ES2684782B1 - Producto alimenticio para animales que comprende aloína, apigenina y ácido cafeico y procedimiento para su obtención - Google Patents

Description

DESCRIPCION

Producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico, y procedimiento para su obtencion.

Campo de la investigacion

La presente invention se refiere al campo de la alimentation en animales. En particular, se refiere a un producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico, y a su procedimiento de obtencion.

Antecedentes de la invencion

Existen varios factores en la production ganadera y avlcola que conducen a un bajo rendimiento del sistema inmunologico de los animales y hacen necesario la existencia en el mercado de un producto con esta finalidad.

Por otro lado, debido a la prohibition de muchos antibioticos, los periodos de supresion que tienen o la preocupacion por los residuos por parte de los consumidores, ha sido necesario orientar la oferta a pronutrientes que no presentan ninguna de las problematicas anteriores, entendiendose por pronutriente un microingrediente incluido en la formulation de un alimento animal en cantidades relativamente pequenas con funciones fisiologicas y microbiologicas especlficas distintas a la de otros nutrientes.

Existen tres factores que actualmente hacen que el sistema inmune de los animales sea vulnerable y por lo cual es conveniente administrar inmunoestimulantes en animales de produccion:

1. Animales jovenes: la inmadurez de su sistema inmunitario hace que estos esten mas predispuestos a las infecciones.

En aves: El desarrollo del sistema inmune continua despues de la eclosion del huevo. Durante los primeros siete dlas de vida, una gran parte de la inmunidad esta formada por anticuerpos maternales.

En lechones y rumiantes, durante las primeras semanas de vida, el sistema inmune activo no es maduro y la inmunidad pasiva adquirida por el calostro disminuye con el tiempo.

Por lo tanto es necesaria la administration de un inmunoestimulante general para prevenir infecciones y fortalecer el sistema inmune de los animales jovenes.

2. La selection genetica de las razas de aves de corral, cerdos y rumiantes para lograr una alta tasa de crecimiento o una mayor prolificidad causa un debilitamiento del sistema inmune debido al desgaste metabolico.

• Los animales de crecimiento rapido, tras la vacunacion, tardan 21 dlas en desarrollar una inmunidad serologica espedfica. En muchos casos, los polios jovenes ("broilers”) son sacrificados el dla 32-35, por esta razon en la mayorla de casos se considera que la vacunacion es inutil debido a que el animal es sacrificado antes de estar completamente inmunizado.

• En animales de vida mas larga, a veces, para mejorar los resultados obtenidos con las vacunas, es necesario el uso de vacunas con cepas muy virulentas, ya que permiten alcanzar una mayor inmunidad.

3. Como complemento de la terapia antimicrobiana: Ademas del tratamiento farmacologico, los inmunoestimulantes ayudan en la respuesta inmune del organismo contra la infeccion. Los inmunoestimulantes mejoran el estado inmune del animal, aceleran la recuperacion y reducen el impacto de las enfermedades en los parametros productivos. Los inmunoestimulantes tambien limitan las infecciones secundarias y recurrentes (sobre todo en superinfecciones vlricas). Tambien pueden reemplazar terapias antimicrobianas cuando, debido al perlodo de retirada, no pueden administrarse productos farmacologicos. Las cepas altamente virulentas pueden causar efectos secundarios o incluso slntomas muy parecidos a la enfermedad. Si se administra un inmunoestimulante los dlas anteriores a la vacunacion, se consigue una mejor inmunidad que unicamente usando la vacunacion y no aparece la necesidad de utilizar cepas altamente virulentas

Por lo tanto, a la luz de la importancia de una inmunoestimulacion a los animales de production, junto con la preocupacion creciente de los consumidores sobre los residuos en la carne para no crear resistencia, los presentes inventores han desarrollado un producto alimenticio para animales a base de extractos vegetales que actua como inmunoestimulante. Descripcion resumida de la invencion

Un primer objetivo de la invencion es un producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico.

Un segundo objetivo de la invencion se refiere a un procedimiento para la obtencion del producto alimenticio segun el primer aspecto de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Test western-Blot.

Figura 2: Representation de los resultados del ejemplo 6.

Descripcion de la invencion

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico. Preferiblemente, dicho producto se destina a animales de produccion ganadera que incluyen, sin limitarse a los mismos, rumiantes, ganado porcino y aves.

En una realization preferida, la alolna esta presente en como mlnimo el 2,8% en peso en el producto alimenticio de la invencion. Dicha alolna esta contenida preferiblemente en un extracto de la hoja de Aloe vera, mas preferiblemente esta contenido en un porcentaje en peso entre el 7 y el 11% en peso en dicho extracto. La alolna habitualmente se prepara mediante la extraction del aloe, un exudado amarillento que emana del anverso de la piel de las hojas de aloe. El latex, conocido como "jugo de aloe”, posteriormente se deshidrata y se convierte en polvo.

La alolna es un glicosido antraquinonico, lo que significa que su esqueleto de antraquinona ha sido modificado por la adicion de una molecula de azucar. Actua estimulando el sistema inmunologico a nivel del tipo inespeclfico, incrementando la actividad de macrofagos y neutrofilos, y estimulando la elimination de microorganismos.

En otra realization preferida, la apigenina esta presente en como minimo el 1,25% en peso en el producto alimenticio de la invention. Dicha apigenina esta contenida preferiblemente en un extracto de Taraxacum officinale, mas preferiblemente esta contenida en un porcentaje en peso entre el 3,5 y el 5,5% en peso en dicho extracto. Las propiedades de la apigenina son de inmunomoduladora e inmunoestimulante mediante aumento de las defensas inespeclficas. En ensayos in vitro se ha demostrado el aumento de la actividad fagocitaria de los macrofagos en un 23%. Los macrofagos son celulas del sistema de defensa que rapidamente emigran al sitio de la infection para detener a las bacterias.

En aun otra realization preferida, el acido cafeico esta presente en como minimo el 3,3% en peso en el producto de la invention. Dicho acido esta contenido preferiblemente en un extracto de Echinacea purpurea, mas preferiblemente esta contenido en un porcentaje en peso entre el 5,5 y el 8,5 % en peso en dicho extracto.

La equinacea (Echinacea purpurea) es una planta originaria de America del Norte que tradicionalmente se la ha conocido por sus propiedades potenciadoras del sistema inmunologico. Aumenta la multiplicacion de globulos blancos (linfocitos T), e incrementa la capacidad de fagocitosis (de los globulos blancos macrofagos). Tambien mejora la interaction de los anticuerpos, producidos por los globulos blancos neutrofilos, haciendo mas eficientes las defensas.

En un segundo aspecto, la presente invention se refiere a un procedimiento para la obtencion de un producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico, que comprende las etapas de:

- (a) obtener un extracto de alolna de las hojas de Aloe vera.

- (b) obtener un extracto de apigenina de las flores de Taraxacum officinale;

interpretandose que por "flor” o “flores” se da a entender cualquier parte de la flor.

- (c) obtener un extracto de acido cafeico de la flor de Echinacea purpurea.

- (d) mezclar los extractos de las etapas (a), (b) y (c) hasta homogeneidad.

Preferiblemente, la etapa (a) comprende las siguientes subetapas:

- (a1) limpiar, cortar las puntas y pelar las hojas de Aloe vera suficientes para obtener un gel ecologico con una concentration entre el 0,5-1% en peso de alolna, preferiblemente el 0,7% en peso de alolna.

- (a2) prensar y filtrar la materia gelatinosa obtenida en el punto (a1).

- (a3) aclarar y esterilizar la materia gelatinosa para eliminar bacterias y otras sustancias de pesos moleculares menores.

- (a4) concentrar la materia gelatinosa mediante ultrafiltracion hasta una concentracion entre el 7 y el 11% en peso de alolna en el extracto, que es entre 10 y 20 veces superior a la concentracion de las hojas.

- (a5) liofilizar.

De este modo se obtiene el extracto de alolna.

Preferiblemente, la etapa (b) comprende las siguientes subetapas:

- (b1) secar las flores frescas, habitualmente durante 4 dlas.

- (b2) suspender las flores de Taraxacum en una solucion enzimatica en emulsion.

- (b3) acidificar la suspension anterior obtenida en (b1), habitualmente con acido sulfurico al 15% en peso.

- (b4) poner a ebullicion la suspension durante 20 minutos a presion reducida.

- (b5) agitar.

- (b5) realizar una extraction metanolica.

- (b6) evaporar el metanol.

En la subetapa (b2), la solucion enzimatica utilizada esta preferiblemente compuesta por celulasa y xilanasa en una proportion en volumen del 80% de celulasa y el 20% de xilanasa. De este modo se obtiene el extracto de apigenina.

Preferiblemente, la etapa (c) comprende las siguientes subetapas y no requiere de ninguna etapa de hidrolisis:

- (c1) suspender la flor de Echinacea purpurea, previa limpieza y desinfeccion, en etanol al 96% en volumen en una proporcion en peso vegetal:alcohol de 1:8 (por ejemplo, 1 kilo de vegetal en 8 kilos de etanol), durante 5 horas.

- (c2) filtrar para separar la parte solida.

- (c3) anadir una solucion acuosa de acido cltrico 0,5-1,5 mM, preferiblemente 1 mM. - (c4) tratar con p-hidroxibenzoato de etilo: emulsionante 1:5 (proporcion en peso).

- (c5) homogeneizar entre 30-35 minutos.

- (c7) eliminar el disolvente por arrastre de vapor.

De este modo se obtiene el extracto de acido cafeico.

En el presente documento, debe entenderse que cualquiera de las realizaciones descritas de la presente invention se pueden combinar entre si, a menos que se indique especlficamente lo contrario.

La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos sin que los mismos representen una limitation del alcance de la presente invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1. Obtencion de aloina a partir de Aloe vera

1. Lavado de la hoja: en tinas de acero inoxidable o plastico, en operation manual o mecanizada, mediante el uso de bombas de recirculation de la solution de lavado compuesta por agua y un agente tensoactivo tipo laurel sulfato de sodio o laurel eter sulfato de sodio.

2. Enjuague de la hoja: en tinas de acero inoxidable o plastico, en operacion manual o mecanizada, mediante el uso de bombas de recirculacion de la solucion de enjuague compuesta por agua y un agente bactericida, tal como yodo, peroxido de hidrogeno u otro conveniente.

3. Corte de los filos o bordes espinosos: operacion manual mediante cuchillas adosadas a la mesa de descortezado.

4. Descortezado automatico: mediante cuchillas de altura ajustable y conduction por rodillos en la mesa de descortezado.

5. Prensado: se prensa en frlo para poder eliminar las fibras y la pulpa para la production de jugo. Es necesario dispersar el cristal mediante el uso de una despulpadora que no corte o desmenuce las fibras en exceso para facilitar su posterior remocion. No es recomendable el licuado.

6. Filtration: mediante el empleo de un filtro centrlfugo a temperatura ambiente para retirar las fibras vegetales.

7. Aclarado del mucllago mediante el uso de una centrlfuga clarificadora de discos, de alta velocidad que ofrece mejores resultados y puede incluso eliminar bacterias grandes.

8. La esterilizacion se ejecuta a temperatura ambiente mediante el empleo de membranas con porosidad de hasta de 0,5 pm. Las bacterias tienen tamanos superiores a 1 pm.

9. La purification en frlo se logra mediante ultrafiltracion a traves de membranas de porosidad para retener sustancias a partir de un peso molecular de 400 Da. Este metodo consigue aumentar la concentration de alolna entre 10 y 20 veces respecto de la que se halla en la hoja sin tratar.

10. Para el secado final se utiliza el procedimiento de liofilizacion que implica la congelation del producto y la posterior sublimation del hielo formado, sin pasar por la fase llquida del agua. Es, sin lugar a dudas, el mejor metodo de secado cuando se desean conservar las propiedades originales del producto. Permite obtener un polvo facilmente reconstituible. Se obtiene un polvo amarillento con reflejos verdosos.

11. Se lleva a cabo una estandarizacion del extracto para comprobar la pureza y riqueza del mismo.

Ejemplo 2. Obtencion de apigenina a partir de las flores de Taraxacum officinale

1. Para la obtencion de apigenina se realizo un secado de las flores frescas durante cuatro dlas. De cada 4 kilos de materia fresca, se obtendra 1 kg de materia seca.

2. Para obtener una mayor concentracion de principio activo, la materia seca se introdujo en un balon con solucion enzimatica con agua, suficiente para lograr la suspension de la muestra. Esto suele ser una proporcion de 1 kilo de Taraxacum seco en 7 litros de agua. Se busca la menor manipulation posible de la muestra con el objetivo de no degradar los principios activos.

3. Acidificar con acido sulfurico al 15%.

4. Se lleva a ebullicion durante 20 min.

5. Para mejorar el rendimiento del extracto se reduce a presion reducida hasta una consistencia butirosa.

6. El residuo se resuspende en metanol y se vuelve a aplicar presion reducida hasta llevar el extracto a sequedad.

7. Se lleva a cabo una estandarizacion del extracto para comprobar la pureza y riqueza del mismo.

Ejemplo 3. Obtencion de acido cafeico a partir de las flores de Echinacea purpurea

1. Para la obtencion de acido cafeico se realiza una limpieza y desinfeccion de la flor mediante el uso de bombas de recirculacion de la solucion de lavado compuesta por agua y un agente tensoactivo tipo laurel sulfato de sodio o laurel eter sulfato de sodio.

2. Enjuague: en tinas de acero inoxidable o plastico, en operation manual o mecanizada, mediante el uso de bombas de recirculacion de la solucion de enjuague compuesta por agua y un agente bactericida tal como yodo, peroxido de hidrogeno u otro conveniente.

3. Suspender la planta en etanol al 96% en volumen en una proportion en peso vegetal: alcohol de 1:8 (por ejemplo, 1 kilo de vegetal en 8 kilos de etanol) durante 5 horas.

4. Filtrar para desechar la parte solida, ya que el acido cafeico ya se halla en solucion en la parte llquida.

5. Prensar las partes solidas, para obtener mayor rendimiento en la extraction.

6. Anadir una solucion acuosa de acido cltrico 0,5-1,5 mM, preferiblemente 1 mM.

7. Tratar con p-hidroxibenzoato de etilo: emulsionante 1:5 (proporcion en peso).

8. Homogeneizar de forma mecanica durante 30-35 minutos.

9. Llevar el extracto a sequedad eliminando el disolvente por arrastre de vapor.

10. Se lleva a cabo una estandarizacion del extracto para comprobar la pureza y riqueza del mismo.

Ejemplo 4. Obtencion del producto alimenticio de la invention

Una vez todos los principios activos han sido purificados, previo analisis cuantitativo para comprobar las concentraciones, se llevo a cabo la preparation del producto final.

Esta preparacion tiene lugar por mezcla simple de los extractos para obtener el producto en forma de polvo.

En un reactor se introdujeron 75 kilos de harina de Echinacea purpurea, 50 kilos de harina de Aloe vera y 50 kilos de harina de Taraxacum officinale. Se mezclaron durante 6 minutos, momento en que se puede asegurar la homogeneidad del producto. En este momento se realizo una molturacion del producto para garantizar una granulometrla apropiada para el uso en instalaciones industriales, que seran los usuarios finales del producto. El alimento obtenido por la incorporation de ingredientes naturales de plantas aromaticas, esta listo para ser consumido con una composition minima garantizada del 2,8% en peso de alolna, el 1,25% en peso de apigenina y el 3,3% en peso de acido cafeico.

Ejemplo 5. Test de interaction genomica del producto motivo de la invention

El objetivo es evaluar la tasa de transduction RNA-mensajero in vitro como medida de la actividad ribosomial que es estimulada por la presencia de pronutrientes activos (alolna, apigenina y acido cafeico) del producto alimenticio. El indicador es puromicina. La detection se basa en la utilization de un anticuerpo antipuromicina y el revelado con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa.

Se realizaron cultivos de tejidos de celulas intestinales que son alimentadas con nutrientes basicos a los que les anaden un indicador, un inhibidor de la production proteica y los pronutrientes a analizar. Se prepararon 4 spots diferentes ((1) blanco procedente de un cultivo celular basico, (2) con indicador, (3) con indicador y producto alimenticio 1:1000, (4) con indicador y producto alimenticio 1:10.000) que se depositaron en una placa de electroforesis. Una vez desarrolladas se tineron. La tincion de las placas se realizo mediante metodo Western Blot. A mayor intensidad, mayor presencia de protelnas procedentes de la actividad ribosomica. Tal como se observa en la figura 1, las bandas 3 y 4 presentan una mayor cantidad de protelna sintetizada por celulas intestinales, lo cual confirma que la presencia de pronutrientes activos de producto alimenticio estimula la trasduccion del RNA-mensajero, procedente del nucleo, en los ribosomas y en consecuencia mas protelna especifica de la celula intestinal. A mayor protelna especifica mayor actividad celular.

Ejemplo 6. Test de production de anticuerpos en aves con el producto motivo de la invention El objetivo de este test in vivo es determinar la eficacia del producto objeto de la presente invention por su efecto en la respuesta inmunitaria contra tres enfermedades virales de las aves como: Gumboro, Newcastle y bronquitis infecciosa; y su eficacia sobre la resistencia antibacteriana general.

La prueba consistio en dividir los pollos en 8 lotes distintos (19.000 pollos por lote).

- A 38.000 pollos se les administro el producto (2 lotes), mientras al resto (114.000 pollos) no se les dio ningun potenciador de la inmunidad.

- El producto fue administrado a la dosis de 500 ml/1000 L en agua bebida durante 7 dlas (desde el 7 hasta el 14) y otros 7 dlas (del 28 al 35).

- En el dla 40, se realizo analisis de muestra de sangre de un numero significativo de las aves para evaluar el tltulo de anticuerpos contra Newcastle, Gumboro y Bronquitis. Los resultados obtenidos se pueden apreciar en la figura 2.

Por lo tanto, se puede concluir que las aves a las que se administro el producto de la invention mejoraron el numero de anticuerpos para cada una de las enfermedades para las que se las vacuno, mejorando por tanto el resultado del tratamiento, traduciendose finalmente en una mejora de los datos de mortalidad.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico.

2. Producto alimenticio, segun la reivindicacion 1, en el que dichos animales son animales de produccion ganadera.

3. Producto alimenticio, segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la alolna esta presente en como mlnimo el 2,8% en peso en dicho producto.

4. Producto alimenticio, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la apigenina esta presente en como mlnimo el 1,25% en peso en dicho producto.

5. Producto alimenticio, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el acido cafeico esta presente en como mlnimo el 3,3% en peso en dicho producto.

6. Producto alimenticio, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la alolna esta contenida en un extracto de la hoja de Aloe vera.

7. Producto alimenticio, segun la reivindicacion 6, en el que la alolna esta presente en dicho extracto de la hoja de Aloe vera en un porcentaje en peso entre el 7 y el 11% en peso.

8. Producto alimenticio, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la apigenina esta contenida en un extracto de Taraxacum officinale.

9. Producto alimenticio, segun la reivindicacion 8, en el que la apigenina esta presente en dicho extracto en un porcentaje en peso entre el 3,5 y el 5,5% en peso.

10. Producto alimenticio, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el acido cafeico esta contenido en un extracto de Echinacea purpurea.

11. Producto alimenticio, segun la reivindicacion 10, en el que el acido cafeico esta presente en dicho extracto en un porcentaje en peso entre el 5,5 y el 8,5% en peso.

12. Procedimiento para la obtencion de un producto alimenticio para animales que comprende alolna, apigenina y acido cafeico, que comprende las etapas de:

- (a) obtener un extracto de alolna de las hojas de Aloe vera.

- (b) obtener un extracto de apigenina de la flor de Taraxacum officinale.

- (c) obtener un extracto de acido cafeico del total de la flor de Equinacea purpurea.

- (d) mezclar los extractos de las etapas (a), (b) y (c) hasta homogeneidad.

13. Procedimiento, segun la reivindicacion 12, en el que la etapa (a) comprende las siguientes subetapas:

- (a1) limpiar, cortar las puntas y pelar las hojas de Aloe vera suficientes para obtener un gel ecologico con una concentration entre el 0,5-1% en peso de alolna.

- (a2) prensar y filtrar la materia gelatinosa obtenida en la subetapa (a1).

- (a3) aclarar y esterilizar la materia gelatinosa.

- (a4) concentrar la materia gelatinosa mediante ultrafiltracion hasta una concentration entre el 7 y el 11% en peso de aloma en el extracto.

- (a5) liofilizar.

14. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en el que la etapa (b) comprende las siguientes subetapas:

- (b1) secar las flores frescas.

- (b2) suspender las flores de Taraxacum en una solution enzimatica en emulsion.

- (b3) acidificar la suspension obtenida en la subetapa (b1).

- (b4) poner a ebullition a presion reducida.

- (b5) agitar.

- (b6) realizar una extraction metanolica.

- (b5) evaporar el metanol.

15. Procedimiento, segun la revindication 14, en el que la solucion enzimatica utilizada en la subetapa (b2) esta compuesta por celulasa y xilanasa en una proportion en volumen del 80% de celulasa y el 20% de xilanasa.

16. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la etapa (c) comprende las siguientes subetapas:

- (c1) suspender la flor de Echinacea purpurea, previa limpieza y desinfeccion, en etanol al 96% en volumen en una proporcion en peso vegetal: alcohol de 1:8 durante 5 horas. - (c2) filtrar para separar la parte solida.

- (c3) anadir una solucion acuosa de acido dtrico 0,5-1,5 mM.

- (c4) tratar con p-hidroxibenzoato de etilo:emulsionante en una proporcion en peso 1:5. - (c5) homogeneizar entre 30-35 minutos.

- (c6) eliminar el disolvente.