BE1023364B1 - Cellules de mammiferes exprimant des antigenes du cytomegalovirus - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne des protéines du cytomégalovirus (CMV) appropriées pour des utilisations vaccinales. Sont fournies ici des cellules hôtes de mammifères, en particulier des cellules CHO, dans lesquelles la ou les séquences codant pour les protéines du CMV gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou l'un de leurs fragments formant un complexe) sont intégrées de façon stable dans le génome.

Description

CELLULES DE MAMMIFERES EXPRIMANT DES ANTIGENES DU

CYTOMEGALOVIRUS

Domaine de l’invention [0001] Cette invention concerne des cellules hôtes exprimant des protéines du cytomégalovirus (CMV) appropriées pour des utilisations vaccinales.

Contexte de l’invention [0002] Le cytomégalovirus est un genre de virus qui appartient à la famille virale connue sous le nom de Herpèsviridés ou herpèsvirus. L’espèce qui infecte les êtres humains est couramment connue sous le nom de cytomégalovirus humain (HCMV) ou d’herpèsvirus-5 (HHV-5) humain. Parmi les Herpèsviridés, le HCMV appartient à la sous-famille des Bêta-herpesvirinés, qui comprend également les cytomégalovirus d’autres mammifères.

[0003] B ien qu’on puisse les trouver dans tout le corps, les infections à HCMV sont fréquemment associées aux glandes salivaires. Le hCMV infecte entre 50 % et 80 % des adultes aux Etats-Unis (40 % dans le monde), comme cela est indiqué par la présence d’anticorps chez une grande proportion de la population générale. Le HCMV passe généralement inaperçu chez les personnes en bonne santé, mais il peut menacer la vie des immunocompromis, comme les personnes infectées par le VIH, les receveurs de transplantation d’organe ou les nourrissons nouveau-nés. Le HCMV est le virus le plus fréquemment transmis aux fœtus en développement. Après une infection, le HCMV a la capacité de demeurer latent au sein du corps la vie durant de l’hôte, avec des réactivations occasionnelles depuis l’état latent. Etant donné la gravité et l'importance de cette maladie, l'obtention d'un vaccin efficace est considérée comme une priorité absolue pour la santé publique (Sung, H., et al., (2010) Expert review of vaccines 9, 1303-1314 ; Schleiss, Expert Opin Ther Pat. Apr 2010; 20(4): 597-602).

[0004] Les génomes de plus de 20 souches différentes du HCMV ont été séquencés, y compris ceux à la fois de souches de laboratoire et d'isolats. Par exemple, les souches suivantes du HCMV ont été séquencées : Towne (GL239909366), AD169 (GI: 219879600), Toledo (GL290564358) et Merlin (GI: 155573956). Les souches du HCMV AD169, Towne et Merlin peuvent être obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC VR538, ATCC VR977 et ATCC VR1590, respectivement).

[0005] Le CMV contient un nombre inconnu de complexes de protéines membranaires. Parmi les approximativement 30 glycoprotéines connues dans l'enveloppe virale, la gH et la gL sont apparues comme étant particulièrement intéressantes en raison de leur présence dans plusieurs complexes différents : le dimère gH/gL, le trimère gH/gL/gO (également connu comme le complexe gCIII), et le pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 (la pUL131 est également appelée « pUL131A », « pUL131a », ou « UL131A » ; les sous-unités pUL128, pUL130, et pUL131 sont parfois également appelées UL12 8, UL130, UL131) . On pense que le CMV utilise les complexes pentamères pour pénétrer dans les cellules épithéliales et endothéliales par endocytose et fusion dépendante d'un pH bas mais on pense qu'il pénètre dans les fibroblastes par fusion directe à la membrane plasmatique dans un processus impliquant le complexe gH/gL ou éventuellement gH/gL/gO. Le(s) complexe(s) gH/gL et/ou gH/gL/gO est/sont suffisant(s) pour l'infection des fibroblastes, tandis que le complexe pentamère est requis pour infecter les cellules endothéliales et épithéliales.

[0006] Le complexe pentamère est considéré comme une cible majeure pour la vaccination contre le CMV. Les gènes viraux UL128, UL130 et UL131 sont nécessaires à la pénétration dans les cellules endothéliales (Hahn, Journal of Virology 2004; 78: 10023-33) . Les souches à tropisme non endothélial adaptées aux fibroblastes contiennent des mutations dans au moins trois de ces gènes. La souche Towne, par exemple, contient une insertion de 2 paires de bases provoquant un décalage du cadre dans le gène UL130, tandis que AD169 contient une insertion de 1 paire de bases dans le gène UL131. A la fois Towne et AD169 ont pu être adaptées pour une croissance dans des cellules endothéliales, et dans les deux cas, les mutations de décalage du cadre dans les gènes UL130 ou UL131 ont été réparées.

[0007] Le brevet US 7 704 510 divulgue que la pUL131A est nécessaire pour un tropisme des cellules épithéliales. Le brevet US 7 704 510 divulgue également que la pUL128 et la pUL130 forment un complexe avec gH/gL, qui est incorporé dans les virions. Ce complexe est nécessaire pour infecter les cellules endothéliales et épithéliales mais pas les fibroblastes. Il a été découvert que des anticorps anti-CD46 inhibent l’infection par le HCMV des cellules épithéliales.

[0008] Des vaccins contre le CMV testés dans des essais cliniques comprennent le vaccin à base de Towne, des chimères Towne-Toledo, un réplicon d’alphavirus avec la gB comme antigène, un vaccin à base de gB/MF59, un vaccin à base de gB produit par GlaxoSmithKline, et un vaccin à base d’ADN utilisant la gB et la pp65. La pp65 est une protéine virale qui est un inducteur puissant des réponses CD8+ dirigées contre le CMV. Ces vaccins sont tous des inducteurs médiocres d’anticorps qui bloquent la pénétration du virus dans les cellules endothéliales/épithéliales (Adler, S. P. (2013), British Medical Bulletin, 107, 57-68. doi:10.1093/bmb/ldt023).

[0009] On pense de façon générale que des anticorps neutralisants dirigés contre le complexe pentamère (gH/gLpUL128/pUL130/pUL131) seront significativement plus puissants que des anticorps neutralisants dirigés contre la sous-unité gB, ou le complexe dimère gH/gL du CMV. Par conséquent, pour développer un vaccin efficace contre le CMV, il existe un besoin urgent de production de grandes quantités (par exemple, à des échelles commerciales) du complexe pentamère du CMV.

[0010] Toutefois, la production recombinante du complexe pentamère du CMV demeure un défi. Les cinq sous-unités doivent être exprimées (de préférence dans une quantité substantiellement égale, et de préférence pendant une période de temps prolongée), repliées correctement, et assemblées de façon correcte en un pentamère. En outre, il existe également un besoin d'éviter l'assemblage non souhaité de complexes contaminants (comme le dimère gH/gL, le tétramère gH/gL (deux copies de gH et deux copies de gL) , le tétramère gH/gLpUL128/pUL130, etc.).

[0011] L'expression recombinante d'un tel complexe de protéines eucaryotes nécessitera l'identification de constructions appropriées et d'hôtes appropriés, pour l'expression de quantités suffisantes de protéines repliées correctement pendant une période de temps prolongée, qui peuvent ensuite s'assembler correctement en complexes de protéines. En outre, la sélection d’un hôte d’expression approprié a un impact significatif sur le rendement et la qualité des protéines, ainsi que sur les coûts véritables du procédé de production. Résumé de l'invention [0012] Il est divulgué et exemplifié ici des cellules hôtes de mammifères, en particulier des cellules CHO, dans lesquelles la/les séquence(s) codant pour les protéines du CMV gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou l’un de leurs fragments formant un complexe) est/sont intégrée(s) de façon stable dans le génome. De telles cellules hôtes fournissent une source fiable où le complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 peut être produit de façon recombinante.

[0013] Dans un aspect, l’invention propose une cellule de mammifère recombinante, comme une cellule de rongeur (par exemple, une cellule CHO) comprenant une ou plusieurs séquences polynucléotidiques codant pour le complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV), où ledit complexe pentamère comprend (i) la gH ou l’un de ses fragments formant un complexe, (ii) la gL ou l’un de ses fragments formant un complexe, (iii) la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, (iv) la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et (v) la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe, où lesdites une ou plusieurs séquences polynucléotidiques sont intégrées dans l’ADN génomique de ladite cellule de mammifère. Parce que les séquences nucléotidiques sont intégrées de façon stable dans l’ADN génomique de la cellule, elles peuvent être transmises à la descendance comme faisant partie des séquences génomiques. De telles cellules sont souvent qualifiées dans l’art de lignées cellulaires stables. En particulier, la cellule ne comprend pas les séquences virales du CMV qui pourraient entraîner la production de virus CMV infectieux. Dans certains modes de réalisation, la cellule de mammifère est une cellule CHO. Lorsqu’elle est cultivée dans des conditions appropriées, ledit complexe pentamère du CMV est exprimé par ladite cellule hôte.

[0014] Les cellules CHO appropriées comprennent, par exemple, toutes les lignées cellulaires CHO disponibles à l’American Type Culture Collection (ATCC) ou à l’European Collection of Cell Cultures (ECACC). Les exemples de lignées cellulaires CHO comprennent, par exemple, les cellules CHO-K1, CHO-DUXB11, CHO-DG44, ou CHO-S. Pour faciliter la sélection des clones intégrés de façon stable, les cellules hôtes peuvent être déficientes pour la dihydrofolate réductase (DHFR). L’expression de protéines de recombinaison dans des lignées cellulaires déficientes pour la DHFR ou compétentes pour la DHFR peut être également criblée par une sélection au méthotrexate (MTX).

[0015] La cellule hôte peut comporter une ou plusieurs modifications supplémentaires pour encore amplifier la production du complexe pentamère du CMV. Dans certains modes de réalisation, le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit dans la cellule hôte, comparativement à un témoin. Dans certains modes de réalisation, le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit dans la cellule hôte, comparativement à un témoin. Dans certains modes de réalisation, le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit dans la cellule hôte, comparativement à un témoin. Les modifications décrites ici peuvent être utilisées seules ou dans n’importe quelle combinaison.

[0016] Le complexe pentamère du CMV produit de façon recombinante peut être soluble (par exemple, auquel il manque le domaine transmembranaire de la gH). Pour faciliter la production, le complexe pentamère du CMV produit de façon recombinante peut être sécrété à partir de la cellule hôte dans le milieu de culture.

[0017] Les cellules hôtes de mammifères décrites ici sont particulièrement appropriées pour une production à grande échelle, comme des cultures qui ont une taille d’au moins 20 litres (par exemple, 50 litres, 100 litres, etc.) . Dans certains modes de réalisation, le rendement du complexe pentamère du CMV est d’au moins 0,05 g/l, ou d’au moins 0,1 g/l.

Brève description des figures [0018] La figure 1 illustre diverses stratégies de conception pour la coexpression des cinq composants du pentamère.

[0019] La figure 2 représente les cartes plasmidiques des vecteurs d'expression utilisés pour la transfection de cellules CHO.

[0020] La figure 3 représente l’analyse SDS-PAGE du pentamère purifié produit avec les 12 principaux clones.

[0021] La figure 4 illustre les conceptions expérimentales utilisées pour étudier la stabilité des 12 principaux clones.

[0022] La figure 5 représente le rendement du pentamère produit par le clone principal VF7.

Description détaillée de l'invention 1. Généralités [0023] L' une des cibles principales pour une vaccination contre le CMV est le complexe pentamère (gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131). Pour produire un pentamère recombinant du CMV à une échelle commerciale, il existe le besoin d'identifier des constructions appropriées et des hôtes appropriés, de telle façon que les cinq sous-unités du pentamère peuvent être exprimées dans des quantités suffisantes pendant une période de temps prolongée, et peuvent s'assembler correctement en un complexe pentamère. Le pentamère du CMV est une cible primaire des anticorps neutralisants dirigés contre le CMV humain.

[0024] Le pentamère du CMV a été produit de façon recombinante en utilisant des cellules HEK293 en tant que cellules hôtes. Voir, le document WO 2014/005959. Toutefois, la lignée cellulaire HEK293 est généralement reconnue dans l’art comme l’une des meilleures lignées de cellules hôtes pour une expression transitoire de gènes. Voir, Meyer et al., PLoS One, 2013 Jul 17;8(7):e68674. doi: 10.1371/journal.pone.0068674. Toutefois, il sera difficile de maintenir l’expression du pentamère pendant une période de temps prolongée dans des cellules HEK293 transfectées de façon transitoire. En outre, dans les exemples divulgués dans le document WO 2014/005959, les cinq sous-unités du pentamère ont été introduites dans des cellules HEK293 par l’intermédiaire de cinq plasmides différents. Dans cette configuration, il sera facile de maintenir l’expression de chaque sous-unité du pentamère à un taux substantiellement égal. Une quantité inégale des sous-unités peut réduire l’efficacité de l’assemblage du pentamère, d’autant plus que ces sous-unités ont déjà une tendance à former des complexes contaminants, comme le dimère gH/gL, le tétramère gH/gL (2 copies de gH et 2 copies de gL) , le tétramère gH/gLpUL128/pUL130. En outre, le plasmide codant pour la gH a été sélectionné par la néomycine, les quatre plasmides codant pour les gL, pUL128, pUL130, et pUL131, respectivement, ont tous été sélectionnés par la kanamycine. Par conséquent, parce que les quatre plasmides ont été sélectionnés par la kanamycine, la perte d’un seul plasmide dans une cellule hôte ne pourra pas être facilement détectée, mais la perte d’un seul plasmide empêchera l’assemblage du pentamère.

[0025] Comme cela est divulgué et exemplifié ici, les inventeurs ont surmonté les difficultés de la production recombinante du pentamère du CMV en utilisant des cellules d’ovaire de hamster de Chine (CHO) . Dans ces cellules CHO, les séquences codant pour les gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou l’un de leurs fragments formant un complexe) sont intégrées de façon stable dans le génome des cellules CHO. En intégrant les séquences codant pour le pentamère dans le génome de la cellule CHO, les inventeurs ont obtenu une expression génomique stable du pentamère recombinant, avec une efficacité et une stabilité génomique élevées. Comme cela est exemplifié dans la section des exemples, il a été découvert que, comparativement aux cellules HEK293 transfectées de façon transitoire, les lignées CHO stables ont obtenu de façon régulière des rendements 100 fois supérieurs, rendant ces lignées cellulaires CHO particulièrement appropriées pour la production commerciale du pentamère du CMV. L'intégration stable permet également une manipulation aisée d'une culture cellulaire à grande échelle, comparativement aux cellules HEK transfectées de façon transitoire avec cinq plasmides exogènes. En fait, les clones principaux ont produit le pentamère avec un rendement aussi élevé que 0,1 g/l à 0,5 g/l.

[0026] D’autres améliorations des cellules hôtes pour la production du pentamère du CMV sont également fournies ici. En particulier, trois cellules hôtes modifiées sont exemplifiées : (i) des cellules hôtes dans lesquelles le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit, comparativement à un témoin ; (ii) des cellules hôtes dans lesquelles le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit, comparativement à un témoin ; (iii) des cellules hôtes dans lesquelles le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit comparativement à un témoin. Il a été découvert que la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la protéine C12orf35 ou de la protéine FAM60A entraîne une augmentation significative du taux d’expression d’une protéine recombinante. Il a été également découvert que la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la matriptase diminue significativement la dégradation protéolytique (« coupure ») d’une protéine recombinante. Ces modifications peuvent être utilisées seules ou dans n’importe quelle combinaison.

[0027] Par conséquent, il est proposé ici des cellules hôtes de mammifères, en particulier des cellules CHO, dans lesquelles la/les séquence(s) polynucléotidique(s) codant pour le complexe pentamère du CMV comprenant les gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou l’un de leurs fragments formant un complexe) sont intégrées de façon stable dans l’ADN génomique. Lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions appropriées, ledit complexe pentamère du CMV est exprimé par lesdites cellules hôtes.

[0028] Il est également proposé ici un complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV) produit par les cellules de mammifères décrites ici.

[0029] Il est également proposé ici un procédé de production du complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV), dans lequel ledit complexe pentamère comprend : la gH ou l’un de ses fragments formant un complexe, la gL ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe, comprenant : (i) la culture de la cellule de mammifère telle que décrite ici dans des conditions appropriées, exprimant de cette façon ledit complexe pentamère ; et la récolte dudit complexe pentamère à partir de la culture. Le complexe pentamère peut être en outre purifié. Il est également proposé ici un complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV) produit par ce procédé.

[0030] Il est également proposé ici une composition comprenant le complexe pentamère décrit ici. La composition peut comprendre un complexe pentamère du CMV purifié qui est approprié pour une administration in vivo. Par exemple, le complexe pentamère dans une telle composition peut avoir une pureté d’au moins 85 %, d’au moins 86 %, d’au moins 87 %, d’au moins 88 %, d’au moins 89 %, d’au moins 90 %, d’au moins 91 %, d’au moins 92 %, d’au moins 93 %, d’au moins 94 %, d’au .... I Jl ' 1 moins 95 %, d’au moins 96 %, d’au moins 97 %, d’au moins 98 %, ou d’au moins 99 %, en masse. La composition peut comprendre en outre un adjuvant, comme un sel d’aluminium, ou le MF59.

[0031] Il est également proposé ici une composition pour une utilisation dans l’induction d’une réponse immunitaire contre le CMV. L’utilisation de la composition décrite ici pour l’induction d’une réponse immunitaire contre le CMV et l’utilisation de la composition décrite ici dans la fabrication d’un médicament destiné à l’induction d’une réponse immunitaire contre le CMV sont également fournies.

2. Complexes pentamères du CMV et séquences codantes A. Complexes pentamères du CMV

[0032] Dans un aspect, l’invention propose une cellule hôte de mammifère qui exprime le complexe pentamère du CMV, où ledit complexe pentamère comprend (i) la gH ou l’un de ses fragments formant un complexe, (ii) la gL ou l’un de ses fragments formant un complexe, (iii) la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, (iv) la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et (v) la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe. Les séquences polynucléotidiques codant pour le complexe pentamère du CMV sont intégrées dans l’ADN génomique de la cellule hôte, et, lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions appropriées, ledit complexe pentamère du CMV est exprimé par ladite cellule hôte.

[0033] Dans certains modes de réalisation, ledit complexe pentamère est soluble. Le complexe pentamère soluble peut être obtenu, par exemple, en utilisant un fragment de la gH dans lequel le domaine transmembranaire de la sous-unité gH est délété, comme cela est décrit en détail ci-dessous.

[0034] Dans certains modes de réalisation, ledit complexe pentamère est sécrété à partir de la cellule hôte. Il a été rapporté que la présence des cinq sous-unités, gH, gL, pUL128, pUL131, et pUL131, est suffisante pour l’assemblage du complexe pentamère dans le RE avant son exportation vers l’appareil de Golgi. Voir, Ryckman et al., J Virol. Jan 2008; 82(1) : 60-70. En variante ou en outre, un peptide signal approprié peut être utilisé dans une ou plusieurs des cinq sous-unités (par exemple, en fabriquant une protéine de fusion avec un signal sécrétoire). Les séquences signal (et la cassette d’expression) pour la production de protéine sécrétoire sont connues dans l’art. En général, les peptides de tête ont une longueur de 5 à 30 acides aminés, et ils sont généralement présents à l’extrémité N-terminale d’une protéine nouvellement synthétisée. Le cœur du peptide signal contient généralement une longue séquence d’acides aminés hydrophobes qui a tendance à former une seule hélice alpha. En outre, de nombreux peptides signal débutent par une séquence d’acides aminés chargés positivement, qui peut aider à l’application de la topologie correcte du polypeptide durant la translocation. A la fin du peptide signal, il y a généralement une séquence d’acides aminés qui est reconnue et clivée par une signal peptidase. La signal peptidase peut cliver soit durant soit après la complétion de la translocation pour produire un peptide signal libre et une protéine mature.

[0035] La glycoprotéine H (gH) du CMV humain, codée par le gène UL75, est une glycoprotéine de virion qui est essentielle à l’infectivité et qui est conservée parmi les membres des alpha-, bêta- et gamma-herpèsvirus. Elle peut former un complexe stable avec la gL, et la formation de ce complexe facilite l’expression à la surface cellulaire de la gH. En se basant sur les structures cristallines des complexes gH/gL du HSV-2 et de l’EBV, la sous-unité gL et les résidus N-terminaux de la gH forment un domaine globulaire à une extrémité de la structure (la « tête »), qui est impliqué dans les interactions avec la gB et l’activation de la fusion membranaire. Le domaine C-terminal de la gH, proximal à la membrane virale (la « queue »), est également impliqué dans la fusion membranaire. La gH affiche des déterminants qui sont reconnus par le facteur de l’hôte TLR2, et elle interagit directement avec un hétérodimère formé entre les facteurs de l’hôte TLR2 et TLR1. Le TLR2 médie l’activation du NF-κΒ et les réponses des cytokines inflammatoires à partir des cellules.

[0036] La gH provenant de la souche du CMV Merlin est représentée par SEQ ID NO : 1 (GI:52139248, 742 résidus d’acides aminés). La gH provenant de la souche du CMV Towne est représentée par SEQ ID NO : 2 (GI:138314, également 742 résidus d’acides aminés). La gH de Towne a été caractérisée comme comportant : (i) six sites de N-glycosylation (au niveau des résidus 55, 62, 67, 192, 641 et 700) ; (ii) une séquence signal hydrophobe à son extrémité N-terminale (résidus d’acides aminés 1 à 23) ; (iii) un ectodomaine (résidus 24 à 717) qui se projette hors de la cellule dans l’espace extracellulaire ; (iv) un domaine transmembranaire (TM) hydrophobe (résidus 718 à 736) ; et (v) un domaine cytoplasmique C-terminal (résidus 737 à 742). SEQ ID NO : 2 partage 99 % et 96 % d’identité de séquence d’acides aminés avec SEQ ID NO : 1, et la gH provenant de la souche du CMV AD169 (GI:138313, SEQ ID NO : 3), respectivement.

[0037] Généralement, la séquence signal N-terminale de la protéine gH pleine longueur est clivée par une signal peptidase de la cellule hôte pour produire une protéine gH mature. En tant que telle, à la protéine gH exprimée par la cellule hôte décrite ici, il peut manquer la séquence signal N-terminale (par exemple, la gH est codée par une séquence nucléotidique à laquelle il manque la séquence codant pour la séquence signal N-terminale).

[0038] Sont également englobés dans l’invention, des fragments formant un complexe de la gH, comme un fragment de la gH auquel il manque le domaine transmembranaire (TM) (par exemple, les résidus 718 à 736 de SEQ ID NO : 2), le domaine C-terminal (par exemple, les résidus 737 à 742 de SEQ ID NO : 2), la séquence signal N-terminale (par exemple, les résidus 1 à 23 de SEQ ID NO : 2), ou l’une de leurs combinaisons. Un fragment formant un complexe de la gH peut être toute partie ou portion de la protéine gH qui conserve la capacité de former un complexe avec une autre protéine du CMV. Dans certains modes de réalisation, un fragment formant un complexe de la gH forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. Par exemple, l’expression de la séquence de la gH pleine longueur peut gêner la purification du complexe pentamère soluble parce que le domaine TM de la gH est hydrophobe. A la place, le complexe pentamère peut comprendre un fragment de la gH avec au moins une portion du domaine TM de la gH délétée.

[0039] Par exemple, un fragment de la gH comprenant la séquence signal N-terminale et l’ectodomaine de la gH, mais pas le domaine TM, peut être utilisé. Un fragment approprié de la gH peut également comprendre une portion de l’ectodomaine de la gH (par exemple, au moins environ 70 %, au moins environ 80 %, au moins environ 85 %, au moins environ 90 %, au moins environ 95 %, au moins environ 96 %, au moins environ 97 %, au moins environ 98 %, ou au moins environ 99 % de la séquence de l’ectodomaine de la gH), mais aucune, ou seulement une petite portion du domaine TM. En variante, au fragment de la gH décrit ici, il peut manquer entre 1 et 20 résidus d’acides aminés (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 résidus d’acides aminés, ou il manque 1 à 20 résidus, 1 à 15 résidus, 1 à 10 résidus, 2 à 20 résidus, 2 à 15 résidus, 2 à 10 résidus, 5 à 20 résidus, 5 à 15 résidus, ou 5 à 10 résidus) à l’extrémité N-terminale et/ou à l’extrémité C-terminale de l’ectodomaine pleine longueur. On pense que les résidus au niveau des domaines C-terminaux ne sont pas nécessaires à l’immunogénicité. Un exemple de fragment approprié de la gH décrit ici est représenté par SEQ ID NO : 4, qui correspond aux résidus d’acides aminés 1 à 715 de SEQ ID NO : 1. Un autre exemple de fragment de la gH décrit ici est représenté par SEQ ID NO : 5, auquel il manque la séquence signal N-terminale, le domaine TM et le domaine C-terminal de la gH, et correspond aux résidus d’acides aminés 24 à 715 de SEQ ID NO : 1. Un autre exemple de fragment de la gH décrit comprend la séquence signal N-terminale entière et l’ectodomaine, mais auquel il manque le domaine C-terminal.

[0040] L’ectodomaine de la gH correspond au domaine extracellulaire de la gH. La localisation et la longueur de l’ectodomaine d’une gH (ou de l’un de ses homologues ou de ses variants) peuvent être prédites en se basant sur un alignement par paires de sa séquence avec les SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, ou 5, par exemple en alignant la séquence d’acides aminés d’une gH avec SEQ ID NO : 1, et en identifiant la séquence qui s’aligne avec les résidus 24 à 717 de SEQ ID NO : 1. De façon similaire, les localisations de la séquence signal, du domaine TM, et du domaine C-terminal peuvent être prédites en alignant la séquence d’acides aminés d’une gH avec les SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, ou 5, et en identifiant les séquences qui s’alignent avec les régions correspondantes (par exemple, les résidus 1 à 23 (séquence signal), 718 à 736 (TM) et 737 à 742 (domaine C-terminal) de SEQ ID NO : 1, respectivement). En variante, la localisation et la longueur de l’ectodomaine, de la séquence signal, du domaine TM, et du domaine C-terminal peuvent être prédites en se basant sur une analyse informatique de l’hydrophobicité tout le long d’une séquence de gH donnée. La séquence signal et le domaine TM présentent les taux les plus élevés d'hydrophobicité et ces deux régions flanquent l'ectodomaine, qui est moins hydrophobe.

[0041] Un fragment formant un complexe approprié de la gH peut être également obtenu ou déterminé par des tests classiques connus dans l'art, comme un test de coimmunoprécipitation, la réticulation, ou la co-localisation par coloration fluorescente, etc. Une SDS-PAGE ou une analyse Western blot peut être également utilisée (par exemple, en montrant que les cinq sous-unités sont présentes dans une électrophorèse sur gel) . Dans certains modes de réalisation, le fragment formant un complexe de la gH (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, ou SEQ ID NO : 5 ; et/ou (iii) peut déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0042] D'autres protéines gH appropriées peuvent être des variants de la gH qui présentent divers degrés d'identité avec SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, ou 5, comme au moins identiques à 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec la séquence citée dans SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, ou SEQ ID NO : 5. Dans certains modes de réalisation, les protéines variantes de la gH : (i) forment une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprennent au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, ou SEQ ID NO : 5 ; et/ou (iii) peuvent déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0043] La glycoprotéine L (gL) du CMV humain est codée par le gène UL115. On pense que la gL est essentielle à la réplication virale et toutes les propriétés fonctionnelles connues de la gL sont directement associées à sa dimérisation avec la gH. Le complexe gL/gH est nécessaire pour la fusion des membranes virale et plasmatique menant à la pénétration du virus dans les cellules hôtes. Il a été rapporté que la gL provenant de la souche du CMV Merlin (GI: 39842115, SEQ ID NO : 6) et de la souche du CMV Towne (GI: 239909463, SEQ ID NO : 7) a une longueur de 278 acides aminés. Il a été rapporté que la gL provenant de la souche du HCMV AD169 (GI: 2506510, SEQ ID NO : 8) a une longueur de 278 acides aminés, avec une séquence signal à son extrémité N-terminale (résidus d’acides aminés 1 à 35), deux sites de N-glycosylation (au niveau des résidus 74 et 114), et à laquelle il manque un domaine TM. La séquence signal N-terminale dans SEQ ID NO : 6 est prédite pour comprendre les résidus d’acides aminés 1 à 30. SEQ ID NO : 7 partage 98 % d’identité de séquence d’acides aminés avec SEQ ID NO : 6. Le séquençage du gène de la gL pleine longueur provenant de 22 à 39 isolats cliniques, ainsi que de souches de laboratoire AD169, Towne et Toledo a révélé moins de 2 % de variation dans les séquences d’acides aminés parmi les isolats.

[0044] Généralement, la séquence signal N-terminale de la protéine gL pleine longueur est clivée par un signal peptidase de la cellule hôte pour produire une protéine gL mature. En tant que telle, à la protéine gL exprimée par la cellule hôte décrite ici, il peut manquer la séquence signal N-terminale (par exemple, la gL est codée par une séquence nucléotidique à laquelle il manque la séquence codant pour la séquence signal N-terminale). Un exemple d’une gL à laquelle il manque la séquence signal est SEQ ID NO : 9, qui comprend les résidus d’acides aminés 31 à 278 de SEQ ID NO : 6, et à laquelle il manque une séquence signal N-terminale de SEQ ID NO : 6. La séquence signal d’autres protéines gL peut être déterminée par alignement des séquences ou des outils d’analyse des séquences tels que décrits ci-dessus.

[0045] Sont également englobés dans l’invention des fragments formant un complexe de la gL. Un fragment formant un complexe de la gL peut être toute partie ou portion de la protéine gL qui conserve la capacité de former un complexe avec une autre protéine du CMV. Dans certains modes de réalisation, un fragment formant un complexe de la gL forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.

[0046] Un fragment formant un complexe approprié de la gL peut être obtenu ou déterminé par des tests classiques connus dans l’art, comme un test de co-immunoprécipitation, la réticulation, ou la co-localisation par coloration fluorescente, etc. Une SDS-PAGE ou une analyse Western blot peut être également utilisée (par exemple, en montrant que les cinq sous-unités sont présentes dans une électrophorèse sur gel) . Dans certains modes de réalisation, le fragment formant un complexe de la gL (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, ou SEQ ID NO : 9 ; et/ou (iii) peut déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0047] D’autres protéines gL appropriées peuvent être des variants de la gL (et des fragments de variants) qui présentent divers degrés d’identité avec SEQ ID NO : 6, 7, 8, ou 9, comme au moins identiques à 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec la séquence citée par SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, ou SEQ ID NO : 9. Dans certains modes de réalisation, les protéines variantes de la gL : (i) forment une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprennent au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, ou SEQ ID NO : 9 ; et/ou (iii) peuvent déclencher des anticorps in vivo présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0048] Il a été rapporté que la pUL128 provenant de la souche du CMV humain Merlin (GI: 39842124, SEQ ID NO : 10) comporte 130 résidus d’acides aminés, et avec 1 substitution de nucléotide provoquant une terminaison prématurée. Il a été rapporté que la pUL128 provenant des souches du CMV humain Towne (GI: 39841882, SEQ ID NO : 11) et AD169 (GI: 59803078, SEQ ID NO : 12) comporte 171 résidus d’acides aminés. SEQ ID NO : 10 et 12 partagent plus de 99 % d’identité de séquence sur la pleine longueur de SEQ ID NO : 10 ; toutefois, à cause de la terminaison prématurée de la traduction, SEQ ID NO : 10 ne comporte pas les 41 résidus d’acides aminés C-terminaux de SEQ ID NO : 12 (environ 75 % d’identité de séquence sur la pleine longueur de SEQ ID NO : 12).

[0049] Il est prédit que la pUL128 comporte une séquence signal N-terminale, qui est localisée au niveau des résidus 1 à 27 de SEQ ID NO : 10, mais il est prédit qu’il lui manque un domaine TM. La séquence signal N-terminale de la protéine pUL128 pleine longueur peut être clivée par une signal peptidase de la cellule hôte pour produire une protéine pUL128 mature. En tant que telle, à la protéine pUL128 exprimée par la cellule hôte décrite ici, il peut manquer la séquence signal N-terminale (par exemple, la pUL128 est codée par une séquence nucléotidique à laquelle il manque la séquence codant pour la séquence signal N-terminale). Un exemple d’une protéine pUL128 mature est SEQ ID NO : 13, à laquelle il manque une séquence signal N-terminale et qui correspond aux résidus d’acides aminés 28 à 171 de SEQ ID NO : 11. SEQ ID NO : 13 correspond également aux acides aminés 28 à 171 de SEQ ID NO : 12.

[0050] Sont également englobés dans l’invention des fragments formant un complexe de la pUL128. Un fragment formant un complexe de la pUL128 peut être toute partie ou portion de la protéine pUL128 qui conserve la capacité de former un complexe avec une autre protéine du CMV. Dans certains modes de réalisation, un fragment formant un complexe de la pUL128 forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.

[0051] Un fragment formant un complexe approprié de la pUL128 peut être obtenu ou déterminé par des tests classiques connus dans l'art, comme un test de co-immunoprécipitation, la réticulation, ou la co-localisation par coloration fluorescente, etc. Une SDS-PAGE ou une analyse Western blot peut être également utilisée (par exemple, en montrant que les cinq sous-unités sont présentes dans une électrophorèse sur gel). Dans certains modes de réalisation, le fragment formant un complexe de la pUL128 (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, ou SEQ ID NO : 13 ; et/ou (iii) peut déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0052] D’autres protéines pUL128 appropriées peuvent être des variants de la pUL128 (et des fragments de variants) qui présentent divers degrés d’identité avec SEQ ID NO : 10, 11, 12, ou 13, comme au moins identiques à 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec la séquence citée par SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, ou SEQ ID NO : 13. Dans certains modes de réalisation, les protéines variantes de la pUL128 : (i) forment une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprennent au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, ou SEQ ID NO : 13 ; et/ou (iii) peuvent déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0053] UL130 est le gène central et le plus grand (214 codons) du locus UL131A-128. La traduction conceptuelle du gène prédit une longue séquence signal N-terminale (25 acides aminés) qui précède une protéine hydrophile, avec deux sites potentiels de N-glycosylation (Asn85 et Asn118) au sein d’un domaine de chimiokine putatif (acides aminés 46 à 120), et un site supplémentaire de N-glycosylation (Asn201) proche de l’extrémité d’une région C-terminale unique. Il est prédit qu’à la pUL130 il manque un domaine TM. Il a été rapporté qu’il s’agit d’une glycoprotéine luminale qui est sécrétée de façon inefficace à partir de cellules infectées mais qui est incorporée dans l’enveloppe du virion sous une forme mature après passage dans l’appareil de Golgi. Les séquences de la pUL130 provenant des souches du CMV humain Merlin et Towne sont disponibles au public (GI: 39842125, SEQ ID NO : 14, 214 résidus d’acides aminés ; et GI: 239909473, SEQ ID NO : 15, 229 résidus d’acides aminés, respectivement). Il a été rapporté que SEQ ID NO : 15 contient une mutation de décalage du cadre dans la région C-terminale de la pUL130, et elle partage 94 % d’identité avec la SEQ ID NO : 14 du HCMV sur la pleine longueur de SEQ ID NO : 14.

[0054] La séquence signal N-terminale de la protéine pUL130 pleine longueur peut être clivée par une signal peptidase de la cellule hôte pour produire une protéine pUL130 mature. En tant que telle, à la protéine pUL130 exprimée par la cellule hôte décrite ici, il peut manquer la séquence signal N-terminale (par exemple, la pUL130 est codée par une séquence nucléotidique à laquelle il manque la séquence codant pour la séquence signal N-terminale). Un exemple d’une protéine pUL130 mature est SEQ ID NO : 16, à laquelle il manque une séquence signal N-terminale, et qui correspond aux résidus d’acides aminés 26 à 214 de SEQ ID NO : 14.

[0055] Sont également englobés dans l’invention des fragments formant un complexe de la pUL130. Un fragment formant un complexe de la pUL130 peut être toute partie ou portion de la protéine pUL130 qui conserve la capacité de former un complexe avec une autre protéine du CMV. Dans certains modes de réalisation, un fragment formant un complexe de la pUL130 forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.

[0056] Un fragment formant un complexe approprié de la pUL30 peut être obtenu ou déterminé par des tests classiques connus dans l’art, comme un test de co-immunoprécipitation, la réticulation, ou la co-localisation par coloration fluorescente, etc. Une SDS-PAGE ou une analyse Western blot peut être également utilisée (par exemple, en montrant que les cinq sous-unités sont présentes dans une électrophorèse sur gel) . Dans certains modes de réalisation, le fragment formant un complexe de la pUL130 (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, ou SEQ ID NO : 16 ; et/ou (iii) peut déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0057] D’autres protéines pUL130 appropriées peuvent être des variants de la pUL130 (et des fragments de variants) qui présentent divers degrés d’identité avec SEQ ID NO : 14, 15, ou 16, comme au moins identiques à 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec la séquence citée dans SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, ou SEQ ID NO : 16. Dans certains modes de réalisation, les protéines variantes de la pUL130 : (i) forment une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprennent au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, ou SEQ ID NO : 16 ; et/ou (iii) peuvent déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0058] La fonction de la pUL131A est requise pour la réplication du CMV humain non seulement dans les cellules endothéliales mais également dans les cellules épithéliales. Il a été rapporté la pUL131A provenant des souches du CMV humain Merlin (GI: 39842126, SEQ ID NO : 17, 129 acides aminés) et Towne (GI: 239909474, SEQ ID NO : 18, 129 acides aminés) et AD169 (GI: 219879712, SEQ ID NO : 19, 76 acides aminés). Il est prédit que la PUL131A contienne une séquence signal N-terminale, qui est localisée au niveau des résidus 1 à 18 de SEQ ID NO : 18, et à laquelle il manque un domaine TM. Il a été rapporté que la pUL131A provenant de la souche AD169 contient une insertion de 1 paire de bases, qui provoque un décalage du cadre. SEQ ID NO : 17 est identique à 96 % avec SEQ ID NO : 19 sur les 28 acides aminés N-terminaux, mais elle est seulement identique à 36 % avec SEQ ID NO : 19 sur la pleine longueur de SEQ ID NO : 17, à cause du décalage du cadre dans le gène UL131A de AD169.

[0059] La séquence signal N-terminale de la protéine pUL131 pleine longueur peut être clivée par une signal peptidase de la cellule hôte pour produire une protéine pUL131 mature. En tant que telle, à la protéine pUL131 exprimée par la cellule hôte décrite ici il peut manquer la séquence signal N-terminale (par exemple, la pUL131 est codée par une séquence nucléotidique à laquelle il manque la séquence codant pour la séquence signal N-terminale). Un exemple de protéine pUL130 mature est SEQ ID NO : 20, à laquelle il manque une séquence signal N-terminale et qui correspond aux résidus d'acides aminés 19 à 129 de SEQ ID NO : 17. SEQ ID NO : 35 correspond également aux résidus d'acides aminés 19 à 129 de SEQ ID NO : 18.

[0060] Sont également englobés dans l’invention des fragments formant un complexe de la pUL131. Un fragment formant un complexe de la pUL131 peut être toute partie ou portion de la protéine pUL131 qui conserve la capacité de former un complexe avec une autre protéine du CMV. Dans certains modes de réalisation, un fragment formant un complexe de la pUL131 forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131.

[0061] Un fragment formant un complexe approprié de la pUL31 peut être obtenu ou déterminé par des tests classiques connus dans l’art, comme un test de co-immunoprécipitation, la réticulation, ou la co-localisation par coloration fluorescente, etc. Une SDS-PAGE ou une analyse Western blot peut être également utilisée (par exemple, en montrant que les cinq sous-unités sont présentes dans une électrophorèse sur gel) . Dans certains modes de réalisation, le fragment formant un complexe de la pUL131 (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, ou SEQ ID NO : 20 ; et/ou (iii) peut déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0062] D’autres protéines pUL131 appropriées peuvent être des variants de la pUL131 (et des fragments de variants) qui présentent divers degrés d’identité avec SEQ ID NO : 17, 18, 19, ou 20, comme au moins identiques à 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % avec la séquence citée dans SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, ou SEQ ID NO : 20. Dans certains modes de réalisation, les protéines variantes de la pUL131 : (i) forment une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; (ii) comprennent au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, ou SEQ ID NO : 20 ; et/ou (iii) peuvent déclencher des anticorps in vivo qui présentent une réactivité croisée immunologique avec un virion du CMV.

[0063] Dans certains modes de réalisation, les gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou l’un de leurs fragments) décrites ici peuvent contenir des résidus d’acides aminés supplémentaires, comme des extensions N-terminales ou C-terminales. De telles extensions peuvent comprendre un ou plusieurs marqueurs, qui peuvent faciliter la détection (par exemple, un marqueur épitopique pour la détection par des anticorps monoclonaux) et/ou la purification (par exemple, un marqueur polyhistidine pour permettre la purification sur une résine chélatrice de nickel) des protéines. Les exemples de marqueurs pour la purification par affinité comprennent, par exemple, le marqueur His (hexahistidine (SEQ ID NO : 36) , se lie aux ions métalliques), la protéine de liaison du maltose (MBP) (se lie à l’amylose), la glutathion-S-transférase (GST) (se lie au glutathion), le marqueur FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-

Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO : 37), se lie à un anticorps anti-flag), le marqueur Strep (Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO : 38), ou Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO : 39), se lient à la streptavidine ou l’un de ses dérivés).

[0064] Dans un certain mode de réalisation, des lieurs clivables peuvent être utilisés. Ceci permet de séparer le marqueur du complexe purifié, par exemple par l’addition d’un agent capable de cliver le lieur. Un certain nombre de lieurs clivables différents sont connus de l’homme du métier. De tels lieurs peuvent être clivés, par exemple, par irradiation d’une liaison photolabile ou hydrolyse catalysée par un acide. Il existe également des lieurs polypeptidiques qui incorporent un site de reconnaissance de protéase et qui peuvent être clivés par l’addition d’une enzyme protéase appropriée.

[0065] Dans d’autres modes de réalisation, il peut être souhaitable d’avoir les protéines gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou l’un de leurs fragments) qui ne comprennent pas de séquence marqueur exogène, par exemple, pour des raisons de sécurité clinique ou d’efficacité.

[0066] B ien qu’il soit parfois fait référence aux protéines gH, gL, pUL130 comme à des glycoprotéines, cette nomenclature ne devra pas être prise comme signifiant que ces protéines doivent être glycosylées lorsqu’elles sont utilisées avec l’invention. Alors qu’il a été fait référence ci-dessus à des souches spécifiques, il faudra comprendre que les protéines du CMV gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou leurs fragments) de souches différentes du CMV peuvent être utilisées. A titre d’exemple non limitatif, les autres souches du CMV peuvent comprendre les souches Towne, Toledo, AD169, Merlin, TB20, et VR1814.

B. Acide nucléique codant pour les protéines et les complexes du CMV

[0067] Sont également proposés ici des acides nucléiques codant pour les protéines et les complexes du CMV pour une intégration génomique, et l’expression subséquente du pentamère du CMV.

[0068] Une ou plusieurs constructions d’acide nucléique codant pour les protéines et les complexes du CMV décrits ici peuvent être utilisées pour une intégration génomique. Par exemple, une seule construction d’acide nucléique codant pour les cinq sous-unités, gH, gL, pUL128, pUL130, pUL131 (ou leurs fragments), peut être introduit dans une cellule hôte. En variante, les séquences codant pour les cinq sous-unités (ou leurs fragments) peuvent être portées par deux constructions d’acide nucléique ou plus, qui sont ensuite introduites dans la cellule hôte simultanément ou séquentiellement.

[0069] Par exemple, dans un exemple de mode de réalisation, l’invention propose une seule construction d’acide nucléique codant pour : l’ectodomaine des gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131. Dans un autre exemple de mode de réalisation, l’invention propose deux constructions d’acide nucléique codant pour : l’ectodomaine des gH, gL, pUL128, pUL130, et pUL131. Voir, figure 1. Dans les deux exemples, il a été obtenu une intégration génomique couronnée de succès.

[0070] La construction d’acide nucléique peut comprendre de l’ADN génomique qui comprend un ou plusieurs introns, ou de l’ADNc. Certains gènes sont exprimés plus efficacement lorsque des introns sont présents. La séquence génomique native codant pour la pUL128 comprend deux introns, la séquence génomique native codant pour la pUL131 comprend un exon, tandis que la séquence génomique native codant pour la pUL130 ne comprend aucun intron. La séquence génomique native codant pour la pUL128 comprend trois exons, la séquence génomique native codant pour la pUL131 comprend deux exons, et la séquence génomique native codant pour la pUL130 comprend un exon. En particulier, la séquence d’acide nucléique est appropriée pour l’expression de polypeptides exogènes dans ladite cellule de mammifère.

[0071] Sont également proposés ici, des vecteurs qui comprennent des séquences codant pour les gH, gL, pUL128, pUL130, et/ou pUL131 (ou l’un de leurs fragments). Les exemples de vecteurs comprennent des plasmides qui sont capables de se répliquer de façon autonome ou d’être répliqués dans une cellule de mammifère. Les vecteurs d’expression types contiennent des promoteurs, des amplificateurs, et des terminateurs appropriés qui sont utiles pour la régulation de l’expression de la ou des séquences codantes dans la construction d’expression. Les vecteurs peuvent également comprendre des marqueurs de sélection pour fournir un trait phénotypique pour la sélection des cellules hôtes transformées (comme la transmission d’une résistance à des antibiotiques tels que l’ampicilline ou la néomycine).

[0072] Les promoteurs appropriés comprennent, par exemple, le promoteur du CMV, un adénovirus, EF1a, le promoteur de la GAPDH métallothionéine, le promoteur précoce du SV-40, le promoteur tardif du SV-40, le promoteur du virus de la tumeur mammaire de la souris, le promoteur du virus du sarcome de Rous, le promoteur de la polyhédrine, etc. Les promoteurs peuvent être constitutifs ou inductibles. Un ou plusieurs vecteurs peuvent être utilisés (par exemple, un vecteur codant pour les cinq sous-unités ou des fragments de celles-ci, ou deux vecteurs ou plus ensemble codant pour les cinq sous-unités ou des fragments de celles-ci) ; voir, par exemple, la figure 1.

[0073] Lorsque la cellule hôte est une cellule CHO, le promoteur, l’amplificateur, ou le terminateur est actif dans les cellules CHO. Un promoteur fréquemment utilisé est le promoteur pour le gène immédiat précoce (IE) du cytomégalovirus humain (hCMV). Le promoteur de ce gène dirige des taux élevés d’expression de transgène dans une large diversité de types cellulaires. L’activité de ce promoteur dépend d’une série de répétitions imparfaites de 17, 18, 19, et 21 pb, dont certaines lient des facteurs de transcription des familles de la protéine de liaison sensible à l’AMPc (CREB) NF-κΒ et du facteur nucléaire 1.

[0074] Un promoteur fort est un promoteur qui provoque l’initiation des ARNm à une fréquence élevée égale ou supérieure à celle du fragment promoteur/amplificateur central du hCMV (décrit dans le brevet US No. 5 168 062) dans une cellule CHO. Un tel promoteur peut être un promoteur fort dépendant du type cellulaire, comme ceux décrits dans le brevet US No. 5 589 392, ou un promoteur fort actif de façon ubiquitaire. Les exemples de promoteurs viraux actifs de façon constitutive comprennent, par exemple, les promoteurs précoce et tardif du virus SV40, le promoteur immédiat précoce du cytomégalovirus humain (hCMV) ou du cytomégalovirus murin (mCMV), le promoteur de la thymidine kinase (TK) ou le virus Herpes Simplex, ou le promoteur des longues répétitions terminales du virus du sarcome de Rous (RS-LTR). D'autres exemples comprennent, par exemple, le promoteur MIE du hCMV tel que défini par le fragment Pst I de 2,1 kb décrit dans le brevet US No. 5 385 839 et/ou dans le document EP-323 997-A1 ou une partie fonctionnelle de celui-ci possédant une activité de promoteur.

[0075] Des séquences de sites internes d’entrée du ribosome (IRES) et de peptide 2A peuvent être également utilisées. Les IRES et peptide 2A fournissent des variantes d’approches pour la coexpression de séquences multiples. IRES est une séquence nucléotidique qui permet l’initiation de la traduction dans le milieu de la séquence d’un ARN messager (ARNm) faisant partie du plus grand processus de synthèse des protéines. Habituellement, chez les eucaryotes, la traduction peut être initiée uniquement à l’extrémité 5' de la molécule d’ARNm. Les éléments IRES permettent l’expression de gènes multiples dans un transcrit. Des vecteurs polycistroniques à base d’IRES, qui expriment des protéines multiples à partir d’un transcrit, peuvent réduire l’échappement des clones non exprimant de la sélection.

[0076] Le peptide 2A permet la traduction de protéines multiples dans un seul cadre de lecture ouvert dans une polyprotéine qui est ensuite clivée en protéines individuelles par l’intermédiaire d’un mécanisme de saut ribosomique. Le peptide 2A peut fournir une expression plus équilibrée de multiples produits protéiniques.

[0077] Les exemples de séquences d’IRES comprennent, par exemple, les IRES de l’EV71, les IRES de l’EMCV, les IRES DU VHC.

[0078] Pour l'intégration génomique, l’intégration peut être spécifique du site ou aléatoire. Une recombinaison spécifique du site peut être obtenue par introduction d'une ou de plusieurs séquences homologues dans les constructions d'acide nucléique décrites ici. Une telle séquence homologue correspond potentiellement à la séquence endogène au niveau d'un site cible spécifique dans le génome de l'hôte. En variante, une intégration aléatoire peut être utilisée. Parfois, le taux d'expression d'une protéine peut varier selon le site d'intégration. Par conséquent, il peut être souhaitable de sélectionner un certain nombre de clones selon le taux d'expression de la protéine recombinante pour identifier un clone qui atteint le taux d'expression souhaité. 3. Cellules hôtes [0079] Dans un autre aspect, l'invention propose des cellules hôtes dans lesquelles les séquences codant pour le pentamère sont intégrées de façon stable dans le génome des cellules hôtes, et, lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions appropriées, elles expriment le pentamère du CMV tel que divulgué ici. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule de mammifère. Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule de rongeur.

[0080] Les exemples de lignées cellulaires de rongeurs comprennent par exemple, les lignées cellulaires de rein du hamster bébé (BHK) (par exemple, BHK21, BH TK), de Sertoli de souris (TM4), de foie du rat buffalo (BRL 3A), de tumeur mammaire de la souris (MMT), d'hépatome du rat (HTC), de myélome de la souris (NS0), d'hybridome murin (Sp2/0), de thymome de la souris (EL4), d'ovaire du hamster de Chine (CHO) et des dérivés des cellules CHO, embryonnaires murines (NIH/3T3, 3T3 Li), myocardiques du rat (H9c2), de myoblastes de la souris (C2C12), et de rein de la souris (miMCD-3).

[0081] Dans un mode de réalisation, la cellule de rongeur est une cellule CHO. Les cellules CHO appropriées comprennent, par exemple, les lignées DUXB11 et DG44. Ces deux lignées cellulaires sont déficientes en activité dihydrofolate réductase (DHFR), et par conséquent dépendantes d’une source exogène de précurseurs nucléotidiques pour leur croissance. La déficience en DHFR est un phénotype facilement manipulé approprié pour sélectionner l’intégration génomique et l’expression stable d’ADN exogène. L’intégration génomique est accomplie par transfection des cellules avec des cassettes d’expression pour le gène d’intérêt et un gène DHFR. Après la transfection, les cellules sont placées dans un milieu de sélection auquel il manque les précurseurs nucléotidiques.

[0082] L’expression de protéines de recombinaison dans des lignées cellulaires déficientes en DHFR peut être en outre amplifiée par l’addition de méthotrexate (MTX) aux cultures, de telle façon qu’il est possible de sélectionner un nombre élevé de copies du vecteur d’expression introduit. Le MTX est un inhibiteur compétitif de l’enzyme DHFR. L’application de cette pression de sélection supplémentaire en plus de l’absence des précurseurs nucléotidiques permet la sélection et l’isolement de la population mineure de cellules qui ont subi une amplification spontanée du vecteur d’expression intégré contenant le marqueur sélectionnable DHFR et, dans la plupart des cas, le gène d’intérêt. La présence de copies multiples du gène permet d’obtenir un taux élevé d’expression des protéines exogènes. En variante, la sélection par le MTX peut être réalisée indépendamment de la déficience en DHFR (c’est-à-dire, l’utilisation de MTX pour sélectionner une cellule hôte qui est à l’origine compétente en DHFR), comme cela est exemplifié dans les exemples divulgués ici.

[0083] Une autre lignée cellulaire CHO appropriée est la lignée cellulaire CHO-K1 de type sauvage, et son dérivé CHO-K1SV.

[0084] Un procédé de sélection couramment utilisé pour les lignées cellulaires CHO-K1 consiste en la sélection par la glutamine synthétase (GS) . En l’absence d’une source exogène de glutamine, la survie cellulaire dépend de l’enzyme GS pour produire la glutamine. Avec des lignées de cellules hôtes telles que les cellules NS/0 dérivées de myélome murin et les cellules CHO, qui présentent une activité enzymatique GS endogène relativement basse, le procédé permet un schéma de sélection simple lors de l’utilisation d’un marqueur sélectionnable GS dans le vecteur d’expression et d’un milieu de sélection dépourvu de glutamine. Similaire au système DHFR/MTX, l’inhibiteur compétitif de la GS, le méthionine sulfoximine (MSX) peut être ajouté au milieu pour appliquer une pression supplémentaire et sélectionner les cellules CHO qui dirigent des taux élevés d’expression à partir du vecteur intégré.

[0085] Les cellules CHO-K1, ou toutes autres cellules CHO couramment utilisées, peuvent être également sélectionnées en se basant sur la déficience en DHFR comme il a été décrit ci-dessus. Par exemple, une cellule CHO-K1, ou tout autre type de cellule CHO, peut présenter une déficience en DHFR, comme une délétion dans laquelle au moins une copie de la séquence génomique du gène de la dihydrofolate réductase (DHFR), ou au moins 30 % (par exemple, au moins 40 %, au moins 50 %, au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 90 %, ou 100 %) de la séquence codante dudit gène DHFR, est délétée. D’autres moyens pour introduire une déficience en DHFR comprennent la création de mutations dans le gène DHFR endogène. Les lignées cellulaires peuvent être en outre amplifiées par l’addition de méthotrexate (MTX) aux cultures comme il a été décrit ci-dessus.

[0086] Les cellules CHO-K1, ou toutes autres cellules CHO couramment utilisées, peuvent être également sélectionnées en se basant sur le MTX, avec ou sans déficience en DHFR. Dans les exemples fournis ici, les cellules CHO ont été sélectionnées en se basant sur le MTX, sans déficience en DHFR (c’est-à-dire que la cellule CHO d’origine utilisée pour l’intégration génomique est compétente pour la DHFR). Dans un tel système, généralement, le nombre de copies des séquences exogènes (par exemple, les séquences codant pour les protéines du CMV) est généralement bas. Il est estimé que les lignées cellulaires dans les exemples décrits ici comportent environ là 10 copies des séquences exogènes codant pour les protéines du CMV, au niveau d’un nombre très limité de sites d’intégration (par exemple, 1 ou 2 sites d’intégration). En général, lorsqu’une lignée cellulaire déficiente en DFHR est utilisée, le nombre de copies des séquences exogènes est généralement de beaucoup supérieur, parfois aussi élevé que quelques centaines de copies. On s’attend à ce que les deux procédés soient appropriés pour la production des lignées cellulaires CHO divulguées ici, bien que lorsque le nombre de copies est élevé, la cellule hôte puisse perdre une ou plusieurs copies des séquences exogènes durant le repiquage et/ou l’expansion de la lignée cellulaire.

[0087] D’autres souches des cellules CHO appropriées pour l’invention décrite ici comprennent, par exemple, des cellules CHO-ICAM-1, et des cellules CHO-hlFNy. Ces cellules génétiquement modifiées permettent une insertion stable d’ADN recombinant dans un gène spécifique ou une région d’expression des cellules, l’amplification de l’ADN inséré, et la sélection des cellules présentant un taux élevé d’expression de la protéine recombinante.

[0088] Les exemples de lignées cellulaires CHO disponibles à l’European Collection of Cell Cultures (ECACC) sont énumérés dans le tableau 1. Toutes les cellules CHO énumérées dans le tableau 1 peuvent être utilisées.

Tableau 1

[0089] Diverses lignées cellulaires CHO sont également disponibles auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC), comme les lignées cellulaires CHO hCBE11 (ATCC® PTA-3357™), E77.4 (ATCC® PTA-3765™), hLT-B : R-hG1 CHO No. 14 (ATCC® CRL-11965™), MOR-CHO- MORAb-003-RCB (ATCC® PTA-7552™),

AQ.C2 clone 11B (ATCC® PTA-3274™), AQ.C2 clone 11B (ATCC® PTA-3274™), hsAQC2 dans CHO-DG44 (ATCC® PTA-3356™), xrs5 (ATCC® CRL-2348™), CHO-K1 (ATCC® CCL-61™), Lec1 [nommée à l’origine Pro-5WgaRI3C] (ATCC® CRL-1735™), Pro-5 (ATCC® CRL-1781™), ACY1-E (ATCC® 65421™), ACY1-E (ATCC® 65420™), pgsE-606 (ATCC® CRL-224 6™) , CHO-CD36 (ATCC® CRL-2092™), pgsC-605 (ATCC® CRL-2245™), MC2/3 (ATCC® CRL-2143™), CHO-ICAM-1 (ATCC® CRL-2093™), et pgsB-618 (ATCC® CRL-2241™). L’une quelconque de ces lignées cellulaires CHO peut être utilisée.

[0090] D’autres lignées cellulaires CHO disponibles dans le commerce comprennent, par exemple, les cellules FreeStyle™ CHO-S et la lignée cellulaire Flp-In™-CHO de Life Technologies.

[0091] Des procédés pour exprimer des protéines recombinantes dans des cellules CHO en général ont été divulgués. Voir, par exemple, dans les brevets US No. 4 816 567 et No. 5 981 214.

[0092] En plus des cellules CHO, d’autres cellules de mammifères peuvent être également utilisées en tant qu’hôtes. Les exemples de cellules de rongeurs comprennent des cellules BHK21, des cellules NS0, des cellules Sp2/0, des cellules EL4, des cellules NIH/3T3, des cellules 3T3-L1, des cellules ES-D3, des cellules H9c2, des cellules C2C12, YB2/0, des cellules mimcd 3, etc. Les exemples de cellules humaines comprennent : des cellules SH-SY5Y, des cellules IM 32, des cellules LAN, des cellules MCFIOA, des cellules 293T, des cellules SK-BR3, des cellules huvec, des cellules huasmc, des cellules HKB-1, des cellules hmsc, des cellules U293, des cellules HE 293, des cellules PERC6®, des cellules Jurkai, des cellules HT-29, des cellules lncap.FGC, des cellules A549, des cellules MDA MB453, des cellules hepg2, des cellules THP-1, des cellules bxpc-3, des cellules Capan-1, des cellules DU145, et des cellules PC-3.

[0093] Par exemple, la lignée cellulaire PERC6®, les cellules NS0 de myélome de souris, les cellules de rat de hamster bébé (BHK), et la lignée cellulaire de rein embryonnaire humain (HEK293) ont reçu une approbation réglementaire pour la production de protéines recombinantes.

[0094] Les exemples de lignées cellulaires de primates non humains utiles dans des procédés fournis ici comprennent les lignées cellulaires de rein de singe (CVI-76), de rein de singe vert d’Afrique (VERO-76), de fibroblastes de singe vert (COS-1), et des cellules de rein de singe (CVI) transformées par le SV40 (COS-7) . D’autres lignées cellulaires de mammifères sont connues d’une personne ayant des compétences moyennes dans le domaine et sont cataloguées à l’American Type Culture Collection (Manassas, VA).

[0095] Dans certains modes de réalisation, les cellules hôtes sont appropriées pour une croissance dans des cultures en suspension. Les cellules hôtes compétentes en suspension sont généralement monodispersées ou se développent en agrégats lâches sans agrégation substantielle. Les cellules hôtes compétentes en suspension comprennent des cellules qui sont appropriées pour une culture en suspension sans adaptation ni manipulation (par exemple, des cellules hématopoïétiques, des cellules lymphoïdes) et des cellules qui ont été rendues compétentes en suspension par modification ou adaptation de cellules dépendantes de la fixation (par exemple, des cellules épithéliales, des fibroblastes).

[0096] Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule dépendante de la fixation qui est cultivée et maintenue dans une culture adhérente. Les exemples de lignées cellulaires adhérentes humaines utiles dans des procédés fournis ici comprennent les lignées cellulaires de neuroblastome humain (SH-SY5 Y, IMR32, et LANS), de carcinome du col de l’utérus humain (HeLa), de l’épithélium de sein humain (MCFIOA), de rein embryonnaire humain (293T), et de carcinome du sein humain (SK-BR3). Gènes C12orf35 et protéines C12orf35 [0097] Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule dans laquelle le taux d'expression ou l'activité de la protéine C12orf35 est réduit, comparativement à un témoin. Dans un certain mode de réalisation, une telle cellule est une cellule CHO. La demande de brevet US provisoire No. 61/919 313, déposée le 20 décembre 2013, et incorporée ici en référence, fournit une description détaillée de cellules de mammifères dans lesquelles le taux d'expression ou l'activité de la protéine C12orf35 est réduit comparativement à un témoin.

[0098] Divers témoins peuvent être utilisés. Le taux d'expression ou l'activité de la protéine C12orf35 à partir d'une cellule de type sauvage correspondante peut être utilisé en tant que témoin. En variante, un témoin peut être un taux prédéterminé ou un taux seuil qui peut être identifié dans la littérature ou une base de données.

[0099] Le gène C12orf35 humain se rapporte à la séquence nucléotidique codant pour le cadre de lecture ouvert 35 du chromosome 12. La protéine C12orf35 codée n’est pas caractérisée. On pense que l’homologue chez Cricetulus griseus (hamster de Chine) du gène C12orf35 humain, nommé Kiaa1551, est localisé sur le chromosome 8. On pense que l’homologue chez Mus musculus du gène C12orf35 humain est localisé sur le chromosome 6. L’ID de gène pour le gène CHO C12orf35 est publié comme l’ID de gène GenBank No. 100762086 ; et pour le gène C12orf35 humain, il est publié comme l’ID de gène GenBank No. 55196. Les informations concernant le gène C12orf35 chez Cricetulus griseus, la séquence codante et la protéine C12orf35 prédite sont également disponibles à la GenBank par le numéro d’accession NCBI : XM_003512865.

[0100] Le gène C12orf35 est exprimé de façon endogène dans des cellules eucaryotes telles que, par exemple, d'espèces de mammifères comme l'être humain, la souris et le hamster. La protéine prédite codée par le gène C12orf35 est une grosse protéine dépassant 1500 résidus. La liste des séquences présente des exemples de séquences d'acides aminés ou de séquences d'acides aminés putatives de la protéine codée par le gène C12orf35 endogène de différentes espèces de mammifères comme le hamster (SEQ ID NO : 21 et 22), l’être humain (SEQ ID NO : 23 et 24), et la souris (SEQ ID NO : 35) . La CDS (séquence d’ADN codante) de C12orf35 du hamster de Chine est représentée par SEQ ID NO : 25. En outre, une section de l’UTR en 5’ (voir SEQ ID NO : 26) et de l’UTR en 3’ (voir SEQ ID NO : 27) de l’ARNm de C12orf35 du hamster de Chine a été séquencée.

[0101] Chez l’êt re humain, le gène C12orf35 est également appelé KIAA1551. Le gène C12orf35 est également appelé de type C12orf35 ou homologue de C12orf35 chez le hamster ou 2810474O19Rik chez la souris. Différents noms peuvent être alloués dans différentes espèces pour la protéine ou le gène et des variantes non limitantes de noms (alias) sont également énumérées ci-dessus dans le tableau 2. Pour simplifier, dans cette divulgation, les homologues et les orthologues de différentes espèces sont tous appelés « gène C12orf35 » ou « protéine C12orf35 ».

[0102] A l’encontre de ce contexte scientifique, il est surprenant et inattendu que lorsque le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit comparativement à un témoin (par exemple, par délétion du gène C12orf35, ou par introduction de mutations), le rendement de la protéine recombinante est significativement amélioré. En tant que telles, des cellules hôtes de mammifères (par exemple, des cellules CHO) avec un taux d’expression ou une activité réduit de la protéine C12orf35 sont particulièrement appropriées pour la production recombinante du complexe pentamère.

[0103] La réduction du taux d'expression ou de l'activité d’une protéine C12orf35 peut être obtenue par divers moyens. Par exemple, le taux d’expression ou l’activité d’une protéine C12orf35 peut être réduit par inactivation de gène, mutation de gène, délétion de gène, silençage de gène, ou une combinaison quelconque des précédents. L’inactivation de gène est une technique génétique par laquelle un gène est rendu inopérant par perturbation de sa fonction. Par exemple, un acide nucléique peut être inséré dans la séquence codante, perturbant de cette façon la fonction du gène. En outre, le gène C12orf35 pleine longueur (ou l’un de ses fragments) peut être délété, grâce à quoi l’expression de la protéine C12orf35 fonctionnelle est substantiellement éliminée. Par exemple, la délétion peut être d’au moins 30 %, d’au moins 40 %, d’au moins 50 %, d’au moins 55 %, d’au moins 60 %, d’au moins 65 %, d’au moins 70 %, d’au moins 75 %, d’au moins 80 %, d’au moins 85 %, d’au moins 90 %, d’au moins 95 %, ou de 100 % de la séquence codante du gène C12orf35. Une autre option est d’introduire une ou plusieurs mutations dans la séquence codante, ce qui rend une protéine C12orf35 non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. Par exemple, une ou plusieurs mutations de décalage du cadre peuvent être introduites, produisant une protéine C12orf35 non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. En variante ou en outre, un ou plusieurs codons d’arrêt peuvent être introduits dans la séquence codante si bien qu’il est obtenu une protéine tronquée, non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. D’autres options comprennent, mais n’y sont pas limitées, une ou plusieurs mutations dans le promoteur, dans l’UTR en 5' et/ou en 3’ ou d’autres éléments régulateurs, par exemple par introduction d’une délétion du promoteur ou par introduction d’une construction entre le promoteur et le départ de la transcription. Les procédés pour la perturbation de gènes afin de supprimer ou d’éliminer l’expression du gène cible sont également bien connus de l’homme du métier.

[0104] Puisque chaque cellule comporte deux copies du gène C12orf35 dans son génome, dans certains modes de réalisation, au moins une copie de la séquence génomique du gène C12orf35, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène C12orf35, est délétée. Dans certains modes de réalisation, les deux copies des séquences génomiques du gène C12orf35 (ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène C12orf35 à partir de chaque copie) sont délétées.

[0105] Dans certains modes de réalisation, la séquence délétée comprend une portion de la région télomérique du chromosome 8 d’une cellule CHO. Une région télomérique est une région de séquences nucléotidiques répétitives à chaque extrémité d’une chromatide, qui protège l’extrémité du chromosome contre la détérioration ou contre la fusion avec des chromosomes voisins. Dans certains modes de réalisation, au moins 30 %, au moins 40 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 %, au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, ou 100 % de la séquence nucléotidique de la région télomérique du chromosome 8 d’une cellule CHO est délétée.

[0106] Dans certains modes de réalisation, la séquence délétée comprend en outre la délétion d’un gène choisi dans le groupe constitué de : Bicd1, Amn1, protéine 20 de type méthyltransférase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8, RPS4Y2, et l’une de leurs combinaisons.

[0107] Dans certains modes de réalisation, la délétion du gène C12orf35 (ou de l’un de ses fragments) est due à une cassure chromosomique. Une cassure chromosomique peut être induite par exemple en traitant les cellules eucaryotes avec un agent toxique qui favorise la cassure chromosomique, comme par exemple le MTX, l’aphidicoline ou l’hygromycine. D’autres options pour induire des cassures chromosomiques comprennent, mais n’y sont pas limitées, des radiations, des irradiations, des mutagènes, des substances cancérigènes et la bléomycine. Des cassures chromosomiques peuvent également se produire spontanément durant la transfection, par exemple, l’électroporation. Des procédés pour induire une cassure chromosomique sont également connus de l’homme du métier et ainsi, n’ont pas besoin d’une description détaillée quelconque ici. Après l’induction d’une cassure chromosomique, les cellules eucaryotes comportant le point de rupture souhaité (qui produit une délétion du gène C12orf35, ou de l’un de ses fragments) peuvent être identifiées, par exemple, en analysant l’ADN ou en utilisant le procédé selon le cinquième aspect de la présente divulgation. Par exemple, le profil d’expression des cellules traitées peut être analysé pour déterminer si le gène C12orf35 ou les gènes localisés en position centromérique du gène C12orf35 sont exprimés, si l’expression est réduite ou si les gènes ne sont pas exprimés. Par exemple, dans le cas de cellules de souris ou de hamster, il peut être analysé si le gène C12orf35 est exprimé et en variante ou en outre à ceci, il peut être analysé si un ou plusieurs gènes choisis dans le groupe constitué de la protéine 20 de type méthyltransférase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8, Tmtcl ou des gènes qui sont localisés en position télomérique des gènes susmentionnés (où télomérique a cet égard signifie dans la direction de l’extrémité télomérique) sont exprimés par la cellule et/ou si l’expression est réduite ou substantiellement éliminée.

[0108] La réduction du taux d’expression de la protéine C12orf35 peut être obtenue par un silençage du gène après la transcription, par exemple, par des molécules d’acide nucléique antisens, ou des molécules qui médient une interférence par ARN. Des exemples non limitants comprennent des ARNsi, des ARNsh, des miARN, des oligonucléotides antisens, etc., tous étant bien connus dans l’art.

[0109] Le taux d’expression de la protéine C12orf35 peut être estimé par des procédés connus dans l’art, par exemple, en mesurant le taux d’ARNm codant pour la protéine C12orf35, ou la protéine C12orf35 elle-même. De tels procédés comprennent, par exemple, les analyses Northern blot, FACS, ImageStream, Western blot, qPCR, RT-PCR, qRT-PCR, ELISA, Luminex, Multiplex, etc.

[0110] Dans certains modes de réalisation, le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit d’au moins 3 fois, d’au moins 5 fois, d’au moins 10 fois, d’au moins 20 fois, d’au moins 30 fois, d’au moins 40 fois, d’au moins 50 fois, d’au moins 60 fois, d’au moins 70 fois, d’au moins 75 fois, d’au moins 80 fois, d’au moins 90 fois, d’au moins 100 fois, comparativement à un témoin.

Gènes FAM60A et protéines FAM60A

[0111] Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule dans laquelle le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit, comparativement à un témoin. Dans un certain mode de réalisation, une telle cellule est une cellule CHO. La demande de brevet US provisoire No. 61/919 340, déposée le 20 décembre 2013, et incorporée ici en référence, fournit une description détaillée de cellules de mammifères dans lesquelles le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit.

[0112] Divers témoins peuvent être utilisés comme il a été discuté ci-dessus. Le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A à partir d’une cellule de type sauvage correspondante peut être utilisé en tant que témoin. En variante, un témoin peut être un taux prédéterminé ou un taux seuil qui peut être identifié dans la littérature ou une base de données.

[0113] La protéine FAM60A est une sous-unité du complexe SIN3-histone désacétylase (HDAC) (complexe SIN3/HDAC) qui fonctionne dans la répression de la transcription (Munoz et al., 2012, THE Journal of Biological Chemistry VOL. 287, NO. 39, pp. 32346-32353 ; Smith et al., 2012, Mol Cell Proteomics 11 (12) : 1815-1828) . Les histone désacétylases (HDAC) catalysent l'élimination des groupes acétyle à partir des histones. L’acétylation des histones sur les lysines est un mécanisme majeur pour la modulation de la conformation de la chromatine. L’acétylation des histones favorise un état de la chromatine relâché, transcriptionnellement actif tandis que la désacétylation catalysée par les histone désacétylases (HDAC) favorise un état inactif silencieux. L’analyse de bases de données a révélé la présence d’au moins un orthologue de la FAM60A chez la plupart des métazoaires, mais pas chez les nématodes. Le gène FAM60A est conservé chez les métazoaires et peut être trouvé dans les génomes de tous les vertébrés et de la plupart des invertébrés qui ont été complètement séquencés. La recherche de similarité de séquence des homologues de la FAM60A indique que principalement, il n’existe qu’un seul membre représentatif de cette famille dans le génome. Il n’existe que quelques exceptions. Selon Smith et al., 2012, la protéine FAM60A a une séquence unique à laquelle il manque n’importe quel domaine connu de protéine. En outre, il a été décrit par Smith et al. 2012, qu’elle ne présente aucune homologie de séquence avec d’autres protéines connues dans le protéome humain. La comparaison des séquences entre les protéines FAM60A provenant de différentes espèces a montré que la protéine FAM60A comprend généralement trois régions : (1) une extrémité N-terminale comprenant des segments hautement conservés chez tous les métazoaires ; (2) une région moyenne qui est hautement conservée parmi les vertébrés tandis que chez les invertébrés elle est constituée d’un espaceur non conservé d’une longueur variable ; (3) une extrémité C-terminale comprenant des segments hautement conservés chez tous les métazoaires. Ainsi, la conservation la plus élevée a été observée dans les régions N- et C-terminales de la FAM60A.

[0114] Des études indiquent que la protéine FAM60A s’associe aux complexes SIN3/HDAC dans divers types de cellules eucaryotes comme en particulier des cellules de mammifères. Toutefois, jusqu’à ce jour, les informations fonctionnelles concernant la protéine FAM60A sont limitées. Des études fonctionnelles récentes (voir Smith et al., 2012) indiquent que la protéine FAM60A peut réprimer l’expression génique et régule un sous-ensemble spécifique de gènes. Smith et al. 2012 rapportent un rôle de la protéine FAM60A dans la régulation de la voie de signalisation du TGF-bêta, qui joue un rôle pivot dans des processus comme la progression d’un cancer, les métastases, la migration cellulaire et la surveillance immunitaire. Il existe des découvertes indiquant que la protéine FAM60A agit comme un répresseur de la transcription des composants de la voie de signalisation du TGF-bêta tandis que cette fonction de la protéine FAM60A semble être permise par l’intermédiaire de son rôle dans le complexe SIN3-HDAC. L’appauvrissement de la protéine FAM60A dans différentes lignées de cellules cancéreuses en utilisant des ARNsi contre la séquence codante de la FAM60A a produit un changement de la morphologie normale des cellules cancéreuses. En outre, il a été trouvé que les taux de protéine FAM60A changent périodiquement au cours du cycle cellulaire dans des cellules U2OS (Munoz et al., 2012) . Des expériences de répression de la FAM60A en utilisant des ARNsi dirigés contre la FAM60A dans des cellules d’ostéosarcome osseux humain U2OS ont révélé que la protéine FAM60A restreint l’expression du gène de la cycline D1.

[0115] A l’encontre de ce contexte scientifique, il a été trouvé de façon surprenante que la réduction de l’expression ou de l’activité de la protéine FAM60A dans une cellule de mammifère augmente la stabilité de l’expression des protéines recombinantes, sans affecter négativement d’autres caractéristiques de la cellule qui sont importantes pour l’expression recombinante. Cette corrélation entre les effets de la protéine FAM60A et la stabilité de l’expression durant une culture prolongée des cellules était inattendue. En tant que telles, des cellules hôtes de mammifères (par exemple, des cellules CHO) avec un taux d’expression ou une activité réduit de la protéine FAM60A sont particulièrement appropriées pour la production recombinante du complexe pentamère.

[0116] Le gène FAM60A est exprimé de façon endogène chez les métazoaires et par conséquent dans des espèces de mammifères telles que l’être humain, la souris, le rat et le hamster, et la séquence d’acides aminés de la FAM60A est hautement conservée dans les espèces de mammifères ainsi que chez les vertébrés. Différents noms peuvent être alloués dans différentes espèces pour la protéine ou le gène et des variantes de noms non limitantes (alias) sont également énumérées dans le tableau 2 (ci-dessous). Pour simplifier, dans cette divulgation, les homologues et les orthologues de différentes espèces sont tous appelés « gène FAM60A » ou « protéine FAM60A ».

[0117] La liste des séquences présente des exemples de séquences d’acides aminés de protéines FAM60A connues et/ou prédites de différentes espèces de vertébrés, notamment Homo sapiens (SEQ ID NO : 28), Mus musculus (SEQ ID NO : 29), Cricetulus griseus (SEQ ID NO : 30). L’ADNc de FAM60A prédit de Cricetulus griseus est représenté par SEQ ID NO : 31 (séquence codante de 14 à 679 ; voir également la séquence de référence du NCBI : XM_0035054 82.1) . La protéine FAM60A n’a pas été décrite en détail dans la littérature. Ainsi, il était surprenant que la stabilité de l’expression d’une cellule hôte recombinante puisse être améliorée, si le génome de la cellule hôte est modifié de telle façon que le taux d’expression ou l’activité de la protéine endogène FAM60A est réduit, comparativement à un témoin. Il était inattendu que la protéine FAM60A influence la stabilité de l’expression d’un produit recombinant d’intérêt.

[0118] Les séquences du gène FAM60A codant pour la protéine FAM60A ont été rapportées chez Homo sapiens (ID du gène du NCBI : 58516) ; Rattus norvegicus (ID du gène du NCBI : 686611) ; Mus musculus (ID du gène du NCBI : 56306) ; Bos Taurus (ID du gène du NCBI : 538649) et d’autres. Des variants de transcrits peuvent exister d’une façon dépendante de l’espèce et dans des nombres différents (par exemple, le gène FAM60A humain exprime trois isoformes de transcrits putatifs qui diffèrent dans les UTR mais qui codent pour la même protéine).

[0119] La réduction du taux d’expression ou de l’activité d’une protéine FAM60A peut être obtenue par divers moyens. Par exemple, le taux d’expression ou l’activité d’une protéine FAM60A peut être réduit par inactivation de gène, mutation de gène, délétion de gène, silençage de gène ou une combinaison quelconque des précédents. L’inactivation de gène est une technique génétique qui rend un gène inopérant par perturbation de sa fonction. Par exemple, un acide nucléique peut être inséré dans la séquence codante, perturbant de cette façon la fonction du gène. En outre, le gène FAM60A pleine longueur (ou l’un de ses fragments) peut être délété, grâce à quoi l’expression de la protéine FAM60A fonctionnelle est substantiellement éliminée. Par exemple, la délétion peut être d’au moins 30 %, d’au moins 40 %, d’au moins 50 %, d’au moins 55 %, d’au moins 60 %, d’au moins 65 %, d’au moins 70 %, d’au moins 75 %, d’au moins 80 %, d’au moins 85 %, d’au moins 90 %, d’au moins 95 %, ou de 100 % de la séquence codante du gène FAM60A. Une autre option est d’introduire une ou plusieurs mutations dans la séquence codante, ce qui rend une protéine FAM60A non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. Par exemple, une ou plusieurs mutations de décalage du cadre peuvent être introduites, produisant une protéine FAM60A non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. En variante ou en outre, un ou plusieurs codons d'arrêt peuvent être introduits dans la séquence codante si bien qu'il est obtenu une protéine tronquée, non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. D’autres options comprennent, mais n'y sont pas limitées, une ou plusieurs mutations dans le promoteur, dans les UTR en 5' et/ou en 3' ou d’autres éléments régulateurs, par exemple par introduction d’une délétion du promoteur ou par introduction d’une construction entre le promoteur et le départ de la transcription. Des procédés de perturbation de gènes pour supprimer ou éliminer l’expression du gène cible sont également bien connus de l’homme du métier.

[0120] Puisque chaque cellule comporte deux copies du gène FAM60A dans son génome, dans certains modes de réalisation, au moins une copie de la séquence génomique du gène FAM60A, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène FAM60A, est délétée. Dans certains modes de réalisation, les deux copies des séquences génomiques du gène FAM60A (ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène FAM60A à partir de chaque copie) sont délétées.

[0121] Dans certains modes de réalisation, la séquence délétée comprend une portion de la région télomérique du chromosome 8 d’une cellule CHO. Une région télomérique est une région de séquences nucléotidiques répétitives à chaque extrémité d’une chromatide, qui protège l’extrémité du chromosome contre la détérioration ou contre la fusion avec des chromosomes voisins. Dans certains modes de réalisation, au moins 30 %, au moins 40 %, au moins 50 %, au moins 55 %, au moins 60 %, au moins 65 %, au moins 70 %, au moins 75 %, au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 %, ou 100 % de la séquence nucléotidique de la région télomérique du chromosome 8 d’une cellule CHO est délétée.

[0122] Dans certains modes de réalisation, la séquence délétée comprend en outre une délétion d’un gène choisi dans le groupe constitué de : Caprin2 et Ipo8, et l’une de leurs combinaisons.

[0123] Dans certains modes de réalisation, la délétion du gène FAM60A est due à une cassure chromosomique. Une cassure chromosomique peut être induite par des procédés décrits ci-dessus. Après l’induction d’une cassure chromosomique, les cellules comportant le point de rupture souhaité (qui entraîne une délétion du gène FAM60A) peuvent être identifiées, par exemple, en analysant l’ADN ou en utilisant le procédé selon le cinquième aspect de la présente divulgation. Par exemple, le profil d’expression des cellules traitées peut être analysé pour déterminer si le gène FAM60A ou des gènes localisés en position centromérique du gène FAM60A sont exprimés, si l’expression est réduite ou si les gènes ne sont pas exprimés. Par exemple, dans le cas de cellules de souris ou de hamster, il peut être analysé si le gène FAM60A est exprimé et en variante ou en outre à ceci, il peut être analysé si un ou plusieurs gènes choisis dans le groupe constitué de Bicdl, C12orf35, protéine 20 de type méthyltransférase, Dennd5b, Caprin2, Ipo8, Tmtcl ou des gènes qui sont localisés en position télomérique des gènes susmentionnés (où télomérique a cet égard signifie dans la direction de l’extrémité télomérique) sont exprimés par la cellule et/ou si l’expression est réduite ou substantiellement éliminée.

[0124] La réduction du taux d’expression de la protéine FAM60A peut être obtenue par un silençage de gène après la transcription, par exemple, par des molécules d’acide nucléique antisens, ou des molécules qui médient une interférence par ARN. Des exemples non limitants comprennent des ARNsi, des ARNsh, des miARN, des oligonucléotides antisens, etc., tous étant bien connus dans l’art.

[0125] Le taux d’expression de la protéine FAM60A peut être estimé par des procédés bien connus, par exemple, en mesurant le taux d’ARNm codant pour la protéine FAM60A, ou la protéine FAM60A elle-même. De tels procédés comprennent, par exemple, les analyses Northern blot, FACS, ImageStream, Western blot, qPCR, RT-PCR, qRT-PCR, ELISA, Luminex, Multiplex, etc.

[0126] Dans certains modes de réalisation, le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit d’au moins 3 fois, d’au moins 5 fois, d’au moins 10 fois, d’au moins 20 fois, d’au moins 30 fois, d’au moins 40 fois, d’au moins 50 fois, d’au moins 60 fois, d’au moins 70 fois, d’au moins 75 fois, d’au moins 80 fois, d’au moins 90 fois, d’au moins 100 fois, comparativement à un témoin. Gènes de matriptases et matriptases [0127] Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte est une cellule dans laquelle le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit, comparativement à un témoin. Dans un certain mode de réalisation, une telle cellule est une cellule CHO. La demande de brevet US provisoire

No. 61/985 589, déposée le 29 avril 2014 et incorporée ici en référence, et la demande de brevet US provisoire

No. 61/994 310, déposée le 16 mai 2014 et incorporée ici en référence, fournissent une description détaillée de cellules de mammifères dans lesquelles le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit.

[0128] Divers témoins peuvent être utilisés comme il a été discuté ci-dessus. Le taux d’expression ou l’activité de la matriptase provenant d’une cellule de type sauvage correspondante peut être utilisé en tant que témoin. En variante, un témoin peut être un taux prédéterminé ou un taux seuil qui peut être identifié dans la littérature ou une base de données.

[0129] La matriptase a été décrite pour la première fois en 1993 comme une nouvelle activité gélatinolytique dans des cellules cultivées de cancer du sein. La matriptase appartient à la famille des sérine protéases transmembranaires de type II (TTSP). Des orthologues de la matriptase sont présents dans différentes espèces de vertébrés, y compris des espèces de mammifères, et ils ont été identifiés, par exemple, chez l'être humain, le chimpanzé, le chien, la souris, le rat, le poulet, le poisson zèbre, le poisson-globe à taches vertes et le poisson-globe tigre, ce qui suggère une fonction conservée dans l’évolution. La matriptase est énoncée dans la nomenclature des enzymes IUBMB sous la référence EC 3.4.21.109. La matriptase est également connue comme une sérine protéase de type membranaire 1 (MT-SP1) et un suppresseur de la tumorigénicité-14 (ST14) (voir Chen et al., The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3) : 097-108) . Il s’agit d’une protéine intégrale de la membrane avec un seul domaine transmembranaire proche de l’extrémité N-terminale cytoplasmatique. La partie extracellulaire est constituée d’une région de tige (comprenant un seul domaine SEA, 2 domaines CUB et 4 domaines LDLRA) et du domaine sérine protéase C-terminal qui est structuralement hautement similaire aux autres TTSP et comprend une triade catalytique conservée histidine/acide aspartique/sérine (HDS) essentielle à l’activité catalytique (voir, par exemple, List et al., Matriptase: Potent

Proteolysis on the cell Surface; Mol Med 12 (1-3) 1-7,

January-March 2006 et Chen et al., The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3) : 097-108) . La matriptase est décrite comme étant exprimée dans les épithéliums dans de nombreux systèmes d’organes tels que la peau, le sein, le poumon, l’épiderme, la cornée, la glande salivaire, les cavités orales et nasales, la thyroïde, le thymus, l’œsophage, la trachée, les bronchioles, les alvéoles, l’estomac, le pancréas, la vésicule biliaire, le duodénum, l’intestin grêle, le côlon, le rectum, le rein, les surrénales, la vessie, l’uretère, les vésicules séminales, l’épididyme, la prostate, les ovaires, l’utérus et le vagin (voir, List et al., 2006 et Chen et al., 2012). La matriptase est synthétisée sous la forme d’un zymogène inactif et elle est convertie en sa forme active par l’intermédiaire d’un processus compliqué. Des détails concernant le processus d’activation qui implique des clivages endoprotéolytiques sont décrits pour la matriptase humaine dans List et al. 2006 et Chen et al. 2012. La matriptase est liée à la membrane en tant que protéine transmembranaire de type II avec le domaine catalytique orienté dans l’espace extracellulaire. En outre, il est décrit dans la littérature qu’une excrétion significative de la matriptase, respectivement sa partie extracellulaire, se produit in vivo (voir List et al., 2006 et Chen et al. 2012). Il est décrit dans la littérature que la matriptase est excrétée sous la forme d’un complexe, par exemple, complexée à l’inhibiteur de la sérine protéase de type Kunitz HAI-1. Différentes études suggèrent que dans des cellules humaines, l’inhibiteur spécifique HAI-1 facilite le transport de la matriptase vers la membrane cellulaire car il a été montré que l’élimination voire même des mutations ponctuelles simples dans HAI-1 mènent à une accumulation de la matriptase dans le compartiment de Golgi. Dans la littérature, plusieurs inhibiteurs endogènes différents de la matriptase en dehors de HAI-1 ont été décrits comme HAI-2, l’antithrombine, l’alpha-1-antitrypsine et l’alpha-2-antiplasmine. En outre, également d’autres inhibiteurs de la matriptase ont été décrits (voir, par exemple, Chen et al., 2012). Il est décrit dans la littérature que la matriptase peut jouer de nombreux rôles dans la physiologie animale comme la fonction de barrière cutanée, l’intégrité épithéliale, le développement des follicules pileux, et l’homéostasie du thymus, et dans des pathologies humaines, comme l’arthrose, l’athérosclérose, et la progression, l’invasion et les métastases tumorales.

[0130] A l’encontre de ce contexte scientifique, qui n’est pas apparenté à la production recombinante d’une protéine, la présente découverte que la matriptase est une protéase impliquée dans la coupure des protéines produites de façon recombinante qui sont sécrétées par les cellules hôtes dans le milieu de culture cellulaire a été hautement surprenante. En prenant en considération le grand nombre et la diversité des protéases exprimées dans les cellules des vertébrés, comme en particulier les cellules de mammifères, il a été encore plus surprenant que la réduction du taux d’expression de l’activité de cette protéine puisse réduire significativement la coupure du polypeptide d’intérêt sécrété dans le milieu de culture cellulaire. Ces effets avantageux ne sont pas observés avec d’autres protéases, même des protéases étroitement apparentées. En tant que telles, des cellules hôtes de mammifères (par exemple, des cellules CHO) avec un taux d’expression ou une activité réduit de la matriptase sont particulièrement appropriées pour la production recombinante du complexe pentamère.

[0131] La liste des séquences présente des exemples de séquences d’acides aminés de la matriptase provenant de différentes espèces de vertébrés comme le hamster (SEQ ID NO : 32 - séquence de référence du NCBI : XP_003495890), l’être humain (SEQ ID NO : 33 - séquence de référence du NCBI : NP_068813), la souris (SEQ ID NO : 34 -séquence de référence du NCBI : NP_035306).

[0132] Les séquences nucléotidiques codant pour la matriptase provenant de différentes espèces de mammifères ont été également rapportées. Voir, par exemple, le hamster de Chine (ID du gène du NCBI : 100755225) ; Homo sapiens (ID du gène du NCBI : 67 68) ; Mus musculus (ID du gène du NCBI : 19143) ; Rattus norvegicus (ID du gène du NCBI : 114093) ; Pan Troglodytes (ID du gène du NCBI : 100188950) et d’autres. Des synonymes pour certains du gène de la matriptase sont énumérés dans le tableau 3, parmi lesquels sont couramment utilisés « ST14 » ou « St14 ».

[0133] Comme cela est montré dans le tableau 3, la matriptase est également appelée « protéine suppresseur de la tumorigénicité 14 » (par exemple, pour l’être humain) et « homologue de la protéine suppresseur de la tumorigénicité 14 » (par exemple, chez la souris et le hamster de Chine) . Pour simplifier, dans cette divulgation, les homologues et les orthologues de différentes espèces sont tous appelés « gène de la matriptase » ou « matriptase » (protéine).

[0134] Sont également décrits ici des variants fonctionnels d’une matriptase (des variants qui possèdent substantiellement les mêmes activités catalytiques qu’une matriptase de type sauvage). Par exemple, un variant de la matriptase peut comprendre une séquence qui est identique au moins à 50 %, au moins à 60 %, au moins à 70 %, au moins à 75 %, au moins à 80 %, au moins à 85 %, au moins à 90 %, au moins à 95 %, au moins à 96 %, au moins à 97 %, au moins à 98 % ou au moins à 99 % avec l’une quelconque des séquences de SEQ ID NO : 32 à 34, et qui possède les mêmes ou substantiellement les mêmes activités catalytiques qu’une protéine matriptase de type sauvage. L’activité catalytique d’un variant de la matriptase peut être estimée, par exemple, par la réaction chimique pour cliver divers substrats synthétiques avec Arg ou Lys en position P1 et il est préféré des acides aminés à petite chaîne latérale, tels que Ala et Gly, en position P2 (voir, EC 3.4.21.109) .

[0135] Sont également décrits ici des fragments fonctionnels d’une matriptase (des fragments qui possèdent substantiellement les mêmes activités catalytiques qu’une matriptase pleine longueur). Un fragment fonctionnel d’une matriptase peut être un sous-ensemble d’acides aminés consécutifs de la matriptase pleine longueur divulguée ici, et qui possède les mêmes ou substantiellement les mêmes activités catalytiques que la séquence de la protéine pleine longueur. L’activité catalytique d’un fragment de la matriptase peut être estimée, par exemple, par la réaction chimique pour cliver divers substrats synthétiques avec Arg ou Lys en position P1 et il est préféré des acides aminés à petite chaîne latérale, tels que Ala et Gly, en position P2 (voir, EC 3.4.21.109).

[0136] La réduction du taux d’expression ou de l’activité d’une matriptase peut être obtenue par divers moyens. Par exemple, le taux d’expression ou l’activité d’une matriptase peut être réduit par inactivation de gène, mutation de gène, délétion de gène, silençage de gène, ou une combinaison quelconque des précédents. L’inactivation de gène est une technique génétique par laquelle un gène est rendu inopérant par perturbation de sa fonction. Par exemple, un acide nucléique peut être inséré dans la séquence codante, perturbant de cette façon la fonction du gène. En outre, le gène de la matriptase pleine longueur (ou l’un de ses fragments) peut être délété, grâce à quoi l’expression de la matriptase fonctionnelle est substantiellement éliminée. Par exemple, la délétion peut être d’au moins 30 %, d’au moins 40 %, d’au moins 50 %, d’au moins 55 %, d’au moins 60 %, d’au moins 65 %, d’au moins 70 %, d’au moins 75 %, d’au moins 80 %, d’au moins 85 %, d’au moins 90 %, d’au moins 95 %, ou de 100 % de la séquence codante du gène de la matriptase. Une autre option est d’introduire une ou plusieurs mutations dans la séquence codante, ce qui rend une matriptase non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. Par exemple, une ou plusieurs mutations de décalage du cadre peuvent être introduites, produisant une matriptase non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. En variante ou en outre, un ou plusieurs codons d'arrêt peuvent être introduits dans la séquence codante de telle façon qu'il est obtenu une protéine tronquée, non fonctionnelle ou moins fonctionnelle. D’autres options comprennent, mais n’y sont pas limitées, une ou plusieurs mutations dans le promoteur, dans les UTR en 5' et/ou en 3' ou d’autres éléments régulateurs, par exemple par introduction d’une délétion du promoteur ou par introduction d’une construction entre le promoteur et le départ de la transcription. Des procédés pour la perturbation de gènes pour supprimer ou éliminer l’expression du gène cible sont bien connus de l’homme du métier.

[0137] Puisque chaque cellule comporte deux copies du gène de la matriptase dans son génome, dans certains modes de réalisation, au moins une copie de la séquence génomique du gène de la matriptase, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène de la matriptase, ou d’un fragment fonctionnel gène de la matriptase, est délétée. Dans certains modes de réalisation, les deux copies des séquences génomiques du gène de la matriptase (ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène de la matriptase, ou d’un fragment fonctionnel dudit gène de la matriptase, à partir de chaque copie) sont délétées.

[0138] Dans certains modes de réalisation, la cellule hôte comprend une mutation dans l’exon 2 du gène de la matriptase. L’exon 2 est particulièrement approprié en tant que cible pour modifier l’activité matriptase parce qu’il existe plusieurs variants d’épissage fonctionnels différents. Ainsi, les exons proches de l’extrémité N-terminale de la matriptase comme par exemple l’exon 1, l’exon 2 et l’exon 3, sont avantageux pour introduire une ou plusieurs mutations, en particulier une ou plusieurs mutations de décalage du cadre. Une mutation de décalage du cadre dans l’un de ces exons mène le plus vraisemblablement à un codon d’arrêt précoce dans la séquence. Des mutations peuvent être également introduites dans l’un des exons subséquents, par exemple choisis parmi les exons 4 à 19.

[0139] Dans certains modes de réalisation, la matriptase comprend une mutation dans le domaine catalytique. Le domaine catalytique est la région d’une enzyme qui interagit avec son substrat pour provoquer la réaction enzymatique. Une ou plusieurs mutations peuvent être introduites dans ce domaine de telle façon que l’activité catalytique de la protéine est réduite comparativement à un témoin. Le domaine catalytique comprend des séquences codées par les exons 16, 17, 18 et 19. Les mutations peuvent être une délétion, une insertion, une substitution, ou l’une de leurs combinaisons. Les mutations peuvent provoquer une mutation de décalage du cadre, une mutation ponctuelle spécifique, une mutation de codon d’arrêt, ou l’une de leurs combinaisons, dans la séquence codant pour le domaine catalytique. Des mutants inactifs du point de vue catalytique de la matriptase comme par exemple la G827R-matriptase ou la S805A-matriptase ont été également décrits dans la littérature (voir Désilets et al., The Journal of Biological Chemistry Vol. 283, No. 16, pp. 10535-10542, 2008) . En outre, la structure cristalline du domaine catalytique d’une matriptase recombinante est connue. D’après cette structure et les données sur la séquence, l’homme du métier peut dériver d’autres cibles spécifiques pour des mutations afin d’altérer la fonction catalytique de la matriptase.

[0140] La réduction du taux d’expression de la matriptase peut être obtenue par un silençage de gène après la transcription, par exemple par des molécules d’acide nucléique antisens, ou des molécules qui médient une interférence par ARN. Les exemples non limitants comprennent des ARNsi, des ARNsh, des miARN, des oligonucléotides antisens, etc., tous étant bien connus dans l’art.

[0141] Le taux d’expression de la matriptase peut être estimé par des procédés connus dans l’art, par exemple, en mesurant le taux d’ARNm codant pour la matriptase, ou la matriptase elle-même. De tels procédés comprennent, par exemple, les analyses Northern blot, FACS, ImageStream, Western blot, qPCR, RT-PCR, qRT-PCR, ELISA, Luminex, Multiplex, etc. L’activité de la matriptase peut être estimée, par exemple, selon son activité enzymatique.

[0142] Dans certains modes de réalisation, le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit d’au moins 3 fois, d’au moins 5 fois, d’au moins 10 fois, d’au moins 20 fois, d’au moins 30 fois, d’au moins 40 fois, d’au moins 50 fois, d’au moins 60 fois, d’au moins 70 fois, d’au moins 75 fois, d’au moins 80 fois, d’au moins 90 fois, d’au moins 100 fois, comparativement à un témoin.

Tableau 2

Abréviations et variantes de noms (alias) de produits codés par des gènes localisés dans le chromosome 8 du hamster de Chine ou le chromosome 6 de la souris.

Tableau 3

Exemples de variantes de noms du gène de la matriptase et/ou du produit de la protéine codée de la matriptase utilisés dans la littérature (ordre alphabétique)

[0143] Une cellule hôte appropriée peut comporter des combinaisons quelconques des modifications décrites ici, par exemple, une cellule dans laquelle à la fois le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit dans ladite cellule, comparativement à un témoin, et le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit dans ladite cellule, comparativement à un témoin. D’autres combinaisons comprennent, par exemple, la réduction de du taux d’expression ou de l’activité de la protéine C12orf35, et la réduction du taux d’activité ou de l’activité de la matriptase ; la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la protéine FAM60A, et la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la matriptase ; la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la protéine C12orf35, la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la protéine FAM60A, et la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la matriptase ; la réduction du taux d’expression ou de l’activité de la protéine C12orf35, et l’inclusion de la séquence de la dihydrofolate réductase (DHFR) en tant que marqueur de sélection, etc.

[0144] Les cellules hôtes décrites ici sont appropriées pour une culture à grande échelle. Par exemple, les cultures cellulaires peuvent être de 10 l, 30 l, 50 l, 100 l, 150 l, 200 l, 300 l, 500 l, 1000 l, 2000 l, 3000 l, 4000 l, 5000 l, 10,000 l ou plus grandes. Dans certains modes de réalisation, la taille de la culture cellulaire peut se situer dans la plage de 10 l à 5000 l, de 10 l à 10,000 l, de 10 l à 20 000 l, de 10 l à 50 000 l, de 40 l à 50 000 l, de 100 l à 50 000 l, de 500 l à 50 000 l, de 1000 l à 50 000 l, de 2000 l à 50 000 l, de 3000 l à 50 000 l, de 4000 l à 50 000 l, de 4500 l à 50 000 l, de 1000 l à 10 000 l, de 1000 l à 20 000 l, de 1000 l à 25 000 l, de 1000 l à 30 000 l, de 15 l à 2000 l, de 40 l à 1000 l, de 100 l à 500 l, de 200 l à 400 l, ou tout nombre entier entre ces valeurs.

[0145] Les composants des milieux pour culture cellulaire sont connus dans l’art, et ils peuvent comprendre, par exemple, un tampon, une teneur en acides aminés, une teneur en vitamines, une teneur en sels, une teneur en minéraux, une teneur en sérum, une teneur en source de carbone, une teneur en lipides, une teneur en acides nucléiques, une teneur en hormones, une teneur en oligo-éléments, une teneur en ammoniac, une teneur en cofacteurs, une teneur en indicateurs, une teneur en petites molécules, une teneur en hydrolysats et une teneur en modulateurs enzymatiques. 4. Purification du complexe pentamère à partir de la culture cellulaire [0146] Le complexe pentamère produit conformément au procédé décrit ici peut être récolté à partir des cellules hôtes, et purifié en utilisant tout procédé approprié. Les procédés appropriés comprennent la précipitation et divers types de chromatographie, comme l'interaction hydrophobe, l'échange d'ions, l'affinité, la chélation, et l'exclusion par la taille, tous étant connus dans l’art. Des schémas de purification appropriés peuvent être créés en utilisant deux ou plus de ces procédés appropriés ou d’autres. Si c’est souhaité, une ou plusieurs des sous-unités du complexe pentamère peuvent comprendre un « marqueur » qui facilite la purification, comme un marqueur épitopique ou un marqueur HIS, un marqueur Strep. De tels polypeptides marqués peuvent être purifiés de façon pratique, par exemple à partir de milieux conditionnés, par chromatographie chélatrice ou chromatographie d’affinité. Eventuellement, la séquence du marqueur peut être clivée après la purification.

[0147] Par exemple, le document WO 2014/005959 divulgue des exemples de procédés de purification du complexe pentamère par chromatographie d’affinité.

[0148] Dans certains modes de réalisation, une ou plusieurs sous-unités du complexe pentamère comprennent un marqueur pour une purification par affinité. Les exemples de marqueurs pour une purification par affinité comprennent, par exemple, le marqueur His (se lie aux ions métalliques), un anticorps (se lie à la protéine A ou à la protéine G), la protéine de liaison du maltose (MBP) (se lie à l’amylose), la glutathion-S-transférase (GST) (se lie au glutathion), le marqueur FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO : 37)) (se lie à un anticorps anti-flag), le marqueur Strep (se lie à la streptavidine ou à l’un de ses dérivés).

[0149] La structure du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 est inconnue. Toutefois, si le marqueur pour la purification par affinité est fixé à un site qui interfère avec la formation du complexe pentamère, ou à un site qui est enterré au sein du complexe, la purification par affinité ne sera pas couronnée de succès. On pense que les sites suivants sont appropriés pour fixer un marqueur pour la purification par affinité, car le marqueur ne semble pas interférer avec la formation du complexe pentamère, et semble être exposé à la surface d'un pentamère assemblé : (i) la région C-terminale de la pUL130, (ii) la région N-terminale de la pUL130, (iii) la région C-terminale de la pUL131, (iv) la région N-terminale de la pUL131, (v) la région C-terminale de la pUL128, (vi) la région N-terminale de la pUL128, ou l’une de leurs combinaisons.

[0150] Dans certains modes de réalisation, le complexe pentamère ne comprend pas de marqueur pour la purification.

[0151] Un autre procédé approprié est la chromatographie par échange d’ions. Les exemples de matériaux utiles dans la chromatographie par échange d’ions comprennent la DEAE-cellulose, la QAE-cellulose, la DEAE-céphalose, la QAE-céphalose, DEAE-Toyopearl, QAE-Toyopearl, Mono Q, Mono S, Q sepharose, SP sepharose, etc. Dans un exemple de mode de réalisation, le procédé utilise une colonne de Mono S. Dans un autre exemple de mode de réalisation, le procédé utilise une colonne de Mono Q.

[0152] Dans certains modes de réalisation, le rendement du complexe pentamère du CMV est d’au moins environ 0,01 g/l, d’au moins environ 0,02 g/l, d’au moins environ 0,03 g/l, d’au moins environ 0,05 g/l, d’au moins environ 0,06 g/l, d’au moins environ 0,07 g/l, d’au moins environ 0,08 g/l, d’au moins environ 0,09 g/l, d’au moins environ 0,1 g/l, d’au moins environ 0,15 g/l, d’au moins environ 0,20 g/l, d’au moins environ 0,25 g/l, d’au moins environ 0,3 g/l, d’au moins environ 0,35 g/l, d’au moins environ 0,4 g/l, d’au moins environ 0,45 g/l, d’au moins environ 0,5 g/l, d’au moins environ 0,55 g/l, d’au moins environ 0,6 g/l, d’au moins environ 0,65 g/l, d’au moins environ 0,7 g/l, d’au moins environ 0,75 g/l, d’au moins environ 0,8 g/l, d’au moins environ 0,85 g/l, d’au moins environ 0,9 g/l, d’au moins environ 0,95 g/l, ou d’au moins environ 1,0 g/l. 5. Définitions [0153] Le terme « fragment formant un complexe » d’une protéine du CMV (comme gH, gL, pUL128, pUL130, ou pUL131) se rapporte à toute partie ou portion de la protéine qui conserve la capacité de former un complexe avec une autre protéine du CMV. De tels complexes comprennent, par exemple, le complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131. Les fragments qui conservent la capacité de former le complexe pentamère sont également appelés « fragments formant le pentamère ».

[0154] Une « culture à grande échelle » se rapporte à une culture qui a une taille d’au moins environ 10 litres (par exemple, un volume d’au moins environ 10 l, d’au moins environ 20 l, d’au moins environ 30 , d’au moins environ 40 l, d’au moins environ 50 l, d’au moins environ 60 l, d’au moins environ 70 l, d’au moins environ 80 l, d’au moins environ 90 l, d’au moins environ 100 l, d’au moins environ 150 l, d’au moins environ 200 l, d’au moins environ 250 l, d’au moins environ 300 l, d’au moins environ 400 l, d’au moins environ 500 l, d’au moins environ 600 l, d’au moins environ 700 l, d’au moins environ 800 l, d’au moins environ 900 l, d’au moins environ 1000 l, d’au moins environ 2000 l, d’au moins environ 3000 l, d’au moins environ 4000 l, d’au moins environ 5000 l, d’au moins environ 6000 l, d’au moins environ 10 000 l, d’au moins environ 15 000 l, d’au moins environ 20 000 l, d’au moins environ 25 000 l, d’au moins environ 30 000 l, d’au moins environ 35 000 l, d’au moins environ 40 000 l, d’au moins environ 45 000 l, d’au moins environ 50 000 l, d’au moins environ 55 000 l, d’au moins environ 60 000 l, d’au moins environ 65 000 l, d’au moins environ 70 000 l, d’au moins environ 75 000 l, d’au moins environ 80 000 l, d’au moins environ 85 000 l, d’au moins environ 90 000 l, d’au moins environ 95 000 l, d’au moins environ 100 000 l, etc.).

[0155] Un complexe pentamère « soluble » se rapporte au complexe gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 dans lequel la sous-unité gH ne comprend pas le domaine transmembranaire.

[0156] Dans tout le mémoire, y compris les revendications, où le contexte le permet, le terme « comprenant » et ses variantes comme « comprend » ou « comprenant » doivent être interprétés comme incluant le nombre entier ou les nombres entiers indiqués sans exclure nécessairement tout autre nombre entier.

[0157] L’identité de séquence est calculée selon le pourcentage de correspondances de résidus entre deux séquences polypeptidiques, ou de correspondances de nucléotides entre deux séquences polynucléotidiques, alignées en utilisant un algorithme normalisé. Un tel algorithme peut insérer, d’une façon normalisée et reproductible, des brèches dans les séquences comparées afin d’optimiser l’alignement entre deux séquences, et par conséquent, obtenir une comparaison plus significative des deux séquences. Le pourcentage d’identité peut être mesuré sur la longueur d’une séquence définie entière, ou il peut être mesuré sur une longueur plus courte, par exemple, sur la longueur d’un fragment pris à partir d’une séquence définie plus grande, par exemple, un fragment d’au moins 45, d’au moins 60, d’au moins 90, d’au moins 120, d’au moins 150, d’au moins 210 ou d’au moins 450 résidus ou nucléotides consécutifs. Si la longueur n’est pas spécifiée, l’identité de séquence est calculée sur la pleine longueur de la plus courte des deux séquences.

[0158] Cette invention est en outre illustrée par les exemples suivants qui ne devront pas être interprétés comme limitants.

Exemples [0159] Cet exemple concerne la production du complexe protéinique pentamère du CMV par des lignées cellulaires CHO dans lesquelles les séquences codantes des sous-unités du pentamère ont été intégrées de façon stable dans le chromosome. Les lignées cellulaires sont également qualifiées de lignées cellulaires CHO stables.

[0160] Comme cela est montré dans cet exemple, ces lignées cellulaires CHO stables ont produit un pentamère fonctionnel du CMV, avec les cinq sous-unités assemblées dans la conformation naturelle. Le rendement est élevé, permettant de cette façon la production du complexe pentamère à une grande échelle commerciale. Ces lignées cellulaires sont particulièrement appropriées pour la fabrication à grande échelle de vaccins contre le CMV utilisant le pentamère.

[0161] Comme cela est montré dans cet exemple, les séquences nucléotidiques codant pour l’ectodomaine de la gH, la gL, la pUL128, la pUL130 et la pUL131 ont été clonées dans des vecteurs d’expression simples ou doubles, avec des promoteurs subgénomiques et des IRES pour diriger l’expression du composant individuel (figure 1). De façon spécifique, les séquences codant pour l’ectodomaine de la gH, les gL, pUL128, pUL130 et pUL131 pleine longueur ont été optimisées pour les codons pour une expression en culture de cellules de mammifères, synthétisées et clonées dans un vecteur d’expression simple (avec sélection par Neo et DHFR) dirigé par le promoteur du CMV (pour les gH et UL128) et l’IRES de l’EV71 (pour les gL, UL130, UL131) pour l’expression ; ou des vecteurs d’expression doubles, un avec sélection par Neo et DHFR pour la gH dirigé par le promoteur du CMV, et pour la gL dirigé par le promoteur du CMV ou l’IRES de l’EV71, et un avec sélection par Hyg et Fra pour la UL128 dirigé par le promoteur du CMV, pour les UL130 et UL131 dirigé par l’IRES de l’EV71 (figure 1) . Les marqueurs pour la purification par affinité comme le marqueur His et/ou le marqueur Strep ont été introduits à l’extrémité C-terminale de l’ectodomaine de la gH et/ou de UL130 pour faciliter la purification. Le codon d’arrêt et le domaine transmembranaire de la gH ont été également introduits à l’extrémité C-terminale de l’ectodomaine de la gH pour faciliter le sous-clonage par FACS (figure 1).

[0162] Le plasmide ou les plasmides d’expression ont été transfectés dans un panel de cellules hôtes CHO, comprenant les lignées cellulaires KO pour la matriptase (i) CHOC8TD, (ii) CHOHPT3 et (iii) CHOC8TD.

[0163] CHOC8TD est dérivée d’une lignée cellulaire CHO K1 et elle est en outre modifiée par délétion de la région télomérique du chromosome, si bien que cette lignée cellulaire a les caractéristiques suivantes : (i) télomère du chromosome 8 délété ; (ii) productivité élevée et bonne croissance cellulaire ; et (iii) problèmes potentiels de dégradation protéolytique élevée. CHOHPT3 est une lignée cellulaire CHO K1 montrant une activité protéolytique réduite, si bien que cette lignée cellulaire a les caractéristiques suivantes : (i) dégradation protéolytique inférieure à CHOC8TD, et (ii) croissance, productivité et efficacité du clonage inférieures à CHOC8TD. CHOC8TD KO pour la matriptase a été dérivée de CHOC8TD, avec la matriptase inactivée, si bien que cette lignée cellulaire a les caractéristiques suivantes : (i) matriptase (sérine protéase) inactivée ; et (ii) dégradation protéolytique moindre.

[0164] Le plasmide ou les plasmides d’expression comprenant les séquences codant pour les gH, gL, UL128, UL130 et UL131 ont été transfectés dans les trois cellules hôtes avec Nucleofection AMAXA. Pour la stratégie à vecteur simple, les cellules transfectées ont été sélectionnées par G418 et MTX séquentiellement. Pour la stratégie à vecteur double, les cellules transfectées ont été sélectionnées par Hyg puis MTX séquentiellement.

[0165] Les groupes de cellules survivantes ont été cultivés en culture fermée pour produire les protéines du pentamère jusqu'à l'évaluation des protéines pour le rendement avec un test ELISA indirect, la contamination par gH/gL et la dégradation de gL avec les analyses Western et SDS-PAGE. En se basant sur le rendement du pentamère et la croissance des cellules, le groupe des cellules CHO transfectées avec la stratégie de vecteur 2 (figure 1), en utilisant des cellules hôtes CHOC8TD, a été sélectionné pour le clonage des cellules simples (plasmide d’expression représenté sur la figure 2). Les clones sélectionnés montrent un rendement élevé et moins de contamination par gH/gL.

[0166] Les clones simples ont été triés avec une analyse FACS en utilisant des Acm spécifiques du pentamère (~ 200). Les 30 clones principaux ont été d’abord sélectionnés en se basant sur le titre du pentamère évalué par un test ELISA indirect et ils ont été en outre sélectionnés pour les ramener à 12 clones principaux. Une culture fermée suivie d’une purification par affinité à l’aide de Strep a montré que les 12 principaux peuvent produire le pentamère avec un rendement > 300 mg/l et une pureté élevée (figure 3) . En fait, les clones principaux ont produit le pentamère avec un rendement d’environ 0,3 g/l à environ 0,5 g/l. Le complexe protéinique purifié a été évalué pour sa liaison avec un panel d’Acm dirigés contre le pentamère, et il a été montré qu’ils présentaient tous les épitopes clés.

[0167] Les 12 clones principaux ont été en outre évalués à l’aide d’études de stabilité sur 14 semaines (figure 4). Les lots contrôlés et non contrôlés ont été évalués pour la croissance cellulaire et le titre du pentamère et le clone VF7 a été sélectionné.

[0168] La production en bioréacteur du pentamère avec le clone principal VF7 a été également estimée. Ce clone a produit > 100 mg/l de pentamère purifié (figure 5).

[0169] Comme cela est exemplifié ici, les cellules CHO stables peuvent être utilisées pour exprimer le pentamère. Ceci est en contraste avec l'expression transitoire par les cellules HEK293. Les lignées cellulaires CHO stables de l'invention peuvent produire les protéines du pentamère de façon régulière avec un rendement 100 fois supérieur.

[0170] La capacité à produire des lignées cellulaires CHO stables dans lesquelles les séquences codant pour les cinq sous-unités du pentamère sont intégrées dans le chromosome, comme cela est exemplifié ici, est plutôt remarquable. Il existe toujours des incertitudes quant à si une lignée cellulaire stable peut être produite, même pour une seule protéine. Par exemple, lorsqu’une séquence codant pour l’IGF-1 humain a été introduite dans des cellules CHO pour produire une lignée stable, il a été découvert que les lignées cellulaires IGF-1/CHO résultantes présentaient une inhibition de la croissance cellulaire et des titres bas. La mesure du titre maximal a été d’environ 8 pg/ml ce qui correspond à 100 mg/l d’un titre d’anticorps (en se basant sur la masse molaire). Comparativement, les mesures de titre moyen d’un anticorps recombinant dans un procédé en bioréacteur sont autour de 3 g/l. Une cause du titre bas d’IGF-1 a été la réduction de la croissance cellulaire et la faible viabilité cellulaire des cellules exprimant l’IGF-1. Durant un procédé d’expression d’anticorps, des cellules dérivées de CHO-K1 se sont développées jusqu’à 2 x 107 cellules/ml et la viabilité cellulaire est supérieure à 97 % durant les 230 à 260 premières heures du temps de culture. Au contraire, des cellules dérivées de CHO-K1 exprimant l’IGF-1 ne se sont développées que jusqu’à 0,5 x 107 cellules/ml et la viabilité cellulaire avait déjà chuté au-dessous de 97 % après deux jours. Pour d’autres détails, voir, la demande US provisoire No. 61/738466, déposée le 18 décembre 2012 et la publication de demande PCT No. WO/2014/097113, déposée le 16 décembre 2013.

[0171] Par conséquent, les inventeurs ont fait face à des difficultés supplémentaires significatives parce que les séquences codant pour les cinq sous-unités du pentamère du CMV doivent être intégrées de façon stable dans le génome de la cellule CHO. Les inventeurs ont surmonté ces difficultés, comme cela est mis en évidence par les clones sélectionnés montrant des rendements élevés, avec le pentamère produit de façon recombinante dans sa conformation naturelle et avec tous les épitopes clés.

[0172] Les diverses caractéristiques et les divers modes de réalisation de la présente invention, auxquels il est fait référence dans des sections individuelles ci-dessus s’appliquent, comme il est approprié, aux autres sections, mutatis mutandis. Par conséquent, les caractéristiques précisées dans une section peuvent être combinées avec des caractéristiques spécifiées dans d’autres sections, comme il est approprié.

[0173] Le mémoire est au mieux compris à la lumière des enseignements des références citées au sein du mémoire. Les modes de réalisation au sein du mémoire fournissent une illustration de modes de réalisation de l’invention et ne devront pas être interprétés comme limitant l’étendue de l’invention. L’homme du métier comprend facilement que de nombreux autres modes de réalisation sont englobés par l’invention. La totalité des publications, des brevets, et des séquences de GenBank cités dans cette divulgation sont incorporés en référence dans leur intégralité. Dans la mesure où le matériau incorporé en référence contredit ou est incohérent avec ce mémoire, le mémoire supplantera tout matériau de ce type. La citation de l’une quelconque des références ici n’est pas une admission que de telles références sont de l’art antérieur à la présente invention.

[0174] L’homme du métier reconnaîtra, ou sera capable de déterminer en utilisant une expérimentation ne dépassant pas la routine, de nombreux équivalents aux modes de réalisation spécifiques de l’invention décrite ici. De tels équivalents sont censés être englobés par les modes de réalisation suivants.

[0175] Les modes de réalisation particuliers de l’invention comprennent : 1. Une cellule recombinante de mammifère, comprenant : une ou plusieurs séquences polynucléotidiques codant pour le complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV), où ledit complexe pentamère comprend : la gH ou l’un de ses fragments formant un complexe, la gL ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe ; où lesdites une ou plusieurs séquences polynucléotidiques sont intégrées dans l’ADN génomique de ladite cellule de mammifère. 2. La cellule de mammifère du mode de réalisation 1, où ladite cellule de mammifère est une cellule d’ovaire de hamster de Chine (CHO). 3. La cellule de mammifère du mode de réalisation 2, où ladite cellule CHO est une cellule CHO-K1, CHO-DUXB11, ou CHO-DG44. 4. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 3, où le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit dans ladite cellule, comparativement à un témoin. 5. La cellule de mammifère du mode de réalisation 4, où au moins une copie de la séquence génomique du gène C12orf35, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène C12orf35, est délétée. 6. La cellule de mammifère du mode de réalisation 5, où les deux copies des séquences génomiques du gène C12orf35, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène C12orf35 à partir de chaque copie, sont délétées. 7. La cellule de mammifère du mode de réalisation 4 ou 5, où au moins une copie de la région télomérique du chromosome 8 d’une cellule CHO qui comprend le gène C12orf35 est délétée. 8. La cellule de mammifère du mode de réalisation 7, où ladite région télomérique comprend en outre un gène choisi dans le groupe constitué de : Bicdl, Amn1, protéine 20 de type méthyltransférase, Dennd5b, FAM60A, Caprin2, Ipo8, RPS4Y2, et l’une de leurs combinaisons. 9. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 4 à 8, où ladite protéine C12orf35 comprend une séquence qui est au moins identique à 80 % avec l’une quelconque des séquences choisies dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 21, 22, 23, 24 et 35. 10. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 4 à 9, où ledit gène C12orf35 comprend une séquence qui est au moins identique à 80 % avec SEQ ID NO : 25. 11. La cellule de mammifère du mode de réalisation 4, où ladite cellule comprend une mutation dans le promoteur, l’UTR en 5’, ou l’UTR en 3’ dudit gène C12orf35. 12. La cellule de mammifère du mode de réalisation 4, où ladite protéine C12orf35 comprend une mutation qui réduit son activité, comparativement à un témoin. 13. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 12, où le taux d’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduit dans ladi te cellule, comparativement à un témoin. 14. La cellule de mammifère du mode de réalisation 13, où au moins une copie de la séquence génomique du gène FAM60A, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène FAM60A, est délétée. 15. La cellule de mammifère du mode de réalisation 14, où les deux copies des séquences génomiques du gène FAM60A, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène FAM60A à partir de chaque copie, sont délétées. 16. La cellule de mammifère du mode de réalisation 13 ou 14, où ladite séquence délétée comprend une portion de la région télomérique du chromosome 8 d’une cellule CHO. 17. La cellule de mammifère du mode de réalisation 16, où ladite séquence délétée comprend en outre un gène choisi dans le groupe constitué de : Caprin2 et Ipo8, et l’une de leurs combinaisons. 18. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 13 à 17, où ladite protéine FAM60A comprend une séquence qui est au moins identique à 80 % avec l’une quelconque des séquences choisies dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 28, 29, et 30. 19. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 13 à 18, où ledit gène FAM60A comprend une séquence qui est au moins identique à 80 % avec SEQ ID NO : 31. 20. La cellule de mammifère du mode de réalisation 13, où ladite cellule comprend une mutation dans le promoteur, l’UTR en 5’, ou l’UTR en 3’ dudit gène FAM60A. 21. La cellule de mammifère du mode de réalisation 13, où ladite protéine FAM60A comprend une mutation qui réduit son activité, comparativement à un témoin. 22. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 21, où le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit dans ladi te cellule, comparativement à un témoin. 23. La cellule de mammifère du mode de réalisation 22, où au moins une copie de la séquence génomique du gène de la matriptase, ou au moins 50 % de la séquence codante du gène de la matriptase, est délétée. 24. La cellule de mammifère du mode de réalisation 23, où les deux copies des séquences génomiques du gène de la matriptase, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène de la matriptase à partir de chaque copie, sont délétées. 25. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 22 à 25, où ladite matriptase comprend une séquence qui est au moins identique à 80 % avec l’une quelconque des séquences choisies dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 32, 33, et 34. 26. La cellule de mammifère du mode de réalisation 22, où ladite cellule comprend une mutation dans l’exon 2 du gène de la matriptase. 27. La cellule de mammifère du mode de réalisation 22, où ladite cellule comprend une mutation dans le promoteur, l’UTR en 5’, ou l’UTR en 3’ du gène de la matriptase. 28. La cellule de mammifère du mode de réalisation 22, où ladite matriptase comprend une mutation qui réduit son activité, comparativement à un témoin. 29. La cellule de mammifère du mode de réalisation 28, où ladite matriptase comprend une mutation dans le domaine catalytique. 30. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 29, où la dihydrofolate réductase (DHFR) endogène de ladite cellule de mammifère est déficiente. 31. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 29, où la dihydrofolate réductase (DHFR) endogène de ladite cellule de mammifère est compétente. 32. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 31, où ledit fragment formant un complexe de la gH ne comprend pas la séquence signal d’une protéine gH pleine longueur. 33. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 32, où ledit fragment formant un complexe de la gH ne comprend pas le domaine transmembranaire d’une protéine gH pleine longueur. 34. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 33, où ledit fragment formant un complexe de la gH comprend l’ectodomaine d’une protéine gH pleine longueur. 35. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 34, où ladite gH comprend une séquence choisie dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, et 5. 36. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 35, où ledit fragment formant un complexe de la gH (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; et (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, ou SEQ ID NO : 5. 37. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 36, où ledit fragment formant un complexe de la gL ne comprend pas la séquence signal d’une protéine gL pleine longueur. 38. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 37, où ladite gL comprend une séquence choisie dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 6, 7, 8, et 9. 39. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 38, où ledit fragment formant un complexe de la gL (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; et (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, ou SEQ ID NO : 9. 40. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 39, où ledit fragment formant un complexe de la pUL128 ne comprend pas la séquence signal d’une protéine pUL128 pleine longueur. 41. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 40, où ladite pUL128 comprend une séquence choisie dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 10, 11, 12 et 13. 42. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 41, où ledit fragment formant un complexe de la pUL128 (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; et (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, ou SEQ ID NO : 13. 43. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 42, où ledit fragment formant un complexe de la pUL130 ne comprend pas la séquence signal d’une protéine pUL130 pleine longueur. 44. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 43, où ladite pUL130 comprend une séquence choisie dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 14, 15, et 16. 45. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 44, où ledit fragment formant un complexe de la pUL130 (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; et (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, ou SEQ ID NO : 16. 46. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 45, où ledit fragment formant un complexe de la pUL131 ne comprend pas la séquence signal d’une protéine pUL131 pleine longueur. 47. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 46, où ladite pUL131 comprend une séquence choisie dans le groupe constitué des SEQ ID NO : 17, 18, 19, et 20. 48. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 47, où ledit fragment formant un complexe de la pUL131 (i) forme une partie du complexe pentamère gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131 ; et (ii) comprend au moins un épitope provenant de SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, ou SEQ ID NO : 20. 49. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 48, où ledit complexe pentamère est soluble. 50. La cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 49, où ledit complexe pentamère est sécrété à partir de la cellule hôte. 51. Une culture à grande échelle comprenant la cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 50, où ladite culture a une taille d’au moins 20 litres. 52. Une culture à grande échelle comprenant la cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 51, où ladite culture a une taille d’au moins 50 litres. 53. La culture à grande échelle du mode de réalisation 51 ou 52, où le rendement du complexe pentamère du CMV est d’au moins 0,05 g/l. 54. La culture à grande échelle du mode de réalisation 51 ou 52, où le rendement du complexe pentamère du CMV est d’au moins 0,1 g/l. 55. Un complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV) produit par la cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 50, ou la culture à grande échelle de l’un quelconque des modes de réalisation 51 à 54. 56. Une composition comprenant le complexe pentamère du mode de réalisation 55. 57. Un procédé de production du complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV), où ledit complexe pentamère comprend : la gH ou l’un de ses fragments formant un complexe, la gL ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe, comprenant : (i) la culture de la cellule de mammifère de l’un quelconque des modes de réalisation 1 à 50 dans des conditions appropriées, exprimant de cette façon ledit complexe pentamère ; et (ii) la récolte dudit complexe pentamère à partir de la culture. 58. Le procédé du mode de réalisation 57, comprenant en outre la purification dudit complexe pentamère. 59. Un complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV) produit par le procédé du mode de réalisation 57 ou 58. 60. Une composition comprenant le complexe pentamère du mode de réalisation 59. 61. La composition du mode de réalisation 56 ou 60, où ledit complexe pentamère a une pureté d’au moins 95 %, en masse. 62. La composition du mode de réalisation 61, comprenant en outre un adjuvant, comme un sel d’aluminium, ou le MF59. 63. La composition du mode de réalisation 61 ou 62, pour une utilisation dans l’induction d’une réponse immunitaire contre le CMV. 64. Le complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV) du mode de réalisation 55, où ledit complexe pentamère est immunogène. 65. Le complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV) du mode de réalisation 64, où les anticorps dirigés contre ledit complexe pentamère sont des anticorps neutralisants. Légendes des figures

Liste des séquences <110> GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS sa

<120> CELLULES DE MAMMIFERES EXPRIMANT DES ANTIGENES DU CYTOMEGALOVIRUS <130> VN56323 <140> 14191385.5 <141> 31-10-2014 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 742 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1).. (742) <223> /note="Souche Merlin" <400> 1

Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Ile Leu Ala Val Cys Leu 1 5 10 15

Phe Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Val Ser Glu 20 25 30

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<210> 2 <211> 742 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1).. (742) <223> /note="Souche Towne" <400> 2

Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Val Leu Ala Val Cys Leu 1 5 10 15

Leu Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Ile Ser Glu 20 25 30

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<210> 3 <211> 743 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(743) <223> /note="Souche AD169" <400> 3

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<210> 4 <211> 715 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(715) <223> /note="Souche Merlin" <400> 4

Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Ile Leu Ala Val Cys Leu 1 5 10 15

Phe Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Val Ser Glu 20 25 30

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<210> 6 <211> 278 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(278) <223> /note="Souche Merlin" <400> 6

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<210> 8 <211> 278 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(278) <223> /note="Souche AD169" <400> 8

Met Cys Arg Arg Pro Asp Cys Gly Phe Ser Phe Ser Pro Gly Pro Val 1 5 10 15

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Gln Ala Val Asp Ala Arg 275

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Ala Ala Val Ser Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu 1 5 10 15

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Gly Pro Gln Ala Val Asp Ala Arg 245

<210> 10 <211> 130 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1).. (130) <223> /note="Souche Merlin" <400> 10

Met Ser Pro Lys Asp Leu Thr Pro Phe Leu Thr Ala Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15

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Pro Tyr 130

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Met Ser Pro Lys Asn Leu Thr Pro Phe Leu Thr Ala Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15

Leu Gly His Ser Arg Val Pro Arg Val Arg Ala Glu Glu Cys Cys Glu 20 25 30

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<210> 12 <211> 171 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(171) <223> /note="Souche AD169" <400> 12

Met Ser Pro Lys Asp Leu Thr Pro Phe Leu Thr Thr Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15

Leu Gly His Ser Arg Val Pro Arg Val Arg Ala Glu Glu Cys Cys Glu 20 25 30

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<210> 13 <211> 144 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <400> 13

Glu Glu Cys Cys Glu Phe Ile Asn Val Asn His Pro Pro Glu Arg Cys 1 5 10 15

Tyr Asp Phe Lys Met Cys Asn Arg Phe Thr Val Ala Leu Arg Cys Pro 20 25 30

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<210> 14 <211> 214 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(214) <223> /note="Souche Merlin" <400> 14

Met Leu Arg Leu Leu Leu Arg His His Phe His Cys Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15

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<210> 15 <211> 229 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(229) <223> /note="Souche Towne" <400> 15

Met Leu Arg Leu Leu Leu Arg His His Phe His Cys Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15

Ala Val Trp Ala Thr Pro Cys Leu Ala Ser Pro Trp Ser Thr Leu Thr 20 25 30

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Glu Asn Arg Ala Ser 225

<210> 16 <211> 189 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S ) <222> (1)..(189) <223> /note="Souche Merlin" <400> 16

Ser Pro Trp Ser Thr Leu Thr Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Pro Trp 1 5 10 15

Ser Lys Leu Thr Tyr Ser Lys Pro His Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys 20 25 30

Pro Phe Leu Tyr Pro Ser Pro Pro Arg Ser Pro Leu Gln Phe Ser Gly 35 40 45

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Leu Leu Tyr Asn Arg Glu Gly Gln Thr Leu Val Glu Arg Ser Ser Thr 65 70 75 80

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Leu Gln Arg Met Pro Arg Thr Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val 100 105 110

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Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr His Pro Asn Leu Ile Val 180 185

<210> 17 <211> 129 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1).. (129) <223> /note="Souche Merlin" <400> 17

Met Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val 1 5 10 15

Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg 20 25 30

Val Pro His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr 35 40 45

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Arg Arg Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser 100 105 110

Leu Ala Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala 115 120 125

Asn

<210> 18 <211> 129 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1).. (129) <223> /note="Souche Towne" <400> 18

Met Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val 1 5 10 15

Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg 20 25 30

Val Pro His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr 35 40 45

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Arg Arg Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser 100 105 110

Leu Ala Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala 115 120 125

Asn

<210> 19 <211> 74 <212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <220> <221> AUTRE(S) CARACTERISTIQUE(S) <222> (1)..(74) <223> /note="Souche AD169" <400> 19

Met Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val 1 5 10 15

Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Lys Arg Leu Leu Pro 20 25 30

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Leu Arg Cys Glu Pro Arg Leu Gly Gln Leu 65 70 <210> 20 <211> 111

<212> PRT <213> Herpèsvirus 5 humain <400> 20

Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Val Pro 1 5 10 15

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Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His Tyr Asp 35 40 45

Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile Asn Val 50 55 60

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Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser Leu Ala 85 90 95

Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala Asn 100 105 110

<210> 21 <211> 1547 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 21

Met Asn Trp Asn Ala Lys Pro Glu Asn Ala Ala Pro Asn Pro Pro Tyr 1 5 10 15

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<212> ADN <213> Cricetulus griseus <400> 25 atgaattgga atgcaaaacc agagaatgct gccccaaacc caccatattc taaaagccag 60 tcgtctcttt tgcagcagtt tttaatgcct tccacaactt ctcaaagttc tttcagctgt 120 ctcccacata accaagaagc atgcatatat cccactaatt caaattcagt ttcacagcca 180 cttctgaacg tcaggagttt cataaatcct ccgatctctg tttctaatgt gcataatagg 240 acagttgtgg cctcacagac ctcagtagaa agagtcacat atacaaatgt taaaggagcc 300 caacaaccaa accacaattt gcaaacagtg tcttctggag ttgtgcaaaa tgcctggatg 360 aattcaacaa tgaggaattt tatgccttct cttacagagg caaccatatc tcataaacct 420 gatggtgggc ctagtatgcc atatatgcat gcaccacaga gtcatcttgt cacatcagac 480 acctactctg tgcaactaca gatgactcct tcaaactctg taagaggccc tgtaacttac 540 caaggaaatt atcaaggaaa tccgggactt aaccactcga tggcaggtga gcttggctgg 600 gtacaatgtg catccagtga acttacttat ccagattaca gaccacctcc aaagcaatat 660 ccttatttac cacaaagctt tgtgcaagac acttctgttc agaaacaaaa ctttgtgtca 720 tctacatcat tacaagttaa aaataatcag cttccacctt ctacacagac cttaccatca 780 aagcgccctg tacctgtgtc gtcatatcag tatgctgcag 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<210> 26 <211> 112 <212> ADN <213> Cricetulus griseus <400> 26 tgctgggatt taaggggaaa gctttaataa aagatcttta tttgtatttc ttgcagattt 60 gtgacattca aaaccacaga ctatgcaaca ctactactaa accaggtcaa at 112

<210> 27 <211> 36 <212> ADN <213> Cricetulus griseus <400> 27 cttcgggata gagtggtttt gcttttacca ccagga 36

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Met Phe Gly Phe His Lys Pro Lys Met Tyr Arg Ser Ile Glu Gly Cys 1 5 10 15

Cys Ile Cys Arg Ala Lys Ser Ser Ser Ser Arg Phe Thr Asp Ser Lys 20 25 30

Arg Tyr Glu Lys Asp Phe Gln Ser Cys Phe Gly Leu His Glu Thr Arg 35 40 45

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Lys Glu Phe Lys Arg His Asn Ser Asp Ala His Ser Thr Thr Ser Ser 115 120 125

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Glu Gln Pro Glu Pro Leu Gln Pro Glu Glu Pro Ala Ser Ser Glu Tyr 740 745 750

Val Glu Ala Asn Arg Glu Ala Thr Glu Glu Ser Cys Arg Glu Tyr Thr 755 760 765

Gly Arg Lys Glu Ser Thr Ala Lys Asp Val Cys Leu Pro Ala Ala Ile 770 775 780

Gln Gln Asp Pro His Pro Arg Glu Thr Asp Met Phe Ser Lys Ser Asp 785 790 795 800

His Ser Leu Pro Ala Ile Asn Glu Ile Asn Asp Glu Ser Glu Pro Ile 805 810 815

Ser Tyr Leu His Asp Gln Leu Ser Glu Leu Leu Lys Glu Phe Pro Tyr 820 825 830

Gly Ile Glu Thr Phe Asn Arg His Glu Val Ser Leu Asp Gln Gln Lys 835 840 845

Thr His Lys Ile Val Glu Asn Gln Thr Gly Gly Lys Thr Ser Asn Val 850 855 860

Ser Gly Asp Ser Thr Asp Gln Ile Lys Ile Thr Val Leu Asn Ser Glu 865 870 875 880

Gln Ile Lys Glu Leu Phe Pro Glu Asp Asp Gln Pro Cys Asp Lys Leu 885 890 895

Ala Glu Pro Glu Asn Lys Glu Ile Val Ala Glu Val Lys Ser Pro Cys 900 905 910

Asp Ser Gln Ile Pro Arg Glu Glu Ser His Asp Leu Gly Met Leu Asp 915 920 925

Pro Glu Lys Asp Lys Ile His Cys Cys Ala Leu Gly Trp Leu Ser Met 930 935 940

Val Tyr Glu Gly Val Pro Gln Cys His Cys Ser Ser Thr Glu Lys Lys 945 950 955 960

Glu Lys Asp Gln Cys Leu Asp Ile Asn Ser Ser Lys Gln Gly Glu Gln 965 970 975

Pro Cys Asn Ser Gly Ile Thr Ile Phe Glu Ile Asn Pro Val Ser Asn 980 985 990

Asn Ser Lys Thr Pro Leu Thr Gln Ala Thr Glu Glu Gly His Phe Ser 995 1000 1005

Ala Val His Gly Glu Lys Thr Lys Ala Ser Lys Thr Lys Asp Asn 1010 1015 1020

Arg Glu Gly Gln Glu Leu Ala Cys His Phe Ser Ala Lys Cys Tyr 1025 1030 1035

Lys Lys Asp Lys Lys Gly Asn Phe Lys Ile Arg His Asp Thr Ser 1040 1045 1050

Leu Lys Met Glu Gln Lys Leu Lys Asn Ile Ser Ser Lys Cys Asp 1055 1060 1065

Ile Pro Asn Pro Ser Lys Cys Asn Lys Ile Ala Ala Pro Glu Ile 1070 1075 1080

Leu His Val Thr Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asn Met Pro Phe Ser 1085 1090 1095

Lys Gln Ala Ser Gln Glu Ser Leu Gln Lys Lys His Thr Ser Gln 1100 1105 1110

Asp Leu Gly Pro Val Lys Ala Pro Ile Glu Leu Ser Ser Asn Thr 1115 1120 1125

Asp Pro Cys Arg Ser Asn Thr Ser Ser Val Gln Ser Val Ser Pro 1130 1135 1140

Glu Lys Lys Lys Leu Lys Phe Lys Ala Gly Gly Ser Arg Leu Lys 1145 1150 1155

Tyr Phe Glu Lys Arg Lys Thr Asp His Val Ile Ile Pro Asp Val 1160 1165 1170

Glu Ile Lys Lys Lys Lys Tyr Glu Lys Gln Glu Gln Asn Lys Asn 1175 1180 1185

Ala Gly Asp Thr Leu Lys Leu Cys Ser Ile Leu Thr Glu Ser Asn 1190 1195 1200

Glu Arg Ala Ser Val Gln Glu Lys Thr Val Pro Ser Pro Glu Ser 1205 1210 1215

Ser Asp Pro Lys Gly Ser Ser Ser Lys Ser Thr Arg Val Ile Thr 1220 1225 1230

Val Gln Glu Tyr Leu Gln Arg Gln Lys Asp Lys Gln Ile Thr Gly 1235 1240 1245

Asn Asn Ala Ser Arg Asn Ile Cys Val Glu Thr Val Leu Cys Asp 1250 1255 1260

Ser Gly His Thr Lys Thr Ser Lys His Ser Ala Ala Val Ser Trp 1265 1270 1275

Gly Lys Leu Val Glu Gly Gln Ser Ile Ser Ala Glu Thr Ala Lys 1280 1285 1290

Glu Leu Glu His Asn Ser Ser Ser His Gly Lys Asp Phe Lys Ile 1295 1300 1305

His His Ser Glu Ala Ser Arg Thr His Ser Val Ser Asn Asn Asn 1310 1315 1320

Lys Gly Lys Phe Asp Gly Lys Gln Pro Asp Lys Met Phe Lys Asn 1325 1330 1335

Lys Thr Ser Met Asn Asn Glu Ser Asn Gln Met Pro Leu Gln Val 1340 1345 1350

Lys Glu Gln Arg Lys Gln Tyr Leu Asn Arg Val Ala Phe Lys Cys 1355 1360 1365

Thr Glu Arg Glu Ser Ile Cys Leu Thr Lys Leu Asp Ser Ala Ser 1370 1375 1380

Lys Lys Leu Ser Ile Glu Lys Lys Ser Gly Glu Tyr Thr Ser Lys 1385 1390 1395

Thr Lys Asp Thr Asp Lys Pro Ser Met Leu Glu Phe Lys Leu Cys 1400 1405 1410

Pro Asp Val Leu Leu Lys Asn Thr Ser Thr Val Asp Lys Gln Asp 1415 1420 1425

Cys Pro Gly Pro Gly Pro Glu Lys Glu Gln Ala Pro Val Gln Val 1430 1435 1440

Ser Gly Ile Lys Ser Thr Lys Glu Asp Trp Leu Lys Cys Ile Pro 1445 1450 1455

Thr Arg Thr Lys Met Pro Glu Ser Ser Gln Arg Asp Ser Ala Asp 1460 1465 1470

Ser Arg Leu Ser Lys Arg Ser Leu Ser Ala Asp Glu Phe Glu Ile 1475 1480 1485

Leu Gln Asn Pro Val Lys Glu Ser Asn Ile Met Phe Arg Thr Tyr 1490 1495 1500

Lys Lys Met Tyr Leu Glu Lys Arg Ser Arg Ser Leu Gly Ser Ser 1505 1510 1515

Pro Val Lys 1520

<210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <221> source <223> /note="Description de séquence artificielle : Synthétique Marqueur 6xHis" <400> 36

His His His His His His 1 5

<210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <221> source <223> /note="Description de séquence artificielle : Synthétique peptide" <400> 37

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <221> source <223> /note="Description de séquence artificielle : Synthétique peptide" <400> 38

Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5

<210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <221> source <223> /note="Description de séquence artificielle : Synthétique peptide" <400> 39

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5

Claims (13)

1. REVENDICATIONS

   1. Cellule CHO recombinante, comprenant : une ou plusieurs séquences polynucléotidiques codant pour le complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV), où ledit complexe pentamère comprend : la gH ou l'un de ses fragments formant un complexe, la gL ou l'un de ses fragments formant un complexe, la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe ; où lesdites une ou plusieurs séquences polynucléotidiques sont intégrées dans l’ADN génomique de ladite cellule CHO et où le taux d’expression ou l’activité de la protéine C12orf35 est réduit dans ladite cellule, comparativement à un témoin.
2. 2. Cellule CHO selon la revendication 1, où ladite cellule CHO est une cellule CHO-K1, CHO-DUXB11, CHO-DG44, ou CHO-S.
3. 3. Cellule CHO selon la revendication 1 ou 2, où au moins une copie de la séquence génomique du gène C12orf35, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène C12orf35, est délétée.
4. 4. Cellule CHO selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, où l’expression ou l’activité de la protéine FAM60A est réduite dans ladite cellule, comparativement à un témoin.
5. 5. Cellule CHO selon la revendication 4, où au moins une copie de la séquence génomique du gène FAM60A, ou au moins 50 % de la séquence codante dudit gène FAM60A, est délétée.
6. 6. Cellule CHO selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, où le taux d’expression ou l’activité de la matriptase est réduit dans ladite cellule, comparativement à un témoin.
7. 7. Cellule CHO selon la revendication 6, où ladi te cellule comprend une mutation dans l’exon 2 du gène de la matriptase.
8. 8. Cellule CHO selon l’une quelconque des revendications là 7, où ledit fragment formant un complexe de la gH comprend l’ectodomaine d’une protéine gH pleine longueur.
9. 9. Cellule CHO selon l’une quelconque des revendications là 8, où ledit complexe pentamère est soluble.
10. 10. Cellule CHO selon l’une quelconque des revendications l à 9, où ledit complexe pentamère est sécrété à partir de la cellule hôte.
11. 11. Culture à grande échelle comprenant la cellule CHO selon l’une quelconque des revendications l à l0, où ladite culture a une taille d’au moins 20 litres.
12. 12. Culture à grande échelle selon la revendication 11, où le rendement du complexe pentamère du CMV est d’au moins 0,05 g/l.
13. 13. Composition comprenant le complexe pentamère du cytomégalovirus (CMV), où ledit complexe pentamère comprend : la gH ou l’un de ses fragments formant un complexe, la gL ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL128 ou l’un de ses fragments formant un complexe, la pUL130 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et la pUL131 ou l’un de ses fragments formant un complexe, et où ledit complexe pentamère est produit par la cellule CHO selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, ou la culture à grande échelle selon la revendication 11 ou 12.