될 수 있었고, 이는 샘플로부터 1개 크로마토그래피 단계로 A형 혈액형 항원 항체 및 B형 혈액형 항원 항체를 모두 제거하기 위해 이용될 수 있다.
이것은 A형 혈액형 항원 항체 및 B형 혈액형 항원 항체의 양이 샘플별로 다양한 경향이 있기 때문에 특히 유용하다. 따라서, 1개 샘플로부터 그러한 항체의 제거를 위해 잘 작용할 수 있는 매질의 혼합물은 다른 샘플의 경우에서는 잘 작용하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 방법은 샘플 중의 항-A 및 항-B 항체의 양을 단순히 아는 것에 의해, 샘플에 대해 잘 작용할 매질의 혼합물의 고안하기 위해 이용될 수 있다.
예를 들어, 정제된 단일클론성 IgM 항체에 대한 매질의 결합능이 샘플로부터 항-A 또는 항-B 항체의 제거 퍼센트와 상관관계가 있기 때문에, 샘플 중의 항-A 및 항-B 항체의 수준 또는 양이 알려지면, 매질의 혼합물 또는 매질은 각 IgM 분자에 대한 결합능을 기본으로 하여, 샘플로부터 항-A 및/또는 항-B 항체의 소망하는 양을 제거하기에 적합할, A형 혈액형 항원 매질 및 B형 혈액형 항원 매질의 비율을 갖도록 고안될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 A형 혈액형 항원 리간드를 갖는 매질 및 B형 혈액형 항원 리간드를 갖는 매질로 구성된 매질 혼합물의 상대적 품질을 결정하기 위해서도 이용될 수 있다.
본 명세서는 참조로 본 명세서에 포함되는 명세서에 인용된 참고문헌의 가르침을 참조하여 대부분 잘 이해된다. 본 명세서에 내의 실시양태는 본 발명에서 실시예의 설명을 제공하며 그 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자들은 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함됨을 인지할 것이다. 모든 공개문헌 및 발명은 참고로 본 명세서에 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 본 발명의 명세서와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 발명의 명세서에 개시된 내용이 이러한 자료를 대체할 것이다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술이라고 인정하는 것은 아니다.
다르게 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 본 발명의 명세서에서 이용된 성분, 세포 배양물, 처리 조건 등과 관련된 양을 표현하는 모든 숫자는 예를 들어 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 근사치이고 또 본 발명에 의해 얻고자 하는 소망하는 특성에 따라서 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 나오는 용어 "적어도"는 이 시리즈 중의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상적인 실험 이외에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 다수의 변형 및 변이는 당업자에게 분명한 바와 같이 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 예시적으로만 기재된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 명세서 및 실시예는 예시적으로만 간주되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 이하의 특허청구범위에 의해 표시된다.

Claims (21)

  1. (a) 각 매질 샘플의 경우, 공지 농도(C1) 및 부피(VM)를 갖는 정제된 단일클론성 IgM-A 항체 용액 및 부피(VR)의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 각 크로마토그래피 매질 샘플을 (a)의 용액과 배양하는 단계;
    (c) 각 크로마토그래피 매질 샘플에 대해, 상청액을 얻고 또 상청액 중의 IgM-A 항체의 농도(C2)를 측정하는 단계;
    (d) 다음 식
    Figure pat00004
    을 이용하여 IgM-A 항체에 대한 각 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 정적 결합능을 결정하는 단계;를 포함하고,
    상기 매질 샘플의 정적 결합능은 샘플로부터 항-A 항체를 제거하는 이들의 능력과 관련되므로, 2개 이상의 상이한 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질 비교를 제공하는,
    고형 지지체에 부착된 A형 혈액형 항원 리간드를 함유하는 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질을 비교하는 방법.
  2. (a) 각 매질 샘플의 경우, 공지 농도(C1) 및 부피(VM)를 갖는 정제된 단일클론성 IgM-B 항체 용액 및 부피(VR)의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 각 크로마토그래피 매질 샘플을 (a)의 용액과 배양하는 단계;
    (c) 각 크로마토그래피 매질 샘플에 대해, 상청액을 얻고 또 상청액 중의 IgM-B 항체의 농도(C2)를 측정하는 단계;
    (d) 다음 식
    Figure pat00005
    을 이용하여 IgM-B 항체에 대한 각 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 정적 결합능을 결정하는 단계;를 포함하고,
    상기 매질 샘플의 정적 결합능은 샘플로부터 항-B 항체를 제거하는 이들의 능력과 관련되므로, 2개 이상의 상이한 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질 비교를 제공하는,
    고형 지지체에 부착된 B형 혈액형 항원 리간드를 각각 함유하는 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플의 품질을 비교하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 다공성 또는 비다공성 중합체성 고형 지지체인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 및 폴리카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 다공성 또는 비다공성 중합체성 고형 지지체인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르계 다공성 고형 지지체인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 고형 지지체는 폴리비닐에테르계 다공성 고형 지지체인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 폴리비닐에테르계 다공성 고형 지지체가 비드 형태인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 폴리비닐에테르계 다공성 고형 지지체가 비드 형태인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 A형 혈액형 항원 리간드 매질의 결합능이 샘플로부터 항-A 항체 제거능과 관련되는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 B형 혈액형 항원 리간드 매질의 결합능이 샘플로부터 항-B 항체 제거능과 관련되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플은 동일 매질의 서로 다른 뱃치를 구성하는 방법.
  12. 제2항에 있어서, 2개 이상의 친화성 크로마토그래피 매질 샘플은 동일 매질의 서로 다른 뱃치를 구성하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 서로 다른 친화성 크로마토그래피 매질 샘플은 상이한 사용 단계에서의 동일 매질을 구성하는 방법.
  14. 제2항에 있어서, 서로 다른 친화성 크로마토그래피 매질 샘플은 상이한 사용 단계에서의 동일 매질을 구성하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 샘플은 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 및 IVIG 공급물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 샘플은 혈액, 혈액 생성물, 혈장, 혈장 유도체 및 IVIG 공급물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 농도의 측정은 280 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제2항에 있어서, 농도의 측정은 280 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  19. (a) 고형 지지체에 부착된 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 갖는 크로마토그래피 매질을 제공하는 단계;
    (b) A형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-A 항체에 대한 매질의 결합능 또는 B형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-B 항체에 대한 매질의 결합능을 측정하는 단계;
    (c) 매질을 산 또는 알칼리 조건에 적어도 5시간 동안 노출시키는 단계; 및
    (d) A형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-A 항체에 대한 매질의 결합능 또는 B형 혈액형 항원 리간드 매질의 경우에는 정제된 IgM-B 항체에 대한 매질의 결합능을 측정하는 단계;를 포함하고,
    단계 (b)에 비교한 단계 (d)에서 매질의 결합능 감소는 매질의 품질이 산 또는 알칼리 조건에 노출된 이후 감소되었음을 나타내는,
    산 또는 알칼리 조건에 노출된 후 매질의 품질을 평가하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 매질 품질의 감소가 항-A 또는 항-B 항체를 제거하는 매질의 능력 감소를 포함하는 방법.
  21. (a) 매질이 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는지 여부가 알려져 있지 않은 매질을 제공하는 단계;
    (b) 정제된 단일클론성 IgM-A 항체 및 별개의 정제된 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 상기 미지 매질의 결합능을 측정하는 단계; 및
    (c) 정제된 단일클론성 IgM-A 항체 및 정제된 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 상기 미지 매질의 능력을 비교하는 단계;를 포함하며,
    상기 미지 매질이 단일클론성 IgM-B 항체에 대한 결합능과 비교하여 단일클론성 IgM-A 항체에 대하여 더 높은 결합능을 가지면, 상기 미지 매질은 A형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 것으로 결정되고, 또 상기 미지 매질이 단일클론성 IgM-A 항체에 대한 결합능과 비교하여 단일클론성 IgM-B 항체에 대하여 더 높은 결합능을 가지면, 상기 미지 매질은 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는 것으로 결정되는,
    매질이 A형 혈액형 항원 리간드 또는 B형 혈액형 항원 리간드를 포함하는지 여부를 결정하는 방법.
KR1020160109955A 2015-09-08 2016-08-29 항-a 또는 항-b 항체에 결합하는 크로마토그래피 매질의 품질 평가 방법 KR101921907B1 (ko)

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