ES2689941T3

ES2689941T3 - Esterasas de hígado de cerdo mejoradas

Info

Publication number: ES2689941T3
Application number: ES10715251.4T
Authority: ES
Inventors: Martin Kietzmann; Harald Pichler; Helmut Schwab; Amin El-Heliebi; Andreas Braun; Christine Winkler
Original assignee: Patheon Austria GmbH and Co KG
Current assignee: Patheon Austria GmbH and Co KG
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2018-11-16
Anticipated expiration: 2030-04-26
Also published as: JP2016025867A; JP2012524535A; US8921080B2; DK2421962T3; CN102439142B; HUE040301T2; US20120100582A1; CN102439142A; JP5863046B2; HK1170264A1; EP2421962B1; WO2010122175A1; EP2421962A1; PL2421962T3

Abstract

Un polipéptido aislado que tiene actividad de esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos con más del 90% de identidad con la secuencia mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, en el que al menos una sustitución o eliminación de aminoácido ha tenido lugar en una posición de aminoácido que se localiza en un punto de interacción de monómeros cuando los monómeros están formando multímeros, y que destruye ese punto de interacción entre los monómeros, dando como resultado una mayor cantidad de polipéptido mutante presente en la forma monomérica en comparación con el polipéptido correspondiente sin mutación, y como resultado, en un polipéptido mutante que tiene una concentración aumentada de la fracción del polipéptido mutante que está presente como una proteína activa y soluble en lisado aclarado del polipéptido mutante expresado en E. coli en relación con la concentración de la fracción del polipéptido sin que la mutación esté presente como una proteína activa y soluble en el lisado aclarado del polipéptido sin la una o más deleciones o sustituciones expresadas en E. coli en las mismas condiciones, en donde el polipéptido aislado muestra un aumento de al menos el 10% en la actividad de la esterasa en comparación con la actividad de la esterasa del polipéptido de tipo salvaje correspondiente sin deleción o sustitución de amino ácidos en donde la sustitución o eliminación se ha llevado a cabo en una o más posiciones seleccionadas del grupo de las posiciones de aminoácidos 260, 263, y posiciones correspondientes a las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Esterasas de hígado de cerdo mejoradas

5 La invención se refiere a polipéptidos imitantes aislados que tienen actividad de esterasa y que tienen una concentración aumentada de la fracción del polipéptido que está presente como una proteína activa y soluble en un lisado aclarado del polipéptido expresado en E. coli con respecto al polipéptido sin ciertas mutaciones en su secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican las esterasas de hígado de cerdo mutantes y al uso de los polipéptidos mutantes de acuerdo con la invención.

10

Las esterasas de hígado de cerdo (PLE) se conocen como una clase muy útil de hidrolasas, por ejemplo, son muy útiles en la hidrólisis enantioselectiva de los ésteres. El hecho de que se consideren útiles es bastante sorprendente, ya que ha habido graves inconvenientes para el uso de PLE, un lisado en bruto aislado de hígado de cerdo. (i) Existen diversas isoenzimas que tienen diferentes propiedades y la enantioselectividad puede, por lo tanto, cambiar 15 de un lote a otro y también puede cambiar con el tiempo de reacción debido a las diferencias en la estabilidad operativa. (ii) El riesgo de contaminación viral o priónica del extracto en bruto de hígado de cerdo es una preocupación importante en la industria farmacéutica. (iii) Además, los productos fabricados con la ayuda de PLE podrían no considerarse Kosher o Halal.

20 Debido a estas limitaciones, se conocen diversos esfuerzos para producir de forma recombinante iso-enzimas de hígado de cerdo. Si bien inicialmente la levadura metilotrófica Pichia pastoris parecía ser un buen sistema de expresión para las esterasas de hígado de cerdo, al final, Escherichia coli demostró ser un mejor huésped después de la mejora del huésped específico, el gen y los sistemas de expresión que contribuyen a corregir el plegamiento enzimático.

25

La solicitud de patente internacional WO 2009/004093 describe la expresión de esterasa de hígado de cerdo en E. coli. La solicitud de patente internacional WO 2008/116745 describe un polipéptido que tiene actividad esterasa, estando dicho polipéptido presente como una proteína activa y soluble en un lisado aclarado de dicho polipéptido que expresa E. coli.

30

Hermann et. al., J. Biotechnol., 2007, 133(3), 301-303, el documento WO 2004/055177 y el documento WO 02/48322 describen que la PLE es activa como multímero, formando preferiblemente una estructura cuaternaria trimérica activa.

35 El documento WO 2007/073845 describe el uso de esterasas en un proceso para la fabricación de agentes reductores de la presión sanguínea.

Dado que las PLE son tales enzimas útiles, sigue existiendo la necesidad de mejorar adicionalmente los niveles de actividad que pueden conseguirse con la enzima.

40

Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que los niveles de expresión y, por lo tanto, los niveles de actividad de mutantes de iso-forma de esterasa de hígado de cerdo y esterasas homólogas expresadas en E. coli pueden mejorarse significativamente sustituyendo uno o más residuos en su secuencia de aminoácidos, concretamente, uno o más de los aminoácidos responsables de la formación del multímero de la esterasa del hígado de cerdo, por un 45 aminoácido que no produce o reduce la tendencia a la formación del multímero, cambiando de este modo la estructura cuaternaria de la PLE.

El hallazgo se desencadenó mediante la preparación de una mutación en la posición 788 del Marco de Lectura Abierta que codifica APLE (SEQ ID NO 1), que corresponde a la posición de nucleótido 5541 en la SEQ ID NO 1, por 50 lo que el reemplazo fue T-> A, que conduce al reeemplazo de la valina hidrófoba en la enzima APLE por un ácido aspártico cargado negativamente: V263D. Un modelo informático indicó que esta mutación estaba localizada en una hélice en el extremo exterior de la enzima, por lo tanto, lejos de la cavidad del sitio activo de la enzima, mientras que también se encontró que la actividad total de esta enzima mutada hacia el éster metílico del ácido (4E)-5-cloro-2- isopropilpent-4-enoico aumentó de 6,5 a 11,6 Unidades/mg de proteína soluble total. En el caso de 3-(3,4- 55 diclorofenil)-glutarato de dimetilo, la actividad aumentó de 36 a 42 mU/mg de proteína soluble total y en el caso de acetato de para-nitrofenilo, la actividad aumentó de 15,4 a 24,3 U/mg de proteína soluble total. Al principio, no había ninguna explicación de por qué una mutación en una región externa de APLE tendría un efecto tan fuerte sobre diversas conversiones. Sin embargo, el análisis de la estructura del homólogo humano hCE1 identificó a la valina en la posición 263 de APLE como potencialmente importante para la multimerización. Tras introducir un ácido aspártico

cargado, en cambio, la interacción hidrófoba que existía anteriormente, la interacción estabilizadora entre dos subunidades, se altera. Un aminoácido cargado negativamente puede repeler la otra subunidad en lugar de unirla a través de la interacción hidrófoba.

5 A continuación, se probó la hipótesis de que la formación de multímeros se interrumpe por un cambio introducido por el ácido aspártico en la posición 263 que interrumpe las interacciones hidrófobas y, por lo tanto, conduce a la formación de monómeros. Al analizar un modelo informático de APLE, se concluyó que la valina en la posición 263 de un monómero puede interactuar con la leucina en la posición 43 de otro monómero. Se postuló que la formación de trímeros se debe, al menos en parte, a la interacción hidrófoba alterna de L43 y V263 entre tres subunidades en 10 total. Por lo tanto, independientemente de qué aminoácido se reemplaza por ácido aspártico, la interacción debe interrumpirse. Probando la hipótesis, la leucina en la posición 43 se reemplazó por ácido aspártico, lo que resultó en la monomerización.

Esta mutación también dio lugar a la formación de monómeros, por lo tanto, demostró que el reemplazo de 15 aminoácidos en ciertas posiciones de un monómero de PLE, que sin el reemplazo puede formar un multímero, aumenta la cantidad de enzima presente en la forma monomérica, y aunque la variante L43D produjo menos proteína soluble que la variante V263D, es evidente que la actividad encontrada para una cierta cantidad de lisado aclarado que comprende enzimas mutadas en una posición involucrada en la formación de multímero y usada para una cierta conversión aumentó con respecto a la misma cantidad de lisado aclarado que comprendía enzimas sin 20 mutaciones usadas para la misma conversión. La misma mutación se introdujo en todos los polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, y dio como resultado el mismo efecto.

Por lo tanto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 o un homólogo de 25 las mismas, que comprende una sustitución o eliminación de aminoácidos de uno o más aminoácidos como se muestra en dichas sEq ID NOs y que da como resultado un polipéptido mutante que tiene una concentración aumentada de la fracción del polipéptido mutante que está presente como una proteína activa y soluble en una lisado aclarado del polipéptido mutante expresado en E. coli en relación con la concentración de la fracción del polipéptido sin que la mutación esté presente como una proteína activa y soluble en el lisado aclarado del 30 polipéptido sin la una o más deleciones o sustituciones expresadas en E. coli en las mismas condiciones.

Se prefiere sustituir uno o más de los aminoácidos en lugar de eliminar uno o más aminoácidos. En este texto, la actividad relativa de la esterasa es una comparación de las actividades de tipo salvaje (es decir, la enzima parental no mutagenizada) y la enzima mutante respectiva que se prepararon (véase en la sección de Materiales y métodos 35 bajo el encabezado "Expresión y cosecha de células"; donde se describe la preparación de lisado aclarado y donde, en "Cuantificación de la actividad de PLE" se describen los métodos para medir la actividad) en las mismas condiciones usando la misma cantidad de la preparación de proteína soluble (lisado aclarado). La actividad relativa (r [%]) se calcula mediante la liberación de para-nitrofenol por minuto del lisado mutante ([p-NPAmut]) dividida por la liberación de para-nitrofenol por minuto del correspondiente lisado de tipo salvaje ([p-NPAwt]) multiplicado por el 100 40 % de acuerdo con la fórmula r = ([p-NPAmut]/[p-NPAwt]) x 100 %.

En una realización, la invención se refiere a un polipéptido aislado de acuerdo con la invención, cuyo polipéptido muestra un aumento del 10% en la actividad de la esterasa en comparación con la actividad de la esterasa del polipéptido de tipo salvaje correspondiente sin deleción o sustitución de aminoácidos.

45

Las enzimas tienen una estructura primaria (secuencia de aminoácidos), secundaria (principalmente hélice alfa y lámina beta) y terciaria (estructura de una cadena peptídica). Además, algunas enzimas forman estructuras cuaternarias que son conglomerados (multímeros) de las mismas (homo) o diferentes (hetero) subunidades (cadenas peptídicas). Las esterasas de hígado de cerdo son homo trímeros. La estructura cuaternaria de las 50 enzimas y los mutantes se puede ensayar mediante centrifugación en gradiente de densidad de glicerol (véase el Ejemplo 3 para una descripción de Centrifugación en gradiente de densidad de glicerol) y electroforesis en gel nativo (véase en la sección Materiales y métodos bajo el encabezado "Electroforesis en gel nativo" para una descripción del método).

55 La formación de multímeros suele ser causada por múltiples fuerzas de atracción intermoleculares de diferentes aminoácidos, tales como interacciones hidrófobas/hidrófobas o iónicas (positivas/negativas) de las diferentes subunidades (monómeros). Dichas interacciones son a menudo enzimas estabilizadoras y, por lo tanto, a menudo son beneficiosas para las enzimas. En la presente invención se encontró sorprendentemente que la destrucción de solo unas pocas de tales fuerzas de atracción conducía a una estructura cuaternaria modificada y actividades

relativas más altas de PLE y enzimas homólogas en lisados aclarados.

Por lo tanto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 o un homólogo de 5 las mismas, que comprende una sustitución o eliminación de aminoácidos de uno o más aminoácidos como se muestra en dichas SEQ ID NOs, en donde al menos una sustitución o eliminación de aminoácidos ha tenido lugar en una posición de aminoácidos que se encuentra en un punto de interacción de monómeros cuando los monómeros están formando multímeros y que destruye ese punto de interacción entre los monómeros, y que da como resultado un polipéptido mutante que tiene una concentración aumentada de la fracción del polipéptido mutante que está 10 presente como una proteína activa y soluble en una lisado aclarado del polipéptido mutante expresado en E. coli en relación con la concentración de la fracción del polipéptido sin que la mutación esté presente como una proteína activa y soluble en el lisado aclarado del polipéptido sin la una o más deleciones o sustituciones expresadas en E. coli en las mismas condiciones. Preferiblemente, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 15 6, 8, 10, 12 o 14, y polipéptidos aislados que tienen una identidad de aminoácidos de al menos más del 90%, preferiblemente más del 95% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, y donde al menos una sustitución o eliminación de aminoácidos ha tenido lugar en una posición de aminoácido que se encuentra en un punto de interacción de monómeros cuando los monómeros forman multímeros y que destruye ese punto de interacción entre los monómeros. Preferiblemente, la sustitución o eliminación se ha llevado a cabo en una 20 o más posiciones seleccionadas del grupo de las posiciones de aminoácidos 43, 260, 263, 266 o 270, o posiciones correspondientes a las mismas. Las sustituciones preferidas son L43D, T260P, T260A, V263D y V263G o posiciones correspondientes a las mismas.

En particular, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de esterasa que comprende una 25 secuencia de aminoácidos con más del 90% de identidad con la secuencia mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, en el que al menos una sustitución o eliminación de aminoácido ha tenido lugar en una posición de aminoácido que se localiza en un punto de interacción de monómeros cuando los monómeros están formando multímeros, y que destruye ese punto de interacción entre los monómeros, dando como resultado una mayor cantidad de polipéptido mutante presente en la forma monomérica en comparación con el polipéptido 30 correspondiente sin mutación, y como resultado, en un polipéptido mutante que tiene una concentración aumentada de la fracción del polipéptido mutante que está presente como una proteína activa y soluble en lisado aclarado del polipéptido mutante expresado en E. coli en relación con la concentración de la fracción del polipéptido sin que la mutación esté presente como una proteína activa y soluble en el lisado aclarado del polipéptido sin la una o más deleciones o sustituciones expresadas en E. coli en las mismas condiciones, en donde el polipéptido aislado 35 muestra un aumento de al menos el 10% en la actividad de la esterasa en comparación con la actividad de la esterasa del polipéptido de tipo salvaje correspondiente sin deleción o sustitución de amino ácidos en donde la sustitución o eliminación se ha llevado a cabo en una o más posiciones seleccionadas del grupo de las posiciones de aminoácidos 260, 263, y posiciones correspondientes a las mismas.

40 En particular, la invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de esterasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 o un homólogo de la misma, que tiene una identidad de aminoácidos de más del 90%, preferiblemente más del 95%, más preferiblemente más del 97%, mucho más preferiblemente más del 98% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del 45 grupo de posiciones 43, 260, 263 o posiciones correspondientes a las mismas, preferiblemente estas sustituciones se seleccionan del grupo de sustituciones L43D, T260P, T260A, V263D, V263G o posiciones correspondientes a las mismas. En el marco de esta invención, los porcentajes de identidad (u homología) se determinaron o pueden determinarse como se describe en Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, usando los siguientes 50 parámetros estándar en

http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/bi2seg/wblast2.cgi

- para secuencias de proteínas:

55 Matriz: BLOSUM62

Hueco abierto: 5 hueco de extensión: 2 Penalizaciones de huecos x_dropoff: 11 Esperado: 10

tamaño de palabra: 11 - para nucleótidos:

5 Recompensa para correspondencia: 1

Penalización por falta de correspondencia: -2 Hueco abierto: 11 hueco de extensión: 1 Penalizaciones de huecos x_dropoff: 50 10 Esperado: 10

tamaño de palabra: 3

Las posiciones que pueden dirigirse para destruir las fuerzas de atracción de diferentes monómeros pueden identificarse mediante el análisis de estructuras de rayos X de PLE o enzimas homólogas (por ejemplo, 15 carboxilesterasa 1 de hígado humano, entrada PDB 1MX1 o la carboxilesterasa 1 de hígado de conejo, entrada PDB 1K4Y) o por experimentos de mutagénesis al azar. Las posiciones de aminoácidos preferidas para dirigir sustituciones son las posiciones 43, 260 y 263, y los aminoácidos de otras subunidades que interactúan con estos aminoácidos. Después de identificar las posiciones de aminoácidos que contribuyen a la estructura cuaternaria utilizando los métodos conocidos, se eligen sustituciones de aminoácidos para destruir las fuerzas de atracción. Las 20 sustituciones preferidas son el intercambio de residuos hidrófobos, por ejemplo, Alanina (abreviada como Ala o A), Valina (abreviada como Val o V), Isoleucina (abreviada como Ile o I), Leucina (abreviada como Leu o L), Metionina (abreviada como Met o M), Fenilalanina (abreviada como Phe o F), Triptófano (abreviado como Trp o W), Cisteína (abreviada como Cys o C), Prolina (abreviada como Pro o P), con menos aminoácidos hidrófobos o hidrófilos, por ejemplo Lisina (abreviada como Lys o K), Arginina (abreviada como Arg o R), Ácido aspártico (abreviado como Asp o 25 D), Ácido glutámico (abreviado como Glu o E), Serina (abreviada como Ser o S), Tirosina (abreviada como Tyr o Y), T reonina (abreviada como Thr o T), Glicina (abreviada como Gly o G), Histidina (abreviada como His o H), Glutamina (abreviada como Gln o Q), Asparagina (abreviada como Asn o N) y viceversa. Otras sustituciones de aminoácidos preferidas tienen como objetivo la destrucción de las fuerzas iónicas mediante la sustitución de aminoácidos cargados positivamente (por ejemplo, lisina, arginina o histidina) con aminoácidos cargados negativamente (por 30 ejemplo, ácido aspártico o ácidos glutámicos) o viceversa.

Por lo tanto, una mutación preferida es el reemplazo de L43 con cualquier aminoácido elegido del grupo de K, R, D, E, S, Y, T, G, H, Q y N. Otra mutación preferida es el reemplazo de T260 con cualquier aminoácido elegido del grupo de A, V, I, L, M, F, W, C y P. Otra mutación preferida es h266 con cualquier aminoácido elegido del grupo de A, V, I, 35 L, M, F, W, C y P y D y E. Otra mutación preferida es el reemplazo de Q270 con cualquier aminoácido elegido del grupo de A, V, I, L, M, F, W, C y P. Todas las mutaciones se describen en relación con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14.

Se prefieren particularmente las siguientes mutaciones, basadas en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera 40 de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14: V263D, L43D, T260P y T260A.

Se entenderá por un experto en la técnica que también son posibles una o más combinaciones de las mutaciones descritas, siempre que los reemplazos no den como resultado una secuencia de aminoácidos que permita una mayor formación de multímeros en relación con la cantidad de formación de multímero antes de que ocurra la 45 mutación.

Como se sabe, la numeración de los aminoácidos depende de la especie de la cual se origina la proteína. La numeración también puede cambiar como resultado de eliminaciones o inserciones. Es sabido, sin embargo, por un experto cómo alinear secuencias. Por lo tanto, en este texto, la frase "o correspondiente a las mismas" se usa para 50 describir las posiciones de aminoácidos que, salvo el número, son las mismas que las posiciones 43, 260 y 263 en la SEQ ID NO 1.

Los polipéptidos aislados de la invención pueden comprender, además de las mutaciones que disminuyen la formación de multímeros, una o más mutaciones adicionales, que mejoran la selectividad y/o la actividad hacia un 55 sustrato deseado.

Por lo tanto, en una realización preferida, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad esterasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 o un homólogo de las mismas que tiene una identidad de aminoácido de al menos más

del 90%, preferiblemente más del 95% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 43, 260 y 263, o posiciones correspondientes a las mismas, y una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo de F234S y L238V. Incluso más preferidas en esta realización, las sustituciones de aminoácidos son una o más sustituciones en 5 una o más posiciones seleccionadas del grupo de posición que comprende la posición 43, la posición 260 y la posición 263, o más específicamente seleccionadas del grupo de L43D, T260P, T260A, V263D y v263G.

La mutación F234S fue el resultado del reemplazo de T en la posición 701 del gen que codifica APLE por C. La mutación L238V fue el resultado del reemplazo de T por A en la posición 712 del gen que codifica APLE. 10 Independientemente de las mutaciones que impiden la formación de multímeros, los mutantes de uno cualquiera de los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 que comprenden al menos una de estas dos mutaciones, son muy útiles para la conversión de acetato de para-nitrofenilo y/o 3-(3,4-diclorofenil)-glutarato de dimetilo y/o para la resolución de éster metílico del ácido (4e)-5-cloro-2-isopropilpent-4-enoico rac. Por lo tanto, la invención también se refiere a dichos polipéptidos.

15

Por lo tanto, la invención también se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad esterasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 o un homólogo de las mismas, que tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 95% de identidad, preferiblemente el 97%, más preferiblemente el 98% con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, 20 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo de L238V y F234S. Preferiblemente, además de estar presentes las mutaciones L238V y/o F234S, las siguientes posiciones tienen los siguientes residuos de aminoácidos: en las posiciones 129, 133, 134, 138 y 139, los residuos son V, S, T, L y A, respectivamente. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 que tienen al menos una mutación elegida de L238V y 25 F234S. También es parte de la invención el uso de los polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 que tienen al menos una mutación elegida de L238V y F234S para la producción de un ácido, éster o alcohol, o más en particular para la conversión de acetato de para-nitrofenilo, o la resolución del éster metílico del ácido (4e)-5-cloro-2-isopropilpent-4-enoico racémico o la conversión de 3-(3,4-diclorofenil)-glutarato de dimetilo.

30

La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos aislados de acuerdo con la invención. En particular, la invención se refiere a ácidos nucleicos que son las secuencias codificantes en las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13 y homólogos de las mismas, preferiblemente con más del 80% de identidad, más preferiblemente más del 90%, incluso más preferible más del 95%, más preferiblemente más del 98% de identidad 35 con los ácidos nucleicos que son las secuencias codificantes en las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de ácidos, ésteres o alcoholes, en el que se aplica un péptido aislado de acuerdo con la invención. Además, la invención se refiere a dicho proceso en el que se fabrican ácidos y/o ésteres a-alquilados, más específicamente un proceso en el que los ácidos a-alquilados 40 ópticamente puros seleccionados de estos ácidos a-alquilados se reducen a sus alcoholes correspondientes. En un aspecto adicional, estos alcoholes se aplican adicionalmente como componentes básicos para miméticos de dipéptidos, siendo los miméticos de dipéptidos copias sintéticas de dipéptidos naturales. Además, la invención se refiere a la aplicación de estos componentes básicos en agentes reductores de la presión sanguínea.

45 La invención se refiere además a todas las combinaciones posibles de diferentes realizaciones y/o características preferidas de acuerdo con el péptido aislado, la secuencia de ácidos nucleicos, el uso del polipéptido y el proceso de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento.

Además, la invención se refiere a todas las realizaciones junto con las SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13, en las que 50 los polipéptidos están codificados por los Marcos de Lectura Abierta indicados en estas secuencias.

Materiales y métodos

Las técnicas generales para preparar polipéptidos y mutantes de los mismos se conocen en la técnica, y se pueden 55 encontrar en, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (2001).

Preparación de E. coli que expresa APLE, vPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 y mutantes correspondientes.

Los genes sintéticos yPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 (véanse las SEQ ID NOs 4, 6, 8, 10, 12 o 14) se cortaron con Ndel e HindIII y se clonaron en los sitios de restricción de Ndel e Hindlll de pCm470_DsbC_APLE-C8P que codifica APLE (véase la SEQ ID NO 2 y la Figura 1) usando técnicas de biología molecular estándar como se describe en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Manniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold 5 Spring Harbor Laboratory Press.

pCm470_DsbC_APLE-C8P y los plásmidos derivados anteriormente que codifican APLE, yPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 se transformaron en Origami B de E. coli (DE3).

10 Los mutantes de APLE, yPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 se prepararon por mutagénesis de saturación de sitio usando el kit de mutagénesis de sitio dirigido QuikChange® (Catálogo N.° 200518) de Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037) de acuerdo con el MANUAL DE INSTRUCCIONES proporcionado usando los plásmidos descritos anteriormente que codifican APLE, yPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 como plantillas.

15

Los ejemplos de cebadores de mutagénesis para mutagénesis de sitio dirigido se describen en las SEQ ID NOs 1524. Los plásmidos mutantes resultantes de APLE, yPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 se transformaron en Origami B de E. coli (DE3).

20 SeqID15: Cebador L43D_F

5' GTCCCTTTTGCTAAGCCACCTGACGGATCTTTGAGGTTTGC 3'

SeqID 16: Cebador L43D_R

5' GCAAACCTCAAAGATCCGTCAGGTGGCTTAGCAAAAGGGAC 3'

SeqID 17: CebadorT260P_F

25 5' GCAGGATGCAAAACTACTCCTTCGGCAGTCTTCGTGC 3'

SeqID 18: Cebador T260P_R

5'GCACGAAGACTGCCGAAGGAGTAGTTTTGCATCCTGC 3'

SeqID 19: Cebador T260A_F

5'GCAGGATGCAAAACTACTGCTTCGGCAGTCTTCGTGC 3'

30 SeqID 20: Cebador T260A_R

5'GCACGAAGACTGCCGAAGCAGTAGTTTTGCATCCTGC 3'

SeqID 21: Cebador V263D_F

5' CTACTACTTCGGCAGACTTCGTGCATTGTTTGC 3'

SeqID 22: Cebador V263D_R

35 5' GCAAACAATGCACGAAGTCTGCCGAAGTAGTAG 3'

SeqID 23: Cebador V263G_F

5' CAAAACTACTACTTCGGCAGGGTTCGTGCATTGTTTGCGTC 3'

SeqID 24: Cebador V263G_R

5' GACGCAAACAATGCACGAACCCTGCCGAAGTAGTAGTTTTG 3'

40

Expresión y cosecha de células.

Todos los componentes de los medios y los antibióticos se compraron en

Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, Alemania). Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: Se inocularon 20 ml 45 de medio LB de medio de cultivo previo (Lennox), que contenía 10 pg/ml de cloranfenicol con colonias de E. coli recombinantes que expresan APLE, yPLE, PICE, PLE2, PLE3, PLE4, PLE5 y mutantes correspondientes (preparación véase más arriba) y se incubaron en matraces Erlenmeyer de 100 ml a 28 °C y a 200 rpm durante una noche (18 h). Se utilizaron 10 ml del mismo para inocular 500 ml de medio LB de medio de cultivo principal (Lennox), que contenía 10 pg/ml de cloranfenicol) en matraces de agitación con deflector de 2 l. El cultivo principal se incubó a 50 28 °C y 120 rpm y se indujo mediante IPTG 0,1 mM a OD600 0,6 - 0,8 durante una noche (18 h). Para cosechar las células, los cultivos se centrifugaron a 4.000 x g durante 10 min a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en 25 ml de tampón de fosfato de potasio 20 mM, pH 8,0. Las células se sometieron a sonicación en un vaso de precipitados de pulpa enfriado con hielo-agua durante 5 min con un ciclo de trabajo del 80% y el nivel de control de salida 8 usando un Branson Sonfier® 250 (Branson, Danbury, Estados Unidos). Después de la centrifugación a 75.600 xg y 55 10 °C durante 1 h, el sobrenadante que contenía proteínas solubles se filtró de forma estéril (filtros de 0,2 pm) y se almacenó a 4 °C. Estos lisados aclarados se utilizaron para la determinación de la actividad usando el ensayo de acetato de para-nitrofenilo (p-NPA) (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemania).

Electroforesis en gel nativo

La electroforesis en gel nativo azul (BN-PAGE) de lisados bacterianos que contenían APLE se realizó de acuerdo con el método descrito por Reisinger and Eichacker (2006), "Analysis of membrane protein complexes by blue native PAGE", Proteomics 6 Suppl 2, 6-15, con las siguientes modificaciones. Las alícuotas que contenían 200 pg de 5 proteínas solubles se diluyeron con Tris/HCl 10 mM, pH 7,4 hasta un volumen final de 95 pl. Se añadieron cinco pl de tampón de carga a la muestra antes de aplicarlos en un gel de gradiente lineal al 8-16%. Los geles de gradiente (16 x 20 cm) se crearon con la ayuda de un modelo anterior Bio-Rad Gradient 485 (Bio-Rad Laboratories, Viena, Austria). La electroforesis se realizó a una corriente constante de 24 mA por gel a 4 °C. Después de la electroforesis, los geles se incubaron en tampón fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,0, durante 20 min a temperatura ambiente. Para la 10 detección en el gel de la actividad de la esterasa, el sustrato diacetato de fluoresceína (FDA) se disolvió en acetona [4 mg/ml] y se aplicó sobre una membrana Biodyne® A (0,45 mm, 16 x 20 cm) (Pall Life Science, Michigan, Estados Unidos). Después de la evaporación de la acetona, la membrana se puso en contacto con el gel que se colocó sobre una placa de vidrio. El emparedado de membrana de gel se incubó a 37 °C durante 30 minutos antes de la detección de bandas fluorescentes.

15

SDS-PAGE, análisis de transferencia Western y electroforesis en gel nativo.

La SDS-PAGE se basó en protocolos estándar. Antes de cargar en los geles (gel de separación: 12,5%, gel de apilamiento: 4%), las muestras que contenían 80 pg de proteínas totales se mezclaron con la cantidad respectiva de 20 tampón de muestra 2x y se calentaron a 40 °C durante 15 min. Se usó una unidad TE 22 Mighty Small Transphor Tank Transfer Unit (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para la transferencia de proteínas en una membrana de nitrocelulosa Hybond-ECL™ (Amersham Biosciences). El anticuerpo primario era un anticuerpo policlonal de conejo contra la carboxilesterasa de hígado porcino (abcam, Cambridge, Reino Unido). El anticuerpo secundario era un anticuerpo policlonal de cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina adsorbida contra proteínas séricas 25 humanas (Leinco Technologies, St. Louis, Estados Unidos). La detección se realizó con la detección BCIP/NBT (CALBIOCHEM/EMD, La Jolla, Estados Unidos) directamente en la membrana. El estándar de proteínas utilizado fue la escalera de proteínas con tinción previa PageRuler™ (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania).

Cuantificación de la actividad de PLE.

30

La actividad hacia el éster metílico del ácido (4E)-5-cloro-2-isopropilpent-4-enoico rac. y el 3-(3,4-diclorofenil)- glutarato de dimetilo se determinaron mediante autotitulación. Las mediciones se realizaron en un Mettler Toledo DL50 GraphiX (Mettler-Toledo GmbH; Giessen, Alemania), usando NaOH 0,1 M y 0,01 M, respectivamente, como agente de valoración (Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania). La mezcla de reacción total de 50 ml consistió en 35 5 ml de sustrato, es decir, éster metílico del ácido (4E)-5-cloro-2-isopropilpent-4-enoico racémico o 3-(3,4- diclorofenil)-glutarato de dimetilo [100 mg/ml] disueltos en tolueno, 5 ml de Tergitol® NP-9 al 10% (Sigma-Aldrich, Viena, Austria) y de 10 a 40 mg de proteínas solubles. Los volúmenes se adaptaron a 50 ml con tampón fosfato de potasio 20 mM, pH 8,0.

40 Se utiliza el siguiente ensayo de p-NPA:

Los ensayos de acetato de para-nitronofenilo (p-NPA) (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemania) se realizaron con lisados aclarados a temperatura ambiente en tampón Tris/HCl 100 mM, pH 7,0, utilizando p-NPA 2 mM. La liberación de para-nitrofenol se cuantificó a 405 nm (s = 9,5946 ml pmol-1 cm-1) utilizando un espectrofotómetro BeckmanCoulterDU® 800 (Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania). Una unidad se define 45 como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de para-nitrofenol en un minuto en las condiciones de reacción anteriores.

Ejemplos

50 La invención se aclarará con referencia a los siguientes ejemplos, sin embargo, no estará restringida por estos: Ejemplo 1: Cuantificación de la actividad de PLE.

El ensayo de p-NPA como se ha descrito anteriormente, se usó como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de 55 para-nitrofenol en un minuto en las condiciones de reacción anteriores.

La Figura 2 muestra el aumento en la actividad celular total hacia p-NPA de las PLE mutantes V263D expresadas en E. coli en comparación con las enzimas de tipo salvaje de PLE sin la mutación V263D expresada en E. coli. Como el nivel del 100% para cada PLE se toma el nivel de la variante de tipo salvaje de PLE respectiva.

En el marco de esta invención, todos los polipéptidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 y homólogos de las mismas se denominan PLE. Por lo tanto, también la enzima llamada carboxilesterasa intestinal porcina (PICE) es una PLE en el marco de esta invención.

Resulta evidente que todas las PLE tras insertar la mutación V263D mostraron una actividad mejorada.

Ejemplo 2

10 El cambio en la estructura cuaternaria de multímero a monómero en iso-enzimas con mutaciones V263D se observó además en la electroforesis en gel de proteína nativa (Figura 3).

La actividad de la esterasa se visualizó en el presente documento a través de la tinción con fluoresceína resultante de la hidrólisis de diacetato de fluoresceína (FDA). Las 7 enzimas de tipo salvaje son trímeros de aproximadamente 15 la misma altura en el gel nativo, mientras que los mutantes V263D muestran bandas en el tercio inferior del gel. Se extirparon múltiples bandas y se analizaron en un gel SDS-PAGE. Las bandas múltiples dan como resultado una banda clara del tamaño de aproximadamente 58 kDa (datos no mostrados). Se supone que estas bandas son resultado de diferentes conformaciones del mismo monómero.

20 Ejemplo 3: Determinación de la estructura cuaternaria

Centrifugación en gradiente de densidad de glicerol.

Las fracciones de 1 ml que variaban del 50% al 5% de glicerol en tampón fosfato de potasio 20 mM, pH 8,0, se 25 estratificaron cuidadosamente una encima de otra en tubos de centrífuga Ultra-Clear™ (14 x 89 mm) (Beckman, Palo Alto, Estados Unidos). Posteriormente, se estratificaron cuidadosamente 500 pl de lisado que contenía proteínas solubles en el mismo tampón en la parte superior. Se realizó una centrifugación de alta velocidad a aprox. 200.000 x g en un rotor SW 41 (Beckman, Palo Alto, Estados Unidos) durante 20 h a 4 °C. Las fracciones, es decir, 500 pl de glicerol al 0% y 1 ml de glicerol al 5 - 50%, se recogieron cuidadosamente en tubos de reacción de 1,5 ml y 30 se almacenaron a 4 °C.

Ensayo de filtro:

Se empaparon círculos de filtro estándar cualitativo de Whatman - grado de estudiante/grado 93 0 85 mm (Whatman 35 International Ltd., Maidstone, Inglaterra) en una mezcla de ensayo que contenía 2 mg/ml de rojo de fenol, pH 7,5, Tergitol® NP-9 al 1% (v/v) (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemania) y éster metílico del ácido (4E)-5-cloro-2-isopropilpent-4-enoico racémico al 10% (v/v) (DSM Fine Chemicals Austria GmbH, Linz, Austria) (para las figuras complementarias 5-10, el sustrato fue metilsuccinato de dimetilo racémico al 10% (v/v)). Si el valor de pH de la mezcla de ensayo era demasiado bajo, se añadieron volúmenes crecientes de tampón fosfato de potasio 1 M, 40 pH 8,0. Se mancharon 2 pl de extractos libres de células en los filtros. El cambio de color de rojo a amarillo, causado por la hidrólisis de los ésteres y la liberación de los respectivos ácidos carboxílicos, indica la actividad enzimática. La calidad del sustrato, la cantidad de tampón adicional y el pH de partida determinaron el tiempo necesario para un cambio de color.

45 El resultado muestra que la fracción principal del APLE de tipo salvaje localiza entre el 25% y el 30% de la concentración de glicerol, mientras que la fracción principal del mutante, el APLE monomérico, localiza entre el 15 y el 20% de glicerol, véase la Figura 4.

Se realizaron experimentos similares para todas las variantes de PLE de origen natural, y todos mostraron el mismo 50 efecto. (Véanse las figuras complementarias 5-10). El estándar de proteínas utilizado en todos los experimentos complementarios fue la escalera de proteínas teñida previamente PageRuler™.

Ejemplo 4

55 La actividad hacia acetato de para-nitrofenilo (gris claro) y 3-(3,4-diclorofenil)-glutarato de dimetilo (gris), y la actividad hacia acetato de para-nitrofenilo (gris claro) y éster metílico del ácido (4E)-5-cloro-2-isopropilpent-4-enoico rac (gris oscuro) se midió como se ha descrito anteriormente en la sección "Materiales y métodos", "Cuantificación de la actividad de PLE". Los resultados se muestran en la figura 11a y 11 b.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS:

Figura 3:

1a. APLE

1b: APLE con mutación V263D 2a: PLE3

2b: PLE3 con mutación V263D 3a:PLE4

3b: PLE4 con mutación V263D 4a: PLE5

4b: PLE5 con mutación V263D

Neg.C: origami B de E. coli de control negativo

5a: y-PLE

5b: y-PLE con mutación V263D 6a: PLE2

6b: PLE2 con mutación V263D 7a: PICE

7b: PICE con mutación V263D Figura 4:

a, b: APLE tipo salvaje c, d: APLE-V263D

a, c: Ensayos de cambio de pH

b, d: Transferencia Western

Figura 5:

a, b: yPLE de tipo salvaje c, d: yPLE-V263D

a, c: Ensayos de cambio de pH

b, d: Transferencia Western

Figura 6:

a, b: PICE de tipo salvaje c, d: PICE-V263D

a, c: Ensayos de cambio de pH

b, d: Transferencia Western

Figura 7:

a, b: PLE2 de tipo salvaje c, d: PLE2-V263D

a, c: Ensayos de cambio de pH

b, d: Transferencia Western

Figura 8:

a, b: PLE3 de tipo salvaje c, d: PLE3-V263D

a, c: Ensayos de cambio de pH

b, d: Transferencia Western

Figura 9:

a, b PLE4 de tipo salvaje c, d PLE4-V263D

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de esterasa que comprende una secuencia de aminoácidos con más del 90% de identidad con la secuencia mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o

5 14, en el que al menos una sustitución o eliminación de aminoácido ha tenido lugar en una posición de aminoácido que se localiza en un punto de interacción de monómeros cuando los monómeros están formando multímeros, y que destruye ese punto de interacción entre los monómeros, dando como resultado una mayor cantidad de polipéptido mutante presente en la forma monomérica en comparación con el polipéptido correspondiente sin mutación, y como resultado, en un polipéptido mutante que tiene una concentración aumentada de la fracción del polipéptido mutante 10 que está presente como una proteína activa y soluble en lisado aclarado del polipéptido mutante expresado en E. coli en relación con la concentración de la fracción del polipéptido sin que la mutación esté presente como una proteína activa y soluble en el lisado aclarado del polipéptido sin la una o más deleciones o sustituciones expresadas en E. coli en las mismas condiciones, en donde el polipéptido aislado muestra un aumento de al menos el 10% en la actividad de la esterasa en comparación con la actividad de la esterasa del polipéptido de tipo salvaje 15 correspondiente sin deleción o sustitución de amino ácidos en donde la sustitución o eliminación se ha llevado a cabo en una o más posiciones seleccionadas del grupo de las posiciones de aminoácidos 260, 263, y posiciones correspondientes a las mismas.
2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende secuencias de aminoácidos 20 con más del 95% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14.
3. Un polipéptido aislado que tiene actividad esterasa, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, o un homólogo de la misma que tenga una identidad de aminoácidos de más del 90 %, preferiblemente más del 95%, más preferiblemente más del

25 98% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, en donde las sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo de T260P, T260A, V263D, V263G y las posiciones correspondientes de los mismos.
4. Un polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende al 30 menos una mutación adicional seleccionada del grupo de L238V y F234S.
5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

35 6. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la producción de

un ácido, éster o alcohol.
7. Proceso para la fabricación de ácidos, ésteres o alcoholes, en el que se aplica un polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

40
8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que se fabrican ácidos y/o ésteres a-alquilados.
9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que los ácidos a-alquilados ópticamente puros se reducen a sus correspondientes alcoholes.

45

Actividad relativa de mutantes V263D hacia p-NPA [%]

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

FIG. 9

imagen5

FIG. 10

imagen6

imagen7