ES2709148T3 - Kit de reactivos para detectar anticoagulante lúpico y método para determinar la presencia o ausencia de anticoagulante lúpico - Google Patents
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Abstract
Un kit de reactivos para la detección de anticoagulante lúpico que comprende: un primer reactivo de medición del tiempo de coagulación; y un segundo reactivo de medición del tiempo de coagulación; donde al menos uno del primer reactivo de medición del tiempo de coagulación y el segundo reactivo de medición del tiempo de coagulación contiene sal de metal alcalino y el segundo reactivo de medición del tiempo de coagulación contiene sal de metal alcalino a una concentración inferior a la del primer reactivo de medición del tiempo de coagulación o no contiene sal de metal alcalino; donde el primer reactivo de medición del tiempo de coagulación contiene fosfolípido y el segundo reactivo de medición del tiempo de coagulación contiene fosfolípido a una concentración menor que la del primer reactivo de medición del tiempo de coagulación; y donde el primer y segundo reactivo de medición del tiempo de coagulación contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en ácido elágico, celite y sílice.
Description
DESCRIPCION
Kit de reactivos para detectar anticoagulante lupico y metodo para determinar la presencia o ausencia de anticoagulante lupico
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico, que es uno de los anticuerpos responsables del smdrome antifosfolipfdico y se refiere adicionalmente a un metodo para determinar la presencia o ausencia de anticoagulante lupico en un especimen obtenido de un sujeto.
Antecedentes
El smdrome antifosfolipfdico (en adelante en el presente documento denominado “SAF”) es un termino general para un grupo de enfermedades que tienen anticuerpos antifosfolfpidos en la sangre y presentan smtomas clmicos tales como trombosis arteriovenosa y aborto habitual (vease Mika Yoshida et al., The Japanese Society for Laboratory Hematology, 2008, 9(1):69-76). Los anticuerpos antifosfolfpidos (en adelante en el presente documento denominados "aFL") es un termino general para los autoanticuerpos que se unen a fosfolfpidos o a un complejo de fosfolfpidos y protemas (vease, Tatsuya Atsumi et al., The Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis, 2008, 19(3):329-332).
Hay varios anticuerpos aFL y el nombre de anticuerpos se da de acuerdo con fosfolfpidos reconocidos por los anticuerpos o protemas de union a fosfolfpidos. Entre los ejemplos de los anticuerpos aFL se incluyen anticuerpos anti-cardiolipina (aCL), anticuerpos anti-p2 glicoprotema I (ap2GPI), anticuerpos anti-protrombina dependientes de fosfatidilserina (aPS/PT) y anticoagulante lupico (en adelante en el presente documento, tambien denominado "AL"). aCL, ap2GPI, y aPS/PT se detectan mediante inmunoensayo enzimatico (ELISA) y LA se detecta mediante la prolongacion del tiempo de coagulacion dependientes de fosfolfpidos (vease Masahiro leko et al., The Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis, 2007, 18(3):226-233).
El AL se define como "una inmunoglobulina que inhibe las reacciones de coagulacion de la sangre dependientes de fosfolfpidos sin inhibir las actividades del factor de coagulacion individual. Tambien se considera que el AL es un autoanticuerpo que inhibe los propios fosfolfpidos en las reacciones de coagulacion de la sangre dependientes de fosfolfpidos.
Actualmente, la norma para la inspeccion del AL es la siguiente:
1) Se observa prolongacion del tiempo de coagulacion en la inspeccion de deteccion selectiva para la medicion de los tiempos de coagulacion dependientes de fosfolfpidos, tales como el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo con veneno de vfbora de Russel diluido (dRVVT) y el tiempo de coagulacion con caolm (KCT);
2) La prolongacion del tiempo de coagulacion no mejora incluso si se lleva a cabo un ensayo de mezcla con plasma de donantes sanos;
3) se confirma que el tiempo de coagulacion se acorta anadiendo un exceso de fosfolfpidos (ensayo para evaluar la dependencia de fosfolfpidos).
Finalmente, se diagnostica a un sujeto que es positivo para AL excluyendo las anomalfas de coagulacion obvias, tales como por inhibidores de los factores de coagulacion y la influencia de anticoagulantes tales como heparina (vease, Mika Yoshida et al., Journal of the Japanese Society for Laboratory Hematology, 2008, 9(1):69-76).
Uno de los ensayos para evaluar la dependencia del AL de los fosfolfpidos es un metodo para evaluar la presencia de AL en un especimen, que incluye las etapas de: medir el tiempo de coagulacion utilizando un reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene una baja concentracion de fosfolfpidos y un reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene una concentracion alta de fosfolfpidos; y confirmar la prolongacion del tiempo de coagulacion en funcion de la concentracion de fosfolfpidos basandose en la relacion de los tiempos de coagulacion que se obtienen con los reactivos.
Exner et al. (1975 Pathology 7(4): 319-328) divulga reactivos de medicion de tiempo de coagulacion que comprenden caolm y diferentes concentraciones de sal de metal alcalino, en particular NaCl, con o sin fosfolfpidos. Exner et al. tambien divulga reactivos que comprenden una cierta cantidad de NaCl y diferentes concentraciones de fosfolfpidos. Exner et al. no divulga reactivos de medicion de tiempo de coagulacion que comprenden diferentes concentraciones de fosfolfpidos y diferentes concentraciones de sal de metal alcalino.
Schjetlein et al. (1993 Thrombosis Research 72(4), 287-294) divulga reactivos de medicion de tiempo de coagulacion (LR-APTT) que comprenden acido elagico y fosfolfpidos, en particular cefalina cruda, diluida 1:50 y 1:800 en solucion salina almacenada. Las concentraciones de la sal de metal alcalino, es decir la solucion salina almacenada, y los fosfolfpidos en estos reactivos siempre se vinculan inherentemente entre sf en el sentido en que el reactivo que
contiene la concentracion mas alta de fosfoKpidos (es dedr, la dilucion menor) contendra la menor concentracion de sal de metal alcalino. Schjetlein et al. tambien divulga un metodo de determinar la presencia o ausencia de anticoagulante lupico usando estos reactivos de medicion de tiempo de coagulacion.
Los presentes inventores han completado un kit de reactivos capaz de detectar el AL con una sensibilidad alta ajustando la composicion de fosfolfpidos contenida en un reactivo (veanse la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 2004/0091952, la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 2005/0175983 y la solicitud de patente japonesa abierta a inspeccion publica (JP-A) n.° 2006-133002).
Aunque el AL se puede detectar mediante los metodos anteriores, la prolongacion del tiempo de coagulacion se observa incluso si se utiliza el reactivo que contiene una concentracion elevada de fosfolfpido. Es decir, en el caso de la utilizacion de los metodos convencionales, incluso una relacion del tiempo de coagulacion en un especimen positivo para AL puede ser igual a la de un especimen negativo. Por lo tanto, es diffcil separar claramente un grupo de espedmenes positivos para AL de un grupo de espedmenes negativos para AL.
Sumario de la invencion
El alcance de la presente invencion solo se define con las reivindicaciones adjuntas y no se ve afectado en ninguna medida por las afirmaciones de este sumario.
Los presentes inventores han descubierto que la prolongacion del tiempo de coagulacion por el anticoagulante lupico (AL) se puede suprimir utilizando un reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sales de metales alcalinos de forma que el grupo de espedmenes positivos a AL puede separarse claramente del grupo de espedmenes negativos a AL y se ha completado la presente invencion.
(1) Un primer aspecto de la presente invencion es
un kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico que comprende:
un primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; y
un segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion;
donde al menos uno del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene sal de metal alcalino
y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene sal de metal alcalino a una concentracion inferior a la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o no contiene sal de metal alcalino;
donde el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpido y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpido a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; y donde el primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en acido elagico, celite y sflice.
(2) El kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico de acuerdo con (1), donde
la sal de metal alcalino es sal de metal alcalino de acido inorganico.
(3) El kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico de acuerdo con uno cualquiera de (1) o (2), donde
la sal de metal alcalino es sal de sodio o sal de potasio.
En realizaciones, el fosfolfpido es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y fosfatidilserina.
(4) El kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), que ademas comprende
un tercer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sal de calcio.
(5) Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere al uso de un primero y segundo reactivo como se describe para el kit de reactivos en el presente documento para determinar la presencia o ausencia de un anticoagulante lupico en un especimen, para la identificacion de muestras positivas para AL y negativas para AL y/o para el diagnostico in vitro del smdrome antifosfolipfdico. Mas particularmente, la invencion proporciona un metodo para determinar la presencia o ausencia de anticoagulante lupico que comprende las etapas de:
mezclar un especimen que se obtiene de un sujeto con el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sal de metal alcalino para medir el primer tiempo de coagulacion;
mezclar el especimen con un segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sal de metal alcalino a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o que no contiene una sal de metal alcalino para medir el segundo tiempo de coagulacion; donde el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos a una concentracion menor que la del primer reactivo de
medicion del tiempo de coagulacion; y
determinar si el AL esta contenido en el especimen basandose en el primer y el segundo tiempo de coagulacion medidos; donde el primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en acido elagico, celite y sflice.
(6) El metodo de determinacion de la presencia o ausencia de anticoagulante lupico de acuerdo con (5), donde se determina si el anticoagulante lupico esta contenido en el especimen mediante la comparacion de un valor obtenido basandose en la diferencia o la relacion entre los tiempos de coagulacion primero y segundo con un valor umbral predeterminado en la etapa de determinacion, donde dicho valor umbral se determina en base a una relacion del tiempo de coagulacion del especimen obtenido del sujeto al tiempo de coagulacion del plasma normal.
(7) El metodo de determinacion de la presencia o ausencia de anticoagulante lupico de acuerdo con uno cualquiera de (5) o (6), donde
la sal de metal alcalino es sal de metal alcalino de acido inorganico.
(8) El metodo de determinacion de la presencia o ausencia de anticoagulante lupico de acuerdo con uno cualquiera de (5) a (7), donde
la sal de metal alcalino es sal de sodio o sal de potasio.
En realizaciones, el fosfolfpido es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y fosfatidilserina.
Al hacer uso del kit de reactivos para la deteccion de AL de la presente invencion, la prolongacion del tiempo de coagulacion del AL se suprime de manera que el grupo de espedmenes positivos para AL se puede separar claramente separada del grupo espedmenes negativos para AL. De acuerdo con el metodo de determinacion de la presencia o ausencia de AL de la presente invencion, se puede determinar con precision si el AL esta contenido en el especimen que se obtiene del sujeto.
En el presente documento tambien se describen metodos in vitro de diagnostico del smdrome antifosfolipfdico mediante el uso de las herramientas y metodos descritos en el presente documento.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama de dispersion que muestra la distribucion de la relacion del lupus de espedmenes negativas para AL y positivas para AL que se ha calculado a partir del tiempo de coagulacion medido usando el kit de reactivos para la deteccion de AL segun una realizacion de la presente invencion, que incluye un primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene cloruro de sodio como sal de metal alcalino y un segundo de reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que no contiene sal de metal alcalino;
La figura 2 es un diagrama de dispersion que muestra la distribucion de la relacion del lupus de espedmenes negativas para AL y positivas para AL que se ha calculado a partir del tiempo de coagulacion medido usando el kit de reactivos para la deteccion de AL segun una realizacion de la presente invencion, que incluye el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene cloruro de potasio como sal de metal alcalino y el segundo de reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que no contiene sal de metal alcalino; y
La figura 3 es un diagrama de dispersion que muestra la distribucion de la relacion del lupus de espedmenes negativas para AL y positivas para AL que se ha calculado a partir del tiempo de coagulacion medido usando el kit de reactivos para la deteccion de AL segun una realizacion de la presente invencion, que incluye el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sal de sodio como sal de metal alcalino y el segundo de reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que no contiene sal de metal alcalino.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
A continuacion en el presente documento se describiran las realizaciones preferidas de la presente invencion con referencia a las figuras.
El kit de reactivos para detectar el AL de la presente invencion incluye un primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y un segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion, donde al menos uno del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y del segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene sal de metal alcalino a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o no contiene sal de metal alcalino, donde el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion, y donde el primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en acido elagico, celite y sflice. La sal de metal alcalino contenida en el primer y opcionalmente en el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion del kit de reactivos de la presente invencion no esta particularmente limitada siempre que genere iones de metal alcalino en un disolvente adecuado, preferentemente tampones incluidos en los reactivos y los aniones generados de la sal de metal alcalino no inhiben una reaccion de la coagulacion de la sangre. Entre los ejemplos que se pueden usar de sal de metal alcalino se incluyen sales de metales alcalinos de acidos inorganicos que son
sales de metales alcalinos tales como acido clortndrico, acido sulfurico, y acido mtrico. Particularmente, es preferible utilizar acidos inorganicos tales como sales de sodio y sales de potasio. Ejemplos espedficos de los mismos incluyen cloruro de sodio, sulfato de sodio, nitrato de sodio, cloruro de potasio, y nitrato de potasio. Particularmente, se prefieren cloruro de sodio, sulfato de sodio, y cloruro de potasio. La sal de metal alcalino puede ser un antndrido o un hidrato.
La concentracion de la sal de metal alcalino en el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede ser de 0,001 a 40 %, preferentemente de 0,01 a 10 %, mas preferentemente de 0,1 a 5 %. En realizaciones particulares, la concentracion de sal de metal alcalino es de 0,2 a 5 %. En realizaciones particulares adicionales, la concentracion de la sal de metal alcalino es de 0,2 a 5 %. El segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion no necesita contener la sal de metal alcalino. Cuando el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene la sal de metal alcalino, la concentracion de sal de metal alcalino en el mismo es inferior a la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion. Por ejemplo, cuando la concentracion de la sal de metal alcalino en el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion es del 1 %, la concentracion de la sal de metal alcalino en el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion se puede fijar en 0,1 %.
En el kit de reactivos de la presente invencion, una relacion de la concentracion de la sal de metal alcalino en el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion con respecto al primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion [concentracion de la sal de metal alcalino del segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion]/ [concentracion de la sal de metal alcalino del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion]) puede ser de 0 a 1, de 010,1 o, preferentemente, de 0 a 0,2.
En el kit de reactivos de la presente invencion, el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion de la coagulacion con el fin de facilitar la coagulacion sangumea. Los ejemplos de los fosfolfpidos incluyen fosfatidiletanolamina (en adelante en el presente documento tambien denominado PE), fosfatidilcolina (adelante en el presente documento tambien denominado PC) y fosfatidilserina (adelante en el presente documento tambien denominado PS). Los primeros y segundo reactivos de medicion del tiempo de coagulacion pueden contener al menos uno seleccionado de PE, PC y PS, preferentemente dos clases de los mismos, mas preferentemente todas las clases de los fosfolfpidos.
El fosfolfpido contenido en los reactivos de medicion del tiempo de coagulacion primero y segundo puede ser un fosfolfpido de origen natural o un fosfolfpido sintetico. Entre ellos, el fosfolfpido sintetico o el fosfolfpido de origen natural purificado con una pureza del 99 % o mas se prefiere desde el punto de vista de la mejora de la capacidad de deteccion del AL. Las cadenas laterales de acidos grasos de PE, PC y PS no estan particularmente limitadas y ejemplos de los mismos incluyen acido palmttico, acido oleico y acido estearico. Entre ellos, es preferente el acido oleico.
El contenido de fosfolfpidos en el primero y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion cuando se mezclan cantidades equivalentes de un especimen y el primero o segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion se mezclan (por ejemplo, se mezclan 50 pl del especimen y 50 pl del primero o segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion) y midiendo el tiempo de coagulacion puede ser el siguiente. La concentracion de fosfolfpido en el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede ser de 100 a 2000 pg/ml, preferentemente de 100 a 600 pg/ml. La concentracion de fosfolfpido en el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede ser de 20 a 1000 pg/ml, preferentemente de 30 a 70 pg/ml.
Cuando los primeros y segundo reactivos de medicion del tiempo de coagulacion contienen seleccionado PE, PC y PS como fosfolfpidos, la concentracion de PE en el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede ser de 30 a 700 pg/ml, preferentemente de 40 a 300 pg/ml. La concentracion de PC puede ser de 50 a 1.000 pg/ml, preferentemente de 60 a 500 pg/ml, y la concentracion de PS puede ser de 5 a 300 pg/ml, preferentemente de 10 a 150 pg/ml. La concentracion de PE en el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede ser de 1 a 100 pg/ml, preferentemente de 10 a 80 pg/ml. La concentracion de PC puede ser de 5 a 200 pg/ml, preferentemente de 20 a 150 pg/ml. La concentracion de PS puede ser de 1 a 100 pg/ml, preferentemente de 3 a 50 pg/ml.
Cuando una relacion de mezcla de un especimen y el primero segundo reactivo de medicion del tiempo no es 1:1, la concentracion final de fosfolfpidos en una mezcla del especimen y el primero o segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion se puede ajustar de manera que sea la misma que una mezcla cuando se usan reactivos que tienen las concentraciones de fosfolfpidos.
En el kit de reactivo de la presente invencion, los primeros y segundos reactivos de medicion del tiempo de coagulacion pueden contener ademas otros componentes necesarios para causar la coagulacion de la sangre in vitro. Entre los ejemplos de los otros componentes se incluyen veneno de serpiente, un factor tisular y sal de calcio. Como activador, el acido elagico puede estar en un estado donde se forman iones metalicos y quelato.
Como veneno de serpiente, preferentemente se usa al menos uno seleccionado del grupo que consiste en veneno de Russel, veneno de textarina y veneno de ecarina.
Como factor tisular, preferentemente se usa uno derivado de cerebro de conejo, derivado de la placenta humana o un recombinante.
Los otros componentes anteriores se seleccionan adecuadamente en funcion del metodo de medicion del tiempo de coagulacion del especimen. Por ejemplo, cuando el tiempo de coagulacion se mide con en base al principio de un tiempo de tromboplastina parcial activada, el primero y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede contener sal de calcio. Cuando el tiempo de coagulacion se mide con en base al principio de un tiempo de veneno de Russel, el primero y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede contener veneno de serpiente y sal de calcio. Cuando el tiempo de coagulacion se mide con en base al principio de un tiempo de protrombina, el primero y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede contener un factor tisular y sal de calcio.
En el kit de reactivos de la presente invencion, el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion pueden contener un tampon que tiene una accion tampon en un intervalo de pH de 5 a 10, preferentemente en un intervalo de pH de 6 a 9. Entre los ejemplos del tampon se incluyen acido 4-(2-hidroximetil)piperazin-1-il-etanosulfonico (HEPES), tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y un tampon fosfato (PBS).
La concentracion de tampon en los reactivos puede estar en el intervalo permitido y usado generalmente en el campo de la qmmica clmica y se determina empmcamente basandose en experimentos simplificados y repetidos. El primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion del kit de reactivos de la presente invencion puede ser una mezcla en forma de solucion o suspension que contiene una sal de metal alcalino, el fosfolfpido, el activador y/u, opcionalmente, otros componentes en el tampon. Ademas, el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede ser una mezcla en forma de solucion o suspension que contiene el fosfolfpido, el activador y opcionalmente, otros componentes en el tampon y contiene o no contiene una sal de metal alcalino.
El kit de reactivos de la presente invencion puede contener ademas un tercer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene una sal de calcio. La sal de calcio no esta particularmente limitada siempre que genere iones de calcio (Ca2+) en un disolvente adecuado, preferentemente tampones incluidos en los reactivos. Por ejemplo, se cita el cloruro de calcio. La concentracion de la sal de calcio en el tercer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion no esta particularmente limitada siempre que sea una concentracion suficiente para el inicio de la coagulacion en la mezcla del especimen y el primer o segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y es, preferentemente, de 10 a 40 mM.
El kit de reactivos de la presente invencion puede ser una forma combinada del primer o segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y el tercer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion. Es decir, en el kit de reactivos de la presente invencion, el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede estar comprendido por el primer reactivo parcial que contiene la sal de metal alcalino y el segundo reactivo parcial que contiene sal de calcio. El segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion puede estar comprendido por el tercer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene la sal de metal alcalino a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o no contiene sal de metal alcalino y un cuarto reactivo parcial que contiene sal de calcio.
De aqrn en adelante en el presente documento se describira el metodo de determinacion de la presencia o ausencia de AL en un especimen (al que tambien se hace referencia como metodo de la presente invencion). En el metodo de la presente invencion, el kit de reactivos para detectar AL de la presente invencion se usa adecuadamente.
En el metodo de la presente invencion, se mezcla primero un especimen obtenido de un sujeto con el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene una sal de metal alcalino y se mide el primer tiempo de coagulacion.
El especimen que se utiliza en la medicion puede ser sangre obtenida del sujeto, preferentemente plasma obtenido de la sangre, mas preferentemente plasma despues de la eliminacion de las plaquetas. Ademas, preferentemente, se utiliza como especimen una mezcla de plasma del sujeto y plasma normal o plasma normal despues de la eliminacion de las plaquetas. La utilizacion de una mezcla que contiene plasma normal como especimen es ventajosa en la prevencion de la prolongacion del tiempo de coagulacion causada por la deficiencia de un factor de coagulacion en el sujeto, asf como mejorar la sensibilidad de deteccion en un ensayo de deteccion de un trastorno de la coagulacion sangumea dependiente de fosfolfpidos. La relacion de la mezcla del plasma del sujeto con respecto al plasma normal generalmente puede variar de 4:1 a 1:4 y, preferentemente, es de 1:1.
En el metodo de la presente invencion, el especimen se puede dividir en dos partes. Una se puede utilizar para medir el primer tiempo de coagulacion y la otra se puede utilizar para medir el segundo tiempo de coagulacion. Uno de los dos espedmenes divididos se puede mezclar con el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion. Cuando el reactivo esta compuesto por el primer reactivo parcial y el segundo reactivo parcial, el especimen puede mezclarse con una mezcla del primer reactivo parcial y el segundo reactivo parcial, o una mezcla del especimen y el primer reactivo parcial (o el segundo reactivo parcial) se puede mezclar con el segundo reactivo parcial (o el primer reactivo parcial).
La relacion de la mezcla (relacion de volumen) del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion respecto al especimen puede ser desde aproximadamente 4:1 a 1:4, preferentemente de 1:1.
Cuando el primer reactivo parcial y el segundo reactivo parcial se anaden por separado al especimen, se puede incubar una mezcla del especimen y el reactivo parcial tras anadir el primer reactivo parcial (o el segundo reactivo parcial) o antes de anadir el segundo reactivo parcial (o el primer reactivo parcial), si fuera necesario. El tiempo de incubacion puede ser de aproximadamente 1 a 10 minutos y la temperatura puede ser desde aproximadamente la temperatura ambiente a 45 °C.
El especimen y el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion se mezclan de dicha manera y luego se mide el primer tiempo de coagulacion. El metodo para medir el tiempo de coagulacion puede ser un metodo conocido en la tecnica y se puede medir, por ejemplo, utilizando un analizador automatico conocido.
A continuacion, el especimen se mezcla con el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sal de metal alcalino a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o que no contiene una sal de metal alcalino y se mide el segundo tiempo de coagulacion.
El segundo tiempo de coagulacion se puede medir mezclando el otro de los dos espedmenes divididos con el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion. Mas particularmente, el proceso de medicion se lleva a cabo de la misma manera que se describe en la medicion del primer tiempo de coagulacion, excepto que el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion se utiliza en lugar del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion.
Los tiempos de coagulacion primero y segundo se pueden medir sucesivamente o simultaneamente.
Basandose en la diferencia o la relacion entre el primero y el segundo tiempo de coagulacion medidos como se ha descrito anteriormente, se determina si hay AL contenido en el especimen. Entre los ejemplos de la diferencia se incluyen un valor que se calcula a partir de la ecuacion: "(el segundo tiempo de coagulacion)-(el primer tiempo de coagulacion)" y un valor calculado a partir de la ecuacion: "(el primer tiempo de coagulacion)-(el segundo tiempo de coagulacion)". Entre los ejemplos de la relacion se incluyen un valor que se calcula a partir de la ecuacion: "(el segundo tiempo de coagulacion)/(el primer tiempo de coagulacion)" y un valor calculado a partir de la ecuacion: "(el primer tiempo de coagulacion)/(el segundo tiempo de coagulacion)".
En el kit de reactivos de la presente invencion, la prolongacion del primer tiempo de coagulacion por AL se suprime mediante la sal de metal alcalino en el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion. Por lo tanto, se preve que el primer tiempo de coagulacion sea igual o mas corto que el segundo tiempo de coagulacion.
En consecuencia, en el caso donde, por ejemplo, se utilice el valor que se calcula de la ecuacion: "(el segundo tiempo de coagulacion)-(el primer tiempo de coagulacion)" se usa como la diferencia del primero y segundo tiempo de coagulacion en el proceso de determinacion, puede determinarse que el AL esta presente en el especimen que se obtiene del sujeto cuando el valor es grande. Por el contrario, cuando el valor que se calcula de la ecuacion: "(el segundo tiempo de coagulacion)-(el primer tiempo de coagulacion)" es pequeno (0 o incluye un valor negativo), se puede determinar que el AL no esta presente en el especimen.
En el caso donde la presencia o ausencia de LA en el especimen se determina utilizando, por ejemplo, el valor calculado a partir de la ecuacion: "(el segundo tiempo de coagulacion)/(el primer tiempo de coagulacion)" como la relacion del primer tiempo de coagulacion y el segundo tiempo de coagulacion, se puede evaluar que hay AL presente en el especimen cuando la relacion es grande. Por el contrario, cuando el valor que se calcula de la ecuacion: "(el segundo tiempo de coagulacion)-(el primer tiempo de coagulacion)" es pequeno, se puede determinar que el AL no esta presente en el especimen.
El proceso de determinacion de la presencia o ausencia de AL en el especimen se puede llevar a cabo de manera experimental acumulando los datos del primer y segundo tiempo de coagulacion del especimen obtenido de sujetos sanos y sujetos con AL, respectivamente. Desde el punto de vista de la determinacion mas precisa, es preferible que el proceso de determinacion de la presencia o ausencia de AL en el especimen se lleve a cabo basandose en los resultados obtenidos por la comparacion de un valor obtenido basandose en la diferencia o relacion entre dicho primer y segundo tiempo de coagulacion obtenidos del especimen del sujeto con respecto a un valor umbral que se describira mas adelante.
Es preferible determinar el valor umbral basandose en una relacion del tiempo de coagulacion del especimen que se obtiene del sujeto con respecto al tiempo de coagulacion del plasma normal, por ejemplo, por mdice de Rosner (E. Rosner et al., Thromb. Haemast. 1987, 57:144-147) o la relacion de lupus (al que tambien se hace referencia como valor LR) (R. Schjetlein et al., Thromb. Res. 1993, 69:239-250).
La expresion "Relacion de lupus (valor LR)" en el presente documento significa un valor calculado por la Ecuacion (I) siguiente.
Ecuacion (I): Relacion de lupus =(b/a)/(d/c)=bc/ad
(en la ecuacion (I), a, b, c y d respectivamente representan los valores medidos del siguiente modo: a: tiempo de coagulacion obtenido a partir del especimen del sujeto y el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; b: tiempo de coagulacion obtenido a partir del especimen del sujeto y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; c: tiempo de coagulacion obtenido de un especimen de un sujeto sano (plasma normal) y el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; y d: tiempo de coagulacion obtenido del especimen de un sujeto sano (plasma normal) y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion).
En el caso del plasma normal, el valor de LR es aproximadamente 1. Asimismo, el valor de LR de cada uno de los espedmenes de los pacientes con deficiencia de factores de coagulacion, pacientes a los que se administra warfarina o pacientes a los que se administra heparina es de aproximadamente 1, debido a que no se reconoce la diferencia entre el primero y segundo tiempo de coagulacion a pesar del hecho de que el tiempo de coagulacion es mayor en comparacion con el caso del plasma normal. Por otro lado, en el caso de los espedmenes obtenidos de pacientes positivos para AL, el segundo tiempo de coagulacion es mas largo que el primer tiempo de coagulacion debido a la presencia de AL en el especimen, y, por lo tanto, el valor LR de los pacientes positivos para AL es mayor de 1. En consecuencia, los espedmenes que contienen AL, es decir, los espedmenes derivados de pacientes positivos a AL se pueden detectar automaticamente comparandolos con el valor de LR del plasma normal.
La sal de metal alcalino que se incluye en el primer y opcionalmente en el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que se va a usar en el metodo de la presente invencion no esta particularmente limitada, siempre que genere iones de metal alcalino en un disolvente adecuado, preferentemente tampones incluido en los reactivos y no inhiben una reaccion de coagulacion de sangre dependiente de fosfolfpidos. Entre los ejemplos que se pueden usar de sal de metal alcalino se incluyen sales de metales alcalinos de acidos inorganicos que son sales de metales alcalinos tales como acido clortndrico, acido sulfurico, y acido nftrico. Particularmente, es preferible utilizar acidos inorganicos tales como sales de sodio y sales de potasio. Ejemplos espedficos de los mismos incluyen cloruro de sodio, sulfato de sodio, nitrato de sodio, cloruro de potasio, y nitrato de potasio. Particularmente, se prefieren cloruro de sodio, sulfato de sodio, y cloruro de potasio. La sal de metal alcalino puede ser un anlddrido o un hidrato.
El primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que se va a usar para el metodo de la presente invencion contiene fosfolfpido y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpidos a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion. El fosfolfpido puede ser al menos uno seleccionados del grupo que consiste en fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y fosfatidilserina.
El primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que se va a utilizar para el metodo de la presente invencion contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en acido elagico, celite y sflice. El primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que se va a utilizar para el metodo de la presente invencion pueden contener otros componentes tales como veneno de serpiente, un factor tisular y sal de calcio. En lo sucesivo en el presente documento, se explicaran ejemplos, sin embargo, la presente invencion no esta limitada a los mismos.
Ejemplos
Se examino si los espedmenes positivos para AL y negativos para AL pueden separarse claramente con un reactivo para la deteccion de AL que contiene sal de metal alcalino.
Se prepararon reactivos para la deteccion de AL (dos sistemas de reactivos), basados en el principio de un tiempo de tromboplastina parcial activada. En cuanto a los reactivos para la deteccion de AL, un reactivo que contiene sal de metal alcalino y fosfolfpido se denomina "LA-H" y un reactivo que contiene fosfolfpidos a una concentracion inferior a la de LA-H se conoce como "LA-L". El reactivo LA-H esta compuesto por el primer reactivo parcial y el segundo reactivo parcial y el reactivo LA-L esta compuesto por el tercer reactivo parcial y el cuarto reactivo parcial. El primer reactivo parcial contema 50 mM de HEPES (Kishida Chemical Co., Ltd.), 0,1 mM de acido elagico (Kishida Chemical Co., Ltd.), 25 mM de Tris (Kishida Chemical Co., Ltd.), 60 pg/ml de PE (Nacalai Tesque, Inc.), 120 pg/ml de PC (Nacalai Tesque, Inc.), y 20 pg/ml de PS (Nacalai Tesque, Inc.), y cloruro de sodio como sal de metal alcalino (a una concentracion final de 0,5 % en peso y 1,0 % en peso, Nacalai Tesque, Inc.). Los primeros reactivos parciales, que contienen, respectivamente, sulfato de sodio (a una concentracion final de 0,5 % en peso y 1,0 % en peso, Nacalai Tesque, Inc.) y cloruro de potasio (a una concentracion final de 0,5 % en peso y 1,0 % en peso, Kishida Chemical Co., Ltd.) se prepararon como sal de metal alcalino. Cada uno de los primeros reactivos parciales incluye acido elagico que contiene una sal metalica y quelato formado. Como control del primer reactivo parcial, tambien se preparo un reactivo que no contema sal de cloruro de metal alcalino. El pH de estos reactivos se ajusto a
El tercer reactivo parcial contiene 50 mM de HEPES (Kishida Chemical Co., Ltd.), 0,1 mM de acido elagico (Kishida Chemical Co., Ltd.), 25 mM de Tris (Kishida Chemical Co., Ltd.), 15 pg/ml de PE (Nacalai Tesque, Inc.), 30 pg/ml de PC (Nacalai Tesque, Inc.), y 5 pg/ml de PS (Nacalai Tesque, Inc.). El tercer reactivo parcial incluye acido elagico que contiene una sal metalica y quelato formado. El pH del tercer reactivo parcial se ajusto a 7,35.
El segundo y cuarto reactivos parciales eran una solucion preparada disolviendo cloruro de calcio (peso molecular: 111.0, Kishida Chemical Co., Ltd.) en agua purificada a una concentracion final de 25 mM.
2. Muestras de medicion
Los espedmenes negativos para AL utilizadas fueron una muestra normal, Coagtrol N (SYSMEX CORPORATION), plasma de 11 donantes sanos (SUNFCO LTD.), plasma heparinizado de 1 paciente (plasma preparado mediante la adicion de heparina no fraccionada (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) a Coagtrol N a una concentracion final de 0,5 U/ml), plasma de 3 pacientes que tienen una deficiencia del factor de coagulacion (George king Bio-Medical, Inc), y plasma de 2 pacientes a los que se ha administrado warfarina (George king Bio-Medical, Inc).
Los espedmenes positivos para AL utilizados fueron plasma de 11 pacientes positivos para AL (SUNFCO LTD). 3. Medicion de los tiempos de coagulacion
Se prepararon dos grupos de 50 pl de los espedmenes. Los espedmenes de uno de los grupos se mezclaron con 50 pl del primer reactivo parcial. Los espedmenes del otro grupo se mezclaron con 50 pl del tercer reactivo parcial. Las mezclas resultantes se calentaron a 37 °C durante 3 minutos. A continuacion, dichas mezclas se mezclaron con 50 pl del segundo reactivo parcial (o el cuarto reactivo parcial) y se midio el tiempo de coagulacion. El tiempo de coagulacion se midio con un analizador de coagulacion automatico "Coagrex-800" (Shimadzu Corp.).
4. Calculo de la relacion de lupus
La relacion del lupus se calculo a partir de los tiempos de coagulacion obtenidos midiendo el tiempo de coagulacion de cada especimen de acuerdo con la ecuacion siguiente.
Ecuacion: (Relacion de lupus) = (b/a)/(d/c)=bc/ad
(en la ecuacion, a, b, c y d respectivamente representan los valores medidos del siguiente modo: a: tiempo de coagulacion obtenido del especimen de AL y los reactivos LA-H; b: tiempo de coagulacion obtenido del especimen de AL y el reactivo LA-L; c: tiempo de coagulacion obtenido de la muestra normal y los reactivos LA-H; y d: tiempo de coagulacion obtenido de la muestra normal y el reactivo LA-L).
La distribucion de la relacion de lupus relativa a cada uno de los reactivos para la deteccion de AL que se ha calculado a partir del especimen negativo a AL y el especimen positivo a AL se muestra en las Figuras 1 a 3. Las figuras 1 a 3 muestran que la relacion de lupus del especimen positivo a AL se incrementa en el sistema de medicion usando el reactivo que contiene sal de metal alcalino. Por lo tanto, se ha confirmado que el kit de reactivos para la deteccion de AL de la presente invencion puede separar mas claramente el especimen positivo para AL del especimen negativo a a L en comparacion con los kits de reactivos convencionales que no contienen sal de metal alcalino.
Claims (8)
1. Un kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico que comprende:
un primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; y
un segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion;
donde al menos uno del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene sal de metal alcalino y
el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene sal de metal alcalino a una concentracion inferior a la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o no contiene sal de metal alcalino; donde el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpido y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpido a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; y
donde el primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en acido elagico, celite y sflice.
2. El kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la sal de metal alcalino es sal de metal alcalino de acido inorganico.
3. El kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la sal de metal alcalino es sal de sodio o sal de potasio.
4. El kit de reactivos para la deteccion de anticoagulante lupico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas un tercer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene sal de calcio.
5. Un metodo para determinar la presencia o ausencia de anticoagulante lupico que comprende las etapas de: mezclar un especimen que se obtiene de un sujeto con un primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene una sal de metal alcalino para medir el primer tiempo de coagulacion;
mezclar el especimen con un segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion que contiene una sal de metal alcalino a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion o que no contiene una sal de metal alcalino para medir el segundo tiempo de coagulacion, donde el primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpido y el segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contiene fosfolfpido a una concentracion menor que la del primer reactivo de medicion del tiempo de coagulacion; y
determinar si el AL esta contenido en el especimen basandose en la diferencia o la relacion entre el primer y el segundo tiempo de coagulacion medidos;
donde el primer y segundo reactivo de medicion del tiempo de coagulacion contienen un activador seleccionado del grupo que consiste en acido elagico, celite y sflice.
6. El metodo de determinacion de la presencia o ausencia de anticoagulante lupico de acuerdo con la reivindicacion 5, donde
se determina si el anticoagulante lupico esta contenido en el especimen mediante la comparacion de un valor obtenido basandose en la diferencia o la relacion entre dichos primero y segundo tiempos de coagulacion a un valor umbral predeterminado, donde dicho valor umbral se determina en base a una relacion entre el tiempo de coagulacion del especimen obtenido del sujeto y el tiempo de coagulacion del plasma normal.
7. El metodo de determinacion de la presencia o ausencia de anticoagulante lupico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, donde la sal de metal alcalino es sal de metal alcalino de acido inorganico.
8. El metodo de determinacion de la presencia o ausencia de anticoagulante lupico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde la sal de metal alcalino es sal de sodio o sal de potasio.
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