ES2710153T3 - Derivados de la colchicina o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, método de preparación de dichos derivados y composición farmacéutica que comprende dichos derivados - Google Patents

Derivados de la colchicina o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, método de preparación de dichos derivados y composición farmacéutica que comprende dichos derivados Download PDF

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Abstract

Un derivado de la colchicina representado por la siguiente fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:**Fórmula** en la que - R1 es fenilo,**Fórmula** o cicloalquilo C3-C6, no sustituido o sustituido con X, donde X es halógeno, OCH3, NO2, NH2 o alquilo C1-C3 de cadena lineal o ramificada, y Z y Z' son cada uno independientemente H, halógeno, OCH3, NO2, NH2 o alquilo C1- C4 de cadena lineal o ramificada; - n es un número entero de 0 a 3; y - A es CH2, NH, u O seleccionado del grupo que consiste en: 1) éster bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbámico; 2) éster 4-nitro bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 3) éster 4-bromo bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 4) éster 4-fluoro bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 5) éster 2-fluoro bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico;~ 6) éster 3-fluoro bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 7) éster 4-metil bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 8) éster 4-isopropil bencílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 9) éster ciclopentilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 10) éster ciclohexilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 11) éster indan-1-ilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 12) éster 1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[ a]heptalen-7-il)-carbámico; 13) éster 9H-fluoren-9-ilmetílico del ácido 1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9- oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbámico; 14) éster 1-metil-9H-fluoren-9-ilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen- 7-il)-carbámico; 15) éster 2-bromo-9H-fluoren-9-ilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro50 benzo[a]heptalen-7-il)-carbámico; 16) éster 2,7-di-terc-butil-9H-fluoren-9-ilmetílico del ácido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[ a]heptalen-7-il)-carbámico; 17) éster 2-(9H-fluoren-9-il)-etílico del ácido (1,2,3,10-tatrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)- carbámico; 18) 3-fenil-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida; 19) 3-(4-metoxi-fenil)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida 20) 2-(9H-fluoren-9-il)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-5 9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-acetamida; 21) 3-(9H-fluoren-9-il)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida; y 22) 1-bencil-3-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-urea.

Description

DESCRIPCION
Derivados de la colchicina o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, metodo de preparacion de dichos derivados y composicion farmaceutica que comprende dichos derivados
La presente invencion se refiere a derivados de la colchicina o a las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, un metodo para preparar los mismos y una composicion farmaceutica que comprende los mismos. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a derivados de la colchicina que pueden usarse como un inmunomodulador de una respuesta inmunitaria aguda o cronica en un trasplante de organos.
Los rechazos de trasplantes de organos, enfermedades autoinmunitarias, alergias, etc. se producen cuando el sistema inmunitario responsable de defender el cuerpo activa el sistema de defensa contra otros antfgenos diferentes del propio cuerpo para destruir el organo o tejido trasplantado y, por lo tanto, tienen efectos nocivos en el cuerpo humano. En general, el trasplante de organos es el tratamiento mas efectivo para los pacientes con insuficiencia organica terminal. Sin embargo, si los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) del donante y el receptor no coinciden, el sistema inmunitario del cuerpo reconoce al organo trasplantado como germenes daninos y ataca al organo trasplantado activando los linfocitos T, los linfocitos B, los macrofagos o los linfocitos citolfticos naturales (NK), etc. La regulacion de la respuesta inmunitaria no deseada se llama inmunomodulacion, y los medicamentos utilizados para la inmunomodulacion se denominan inmunomoduladores. Hasta ahora se han desarrollado inmunomoduladores como la ciclosporina A, el tacrolimus (en lo sucesivo, FK506), etc.
La ciclosporina A fue aislada de Trichoderma polysporum en 1976 y se ha descrito que tiene relativamente menos efectos secundarios y que reduce la infeccion bacteriana en comparacion con otros inmunomoduladores. Ademas, se ha descrito que el FK506 aislado de Streptomyces tsukubaensis tiene una eficiencia 10 a 100 veces mayor que la de la ciclosporina A. Sin embargo, la ciclosporina A y FK506 tienen efectos secundarios como toxicidad renal grave, toxicidad hepatica, etc.
Por otro lado, la colchicina es un farmaco alcaloide utilizado para el tratamiento de la gota y se ha descrito que inhibe la funcion de la tubulina, una protefna que se sabe que actua como musculo y esqueleto, al unirse a la tubulina. Se ha descrito que la colchicina tiene actividades anticancerfgenas y antiproliferativas y se ha usado ampliamente para el tratamiento de la psoriasis o la artritis reumatoide, el tratamiento de la amiloidosis y la inflamacion, etc. Ademas, la Patente Coreana N.° 324302 y la publicacion de patente coreana N.° 2002-30296 divulgan el uso de colchicina como inmunomodulador, asf como el documento WO02100824,
Sin embargo, la colchicina tiene poco efecto en comparacion con la dosis y es altamente toxica en dosis altas, por lo que se necesita con urgencia el desarrollo de un nuevo inmunomodulador mejorado.
En consecuencia, los presentes inventores han preparado nuevos derivados de la colchicina mediante varias rutas sinteticas y han confirmado que los derivados de la colchicina muestran efectos inmunomoduladores superiores y baja toxicidad en comparacion con los inmunomoduladores convencionales y las colchicinas, completando asf la presente invencion. Un derivado de la colchicina de acuerdo con la presente invencion a lo largo de la descripcion se selecciona del grupo que consiste en los compuestos 1) a 22) como se indica a continuacion.
Un objeto de la presente invencion es proporcionar derivados de la colchicina o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar los derivados de la colchicina.
Otro objeto mas de la presente invencion es proporcionar una composicion farmaceutica para la inmunomodulacion que comprende los derivados de la colchicina o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos como principio activo.
En un aspecto, se divulga un derivado de la colchicina o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo representado por la siguiente formula 1:
en la que R1 es fenilo,
Figure imgf000003_0001
o cicloalquilo C3-C6 , no sustituido o sustituido con X, donde X es halogeno, OCH3 , NO2 , NH2 o alquilo C1-C3 de cadena lineal o ramificada, y Z y Z' son cada uno independientemente H, halogeno, OCH3 , NO2 , NH2 o alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada;
n es un numero entero de 0 a 3; y
A es CH2 , NH, u O.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para preparar un derivado de la colchicina que comprende la etapa de hacer reaccionar un derivado de la desacetil colchicina representado por la siguiente formula 2 con una cantidad equivalente o un exceso de
Figure imgf000003_0002
en presencia de una base o un agente de condensacion en un disolvente de reaccion para formar amida.
Figure imgf000003_0003
en la que R1, n y A tienen los significados que se han definido anteriormente.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para la inmunomodulacion que comprende el derivado de la colchicina o sus sales farmaceuticamente aceptables como principio activo.
Los derivados de la colchicina o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos de la presente invencion no tienen citotoxicidad a dosis altas y exhiben efectos inmunomoduladores superiores en comparacion con los inmunomoduladores convencionales o colchicinas, y por lo tanto pueden usarse eficazmente como un inmunomodulador para modular una respuesta inmunitaria aguda o cronica en el trasplante de organos.
La FIG. 1 un grafico que muestra la modulacion o los efectos inmunomoduladores de la proliferacion de linfocitos T utilizando bazos de ratas Lewis y ratas Wistar tratadas con derivados de la colchicina (compuestos 1, 7, 9, 14, 15, 17, 18, 22 y 23) de la presente Invencion para examinar los efectos inmunomoduladores de los derivados de la colchicina.
La FIG. 2 muestra los resultados del analisis de tejidos realizado 100 dfas despues del trasplante de celulas de los islotes mediante inyeccion intraperitoneal en combinacion con ciclosporina A (5 mg/kg) y compuestos derivados de la colchicina 7 (50, 100 qg/kg), 9 (50 qg/kg), y 14 (40 qg/kg), en los cuales los tejidos del hfgado se tineron con insulina, hematoxilina y eosina (H-E), y los linfocitos CD4 y CD8, y los tejidos pancreaticos se tineron con insulina y H-E.
A continuacion, se describira con mas detalle la presente invencion.
La presente invencion proporciona un derivado de la colchicina o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo de la siguiente formula 1:
Figure imgf000004_0001
en la que R1 es fenilo,
Figure imgf000004_0002
o cicloalquilo C3-C6 , no sustituido o sustituido con X, donde X es halogeno, OCH3 , NO2 , NH2 o alquilo C1-C3 de cadena lineal o ramificada, y Z y Z' son cada uno independientemente H, halogeno, OCH3 , NO2 , NH2 o alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada; n es un numero entero de 0 a 3; y
A es CH2 , NH, u O seleccionado del grupo que consiste en:
1) ester bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico; 2) ester 4-nitro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
3) ester 4-bromo bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
4) ester 4-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
5) ester 2-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
6) ester 3-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
7) ester 4-metoxi bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
8) ester 4-metil bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
9) ester 4-isopropil bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
10) ester ciclopentilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
11) ester ciclohexilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
12) ester indan-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
13) ester 1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
14) ester 9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
15) ester 1-metil-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
16) ester 2-bromo-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
17) ester 2,7-di-terc-butil-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tatrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
18) ester 2-(9H-fluoren-9-il)-etflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;;
19) 2-fenil-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-acetamida;
20) 2-(4-metoxi-fenil)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-acetamida;
21) 3-fenil-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida;
22) 3-(4-metoxi-fenil)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida.
Las estructuras de los compuestos anteriores se muestran en la siguiente tabla 1.
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0003
Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para preparar un derivado de la colchicina, comprendiendo el metodo la etapa de obtener un derivado de la colchicina (formula 1-1) haciendo reaccionar un derivado de desacetil colchicina (formula 2) con una cantidad equivalente o un exceso de
Figure imgf000006_0001
en presencia de una base o un agente de condensacion en un disolvente de reaccion para formar amida como se muestra en el siguiente esquema de reaccion 1,
Figure imgf000006_0002
(en el que R1 y n son como se definen en la formula 1, A es CH2 u O, y X es un grupo hidroxilo o un grupo cloruro). En el metodo de preparacion de acuerdo con la presente invencion, una base organica tal como piridina, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, DBU, o una base inorganica tal como NaOH, Na2CO3 , K2CO3 , Cs2CO3 se puede utilizar p refe rente me nte como base. Como agente de condensacion, se puede usar preferiblemente 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), 1,1'-carbonildiimidazol (CDI). Como disolvente de reaccion, puede usarse preferiblemente un disolvente de eter tal como tetrahidrofurano, dioxano, diclorometano, 1,2-dimetoxietano, N,N'-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfoxido, cloroformo, o mezclas de los mismos. La temperatura de reaccion puede ser preferiblemente de 0 °C o el punto de ebullicion del disolvente.
Mas preferiblemente, cuando A es CH2 u O y X es un grupo cloruro, se puede utilizar preferentemente como base una cantidad equivalente o un exceso de una base organica como piridina, trietilamina, N,N'-diisopropil etilamina, DBU, o una base inorganica como NaOH, Na2CO3 , K2CO3 , Cs2CO3. Como disolvente de reaccion, se puede usar preferiblemente un disolvente de eter tal como tetrahidrofurano, dioxano, diclorometano, 1,2-dimetoxietano, N,N'-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfoxido, o mezclas de los mismos. La reaccion se puede realizar en el rango de temperatura de 0 °C hasta el punto de ebullicion del disolvente. Por otro lado, cuando A es CH2 y X es un grupo hidroxilo, se puede usar DCC, DIC, EDC, CDI, como agente de condensacion. Como disolvente de reaccion, se pueden usar diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, DMF o mezclas de los mismos. La reaccion se puede realizar desde temperatura ambiente hasta el punto de ebullicion del disolvente.
Por otro lado, en la formula 1 anterior, un compuesto (formula 1-2) en el que R1 es fenilo, n es 1, y A es NH puede prepararse haciendo reaccionar un derivado de desacetil colchicina (formula 2) con una cantidad equivalente o un exceso de isocianato de bencilo en un disolvente de reaccion para formar urea como se muestra en el siguiente esquema de reaccion 2.
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Como disolvente de reaccion, se puede usar preferiblemente un disolvente de eter tal como tetrahidrofurano, dioxano, diclorometano, 1,2-dimetoxietano, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfoxido o mezclas de los mismos. La reaccion se puede realizar en el rango de temperaturas desde 0 °C hasta el punto de ebullicion del disolvente. El derivado de desacetil colchicina de formula 2 usado como material de partida en los esquemas de reaccion 1 y 2 puede prepararse a partir de la colchicina disponible comercialmente mediante la reaccion de formacion de carbamato, la hidrolisis de la amida y la reaccion de formacion de la amina como se muestra en el siguiente esquema de reaccion 3 (Helv. Chem. Acta 1996, 79, 2346).
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El compuesto de la siguiente formula 3 que reacciona con el derivado de desacetil colchicina (formula 2) del esquema de reaccion 1, se puede preparar por el siguiente metodo.
[Formula 3]
Figure imgf000007_0003
(en la que R1 y n son como se definen en la formula 1, A es CH2 u O, y X es un grupo hidroxilo o un grupo cloruro). En general, el compuesto de formula 3 se puede preparar utilizando un compuesto disponible comercialmente o mediante sfntesis de acuerdo con el siguiente esquema de reaccion 4, Por otro lado, cuando
R1 es
Figure imgf000007_0004
X es un grupo hidroxilo, A es CH2 y n es 1, el compuesto de formula 3 se puede preparar por sfntesis de acuerdo con la siguiente reaccion 5, Aquf, Z y Z' son cada uno independientemente H.
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(en el que R1 es
Figure imgf000008_0002
donde n es 0, si R1 es
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n es 1).
En el esquema de reaccion 4 anterior, el acido carboxflico (3-1 a) se reduce a un grupo alcohol con un hidruro de litio y aluminio o un complejo de borano tetrahidrofurano utilizando tetrahidrofurano como disolvente de reaccion, preparando asf un derivado de alcohol. El agente reductor se puede usar en exceso, y la temperature de reaccion puede ser desde 0 °C hasta temperature ambiente. Despues de obtener cloroformiato como compuesto intermedio utilizando una cantidad equivalente o un exceso de fosgeno y trifosgeno, el derivado de alcohol (3-1) obtenido en el esquema de reaccion 4 no se purifica mas y se hace reaccionar adicionalmente con el compuesto (2) del esquema de reaccion 1, Aquf, como disolvente de reaccion, se puede usar diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, y la temperatura de reaccion puede ser desde 0 °C hasta temperatura ambiente.
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El fluoreno (3-2a) utilizado como material de partida en el esquema de reaccion 5 se agita a 0 °C durante 30 minutos usando una cantidad equivalente o un exceso de hidruro de sodio como base y luego reacciona con formiato de etilo, preparando asf el compuesto (3 -2b) en el que se introduce un grupo aldehfdo en C-9, Aquf, como disolvente de reaccion, se pueden usar diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, DMF. La temperatura de reaccion puede ser desde 0 °C hasta temperatura ambiente.
El compuesto ester (3-2c) en el esquema de reaccion 5 con un doble enlace exo en C-9 se puede preparar haciendo reaccionar el compuesto aldehfdo (3-2b) con una cantidad equivalente o un exceso de trifenil (carbetoximetilen)fosforano y un exceso de acido carboxflico benzoico. Aquf, se puede usar benceno o tolueno como disolvente de reaccion, y la reaccion se puede realizar desde temperatura ambiente hasta el punto de ebullicion del disolvente.
En la reaccion de reduccion, el compuesto (3-2d) se puede preparar por hidrogenacion usando hidrogeno gaseoso en presencia de un catalizador de paladio (Pd/C) o un catalizador de nfquel raney o haciendo reaccionar un hidruro de hidrazina con nfquel raney, SnCb- HCl, Fe ■ HCl, etc. En general, la reaccion se realiza en un alcohol disolvente como el metanol.
En el esquema de reaccion anterior, el derivado de acido carboxflico (3-2) se puede preparar por hidrolisis del grupo ester del compuesto (3-2d) con una base. Como disolvente, puede usarse un disolvente alcoholico tal como metanol, un disolvente ester tal como tetrahidrofurano, dioxano o mezclas de los mismos. Como base, se puede usar hidroxido de sodio, hidroxido de potasio. Aquf, la cantidad de base utilizada puede ser de 1 a 5 equivalentes, y la temperatura de reaccion puede ser de 0 °C o el punto de ebullicion del disolvente.
La presente invencion comprende los derivados de la colchicina o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos y comprende ademas todos los solvatos, hidratos y estereoisomeros, que pueden prepararse a partir de ellos. Ademas, las sales farmaceuticamente aceptables de los derivados de la colchicina de acuerdo con la presente invencion pueden ser sales de adicion de acido formadas por acidos libres farmaceuticamente aceptables. Como acidos libres, se pueden usar acidos organicos y acidos inorganicos. Como acidos inorganicos, se pueden usar acido clorhfdrico, acido bromico, acido sulfurico, acido sulfuroso, acido fosforico. Como los acidos organicos, se pueden usar acido cftrico, acido acetico, acido maleico, acido fumarico, acido gluconico, acido metanosulfonico, acido acetico, acido glicolico, acido succfnico, acido tartarico, acido 4-toluenosulfonico, acido galacturonico, acido glutamico, acido aspartico. Preferiblemente, se puede usar acido metanosulfonico, acido clorhfdrico.
Las sales de adicion de acido de acuerdo con la presente invencion pueden prepararse mediante un metodo tfpico de disolucion del compuesto de formula 1 en un disolvente organico miscible con agua tal como acetona, metanol, etanol, acetonitrilo, agregando un exceso de un acido organico o una solucion acuosa de un acido inorganico, y la precipitacion o cristalizacion de la mezcla resultante. A continuacion, el disolvente o un exceso del acido puede evaporarse de la mezcla y luego secarse para obtener sales de adicion de acido o las sales precipitadas pueden separarse por filtracion y recristalizarse.
La presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para inmunomodulacion que comprende los derivados de la colchicina o sus sales farmaceuticamente aceptables como principio activo. La inmunomodulacion puede modular una respuesta inmunitaria aguda o cronica en el trasplante de organos.
Los derivados de la colchicina o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos de la presente invencion tienen efectos inmunomoduladores superiores, efectos secundarios bajos y altas tasas de supervivencia despues del trasplante de organos, en comparacion con los inmunomoduladores convencionales y las colchicinas, y por lo tanto se pueden usar de manera eficaz.
Los derivados de la colchicina de la presente invencion se pueden usar solos o en combinacion con otros inmunomoduladores convencionales. El uso puede depender de los tejidos a partir de los cuales se logran los efectos inmunomoduladores. Por ejemplo, en el caso de tejidos (por ejemplo, corazon), que es vulnerable a la respuesta inmunitaria, se pueden lograr efectos significativos solo con los derivados de la colchicina de la presente invencion. Sin embargo, en el caso de tejidos (por ejemplo, celulas de los islotes) es mas ventajoso usar los derivados de la colchicina de la presente invencion en combinacion con otros inmunomoduladores convencionales (por ejemplo, ciclosporina). Los ejemplos de inmunomoduladores disponibles pueden incluir ciclosporina A, tacrolimus, prednisolona, deflazacort, acido micofenolico, azatioprina, mizoribina, sirolimus, everolimus, anticuerpo anti-CD25 (Simulect y Zenapax), anticuerpo anti-CD3 (OKT3) y anticuerpo anti-CD20 (rituximab).
El derivado de la colchicina de la presente invencion puede administrarse por via oral o parenteral durante la administracion clfnica y puede formularse en diversas preparaciones farmaceuticas.
Durante la formulacion de las preparaciones, se pueden usar diluyentes o excipientes tales como cargas, diluyentes, aglutinantes, agentes humectantes, disgregantes, tensioactivos, etc. Las preparaciones solidas para administracion oral se pueden preparar mezclando al menos un compuesto de la presente invencion con al menos un excipiente como almidon, carbonato de calcio, sacarosa o lactosa, gelatina, etc. Asimismo, ademas de excipientes simples, se pueden usar lubricantes tales como estearato de magnesio o talco. Las preparaciones lfquidas para administracion oral pueden incluir suspensiones, soluciones internas, emulsiones, jarabes, etc. Ademas de diluyentes simples como el agua y la parafina lfquida, se pueden incluir varios excipientes como agentes humectantes, edulcorantes, aromas, conservantes, etc. Las formulaciones para administracion parenteral pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas esterilizadas, suspensiones, emulsiones, preparaciones de liofilizacion o supositorios. Se pueden usar propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, esteres inyectables como oleato de etilo, como soluciones o suspensiones no acuosas. Como base de supositorios pueden usarse Witepsol, macrogol, Tween 61, manteca de cacao, manteca de laurina, glicerol, gelatina.
La dosis efectiva del compuesto de acuerdo con la presente invencion administrado al cuerpo puede depender de la edad, el peso, el sexo, la via de administracion, las condiciones de salud y la gravedad de un paciente. Para un paciente que pesa 70 kg, la dosis puede ser de 0,1 a 1.000 mg/dfa, preferiblemente de 1 a 500 mg/dfa, lo mas preferiblemente de 0,7 a 3,5 mg/dfa. Ademas, con el consejo de un medico o farmaceutico, el compuesto de acuerdo con la presente invencion se puede administrar una o varias veces al dfa a intervalos regulares.
A continuacion, la presente invencion se describira con mas detalle con referenda a los siguientes Ejemplos.
En la presente invencion, las estructuras moleculares de los compuestos se determinaron mediante espectroscopia infrarroja, espectroscopia de RMN, espectroscopia de masas, cromatograffa lfquida, cristalograffa de rayos X, espectroscopia de rotacion optica, analisis elemental o estudios comparativos entre los valores calculados y los valores observados experimentalmente de compuestos representativos.
Ejemplo de preparacion 1: Preparacion de 7-amino-1,2,3,10-tetrametoxi-6,7-dihidro-5H-benzo[a]heptalen-9-ona (formula 2) como material de partida
<1-1> Preparacion del ester f-butflico del acido acetil-1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzofa1heptalen-7-il)-carbamico (2-2)
Figure imgf000010_0001
Se disolvieron 100 mg (0,25 mmol) de colchicina en 5 ml de cloruro de metileno y a continuacion se anadieron 104 pl (0,75 mmol, 3 eq) de trietilamina, 546 mg (2,5 mmol, 10 eq) de dicarbonato de f-butilo y 546 mg (0,25 mmol, 1 eq) de dimetilaminopiridina y se agitaron a 50 °C durante 48 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de cloruro de metileno y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (metanol 5 %/cloruro de metileno) para dar 75 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 75 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 5 1,56(s, 9H), 1,92-2,0(m, 1H), 2,28(s, 3H), 2,45-2,54(m, 1H), 2,57-5,71(m, 2H), 3,66(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,93(s, 3H), 3,97(s, 3H), 5,11-5,17(m, 1H), 6,53(s, 1H), 6,74-6,78(d, 1H, J = 10,5 Hz), 7,18-7,22(d, 1H, J = 10,5 Hz), 7,57(s, 1H)
MS (m/e, M+): 499
<1-2> Preparacion del ester f-butflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzofa1heptalen-7-il)-carbamico (2-3)
Figure imgf000010_0002
Se disolvieron 100 mg (0,2 mmol) del compuesto obtenido en el apartado anterior <1-1> en 4 ml de metanol y a continuacion se anadieron 0,15 ml (0,3 mmol, 1,5 eq) de metoxido de sodio 2N y se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el filtrado se concentro a presion reducida para dar 80 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 88 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 5 1,24(s, 9H), 1,61-1,69(m, 1H), 2,15-2,34(m, 2H), 2,38-2,44(m, 1H), 3,54(s, 3H), 3,79(s, 3H), 3,82(s, 3H), 3,89(s, 3H), 4,26-4,34(m, 1H), 6,44(s, 1H), 6,71-6,74(d, 1H, J = 10,9 Hz), 7,13-7,17(d, 1H, J = 10,9 Hz), 7,44(s, 1H)
MS (m/e, M+): 457
<1-3> Preparacion de la 7-amino-1.2.3.10-tetrametoxi-6.7-dihidro-5H-benzo[a1heptalen-9-ona (2)
Figure imgf000011_0001
Se disolvieron 100 mg (0.22 mmol) del compuesto obtenido en el apartado anterior <1-2> en una solucion de 10 ml de acido trifluoroacetico y cloruro de metileno (1:10) y luego se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida. y el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de cloruro de metileno y luego se anadio a una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio para alcalinizar hasta pH 9. La capa organica se extrajo y se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro. y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (metanol 10 %/cloruro de metileno) para dar 57 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 76 %).
RMN de 1H (300 MHz. CDCb) 5 = 1.6-1.64(m. 1H). 2.31-2.47(m. 3H). 3.66(s. 3H). 3.69-3.74(m. 1H). 3.91(s. 3H).
3.99(s. 3H). 3.69-3.74(m. 1H). 3.91(s. 6H). 3.99(s. 3H). 6.54(s. 1H). 6.78-6.82(d. 1H. J = 10.8 Hz). 7.18-7.21(d. 1H. J = 10.8 Hz)7.74(s. 1H)
MS (m/e. M+): 357
Ejemplo de preparacion 2: Preparacion del compuesto de formula 3 como material de partida
<2-1> Preparacion de indan-1-il-metanol
Figure imgf000011_0002
Se disolvieron 150 mg (0.92 mmol) de compuesto acido indan-1-carboxflico en 9 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 105 mg (2.77 mmol) de hidruro de litio y aluminio a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. Se anadio agua lentamente para inactivar la reaccion. y cuando se formo un gel anadiendo acetato de etilo. se filtro a traves de celite. A continuacion. el residuo se disolvio de nuevo en 20 ml de acetato de etilo y la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro. y el filtrado se concentro a presion reducida para dar 124 mg de un aceite incoloro (rendimiento: 91 %).
RMN de 1H (300 MHz. CDCla) 51.89-2.00(m. 1H). 2.21-2.33(m. 1H). 2.83-3.01(m. 2H). 3.34-3.39(m. 1H). 3.76-3.82(m. 2H). 7.15-7.30(m. 4H)
MS (m/e. M+): 148
<2-2> Preparacion de (1.2.3.4-tetrahidro-naftalen-1-il)-metanol
Figure imgf000011_0003
Se disolvieron 200 mg (1.10 mmol) del compuesto acido 1.2.3.4-tetrahidro-naftalen-1-carboxflico en 9 ml de tetrahidrofurano. y a continuacion se anadieron 129 mg (3.30 mmol) de hidruro de litio y aluminio a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio agua lentamente para inactivar la reaccion. y cuando se formo un gel anadiendo acetato de etilo. se filtro a traves de celite. A continuacion. el residuo se disolvio de nuevo en 20 ml de acetato de etilo y la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro. y el filtrado se concentro a presion reducida para dar 180 mg de aceite incoloro (rendimiento: 97 %).
RMN de 1H (300 MHz. CDCla) 51.69-1.98(m. 4H). 2.74-2.78(m. 2H). 2.94-3.01(m. 1H). 3.80(d. 2H. J = 8.3 Hz). 7.07-7.24(m. 4H)
MS (m/e. M+): 162
<2-3> Preparacion de 2-(9H-fluoren-9-il)-etanol
Figure imgf000012_0001
Se disolvieron 200 mg (0,89 mmol) de acido (9H-fluoren-9-il)acetico en 9 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 101 mg (2,67 mmol) de hidruro de litio y aluminio a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. Se anadio agua lentamente para inactivar la reaccion, y cuando se formo un gel anadiendo acetato de etilo, se filtro a traves de celite. A continuacion, el residuo se disolvio de nuevo en 20 ml de acetato de etilo y la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el filtrado se concentro a presion reducida. El residuo obtenido se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetato de etilo:hexano = 1:3) para dar 88 mg de un compuesto solido blanco (rendimiento: 47 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 51,16(sa, 1H), 2,26-2,33(m, 2H), 3,55-2,63(m, 2H), 4,10-4,14(t, 1H), 7,24-7,39(m, 4H), 7,52-7,54(d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,74-7,77(d, 1H, J = 7,2 Hz)
MS (m/e, M+): 210
<2-4> Preparacion del ester etilico del acido 3-fluoren-9-iliden-propionico (3-2c)
Figure imgf000012_0002
Se disolvieron 100 mg (0,6 mmol) de fluoreno en 10 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 72 mg (1,8 mmol) de hidruro de sodio a 0 °C y se agito durante 1 hora. A continuacion, se anadieron 0,48 ml (6 mmol) de formiato de etilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. Los reactantes se disolvieron en 50 ml de acetato de etilo y la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el filtrado se concentro a presion reducida. El residuo se disolvio en 10 ml de benceno y a continuacion se anadieron 250 mg (0,72 mmol) de trifenil(carbetoximetilen)-fosforano y 73 mg (0,6 mmol) de acido benzoico y se agito a 80 °C durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetato de etilo:hexano = 1:40) para dar 80 mg de un compuesto solido blanco (rendimiento): 50 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 51,30-1,34(t, 3H, J = 7,1 Hz), 3,86-3,88(d, 2H, J = 7,1 Hz), 6,93-6,98(t, 1H, J = 6,9 Hz), 7,25-7,40(m, 4H), 7,67-7,78(m, 4H) MS (m/e, M+): 264
<2-5> Preparacion del ester etilico del acido 3-(9H-fluoren-9-il)-propionico (3-2d)
Figure imgf000012_0003
Se disolvieron 160 mg (0,61 mmol) del compuesto obtenido en el apartado anterior <2-4> en metanol, y a continuacion se anadieron gota a gota 16 mg de paladio/carbon al 10 %, se purgo con hidrogeno y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. Una vez que la reaccion se extinguio, la solucion de reaccion se filtro a traves de celite y se evaporo a presion reducida para dar 159 mg de un compuesto solido blanco (rendimiento: 98 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 51,13-1,18(t, 3H, J = 7,1 Hz), 1,92-1,97(m, 2H), 2,39-2,46(m, 2H), 3,97-4,04(m, 2H), 4,05-4,09(m, 1H), 7,25-7,49(m, 4H), 7,50-7,52(d, 2H, J = 6,9 Hz), 7,73-7,75(d, 2H, J = 7,4 Hz) MS (m/e, M+): 266
<2-6> Preparacion del acido 3-(9H-fluoren-9-il)-propi6nico (3-2)
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Se disolvieron 157 mg (0,59 mmol) del compuesto obtenido en el apartado anterior <2-5> en 10 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 0,59 ml (1,18 mmol) de una solucion de hidroxido de sodio 2N y se agito a 80 °C durante dos horas. Se anadio acido clorhfdrico 2N a los reactantes que se acidificaron a pH 4 y se disolvieron en 40 ml (20 ml x 2) de acetato de etilo, y despues se extrajo la capa organica. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el filtrado se concentro a presion reducida para dar 131 mg de un compuesto solido blanco (rendimiento: 94 %).
RMN de 1H (300 MHz, DMSO-d6) 51,84-1,91 (m, 2H), 2,22-2,29(m, 2H), 4,04-4,07(t, 1H), 7,31-7,41 (m, 4H), 7,58-7,60(d, 2H, J = 7,2 Hz), 7,86-7,89(d, 2H, J = 7,2 Hz)
MS (m/e, M+): 238
Ejemplo 1: Preparacion del ester bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 1)
Figure imgf000013_0002
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de tetrahidrofurano y despues se anadieron 78 pl (0,56 mmol, 2 eq) de trietilamina y 60 pl (0,42 mmol, 1,5 eq) de cloroformiato de bencilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo, y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 137 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 61 %).
RMN de 1H (300MHz, CDCla) 5 1,71-1,79(m, 1H), 2,25-2,53(m, 3H), 3,64(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,43-4,47(m, 1H), 4,91(d, 1H, J = 12,3 Hz), 5,07(d, 1H, J = 12,3 Hz), 5,38(d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,53(s, 1H), 6,89(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,28-7,36(m, 6H), 7,52(s, 1H) MS (m/e, M+): 491
Ejemplo 2: Preparacion del ester 4-nitro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 2)
Figure imgf000013_0003
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de tetrahidrofurano y despues se anadieron 78 pl (0,56 mmol, 2 eq) de trietilamina y 90 pl (0,42 mmol, 1,5 eq) de cloroformiato de 4-nitro bencilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo, y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 100 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 67 %). RMN de 1H (300MHz, CDCla) 5 = 1,79-1,80(m, 1H), 2,29-2,56(m, 3H), 3,63(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,93(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,43-4,47(m, 1H), 5,01(d, 1H, J = 13,5 Hz), 5,15(d, 1H, J = 13,2 Hz), 5,56(d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,54(s, 1H), 6,82(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,29(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,43(d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,51(s, 1H), 8,18(d, 2H, J = 8,7 Hz)
MS (m/e, M+): 536
Ejemplo 3: Preparacion del ester 4-bromo-bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 3)
Figure imgf000014_0001
Se disolvieron 157 mg (0,84 mmoles) de alcohol 4-bromobencflico en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmoles) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 54 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 34 %).
RMN de 1H (300MHz, CDCla) 5 1,84-1,90(m, 1H), 2,33-2,54(m, 3H), 3,68(s, 3H), 3,88(s, 3H), 3,91(s, 3H), 3,95(s, 3H), 4,42-4,50(m, 1H), 4,78(d, 1H, J = 12,3 Hz), 4,98(d, 1H, J = 12 Hz), 6,24(d, 1H, J = 6,9 Hz), 6,55(s, 1H), 6,80(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,08(d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,29(d, 1H, J = 11,7 Hz), 7,39(d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,63(s, 1H)
MS (m/e, M+): 571
Ejemplo 4: Preparacion del ester 4-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 4)
Figure imgf000014_0002
Se disolvieron 105 mg (0,84 mmoles) de alcohol 4-fluorobencflico en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmoles) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1: 4) para dar 110 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 77 %).
RMN de 1H (300MHz, CDCl3) 6 1,72-1,74(m, 1H), 2,27-2,51(m, 3H), 3,64(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,42-4,46(m, 1H), 4,88(d, 1H, J = 12 Hz), 5,03(d, 1H, J = 12 Hz), 5,25(d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,53(s, 1H), 6,81 (d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,02(t, 2H), 7,28-7,29(m, 3H), 7,48(s, 1H)
MS (m/e, M+): 509
Ejemplo 5: Preparacion del ester 2-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-6,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 5)
Figure imgf000014_0003
Se disolvieron 106 mg (0,84 mmol) de alcohol 2-fluorobencflico en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 106 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 75 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,61-1,79(m, 1H), 2,26-2,56(m, 3H), 3,64(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,20-4,50(m, 1H), 4,97(d, 1H, J = 12,3 Hz), 5,17(d, 1H, J = 12,3 Hz), 5,35(d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,53(s, 1H), 6,81(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,00-7,14(m, 2H), 7,26-7,35(m, 3H), 7,51(s, 1H)
MS (m/e, M+): 509
Ejemplo 6: Preparacion del ester 3-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-6,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 6)
Figure imgf000015_0001
Se disolvieron 106 mg (0,84 mmol) de alcohol 3-fluorobencflico en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 115 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 81 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,74-1,84(m, 1H), 2,26-2,56(m, 3H), 3,62(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,18-4,50(m, 1H), 4,86(d, 1H, J = 12,6 Hz), 5,07(d, 1H, J = 12,3 Hz), 5,59(d, 1H, J = 7,5 Hz), 6,54(s, 1H), 6,81(d, 1H, J = 10,5 Hz), 7,95-7,05(m, 2H), 7,24-7,32(m, 3H), 7,54(s, 1H)
MS (m/e, M+): 509
Ejemplo 7: Preparacion del ester 4-metoxi bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il) carbamico (Compuesto 7)
Figure imgf000015_0002
Se disolvieron 116 mg (0,84 mmol) de alcohol 4-metoxibencflico en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1: 4) para dar 68 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 47 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,68-1,78(m, 1H), 2,22-2,55(m, 3H), 3,65(s, 3H), 3,77(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,40-4,49(m, 1H), 4,83(d, 1H, J = 11,7 Hz), 5,01(d, 1H, J = 11,7 Hz), 5,35(d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,53(s, 1H), 6,79-6,87(m, 3H), 7,21-7,29(m, 3H), 7,51(s, 1H)
MS (m/e, M+): 521
Ejemplo 8: Preparacion del ester 4-metilbencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 8)
Figure imgf000016_0001
Se disolvieron 102 mg (0,84 mmoles) de alcohol 4-metilbencflico en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmoles) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 93 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 66 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,70-1,78(m, 1H), 2,17-2,55(m, 6H), 3,64(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,40-4,49(m, 1H), 4,86(d, 1H, J = 12 Hz), 5,03(d, 1H, J = 12 Hz), 5,31(d, 1H, J = 7,5 Hz), 6,53(s, 1H), 6,81 (d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,07-7,29(m, 5H), 7,51 (s, 1H)
MS (m/e, M+): 505
Ejemplo 9: Preparacion del ester 4-isopropilbencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,8,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 9)
Figure imgf000016_0002
Se disolvieron 126 mg (0,84 mmol) de alcohol 4-isopropilbencflico en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y luego el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 121 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 81 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,23(d, 6H, J = 3,9 Hz), 1,69-1,78(m, 1H), 2,23-2,55(m, 3H), 2,84-2,93(m, 1H), 3,64(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,41-4,49(m, 1H), 4,86(d, 1H, J = 12 Hz), 5,04(d, 1H, J = 12 Hz), 5,37(d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,53(s, 1H), 6,81(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,12-7,30(m, 5H), 7,52(s, 1H)
MS (m/e, M+): 533
Ejemplo 10: Preparacion del ester ciclopentil metflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptaen-7-il)-carbamico (Compuesto 10)
Figure imgf000017_0001
Se disolvieron 84 mg (0,84 mmoles) de ciclopentano metanol en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmoles) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 105 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 78 %).
RMN de 1H (300MHz, CDCla) 51,17-1,25(m, 2H), 1,48-1,78(m, 6H), 2,09-2,17(m, 1H), 2,26-2,56(m, 3H), 3,62(s, 3H), 3,78-3,86(m, 2H), 3,90(s, 3H), 3,92(s, 3H), 3,93(s, 3H), 3,99-4,44(m, 1H), 5,17(d, 1H, J = 7,5 Hz), 6,53(s, 1H), 6,80(d, 1H, J = 11,1 Hz), 7,27(d, 1H, J = 10,5 Hz), 7,48(s, 1H)
MS (m/e, M+): 483
Ejemplo 11: Preparacion del ester ciclohexilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 11)
Figure imgf000017_0002
Se disolvieron 96 mg (0,84 mmol) de ciclohexil metanol en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 109 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 78 %).
RMN de 1H (300MHz, CDCla) 50,88-0,95(m, 2H), 1,10-1,27(m, 3H), 1,54-1,78(m, 6H), 2,24-2,56(m, 3H), 3,62(s, 3H), 3,69-3,82(m, 2H)3,90(s, 3H), 3,92(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,38-4,47(m, 1H), 5,19(d, 1H, J = 7,5 Hz), 6,53(s, 1H), 6,80(d, 1H, J = 11,1 Hz), 7,27(d, 1H, J = 10,5 Hz), 7,48(s, 1H)
MS (m/e, M+): 497
Ejemplo 12: Preparacion del ester indan-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 12)
Figure imgf000017_0003
Se disolvieron 124 mg (0,84 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <2-1 > en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (4,20 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,78 mmol, 2 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 121 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 81 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,73-1,83(m, 2H), 2,14-2,56(m, 4H), 2,82-2,90(m, 2H), 3,31-3,35(m, 1H), 3,58(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,93(s, 3H), 3,98-4,02(m, 4H), 4,17-4,22(m, 1H), 4,43-4,47(m, 1H), 5,62(d, 1H, J = 6 Hz), 6,54(s, 1H), 6,81 (d, 1H, J = 12 Hz), 7,12-7,29(m, 5H), 7,57(s, 1H)
MS (m/e, M+): 531
Ejemplo 13: Preparacion del ester 1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 13)
Figure imgf000018_0001
Se disolvieron 136 mg (0,84 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <2-2> en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (4,20 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,78 mmol, 2 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 140 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 92 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 5 1,65-1,79(m, 4H), 2,26-2,57(m, 4H), 2,72-2,74(m, 2H), 2,97-3,05(m, 1H), 3,63(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,93-3,95(4H; s, 3H - m, 1H), 3,99(s, 3H), 4,22-4,27(m, 1H), 4,41-4,47(m, 1H), 5,37-5,39(d, 1H, J = 7,4 Hz), 6,54(s, 1H), 6,79-6,84(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,01-7,16(m, 4H), 7,25-7,29(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,52(s, 1H) MS (m/e, M+): 545
Ejemplo 14: Preparacion del ester 9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 14)
Figure imgf000018_0002
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 10 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 58 pl (0,4 mmol) de trietilamina y 86 mg (0,32 mmol) de cloroformiato de 9-fluorenilmetilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo, y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetona; cloruro de metileno = 1:4) para dar 155 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 96 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 52,00-2,05(m, 1H), 2,39-2,57(m, 3H), 3,28(s, 3H), 3,78-4,03(m, 11H), 4,41-4,56(m, 2H), 6,54(s, 1H), 6,70-6,76(m, 2H), 7,17-7,39(m, 5H), 7,49-7,56(m, 2H), 7,69-7,71 (d, 2H, J = 6,7 Hz), 7,86(s, 1H) MS (m/e, M+): 579
Ejemplo 15: Preparacion del ester 1-metil-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 15)
Figure imgf000019_0001
Se disolvieron 176 mg (0,84 mmol) de (1-metil-9H-Fluoren-9-il)-metanol en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (4,20 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (metanol:cloruro de metileno = 1:19) para dar 41 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 33 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 51,77(m, 1H), 2,23(m, 3H), 2,45(s, 3H), 3,58(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,92(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,08(m, 2H), 4,44(m, 1H), 4,71(dd, 1H), 5,40(m, NH), 6,53(s, 1H), 6,78(m, 1H), 7,05(t, 1H), 7,07(m, 4H), 7,46(s, 1H), 7,62(m, 2H), 7,70(d, 1H)
MS (m/e, M+): 593
Ejemplo 16: Preparacion del ester 2-bromo-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-6,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico acido (Compuesto 16)
Figure imgf000019_0002
Se disolvieron 231 mg (0,84 mmol) de (2-bromo-9H-fluoren-9-il)-metanol en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 2,2 ml (4,20 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se elimino a presion reducida, y despues el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol, 3 eq) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (metanol:cloruro de metileno = 1:19) para dar 70 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 39 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) 6 2,05(m, 1H), 2,39(m, 3H), 3,66(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,91(s, 3H), 3,97(m, 4H), 4,21(m, 1H), 4,44(m, 2H), 5,84(m, NH), 6,55(s, 1H), 6,77(d, 1H), 7,25(m, 2H), 7,51(m, 7H)
MS (m/e, M+): 658
Ejemplo 17: Preparacion del ester 2,7-di-terc-butil-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 17)
Figure imgf000020_0001
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y 156 mg (0,42 mmol) de cloroformiato de 2,7 di-terc-butil-9-fluorenilmetilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 174 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 90 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 5 1,31(s, 9H), 1,34(s, 9H), 1,76-1,84(m, 1H), 2,22-2,56(m, 3H), 3,59(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,92(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,02-4,07(m, 1H), 4,30-4,34(m, 2H), 4,41-4,49(m, 1H), 5,43-5,45(d, 1H, J = 7,4 Hz), 6,53(s, 1H), 6,78-6,82(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,25-7,28(m, 1H), 7,37-7,39(d, 2H, J = 8 Hz), 7,50-7,66(m, 5H)
MS (m/e, M+): 691
Ejemplo 18: Preparacion del ester 2-(9H-fluoren-9-il)-etflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-6,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico (Compuesto 18)
Figure imgf000020_0002
Se disolvieron 176 mg (0,84 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <2-3> en 8 ml de tetrahidrofurano y a continuacion se anadieron 2,2 ml (1,40 mmol) de una solucion de fosgeno al 20 % a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, y luego el residuo y 100 mg (0,28 mmol) del compuesto preparado en el Ejemplo de preparacion <1-3> se disolvieron en 10 ml de tetrahidrofurano. A continuacion, se anadieron 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 154 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 93 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 5 1,64-1,74(m, 1H), 2,18-2,54(m, 5H), 3,59(s, 3H), 3,86-3,96(m, 11H), 4,01-4,06(t, 1H), 4,30-4,38(m, 1H), 5,05-5,08(d, 1H, J = 6,7 Hz), 6,53(s, 1H), 6,76-6,80(d, 1H, J = 10,9 Hz), 7,21-7,37(m, 5H), 7,44-7,49(m, 3H), 7,72-7,75(d, 2H, J = 7,3 Hz)
MS (m/e, M+): 593
Ejemplo 19: Preparacion de la 2-fenil-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-acetamida (Compuesto 19)
Figure imgf000020_0003
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y 65 mg (0,42 mmol) de cloruro de fenilacetilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 113 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 85 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCb) 5 1,61-1,71(m, 1H), 2,08-2,17(m, 1H), 2,33-2,51(m, 2H), 3,56(s, 2H), 3,65(s, 3H), 3,89(s, 3H), 3,93(s, 3H), 3,99(s, 3H), 4,59-4,66(m, 1H), 5,99-5,97(d, 1H, J = 6 Hz), 6,51(s, 1H), 6,78-6,81 (d, 1H, J = 9 Hz), 7,26-7,39(m, 7H)
MS (m/e, M+): 475
Ejemplo 20; Preparacion de la 2-(4-metoxi-fenil)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-acetamida (compuesto 20)
Figure imgf000021_0001
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 8 ml de tetrahidrofurano, y a continuacion se anadieron 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y 77 mg (0,42 mmol) de cloruro de 4-metoxi acetilo y se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de acetato de etilo y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico mediante cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 100 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 71 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 5 1,67-1,73(m, 1H), 2,08-2,17(m, 1H), 2,32-2,51(m, 2H), 3,57(s, 2H), 3,66(s, 3H), 3,80(s, 3H), 3,88(s, 3H), 3,93(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,56-4,63(m, 1H), 6,13-6,15(d, 1H, J = 6 Hz), 6,49(s, 1H), 6,78-6,82(d, 1H, J = 12 Hz), 6,87-6,90(d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,16-7,19(d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,26-7,30(d, 1H, J = 12 Hz) MS (m/e, M+): 505
Ejemplo 21: Preparacion de la 3-fenil-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida (Compuesto 21)
Figure imgf000021_0002
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de cloruro de metileno y a continuacion se anadieron 80 mg (0,42 mmol) de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), 18 mg (0,14 mmol) de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y 62 mg (0,40 mmol) de acido hidrocinamico a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de cloruro de metileno y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 81 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 59 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 51,73-1,81(m, 1H), 2,14-2,22(m, 1H), 2,32-2,54(m, 4H), 2,85-2,90(2, 1H), 3,66(s, 3H), 3,90(s, 3H), 3,95(s, 3H), 3,97(s, 3H), 4,60-4,69(m, 1H), 6,52(s, 1H), 6,63-6,65(d, 1H. J = 6,9 Hz), 6,80-6,84(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,11-7,33(m, 6H), 7,41(s, 1H)
MS (m/e, M+): 489
Ejemplo 22: Preparacion de la 3-(4-metoxi-fenil)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-propionamida (Compuesto 22)
Figure imgf000022_0001
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de cloruro de metileno y a continuacion se anadieron 80 mg (0,42 mmol) de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), 18 mg (0,14 mmol) de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina, y 62 mg (0,40 mmol) de acido 3-(4-metoxifenil)propionico a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de cloruro de metileno y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 131 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 90 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 51,72-1,82(m, 1H), 2,18-2,23(m, 1H), 2,33-2,51(m, 4H), 2,80-2,85(2, 1H), 3,67(s, 3H), 3,78(s, 3H), 3,91(s, 3H), 3,95(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,61-4,69(m, 1H), 6,53(s, 1H), 6,69-6,85(m, 4H), 7,03-7,06(d, 2H, J = 9 Hz), 7,27-7,34(m, 1H), 7,43(s, 1H)
MS (m/e, M+): 519
Los ejemplos 23 a 25 estan fuera del alcance de la presente invencion.
Ejemplo 23: Preparacion de la 2-(9H-fluoren-9-il)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobanzo[a]heptalen-7-il)-acetamida (Compuesto 23 )
Figure imgf000022_0002
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de cloruro de metileno y a continuacion se anadieron 80 mg (0,42 mmol) de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), 18 mg (0,14 mmol) de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y 94 mg (0,42 mmol) de acido 9-fluorenacetico a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de cloruro de metileno y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 40 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 59 %).
RMN de 1H (300 MHz, COCla): 5 = 1,61-1,67(m, 1H), 2,07-2,16(m, 1H), 2,33-2,54(m, 2H), 2,66-2,70(m, 2H), 3,71(s, 3H), 3,92(s, 3H), 3,97(s, 3H), 3,98(s, 3H), 4,40-4,45(t, 1H), 4,65-4,73(m, 1H), 5,84-5,87(d, 1H, J = 6,9 Hz), 6,54(s, 1H), 6,79-6,83(d, 1H, J = 10,6 Hz), 7,23-7,46(m, 8H), 7,74-7,76(m, 2H);
MS (m/e, M+): 563
Ejemplo 24: Preparacion de la 3-(9H-fluoren-9-il)-N-(1,2,3,10-tetramotoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il) -propionamida (Compuesto 24)
Figure imgf000022_0003
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> en 3 ml de cloruro de metileno y a continuacion se anadieron 80 mg (0,42 mmol) de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC), 18 mg (0,14 mmol) de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 116 pl (0,84 mmol) de trietilamina y 100 mg (0,42 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <2-6> a 0 °C y se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se elimino a presion reducida, el residuo se disolvio de nuevo en 50 ml de cloruro de metileno y despues la capa organica se lavo con agua destilada tres veces. La capa organica se seco con sulfato de sodio anhidro y se filtro, y el residuo obtenido concentrando el filtrado a presion reducida se purifico por cromatograffa en columna de sflice (acetona:cloruro de metileno = 1:4) para dar 110 mg de un compuesto solido en forma de espuma amarilla (rendimiento: 68 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 51,58-1,88(m, 3H), 2,00-2,12(m, 1H), 2,27-2,48(m, 4H), 3,65(s, 3H), 3,89(s, 3H), 3,94(s, 3H), 3,95(s, 3H), 4,04-4,06(t, 1H), 4,42-4,50(m, 1H), 6,00-6,02(d, 1H, J = 6,7 Hz), 6,50(s, 1H), 6,77-6,80(d, 1H, J = 10,8 Hz), 7,18-7,37(m, 6H), 7,42-7,48(m, 2H), 7,70-7,73(d, 2H, J = 7,3 Hz)
MS (m/e, M+): 577
Ejemplo 25: Preparacion de la 1-bencil-3-(1,2,3,10-tatrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-urea (Compuesto 25)
Figure imgf000023_0001
Se disolvieron 100 mg (0,28 mmol) del compuesto obtenido en el Ejemplo de preparacion <1-3> y a continuacion se anadieron 38 pl (0,31 mmol) de bencilisocianato en 2 ml de cloruro de metileno y despues se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de inactivar la reaccion, la solucion de reaccion se concentro y se purifico por cromatograffa en columna (metanol 5 %/diclorometano) para dar 125 mg de un solido blanco (rendimiento: 91 %).
RMN de 1H (300 MHz, CDCla) 61,87(m, 1H), 2,52(m, 3H), 3,67(s, 3H), 3,70(s, 3H), 3,92(s, 3H), 3,95(s, 3H), 4,23(dd, J = 6,0 Hz, 15,0 Hz, 1H), 4,41 (dd, J = 6,0 Hz, 15,0 Hz, 1H), 4,81(m, 1H), 6,11(m, 1H), 6,55(s, 1H), 6,75(d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,84(m, 1H), 7,11(m, 1H), 7,19(m, 3H), 7,35(d, J = 10,5 Hz, 1H), 7,96(s, 1H)
MS (m/e, M): 490
Ejemplos experimentales
Los siguientes experimentos se realizaron en el compuesto de formula 1 seleccionado del grupo de compuestos 1) a 22) para investigar diversas acciones farmacologicas. La dosis de los derivados de la colchicina depende y varfa segun la edad, el peso, el efecto terapeutico esperado, la via de administracion, el perfodo de tratamiento, de un animal o ser humano. Sin embargo, se pueden obtener efectos satisfactorios utilizando dosis de 10, 50, 100 a 500 pg/kg.
Ejemplo Experimental 1: prueba de citotoxicidad
La prueba de citotoxicidad se realizo para determinar la toxicidad de los materiales candidatos inmunosupresores mezclando los materiales candidatos inmunosupresores con celulas de bazo de ratas en medios de cultivo y midiendo el grado de toxicidad en las celulas. En detalle, se sembraron celulas de bazo de rata a una densidad celular de 5 x 105 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos, y se anadio ciclosporina A y los derivados de la colchicina de la presente invencion. Las concentraciones de los farmacos fueron 0,1, 1, 10, 100, 1000, 10000 y 100000 ng/ml. Las celulas se cultivaron en una incubadora de CO2 durante 72 horas, y luego cada pocillo se trato con 10 pl de CCK-SK (Dojindo, Japon). Posteriormente, las celulas fueron cultivadas de nuevo en la incubadora de CO2 durante 4 horas, y luego se midio la absorbancia (valor D.O.) a 450 nm utilizando un espectrofotometro.
Como resultado del experimento, se determino que los compuestos derivados de la colchicina de la presente invencion (compuestos 1, 7, 9, 14, 15, 17, 18 y 22) no tenfan citotoxicidad incluso a concentraciones de 100 ng a 10000 ng/ml.
Ejemplo experimental 2: Medicion de las funciones inmunosupresoras mediante la prueba de reaccion mixta de linfocitos (MLR)
Se realizo una prueba de reaccion de linfocitos mixtos (MLR) para examinar los efectos inmunomoduladores de los derivados de la colchicina de acuerdo con la presente invencion. Cuando ambas celulas respondedoras (celulas de bazo de rata Wistar) y celulas estimuladoras (celulas de bazo de rata de Lewis, irradiadas) se cultivan solas, a menudo no se produce el crecimiento de celulas. Sin embargo, cuando ambas celulas se cultivan conjuntamente, las celulas proliferan por interaccion celula-celula. Aquf, es posible determinar los efectos inmunomoduladores de los materiales candidatos inmunomoduladores mezclando los materiales candidatos inmunomoduladores con las celulas en proliferacion y midiendo el grado de inhibicion de la proliferacion.
En detalle, las celulas respondedoras (celulas de bazo de rata Wistar, 2,5 x 105 celulas por pocillo) y celulas estimuladoras (celulas de bazo de rata Lewis, 5 x 105 celulas por pocillo) se cultivaron conjuntamente y se trataron con los derivados de la colchicina de la presente invencion. Se uso ciclosporina A como grupo de control. Las concentraciones de los farmacos fueron 0,1, 1, 10, 100, 1000, 10000 y 100000 ng/ml. Las celulas se cultivaron en una incubadora de CO2 durante 72 horas. En el dfa 2 todos los pocillos fueron pulsados con 3H-timidina y se incubaron durante 24 h mas a 37 °C en CO2 5 %. Despues de la recoleccion celular, se midio la incorporacion de timidina usando un contador p.
Como resultado de la medicion, como se muestra en la FIG. 1, se determino que los compuestos derivados de la colchicina de la presente invencion (compuestos 1, 7, 9, 14, 15, 17, 18 y 22) inhibfan el crecimiento de la celulas a concentraciones de 100 a 1000 ng/ml, lo que indica que los compuestos de la presente invencion tenfan efectos inmunomoduladores superiores.
Ejemplo experimental 3: modulacion de la respuesta inmunitaria de acuerdo con el trasplante alogenico de corazon
Se extrajeron corazones de ratas Lewis (donantes) de 8 semanas de edad que pesaban aproximadamente 250 g y se realizo un trasplante de corazon heterotopico abdominal en la cavidad abdominal de ratas Wistar de 8 semanas de edad (receptor) con un peso aproximado de 300 g por pinzamiento cruzado de la vena cava caudal y la aorta abdominal del receptor tanto proximal como distalmente del sitio anastomotico. Despues del trasplante de corazon, se inyectaron por via intravenosa a los grupos experimentales ciclosporina A (5 mg/kg), colchicina (10 pg y 40 pg/kg) y un compuesto de derivado de la colchicina 14 (10 pg y 40 pg/kg), respectivamente, durante 14 dfas.
La frecuencia cardfaca de cada rata en un grupo de control no tratado y los grupos experimentales se midio mediante palpacion abdominal desde la fecha del trasplante de corazon, y la frecuencia cardfaca se clasifico como +++ (latidos cardfacos fuertes y rapidos), ++ (latidos cardfacos fuertes o rapidos), + (latidos cardfacos debiles y lentos pero distintos), (latidos cardfacos debiles pero constantes) y ± 0 (latidos cardfacos intermitentes). Los resultados de la medicion se muestran en la siguiente tabla 2.
Tr l n l ni r z n
Figure imgf000024_0001
Como resultado del experimento, se pudo ver que el latido del corazon se detuvo debido al rechazo de los corazones trasplantados en el grupo de control no tratado despues de 8 a 9 dfas.
Por el contrario, se observo que en el grupo experimental, al que se administro ciclosporina A (5 mg/kg), se detuvo el latido cardfaco de una rata despues de 166 dfas, y el latido cardfaco de dos ratas continuo durante 200 dfas y 182 dfas. Ademas, se observo que en el grupo experimental, al que se administro colchicina (10 pg/kg), se detuvo el latido cardfaco de dos ratas despues de 12 dfas, y el latido cardfaco de una rata continuo durante 186 dfas, y en el grupo experimental, al que se administro colchicina (40 pg/kg), se detuvo el latido cardfaco de dos ratas despues de 13 dfas y 14 dfas, y el latido cardfaco de una rata continuo durante 187 dfas.
Por otro lado, se observo que en el grupo experimental, al que se administro el compuesto de colchicina 14 (10 pg/kg), se detuvo el latido cardfaco de una rata despues de 9 dfas, y el latido cardfaco de dos ratas continuo durante 139 dfas y 173 dfas, y en el grupo experimental, al que se administro el compuesto derivado de la colchicina 14 (40 pg/kg), el latido del corazon de todas las ratas continuo durante 173 dfas y 174 dfas.
Las observaciones anteriores indican que los derivados de la colchicina de la presente invencion exhiben efectos inmunomoduladores similares incluso en una pequena cantidad en comparacion con la ciclosporina A, y exhiben efectos inmunosupresores superiores, en particular, en comparacion con las colchicinas.
Ejemplo experimental 4: modulacion de la respuesta inmunitaria de acuerdo con el trasplante alogenico de celulas de los islotes pancreaticos
La estreptozotocina es un medicamento que destruye las celulas de los islotes pancreaticos para inducir la diabetes y se utiliza para crear modelos experimentales de animales diabeticos. Los islotes alogenicos se trasplantaron en los hfgados de ratas diabeticas inducidas con estreptozotocina mediante inyeccion en la vena porta. El funcionamiento de los islotes trasplantados se evaluo mediante mediciones diarias de los niveles de glucosa en sangre. Los islotes se consideraron rechazados cuando el nivel de glucosa en la sangre era > 200 mg/dl en dos dfas consecutivos. Aquf, los inmunomoduladores como la ciclosporina A, que son medicamentos para suprimir la respuesta inmunitaria, se utilizan para evitar que las celulas de los islotes trasplantados se destruyan.
Se inyectaron por via intraperitoneal 35 mg/kg de estreptozotocina (50 mg/ml) disueltos en una solucion de tampon de citrato 0,1 M (pH 4,5) en ratas Fischer 344 macho de 8 semanas de edad (F344) que pesaban entre 200 y 220 g. A continuacion, el nivel de glucosa en sangre se midio despues de 1 semana, y el primer dfa cuando el nivel de glucosa en sangre aumento mas de 300 mg/dl y el aumento se repitio mas de dos veces se considero como la fecha de diagnostico de la diabetes. Las ratas se utilizaron en el trasplante 3 semanas despues de la administracion de estreptozotocina.
Los pancreas de ratas Lewis de 8 semanas de edad se extrajeron a las 3 semanas posteriores a la induccion de la diabetes en ratas Fischer y se aislaron las celulas de los islotes. Las celulas aisladas de los islotes fueron cultivadas en una incubadora de CO2 a 37 °C durante un dfa, y las celulas de los islotes cultivadas fueron trasplantadas en ratas Fischer diabeticas.
<4-1> Administracion unica intraperitoneal
La ciclosporina (5 mg/kg), la colchicina (10 pg/kg y 40 pg/kg) y los compuestos derivados de la colchicina (compuestos 1, 7, 9, 14, 15, 17, 18 y 22; 50 pg/kg) fueron administrados a las ratas Fischer, a las que se trasplantaron las celulas de los islotes, durante 14 dfas a partir de la fecha del trasplante, y se examino el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre hasta que se produjo el rechazo desde la fecha del trasplante. Los resultados experimentales se muestran en la siguiente tabla 3.
Trasplante alogenico de celulas de los islotes pancreaticos - Administracion intraperitoneal unica
Figure imgf000025_0001
Como resultado del experimento, se pudo ver que el rechazo de las celulas de los islotes trasplantados ocurrio en el grupo de control no tratado despues de 5 a 6 dfas. Por el contrario, el rechazo de las celulas de los islotes trasplantados se observo despues de un promedio de 9 dfas en el grupo experimental al que se administro la ciclosporina (5 pg/kg) solo. Ademas, el rechazo de las celulas de los islotes trasplantados se observo despues de 5 dfas en el grupo experimental al que se administro solo colchicina (10 pg/kg). Se pudo ver que en el grupo experimental al que se administraron colchicinas (40 pg/kg) solo, dos de las cuatro ratas murieron con una reduccion de peso del 15 % el segundo dfa, una rata murio repentinamente despues de 9 dfas, manteniendo el nivel de glucosa en sangre, y el rechazo de las celulas de los islotes trasplantadas ocurrio en la rata restante despues de 6 dfas.
Por otro lado, se pudo observar que el rechazo de las celulas de los islotes trasplantados se produjo despues de 5 dfas a 7 dfas en el grupo experimental al que se administro el compuesto derivado de la colchicina 7 (50 pg/kg) solo, despues de 5 dfas a 6 dfas en el grupo experimental al que se administro el compuesto derivado de la colchicina 9 (50 pg/kg) solo, despues de 5 dfas a 6 dfas en el grupo experimental al que se le administro el compuesto derivado de la colchicina 14 (10 pg/kg) solo, y despues de 6 dfas a 7 dfas en el grupo experimental al que se administro el compuesto derivado de la colchicina 14 (40 pg/kg) solo.
Como administracion unica, la ciclosporina A mantuvo los niveles de glucosa en sangre durante mas de 4 dfas, en comparacion con el grupo de control no tratado, y la colchicina y los derivados de la colchicina no mostraron diferencias significativas con el grupo de control. Esto indica que las celulas de los islotes tienen una fuerte respuesta inmunitaria y, por lo tanto, la ciclosporina A, la colchicina o su derivado no presentan efectos significativos. <4-2> Administracion intraperitoneal combinada
Dado que no hubo efectos en la administracion unica, la ciclosporina A (5 mg/kg) y los compuestos derivados de la colchicina se administraron juntos durante 14 dfas a partir de la fecha del trasplante de celulas de los islotes, y se examino el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre. Sin embargo, considerando la interaccion entre los dos medicamentos, los dos medicamentos se introdujeron en jeringas diferentes y se inyectaron en los lados derecho e izquierdo de la cavidad abdominal, respectivamente, y los resultados de la medicion se muestran en la siguiente tabla 4.
Trasplante alogenico de celulas de los islotes pancreaticos - Administracion intraperitoneal combinada
Figure imgf000026_0001
Como resultado del experimento, se determino que el numero de dfas durante los cuales se mantuvo la funcion de las celulas de los islotes era un promedio de 8 dfas en el grupo experimental al que se administro la colchicina (10 pg/kg) en combinacion con la ciclosporina A (5 mg/kg), que aumento en aproximadamente 3 dfas, en comparacion con la administracion unica. Por el contrario, se pudo observar que los grupos experimentales a los que se administraron los compuestos derivados de la colchicina en combinacion con la ciclosporina A (5 mg/kg) mantuvieron la funcion de las celulas de los islotes durante mas tiempo y, por lo tanto, mostraron efectos inmunomoduladores superiores, en comparacion con la administracion unica, y en comparacion con la administracion combinada de colchicina (10 pg/kg) y ciclosporina A (5 mg/kg).
En particular, durante la administracion combinada de la ciclosporina A y los derivados de la colchicina de la presente invencion, la funcion de las celulas de los islotes duro un promedio de 20 dfas o mas. Ademas, en el caso de los compuestos 7, 9 y 14, los efectos inmunomoduladores que duran mas de 100 dfas muestran que la administracion combinada es mas ventajosa que la administracion unica en el caso del trasplante de celulas de los islotes, ademas, el hecho de que los efectos sobre la regulacion de la glucosa en sangre fueran elevados, incluso con la administracion a corto plazo, demuestra que los derivados de la colchicina de la presente invencion exhiben efectos inmunomoduladores superiores en comparacion con las colchicinas.
<4-3> Administracion intraperitoneal combinada continua
Para verificar los efectos inmunomoduladores durante la administracion intraperitoneal combinada continua, despues de inyectar la ciclosporina A (5 mg/kg) y el compuesto 14 (40 a 500 pg/kg) durante 14 dfas (2 semanas) a partir de la fecha del trasplante de celulas de los islotes, se llevo a cabo la administracion continuada unica o combinada en las condiciones que se muestran en la siguiente tabla 5, y se examino el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre. Sin embargo, considerando la toxicidad de la ciclosporina, la cantidad de ciclosporina A se redujo de 5 mg/kg a 2 mg/kg despues de 30 dfas. Los resultados de la medicion se muestran en la siguiente tabla 5.
Tr l n l ni l l l i l n r i - A mini r i n inr ri n l m in nin
Figure imgf000027_0001
Como se muestra en la tabla 5 anterior, en el grupo experimental al que se administro la ciclosporina A o el compuesto 14 solo despues de la administracion combinada durante 2 semanas, la funcion de las celulas de los islotes se mantuvo entre 1,6 y 1,8 veces en comparacion con el grupo experimental al cual se administro ciclosporina A y el compuesto 14 solo durante 2 semanas. Ademas, los grupos experimentales a los que se administran continuamente los dos farmacos juntos incluso despues de la administracion combinada durante 2 semanas, la funcion de las celulas de los islotes mejoro aproximadamente 2,3 veces en comparacion con el grupo experimental al que se administran la ciclosporina A y el compuesto 14 durante 2 semanas solo, y entre 1,28 y 1,3 veces en comparacion con el grupo experimental al que se administro la ciclosporina A o el compuesto 14 solo despues de la administracion combinada durante 2 semanas.
Los resultados anteriores indican que la administracion combinada de la ciclosporina A y los derivados de la colchicina de la presente invencion despues del trasplante de celulas de los islotes es mas eficaz para mantener las funciones de las celulas de los islotes trasplantados y los derivados de la colchicina de la presente invencion no tienen efectos secundarios incluso con la administracion a largo plazo.
Ejemplo Experimental 5: Analisis de tejidos de organos trasplantados
La tincion de la insulina se realizo en tejidos hepaticos y pancreaticos para determinar si las celulas de los islotes trasplantados en tejidos hepaticos se infunden y segregan insulina o si las celulas de los islotes se regeneran en el pancreas y segregan insulina, y se realizo una tincion de hematoxilina y eosina (H-E) para determinar cambios en los tejidos. Al mismo tiempo, se realizo la tincion de CD4 y CD8 para determinar la infiltracion de linfocitos T.
Los tejidos utilizados en la tincion fueron los extrafdos del hfgado y el pancreas de las ratas, cuya funcion de las celulas de los islotes se mantuvo durante 100 dfas, entre los grupos experimentales a los que se administraron la ciclosporina A y los compuestos derivados de la colchicina (7, 9 y 14) en las condiciones que se muestran en la tabla 4 despues del trasplante de celulas de los islotes, y se mantuvo en formalina al 10 %.
Primero, para la tincion con insulina, los tejidos se incrustaron en parafina y se obtuvieron cortes de 2 a 3 pm de espesor. Cada corte se mantuvo a 60 °C durante 30 minutos, de manera que el tejido no se separo del portaobjetos durante la tincion, y luego la parafina se elimino con xileno. Posteriormente, cada portaobjetos se trato secuencialmente con alcoholes al 100 %, 95 % y 90 %, se trato con suero de caballo normal (Vectastain kit, Vector, EE. UU.) y se tino con anticuerpo antiinsulfnico (anticuerpo primario: Dako, EE. UU.) durante 1 hora. A continuacion, el portaobjetos resultante se tino con anticuerpo secundario (Vectastain kit, Vector, EE. UU.) durante 30 minutos, se tino con DAB durante 2 minutos, se tino de nuevo con hematoxilina durante 1 minuto, se lavo para detectar cualquier exceso de mancha y luego se seco. El portaobjetos seco se sumergio en xileno y se monto en Permount, y despues se examino la presencia de tincion con insulina en un microscopio optico.
La tincion de los linfocitos CD4 y CD8 se realizo de la misma manera que la tincion de insulina.
Por otro lado, para la tincion con hematoxilina y eosina, los tejidos se incrustaron en parafina y se obtuvieron cortes de 2 a 3 pm de espesor. Cada corte se mantuvo a 60 °C durante 30 minutos, de modo que el tejido no se separo del portaobjetos durante la tincion, y luego se elimino la parafina con xileno. Posteriormente, cada portaobjetos se trato secuencialmente con alcoholes al 100 %, 95 % y 90 %, y luego se realizo una tincion nuclear con hematoxilina Harris durante 5 minutos. Con respecto a los portaobjetos con tincion nuclear, el exceso de tincion se decoloro con una solucion de alcohol acido, se tino con mordiente usando una solucion de amonfaco, y luego se realizo la tincion citoplasmica con eosina. A continuacion, el portaobjetos resultante se trato secuencialmente con alcoholes al 90 %, 95 % y 100 %, se deshidrato, se sustituyo con xileno y se monto en Permount, y luego se examinaron los cambios en los tejidos hepaticos de las celulas de los islotes trasplantados en un microscopio optico.
Los resultados experimentales se muestran en la FIG. 2, Como se muestra en la FIG. 2, se determino a partir del analisis de tejidos de hfgado y pancreas de las ratas, cuya funcion de las celulas de los islotes se mantuvo durante 100 dfas, y a las que se administraron la ciclosporina A y los compuestos derivados de la colchicina juntos despues del trasplante de celulas de los islotes, que las celulas de los islotes perfundidas en tejidos hepaticos eran viables por la tincion positiva de insulina, mientras que las celulas de los islotes estaban destruidas en el pancreas por tincion negativa de insulina. De los resultados experimentales de la tincion con hematoxilina y eosina se pudo determinar que cuando la funcion de las celulas de los islotes pancreaticos se mantenfa durante 100 dfas, los tejidos del hfgado se mantuvieron muy limpios y hubo menos celulas inmunitarias que se infiltraron en los tejidos. Se pudo confirmar a partir de los resultados experimentales de la tincion de linfocitos CD4 y CD8 que habfa muy pocas celulas inmunitarias infiltradas en los tejidos.
Ejemplo de preparacion 1: Comprimidos (compresion directa)
Se tamizaron 5,0 mg de principio activo, se mezclaron con 14,1 mg de lactosa, 0,8 mg de CrossPovidone USNF y 0,1 mg de estearato de magnesio, y luego se comprimieron para formar comprimidos.
Ejemplo de preparacion 2: Comprimidos (granulacion en humedo)
Se tamizaron 5,0 de principio activo y se mezclaron con 16,0 mg de lactosa y 4,0 mg de almidon. Se disolvieron 0,3 mg de Polisorbato 80 en agua purificada, y se anadio una cantidad apropiada de esta solucion a la mezcla y se granulo. Los granulos se tamizaron y se mezclaron con 2,7 mg de dioxido de silicio coloidal y 2,0 mg de estearato de magnesio y luego se comprimieron para formar comprimidos.
Ejemplo de preparacion 3: Polvos y capsulas
Se tamizaron 5,0 mg de principio activo y se mezclaron con 14,8 mg de lactosa, 10,0 mg de polivinilpirrolidona y 0,2 mg de estearato de magnesio. La mezcla se introdujo en una capsula de gelatina dura N.° 5 utilizando un aparato apropiado.
Ejemplo de preparacion 4: inyecciones
Se mezclaron 100 mg de principio activo, 180 mg de manitol, 26 mg de Na2HPO4- 12 H2O y 2974 mg de agua destilada para formar inyecciones.
Ċ

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un derivado de la colchicina representado por la siguiente formula 1 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo:
    Figure imgf000030_0001
    en la que
    - R1 es fenilo,
    Figure imgf000030_0002
    o cicloalquilo C3-C6, no sustituido o sustituido con X, donde X es halogeno, OCH3 , NO2, NH2 o alquilo C1-C3 de cadena lineal o ramificada, y Z y Z' son cada uno independientemente H, halogeno, OCH3, NO2 , NH2 o alquilo C1-C4 de cadena lineal o ramificada;
    - n es un numero entero de 0 a 3; y
    - A es CH2 , NH, u O
    seleccionado del grupo que consiste en:
    1) ester bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    2) ester 4-nitro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    3) ester 4-bromo bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    4) ester 4-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    5) ester 2-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    6) ester 3-fluoro bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    7) ester 4-metil bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    8) ester 4-isopropil bencflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    9) ester ciclopentilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    10) ester ciclohexilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    11) ester indan-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    12) ester 1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    13) ester 9H-fluoren-9-ilmetflico del acido 1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    14) ester 1-metil-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    15) ester 2-bromo-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    16) ester 2,7-di-terc-butil-9H-fluoren-9-ilmetflico del acido (1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidrobenzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    17) ester 2-(9H-fluoren-9-il)-etflico del acido (1,2,3,10-tatrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-carbamico;
    18) 3-fenil-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida;
    19) 3-(4-metoxi-fenil)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida 20) 2-(9H-fluoren-9-il)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-acetamida;
    21) 3-(9H-fluoren-9-il)-N-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-propionamida; y 22) 1-bencil-3-(1,2,3,10-tetrametoxi-9-oxo-5,6,7,9-tetrahidro-benzo[a]heptalen-7-il)-urea.
    2. Un metodo para preparar un derivado de la colchicina de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende la etapa de hacer reaccionar un derivado de la desacetil colchicina representado por la siguiente formula 2 con una cantidad equivalente o un exceso de
    Figure imgf000031_0001
    en presencia de una base o un agente de condensacion en un disolvente de reaccion para formar amida.
    Figure imgf000031_0002
    3. La composicion farmaceutica que comprende
    a) el derivado de la colchicina o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1; y
    b) un inmunosupresor.
    4. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 3, en la que el inmunosupresor se selecciona del grupo que consiste en ciclosporina A, tacrolimus, prednisolona, deflazacort, acido micofenolico, azatioprina, mizoribina, sirolimus, everolimus, anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD3 (OKT3), anticuerpo anti-CD20, y combinaciones de los mismos.
    5. Composicion farmaceutica que comprende el derivado de la colchicina o la sal farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1 para su uso en inmunomodulacion.
    6. Composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, para su uso en la modulacion de una respuesta inmunitaria aguda o cronica en el trasplante de organos.
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