ES2683362T3 - Microvesículas obtenidas a partir de células tumorales - Google Patents

Abstract

Un método para supervisar la progresión de un cáncer o la eficacia terapéutica de un tratamiento contra el cáncer en un sujeto, que comprende: a) aislar microvesículas a partir de una primera muestra de fluido corporal que se ha recogido a partir de un sujeto que tiene cáncer en un primer punto de tiempo y supervisar el estado de uno o varios sitios de fosforilación distintos de una proteína oncogénica o relacionada con el tumor en las microvesículas obtenidas a partir de la primera muestra de fluido corporal; y b) aislar las microvesículas a partir de una segunda muestra de fluido corporal que se ha recogido a partir del sujeto que tiene cáncer en un segundo punto de tiempo, en donde el segundo punto de tiempo se produce después del primer punto de tiempo, y supervisar el estado de uno o varios sitios de fosforilación distintos de la proteína oncogénica o la proteína relacionada con el tumor en las microvesículas obtenidas a partir de la segunda muestra de fluido corporal; en donde un cambio en el estado de dicho uno o varios sitios de fosforilación distintos de la proteína oncogénica o relacionada con el tumor en las microvesículas obtenidas a partir de la segunda muestra de fluido corporal, en comparación con las microvesículas obtenidas a partir de la primera muestra de fluido corporal, indica progresión o regresión del cáncer, o indica una eficacia terapéutica o ineficacia del tratamiento contra el cáncer, cuando el primer punto de tiempo se produce antes de que el sujeto haya recibido un tratamiento contra el cáncer y el segundo punto de tiempo se produce después de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cáncer; y en donde una regresión del cáncer o una eficacia terapéutica del tratamiento contra el cáncer se indica por un aumento de la forma no activa de la proteína oncogénica o relacionada con el tumor, y una progresión del cáncer o una ineficacia del tratamiento contra el cáncer se indica por un incremento en la forma activada de la proteína oncogénica o relacionada con el tumor, tal y como se determina por el estado de dicho uno o varios sitios de fosforilación distintos detectados en las microvesículas, en donde la proteína oncogénica o relacionada con el tumor es EGFR y el uno o varios sitios de fosforilación distintos se seleccionan a partir del grupo que consiste en T693, Y1110, Y1197, T678 e Y1068.

Description

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DESCRIPCION

Microvesroulas obtenidas a partir de celulas tumorales Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo para supervisar la progresion de un cancer y/o la eficacia terapeutica de un tratamiento anticancengeno en una muestra de un sujeto mediante la deteccion de protemas oncogenicas y/o mediadores moleculares de su actividad transformadora en microvesroulas.

Antecedentes de la invencion

La transformacion de una celula normal en una celula maligna produce como resultado, entre otras cosas, la proliferacion incontrolada de las celulas de la progenie, que muestran una morfologfa indiferenciada, inmadura, una supervivencia exagerada y propiedades proangiogenicas y una expresion, sobreexpresion o activacion constitutiva de oncogenes que normalmente no se expresan de esa forma en las celulas normales, maduras.

Las mutaciones oncogenicas y las perturbaciones intrrnsecas resultantes en la senalizacion celular se consideran eventos que causan el desarrollo del cancer. Por ejemplo, un crecimiento agresivo de los tumores cerebrales humanos (gliomas) se asocia frecuentemente con una sobreexpresion y una amplificacion del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) y su mutante truncado independiente de ligando, conocido como EGFRvIII (Cavenee, 2002, Carcinogenesis, 23: 683-686). La activacion persistente de este receptor oncogenico desencadena una activacion anormal de las rutas de senalizacion transformantes, los mecanismos de regulacion y, en ultima instancia, la expresion de genes implicados en la proliferacion celular, la supervivencia y la angiogenesis.

Se conocen muchas mutaciones geneticas que dan lugar a la activacion de oncogenes y, de ese modo, aumentan la probabilidad de que una celula normal se convierta en una celula tumoral. Ademas, la inactivacion de genes supresores tumorales, que actuan normalmente para contrarrestar a los oncogenes mediante una reparacion del dano en el ADN, o mediante la induccion de una apoptosis de las celulas danadas y que conservan las actividades celulares bajo control, tambien puede conducir al cancer. Existen muchas pruebas que apoyan la idea de que una activacion de los oncogenes o una inactivacion de los supresores tumorales puede conducir al cancer (Hanahan y Weinberg, 2000, Cell, 100: 57-70). Las mutaciones de proto-oncogenes en las celulas somaticas son cada vez mas reconocidas como significativas en el inicio de canceres humanos. Algunos ejemplos de oncogenes formados por tales mutaciones incluyen: neu, fes, fos, myc, myb, fms, Ha-ras y Ki-ras. Queda mucho por aprender con el fin de entender como actuan los oncogenes y sus productos de expresion para transformar celulas normales en celulas cancerosas.

Los factores de crecimiento y sus receptores estan implicados en la regulacion de la proliferacion celular y tambien parecen tener un papel clave en la oncogenesis. Por ejemplo, los tres siguientes proto-oncogenes estan relacionados con un factor de crecimiento o un receptor de factor de crecimiento: 1) c-sis, que es homologo al gen transformante del virus del sarcoma de simio y es la cadena B del factor de crecimiento obtenido a partir de plaquetas (PDGF); 2) c-fms, que es homologo al gen transformante del virus de sarcoma felino y esta estrechamente relacionado con el receptor del factor estimulante de colonias de macrofagos (CSF-1 R); y 3) c-erbB, que codifica el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) y es homologo al gen transformante del virus de la eritroblastosis aviar (v-erbB). Los dos proto-oncogenes relacionados con un receptor, c-fms y c-erbB, son miembros de la familia de protemas cinasas espedficas de tirosina, a la cual pertenecen muchos proto-oncogenes.

Ademas, un crecimiento agresivo de los tumores cerebrales humanos (gliomas) se asocia frecuentemente con una sobreexpresion y una amplificacion de EGFR y su mutante truncado independiente de ligando, conocido como EGFRvIII. La activacion persistente de este receptor oncogenico desencadena una expresion anormal de genes implicados en la proliferacion celular, la supervivencia y la angiogenesis.

Diversos grupos han investigado la expresion de EGFR en una variedad de tumores utilizando metodos inmunohistoqmmicos cuantitativos, asf como semicuantitativos. Los tipos de tumores investigados incluyen carcinomas ginecologicos, de vejiga, cabeza y cuello, pulmon, colorrectales, pancreaticos y de mama. Tales estudios se basan casi exclusivamente en una metodologfa de union a radioligando o un inmunorreconocimiento para la cuantificacion de EGFR en muestras de tejido.

Las correlaciones mas extensas de la expresion de EGFR con datos clmicos se han llevado a cabo en estudios con pacientes con cancer de mama que datan de hace varias decadas (por ejemplo, Nicholson et al., 1988, Int. J. Cancer, 42: 36-41). En varios estudios con un maximo de 246 pacientes, se ha demostrado que el EGFR es un marcador muy importante de un pronostico malo para el cancer de mama. Esta considerado como una de las variables mas importantes para predecir una supervivencia exenta de recafda y general en pacientes con ganglios linfaticos negativos y es la segunda variable mas importante, despues del estado ganglionar, en pacientes con ganglios linfaticos positivos. En general, los tumores positivos para EGFR son mas grandes y se producen en una mayor proporcion de pacientes con implicacion de los ganglios linfaticos. El significado de un pronostico de EGFR/ErbB1/HER-1 se ve reforzado por una deteccion simultanea de su receptor oncogenico de tirosina cinasa relacionado y que interacciona, conocido como ErbB2/HER-2/neu, una diana de la herceptina (Citri & Yarden, 2006,

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Nature Rev. Mol. Cell. Biol., 7: 505-516).

Los oncogenes mutados son, por lo tanto, marcadores de afecciones malignas o premalignas. Tambien se sabe que otras porciones, no oncogenicas del genoma se pueden alterar en el estado neoplasico. Existe un amplio reconocimiento de la importancia de las pruebas para una deteccion temprana del cancer. En algunos casos, las celulas anormales o malignas exfoliadas desde la superficie de un organo, se pueden identificar mediante un examen citologico de raspados y fluidos. Por ejemplo, un frotis de PAP (prueba de Papanicolaou) puede detectar celulas anormales (por ejemplo, pre-cancerosas o cancerosas) del cuello uterino. Alternativamente, anomalfas geneticas en las celulas cancerosas o celulas pre-cancerosas se pueden detectar utilizando tecnicas moleculares. Por ejemplo, tecnicas tales como un analisis de la secuencia de ADN o de la metilacion se pueden usar para detectar mutaciones espedficas y/o alteraciones estructurales, asf como epigeneticas en el ADN.

Los ensayos basados en acido nucleico pueden detectar tanto ADN oncogenico como no oncogenico, ya sea mutado o no mutado, siempre que las celulas cancerosas o sus residuos celulares relacionados esten directamente disponibles para un analisis (por ejemplo, en material quirurgico o de biopsia, un lavado, heces o celulas cancerosas circulantes). En particular, los metodos de amplificacion de acido nucleico (por ejemplo, mediante la reaccion en cadena de la polimerasa) permiten la deteccion de pequenas cantidades de moleculas mutantes entre un fondo de celulas normales. Aunque los medios alternativos para detectar pequenas cantidades de celulas tumorales (tales como la citometna de flujo) en general se han limitado a neoplasias hematologicas, los ensayos para la amplificacion de acidos nucleicos han probado una sensibilidad y especificidad en la identificacion de celulas malignas y para predecir el pronostico despues de una quimioterapia (Fey et al., 1991, Eur. J. Cancer 27: 89-94).

Se han desarrollado varias estrategias de amplificacion de acidos nucleicos para detectar pequenas cantidades de moleculas mutantes en tejido tumoral solido, en particular para el oncogen ras (Chen y Viola, 1991, Anal. Biochem. 195: 51-56). Por ejemplo, un metodo sensible y espedfico identifica ADN mutante del oncogen ras basandose en el fallo para escindir un sitio de restriccion en el codon 12° que es fundamental (Kahn et al., 1991, Oncogene, 6: 10791083). Se pueden aplicar protocolos similares para detectar cualquier region mutada del ADN en una neoplasia, lo que permite la deteccion de otro ADN que contiene oncogenes o un ADN asociado a un tumor.

Muchos estudios emplean ensayos de amplificacion de acidos nucleicos para analizar la sangre periferica de pacientes con cancer con el fin de detectar el ADN intracelular extrafdo a partir de celulas cancengenas circulantes, incluyendo un estudio que detectaba el oncogen ras intracelular a partir de celulas circulantes de cancer pancreatico (Tada et al., 1993, Cancer Res. 53: 2472-4). El ensayo se realiza sobre la fraccion celular de la sangre, es decir, el sedimento celular o las celulas dentro de la sangre completa y la fraccion de suero o plasma se ignora o se retira antes del analisis. Puesto que un enfoque de este tipo requiere la presencia de celulas cancengenas circulantes metastasicas (para los tumores no hematologicos), tiene un uso clmico limitado en pacientes con canceres tempranos y no es util en la deteccion de neoplasias no invasivas o estados premalignos.

No se ha reconocido en general que los ensayos de amplificacion de acido nucleico puedan detectar el ADN mutado extracelular asociado a un tumor, incluyendo el ADN de un oncogen, en la fraccion de plasma o suero de la sangre. Ademas, no se ha reconocido que esto se puede lograr de una manera clmicamente util, es decir, rapidamente en un dfa, o en menos de 8 horas.

La deteccion de un oncogen mutante mediante un ensayo de amplificacion de acido nucleico, en el plasma o suero sangumeo periferico, ha sido el objeto de informes de la tecnica anterior. Sin embargo, ese metodo requiere mucho tiempo y enfoques tecnicamente exigentes para la extraccion de ADN y, por lo tanto, tienen una utilidad clmica limitada.

Las pruebas para detectar protemas expresadas por ciertos tipos de cancer se pueden realizar. Por ejemplo, el escrutinio del antfgeno prostatico espedfico (PSA) se puede usar para identificar pacientes que tienen riesgo de o que padecen cancer de prostata. Sin embargo, el escrutinio del PSA puede sufrir por la variabilidad de los metodos de ensayo y la falta de especificidad. Por ejemplo, aunque las celulas malignas de la prostata producen mayores cantidades de PSA, el PSA no es espedfico de las celulas cancerosas, sino que es producido tanto por celulas normales como cancerosas de la prostata. Los niveles de PSA pueden variar dependiendo de la edad del paciente, la fisiologfa de la prostata, el grado del cancer y la sensibilidad de los niveles de PSA frente a agentes farmacologicos. Ademas, las bases moleculares de muchos tipos de cancer son aun desconocidas y por lo tanto, las pruebas moleculares aun no son lo suficientemente amplias como para detectar la mayona de los canceres.

Por lo tanto, la deteccion de muchos tipos de cancer todavfa se basa en la deteccion de una masa anormal en el organo de interes. En muchos casos, un tumor se detecta frecuentemente solo despues de que un tumor maligno esta avanzado y puede haber metastasis en otros organos. Por ejemplo, el cancer de mama se detecta normalmente mediante la obtencion de una biopsia de un bulto detectado por una mamograffa o mediante un examen ffsico de la mama. Tambien, aunque la medicion del antfgeno prostatico espedfico (PSA) ha mejorado de manera significativa la deteccion del cancer de prostata, la confirmacion de un cancer de prostata por lo general requiere la deteccion de una morfologfa o textura anormal de la prostata. Por lo tanto, existe una necesidad de metodos y dispositivos para la deteccion temprana del cancer. Estos nuevos metodos podnan, por ejemplo, reemplazar o complementar los ya existentes, reduciendo los margenes de incertidumbre y ampliando la base para

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la toma de decisiones medicas.

Como se ha indicado anteriormente, se han utilizado varios metodos para detectar los niveles de EGFR en tejidos tumorales. Sin embargo, hay muchos casos en los que el tejido no esta disponible facilmente o en los que no es deseable o no es posible retirar tejido de una biopsia de los tumores. Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica medica de pruebas de diagnostico rapidas, precisas y fiables, que tambien sean practicas y no traumaticas para los pacientes.

El documento WO 2009/021322 A1 describe microvesmulas obtenidas a partir de celulas y metodos para diagnosticar o determinar el pronostico de un cancer, detectando la presencia de una protema oncogenica en las microvesmulas y midiendo el estado de fosforilacion de tal protema oncogenica en un metodo para supervisar la eficacia terapeutica de un tratamiento contra el cancer. El documento, sin embargo, no describe una fosforilacion de sitios de aminoacidos espedficos que son responsables de diferentes funciones de la molecula y que tienen una importancia biologica espedfica.

El documento GB 2 463 401 A1 describe un metodo para la caracterizacion de un fenotipo, o el diagnostico de enfermedades que comprende la determinacion de una biofirma de un exosoma en una muestra de un paciente. La biofirma que se basa en la presencia o la cantidad de uno o varios biomarcadores, se define mas bien en terminos generales y la fosforilacion es solo una entre una gran cantidad de caractensticas de exosomas posiblemente relevantes.

Al-Nedawi et al., Cell Cycle 8:13 (2009), paginas 2014-2018 indican que las microvesmulas se pueden recuperar desde la sangre de pacientes con cancer y revelan la presencia de oncogenes en sus tumores, sirviendo de este modo como biomarcadores. Los cambios en la fosforilacion de tales biomarcadores solo se mencionan brevemente, mientras que Al-Nedawi et al., Nature Cell Biology, vol. 10, n° 5 (2008), paginas 619-624, se refieren unicamente a EGFRVIII fosforilado en general, pero no a los sitios de fosforilacion espedficos o a su uso para controlar la progresion de un cancer o la eficacia terapeutica de un tratamiento contra el cancer.

Por lo tanto, sena altamente deseable proporcionar un metodo que permita una deteccion medicamente util, rapida y sensible de oncogenes mutados, en conjuncion con transductores moleculares, moduladores y efectores de su actividad, asociados con el cancer y con un metodo para supervisar la progresion y/o el tratamiento del cancer.

En esta memoria se describe un metodo para diagnosticar o determinar el pronostico, o una prediccion terapeutica de un cancer en un sujeto, que comprende las etapas de recoger una muestra del sujeto, aislar microvesmulas de la muestra y detectar la presencia de una protema oncogenica, una protema relacionada con un tumor y/o una protema asociada con MVs en las microvesmulas, en donde la presencia de la protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en la muestra es indicativa de que el sujeto puede tener cancer.

Tambien se describe un metodo para detectar la presencia de una protema oncogenica, una protema relacionada con un tumor y/o una protema asociada con MVs en un sujeto, que comprende recoger una muestra del sujeto, aislar microvesmulas desde la muestra y detectar la presencia de la protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en las microvesmulas.

Ademas, el metodo descrito en este documento puede comprender tambien la etapa de medir la fosforilacion, u otro estado de modificacion postraduccional de la protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor (por ejemplo, una protema transductora de senales oncogenicas o mediadora del efecto oncogenico), y/o la protema asociada con MVs.

Tambien se describe un kit para detectar un cancer en una muestra de un sujeto, que comprende al menos un anticuerpo contra una protema oncogenica, una protema relacionada con un tumor y/o una protema asociada con MVs, e instrucciones para usar dicho al menos un anticuerpo para detectar la protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en microvesmulas de la muestra.

Ademas, se describe tambien un uso de al menos un anticuerpo para diagnosticar o determinar el pronostico de un cancer en una muestra de un sujeto, en donde dicho al menos un anticuerpo se une a una protema oncogenica, una protema relacionada con un tumor y/o una protema asociada con MVs presente en las microvesmulas.

En particular, el al menos un anticuerpo es un anticuerpo fosfoespedfico.

Tambien se describe en la presente memoria un uso de un agente que bloquea el intercambio de microvesmulas para tratar el cancer. En una realizacion particular, el agente es anexina V o un derivado de la misma o un agente que bloquea la P-selectina o su ligando PSGL, u otros agentes similares que bloquean receptores para moleculas que participan en la captacion de MVs relacionadas con el cancer a traves de celulas diana.

Ademas se describe un metodo para supervisar la progresion de un cancer en un sujeto, que comprende las etapas de, en una primera muestra recogida a partir de un sujeto que tiene cancer en un primer punto de tiempo, aislar las

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microvesroulas de la primera muestra y medir una protema oncogenica, una protema relacionada con un tumor y/o una protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra; y, en una segunda muestra recogida a partir del sujeto que tiene cancer en un segundo punto de tiempo, en donde el segundo punto de tiempo se produce despues del primer punto de tiempo, aislar las microvesroulas de la segunda muestra y medir la protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra, en donde un cambio en la cantidad de protema oncogenica, protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra en comparacion con la cantidad de protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, es indicativo de la progresion del cancer.

Tambien se incluye que el primer punto de tiempo se puede producir antes de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer y el segundo punto de tiempo se puede producir despues de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer. En otra realizacion, los dos puntos de tiempo se pueden producir despues de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer. En una realizacion, el tratamiento contra el cancer es una reseccion quirurgica o la extirpacion del tumor.

Una reduccion o una falta de cambio en la cantidad de protema oncogenica, protema relacionada con un tumor y/o protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra en comparacion con la cantidad de protema oncogenica, protema relacionada con un tumor y/o protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, indica una eficacia terapeutica del tratamiento contra el cancer.

Tambien se describe un metodo para supervisar la eficacia terapeutica de un tratamiento contra el cancer, que comprende las etapas de recoger una primera muestra a partir de un sujeto que tiene cancer en un primer punto de tiempo, aislar microvesroulas de la primera muestra y medir una protema oncogenica, una protema relacionada con un tumor y/o una protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra; y recoger una segunda muestra a partir del sujeto que tiene cancer en un segundo punto de tiempo, en donde el segundo punto de tiempo tiene lugar despues del primer punto de tiempo, aislar las microvesroulas de la segunda muestra y medir la protema oncogenica, la protema relacionada con un tumor y/o la protema asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra; en donde una reduccion o una falta de cambio en la cantidad de protema oncogenica, relacionada con el tumor y/o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra en comparacion con la cantidad de protema oncogenica, relacionada con el tumor y/o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, indica una eficacia terapeutica del tratamiento contra el cancer. En otras realizaciones, un cambio en la composicion de las MVs es indicativo de una eficacia terapeutica.

El primer punto de tiempo se puede producir antes de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer y el segundo punto de tiempo se puede producir despues de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer. Alternativamente, el primer y el segundo punto de tiempo se pueden producir ambos despues de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer. En aun otra realizacion, el primer y el segundo punto de tiempo se pueden producir tanto en ausencia de tratamiento contra el cancer como antes de que el sujeto reciba un tratamiento contra el cancer, y la cantidad de protema oncogenica, relacionada con el tumor y/o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra, en comparacion con la de la primera muestra, proporcionana una indicacion de la progresion o la agresividad del cancer.

Al menos dos protemas oncogenicas, relacionadas con un tumor y/o asociadas con MVs se pueden detectar en las microvesroulas. Mas espedficamente, las protemas oncogenicas o asociadas con MVs pueden ser EGFR y HER-2, o HER-2 y HER-3, o HER-2 y EGFR2, o EGFRvIII y HER-2. En otra realizacion, las protemas asociadas con MVs pueden ser EGFR, FGFR3, EphB2, ROR1, EphA2 y EphA4, solas o en combinacion.

Las microvesroulas se pueden aislar mediante ultracentrifugacion, inmunoprecipitacion, cromatograffa de afinidad, filtracion en gel, purificacion por afinidad, microfiltracion o combinaciones de las mismas, u otros metodos similares, entre los cuales muchos son conocidos en la tecnica.

Ademas, la presencia de la protema oncogenica, relacionada con un tumor o asociada con MVs en las microvesroulas, se puede detectar o medir mediante inmunotransferencia, inmunoprecipitacion, ELISA, RIA, citometna de flujo, microscopfa electronica, plataformas de matrices de anticuerpos, plataformas de multiplexacion basadas en anticuerpos o espectrometna de masas.

Los metodos tal y como se describen en esta memoria, pueden comprender ademas la etapa de medir el estado de fosforilacion de la protema oncogenica, relacionada con un tumor o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera y la segunda muestra.

Compendio de la invencion

La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, la invencion se refiere a un metodo para supervisar la progresion de un cancer o la eficacia terapeutica de un tratamiento contra el cancer en un

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sujeto, que comprende:

a) aislar microvesroulas a partir de una primera muestra de fluido corporal que se ha recogido desde un sujeto que tiene cancer en un primer punto de tiempo y controlar el estado de uno o varios sitios de fosforilacion distintos de una protema oncogenica o relacionada con un tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra de fluido corporal; y

b) aislar las microvesroulas a partir de una segunda muestra de fluido corporal que se ha recogido desde el sujeto que tiene cancer en un segundo punto de tiempo, en donde el segundo punto de tiempo se produce despues del primer punto de tiempo y controlar el estado de uno o varios sitios de fosforilacion distintos de la protema oncogenica o la protema relacionada con un tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra de fluido corporal;

en donde un cambio en el estado de dicho uno o varios sitios de fosforilacion distintos de la protema oncogenica o relacionada con un tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra de fluido corporal, en comparacion con las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra de fluido corporal, indica progresion o regresion del cancer o indica una eficacia terapeutica o ineficacia del tratamiento contra el cancer, cuando el primer punto de tiempo se produce antes de que el sujeto haya recibido un tratamiento contra el cancer y el segundo punto de tiempo se produce despues de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer; y en donde la regresion del cancer o la eficacia terapeutica del tratamiento contra el cancer se indica por un aumento de la forma no activa de la protema oncogenica o relacionada con un tumor, y la progresion del cancer o la ineficacia del tratamiento contra el cancer se indica por un aumento en la forma activada de la protema oncogenica o relacionada con un tumor, tal y como se determina por el estado de dicho uno o varios sitios de fosforilacion distintos, detectados en las microvesroulas, en donde la protema oncogenica o relacionada con un tumor es EGFR y el uno o varios sitios de fosforilacion distintos se seleccionan a partir del grupo que consiste en T693, Y1110, Y1197, T678 e Y1068.

Una reduccion o una falta de cambio en la fosforilacion de la protema oncogenica, relacionada con un tumor y/o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra, en comparacion con la cantidad de fosforilacion de la protema oncogenica o relacionada con el tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, indica la eficacia terapeutica del tratamiento contra el cancer.

Alternativamente, un aumento en la fosforilacion de la protema oncogenica o relacionada con un tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra, en comparacion con la cantidad de fosforilacion de la protema oncogenica o relacionada con un tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, indica que el cancer ha progresado o ha seguido proliferando.

Por otra parte, una reduccion en la fosforilacion de la protema oncogenica o relacionada con el tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra, en comparacion con la cantidad de fosforilacion de la protema oncogenica o relacionada con un tumor en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, indica que el cancer ha revertido o ha cesado la fase de crecimiento activo (estabilizado).

Ademas, una falta de cambio en la fosforilacion de la protema oncogenica, relacionada con un tumor y/o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la segunda muestra, en comparacion con la cantidad de fosforilacion de la protema oncogenica, relacionada con el tumor y/o asociada con MVs en las microvesroulas obtenidas a partir de la primera muestra, indica que el cancer no ha progresado.

Tambien se describe en el presente documento una microvesroula aislada que comprende una protema oncogenica, relacionada con un tumor o asociada con MVs.

El tratamiento contra el cancer puede ser una cirugfa, radiologfa, quimioterapia o un tratamiento dirigido contra el cancer. Mas espedficamente, el tratamiento dirigido contra el cancer se selecciona a partir del grupo que consiste en terapia con moleculas pequenas, anticuerpos monoclonales, vacunas contra el cancer, antisentido, ARNsi, aptameros, terapia genica y combinaciones de las mismas.

En otra realizacion, el cancer incluido se selecciona a partir del grupo que consiste en cancer de mama, glioma, cancer de intestino grueso, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de estomago, cancer de tngado, cancer hematologico, cancer de hueso, cancer pancreatico, cancer de piel, cancer de cabeza o cuello, melanoma cutaneo o intraocular, sarcoma uterino, cancer de ovario, cancer rectal o colorrectal, cancer anal, cancer de colon, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma endometrial, cancer cervical, cancer de vulva, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma vaginal, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, cancer de esofago, cancer de intestino delgado, cancer endocrino, cancer de tiroides, cancer de paratiroides, cancer adrenal, tumor del tejido blando, cancer de uretra, cancer de pene, cancer de prostata, leucemia cronica o aguda, linfoma linfodtico, cancer de vejiga, cancer de rinon, cancer de ureter, carcinoma de celulas renales, carcinoma de la pelvis renal, tumor del SNC, astrocitoma, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, linfoma del SNC primario, tumor de la medula osea, gliomas del nervio tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, melanoma uveal, cancer testicular, cancer oral, cancer farmgeo, neoplasias pediatricas, leucemia, neuroblastoma, retinoblastoma, glioma pediatrico, meduloblastoma, tumor de Wilms, osteosarcoma, teratoma, rabdomioblastoma y sarcoma.

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En una realizacion, mas de una protema oncogenica, relacionada con un tumor y/o asociada con MVs, o una combinacion de protemas oncogenicas, relacionadas con un tumor y/o asociadas con MVs, se pueden detectar en las microvesmulas y/o se pueden utilizar en los metodos descritos. En una realizacion de la invencion, el estado de fosforilacion de la protema oncogenica, relacionada con un tumor y/o asociada con MVs (es decir, EGFR) o las protemas en las microvesmulas, se determina y/o se utiliza en los metodos de la invencion. En una realizacion, la protema asociada con MVs esta fijada a la membrana, por ejemplo, una protema de la membrana integral o unida a la membrana. En una realizacion alternativa, la protema asociada con MVs es una protema soluble presente en el lumen de la microvesmula.

Ademas, la muestra es un fluido corporal, o mas espedficamente, un fluido corporal seleccionado a partir del grupo que consiste en sangre, orina, linfa, fluido cerebroespinal, ascitis, saliva, lavado, semen, secreciones glandulares, exudado, contenido de quistes y heces.

Se proporcionan ademas metodos para el control de la activacion de un receptor oncogenico de tirosina cinasa en un tumor, que comprende recoger una muestra de sangre de un sujeto que tiene el tumor, aislar las microvesmulas desde la muestra de sangre y medir el estado de fosforilacion del receptor oncogenico de tirosina cinasa en las microvesmulas, en donde el estado de fosforilacion del receptor oncogenico de tirosina cinasa indica la activacion o la no activacion del receptor de tirosina cinasa.

En una realizacion particular, el tipo de cancer es cancer de mama, glioma, cancer de cerebro, cancer de pulmon, cancer pancreatico, cancer de piel, cancer de prostata y cancer colorrectal.

Debe entenderse que los metodos y los kits descritos en este documento no se limitan a protemas oncogenicas, pero incluyen las protemas asociadas con MVs (por ejemplo, protemas relacionadas con un tumor) identificadas en la presente memoria, ademas de otras protemas relacionadas con el cancer o protemas conocidas relacionadas con un tumor maligno, tales como oncogenes, supresores tumorales o mediadores de la senalizacion celulary cualquier otra protema detectada en las microvesmulas que se puede encontrar que esta relacionada con un tumor. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "protema asociada con MVs" se refiere a cualquier protema asociada con el cancer que se detecta en una microvesmula obtenida a partir de un tumor y es util para la deteccion, el diagnostico, el pronostico, el seguimiento, etc. del tumor, de acuerdo con los metodos proporcionados en este documento. Ejemplos no limitantes de protemas asociadas con MVs, incluyen protemas oncogenicas, protemas supresoras de tumores, mediadores de la senalizacion celular, receptores de tirosina cinasa, biomarcadores y protemas enumeradas en las Tablas 1-4 en esta memoria.

Tambien se debe entender que en algunos casos, puede ser la ausencia o la reduccion de una protema que normalmente esta presente en el tejido normal, lo que es un diagnostico o pronostico de un cancer. Por ejemplo, la ausencia o la reduccion de los niveles de una protema supresora de tumor en las MVs, tambien puede ser util para la deteccion, el diagnostico, el pronostico, el seguimiento, etc., de un tumor.

La medicion de otras modificaciones postraduccionales en las protemas asociadas con MVs, tales como la escision de isoformas, los patrones de glicosilacion y asf sucesivamente, tambien se puede utilizar para la deteccion, el diagnostico, el pronostico, el seguimiento, etc., de un tumor.

Por consiguiente, tambien los metodos para detectar un cancer en un sujeto, en donde una muestra de un fluido corporal, por ejemplo, sangre, se recoge a partir del sujeto, las microvesmulas se afslan desde la muestra y las microvesmulas se someten a ensayo para determinar la presencia de una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor en las microvesmulas, en donde la presencia de una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor en las microvesmulas, indica que el sujeto tiene cancer. En algunas realizaciones, se describe ademas del metodo inventivo que la protema oncogenica o relacionada con un tumor no se detecta en un especimen de biopsia (por ejemplo, una muestra de tejido) obtenido a partir del sujeto.

Breve descripcion de los dibujos

Habiendo descrito por tanto en general la naturaleza de la invencion, se hara ahora referencia a los dibujos que se acompanan que muestran a modo de ilustracion, una realizacion o realizaciones de la misma y en donde:

La Fig. 1 ilustra la produccion de microvesmulas que contienen EGFRvlll mediante celulas de glioma humanas en donde en (A) se muestra la generacion de multiples estructuras microvesiculares en las superficies de celulas de glioma U373vIII que albergan el oncogen EGFRvIII (puntas de flecha en blanco, imagen con SEM), pero no en sus homologos parentales U373 benignos; en (B) se muestra el aumento de la abundancia de la fraccion microvesicular de los medios condicionados, como una funcion de la expresion de EGFRvIII en un glioma U373 (medida por el contenido total de protemas); en (C) se muestra la inclusion de EGFRs oncogenicos en microvesmulas obtenidas a partir de balsas lipfdicas liberadas por las celulas de cancer que expresan EGFR; en (D) se muestra la dependencia de las propiedades oncogenicas de las celulas U373vIII sobre EGFRvIII funcional; en (E) se muestra la expresion predominante de EGFRvIII pero no de EGFR en tumores U373vIII; en (F) se muestra la liberacion de microvesmulas que contienen EGFRvIII y positivas para flotilina- - en la sangre circulante de ratones SCID portadores de tumores U373vIII (paneles superiores);

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La Fig. 2 ilustra la transferencia microvesicular de EGFRvIII oncogenico entre celulas de glioma, en donde en (A) se muestra que las celulas U373 incubadas con microvesmulas liberadas por sus homologos transformados con EGFRvIII (U373vIII) adquinan la expresion del antigeno EGFRvIII en su superficie (FACS); en (B) se muestra la deteccion de EGFRvIII en la superficie de las celulas U373 incubadas con microvesmulas obtenidas a partir de U373vIII; en (C) se observa la generacion de la lmea celular U373/EGFRvIII-GFP mediante la expresion de EGFRvIII marcado con GFP en celulas U373; y en (D) se observa la fluorescencia directa de GFP de celulas U373 incubadas con microvesmulas que contienen eGfRvIII-GFP;

La Fig. 3 ilustra la activacion de las rutas de senalizacion que favorecen el crecimiento en celulas que han adquirido EGFRvIII oncogenico a traves de una transferencia intercelular mediada por microvesmulas, en donde en (A) se muestra el aumento dependiente de EGFRvIII de la fosforilacion mediada por Erk1/2 en celulas U373 que han incorporado microvesmulas desprendidas desde celulas U373vIII; en (B) se observa la inhibicion de la fosforilacion mediada por Erk1/2 en celulas U373 mediante el bloqueo de la captacion de sus microvesmulas que contienen EGFRvIII con anexina V; y en (C) se observa el aumento de la fosforilacion de Akt en celulas U373 que han incorporado microvesmulas que contienen EGFRvIII;

La Fig. 4 ilustra la induccion de una transformacion celular mediante la captacion de microvesmulas que contienen EGFRvIII, en donde en (A) se muestra un aumento dependiente de EGFRvIII en la secrecion de VEGF a traves de celulas U373 que han incorporado microvesmulas de U373vIII; en (B) se muestra que la estimulacion de la actividad del promotor de VEGF en las celulas U373 mediante la incorporacion de microvesmulas que contienen EGFRvIII, se puede bloquear con un tratamiento previo con anexina V; en (C) se muestra el aumento de la expresion de BclXL (prosupervivencia) y la reduccion de la expresion de p27 (inhibidor del ciclo celular) en celulas U373 expuestas a microvesmulas que contienen EGFRvIII y en (D-E) se observa el aumento de la capacidad formadora de colonias en agar de las celulas U373 despues de un tratamiento previo con microvesmulas que contienen EGFRvIII;

La Fig. 5 ilustra un analisis de transferencia Western de microvesmulas transportadas por la sangre en donde la deteccion de EGFRvIII circulante procedente de muestras de sangre de 6 pacientes (carriles 1 a 6) con glioblastoma multiforme se muestra para el paciente 2 (bandas circulares) y, potencialmente, para el paciente 3;

La Fig. 6 ilustra estructuras de tipo microvesmulas in vivo, en donde en (A) se muestra una Micrograffa Electronica de Transmision de estructuras microvesiculares presentes en el espacio intercelular entre dos celulas cancerosas (flecha negra) dentro del xenoinjerto del tumor mixto en el raton SCID (barra -1 metro); y en (B) la inmunotincion con oro de EGFRvIII revela la presencia de ese receptor (flecha blanca) en asociacion con las estructuras de tipo microvesmulas que se encuentran dentro de los tumores U373vIII/U373-GFP mixtos (barra -100 nm); y

La Fig. 7 ilustra la emision del material positivo para FLAG/EGFRvIII procedente de celulas U373vIII en tumores mixtos in vivo, en donde se muestra una representacion fotografica de una microscopfa confocal de tumores mixtos compuestos por U373-GFP (verde) y celulas de glioma U373vIII-FLAG (rojo) y con tincion de GFP (verde, panel A) y FLAG (rojo, panel B), respectivamente; los canales fusionados (C y D) revelan la presencia de las estructuras de tipo microvesmulas positivas para FLAG/EGFRvIII (flechas) que estan asociadas no solo con celulas claramente positivas para FLAG/EGFRvIII (U373vIII-FLAG, lado derecho de los paneles C y D), sino tambien con celulas positivas para GFP (U373-GFP) (barras - 5 pm).

La Fig. 8 ilustra la deteccion del oncogen EGFRIII asociado con microvesmulas (MVs) en una cohorte de pacientes con glioblastoma multiforme (GBM), en donde (+) indica la deteccion de la oncoprotema en las microvesmulas (MVs) en una muestra de sangre o la deteccion del oncogen en una muestra de tumor usando PCR y (-) indica que no se detecto la oncoprotema/oncogen, en una cohorte (coh.) de 24 pacientes procedentes del Toronto Tumor Bank (TO);

La Fig. 9 ilustra la deteccion de la senal de EGFR (EGFR de tipo silvestre (wt EGFR) o EGFRvIII mutante) en MVs recogidas de la sangre de ratones SCID portadores de xenotransplantes de lmeas celulares de cancer humano, en donde las celulas A431 obtenidas a partir de SCC expresan EGFR de tipo silvestre, U373vIII obtenidas a partir de glioma expresan principalmente el EGFRvIII mutante y Cc son muestras de plasma de raton de control y en donde la senal de EGFR se detecta usando ELISA para EGFR;

La Fig. 10 ilustra la deteccion de multiples dianas moleculares relacionadas con el cancer en la carga de microvesmulas liberadas por celulas tumorales humanas en el medio de cultivo, en donde en (A), las lmeas celulares indicadas se sometieron a ensayo para estudiar las protemas indicadas utilizando un analisis Western, en donde (+) indica una fuerte reactividad, (+/-) indica una reactividad debil y (-) indica que no hay una reactividad detectable; y en (B), se muestran ejemplos del analisis de una transferencia de Western, en donde las protemas detectadas se muestran a la derecha y las lmeas celulares se muestran arriba;

La Fig. 11 ilustra la deteccion in vitro de multiples fosfo-receptores de tirosina cinasa (RTKs) en MVs liberadas en el medio de cultivo por varios tipos de celulas de cancer humano, utilizando una matriz de anticuerpos de fosfoprotema que contiene sondas para 42 fosfo-RTKs, en donde en (A), se enumeran ejemplos de RTKs para los que se puede detectar simultaneamente una fosforilacion relativa en una unica muestra usando la matriz; en (B), se muestran fosfo-RTKs importante detectados en MVs de las lmeas celulares indicadas; y en (C), se muestran ejemplos de los resultados del ensayo, en donde las lmeas de celulas se indican a la derecha;

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La Fig. 12 ilustra un ejemplo de un ensayo con RTKs en el que se examina el perfil fosfoproteico de MVs que circulan en la sangre de ratones que albergaban un xenoinjerto de tumor humano A431, en donde: EGFR/HER-1 es el receptor del factor de crecimiento epidermico; ErbB2/HER-2 es el receptor del factor de crecimiento epidermico 2; ErbB3/HER-3 es el receptor del factor de crecimiento epidermico 3; ErbB4/HER-4 es el receptor del factor de crecimiento epidermico 4; FGFR1 es el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1; FGFR2a es el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos a; InsulinR es el receptor de insulina; IGF-1 R es el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1; Axl es receptor de Gas6; Dtk/TYR03 es el receptor de Gas6 que interacciona con PI3K; Mer/MERTK es la protema de la retinitis pigmentosa; HGFR/MET es el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; y MSPR/MST1 R/RON es el receptor de la protema estimulante de macrofagos; PDGFRa es el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas; PDGFRb es el receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas; SCFR/cKit/CD1 7 es el receptor del factor de celulas madre; Flt-3/CD135 es el receptor 3 de tirosina cinasa similar a fms; M-CSFR/CSF1 R/CD-15 es el receptor del factor estimulante de colonias de macrofagos; c-Ret es el receptor para la familia de ligandos v; ROR1 es el receptor huerfano 1 relacionado con RAR (nuclear, se une a melatonina); ROR2 es el receptor huerfano 1 relacionado con RAR (nuclear); Tie-1 es el receptor huerfano implicado en la angiogenesis; Tie-2 es el receptor de la angiopoyetina; TrkA/NTRK1 es el receptor A del factor de crecimiento nervioso (NGF); TrkB/NTRK2 es el receptor del factor neurotrofico obtenido a partir del cerebro (BDNF); TrkC/NTRK3 es el receptor de neurotrofina 3 (NT-3); VEGFR1/FIM es el receptor de VEGF/PIGF; VEGFR2/KDR/Flk- 1 es el receptor de la senalizacion de VEGF; VEGFR3/Flt-4 es el receptor de VEGF-C/D (linfangiogenesis); MuSK es el receptor de cinasa espedfica de musculo/agrina (senalizacion neuromuscular); EphA1 es el receptor de efrina de tipo A; EphA2 es el receptor 2 de efrina de tipo A; EphA3 es el receptor 3 de efrina de tipo A; EphA4/TYRO1/SEK es el receptor 4 de efrina de tipo A; EphA6 es el receptor 6 de efrina de tipo A; EphA7 es el receptor 7 de efrina de tipo A; EphB1 es el receptor 1 de efrina de tipo B; EphB2/DRT/Tyro5 es el receptor 2 de efrina de tipo B; EphB4/MYK1/TYRO11 es el receptor 4 de efrina de tipo B; y EphB6 es el receptor 6 de efrina de tipo B; y

La Fig. 13 ilustra una reduccion del EGFR humano fosforilado en MVs que circulan en la sangre de ratones que son portadores de tumores subcutaneos dirigidos por EGFR y tratados con el inhibidor de EGFR, CI-1022, en donde en (A), se muestra la capacidad de respuesta de los tumores A431 y U373vIII frente a una exposicion a una dosificacion diaria de Cl-1033; el volumen del tumor (mm3) se muestra en el eje y, y los dfas despues de la inoculacion se muestran en el eje x; y en (B), se muestra una transferencia Western de MVs procedentes de ratones portadores de tumores A431 subcutaneos, tratados durante 7 dfas con 20 mg/kg de CI-1033 por via intraperitoneal (parte superior) y de ratones portadores de tumores U373vIII tratados durante 7 dfas con 20 mg/kg de CI-1033 por via intraperitoneal (parte inferior), en donde el anticuerpo anti-fosfo-EGFR se utilizo para el analisis Western.

Descripcion detallada de la realizacion preferida

Un metodo para el seguimiento de la progresion de un cancer y/o la respuesta a un tratamiento, se proporciona de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

El cancer se refiere en esta memoria a un agrupamiento de celulas de cancer que muestran una proliferacion excesiva por la falta de coordinacion del crecimiento y una proliferacion de las celulas debida a la perdida de la capacidad de diferenciacion de las celulas.

El termino “cancer” incluye pero no se limita a cancer de mama, glioma, cancer de intestino grueso, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de estomago, cancer de fngado, cancer hematologico, cancer de hueso, cancer pancreatico, cancer de piel, cancer de cabeza o cuello, melanoma cutaneo o intraocular, sarcoma uterino, cancer de ovario, cancer rectal o colorrectal, cancer anal, cancer de colon (considerado generalmente la misma entidad que cancer colorrectal y de intestino grueso), tumores del estroma gastrointestinal (GIST), carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma endometrial, cancer cervical, cancer de vulva, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma vaginal, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, cancer de esofago, cancer de intestino delgado, cancer endocrino, cancer de tiroides, cancer de paratiroides, cancer adrenal, tumor del tejido blando, cancer de uretra, cancer de pene, cancer de prostata, leucemia cronica o aguda, linfoma linfodtico, cancer de vejiga, cancer de rinon, cancer de ureter, carcinoma de celulas renales, carcinoma de la pelvis renal, tumor del SNC, astrocitoma, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, linfoma del SNC primario, tumor de la medula osea, gliomas del nervio tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, melanoma uveal (tambien conocido como melanoma intraocular), cancer testicular, cancer oral, cancer farmgeo, neoplasias pediatricas, leucemia, neuroblastoma, retinoblastoma, glioma pediatrico, meduloblastoma, tumor de Wilms, osteosarcoma, teratoma, rabdomioblastoma y sarcoma, o una combinacion de los mismos. En una realizacion, el cancer es un tumor cerebral, por ejemplo, un glioma. En otra realizacion, el cancer expresa ciertas oncoprotemas, por ejemplo, HER-2, HER-3, etc. El termino "cancer" incluye tambien canceres pediatricos, incluyendo neoplasias pediatricas, que incluyen leucemia, neuroblastoma, retinoblastoma, glioma, rabdomioblastoma, sarcoma y otros tumores malignos.

Ejemplos no limitantes de protemas oncogenicas que se pueden detectar utilizando los metodos descritos en este documento, son los siguientes: (i) oncoprotemas asociadas a la membrana obtenidas a partir de celulas cancerosas, tales como EGFRvIII en glioma, EGFR en carcinoma de celulas escamosas, glioma, cancer de pulmon o cancer de vejiga, mutante de cancer de mama (por ejemplo, las protemas BRCA1 y/o BRCA2 supresoras tumorales mutantes o no expresadas, sensibles a Iressa), EGFR en cancer de pulmon, HER-2 en carcinoma de mama y de ovario, MET en diversos canceres metastasicos e invasivos, Kit en tumores del estroma gastrointestinal, PDGFR en glioma, Wnt

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en diversos tumores, diversas fosfatasas; (ii) agrupaciones combinatorias de receptores transformantes, tales como EGFR/HER-2 en el cancer de mama, HER-2/HER-3 en varios tumores; (iii) moleculas citoplasmaticas asociadas a la membrana con propiedades transformantes, tales como K-ras en el cancer colorrectal, de pancreas y de pulmon, PTEN (falta de o inactivacion) en glioma y cancer de prostata; (iv) complejos de senalizacion que podnan estar presentes (y activos) en las balsas lipfdicas y las microvesmulas tales como PI3K/Akt, Raf/MEK/MAPK; y (v) receptor endotelial relacionado con un tumor, relacionado con la angiogenesis tumoral y la antiangiogenesis, tal como VEGFR-2, VEGFR-1, Tie-2 y TEMs (por ejemplo, TEM-1, CD276). Estas protemas se pueden detectar de forma aislada o en combinacion.

Otros ejemplos no limitantes de protemas oncogenicas incluyen EGFRvIII, EGFR, HER-2, HER-3, HER-4, MET, cKit, PDGFR, Wnt, beta-catenina, K-ras, H-ras, N-ras, Raf, N-myc, c-myc, IGFR, IGFR, PI3K y Akt; protemas supresoras de tumores, tales como BRCA1, BRCA2 y PTEN; receptores de hospedadores relacionados con el cancer y moleculas asociadas con microvesmulas, por ejemplo, los implicados en la angiogenesis, tales como VEGFR-2, VEGFR-1, Tie-2, TEM-1 y CD276. Se contempla que todas las protemas oncogenicas, protemas supresoras tumorales, receptores relacionados con celulas hospedadoras y moleculas asociadas con microvesmulas se pueden utilizar, de forma aislada o en combinacion, en los metodos, composiciones y kits de la presente invencion. Se contempla, ademas, que cualquier protema oncogenica y cualquier combinacion de protemas oncogenicas, que se determina que es importante de forma mecanica, para el diagnostico, pronostico o terapeuticamente para el cancer, se pueden utilizar en los metodos y composiciones descritos.

Es bien conocido en la tecnica que las "protemas oncogenicas" son protemas que son productos de genes mutantes y que causan o contribuyen a la transformacion de celulas normales en celulas tumorales cancerosas o desde cancer de grado bajo hasta cancer de grado alto (para una revision, vease Vogelstein y Kinzler, Nat. Medicine, 10(8): 789-799, 2004; Croce, CM., N. Engl. J. Med. 358(5): 502-511,2008).

Existen tres tipos principales de genes responsables de la tumorigenesis: los oncogenes, los genes supresores tumorales y los genes de estabilidad. Los oncogenes generalmente han mutado de tal manera que la protema codificada por el gen (la protema oncogenica) se vuelve constitutivamente activa, sobreexpresada, mal expresada (por ejemplo, en el momento o lugar equivocado) o activa en condiciones en las que la protema de tipo silvestre no lo esta.

En contraste, los genes supresores tumorales mutan generalmente para reducir su actividad genica, lo que da lugar a una proliferacion celular incontrolada y tumorigenesis. Los genes de estabilidad tambien se inactivan generalmente por mutacion. Estos genes se denominan "genes de estabilidad", porque en su forma de tipo silvestre sirven para minimizar las mutaciones geneticas. Estan involucrados, por ejemplo, en la reparacion del ADN, la recombinacion mitotica y la segregacion cromosomica. La inactivacion de estos genes conduce a una mayor tasa de mutacion general, lo que aumenta la probabilidad de que se produzca una mutacion tumorigenica en un oncogen o un gen supresor tumoral. Esta claro, pues, que, ademas de las protemas oncogenicas, los cambios en los genes supresores tumorales y de estabilidad tambien estan asociados y pueden ser indicativos del cancer.

Tambien se sabe que los supresores tumorales pueden servir para inducir la apoptosis en celulas que albergan mutaciones.

Tambien esta bien establecido que las mutaciones de genes cancengenos actuan frecuentemente en las rutas o redes. Por ejemplo, las protemas oncogenicas pueden actuar para regular las protemas efectoras aguas abajo, que pueden a su vez regular otras protemas, lo que conduce a una cascada de acontecimientos de senalizacion que finalmente dan lugar a una transformacion cancerosa. Por lo tanto, se debe entender que ademas de los cambios en las propias protemas oncogenicas, los cambios en tales protemas efectoras o mediadoras aguas abajo tambien se asocian y pueden ser indicativos del cancer.

Se debe entender por lo tanto que, ademas de las protemas oncogenicas que provocan una transformacion celular, los cambios en otras protemas tambien estan asociados con la tumorigenesis y se pueden detectar en microvesmulas obtenidas a partir de tumores. Tales otras protemas se denominan en esta memoria "protemas relacionadas con tumores". Ejemplos no limitantes de protemas relacionadas con tumores incluyen: protemas supresoras de tumor; protemas de estabilidad; y protemas aguas abajo de protemas oncogenicas (es decir, protemas efectoras aguas abajo) tales como los receptores celulares relacionados con tumores, mediadores de la senalizacion celular, factores de transcripcion, receptores nucleares, biomarcadores asociados con el cancer y la tumorigenesis y protemas asociadas con la angiogenesis tumoral, la migracion o la invasion. Por ejemplo, la expresion "protemas relacionadas con tumores" incluye receptores endoteliales relacionados con tumores, relacionados con la angiogenesis tumoral y la antiangiogenesis, tales como VEGFR-2, VEGFR-1, Tie-2 y TEMs (por ejemplo, TEM-1, CD276). Los cambios en la expresion o la actividad de "protemas relacionadas con tumores" que estan asociadas con la tumorigenesis, se pueden determinar en las microvesmulas obtenidas a partir de tumores (por ejemplo, se ha observado una regulacion a la baja de una protema supresora tumoral en una microvesmula obtenida a partir de tumor, o un aumento de la expresion o una activacion de un receptor endotelial relacionado con tumores, tal como VEGR-2 o VEGFR-1). Se contempla que, ademas de las protemas oncogenicas, cualquier protema relacionada con un tumor, que se determina que es importante de forma mecanica, para el diagnostico, pronostico o terapeuticamente del cancer, se puede usar en los metodos, composiciones y kits como se describe en

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esta memoria.

La expresion "protema asociada con MVs" tal y como se utiliza en esta memoria, incluye tanto protemas oncogenicas como protemas relacionadas con tumores, como se han definido anteriormente, que se detectan en microvesmulas obtenidas a partir de tumores y son utiles para la deteccion, el diagnostico, el pronostico, el seguimiento, etc., del tumor, de acuerdo con los metodos proporcionados en este documento.

La invencion descrita en el presente documento se basa, al menos en parte, en la observacion novedosa e inesperada de que la oncoprotema EGFRvIII puede ser emitida y compartida entre las celulas de glioma a traves de una transferencia intercelular del receptor activado que se produce como una carga de microvesmulas obtenidas a partir de membranas, liberadas desde las celulas que producen la protema mutante. De hecho, EGFRvIII estimula la formacion de microvesmulas relacionadas con balsas lipfdicas, a las que se incorpora.

Las microvesmulas que contienen la oncoprotema EGFRvIII se liberan a un medio condicionado o a la sangre de ratones portadores de tumores y se pueden fusionar con las membranas plasmaticas de las celulas tumorales que carecen de este receptor. Esta transferencia de EGFRvIII desencadena la activacion de las rutas de senalizacion aguas abajo (MAPK y Akt), cambios relacionados con la progresion en la expresion genica (VEGF, BclXL, p27) y la manifestacion de una transformacion celular exacerbada, en particular una morfologfa alterada y un aumento de la eficiencia de la formacion de colonias sobre agar blando. Estas observaciones senalan el papel de las microvesmulas de la membrana en la propagacion horizontal de protemas transformantes entre diferentes subconjuntos de celulas cancerosas y sugieren que el impacto transformador de las oncoprotemas asociadas a la membrana se puede extender mas alla de las celulas que albergan los genes mutantes correspondientes.

Se sabe que las celulas activadas de diversos tipos producen y desprenden en su entorno microvesmulas de membrana, tambien conocidas como micropartmulas, ectosomas o argosomas; en el caso en que tales vesmulas se originan a partir de la ruta lisosomica, se denominan frecuentemente exosomas. El papel biologico de estas estructuras es poco conocido, pero puede incluir procesos de secrecion, inmunomodulacion, coagulacion y comunicacion intercelular (Janowska-Wieczorek et al., 2005, Int. J Cancer, 20: 752-760).

Las microvesmulas pueden variar en su mecanismo de generacion, el tamano y la composicion, pero frecuentemente (especialmente los ectosomas) contienen un material asociado con las balsas lipfdicas de la membrana, incluyendo protemas transmembranales funcionales. Por ejemplo, el factor tisular procoagulante (TF) se puede liberar de esta manera desde celulas inflamatorias y, de manera importante, se incorpora posteriormente en las membranas de plaquetas, celulas endoteliales y otras celulas en donde ejerce sus efectos biologicos. Tal y como se emplea en esta memoria, el termino "microvesmulas" incluye microvesmulas, micropartmulas, ectosomas, argosomas, exosomas, vesmulas tumorales y todos los demas cuerpos vesiculares liberados desde las celulas.

Las celulas cancerosas que carecen del gen supresor tumoral p53, pueden imitar en algunos casos este proceso mediante la liberacion de cantidades alteradas de microvesmulas que contienen TF (Yu et al., 2005, Blood, 105: 1734-1741), o microvesmulas secretoras (Yu et al., 2006, Cancer Res, 66: 4795-47801) a la sangre y al medio pericelular.

Los receptores oncogenicos residen frecuentemente dentro de las regiones de la membrana plasmatica, a partir de las cuales se originan las microvesmulas en las celulas cancerosas (por ejemplo, balsas lipfdicas). Se da a conocer en el presente documento que los receptores oncogenicos se pueden incluir ellos mismos en la carga de las microvesmulas. Esto es de particular interes, por ejemplo, en tumores cerebrales malignos (gliomas), en donde la activacion de EGFR asociado a la membrana representa un importante evento de transformacion y en casi el 30% de los casos con glioblastoma multiforme (GBM), se puede detectar facilmente la expresion del mutante oncogenico EGFRvIII.

Con el fin de explorar este fenomeno de forma adicional, se examino la produccion de microvesmulas mediante celulas de glioma U373 en cultivo que caredan de EGFR activado y sus homologos, modificados geneticamente para expresar EGFRvIII (celulas U373vIII). Curiosamente, la presencia del oncogen EGFRvIII en la ultima lmea celular, daba como resultado la formacion de multiples salientes vesiculares en la superficie celular, un efecto que estaba acompanado por un aumento en la recuperacion de protema a partir de la fraccion microvesicular del medio de cultivo (vease la Fig. 1A, B). Este material contema una cantidad proporcional de flotilina-1, una protema asociada con las balsas lipfdicas de la membrana y que se encuentra frecuentemente en microvesmulas relacionadas con balsas procedentes de varias fuentes. En conjunto, se demuestra que una transformacion relacionada con EGFRvIII observada en las celulas U373vIII, esta acoplada con una produccion incrementada de microvesmulas obtenidas a partir de balsas lipfdicas de la membrana.

Las protemas enriquecidas en microvesmulas, tales como EGFRvIII, HER-2 y MET, se pueden detectar mediante varios metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los lisados de microvesmulas se pueden analizar por inmunotransferencia utilizando anticuerpos tales como anti-EGFRvIII o anti-EGFR. Es necesario concentrar las microvesfculas mediante centrifugacion, pero tambien proporciona una considerable ventaja cuantitativa y cualitativa sobre el analisis de todo el plasma. Esto es debido a que el aislamiento de las microvesfculas puede mejorar la sensibilidad de la deteccion de ciertas moleculas, por ejemplo, EGFRvIII (debido a su enriquecimiento en las

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microvesmulas), aumentar la especificidad (ya que las microvesmulas no son colecciones aleatorias de moleculas de la membrana plasmatica), proteger la carga de la proteolisis, desfosforilacion o degradacion (debida a la membrana de las microvesmulas) y ampliar el alcance del analisis (debido a la presencia de combinaciones unicas y diagnosticamente informativas de protemas en la carga de las microvesmulas). En este sentido, la sensibilidad del analisis de las microvesmulas se puede incrementar mediante un cambio de ultracentrifugacion a microfiltracion, en donde esta ultima puede simplificar y mejorar la recuperacion de microvesmulas. Otra tecnica para detectar protemas microvesiculares es la inmunoprecipitacion de material relacionado con las microvesmulas procedente de perlas magneticas recubiertas, por ejemplo, con anexina V (ya que las MVs expresan grandes cantidades de fosfatidilserina) o un anticuerpo que se une a una protema oncogenica que se expresa en la superficie de las MVs, tal como un anticuerpo anti-EGFRvIII. Ademas, tambien se puede utilizar un ensayo ELISA basado en dos anticuerpos (por ejemplo, 2 x anti-EGFRvIII o anti-EGFRvIII + anti-EGFR) o un radioinmunoensayo (RIA) basado en dos anticuerpos (por ejemplo, 2 x anti-EGFRvIII o anti-EGFRvIII + anti-EGFR). Ademas, el ELISA basado en la union de las microvesmulas a superficies recubiertas con anexina V (como, por ejemplo, en los ensayos de TF comerciales) o con anticuerpos de EGFRvIII/EGFR, se podna utilizar junto con un componente de deteccion basado en el anticuerpo anti-EGFRvIII. Otras tecnicas que se pueden usar incluyen la citometna de flujo, en donde las microvesmulas son capturadas por perlas recubiertas, por ejemplo, con anexina V, o anticuerpos espedficos de moleculas (protemas, hidratos de carbono y otras) presentes en sus superficies, o con reactivos de afinidad que no son anticuerpos (receptores, aptameros, lectinas, secuencias de acido nucleico y asf sucesivamente) y se tinen, por ejemplo, con anticuerpo anti-EGFRvIII y espectrometna de masas, en donde se detecta EGFR en el proteoma de preparaciones de microvesmulas. Todos estos reactivos y metodos de captura tambien se podnan utilizar para aislar microvesmulas utilizando columnas de purificacion por afinidad y plataformas multiples. Se contempla que las tecnicas convencionales conocidas en la tecnica para la preparacion de microvesmulas y para la deteccion de las protemas, se pueden utilizar en los metodos descritos en el presente documento.

La presente invencion se basa, al menos en parte, en la observacion de que se detecta una expresion abundante de la protema EGFRvIII en los lisados no solo de las propias celulas U373vIII, sino tambien en sus microvesmulas derivadas, demostrando que la oncoprotema intacta se libera de esta manera en la circulacion. Aunque las celulas U373 parentales liberaban cantidades detectables de microvesmulas que conteman flotilina-1, solo conteman pequenas cantidades de EGFR de tipo silvestre (wtEGFR) y no EGFRvIII. Estos resultados se validaron frente a celulas endoteliales negativas para EGFR (HUVEC) y celulas A431 que expresaban solo wtEGFR, asf como sus preparaciones de microvesmulas respectivas (Fig. 1C). Aunque las celulas U373 muestran un fenotipo benigno in vivo, sus homologas U373vIII forman con facilidad tumores subcutaneos en ratones inmunodeficientes (SCID), de una manera susceptible a inhibicion con dosis diarias de un inhibidor irreversible de pan-Erb de molecula pequena, CI-1033 (Fig. 1 D). Los tumores U373vIII se teruan fuertemente en relacion con EGFRvIII pero no con wtEGFR y, curiosamente, emitfan microvesmulas que conteman EGFRvIII en la circulacion sistemica (Fig. 1E, F). Por lo tanto, la expresion del gen EGFRvIII mutante conduce al aumento de la agresividad de las celulas de glioma, junto con una liberacion extracelular de microvesmulas que contienen una oncoprotema EGFRvIII intacta.

La expresion heterogenea de EGFRvIII en glioma humano sugiere que diferentes subgrupos de celulas tumorales podnan desprender microvesmulas que contienen EGFRvIII en el espacio intercelular comun. Ya que las microvesmulas se pueden fundir facilmente con las membranas celulares a traves de un mecanismo dependiente de fosfatidilserina, se demostro en esta memoria que EGFRvIII oncogenicos se pueden transferir de esta manera desde celulas de glioma mas agresivas a benignas. Las celulas U373 negativas para EGFRvIII se incubaron, por lo tanto, con preparaciones de microvesmulas obtenidas a partir de cualquiera de sus homologos U373vIII que albergaban EGFRvIII, o a partir de celulas U373vIII-GFP modificadas geneticamente para expresar un oncogen EGFRvIII marcado con una protema fluorescente verde (GFP), (EGFRvIII-GFP). Curiosamente, esto dio lugar a una captacion mayor del contenido microvesicular por las celulas U373, como se demostro por la expresion de novo v del antfgeno EGFRvII y la fluorescencia de GFP (Fig. 2A-D).

La aparente transferencia intercelular mediada por microvesmulas del receptor EGFRvIII ostensiblemente intacto, plantea la cuestion en cuanto a las consecuencias de la senalizacion (si las hay) de este evento para las celulas (U373) aceptoras. Para abordar esta cuestion, se examinaron celulas U373 24 horas despues de su exposicion a microvesmulas que conteman EGFRvIII para estudiar la activacion de las cascadas de MAPK y Akt, ambas conocidas por mediar en los efectos transformantes aguas abajo de este oncogen. De hecho, la incorporacion de EGFRvIII en la membrana plasmatica de U373 daba lugar a un incremento constante de la fosforilacion de Erk1/2. Este evento era dependiente de la transferencia de EGFRvIII activo, ya que las microvesmulas obtenidas a partir de U373 que no conteman EGFRvIII, eran ineficaces. Ademas, el bloqueo irreversible de este receptor mediante una preincubacion de las microvesmulas obtenidas a partir de U373vIII con el inhibidor de pan-ErbB (CI-1033), reduda marcadamente la fosforilacion de Erk1/2 (Fig. 3A). La fosforilacion de Erk1/2 tambien fue suprimida mediante la preincubacion de estas microvesmulas con anexina V, que bloquea sus residuos de fosfatidilserina expuestos y de este modo su captacion por las celulas U373. Estos resultados demuestran que no solo se requena el mero contacto entre las microvesmulas que conteman EGFRvIII con la superficie de las celulas U373, sino mas bien su integracion real (dependiente de fosfatidilserina) y la transferencia de EGFRvIII para desencadenar la activacion de la ruta MAPK en las celulas aceptoras (Fig. 3B). La incorporacion de microvesmulas obtenidas a partir de U373vIII tambien induda la fosforilacion de Akt en celulas U373, de una manera que se podfa inhibir con anexina V (Fig. 3C), y desencadenaba otros eventos diferentes, en particular la fosforilacion de PDK1 y Raf.

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Los efectos transformantes de las rutas dependientes de EGFRvIII en ultima instancia estan mediados por la desregulacion de varios genes responsables del crecimiento del tumor, la supervivencia y la angiogenesis. Con respecto a esto ultimo, se observo que las celulas U373 expuestas a microvesmulas obtenidas a partir de U373vIII, mostraban un marcado aumento (2-3 veces) de la produccion de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un potente mediador de la angiogenesis del tumor cerebral y una diana conocida de EGFR. La actividad de EGFRvIII era esencial para este efecto, ya que las microvesmulas obtenidas a partir de U373 (desprovistas de EGFRvIII), o las de U373vIII, pero preincubadas con CI-1033, eran incapaces de inducir esta liberacion de VEGF (Fig. 4A). Con estos ajustes, las microvesmulas que conteman EGFRvIII tambien estimulaban fuertemente la actividad del promotor de VEGF y este efecto era inhibido mediante su tratamiento previo con anexina V (Fig. 4B). En conjunto, estas observaciones demuestran que la incorporacion de microvesmulas de U373vIII desencadena un incremento dependiente de EGFRvIII en la expresion del gen VEGF y una produccion de protemas en las celulas U373, mediante la activacion de las rutas de mApK y Akt.

Aunque la regulacion al alza de VEGF anuncia frecuentemente una activacion de las rutas oncogenicas, la transformacion celular aguas abajo de EGFRvIII esta mediada por cambios en la expresion de genes implicados directamente en la proliferacion celular y la supervivencia. En este sentido, las celulas U373 tratadas con microvesmulas que conteman EGFRvIII revelaron un aumento en la expresion de la protema antiapoptotica BclXL y una disminucion de los niveles del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina p27/Kip1, ambas dianas conocidas de EGFR (Fig. 4C, D). Una vez mas, esos efectos fueron inhibidos por un bloqueo mediado por anexina V de la captacion de microvesmulas a traves de las celulas U373 aceptoras. Cambios similares dependientes de EGFRvIII en la expresion de otros genes diana de EGFRvIII, por ejemplo p21/Cip, tambien se observaron.

Las consecuencias funcionales del repertorio mencionado anteriormente de respuestas moleculares provocadas por la incorporacion de microvesmulas que contienen EGFRvIII, pueden conducir a un mayor grado de transformacion celular, como se demuestra por una mayor morfologfa del huso de las celulas U373 expuestas a este material (Fig. 2B). Las celulas U373 se preincubaron con microvesmulas que conteman EGFRvIII y se sometieron a ensayo para estudiar el crecimiento en medios semisolidos, un ensayo de transformacion paradigmatico. Sorprendentemente, la incorporacion de la oncoprotema de esta manera causaba un aumento de dos veces en la formacion de colonias sobre agar blando, independientemente del anclaje, de las celulas U373, mientras que una exposicion a cantidades equivalentes de microvesmulas desprovistas de contenido en EGFRvIII, era intranscendente (Fig. 4D, E).

Es bien sabido que en los GBMs humanos, solo una pequena subpoblacion de celulas tumorales es portadora de la mutacion genetica primaria que conduce a la expresion de EGFRvIII, aunque hay un aumento de crecimiento de todo el tumor. En este sentido, se describe en el presente documento que la expresion de EGFRvIII provoca la formacion de microvesmulas celulares, a las que se incorpora esta protema transmembranal y se desprenden en el micromedio pericelular (Figs. 6 y 7) y en la sangre (Fig. 1F). Los experimentos descritos en este documento demuestran que las microvesmulas que contienen un oncogen activo de este tipo (oncosomas) pueden servir como vehmulos para una transferencia rapida intercelular de la actividad transformante entre las celulas que comprenden los tumores cerebrales. Esto podna conducir a una propagacion horizontal de una mayor capacidad proliferativa, de supervivencia y angiogenica incluso sin un enriquecimiento (anterior) en las celulas que albergan la mutacion respectiva. Esta forma hasta ahora no apreciada de interaccion intercelular es fundamentalmente diferente de la transferencia previamente postulada de fragmentos de ADN que contienen secuencias oncogenicas desde las celulas cancerosas apoptoticas a sus homologos no transformados (fagodticos). Un intercambio de microvesmulas es tambien diferente por los efectos paracrinos inducidos por la secrecion de ligandos solubles estimulantes tumorales, pero podna amplificar/modular los ultimos efectos, compartiendo de forma intercelular receptores activos asociados a la membrana (y por lo tanto insolubles).

Confirmando que en los GBMs humanos, solo una pequena subpoblacion de celulas tumorales es portadora de la mutacion genetica primaria que conduce a la expresion de EGFRvIII, se detectaron las bandas tanto de EGFR de tipo silvestre como de EGFRvIII con los tamanos esperados y se determinaron usando un protocolo de SDS-PAGE estandar en microvesmulas recogidas a partir de plasma humano de pacientes con GBM (Fig. 5).

Se incluye que una transferencia microvesicular similar tambien puede implicar otras tirosinas cinasas oncogenicas asociadas a la membrana, transformantes, mutantes, reguladas al alza o activadas de otro modo (por ejemplo, HER- 2, wtEGFR, cKit o MET) y protemas operativas en una variedad de tumores humanos. Las celulas hospedadoras (por ejemplo, del endotelio) tambien pueden ser dianas de microvesmulas que contienen oncogenes. En un aspecto, las funciones que favorecen el tumor (por ejemplo angiogenesis) de una celula hospedadora se podnan intensificar mediante una transferencia microvesicular. Al contrario, las celulas hospedadoras asociadas a tumores se alteran frecuentemente de forma profunda o incluso contienen alteraciones citogeneticas manifiestas (Akino et al. Am. J. Pathol. 2009) y sus microvesmulas derivadas (por ejemplo, que contienen marcadores endoteliales tumorales (TEMs) de celulas endoteliales) podnan poseer un valor diagnostico, pronostico y predictivo.

Tambien se considera en este documento que agentes capaces de bloquear el intercambio de microvesmulas entre celulas (por ejemplo, derivados de anexina V) pueden ser utiles como agentes terapeuticos, por ejemplo, para inhibir la propagacion y el crecimiento del cancer mediante una inhibicion de la fusion de microvesmulas con las celulas. Los metodos para el tratamiento del cancer se dan a conocer y comprenden la administracion de un agente de bloqueo del intercambio de microvesmulas, por ejemplo, anexina V y/o derivados de la misma, a un sujeto que lo

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requiere. Se contempla que cualquier agente que se podna utilizar para el bloqueo de la transferencia de microvesmulas, micropartmulas, ectosomas o exosomas se puede utilizar en tales metodos. Otros ejemplos no limitativos de tales agentes incluyen agentes bloqueantes de P-selectina o su ligando, PSGL.

Ademas se describen metodos para el diagnostico del cancer, que permiten la deteccion de multiples protemas oncogenicas y/o multiples sitios de fosforilacion dentro de las mismas, mediante la realizacion del analisis en las microvesmulas. Por ejemplo, un cancer se podna caracterizar mediante la determinacion de si es portador de EGFRvIII, HER-2, wtEGFR, cKit o MET, solos o en combinacion, mediante el analisis de la composicion proteica de las microvesmulas. El numero de microvesmulas que contienen protemas oncogenicas que se encuentran en un fluido corporal tambien se puede usar como una forma de determinar la agresividad de un tumor, es decir, su tendencia a extenderse o a la metastasis. Los metodos por lo tanto pueden ayudar en el diagnostico y/o el pronostico. El diagnostico y/o el pronostico del cancer de mama se puede determinar mediante la deteccion de la presencia de EGFR y/o HER-2. En una alternativa, el diagnostico y/o el pronostico de los tumores se determina detectando la presencia de HER-2 y/o HER-3. En otro metodo, el diagnostico y/o el pronostico del cancer colorrectal se determina mediante la deteccion de la ausencia de una protema relacionada con el tumor, tal como el supresor tumoral PTEN y/o p53 y la presencia de una protema oncogenica tal como K-ras y/o c-Met, que es indicativa de un tumor agresivo.

Ademas se describen metodos para supervisar la progresion de un cancer y/o para supervisar la eficacia de un tratamiento o un regimen terapeutico. Por ejemplo, el tamano y la naturaleza de un tumor se pueden controlar mediante el seguimiento de la cantidad y la composicion de una protema o protemas oncogenicas, por ejemplo, EGFRvIII, HER-2, HER-3, cKit o MET, liberadas en las microvesmulas. Sena de esperar, por ejemplo, que un tumor mas grande incluya mas celulas y por lo tanto libere mas microvesmulas que uno mas pequeno. Esto se podna utilizar para supervisar una terapia, proporcionando un medio para medir un cambio en el tamano de un tumor, que se puede reducir, crecer o permanecer igual. Tales metodos senan valiosos en la evaluacion de la eficacia de una terapia en una poblacion de pacientes como un conjunto, o en un paciente individual. Tambien se contempla que la progresion de un cancer y/o la respuesta a un tratamiento se pueden controlar mediante la medicion de una combinacion de protemas oncogenicas que se encuentran en las microvesmulas. Por ejemplo, EGFR y HER-2 se pueden medir en combinacion, por ejemplo, en el cancer de mama, proporcionando de este modo una indicacion del estado genetico (por ejemplo, genotipo) y la progresion (o recurrencia) del tumor maligno, en algunos aspectos independientemente del tamano real del tumor. Tambien, HER-2 y HER-3 o HER-2 y EGFR se pueden medir en combinacion, por ejemplo. Ademas, como las microvesmulas pueden contener oncoprotemas intactas, en otra realizacion se puede determinar el estado de fosforilacion de las oncoprotemas para supervisar o medir la eficacia de los tratamientos dirigidos. Por ejemplo, supervisar el estado de fosforilacion de la combinacion EGFR/HER-2 en microvesmulas obtenidas a partir de un cancer de mama, podna indicar la eficacia de un farmaco dirigido a HER-2 tal como Herceptin®, un farmaco dirigido a EGFR tal como Tarceva®, o tratamientos contra el cancer similares, solos o en combinacion. Ademas, el entorno molecular que rodea una protema oncogenica en las microvesmulas, por ejemplo, otras moleculas, el proteoma completo o el fosfoproteoma, se pueden emplear para supervisar la progresion del cancer y/o la eficacia de un tratamiento contra el cancer. Por ejemplo, la presencia o ausencia o un estado de fosforilacion de PTEN en las microvesmulas puede ser indicativo de la progresion del cancer y/o de la eficacia de un tratamiento contra el cancer.

La invencion tal y como se reivindica en el presente documento, proporciona metodos para supervisar la progresion de un cancer y/o supervisar la eficacia de un tratamiento contra el cancer o un regimen terapeutico. Se contempla que cualquier tratamiento contra el cancer o regimen terapeutico conocido en la tecnica se podna utilizar en los metodos descritos en el presente documento. Ejemplos no limitantes de tratamientos y regfmenes terapeuticos incluidos en el presente documento, incluyen cirugfa, radiologfa, quimioterapia y administracion de terapias y tratamientos dirigidos contra el cancer, que interfieren con mecanismos espedficos implicados en la carcinogenesis y el crecimiento de tumores. Ejemplos no limitantes de terapias contra el cancer dirigidas incluyen terapias que inhiben dianas asociadas a la tirosina cinasa (tales como Iressa®, CI-1033, Tarceva® y Gleevec®), inhibidores de sitios de union a receptores extracelulares para hormonas, citocinas y factores de crecimiento (Herceptin®, Erbitux®), inhibidores de proteasoma (Velcade®) y estimuladores de la apoptosis (Genasense®). Tales terapias dirigidas se pueden conseguir a traves de moleculas pequenas, anticuerpos monoclonales, antisentido, ARNsi, aptameros y terapia genica. Un sujeto puede recibir tambien una combinacion de tratamientos o regfmenes terapeuticos. Cualquier otro tratamiento o regimen terapeutico conocido en la tecnica se puede utilizar en los metodos descritos en el presente documento, solo o en combinacion con otros tratamientos o regfmenes terapeuticos.

Aunque tambien se describen metodos de diagnostico del cancer, al permitir la deteccion de multiples protemas oncogenicas fosforiladas y/o multiples sitios de fosforilacion dentro de ellas, mediante la realizacion del analisis en las microvesmulas, la presente invencion proporciona metodos para supervisar la progresion de un cancer y/o supervisar la eficacia de un tratamiento o un regimen terapeutico mediante la medicion del estado de fosforilacion de una protema oncogenica en las microvesmulas.

Los receptores de tirosinas cinasas (RTKs), tales como EGFR, contienen un dominio de union a ligando extracelular conectado a un dominio citoplasmico a traves de una unica helice transmembranal. El dominio citoplasmico contiene un nucleo de protema tirosina cinasa conservado y secuencias reguladoras adicionales que estan sujetas a una autofosforilacion y fosforilacion mediante protemas cinasas heterologas. Cuando un ligando se une al dominio

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extracelular de un RTK, se activa la dimerizacion del RTK con otros RTKs adyacentes. La dimerizacion conduce a una rapida activacion de los dominios de cinasa citoplasmica de las protemas, siendo el primer sustrato para estos dominios el propio receptor. Como resultado, el receptor activado se autofosforila en multiples residuos de tirosina intracelulares espedficos. La fosforilacion de residuos de tirosina espedficos dentro del receptor activado crea sitios de union para protemas que contienen el dominio de homologfa 2 Src (SH2) y de union a fosfotirosina (PTB). Las protemas espedficas que contienen estos dominios incluyen Src y la fosfolipasa Cy, y la fosforilacion y la activacion de estas dos protemas despues de la union al receptor, conduce a la iniciacion de las rutas de transduccion de senales. Otras protemas que interaccionan con el receptor activado, actuan como protemas adaptadoras y no tienen actividad enzimatica intrmseca por sf mismas. Estas protemas adaptadoras enlazan la activacion de RTK con rutas de transduccion de senales aguas abajo, tales como la cascada de senalizacion de la cinasa MAP. La actividad de practicamente todos los RTKs se puede mejorar, incluso en ausencia de union al ligando, mediante el tratamiento de las celulas con inhibidores de la protema tirosina fosfatasa. Por tanto, la activacion persistente de un RTK o un receptor oncogenico, que desencadena una expresion anormal de genes implicados en la proliferacion celular, la supervivencia y la angiogenesis, esta regulada positivamente por uno o varios sitios de fosfotirosina en el bucle de activacion.

La fosforilacion de RTKs se puede medir utilizando una serie de metodos. Ejemplos no limitativos de tales metodos incluyen anticuerpos fosfoespedficos, matrices de fosfoanticuerpo, tincion con anticuerpos contra residuos de fosfotirosina y ensayos directos de cinasas con sustratos que se pueden fosforilar. Otra manera de determinar el estado de fosforilacion de multiples receptores sobre las microvesmulas podna ser evaluar su fosfoproteoma total usando metodos relacionados con el espectrometro de masas (MS). Se contempla que las tecnicas convencionales conocidas en la tecnica para medir y detectar protemas fosforiladas (tambien denominadas fosfoprotemas) y el estado de fosforilacion de una protema, se pueden utilizar en los metodos descritos en el presente documento.

Tambien se describe adicionalmente en este documento que la transformacion oncogenica puede tener un impacto sobre una celula cancengena de manera que se causa un cambio en el espectro mas amplio de las protemas asociadas con MVs, cuyos enlaces con el oncogen desencadenante pueden ser mecanicamente obvios o no, pero pueden ser significativos para un uso como biomarcadores. Por lo tanto, en este documento se describe la identificacion de protemas asociadas con el cancer presentes en MVs circulantes de ratones que albergaban xenoinjertos de tumores humanos subcutaneos o en las MVs procedentes del medio de cultivo de lmeas celulares tumorales humanas. Estas protemas representan biomarcadores que se pueden utilizar, por ejemplo, para controlar la progresion de un tumor o la respuesta frente a una terapia anti-tumoral. Los biomarcadores tambien se pueden utilizar para el diagnostico y el pronostico de un tumor en un sujeto. Se demuestra en la presente memoria que muchas protemas relacionadas con tumores malignos, tales como oncogenes, supresores tumorales, receptores de tirosinas cinasas y mediadores de la senalizacion celular, se detectan en las MVs obtenidas a partir de varios tipos de celulas cancerosas humanas. Ejemplos de tales protemas asociadas con el cancer y de fosfoprotemas que se encuentran en las MVs obtenidas a partir de tumores que se pueden utilizar como biomarcadores, se indican en las Tablas 1-4 a continuacion.

Se debe tener en cuenta que las protemas y fosfoprotemas asociadas al cancer que se encuentran en las MVs incluyen tanto protemas oncogenicas conocidas, tales como HER-2 como protemas inesperadas, tales como VEGFR2 o Tie 2, que son receptores angiogenicos que normalmente se encuentran en las celulas epiteliales. Por lo tanto, el analisis del contenido proteico de las MVs obtenidas a partir de tumores, tal y como se muestra en el presente documento, ayudara a la caracterizacion, el pronostico y el diagnostico de tumores, incluyendo las complejidades de su microambiente y el estroma del hospedador. Una determinacion del contenido en protemas de las MVs obtenidas a partir de tumores tambien puede conducir a la identificacion potencial de nuevas dianas terapeuticas. Por ejemplo, la fosfoprotema VEGFR3 humana se identifico en las MVs de ratones que eran portadores de xenoinjertos de PANC-1, lo que sugiere que la fosfoprotema VEGFR3 asociada a celulas de cancer puede ser un biomarcador hasta ahora no apreciado y/o una diana terapeutica para al menos un subconjunto de los canceres pancreaticos (vease la Tabla 4). Ademas, la combinacion de protemas presentes en las MVs puede ser caractenstica del tumor a partir del cual se obtienen las MVs (vease la Tabla 4, por ejemplo). Por lo tanto, el perfil proteico o fosfoproteico, o un subconjunto de los mismos, de las MVs se puede utilizar en los metodos proporcionados en este documento, por ejemplo, para el seguimiento de una terapia anti-tumoral o para el diagnostico o el pronostico de un tumor.

Como muchas de las protemas identificadas en este documento son fosfoprotemas que son conocidas por estar activadas o inactivadas mediante fosforilacion, la activacion o el estado funcional de las protemas asociadas al cancer se puede evaluar mediante un seguimiento de su estado de fosforilacion. Por tanto, el estado de fosforilacion de las protemas asociadas con MVs, solas o en combinacion, tambien se puede utilizar en los metodos proporcionados en este documento, por ejemplo, para el seguimiento de una terapia anti-tumoral o para el diagnostico o el pronostico de un tumor.

Debe entenderse que las protemas y fosfoprotemas asociadas con MVs identificadas en el presente documento y combinaciones de las mismas, se pueden usar en los metodos y kits descritos en este documento.

En un aspecto, se proporciona en la presente memoria un analisis de sangre basado en las microvesmulas, en donde las MVs se afslan a partir de una muestra de sangre de un sujeto y se someten a ensayo las protemas

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asociadas con MVs, o se someten a ensayo para evaluar el estado de fosforilacion de las protemas asociadas con MVs. Tales metodos se demuestran a continuacion, por ejemplo, en las MVs que expresan EGFRvIII y EGFR de tipo silvestre, en los ratones que son portadores de un xenoinjerto de una lmea celular tumoral humana y en pacientes con glioblastoma (GBM). Se ha demostrado la viabilidad de este enfoque en numerosos tipos de celulas cancengenas (como cancer de mama, glioma, cancer cerebral, cancer de pulmon, cancer de pancreas, cancer de piel, cancer de prostata y cancer colorrectal).

Se observa que otra ventaja potencial del uso de MVs circulantes en lugar de una muestra de biopsia, es el problema de la heterogeneidad tumoral: se ha observado en una ocasion que una muestra de biopsia tumoral era negativa para EGFRvIII, mientras que la correspondiente muestra de MV de la sangre era positiva (vease el Ejemplo 3). Por lo tanto, mediante la obtencion de una muestra de biopsia de tejido que no es representativa del fenotipo/genotipo tumoral general, el resultado es enganoso, mientras que la muestra de sangre es representativa de todo el tumor y por lo tanto mas fiable.

En el presente documento se describen metodos para detectar la presencia de una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor en un tumor en un sujeto, en donde las MVs se afslan a partir de una muestra de un fluido corporal, por ejemplo, sangre, procedente del sujeto y se somete a ensayo la protema oncogenica o relacionada con un tumor, y en donde la presencia de la protema en las MVs indica la presencia de la protema en el tumor. En algunos casos, los metodos descritos en este documento pueden detectar una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor que no se detecta en una muestra de biopsia del sujeto. Estos metodos pueden ser particularmente utiles para el analisis de tumores heterogeneos, en donde una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor se puede perder por los metodos de biopsia tisular convencionales y la toma de muestras histopatologicas. Por ello, los metodos proporcionados en este documento reducen o eliminan el riesgo de no detectar una protema oncogenica o relacionada con un tumor en una muestra de biopsia obtenida a partir de un sujeto. Estos metodos tambien proporcionan una alternativa no invasiva a la biopsia tisular.

Ademas, se describen metodos para detectar un cancer en un sujeto, en donde una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor se detecta en microvesmulas obtenidas a partir de una muestra de fluido corporal, por ejemplo, sangre, recogida del sujeto. En una realizacion, dicha protema oncogenica o relacionada con el tumor no se detecta en una muestra de biopsia obtenida a partir de dicho sujeto. Tambien, se describen metodos para detectar un cancer metastasico en un sujeto, en donde una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor se detecta en microvesmulas obtenidas a partir de una muestra de fluido corporal, por ejemplo, sangre, recogida a partir del sujeto. En algunos casos en los que es poco practico o imposible obtener muestras de biopsias de todos los sitios de metastasis en un sujeto, el analisis de las microvesmulas se puede utilizar para determinar la presencia de protemas oncogenicas o relacionadas con un tumor en los tumores y/o para reducir o eliminar el riesgo de no detectar una protema oncogenica o relacionada con un tumor.

En otro aspecto, se proporcionan metodos para determinar el estado de fosforilacion de una protema oncogenica o una protema relacionada con un tumor en un tumor en un sujeto, que comprende recoger una muestra de un fluido corporal del sujeto; aislar las microvesmulas de la muestra; y detectar el estado de fosforilacion de la protema oncogenica o la protema relacionada con un tumor en las microvesmulas, en donde el estado de fosforilacion de la protema oncogenica o la protema relacionada con un tumor en las microvesmulas indica el estado de fosforilacion de la protema oncogenica o la protema relacionada con un tumor en el tumor. En un aspecto, el fluido corporal es sangre.

Ademas, se describen metodos para diagnosticar o determinar el pronostico de un cancer en un sujeto, que comprenden recoger una muestra de un fluido corporal, por ejemplo, sangre, desde el sujeto; aislar las microvesmulas de la muestra; y determinar las protemas oncogenicas y/o relacionados con el tumor en las microvesmulas.

En un aspecto, las protemas oncogenicas, relacionadas con un tumor y/o asociadas con MVs en las microvesmulas, es un diagnostico, por ejemplo, del tipo de cancer, y/o un pronostico.

La presente invencion se entendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan para ilustrar la invencion, en lugar de para limitar su alcance.

EJEMPLO 1

Cultivo celular y aislamiento de microvesmulas (MVs)

Celulas U373 (astrocitoma humano), su variante estable U373vIII que expresa EGFRvIII regulada con Tet-off o EGFRvIII fusionada en el extremo C-terminal con el casete de protema fluorescente verde (pEGFPNI) (U373vIII- GFP) y A431 se mantienen como se ha descrito previamente (Viloria-Petit et al. Am. J. Pathology, 1997, 6:15231530; Yu et al., 2005, Blood, 105: 1734-1741) en medio que contiene suero bovino fetal, FBS, con agotamiento de microvesmulas. Las celulas HUVEC se mantienen en EGM-2 (Cambrex Bioscience, Walkesville, MD, EE.UU.). Las microvesmulas se recogen a partir de medios condicionados o plasma de raton, como se ha descrito previamente (Yu & Rak, J. Thromb. Haemost, 2004, 2:2065-67; Al-Nedawi et al., 2005, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 25: 1744-1749). Brevemente, los medios se someten a dos centrifugaciones sucesivas a 300 g y 12.000 g para eliminar

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las celulas y los residuos. Las microvesmulas se sedimentan por ultracentrifugacion durante 2 horas a 100.000 g y se cuantifican mediante el contenido en protema y se analiza el contenido en EGFR o EGFRvIII. Para la microscop^a electronica de barrido (SEM), las celulas se cultivan sobre cubreobjetos, se fijan con 2,5% de glutaraldehndo, se tinen con 1% de OsO4, se cubren con oro y se visualizan usando el instrumento JEOL 840A. Para un analisis in vivo, los tumores se generan mediante una inyeccion de 1-10 x 106 celulas U373vIII o U373 en ratones inmunodeficientes (SCID) (Charles River, Canada). En algunos casos, los ratones se tratan diariamente con el inhibidor de pan-ErbB, CI-1033, como se ha indicado. Se recoge la sangre de los ratones portadores de tumor o de los ratones de control mediante una puncion cardiaca en jeringas heparinizadas. El plasma exento de plaquetas se utiliza para preparar las microvesmulas.

La citometna de flujo (FACS) se emplea para detectar EGFRvIII o EGFRvIII-GFP en la superficie de celulas no permeabilizadas viables y se lleva a cabo ya sea con celulas que expresan estos receptores de forma endogena, o con las que han adquirido tal expresion despues de la transferencia de microvesmulas. Tfpicamente, las celulas U373 se tratan con microvesmulas (MVs) obtenidas a partir de celulas U373vIII o U373vIII-GFP durante 24 horas. Las celulas se separan despues, usando EDTA 2 mM (acido etilendiaminotetraacetico) para obtener una suspension de celulas individuales, cuyas partes almuotas (1,5 x 106/muestra) se lavan en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) con 1% de FBS y 0,1% de azida de sodio. Las celulas tratadas con MVs obtenidas a partir de U373vIII, se tinen a continuacion durante 30 minutos a 4°C, por ejemplo, con un anticuerpo monoclonal contra EGFRvIII (Zymed). Despues del lavado, las muestras se incuban con anticuerpo secundario de cabra anti-raton Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 30 minutos a 4°C, se lavan con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se analizan. En el caso de un tratamiento con MVs obtenidas a partir de celulas U373vIII-GFP, suspensiones de celulas de nuevo aporte se analizan directamente en busca de fluorescencia de GFP. Los datos se pueden adquirir utilizando un citometro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA).

Todos los experimentos in vivo se realizan en ratones con una edad de 6 a 8 semanas con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) (Charles River, Saint-Coustant, QC, Canada). Brevemente, 1 a 10 x 106 celulas U373vIII o U373, se inyectan por via subcutanea en 0,2 ml de PBS. Se recoge sangre de los ratones mediante puncion cardfaca, en una solucion de heparina sodica. El plasma exento de plaquetas se prepara mediante centrifugacion a 2000 g durante 5 minutos, 2000 g durante 5 minutos y 16.000 g durante 5 minutos para aislar las microvesfculas.

Ejemplo 2

Ensayos de transferencia de microvesfculas

Las celulas U373 (aceptoras) se tratan con microvesfculas durante 24 horas y una suspension de celulas individuales se analiza por citometna de flujo o microscopfa de fluorescencia para estudiar la expresion de EGFRvIII o GFP. Para detectar los eventos de senalizacion, las U373 se privan de nutrientes en 0,5% de FBS (DMEM) antes de la adicion de las microvesmulas, que estan o bien intactas o se han preincubado con anexina-V, o CI-1033, a las concentraciones que se indican. La expresion de moleculas asociadas con las microvesfculas (EGFRvIII, TF) y la expresion de mApK total y activada y Akt, asf como otros cambios, se somete a ensayo mediante inmunotransferencia (BclXL, p27/Kip1), ELISA (VEGF, R&D Systems), o ensayos de actividad de promotor (VEGF), como se describe en otra parte (Lopez-Ocejo et al. 2000, Oncogene, 40:4611-4620). Para los ensayos de formacion de colonias sobre agar blando, se preparan suspensiones de celulas individuales en 0,3% de agarosa a partir de un numero igual de celulas pretratadas con microvesfculas o medio de control. Los cultivos se establecen en placas recubiertas previamente con 0,5% de agarosa y se hace un recuento de todas las colonias que contienen mas de 4 celulas.

Ejemplo 3

Deteccion de EGFRvlll circulante en pacientes con glioblastoma multiforme

Las microvesfculas se recogen a partir de plasma humano de una manera similar a como se ha descrito previamente para el plasma de los ratones portadores de tumores (Al-Nedawi et al., 2008, Nature Cell Biology, 10: 619-624). Brevemente, muestras de sangre archivada son sometidas a dos centrifugaciones consecutivas a 300 g durante 5 minutos y despues a 12.000 g durante 20 minutos para eliminar las celulas y los residuos. Finalmente, las microvesfculas se obtienen despues de una centrifugacion durante 2 horas a 100.000 g, se lavan dos veces con un gran volumen de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Los lisados de protemas se preparan en el tampon de lisis que contiene: Tris 10 mM, pH 6,8, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, pirofosfato de sodio 30 mM, 2% (peso/vol) de SDS, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y Na3VO41 mM, durante 10 minutos sobre hielo. A menos que se indique lo contrario, los lisados se determinaron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia, por ejemplo, con un anticuerpo policlonal anti-EGFR humano de raton o de oveja, o anticuerpos monoclonales de raton apropiados. La inmunodeteccion se logra usando el anticuerpo secundario apropiado conjugado con HRP y el kit de quimioluminiscencia (kit ECL; Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido), despues de lo cual las transferencias se escanean y las bandas de protemas se cuantifican utilizando, por ejemplo, el escaner Storm 860 (GE Healthcare). Las bandas tanto de EGFR de tipo silvestre como de EGFRvIII se detectan de esta manera en los tamanos esperados y se determinan usando un protocolo convencional de SDS-PAGE.

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La oncoprotema EGFRvIII tambien se detecto en MVs circulantes recogidas a partir de una cohorte de 24 pacientes con GBM procedente del Banco de Tumores de Toronto, utilizando analisis Western (Fig. 8). La deteccion de la oncoprotema en las MVs se correlacionaba bien con la deteccion del oncogen EGFRvIII en muestras tumorales de los mismos pacientes (Fig. 8). Estos resultados demuestran la viabilidad de la deteccion de la oncoprotema en MVs circulantes en pacientes con cancer. En particular, para el paciente n° 4 se detecto la oncoprotema en MVs a pesar de que el oncogen no se habfa detectado en la muestra de tumor usando PCR. Este resultado indica que en algunos casos el analisis de las MVs puede ser mas sensible que la PCR para la deteccion de biomarcadores asociados con el cancer, tales como EGFRvIII. Tambien es posible que la senal de EGFR relacionada con las MVs pudiera haber surgido de celulas tumorales que no se habfan eliminado y que se esperaba que causaran una recurrencia.

Se detecto la senal de EGFR en las MVs recogidas a partir de sangre de ratones SCID portadores de un xenoinjerto humano, usando un ensayo de ELISA (Fig. 9). Un kit comercial para ELISA de EGFR (R&D, Systems, DYC 1854-5) que contema el anticuerpo anti-EGFR que tema una reaccion cruzada con EGFRvIII, se utilizo para detectar EGFRvIII en las MVs de ratones que eran portadores de xenotrasplantes de celulas U373vIII obtenidas a partir de un glioma y EGFR de tipo silvestre en celulas A431 obtenidas a partir de un carcinoma de celulas escamosas (SCC). Estos resultados indican que ambas formas de EGFR se detectan facilmente mediante un ensayo ELISA y confirman la viabilidad de la deteccion de biomarcadores basandose en las MVs.

Ejemplo 4

Deteccion de multiples dianas moleculares relacionadas con el cancer en las MVs

Se aislaron microvesmulas liberadas por las lmeas de celulas tumorales humanas en medio de cultivo y se utilizo el analisis Western para detectar diversas protemas relacionadas con tumores malignos, tales como oncogenes, supresores tumorales y mediadores de la senalizacion celular, en la carga de las microvesmulas. Se utilizaron lmeas celulares de glioma (U373, U373vIII, U87 y U87vlll), celulas de cancer de pulmon (A549), celulas de cancer de mama (MDA-MB-231), celulas de cancer de prostata (PC-3) y celulas de cancer colorrectal (DLD-1, HCT116 y CaCo2). Las oncoprotemas putativas K-ras, c-Met, beta-catenina y PDGFR y los productos genicos supresores de tumores PTEN, TP53 y E-cadherina se sometieron a ensayo en las microvesmulas. Los resultados se muestran en la Fig. 10A, en donde (+) indica reactividad fuerte, (+/-) indica reactividad debil y (-) indica que no hay reactividad detectable. Ejemplos de analisis de transferencia Western se muestran en la Fig. 10B.

El analisis de transferencia Western se realizo en lisados celulares totales de preparaciones de MVs, obtenidas a partir de las lmeas celulares cultivadas, como se ha indicado. Los anticuerpos utilizados eran los siguientes: Pan Ras: monoclonal de conejo [Y131], n° de cat. (ab32442), Abeam; K-ras: Ac. monoclonal de raton, n° de cat. AT2650a, Biolynx Inc.; C-Met: monoclonal de conejo (EP145Y], n° de cat. (ab51067), Abcam; PDGFR-b2: monoclonal de raton, n° de cat. (ab10847-100), Abcam; Beta-catenina: monoclonal de raton, n° de cat. (MA 1-301), ABR; E-cadherina: monoclonal de raton [MB2], n° de cat. (ab8993), Abcam; PTEN: monoclonal de conejo, n° de cat. (#9188), Cell Signaling; P53: monoclonal de conejo, n° de cat. (#2527), Cell Signaling. Se observa que las lmeas celulares utilizadas en este estudio representan poblaciones que actualmente se utilizan en el laboratorio y que se obtienen a partir de diversas fuentes (ATCC, colaboradores), y por tanto pueden diferir en su estado molecular de lmeas celulares denominadas de forma similar, conservadas en otro lugar.

Estos resultados muestran el gran alcance de dianas moleculares de interes para el cancer que estan presentes y son detectables en las MVs. Por ejemplo, RTKs fosforilados asociados con MVs in vivo, se pueden detectar. Los resultados tambien muestran que se puede analizar de esta manera una variedad de tipos de tumores humanos.

Ejemplo 5

Demostracion del estado funcional sostenido (fosforilacion/activacion) de protemas relacionadas con el cancer asociadas a MVs

Se han detectado, in vitro, multiples fosfo-RTKs en microvesmulas liberadas en el medio de cultivo por varios tipos de lmeas celulares tumorales humanas, usando una matriz de anticuerpos para fosfoprotemas que contiene sondas para 42 RTKs (R&D Systems) (Fig. 11). La Fig. 11A muestra ejemplos de RTKs en los que se puede detectar simultaneamente una fosforilacion relativa en una unica muestra usando la matriz de anticuerpos para fosfo-RTKs; la matriz tiene 119 puntos y se pueden detectar 42 RTKs fosforilados diferentes. La Fig. 11B muestra los fosfo-RTKs importantes detectados en las MVs de las lmeas celulares indicadas. Ejemplos de los resultados del ensayo se proporcionan en la Fig. 11C. Los resultados indican que se pueden detectar numerosas fosfoprotemas asociadas con MVs. Las 'principales fosfoprotemas asociadas con MVs incluyen, por ejemplo, EGFR, FGFR3, EphB2, ROR1, EphA2 y EphA4.

Las lmeas celulares utilizadas en este estudio representan poblaciones que actualmente se utilizan en el laboratorio y que se obtienen a partir de diversas fuentes (ATCC, colaboradores) y por lo tanto pueden diferir en su estado molecular de lmeas celulares con nombres similares conservadas en otros lugares. Ademas, se observa que los resultados obtenidos dependen de los anticuerpos espedficos utilizados para esa deteccion y los fosfo-epftopos a los que se dirigen. Los anticuerpos utilizados en la matriz son unicos y pueden tener una reactividad no solapante con otros anticuerpos fosfo-espedficos dirigidos a los mismos RTKs.

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30

Estos resultados demuestran que los receptores de tirosinas cinasas (RTKs) contenidos en las microvesmulas de celulas cancerosas han facilitado la fosforilacion y, por lo tanto, tienen una activacion sostenida y un estado funcional.

Tambien se realizaron perfiles in vitro a gran escala de fosfoprotemas contenidas o enriquecidas en MVs liberadas desde las celulas de GBM dirigidas con EGFRvIII. Se empleo una micromatriz de anticuerpos Kinex® compuesta por mas de 650 anticuerpos diferentes, espedficos del sitio fosfo para realizar el perfil de la expresion proteica de la senalizacion celular y la fosforilacion (Kinexus, Inc.). La matriz puede detectar 248 sitios unicos de fosforilacion con anticuerpos fosfo-espedficos, 121 sitios de fosforilacion de cinasas, 2 sitios de fosforilacion de fosfatasas y 125 sitios de fosforilacion en subunidades reguladoras y otras protemas. Empleando la micromatriz de anticuerpos Kinex®, se analizo el fosfoproteoma de MVs producidas por celulas de GBM humanas. Con el fin de identificar los cambios dependientes de EGFRvIII en el fosfoproteoma de las MVs, se emplearon tanto celulas U373P (tambien denominadas U373 parentales) (no transfectadas, no tumorigenicas) y celulas U373vIII. En cada caso, los valores obtenidos a partir de las MVs se normalizaron respecto a los valores obtenidos a partir de las celulas. Los resultados ejemplares se proporcionan en las Tablas 1 y 2 a continuacion, en donde la fosfoprotema (P-Protema) se indica en la columna de la izquierda y la senal media neta normalizada (NNMS) se indica en la columna de la derecha. Las protemas mas abundantes encontradas en las MVs se muestran en las Tablas 1 y 2. La Tabla 3 proporciona ejemplos adicionales de fosfoprotemas detectadas en U373-MVs utilizando la matriz de anticuerpos Kinex®; estas protemas representan una muestra de las mas de 200 fosfoprotemas detectadas. La Tabla 3.1 muestra que la fosforilacion de sitios distintos, por ejemplo, Y1068 o Y1110 de EGFR, se puede supervisar en las MVs.

Los resultados indican que hay numerosas protemas fosforiladas, y por lo tanto activadas, en las MVs, muchas de las cuales se sabe que tienen una funcion y/o un valor predictivo en el cancer. Ademas, los resultados presentados en este documento usando tanto la matriz de anticuerpos Kinex® como la matriz de anticuerpos de fosfoprotemas de R&D Systems, muestran que multiples dianas moleculares oncogenicas, de senalizacion y biologicamente activas se pueden detectar simultaneamente en las MVs obtenidas a partir de celulas de cancer, tanto las MVs recuperadas a partir de un medio de cultivo celular condicionado como las MVs recuperadas a partir de la sangre de ratones que albergaban xenoinjertos de tumores humanos.

Tabla 1. Matrices Kinex® - Fosfoprotemas asociadas con MVs con la senal media normalizada neta mas alta (celulas U373P frente a U373P-MVs).

P-Protema

Senal media neta normalizada NNMS

BLNK

5079

BAD

8520

CrystalliaB

8499

elF4E

6455

MKK1

6244

PKB/Akt

5505

PKCg

5316

PLcg1

5025

Receptor de progesterona

5013

VEGFR2(KDR) Y1214

5065

VEGFR2(KDR) Y1214

5252

ZAP70/Syk

7160

ZAP70/Syk

7031

Tabla 2. Matrices Kinex® - Fosfoprotemas asociadas con MVs con la senal media normalizada neta mas alta (celulas U373vIII frente a U373vIII-MVs).

P-Protemas

NNMS

MEK1

6003

MEK

8459

P-Protemas

NNMS

MARCK

6202

Tau (mtub)

5270

IRS1

5064

IRS1

5947

Ret

5861

Jun

8782

Jun

6743

BAD

12142

BAD

5055

Erk-1

5314

MKK1

9113

HER-2

6389

HER-2

6252

HER-2

5779

HER-2

5399

PKCd

9078

PKCg

14431

PKCg

5999

PKCg

15696

PKCg

17197

PKCg

7949

PKCg

7013

Tau

5264

Tau

5117

Chk2

6002

EGFR

5929

EGFR

5958

EGFR

5250

VEGFR2

5117

Zap70/Syk

8242

Zap70/Syk

5796

FAK

5242

BLNK (lin)

11480

Tabla 3. Ejemplos de fosfoprotemas detectadas en U373-MVs.

Codigos de anticuerpos

Nombre de la proteina diana Sitio de fosforilacion (humano) Nombre completo de la proteina diana NNMS

PN011

Bad S91 Antagonista de Bcl2 de la protema de muerte celular 8520,4

Codigos de anticuerpos

Nombre de la protema diana Sitio de fosforilacion (humano) Nombre completo de la proteina diana NNMS

N024

CREB1 S133 Protema que se une al elemento de respuesta AMPc 4935,8

PK121

EGFR*) T693 Receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 4807,0

PN030-1

elF4E S209 Factor de iniciacion de la traduccion eucariota 4 (protema que se une a la caperuza de ARNm) 6554,6

PK125

ErbB2 (HER2) Y877 Receptor de tirosina cinasa de ErbB2 (Neu) 4922,7

PK014-PK015-2

Erk1 T202+Y204; T185/Y187 Protema serina cinasa 1 regulada extracelularmente (cinasa p44 MAP) 4199,1

PK019-1

FAK Y577 Protema tirosina cinasa de adhesion focal 3457,4

PN048-1

Jun S73 Proto-oncogen Jun codificado por el factor de transcripcion API 5879,4

PK046-3

MEK1 T291 Protema serina cinasa 1 MAPK ERK (MKK1) 6244,5

PK116

mTOR (FRAP) S2448 Diana de mairnfero de rapamicina (FRAP) 1183,9

PN053

NFkappaB p65 S276 Factor de transcripcion nuclear NF-kappa-B p65 1503,1

PK060-3

P38a MAPK T180+Y182 Protema serina cinasa activada con mitogeno p38 alfa 1171,6

PK063

PDGFRa Y754 Receptor de cinasa alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas 2315,3

PK065

PDGFRb Y716 Receptor de cinasa beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas 3369,6

PK073

PKCa S657 Protema serina cinasa C alfa 3019,3

PK079

PKCd S645 Protema serina cinasa C delta 4061,2

PK082-2

PKCg T514 Protema serina cinasa C gamma 4857,1

NN143

PLCg2 Y753 1 -fosfatidilinositol-4,5-bifosfato fosfodiesterasa gamma-2 2472,8

PN104

Receptor de progesterona S294 Receptor de progesterona 5013,0

PP003

PTEN S380+S382+ S385 Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3-fosfatasa y protema fosfatasa y homologo de tensina delecionados en el cromosoma 10 1623,7

PK098

Raf1 S259 Protema serina cinasa codificada por el protooncogen Raf1 2463,0

PN065

Rb T356 Protema 1 asociada a retinoblastoma 1331,6

PN074-2

Shd Y349+Y350 Protema transformante 1 que contiene el dominio SH2 2088,9

PN077

SOX9 S181 SRY (region determinante del sexo Y) -caja 9 (displasia campomelica, reversion sexual autosomica) 3355,7

PN078

STAT1 S727 Transductor de senal y activador de transcripcion 1 2016,7

PK110

VEGFR2 (KDR) Y1054 Receptor de tirosina cinasa 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (Flk1) 3542,7

Histona H1 Sitios CDK1 de fosforilacion Histona H1 fosforilada 663,2

P27 Kip1 S10 Inhibidor de cinasa 1 B dependiente de ciclina 27,9

Codigos de anticuerpos

Nombre de la proteina diana Sitio de fosforilacion (humano) Nombre completo de la proteina diana NNMS

p27

Histona H2A.X S139 Variante X de la histona H2A 1558,5

BRCA1 S1423 Protema de susceptibilidad de cancer de mama de tipo 1 4698,6

Hsp27 S15 Proteina de choque termico de 27 kDa beta 1 (HspB1) 1428,5

Lck S157 Protema tirosina cinasa espedfica de linfocitos 2049,3

Caveolina 2 S36 Caveolina 2 977,9

p53 S392 Proteina p53 supresora tumoral (antfgeno NY- CO-13) 1535,4

IRS1 S639 Sustrato 1 del receptor de insulina 5064,2

Ret S696 Receptor de tirosina cinasa Ret 5861,1

Rac1 S71 Sustrato 1 de la toxina botulmica C3 relacionada con Ras 2791,5

FAK S843 Proteina tirosina cinasa de adhesion focal 4081,5

SMC1 S957 Mantenimiento estructural de la proteina 1A de cromosomas 470,1

Integrina a4 S988 Integrina alfa 4 (VLA4) 2846,1

p38a MAPK T180+Y182 Proteina serina cinasa p38 alfa activada por mitogeno 1817,2

MLK3 T277+S281 Proteina serina cinasa 3 de linaje mixto 2096,6

PKBa (Akt1) T308 Proteina serina cinasa B alfa 2339,6

RSK 1/3 T359+S363/ T356+S360 Proteina serina cinasa 1/3 ribosomica S6 130,0

MEK1 (MAP2K1) T385 Protema serina cinasa 1 MAPK/ERK (MKK1) 4256,4

Chk2 T68 Proteina serina cinasa “Checkpoint” 2 6002,0

IR/IGF1R (INSR) Y1189/1190 Receptor de insulina/receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 3420,7

Met Y1230+Y123 4+Y1235 Receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) 2459,8

CDK1/2 Y15 Proteina serina cinasa 1/2 dependiente de ciclina 4737,5

Lck Y191 Proteina tirosina cinasa espedfica de linfocitos 2272,8

Shc1 Y239 Proteina 1 transformante que contiene el dominio SH2 2557,0

GSK3a Y279/Y216 Sintasa de glucogeno-serina cinasa 3 alfa 4249,1

Src Y529 Proteina tirosina cinasa codificada por el protooncogen Src 3564,0

Kit Y703 Receptor de tirosina cinasa de kit/factor Steel 1653,3

IR (INSR) Y972 Receptor de insulina 2594,7

*) de acuerdo con la invencion

Tabla 3.1. Kinex® - Ejemplos de deteccion redundante y no redundante de sitios de fosforilacion del receptor (EGFR) en MVs liberadas por celulas de cancer (U373) (todos los ejemplos son de acuerdo con la invencion).

5

10

15

20

25

Nombre de la proteina diana

Sitio de fosforilacion (humano) Nombre de la proteina diana completa NNMS

EGFR

T693 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 4807,0

EGFR

Y1110 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 3966,1

EGFR

Y1110 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 3806,9

EGFR

Y1197 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 3521,4

EGFR

Y1197 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 1971,5

EGFR

T678 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 4535,8

EGFR

T678 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 4001,3

EGFR

T693 receptor de tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico 5929,1

Estos resultados indican el espectro de tipos de moleculas que se pueden encontrar en las MVs en forma fosforilada. Si bien este es un ensayo in vitro, se observa que el espectro de cambios relacionados con oncogenes en las MVs (algunos de los cuales pueden estar asociados con MVs pero no ser necesariamente oncogenicos) es inesperadamente grande.

Los resultados tambien muestran que no solo se puede determinar la fosforilacion-desfosforilacion, sino que tambien se puede supervisar el estado de distintos sitios de fosforilacion (por ejemplo, Y1068 o Y1110 del EGFR), que son responsables de diferentes funciones de la molecula (interacciones con diferentes dianas, reciclado, etc.). Esta informacion es facilmente asequible a partir del analisis de las MVs, aunque sena dificil y tal vez no sea posible, obtener esta informacion usando un analisis comparable de muestras tumorales.

Ejemplo 6

Determinacion de perfiles de fosfoprotemas de MVs circulantes en ratones con xenoinjertos de tumores humanos

A continuacion, los perfiles de fosfoprotemas humanas de MVs que circulan en la sangre de ratones que albergaban xenoinjertos de tumores humanos, se analizaron in vivo (Tabla 4; Figura 12). Los xenoinjertos de las lmeas celulares de cancer humano indicadas, se generaron en ratones SCID mediante una inoculacion subcutanea de celulas. Se permitio que se formaran los tumores. Cuando los tumores alcanzaron el punto final de 17 mm de diametro, se sacrificaron los ratones y las MVs se aislaron a partir de plasma agrupado de ratones portadores de 4-5 tumores. El material lisado de protemas se genero y se empleo para rastrear la matriz de anticuerpos anti-fosfoprotemas de RTKs humanos de R&D Systems.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 4 a continuacion y un ejemplo del ensayo con RTKs para MVs circulantes procedentes de ratones con un xenoinjerto A431, se muestra en la Fig. 12. Los resultados muestran que multiples RTKs fosforilados estan contenidos en MVs circulantes en ratones que albergan xenoinjertos de tumores, representativos de varios tipos de tumores humanos, tales como tumores de mama, colon, pancreas, prostata, pulmon, piel y cerebro, y que estos RTKs fosforilados se pueden detectar facilmente en las MVs.

Tabla 4. Perfiles de fosfoprotemas de MVs que circulan en la sangre de ratones que son portadores de xenoinjertos de tumores humanos.

Lmea celular

Tipo de tumor Fosfoprotemas detectables

U373vIII

glioblastoma EGFR, ErbB3, ErbB4, FGFR1, FGFR4, InsulinR IGF-1R Dtk, Mer, MSPR, c-Ret ROR1, ROR2, Tie-1, Tie-2, TrkA, TrkB, VEGFR1, VEGFR3, EphA 1, EphA7, EpHB2, EphB4

U87

glioblastoma EGFR, ErbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR2a, InsulinR, IGF-1R, Dtk, Mer, MSPR. PDGFRb, SCFR, c-Ret, Tie-2, TrkA, TrkB, TrkC, VEGFRVEGFR2 VEGFR3, EphA7, EphB1, EphB2, EphB4, EphB6

Lmea celular

Tipo de tumor Fosfoprotemas detectables

U87vIII

glioblastoma EGFR, ErbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR2a, Dtk, Mer, MSPR, c-Ret, ROR1, ROR2, Tie- 1, Tie-2, TrkA, TrkB, TrkC, VEGFR3, EphA6, EphA7, EphB1, EphB2

A549

cancer de pulmon EGFR, ErbB2, InsulinR, IGF-1R, Dtk, Mer, MSPR, c-Ret, ROR1, Tie-2, TrkA, EphA4, EphA7, EphB2,

A431

carcinoma de celulas escamosas EGFR, ErbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR2a, FGFR3 InsulinR, Dtk, Mer, MSPR, c-Ret, ROR1, ROR2, Tie-1, TrkC, EphA1,

MDA-MB- 231

cancer de mama EGFR, ErbB2, InsulinR. IGF-1R, Dtk, Mer, MSPR, c-Ret, ROR1, Tie-1, Tie-2, TrkB, EphA1, EphA7, EphB2

PC-3

cancer de prostata EGFR, ErbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR3, IGF-IR, Dtk, Mer, MSPR, PDGFRb, ROR1,ROR2, Tie-1 Tie-2, TrkA, TrkB, TrkC, VEGFR1, EphB4

PANC-1

cancer de pancreas EGFR, ErbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR2a, InsulinR, IGF-1R, Ax1, Dtk, Mer: HGFR, MSPR, PDGFRa, SCFR, Flt-3 M-CSFR, c-Ret ROR1, ROR2, Tie-1, Tie-2, TrkA. TrkC, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, MuSK, EphA1, EphA4, EphA6, EphA7, EphB2, EphB4, EphB6

DLD-1

cancer de colon EGFR, InsulinR, IGF-1R, Axl. Dtk, MSPR c-Ret, ROR1, ROR2, Tie-1, Tie-2, TrkC, EphA7, EphB2

HCT116

cancer de colon EGFR, ErbB2, ErbB4, FGFR1, FGFR4, InsulinR, IGF-IR, Dtk, Mer MSPR, PDGFRb, M-CSFR, c-Ret ROR1, ROR2 Tie-1, Tie-2, TrkA. TrkB, TrkC, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, MuSK, EPhA4, EphA6, EphA7, EphB1, EphB2, EphB4, EphB6

CaCo2

cancer de colon EGFR, ErbB2. InsulinR, IGF-1R, Dtk, Mer, MSPR, c-Ret ROR1, Tie-1, TrkB, TrkC, EphA1, EphA7, EphB2

Ejemplo 7

Demostracion de que el estado de fosforilacion de RTKs asociados con MVs es sensible a una terapia dirigida

Con el fin de determinar si las MVs se pueden utilizar como biomarcadores para supervisar la respuesta frente a 5 agentes terapeuticos in vivo, se trataron ratones portadores de tumores subcutaneos dirigidos por EGFR con el inhibidor de EGFR, CI-1033 (Fig. 13). Despues de 7 dfas de tratamiento con 20 mg/kg de CI-1033 administrado por v^a intraperitoneal, el tamano del tumor se midio en los ratones (Fig. 13A) y un analisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-fosfo-EGFR se utilizo para determinar el estado de fosforilacion de EGFR en las MVs que circulaban en los ratones (Fig. 13B, con MVs procedentes de ratones portadores de tumores subcutaneos A431 que 10 se muestran en la parte superior y MVs de ratones portadores de tumores U373vIII mostrados en la parte inferior). Tanto los tumores A431 como los U373vIII eran sensibles a una exposicion a una dosificacion diaria de CI-1033. Ademas, habfa una presencia disminuida de EGFR humano fosforilado en las MVs que circulaban en la sangre de ratones portadores de tumores subcutaneos dirigidos por EGFR y tratados con el inhibidor de EGFR, CI-1033, como se observo mediante un analisis Western. El grado de inhibicion de EGFR era menor en el caso del receptor 15 mutante EGFRvIII (U373vIII), en comparacion con EGFR de tipo silvestre (celulas A431) y esto se refleja en efectos antitumorales distintos.

Nuestros resultados demuestran que el estado de fosforilacion de los RTKs activos, asociados con MVs, que son oncogenicos, es sensible a una terapia dirigida sistemica, dirigida a estos receptores y que el estado de estas dianas oncogenicas se puede verificar usando un analisis de sangre basado en el aislamiento de MVs y el analisis de su 20 contenido. Estos hallazgos indican que las MVs circulantes se pueden utilizar como biomarcadores para supervisar la respuesta frente a agentes terapeuticas dirigidos contra oncogenes in vivo.

Claims (6)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para supervisar la progresion de un cancer o la eficacia terapeutica de un tratamiento contra el cancer en un sujeto, que comprende:

   a) aislar microvesmulas a partir de una primera muestra de fluido corporal que se ha recogido a partir de un sujeto que tiene cancer en un primer punto de tiempo y supervisar el estado de uno o varios sitios de fosforilacion distintos de una protema oncogenica o relacionada con el tumor en las microvesmulas obtenidas a partir de la primera muestra de fluido corporal; y

   b) aislar las microvesmulas a partir de una segunda muestra de fluido corporal que se ha recogido a partir del sujeto que tiene cancer en un segundo punto de tiempo, en donde el segundo punto de tiempo se produce despues del primer punto de tiempo, y supervisar el estado de uno o varios sitios de fosforilacion distintos de la protema oncogenica o la protema relacionada con el tumor en las microvesmulas obtenidas a partir de la segunda muestra de fluido corporal;

   en donde un cambio en el estado de dicho uno o varios sitios de fosforilacion distintos de la protema oncogenica o relacionada con el tumor en las microvesmulas obtenidas a partir de la segunda muestra de fluido corporal, en comparacion con las microvesmulas obtenidas a partir de la primera muestra de fluido corporal, indica progresion o regresion del cancer, o indica una eficacia terapeutica o ineficacia del tratamiento contra el cancer, cuando el primer punto de tiempo se produce antes de que el sujeto haya recibido un tratamiento contra el cancer y el segundo punto de tiempo se produce despues de que el sujeto haya recibido el tratamiento contra el cancer; y en donde una regresion del cancer o una eficacia terapeutica del tratamiento contra el cancer se indica por un aumento de la forma no activa de la protema oncogenica o relacionada con el tumor, y una progresion del cancer o una ineficacia del tratamiento contra el cancer se indica por un incremento en la forma activada de la protema oncogenica o relacionada con el tumor, tal y como se determina por el estado de dicho uno o varios sitios de fosforilacion distintos detectados en las microvesmulas, en donde la protema oncogenica o relacionada con el tumor es EGFR y el uno o varios sitios de fosforilacion distintos se seleccionan a partir del grupo que consiste en T693, Y1110, Y1197, T678 e Y1068.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que al menos dos protemas oncogenicas o relacionadas con el tumor se detectan en las microvesmulas.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la presencia de la protema oncogenica o relacionada con el tumor en las microvesmulas se detecta o se mide mediante inmunotransferencia, inmunoprecipitacion, ELISA, RIA, citometna de flujo, microscopfa electronica o espectrometna de masas.
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho cancer se selecciona a partir del grupo que consiste en cancer de mama, glioma, cancer de intestino grueso, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de estomago, cancer de tugado, cancer hematologico, cancer de hueso, cancer pancreatico, cancer de piel, cancer de cabeza o cuello, melanoma cutaneo o intraocular, sarcoma uterino, cancer de ovario, cancer rectal o colorrectal, cancer anal, cancer de colon, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), carcinoma de trompas de Falopio, carcinoma endometrial, cancer cervical, cancer de vulva, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma vaginal, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, cancer de esofago, cancer de intestino delgado, cancer endocrino, cancer de tiroides, cancer de paratiroides, cancer adrenal, tumor del tejido blando, cancer de uretra, cancer de pene, cancer de prostata, leucemia cronica o aguda, linfoma linfocftico, cancer de vejiga, cancer de rinon, cancer de ureter, carcinoma de celulas renales, carcinoma de la pelvis renal, tumor del SNC, astrocitoma, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, linfoma del SNC primario, tumor de la medula osea, gliomas del nervio tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, melanoma uveal, cancer testicular, cancer oral, cancer farmgeo, neoplasias pediatricas, leucemia, neuroblastoma, retinoblastoma, glioma pediatrico, meduloblastoma, tumor de Wilms, osteosarcoma, teratoma, rabdomioblastoma y sarcoma.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el fluido corporal es sangre.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el fluido corporal se selecciona a partir del grupo que consiste en sangre, linfa, orina, fluido cerebroespinal, ascitis, saliva, lavado, semen, secreciones glandulares, exudado y contenidos de quistes y heces.