ES2691083T3 - Composición para el tratamiento de fibrosis quística y la inducción de secreción de iones - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un sustrato de transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) como principio activo, formulado con vehículos farmacéuticamente aceptables, en la que el sustrato de SGLT-1 está presente a una concentración de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3,0 mM, en la que el sustrato de SGLT-1 es glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable que se selecciona del grupo que consiste en α-metil- D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y α-metil-D-glucosa, que comprende además una proteína NSP4, péptido de NSP4 o toxoide de NSP4 como el principio activo.

Description

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DESCRIPCION

Composición para el tratamiento de fibrosis quística y la inducción de secreción de iones Antecedentes de la invención

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad hereditaria potencialmente mortal que resulta de mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). La proteína CFTR, que se localiza en el epitelio de diversos órganos, incluyendo los pulmones, el hígado, el páncreas, el tracto gastrointestinal, el tracto reproductor y la piel, es un canal iónico controlado por ATP y activado por AMPc que transporta cloruro y otros iones a través de la membrana de la célula epitelial. En pacientes de FQ, los defectos en la CFTR dan como resultado una reducción de la secreción de cloruro, que a su vez lleva a una secreción de fluido reducida debido al arrastre del disolvente.

Los síntomas característicos de la FQ incluyen la acumulación de moco espeso y pegajoso en diversos órganos, en particular, en los pulmones y en el páncreas. La presencia de un moco espeso en las vías respiratorias, incluyendo los pulmones, el epitelio nasal y los senos paranasales, da como resultado alteraciones respiratorias, inflamación y síntomas tales como tos persistente, sibilancias y dificultad para respirar. El líquido espeso de las vías respiratorias también contribuye a infecciones frecuentes y al desarrollo de enfermedades que incluyen la neumonía, la bronquitis y la tuberculosis.

Aunque la gestión de la FQ ha mejorado algo a lo largo de los años, las opciones para el tratamiento y el cuidado de los pacientes de FQ permanece limitada. Específicamente, hay una ausencia de medios eficaces para inducir la secreción en pacientes de FQ. Como la FQ afecta a los pulmones de la mayoría de los pacientes, una gran parte del tratamiento habitual implica la eliminación de mocos de las vías respiratorias, la mejora de la respiración y la prevención o la mejora de la infección pulmonar. Gran parte del tratamiento se logra mediante terapia física.

Los medicamentos existentes para mejorar la función respiratoria en pacientes de FQ incluyen mucolíticos, antibióticos, agentes antiinflamatorios y broncodilatadores; además, a medida que disminuye la función pulmonar, puede ser necesario el trasplante de pulmón. Aún existe la necesidad del desarrollo de medicamentos adicionales y mejorados para la FQ. Tal como se aclarará a partir de la siguientes descripciones, se proporciona este y otros beneficios mediante la presente invención.

Breve resumen

La presente invención proporciona materiales y procedimientos tal como se reivindica en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona materiales y procedimientos para aumentar el transporte de cloruro y/u otros iones a través de la membrana de células epiteliales, induciendo de este modo la secreción de iones (por ejemplo, de aniones) y/o de líquidos (por ejemplo, agua). En una realización, la presente invención proporciona un tratamiento para la fibrosis quística y enfermedades inducidas por la fibrosis quística. En una realización preferida, la presente invención proporciona el tratamiento para enfermedades pulmonares inducidas por fibrosis quística.

La composición de la presente invención comprende como principio activo un sustrato de sodio-glucosa (SGLT-1) que es una glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable seleccionado del grupo que consiste en a-metil-D- glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa y comprende además una proteína no estructural aislada o sustancialmente pura (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo, formulado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, en los que el sustrato de SGLT- 1 está presente a una concentración de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3,0 mM.

La presente invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que consiste esencialmente en un sustrato del transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) como el principio activo, y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes, en los que el sustrato de SGLT-1 es glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable que se selecciona del grupo que consiste en a-metil-D-glucopiranósido (AMG), 3-O- metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa, que comprende además una proteína NSP4, péptido de NSP4 o toxoide de NSP4 como el principio activo.

En una realización preferida, la composición está en una forma de una preparación de aerosol para la administración intranasal y/o pulmonar. La presente invención proporciona las composiciones para su uso en procedimientos para el tratamiento de fibrosis quística y de enfermedades inducidas por fibrosis quística. En una realización, el procedimiento comprende la administración, a través de una vía intranasal o pulmonar, a un sujeto que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición de la invención.

Ventajosamente, en realizaciones específicas, la presente invención estimula la secreción de cloruro y de fluidos en el epitelio nasal, traqueal y/o bronquial y, de este modo, mejora la función respiratoria de los pacientes de FQ. En una realización preferida, la presente invención proporciona el tratamiento de enfermedades pulmonares inducidas por fibrosis quística.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra que la secreción de Cl- contribuye al aumento neto en 4c estimulado por glucosa. La adición

de una concentración en aumento de glucosa o de 3-O-metilglucosa (3-OMG) (A) al lado del lumen muestra in

aumento en 4c dependiente de la dosis con cinética saturable. El ajuste no lineal de la curva con el modelo de

Michaelis-Menten para la cinética enzimática para la glucosa da como resultado una Vmax = 3,3 ± 0,19 peqh-

1cm-2 y Km = 0,24 ± 0,06 mM (-■-). La adición de 3-OMG al lumen da como resultado un aumento en 4c J ' ' 12 dependiente de la concentración con una Vmax = 1,9 ± 0,13 peqh' cm y Km = 0,22 ± 0,07 mM (-•-). La adición

de una concentración en aumento de glucosa en tejidos pretratados con florizina no muestra respuesta a la

glucosa (-■-) (B). Los valores son de n=6 tejidos. El flujo neto y unidireccional de Cl- (C) no muestra diferencias

significativas en JmsCl- con glucosa a 0, 0,6 o 6 mM. JsmCl- muestra un aumento significativo a 0,6 y 6 mM cuando

se compara con glucosa 0 mM. La glucosa 0 mM muestra una absorción significativa de Cl- cuando se compara

con la glucosa 0,6 mM y 6 mM. (D) Con glucosa 0 mM hay una absorción neta de Na+. La absorción de Na+ es

mínima a 0,6 mM pero hay una absorción significativa con glucosa a 6 mM. Los flujos unidireccionales (Jms y Jsm)

no muestran ninguna diferencia significativa con glucosa a 0, 0,6 o 6 mM). n=8 tejidos

La Figura 2 muestra el efecto de la glucosa y de la 3-O-metil-glucosa sobre el AMPc intracelular en las células de las vellosidades y de las criptas del íleon. El tratamiento con forskolina aumenta de manera significativa los niveles de AMPc intracelular en las células de la cripta y de las vellosidades (A). La incubación de las células con glucosa 8 mM no da como resultado ningún cambio significativo en los niveles de AMPc intracelular tanto en las células de la cripta como en las células de las vellosidades (B). Las columnas representan los valores medios y las barras muestran el S.E.M. Los valores son de n=4 ratones diferentes repetidos por triplicado. Los niveles de AMPc se estandarizan a niveles de proteína de las respectivas fracciones y se expresan como pmol.(mg de proteína)'1. * P < 0,001 comparado con el grupo tras la adición de forskolina. NS = no significante entre las células de las vellosidades tratadas con solución salina y las tratadas con glucosa (comparaciones múltiples de Bonferroni).

La Figura 3 muestra el efecto de la glucosa y de la 3-O-metilglucosa sobre el Ca2+ intracelular en células Caco-2. (A) La glucosa 0,6 mM da como resultado un aumento significativo en fluorescencia. La glucosa 6 mM da como resultado un aumento significativo en la fluorescencia en comparación con el control y 0,6 mM. La preincubación de las células (45 minutos) con BAPTA no muestra un aumento en Ca2+ intracelular estimulado por glucosa. 3- OMG da como resultado un pequeño aumento en el Ca2+ intracelular estimulado por glucosa en comparación con la concentración similar de glucosa. (B) muestra un trazado representativo para mostrar el aumento en Ca2+ intracelular estimulado por glucosa 0,6 mM y 6 mM.

La Figura 4 muestra estudios de inmunohistoquímica que demuestran que el transporte de glucosa acoplado a sodio tiene lugar en las células de las vellosidades (A y B) y los estudios en cámara de Ussing que muestran que el aumento en 4c estimulado por glucosa se inhibe parcialmente con ácido niflúmico (NFA) en la mucosa del íleon (C) y en células Caco-2 (D). Para estudios de inmunohistoquímica, se tiñen secciones congeladas de 6 mm de espesor del íleon de ratón usando anti-IgG de conejo en cabra conjugada con Alexa Fluor 488. Las secciones se visualizan en microscopía confocal de barrido láser usando un láser de 488 nm y un objetivo de 20x. (A) la expresión de SGLT1 tiene lugar principalmente en la región de células de las vellosidades. (B) muestra la correspondiente imagen de campo blanco. (C) La adición de glucosa 8 mM al lado del lumen de los tejidos del íleon montados en la cámara Ussing da como resultado un aumento significativo en 4c. La adición de ácido niflúmico (NFA) 100 pM al lado del lumen da como resultado una inhibición parcial del aumento en 4c estimulado por glucosa. De forma similar, la adición de NFA al lado apical de las células Caco-2 cultivadas sobre insertos permeables (0,4 pM) da como resultado una inhibición significativa del aumento en 4c estimulado por glucosa. *, p < 0,001, en comparación con el grupo basal tras la adición de glucosa. #, p < 0,01 comparado con el grupo de la glucosa tras la adición de NFA.

La Figura 5 muestra las corrientes de células enteras perforadas con gramicidina en células Caco-2. (A) muestra una familia de relación superposición de corriente-voltaje (I-V). En presencia de Ringer común, el trazado muestra una corriente hacia dentro débilmente rectificada (-■-). La adición de glucosa da como resultado un aumento significativo en la corriente hacia dentro (-•-). El bloqueador de canal de Cl- activado por calcio, ácido niflúmico (100 mM), añadido en presencia continua de glucosa inhibe la corriente de entrada activada por glucosa (-◄-). (B) muestra una corriente representativa en Ringer común. (C) muestra una corriente representativa tras la incubación de las células en glucosa 6 mM durante 5 minutos. (D) muestra una corriente representativa en presencia de glucosa y la posterior adición de ácido niflúmico y la espera durante 5 minutos. Los trazados alternativos en cada potencial de retención se han retirado para producir una mejor claridad.

La Figura 6 muestra que la glucosa y NSP4, cuando se administran juntos, estimulan un aumento significativo en Isc. El ácido niflúmico (NFA) (100 pM) anula la corriente estimulada por NSP4114-135 (SEQ ID NO:5). La corriente sensible a NFA en presencia de NSP4 y glucosa es cuatro veces mayor que la corriente sensible a NFA en presencia de NSP4 solo.

La Figura 7 muestra que la glucosa y NSP4, cuando se administran juntos, estimulan una secreción significativa de cloruro. La Figura 8 muestra tejidos incubados en presencia de solución de Ringer (a, b, c), NSP4 (d, e, f), glucosa 8 mM (g, h, i), NSP4 + glucosa (j, k, l). Los tejidos incubados con NSP4 + glucosa (j, k, l) muestran un mayor nivel de expresión para anoctamina 1 (ANO1) que los tejidos incubados con solución de Ringer (a, b, c), NSP4 (d, e, f), y glucosa (g, h, i). La Figura 9 muestra los resultados de un análisis por transferencia de Western que muestra que los tejidos incubados con glucosa y NSP4 tienen elevados niveles de proteína anoctamina 1 (ANO1).

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Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID invención.

NO:1 es una secuencia de aminoácidos de una proteína NSP4 útil de acuerdo con la presente

La SEQ ID invención.

NO:2 es una secuencia de aminoácidos de una proteína NSP4 útil de acuerdo con la presente

La SEQ ID invención.

NO:3 es una secuencia de aminoácidos de una proteína NSP4 útil de acuerdo con la presente

La SEQ ID invención.

NO:4 es una secuencia de aminoácidos de una proteína NSP4 útil de acuerdo con la presente

La SEQ ID

NO:5 es una secuencia de aminoácidos de un péptido 114-135 de NSP4 útil de acuerdo con la

presente invención.

Descripción detallada

En una realización, la presente invención proporciona materiales y procedimientos para el tratamiento de la fibrosis quística. En una realización específica, la composición proporciona glucosa como el principio activo, formulada con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo. En otra realización, la composición comprende un análogo de glucosa no metabolizable seleccionado del grupo que consiste en a-metil-D- glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa como el principio activo, formulada con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo. En otra realización, la composición comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, un sustrato del transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) que es glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable seleccionado del grupo que consiste en a-metil- D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa y una proteína NSP4 aislada o sustancialmente pura, un péptido o un toxoide como un principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, en los que el sustrato de SGLT-1 está presente a una concentración de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3,0 mM.

En una realización preferida, la composición está en una forma de una preparación de aerosol para administración intranasal y/o pulmonar, y se usa para estimular la secreción de cloruro y de fluidos en el epitelio nasal, traqueal y/o bronquial.

En otra realización, la composición farmacéutica consiste esencialmente en un sustrato del transportador de sodio- glucosa (SGLT-1) y una proteína NSP4, un péptido de NSP4 o un toxoide de NSP4 como el principio activo, y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes, en los que el sustrato de SGLT-1 es glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable que se selecciona del grupo que consiste en a-metil- D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa.

De acuerdo con la presente invención, los experimentos llevados a cabo usando microscopía láser de barrido láser muestran que la glucosa aumenta los niveles de calcio intracelular en células epiteliales pulmonares. El aumento de los niveles de calcio intracelular activa otro canal de transporte de cloruro, los canales de cloruro activados por calcio (CaCC). Los experimentos de pinzamiento de parche muestran que la glucosa estimula la secreción de cloruro mediada por CaCC.

Inducción de la secreción de iones mediante glucosa y NSP4

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que la glucosa del lumen induce la secreción de iones neta en el intestino delgado. Específicamente, la glucosa induce una secreción de cloruro activa mediada por niveles elevados de AMPc intracelular y de Ca2+. Además, el transporte neto de Na+ en el intestino es absorbente a altas concentraciones de glucosa. Además, la glucosa da como resultado la secreción de bicarbonato en el intestino delgado.

Sorprendentemente, los presentes inventores también han descubierto que la coadministración de glucosa y de NSP4 da como resultado una secreción significativamente prolongada de iones (tales como cloruro) y/o de fluidos, que se incrementa notablemente cuando se compara con el nivel de secreción de iones (tales como cloruro) y/o de fluidos inducido mediante la administración de solo NSP4. Los resultados muestran que la coadministración de glucosa y NSP4 produce un efecto sinérgico en la inducción de la secreción de iones (tales como cloruro) y/o de fluidos.

Los presentes inventores han demostrado que un aumento en el nivel de AMPc intracelular media la secreción de Cl- y/o de HCO3'. La secreción de Cl- y/o de HCO3' está ampliamente mediada por los canales iónicos del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que tiene numerosos sitios posibles (aproximadamente 20) de fosforilación de serina y treonina. Se sabe que la proteína cinasa A (PKA) y la proteína cinasa C (PKC) activan los canales aniónicos de CFTR. En estudios de pinzamiento de parche, se ha demostrado que los canales de CFTR se inactivan ("se reducen") rápidamente salvo que se activen de manera continua mediante PKA, lo que

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significa la importancia de PKA en la activación de CFTR. Consistente con esta observación, el pretratamiento de células del intestino delgado con un potente inhibidor de PKA H89 da como resultado una reducción significativa en el aumento neto en ISc estimulado por glucosa.

Se ha demostrado que los antagonistas inhiben la expresión de proteína SGLT1 tras la exposición a glucosa (Dyer y col. (2003) Eur. J. Biochem. 270(16):3377-3388). Los canales de CFTR se activan mediante la proteína cinasa dependiente de AMPc (PKA), lo que lleva a la secreción de aniones. El aumento en 4c estimulado por glucosa en el intestino delgado está parcialmente mediado por el transporte de iones mediado por CFTR.

La glucosa así como los agonistas de PKA (tales como AMPc) han demostrado que aumentan el tráfico de SGLT1 hacia la membrana del borde en cepillo (Wright y col. (1997) J. Exp. Biol. 200(Pt 2):287-293; Dyer y col. (2003) Eur. J. Biochem. 270(16):3377-3388). El descenso en la Vmax indica un descenso total en la corriente, que representa un descenso en el transporte de glucosa. El descenso en la Vmax sería resultado de una reducción del número total del transportador de glucosa SGTL1, que se encuentra principalmente en las células epiteliales de las vellosidades. La pérdida de vellosidades da como resultado una pérdida significativa de transportadores disponibles para absorber glucosa en las células.

Se ha descubierto que la incubación de enterocitos con glucosa aumenta los niveles de AMPc intracelular. Se observa un mayor aumento en el nivel de AMPc intracelular inducido por glucosa en las células de las vellosidades que en las células de las criptas. La incubación de enterocitos con forskolina aumenta los niveles de AMPc intracelular tanto en las células de la cripta como en las de las vellosidades. El transporte de glucosa mediado por SGLT1 tiene lugar principalmente en las células de las vellosidades en lugar de en las células de la cripta, dado que se localiza un mayor número de SGLT-1 en la región de las vellosidades que en la región de la cripta (Knickelbein y col. (1988) J. Clin. Invest. 82(6):2158-2163). Por consiguiente, el aumento de las concentraciones de glucosa en las células de la cripta no da como resultado un aumento en la respuesta de AMPc.

Incluso a baja concentración (por ejemplo, la glucosa 0,6 mM que es aproximadamente la mitad de su Vmax), la glucosa del lumen induce la secreción neta de aniones. A altas concentraciones de glucosa, la absorción de sodio es predominante. La elevada concentración de glucosa del lumen aumenta los niveles de AMPc y de Ca2+ intracelulares. Los estudios previos han demostrado que la Km para el transporte de glucosa acoplado a Na+ está en un intervalo de 0,2 a 0,7 mM (Lo y Silverman (1998) J. Biol. Chem. 273(45):29341-29351).

La presencia de un aumento en Isc mediado por glucosa residual en células pretratadas con H-89 indica que existe(n) la(s) vía(s) independientes e PKA en la secreción aniónica inducida por glucosa. La secreción aniónica electrogénica a través del intestino delgado está medida por los canales iónicos, que se pueden clasificar basándose en sus mecanismos de activación, tales como la activación por AMPc, por Ca2+, por volumen celular y por potencial de membrana.

También se ha descubierto que la glucosa del lumen induce un aumento en los niveles de Ca2+ intracelular. Además, la secreción de Cl" inducida por glucosa está mediada por rutas dependientes de PKA así como rutas independientes de PKA. Esto indica que, además de la CFTR, los canales de cloruro activados por calcio (CaCC) también desempeñan un papel en la secreción de aniones inducida por glucosa.

Además, la glucosa estimula la secreción electrogénica de HCO3". Las células del intestino delgado incubadas con glucosa presentan altos niveles de secreción de HCO3" en la solución que contienen Cl" que en la solución sin Cl" del lumen. Estos resultados indican que los canales aniónicos median la secreción de HCO3" en presencia de glucosa. Además, la adición de glucosa da como resultado un ligero descenso en el intercambio Cl"-HCO3-, cuando se compara con células sin adición de glucosa. Este descenso puede ser secundario a un aumento en el nivel de AMPc intracelular con glucosa. Esto también indica que la glucosa induce la secreción mediada por canales aniónicos e inhibe el intercambio electroneutro Cl"-HCO3-.

Además, las células del intestino delgado incubadas con un bloqueante de canales de aniones (NPPB 100 mM) y un inhibidor de intercambio aniónico (DIDS 100 mM), respectivamente. Hubo una inhibición significativa de la secreción por NPPB (100 mM) de HCO3" mediada por los canales aniónicos e inducida por glucosa (4,2 ± 0,7 frente a 7,6 ± 1,5 mEqh"1cm"2).

En presencia de inhibidores de canales aniónicos, aún se observa secreción residual de HCO3". Esto indica que el intercambio Cl"-HCO3- está presente en la secreción mediada por glucosa. Esto también indica que un elevado nivel de calcio intracelular podría inhibir la actividad del intercambiador sodio-hidrógeno 3 (NHE3) durante la función digestiva normal así como en determinadas condiciones de enfermedad. Esto también indica que SGLT1 desempeña un doble papel en la regulación de la absorción de sodio y en algunas veces, en la estimulación de un defecto secretor y/o absorbente.

El descubrimiento del mecanismo secretor inducido por glucosa se puede usar en el tratamiento de enfermedades gastrointestinales que incluyen diarrea. Los pacientes con enfermedades de diarrea aguda comúnmente tienen una absorción de glucosa alterada que tiene lugar en el tracto gastrointestinal superior. La presencia de hidratos de carbono no absorbidos puede ejercer un efecto osmótico en el intestino, que lleva a la diarrea. Además, la glucosa aumenta los niveles de Ca2+ y/o de AMPc e induce la secreción de aniones. Los efectos secretores de la glucosa

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previamente se han estudiado poco o se han enmascarado mediante la absorción simultánea de Na+-glucosa. Además, debido a estos efectos secretores, la administración de glucosa particularmente exacerba las enfermedades gastrointestinales con absorción de Na+-glucosa alterada, tal como la enfermedad de Crohn y la enteritis inducida por radiación o quimioterapia que se asocian con un acortamiento de las vellosidades y, por lo tanto, comprometen extremadamente la absorción.

Composiciones terapéuticas

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro de inducción de una elevada secreción de iones (por ejemplo, aniones) y/o de fluidos (por ejemplo, agua), que comprende la administración, a una célula que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición de la invención.

En una realización, la composición induce la secreción de cloruro y/o de fluido (por ejemplo, agua). En una realización, la composición de la presente invención se puede usar para tratar la fibrosis quística y las enfermedades inducidas por fibrosis quística que incluyen, enfermedades del pulmón inducidas por fibrosis quística.

En una realización preferida, la composición se formula en una forma de una preparación de aerosol para la administración intranasal y/o pulmonar.

En una realización, la composición proporciona glucosa como el principio activo, formulada con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo, en la que la glucosa está presente a una concentración de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3,0 mM.

En una realización, la composición consiste esencialmente en, o consiste en, un sustrato de transportador de sodio- glucosa (SGLT-1) como principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo.

En una realización, la composición comprende un sustrato de transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) como el principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo, en la que el análogo de glucosa está presente a una concentración de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3,0 mM.

Los sustratos de SGLT-1 de acuerdo con la presente invención, de glucosa o de análogos de glucosa no metabolizables de glucosa se seleccionan del grupo que consiste en a-metil-D-glucopiranósido (AMG), 3-O- metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa. Se pueden seleccionar sustratos de SGLT-1 basándose en ensayos de agonistas conocidos en la materia. Además, se pueden hacer modificaciones estructurales de glucosa y de otros hidratos de carbono (tales como azúcares) para obtener sustratos de SGLT-1.

En una realización, la composición comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, glucosa como el principio activo; y opcionalmente, agua y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo.

En otra realización, la composición comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, un análogo de glucosa no metabolizable seleccionado del grupo que consiste en a-metil-D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), y a-metil-D-glucosa como el principio activo; y opcionalmente, agua y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes, y comprende adicionalmente una proteína no estructural (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo.

En una realización, la composición comprende un sustrato de SGLT-1 (por ejemplo, glucosa, un análogo de glucosa no metabolizable) a una concentración de 2 mM o menor, que incluye 2, 1,5, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 mM.

De acuerdo con la invención, la composición comprende un sustrato de SGLT-1 (por ejemplo, glucosa, un análogo de glucosa no metabolizable) a una concentración de 0,3 mM a 3,0 mM, o cualquier valor entre los mismos que incluye, aunque sin limitación, 0,5 mM a 1,5 mM, y 0,8 mM a 1,2 mM.

De acuerdo con la invención, la composición comprende adicionalmente una proteína no estructural aislada o sustancialmente pura (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes.

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En otra realización, la composición comprende adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas no estructurales (NSP4), un péptido de NSP4, o un toxoide de NSP4 como el principio activo.

La proteína no estructural NSP4 es una enterotoxina producida por rotavirus. Las proteínas NSP4, los péptidos y los toxoides útiles de acuerdo con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, una proteína que comprende toda la secuencia de aminoácidos de NSP4, NSP4 no glucosilada, y fragmentos de la proteína NSP4 que incluyen, aunque sin limitación, los fragmentos de péptido de NSP4 que comprenden los aminoácidos 112-175 de la proteína NSP4 y cualquiera de los fragmentos del péptido 112-175 de NSP4 que incluyen, aunque sin limitación, el péptido 114-135 de NSP4, el péptido 116-135 de NSP4, el péptido 118-135 de NSP4, el péptido 118-133 de NSP4, el péptido 120-130 de NSP4, y el péptido 112-150 de NSP4.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de NSP4, los péptidos y los toxoides útiles de acuerdo con la presente invención pueden provenir de todas las secuencias de NSP4 públicamente disponibles, que se pueden obtener, por ejemplo, a través de la base de datos de GenBank y de las bases de datos que contienen patentes publicadas y solicitudes de patentes. Los ejemplos no limitantes de proteínas NSP4 incluyen, aunque sin limitación, la NSP4 de rotavirus humano (N.° de referencia de GenBank BAE72460.1; SEQ ID NO:1), N.° de referencia de GenBank AAC61867 (SEQ ID NO: 2), N.° de referencia de GenBank AAB58700 (SEQ ID NO:3), y N.° de referencia de GenBank BAA13728 (SEQ ID NO:4).

En una realización específica, la secuencia de aminoácidos del péptido 114-135 de NSP4 es la SEQ ID NO:5. En una realización, el péptido de NSP4 comprende la SEQ ID NO:5; un fragmento que tiene más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID No:5; una secuencia de aminoácidos que tiene modificaciones (por ejemplo, inserción, deleción, sustitución) de no más de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos de la SEQ ID NO:5 o un fragmento de la misma; o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad (tal como, al menos el 85 %, el 90 %, el 93 % o el 95 % de identidad) con la SeQ ID NO:5.

En determinadas realizaciones, la composición comprende proteínas NSP4, péptidos (tales como el 114-135 de NSP4) y toxoides a una concentración de 0,2 pM a 20 pM o cualquier otro valor entre los mismos que incluye, aunque sin limitación, 0,2 pM a 15 pM, 2,0 pM a 15 pM y 2.0 pM a 10 pM. En determinadas realizaciones, las proteínas NSP4, los péptidos y los toxoides útiles de acuerdo con la presente invención comprenden modificaciones de aminoácidos de las secuencias de NSP4 de origen natural o públicamente disponibles, para proporcionar efectos terapéuticos similares o mejorados. Los ejemplos de las modificaciones de aminoácidos incluyen, aunque sin limitación, inserciones, deleciones, sustituciones y modificaciones químicas de uno o más aminoácidos.

Los aminoácidos se pueden clasificar generalmente en las siguientes clases: no polar, polar no cargado, básico y ácido. En una realización, los aminoácidos de una secuencia de NSP4 de origen natural o públicamente disponible se pueden sustituir con otro aminoácido natural o no natural de la misma clase y dentro del alcance de la presente invención siempre que la proteína NSP4 modificada, el péptido o el toxoide que tiene la sustitución aún conserve sustancialmente la misma actividad funcional (por ejemplo, inducción de iones (tales como cloruro) y/o secreción de fluidos) como la proteína NSP4, el péptido o el toxoide que no tiene la sustitución. Los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión modificada que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia también están dentro del alcance de la presente invención. La Tabla 1 a continuación proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

Tabla 1.

Clase de aminoácido

Ejemplos de aminoácidos

No polar

Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp

Polar no cargado

Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

Ácidos

Asp, Glu

Básicos

Lys, Arg, His

Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, aunque sin limitación, ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, iodotirosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido Y-aminobutírico, ácido £-aminohexanoico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, t- butilglicina, T-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos diseñados tales como p-metilaminoácidos, C-metilaminoácidos, N-metilaminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Los aminoácidos no naturales también incluyen aminoácidos que tienen grupos laterales derivatizados. Además, cualquiera de los aminoácidos de la proteína puede ser de la forma D (dextrógira) o de la forma L (levógira).

Las proteínas, los péptidos y los toxoides útiles de acuerdo con la presente invención se pueden aislar de rotavirus, se pueden sintetizar químicamente o se pueden producir de forma recombinante. Los procedimientos de aislamiento, de síntesis y de producción recombinante de proteínas NSP4, de péptidos y de toxoides se conocen en la materia.

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En una realización, las proteínas NSP4, los péptidos y los toxoides se pueden producir a partir de vectores de expresión que incluyen, aunque sin limitación, vectores de expresión de mamíferos, de levaduras, de bacterias y de insectos.

En una realización adicional, la composición comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, un sustrato de transportador de sodio-glucosa (SGLT-1), tal como se define anteriormente, y una proteína de NSP4 aislada o sustancialmente pura, un péptido o un toxoide como el principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

En una realización, la composición se formula de manera que, cuando se administra a una célula o a un sujeto, la proteína NSP4, el péptido o el toxoide no se libera hasta que el sustrato de SGLT-1 (por ejemplo, glucosa o análogos de glucosa no metabolizables tales como AMG, 3-OMg, etc) se libera. En una realización, la composición se formula de manera que, cuando se administra a una célula o a un sujeto, el sustrato de SGLT-1 se libera antes de la liberación de la proteína NSP4, el péptido o el toxoide. En una realización, la composición se formula de manera que, cuando se administra a una célula o a un sujeto, el sustrato de SGLT-1 se libera de forma simultánea con la proteína NSP4, el péptido o el toxoide.

En una realización específica, la proteína NSP4, el péptido o el toxoide está contenido o encapsulado en una estructura (tal como un recubrimiento, un armazón o una matriz) que comprende o está hecha de materiales que comprenden un sustrato de SGLT-1. En otra realización específica, la proteína NSP4, el péptido o el toxoide está contenido en una estructura y el sustrato de SGLT-1 está contenido en otra estructura, y durante la administración, la proteína NSP4, el péptido o el toxoide no se libera hasta que se libera el sustrato de SGLT-1.

En una realización, la composición se formula para administración oral.

En otra realización, la composición se formula como una preparación de aerosol para la administración intranasal y/o pulmonar. En una realización específicamente preferida, la composición es un pulverizador nasal. En una realización preferida, la preparación del pulverizador nasal se formula como una nebulización de formulación salina líquida.

El término "aerosol", tal como se usa en el presente documento, se refiere a su significado habitual en farmacología, que es un tipo de preparación de fármaco administrada mediante inhalación a través de la nariz o de la boca. Un aerosol es una suspensión o dispersión de partículas sólidas o líquidas finamente divididas en el aire o en otro ambiente gaseoso. Las formulaciones de aerosol son particularmente útiles para el tratamiento de trastornos respiratorios dado que pueden administrar fármacos directamente al lugar de acción y minimizar de este modo el riesgo de efectos secundarios sistémicos. En algunas realizaciones de la presente invención, los dispositivos de aerosol contienen fármacos dispersos en un gas presurizado, y se diseñan para administrar una dosis precisa cada vez. Los pulverizadores nasales, una realización de la preparación de aerosoles, se pueden usar bien para administrar fármacos sobre la mucosa nasal o bien para administrar fármacos que se adsorben a través de la mucosa y ejercen un efecto sobre otro órgano.

En una realización, la formulación de aerosol de la presente invención se prepara como una formulación de polvo seco que comprende una forma de polvo seco finamente dividido del(los) principio(s) activo(s) y, opcionalmente, un dispersante. En determinadas realizaciones, la forma de polvo seco del aerosol puede tener un tamaño de partícula que varía de 1 a 1000 pm o cualquier tamaño entre los mismos que incluye, aunque sin limitación, 10 a 700 pm, 20 a 500 pm, 30 a 250 pm, 40 a 150 pm o 50 a 100 pm.

En otra realización, la formulación de aerosol de la presente invención se prepara como una nebulización que comprende una forma líquida del(los) principio(s) activo(s) y, opcionalmente, un dispersante. En determinadas realizaciones, la forma líquida del aerosol puede tener un tamaño de gota (partícula) que varía de 1 a 1000 pm o cualquier tamaño entre los mismos que incluye, aunque sin limitación, 10 a 700 pm, 20 a 500 pm, 30 a 250 pm, 40 a 150 pm o 50 a 100 pm.

En una realización, al menos un componente de la composición se formula como una formulación de liberación sostenida.

La expresión "que consiste esencialmente en", tal como se usa en el presente documento, limita el alcance de los ingredientes y de las etapas a los materiales o etapas especificadas y aquellos que no afectan a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la presente invención, por ejemplo, composiciones y procedimientos para el tratamiento de la fibrosis quística, para la activación de SGLT-1, para inducir la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o de fluidos, y/o la activación de los CaCC (por ejemplo, TMEM16a). Por ejemplo, "que consiste esencialmente en" significa que la composición terapéutica no contiene ningún ingrediente no especificado incluyendo, pero sin limitación, aminoácidos libres no especificados; dipéptidos, oligopéptidos o polipéptidos; proteínas; monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos; hidratos de carbono; ácidos grasos y lípidos que tienen un efecto terapéutico beneficioso o adverso sobre el tratamiento de la fibrosis quística, la activación de SGLT-1, la inducción de la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o de fluidos, y/o la activación de CaCC (por ejemplo, TMEM16a). También, el uso de la expresión "que consiste esencialmente en", indica que la composición puede comprender sustancias que no tienen efectos terapéuticos sobre el tratamiento de la fibrosis quística, la activación de SGLT-1, la inducción de la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o de fluidos, y/o la activación de

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CACC (por ejemplo, TMEM16a); tales ingredientes incluyen vehículos, excipientes, agentes tamponadores, agentes de dispersión, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y conservantes, que no afectan al tratamiento de la fibrosis quística, a la activación de SGLT-1, a la inducción de la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o de fluidos y/o a la activación de CaCC (por ejemplo, TMEM16a).

En una realización adicional, la composición no contiene uno o más ingredientes seleccionados de disacáridos, oligosacáridos o polisacáridos; hidratos de carbono; aminoácidos libres; dipéptidos, oligopéptidos o polipéptidos; proteínas; ácidos nucleicos; ácidos grasos de cadena pequeña, media y/o larga; lípidos; y/o vitaminas.

El término "oligopéptido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que consiste en de tres a veinte aminoácidos. El término "oligosacáridos", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sacárido que consiste en de tres a veinte monosacáridos.

En una realización, la osmolaridad total de la composición es de aproximadamente 230 mosm a 280 mosm, o cualquier valor entre los mismos. En determinadas realizaciones, la osmolaridad es de aproximadamente 250 a 260 mosm. En otra realización, la composición tiene osmolaridad total que es de cualquier valor menor de 280 mosm.

En determinadas realizaciones preferidas, la osmolaridad total de la composición es de 230 mosm a 390 mosm, o cualquier valor entre los mismos incluyendo, aunque sin limitación, de 275 mosm a 340 mosm, de 280 mosm a 320 mosm, y de 290 mosm a 310 mosm.

En una realización, la composición es ligeramente alcalina. En determinadas realizaciones, la composición tiene un pH de aproximadamente 7,1 a 7,9 o de cualquier valor entre los mismos. En determinadas realizaciones, la composición tiene un pH de aproximadamente 7,3 a 7,5, de aproximadamente 7,2 a 7,4 o de aproximadamente 7,2.

En determinadas realizaciones, la composición tiene un pH de aproximadamente 5,0 a 7,5 o de cualquier valor entre los mismos incluyendo, aunque sin limitación, 5,5 a 7,2, 5,5 a 6,9, y 5,7 a 6,5.

Inducción de secreción de iones y tratamiento de fibrosis quística

Otro aspecto de la presente invención proporciona materiales y procedimientos in vitro para aumentar el transporte de cloruro y/u otros iones a través de la membrana de células epiteliales, induciendo de este modo la secreción de iones (por ejemplo, aniones) que comprende la administración, a una célula que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición de la invención. La presente invención también proporciona tratamiento para enfermedades en las que el elevado transporte de cloruro y/o de otros iones a través de la membrana de la célula epitelial y/o la elevada secreción de iones (por ejemplo, aniones) y/o de fluidos es beneficiosa.

En una realización, la presente invención induce la secreción de cloruro y/o de fluidos, y se puede usar en el tratamiento de enfermedades en las que la elevada secreción de cloruro y/o de fluidos es beneficiosa. Ventajosamente, la presente invención puede producir la secreción sostenida de cloruro y/o de fluidos durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas o 48 horas) tras la administración de la composición en cada momento.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de inducción de la secreción de iones (por ejemplo, cloruro y otros aniones) y/o de fluidos (por ejemplo, agua) a partir de las células, que comprende la administración a una célula que necesite tal inducción, de una composición de la invención. En una realización, la composición de la presente invención se administra a una célula epitelial. En una realización específica, la composición de la presente invención se administra a las células en un sujeto animal.

En una realización, la presente invención proporciona las composiciones de la invención para su uso en procedimientos para el tratamiento de la fibrosis quística. En realizaciones preferidas, la presente invención, a través de la administración de la composición por vía intranasal y/o pulmonar, se estimula la secreción de cloruro y de fluidos en el epitelio nasal, traqueal y/o bronquial de los pacientes de FQ. En una realización preferida, la presente invención proporciona las composiciones de la invención para su uso en procedimientos para el tratamiento de enfermedades pulmonares inducidas por fibrosis quística.

En una realización, el procedimiento comprende la administración, a un sujeto que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición de la invención.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o de fluidos en una célula, en el que el procedimiento comprende la administración a dicha célula que necesita tal inducción, de una cantidad eficaz de una composición que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, un sustrato de un transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) (por ejemplo, glucosa o análogos de glucosa no metabolizable tales como AMG, 3-OMG, etc) como el principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la secreción de iones (por

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ejemplo, cloruro) y/o de fluidos en una célula, en el que el procedimiento comprende la administración a dicha célula que necesita tal inducción, de una cantidad eficaz de una composición que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, una proteína NSP4 aislada o sustancialmente pura, un péptido o toxoide como el principio activo; y opcionalmente agua, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento de aumentar la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o d efluidos en una célula, en el que el procedimiento comprende la administración, a una célula que necesite tal inducción, de una cantidad eficaz de una composición que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, un sustrato de transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) y una proteína NSP4 aislada o sustancialmente pura, un péptido o un toxoide como el principio activo; y opcionalmente, agua, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las células a las que se les puede administrar la composición de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, células de los pulmones, del epitelio nasal, de los senos paranasales, del hígado, del páncreas, del tracto gastrointestinal, del tracto reproductor y de la piel. En una realización, la célula a la que se administra la composición de la presente invención es una célula de un sujeto.

En otra realización específica, la presente invención proporciona la composición de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de la fibrosis quística, en el que el procedimiento comprende la administración, a un sujeto que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una dicha composición.

En la práctica de los procedimientos de tratamiento de la presente invención, la proteína NSP4, el péptido o el toxoide se puede administrar antes, durante o después de la administración del sustrato de SGLT-1. En una realización específica, el sustrato de SGLT-1 se administra antes de la administración del sustrato de SGLT-1. En otra realización específica, el sustrato de SGLT-1 se administra de manera simultánea con la proteína NSP4, el péptido o el toxoide.

En realizaciones preferidas, la composición se administra a través de la administración intranasal o pulmonar. En otra realización, la composición se administra por vía oral.

El término "tratamiento" o cualquier variación gramatical del mismo (por ejemplo, tratar, tratando y tratamiento, etc.), tal como se usa en el presente documento, incluye pero sin limitación, aliviar o mejorar un síntoma de una enfermedad o afección; y/o reducir la gravedad de una enfermedad o afección.

En determinadas realizaciones, el tratamiento incluye uno o más de lo siguiente: aliviar o mejorar la fibrosis quística; estimular la secreción de cloruro y/o de fluidos en órganos, incluyendo los pulmones, el epitelio nasal, los senos paranasales, el hígado, el páncreas, el tracto gastrointestinal, el tracto reproductor y la piel; aliviar o reducir la acumulación o el espesamiento de mocos en órganos que incluyen las vías respiratorias (incluyendo los pulmones, el epitelio nasal y los senos paranasales), el hígado, el páncreas, el tracto gastrointestinal, el tracto reproductor y la piel; mejorar la función pulmonar; y mejorar la función respiratoria tal como mejorar la facilidad para respirar y reducir la tos.

La expresión "cantidad eficaz", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad que es capaz de tratar o mejorar una enfermedad o afección o que es capaz de otro modo de producir un efecto terapéutico pretendido.

El término "sujeto" o "paciente", tal como se usa en el presente documento, describe un organismo, que incluye mamíferos tales como primates, al que se le puede proporcionar el tratamiento con las composiciones de acuerdo con la presente invención. Las especies de mamífero que se pueden beneficiar de los procedimientos de tratamiento desvelados incluyen, aunque sin limitación, simios, chimpancés, orangutanes, humanos, monos; animales domésticos tales como perros, gatos; ganados tales como de caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras, pollos; y otros animales tales como ratones, ratas, cobayas y hámsteres.

En una realización, la célula o el sujeto que necesita el tratamiento tiene proteínas funcionales de transporte de glucosa, tales como, las proteínas SGLT-1. En otra realización, la célula o el sujeto que necesita el tratamiento tiene proteínas de cloruro funcionales activadas por calcio (Ca2+), tales como al proteína 16a transmembrana (TMEM16a). En otra realización, la célula o el sujeto que necesita el tratamiento no tiene proteínas CFTR o las tiene defectuosas.

En una realización, el sujeto que necesita tratamiento tiene, o está diagnosticado de, fibrosis quística. La fibrosis quística se puede diagnosticar en el momento del nacimiento a través de exámenes de detección en recién nacidos. Los ensayos comunes para el diagnóstico de la fibrosis quística incluyen la prueba del sudor y ensayos genéticos.

En una realización, el sujeto que necesita tratamiento tiene, o está diagnosticado de, enfermedades pulmonares inducidas por fibrosis quística.

En una realización, el sujeto humano es un niño de menos de catorce años de edad, o de cualquier edad más joven de nueve años, tal como de cinco años de edad, de tres años de edad, de dos años de edad o de un año de edad. En otra realización, el sujeto humano en un lactante de menos de un año de edad o de cualquier edad más joven tal

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como menos de nueve, seis o tres meses de edad.

En una realización, el sujeto que necesita tratamiento tiene mutaciones en genes CFTR y, por lo tanto, tiene una secreción reducida de cloruro y/o de fluido cuando se compara con un sujeto de control normal. La FQ es una enfermedad autosómica recesiva. Mientras que un sujeto que tiene una copia funcional y una copia no funcional del gen CFTR puede no estar caracterizado como que tiene fQ, tal sujeto podría beneficiarse de, y por lo tanto, (en una realización de la invención) se considera como que necesita el tratamiento de la invención.

En una realización, se puede usar la presente invención para tratar enfermedades y afecciones con secreción de cloruro y/o de fluido reducida en células epiteliales de diversos órganos que incluyen, aunque sin limitación, los pulmones, el epitelio nasal y los senos paranasales, el hígado, el páncreas, el tracto gastrointestinal, del tracto reproductor y de la piel. En otra realización, la presente invención se puede usar para tratar enfermedades y afecciones que se beneficiarían de una elevada secreción de cloruro y/o de fluido activada por CaCC (por ejemplo, TMEM16a). En una realización, la presente invención se puede usar para estimular la secreción de cloruro y/o de fluido en el epitelio nasal, traqueal y/o bronquial de los pacientes de FQ. En una realización, la presente invención se usa para limpiar mucosa espesa seca en pacientes con fibrosis quística y/o en mucosa nasal seca y atrófica.

En una realización, la presente invención se usa para tratar enfermedades pulmonares inducidas por fibrosis quística. En una realización, la presente invención se puede usar para tratar enfermedades y afecciones inducidas por fibrosis quística que incluyen, aunque sin limitación, enfermedades respiratorias que incluyen, aunque sin limitación, inflamación en las vías respiratorias (que incluyen los pulmones y los senos paranasales), bronquiectasia, hipertensión pulmonar, neumonía, bronquitis, tuberculosis, infección pulmonar y/o de las vías respiratorias mediante patógenos que incluyen, aunque sin limitación, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, y Mycobacterium avium; enfermedades relacionadas con la FQ y afecciones en el páncreas, el hígado, el intestino y otros órganos del tracto gastrointestinal; enfermedades endocrinas tales como diabetes relacionada con la FQ; esterilidad; y enfermedades de la piel relacionadas con la FQ y afecciones tales como la piel salada.

En una realización, las composiciones de la presente invención se administran en las vías respiratorias, incluyendo los pulmones y los senos paranasales. En una realización, la presente invención se usa para inducir la secreción de iones (por ejemplo, cloruro) y/o de fluidos en el tracto gastrointestinal, tal como, por ejemplo, el intestino delgado.

Formulaciones y sistemas de administración

La presente invención también proporciona composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden el principio activo en una forma que se puede combinar con un vehículo terapéuticamente o farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición está en una forma de una preparación de aerosol para la administración intranasal y/o pulmonar. En otra realización, la composición se formula para administración oral.

El término "transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyen los de aceite de petróleo tales como aceite mineral, aceite vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite de sésamo, aceite animal o aceite de origen sintético. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos.

Se pueden usar, de acuerdo con la presente invención, excipientes farmacéuticos convencionales tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición terapéutica, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tales composiciones contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición terapéutica, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debería adecuarse al modo de administración.

En realizaciones preferidas, las composiciones se preparan en una forma adaptada para la administración intranasal, es decir, para la administración a través de la mucosa nasal. En una realización, la composición es una preparación nasal. Las preparaciones nasales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, aunque sin limitación, gotas nasales, pulverizador nasal, gel, pomada, crema, loción, parches cutáneos, polvo o suspensión, administrado usando un dispensador u otro dispositivo como sea necesario. Se conocen en la materia una variedad de dispensadores y vehículos de administración, que incluyen ampollas monodosis, atomizadores, nebulizadores, bombas, parches nasales, esponjas nasales, cápsulas nasales y similares.

En determinadas realizaciones, la preparación nasal puede ser una forma sólida, semisólida o líquida. En el caso de una forma sólida, los componentes se pueden mezclar mediante mezcla, mezcla de volteo, secado en frío, evaporación del solvente, comolienda, secado por pulverización, y otras técnicas conocidas en la materia.

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En una realización, la composición se formula en una preparación semisólida adecuada para administración intranasal, tal como un gel o pomada acuosa o a base de aceite. Por ejemplo, los principios activos se pueden mezclar con microesferas de almidón, gelatina, colágeno, dextrano, polilactida, poliglicólido u otros materiales similares que son capaces de formar geles hidrofílicos. Las microesferas se pueden cargar con fármaco y, tras la administración, forman un gel que se adhiere a la mucosa nasal.

En una realización, la preparación nasal está en forma líquida, que puede incluir una solución acuosa, una suspensión acuosa, una solución de aceite, una suspensión de aceite o una emulsión, dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de los componentes de la composición. La preparación líquida se administra como un pulverizador nasal o como gotas nasales, usando dispositivos conocidos en la materia, que incluyen nebulizadores capaces de administrar volúmenes seleccionados de formulaciones tales como aerosoles de gotas líquidas. Por ejemplo, una bomba de pulverizador comercialmente disponible con un volumen de administración de 50 o 100 pl está disponible de, por ejemplo, Valois (Congers, N.Y.) con puntas del pulverizador de tamaño adulto y pediátrico.

En determinadas realizaciones preferidas, las composiciones se preparan en una forma adaptada para la administración pulmonar. Por ejemplo, la composición farmacéutica líquida se puede liofilizar antes de su uso en la administración pulmonar, donde la composición liofilizada se muele para obtener el polvo seco finamente dividido que consiste en partículas de un intervalo de tamaño deseado indicado anteriormente. Para otro caso, el secado por pulverización se puede usar para obtener una forma de polvo seco de la composición farmacéutica líquida, y el procedimiento se lleva a cabo en condiciones que dan como resultado un polvo seco finamente dividido y sustancialmente amorfo que consiste en partículas dentro del intervalo de tamaño deseado. Para los procedimientos de preparación de formas de polvo seco de las composiciones farmacéuticas, véase, por ejemplo, los documentos WO 96/32149; los documentos WO 97/41833; los documentos WO 98/29096; y las patentes de EE.UU. N.° 5.976.574; 5.985.248; 6.001.336; y 6.875.749 incorporadas en el presente documento a modo de referencia. Además, la forma de polvo seco de la composición farmacéutica se puede preparar y dispensar como una solución acuosa o no acuosa o una suspensión, en un inhalador de dosis medida.

Además, se puede formular una cantidad farmacéuticamente eficaz de la forma en polvo seco de la composición como un aerosol u otra preparación adecuada para la inhalación pulmonar. La cantidad de forma de polvo seco de la composición colocada en el dispositivo de administración es suficiente como para permitir la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición al sujeto mediante inhalación. El dispositivo de administración administra, en una única dosis o en múltiples dosis fraccionales, mediante inhalación, una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición al sujeto.

Cuando se usa en el contexto de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración intranasal y pulmonar, estos términos tienen el siguiente significado que se pretende. Con "acuoso" se pretende decir una composición preparada con, que contiene, o disuelta en agua, que incluye mezclas en las que el agua es la sustancia predominante en la mezcla. Con "no acuoso" se pretende decir una composición preparada con, que contiene, o disuelta en una sustancia que no sea agua o mezclas en las que el agua no sea la sustancia predominante en la mezcla. Con "solución" se pretende decir una preparación homogénea de dos o más sustancias, que pueden ser sólidos, líquidos, gases o intercombinaciones de las mismas. Con "suspensión" se pretende decir una mezcla de sustancias de manera que una o más sustancias insolubles se dispersan de manera homogénea en otra sustancia predominante.

A efectos de la presente invención, los términos "sólido" y "polvo seco" se usan de manera intercambiable con referencia a las composiciones farmacéuticas. Con forma "sólida" o de "polvo seco" de una composición farmacéutica se pretende decir que la composición se ha secado hasta un polvo finamente dividido que tiene un contenido en humedad aproximadamente por debajo del 10 % en peso, normalmente por debajo de aproximadamente el 5 % en peso, y preferentemente por debajo de aproximadamente el 3 % en peso. Esta forma de polvo seco de la composición consiste en partículas que comprenden los péptidos de la presente invención. Los tamaños de partícula preferidos son menos de aproximadamente 90,0 pm de diámetro medio, más preferentemente menos de 70,0 pm, más preferentemente menos de 50,0 pm, incluso más preferentemente aproximadamente menos de 30,0 pm, más preferentemente menos de 10,0 pm, más preferentemente menos de 7,0 pm, incluso más preferentemente en el intervalo de 0,1 a 5,0 pm, lo más preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 pm de diámetro.

Se puede añadir un tensioactivo a la composición farmacéutica para reducir la adhesión del polvo seco a las paredes del sistema de administración a partir del cual se dispensa el aerosol. Los tensioactivos adecuados para este uso intencionado incluyen, aunque sin limitación, trioleato de sorbitán, lecitina de soja y ácido oleico. Los dispositivos adecuados para la administración pulmonar de una forma de polvo seco de una composición tal como una suspensión no acuosa están comercialmente disponibles. Los ejemplos de tales dispositivos incluyen el inhalador de dosis medida Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.) y el inhalador Intal (Fisons, Corp., Bedford, Mass.). Véase también los dispositivos de administración de aerosoles descritos en las patentes de EE.UU. N.° 5.522.378; 5.775.320; 5.934.272; y 5.960.792 incorporadas en el presente documento a modo de referencia.

En otra realización más, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref.

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Biomed. Eng. 14:201; Buchwald y col., 1980, Surgery 88:507; y Saudek y col., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy y col., 1985, Science 228:190; During y col., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard y col., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca de la diana de la composición, es decir, el pulmón, requiriendo por lo tanto solo una parte de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984).

Las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar en una forma adecuada para la administración mediante inhalación. El experto en la materia conoce los dispositivos y las formulaciones adecuadas para la administración mediante inhalación. La composición se puede preparar para la administración como un aerosol en un propulsor líquido, por ejemplo, para su uso en un inhalador de dosis medida presurizada (PMDI, del inglés pressurised metered dose inhaler). El experto en la materia conoce los propulsores adecuados para su uso en un PMDI, e incluyen CFC-12, HFA-134a, HFA-227, HCFC-22 (difluoroclorometano), HFA-152 (difluoroetano e isobutano).

En una realización, la presente invención se formula para la administración tópica, para el tratamiento de enfermedades de la piel relacionadas con la FQ. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, loción, gel, pomada, crema y formulaciones de parches dérmicos.

Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la invención se pueden formular como formas neutras o de sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico y tartárico; y los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, zinc, cobre y férrico.

La invención también describe un pack o kit farmacéutico que comprende uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes, por ejemplo, un compuesto, vehículo de las composiciones farmacéuticas de la invención.

La presente invención describe un kit que comprende la composición de la presente invención; y opcionalmente, un recipiente, una etiqueta, una instrucción y, opcionalmente, un dispositivo de administración para la inhalación (tal como un inhalador, propulsores).

La presente invención describe un kit que comprende un envase que contiene los principios activos de la presente invención; y opcionalmente, 1) uno o más envases que comprenden agua, vehículos terapéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes; y 2) un marcador, una instrucción y, opcionalmente, un dispositivo de administración para la inhalación (tal como un inhalador, propulsores).

Vías de administración

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto que se está tratando mediante vías estándar que incluyen, aunque sin limitación, pulmonar, intranasal, oral, inhalación, parenteral tal como intravenosa, tópica, transdérmica, intradérmica, transmucosal, intraperitoneal, intramuscular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e inyección intraesternal. En realizaciones preferidas, la composición se administra a través de la vía intranasal, pulmonar u oral.

En realizaciones preferidas, las composiciones de la presente invención se administran en cualquier vía adecuada para la administración intranasal y/o pulmonar. A efectos de la presente invención, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a través de la inhalación de un aerosol u otra preparación adecuada que se obtiene de una solución acuosa o no acuosa o forma de suspensión, o una forma de sólido o polvo seco de la composición farmacéutica, dependiendo del dispositivo de administración usado.

La cantidad de composición terapéutica o farmacéutica de la invención que es eficaz en el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno particular dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad, afección o trastorno, y se debería decidir de acuerdo con el juicio del médico y de las circunstancias de cada paciente. Tal dosis unitaria se deme administrar más de una vez al día, por ejemplo, dos o tres veces al día.

La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales del vehículo para producir una única forma de dosificación variarán, dependiendo del tipo de la afección y del sujeto a tratar. En general, una composición terapéutica contiene desde aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 95 % de principio activo (p/p). De manera más específica, una composición terapéutica contiene desde aproximadamente el 20 % (p/p) a aproximadamente el 80 % o de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 70 % del principio activo (p/p).

Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad, afección o trastorno, y se debería decidir de acuerdo con el juicio del médico y de las circunstancias de

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cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar de curvas de respuesta a la dosis que provienen de sistemas de ensayos en modelos animales o in vitro.

Materiales y procedimientos

Preparación de los animales

Los ratones NIH Swiss macho de 8 semanas de vida y alimentados de forma normal se sacrifican mediante inhalación de CO2, seguido de dislocación cervical. Se retira suavemente el intestino delgado, y el segmento se lava y se enjuaga con solución de Ringer enfriada en hielo. Después se separa la mucosa de la serosa y las capas musculares mediante la extracción a través del plano submucosal tal como se ha descrito anteriormente (Zhang y col. (2007) J Physiol 581(3):1221-1233). Tras los desangrados, se obtiene la mucosa del íleon de un segmento de 10 cm cerca del ciego. Todos los experimentos están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida.

Mediciones bioeléctricas

Los estudios de transporte de iones se realizan sobre láminas del íleon. Los tejidos se montan después entren las dos mitades de una cámara Lucite de tipo Ussing con 0,3 cm2 de zonas superficiales expuestas (P2304, Physiologic Instruments, San Diego, CA, Estados Unidos). La solución común de Ringer (NaCl 115 mM, NaHCO3 25 mM, K2HPO4 4,8 mM, KH2PO4 2,4 mM, MgCh 1,2 mM y CaCl2 1,2 mM) gaseada con O2 al 95 % y CO2 al 5 % se usa de forma bilateral como solución de lavado para los tejidos y la temperatura se mantiene constante a 37 °C. Las cámaras están equilibradas para eliminar las fuerzas osmóticas e hidrostáticas. La resistencia debido al fluido también se compensa. Se permite que los tejidos se estabilicen. La corriente de cortocircuito basal (Isc) y la correspondiente conductancia (G) se registran usando un dispositivo de pinzamiento de voltaje/corriente controlado por ordenador (VCC MC-8, Physiologic Instruments).

Estudios de flujo

El isótopo de sodio, 22Na, se usa para estudiar el flujo de Na a través de la mucosa en condiciones basales tras la adición de glucosa. Se designan tejidos emparejados por conductancia para estudiar el flujo serosal a mucosal (Jsm) que representa la función secretora, y el flujo mucosal a serosal (Jms) que representa la función absortiva. Se añade 22Na al lado designado del tejido y se toman muestras de 500 ql cada 15 minutos del otro lado. En un conjunto separado de tejidos se añade 36Cl bien al lado serosal o al lado mucosal. Se añade glucosa de concentración 8 mM a la cámara para la estimulación completa, y se registran los correspondientes cambios en Isc y en conductancia. La conductancia se registra basándose en la ley de Ohm.

Se toman tres muestras en cada condición. La radiactividad se cuenta usando un contador gamma. Los tejidos con conductancia inferior al 10 % de cambio se asocian y se calcula el promedio Jnet= Jms - Jsm.

Estudios de inhibidor de proteína cinasa A (PKA)

Los tejidos emparejados con una conductancia y corriente similar se tratan con o sin H-89 100 qM (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA), un inhibidor de proteína cinasa A (PKA) irreversible. Los tejidos se incuban con H-89 durante 30 minutos. Las concentraciones en aumento de glucosa (0,015-8 mM) se añaden cada 5 minutos y se anota la corriente máxima. La constante de cinética de saturación se calcula para las correspondientes Km y Vmax para tejidos tratados y no tratados.

Cultivo de células Caco-2

Las células Caco-2 diferencian la confluencia posterior en células con características funcionales del epitelio del íleon fetal. Las células Caco-2 producen microvellosidades y tienen una elevada expresión de proteínas de transporte específicas del intestino delgado que incluyen SGLT1 y que, por lo tanto, se usan ampliamente como un sistema modelo para estudiar la función de los enterocitos.

Las células Caco-2 se obtienen de ATTC y se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecoo complementado con suero fetal bovino (FCS) al 10 % y aminoácidos no esenciales al 1 % a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células Caco-2 se pasan durante 20-25 veces y se siembran (2 x 105 células/placa) en placas petri de 5 cm y se cultivan hasta el 80 % de confluencia, cuando se cambia la concentración de FCS al 5 %. Las células se cultivan durante otros 10 días antes de que se usen para estudios funcionales.

Microscopía de fluorescencia con focal de Ca2+

Las células Caco2 cultivadas en cubreobjetos redondos de 25 mm se montan en la cámara de baño RC-21BR unida al adaptador de etapa de serie 20 (Warner Instruments, CT EE.UU.). Las células se mantienen a 37 °C usando un controlador de calentador de mesa de un solo canal (TC-324B, Warner Instruments, CT EE.UU.). Las células se cargan con el colorante Fluo-8 AM indicador de calcio fluorescente (n.° de cat. 0203, TEFLab, Inc., Austin, TX EE.UU.) a una concentración de 0,5 qM a temperatura ambiente y se incuban durante 45 minutos. La microscopía de barrido láser confocal se realiza usando un microscopio invertido Fluoview 1000 IX81 (Olympus, Tokyo, Japón) y

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un objetivo U Plan S-Apo 20*. La fluorescencia se registra mediante láseres de argón con excitación a 488 nm y emisión a 515 nm. Se toman imágenes de fluorescencia con el microscopio confocal de barrido. Las soluciones de Ringer, de Ringer que contiene glucosa o de Ringer de glucosa que contiene BAPTA-AM se añaden al lote usando un sistema de perfusión multiválvula (VC-8, Warner instruments, Hamden CT, EE.UU.) controlado usando un controlador de válvula VC-8 (Warner instruments, Hamden CT, EE.UU.). Se registran los cambios y se mide la fluorescencia para diversas células. Las células se lavan con solución de Ringer y se repite el experimento con el uso de 3-O-metilglucosa y carbacol (control positivo).

Mediciones colorimétricas de AMPc

Los raspados mucosales recientemente aislados de células epiteliales del íleon se lavan tres veces en solución de Ringer que contiene Ca2+ 1,2 mM a 37 °C. Las células lavadas se dividen después en dos grupos y se tratan con solución salina o con glucosa 6 mM y se incuban durante 45 minutos. Las células se tratan con HCl 0,1 M para detener la actividad fosfodiesterasa endógena. Los lisados se usan después para el ensayo de AMPc usando el kit de inmunoensayo directo de AMPc (Calbiochem, EE.UU.).

El ensayo cuantitativo de AMPc usa un anticuerpo policlonal para AMPc que se une al AMPc en muestras de forma competitiva. Tras una incubación simultánea a temperatura ambiente, se elimina por lavado el exceso de reactivos y se añaden los sustratos. Tras un corto tiempo de incubación, la reacción se detiene y se lee el color amarillo generado a 405 nm. La intensidad del color es inversamente proporcional a la concentración de AMPc en los estándares y en las muestras. Los niveles de AMPc se estandarizan a niveles de proteína de respectivas fracciones y se expresan en pmol (mg de proteína)'1.

Las células tratadas con forskolina se usan como un control positivo. Las células tratadas con glucosa y forskolina se incuban durante 45 minutos. Todos los ensayos se realizan por triplicado y se repiten hasta n = 4 diferentes ratones.

Ejemplos

A continuación se muestran ejemplos que ilustran los procedimientos y las realizaciones para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deberían interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes se dan en peso y todas las proporciones de mezcla del disolvente se dan en volumen salvo que se indique lo contrario.

Ejemplo 1 - Inducción de secreción de iones y de fluido mediante glucosa y el análogo de glucosa no metabolizable

Este ejemplo demuestra que la glucosa y los análogos de glucosa no metabolizables inducen la secreción de cloruro y de otros iones. La Figura 1 muestra que la secreción de Cl' contribuye al aumento neto en Isc estimulado por glucosa. La Figura 2 muestra el efecto de la glucosa y de la 3-O-metil-glucosa sobre el AMPc intracelular en las células de las vellosidades y de las criptas del íleon. La Figura 3 muestra el efecto de la glucosa y de la 3-O- metilglucosa sobre el Ca2+ intracelular en células Caco-2. La Figura 4 muestra que el transporte de glucosa acoplado a sodio tiene lugar en células de las vellosidades (A y B) y el aumento en Isc estimulado por glucosa se inhibe parcialmente con ácido niflúmico (NFA) en la mucosa del íleon (C) y en células Caco-2 (D). La Figura 5 muestra que la glucosa da como resultado un aumento significativo de la secreción de cloruro en células Caco-2.

Ejemplo 2- Inducción de secreción de iones en células a través de la coadministración de un sustrato para el transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) y NSP4

Este ejemplo demuestra que la coadministración de un sustrato para el transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) y una proteína NSP4, un péptido de NSP4 o un toxoide de NSP4 induce de manera potente la secreción de iones.

Los resultados, tal como se muestra en la Figura 6, muestran que la combinación de un péptido de NSP4 y de glucosa aumentan la secreción de aniones. Además, el aumento en la secreción de aniones inducido por la combinación de un péptido de NSP4 y de glucosa no se inhibe completamente con ácido niflúmico (NFA). Los resultados indican que la combinación de un péptido de NSP4 y de glucosa activa la secreción de aniones mediante mecanismos sensibles a NFA y mecanismos no sensibles a NFA.

Los resultados, tal como se muestra en la Figura 7, muestran que la combinación de un péptido de NSP4 y de glucosa potencian la secreción neta de cloruro. Además, el aumento en la secreción de cloruro inducido por la combinación de un péptido de NSP4 y de glucosa no se inhibe completamente con ácido niflúmico (NFA). Los resultados indican que la combinación de un péptido de NSP4 y de glucosa activa la secreción de cloruro mediante mecanismos sensibles a NFA y mecanismos no sensibles a NFA.

La Figura 8 muestra que los tejidos incubados con NSP4 y glucosa (j, k, l) muestran un mayor nivel de expresión de la proteína del canal de cloruro ANO1 que tejidos incubados con solución de Ringer (a, b, c), NSP4 (d, e, f), y glucosa (g, h, i).

Los datos de inmunohistoquímica, tal como se muestran en la Figura 9, muestran que los tejidos incubados con glucosa y NSP4 tienen una elevada expresión de anoctamina 1 (ANO1) - un canal de cloruro activado por calcio.

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Debería entenderse que los ejemplos y las realizaciones descritas en el presente documento son solo para fines ilustrativos y que las diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridas por los expertos en la materia y se incluyen dentro del espíritu y de las competencias de la presente solicitud y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias, incluyendo las publicaciones, las solicitudes de patente y las patentes, citadas en el presente documento se incorporan en el presente documento a modo de referencia en la misma medida que si cada referencia se indicara individual y específicamente para ser incorporada por referencia y se estableciera en su totalidad en el presente documento.

Los términos "un" y "una" y "el" y "la" y referentes similares tal como los usados en el contexto de describir la invención se deben interpretar como que abarcan tanto el singular como el plural, salvo que se indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto.

El recitado de los intervalos de valores en el presente documento meramente pretenden servir como un procedimiento abreviado para referirse de manera individual a cada valor separado que está dentro del intervalo, salvo que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara de forma individual en el presente documento.

Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado salvo que se indique lo contrario en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto.

El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o del lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, meramente pretende iluminar mejor la invención y no presenta una limitación en el alcance de la invención salvo que se indique otra cosa. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica que cualquier elemento es esencial para la práctica de la invención a menos que se indique explícitamente.

La descripción en el presente documento de cualquier aspecto o realización de la invención que usa términos tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar apoyo para un aspecto o realización similar de la invención que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos particulares, salvo que se indique otra cosa o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento como que comprende un elemento particular debería entenderse también como que describe una composición que consiste en ese elemento, salvo que se indique otra cosa o claramente se contradiga por el contexto).

Listado de secuencias

<110> University of Florida Research Foundation, Inc.

Vidyasagar, Sadasivan Okunieff, Paul Zhang, Lurong Prabhakaran, Sreekala

<120> Materiales y procedimientos para el tratamiento de la fibrosis quística y para la inducción de secreción de iones

<130> UF.1026CXC1PCT

<150> 61/637.675 <151> 24/04/2012

<150> 61/620.758 <151> 05/04/2012

<160> 5

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 175 <212> PRT

<213> Rotavirus humano A <400> 1

imagen1

<210>2 <211> 175 <212> PRT

5 <213> Rotavirus de simio A/SA11

<400>2

Met Glu Lys Leu Thr Asp Leu Asn 1 5

Met Asn Asn Thr Leu His Thr lie 20

Phe Pro Tyr lie Ala Ser Val Leu 35 40

Ala Ser lie Pro Thr Met Lys lie 50 55

Tyr Lys Val Val Lys Tyr Cys lie 65 70

Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln 85

Lys Gln Met Asp Arg Val Val Lys 100

lie Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu 115 120

Arg lie Tyr Asp Lys Leu Thr Val 130 135

Thr Lys Glu lie Asn Gln Lys Asn 145 150

Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro 165

Tyr Thr Leu Ser Val lie Thr Leu 10 15

Leu Glu Asp Pro Gly Met Ala Tyr 25 30

Thr Val Leu Phe Ala Leu His Lys 45

Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser 60

Val Thr lie Phe Asn Thr Leu Leu 75 80

lie Thr Thr Lys Asp Glu lie Glu 90 95

Glu Met Arg Arg Gln Leu Glu Met 105 110

lie Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 125

Gln Thr Thr Gly Glu lie Asp Met 140

Val Arg Thr Leu Glu Glu Trp Glu 155 160

Arg Glu Val Thr Ala Ala Met 170 175

<210>3 <211> 175 <212> PRT

5 <213> rotavirus de murino

<400>3

Met Glu Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Gly Val lie Thr Leu 15 10 15

Met Asn Asp Thr Leu His Asn lie Leu Glu Glu Pro Gly Met Val Tyr 20 25 30

Phe Pro Tyr lie Ala Ser Ala Leu Thr Val Leu Phe Thr Met His Lys 35 40 45

Ala Ser Leu Pro Ala Met Lys Leu Ala Met Arg Thr Ser Gln Cys Ser 50 55 60

Tyr Arg lie lie Lys Arg Val Val Val Thr Leu Val Asn Thr Leu Leu 65 70 75 80

Arg Leu Gly Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Thr Asp Lys Asp Glu Thr Glu 85 90 95

Lys Gln lie Asn Arg Val Val Lys Glu Leu Arg Gln Gln Leu Ala Met 100 105 110

lie Glu Lys Leu Thr Thr Arg Glu lie Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 115 120 125

Arg lie Tyr Asp Met Met Val Val Cys Arg Asp Arg Glu lie Asp Met 130 135 140

Ser Lys Glu Thr Asn Arg Lys Ala Phe Lys Thr Leu His Asp Trp Gly 145 150 155 160

Ser Asp Arg Asn Tyr Asp Asp Asn Thr Asp Val lie Ala Pro Leu 165 170 175

<210>4 <211> 175 <212> PRT

5 <213> Rotavirus porcino A

<400> 4

Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val lie Thr Leu 15 10 15

Met Asn Asp Thr Leu His Ser lie lie Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr 20 25 30

Phe Pro Tyr lie Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Thr Leu His Lys

35 40 45

Ala Ser lie Pro Thr Met Lys lie Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser 50 55 60

Tyr Lys Val lie Lys Tyr Cys Met Val Thr lie lie Asn Thr Leu Leu 65 70 75 80

Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu lie Glu

85 90 95

Gln Gln Met Asp Arg lie lie Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Glu Met 100 105 110

lie Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu lie Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys 115 120 125

Arg lie His Asp Lys Leu Ala Ala Arg Ser Val Asp Ala lie Asp Met 130 135 140

Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn lie Arg Thr Leu Asp Glu Trp Glu 145 150 155 160

Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr Ala Ser Met 165 170 175

<210>5 <211> 22 <212> PRT

5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido 114-135 de NSP4 <400> 5

Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu lie Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys Arg 15 10 15

lie Tyr Asp Lys Leu Thr 20

Claims (12)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica que comprende un sustrato de transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) como principio activo, formulado con vehículos farmacéuticamente aceptables, en la que el sustrato de SGLT-1 está presente a una concentración de aproximadamente 0,3 mM a aproximadamente 3,0 mM, en la que el sustrato de SGLT-1 es glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable que se selecciona del grupo que consiste en a-metil- D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa,

   que comprende además una proteína NSP4, péptido de NSP4 o toxoide de NSP4 como el principio activo.
2. 2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, formulada para la administración intranasal o pulmonar.
3. 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, formulada como un aerosol o como un pulverizador nasal.
4. 4. Una composición farmacéutica que consiste esencialmente en un sustrato del transportador de sodio-glucosa (SGLT-1) y una proteína NSP4, una proteína NSP4 o un toxoide de NSP4 como el principio activo, y opcionalmente, agua, vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes de carga, tensioactivos, diluyentes, colorantes y/o conservantes,

   en la que el sustrato de SGLT-1 es glucosa o un análogo de glucosa no metabolizable que se selecciona del grupo que consiste en a-metil-D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa,
5. 5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la proteína NSP4, el péptido de NSP4 o el toxoide de NSP4 está presente a una concentración de aproximadamente 0,2 pM a 20 pM.
6. 6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, que comprende una NSP4 que comprende la SEQ ID NO:5, un fragmento que tiene no menos de 8 aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO:5, o un péptido que tiene modificaciones de no más de 5 aminoácidos de la SEQ ID NO:5.
7. 7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el pH es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,5, y/o en la que la osmolaridad total es de aproximadamente: 230 mosm a aproximadamente 390 mosm.
8. 8. La composición de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de fibrosis quística,

   que comprende preferentemente la administración, a un sujeto que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición de la reivindicación 1.
9. 9. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la composición comprende glucosa y/o un análogo de glucosa no metabolizable que se selecciona del grupo que consiste en a-metil-D-glucopiranósido (AMG), 3-O-metilglucosa (3-OMG), desoxi-D-glucosa y a-metil-D-glucosa.
10. 10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composición comprende un péptido 114-135 de NSP4.
11. 11. La composición para su uso de la reivindicación 8, en la que la composición se administra a través de la administración intranasal o pulmonar.
12. 12. Un procedimiento in vitro de inducción de secreción de iones a partir de las células, que comprende la administración, a una célula que necesite tal tratamiento, de una cantidad eficaz de una composición de la reivindicación 5.