ES2695161T3 - Administración de agentes terapéuticos mediante una proteína de unión a colágeno - Google Patents

Administración de agentes terapéuticos mediante una proteína de unión a colágeno Download PDF

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Sagaya Theresa Leena Philominathan
Ranjitha Katikaneni
Osamu Matsushita
Tulasi Ponnapakkam
Takaki Koide
Robert C Gensure
Nozomu Nishi
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Kagawa University NUC
University of Arkansas
Montefiore Medical Center
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Kitasato Institute
Kagawa University NUC
University of Arkansas
Montefiore Medical Center
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Abstract

Una composición que comprende un segmento polipeptídico de unión a colágeno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP para su uso en un método para tratar la alopecia areata en un sujeto que necesita crecimiento del cabello, que comprende administrar la composición a un sujeto para aumentar el crecimiento del cabello.

Description

DESCRIPCION
Administracion de agentes terapeuticos mediante una protema de union a colageno
Introduccion
La administracion de agentes terapeuticos a los puntos del organismo de un sujeto donde se necesita un agente terapeutico concreto para que sea eficaz en un campo en desarrollo. Dichos sistemas de administracion permitiran un uso mas eficaz de los agentes terapeuticos, con menos toxicidad derivada de algunos agentes terapeuticos. El uso de liposomas o polipeptidos dirigidos, como los anticuerpos, para dirigir agentes terapeuticos a sitios concretos del organismo ha mostrado tener exito, pero se necesitan agentes adicionales.
La alopecia (perdida de cabello) es un evento perturbador tanto fisiologica como emocionalmente con multiples causas. La alopecia se produce con mayor frecuencia en la calvicie de patron masculino, que afecta a aproximadamente dos tercios de los varones de aproximadamente 35 anos de edad; se observa un patron de perdida de cabello similar en mujeres con smdrome de ovarios poliqmsticos. En ambos trastornos, la perdida de cabello esta mediada por androgenos. La alopecia tambien se puede producir como enfermedad autoinmunitaria, denominada alopecia areata; un trastorno que afecta al 1,7 % de la poblacion. Puede producirse como efecto secundario de tratamientos medicos, especialmente en la quimioterapia, donde un 65-85 % de los pacientes de quimioterapia experimentan algun grado de alopecia. Las consecuencias psicologicas de la perdida de cabello se han estudiado bien en el escenario de la quimioterapia. La alopecia inducida por quimioterapia (AIQ) puede producir ansiedad, depresion, una imagen corporal negativa, una menor autoestima y una menor sensacion de bienestar. De hecho, 47­ 58 % de las mujeres pacientes de cancer consideran la perdida de cabello el aspecto mas traumatico de la quimioterapia, y un 8 % declinana el tratamiento por temor a la perdida de cabello. Ademas de estos estudios en pacientes de quimioterapia, existen evidencias de otras formas de alopecia que respaldan la terapia para reducir las consecuencias psicologicas de la perdida de cabello. De esta forma, sena beneficioso disponer de un nuevo tratamiento para detener la perdida de cabello o acelerar el recrecimiento del cabello.
Aunque se han utilizado farmacos con efectos antiandrogenicos suaves (es decir, espironolactona) con un exito limitado como terapia para la alopecia, la primera medicacion eficaz para la alopecia fue minoxidil (Rogaine). Este antihipertensivo tiene un efecto secundario adverso de producir el crecimiento del cabello, y en la actualidad se utiliza como una terapia topica para muchas formas de alopecia. Sin embargo, las respuestas son incompletas, donde algunos sujetos solamente muestran una ralentizacion de la perdida de cabello en lugar de un recrecimiento real. Finasteride (Propecia) es un agente novedoso que bloquea conversion de testosterona en dihidrotestosterona, dando como resultado una mejora de la alopecia androgenica a costa de un bloqueo parcial del sistema de los androgenos. Sin embargo, las tasas de respuesta a largo plazo (10 anos) son solo de aproximadamente un 50 %. En su conjunto, a pesar de una importante investigacion en este campo, sigue sin haber una terapia adecuada para la perdida de cabello.
Ademas, el crecimiento del vello indeseado es una cuestion estetica que muchas personas afrontar de forma regular. El vello no deseado en la cara, piernas, brazos, torso o espalda es un creciente problema cosmetico. Muchas personas utilizan terapia con laser, cera u otras terapias para eliminar el vello no deseado. En la actualidad no existe ningun principio farmaceutico que limite el crecimiento del vello.
Las colagenopatfas representan una gran cantidad de enfermedades en las que la formacion o la estructura del colageno no son normales. Este grupo de enfermedades da como resultado una amplia gama de smtomas entre los que se incluyen defectos oseos, defectos vasculares, y defectos en la piel. Muchas de estas enfermedades no tienen tratamiento, o los tratamientos disponibles son ineficaces.
Por ejemplo, la osteogenesis imperfecta (OI), tambien conocida como enfermedad de los huesos de cristal, esta producida por una mutacion congenita en el colageno de tipo I. Aproximadamente de 25.000 a 50.000 estadounidenses estan afectados y los efectos de la enfermedad van de leves, en los que muchas personas no son conscientes de la enfermedad, a graves, en los que las personas no pueden llevar una vida normal debido a las fracturas oseas recurrentes. La mayona de pacientes de Ol tienen una mutacion que produce un cambio de aminoacido en el colageno, que cambia una glicina por un aminoacido mas voluminoso, lo que da como resultado una perturbacion en la estructura de triple helice del colageno y una torsion deficiente. El organismo puede responder hidrolizando el colageno, y esto puede dar como resultado una reduccion en la resistencia osea. En la actualidad no existe cura y pocos tratamientos para la OI.
Sumario
La invencion proporciona una composicion que comprende un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP para su uso en un metodo para tratar la alopecia areata en un sujeto que necesita crecimiento del cabello que comprende administrar la composicion a un sujeto para aumentar el crecimiento del cabello.
Se divulgan en el presente documento metodos para administrar agentes terapeuticos, mediante la administracion de composiciones que incluyen segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido al agente terapeutico a los sujetos que necesitan tratamiento con el agente terapeutico. En estos metodos, el agente terapeutico no es un agonista o antagonista del receptor PTH/PTHrP, factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) o factor de crecimiento epidermico (EGF), y el segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano suministra el agente a los sitios donde el colageno esta parcialmente desenrollado o poco enrollado. Tambien se divulgan en el presente documento metodos para tratar un sujeto con una colagenopatfa, tal como osteogenesis imperfecta, mediante la administracion de una composicion que comprende un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar la colagenopatfa, que se proporciona. El segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano suministra el agente a los sitios donde el colageno esta parcialmente desenrollado o poco enrollado.
En otro aspecto mas de la presente divulgacion, se proporcionan metodos para tratar el hiperparatiroidismo mediante la administracion de una composicion que comprende un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto.
En otro aspecto adicional de la presente divulgacion, se proporcionan metodos para ralentizar el crecimiento o el recrecimiento del vello tras la depilacion mediante la administracion de una composicion que comprende un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto.
En un aspecto mas de la presente divulgacion, se proporcionan metodos para aumentar el crecimiento del cabello o la velocidad del recrecimiento del cabello despues de la perdida o la depilacion mediante la administracion de una composicion que comprende un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un alineamiento de secuencias que muestra el alineamiento de varias colagenasas bacterianas M9B procedentes de las familias de Bacillus y Clostridium. Los restos mostrados en azul son importantes para la actividad de union del colageno, los mostrados en verde son importantes para mantener la arquitectura o el plegado de protema. Ambos grupos tambien estan subrayados para las secuencias superior e inferior. Los restos mostrados en rojo son fundamentales para la union a Ca2+ y los de color naranja son fundamentales para colocar los residuos de union a Ca2+.
La Figura 2 es un conjunto de dibujos que muestran las estructuras qrnmicas de los peptidos sintetizados.
La Figura 3A es un grafico que muestra el espectro de dicrofsmo circular, de los peptidos colagenosos medidos a 4°C.
La Figura 3B es un grafico que muestra el perfil de desnaturalizacion termica de varios peptidos colagenosos. La temperatura se aumento a una velocidad de 0,3°C/min.
La Figura 4A es un grafico que muestra el perfil de dispersion con la intensidad I(Q) representado graficamente contra el vector de dispersion Q.
La Figura 4B es un grafico que muestra la funcion de distribucion par-distancia P(r) en el espacio real obtenido usando GNOM para el complejo [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3:CBD (Rojo), complejo [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3:CBD (Azul), complejo [PROXYL-(POG)5 POA(POG)4j:CBD (Verde), complejo [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3:CBD (Naranja) y complejo [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3:CBD (Cian).
La Figura 5 es un conjunto de graficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones entre el dominio de union a colageno (CBD) - peptido colagenoso. La Figura 5A muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)io]3:CBD (verde) en una relacion 1:1. La resonancia de amida de V973, G975 y S979 estan presentes en esta titulacion. La Figura 5B muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de V973, G975 y S979 desaparecieron debido a su proximidad con el grupo de espm marcado. La Figura 5C es un diseno que muestra la estructura de y de los restos CBD que tienen la lmea engrosada despues de la titulacion con [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3.
La Figura 6 es un conjunto de graficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones CBD -peptido colagenoso. La Figura 6A muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1o]3:CBD (verde) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de Q972, V973, G975 y S979 estan presentes en esta titulacion. La Figura 6B muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de Q972, V973, G975 y S979 tienen la lmea engrosada debido al resto PROXYL. La Figura 6C es un diseno de la estructura de CBD que muestra los restos CBD que tienen la lmea engrosada de forma unica despues de la titulacion con [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3. La Figura 6D muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)io]3:CBD (verde) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de L946, Q972, V973, G975 y S979 estan presentes en esta titulacion. La Figura 6E muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(Po G)4Po A(POG)5]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de L946, Q972, v 973, G975 y S979 desaparecieron debido a la marca de espm. La Figura 6F muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)4POA(POG)5]3:CBD (cian) en una relacion 1:1. En ausencia de la marca de espm, las resonancias de la amida de L946, Q972, V973, G975 y S979 no tienen la lmea engrosada. La Figura 6G muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)io]3:CBD (verde) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de L946, G953, Q972, V973, D974, G975, N976, V978, S979 estan presentes durante esta titulacion. La Figura 6H muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de L946, G953, Q972, V973, D974, g 975, N976, V978, S979 tienen la lmea engrosada debido al resto PROXYL. La Figura 6I es un diseno de la estructura de CBD que muestra los restos CBD que tienen la lmea engrosada por la marca de espm de [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3.
La Figura 7 es un conjunto de graficas que muestran la disminucion en la intensidad de (A) Q972, (B) G975, (C) S979 y (D) L924 en CBD en funcion de concentraciones crecientes de minicolageno es decir [(POG)-iob (negro), [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3(rojo), [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3(azul), [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3(verde), y [PROXYL-(POG)3POA(POG)a]3(clan).
La Figura 8 es un conjunto de graficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones CBD -peptido colagenoso. La Figura 8A muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)1o]3:CBD (verde) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 estan presentes en esta titulacion. La Figura 8B muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 tienen la lmea engrosada debido al resto PROXYL. La Figura 8C muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)4POA(POG)5C-carbamidometil]3:CBD (cian) en una relacion 1:1. En ausencia de la marca de espm, las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 no tienen la lmea engrosada. La Figura 8D es un diseno de la estructura de CBD que muestra los restos CBD que tienen la lmea engrosada debido a la marca de espm de [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3. Las resonancias de la amida de S906, S997 y G998 (rojo) desaparecieron tras titulacion con [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3. La Figura 8E muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)io]3:CBD (verde) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de S906, Q972, V973, G975, S979, S997 y G998 estan presentes en esta titulacion. La Figura 8F muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro HSQC 1H-15N del complejo [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. Las resonancias de la amida de S906, Q972, v 973, G975, s 979, S997 y G998 desaparecieron debido a la marca de espm. Figure 8G muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de CBD (negro) y del espectro Hs Qc 1H-15N de [(POG)3PCG(POG)4]3:CBD (cian) en una relacion 1:1. Las resonancias de S906, Q972, V973, G975, S979, S997 y G998 estan intactas en ausencia de la marca de espm. La Figura 8H es un diseno de la estructura de CBD que muestra los restos que tienen la lmea engrosada de forma unica despues de la titulacion con [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3. Solamente las resonancias de amida de S906, R929, S997, y G998 (rojo) desaparecieron en la relacion 0,2:1. Cuando la relacion del peptido aumento hasta 0,3:1, las resonancias adicionales de V973, G975, S979 (azul) desaparecieron.
La Figura 9 es un conjunto de dibujos de estructura derivados de los perfiles de dispersion SAXS usando calculos de hibridacion simulada ab initio para (A) complejo [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3:CBD, (B) complejo [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3:CBD, (C) complejo [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3:CBD y (D) complejo [PROXYL-(POG)aPOA(POG)3]3:CBD, (E) complejo [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3:CBD, (F) [(POG)4POA(POG)5C-carbarnidometil]3:CBD. Los sitios de la mutacion G ly^A la estan destacados. Las Figuras 9g y 9H muestran dos modos de union probables del complejo [11PROXy L-(POG)3PCG(POG)4]3:CBD.
La Figura 10 es un conjunto de graficas que muestran los datos de RMN HSQC usando las interacciones CBD -peptido colagenoso. Figure 10A es una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de [POGPO-15N-G-(POG)s]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N HSQC del complejo [p Og PO-15N-G-(POG)b]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. La Figura 10B muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de [POGpO-15N-G-(POG)2-POA-(POG)5]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N HSQC del complejo [POGPO-15N-G-(POG)2-POA-(POG)5]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. La Figura 10C muestra una superposicion del espectro HSQC 1H-15N de [(POG)s-PO-15N-G-POG]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)s-PO-15N-G-POG]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1. La Figura 10D muestra una superposicion del espectro Hs Qc 1H-15N de [(pOg )4-POA-pO-15N-G-POG]3 (negro) con el espectro HSQC 1H-15N del complejo [(POG)4-POA-PO-15N-G-pOg ]3:CBD (rojo) en una relacion 1:1.
La Figura 11 muestra la distribucion en el tejido de S35 -PTH-CBD 1 hora y 12 horas despues de la inyeccion subcutanea. Destacar el perfilado de la piel.
La Figura 12 es un conjunto de fotograffas que documentan el crecimiento del cabello en la espalda de ratones en el dfa 36 despues de la depilacion, grupos de tratamiento como se indica (Antagonista = PTH(7-33)-CBD, Agonista = PTH-CBD).
La Figura 13 es un conjunto de fotograffas que muestran la histologfa en el Dfa 36 despues del tratamiento indicado. Se tomaron muestras de piel de la region dorsal, que se procesaron para su tincion mediante hematoxilina y eosina (H&E). Se muestran secciones representativas de cada grupo de tratamiento como se indica. (Antagonista = PTH(7-33)-CBD, Agonista = PTH-CBD).
La Figura 14 es un grafico que muestra el recuento de folmulos pilosos segun campo alto potenciado. Los folmulos pilosos en fase anagena Vl se contaron por dos observadores independientes de manera enmascarada. Los resultados se expresan como promedio /- desviacion estandar. **=p<0,01 vs. sin quimio ANOVA seguido por la prueba de Dunnett. (Antagonista = PTH(7-33)-CBD, Agonista = PTH-CBD).
La Figura 15 es un conjunto de fotograffas que muestran el crecimiento del pelo en la espalda de los ratones despues de cada uno de los tratamientos indicados y un grafico que muestra los resultados de un analisis mediante escala de grises del cabello en el sitio de inyeccion con el tiempo despues de la inyeccion.
La Figura 16 es un conjunto de fotograffas que muestran el pelo de la espalda de los ratones despues del tratamiento indicado sin depilacion anterior.
La Figura 17 es un conjunto de fotograffas y un grafico que muestran el analisis en escala de grises del crecimiento de pelo en la espalda de los ratones que comparan los tratamientos indicados con el PTH-CBD administrado antes de la quimioterapia en contraposicion a despues de comenzar la quimioterapia.
La Figura 18 es una fotograffa de tres ratones 13 dfas despues de la aplicacion de cera para eliminar el pelo y el tratamiento con PTH-CBD, PTH antagonista-CBD o vetffculo solo.
La Figura 19 es un conjunto de fotograffas de ratones que muestran recrecimiento del cabello en un modelo de alopecia areata despues del tratamiento con un control o con PTH-CBD.
La Figura 20 es un grafico que muestra los niveles de hormona paratiroidea en ratas envejecidas ovariectomizadas que recibieron una inyeccion con una sola dosis de PTH-CBD humano 6 meses antes del sacrificio.
Descripcion detallada
Se proporcionan en el presente documento metodos para suministrar un agente terapeutico mediante la administracion de una composicion que comprende un segmento polipepffdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agente terapeutico a un sujeto que necesita tratamiento con el agente terapeutico. En esta realizacion, el agente terapeutico no es un agonista o antagonista del receptor PTH/PTHrP, u no es un polipeptido bFGF o EGF. El segmento polipepffdico de union a colageno de origen bacteriano suministra el agente terapeutico a los sitios donde el colageno esta parcialmente desenrollado o poco enrollado. La presente invencion se define en las reivindicaciones.
Ademas, se proporcionan metodos para tratar colagenopaffas, tales como la osteogenesis imperfecta (OI), mediante la administracion de una composicion que comprende un segmento polipepffdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto que necesita tratamiento para la colagenopaffa. Las colagenopaffas incluyen aunque no de forma limitativa osteogenesis imperfecta, smdrome de Stickler, smdrome de Ehlers-Danlos, smdrome de Alport, enfermedad de Caffey, y danos localizados en el colageno o en el carfflago. Muchas de estas enfermedades estan causadas por defectos geneticos que dan como resultado que el colageno de algunos tejidos quede poco enrollado o parcialmente enrollado.
Por ejemplo, los individuos con OI tienen una mutacion que produce un cambio de aminoacido en el colageno, que cambia una glicina por un aminoacido mas voluminoso, lo que da como resultado una perturbacion en la estructura de triple helice del colageno y una torsion deficiente del colageno. En los Ejemplos, los inventores demuestran que los polipeptidos bacterianos de union a colageno descritos en el presente documento se dirigen y se unen a estas zonas de colageno poco enrollado. Por lo tanto, el uso de los polipeptidos de union a colageno descritos en el presente documento para administrar un agente terapeutico capaz de tratar la OI a los sitios del colageno poco enrollado puede permitir un tratamiento mas eficaz.
El segmento de polipeptido de union a colageno y el agente terapeutico pueden reticularse qmmicamente entre sf o pueden ser porciones polipepffdicas de una protema de fusion. Las expresiones "protema de fusion" y "polipeptido de fusion" se pueden utilizar para referirse a un unico polipeptido que comprende dos segmentos funcionales, por ejemplo, un segmento de polipeptido de union a colageno y un agente terapeutico de tipo polipeptido, tal como un segmento polipepffdico de un receptor PTH/PTHrP. Las protemas de fusion pueden tener cualquier tamano, y el unico polipeptido de la protema de fusion puede encontrarse en una forma multimerica en su estado funcional, por ejemplo, mediante una conexion de disulfuro de cistema de dos monomeros del polipeptido unico. Un segmento polipepffdico puede ser un polipeptido sintetico o un polipeptido de origen natural. Dichos polipeptidos pueden ser una porcion de un polipeptido o pueden comprender una o mas mutaciones. Los dos segmentos polipepffdicos de las protemas de fusion pueden unirse directa o indirectamente. Por ejemplo, los dos segmentos pueden unirse directamente mediante, por ejemplo, un enlace pepffdico o reticulacion qmmica, o indirectamente, a traves de, por ejemplo, un segmento enlazador o polipeptido enlazador. El enlazador pepffdico puede tener cualquier longitud y puede incluir aminoacidos tradicionales y no tradicionales. Por ejemplo, el enlazador pepffdico puede tener 1 -1 o0 aminoacidos de longitud, de forma adecuada tiene 5, 10, 15, 20, 25 o mas aminoacidos de longitud de tal forma que la porcion de union a colageno del polipeptido de fusion puede mediar en la union de colageno y el agente terapeutico puede tener su efecto terapeutico. Los enlazadores pepffdicos pueden incluir aunque no de forma limitativa un dominio PKD (enfermedad del rinon poliqmstico) procedente de una colagenasa u otra protema tal como en la SEQ ID NO: 2, un GST o etiqueta His, o un enlazador Ser o Gly.
El segmento polipepffdico de union a colageno es un polipeptido que se une al colageno y puede ser parte de una protema de fusion mas grande, agente bioactivo, o agente farmaceutico. La determinacion de si una composicion, segmento polipepffdico, protema de fusion, o agente farmaceutico o bioactivo, se une al colageno, se puede llevar a cabo como se describe en la publicacion de patente estadounidense n.° 2010/0129341. Brevemente, Se incuba con colageno en tampon de union, y la mezcla se filtra a continuacion a traves de un filtro que permitiffa que pasara a su traves, pero que bloquea el colageno y por lo tanto retiene los materiales que se unan al colageno. A continuacion, el filtrado se analiza para determinar la presencia de la composicion, segmento polipeptidico, protema de fusion, o agente farmaceutico o bioactivo. De manera adecuada, al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o de forma mas adecuada al menos un 99 % de la composicion de union a colageno, segmento polipeptidico, protema de fusion, o agente farmaceutico o bioactivo queda retenido por el filtro en este ensayo, en comparacion a cuando la filtracion se realiza sin colageno.
El segmento polipeptidico de union a colageno puede ser un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano. Puede ser un segmento polipeptidico de union a colageno de Clostridium. El segmento polipeptidico de union a colageno puede ser un segmento de una colagenasa, o una colagenasa bacteriana, o una colagenasa de Clostridium. De forma adecuada, el segmento polipeptidico es solamente una parte de la colagenasa y el segmento polipeptfdico de union a colageno no tiene actividad colagenasa. El polipeptido de union a colageno puede ser una protema de union a colageno M9B bacteriana (incluidas las derivadas de Bacillus spp. y Clostridium spp.) o una M9A (incluidas las derivadas de Vibrio spp.), o un peptido de union a colageno derivado de dicha protema. Por "derivada de", los autores entienden que el peptido es un fragmento de la protema de longitud completa, un peptido que tiene cambios en los aminoacidos con respecto a la protema natural o una combinacion de los mismos. La clave es que el peptido retiene la capacidad de unirse al colageno. Por ejemplo, un peptido se puede derivar de una protema seleccionando una region de la protema capaz de unirse al colageno. Las composiciones que incluyen una colagenasa bacteriana como peptido de union al colageno se describen en la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 2010/0129341.
La Figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de la region de union al colageno de varias protema de union a colageno M9B de origen bacteriano como las SEQ ID NOs: 13-34. Como se puede observar en el alineamiento de secuencias, estas protemas tienen una cantidad relativamente pequena de identidad de secuencia (aproximadamente un 30 %), pero todas ellas se unen al colageno de una forma similar y se cree que tienen similar conformacion como se analiza en los Ejemplos. Asf, cualesquiera de los peptidos mostrados en la Figura 1 o fragmentos de union a colageno de los mismos se pueden usar en las composiciones y metodos descritos en el presente documento. En la Figura 1, los restos de aminoacidos fundamentales para la conformacion del peptido y para la actividad de union a colageno estan subrayados y se muestran en color verde y azul, respectivamente. Los restos de aminoacidos clave para la union al colageno son una tirosina o fenilalanina en la posicion 970 de ColG, la posicion 977 de la secuencia ColH de la SEQ ID NO: 1 (posicion 937 en la Figura 1) o una posicion similar en una de las secuencias mostradas en la Figura 1; una tirosina en la posicion 994 de ColG, la posicion 1000 de la secuencia ColH de la SEQ ID NO: 1 (posicion 962 de la Figura 1) o una posicion similar en una de las secuencias mostradas en la Figura 1; una tirosina, fenilalanina o histidina en la posicion 996 de ColG, posicion 1002 de la secuencia ColH de la SEQ ID NO:1 (posicion 964 de la Figura 1) o una posicion similar en una de las secuencias mostradas en la Figura 1. Asf, un peptido con una identidad de secuencia relativamente baja, que comparte la estructura y funcion de la protema ColG tambien se puede usar como dominio de union al colageno (CBD) del presente documento.
En una realizacion, la colagenasa es ColH, SEQ ID NO: 6. El segmento polipeptfdico de union a colageno puede ser o puede incluir los restos 901-1021 de la SEQ ID NO:6 (restos 34-158 de la SEQ ID NO:1), o un fragmento de los restos 34-158 de la SEQ ID NO:1 de al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 aminoacidos de longitud. El segmento polipeptfdico de union a colageno es al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o al menos un 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos 98 %, o al menos un 99 % identico a los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1. El segmento polipeptfdico de union a colageno puede ser o puede incluir los restos 807-1021 de la SEQ ID NO:6 (restos 37-251 de la SEQ ID NO:2), o un fragmento de los restos 807-1021 de la SEQ ID NO:6 de al menos 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 aminoacidos de longitud. Los restos 807-901 comprenden el dominio de la enfermedad del rinon poliqmstico (PKD) de la protema de union a colageno. Los expertos en la materia apreciaran que se podnan utilizar otros enlazadores para unir el peptido de union al colageno a un agente terapeutico, como se resalta anteriormente. El segmento polipeptfdico de union a colageno puede ser o puede comprender un fragmento de los restos 901-1021 de la SEQ ID n O:6, por ejemplo, un fragmento de al menos 8, al menos 10, al menos 20, a menos 30, al menos 40, o al menos 50 restos de aminoacidos consecutivos de los restos 901-1021 de la SEQ ID NO:6. De forma adecuada, el polipeptido de union a colageno consiste en los restos 894-1008, 894-1021, 901-1021, o 901-1008 de la SEQ ID NO: 6 o un homologo de la misma como se muestra mediante el alineamiento de secuencias de la Figura 9.
Entre otras protemas, el segmento de union a colageno se puede derivar de ColG (Matsushita et al., (1999) J. Bacteriol.
181:923-933), una colagenasa de clase I procedente de Clostridium histolyticum. ColH es una colagenasa de clase II (Yoshihara et al., (1994) J. Bacteriol. 176: 6489- 6496). El segmento polipeptfdico de union a colageno tambien puede ser un fragmento polipeptfdico procedente de una cualquiera de las secuencias de protemas proporcionadas en la Figura 1 que se alinea con los peptidos de union al colageno de Clostridium y Bacillus. Los expertos en la tecnica apreciaran que otros miembros de esta familia de protemas de union al colageno puede ser de utilidad en los metodos descritos en el presente documento.
Los agentes terapeuticos unidos al polipeptido de union a colageno pueden ser cualquier principio farmaceutico o cualquier otro principio activo adecuado, incluidos, aunque no de forma limitativa, promotores osteogenicos, antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, polipeptidos tales como protemas recombinantes, citoquinas o anticuerpos, sustancias qmmicas de molecula pequena, o cualquier combinacion de los mismos. De manera adecuada, los agentes terapeuticos son capaces de promover el crecimiento del hueso, disminuir la inflamacion, promover la estabilidad del colageno. De manera adecuada, el agente terapeutico es uno de aquellos que tienen efecto terapeutico en la region del colageno o del colageno danado. El agente terapeutico puede incluir, aunque no de forma limitativa, protema morfogenica osea (BMP), G-CSF, FGF, BMP-2, BMP-3, FGF-2, FGF-4, anticuerpo contra la esclerosina, hormona de crecimiento, IGF-1, VEGF, TGF-p, KGF, FGF-10, TGF-a, TGF-P1, receptor TGF-p, CT, GH, GM-CSF, EGF, PDGF, celiprolol, activinas, y factores de crecimiento del tejido conectivo. En realizaciones alternativas, el principio activo puede ser un agonista o antagonista del receptor PTH/PTHrP.
La perdida de hueso debido a una colagenopatfa tal como osteogenesis imperfecta, smdrome de Stickler u otros, que ponen a una persona en riesgo elevado de una fractura de hueso debido a un defecto en el colageno se podna tratar mediante la administracion de un peptido anabolico del hueso. El CBD puede dirigir los agentes anabolicos del hueso a los sitios donde el colageno esta incorrectamente formado y, de esta forma, puede prevenir la fractura.
La fragilidad vascular debido a defectos tal como el smdrome de Ehlers-Danlos de tipo IV, smdrome de Alport, u otras enfermedades donde la rotura de los vasos sangumeos es mas probable debido a un defecto en la formacion de colageno, se pueden administrar peptidos que estimulan el crecimiento o la reparacion vascular. El CBD dirigira el peptido a las zonas con el colageno danado y es probable que estas areas tengan vasos danados. Los agentes terapeuticos estimularan el crecimiento y la reparacion en el sitio del dano y evitaran la rotura de los vasos.
La fragilidad de la piel debida a trastornos tales como el smdrome de Ehlers-Danlos, enfermedad de Caffey u otras enfermedades donde el debilitamiento de la piel debido a un defecto del colageno produce hiperelasticidad, formacion rapida de hematomas o mala cicatrizacion de heridas. Los factores de crecimiento dermicos y epidermicos pueden servir como agentes terapeuticos que cuando se unen al CBD y se administran a las zonas con el colageno danado estimularan el crecimiento y la reparacion de la piel, evitando las estnas y mejorando la cicatrizacion.
Los defectos del colageno tambien pueden producir malformacion o insuficiencia del cartflago. Los factores de crecimiento del cartflago se podnan administrar localmente a los sitios con el cartflago danado para ayudar en la reparacion y restaurar la funcion.
El segmento polipeptfdico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser un polipeptido sintetico o un polipeptido de origen natural. Dichos polipeptidos pueden ser una porcion de un polipeptido o pueden comprender una o mas mutaciones. Las mutaciones pueden convertir el agonista del receptor PTH/PTHrP en un agonista mejor o peor, en comparacion con el PTH/PTHrP natural. La actividad agonista con el receptor PTH/PTHrP se puede someter a ensayo como se describe en el Ejemplo 3, mas adelante, mediante un ensayo de estimulacion de AMPc. Un agonista estimulara la smtesis de AMPc en el ensayo descrito. De manera adecuada, un agonista puede activar la actividad del receptor en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o incluso un 110 % o 120 % de lo que hana el PTH(1-34) natural.
El segmento polipeptfdico agonista del receptor PTH/PTHrP es un segmento polipeptfdico PTH o PTHrP. Una isoforma humana de PTH es la SEQ ID NO:7. Una isoforma humana de PTHrP es la s Eq ID NO:8. Aunque se proporcionan isoformas humanas, los expertos en la materia apreciaran que tambien se pueden utilizar otras isoformas no derivadas de seres humanos. Dichas isoformas no derivadas de seres humanos pueden ser capaces de interactuar con el receptor PTH/PTHrP y viceversa. El segmento polipeptfdico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-33 de la SEQ ID NO:1 (restos 1- 33 de PTH (SEQ ID NO:7)). El segmento polipeptfdico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-34 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, es un fragmento de los restos 1-34 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, el segmento polipeptfdico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-84 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, el segmento polipeptfdico agonista del receptor PTH/PTHrP puede ser o puede incluir los restos 1-14 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones adicionales, el agonista del receptor PTH/PTHrP es un segmento polipeptfdico de PTH o PTHrP de cualquier otra especie.
El antagonista del receptor PTH/PTHrP puede incluir en una realizacion PTH(7-34), es decir, los restos 7-34 de PTH (SEQ ID NO:7). En otra realizacion, es, o incluye, los restos 7-33 de PTH (SEQ ID NO:7). En otras realizaciones, es un fragmento o los restos 7-34 de la SEQ ID NO: 8. En otra realizacion, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye PTH(7-14), es decir, los restos 7-14 de PTH (SEQ ID NO:7). En otra realizacion, los antagonistas del receptor PTH/PTHrP incluyen ((-1)-33) de PTH/PTHrP. En otra realizacion, los antagonistas del receptor PTH/PTHrP incluyen los restos 1-14 de PTH con una extension en el extremo N. La adicion de una extension en el extremo N a PTH o fragmentos activos en el extremo N de PTH convierte los peptidos PTH en antagonistas. La extension en el extremo N puede tener 1, 2, 3, 4, 5, o mas aminoacidos de longitud. La identidad de los aminoacidos de la extension del extremo N no suele ser importante. En una realizacion, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye los restos 1-33 de PTH con una extension Gly-Ser en el extremo N (SEQ ID NO:11). En otra realizacion, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye PTHrP(7-34), es decir, los restos 7-34 de la SEQ ID NO:8, o un fragmento de los restos 7-34 de la SEQ ID NO:8. En otra realizacion, el antagonista del receptor PTH/PTHrP incluye TIP(7-39) de raton (vease Hoare S R, Usdin T B. 2002. Specificity and stability of a new PTh 1 receptor antagonist, mouse TIP(7-39). Peptides 23:989­ 98.). Otros antagonistas del receptor PTH/PTHrP que se pueden utilizar en las protemas de fusion tambien se divulgan en Hoare et al. El antagonista del receptor PTH/PTHrP puede ser un fragmento de al menos 8, 10, 12 o mas aminoacidos procedentes de los restos 1-34 de la SEQ ID NO:7. En otras realizaciones, el antagonista del receptor PTH/PTHrP puede ser el polipeptido antagonista del receptor PTH/PTHrP procedente de otra especie.
En una realizacion, el agente terapeutico o el antagonista del receptor PTH/PTHrP o el segmento polipeptfdico antagonista esta en el extremo N con respecto al segmento polipeptfdico de union a colageno de la protema de fusion. Es decir, cada uno de los dos segmentos polipeptfdicos tiene un extremo N y un extremo C, y el extremo N del segmento polipeptfdico de union a colageno esta unido directa o indirectamente, por ejemplo, mediante un segmento polipeptfdico enlazador (tal como un enlazador de PKD, glicina o serina) con el extremo C del agente terapeutico o segmento polipeptfdico agonista o antagonista de PTH/PTHrP.
Las protemas de fusion anteriormente descritas que comprenden (a) un segmento polipeptfdico de union a colageno unido a (b) un agente terapeutico o un segmento polipeptfdico agonista o antagonista de PTH/PTHrP se pueden sustituir por agentes farmaceuticos que comprenden (a) un segmento polipeptfdico de union a colageno unido a (b) un agente terapeutico o agonista del receptor PTH/PTHrP o un agonista del receptor PTH/PTHrP no peptidflico. Un ejemplo de un agonista del receptor PTH/PTHrP no peptidflico es el compuesto AH3960 (Rickard et al., (2007) Bone 39:1361-1372).
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AH3960 contiene dos grupos amino. Los grupos amino de moleculas qufmicas pequenas tales como AH3960 se pueden usar para reticular el agente terapeutico a los grupos amino del segmento polipeptfdico de union a colageno mediante un reticulante tal como DSG (glutarato de disuccinimidilo) o mediante una combinacion de SANH (succinimidil-4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona) y SFB (benzoato de succinimidil-4-formilo). Los agentes terapeuticos se pueden reticular por su grupo amino a un grupo carboxilo del segmento polipeptfdico de union a colageno mediante EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) o viceversa. Estos productos de reticulacion estan disponibles de Pierce (piercenet.com, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, III.). Los protocolos y las condiciones de reaccion tambien estan disponibles en la bibliograffa del producto de Pierce (piercenet.com).
En otra realizacion de los agentes farmaceuticos que comprenden (a) un segmento polipeptfdico de union a colageno; unido a (b) un agente terapeutico polipeptfdico o un segmento polipeptfdico agonista o antagonista de PTH/PTHrP, el segmento (a) y el segmento (b) son polipeptidos independientes, y los dos polipeptidos estan unidos mediante reticulacion qufmica. Los dos polipeptidos pueden estar reticulados mediante grupos amino por reactivos que incluyen DSG (glutarato de disuccinimidilo) o glutaraldehfdo. Tambien se pueden reticular mediante grupos amino mediante derivatizacion de un polipeptido con SANH (succinimidil-4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona) y el otro con SFB (benzoato de succinimidil-4-formilo), y mezclando despues ambos polipeptidos derivatizados para su reticulacion. Los dos polipeptidos se pueden reticular entre un grupo amino de un polipeptido y un carboxilo del otro mediante reaccion con EDC (clorhidrato de (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida). Los polipeptidos tambien se pueden reticular (por ejemplo, acoplarse covalentemente) mediante cualquier otro metodo adecuado conocido de una persona normalmente experta en la materia. Estos reactivos de reticulacion estan disponibles de Pierce (piercenet.com, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, III.). Los protocolos y las condiciones de reaccion tambien estan disponibles en la bibliograffa del producto de Pierce (piercenet.com). Estos y otros metodos de reticulacion aplicables se describen en las solicitudes publicadas de patente de Estados Unidos 2006/0258569 y 2007/0224119.
En el presente documento tambien se proporcionan metodos para tratar el hiperparatiroidismo mediante la administracion de PTH-CBD a un sujeto que necesita tratamiento para el hiperparatiroidismo. En una realizacion, la PTH administrada a un sujeto puede ser una PTH de una especie diferente. Como se muestra en los Ejemplos, una unica administracion de CBD-PTH a ratas envejecidas ovariectomizadas puede reducir la cantidad de p Th endogena producida por el animal. Por lo tanto, la administracion de PTH-CBD a personas que padecen hiperparatiroidismo puede producir una disminucion de los smtomas asociados con el hiperparatiroidismo y tener niveles menores de PTH despues de la administracion de PTH-CBD.
Los efectos de los agonistas y antagonistas de PTH sobre el crecimiento del cabello se han estudiado durante al menos 15 anos. La PTH tiene un receptor comun con el peptido relacionado con PTH (PTHrP), que normalmente esta producido por los fibroblastos dermicos. PTHrP afecta la proliferacion y diferenciacion de los queratinocitos, y modula el ciclo del cabello. La mayona de los ensayos realizados sobre los efectos de crecimiento del cabello se han realizado con antagonistas de PTH, donde las indicaciones de los ensayos iniciales eran que estos eran los agentes mas eficaces. Las formulaciones tanto inyectadas como topicas se han sometido a ensayo en modelos animales de alopecia inducida por quimioterapia y en el raton SKH-1 sin pelo. Parte del efecto de los antagonistas de PTH sobre el crecimiento del cabello es la transicion de los folmulos pilosos a un estado catageno distrofico, que los protege de danos derivados de la quimioterapia. Sin embargo, los ensayos clmicos con antagonistas de PTH por via topica para la alopecia inducida por quimioterapia realizados por IGI Pharmaceuticals se interrumpieron en la Fase 2 debido a su eficacia limitada. Por tanto, se necesitan nuevas composiciones contra la alopecia.
Los problemas de administracion y retencion de PTH a la piel se pueden superar usando analogos de PTH dirigidos al colageno. Para conseguir esto, los inventores sintetizaron varias protemas de fusion con diferentes agonistas y antagonistas de PTH enlazados a un dominio de union a colageno derivado de la colagenasa ColHI de Clostridium histolyticum. En los estudios descritos en los Ejemplos, los inventores descubrieron que el compuesto agonista PTH-CBD fomenta la transicion de los folmulos pilosos a la fase anagena, y tiene efectos potentes sobre el crecimiento del cabello. El compuesto antagonista PTH(7-33)-CBD tiene poco efecto sobre el crecimiento del cabello en modelos de quimioterapia, y tiene un efecto perjudicial sobre el recrecimiento del vello despues de la depilacion. Compuestos tales como PTH-CBD, que fomentan la transicion de los folmulos pilosos a la fase anagena, han sido muy deseados debido a su potencial para tratar una gran variedad de trastornos de perdida de cabello. PTH-CBD parece tener un mecanismo de accion similar a la ciclosporina, que tambien fomenta la transicion de los folmulos pilosos a la fase anagena, aunque es menor probable que el mecanismo sea el resultado de efectos directos sobre la senalizacion de WNT. Aunque el uso clmico de la ciclosporina con este fin esta limitado por toxicidad sistemica, PTH-CBD no ha mostrado efectos toxicos, incluso con administracion sistemica.
Por tanto, en otro aspecto, se proporcionan en el presente documento metodos para aumentar el crecimiento del cabello. Los metodos incluyen, administrar un CBD unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto que necesita tratamiento para inducir el crecimiento del cabello o detener la cafda del cabello. El metodo es aplicable a personas con alopecia, incluida la alopecia inducida por quimioterapia, pero tambien alopecia areata, alopecia causada por calvicie de patron masculino, smdrome de ovario poliqrnstico y otras perdidas del cabello. Las composiciones pueden administrarse de forma local o topica para tratar la perdida de cabello.
En otro aspecto, se proporcionan metodos para ralentizar el crecimiento o el recrecimiento del vello despues de un procedimiento de eliminacion mediante la administracion de un CBD unido a un antagonista del receptor PTH/PTHrP a un sujeto. En una realizacion, la composicion antagonista de PTH se aplica de forma local, por via topica. El antagonista de PTH se puede aplicar despues de un procedimiento de eliminacion del vello para evitar o ralentizar el crecimiento del vello. Tal como se describe en los Ejemplos, los inventores han demostrado que el recrecimiento del pelo se ralentiza despues de aplicar depilacion con cera a animales tratados con antagonistas de CBD-PTH en comparacion con los animales de control tratados con PTH-CBD o vehmulo solo. Las composiciones pueden administrarse de forma local o topica para bloquear el crecimiento del vello.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse por medios conocidos por el experto en la materia, que incluyen, aunque no de forma limitativa, vfas oral, topica, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intradermica o subcutanea. De esta manera, las composiciones pueden formularse como una formulacion ingerible, inyectable, topica o de supositorio. La composicion se puede formular para su administracion por inyeccion para dar como resultado una administracion sistemica o una administracion local. Las composiciones pueden administrarse tambien mediante un liposoma o vehmulo de liberacion temporalizada. Las composiciones pueden administrarse tambien mediante un vehmulo de administracion dirigida al sitio, tales como, aunque no de forma limitativa, un liposoma dirigido o un transportador de esponja de colageno absorbible u otro implante.
Los inventores han descubierto que cuando se administran composiciones que incluyen un CBD por via subcutanea, este se une localmente al sitio de la inyeccion si la composicion esta disuelta en un tampon de pH neutro. Pero si la composicion esta disuelta en un tampon de pH bajo, por ejemplo, un tampon que tiene pH 5,0 o pH 4,5 o inferior, el dominio de union a colageno no se une al colageno, y la composicion tiene tiempo para dispersarse sistemicamente antes de unirse al colageno en otra parte del cuerpo a pH neutro. Por tanto, la administracion sistemica de las composiciones implica administrar la composicion disuelta en un tampon o solucion acuosa a un pH menor de aproximadamente 5,0 o a pH 4,5 o inferior. En otra realizacion, la administracion sistemica de las composiciones implica administrar las protemas de fusion disueltas en una solucion acuosa con un pH inferior a aproximadamente 6,0. Como alternativa, si la dolencia cutanea esta localizada, las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar en un tampon con un pH de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 o superior para permitir la administracion localizada de las composiciones en la zona afectada de la piel.
Las composiciones farmaceuticas para administracion topica tambien se pueden formular usando metodos y composiciones tales como las disponibles para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, geles, cremas o preparaciones de liposomas pueden ser adecuados para la administracion topica. Estos vehmulos de administracion se pueden formular para mediar la administracion en las capas inferiores de la piel o para permitir una liberacion prolongada en el sitio de aplicacion.
Las composiciones se pueden administrar como una sola dosis o en forma de dosis divididas. Por ejemplo, la composicion se puede administrar dos o mas veces separadas por 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, un dfa, dos d^as, tres d^as, cuatro dfas, una semana, una semana o hasta tres o mas semanas. Opcionalmente, dicho tratamiento se puede repetir, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 dfas o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Se espera que la composicion sea mas eficaz que una composicion comparable o de control que comprende el agente Terapeutico o un agonista del receptor PTH/PTHrP que no este enlazado a una protema de union a colageno. En una realizacion, se puede usar una cantidad mas pequena de la composicion o la composicion puede administrarse menos frecuentemente que una composicion comparable que comprende el agente terapeutico o un agonista del receptor PTH/PTHrP que no este enlazado a una protema de union a colageno.
Las cantidades de dosificacion y las frecuencias de administracion proporcionadas en el presente documento estan abarcadas por los terminos terapeuticamente eficaz y profilacticamente eficaz. Las dosis individuales de los agentes farmaceuticos que comprenden un segmento polipeptfdico de union a colageno enlazado a un agente terapeutico pueden ser aproximadamente las mismas en base molar que las dosis usadas para el agente terapeutico en solitario. Se espera que los agentes farmaceuticos que comprenden un segmento polipeptfdico de union a colageno enlazado a un agente terapeutico se puedan administrar con menos frecuencia, porque la union del agente al segmento polipeptfdico de union a colageno le proporciona una actividad in vivo mucho mas prolongada.
La administracion de las composiciones al sujeto de acuerdo con la invencion parece presentar efectos beneficiosos de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, en amplios lfmites, se espera que la administracion de mayores cantidades de las composiciones consiga mejores efectos biologicos beneficiosos que la administracion de una cantidad mas pequena. Ademas, tambien se contempla la eficacia a dosificaciones por debajo del nivel al cual se observa toxicidad.
Se apreciara que la dosificacion espedfica administrada en cualquier caso dado se ajustara de acuerdo con las composiciones que se estan administrando, la enfermedad que se va a tratar o inhibir, el estado del sujeto, y otros factores medicos relevantes que puedan modificar la actividad del agente o la respuesta del sujeto, como saben bien los expertos en la materia. Por ejemplo, la dosis espedfica para un sujeto concreto depende de la edad, peso corporal, el estado de salud general, la dieta, el calendario y el modo de administracion, la tasa de excrecion, los medicamentos usados en combinacion, y la gravedad del trastorno particular para el que se aplica la terapia. Las dosificaciones para un paciente dado pueden determinarse usando consideraciones convencionales, por ejemplo, por comparacion personalizada de las diferentes actividades de las composiciones de la invencion y del agente terapeutico administrado en solitario, tal como mediante un protocolo farmacologico o profilactico convencional adecuado.
La dosificacion maxima para un sujeto es la dosificacion mas elevada que no produce efectos secundarios indeseables o intolerables. El numero de variables con respecto a un regimen profilactico o de tratamiento. individual es amplio, y se espera un considerable intervalo de dosis. La ruta de administracion afectara los requerimientos de dosificacion. Se anticipa que las dosis de las composiciones reduciran los smtomas de la patologfa en tratamiento en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % en comparacion con los smtomas antes del tratamiento o los smtomas si no se aplica tratamiento. Se contempla espedficamente que las preparaciones y composiciones farmaceuticas pueden paliar o aliviar los smtomas de la enfermedad sin proporcionar una cura o, en algunas realizaciones, se pueden utilizar para curar la enfermedad o trastorno.
Las cantidades de dosificacion eficaces adecuadas para administrar las composiciones pueden determinarse por los expertos en la materia, pero normalmente vanan desde aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 10.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente, aunque son normalmente de aproximadamente 1.000 microgramos o menos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En algunas realizaciones, la cantidad de dosis eficaz esta comprendida en un intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En otra realizacion, la cantidad de dosis eficaz esta comprendida en un intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 5.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En otra realizacion, la cantidad de dosis eficaz esta comprendida en un intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 1000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. Las cantidades de dosis eficaz descritas en el presente documento se refieren a las cantidades totales administradas, es decir, si se administra mas de un compuesto, las cantidades de dosis eficaz corresponden a la cantidad total administrada.
La eficacia de las composiciones descritas en el presente documento se puede potenciar en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 100 % con respecto a un control. tratado con el agente terapeutico en solitario. Se apreciara que la eficacia del tratamiento en cualquier caso dado se potenciara de forma variable segun la composicion espedfica que se use, el tipo de enfermedad a tratar, el estado del sujeto, las formulaciones espedficas de los compuestos, y otros factores medicos relevantes que pueden modificar la actividad de las composiciones o la respuesta del sujeto, segun apreciara el experto en la materia.
Se pretende que los siguientes ejemplos sean meramente ilustrativos y en ningun caso deben tomarse como limitantes del alcance de la invencion o de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: CBD se dirige a regiones parcialmente desenrolladas o poco enrolladas del colageno
La colagenasa de Clostridium histolyticum produce una amplia la degradacion del colageno del tejido conectivo dando como resultado gangrena gaseosa. El dominio de union a colageno (CBD) del extremo C de estas enzimas es el segmento mmimo necesario para unirse a las fibrillas de colageno. CBD se une unidireccionalmente al extremo C parcialmente desenrollado de la tripe helice del colageno. Tambien se estudio si el CBD tambien podna dirigirse a las regiones poco enrolladas incluso en la parte central de la triple helice del colageno. Los peptidos colagenosos parcialmente desenrollados se sintetizaron introduciendo sustituciones G ly^A la en el colageno ([(POG)xPOA(POG)y]3 donde x+y=9 y x>3). Los estudios de titulacion realizados con resonancia magnetica nuclear 1H-15N heteronuclear de coherencia de cuanto unico (RMN HSQC) con CBD marcado con 15N demostraron que el minicolageno desenrollado se une a una brecha de 10 A de anchura y 25 A de longitud. Seis peptidos colagenosos desenrollados, marcados cada uno de ellos con un radical nitroxido, se titularon con CBD marcado con 15N. Los efectos de relajacion del espm nuclear paramagnetico mostraron que el CBD se une cerca bien del sitio de sustitucion G ly^A la o bien al extremo C de cada minicolageno. Las mediciones de dispersion de rayos X de angulo pequeno (SAXS) revelaron que CBD prefiere unirse al sitio G ly^A la que al extremo C. Los espectros de RMN HSQC de minicolageno marcado con 15N y de minicolageno desenrollado no se vieron afectados por la titulacion del CBD no marcado. Los resultados implican que el CDB se une a la region parcialmente desenrollada del CBD del minicolageno, pero no desenrolla activamente la triple helice.
Materiales y metodos:
Produccion de proteinas marcadas con 15N: El peptido s3b (Gly893-Lys1008) derivado de la colagenasa de clase I de Clostridium histolyticum (ColG) se expreso como una glutation S-transferasa (GST)-protema de fusion. La GST marcada se escindio mediante trombina, y el CBD se purifico tal como se ha descrito anteriormente. Matsushita, et al., (2001) J Biol Chem 276, 8761-8770. El marcado uniforme con el isotopo 15N se consiguio usando medio mmimo de Tanaka que contiene 15NH4Cl 40 mM. Se estimo que la eficacia de marcado era de un 99,6 %, segun espectrometna de masas mediante desorcion/ionizacion laser asistida por matriz con detector de iones por tiempo de vuelo (MALDI-TOF-EM).
Peptidos: (POG)i0 (SEQ ID NO: 35) se adquirio al Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japon). Otros peptidos se construyeron mediante una estrategia normalizada basada en N-(9-fluorenil) metoxicarbonil (Fmoc) en resinas Rinkamida (Novabiochem, Darmstadt, Alemania). El marcado de espm del extremo N se llevo a cabo sobre la resina por tratamiento con 5 equivalentes de 3-carboxi-PROXYL (Aldrich), 1-hidroxibenzotriazol, diisopropilcarbodiimida en N,N-dimetilformamida a temperatura ambiente durante 2 horas. Las etapas de escision del peptido y desproteccion se llevaron a cabo por tratamiento con un coctel secuestrante de acido trifluoroacetico (TFA) convencional (TFA: m-cresol: tioanisol: agua: triisopropilsilano = 82,5: 5: 5: 5: 2,5, v/v). El marcado de espm en los restos Cys se llevo a cabo con 3-(2-yodoacetamido)-PROXYL (IPSL, Sigma-Aldrich). Brevemente, un exceso de 10 molar de IPSL disuelto en etanol se anadio al mismo volumen de 10 mg/ml de peptido en Tris-HCl 0,1 M (pH 8.8), acido etilendiaminotetraacetico 5 mM. T ras hacer reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h, la reaccion se inactivo anadiendo un exceso de ditiotreitol. Todos los peptidos se purificaron mediante HPLC en fase invertida en una columna Cosmosil 5C-ia AR-II (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon) y se caracterizo mediante MALDI-TOF-EM. Todas las masas medidas concordaron con los valores esperados. Las estructuras qmmicas de los peptidos sintetizados se muestran en la Fig. 2.
Espectroscopia de dicrô smo circular: La conformacion de la triple helice y la estabilidad de los peptidos colagenosos se comprobaron mediante espectroscopia DC (vease la Fig. 3 y la Fig. 4). Los espectros DC se registraron con un espectropolanmetro J-820 CD (JASCO Co., Hachioji, Japon) provisto de un termocontrolador Peltier, usando una cubeta de cuarzo de 0,5 mm y conectado a una estacion de datos para promediado de la senal. Todas las muestras de peptidos se disolvieron en agua (1 mg/ml), y se almacenaron a 4 °C durante 24 h. Los espectros se notifican en terminos de unidades de elipticidad por mol de restos peptfdicos [0]mrw. La termoestabilidad de la triple helice se vigilo mediante los valores de [0]225 de cada peptido al aumentar la temperatura a una velocidad de 0,3 °C/min.
Espectroscop^a de RMN: Los experimentos de RMN se realizaron en un espectrometro Bruker 700 MHz provisto de cryoprobe™. Todos los experimentos de titulacion por RMN se realizaron a 16 ± 0,5 °C. La temperatura de trabajo es menor que las temperaturas de fusion (Tm) de todos los peptidos colagenosos marcados con espm paramagnetico utilizados (Tabla 1). La concentracion de la protema fue 0,1 mM en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que contema NaCl 100 mM y CaCl220 mM. El efecto de dilucion durante la titulacion se minimizo por titulacion de una solucion madre muy concentra (4 mM) de peptido. Las almuotas de peptido colagenoso se anadieron a la protema y se equilibraron durante 5 min antes de adquirir los espectros 1H-15N HSQC. El pH de las muestras de RMN analizadas durante la titulacion no presentaron un desplazamiento del pH significativo (en ± 0,2 unidades).
Tabla 1: Temperaturas de fusion (Tm) de varios peptidos de minicolageno que se usaron en la titulacion por RMN y en los experimentos descritos en el presente documento.
Figure imgf000012_0001
Experimentos de dispersion de luz dinamica: Los datos de dispersion de luz dinamica (DLS) se recogieron en un DynaPro-E provisto de un micromuestreador con control de la temperature sobre las muestras de CBD, peptidos colagenosos y complejos CBD:minicolageno en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contema cloruro de sodio 100 mM y CaCl220 mM. Las muestras de protemas se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 min y se filtraron por una jeringuilla Whatman de 0,02 pm directamente a una cubeta de cuarzo de 50 pl. Para cada experimento, se realizaron 20 mediciones. El radio hidrodinamico medio (RH), desviacion estandar, polidispersidad, y porcentaje de area de picos se analizaron usando Dynamics V6 (Protein Solutions). Las estimaciones de radio hidrodinamico y peso molecular se calcularon a partir de fluctuaciones dependientes del tiempo inducidas por movimiento browniano, como se ha descrito. Proteau, et al. (2010) Curr Protoc Protein Sci Capttulo 17, Unidad 1710.
Experimentos de dispersion de rayos X de angulo pequeno en solucion: Los datos de dispersion de rayos X de angulo pequeno en solucion (SAXS) se recogieron en soluciones de CBD, peptidos colagenosos y complejos CBD-minicolageno en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM y CaCh 20 mM en configuracion SAXS/WAXS situada en la lmea del haz 5-ID-D del centro de investigacion de sincrotron DND-CAT, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory (Argonne, IL). La ventaja principal de la dispersion de rayos X es que se puede llevar a cabo en solucion en condiciones casi fisiologicas. Petoukhov et al., (2007) Curr Opin Struct Biol 17, 562-571. La radiacion de 1,2398 A (10 keV) se selecciono desde el dispositivo de insercion APS Undulator A usando un monocromador Si-111, con enfoque horizontal 1:1 y mayor rechazo de armonicos procedentes de un espejo revestido Rh y ranuras de definicion de haz configuradas de 0,3 en vertical por 0,25 mm en horizontal. Se uso una celda de flujo capilar de 1,6 mm de diametro con un caudal de 4 pl/s para recoger cuatro marcos con un tiempo de exposicion de 10 s. El detector SAXS usado fue un detector de centelleo Mar165 CCD acoplado a fibra optica y que funcionaba en el intervalo de transferencia de momento de 0,005<q<0.198 A'1, donde q = 4n sin9/A (20 es el angulo de dispersion). El detector WAXS era un detector de centelleo Roper CCD acoplado a fibra optica personalizado y que funcionaba en el intervalo de transferencia de momento de 0,191 <q<1,8 A’1 S. Weigand, et al. (2009) Advances in X-ray Analysis 52, 58-68. Todos los datos de dispersion se adquirieron a una temperatura de la muestra de 10 °C. Los cuatro patrones de dispersion de cada detector se promediaron y se combinaron con el rechazo de las exploraciones fuera de rango. Para analisis adicional, se uso el programa IGOR Pro 5.5 A (WaveMetrics). Los perfiles de dispersion de la protema, peptido y sus complejos se obtuvieron despues de restar los perfiles del tampon. Los datos de dispersion reducidos se representaron graficamente como intensidad de dispersion I(Q) vs. Q (Fig. 4A). El radio de girado, Rg, se obtuvo con la aproximacion Guinier por ajuste de mmimos cuadrados en la region QRg < 1, donde la intensidad de dispersion hacia adelante I(0) es proporcional al peso molecular del complejo de protema. Una transformacion de Fourier indirecta de los datos I(Q) mediante GNOM proporciono la funcion de distribucion de partmulas P(r) en el espacio real (Fig. 4B). Svergun, D. (1992) J Appl Crystallogr 25, 495-503. Donde P(r) intersecta con el eje x, representa el diametro maximo Dmax promediado en todas las orientaciones. Las envolturas qmmicas se construyeron para todas las muestras en funcion de los datos de SAXS despues de un calculo ab initio con el programa GASBOR. Svergun, et al. (2001) Biophys J 80, 2946-2953. Una minimizacion de la hibridacion simulada de atomos senuelo distribuidos aleatoriamente convergio en la estructura de la protema despues de ensayar el mejor ajuste para los datos de dispersion I(Q). No se aplicaron restricciones de simetna a ninguna de las reconstrucciones de forma. Para cada uno de los complejos, se calcularon diez modelos ab initio con GASBOR y se promediaron con DAMAVER. Svergun, D. (2003) J Appl Crystallog 36. Los modelos atomicos representados como una configuracion compacta interconectada de esferas de diametro Dmax se ajustaron a los datos experimentales Iexp (s) para minimizar el error. Los modelos atomicos se acoplaron a envolventes ab initio con el programa SUBCOMB. Kozin, M. B., y Svergun, D. (2000) J Appl Crystallogr 33, 775-777.
Modelo de acoplamiento: El complejo CBD-peptido colagenoso se genero a partir de entradas del banco de datos de protemas de ColG s3b (1NQD) y peptido colagenoso parcialmente desenrollado 1CAG (mutacion Ala en la posicion 15a). Se generaron otras moleculas de minicolageno desenrolladas por modificacion de 1CAG usando fragmentos derivados de la estructura [(POG)10]3 (1K6F). Para obtener el complejo, se uso el algoritmo de acoplamiento BiGGER. Palma, et al. (2000) Proteins 39, 372- 384. Las soluciones se filtraron usando datos de titulacion por RMN y se selecciono el modelo de mayor puntuacion que se ajusto a los resultados de RMN y SAXS. Los ajustes manuales se complementaron con el uso de MlFit. McRee. (1999) J Struct Biol 125, 156-165.
Resultados y discusion:
Titulacion mediante RMN HSQC de CBD dirigido los sitios poco enrollados del colageno: Se sintetizo el peptido colagenoso desenrollado [(POG)6POA(POG)3]3 (SEQ ID NO: 36) que tiene Ala en la posicion 21a a contar desde el extremo N. Este peptido se modifico adicionalmente para acomodar una etiqueta de espm paramagnetico en el extremo N. Las titulaciones de RMN HSQC 1H-15N se realizaron con [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3 (SEQ ID NO: 36) y CBD marcado con 15N en relaciones de 0,02:1 a 1,5:1. Como se ha demostrado anteriormente, un total de once restos de la interfase de union a colageno (S928, W956, G971, K995, Y996, L924, T957, Q972, D974, L991 y V993) bien desaparecieron del espectro HSQC o presentaron una perturbacion de su desplazamiento qmmico significativa desde la posicion original durante la titulacion. Philominathan,et al. (2009) J Biol Chem 284, 10868-10876. El grupo PROXYL en el extremo N de los peptidos colagenosos puede causar un engrosamiento de la lmea dependiente de la distancia en las senales RMN de CBD durante la titulacion. Ademas de los once restos, tres restos mas, V973, G975 y S979 mostraron un engrosamiento de la lmea apreciable, y estos restos desaparecieron en su caso del espectro HSQC 1H-15N de CBD (Fig. 5A y 5B). Cuando el complejo [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3(SEQ ID NO: 36):CBD se redujo con acido ascorbico, estos tres restos reaparecieron en el espectro HSQC 1H-15N. La desaparicion de estos tres restos fue coherente con la titulacion de [PROXYL-G(POG)7]3 (s Eq ID NO: 42) (el extremo C esta en la posicion 22 desde el extremo N del PROXYL) segun una publicacion anterior de los inventores. La comparacion de los dos resultados de la titulacion demuestra que el CDB se dirige al sitio sustituido G ly^Ala. Si CBD solo se hubiera unido al extremo C del [PROXYL-(POG)6POA(POG)3]3 (SEQ ID NO: 36) (el extremo C esta en la posicion 30 desde el extremo N del PROXYL), los inventores esperanan observar la desaparicion solo del resto (V973), como maximo, como en la titulacion publicada del [PROXYL-G(POG)7(PRG)]3(SEQ ID NO: 43). La desaparicion de los restos (V973, G975 y S979) situados en un lados distal del sitio de union a Ca2+ (Fig. 5C) confirmo que el CDB se une unidireccionalmente al colageno desenrollado analogamente. La superficie de union al colageno en el CBD es una hendidura de 10 A de anchura y 25 A de longitud. La anchura de la hendidura de union del CBD se corresponde con el diametro de la triple helice y su longitud podna dar cabida al [(POG)3]3 (SEQ ID NO: 44). Los resultados de la RMN implican que el CBD se une a la region poco enrollada [(POG)2POA]3 (SEQ ID NO: 45) del colageno.
Puesto que la mejora en la relajacion paramagnetica es un fenomeno dependiente de la distancia, la sustitucion G ly^A la realizada muy cerca del grupo PROXYL del extremo N debena dar como resultado la desaparicion de mas restos en el CBD. Los peptidos colagenosos que contienen PROXYL, [PROXYL-(POG)5POA(POG)4]3 (SEQ ID NO: 37) (Ala en la posicion 18a desde el extremo N del PROXYL), [PROXYL-(POG)4POA(POG)5]3 (SEQ ID NO: 38) (Ala en la posicion 15a desde el extremo N del PROXYL), y [PROXYL-(POG)3POA(POG)6]3 (SEQ ID NO: 39) (Ala en la posicion 12a desde el extremo N del PROXYL) se sintetizaron. Analogamente a las titulaciones posteriores, los efectos de engrosamiento de lmea de los restos del CBD se analizaron a partir de los cambios en el espectro HSQC 1H-15N. Cuanto menor sea la distancia entre el sitio de sustitucion G ly^A la y el PROXYL del extremo N, mas restos del CBD desaparecen (Fig. 6 y Tabla 2). La magnitud de la cafda de intensidad para cuatro resonancias de la amida (Q972, G975, S979 y L924) de cuatro moleculas de minicolageno diferentes) tambien era funcion de la distancia (Fig. 7). Los resultados de la RMN son coherentes con la union del CBD a la region [(POG)2POA]3 (SEQ ID NO: 45) de cada uno de los cuatro minicolagenos poco enrollados. Las constantes de union obtenidas para todas las titulaciones mediante RMN fueron <100 pM lo que indica una afinidad de union moderada entre el CBD y el minicolageno poco enrollado.
Tabla 2: Restos que desaparecen debido a la presencia de PROXYL bien en el extremo N, en el extremo C o en el nr l n i i l n .
Figure imgf000013_0001
La conformacion helicoidal tanto de [(POG)2POA]3 (SEQ ID NO: 45)y el extremo C [(POG)3]3 (SEQ ID NO: 44) esta poco enrollada de forma analoga. El grado de rotacion alrededor del eje de simetna del husillo que describe el enrollamiento en forma de triple helice interna se define por un valor de enrollamiento helicoidal k. El valor de k oscila alrededor de un valor medio de -103° para [(PO G )-^ (SEQ ID NO: 35). Bella (2010) J Struct Biol 170, 377-391. El extremo C de un minicolageno esta poco enrollado (desplazamiento del valor k de -103° a -110°) pro habitualmente el extremo N esta demasiado enrollado. Los peptidos del colageno con sustitucion G ly^A la en el centro de la secuencia peptfdica siguen formando triples helices, pero con un brusco enrollamiento bajo (desplazamiento del valor k de -103° a -115°) en el sitio de sustitucion seguido por un enrollamiento superior a la norma. Como la region [(POG)2POA]3. (SEQ iD NO: 45) esta algo menos enrollada que el extremo C [(p Og )3]3 (SEQ ID NO: 44), la primera podna ser una diana mas preferente para CBD que la otra. Sin embargo, CBD se podna seguir uniendo al extremo C.
CBD tambien se dirige al extremo C del minicolageno poco enrollado: Para demostrar que el extremo CBD se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) tambien, se sintetizo un peptido colagenoso [(POG)4pOA(POG)5-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 38). [(POG)4POA(POG)5C-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 41) se titulo con CBD marcado con 15N en relaciones de 0,02:1 a 1,5:1 en incrementos de 0,02, y se realizo seguimiento de los cambios en el espectro HSQC del CBD. Cuando el minicolageno esta unido a la hendidura, un total de once restos de la interfase de union a colageno mostraron bien un engrosamiento de la lmea o bien una perturbacion en el desplazamiento qmmico, como se ha descrito anteriormente. Philominathan,et al. (2009) J Biol Chem 284, 10868-10876. Cuatro restos adicionales S906, R929, S997 y G998 desaparecieron del espectro h Sq C debido al PROXYL (Figs. 6 A, B y D). Estos picos reaparecidos tras adicion de acido ascorbico. Este fenomeno es identico al de la titulacion anterior de los inventores del [GPRG(POG)7C-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 46) cuando el extremo CBD es el extremo C. Si el CBD se fuera a unir solamente al sitio de Ala parcialmente enrollado, los inventores habnan observado la desaparicion de menos restos. Asf, ademas del direccionamiento a la region (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) del peptido colagenoso, CBD tambien se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44). Como se describe, la conformacion helicoidal tanto de la region (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) como del extremo (POG)3 (SEQ ID NO: 44) estan analogamente poco enrollados en comparacion con la norma. Bella. (2010) J Struct Biol 170, 377-391. La explicacion actual de los autores sobre el motivo de que CBD se dirija a las regiones poco enrolladas es que las posiciones parcialmente desenrolladas de los grupos carbonilo de la cadena principal favorecen las interacciones de enlaces de hidrogeno con el grupo hidroxilo de Tyr994. La mutacion Tyr994 en Phe dio como resultado la reduccion de 12 veces en la union al minicolageno, y la mutacion en ala pierde capacidad de union Ala. Wilson, et al. (2003) EMBO J 22, 1743-1752.
Para demostrar la capacidad del CBD para unirse tanto a la region (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) como a la region del extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44), se sintetizo un peptido colagenoso [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3 (SEQ ID NO: 40) modificado para insertar un grupo PROXYl en el centro (posicion 11). El grupo PROXYL esta unido covalentemente a un resto cistema. Debido a la presencia del grupo PROXYL voluminoso, se espera que este peptido este parcialmente desenrollado. El grado preciso de bajo enrollamiento no es conocido para el peptido, pero un minicolageno con repeticiones GPX muestra un bajo enrollamiento (k = -105°). Bella. (2010) J Struct Biol 170, 377­ 391. El voluminoso grupo PROXYL inducira probablemente un desenrollado mayor de k = -105°. Ademas de las resonancias de los once aminoacidos bien con lmea engrosada o desplazada, las titulaciones de RMN HSQC 1H-15N revelaron dos fenomenos diferentes. A la relacion menor (0,2:1) las resonancias de la amida correspondientes a S906, R929, S997, y G998 desaparecieron del espectro HSQC del c Bd (Figs. 8E, F y H). Despues, a relacion mayor (0,3:1), resonancias de la amida adicionales correspondientes a V973, G975 y S979 desaparecieron del espectro HSQC del CBD (Figs. 8E, F y H). Para ocasionar la desaparicion de cuatros restos (S906, R929, S997 y G998), CBD se debe unir inicialmente al extremo N (POG)3 (SEQ ID NO: 44). La desaparicion de las resonancias V973, G975 y S979 se puede explicar si el CBD se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) del minicolageno. Sin embargo, el fenomeno inicial significa que el CBD se une preferentemente a la seccion central poco enrollada del extremo C.
Para demostrar que el PROXYL produce engrosamiento de la lmea, y que los restos Ala o Cys no lo hacen, tres peptidos de control mas, [(POG)4POA(POG)s]3 (SEQ ID NO: 38), [(POG)4POA(POG)aC-carbamidometil]3 (SEQ ID NO: 41), y [(POG)3PCG(POG)4]3 (SEQ ID NO: 40) que carecen de los grupos Pr Ox YL se sintetizaron, y se repitieron las titulaciones mediante RMN (Figs. 6F, 8C y 8G, respectivamente). Los resultados de la titulacion fueron casi identicos a los de [(POG)k)]3 (SEQ ID NO: 35). Solamente las once resonancias de la amida experimentaron bien engrosamiento de la lmea o desplazamiento incluso a una relacion 1:1 (minicolageno:CBD). Estos peptidos de control se unieron a la misma hendidura, y PROXYL hizo que los demas restos mostraran engrosamiento de la lmea.
Para ilustrar si el CBD se une solamente al sitio parcialmente enrollado en el centro del peptido de colageno, y/o el extremo C del minicolageno, se realizaron experimentos de dispersion de luz dinamica (DLS). Los experimentos DLS proporcionaron las estequiometnas de los complejos colageno:CBD. El radio hidrodinamico de [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3(SEQ ID NO: 38):CBD y [11 PROXYL-(POG)3PCG(POG)4k(SEQ ID NO: 40):CBD fue de 3 nm y el peso molecular aparente del complejo fue de 42±1 kDa, que es similar a lo observado para el complejo [(POG)10]3(SEQ ID NO: 35):CBD (Tabla 3). Otros complejos tambien presentaron valores similares. Hasta ahora, todos los minicolagenos y el CBD siempre formaron complejos 1:1. CBD se une a uno cualquiera de los sitios disponibles del minicolageno pero no ocupa ambos sitios para formar un complejo 1:2.
Tabla 3: Radio hidrodinamico (RH), peso molecular aparente (Mw), radio de giro (Rg) y diametro maximo de partmula (Dmax) calculados segun dispersion de luz dinamica (DLS) y dispersion de rayos X de angulo pequeno (SAXS) para diferentes complejos CBD:peptidos colagenosos.
Figure imgf000015_0001
Experimentos de dispersion de rayos X de angulo pequeno (SAXS): Las formas tridimensionales de los complejos CBD-peptido colagenoso se construyeron con mediciones SAXS. La ventaja principal de las mediciones SAXS es que los experimentos se llevan a cabo en solucion en condiciones casi fisiologicas. En el trabajo anterior de los inventores, estas envolturas tridimensionales se utilizaron para demostrar la union asimetrica del CBD al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) del minicolageno. Las formas moleculares se construyeron para los complejos de CBD y seis moleculas de minicolageno no enrolladas diferentes. En todos los casos, el CBD se une a la region (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) preferentemente al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) (Figs. 9A-F). Por ejemplo, el modelo de acoplamiento para el CBD:[(POG)4POA(POG)5]3 (SEQ ID NO: 38) construido usando la estructura cristalina del CBD (n.° de registro pdb 1NQD) interactua con la region (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) del colageno no enrollado (n.° de registro pdb 1CAG) se ajusta bien a la envoltura (Fig 9B). Aunque los resultados de RMN demostraron que el CBD tambien se une al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) de [(POG)4POA(POG)5-PROXYL]3 (SEQ ID NO: 38), CBD se une predominantemente a la region (POG)2POA (SEQ ID NO: 45) del peptido (Figs. 9E y 9F).
Las estructuras derivadas de los perfiles SAXS usando calculos de hibridacion simulada para [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3 (SEQ ID NO: 40) (Figs. 9G y 9H) indicaron una densidad adicional que podna atribuirse al grupo PROXYL. La forma tridimensional derivada de SAXS del complejo [11PROXYL-(POG)3PCG(POG)4]3(SEQ ID NO: 40):CBD se superpone bien con cualquiera de los complejos derivados por RMN es decir, la union del CBD al extremo N (POG)3 (SEQ ID NO: 44) o al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 44) (Figs. 9G y 9H).
Poco cambio estructural del 15N-minicolageno tras la union al CBD: Los estudios hasta el momento sugieren que el CDB analiza las fibrillas de colageno para detectar las regiones poco enrolladas. Tras la union a las regiones menos estructuradas, ^desenrolla el colageno de forma activa? Activar el desenrollado mediante el CBD facilitana la colagenolisis. Para la investigacion, se sintetizaron dos peptidos colagenosos marcados selectivamente con 15N cerca del extremo N o C de [(POG)io]3 (SEQ ID NO: 35) (Tabla 4, peptidos A,B), y se realizo seguimiento de los cambios estructurales debido a la union del CBD no marcado mediante titulacion con HSQC 1H-15N.
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Los peptidos marcados con 15N-Gly mostraron dos picos de cruce diferentes en el espectro HSQC 1H-15N (Figs. 10A y 10B). Estos picos de cruce corresponden a las conformaciones de monomero desenrollado y triple helice asignadas en estudios anteriores con RMN. Liu, et al.(1996) Biochemistry 35, 4306- 4313 y Li, et al. (1993) Biochemistry 32, 7377-7387. El resto Gly mas cercano a los tripletes del extremo presenta picos tanto de monomero como de tnmero en el espectro HSQC, mientras que el resto Gly en el centro de la triple helice muestra un pico de cruce del tnmero mas intenso. Si el CBD va a flexar o producir cualquier desenrollado de la triple helice tras la union, los inventores esperan que el pico de cruce correspondiente a la triple helice experimente engrosamiento de lmea y desaparezca durante la titulacion, y que el pico de cruce correspondiente al monocatenario se intensifique. Sin embargo, durante la titulacion, CBD no instigo ningun cambio en los espectros HSQC 1H-15N de los peptidos colagenosos. Por tanto, el CBD unido al extremo C (POG)3 (SEQ ID NO: 35) impuso pocos cambios estructurales en la triple helice.
Una molecula de minicolageno no enrollada marcada selectivamente con 15N-Gly cerca de los extremos N o C (Tabla 4C y D) se titulo con CBD no marcado CBD. Los picos de cruce correspondiente al monomero y a la triple helice se identificaron en los espectros HSQC (Figs 10C y 10D). La titulacion del CBD no marcado indujo pocos cambios en la intensidad del pico de cruce del monomero o del tnmero. Incluso despues de la union al minicolageno parcialmente desenrollado, CBD no inicia ningun desenrollado adicional.
El CBD se une unidireccionalmente al sitio poco enrollado de la triple helice del colageno. El CBD puede ayudar a disolver las fibrillas de colageno, pero no desenrolla la triple helice. El direccionamiento a regiones poco enrolladas del tropocolageno podna evitar la barrera de energfa necesaria para desenrollar las triples helices. Cuando el CBD se utiliza como molecula de administracion de farmaco, la molecula inyectada se distribuye rapidamente a las placas finales de los discos vertebrales, cerca de las placas de crecimiento de la tibia y la fibula, y tambien a la piel. Podna descargar su carga hacia el colageno en sangre mas accesible que esta experimentando remodelacion, por tanto rico en regiones poco enrolladas.
Ejemplo 2: Comparacion estructural entre los dominios de union a colageno ColH y ColG
El dominio de union a colageno (CBD) del extremo C de la colagenasa es necesario para la union a las fibrillas de colageno insolubles y para la posterior colagenolisis. En las estructuras cristalinas de alta resolucion de ColG-CBD (s3b) y ColH-CBD (s3) se parecen mucho entre sf (r.m.s.d. Ca = 1,5 A), a pesar de compartir solamente el 30 % de identidad de secuencia. Cinco de los seis restos quelantes del Ca2+ se conservan. Los sitios de union dobles a Ca2+ de s3 se completan con un aspartato equivalente funcionalmente. Los tres restos mas cnticos para la interaccion con el colageno en s3b estan conservados en s3. La forma general del bolsillo de union se retiene mediante estructuras de bucle alteradas y posiciones en la cadena lateral. Los datos de dispersion de rayos x de angulo pequeno revelaron que s3 tambien se une asimetricamente al minicolageno. Ademas de los sitios de union al calcio y del bolsillo de union al colageno, los restos hidrofobos arquitectonicamente importantes y la red de enlaces de hidrogeno alrededor del peptido union en cis estan bien conservadas en la subfamilia de la metalopeptidasa M9B.
Los rasgos estructurales comunes descritos anteriormente y en Bauer et al. (2012) J Bacteriol November, permitieron a los inventores actualizar el alineamiento de secuencias del CBD en la subfamilia M9B (Fig. 1). Los restos conservados son importantes para uno de los cuatro motivos: quelacion del calcio (rojo), isomerizacion cis-trans del enlazador (amarillo), union a colageno (azul) o plegado de la protema (verde). La Fig. 1 tambien indica las hebras de la estructura a lo largo de la parte superior de la figura.
El sitio doble de union a calcio se forma mediante cuatro restos quelantes (Glu899, Glu901, Asn903, y Asp904) dentro del extremo N del enlazador, dos restos quelantes (Asp927 y Asp930) de C de la hebra p y los enlaces de hidrogeno invariantes Tyr1002 y que orientan Asp930. Los numeros de resto usados en este parrafo son del s3b. Analogamente, otras estructuras de soporte como Gly921 estan conservadas en el centro de la hebra p estrategicamente situadas para dejar sitio a Glu899. El sitio doble de quelacion del calcio esta formado a veces por restos funcionalmente equivalentes. Como se menciona anteriormente, Asp897 de s3 actua equivalente a Asp927 de s3b. Se realizo un intento de identificar Asp897 equivalentes en s3a y s3b de B. brevis, A3 s3a de C. botulinum y ColG s3a de C. histolyticum. Los restos Asp y Glu tridentados y divalentes estan conservados, con la unica excepcion de s3a de C. sordellii. El resto Asp904 monodentado esta sustituido a veces por Asn. Para las moleculas sustituidas, la carga neta del sitio del calcio doble es neutra, en lugar de -1.
El peptido entre los restos 901-902 tiene conformacion cis en el estado holo para s3b y s3. La posicion 902 de otras moleculas CBD es Pro, Asp o Asn. Pro tiene frecuentemente exito en la union del peptido para facilitar la isomerizacion trans-cis. La molecula s3 tiene Pro. En s3b, OD de Asn902 tiende un enlace de hidrogeno al N de la cadena principal de Asp904. El enlace de hidrogeno es fundamental para la isomerizacion del peptido. Spiriti y van der Vaart. (2010) Biochemistry 49:5314-5320. Para el resto de las moleculas de CBD que tienen Asp en la posicion, OD de Asp podna tener el mismo papel que Asn902. Otros enlaces de hidrogeno identificados mediante estudios de simulacion importantes para estabilizar los estados de transicion estan bien conservados. Estos pares de donante-aceptor en s3 y s3 b estan tabulados (Tabla 5). Los iones de calcio podnan catalizar la isomerizacion de todas las moleculas de CBD y sus estados de transicion y su mecanismo catalftico pueden parecer muy similares.
T l : Enl hi r n im r n n l i m riz i n r n - i l i n n l n .
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Los restos no funcionales que son importantes para el plegado o para la estabilidad arquitectonica estan conservados. Los restos hidrofobos empaquetados entre las p-laminas se conservan mejor si estan situados cerca de restos funcionalmente cnticos. Por ejemplo, el Trp956 invariante de la hebra E esta empaquetado entre p-laminas. Los restos flanqueantes (Thr955 y Thr957) interactuan con el minicolageno. Tyr932 esta empaquetado entre las laminas y ayuda a colocar Tyr1002. Los restos de curvas cerradas tambien se han conservado. Gly975 esta bien conservado para permitir un giro IF en s3b. Gly942 (equivalente de Gly975) en s3 permite que la cadena secundaria de Asp941 estabilice el giro inverso. Un tramo de seis restos bien conservado, entre los restos 986 y 991, adopta una curva cerrada y antecede la hebra H funcionalmente importante. La region esta bien ordenada en las estructuras cristalinas con pocos factores B, y es la menos dinamica segun los estudios de RMN y proteolisis limitada con MALDI-TOF MS (25). Philominathan, et al. (2009) J Biol Chem 284:10868-10876 y Sides et al. J Am Soc Mass Spectrom. (2012) 23(3):505-19. Los grupos carbonilo y amino de la cadena principal de Arg985 tienden un enlace de hidrogeno a OH de Tyr989 para estabilizar el giro. Solo Gly987 puede hacer sitio a la voluminosa cadena secundaria de Tyr989. Tyr990 se empaqueta contra el Ala909 invariante y la helice 310 conservada. Ala909 esta en la base del enlazador que experimenta la transformacion a-helice^ p-hebra. La curva cerrada puede garantizar que los restos interactuantes del colageno Leu992, Tyr994, y Tyr996 esten correctamente colocados. Tyr994 es el resto mas importante para la interaccion con los peptidos colagenosos. Wilson, et al. (2003) EMBO J 22:1743-1752. Las hebras adyacentes a la hebra H, es decir, las hebras C y E, estan muy bien conservadas. Las tres hebras antiparalelas moldean el bolsillo de union a colageno. Las hebras F apilan las p-laminas por interaccion con ambas laminas. El p-hebra interactua en primer lugar en orientacion antiparalela con la hebra E, despues rompe su direccion en Gly971 para interactuar con la hebra G. En lugar de Gly971, Ala o Pro se encuentra en la situacion donde la hebra cambia su sentido. La doble interaccion de la hebra ayuda a colocar Tyr970 para que interactue con el minicolageno.
Se ha mostrado que tres restos que interactuan fuertemente con el minicolageno estan conservados. El Tyr994 invariante y los restos Tyr970 y Tyr996 bien conservados constituyen el "punto caliente". La mutacion Y994A pierde capacidad de union. Como Y994F da como resultado una reduccion de 12 veces en la union al minicolageno, el grupo hidroxilo de Tyr994 puede interactuar con el colageno mediante un enlace de hidrogeno. Tyr996, que es un resto cntico para la union al minicolageno, no esta tan bien conservado. Y996A produjo una reduccion de 40 veces en la union al minicolageno. Y996 en s3b esta sustituido por Phe en s3, mediante lo cual ambas cadenas tienen identica orientacion. En otras moleculas de CBD, un resto aromatico, tal como Phe o His, se encuentra a veces en el sitio. Y970A da como resultado una reduccion de 12 veces en la union al minicolageno. Mediante titulacion RMN HSQC 15N, se ha descubierto que Thr957 interactua con el minicolageno. Los restos de aminoacidos p-ramificados o Leu se encuentran en las posiciones equivalentes a Thr957 en la mayona de los CBD. En la titulacion con RMN HSQC 15N se identifico que seis restos mas que interactuaban con el minicolageno no estan bien conservados. Puesto que CBS divergentes (s3 y s3b) adoptan un bolsillo de union en forma de paleta similar, otros CBD podnan adoptar tambien una estrategia de union al colageno similar.
Los CBD divergentes podnan dirigirse a diferentes secuencias de colageno, y posiblemente se podnan dirigir a diferentes tipos de colageno; sin embargo, este estudio estructural sugiere otra cosa. Mas bien, todos los dominios CBD se unen de forma similar a una region poco enrollada tal como el extremo C de una fibrilla de colageno. El extremo C del colageno tipo I queda expuesto en la superficie de la fibrilla, segun los experimentos de difraccion de rayos x en fibras, y este es el sitio mas accesible para que la colagenasa bacteriana inicie los asaltos. Sin embargo, no se ha descubierto aun un CBD unido al extremo C del tropocolageno. Un tandem ColG-CBD (s3a-s3b) marcado con partfculas de oro donde las partfculas de oro estan unidas a fibrillas de colageno de tipo I no mostro periodicidad. En las fibrillas de colageno, las moleculas estan escalonadas entre sf por aproximadamente 67 nm. Por tanto, un CBD podna dirigirse a las regiones parcialmente poco enrolladas en el centro de un tropocolageno que tambien sena vulnerable a asaltos.
Muy similar a s3b, s3 es al mismo tiempo compacto y extremadamente estable en presencia de Ca2+ fisiologico. Por lo tanto, la enzima podna degradar la matriz extracelular durante un tiempo prolongado. El enlazador que induce una transformacion estructural es un rasgo comun de la colagenasa M9B. Puede actuar como un sensor de Ca2+ para disparar reordenamientos del dominio como medio de activacion enzimatica. La concentracion de Ca2+ en la matriz extracelular es superior a la del interior de una bacteria. Tanto s3 como s3b se unen de forma similar a un minicolageno, asf, las moleculas de colagenasa M9B podnan iniciar la colagenolisis a partir de rasgos estructurales analogos en diferentes fibrillas de colageno. La protema de fusion de cualquier CBD derivado de la colagenasa M9B y un factor de crecimiento dana como resultado un resultado clmico comparable.
Ejemplo 3: Un agonista de CBD-PTH fomenta el crecimiento del cabello y un agonista de CBD-PTH inhibe el crecimiento del cabello
Caracterizacion in vitro de compuestos PTH unido a CBD: La union a colageno de cada peptido se comprobo en ensayos de union a colageno de flujo piston como se ha descrito anteriormente en la Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2010/0129341. PTH-CBD, que consiste en los 33 primeros aminoacidos de PTH unido directamente al dominio de union a colageno (SEQ ID NO: 1) fue el agonista mas potente, que tiene un efecto similar al de PTH(1-34) (SEQ ID NO: 7) sobre la acumulacion de a Mpc. Ponnapakkam et al. (2011) Calcif 88:511-520. Epub 2011 Abr 2022. Entre los antagonistas, PTH(7-33)-CBD (SEQ ID NO: 10) mostro la mejor combinacion de baja actividad intrmseca y elevado bloqueo del receptor (no se muestra), similar a lo observado para otros antagonistas de PTH, incluidos los utilizados en los estudios de crecimiento del cabello. Peters, et al. (2001) J Invest Dermatol 117:173­ 178.
Distribucion de PTH-CBD in vivo: La distribucion en los tejidos se evaluo administrando PTH-CBD marcado con 35S mediante inyeccion subcutanea, seguido por autorradiograffa de preparacion completa congelada y del cuerpo completo. PTH-CBD con un sitio de fosforilacion entre PTH(1-33) y el CBD se purifico, activo y marco con [gamma-35] ATP, como se ha descrito anteriormente. Tamai et al. (2003) Infect Immun. 71:5371-5375. Aproximadamente 10,8 mcg de 35S-PTH-CBD (122 kcm/mcg) se inyectaron por via subcutanea a ratones de 7 semanas de edad (32-35g). Los ratones se sacrificaron 1 hora o 12 horas despues de la inyeccion, y a continuacion se congelaron en hielo secoacetona. Se prepararon secciones congeladas (50 pm) con un autocriotomo, se secaron a -20°C, y se expusieron a una placa de imagen durante 4 semanas. Parece que la distribucion inicial de 35S-PTH-CBD se realiza en una amplia zona de la piel alrededor del sitio de inyeccion, seguido por una rapida redistribucion en la piel de todo el animal, asf como a otros tejidos diferentes (es decir hueso, intestino, vejiga) (Fig. 11). Por tanto, PTH-CBD muestra las propiedades deseadas de distribucion y retencion en la piel con administracion subcutanea.
PTH-CBD invierte la perdida de pelo en alopecia inducida por quimioterapia en ratones: Los inventores compararon la eficacia de agonistas y antagonistas unidos a PTH en alopecia inducida por quimioterapia, utilizando un diseno experimental publicado por Peters, et al., para compuestos PTH no unidos a CBD. Peters, et al. (2001) J Invest Dermatol 117:173-178. Ratones C57BL/6J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) se depilaron para sincronizar los folfculos pilosos, y se administro ciclofosfamida (CYP, 150 mg/kg) el dfa 9 para maximizar el dano inducido por quimioterapia. El agonista (PTH-CBD) y el antagonista (PTH(7-33)-CBD) se administraron 2 dfas antes de la quimioterapia, y dada la retencion a largo plazo de los compuestos sobre la piel, los inventores administraron solo una unica dosis para cubrir el calendario de multiples inyecciones del agonista y el antagonista de PTH en el estudio de Peters, et. al. La dosis administrada de compuestos unidos a CBD (320 mcg/kg) se tolero bien en ratones. Ponnapakkam et al. (2011) Calcif 88:511-520. Epub 2011 Abr 2022.
Los resultados del registro fotodocumental indicaron que el agonista, PTH-CBD, era bastante mas eficaz para estimular el crecimiento del pelo de lo que era el antagonista (Fig. 12). El examen histologico revelo cambios morfologicos en los folfculos pilosos despues de la terapia con CYP, que estaban localizados mas superficialmente y mostraban melanocitos agrupados alrededor del bulbo, caractensticos de la fase distrofica anagena y de la fase catagena (Fig. 13). Aunque el antagonista PTH(7-33)-CBD no tuvo efecto beneficioso, el tratamiento con el agonista PTH-CBD condujo a un enraizamiento mas profundo y menor agregacion de monocitos, invirtiendo de esta forma los cambios distroficos. Los recuentos de folfculos pilosos en fase anagena VI mediante campo muy intenso (HPF) se compararon entre los grupos; los animales tratados con PTH-CBD tuvieron mayor numero de folfculos pilosos, acercandose a los de los animales que no recibieron quimioterapia (Fig. 14), mientras que el antagonista PTH(7-33)-CBD no tuvo efecto beneficioso.
Es importante destacar que, los inventores no observaron evidencias de efectos adversos derivados de la administracion de PTH-CBD. Aunque se sabe que las inyecciones de PTH elevan el calcio sangumeo y pueden producir calculos renales, PTH-CBD no tuvo efectos sobre el calcio serico. Ademas, no hubo evidencia de una longitud excesiva del pelo en el cuerpo o un exceso de crecimiento de pelo en las orejas y la cola, donde normalmente no esta presente una cobertura completa. Los efectos del PTH-CBD sobre el crecimiento del pelo se confirmaron en modelos de alopecia inducida por quimioterapia sin depilacion, que son mucho mas parecidos a los protocolos clmicos.
Cuantificacion de los efectos de PTH-CBD en la alopecia inducida por quimioterapia: Los inventores continuaron estos estudios comparando los efectos de diferentes dosis de PTH-CBD sobre la alopecia inducida por quimioterapia. En estos estudios, los inventores aplicaron inyecciones mas distalmente en la espalda y aplicaron un analisis por escala de grises para cuantificar la cantidad de crecimiento del pelo. La inyeccion mas distal en la espalda permitio a los inventores comparar el recrecimiento del pelo despues de un tratamiento con PTH-CBD con menos interferencia derivada del recrecimiento de pelo normal que, en los ratones, suele suceder desde la cabeza hasta la cola. Los resultados se muestran en la Fig. 15, lo que indica un efecto dependiente de la dosis sobre el recrecimiento del pelo tanto cualitativamente como cuantitativamente.
Alopecia inducida por quimioterapia sin depilacion: Aunque el modelo depilado de la alopecia inducida por quimioterapia ofrece un modelo uniforme para la comparacion de los efectos del farmaco, se sabe que el proceso de depilacion produce danos en el folfculo, y puede alterar la respuesta de los animales a la administracion de PTH-CBD. Por tanto, los inventores sometieron a ensayo los efectos de PTH-CBD en otro modelo de la alopecia inducida por quimioterapia, donde los animales recibieron 3 ciclos de tratamiento con una terapia con ciclofosfamida (50 mg/kg/semana), similar a la forma habitual en la que se tratanan los pacientes con cancer. En este modelo, la alopecia tarda mucho mas tiempo (4-6 meses) en desarrollarse. Los animales que recibieron una sola dosis de PTH-CBD (320 mcg/kg por via subcutanea) antes del primer ciclo no desarrollaron perdida de pelo, como se muestra en la Figura 16.
En un segundo estudio, los inventores compararon los efectos de PTH-CBD cuando se administra con fines profilacticos, en el momento del primer ciclo de quimioterapia, vs. con fines terapeuticos, una vez que aparece la perdida de pelo. Aunque PTH-CBD fue eficaz en ambos casos, los efectos fueron mas evidentes cuando se administro con fines profilacticos. Esto es evidente, tanto de forma visual como cuantitativamente en la Fig. 17, usando el mismo analisis con escala de grises que los inventores utilizaron en el estudio de respuesta a la dosis.
Alopecia por depilacion: El agonista PTH-CBD parece aumentar el crecimiento del cabello al aumentar el numero de folfculos pilosos en fase anagena. Por tanto, no hay motivos para creer que los efectos sobre el crecimiento del cabello solo debenan limitarse al modelo de quimioterapia. Por tanto, los inventores sometieron a ensayo tanto PTH-CBD como el compuesto antagonista, PTH(7-33)-CBD, despues de retirar el pelo de ratones C57/BL6J por tratamiento con cera (Fig. 18). Los resultados fueron bastante interesantes; los animales tratados con agonista (PTH-CBD) tuvieron una erupcion anagena anterior (dfa 7 vs. dfa 9 para los controles del vehnculo) y mostraron un recrecimiento del pelo mas completo hacia el final del estudio (dfa 18). Los animales tratados con el antagonista (PTH(7-33)-CBD) tambien tuvieron una erupcion anagena temprana, pero el crecimiento del cabello que siguio estuvo notablemente recortada, y el ciclo piloso se detuvo despues de ese punto, no observandose crecimiento de pelo adicional. Por lo tanto, parece que la terapia con el agonista actua estimulando un recrecimiento mas rapido del pelo estimulando una transicion mas rapida a la fase anagena, mientras que el antagonista inhibio el recrecimiento del pelo bloqueando esta transicion.
PTH-CBD es una protema de fusion de los primeros 33 aminoacidos de la hormona paratiroidea (PTH), y un dominio de union a colageno de origen bacteriano. La actividad de union a colageno hace que PTH-CBD quede retenido en su sitio de accion en el colageno dermico, maximizando la eficacia y dando como resultado efectos secundarios sistemicos. PTH-CBD estimula el crecimiento del cabello haciendo que los folfculos pilosos entren en una fase anagena VI o fase de crecimiento, supuestamente, activando la senalizacion WNT y aumentando la produccion de beta-catenina. Por tanto, los inventores planificaron los siguientes estudios adicionales para confirmar este mecanismo de accion y determinar el efecto del PTH-CBD sobre dos modelos de raton geneticamente diferentes con inhibicion de la senalizacion WNT. Estos datos se usaran para formular ensayos clmicos de PTH-CBD como terapia para la alopecia.
Alopecia Areata: La alopecia areata es una enfermedad de perdida de cabello en zonas localizadas debido a la destruccion autoinmunitaria de los folfculos pilosos. Los inventores sometieron a ensayo la eficacia de PTH-CBD para fomentar el recrecimiento de pelo en un modelo animal de alopecia areata, el raton C3H/Hej injertado. En este modelo, la perdida de pelo se desarrolla de forma variable durante los 2 primeros meses de vida. En la Fig. 19 se muestran los resultados de una sola dosis de PTH-CBD (320 mcg/kg por via subcutanea) administrada en el sitio del injerto, el centro de la espalda, donde existfa la maxima perdida de pelo. En comparacion con los animales de control tratados con vehnculo, que continuaron perdiendo pelo en ese sitio, los animales que recibieron la PTH-CBD comenzaron a mostrar recrecimiento del pelo en los siguientes 1-4 dfas. Es importante destacar que, se encontro que la respuesta se mantema durante los 2 meses de duracion del experimento.
Ejemplo 4: CBD-PTH puede prevenir o tratar el hiperparatiroidismo
En este experimento, se extirparon quirurgicamente los ovarios a las ratas a una edad de 3 meses. A la edad de 9 meses, las ratas recibieron una inyeccion bien de una sola dosis de PTH-CBD (320 mcg/kg) o bien control con vehfculo. Los animales se sacrificaron 6 meses despues de la terapia (edad 15 meses). Los niveles de PTH humana intacta se midieron para evaluar los niveles sericos de PTH-CBD, y se encontro que era indetectable en ambos grupos. Se midio el calcio serico, y no habfa diferencias entre los grupos (vehfculo: 13,5 /- 1,1 vs. PTH-CBD: 14,3 /-1,1 mg/dl, NS). Los niveles de PTH de rata intacta se midieron para evaluar la produccion de PTH endogena, y PTH-CBD suprimio el aumento normal de los niveles de PTH endogena observados en ratas envejecidas ovariectomizadas. Estos hallazgos indican que una sola inyeccion de PTH-CBD puede proporcionar supresion a largo plazo de la produccion de PTH endogena, evitando el aumento normal observado con la edad en el modelo de rata ovariectomizada y, por tanto, puede servir como terapia para el hiperparatiroidismo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion que comprende un segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano unido a un agonista del receptor PTH/PTHrP para su uso en un metodo para tratar la alopecia areata en un sujeto que necesita crecimiento del cabello, que comprende administrar la composicion a un sujeto para aumentar el crecimiento del cabello.
2. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en donde la composicion se administra de forma local.
3. La composicion para el uso de la reivindicacion 2, en donde la composicion se administra de forma topica.
4. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la composicion se administra en solucion acuosa a un pH inferior a 5,0.
5. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano comprende un polipeptido de union a colageno derivado de una peptidasa M9 seleccionada entre el grupo que consiste en Clostridium, Bacillus y Vibrio, uno de las SEQ ID NOs: 13-34 o un fragmento de al menos 8 aminoacidos consecutivos de las SEQ ID NOs:13-34, restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1, un fragmento de al menos 8 aminoacidos consecutivos de los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1, y un peptido que es al menos un 90 % identico a los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1 o las SEQ ID NOs: 13-34.
6. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el agonista del receptor PTH/PTHrP comprende los restos 1-33 de la SEQ ID NO: 1, PTH (SEQ ID NO: 7), los restos 1-14 de la SEQ ID NO: 1, restos 1-34 de la SEQ ID NO: 7 o un fragmento de al menos 8 aminoacidos consecutivos de los restos 1-34 de la SEQ ID NO: 7.
7. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agonista del receptor de PTH/PTHrP es un polipeptido, y el extremo N del segmento polipeptfdico de union a colageno esta unido directamente o mediante un segmento polipeptfdico enlazador al extremo C del polipeptido agonista del receptor de PTH/PTHrP.
8. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el segmento polipeptfdico de union a colageno y el agente terapeutico estan qmmicamente reticulados entre sf o son porciones polipeptfdicas de una protema de fusion.
9. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el sujeto es humano.
10. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano comprende una de las SEQ ID NOs: 13-34, restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1, o un peptido que es al menos un 90 % identico a los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1 o las SEQ ID NOs: 13-34.
11. La composicion para el uso de la reivindicacion 10, en la que el segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano comprende los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1.
12. La composicion para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que el agonista del receptor PTH/PTHrP comprende los restos 1-33 de la SEQ ID NO: 1, PTH (SEQ ID NO: 7), los restos 1-14 de la SEQ ID NO: 1, restos 1-34 de la SEQ ID NO: 7.
13. La composicion para el uso de la reivindicacion 12, en la que el agonista del receptor PTH/PTHrP comprende los restos 1-33 de la SEQ ID NO: 1.
14. La composicion para el uso de la reivindicacion 13, en la que el segmento polipeptfdico de union a colageno de origen bacteriano comprende los restos 34-158 de la SEQ ID NO: 1.
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