ES2742650T3 - Uso de ácido acetilsalicílico para la prevención y/o el tratamiento tópico de las heridas del diabético - Google Patents

Abstract

Ácido acetilsalicílico o una de sus sales, a una concentración comprendida entre 200 y 4800 μM, para su uso para la prevención y/o el tratamiento de las heridas del diabético, la administración del ácido acetilsalicílico o una de sus sales a esta concentración siendo realizada en forma tópica.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de ácido acetilsalicílico para la prevención y/o el tratamiento tópico de las heridas del diabético

Sector de la técnica

El objeto de la presente invención consiste en un nuevo uso tópico de ácido acetilsalicílico, a una concentración comprendida entre 200 y 4800 pM, en la prevención y/o el tratamiento de las heridas del diabético.

Estado de la técnica

La cicatrización de una herida es un proceso fisiopatológico natural, los tejidos humanos y animales pueden ser capaces de reparar lesiones localizadas por sus propios procesos de reparación y regeneración.

La cicatrización natural de una herida se lleva a cabo principalmente de acuerdo con tres secuencias cronológicas principales. Cada una de estas secuencias se caracteriza por actividades celulares específicas y está controlada por una multitud de señales de regulación (tanto positivas como negativas) que de forma colectiva, dirigen y enmarcan el progreso del proceso de reparación. Por lo tanto los investigadores distinguen:

- la fase inflamatoria;

- la fase de proliferación (que comprende la fase de granulación y epitelización); y

- la fase de remodelación.

La primera fase, la fase inflamatoria, comienza con la ruptura de los vasos sanguíneos, un evento que desencadena la formación de un coágulo (coagulación de la sangre) compuesto principalmente por fibrina y fibronectina, y que constituirá una matriz temporal. Esta matriz llena parcialmente la lesión y permitirá la migración dentro del área lesionada de las células inflamatorias reclutadas para asegurar la limpieza de la herida. Las plaquetas presentes también liberarán factores (por ejemplo, citoquinas y/o factores de crecimiento) que permitirán el reclutamiento de células involucradas en el proceso de cicatrización. Esta fase se caracteriza por la infiltración y la activación, en el sitio de la lesión, de numerosas células inflamatorias (polinucleares, macrófagos) que aseguran la defensa del organismo frente a posibles microorganismos extraños, así como la limpieza de la herida o desbridamiento.

La segunda fase corresponde al desarrollo del tejido de granulación. En primer lugar los investigadores observan una colonización de la herida por migración y proliferación de fibroblastos. A continuación, la migración de las células endoteliales de los vasos sanos permitirá la neovascularización, o angiogénesis, del tejido lesionado. En el tejido de granulación, los fibroblastos se activan y se diferenciarán en miofibroblastos con propiedades contráctiles significativas, propiedades generadas por los microfilamentos de actina, permitiendo de ese modo la contracción de la herida. Estos microfilamentos se expresan mediante una proteína: la a-actina del músculo liso. Estos miofibroblastos desempeñan un papel importante en la formación y contracción del tejido de granulación que conducirá a la curación de la lesión. A continuación se produce la migración de los queratinocitos desde los bordes de la herida y la diferenciación de esta última, lo que da como resultado la reconstrucción de la epidermis.

Esta fase de desarrollo del tejido de granulación se inicia después de una disminución previa en el estado inflamatorio general de la lesión, la desaparición progresiva de neutrófilos polinucleares y la aparición de macrófagos, incluidos los denominados macrófagos de reparación. Esta transición entre la fase inflamatoria y la fase de proliferación/reparación se denomina fase de resolución de la inflamación.

La tercera fase del proceso es principalmente un paso de remodelación para reconstruir un tejido funcional, con el fin de que el tejido recién formado recupere las características y propiedades originales del tejido original. Una parte de la matriz extracelular es digerida por proteasas (esencialmente metaloproteasas de matriz y elastasas), y se observa una reorganización de la matriz extracelular. De forma progresiva, el colágeno de tipo III, predominante en el tejido de granulación, se reemplaza por colágeno de tipo I, el componente principal de la matriz de la dermis. Al final de la fase de maduración, los fibroblastos, miofibroblastos y células vasculares ven reducida su proliferación y/o actividad. A continuación, el exceso de células muere por apoptosis en paralelo con la remodelación de la matriz extracelular. Sin embargo, algunos tipos de heridas no cicatrizan de forma correcta adecuada, las 3 etapas fundamentales del proceso se desarrollan de manera anómala y esto, a pesar del establecimiento de las mejores condiciones fisicoquímicas y biológicas posibles. De hecho, la velocidad y la calidad de la curación de una herida dependen de factores intrínsecos y extrínsecos. Por lo tanto, este proceso de reparación se puede prolongar de manera anómala de acuerdo con:

- la etiología de la herida;

- su estado y su localización;

- la aparición de una infección causada por la presencia de ciertos agentes infecciosos como Staphylococcus aureus o Pseudomonas aeruginosa;

- la existencia de una patología preexistente (como diabetes, inmunodeficiencia, insuficiencia venosa, etc.); - el ambiente externo; o

- factores genéticos que predisponen o no a los trastornos de cicatrización.

Entre estas heridas, se encuentran heridas crónicas tales como úlceras venosas, escaras o heridas características de los sujetos diabéticos, y más particularmente las heridas del pie diabético.

Las heridas crónicas se definen por la falta de fiscalización después de un retraso de 6 semanas desde el inicio de la aparición de la herida y sea cual sea el tratamiento aplicado. Las heridas del diabético se caracterizan por ser de un tipo particular y aparte de las heridas crónicas.

En efecto, la causa principal de la ausencia de cicatrización de estas heridas diabéticas está relacionada con la biodisponibilidad de la glucosa exacerbada. Esto induce muchos cambios fisiológicos y metabólicos, como engrosamiento de la piel, estrés oxidativo significativo que conduce a una neuropatía y una arteriopatía. La arteriopatía y la neuropatía son dos factores de riesgo principales para la cronificación y, por lo tanto, retrasan la curación de las heridas diabéticas, en particular las heridas del pie diabético. Los otros tipos conocidos de heridas crónicas, como úlceras por presión o úlceras venosas, arteriales o mixtas, no surgen a partir de la misma patología. Por ejemplo, la insuficiencia venosa es la que está en el origen de la formación, la cronificación y, por lo tanto, el retraso de la curación de las úlceras venosas. Las úlceras por presión, por su parte, son heridas que resultan de los ciclos de isquemia/reperfusión después de una presión y fricción excesivas y prolongadas ejercidas sobre los tejidos cutáneos.

Por lo tanto, todos los pacientes diabéticos que sufren heridas están expuestos a complicaciones que a menudo son responsables de la morbilidad y la mortalidad de dicho paciente. Varios problemas importantes producen la alteración del buen desarrollo de la cicatrización en este tipo de sujetos. Se produce un primer retraso de la cicatrización desde la fase inflamatoria: se interrumpe la transición de la fase inflamatoria a la fase de proliferación. Se habla de un problema a nivel de la resolución de la inflamación. La fase inflamatoria es una fase esencial de y calibración pero debe ser transitoria. La resolución de la inflamación es un punto crítico que condiciona el inicio de las otras fases de la cicatrización. Este fenómeno dinámico implica la desaparición de células inflamatorias (neutrófilos polinucleares) y la aparición de macrófagos. Entonces se produce una producción de mediadores antiinflamatorios quimiotácticos y angiogénicos que permiten en particular la migración y la diferenciación de los fibroblastos, células fundamentales de la fase de granulación.

Una alteración de esta fase inflamatoria, como es el caso en los sujetos que se han mencionado anteriormente, va a generar una prolongación anómala de la fase inflamatoria y conducirá a la cronicidad de la lesión, retrasando de ese modo todas las etapas posteriores de la cicatrización.

Al final, la fase de cierre de la herida, en particular durante la epitelización, se retrasa, incluso, y en la mayoría de los casos, no tiene éxito.

La aspirina o el ácido acetilsalicílico se conoce desde hace mucho tiempo como un remedio eficaz para muchos síntomas o patologías. Su modo de acción más común es una acción ancestral para aliviar el dolor o reducir la fiebre. También se usa en dosis bajas por su acción preventiva frente a la aparición de trastornos cardiovasculares (acción antitrombótica).

En efecto, las propiedades antiplaquetarias permiten luchar de manera eficaz frente a la formación de coágulos sanguíneos en los vasos sanguíneos. Sin embargo, parece que esta acción es más beneficiosa en el contexto de una acción preventiva después de un primer trastorno vascular, más que en la prevención primaria, en la que la eficacia real de esta sustancia parece intangible.

Aquí se trata, en cada uno de los casos mencionados anteriormente, de una administración de aspirina por vía oral. También existen aplicaciones de aspirina por vía tópica. En efecto, también se sabe que la aplicación tópica de la aspirina tiene una acción beneficiosa en las cicatrices hipertróficas y, en particular, en la mejora de la estética de estas cicatrices (véase Wound Repair Regen, 5 de noviembre de 2012, Epub antes de impresión, Topical application of a film-forming emulgel dressing that controls the release of stratifin and acetylsalicylic acid and improves/prevents hypertrophic scarring par Rahmani-Neishaboor E, Jallili R, Hartwell R, Leung V, Carr N, Ghahary A., Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canadá).

Además, también se conoce la acción positiva del ácido acetilsalicílico o aspirina, o uno de sus derivados, en la cicatrización de una herida normal, así como en el dolor de la herida, a pesar de la actividad antiagregante de esta última, que podría parecer antinómico al destino de una acción pro-cicatrizante.

En efecto, la solicitud de patente EP 1581 252 de la compañía Kimberly Clark describe una composición que comprende aspirina para estimular la proliferación celular, y más particularmente la de fibroblastos y queratinocitos. Esta composición mejora la cicatrización de una herida gracias a la estimulación de la proliferación celular. El presente documento revela que el efecto de la aspirina depende de la dosis para concentraciones que oscilan entre 10-5 y 10-6 M, con las dosis más eficaces encontrándose en las concentraciones más bajas. La composición final descrita comprende una concentración de aspirina entre 1 pM y 5 mM. La estimulación de la proliferación celular, es decir, la de los fibroblastos y los queratinocitos, así como la estimulación de la producción de colágeno, son procesos importantes de la cicatrización, que intervienen en las etapas de proliferación así como en la fase muy tardía de la remodelación.

La solicitud de patente EP 0 784 975 de la compañía japonesa Teikoku describe con respecto a la misma una preparación farmacéutica a base de aspirina para una aplicación tópica destinada a tratar heridas de la piel, en particular mimetizada por modelos de ratas que presentan úlceras de decúbito. Cabe señalar que estos modelos son modelos de animales sanos. En efecto, ninguna de las ratas en el estudio tenía trastornos metabólicos del tipo diabetes. En la presente solicitud, la preparación tiene como objeto aumentar la velocidad de formación del tejido de granulación, y además la restauración de la epidermis en animales sanos y que presentan una o varias heridas. Por lo tanto, la presente solicitud se centra en estimular el proceso celular de la cicatrización en sus fases más tardías. Ninguno de estos documentos se interesa por la primera etapa de la cicatrización, es decir, la fase inflamatoria y su resolución, siendo la fase inflamatoria por tanto una etapa primordial e indispensable ya que inicia el proceso global de cicatrización. En efecto, las heridas del diabético necesitan una gestión o una intervención más precoz en la cinética del proceso cicatricial.

Esta es la razón por la cual la mayúscula inicial solicitante ha observado que existía una necesidad real para la realización de un tratamiento precoz, eficaz y dirigido de las heridas del diabético.

De forma totalmente sorprendente, la esplénica solicitante ha podido observar que el uso de aspirina permitirá restablecer una fase inflamatoria controlada, que también se podría calificar como normal (no prolongada y no exacerbada) pero también acelerar la resolución de la inflamación, emitiendo por consiguiente llevar a un cierre de la herida más precoz y más rápido, en los sujetos diabéticos.

Objeto de la invención

Por lo tanto la presente invención tiene como objeto el uso, tópico, de ácido acetilsalicílico o de una de sus sales, a una concentración comprendida entre 200 y 4800 pM, para su uso en la prevención y/o tratamiento de las heridas del diabético.

Por lo tanto, la presente invención tiene como objeto el ácido acetilsalicílico o una de sus sales, a una concentración comprendida entre 200 y 4800 pM, para su uso para la prevención y/o el tratamiento de las heridas del diabético, la administración del ácido acetilsalicílico o una de sus sales a esta concentración siendo realizada en forma tópica. La presente invención también tiene como objeto una composición farmacéutica que comprende ácido acetilsalicílico o una de sus sales, en la que la concentración está comprendida entre 200 y 4800 pM, para su uso para la prevención y/o el tratamiento de las heridas del diabético, la administración de dicha composición siendo realizada en forma tópica.

Por « herida del diabético », se hace referencia a una herida que se produce en un sujeto diabético de tipo I o diabético de tipo II, elegida en particular entre las heridas de los miembros inferiores, y de preferencia las heridas del pie diabético.

Por « sal de ácido acetilsalicílico », se hace referencia a una sal de ácido acetilsalicílico con un catión farmacéuticamente aceptable, de preferencia acetilsalicilato de lisina o acetilsalicilato de sodio.

Por « dosis eficaz », se hace referencia, en el contexto de la presente invención, a una cantidad de ácido acetilsalicílico o una de sus sales comprendida entre 7,2.10'3 y 0,173 mg por herida, de preferencia comprendida entre 7,2.10'3 y 0,1044 mg por herida y de preferencia incluso entre 1,08.10-2 y 7,2.10'2 mg por herida. Esta cantidad de ácido acetilsalicílico o de una de sus sales es la que se pone en contacto directo con la herida. Se trata de una herida que se podría definir como de aproximadamente 1 cm2 de superficie. Sin embargo, la dosis eficaz de ácido acetilsalicílico o de uno de sus sales varía en función de numerosos parámetros tales como, por ejemplo, el tamaño de la herida, el peso, la edad, el sexo, la sensibilidad y el tipo de individuo (ser humano o animal) que se va a tratar. En consecuencia, la dosis eficaz óptima se deberá determinar en función de los parámetros que el especialista en la materia considere relevantes.

Por « cronificación », se hace referencia a cualquier retraso en la cicatrización de dichas heridas.

Por « tratar » las heridas del diabético, se hace referencia a una cicatrización y un cierre de dichas heridas.

Por « prevenir » las heridas del diabético, se hace referencia a impedir el retraso de la cicatrización o cronificación de dichas heridas.

El ácido acetilsalicílico o una de sus sales se usa en la invención a una concentración eficaz. En efecto, usado a una concentración inferior a 200 pM, por ejemplo a 100 pM, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales no tiene efecto la aceleración de la velocidad de cicatrización de las heridas del diabético.

Del mismo modo, a una concentración mayor o igual a 5000 pM, el ácido acetilsalicílico ya no tiene ninguna acción beneficiosa en la aceleración de la cicatrización de las heridas diabéticas, o incluso una acción perjudicial en la viabilidad de ciertas células presentes al nivel de la herida, como por ejemplo los macrófagos.

De acuerdo con un modo de realización preferente, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales se usa a una concentración comprendida entre 200 y 2900 pM.

De acuerdo con un modo de realización incluso más preferente, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales se usa a una concentración comprendida entre 300 y 2000 pM.

De preferencia, la concentración definida de ácido acetilsalicílico o una de sus sales es la concentración atribuida en contacto con la herida.

De preferencia, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales se usa para el tratamiento de la cronificación de las heridas del diabético. En particular, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales permite restablecer una fase inflamatoria denominada controlada (no prolongada y no exacerbada), acelerar la resolución de la inflamación, y en consecuencia acelerar la cinética de cierre de la herida.

De preferencia, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales de acuerdo con la invención se formula en un medio fisiológicamente aceptable, con el fin de obtener una composición farmacéutica. Por « medio fisiológicamente aceptable », se hace referencia a un medio compatible con la piel, las heridas, las membranas mucosas y las faneras.

De preferencia, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales está asociado a un lípido o a un aceite hiperoxigenado, o a uno de sus derivados. Dicho lípido o dicho aceite hiperoxigenado se puede formularse en la composición farmacéutica que ya comprende ácido acetilsalicílico o una de sus sales, o bien se puede administrar independientemente del ácido acetilsalicílico o una de sus sales. De preferencia, el lípido es un ácido graso de tipo Omega-3 u Omega-6 o una combinación de los dos.

Por « Omega-3 » se hace referencia a cualquier compuesto elegido entre el listado no limitante que consiste en el ácido a-linolénico, ácido eicosapentaenoico o incluso ácido docosahexaenoico.

Por « Omega-6 » se hace referencia a cualquier compuesto elegido entre el listado limitante que consiste en ácido linoleico, ácido Y-linolénico, ácido eicosadienoico, ácido dihomo-Y-linolénico, ácido araquidónico, ácido docosadienoico, ácido docosatetraenoico o incluso ácido docosapentaenoico.

Por aceite « hiperoxigenado », se hace referencia a cualquier aceite de origen vegetal hiperoxigenado, la definición de este aceite en espectrofotometría de UV siendo de 10 a 20 para el factor E270 y de 8 a 60 para el factor E232. De preferencia, el aceite de origen vegetal hiperoxigenado presenta una velocidad de peroxidación comprendida entre 30 y 300 expresada en miliequivalentes por kilogramo y un contenido de glicéridos oxidados comprendido entre 5 y 40.

De preferencia incluso, el aceite de origen vegetal hiperoxigenado presenta una tasa de peroxidación comprendida entre 50 y 150 expresada en miliequivalentes por kilogramo.

De acuerdo con un modo de realización preferente, el aceite de origen vegetal hiperoxigenado se elige entre el grupo que consiste en aceites de maíz, aceites de almendra dulce, aceites de cártamo, aceites de avellana, aceites de cacahuete, aceites de oliva, aceites de colza, aceites de soja, aceites de onagra, aceites de girasol, aceites de semilla de uva, aceites de sésamo y sus mezclas, y de preferencia un aceite de maíz.

El ácido acetilsalicílico o una de sus sales, y la composición farmacéutica que los comprende, se administran por vía local, también denominada vía tópica. La administración por vía local o tópica implica que el principio activo, en este caso el ácido acetilsalicílico o una de sus sales, actúa de manera local después de su absorción por la piel, herida o membranas mucosas. Existen diversas formas galénicas, tales como soluciones, emulsiones, cremas, pomadas, lociones, parches, geles, apósitos, microcápsulas, microfibras, pulverizaciones, polvos o nanofibras.

De preferencia, el ácido acetilsalicílico o una de sus sales está comprendido en una composición (farmacéutica) elegida entre apósitos, microcápsulas, microfibras, nanofibras, soluciones, lociones, geles, parches, emulsiones, cremas, pomadas, polvos y pulverizaciones.

Cuando la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se encuentra en forma de una emulsión, ésta comprende al menos una fase acuosa y/o una fase oleosa, y un agente tensioactivo. En efecto, las emulsiones clásicas son sistemas inestables casi homogéneos de dos líquidos no miscibles, de los cuales uno se dispersa el otro en forma de gotitas finas (micelas). Esta dispersión se estabiliza gracias a la acción de agentes tensioactivos que modifican la estructura y la proporción de las fuerzas a nivel de la superficie de contacto, y por lo tanto aumentando la estabilidad de la dispersión disminuyendo la energía de la tensión interfacial.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también se puede presentar en forma de gel; entonces comprende uno o varios compuestos gelificantes.

Cuando la composición farmacéutica se presenta en forma de una solución, ésta comprende, además del ácido acetilsalicílico o una de sus sales, una solución acuosa u oleosa, y opcionalmente uno o varios disolventes y/o propenetrantes del ácido acetilsalicílico o una de sus sales.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender además aditivos inertes o combinaciones de estos aditivos, tales como:

- agentes espesantes o emulsionantes;

- agentes reguladores del pH;

- filtros UV-A y UV-B;

- y antioxidantes.

Los agentes espesantes o emulsionantes se pueden elegir entre el listado no limitante de compuestos que incluyen en particular goma de xantano o incluso la familia de los tensioactivos.

Los agentes reguladores del pH se pueden elegir entre el listado no limitante de compuestos que comprenden en particular carbonatados.

Los filtros UV-A y UV-B se pueden elegir entre el listado no limitante de compuestos que comprenden filtros químicos y minerales. Entre los filtros químicos se encuentran octocrileno, benzofenonas, drometrizol trisiloxano o incluso avobenzona. Entre los filtros minerales se encuentran el óxido de cinc o el dióxido de titanio.

Los antioxidantes se pueden elegir entre el listado no limitante de compuestos que comprenden en particular acetato de tocoferol o ácido ascórbico.

Por supuesto, el experto en la materia se encargará de elegir el compuesto o compuestos opcionales que se añadirán a estas composiciones farmacéuticas de un modo tal que las propiedades ventajosas intrínsecamente unidas a la presente invención no se vean sustancialmente perjudicadas por la adición prevista.

Estos aditivos pueden estar presentes en la composición de un 0,001 a un 20 % en peso con respecto al peso total de la composición.

A continuación se proporcionarán los siguientes ejemplos a modo de ilustración.

Descripción de las figuras

Otras características y ventajas de la invención aparecerán más claramente con la lectura de la descripción que sigue a continuación de un modo de realización preferente de la invención, proporcionará a modo de ejemplo de las cuales aquí se proporcionan las leyendas de las figuras:

Figura 1: Cinética de cierre de la herida en ratones de « control » y diabéticos (HFD y db/db)

Figura 2: Evaluación del exudado y cuantificación del número de células en el exudado de los ratones de « control » y diabéticos (HFD y db/db). Las leyendas de la tabla son las siguientes:

Ausencia de exudado: -Supuración: /-Exudación débil:

Exudación moderada: +

Exudación intensa: ++

Figura 3: Cuantificación del número total de neutrófilos polinucleares y macrófagos en el exudado de ratones de « control » y diabéticos (HFD)

Figura 4: Cinética de cierre de la herida de los ratones « indicador » y diabéticos (db/db) tratados con ácido acetilsalicílico

Figura 5: Cinética de cierre de la herida de los ratones « indicador » y diabéticos (db/db) tratados con ácido acetilsalicílico

Figura 6: Viabilidad de macrófagos in vitro en presencia de ácido acetilsalicílico

Figura 7: Cinética de infiltración celular en la herida de ratones « indicador » y diabéticos (HFD) tratados con ácido acetilsalicílico.

Descripción detallada de la invención

Ejemplos

MATERIAL Y MÉTODOS

Ratón db/db:

Los ratones homocigotos db/db presentan una mutación puntual en el gen del receptor de leptina, una hormona que controla en particular el fenómeno de la saciedad. Los ratones db/db se vuelven hiperfágicos y espontáneamente obesos a partir de su tercera/cuarta semana de vida. Estos animales se caracterizan por hiperglucemia, resistencia a la insulina e hipertrigliceridemia, lo que convierte a estos ratones en modelos diabéticos de origen genético de primera elección. Los ratones del grupo de « control » de los ratones db/db son los ratones heterocigotos db/+. Ratón HFD:

Los ratones HFD son modelos murinos de diabetes inducida realizados con ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad. Estos ratones siguen un régimen alimentario hipercalórico (hiperlipídico) durante 16 semanas. Presentan un aumento de peso elevado debido al aumento de su tejido adiposo y también desarrollan intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina. A diferencia de los ratones db/db, el estado diabético de estos animales no es genético. Los ratones en el grupo de « control » de los ratones HFD son ratones con un régimen convencional, también conocidos con la abreviatura « NC ».

Todos los animales se mantienen en un ciclo diario dividido en 12 horas de oscuridad seguido de 12 horas de luminosidad a 22 °C con acceso perpetuo a agua y a alimento. El establecimiento de diabetes en ratones se valida de acuerdo con dos ensayos que permiten evaluar el metabolismo de la glucosa: el ensayo de tolerancia a la glucosa (IPGTT) y el ensayo de sensibilidad a la insulina (IPIST).

Seguimiento de la cinética de cicatrización:

El ratón se anestesia con la ayuda de isofluorano (gas anestésico halogenado). La parte dorsal y los costados del ratón se rasuran, se desinfectan y se realiza una escisión circular de aproximadamente 1 cm2. El tejido conectivo situado en la superficie de contacto del tejido muscular se elimina sin dañar la fascia muscular. Esta escisión total de la piel reducida de ese modo va hasta el panículo carnoso.

La herida producida de ese modo está protegida por un dispositivo tal como se describe en las solicitudes de patente FR 11 62295 y FR 11 62344 depositadas por los laboratorios Urgo, lo que permite a la vez proteger la herida como observar y evaluar la cinética de la cicatrización y la recogida de exudados.

El proceso de cicatrización de las heridas se observa de 0 a 30 días después de la lesión. Para cada animal, se toman entre 3-5 fotografías digitales estandarizadas de muy alta resolución. El porcentaje de cierre de heridas se basa en los cambios de área calculados para la misma herida, en el mismo ratón y para los puntos de tiempo indicados. Por lo tanto, el promedio calculado para la cicatrización de las heridas (en porcentaje) entre los 3 ratones en un grupo se obtiene de forma independiente, y las estadísticas se calculan a partir de 3 grupos de 3 experimentos independientes.

Las células del exudado se recuperan el J1 después de la lesión hasta que la herida ya no se secreta más exudados. Para determinar la cinética de infiltración de neutrófilos polinucleares, las células del exudado de la lesión se caracterizan por un inmunomarcado que afecta a los receptores de membrana Ly6G, 7/4 (para los polinucleares) y F4/80 (para los macrófagos) en citometría de flujo. Se analizan un total de 10000 sucesos para cada muestra. Todos los resultados se informan como un porcentaje de expresión.

RESULTADOS OBTENIDOS

Los resultados se expresan en promedio ± ETM. La ETM es la desviación estándar de la media. Representa la desviación de la media de la muestra con respecto al promedio de la población real. Se calcula dividiendo la desviación estándar entre la raíz cuadrada del tamaño de la muestra. Los análisis estadísticos se llevan a cabo de acuerdo con el método de comparación múltiple, el ensayo de Bonferroni-Dunnet que cubre al menos 3 sujetos para cada grupo (n = 3). P < 0,05 (*) se considera estadísticamente significativo.

A. Seguimiento de la cicatrización

Cinética de cierre de la herida (figuras 1A y 1B):

En los ratones de « control », se observa el cierre total de la lesión en 14 días. Por el contrario, en los ratones HFD, este cierre se completa solo después de un periodo de 18 días, es decir, 4 días de retraso efectivo (figura 1A). En los ratones db/db, el cierre completo de la herida no es eficaz más que entre J26 a J28, es decir, de 10 a 12 días de retraso de la cicatrización con respecto a su control respectivo (figura 1B).

Por lo tanto, existe un retraso significativo en el cierre de la herida en los ratones diabéticos (HFD y db/db).

Observación macroscópica de la cicatrización (exudados tejido de granulación) (figura 2):

En los ratones de « control », después de la creación de la lesión cutánea, se observa el establecimiento de un tejido de granulación que aparece de forma progresiva a nivel de la herida. Su expansión no es homogénea pero tiene su origen en diferentes puntos de los bordes de la herida para rellenar la completamente en 5 días. Este tejido se engrosa a medida que avanza la cicatrización.

Los ratones diabéticos presentan un claro retraso desde el segundo día después de la lesión en el establecimiento de este tejido de granulación. El llenado total de la lesión se produce solo después de 7 días después de la lesión en ratones diabéticos, es decir, dos días adicionales en comparación con los ratones « control ».

En los ratones diabéticos, el establecimiento del tejido de granulación va acompañado por un fenómeno de exudación. Este fluido, rico en células y mediadores, se produce desde el momento de la creación de la lesión. En los ratones de « control », el pico de producción se alcanza desde el J3 después de la lesión.

Por el contrario, los ratones diabéticos (HFD y db/db) presentan una exudación mucho mayor en términos de volúmenes desde el J2 después de la lesión, pero sobre todo que persiste a lo largo del tiempo (figura 2).

Por lo tanto, existe un retraso significativo en el establecimiento del tejido de granulación en los ratones diabéticos acompañado por una exudación más importante y persistente.

B. Análisis de poblaciones celulares presentes en el exudado (Figuras 2, 3A y 3B)

Los ratones de « control » "presentan de manera general un volumen de exudado bajo y la infiltración celular en este exudado es limitada. Una infiltración celular en el exudado se observa el segundo día después de la lesión y hasta 5 días después de la lesión. Se observa un pico de infiltración celular en J3 después de la lesión (figura 2). La cinética de la infiltración celular en el exudado de los ratones diabéticos es diferente a la observada en los ratones de « control ». En efecto, se observa una infiltración celular, más importante que persiste a lo largo del tiempo hasta el J7 después de la lesión (figura 2).

La diferencia de la infiltración celular que se observa en función del tiempo se explica por la persistencia de neutrófilos polinucleares en el sitio de la lesión de los ratones diabéticos. De hecho, en los ratones de « control », los neutrófilos desaparecen después de 5 días después de la lesión, mientras que en los ratones diabéticos, esta población celular persiste a lo largo del tiempo, hasta el J7 después de la lesión (figura 3A). Por lo tanto, parece claramente que el porcentaje de células polimorfonucleares que se infiltran en la lesión cutánea es mucho mayor para el grupo diabético que para el grupo de « control ».

Los ratones diabéticos presentan una infiltración celular más importante que tiene su origen en la persistencia de los neutrófilos polinucleares en el sitio de la lesión.

Los macrófagos llegan al sitio de la lesión tan pronto como el J3 después de la lesión en los ratones de « control ». Por el contrario, esta infiltración de células no es más que ligeramente visible después del J3 después de la lesión en ratones diabéticos, sin aumentar durante la continuación de la introducción del tejido de granulación (figura 3B). Los ratones diabéticos presentan una infiltración celular más importante que se explica:

- Por la persistencia de neutrófilos polinucleares en el sitio de la lesión;

- Por un retraso en el reclutamiento de macrófagos; y

- Por un defecto de desaparición de neutrófilos polinucleares.

RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS RATONES TRATADOS CON ÁCIDO ACETILSALICÍLICO

A. Seguimiento de la cinética de cicatrización de ratones diabéticos en presencia de ácido acetilsalicílico usado en diferentes concentraciones

Cinética del cierre de la herida (figuras 4, 5 y 6):

Como ya se ha descrito anteriormente, el ratón se anestesia con la ayuda de isofluorano. La parte dorsal y los costados del ratón se rasuran, se desinfectan y se realiza una escisión circular de aproximadamente 1 cm2. El tejido conectivo situado en la superficie de contacto del tejido muscular se elimina sin dañar la fascia muscular. Esta escisión total de la piel realizada de ese modo va hasta el panículo carnoso.

Mientras tanto, la solución de referencia de ácido acetilsalicílico se prepara a 5 mM. Esta solución se usará para soluciones a las concentraciones 100 pM, 200 pM, 300 pM, 1 mM, 2 mM, 2,9 mM, 4,8 mM y 5 mM.

Las soluciones a concentraciones de 100 pM, 200 pM, 300 pM, 1 mM, 2 mM, 2,9 mM, 4,8 mM y 5 mM de ácido acetilsalicílico se someten ensayo.

Por cuestiones de precisión, se establece una tabla de correspondencia entre las concentraciones de ácido acetilsalicílico y las dosis administradas a nivel de la herida, véase a continuación. Estas dosis administradas a nivel de la herida corresponden a un modo de realización particular de la invención.

Tabla 1:

A partir de cada solución, se toma un volumen de entre 50 y 500 pl y se pone en contacto con la herida mediante un dispositivo tal como se describe a través de las solicitudes de patente FR 11 62295 y FR 11 62344 depositadas por los Laboratorios Urgo.

Se debe observar que esta puesta en contacto de una concentración definida previamente de ácido acetilsalicílico en el sitio de la cicatriz se realiza desde el tercer día después de la lesión. En efecto, es en este periodo en el que el retraso de la cicatrización aparece en los ratones diabéticos, en comparación con los ratones de control « control » (figura 1A y 1B). Además, en el contexto del tratamiento de pacientes diabéticos, las heridas tratadas ya se formarán y se estancarán en la fase inflamatoria. Ninguna herida crónica, y más particularmente las heridas del diabético, se tratan desde el momento de su aparición. Además, la fase inflamatoria es una fase indispensable para la cicatrización, ya que permite la limpieza de la zona dañada y su limpieza gracias a la infiltración de células inflamatorias tales como los neutrófilos polinucleares. Por lo tanto, es necesario mantener la inflamación para iniciar una curación eficaz y, por lo tanto, no bloquear completamente esta fase. Es por eso que el tratamiento con ácido acetilsalicílico solo se ofrece desde el día J3 después de la lesión.

Las figuras 4A y 4B describen las cinéticas de cicatrización de las heridas de ratones diabéticos después de aplicar de forma alternativa una solución de NaCl (que corresponde al « indicador » de los investigadores), o una solución de ácido acetilsalicílico 300 pM o 1000 pM de ácido acetilsalicílico o una solución de 2000 pM.

Los ratones diabéticos tratados con ácido acetilsalicílico a 300 pM, 1000 pM y 2000 pM presentan cinéticas de cicatrización totalmente diferentes a las de los ratones « indicador ». Mientras que en los ratones diabéticos « indicador » el cierre de la herida se concluyó en 26 días, los ratones diabéticos tratados con ácido acetilsalicílico 300 pM y 1000 pM tuvieron sus heridas cerradas aproximadamente 20 días después de la lesión. Por analogía, la figura 4B sugiere los mismos resultados para una dosis de 2000 pM.

Además, los investigadores pueden observar que el aumento en la velocidad de cierre de las heridas tratadas con soluciones de ácido acetilsalicílico a 300 pM, 1000 pM y 2000 pM se realiza por medio de una aceleración en la fase precoz de la cicatrización (fase inflamatoria) a saber entre J3 y J7 después de la lesión, visible en la figura 4. Esta aceleración de la cicatrización entre J3 y J7 después de la lesión se correlaciona con una velocidad de resolución de la inflamación acelerada. Por lo tanto, la velocidad de cicatrización y, por lo tanto, la velocidad de cierre de la herida de los ratones en los que se administran dichas soluciones de ácido acetilsalicílico, se aceleran enormemente en relación con los ratones « indicador ».

En resumen, la administración tópica de soluciones a 300 pM, 1000 pM y 2000 pM de ácido acetilsalicílico restablece una fase inflamatoria controlada e induce una aceleración muy clara de la resolución de la inflamación que permite de ese modo un aumento de la velocidad de cierre de la herida (aproximadamente el J20 después de la lesión) en comparación con los ratones diabéticos « indicador ».

La figura 5 describe las cinéticas de cicatrización de las heridas de ratones diabéticos después de la aplicación de forma alternativa de una solución de NaCl (que corresponde al « indicador » de los investigadores), o de una solución a 100 pM o a 5000 pM de ácido acetilsalicílico.

Las cinéticas de cicatrización de ratones diabéticos « indicador » "y de los ratones diabéticos tratados con ácido acetilsalicílico 100 pM y 5000 pM son similares y no muestran diferencias significativas. No existe el menor efecto después de la introducción de tales concentraciones de ácido acetilsalicílico en contacto con la herida sobre la cinética de cicatrización en comparación con los ratones diabéticos de « indicador », y especialmente durante la fase inflamatoria así como durante la colocación en el lugar del tejido de granulación.

En resumen, la administración tópica de soluciones de ácido acetilsalicílico 100 pM y 5000 pM en las heridas de ratones diabéticos no muestra ninguna eficacia en la restauración de una fase inflamatoria controlada ni en la aceleración de la resolución de la inflamación y, por lo tanto, no permite un aumento de la velocidad de cierre de la herida.

Además, se llevan a cabo ensayos de viabilidad celular para diferentes concentraciones de ácido acetilsalicílico en macrófagos (figura 6).

Este método de análisis comprende el uso de monocitos obtenidos a partir de sangre periférica humana que se cultivan en medio RPMI en el que se añade M-CSF a 10 ng/ml durante 24 horas para diferenciarlos en macrófagos. El ácido acetilsalicílico se añade al medio de cultivo a razón de de 1000 pM o 5000 pM final.

La mortalidad celular se analiza después de 72 horas de incubación mediante citometría de flujo, midiendo la incorporación citoplasmática de yoduro de propidio.

El objeto de un ensayo de viabilidad celular de ese tipo llevado a cabo in vitro es verificar la nocividad de la dosis administrada en las células encontradas a nivel de la herida, y de forma preferente en el presente caso en los macrófagos, células consideradas como un tipo de células efectoras en la curación de la lesión estudiada. En efecto, un estudio de este tipo es imposible en neutrófilos polinucleares debido a su mortalidad basal demasiado importante in vitro.

La figura 6 desvela una pérdida muy clara de la viabilidad celular para una dosis de 5000 pM de ácido acetilsalicílico administrada en células in vitro a las 72 horas, con un valor de viabilidad que se encuentra disminuido en un 20 % y que por lo tanto se puede caracterizar como nocivo.

Por el contrario, la aplicación de una dosis de 1000 pM no desvela ninguna toxicidad celular.

Por lo tanto, la solución a una concentración de 5 mM administrada en la herida no es, por una parte, eficaz en la cinética de cicatrización (figura 5) y además se observa que es perjudicial para las células presentes en el sitio cicatricial (figura 6).

B. Análisis de las poblaciones celulares presentes en el exudado (figura 7)

La figura 7 describe la cinética de la infiltración celular realizada en ratones diabéticos « indicador » o en los que se encuentra aplicará una solución de 1000 pM de ácido acetilsalicílico.

El J7 después de la lesión, se observa que el tratamiento con ácido acetilsalicílico permite disminuir en forma significativa el número de células infiltradas en el sitio de la lesión en los ratones diabéticos tratados.

Por lo tanto, con la lectura de todos los resultados anteriores se puede llegar a la conclusión que el tratamiento a base de aspirina a una concentración comprendida entre 100 pM y 4800 pM (administradas desde el J3 después de la lesión) permite disminuir la infiltración celular en ratones diabéticos, restablecer una fase inflamatoria controlada y acelerar la resolución de la inflamación para permitir términos para aumentar la velocidad de cierre de la herida. El ácido acetilsalicílico, por lo tanto, tiene un papel fundamental en el proceso de resolución de la inflamación y en consecuencia en la velocidad de cierre de la herida del individuo diabético.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales, a una concentración comprendida entre 200 y 4800 pM, para su uso para la prevención y/o el tratamiento de las heridas del diabético, la administración del ácido acetilsalicílico o una de sus sales a esta concentración siendo realizada en forma tópica.

2. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración de ácido acetilsalicílico o una de sus sales está comprendida entre 200 y 2900 pM.

3. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la concentración de ácido acetilsalicílico o una de sus sales está comprendida entre 300 y 2000 pM.

4. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la sal de ácido acetilsalicílico se elige entre acetilsalicilato de lisina y acetilsalicilato de sodio.

5. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado por que el ácido acetilsalicílico o una de sus sales está comprendido en una composición elegida entre apósitos, microcápsulas, microfibras, nanofibras, soluciones y pulverizaciones.

6. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para el tratamiento de la cronificación de las heridas del diabético.

7. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para acelerar la resolución de la inflamación.

8. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que el ácido acetilsalicílico o una de sus sales está asociado a un lípido, un aceite hiperoxigenado o a uno de sus derivados.

9. Ácido acetilsalicílico o una de sus sales para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que el lípido o uno de sus derivados es un ácido graso de tipo Omega-3 u Omega-6, o una asociación de los dos.

10. Composición farmacéutica que comprende ácido acetilsalicílico o una de sus sales, en la que la concentración está comprendida entre 200 y 4800 pM, para su uso para la prevención y/o el tratamiento de las heridas del diabético, la administración de dicha composición siendo realizada en forma tópica.