ITRM20070088A1 - Composti derivati della colchicina, procedimento per la loro preparazione e usi in campo medico. - Google Patents

Composti derivati della colchicina, procedimento per la loro preparazione e usi in campo medico. Download PDF

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Oriana Piermatti
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Ferdinando Pizzo
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Description

DESCRIZIONE
A corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: "Composti derivati della colchicina, procedimento per la loro preparazione e usi in campo medico"
La presente invenzione concerne composti derivati della colchicina, procedimento per la loro preparazione e usi in campo medico. In particolare, la presente invenzione concerne composti derivati della colchicina da impiegare vantaggiosamente nella terapia antifidrotica delle malattie epatiche croniche.
Le malattie croniche del fegato ad evoluzione sclerogena comprendono una serie di affezioni ad etiologia infettiva, tossico/metabolica, genetica ed autoimmune. In Italia, nei Paesi del bacino Mediterraneo ed in genere in Europa queste malattie incidono pesantemente in termini di morbilità e mortalità. In particolare, per quanto concerne le forme infettive, si calcola che circa il 10% della popolazione italiana possa essere portatore di malattia ed un picco di incidenza di forme terminali di epatopatia cronica è previsto al momento tra il 2010 ed il 2020. Va sottolineato inoltre che, nonostante l'incidenza delle epatopatie croniche sclerogene sia inferiore a quella di altre patologie sclerogene quali ad esempio le malattie cardiovascolari, la loro incidenza nelle varie classi di età è più ampiamente distribuita con molti pazienti affetti da fasi invalidanti della malattia in classi di età relativamente più giovani e in cui è massima la pressione produttiva. Dato che il trapianto di fegato è attualmente l'unico reale presidio terapeutico efficace si comprende come tutto questo si traduca in un notevole danno sociale ed economico. Nonostante i notevoli sforzi operati in questo senso negli ultimi anni, al momento non esiste un reale trattamento che possa definirsi sicuramente proponibile in senso antifibrogenico. L'introduzione di tale tipo di trattamento associato a terapie specificamente dirette a correggere la causa principale del danno cronico costituirebbe un sicuro vantaggio strategico nell'ambito di una terapia combinata dei vari aspetti delle epatopatie croniche.
Di seguito vengono descritte in breve le basi cellulari della fibrosi epatica.
Durante il processo di attiva fibrogenesi epatica le cellule stellate perisinusoidali costituiscono uno dei principali tipi cellulari responsabili della produzione di matrice extracellulare, con una predominante sintesi di collagene I e III. Le cellule stellate (HSC; note come hepatic stellate cells, fatstoring cells, o lipociti) sono localizzate a livello dello spazio di Disse in intimo contatto sia con gli epatociti che con le cellule endoteliali dei sinusoidi. In condizioni di danno epatico cronico le HSC vanno incontro ad un processo di attivazione e modulazione fenotipica trasformandosi nel fenotipo denominato myofibroblast-like. Questa transizione, osservabile sia nel tessuto epatico sede di danno cronico che in vitro dopo prolungata coltura su plastica, è caratterizzata da una notevole proliferazione cellulare, da migrazione cellulare, da un aumento della sintesi e della secrezione di matrice extracellulare (MEC) fibrillare (in particolare collagene tipo I e III), e da un consistente aumento delle loro capacità contrattili. Le HSC attivate sono in grado, almeno nelle prime fasi di attivazione, di operare una degradazione ed un rimodellamento della MEC prodotta. Tuttavia questa caratteristica viene gradualmente persa con il perpetuarsi del processo di attivazione, mentre vengono progressivamente ad accentuarsi le caratteristiche proliferative, sintetiche e contrattili. E' possibile quindi affermare che la fibrosi epatica è in pratica il risultato di uno sbilanciamento tra il processo di fibrogenesi e quello di degradazione della matrice.
Le HSC costituiscono la principale sede di deposito di retinoidi nell'organismo adulto. Ciò in ragione delle loro capacità di uptake selettivo del retinolo contenuto nella dieta e metabolizzazione del retinolo in esteri del retinolo, che costituiscono la principale forma di stivaggio nelle caratteristiche gocce lipidiche presenti nel citoplasma delle HSC. Nel corso del processo di attivazione delle HSC si osserva una progressiva perdita dei depositi intracellulari di retinoidi. E' stato ipotizzato che la perdita del fisiologico contenuto intracellulare di retinoidi abbia un impatto su alcuni aspetti dell'attivazione delle HSC ed in particolare sulle caratteristiche proliferative del fenotipo attivato. In supporto di questa possibilità è il rilievo di una riduzione della proliferazione cellulare, sia in condizioni basali che dopo stimolazione con mitogeni, dopo incubazione con retinolo o con acido retinoico e successivo, almeno parziale, ripristino dei depositi intracellulari di retinoidi.
Nell'ultima decade, si sono realizzati significativi avanzamenti nella identificazione e nello sviluppo di nuovi agenti antifibrotici, principalmente grazie ad una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che conducono ad una progressiva cirrotizzazione del fegato. Al momento, solo pochi agenti hanno raggiunto la possibilità di una sperimentazione clinica, e un efficace trattamento della cirrosi epatica non è ancora realizzabile. In generale, il principale problema posto dai farmaci in grado di influenzare la risposta fibrogenica e infiammatoria del fegato è la mancanza di specificità della loro azione, tanto a livello di organo che a livello di tipo cellulare, cui conseguono effetti collaterali di vario genere. Tali reazioni avverse impongono limitazioni di dosaggio che compromettono seriamente l'efficacia della terapia. D'altra parte, i farmaci agenti come inibitori o modulatori delle principali vie di trasduzione intracellulare del segnale in conseguenza dell'occupazione di recettori di membrana da parte di fattori di crescita e citochine agenti in senso profibrogenico non sono dotati di alcuna specificità cellulare e possono quindi determinare effetti altamente controproducenti nell'ambito del processo rigenerativo epatico.
La colchicina, principale alcaloide di Colchicum autumnale e Gloriosa superba, è il più noto e il più estesamente studiato tra i farmaci in grado di interferire con i microtubuli, componenti fondamentali del citoscheletro. L'intimo meccanismo di azione della colchicina risiede nel legame virtualmente irreversibile che essa forma con le molecole di tubulina libere nel citosol, che stabilendosi in una regione critica per la polimerizzazione con altre subunità di tubulina, ne impedisce l'assemblaggio a formare i microtubuli. Il risultato è il dissolvimento dei microtubuli cellulari, poiché tali strutture si mantengono grazie al perenne equilibrio tra l'associazione di nuove subunità di tubulina e la dissociazione di quelle integrate. Ne deriva 1' inibizione di funzioni cellulari microtubulo-dipendenti, incluse la mitosi e la secrezione extracellulare di diverse macromolecole. Nel complesso, ciò spiega la molteplicità e il ventaglio degli effetti farmacologici che la colchicina può esercitare nell'organismo in conseguenza della sua azione anti-microtubulare. Un vasto corpo di evidenze sperimentali, accumulatesi nel corso degli ultimi trenta anni, ha messo in evidenza che la colchicina può esercitare una varietà di attività farmacologiche potenzialmente sfruttabili a scopo terapeutico nei pazienti con danno epatico. Esse possono essere artificialmente distinte in due classi: proprietà di tipo antifibrotico e antiinfiammatorio, da una parte, e proprietà di citoprotezione dall'altra. Il razionale per l'impiego della colchicina nella fibrosi epatica è basato sulle seguenti evidenze sperimentali: (a) la colchicina è in grado di inibire la secrezione extracellulare di collagene da parte di osteoblasti, condrociti, e fibroblasti di fegato in coltura, con conseguente accumulo intracellulare di collagene e "feed-back inhibition" della sua sintesi; (b) la colchicina stimola l'espressione e la secrezione extracellulare di varie proteinasi, incluse collagenasi, elastasi, e gelatinasi, in differenti tipi di cellule mesenchimali in coltura; (c) in colture di cellule stellate del fegato, la colchicina sopprime la proliferazione e la motilità cellulare indotta da platelet-derived growth factor (PDGF).
A fronte di questi presupposti, le sperimentazioni cliniche nell'uomo volte a valutare l'efficacia della colchicina in vari tipi di fibrosi epatica (alcolica e non alcolica) hanno fornito complessivamente risultati deludenti. Ciò contrasta con l'efficacia antifibrotica che la colchicina - ad alte dosi - ha esibito in diversi modelli sperimentali di cirrosi epatica. Infatti quando somministrata nell'animale di laboratorio a dosaggi elevati, la sostanza si è dimostrata in grado non solo di prevenire, ma anche di far regredire, la cirrosi sperimentale. Questa discrepanza è facilmente spiegabile con il fatto che le alte dosi impiegate nell'animale da esperimento e dotate di effettiva azione antifibrotica e anticirrotica non sono praticabili in campo umano per l'insorgere di significativi e anche gravi effetti collaterali dovuti all'azione del farmaco in distretti extraepatici. A questo riguardo alcune considerazioni di ordine farmacocinetico suggeriscono indirettamente l'ordine di grandezza dei potenziali vantaggi derivanti da un targeting della colchicina selettivo per il fegato. Studi di distribuzione hanno mostrato che alte percentuali di farmaco si concentrano normalmente nel rene, nella milza, nell'intestino, e nei leucociti circolanti, oltre che nel fegato. Inoltre, assumendo una distribuzione uniforme del farmaco nei differenti tipi cellulari del fegato, è ovvio che una quota preponderante di colchicina si disperde negli epatociti che rendono conto di circa l'80% del volume parenchimale, mentre solo una minima frazione finisce per essere internalizzata dalle cellule stellate, che contribuiscono solo per l'1.4% del volume parenchimale normale. E' difficile pensare che al dosaggio di colchicina di 1 mg al giorno, una frazione di questo tipo possa influenzare in misura significativa il processo di "attivazione" delle cellule stellate che è alla base della fibrosi del fegato.
E' noto il derivato della colchicina retinoildeacetilcolchicina (composto 2a nella tabella).<2>Il composto è stato sintetizzato da Brossi et. Al. senza alcun rapporto con l'impiego antifibrotico o per malattie croniche del fegato ma solo nell'ambito di studi riguardanti i rapporti tra struttura della colchicina e suo legame con la tubulina. Lo scopo era quello di indagare in vitro l'influenza di un sostituente di grosse dimensioni molecolari (vitamina A) nella posizione C7 dell'anello B della colchicina nei riguardi della cinetica di legame con la tubulina. Rispetto alla colchicina, la retinoildeacetilcolchicina ha mostrato nello studio ridotta affinità di legame con la tubulina, ciò che fa presumere una sua ridotta o assente attività biologica.<2>
Alla luce di quanto sopra esposto risulta pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi composti in grado di risolvere gli svantaggi delle terapie finora note.
Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato nuovi composti con aumentata efficacia terapeutica e ridotta tossicità rivolti al trattamento antifibrotico delle malattie epatiche croniche fibrogeniche. Inoltre, l'invenzione è in grado di fornire composti che veicolano farmaci antifibrotici selettivamente al fegato, e specificatamente nelle cellule stellate, soluzione ideale per assicurare una terapia antifibrotica efficace e sicura ai pazienti con malattie epatiche croniche. Questo tipo di targeting conferisce a dosi standard di un farmaco antifibrotico, convenzionale o sperimentale: a) il drammatico aumento dell'efficacia terapeutica, attraverso la concentrazione nell'organo e nelle cellule-bersaglio; b) l'attenuazione fino al virtuale annullamento degli effetti avversi, per la drastica riduzione della distribuzione in altri distretti. L'invenzione si basa sulla peculiare via metabolica del retinolo, che dopo essere assorbito a livello intestinale viene veicolato dai chilomicroni nel fegato dove si ritrova stivato in forma di estere all'interno delle cellule stellate. Di conseguenza la coniugazione della colchicina e composti da essa derivati con il retinolo (o altri retinoidi) può permettere la loro veicolazione preferenzialmente a livello epatico (targeting di I ordine) e, all'interno dell'organo, specificatamente a livello delle cellule stellate epatiche (targeting di II ordine), il principale effettore cellulare della fibrogenesi epatica.
Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione composti derivati della colchicina aventi formula generale (I):
di configurazione ( aR, 7S) ,(aS, 7R);( aR, 7S) o (aS, 7R) il gruppo R è scelto tra OCH3, SCH3o SCH2Ph, X è scelto tra NH o 0, R1è scelto tra
e R1è H quando X è NH e R è SCH2Ph, oppure quando X è O e R è SCH3o SCH2Ph;
a condizione che quando R1 è
e X è NH allora R è diverso da OCH3.
Preferibilmente la colchicina è (aR,7S)-cochicina, ancora più preferibilmente (-)-(aR,7S)-colchicina .
I composti secondo l'invenzione sono preferibilmente scelti tra i composti aventi le seguenti formule:
I composti sopra descritti possono essere vantaggiosamente impiegati in campo medico.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente uno o più composti come definiti sopra come principio attivo assieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
Inoltre, l'invenzione concerne l'uso dei composti e della composizione come definiti sopra per la preparazione di un medicamento da impiegare nella terapia antifibrotica delle malattie epatiche croniche.
Costituiscono ulteriore oggetto della presente invenzione composti derivati del retinolo aventi la seguente formula generale (II):
in cui R2è scelto tra
di configurazione ( aR, 7S) , ( aS, 7R) ; ( aR, 7S) o ( aS, 7R) , dove il gruppo R è scelto tra OCH3, SCH3o SCH2Ph, a condizione che quando R2è
di configurazione (aR, 7S) , allora R è diverso da OCH3.
I composti secondo la formula (II) possono essere vantaggiosamente impiegati come farmaci antifibrotici in cui il retinolo funge da carrier.
Inoltre, l'invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente uno o più composti di formula (II) come principio attivo assieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti farmaceuticamente accettabili. Detti composti e composizione possono essere vantaggiosamente impiegati per per la prevenzione e la cura delle malattie epatiche come la fibrosi epatica e nella terapia antifibrotica delle malattie epatiche croniche.
La presente invenzione riguarda inoltre l'uso del retinolo come veicolo di farmaci antifibrotici.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione.
Esempio 1: Preparazione di derivati della colchicina secondo la presente invenzione (Tabella 1 ) .
Tabella 1
Preparazione di (—) —N— Retinoil— Deacetil— Tiometilcolchicina (2b) e (—) —N— Retinoil— Deacetil— Benziltiocolchicina (2c)
Le (-)-deacetilcolchicine la e lb sono preparate in accordo alla letteratura.<1>La (-)-deacetilbenziltiocolchicina le è un nuovo prodotto ed è stato da noi preparato per idrolisi della benziltiocolchicina<16>con HC1 in MeOH a riflusso.
I retinoli derivati 2b e 2c sono nuovi prodotti e sono stati preparati mediante reazione delle deacetilcolchicine 1b-c con acido retinoico in CH2CI2in presenza di dicicloesilcarbodimmide (DCC) e 4-pirrolidinpiridina (PPY) mediante una procedura già descritta per la (-)-N-retinoil-deacetilcolchicina 2a.<2>
Procedura : Una miscela costituita da deacetilcolchicina 1b o 1c (1.4 mmol), acido retinoico (0.5 g, 1.65 mmol) , DCC (0.5 g, 2.4 mmol) , PPY (0.05 g, 0.34 mmol) in CH2CI2(15 mi) viene agitata a temperature ambiente per 20 h. La miscela di reazione viene filtrata per eliminare la dicicloesilurea (DCU) . La soluzione viene lavata con acqua, seccata su sodio solfato e concentrata a pressione ridotta. Il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna su gel di silice utilizzando una miscela di etere dietilico/etere di petrolio 90:10 come eluente. I retinoil derivati 2b,c sono ottenuti con rese del 80-85%.
(—) —N— Retinoil— Deacetil—Tiometilcolchicina (2b)
p . f . : 208-211 °C
[α]<25>D-88.7° (c. 0.32; CHCl3)
<1>H-NMR (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.00 (s, 6H, 2CH3-1'), 1.40-1.65 (m, 4H, CH2-2', CH2-3'), 1.69 (s, 3H, CH3-5 ' ) , 1.92 (s, 3H, CH3-9') , 2.00 (m, 2H, CH2-4'), 2.22 (s, 3H, CH3-13' ) , 2.42 (s, 3H, SCH3-10), 2.2-2.6 (m, 4H, CH2-5, CH2-6) , 3.71 (s, 3H, OCH3-1), 3.8 (s, 3H, OCH3-2), 3.94 (s, 3H, OCH3-3), 4.73 (m, 1H, H-7), 5.84 (s, 1H, H-14 ' ) , 6.05-6.25 (m, 4H, H-7',H-8',H-10' , H-12' ) , 6.52 (s, 1H, H-4), 6.80 (dd, 1H, H-11', J=14. 8 , 11.7 Hz) , 7.06 (d, 1H, H-11, J=10.4 Hz), 7.30 (d, 1H, H-12, J=1 0 . 4 Hz), 7.44 (s, 1H, H-8)
1<3>C-NMR (CDCl3, 400 MHz) ppm : 12.7, 13.4, 15.1, 19.2, 21.7, 28.9 (2C) , 30.0, 33.0, 33.9, 36.6, 39.5, 51.8, 56.0, 61.3, 61.8, 107.2, 120.9, 125.7, 126.5, 127.8, 128.7, 129.6, 129.7, 129.8, 134.5, 134.7, 135.9, 137.4, 137.6, 138.36, 138.39, 141.5, 149.4, 151.1, 151.6, 153.5, 156.8, 158.1, 166.5, 182.3
(—) —N— Retinoil— Deacetil-Benziltiocolchicina (2c) p.f.: decompone a 144-146 °C
[a]<25>D-29.0° (c. 0.49; CHC13)
<1>H-NMR (CDCI3, 400 MHz) δ: 1.03 (s, 6H, 2CH3-1'), 1.44-1.66 (m, 4H, CH2-2 ' , CH2-3 ' ) , 1.72 (s, 3H, CH3-5'), 1.96 (s, 3H, CH3-9') , 2.02 (m, 2H, CH2-4'), 2.25 (s, 3H, CH3-13' ) , 2.2-2. 6 (m, 4H, CH2-5, CH2-6) , 3.70 (s, 3H, OCH3-1), 3.90 (s, 3H, OCH3-2), 3.95 (s, 3H, OCH3-3), 4.14 (s, 2H, CH2Ph) , 4.72 (m, 1H, H-7), 5.77 (s, 1H, H-14 ' ) , 6.05-6.35 (m, 4H, H-7', H-8', H-10', H-12 ' ) , 6.53 (s, 1H, H-4), 6.90 (dd, 1H, H-11', J=14 . 4 , 11.3 Hz) , 7. 1-7. 5 (m, 8H, H-8, H-11, H-12, Ph)
<13>C-NMR (CDCl3, 400 MHz) ppm: 12.8, 13.4, 19.2, 21.7, 28.9 (2C) , 30.0, 33.0, 34.2, 36.6, 36.8, 39.5, 51.8, 56.0, 61.4, 61.8, 107.2, 120.7, 125.6, 127.2, 127.6, 128.0 (2C) , 128.7 (2C) , 129.0, 129.1, 129.7, 129.8, 129.9, 134.4, 134.7, 134.8, 135.7, 137.4, 137.7, 138.6, 138.8, 141.5, 149.6, 151.2, 151.4, 153.5, 156.7, 166.4, 182.4
Preparazione di (—) —N— (Cumarina— 3— carbonile) — Deacetil-Colchicina (3a) , (-) -N- (Cumarina-3-carbonile) —Deacetil—Tiometilcolchicina (3b) e (—) —N— ( Cumarina— 3— carbonile) —Deacetil —Benziltiocolchicina (3c)
Le ammidi 3a-c sono state preparate mediante reazione delle deacetilcolchicine 1a-c con acido 3-carbossi cumarinico in CH2Cl2in presenza di dicicloesilcarbodimmide (DCC) e 4-pirrolidinpiridina (PPY).
Procedura : Una miscela costituita da deacetilcolchicina la, lb o le (1.4 mmol), acido 3-carbossicumarinico (0.31 g, 1.65 mmol), DCC (0.5 g, 2.4 mmol), PPY (0.05 g, 0.34 mmol) in CH2Cl2(15 ml) viene agitata a temperature ambiente per 20 h. La miscela di reazione viene filtrata per eliminare la dicicloesilurea (DCU). La soluzione viene lavata con acqua, seccata su sodio solfato e concentrata a pressione ridotta. Il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna su gel di silice utilizzando una miscela di etere dietilico/etere di petrolio 90:10 come eluente. I derivati 3a-c sono ottenuti con rese del 80-85%.
(-) -N- (Cumarina-3-carbonile) -Deacetil-Colchicina (3a) pf 151-156 °C
[α]<25>D -74.52° (c. 0.5; CHC13)
<1>HNMR (CDC13, 200 MHz) δ: 2.40-2.67 (m, 4H, CH2-5, CH2-6), 3.76 (s, 3H, OMe-10), 3.97 (s, 3H, OMe-1), 4.01 (s, 3H, OMe-2) , 4.03 (s, 3H, OMe-3) , 4.81 (m, 1H, H-7), 6.63 (s, 1H, H-4), 6.86 (d, 1H, J=10.8Hz, H-11), 7.32 (s, 1H, H-6' ) , 7.33-7.74 (m, 5H, H-8, H-12, H-4', H-5 ' , H-7'), 8.80 (s, 1H, H-3' ) ;
<13>C-NMR (CDCI3, 400 MHz) ppm : 29.4, 36.3, 52.6, 55.7, 56.0, 61.1, 107.0, 111.7, 116.3, 117.4, 118.0, 125.1, 125.4, 129.5, 130.7, 133.9, 134.1, 134.7, 135.5, 141.2, 148.3, 149.8, 150.8, 153.1, 154.1, 160.7, 161.0, 163.7, 179.0.
Preparazione di Colchicolo (4a) , Thiometil—Colchicolo (4b) and Benziltio— Colchicolo (4c) in forma otticamente pura.
I colchicoli 4a-b sono ottenuti dalle corrispondenti deacetilcolchicine 1a-b rispettivamente, in accordo alla letteratura.<1c>'<3>Il colchicolo racemo 4c è un nuovo prodotto ed è stato da noi preparato per reazione della deacetilcolchicina 1c con 4-formil-1-metilpiridinium benzensolfonato (FMB) , a temperatura ambiente per 1.5 h. L' immina ottenuta viene trattata in situ con 1, 8-diazabiciclo[5. 4 . 0]undec-7-ene (DBU) e poi con acido ossalico per dare il corrispondente colchicone che viene ridotto con NaBH4in metanolo per dare l'alcol racemo (±)-4c.
La separazione del (+) e (-)-colchicolo 4a-c è stata ottenuta per la prima volta mediante ricristallizzazione dei mentii derivati 5a-c, ottenuti mediante trattamento della miscela racemica con (-)-mentil-cloroformiato. L'uso di etil acetato come solvente di ricristallizzazione fornisce il (+)-(aS,7R)-mentil-derivato (+)-5a-c, con circa il 40% di resa. L'uso di MeOH/CHCl3come solvente di ricristallizzazione fornisce il (-)-(aR,7S)-mentilderivato (-)-5a-c con circa il 40% di resa.
L'idrolisi dei mentil-derivati in una soluzione di KOH 0.5 M in metanolo fornisce il (+) e (-)-colchicolo 4a-c in forma otticamente pura con rese del 95%. Di seguito viene riportata la procedura per la separazione del (±)-tiocolchicolo 4b.
Procedura : a) Ad una soluzione di (±)-tiocolchicolo 4b (6 g, 16.0 mmol) in piridina anidra (30 ml), viene addizionato il (-)-mentil-cloroformiato (6.8 ml, 32 mmol) e la miscela viene agitata a temperatura ambiente per 1.5 h. Dopo la rielaborazione il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna su gel di silice utilizzando una miscela costituita da etere dietilico/ cloroformio/etere di petrolio in rapporto 20:50:30. Il mentil-derivato 5b viene ottenuto con una resa del 94%.
b) Separazione dei diastereoisomeri : I diatereoisomeri (±)-5b sono stati separati mediante ricristallizzazione. L'uso di etil acetato come solvente di ricristallizzazione fornisce il diastereoisomero (+)-5b ([α]<25>D+185.5° (c. 0.3 CHCI3)), con il 44% di resa. L'uso di MeOH/CHCl3come solvente di ricristallizzazione fornisce (-)-5b ([α]<25>D-269.5° (c. 0.3 CHCl3)) con una resa del 40%.
Mentil derivato (+)-5b
[α]<25>D+185.5° (c. 0.33 CHCl3)
<1>H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 0.69 (d, 3H, CH3-5', J= 6.9 Hz), 0.85 (d, 3H, CH3-CH-CH3, J=6.8 Hz), 0.86 (d, 3H, CH3-CH-C , J= 6.2 Hz), 0.75-1.12 (m, 3H), 1.37 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.80-2.10 (m, 3H), 2.42 (s, 3H, SCH3), 2.35-2.60 (m, 3H), 3.62 (s, 3H, OCH3-1), 3.89 (s, 3H, OCH3-2), 3.91 (s, 3H, OCH3-3), 4.38 (m, 1H, H-1'), 5.16 (m, 1H, H-7), 6.55 (s, 1H, H-4), 7.02 (d, 1H, H-11, J=10.3 Hz), 7.23 (d, 1H, H-12, J= 10.3 Hz), 7.30 (s, 1H, H-8)
<13>C-NMR (CDCl3400 MHz) ppm : 15.1, 16.1, 20.6, 21.8, 23.1, 25.8, 29.2, 31.3, 33.9, 35.8, 40.4, 46.8, 55.9, 61.2, 61.3, 75.9, 78.9, 107.3, 124.9, 125.8, 127.6, 134.2, 134.5, 136.0, 141.5, 147.9, 151.0, 153.5, 153.6, 158.6, 182.2
Mentil derivato (-) -5b
[α]<25>D-269.5° (c. 0.31 CHCl3)
<1>H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 0.69 (d, 3H, CH3-5' , J= 6.9 Hz), 0.84 (d, 3H, C -CH-CH3, J=6.5 Hz), 0.89 (d, 3H, CH3-CH-C , J= 7.0 Hz), 0.75-1.05 (m, 3H), 1.38 (m, 2H) , 1.63 (m, 2H) , 1.90-2.06 (m, 3H) , 2.41 (s, 3H, SCH3), 2.35-2.60 (m, 3H) , 3.62 (s, 3H, OCH3-1), 3.89 (s, 3H, OCH3-2), 3.91 (s, 3H, OCH3-3) , 4.37 (m, 1H, H-1'), 5.15 (m, 1H, H-7), 6.54 (s, 1H, H-4), 7.01 (d, 1H, H-1 1 , J=1 0 . 4 Hz), 7.22 (d, 1H, H-12, J= 10.4 Hz), 7.28 (s, 1H, H-8)
<13>C-NMR (CDCl3) ppm: 15.0, 16.0, 20.6, 21.8, 23.2, 26.1, 29.2, 31.2, 33.9, 35.7, 40.5, 46.9, 55.9, 61.2, 61.3, 75.9, 79.0, 107.3, 124.9, 125.8, 127.5, 134.2, 134.4, 135.9, 141.5, 147.8, 151.0, 153.6, 158.6, 181.9
c) Idrolisi: Una soluzione di (+ ) -5b o (—)—5b (1.8 mmol) in KOH 0.5 M in metanolo (25 ml) viene agitata a 80 °C per 30 min. Dopo rielaborazione il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice, etere dietilico/cloroformio/metanolo 50:45:5). Il (+)-(aS,7R)-tiocolchicolo (+)-4b ([α]<25>D+189° (c. 0.3, MeOH)), e il (-)-(aR,7S)-thiocolchicol (—)—4b ([α]<25>D-188° (c. 0.3, MeOH)), sono ottenuti con una resa del 95 %.
Preparazione di (+) e (—) — 7—0— Retinili— Deacetammido— colchicina (6a) , 7—0— Retinoil— Deacetammidotiometilcolchicina (6b) , and 7—0— Retinoil— Deacetammido-benziltiocolchicina (6c) .
I (+) e (-)-retinoli derivati 6a-c sono preparati mediante reazione dei (+) e (-)-colchicoli 4a-c con acido retinoico in CH2Cl2in presenza di dicicloesilcarbodimmide (DCC) and 4-pirrolidinpiridina (PPY).
Procedura : Una miscela di (+) o (-)-colchicolo (4a, 4b or 4c) (1.4 mmol), acido retinoico (0.7 g, 2.3 mmol), DCC (0.58 g, 2.8 mmol), PPY (0.062 g, 0.42 mmol) in CH2Cl2(15 ml) viene agitata a temperatura ambiente per 3 h. La miscela di reazione viene filtrata per eliminare la DCU; la soluzione filtrata viene lavata con acqua, seccata su sodio solfato e concentrata a pressione ridotta. Il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice, etere dietilico/cloroformio/etere di petrolio 10:50:40). I (+) e (-)- retinoli derivati 6a-c sono ottenuti con una resa del 70-75%.
(—) —7—0— Retinoil— Deacetammido-tiometilcolchicina (— )-6b
[α]<25>D-68.9° (c. 0.37 CHCl3)
p .f.: 113-117°C
<1>H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.02 (s, 6H, 2CH3-1'), 1.45-1.75 (m, 4H, CH2-13', CH2-14'), 1.71 (s, 3H, CH3-11'), 1.98 (s, 3H, CH3-7'), 1.9-2.1 (m, 2H, CH2-5), 2.25 (s, 3H, CH3-3'), 2.3-2.6 (m, 2H, CH2-5), 2.42 (s, 3H, S-CH3), 3.66 (s, 3H, OCH3-1), 3.90 (s, 3H, OCH3-2), 3.93 (s, 3H, OCH3-3), 5.37 (m, 1H, H-7), 5.87 (s, 1H, H-2'), 1.1-6.3 (m, 4H, H-4',H-6',H-8',H-9'), 6.54 (s, IH, H-4), 6.99 (dd, 1H, H-5', J=14.8, 11.6 Hz), 7.03 (d, 1H, H-11, J=10.3 Hz), 7.25 (d, IH, H-12, J=10.3 Hz), 7.33 (s, 1H, H-8).
<13>C-NMR (CDCl3. 400 MHz) ppm : 12.8, 13.9, 15.1, 19.1, 21.7, 28.9 (2C) , 29.4, 33.0, 34.2, 36.0, 39.5, 56.0, 61.2, 61.4, 71.9, 107.4, 117.4, 125.1, 126.2, 128.2, 128.8, 129.4, 130.0, 131.6, 134.5, 134.6, 134.7, 136.7, 137.1, 137.6, 140.0, 141.5, 148.9, 151.0, 153.6, 154.5, 158.5, 165.4, 182.3
Preparazione di vari esteri del (+) e (—) — Colchicolo (4a) , Tiometilcolchicolo (4b) e Benziltiocolchicolo (4c) .
Vari esteri di struttura 7-9(a-c) sono stati preparati per reazione dei (+) e (-)-colchicoli 4a-c con un appropriato acido carbossilico (acido esanoico, dodecanoico e esadecanoico, acido 3-carbossi cumarinico e acido acetil salicilico) in CH2Cl2in presenza di DCC and PPY.
Procedura : Una miscela di (+) o (-)-colchicolo (4a, 4b or 4c) (1.4 mmol), acido carbossilico (2.3 mmol), DCC (0.58 g, 2.8 mmol), PPY (0.062 g, 0.42 mmol) in CH2Cl2(15 ml) viene agitata a temperatura ambiente per 3 h. La miscela di reazione viene filtrata per eliminare la DCU; la soluzione filtrata viene lavata con acqua, seccata su sodio solfato e concentrata a pressione ridotta. Il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice, etere dietilico/cloroformio/etere di petrolio 10:50:40). I (+) and (-)-esteri derivati 7-9 sono ottenuti con resa del 70-75%.
7- (cumarina-3-carbossilato) -Deacetammidobenziltiocolchicina (8c)
mp 116-118 °C;
<1>H-NMR (CDCl3, 400 MHz ) δ : 2 . 18-2 . 61 (m, 4H, CH2-5 CH2-6), 3.67 (s, 3H, OCH3-1), 3.92 (s, 3H, OCH3-2), 3.94 (s, 3H, OCH3-3), 4.14 (s, 1H, SCH2Ph) , 5.56 (m, 1H, H-7), 6.57 (s, 1H, H-4), 7. 2-7. 7 (m, 12H, Ar, H-8, H-11, H-12), 8.60 (s, 1H, H-4");
<13>C-NMR (CDCl3. 400 MHz) ppm : 28.9, 35.5, 36.2, 55.8, 61.0, 61.2, 73.9, 107.3, 116.2, 116.5, 117.4, 124.4, 124.7, 126.8, 127.3, 127.8, 128.4 (2C) , 128.7 (2C) , 129.6, 133.9, 134.4, 134.5, 134.6, 136.5, 141.2, 147.7, 149.0, 150.8, 153.4, 154.6, 156.0, 157.0, 161.0, 181.8.
Preparazione di (+)- e (-)-7-{[(2'E)-4' (Retinilossi)but-2'—enil]ossi}— deacetammidocolchicina (11a), 7-{[(2E)-4 (Retinilossi)but—2—enil]ossi}-deacetammidotiometilcolchicina (11b) and 7 -{[(2E)-4 (Retinilossi)but-2—enil]ossi}-deacetammidobenziltiocolchicina (11c) .
I sali di litio dei (+) o (-) -colchicoli 4a-c ottenuti per trattamento con litio diisopropilammide (LDA) , reagiscono con il trans-1,4-dibromo-2-butene per dare i corrispondenti (+) - and (-) -butenilbromuri 10a-c. La reazione dei 4-bromo-butenil derivati con il sale di litio del retinolo fornisce i (+) - e (-)-retinil eteri 11a-c.
Procedura: a) Ad una soluzione di (+ ) o (-)colchicolo (4a, 4b or 4c) (2.7 iranol) in THF (20 mi) raffreddata a -20 °C viene addizionata una soluzione di LDA (4 mmol ) in THF (6 ml). La risultante miscela viene agitata a 0 °C per 30 min e poi a temperatura ambiente per 1 h. Una soluzione di 1,4-dibromo-2-butene (5.4 iranol) in DMF (15 ml) viene addizionata e la soluzione agitata a temperatura ambiente per 15 h. Dopo rielaborazione il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice gel, etere dietilico/cloroformio/etere di petrolio 50:40:10) . I (+)- e (-)-butenilbromuri 10a-c sono ottenuti con una resa del 40 %.
b) Ad una soluzione di LDA (2.5 iranol) in 4 mi di Et2O, raffreddata a -20 °C, una soluzione di retinolo (2.5 iranol) in 4 mi di Et2O viene addizionata lentamente. La miscela viene agitata a temperatura ambiente per 30 minuti e una soluzione del butenilbromuro 10 (1 mmol ) in DMF viene addizionata e la soluzione lasciata sotto agitazione a t.a. per 15 h. Dopo rielaborazione il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice, etere dietilico/etere di petrolio 85:15). I (+)- e (-)-retinil eteri lla-c sono ottenuti con una resa del 30 %.
(—)—7—{ [ (2E) -4 (Retinilossi)but- 2-enil] ossi}-deacetammido-tiometilcolchicina (—) —11b
[α]<25>D-106.2° (c. 0.65 CHC13)
<1>H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.00 (s, 6H, 2CH3-15") , 1.40-1.65 (m, 4H, CH2-13", CH2-14") , 1.70 (s, 3H, CH3-11"), 1.81 (s, 3H, CH3-7"), 1.85 (m, 1H, CHH-6) , 1.94 (s, 1H, CH3-3"), 2.00 (m, 2H, CH2-12") , 2. 3-2. 5 (m, 3H, CHH-6 , CH2-5), 2.43 (s, 3H, S-CH3) , 3.61 (s, 3H, OCH3-1), 3.67 (m, 1H, CHR-1' ) , 3.85-4.0 (m, 4H, CHH-1', CH2-4 ' , H-7), 3.91 (s, 6H, OCH3-2, OCH3-3), 4.06 (d, 2H, CH2-1", J = 6.7 Hz), 5.58 (t, 1H, H-2", J = 6.7 Hz), 5.72 (m, 2H, H-2', H-3'), 6.05-6.30 (m, 4H, H-4",H-6",H-8",H-9") , 6.53 (s, 1H, H-4), 6.57 (dd, 1H, H-5", J=15 . 1 , 11.2 Hz), 7.03 (d, 1H, H-11, J=10.3 Hz), 7.20 (d, 1H, H-12, J=10.3 Hz) , 7.50 (s, 1H, H-8) .
<13>C-NMR (CDCl3400 MHz) ppm : 12.7, 12.8, 15.1, 19.2, 21.7, 28.9 (2C) , 29.6, 33.0, 34.2, 37.6, 39.6, 56.0, 61.0, 61.2, 66.6, 69.6, 69.8, 78.8, 107.2, 124.8, 124.9, 125.8, 126.5, 127.7, 128.7, 129.0, 129.2, 129.8, 130.1, 134.4, 135.1, 135.9, 136.4, 137.2, 137.4, 137.0, 137.8, 141.2, 149.2, 150.7, 153.5, 158.5, 182.4.
Preparazione of (+)— and (—) —7— (Alchil—ossi) — deacetammidocolchicina (12—14a), 7— (Alchil—ossi) — deacetamidotiometilcolchicina (12— 14b) and 7— (Alchil—ossi) -deacetammido benziltio—colchicina (12— 14c) .
La reazione dei sali di litio dei (+) e (-)-colchicoli 4a-c con una serie di alchilbromuri (1-bromo-nonano, 1-bromo-dodecano, 1-bromo-esadodecano, bromuro di geranile e bromuro di farnesile) fornisce i rispettivi (+)- e (-)-alchil eteri 12-14(a-c).
Procedura : Ad una soluzione di (+) o (-)-colchicolo (4a, 4b or 4c) (2.7 mmol) in THF (20 ml) raffreddata a -20 °C viene addizionata una soluzione di LDA (4 mmol) in THF (6 ml). La risultante miscela viene mantenuta sotto agitazione magnetica a 0 °C per 30 minuti e poi a t.a. per 1 h. Una soluzione di alchil bromuro (4 mmol) in DMF (15 ml) viene addizionata e la soluzione agitata a t.a. per 15 h. Dopo rielaborazione il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia su colonna (gel di silice, etere dietilico/cloroformio/etere di petrolio 50:40:10). I (+)- e (-)-alchil eteri 12-14(a-c) sono ottenuti con una resa del 40 %.
(—) —7— (Geranil—ossi) -deacetammidotiometilcolchicina (-) -13b
[α]<25>D-221 . 8 ° (c . 0 .3 CHCl3)
<1>H-NMR (CDCl3, 400 MHz ) δ : 1 .50 (s, 3H, CH3-7 ' ) , 1 .55 (s, 3H, CH3-7'), 1.63 (s, 3H, CH3-3') , 1.77-2.05 (m, 5H, CflH-6, CH2-4',), 2.25-2.5 (m, 3H, CHH-6, CH2-5), 2.42 (s, 3H, S-CH3), 3.63 (s, 3H, OCH3-1), 3.67 (m, 1H, CHH-1 ' ) , 3.85-4.0 (m, 4H, CHH-1', H-7), 3.89 (s, 6H, OCH3-2 , OCH3-3) , 5.00 (t, 1H, H-6' , J = 6.9 Hz), 5.28 (t, 1H, H-2 ' , J = 6.3 Hz), 6.53 (s, 1H, H-4), 7.02 (d, 1H, H-11, J=10.3 Hz), 7.18 (d, 1H, H-12,
J=10 . 3 Hz), 7.53 (s, 1H, H-8) .
<13>C-NMR (CDC13400 MHz) ppm: 15.1, 16.4, 17.6, 25.6, 26.2, 29.6, 37.7, 39.5, 55.9, 60.9, 61.1, 66.2, 78.5, 107.1, 120.2, 123.8, 124.9, 125.8, 129.1, 131.5, 134.3, 135.2, 137.3, 140.6, 141.1, 149.4, 150.6, 153.4, 158.4, 182.4.
Esempio 2 : Studio degli effetti di dosi crescenti di colchicina e di diversi composti coniugati retinolocolchicina secondo la presente invenzione sulla proliferazione e la migrazione di cellule stellate umane sia in condizioni di controllo che dopo stimolazione con 10 ng/ml di PDGF-BB.
MATERIALI E METODI
Isolamento e coltura delle cellule stellate di fegato umano .
Le HSC umane sono state isolate da sezioni chirurgiche (10-20 g) di fegato umano normale non utilizzabile per trapianto. In breve, dopo una digestione combinata dei pezzi chirurgici con collagenasi e pronasi le HSC sono state separate dalle altre cellule non-parenchimali del fegato mediante ultra-centrifugazione su gradienti di stractan (Cellsep™ isotonic solution, Larex Ine, St. Paul, MN, USA). Le cellule sono state mantenute in coltura in fiasche di plastica (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln, New Jersey, USA) in Iscove's modified Dulbecco's medium, con l'aggiunta di 0.6 U/ml di insulina, glutamina (2 mM), aminoacidi non essenziali (0.1 mM), piruvato di sodio (1 mM), soluzione antimicotica ed antibatterica (tutto fornito dalla GIBCO BRL Laboratories, Grand Island, New York, USA), e con siero fetale bovino al 20% (v/v) (Imperiai Laboratories, Andover, UK) . Le cellule sono state coltivate in atmosfera costituita da aria umidificata al 95% di O2e 5% di CO2, con una temperatura costante di 37 °C. Le cellule appena isolate e coltivate in successive sottocolture sono state caratterizzate come precedentemente descritto. Gli esperimenti descritti sono stati condotti utilizzando HSC fra il terzo ed il quinto passaggio seriale, con un rapporto di distribuzione di 1:3. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando tre differenti linee cellulari.
Determinazione della sintesi di DNA
La sintesi di DNA è stata valutata tramite il metodo dell'incorporazione di [methyl-<3>H]-timidina nel materiale cellulare precipitato con acido tricloroacetico. In breve, le cellule sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti, alla densità di 2X10<4>cellule/pozzetto, con medium di coltura completo contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS). Una volta raggiunta la confluenza (circa 1X10<5>cellule/pozzetto), le cellule sono state rese quiescenti con l'incubazione in mezzo di coltura privo di siero e insulina ( serum-free/insulin-free : SFIF) per 48 ore. Le cellule sono state quindi incubate con o senza agonisti, alle dosi e secondo le modalità indicate, per 20 ore. Le cellule sono state poi incubate per 4 ore con 1 . 0 μCi/ml di [methyl- H] -timidina ( 6.7 Ci/mM) . Alla fine del periodo di pulsing la [methyl-<3>H]-timidina incorporata è stata misurata come riportato in letteratura. Il numero di cellule è stato valutato in tre diversi pozzetti per ogni disco e il risultato finale dell'esperimento è stato espresso come cpm/10<5>cellule.
Analisi della migrazione cellulare
La migrazione cellulare è stata analizzata come descritto nella letteratura. In breve, gli esperimenti sono stati condotti usando la tecnica delle camere di Boyden, provviste di filtri di policarbonato con pori di 8 μm. I filtri sono stati pre-trattati con collagene umano di tipo I (20 μg/ml) per 30 min a 37 °C e successivamente inseriti tra la camera superiore e quella inferiore. Le HSC, coltivate fino alla confluenza, sono state incubate in SFIF per 48 ore e quindi sono state trattate per 10 min con concentrazioni crescenti di donatori di NO. Le cellule sono state, quindi, ri-sospese mediante una blanda tripsinizzazione (0.05% tripsina/EDTA) ed una aliquota della sospensione cellulare (210 μl), corrispondente a circa 4X10<4>cellule, è stata inserita nella camera superiore e incubata a 37 °C per 6 ore. Nella camera inferiore erano presenti SFIF (controllo) o PDGF-BB (10 ng/ml) con o senza la stessa concentrazione di donatori di NO impiegata nel periodo di pre-incubazione . Dopo fissazione con metanolo al 96% e colorazione con ematossilina di Harris, le cellule migrate sul lato inferiore del filtro sono state quantificate come numero di cellule in 10 high-power fìelds (HPF). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. L'analisi di ogni triplicato è stata ripetuta due volte, in sedute diverse, e con diverse preparazioni di HSC. Possibili effetti citotossici sono stati controllati con il test di esclusione del trypan blu. Questo test ha costantemente indicato una vitalità cellulare superiore al 90%.
Analisi statistica dei dati
I risultati relativi agli esperimenti indicati nelle Tabelle 2 e 3 sono espressi come media deviazione standard e sono relativi a 18 determinazioni per punto sperimentale (n=18). L'analisi statistica è stata effettuata con l'analisi della varianza (ANOVA) e quando il valore di F era significativo con il Test di Duncan.
Esperimenti
In un primo gruppo di esperimenti (Tabella 2) sono stati valutati gli effetti di dosi crescenti di colchicina e di diversi composti coniugati retinolocolchicina sulla proliferazione (valutata mediante l'incorporazione di timidina triziata nel DNA cellulare) di cellule stellate umane sia in condizioni di controllo che dopo stimolazione con 10 ng/ml di PDGF-BB. In un secondo gruppo di esperimenti (Tabella 3) sono stati valutati gli effetti di dosi crescenti di colchicina e di diversi composti coniugati retinolo-colchicina sulla migrazione di cellule stellate umane sia in condizioni di controllo che dopo stimolazione con 10 ng/ml di PDGF-BB. La valutazione dei composti in esame mediante il suddetto disegno sperimentale permette una valutazione rapida del potenziale antifibrogenico di un numero elevato di composti. Per tutti i composti elencati nelle Tabelle 2 e 3 è stato accuratamente escluso un effetto tossico.
Proliferazione cellulare (TABELLA 2): Come previsto, la stimolazione con PDGF-BB ha indotto in tutti gli esperimenti un significativo aumento della proliferazione cellulare rispetto al controllo (C). La co-incubazione con tre concentrazioni molari decrescenti di colchicina (1C<-6>, 10<- 7>, 1CT<-8>M) ha indotto a tutte le concentrazioni una significativa riduzione della proliferazione. Tutti i composti retinolo-colchicina elencati nella Tabella 1 hanno indotto almeno ad una delle concentrazioni molari (1C<-6>, 1C<-7>, 1C<-8>M) testate una significativa riduzione della proliferazione cellulare. Inoltre i composti 1a, 3a, 4c, (—)—6b, (+)-6b, (-)-11b, (+)-11b, (—)—13b, (+)-13b (risultati evidenziati in giallo nella tabella) hanno indotto una significativa inibizione della proliferazione indotta da PDGF-BB in modo dose-dipendente. Una minoranza dei composti testati ha determinato una riduzione significativa della proliferazione basale (confronto con Controllo).
Migrazione cellulare (TABELLA 3): Come previsto, la stimolazione con PDGF-BB ha indotto in tutti gli esperimenti un significativo aumento della migrazione cellulare rispetto al controllo (C). La coincubazione con tre concentrazioni molari decrescenti di colchicina (1C<-6>, 10<7>, 1C<-8>M) ha indotto a tutte le concentrazioni una significativa riduzione della migrazione. Tutti i composti retinolo-colchicina elencati nella Tabella 2 hanno indotto almeno ad una delle concentrazioni molari (1C<-6>, 10<- 7>- 10<-8>M) testate una significativa riduzione della migrazione cellulare. Inoltre i composti 6b, 11b, 13b, (-)-6b, (+)-6b, (-)-11b, (+)-11b, (-)-13b, (+)-13b (risultati evidenziati in giallo nella tabella) hanno indotto una significativa inibizione della migrazione indotta da PDGF-BB in modo dose-dipendente. Una minoranza dei composti testati ha determinato una riduzione significativa della proliferazione basale (confronto con Controllo).
TABELLA 2
Effetti sulla proliferazione cellulare
(*= P<0 .05 o livello di significatività più alto vs. Controllo)
(**= p<0.05 o livello di significatività più alto vs. PDGF-BB)
TABELLA 3
Effetti sulla migrazione cellulare
(*= P<0.05 o livello di significatività più alto vs. Controllo)
(**= p<0.05 o livello di significatività più alto vs. PDGF-BB)
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Claims (11)

  1. RIVENDICAZIONI 1.Composti derivati della colchicina aventi formula generale (I):
    di configurazione ( aR, 7S) , (aS, 7R) ;( aR, 7S) o ( aS, 7R) , il gruppo R è scelto tra OCH3, SCH3o SCH2Ph, X è scelto tra NH o 0, Ri è scelto tra o
    in cui n è 4 , 10 o 14
    in cui n è 8 , 11 o 15
    e R1è H quando X è NH e R è SCH2Ph, oppure quando X è O e R è SCH3o SCH2Ph; a condizione che quando R1è g e X è NH allora R è diverso da OCH3.
  2. 2. Composti secondo la rivendicazione 1 scelti tra i composti aventi le seguenti formule:
  3. 3. Composti come definiti in ognuna delle rivendicazioni 1-3, per l'uso in campo medico.
  4. 4 .Composizione farmaceutica comprendente uno o più composti come definiti in ognuna delle rivendicazioni precedenti come principio attivo assieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
  5. 5. Uso dei composti e della composizione come definiti in ognuna delle rivendicazioni precedenti per la preparazione di un medicamento da impiegare nella terapia antifidrotica delle malattie epatiche croniche.
  6. 6. Composti derivati del retinolo aventi la seguente formula generale (II):
    in cui R2è scelto tra
    di configurazione ( aR , 7S) , ( aS , 7R) ; ( aR , 7S) o ( aS , 7R) , dove il gruppo R è scelto tra OCH3, SCH3o SCH2Ph, a condizione che quando R2è di configurazione (aR, 7S) , allora R è diverso da OCH3.
  7. 7. Uso dei composti come definiti nella rivendicazione 6 per la preparazione di un medicamento per la terapia antifidrotica in cui il retinolo funge da carrier.
  8. 8. Composizione farmaceutica comprendente uno o più composti come definiti nella rivendicazione 6 come principio attivo assieme ad uno o più eccipienti o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
  9. 9. Uso dei composti e della composizione come definiti nelle rivendicazioni 6 e 8 per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e la cura delle malattie epatiche.
  10. 10. Uso secondo la rivendicazione 9 in cui la malattia epatica è la fibrosi epatica.
  11. 11. Uso del retinolo come veicolo di farmaci antifibrotici.
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