ES2937862T3 - Predicción de respondedores a terapia con ciclofosfamida - Google Patents

Abstract

La presente descripción se basa en la detección de la expresión del receptor 4 de quimioquinas CC (CCR4) en células T efectoras para predecir de forma diagnóstica o profiláctica sujetos, en particular aquellos con cáncer ginecológico que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Predicción de respondedores a terapia con ciclofosfamida

Campo de la divulgación

La presente divulgación se basa en la detección de la expresión del receptor 4 de quimioquinas CC (CCR4) en células T efectoras para predecir de forma diagnóstica o profiláctica sujetos, en particular aquellos con cáncer ginecológico que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida.

Antecedentes

Los cánceres ginecológicos son cánceres del aparato reproductor femenino e incluyen cánceres de cuello uterino, vaginal, de vulva, útero y ovario. A nivel mundial, estos cánceres representan más del 15 % de todas las incidencias de cáncer en mujeres con más de 1 millón de casos diagnosticados anualmente (Bray F et al., (2013) 1 ;132(5):1133-45). La tasa de mortalidad anual es de poco menos de 500.000, lo que contribuye al 14 % de todas las muertes relacionadas con el cáncer reportadas en mujeres. Los cánceres de útero, cuello uterino y de ovario son los más frecuentes de los cánceres ginecológicos, mientras que los cánceres de vagina y vulva son raros y contribuyen a menos del 0.6 % de la incidencia anual de cáncer en las mujeres.

Los patrones de prevalencia en Australia difieren de las tendencias mundiales, que están impulsadas por una alta prevalencia de cáncer de cuello uterino en los países en desarrollo. En promedio, a 12 mujeres australianas se les diagnostican cánceres ginecológicos diariamente, lo que da una incidencia anual total de más de 4500 casos y contribuye a poco menos del 10 % de todos los casos de cáncer reportados en mujeres (Report to the nationgynaecological cancer 2012. In: Australia C, editor. Surry Hills, NSW2012). Los cánceres de útero y de ovario son de gran preocupación para la salud pública en Australia porque los cánceres de útero son los más prevalentes y representan el 44 % de los casos de cáncer ginecológico. Si bien los cánceres de ovario representan el 28 % de los casos, contribuyen a más de la mitad de las muertes por cánceres ginecológicos.

Las muertes prematuras provocadas por cánceres ginecológicos tienen un efecto negativo sobre la economía. Los cánceres ginecológicos representaron más del 8 % de toda la carga de morbilidad por cáncer en las mujeres, con más de 22.000 años de vida ajustados por discapacidad (DALY) en 2012. En el año fiscal 2004-2005, las hospitalizaciones por cáncer ginecológico le costaron a la nación 63 millones de dólares australianos, con la mayor parte del dinero gastado en cáncer de ovario (AUD $ 25 millones), útero (AUD $ 22 millones) y cuello uterino (AUD $ 11 millones).

La mayoría de los cánceres de ovario y de útero se producen debido a mutaciones somáticas esporádicas, mientras que el 5 % de los cánceres de ovario y el 10 % de los cánceres de útero tienen una base hereditaria (Whang JD et al., (1997) Oct; 12(5): 383-9)). El papel de las mutaciones genéticas específicas en la tumorigénesis aún no está claro en gran medida, sin embargo, existen varias aberraciones genéticas en los genes supresores de tumores y oncogenes que se han asociado comúnmente con la aparición de la enfermedad. La mutación somática más común que da lugar al cáncer de ovario esporádico se encuentra en el gen p53. Las mutaciones en p53 también se observan con frecuencia en los cánceres de útero.

El cáncer de ovario (OC) es la quinta causa más común de muerte por cáncer en mujeres. Actualmente, más de la mitad de estas mujeres mueren dentro de los cinco años posteriores al diagnóstico (Luvero D et al., (2014) Therapeutic Advances in Medical Oncology 6:229-239). Hay varias formas de cáncer de ovario que incluyen el cáncer epitelial, el cáncer de línea germinal de los ovarios y el cáncer del estroma de ovario. El cáncer de ovario epitelial representa la forma más común de la enfermedad.

El cáncer de ovario es una enfermedad que afecta principalmente a mujeres posmenopáusicas con una mediana de edad para el diagnóstico de 63 años. Sin embargo, la enfermedad puede afectar a mujeres de todas las edades.

La clasificación del estadio del cáncer de ovario se basa en el grado de localización frente a la propagación de la enfermedad más allá de los ovarios. El cáncer de ovario en etapa 1 se limita a uno o ambos ovarios. La enfermedad en etapa 2 involucra un tumor en uno o ambos ovarios con extensión pélvica. La enfermedad en etapa 3 involucra un tumor en uno o ambos ovarios con metástasis peritoneal microscópicamente confirmada fuera de la pelvis y/o metástasis en los ganglios linfáticos regionales. El cáncer de ovario en etapa 4 se caracteriza por metástasis a distancia más allá de la cavidad peritoneal. Los cánceres de ovario tienden a diagnosticarse en etapas avanzadas y esto se debe a la ubicación topográfica de la lesión primaria. Los síntomas solo se manifiestan una vez que los tumores se han desarrollado lo suficiente como para causar molestias físicas. Incluso entonces, los síntomas (que incluyen dolor abdominal o pélvico, micción frecuente y vómitos) son vagos y, a menudo, pueden confundirse con otras enfermedades como gastritis, síndrome del intestino irritable o infecciones urinarias. Por el contrario, los cánceres uterinos se diagnostican antes como resultado de un sangrado vaginal anormal que a menudo se observa en las pacientes que se presentan. En el momento de la presentación, los pacientes son diagnosticados a través de análisis histológicos de biopsias de tejido y la enfermedad se clasifica según el grado de propagación y la afectación de órganos.

El cáncer de ovario se propaga a través del desprendimiento local desde el epitelio de ovario hacia la cavidad peritoneal seguido de la implantación en el peritoneo y la invasión local del intestino y la vejiga. La presencia de afectación de los ganglios linfáticos en el cáncer de ovario es evidente en todas las etapas del cáncer de ovario diagnosticado.

La supervivencia de pacientes con cáncer de ovario es una función del estadio donde se diagnostica la enfermedad, disminuyendo la supervivencia a 5 años con la enfermedad avanzada.

El cáncer de ovario a menudo se detecta con la presentación de síntomas clínicos manifiestos, más notablemente la presentación de dolor abdominal, una masa anexial, distensión abdominal y urgencia urinaria. La detección del cáncer de ovario en una etapa temprana (es decir, la etapa 1) da como resultado una tasa de curación de aproximadamente el 90 % con cirugía estándar y quimioterapia.

Los métodos de detección actuales para detectar el cáncer de ovario en una etapa temprana son insuficientes. La práctica actual para la detección del cáncer de ovario emplea el uso de CA125 y ultrasonido transvaginal (ecografía). El aumento de los niveles séricos de CA125 está asociado con el cáncer de ovario y la utilización posterior de ultrasonidos transvaginales ayuda a detectar la presencia de cáncer de ovario. La confirmación de la enfermedad ovárica se basa en procedimientos invasivos como la laparotomía. Sin embargo, el uso de CA125 es ineficaz para la detección en la población en general debido a problemas de sensibilidad limitada, especificidad limitada y un valor predictivo positivo bajo de < 3 % (Bast (2003) J. Clin Oncol. 21(10 Suppl):200-205).

El tratamiento de primera línea de los cánceres ginecológicos tal como el cáncer de ovario implica la cirugía de reducción de volumen para eliminar toda la enfermedad macroscópica dejando menos de 2 cm de enfermedad residual. La cirugía puede incluir laparoscópica o histerectomía total, salpingooforectomía bilateral y linfadenectomía según la propagación de la enfermedad. Dependiendo de la etapa de la enfermedad, después de la cirugía, también se puede recomendar radioterapia o quimioterapia adyuvante con carboplatino y epirrubicina para pacientes con cáncer de útero o carboplatina y paclitaxel para cáncer de ovario. En algunos casos, los pacientes no son aptos para la cirugía debido a la presencia de comorbilidades médicas o al grado de propagación de la enfermedad. Estas pacientes se someten a radioterapia primaria para el cáncer de útero o quimioterapia para el cáncer de ovario.

Aunque el tratamiento primario de los cánceres ginecológicos es relativamente exitoso, a menudo se produce la recurrencia de la enfermedad. La terapia de segunda línea para la enfermedad recurrente consiste en radioterapia, terapia hormonal o quimioterapia. La quimioterapia estándar para el cáncer de útero y de ovario consiste en cisplatino y carboplatino a base de platino, respectivamente, y las tasas de respuesta rondan el 20 % (Fung-Kee-Fung M et al., (2007) Current oncology Oct;14(5):195-208). Las opciones de tratamiento posteriores para pacientes con enfermedad recurrente se basan en la clasificación de la enfermedad. Si la recurrencia de la enfermedad ocurre menos de 6 meses después del último ciclo de tratamiento basado en platino, la enfermedad se considera resistente al platino, mientras que la enfermedad sensible al platino recurre más de 6 meses después del tratamiento. Para el tratamiento de la enfermedad resistente al platino, se usan estrategias alternativas de quimioterapia que incluyen el tratamiento con texanos (doxetaxel y paclitaxel), antraciclinas (doxorrubicina y doxorrubicina liposomal), oxazafosforinas (ciclofosfamida e ifosfamida), gemcitabina, etopósido y topotecan, cada una con tasas de respuesta relativamente comparables de entre el 12 y el 30 % (Handolias D et al., (2013) Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology 2013 May 29).

Hay dos tipos de criterios utilizados para evaluar la respuesta del paciente al tratamiento, los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) o los criterios de respuesta CA125 del intergrupo de cáncer ginecológico (GCIG). Los criterios RECIST utilizan tomografía computarizada (TC) o imágenes por resonancia magnética (IRM) para medir el diámetro más grande del tumor objetivo o cualquier aparición de novo de nuevas lesiones y el GCIC mide los niveles séricos de CA125. Utilizando una combinación de ambos criterios, las respuestas de los pacientes pueden clasificarse en respuesta completa (RC), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD) y enfermedad progresiva (PD) (Rustin GJ et al., (2011) International journal of gynaecological cancer society Feb; 21(2):419-23).

La ciclofosfamida en dosis bajas se usa a menudo para tratar cánceres en etapa avanzada y/o recurrentes tales como cáncer de ovario recurrente (Handolias et al. (2013) Asia Pac J Clin Oncol 12(1): e154-e160). Sin embargo, la ciclofosfamida en dosis bajas da como resultado un beneficio clínico para solo el 25-44 % de las mujeres con cáncer de ovario recurrente (Liu et al. (2010) J Immunother 33:53-59; Ghiringhelli et al. (2007) Cancer Immunol Immunother 56(5):641-8). Madondo et al. ((2015) Cancer treatment reviews 42:3-9) identificaron que la ciclofosfamida aumenta la población de células Th17 productoras de IL-17 y asociaron la presencia de células Th17 en tumores de ovario con una mejor supervivencia de las pacientes.

Actualmente no se sabe quién responderá a qué fármaco, y cuando se descubre que un fármaco en particular no está funcionando, el tratamiento adicional puede ser ineficaz. Por lo tanto, sería beneficioso poder predecir sujetos que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida, ya sea antes de que comience la terapia o dentro del primer ciclo de tratamiento. Esto permitiría administrar dosis bajas de ciclofosfamida a sujetos que responderán al tratamiento antes en el régimen de tratamiento y los sujetos que se prevé que no responderán al tratamiento para pasar a otros protocolos de tratamiento.

En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de métodos que puedan predecir sujetos que responderán al tratamiento quimioterapéutico. En particular, existe la necesidad de métodos de pronóstico que detecten de forma fiable a los sujetos que se beneficiarán del tratamiento con quimioterapia.

El resumen de la divulgación

La presente divulgación se basa en métodos de diagnóstico y pronóstico para predecir o identificar sujetos que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida (o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma). En particular, la presente divulgación se basa en el hallazgo sorprendente de que la expresión del receptor 4 de quimioquinas CC (CCR4) en células T efectoras (Teff) de un sujeto con cáncer ginecológico puede identificar selectivamente sujetos que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida.

Sin desear limitarse a la teoría, los inventores han demostrado que el tratamiento con ciclofosfamida enriquece el entorno del cáncer de ovario en células T efectoras CD4 y CD8 de manera que su actividad puede mejorarse localmente en el sitio del tumor, por ejemplo, mediante el uso de inhibidores de puntos de control.

La presente divulgación proporciona métodos de diagnóstico y pronóstico para identificar un subconjunto de los denominados pacientes respondedores (es decir, pacientes que responderán a la ciclofosfamida). Los métodos se basan en el hallazgo de que la regulación en aumento de CCR4 en las células T CD4 y CD8 efectoras se asocia con mejores resultados de supervivencia en sujetos con cáncer ginecológico, por ejemplo, cáncer de ovario.

Los métodos de diagnóstico (denominados en el presente documento pretratamiento de regulación en aumento de CCR4 (diagnóstico CUP)) pueden usarse para identificar a los pacientes respondedores temprano después de recibir ciclofosfamida en dosis bajas (LDCy). Los métodos de pronóstico (denominados aquí como pronóstico CUP) se pueden usar para identificar a los pacientes respondedores antes de recibir LDCy. Ambas pruebas se basan en la detección de la regulación en aumento específica de CCR4 en las células T CD4 y CD8 efectoras, pero no en las células T reguladoras (Treg). Estos métodos identifican sujetos cuyas células T efectoras beneficiosas migrarán a los tumores después del tratamiento con LDCy. Dichos sujetos pueden ser tratados con, por ejemplo, inhibidores de puntos de control que evitan que las Tregs apaguen esas células T efectoras beneficiosas dentro del entorno del tumor.

La mayoría de las células T CD8 y las células efectoras de memoria de las células T colaboradoras 1 (T^h1) CD4 normalmente no expresan CCR4. Por lo tanto, sin intervención externa, las células Treg CCR4+ supresoras se reclutan preferentemente en el microambiente tumoral, en lugar de las células T CD8 beneficiosas o las células T^h1.

En particular, el presente inventor ha encontrado que el estado de ciclofosfamida puede ser útil para identificar sujetos con cáncer que responderán al tratamiento con ciclofosfamida, incluso con un análogo o derivado de la misma.

La invención se define en su sentido más amplio por las reivindicaciones independientes adjuntas, las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes.

En detalle, la presente invención se refiere a un método para identificar a un sujeto con cáncer que responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado del mismo, comprendiendo el método detectar la expresión de CCR4 en células Teff obtenidas de un sujeto que previamente se ha administrado al menos una dosis o ciclo de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff indica que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento.

Además, la presente invención se refiere a un método para predecir si un sujeto con cáncer que no ha recibido previamente ciclofosfamida responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma, comprendiendo el método detectar la expresión de CCR4 en células Teff siguiendo en exposición in vitro de las células Teff en una muestra biológica obtenida del sujeto a ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, en la que la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff después de la exposición es indicativa de que el sujeto responderá al tratamiento. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para evaluar la eficacia del tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida de un sujeto con cáncer, comprendiendo el método detectar en una primera muestra biológica que comprende células Teff, habiendo sido obtenida previamente dicha primera muestra biológica del sujeto en un primer punto de tiempo, el nivel de expresión de CCR4, repitiendo este análisis con una segunda muestra biológica que comprende células Teff, habiéndose obtenido previamente dicha segunda muestra biológica del sujeto en un punto de tiempo posterior, y comparando el nivel de expresión de CCR4 en los dos puntos de tiempo donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff en la segunda muestra en comparación con la primera es indicativa de un tratamiento clínicamente eficaz, donde el primer punto de tiempo fue antes o después de que el sujeto recibiera al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado del mismo y el punto de tiempo posterior fue después de que el sujeto recibió una o más dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado del mismo.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un complejo que comprende células Teff y un resto de unión a CCR4 unido a ellas en un método in vitro para identificar o predecir un sujeto que responderá a dosis bajas de ciclofosfamida en los métodos de la invención detallada arriba.

La presente divulgación proporciona un método para identificar a un sujeto con cáncer que responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma, comprendiendo el método detectar la expresión de CCR4 en células Teff del sujeto después de la administración de al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff indica que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento.

En ciertos ejemplos, el sujeto se ha sometido al menos a un ciclo de tratamiento con ciclofosfamida.

En un ejemplo, el sujeto tiene un cáncer ginecológico. En otro ejemplo, el sujeto tiene cáncer de ovario.

En un ejemplo, el método identifica a un sujeto que responderá a un tratamiento adicional con dosis bajas de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma. En un ejemplo, el método identifica a un sujeto que responderá a una o más dosis adicionales de ciclofosfamida en dosis bajas.

En un ejemplo, el método comprende detectar la expresión de CCR4 en células Teff y T supresoras (Tsupp), donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en Teff pero no en Tsupp identifica a un sujeto que responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo, o derivado del mismo.

En un ejemplo, las células Teff son células T colaboradoras y/o células T citotóxicas. En otro ejemplo, las células Teff son células T CD4+ y CD8+. En otro ejemplo más, las células Teff son células T CD4+CD25-. En otro ejemplo más, las células Teff son células T FoxP3-CD25-CD4+ (Tconv) y CD8+. En otro ejemplo más, las células Teff son células T CD8+.

En un ejemplo, las células Tsupp son células T reguladoras (Tregs).

En un ejemplo, el método comprende detectar la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff y T supp de un sujeto al que se le había administrado previamente una dosis más de ciclofosfamida en dosis bajas. En un ejemplo, las células Teff y las células Treg son células T CD3+. En un ejemplo, las células T colaboradoras comprenden una o más de las siguientes células T^h1, células T^h2, células T^h9, células T^h17, células T^h22 y células TFH.

En un ejemplo, las células CD8+ también son CD69+.

En un ejemplo, el método comprende detectar la expresión de CCR4 en células Teff en una muestra biológica obtenida del sujeto.

En otro ejemplo, la detección comprende:

(i) poner en contacto las células Teff en una muestra biológica obtenida del sujeto con un agente que se une a CCR4 en la superficie de las células Teff; y

(ii) medir el nivel de expresión de CCR4 en las células,

donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff es indicativa de que el sujeto responderá clínicamente a un tratamiento in vivo adicional con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

En un ejemplo, el método comprende además aislar o purificar células Teff de la muestra biológica.

En otro ejemplo, el método comprende comparar el nivel de expresión de CCR4 medido según la etapa (ii) con el nivel de expresión de CCR4 en células Teff del pretratamiento del sujeto con ciclofosfamida. Esto puede proporcionar información sobre la expresión de CCR4 de referencia de las células Teff.

En un ejemplo, el método comprende además obtener una muestra biológica del sujeto que comprende células Teff. Los métodos para obtener una muestra biológica serán familiares para los expertos en la materia. Por ejemplo, una muestra biológica es una muestra de sangre.

La muestra biológica que contiene células Teff se puede obtener del sujeto en un momento adecuado después de al menos una dosis de ciclofosfamida. Por ejemplo, la muestra biológica se obtendrá en un momento en que la ciclofosfamida haya tenido tiempo suficiente para ejercer un efecto sobre el sistema inmunitario del sujeto, en particular las células Teff del sujeto. En otro ejemplo, la muestra biológica se obtiene después de dejar suficiente tiempo para que se detecte cualquier regulación en aumento en la expresión de CCR4 en células Teff. Por ejemplo, la muestra biológica se puede obtener del sujeto días o semanas después de una dosis baja de ciclofosfamida. Por ejemplo, la muestra biológica se puede obtener del sujeto después de al menos siete, catorce, dieciocho, veinte o veintiocho días después de la primera dosis de ciclofosfamida. La muestra biológica puede obtenerse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la primera dosis de ciclofosfamida.

En otro ejemplo, el método comprende además tratar al sujeto con ciclofosfamida en dosis bajas si se identifica que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida.

Los métodos de la presente divulgación también se pueden usar para identificar profilácticamente sujetos que responderán clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado del mismo, dichos sujetos que no hayan recibido ciclosfosfamida previamente.

En otro aspecto, la presente divulgación también proporciona un método para predecir si un sujeto con cáncer que no ha recibido previamente ciclofosfamida responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma, comprendiendo el método detectar la expresión de CCR4 en células Teff después de la exposición in vitro de las células Teff presentes en una muestra biológica obtenida del sujeto a ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff después de la exposición es indicativa de que el sujeto responderá al tratamiento. En un ejemplo, el método comprende además detectar la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff.

En un ejemplo, el sujeto tiene un cáncer ginecológico. El cáncer ginecológico puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de útero, endometrio, ovario, cuello uterino, vulva o vagina. En un ejemplo particular, el sujeto tiene cáncer de ovario.

En un ejemplo, el método identifica a un sujeto que responderá clínicamente al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

En otro ejemplo, el sujeto es uno que ha recibido previamente tratamiento con uno o más de una antraciclina, un antimetabolito, un taxano o una terapia dirigida. Por ejemplo, el sujeto es uno que ha recibido tratamiento con uno o más de los siguientes agentes, incluidos epirrubicina, doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, 5-fluorouracilo, capecitabina, gemcitabina, vinorelbina, trastuzumab, lapatinib y bevacizumab.

En un ejemplo, el sujeto es refractario a un agente de quimioterapia que no es ciclofosfamida, p.ej., un agente de platino.

En un ejemplo, el método comprende detectar la expresión de CCR4 en células Teff y células T supresoras (Tsupp), donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en Teff, pero no en Tsupp identifica a un sujeto que responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo, o derivado del mismo.

En un ejemplo, las células Teff son células T colaboradoras y/o células T citotóxicas. En otro ejemplo, las células Teff son células T CD4+ y CD8+. En otro ejemplo más, las células Teff son células T CD4+CD25-. En otro ejemplo más, las células Teff son células T FoxP3-CD25-CD4+ (Tconv) y CD8+. En otro ejemplo más, las células Teff son células T CD8+. En un ejemplo, las células T CD8+ también son CD69+.

En un ejemplo, las células Tsupp son células T reguladoras (Tregs).

En un ejemplo, las células Teff y/o Tsupp están presentes dentro de una muestra biológica obtenida del sujeto.

En un ejemplo, la detección de la expresión comprende:

(i) exponer la muestra biológica a ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma in vitro;

(ii) poner en contacto las células Teff en una muestra biológica del sujeto con un agente que se une a CCR4 en la superficie de las células Teff; y

(iii) medir el nivel de expresión de CCR4 en las células,

donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff es indicativa de que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

En otro ejemplo, la exposición in vitro a ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma es durante un período de al menos 24 horas, al menos 48 o al menos 72 horas. En un ejemplo, la exposición in vitro es por un período de aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días o aproximadamente 3 días o más de 3 días.

En otro ejemplo, la muestra biológica se expone a mafosfamida, ifosfamida o trofosfamida in vitro. En un ejemplo particular, la muestra biológica se expone a mafosfamida in vitro.

En un ejemplo, el método comprende aislar o purificar células Teff de la muestra biológica.

En otro ejemplo, el método comprende comparar el nivel de expresión de CCR4 medido según la etapa (iii) con el nivel de expresión de CCR4 en células Teff del sujeto preexpuesto a ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

En otro ejemplo, el método comprende comparar el nivel de expresión de CCR4 determinado en la etapa (iii) con el nivel de expresión de CCR4 en células Teff de sujetos de control. En un ejemplo, sujeto(s) de control se refiere a la expresión promedio de CCR4 en células Teff obtenidas de una población agrupada de sujetos con cáncer ginecológico, más preferiblemente cáncer de ovario. En otro ejemplo, los sujetos de control son sujetos sin experiencia previa en quimioterapia.

En otro ejemplo, el método comprende además tratar al sujeto con una dosis baja de ciclofosfamida si se predice que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida.

Los métodos de la presente divulgación se pueden usar para identificar o predecir sujetos que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida. En un ejemplo, el sujeto tiene un cáncer que puede tratarse con ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma. En otro ejemplo, el sujeto tiene un cáncer que secreta la quimioquina 22 del motivo C-C (CCL22).

Por ejemplo, el cáncer del sujeto puede seleccionarse del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia mielocítica aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda (LLA), linfoma de células T (micosis fungoide), mieloma múltiple, neuroblastoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing; cáncer de mama, testicular, endometrial, ovárico, otros cánceres ginecológicos, incluido el cáncer de útero, cuello uterino, vulva o vagina, y cáncer de pulmón o una combinación de cualquiera de estos.

En un ejemplo particular, el sujeto tiene cáncer de ovario.

En algunos ejemplos, el sujeto tiene cáncer en etapa temprana. En algunos ejemplos, el sujeto tiene cáncer refractario al tratamiento avanzado.

El sujeto según la presente divulgación puede ser un hombre o una mujer humanos. En un ejemplo, el sujeto es un sujeto humano adulto (por ejemplo, un sujeto de 18 años o más).

Los métodos descritos en el presente documento identifican o predicen preferentemente sujetos que responderán al tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma. La duración del tratamiento normalmente será determinada por el médico tratante.

El término “ciclofosfamida en dosis bajas” es una dosificación que el médico tratante entenderá. En un ejemplo, ciclofosfamida en dosis bajas se refiere a las dosis descritas en los ejemplos del presente documento. Sin desear limitarse a la teoría, se entiende que la ciclofosfamida en dosis bajas se refiere a una dosis de quimioterapia que proporciona un beneficio clínico al sujeto mientras evita algunos o todos los efectos secundarios de ese agente cuando se administra a una dosis tóxicamente alta. En un ejemplo, la ciclofosfamida de dosis baja se refiere a una dosis de entre 25 y 50 mg administrada por vía oral dos veces al día.

En ejemplos adicionales según los métodos descritos en el presente documento, se detecta una regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff en una muestra biológica que comprende dichas células. La muestra biológica es preferiblemente cualquier muestra en la que residen las células T efectoras, incluyendo, pero sin limitarse a, médula ósea, bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, tejido linfoide asociado a la mucosa, tejido linfoide asociado al intestino o sangre. En otro ejemplo, la muestra biológica es una muestra de sangre, tal como una muestra de sangre entera o de suero. En otro ejemplo, la muestra biológica comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

En otro ejemplo, la muestra biológica es ascitis. En otro ejemplo, la muestra son linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) del órgano afectado por el cáncer. En algunos ejemplos, la muestra biológica se trata previamente para eliminar los glóbulos rojos. Si la muestra biológica es un órgano, se puede preparar una biopsia de bazo o una suspensión celular a partir del tejido mediante el uso de medios mecánicos (por ejemplo, separando el tejido con pinzas). Se pueden emplear otros medios, como la centrifugación, para concentrar las células. En otros ejemplos, la muestra se puede tratar para eliminar los componentes de la matriz extracelular y similares del tejido.

En algunos ejemplos, la muestra biológica se crioconserva y almacena para su posterior análisis. La detección de la expresión de CCR4 en células Teff se puede realizar in vivo o in vitro.

En otro ejemplo, según cualquier método descrito en el presente documento, el método comprende, además: (i) obtener una muestra biológica del sujeto, comprendiendo dicha muestra biológica células T efectoras; y

(ii) preparar una suspensión celular a partir de la muestra biológica.

En algunos ejemplos, la muestra biológica puede purificarse o enriquecerse en células de linfocitos (por ejemplo, células Teff). Por ejemplo, pueden emplearse procedimientos de clasificación (por ejemplo, FACS) para eliminar células no deseadas tales como macrófagos, células dendríticas y células B. En un ejemplo, las células se clasifican según la expresión de CD3. En otro ejemplo, las células B se clasifican negativamente en función de su expresión de marcadores de células B (por ejemplo, B220). En otro ejemplo, las células se pueden purificar utilizando perlas marcadas magnéticamente (por ejemplo, Dynabeads).

La muestra biológica puede comprender una población heterogénea de células dentro de la cual al menos una proporción de las células T son células T efectoras. Por ejemplo, la población de células puede comprender al menos el 1 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 30 % o más células T efectoras. En otro ejemplo, la muestra biológica puede comprender una población purificada o enriquecida de células T efectoras. Por ejemplo, la población de células puede comprender al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o más células T efectoras.

La detección de la expresión de CCR4 en las células se puede realizar según métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, la detección de la expresión de CCR4 en las células se realiza mediante citometría de flujo.

La medición de la regulación en aumento de la expresión de CCR4 puede ser cualitativa o cuantitativa. La diferencia en el nivel de expresión de CCR4 se puede expresar como un valor absoluto, una proporción o multiplicidad de cambio dependiendo del método utilizado.

En un ejemplo según cualquier método descrito en el presente documento, las células Teff comprenden células T CD4+ y/o CD8+. En un ejemplo, las células CD4+ son células T colaboradoras 1 (T^h1) o T^h2. En algunos ejemplos, las células comprenden células T efectoras CD4+. En algunos ejemplos, la muestra de células comprende células T efectoras CD8+. En otro ejemplo, las células comprenden células T convencionales (Tconv). En otro ejemplo, los Tconv comprenden células T c D4+ T^h1 y/o células T citotóxicas CD8+. En otro ejemplo, el Teff comprende células CD25-CD4+. En otro ejemplo, el Teff comprende células FoxP3-CD25-CD4+. En otro ejemplo, el Teff comprende células CD8+. En otro ejemplo, el Teff comprende células CD8+ CD69+. En otro ejemplo, las células Teff comprenden una combinación de células FoxP3-CD25-CD4+ y células T CD8+.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento de la expresión de CCR4 se determina cuantitativa o cualitativamente. En algunos ejemplos, la regulación en aumento de la expresión de CCR4 se determina comparando el nivel de expresión de CCR4 en células Teff del mismo sujeto antes y después del tratamiento in vivo con ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento de CCR4 se determina comparando el nivel de expresión de CCR4 en células Teff del mismo sujeto antes y después de la exposición in vitro a ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma.

En algunos ejemplos, la expresión de CCR4 en células Teff puede determinarse después de cada ciclo de tratamiento con ciclofosfamida. En otro ejemplo, la expresión de CCR4 en Teff puede determinarse en un punto o puntos de tiempo dados si el sujeto está recibiendo ciclofosfamida diaria continua. Por ejemplo, se pueden obtener del sujeto muestras biológicas que contienen células Teff cada 7 días, cada 14 días o mensualmente para monitorizar la eficacia del tratamiento con ciclofosfamida. Si el nivel de expresión de CCR4 disminuye con el tiempo, esto alertaría al médico de que el sujeto no está respondiendo y que debería investigar formas alternativas de tratamiento, incluidos, por ejemplo, agentes de quimioterapia alternativos. En consecuencia, en algunos ejemplos, el método no requiere comparación con un nivel de referencia o pretratamiento. La expresión de CCR4 en células Teff puede compararse entre ciclos de ciclofosfamida en dosis bajas o a intervalos de tiempo dados si el sujeto está recibiendo ciclofosfamida en dosis bajas continuas.

En algunos ejemplos, la muestra biológica que comprende células Teff se obtiene del sujeto en cualquier momento antes de la administración de al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, o antes de la exposición (en el caso de ensayos in vitro) de la muestra biológica a ciclofosfamida, o un análogo, o derivado del mismo, para proporcionar un pretratamiento o un nivel de referencia de CCR4 en las células Teff.

En un ejemplo, la muestra de referencia se obtiene al menos 30 días, al menos 20 días, al menos 15 días, al menos dos semanas, al menos una semana o menos de una semana antes de la administración de al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, o antes de la exposición a ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma.

Con respecto a los métodos de pronóstico descritos en el presente documento, se puede obtener una muestra biológica del sujeto en cualquier momento antes de la exposición in vitro de la muestra a la ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma. En algunos ejemplos, la muestra biológica puede obtenerse al menos dos semanas antes, una semana antes, al menos 72, 48, 24 horas o menos, antes de la exposición in vitro de la muestra a ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma. En algunos ejemplos, la muestra biológica ha sido previamente criopreservada y almacenada para su análisis en un momento conveniente.

Con respecto a los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento, los presentes métodos proporcionan la identificación de respondedores de ciclofosfamida a dosis bajas en sujetos que reciben terapia con ciclofosfamida a dosis bajas según cualquier protocolo. En algunos ejemplos, el sujeto ha recibido dos dosis, tres dosis, cuatro dosis, cinco dosis o más de ciclofosfamida antes de obtener la muestra biológica del sujeto. En un ejemplo, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que se somete a un protocolo de tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida. En un ejemplo, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que está recibiendo un ciclo de ciclofosfamida en dosis bajas. En otro ejemplo, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que está entre ciclos de tratamiento con ciclofosfamida en dosis bajas pero que ha recibido al menos una dosis de ciclofosfamida en dosis bajas.

En algunos ejemplos, la expresión de CCR4 en células Teff es regulada en aumento al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veces o más en comparación con un control adecuado, pretratamiento o nivel de referencia de expresión de CCR4.

En algunos ejemplos, se puede usar una proporción del nivel de expresión de CCR4 en células T citotóxicas y/o células T colaboradoras (es decir, células Teff) en comparación con el nivel de expresión de CCR4 en células T reguladoras para identificar o predecir un sujeto que responderá positivamente a la ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma.

En algunos ejemplos, la proporción de expresión de CCR4 en células T citotóxicas y/o células T colaboradoras (es decir, células Teff) aumenta al menos dos veces, o al menos tres veces, o al menos cuatro veces o más en relación con expresión de CCR4 en Tregs. En otro ejemplo, la expresión de CCR4 en células T CD4+ (células T convencionales; Tconv) aumenta al menos dos veces, o al menos tres veces en comparación con Tregs. En otro ejemplo, la expresión de CCR4 en células T CD8+ aumenta al menos tres veces, o al menos cuatro veces en comparación con Tregs.

En otro ejemplo, la regulación en aumento de CCR4 puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, la expresión de CCR4 puede incrementarse en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o 600 % o más en comparación con Tregs.

Los métodos descritos en este documento incluyen además la etapa de tratar al sujeto si se identifica que el sujeto responderá clínicamente a la ciclofosfamida.

Los expertos en la técnica apreciarán que hay varios protocolos diferentes disponibles para tratar a un paciente con dosis bajas de ciclofosfamida. La programación y la duración del tratamiento generalmente quedarán a discreción del médico y pueden depender de factores que incluyen la edad del sujeto y la etapa del cáncer. Por ejemplo, el sujeto puede recibir quimioterapia con ciclofosfamida en dosis bajas metronómicas. Por quimioterapia metronómica se entiende la administración repetida a una dosis baja con frecuencia y sin un largo período libre de fármaco. Por ejemplo, la ciclofosfamida se puede administrar durante tres días consecutivos, durante 14 días consecutivos o durante 30 o más días consecutivos.

En otro ejemplo, el sujeto puede recibir ciclofosfamida cíclica en dosis bajas. El sujeto puede recibir cualquier número de ciclos de tratamiento, por ejemplo, entre 2 y 10, entre 3 y 8, entre 4 y 6. Alternativamente, el sujeto puede recibir 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20 o más ciclos de tratamiento.

En otros ejemplos, el sujeto puede recibir ciclofosfamida en dosis bajas durante un período continuo de al menos 3 a 7 días seguido de un descanso de un período determinado, por ejemplo, de una a dos semanas. En un ejemplo, el sujeto puede recibir ciclofosfamida en dosis bajas en ciclos de tratamiento a intervalos quincenales. Por ejemplo, un sujeto puede recibir 3 días de ciclofosfamida diaria continua a intervalos quincenales.

La ciclofosfamida puede administrarse al sujeto por vía sistémica u oral. Las formas sistémicas de administración incluyen inyección intravenosa directa o infusión intravenosa.

En un ejemplo, el método comprende tratar al sujeto con una dosis baja de ciclofosfamida en una cantidad terapéuticamente eficaz. En otro ejemplo, la ciclofosfamida se administra en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto inmunomodulador.

El sujeto puede recibir ciclofosfamida en dosis bajas como dosis única o dosis dividida. En un ejemplo, el sujeto puede recibir una dosis de entre 50 y 300 mg de ciclofosfamida al día. En un ejemplo, la administración es de 50 mg dos veces al día (mañana y tarde) por vía oral.

La presente divulgación también proporciona un método para evaluar la eficacia del tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida de un sujeto con cáncer, comprendiendo el método detectar en una primera muestra biológica que comprende células Teff en un primer punto de tiempo, el nivel de expresión de CCR4, repitiendo este análisis con una segunda muestra biológica que comprende células Teff en un punto de tiempo posterior, y comparando el nivel de expresión de CCR4 en los dos puntos de tiempo donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff en la segunda muestra en comparación con la primera es indicativo de tratamiento clínicamente eficaz.

En un ejemplo, el primer punto de tiempo es antes o después de que el sujeto haya recibido al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma.

La presente divulgación también proporciona un método de monitorización para evaluar la regresión o progresión del cáncer de ovario en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una primera muestra biológica que comprende células Teff en un primer punto de tiempo, el nivel de expresión de CCR4, repitiendo este análisis con una segunda muestra biológica que comprende células Teff en un punto de tiempo posterior, y comparar el nivel de expresión de CCR4 en los dos puntos de tiempo donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff en la segunda muestra en comparación con la primera es indicativa de regresión de cáncer de ovarios.

En un ejemplo, el primer punto de tiempo es antes o después de que el sujeto haya recibido al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma. En un ejemplo, el primer punto de tiempo es el pretratamiento o la línea de referencia y el segundo punto de tiempo es después del tratamiento con ciclofosfamida. En otro ejemplo, tanto el primer como el segundo puntos de tiempo siguen al tratamiento con ciclofosfamida en el sujeto.

En algunos ejemplos, el nivel de expresión de CCR4 se compara con un nivel de referencia de expresión de CCR4 obtenido de sujetos sanos (no cancerosos). En otros ejemplos, la expresión de CCR4 en Teff puede medirse antes de cada ciclo de ciclofosfamida para monitorizar la respuesta de ciclofosfamida del sujeto.

En algunos ejemplos, los métodos descritos en este documento comprenden además la administración de un agente terapéutico al sujeto seleccionado del grupo que consiste en uno o más inhibidores de puntos de control, una vacuna o vacunas contra el cáncer, un anticuerpo monoclonal, un agente quimioterapéutico adicional (s), una citoquina, un virus oncolítico, terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) y un agente inmunomodulador o una combinación de cualquiera de estos. El inhibidor del punto de control puede ser uno que se dirija a PD-1 o PD-L1 (por ejemplo, inhibidor de PD-1 o PD-L1). En un ejemplo, el PD-1 o PDL-1 se selecciona del grupo que consta de pembrolizumab (keytruda), nivolumab (opdivo) y atezolizumab (Tecentriq). En un ejemplo, el inhibidor del punto de control es un agente que se dirige a CTLA-4.

En otro ejemplo, el agente quimioterapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en adriamicina, vincristina, doxorrubicina, carboplatino o metotrexato o una combinación de los mismos.

En un ejemplo, el agente inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en lenalidomida y pomalidomida o una combinación de los mismos.

Los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar en un método para tratar el cáncer en un sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgación también proporciona un método para tratar un cáncer ginecológico en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método:

(i) realizar un método descrito en el presente documento para identificar o predecir un sujeto que responderá a una dosis baja de ciclofosfamida; y

(ii) administrar más ciclofosfamida baja al sujeto si se identifica o se predice que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida en dosis bajas.

En un ejemplo, el método comprende, además:

(i) poner en contacto las células Teff en una muestra biológica obtenida del sujeto con un agente que se une a CCR4 en la superficie de las células Teff; y

(ii) medir el nivel de expresión de CCR4 en las células.

En un ejemplo, el método comprende además aislar o purificar células Teff de la muestra biológica.

La presente divulgación también proporciona un método para tratar un sujeto con cáncer de ovario con ciclofosfamida en dosis bajas, habiéndose identificado o predicho previamente que el sujeto responderá a ciclofosfamida en dosis bajas según un método descrito en el presente documento.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de ovario en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método:

(i) detectar la expresión de CCR4 en células Teff del sujeto después de la administración de al menos una dosis o ciclo de tratamiento con ciclofosfamida, o un análogo o derivado del mismo;

(ii) medir el nivel de regulación en aumento de la expresión de CCR4 de las células Teff;

(iii) administrar más ciclofosfamida baja al sujeto si el sujeto tiene una regulación en aumento de la expresión de CCR4 en sus células Teff.

La presente divulgación también proporciona un complejo que comprende células Teff y un resto de unión a CCR4 unido a ellas para uso, o cuando se usa en un método para identificar o predecir un sujeto que responderá a dosis bajas de ciclofosfamida según un método descrito en este documento.

Los métodos divulgados en el presente documento se pueden usar en combinación con otros métodos de detección para identificar sujetos con cáncer en función de la expresión de uno o más biomarcadores que se correlacionan positivamente con un cáncer dado. En un ejemplo, la muestra biológica obtenida del sujeto puede ser evaluada adicionalmente en busca de uno o más biomarcadores que se sobreexpresen en el cáncer de ovario, donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en HE4, CA125, glicodelina, MMP-7, Muc-1, PAI-1, CTHRC1, inhibina A, PLAU-R, prolactina, KLK-10, KLK-6, SLPI, alfa-1 antitripsina, Imp-2, MAL2, Cox-1, proteína quinasa C-iota, cadherina-6, ADPRT, matriptasa, receptor de folato, claudina 4, mesotelina, acuaporina 5, cofilina 1, gelsolina, clusterina, alfa tetranectina, vitronectina, PAPP-A y folistatina.

La presente divulgación también proporciona un kit que comprende reactivos para detectar la expresión de CCR4 en células Teff para uso o cuando se usa en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. En un ejemplo, el kit comprende un recipiente donde se recoge la muestra biológica y uno o más reactivos de unión que se unen a un antígeno de superficie seleccionado del grupo que consta de CD3, CD8, CD4, CD25, CCR4 y FoxP3.

Opcionalmente, cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento puede usarse junto con cualquier otro método conocido, particularmente un método conocido de diagnóstico, pronóstico, predicción y/o monitorización para el cáncer.

En algunos ejemplos, los métodos y kits de la presente divulgación permiten ventajosamente la estratificación de pacientes con cáncer. Esto permite identificar un tratamiento o régimen anticancerígeno más óptimo para un sujeto individual dado. Esto también permite realizar ajustes en el régimen de tratamiento a la luz de los cambios en los niveles de CCR4 dentro del primer ciclo de tratamiento. En algunas realizaciones, los métodos y kits de la presente divulgación permiten ventajosamente la predicción, la estratificación y/o la monitorización a través de una prueba para un biomarcador que se puede realizar en una muestra fácilmente obtenible, como una muestra de sangre.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Muestra la secuencia de CCR4 humano.

Figura 2. La ciclofosfamida aumenta la expresión de CCR4 en las células T Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer antes del tratamiento y después de cada ciclo de tratamiento con 50 mg de ciclofosfamida oral, dos veces al día durante 3 días consecutivos. La expresión de CCR4 en células T se determinó mediante citometría de flujo. Se determinaron los cambios en la frecuencia de células T CCR4+ y 4 pacientes mostraron aumentos significativos en la frecuencia de células T CCR4+ después del tratamiento. (A) la expresión de CCR4 en células T CD3+ se comparó entre pacientes que no tuvieron cambios en la frecuencia de células T CCR4+ después del tratamiento (% CCR4 constante, n=6) y pacientes que tuvieron un aumento significativo en la frecuencia de células T CCR4+ al menos una vez después del tratamiento (% CCR4 aumentado, n=4). (B) también se comparó la supervivencia global entre los dos grupos de pacientes. (C) los puntos de tiempo donde se produjeron aumentos en la frecuencia de células T CCR4+ y estabilidad de la enfermedad. * representa una significancia estadística p<0.05 en la multiplicidad de cambio de los niveles de pretratamiento y los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (^s E^m ).

Figura 3. La expresión de CCR4 es regulada en aumento en las poblaciones de células T efectoras. Se restringió un análisis a las células T FoxP3+CD25+CD4+ (Tregs), las células T FoxP3-CD25-CD4+ (Tconvs) y las células T CD8+ en el porcentaje aumentado de pacientes con CCR4 en los puntos de tiempo donde hubo un aumento significativo en la frecuencia. de células T CCR4+ (n = 6 de 4 pacientes). Se graficaron los incrementos de multiplicidad, a partir de los niveles de pretratamiento, en estas frecuencias de células CCR4+ junto con los incrementos de multiplicidad en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CCR4. *p<0.05, significancia estadística en la multiplicidad de cambio de los niveles pretratamiento. B se calcularon las proporciones de Tconvs a Tregs y de células T CD8+ a Tregs para los primeros 3 ciclos de tratamiento para todos los pacientes. Estas proporciones se compararon luego entre pacientes con % CCR4 constante (n = 12 de 6 pacientes) y pacientes con % CCR4 aumentado (n = 11 de 4 pacientes). * representa p<0.05 y ** representa significancia estadística p<0.01 entre los grupos de pacientes y los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 4. Después de la regulación en aumento de la expresión de CCR4, las células T conservan su citotoxicidad. La función citotóxica de las células T de pacientes con un porcentaje aumentado de células T CCR4+ se evaluó en puntos de tiempo donde hubo un aumento significativo en la frecuencia de células T CCR4+. Las PBMC se estimularon durante 6 horas con 50 ng/ml de forbol 12-miristrato 13-acetato (PMA) y 1 pg/ml de ionomicina en presencia de inhibidor del transporte de proteínas y anti-CD107a. A y B, a continuación, se determinó la expresión de CD107a en células T CD4+ y CD8+ mediante citometría de flujo y se comparó con los niveles pretratamiento (n = 3 pacientes). Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 5. Dosis óptima de mafosfamida. Las PBMC de donantes sanos se trataron con concentraciones variables de mafosfamida como se describe anteriormente. Las frecuencias de células T CCR4+ (eje y derecho) y células vivas (eje y izquierdo) se determinaron mediante citometría de flujo (n = 6 donantes). * representa p<0.05 y *** representa significancia estadística p<0.001 en comparación con no tratados. Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 6. La mafosfamida induce la expresión de CCR4 en células T Se cultivaron PBMC de donantes sanos y pacientes con cáncer antes del tratamiento con o sin 1.5 pg/ml de mafosfamida durante 72 horas. A se determinó la expresión de CCR4 en células T CD3+ mediante citometría de flujo y se comparó entre células no tratadas y tratadas con mafosfamida (donantes sanos n=20 y pacientes con cáncer n=10). ** representa significancia estadística de p<0.01 y **** representan significancia estadística de p<0.0001 entre células tratadas y no tratadas. Luego, B se determinó la frecuencia de las células T CCR4+, así como la MFI de CCR4 para las células Tregs, Tconvs y CD8+, y los valores tratados se normalizaron a los valores no tratados (donantes sanos n=14 y pacientes con cáncer n=10). ** representa significancia estadística p<0.01 y *** representa significancia estadística p<0.001 en la multiplicidad de cambio de los niveles no tratados. C se determinaron las proporciones de Tconvs a Tregs y de células T CD8+ a Tregs para las células tratadas con mafosfamida y se compararon con las de las células no tratadas (donantes sanos n=11 y pacientes con cáncer n=10). * representa significancia estadística p<0.05, ** representa significancia estadística p<0.01 y *** representa significancia estadística p<0.001 entre los grupos de tratamiento. Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM). D comparación de la regulación en aumento en la frecuencia de efectores de células T CD4 CCR4+ entre pacientes con CCR4 estable (n = 6) y con pico de CCR4 (n = 4) (p<0.0005).

Figura 7. Paclitaxel (un agente antineoplásico) no induce la expresión de CCR4 en las células T. Se cultivaron PBMC de donantes sanos con medio solo, 1.5 pg/ml de mafosfamida o 30 ng/ml de paclitaxel durante 72 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. A continuación, se determinó la expresión de CCR4 en células T CD8+ y CD4+CD25- usando citometría de flujo y la expresión de % CCR4 se normalizó al medio solo (n = 8). * representa significancia estadística p<0.05 y ** representa significancia estadística p<0.01 entre las células tratadas y las células con medio solo. El gráfico muestra las medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 8. Una comparación de la regulación en aumento en la frecuencia de células T CCR4+ entre pacientes con % CCR4 constante y pacientes con % CCR4 aumentado. (A), (B) y (C), se comparó la multiplicidad de cambios en la expresión de CCR4 en células T CD3+, Tconvs y células T CD8+ en muestras de pretratamiento de pacientes con cáncer, después del tratamiento in vitro con mafosfamida entre pacientes con % CCR4 constante (n = 6 pacientes) y aumentar el % de pacientes CCR4 (n = 4 pacientes). * representa una significancia estadística p<0.05 entre grupos de pacientes. Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 9. El mecanismo de inducción de CCR4 por mafosfamida. Se cultivaron PBMC de donantes sanos con o sin 1.5 pg/ml de mafosfamida durante 24, 48 y 72 horas. En las últimas 6 horas de incubación, las células se estimularon con 50 ng/ml de forbol 12-miristrato 13-acetato (PMA) y 1 pg/ml de ionomicina. Se añadió Brefaldina A a 3 pg/ml durante las últimas 4 horas de incubación. A se determinó la frecuencia de células IL-4+ usando citometría de flujo y se correlacionó con las frecuencias correspondientes de células T CCR4+ en células no estimuladas usando análisis de correlación de Spearman (n = 18 puntos de 6 donantes). B las células T CD4+ y CD8+ se purificaron utilizando clasificación celular activada por fluorescencia y luego se cultivaron con o sin 1.5 pg/ml de mafosfamida en presencia de 20 unidades/ml de IL-2 durante 72 horas. A continuación, se determinó la frecuencia de las células CCR4+ usando citometría de flujo y se calculó la multiplicidad de cambios de las muestras no tratadas. Se comparó la multiplicidad de cambios en la frecuencia de las células T CCR4+ entre las células T purificadas y las células T de cultivos de PBMC completas (n = 3 donantes). C se cultivaron los PBMC con mafosfamida (mafos) a 1.5 pg/ml o IL-4 a 10 ng/ml o IL-2 a 20 unidades/ml durante 72 horas. En las últimas 4 horas de incubación se añadió LBH589 50 nM a los cultivos de IL-2. Los niveles intracelulares de acetilación de H3K9, H3K14 y H3K18 se determinaron mediante citometría de flujo (n = 6 donantes). El MFI de acetilación de H3K9, H3K14 y H3K18 se calculó y normalizó a niveles no tratados para células T CD4+ y CD8+ y para células CCR4+ y CCR4- dentro de ellas. * representa una significancia estadística p<0.05 en la multiplicidad de cambio de los niveles no tratados. Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 10. Mecanismo de inducción de CCR4. Se cultivaron PBMC de donantes sanos con o sin 15 pg/ml de mafosfamida durante 24, 48 y 72 horas. A continuación, las células se estimularon para el análisis de citoquinas intracelulares como se ha descrito anteriormente. A y B, las frecuencias de las células IL-2+ con células T CD4+ y CD8+ se correlacionaron con las frecuencias correspondientes de expresión de CCR4 en células no tratadas utilizando el análisis de correlación de Spearman (n = 18 puntos de 6 donantes).

Figura 11. Gráficos representativos de la acetilación de H3K9, H3K14 y H3K18. Las PBMC de donantes sanos se trataron con 1.5 pg/ml de mafosfamida durante 72 horas. La acetilación de H3K9, H3K14 y H3K18 se determinó mediante citometría de flujo como se describe en la sección de métodos. Las puertas para células positivas se establecieron en función del isotipo. Para comparar los cambios en los niveles de acetilación, el MFI de las células en la puerta positiva para cada grupo de tratamiento se normalizó luego con el del medio.

Figura 12. La expresión de CCR4 inducida por mafosfamida permite que las células T migren hacia CCL22. Las PBMC de donantes sanos se trataron con mafosfamida (mafos) como se describe anteriormente. A continuación, las células se sembraron en un inserto Transwell a una concentración de 2.5 x 105 células/100 pl y se permitió que migraran a la cámara inferior que contenía CCL22 (100 ng/ml) o medio solo durante 2 horas. A el índice de migración se calculó dividiendo el número de células que migraron hacia CCL22 por el número de células que migraron hacia el medio. Los índices de migración se graficaron para células no tratadas y tratadas con mafosfamida (n = 7). * representa una significancia estadística p<0.05 en la multiplicidad de cambio de los niveles no tratados. B, los índices de migración se correlacionaron con las frecuencias correspondientes de células T CCR4+ mediante el análisis de correlación de Spearman (n = 14 puntos de 7 donantes). C se comparó la proporción de Tconvs a Tregs y de células T CD8+ a Tregs que migraron entre las células no tratadas y las tratadas con mafosfamida (n = 7 donantes). * representa una significancia estadística p<0.05 entre los grupos de tratamiento. Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 13. Concentración sérica de CCL22. La concentración de CCL22 en sueros antes del pretratamiento de pacientes (n = 10 pacientes) y de donantes sanos (n = 5 donantes) se determinó utilizando un kit de inmunoensayo de perlas Múltiple. * representa una significancia estadística p<0.05 entre pacientes y donantes sanos. Los gráficos muestran medias ± error estándar de la media (SEM).

Figura 14. Aumentos en las células T CD8 que expresan CCR4 en sangre periférica por LDCy 14 días después del tratamiento en animales portadores de tumores ID8, normalizados para controlar ratones tratados con solución salina; con aumentos concomitantes en linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) para células T CD8 activadas que expresan CD69 ** representa p<0.02.

Descripción detallada de la divulgación

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Cualquier material y método similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse para practicar o probar la presente divulgación. Los practicantes están particularmente orientados a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 47, John Wiley & Sons, Nueva York, 1999; Colowick y Kaplan, eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir y Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology, vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications, 1986; Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed., Mack Easton, Pa. (1990)), para definiciones y términos de la técnica y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

A lo largo de esta especificación, la palabra “comprende”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.

El término “y/o”, por ejemplo, “X y/o Y” se entenderá que significa “X e Y” o “X o Y” y se considerará que proporciona apoyo explícito para ambos medios o para cualquiera de los dos significados. Además, una lista o características que incluyen la frase “y/o” entre la penúltima y la última característica significa que cualquiera o más de las características enumeradas pueden estar presentes en cualquier combinación.

También se entiende que la referencia a las formas singulares “un”, “una” y “el” implica la inclusión de formas plurales a menos que el contexto dicte lo contrario.

Como se usa en esta divulgación, el término “o” pretende significar un “o” inclusivo en lugar de un “o” exclusivo. Es decir, a menos que se especifique lo contrario, o que quede claro por el contexto, “X emplea A o B” significa cualquiera de las permutaciones inclusivas naturales. Es decir, si X emplea a A; X emplea a B; o X emplea tanto A como B, entonces “X emplea A o B” se cumple en cualquiera de los casos anteriores. Además, al menos uno de A y B y/o similar generalmente significa A o B o ambos A y B.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, los términos en el singular y las formas singulares “un”, “una” y “el”, por ejemplo, incluyen opcionalmente referentes en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.

A menos que se indique lo contrario, la referencia al término “cidofosfamida” como se usa en el presente documento también incluye análogos, derivados o metabolitos activos de la ciclofosfamida.

Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente”, a menos que se indique lo contrario, se refiere a /- 10 %, más preferiblemente /- 5 %, más preferiblemente /- 1 %, del valor designado.

Cualquier discusión sobre documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se haya incluido en la presente especificación no debe tomarse como una admisión de que cualquiera o todos estos asuntos forman parte de la base de la técnica anterior o fueron conocimiento general común en el campo relevante para la presente divulgación tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Definiciones y frases seleccionadas

El término “sujeto” como se usa en el presente documento se refiere a un mamífero que incluye animales humanos y no humanos. Más particularmente, el mamífero es un ser humano. Aún más particular, el sujeto es una mujer. Términos tales como “sujeto”, “paciente” o “ individuo” son términos que pueden, en contexto, usarse indistintamente en la presente divulgación. En ciertos ejemplos, el sujeto puede ser un sujeto adulto o niño (pediátrico). El término “adulto”, como se usa en el presente documento, se entiende que significa un sujeto humano de 18 años de edad o más. El sujeto puede ser un sujeto humano adulto de entre 60 y 85 años de edad.

El término “ciclofosfamida en dosis bajas” pretende significar una dosis que es activa para suprimir el cáncer en el sujeto, pero con efectos secundarios mínimos. Lo que constituye una dosis baja de ciclofosfamida normalmente quedará a discreción del médico y no se pretende que el término se limite a una dosis particular. Clínicamente, se entiende que la ciclofosfamida en dosis bajas se refiere a una dosis oral de aproximadamente 1.2-2 g/m2 o una dosis oral de aproximadamente 25-150 mg por día.

El término “dosis”, como se usa en el presente documento, se refiere a una administración única de una cantidad determinada de ciclofosfamida.

El término “medir el nivel de expresión” como se usa en el presente documento pretende tener un significado amplio y puede abarcar mediciones cualitativas o cuantitativas. Los métodos para medir el nivel de expresión se discuten en otra parte del presente documento. A modo de ejemplo, la expresión de CCR4 en células Teff se puede determinar cuantitativamente midiendo el aumento logarítmico (o lineal) en la intensidad de fluorescencia entre células que son positivas para un marcador dado y un isotipo adecuado u otro control apropiado. Los datos se pueden representar como un histograma donde la intensidad de fluorescencia media (representada por el pico en el histograma) se compara con la intensidad de fluorescencia media del control. Un desplazamiento hacia la derecha a lo largo del eje X del histograma indica tinción positiva y, por tanto, expresión del marcador.

El término “tratamiento” o “tratar” como se usa en el presente documento se refiere a una intervención clínica diseñada para alterar el curso natural del individuo o célula que se está tratando durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o mejora del pronóstico. Un individuo es “tratado” con éxito, por ejemplo, si se mitigan o eliminan uno o más síntomas asociados con una enfermedad. El tratamiento es preferiblemente un tratamiento contra el cáncer. La referencia en este documento a “tratamiento contra el cáncer” incluye cualquier tratamiento dirigido al tratamiento del cáncer. El tratamiento puede incluir cirugía, radiación de quimioterapia y/o medicamentos.

Como se usa en el presente documento, el término “tratamiento del cáncer” no pretende ser un término absoluto. En algunos aspectos, los métodos de la divulgación buscan reducir el tamaño de un tumor o el número de células cancerosas, hacer que un cáncer entre en remisión o prevenir el crecimiento del tamaño o el número de células cancerosas. En algunas circunstancias, “tratar el cáncer” conduce a un mejor pronóstico y/o supervivencia.

Como se usa en el presente documento, el término “pronóstico” se refiere a la predicción del riesgo de la gravedad de la enfermedad o del curso probable y el resultado clínico asociado con una enfermedad, preferiblemente cáncer. Este abarca métodos mediante los cuales el experto en la materia puede estimar y/o determinar la probabilidad de que se produzca un resultado determinado. El resultado con el que se relaciona el pronóstico puede ser la morbilidad y/o la mortalidad. En particular, el pronóstico puede relacionarse con la “supervivencia libre de progresión” (PFS), que es el tiempo que un paciente vive con la enfermedad sin que esta progrese. Por lo tanto, la PFS puede ser el tiempo desde el inicio de la terapia hasta la fecha de progresión del cáncer, o el tiempo desde el final de la terapia hasta la fecha de progresión del cáncer. El pronóstico puede estar relacionado con la supervivencia global. Por “supervivencia global” (OS) se entiende el período de tiempo que un paciente vive con la enfermedad antes de que ocurra la muerte. La supervivencia global puede, por ejemplo, definirse como el tiempo desde el diagnóstico del cáncer, el inicio del tratamiento o la finalización del tratamiento, hasta la muerte. La supervivencia general típicamente se expresa como una “tasa de supervivencia general”, que es el porcentaje de personas en un grupo de estudio o tratamiento que aún están vivas durante un cierto período de tiempo después de que se les diagnosticó, comenzaron el tratamiento o completaron el tratamiento para, una enfermedad, como el cáncer. La tasa de supervivencia general puede, por ejemplo, establecerse como una tasa de supervivencia a cinco años, que es el porcentaje de personas en un grupo de estudio o tratamiento que están vivas cinco años después de su diagnóstico o del inicio o finalización del tratamiento.

La información estadística con respecto a la OS y la PFS promedio (por ejemplo, mediana, media o moda) de pacientes que tienen un tipo particular de cáncer está disponible para los expertos en la técnica. Por lo tanto, se puede realizar una determinación de si un sujeto tiene, o es probable que tenga, una OS o FPS aumentada o disminuida en comparación con dicho promedio.

Como se usa en el presente documento, el término “supervivencia aumentada” se refiere a un aumento en la esperanza de vida o la calidad de vida de un sujeto que padece una enfermedad como el cáncer. Por ejemplo, aumentar la supervivencia también incluye promover la remisión del cáncer, prevenir la invasión tumoral, prevenir la recurrencia del tumor, ralentizar el crecimiento del tumor, prevenir el crecimiento del tumor, disminuir el tamaño del tumor, disminuir el recuento total de células cancerosas y similares.

Por “progreso” o “progresión” se entiende que la enfermedad empeora, es decir, que aumenta la gravedad, por ejemplo, que aumenta la carga tumoral, que el tumor aumenta de tamaño y/o peso, que el cáncer se vuelve maligno o más maligno, y/o que se desarrolla metástasis o aumenta la incidencia y/o tasa de metástasis.

Por “regreso” o “regresión” se entiende que la enfermedad mejora, es decir, que la gravedad disminuye, por ejemplo, que la carga tumoral disminuye, que el tumor disminuye en tamaño y/o peso o se vuelve indetectable, que el cáncer se vuelve menos maligno, y/o que la incidencia y/o tasa de metástasis disminuya.

El término “predicción” o “predecir” como se usa en el presente documento se refiere a determinar la probabilidad de un resultado particular.

Una “cantidad eficaz” se refiere al menos a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Se puede proporcionar una cantidad eficaz en una o más administraciones. En algunos ejemplos de la presente divulgación, el término “cantidad eficaz” se usa para referirse a una cantidad necesaria para efectuar el tratamiento de una enfermedad o afección como se ha descrito anteriormente. La cantidad eficaz puede variar según la enfermedad o condición a tratar y también según el peso, la edad, el origen racial, el sexo, la salud y/o condición física y otros factores relevantes para el mamífero que se está tratando. Típicamente, la cantidad eficaz estará dentro de un rango relativamente amplio (por ejemplo, un rango de “dosis”) que puede determinarse a través de pruebas y experimentos de rutina por parte de un médico. La cantidad eficaz se puede administrar en una sola dosis o en una dosis repetida una o varias veces durante un período de tratamiento.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es al menos la concentración mínima requerida para efectuar una mejora medible de un trastorno particular (por ejemplo, cáncer). Una cantidad terapéuticamente eficaz en el presente documento puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del paciente, y la capacidad de la composición celular para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En el caso del cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz puede reducir la gravedad, inhibir o retrasar la progresión del cáncer y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer.

El término “cáncer de ovario”, como se usa en el presente documento, pretende significar aquellas condiciones clasificadas por laparotomía postexploratoria como patología premaligna, patología maligna y cáncer (estadios 1-4 de FIGO). La estadificación y clasificación del cáncer de ovario se describen en otra parte del presente documento. “Cáncer de ovario en etapa temprana” se refiere a aquellos estados de enfermedad clasificados como carcinoma en etapa 1 o etapa 2. La detección temprana del cáncer de ovario aumenta significativamente las tasas de supervivencia a 5 años.

El término “identificar un sujeto” tal como se usa en el presente documento puede intercambiarse con el término “detectar un sujeto”. Estos términos se refieren a estrategias para identificar sujetos que tienen una mayor probabilidad de responder a la ciclofosfamida, en particular a dosis bajas de ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma. Los métodos de detección de la divulgación no pretenden diagnosticar definitivamente a un sujeto como respondedor o no respondedor. Más bien, dichos métodos están destinados a identificar sujetos que tienen una mayor probabilidad de responder al tratamiento con ciclofosfamida. Dichos métodos de detección pueden usarse en combinación con uno o más métodos utilizados para diagnosticar definitivamente el cáncer de ovario o el cáncer ginecológico, incluidos el examen pélvico, la ecografía transvaginal, el escáner TC, la IRM, la laparotomía, la laparoscopia y la biopsia de muestras de tejido.

El término “biomarcador” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier gen o proteína cuyo nivel de expresión en un tejido o células está alterado en comparación con el de una célula o tejido normal o sano.

El término “estratificación” o “estratificar” como se usa en el presente documento se refiere a la división de una población en subpoblaciones sobre la base de un criterio específico. Más particularmente, se refiere a la división de una cohorte de sujetos o pacientes en al menos dos grupos en base a criterios específicos, que en el contexto de la presente solicitud comprende o consiste en la expresión de CCR4 en una muestra de células.

El término “regulado al alza” o “regulación en aumento de la expresión de CCR4” como se usa en el presente documento se refiere a un nivel de expresión de CCR4 que es significativa o sustancialmente mayor después de la exposición a ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma en comparación con el nivel de expresión de CCR4 en ausencia de exposición a ciclofosfamida o en comparación con una exposición previa a ciclofosfamida, incluidos análogos, derivados o metabolitos activos de los mismos. Más particularmente, se refiere a un nivel de expresión de proteínas, y aún más particularmente, a un nivel de expresión de proteínas de la superficie celular.

El término “enfermedad estable” como se usa en el presente documento significa un cáncer o tumor que no crece ni se reduce.

El término “enfermedad progresiva”, como se usa en el presente documento, significa un cáncer o tumor que empeora o se propaga.

Divulgación detallada

La presente divulgación proporciona métodos para detectar o estratificar sujetos, en particular sujetos con cáncer para el tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida en base a la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff del sujeto.

La presente invención se define en su sentido más amplio por las reivindicaciones independientes adjuntas, las realizaciones preferidas se detallan en las reivindicaciones dependientes.

Los presentes inventores han encontrado que el tratamiento de pacientes con cáncer con dosis bajas de ciclofosfamida (LDCy) altera las capacidades comparativas de migración de las células Teff beneficiosas en relación con las células T reguladoras (Tregs) en el microambiente del cáncer al alterar su patrón de expresión CCR4 comparativo. Basándose en este hallazgo, los inventores han desarrollado una prueba de predicción inmunitaria (denominada pretratamiento de regulación en aumento de CCR4 (diagnóstico CUP)) que puede usarse para identificar a los pacientes respondedores poco después de recibir ciclofosfamida en dosis bajas (LDCy). Esta prueba puede así identificar a los pacientes que recibirán el máximo beneficio del tratamiento con ciclofosfamida.

Los inventores han encontrado que los sujetos que tienen una expresión aumentada de CCR4 en células Teff se correlacionan positivamente con tasas de supervivencia más largas.

Estos hallazgos son inesperados ya que un trabajo anterior había demostrado que la expresión de CCR4 aumenta en Tregs en ciertos cánceres.

Normalmente, se obtendrá una muestra de células del sujeto a evaluar y se determinará el nivel de expresión de CCR4 en células Teff dentro de la muestra. Un aumento en la expresión (es decir, regulación en aumento) de CCR4 después del tratamiento con ciclofosfamida indica que el sujeto tiene una mayor probabilidad de responder a la ciclofosfamida o a ciclos de tratamiento adicionales con ciclofosfamida. Los niveles constantes de expresión de CCR4 después del tratamiento con ciclofosfamida indican que es poco probable que el sujeto responda a un tratamiento posterior con este agente.

Además, los pacientes respondedores pueden identificarse antes de recibir tratamiento con LDCy (pronóstico CUP). Por lo tanto, solo aquellos pacientes identificados como respondedores pueden seleccionarse para el tratamiento con quimioterapia con ciclofosfamida.

LDCy se usa actualmente como tratamiento de segunda línea después de que los pacientes se hayan sometido a otros tratamientos, a menudo habiendo desarrollado resistencia a taxanos o fármacos de platino. En este entorno, resulta en un beneficio clínico para el 25-44 % de los pacientes con cáncer de ovario (Handolias, D., et al. (2013) Oral cyclophosphamide in recurrent ovarian cancer. Asia-Pacific journal of clinical oncology).

Sería preferible la administración de quimioterapia en dosis bajas debido a la reducción de la toxicidad para el paciente y/o la frecuencia de eventos adversos. Además, la disponibilidad de ciclofosfamida en forma oral hace que este agente sea particularmente atractivo para entornos de bajos recursos (por ejemplo, donde no hay hospitales o es difícil llegar a un hospital).

Actualmente, la ciclofosfamida se administra a pacientes con cáncer de ovario que se encuentran en una etapa avanzada o terminal. La capacidad de identificar a los pacientes que responderán al tratamiento con ciclofosfamida sería ventajosa ya que proporciona a los pacientes que se identifican como no respondedores recibir un tratamiento beneficioso alternativo sin demora. Además, abriría la puerta a su uso en terapia de primera línea dada su mejor tolerabilidad en los pacientes en comparación con los agentes de platino y taxanos.

Además, la capacidad de identificar a los respondedores tiene un gran potencial para usarse rápidamente en muchos otros cánceres donde LDCy es una opción de tratamiento en etapa tardía, como el cáncer de mama. Además, los métodos descritos en el presente documento permitirían combinaciones eficaces de LDCy con otras terapias contra el cáncer, por ejemplo, inhibidores de puntos de control. Por ejemplo, los métodos descritos en este documento identificarán a los pacientes cuyas células inmunitarias beneficiosas migrarán a los tumores después del tratamiento con LDcy, y la coadministración de inhibidores de puntos de control evitaría que estas células inmunitarias beneficiosas sean desactivadas dentro del entorno del tumor por células inmunosupresoras como Tregs.

Además, el uso de LDCy en la primera recaída (donde no se usa actualmente) ofrece una opción de tratamiento poderosa y de baja toxicidad para pacientes en la primera evidencia de recurrencia subclínica (aumento de CA1253 meses después de la quimioterapia basada en platino de primera línea).

Células T efectoras

Los métodos de la presente divulgación comprenden detectar y/o medir la expresión de CCR4 en células T efectoras. El término “células T efectoras” se refiere a las células T que se han activado en respuesta a un estímulo. Esta clase de células T incluye células T colaboradoras y células T citotóxicas (asesinas).

Las células T citotóxicas (asesinas) están involucradas en la destrucción de células infectadas y transformadas y, por lo tanto, ayudan a proteger al huésped de infecciones por virus y cáncer. Las células T citotóxicas (asesinas) también se han implicado en el rechazo de trasplantes. Estas células expresan la glicoproteína CD8 en su superficie celular y, a veces, se denominan células T CD8+. Otros marcadores de superficie celular que se encuentran en las células T citotóxicas (asesinas) incluyen CD3 y ap TCR. También son positivos para los factores de transcripción EOMES, T-bet y BLIMP1.

Las células T colaboradoras (T^h) promueven y ayudan en la respuesta inmunitaria, en particular se ha descrito que ayudan a la actividad de otras células T mediante la liberación de citocinas de células T. Las células T colaboradoras incluyen T^h1, T^h2, T^h22, T^h17, T^h9 y T^fh. Estas células expresan la proteína de superficie CD4 y, a veces, se denominan células T CD4+. Otros marcadores de superficie celular incluyen CD3 y ap TCR. Los marcadores adicionales expresados en las células TH incluyen IL-12R, IFNyR, CXCR3, IL-17RB e IL-1R. En consecuencia, las células Teff también pueden incluir uno o más de estos marcadores.

En un ejemplo, las células Teff son células T colaboradoras y/o células T citotóxicas. En otro ejemplo, las células Teff son células T CD4+ y CD8+. En otro ejemplo más, las células Teff son células T CD4+CD25-. En otro ejemplo más, las células Teff son células T FoxP3-CD25-CD4+ (Tconv) y CD8+. En otro ejemplo más, las células Teff son células T CD8+. En un ejemplo, las células CD8+ también son CD69+.

En un ejemplo, las células Teff son células T CD3+. En un ejemplo, las células T colaboradoras comprenden una o más de las siguientes células T^h1, células T^h2, células T^h9, células T^h17, células T^h22 y células TFH.

Células T reguladoras

Las células T reguladoras se conocen anteriormente como células T supresoras y se refieren a una subpoblación de células T que modulan el sistema inmunitario, mantienen la tolerancia a los autoantígenos y previenen enfermedades autoinmunes. Su función es suprimir o regular a la baja la inducción y proliferación de células T efectoras (Bettelli E et al. (2006) Nature 441 (7090): 235-238).

Las células T reguladoras se caracterizan por la expresión de CD4, CD25 y CD127. Las células T reguladoras también pueden expresar CD3+FoxP3+CD25+CD4+. Las células T reguladoras en humanos se caracterizan por un alto nivel de expresión de CD25.

Quimiocinas y receptores de quimiocinas

El CCR4 (también denominado receptor 4 de quimiocinas CC y receptor 4 de quimiocinas (motivo C-C)) es un receptor acoplado a proteína G. CCR4 es el receptor de las quimiocinas: timo y quimiocina regulada por activación (también denominada CCL17) y quimiocina derivada de macrófagos (también denominada CCL22) CCR4 se expresa predominantemente en las células T colaboradoras tipo 2 (TH2) y células T reguladoras (Treg). La expresión limitada de CCR4 ocurre en otras células y tejidos sanos, por ejemplo, células T CD8+ de memoria que secretan una combinación de tipo 1 (interleucina (IL)-2, interferón (IFN)-^y y factor de necrosis tumoral (TNF) y citoquinas tipo 2 (IL-4) (Kondo, T. & Takiguchi, M. (2009). International immunology 21, 523-532 (2009).

El receptor CCR4 permite que las células T migren a sitios de inflamación ricos en sus ligandos CCL2, CCL4, CCL5, CCL17 y/o CCL22 (Cronshaw, D.G., Owen, C., Brown, Z. & Ward, S.G. (2004) Revista de inmunología 172, 77617770). Las células de cáncer de ovario y los macrófagos que se infiltran en la ascitis del tumor secretan grandes cantidades de CCL22 (Yigit, R., et al. Cytokine analysis as a tool to understand tumor-host interaction in ovarían cancer. European journal of cancer 47, 1883-1889 (2011)). Sin intervención externa, las células Treg CCR4+ supresoras se reclutan preferentemente en el microambiente tumoral, en lugar de las células T CD8 beneficiosas o las células T^h1 (células efectoras CD4+).

Los métodos de la presente divulgación comprenden, o consisten en determinar la expresión de CCR4, en particular en células T efectoras tales como células T CD4+ y CD8+.

En la ascitis por cáncer de ovario, las Treg bioactivas inhiben las respuestas de las células T efectoras locales.

La secuencia de CCR4 humano está disponible en bases de datos publicadas. Por ejemplo, la secuencia proteica del CCR4 humano está disponible como referencia P51679 de UniProt. En la Figura 1 se muestra una secuencia representativa.

Sujetos

Los métodos y kits de la presente solicitud se pueden usar para identificar sujetos que responderán al tratamiento con un agente quimioterapéutico mediante la determinación de la expresión de CCR4. En algunas realizaciones, el sujeto a evaluar tiene cáncer. Como se usa en el presente documento, “cáncer” es un término colectivo para condiciones caracterizadas por neoplasia, es decir, el crecimiento o división anormal de células. Por lo tanto, las células cancerosas pueden denominarse “neoplásicas”. Una colección de células cancerosas a menudo se denomina “tumor” y los términos “tumor” y “cáncer” se usan indistintamente en este documento. Un tumor puede ser benigno o maligno. Preferiblemente, es maligno.

El cáncer puede ser cualquier cáncer, como carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas, gliomas y similares. En algunas realizaciones, el cáncer es un carcinoma, sarcoma y/o glioma. En algunos ejemplos, el cáncer es un carcinoma.

Los ejemplos de cánceres adecuados incluyen, sin limitación, cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de vejiga, cáncer de vesícula biliar, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de células epidermoides, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia, leucemia de células T en adulto, cáncer de laringe, cáncer de cerebro, neuroblastoma, cáncer de estómago, cáncer de endometrio y melanoma.

En algunos ejemplos, el cáncer es un cáncer ginecológico. Como se usa en este documento, un “cáncer ginecológico” es un crecimiento y propagación descontrolados de células anormales que se originan en los órganos reproductores. Los ejemplos de cánceres ginecológicos incluyen, sin limitación, cáncer de cuello uterino, enfermedad trofoblástica gestacional (GTD), peritoneal primario, de las trompas de Falopio, placentario, de ovario, uterino/endometrial, vaginal y vulvar. En algunos ejemplos, el cáncer es cáncer de ovario.

Preferiblemente, el cáncer expresa CCL22. CCL22 (también denominada quimiocina derivada de macrófagos o MDC) es una quimiocina producida por células tumorales y macrófagos infiltrantes de tumores. CCL22 se une a CCR4 y participa en la quimiotaxis de las células T reguladoras (Tregs) en el microambiente del tumor, lo que reduce la inmunidad contra el cáncer. Los ejemplos de cánceres que expresan CCL22 incluyen, pero no están limitados a, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular (CHC), cáncer gástrico, carcinoma de células de Lewis, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de ovario.

Los métodos de la invención como se describe en este documento se pueden llevar a cabo en cualquier sujeto que pueda padecer cáncer. Los métodos generalmente se llevan a cabo en mamíferos tales como humanos, otros primates tales como monos, mamíferos de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, mamíferos de ganado como caballos, vacas, ovejas, cerdos o animales domésticos como gatos, perros. En algunas realizaciones, los sujetos son humanos. Sin embargo, en otros ejemplos, los métodos pueden usarse en cualquier modelo animal apropiado. Un sujeto que está recibiendo atención médica puede denominarse “paciente”. Cualquier referencia en el presente documento a un “sujeto” debe entenderse, por lo tanto, que incluye una referencia a un paciente, preferiblemente un paciente humano.

En algunos ejemplos, el sujeto puede mostrar evidencia de recaída. En algunas realizaciones, el sujeto puede mostrar evidencia de una primera recaída. En algunas realizaciones, el sujeto puede mostrar evidencia de recurrencia subclínica. Por ejemplo, en el caso del cáncer de ovario, el sujeto puede tener niveles crecientes de CA125 en la sangre tres meses después de la quimioterapia de primera línea basada en platino. En consecuencia, los métodos de la presente divulgación pueden aumentar el uso de agentes quimioterapéuticos tales como ciclofosfamida en dosis bajas en la primera recaída (cuando no se usa actualmente). Esto ofrecería una opción de tratamiento poderosa y de baja toxicidad para los pacientes ante la primera evidencia de recurrencia subclínica.

Los métodos y kits de la presente solicitud se pueden usar para identificar sujetos que responderán al tratamiento, ya sea antes de que comience la terapia (incubación in vitro del fármaco con la muestra de sangre/células del sujeto), o después de que haya comenzado la terapia (muestra de sangre/célula in vitro). Por ejemplo, el sujeto puede haber iniciado o estar iniciando un tratamiento con el agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el sujeto a evaluar no ha sido tratado con el agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, se puede evaluar al sujeto para determinar si es probable que el tratamiento con el agente quimioterapéutico mejore la supervivencia. Por lo tanto, el método incluye incubar una muestra de células derivadas del sujeto con el agente quimioterapéutico antes de que se determine la expresión de CCR4. En algunas realizaciones, el sujeto a evaluar ha iniciado la terapia, por ejemplo, el sujeto a evaluar se encuentra dentro del primer ciclo de tratamiento con el agente quimioterapéutico. En esta realización, el método incluye determinar la expresión de CCR4 en una muestra de células derivadas del sujeto que se está tratando.

Cáncer de ovarios

El cáncer de ovario es el crecimiento de células malignas anormales que comienza en los ovarios. A menudo se asocia con síntomas vagos e inespecíficos, como distensión abdominal, dolor pélvico o abdominal, dificultad para comer y/o sensación de saciedad rápida y síntomas urinarios. Una vez que se ha diagnosticado el cáncer de ovario, se realiza la estadificación del cáncer para decidir cuánto ha progresado la enfermedad.

Típicamente, la estadificación del cáncer de ovario implica tomar muestras de tejidos de diferentes partes de la pelvis y el abdomen para determinar si la enfermedad se ha propagado y, de ser así, cuánto se ha propagado. El cáncer de ovario se clasifica según el sistema de clasificación por etapas de la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO), que describe cuatro etapas principales:

Etapa 1: el cáncer solo se encuentra dentro del ovario (u ovarios) y no se ha propagado a los órganos y tejidos del abdomen o la pelvis, los ganglios linfáticos o a sitios distantes.

Etapa 2: el cáncer se diseminó a otros órganos dentro de la pelvis, por ejemplo, el útero, las trompas de Falopio, la vejiga, el colon sigmoide o el recto. No se ha diseminado a los ganglios linfáticos ni a sitios distantes.

Etapa 3: el cáncer se ha diseminado más allá de la pelvis hasta el revestimiento del abdomen y/o se ha diseminado a los ganglios linfáticos en la parte posterior del abdomen (ganglios linfáticos retroperitoneales).

Etapa 4: el cáncer se diseminó hacia el interior del bazo, el hígado, los pulmones u otros órganos ubicados fuera de la cavidad peritoneal.

La etapa FIGO es un predictor importante de supervivencia a largo plazo. También se utiliza para ayudar a identificar las opciones de tratamiento. La etapa 4 es la forma más avanzada de cáncer de ovario y está asociada con la tasa de supervivencia a cinco años más baja.

Los métodos de la presente invención se pueden usar en un sujeto que tiene cáncer de ovario en cualquier estadio clínico.

Muestras biológicas y células.

Los métodos y kits de la presente divulgación comprenden determinar la expresión de CCR4 en una muestra biológica obtenida de un sujeto, preferiblemente un sujeto con cáncer. La muestra biológica es cualquier muestra obtenida del sujeto en la que están presentes células Teff. Como se usa aquí, el término “obtenido” se define ampliamente y se refiere a células, tejidos u órganos derivados de un sujeto directamente, así como a células, incluidas las derivadas del tejido u órgano que han sido cultivadas o proceden de alguna manera.

En algunos ejemplos, la muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en, pero no se limita a, médula ósea, bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, tejido linfoide asociado a la mucosa, tejido linfoide asociado al intestino o sangre. En algún ejemplo, las células comprenden células de una muestra de sangre total.

Las muestras biológicas se pueden obtener de un sujeto por una variedad de técnicas que incluyen, por ejemplo, por venopunción, raspando o frotando un área o usando una aguja para aspirar fluidos o tejidos corporales. Los métodos para recoger diversas muestras biológicas son bien conocidos en la técnica.

En algunos ejemplos, las células se purifican. Como se usa en el presente documento, “purificado” se refiere a células que se han separado al menos parcialmente de otros tipos de células con las que normalmente se asocian en su estado natural. Típicamente, el tipo celular seleccionado se purifica cuando es al menos el 50 % o el 60 %, en número, del total de células presentes. Por ejemplo, el tipo de célula seleccionado es al menos el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, en número, del total de células presentes. La pureza de las células se puede comprobar mediante citometría de flujo y otras técnicas adecuadas.

En algunos ejemplos, las células comprenden células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC pueden incluir linfocitos (células T, células B y células NK), monocitos y células dendríticas. Las PBMC se pueden aislar a partir de una muestra de sangre entera utilizando cualquier técnica conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, las PBMC se pueden aislar mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll, tubos de preparación de células (como BD Vacutainer® CPT) o tubos SepMate.

En algunos ejemplos, las células se seleccionan basándose en la expresión de marcadores de superficie celular particulares. En algunos ejemplos, las células se seleccionan basándose en la expresión de CD3 en la superficie celular. En otros ejemplos, las células se seleccionan basándose en la expresión de marcadores asociados con células T efectoras (Teff) o con células T reguladoras (Treg).

Por ejemplo, las células Treg incluyen células que expresan las proteínas de la superficie celular CD4, CD25 y CD27. En un ejemplo, las células Treg son CD27hi. En un ejemplo, las células Teff son CD4+ o CD8+. En algunos ejemplos, las células Teff son células CD25-CD4+. En algunos ejemplos, las células Treg llevan los marcadores de superficie CD3+FoxP3+CD25+CD4+. En algunos ejemplos, las células Teff son células CD3+FoxP3-CD25-CD4+ (también denominadas Tconvs). En otros ejemplos, las células Teff son células CD3+CD8+. En otro ejemplo, las células Teff son CD69+ CD8+. En otro ejemplo, las células Teff son células T CCR4+ CD8+ o células T CCR4+ CD4+.

Las células se pueden seleccionar basándose en la expresión de la superficie celular utilizando cualquier técnica conocida por el experto en la materia. Estas técnicas pueden basarse tanto en la detección positiva como en la negativa. En las técnicas de detección positiva, las células deseadas se marcan con anticuerpos y se cuantifican. Las técnicas adecuadas para seleccionar células basadas en la expresión de antígenos en la superficie celular incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, técnicas de inmunoadsorción, aislamiento de células basadas en sangre total RosetteSep y similares. En las técnicas de inmunoadsorción, las células se seleccionan con anticuerpos monoclonales y se unen preferentemente a una superficie que puede eliminarse del resto de las células, por ejemplo, columna de perlas, matraces, partículas magnéticas. Las técnicas de inmunoadsorción de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aislamiento celular basado en anticuerpos magnéticos, como Life Technologies Dynabeads® y Stemcell Technologies EasySep™, RoboSep™ y StemSep™.

Las células pueden ser células recién obtenidas o células que han sido almacenadas o crioconservadas. Las células se pueden cultivar en medios adecuados antes o después de la purificación, por ejemplo, en medios AIM-V (Life Technologies, EE. UU.) con suero humano normal al 5 % (HS, Sigma-Aldrich, EE. UU.) (medios AIM-V completos).

Detección y medición de la expresión de CCR4 en las células

El presente inventor ha encontrado que el tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida aumenta las células T CCR4+ ^c D8+ efectoras en la sangre, pero no las Treg CCR4+. Los métodos y kits de la presente divulgación comprenden la detección de la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff. Cualquier método disponible en la técnica para la detección de la expresión de CCR4 puede usarse en los métodos de la presente divulgación. En un ejemplo, la expresión de CCR4 se detecta a nivel de proteína. En algunos ejemplos, la detección de la regulación en aumento en la expresión de CCR4 identificará de forma pronóstica a los sujetos que responderán al tratamiento con ciclofosfamida. En otros ejemplos, la detección de la regulación en aumento en la expresión de CCR4 diagnosticará sujetos que responderán a ciclos adicionales de ciclofosfamida después de un tratamiento previo con ciclofosfamida.

El término “regulación en aumento de CCR4”, como se usa en el presente documento, se refiere a un nivel de expresión de CCR4 en células Teff que es sustancialmente o significativamente mayor después de la exposición o administración de ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma, en comparación con el nivel de Expresión de CCR4 en células Teff pretratamiento o preexposición a ciclofosfamida o un análogo o derivado del mismo. En algunos métodos, el término “regulación en aumento de CCR4” puede referirse a un nivel de expresión de CCR4 en células Teff que es sustancialmente o significativamente mayor entre un primer punto de tiempo en comparación con un segundo punto de tiempo donde el sujeto ha recibido ciclofosfamida en ambos puntos de tiempo.

En un ejemplo, significativamente mayor se refiere a un nivel que es mayor que el error estándar del método de evaluación utilizado. En un ejemplo, significativamente mayor se refiere a una significancia estadística de p<0.05, p<0.01 o p<0.001.

En un ejemplo, la detección de CCR4 se determina midiendo la expresión de CCR4 en la superficie celular en células T efectoras presentes en una muestra biológica. En otro ejemplo, la expresión de CCR4 se mide mediante citometría de flujo. En otro ejemplo, la expresión de CCR4 se determina en células Teff definidas según el perfil de expresión de la superficie celular discutido anteriormente. En un ejemplo, la detección de CCR4 se determina en células T CD3+.

En otro ejemplo, la detección de la expresión de CCR4 se determina en células que también son células T CD8+. En otro ejemplo, la detección de la expresión de CCR4 se determina en células que son células T CD3+, CD8+. En otro ejemplo, la detección de la expresión de CCR4 se determina en células que son células CD25-CD4+. En otro ejemplo, la detección de la expresión de CCR4 se determina en células que son células FoxP3-CD25-CD4+. En otro ejemplo, la detección de la expresión de CCR4 también se determina en células que son FoxP3+CD25+CD4+ (es decir, Tregs) para confirmar la ausencia de regulación en aumento de CCR4 en estas células.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento de CCR4 se refiere a un nivel de expresión de CCR4 que es al menos 2 logs mayor, al menos 3 logs mayor, al menos 3.5 logs mayor o al menos 4 logs mayor cuando se evalúa mediante citometría de flujo.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento de la expresión de CCR4 se refiere a un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CCR4 observada por citometría de flujo.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento de la expresión de CCR4 se refiere a un nivel de expresión de CCR4 después del tratamiento con ciclofosfamida que es al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 veces o mayor que el nivel de expresión de CCR4 antes de tratamiento con ciclofosfamida.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento del nivel de expresión de CCR4 es de al menos 5 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 80 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 300 % o más después del tratamiento con ciclofosfamida en comparación con el pretratamiento.

En algunos ejemplos, la regulación en aumento del nivel de expresión de CCR4 es de al menos el 5 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 % o al menos el 50 % o más después de la exposición a mafosfamida en comparación con el pretratamiento.

El experto en la materia apreciará que la regulación en aumento de la expresión de CCR4 se puede expresar de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a la multiplicidad de cambio en el % de células CCR4+ o la proporción de CCR4+ T conv/CCR4+ Tregs como se muestra en los ejemplos del presente documento.

En algunos ejemplos, se puede establecer un nivel de umbral de CCR4 por encima del cual se considera que está regulado al aumento en una muestra biológica. Los métodos para seleccionar el valor umbral incluyen, pero no se limitan al, análisis del gráfico ROC para CCR4 o el análisis del nivel de expresión de CCR4 para una población de sujetos normales. Como se usa en el presente documento, el término “normal” se refiere al nivel de expresión en una muestra biológica correspondiente de una persona sana que no padece cáncer. Tal muestra puede estar presente en forma estandarizada. Los valores de umbral o “cortes ejemplares incluyen el nivel medio de expresión de CCR4 más dos desviaciones estándar, según lo determinado a partir de una población de sujetos normales; niveles de expresión seleccionados de la curva ROC que representan el valor más alto de sensibilidad más especificidad; un nivel de expresión de CCR4 que es estadísticamente mayor a p<0.05 que el nivel de expresión de CCR4 observado en el pretratamiento. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar otros métodos para seleccionar valores umbral de expresión apropiados para practicar los métodos descritos en este documento.

La regulación en aumento de la expresión de CCR4 se observa preferiblemente después de al menos un ciclo de tratamiento con ciclofosfamida. En algunos ejemplos, se observa una regulación en aumento de la expresión de CCR4 después de uno, dos o tres ciclos de tratamiento con ciclofosfamida.

Los presentes inventores han determinado que los sujetos que no responderán al tratamiento con ciclofosfamida pueden identificarse con un nivel de expresión de CCR4 que permanece sustancialmente igual al nivel de CCR4 al inicio o en el pretratamiento. En consecuencia, la presente divulgación también proporciona un método para identificar a un sujeto que probablemente no responda al tratamiento con ciclofosfamida, análogo, derivado o metabolito activo del mismo, comprendiendo el método determinar la expresión de CCR4 en células Teff del sujeto, la expresión estable de CCR4 en dichas células identifica a un sujeto que no responderá a dicho tratamiento.

En este contexto, el término “expresión estable” se refiere a una frecuencia sin cambios en el nivel de expresión de CCR4 en comparación con el tratamiento previo o con sujetos con un aumento evidente en la expresión de CCR4 (denominados como sujetos con pico de CCR4). En otras palabras, no existe una diferencia estadísticamente significativa en el nivel de expresión de CCR4 observado en el pretratamiento o postratamiento del sujeto o preexposición o postexposición a la ciclofosfamida o a un análogo, derivado o metabolito activo de la misma. En algunos ejemplos, el nivel de expresión de CCR4 permanece estable después del primer, segundo, tercer, cuarto o ciclo posterior de tratamiento con ciclofosfamida.

La expresión de CCR4 puede determinarse usando cualquier técnica que pueda usarse para identificar y cuantificar las células que expresan CCR4. Por ejemplo, la cantidad de CCR4 puede determinarse poniendo en contacto una muestra de células derivadas de dicho sujeto con un anticuerpo que se une a CCR4, sometiendo la muestra y el anticuerpo a condiciones que permitan que el anticuerpo se una y determinando la cantidad de dicha quimiocina en dicha muestra. Puede usarse cualquier anticuerpo apropiado y los ejemplos de estos se describen en otra parte del presente documento. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos apropiados para CCR4, o anticuerpos que reconozcan epítopos particulares del mismo, mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante la inmunización de animales de experimentación, con las modificaciones apropiadas hechas a los anticuerpos en términos de etiquetado, etc. Los ejemplos de métodos que pueden usarse para determinar la expresión de CCR4 incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica o tinción de células con anticuerpos, inmunoensayos multiplex basados en microesferas y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

También se proporcionan métodos para evaluar la eficacia de la ciclofosfamida en un sujeto. Dichos métodos normalmente comprenden comparar el nivel de expresión de CCR4 en una primera muestra biológica obtenida antes del inicio de la terapia (es decir, línea de referencia o pretratamiento) con el de una segunda muestra biológica obtenida después de la administración de al menos una porción de la terapia (por ejemplo, uno o más ciclos de ciclofosfamida). Un nivel significativa o sustancialmente mayor de expresión de CCR4 en la segunda muestra es una indicación positiva de la eficacia de la terapia. Un nivel significativa o sustancialmente más bajo de expresión de CCR4 es una indicación negativa de la eficacia de la terapia. Un término usado en el presente documento “una indicación positiva de la eficacia de la terapia” significa que la terapia está produciendo resultados beneficiosos en el tratamiento del cáncer del sujeto (por ejemplo, regresión del tumor, etc.). Se pretende que una “ indicación negativa de la eficacia de la terapia” signifique que la terapia no tiene efectos beneficiosos con respecto al tratamiento del cáncer del sujeto.

La presente divulgación también proporciona un método de monitorización para evaluar la regresión o progresión del cáncer de ovario en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una primera muestra biológica en un primer punto de tiempo, el nivel de expresión de CCR4 en células Teff, repitiendo este análisis con una segunda muestra biológica obtenida en un punto de tiempo posterior, y comparando el nivel de expresión de CCR4 en células Teff en los dos puntos de tiempo donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff entre el primer y el segundo punto de tiempo indica regresión del cáncer de ovario.

En un ejemplo, el primer punto de tiempo es el pretratamiento o la línea de referencia y el segundo punto de tiempo es después del tratamiento con ciclofosfamida. En un ejemplo, el primer punto de tiempo es después de un primer ciclo de ciclofosfamida y el segundo punto de tiempo es después de un segundo o tercer ciclo de ciclofosfamida. Un nivel significativa o sustancialmente mayor de expresión de CCR4 en células Teff en la muestra biológica en el punto de tiempo posterior indica que el cáncer de ovario ha retrocedido. Mientras que un nivel de expresión significativamente más bajo es una indicación de que el cáncer de ovario ha progresado. Como se usa en el presente documento, “regresión del cáncer de ovario” pretende significar que la condición del sujeto con respecto al cáncer de ovario ha mejorado, caracterizada, por ejemplo, por una disminución del tamaño del tumor. “Progresión del cáncer de ovario” significa que la condición del sujeto con respecto al cáncer de ovario ha empeorado, caracterizado por, por ejemplo, aumento del tamaño del tumor, metástasis, etc.

Los métodos de la presente divulgación se pueden usar para predecir si un sujeto responderá a la ciclofosfamida o un análogo, o derivado del mismo, antes de comenzar el tratamiento con ciclofosfamida o un análogo, o derivado del mismo. Por ejemplo, los métodos de pronóstico se pueden realizar usando células derivadas de sujetos que muestran los primeros signos de recurrencia, que muestran recurrencia subclínica de su cáncer, o sujetos a los que se les ha diagnosticado formalmente que tienen cáncer. Dichos métodos normalmente comprenden comparar el nivel de expresión de CCR4 en células Teff en una primera muestra biológica obtenida antes de la exposición a ciclofosfamida con el de una segunda muestra biológica que se ha expuesto in vitro a mafosfamida. Un nivel significativa o sustancialmente mayor de expresión de CCR4 en células Teff en la segunda muestra es una indicación positiva de que el sujeto responderá al tratamiento con ciclofosfamida. Un nivel significativa o sustancialmente más bajo de expresión de CCR4 es una indicación negativa de que el sujeto responde al tratamiento con ciclofosfamida. En otras palabras, el sujeto no responderá o responderá de forma subóptima al tratamiento con ciclofosfamida.

La presente divulgación también proporciona un método para predecir si un sujeto, que no ha sido tratado previamente con ciclofosfamida, responderá al tratamiento con ciclofosfamida, o un análogo o derivado del mismo, el método que comprende analizar las células T efectoras (Teff) del sujeto para la expresión de CCR4, tras la exposición in vitro a ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma, donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en dichas células identifica a un sujeto que responderá positivamente al tratamiento con ciclofosfamida in vivo.

En un ejemplo, el análisis se realiza en una muestra biológica que comprende células Teff.

La expresión de CCR4 puede determinarse usando cualquier técnica que pueda usarse para identificar y cuantificar las células que expresan CCR4. En un ejemplo, la cantidad de CCR4 puede determinarse poniendo en contacto una muestra de células derivadas de dicho sujeto con cualquier agente de unión a la superficie celular como, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y fragmento de dominio variable (dAb), fragmentos pesados variables (VH) y ligeros variables (VL); un péptido; un aptámero, un nanocuerpo u otro reactivo de afinidad sin anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, pero en particular son anticuerpos monoclonales. El agente (por ejemplo, anticuerpo) puede proceder de cualquier fuente, incluidos los animales (por ejemplo, hámster, murino, rata, conejo, etc., o humanos o primates). El anticuerpo puede estar parcial o totalmente humanizado.

En ciertos ejemplos, la expresión de CCR4 se detecta usando un anticuerpo. El término “anticuerpo” abarca ampliamente formas naturales de anticuerpos y anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos y humanizados, así como fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos ejemplos, el anticuerpo se marca con una sustancia detectable para facilitar la detección en la muestra biológica. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa. Los ejemplos de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo.

En algunos ejemplos, los métodos de la presente divulgación se practican usando un anticuerpo disponible comercialmente que se une a CCR4 humano. Se pueden adquirir ejemplos de anticuerpos comerciales adecuados que se unen al CCR4 humano de Lifespan BioSciences, Invitrogen, Enzo Lifesciences, Inc, Abcam, Miltenyi Biotec, Bio Legend, BD Biosciences, Santa Cruz Biotechnology, Inc y Abbexa Ltd.

Los anticuerpos apropiados para CCR4, o anticuerpos que reconocen epítopos particulares de los mismos, pueden prepararse mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante la inmunización de animales de experimentación, con las modificaciones apropiadas hechas a los anticuerpos en términos de marcaje, etc. Los ejemplos de métodos que pueden usarse para determinar la expresión de CCR4 incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica o tinción de células con anticuerpos y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Quimioterapia

Los métodos de la presente divulgación se pueden usar para identificar sujetos que responderán a la ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma. Los métodos de la presente divulgación también se pueden usar para predecir si un sujeto que no ha recibido ciclofosfamida previamente responderá a la ciclofosfamida.

El cáncer de ovario es una enfermedad molecularmente heterogénea y las diferencias moleculares impulsan comportamientos clínicos distintos. A pesar de esto, los principales tratamientos quimioterapéuticos basados en platino/taxanos para el cáncer de ovario no han evolucionado en las últimas dos décadas, lo que ha resultado en una mejoría estancada en la supervivencia del cáncer de ovario, con una mediana de supervivencia a cinco años sin cambios de aproximadamente 40 %. La participación de más de 12.000 mujeres en ensayos clínicos de fase III no ha cambiado el panorama terapéutico (Bookman, MA (2011) Eur J Cancer 47 S3).

La ciclofosfamida es un agente quimioterapéutico que se ha usado durante mucho tiempo para tratar el cáncer (Arnold et al. (1958) Nature 181(4613):931) y enfermedades autoinmunes. En dosis altas es inmunosupresor, mientras que en dosis bajas no tóxicas es un inmunoestimulante. Actualmente, la ciclofosfamida en dosis altas se usa como inmunosupresor para tratar enfermedades autoinmunes como el lupus o el acondicionamiento para trasplantes de médula ósea, ya que causa un agotamiento general de la linfa (Dussan et al. (2008) Lupus. 17 (12): 1079-85; Rossi et al. (2003)) Bone marrow transplant. 31(6):441-6.). La ciclofosfamida en dosis bajas se usa para tratar el cáncer (Liu et al. (2010) J Immunother 33(1):53-9; Lutsiak et al. (2005) Blood. 105(7):2862-8; Ghiringhelli et al. (2007). Cancer Immunol Immunother 56(5):641-8; Kishimoto et al. (1990) Circulation. 82(3):982-9; Brodsky & Jones. (2008) Autoimmunity 41(8):596-600) y, en comparación con la ciclofosfamida en dosis altas, generalmente se tolera bien con un riesgo significativamente reducido de efectos secundarios.

LDCy se utiliza, así como inmunoterapéutico en una variedad de cánceres. Este es un miembro de la familia de las oxazafosforinas de agentes alquilantes de mostaza. La ciclofosfamida es un profármaco inerte. Sin embargo, tras la administración, la ciclofosfamida es hidrolizada por las enzimas del citocromo P450 en el hígado a su forma farmacológicamente activa 4-hidroxiciclofosfamida, que existe en equilibrio con su tautómero, la aldofosfamida (Clarke & Waxman (1989) Cancer Res 49(9):2344-50; Yu et al. (1999) J. Pharm. Exp. Ther. 288(3):928-37). En el citosol de las células diana, los dos productos se convierten, mediante eliminación p espontánea, en mostaza de fosforamida y acroleína (Brode & Cooke, (2008) Crit. Rev. Immunol. 28(2):109-26). Ambos metabolitos son agentes alquilantes citotóxicos, mientras que la mostaza de fosforamida también provoca el entrecruzamiento del ADN que provoca la muerte celular.

En un ejemplo, la ciclofosfamida y sus sales, análogos o derivados farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, ciclofosfamida, 4-hidroxiciclofosfamida, aldofosfamida, mostaza fosforamida, acroleína, mafosfamida, 4-hidroperoxiciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida y similares.

Agentes de quimioterapia

En algunos ejemplos, los métodos comprenden además la administración de un agente quimioterapéutico adicional. El agente quimioterapéutico adicional se puede administrar al sujeto antes, sustancialmente simultáneamente o después del tratamiento con el agente quimioterapéutico. En algunos ejemplos, el agente quimioterapéutico se administra antes que el agente quimioterapéutico adicional. En algunos ejemplos, el agente quimioterapéutico adicional se administra antes que el agente quimioterapéutico.

A lo largo de la especificación, “agente quimioterapéutico” y “agente terapéutico contra el cáncer” se usan indistintamente. Los ejemplos de agentes terapéuticos contra el cáncer o agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como melfalán, clorambucilo, busulfán, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, descarbacina, metotrexato y mitomicina C; sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina , marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptongrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology , Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTEPvE™, Pvhne-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; trastuzumab, docetaxel, platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAKT™ (denileukina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores, como los antiestrógenos, incluidos, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 1 17018, onapristone y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otros agentes terapéuticos contra el cáncer incluyen sorafenib y otros inhibidores de la proteína quinasa como afatinib, axitinib, bevacizumab, cetuximab, crizotinib, dasatinib, erlotinib, fostamatinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, lenvatinib, mubritinib, nilotinib, panitumumab, pazopanib, pegaptanib, ranibizumab, ruxolitinib, trastuzumab, vandetanib, vemurafenib y sunitinib; sirolimus (rapamicina), everolimus y otros inhibidores de mTOR. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la topoisomerasa I (por ejemplo, irinotecán, topotecán, camptotecina y análogos o metabolitos de los mismos, y doxorrubicina); inhibidores de la topoisomerasa II (por ejemplo, etopósido, tenipósido y daunorrubicina); intercaladores de ADN (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino); intercaladores de ADN y generadores de radicales libres como la bleomicina; y miméticos de nucleósidos (por ejemplo, 5-fluorouracilo, capecitibina, gemcitabina, fludarabina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e hidroxiurea). Además, los ejemplos de agentes quimioterapéuticos que interrumpen la replicación celular incluyen: paclitaxel, docetaxel y análogos relacionados; vincristina, vinblastina y análogos relacionados; talidomida, lenalidomida y análogos relacionados (por ejemplo, CC-5013 y CC-4047); inhibidores de proteína tirosina quinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib y gefitinib); inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib); inhibidores de NF-^kB, incluidos los inhibidores de la quinasa I^kB; anticuerpos que se unen a proteínas sobreexpresadas en cánceres y otros inhibidores de proteínas o enzimas que se sabe que están reguladas en aumento, sobreexpresadas o activadas en cánceres, cuya inhibición regula negativamente la replicación celular.

El experto en la técnica sabrá que la clasificación del agente quimioterapéutico adicional en una clase (por ejemplo, agente alquilante) no excluye que también se clasifique en otra clase.

Determinación de la respuesta clínica en un sujeto

Los métodos para determinar si un sujeto ha respondido clínicamente al tratamiento serán conocidos por los expertos en la técnica. El término tiene una definición amplia y puede determinarse, por ejemplo, evaluando la toxicidad relacionada con el tratamiento y la respuesta al tratamiento según varios criterios, como los criterios de toxicidad comunes del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) o los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST). También se pueden evaluar la supervivencia libre de progresión (PFS) y la supervivencia general (OS). El criterio RESIST utiliza tomografía computarizada (TC) o imagines de resonancia magnética (IRM) para medir el diámetro más grande del tumor objetivo o cualquier aparición de novo de nuevas lesiones.

En algunos ejemplos, la respuesta clínica se determina según los criterios de respuesta CA125 del Intergrupo de cáncer ginecológico (GCIG). El GCIC mide los niveles séricos de CA125. El biomarcador CA125 es una glicoproteína producida y eliminada por algunos tumores ginecológicos. Usando una combinación de GCIG y RECIST, las respuestas de los pacientes se pueden clasificar en respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR), enfermedad estable (SD) y enfermedad progresiva (PD) (Rustin GJ et al. (2011) PubMed p M iD 21270624).

Métodos de tratamiento

La presente divulgación también se refiere a métodos para tratar el cáncer (por ejemplo, cáncer ginecológico) en un sujeto que lo necesita según la probabilidad de respuesta prevista. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que se ha identificado que responde positivamente al tratamiento con ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, en base a la expresión de CCR4 en las células Teff del sujeto. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende identificar un sujeto que responderá positivamente al tratamiento con ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, según un método descrito en el presente documento y tratar al sujeto con ciclofosfamida, o un análogo o derivado del mismo.

La cantidad de ciclofosfamida o análogo o derivado de la misma, administrada al sujeto será a discreción del médico tratante. Por ejemplo, la cantidad de ciclofosfamida administrada al sujeto puede depender del sujeto que se está tratando, del peso del sujeto, de la gravedad del cáncer, de la forma de administración y del programa de tratamiento. La cantidad y el programa de tratamiento se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles de los ingredientes activos que sean suficientes para mantener los efectos terapéuticos o profilácticos.

En algunos ejemplos, se administra ciclofosfamida en dosis bajas. En algunos ejemplos, se administran 50 mg de ciclofosfamida. En algunos ejemplos, se administran 100 mg o 150 mg de ciclofosfamida.

En algunos ejemplos, la ciclofosfamida se administra al menos dos veces al día, al menos a diario, al menos cada dos días, al menos cada tres días, al menos cada cuatro días, al menos cada 5 días, al menos cada 6 días, al menos semanalmente, al menos quincenalmente o al menos mensualmente.

En algunos ejemplos, la administración es metronómica.

En algunos ejemplos, la ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma, se administra por vía oral o sistémica.

En algunos ejemplos, la ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma, se administra de forma cíclica. Por ejemplo, la ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma, se puede administrar durante un período de dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días o siete días antes de suspender la administración por un período de tiempo (por ejemplo, pero no limitado a, una, dos, tres de cuatro semanas). El ciclo puede entonces repetirse a discreción del médico tratante. En un ejemplo, la ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma, se administra durante tres días seguidos de un período de descanso de X días (por ejemplo, 14 días). En un ejemplo, se administran 50 mg de ciclofosfamida, o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma, dos veces al día durante tres días seguidos de un período de descanso de X días (por ejemplo, 14 días).

En algunos ejemplos, los métodos para el tratamiento también pueden comprender la administración de un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, inhibidores de puntos de control, vacunas y agentes inmunomoduladores. El experto en la materia sabrá que la clasificación del agente terapéutico en una clase (por ejemplo, inhibidor de puntos de control) no excluye que también se clasifique en una clase diferente.

En algunos ejemplos, los métodos de tratamiento también pueden comprender la administración de un tratamiento no basado en fármacos. Como se usa en el presente documento, el tratamiento “no basado en fármacos” incluye, pero no se limita a, radioterapia o cirugía o similar. Por ejemplo, el tumor se puede resecar antes de la administración del agente quimioterapéutico.

La frecuencia y el tipo de tratamiento administrado al sujeto quedarán a discreción del médico tratante.

Terapias combinadas

Inhibidores de puntos de control

En algunos ejemplos, los métodos comprenden además la administración de un inhibidor de puntos de control. El inhibidor de puntos de control se puede administrar al sujeto antes, sustancialmente simultáneamente o después del tratamiento con ciclofosfamida. En algunos ejemplos, la ciclofosfamida se administra antes que el inhibidor del punto de control. En algunos ejemplos, el inhibidor del punto de control se administra antes que la ciclofosfamida.

Como se usa en el presente documento, los “ inhibidores de puntos de control” incluyen cualquier agente que bloquee o inhiba de una manera estadísticamente significativa, las vías inhibidoras del sistema inmunitario. Por ejemplo, los inhibidores de puntos de control pueden afectar la función Treg. Los inhibidores de puntos de control incluyen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, otras proteínas de unión, agentes terapéuticos biológicos o moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, los inhibidores de puntos de control se unen y bloquean o inhiben los receptores de puntos de control inmunitarios. En algunas realizaciones, los inhibidores de puntos de control se unen y bloquean o inhiben ligandos de receptores de puntos de control inmunitarios. En algunos ejemplos, los inhibidores de puntos de control pueden bloquear o inhibir CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, LAG3, T ⁱM3, VISTA, KIR, 2B4 (pertenece a la familia CD2 de moléculas y se expresa en todas las células T NK, ^y6 y memoria CD8+ (ap), CD160 (también conocido como BY55), CGEN-15049, CHK 1 y CHK2 quinasas, A2aR y varios ligandos de la familia B-7 y una combinación de los mismos. Los ligandos de la familia B7 incluyen, pero no se limitan a, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 y B7-H7. En algunos ejemplos, el inhibidor del punto de control interactúa con un ligando de una proteína del punto de control que puede ser CTLA-4, PDLI, PDL2, PDI, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, ligandos de la familia B-7 o una combinación de los mismos. Los ligandos de proteína de punto de control incluyen, pero no se limitan a, PD-LI, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 y TIM-3.

En algunos ejemplos, el inhibidor del punto de control es un agente terapéutico biológico o una molécula pequeña. En algunos ejemplos, el inhibidor del punto de control es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, una proteína de fusión o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, los inhibidores de puntos de control incluyen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, otras proteínas de unión, terapéuticos biológicos o moléculas pequeñas, que se unen y bloquean o inhiben la actividad de uno o más de CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD 160 y CGEN-15049. Los ejemplos de inhibidores de puntos de control incluyen, pero no se limitan a, Tremelimumab (anticuerpo anti-CTLA-4), anti-OX40, Anticuerpo monoclonal PD-LI (Anti-B7-HI; MEDI4736), MK-3475 (bloqueador de PD-1), Nivolumab (anticuerpo anti-PDI), CT-011 (anticuerpo anti-PDI), anticuerpo monoclonal BY55, AMP224 (anticuerpo anti-PDLI), B^m S-936559 (anticuerpo anti-PDLI), M^p L^d L3280A (anticuerpo anti-PDLI), MSB0010718C (anticuerpo anti-PDLI) y Yervoy/ipilimumab (anticuerpo anti-CTLA-4).

Vacunas

En algunos ejemplos, los métodos comprenden además la administración de una vacuna. La vacuna se puede administrar al sujeto antes, sustancialmente simultáneamente o después del tratamiento con ciclofosfamida. En algunos ejemplos, la ciclofosfamida se administra antes de la vacuna. En algunos ejemplos, la vacuna se administra antes que la ciclofosfamida.

Puede usarse cualquier vacuna adecuada. Como se usa en este documento, las vacunas incluyen, pero no se limitan a, vacunas contra el cáncer. Como se usa en el presente documento, una “vacuna contra el cáncer” se refiere a una vacuna que estimula al sistema inmunitario para atacar las células cancerosas del cuerpo. En consecuencia, en lugar de prevenir la enfermedad, una vacuna contra el cáncer estimula el sistema inmunológico (por ejemplo, induciendo células T CD8 y/o células T CD4) para atacar una enfermedad que ya existe. En algunos ejemplos, una vacuna contra el cáncer puede usar células cancerosas, partes de células o antígenos puros para aumentar la respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que ya están en el cuerpo. Los ejemplos no limitativos de vacunas contra el cáncer incluyen vacunas de células tumorales, vacunas de antígenos, vacunas de células dendríticas, vacunas de ADN o ARN y vacunas basadas en vectores.

En algunos ejemplos, la vacuna es una vacuna antigénica que comprende un antígeno y un adyuvante y, opcionalmente, un vehículo. Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen Montanide ISO720, Alum, etc. Las vacunas antigénicas estimulan el sistema inmunitario mediante el uso de uno o más antígenos, en contraste con las células tumorales completas que contienen muchos miles de antígenos. Estos antígenos pueden ser péptidos, proteínas, ARNm o ADN. Las vacunas de antígenos pueden ser específicas para cierto tipo de cáncer porque cada tipo de tumor puede identificarse mediante perfiles de antígenos específicos. Para maximizar la eficacia de estas vacunas, puede ser beneficioso combinar múltiples antígenos en la vacuna según el perfil de antígeno de un cáncer específico.

En algunos ejemplos, las vacunas contra el cáncer pueden fabricarse a partir de células cancerosas reales que se han extraído de un sujeto. Una vez extraídas, las células cancerosas se modifican en el laboratorio, generalmente con radiación, o mediante la generación de un lisado de células cancerosas para que no puedan formar más cáncer. Las células cancerosas se pueden modificar aún más, por ejemplo, mediante la adición de sustancias químicas o nuevos genes, para que sea más probable que el sistema inmunitario del sujeto las considere extrañas. Luego, las células modificadas se vuelven a inyectar en el sujeto. El sistema inmunitario es capaz de reconocer los antígenos de estas células y, a través de procesos fisiológicos naturales, busca y ataca/mata las células que expresan el antígeno deseado.

En algunos ejemplos, la vacuna contra el cáncer comprende una vacuna de células dendríticas. Las vacunas de células dendríticas son a menudo vacunas autólogas y, a menudo, deben prepararse individualmente para cada sujeto. El proceso utilizado para crearlos es complejo y costoso. Por ejemplo, las células inmunitarias se extraen de la sangre del sujeto y se exponen a células cancerosas o antígenos cancerosos, así como a otras sustancias químicas que las convierten en células dendríticas y las ayudan a crecer. Luego, las células dendríticas se inyectan nuevamente en el sujeto, donde deberían provocar una respuesta inmune a las células cancerosas en el cuerpo.

En algunos ejemplos, la vacuna contra el cáncer comprende una vacuna de ADN y/o ARN. Los ejemplos no limitativos de vacunas contra el cáncer incluyen DCVax es Sipuleucel-T (o Provenge®). DCVax es una tecnología de plataforma que utiliza células dendríticas activadas y está diseñada para revitalizar y educar al sistema inmunitario para atacar el cáncer. DCVax utiliza muchos agentes activos para alcanzar muchos objetivos en el cáncer (Liau, LM et al. Journal of Neurosurgery 90:1115-1124, 1999; Prins RM et al. J Immunother. 2013 Feb.; 36(2):152-7). Sipuleucel-T es una vacuna de células dendríticas que se usa para tratar el cáncer de próstata avanzado que no es tratable con terapias quimioterapéuticas u hormonales tradicionales. Para esta vacuna, las propias células inmunitarias del sujeto se aíslan del sujeto y luego las células inmunitarias se exponen a productos químicos para convertirlas en células dendríticas. Las células dendríticas se exponen a la fosfatasa ácida prostática (PAP) que, cuando se reintroduce en el sujeto, produce una respuesta inmunitaria contra el cáncer de próstata.

Agentes inmunomoduladores

En algunos ejemplos, los métodos comprenden además la administración de un agente inmunomodulador. El agente inmunomodulador puede administrarse al sujeto antes, sustancialmente simultáneamente o después del tratamiento con ciclofosfamida. En algunas realizaciones, la ciclofosfamida se administra antes que el agente inmunomodulador. En algunos ejemplos, el agente inmunomodulador se administra antes que la ciclofosfamida.

Como se usa en el presente documento, un “agente inmunomodulador” incluye un compuesto que induce o aumenta la inmunogenicidad y el reconocimiento inmunitario de las células cancerosas por parte del sistema inmunitario del huésped. Por ejemplo, el agente inmunomodulador puede ser un anticuerpo inmunomodulador, una vacuna contra el cáncer, una citocina terapéutica, una terapia celular o combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, el anticuerpo inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-CTLA-4, anti-PDL1, anti-PDL2, anti-PD1, anti-CD137, anti-CD40 o anti-OX-40. En algunos ejemplos, la vacuna contra el cáncer es como se define aquí. Por ejemplo, la vacuna contra el cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en anticuerpos antiidiotípicos, inhibidores de la angiogénesis, péptidos específicos de antígenos tumorales o proteínas recombinantes. En algunos ejemplos, la terapia celular se selecciona del grupo que consiste en células T, células madre, células dendríticas, células inmunitarias y/o cancerosas modificadas genéticamente o farmacológicamente.

Ejemplos

Métodos

1.1 Diseño del ensayo y detalles del paciente

Se reclutaron diez (10) pacientes humanos con cánceres ginecológicos con edades comprendidas entre 62 y 82 años en un ensayo bicéntrico de fase II. Los pacientes tenían tumores ginecológicos refractarios al tratamiento avanzado y fueron reclutados del Royal Women's Hospital, Melbourne, Australia (n = 3) y del University Hospital Leuven, Bélgica (n = 7) ver Tabla 1. La progresión de la enfermedad se determinó usando criterios RECIST y GCIG CA125 (Rustin GJ et al., (2011) Official journal of the International Gynecological Cancer Society Feb; 21(2):419-23). Desde el momento del reclutamiento, se obtuvo el consentimiento por escrito de los pacientes y se recolectaron muestras de sangre pretratamiento. Los pacientes recibieron dosis orales de 50 mg de ciclofosfamida dos veces al día (mañana y noche), durante 3 días consecutivos y se recolectó sangre 2 semanas después en tubos recubiertos con EDTA para sangre total y tubos de separación de suero para sueros (BD Vacutainer, BD, EE. UU.). El ciclo de tratamiento y la toma de muestras de sangre se repitieron a intervalos quincenales durante un máximo de 8 ciclos. Para muestras sanas, se obtuvieron capas leucocitarias de donaciones de sangre de rutina, adquiridas en el Servicio de Sangre de la Cruz Roja Australiana.

Tabla 1 Resumen del paciente

1.2 Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) dentro de las 24 horas de la extracción de sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, Suecia). A continuación, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Las PBMC aisladas se congelaron en un medio de congelación que contenía 10 % de DMSO (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y 90 % de suero de ternero fetal inactivado por calor (GIBCO, Life Technologies, EE. UU.) o 90 % de suero AB humano (Sera Laboratories International, Reino Unido) a una velocidad de 1 °C/min a -80 °C y posteriormente almacenada en nitrógeno líquido. Tras la descongelación, cada vial de PBMC congeladas se descongeló rápidamente en un baño de agua a 37 °C y se volvió a suspender en medio AIM-V (Life Technologies, EE. UU.) con suero humano normal al 5 % (HS, Sigma-Aldrich, EE. UU.) (medios AIM-V completos).

1.3 Conteo de células

Se contaron las células utilizando un hemocitómetro de vidrio (Hausser Scientific, EE. UU.) en un microscopio invertido (Leica Microsystems, Alemania). Las células se diluyeron en tinción con Trypan Blue (GIBCO, Life Technologies, EE. UU.) para determinar la viabilidad celular.

Fórmula para calcular el recuento de células:

Células totales = recuento de células * factor de dilución * volumen de células en el tubo * 104.

1.4 Detección de CCL22 en suero

Las concentraciones de CCL22 en sueros de pacientes con cáncer y donantes sanos se determinaron utilizando un kit de inmunoensayo de microesferas multiplex (panel 5-plex de quimiocinas humanas, Life Technologies, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se adquirieron en un sistema Bio-Plex 200 (Bio-Rad, EE. UU.), recolectando un mínimo de 100 eventos. Los resultados se analizaron utilizando el software Bio-Plex Manager versión 5 (Bio-Rad, EE. UU.).

1.5 Análisis de citometría de flujo

Para determinar la frecuencia y el fenotipo de las poblaciones de células T en PBMC, se realizó una citometría de flujo multicolor utilizando los siguientes anticuerpos de superficie: anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD25 y anti-CCR4. Los anticuerpos se diluyeron en dPBS con HS al 5 % (tampón de tinción). Las células se tiñeron a temperatura ambiente durante 15 min a una concentración final de 107 células/150 pl de coctel de anticuerpos. A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón de tinción. Se usó un colorante de células muertas fijable (kit de tinción de células muertas fijable en vivo/muerto, Life Technologies, EE. UU.) para distinguir entre células muertas y vivas. El tinte se diluyó 1/500 en tampón de tinción y las células se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente a una concentración final de 107 células/150 pl de tinte diluido y luego se lavaron dos veces en tampón de tinción. Los niveles intracelulares de FoxP3 se determinaron después de la fijación y permeabilización de las células utilizando un kit de tampón de fijación/permeabilización (eBioscience, EE. UU.). El concentrado de fijación/permeabilización se diluyó 1:3 con el diluyente. A continuación, las células se resuspendieron en 50 pl de la solución diluida de fijación/permeabilización durante 30 minutos a 4 °C. Anti-FoxP3 intracelular y anti-Ki67 se diluyeron en tampón de lavado de fijación/permeabilización (eBioscience, EE. UU.). Las células se lavaron en tampón de lavado de fijación/permeabilización, luego se resuspendieron en los anticuerpos intracelulares diluidos a una concentración final de 107 células/150 pl y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en dPBS con paraformaldehído al 1 % (PFA, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un citómetro de flujo Becton Dickinson LSR II utilizando el software FACSDiva, adquiriendo un mínimo de 100.000 eventos por muestra. También se usaron controles de fluorescencia menos uno (FMO) y anticuerpos de isotipo coincidente para permitir una activación precisa. Los datos se analizaron utilizando el software Flowjo (TreeStar, EE. UU.). La lista de anticuerpos se muestra en la Tabla 2.

1.6 Ensayo de citotoxicidad de células T

La capacidad citotóxica de las células T se determinó cultivando PBMC con medio AIM-V completo a 106 células/500 pl de pocillo en una placa de 48 pocillos. A continuación, las células se estimularon durante 6 horas con 50 ng/ml de forbol 12-miristrato 13-acetato (PMA, Sigma-Aldrich, EE. UU.) y 1 pg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas (dilución 1/1.500 de solución madre, BD GolgiStop, BD biosciences, EE. UU.) y anti-CD107a (dilución 1/20 de solución madre, BD Pharmingen, EE. UU.) a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Se añadió Brefeldin A (eBioscience, EE. UU.) a 3 pg/ml durante las últimas 4 horas de incubación. Después de la incubación, las células se lavaron y marcaron para marcadores de superficie como se describe anteriormente. Las células se analizaron usando citometría de flujo, las células no estimuladas, la fluorescencia menos uno (FMO) y los anticuerpos de isotipo coincidente también se usaron como controles. Los datos se recogieron y analizaron como se indicó anteriormente.

1.7 Experimento de drogas in vitro

Para investigar el efecto de la ciclofosfamida sobre las células T in vitro, se trataron PBMC de pacientes, pretratamiento y donantes sanos con mafosfamida (Niomech, Alemania), un análogo del metabolito hepático farmacológicamente activo de la ciclofosfamida. La mafosfamida se reconstituyó tras su uso a una concentración de 80 mg/ml en agua estéril Millo Q. Las células T CD4+ y CD8+ se purificaron marcando las células con los respectivos anticuerpos como se ha descrito anteriormente y luego utilizando la clasificación de células activada por fluorescencia. Se cultivaron PBMC enteras o células T CD4+ y CD8+ purificadas en medio AIM-V completo a 3 x 105 células/150 pl de pocillo en una placa de 96 pocillos con mafosfamida a 1.5 pg/ml o medio durante 72 horas a 37 °C en una Incubadora humidificada con 5 % CO2. Para cultivos celulares purificados, se añadió IL-2 a una concentración de 20 unidades/ml para mantener la viabilidad celular. Después de la incubación, las células se lavaron y se determinó la expresión de CCR4 en Tregs y células T efectoras usando citometría de flujo como se describe anteriormente. Para determinar el perfil de secreción de citoquinas de las células T después del tratamiento in vitro, las células se trataron con mafosfamida como se describe anteriormente en un transcurso de tiempo de 24, 48 y 72 horas. Las células se estimularon con PMA e ionomicina como se describe anteriormente en las últimas 6 horas de incubación para cada punto de tiempo. A continuación, las células se lavaron y marcaron para marcadores de superficie y luego se tiñeron con citoquinas intracelulares como se describió anteriormente usando anti-IL-4 (BD Pharmingen, EE. UU.) y anti-IL-2 (BD Pharmingen, EE. UU.).

1.8 Detección de acetilación de histona 3

La acetilación de la histona 3 en la lisina (H3K)9, H3K14 y H3K18 se evaluó mediante citometría de flujo. Inicialmente, las células se cultivaron como se describe anteriormente en mafosfamida a 1.5 pg/ml o IL-4 (R&D Systems, EE. UU.) a 10 ng/ml o con IL-2 (R&D Systems, EE. UU.) a 20 unidades/ml durante 72 horas. En las últimas 4 horas de cultivo, se añadió panobinostat 50 nM (LBH589, un inhibidor de pan histona desacetilasa (HDAC)) a los cultivos de IL-2. Las células se recolectaron y prepararon para el análisis de citometría de flujo como se describe anteriormente. Después del marcaje, la fijación y la permeabilización de la superficie, las células se marcaron con anti-H3K9, anti-H3K14 y anti-H3K18 no conjugados (Cell Signaling Technology, EE. UU.). El marcaje secundario se realizó usando un anticuerpo Ig anticonejo de burro conjugado con Alexa Fluor 488 (Biolegend, EE. UU.). Los datos se recogieron y analizaron como se indicó anteriormente.

1.9 Ensayo de migración

Las PBMC de donantes sanos se trataron con mafosfamida como se describe anteriormente. Después de 72 horas de incubación, las células se lavaron y las células viables se sembraron en insertos transwell de 24 pocillos (Corning, EE.UU.) a 2.5 x 105 células/100 pl de inserto en medio AIM-V con 0.5 % de albumina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich, EE.UU.). Se añadieron 600 pl de CCL22 (R&D Systems, EE. UU.) a 100 ng/ml en medio AIM-V o medio AIM-V solo a cada pocillo debajo del inserto transwell. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % durante 2 horas, después de lo cual se contaron y se determinaron los subconjuntos de células T mediante citometría de flujo. Los índices de migración se calcularon dividiendo el porcentaje de células que migraron hacia CCL22 por el de células que migraron hacia el medio solo.

1.10 Estadísticas

Para determinar la significancia estadística, se usaron pruebas no paramétricas. Para comparar las diferencias en los pacientes entre las muestras de postratamiento y pretratamiento in vitro e in vivo, se realizaron pruebas de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon, mientras que las pruebas de Mann-Whitney se usaron para comparar entre grupos de pacientes o entre pacientes y donantes sanos. Para determinar la importancia en la multiplicidad de cambios después del tratamiento, se realizaron pruebas de rangos con signos de Wilcoxon para probar la hipótesis nula de que las medias eran iguales a 1. Se usaron pruebas de correlación de Spearman para determinar las correlaciones entre parámetros. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (v.6, GraphPad Software, Inc, EE. UU.). p<0.05 se consideró significativo. Se presentaron los valores medios ± el error estándar de la media (SEM).

Tabla 2 Lista de anticuerpos Anticuerpo Fluorocromo Compartía (Número de catálogo)

CD3 0655 Life Technologies (Q10012)

C03 BV655 Btotogend (3* 7324)

e n ^{V4S0 80 Hortron (500365)}

CD4 AF700 BD Phennigan (557922)

C04 APC-CY7 BO Ptiarrnngen (557871)

C08 0605 üfe Tachnotog>es (010009) COi BV605 BM>legend (301039)

CD8 Percp-Cy55 BO PtMrmngen (560662)

CD2S PE BO Pturmngen (555432)

CD28 PE-CFS94 BO Ptuniigen (562403)

FoxP3 Ar700 eB<osoence (56-4776-41)

FoxPS Percp eB osoence (45-4776-73)

Fo*P3 APC eB oscience (17-4776-42)

FoxP3 eFluor 450 eB osceoce (46-4776-42)

CCR4 PE-Cy7 BO Ptiarrnngon (557869)

CCR4 PE BD Ptier*mgen (551120)

Ki47 V450 BO Horvon (561281)

IL-2 APC ^{BO Ptuii’mgen (554567)}

IL-4 Percp-Cy55 BO Phjrrrangen (561234) CD107a Blotina BO Pher-moen (555799) CO107e PE BO Ptiarrnngen (555801)

H3K9 No conjugado Cali Signa tng (9649)

H3K14 No conjugado CeN Sgnaibng (7627)

H3K1S _{No conjugado} Catt S^namng (13996) Estreptavidina APC<«FkJOr 7SO eBioeoeoce (47-4317-62)

C03 Purificado Boiegend (3'7315)

C028 Purificado BO Plwrrnngen (556620)

^IL4 Purificado R & D SyVeme (MAB2062) Ejemplo 1. Un aumento en las células T CCR4+ después del tratamiento se asocia con una mayor supervivencia en pacientes con neoplasias malignas ginecológicas

Para investigar el efecto de la ciclofosfamida en la expresión de CCR4 dentro de las células T, se comparó la frecuencia del pretratamiento con células CCR4+ (n = media de 7-8 puntos de tiempo) con las frecuencias después de cada ciclo de tratamiento (n = media de 3-6 puntos de tiempo) para cada paciente individual. De los 10 pacientes, 4 tuvieron aumentos significativos en la frecuencia de células CCR4+ dentro de las células T CD3+ (aumento del % de CCR4 o pico de CCR4, Figura 2A), luego de al menos un ciclo de tratamiento y esto ocurrió dentro de los primeros 3 ciclos de tratamiento, mientras que en los otros 6 pacientes, la frecuencia de células CCR4+ dentro de las células T CD3+ se mantuvo relativamente constante (% CCR4+ constante o CCR4 estable, Figura 2 y Tabla 3).

Tabla 3: Cambio en la expresión del % CCR4 luego del tratamiento con ciclofosfamida

Los pacientes con “pico de CCR4” sobrevivieron significativamente más (aproximadamente 3 veces más) que los pacientes estables con CCR4 con una supervivencia global media de casi un año más, 476 ± 80 días en comparación con 163 ± 37 días (p<0.01). El momento de la estabilización de la enfermedad coincidió exactamente con el momento de su pico individual en las células T CCR4+ (no mostrado). Ninguno de los 6 pacientes con células “CCR4 estables” después del tratamiento logró una enfermedad estable (mostrada en la Figura 2B). De los 4 pacientes con aumento de CCR4, 3 lograron además una enfermedad estable y curiosamente, la estabilización de la enfermedad coincidió completamente con el momento del aumento de sus células T CCR4+ (Figura 2C). Ninguno de los 6 pacientes con % de células CCR4 constante sin cambios (CCR4 estable) después del tratamiento logró la estabilidad de la enfermedad (Figura 2C).

Ejemplo 2 La expresión de CCR4 aumenta en las células T CD8+ y las células T efectoras, pero no en las Treg

El tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida dio como resultado un aumento transitorio en la frecuencia de células CCR4+ dentro de las células T CD3+ en un subgrupo de pacientes. Para determinar aún más los subconjuntos de células T específicas que expresaban CCR4, los inventores centraron su análisis en estos pacientes en los puntos de tiempo donde se observó un aumento en la frecuencia de células CCR4+ dentro de las células T CD3+. A continuación, las células T se dividieron en subconjuntos de células T reguladoras, FoxP3+CD25+CD4+ (Tregs) y células T efectoras que eran FoxP3-CD25-CD4+ (Tconvs) o células T CD8+ (Figura 3A). Se determinaron las frecuencias de células CCR4+ dentro de los subconjuntos respectivos y los valores postratamiento se normalizaron a los valores pretratamiento. El aumento en la frecuencia de células CCR4+ dentro de las células T CD3+ fue impulsado por un aumento en la expresión de CCR4 en las poblaciones de células T efectoras, ya que tanto las células Tconvs como las células T CD8+ mostraron un aumento significativo de 5 veces en la frecuencia de las células CCR4+ (p<0.05 en ambos casos) en comparación con los niveles pretratamiento (Figura 3A). La frecuencia de células CCR4+ dentro de Tregs no aumentó significativamente (Figura 3A). También se evaluó la multiplicidad de cambios en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de CCR4 en Tregs, Tconvs y células T CD8+ en relación con los niveles pretratamiento y en las 3 poblaciones CCR4 MFI permaneció sin cambios (Figura 3A).

La proporción de células T efectoras a Tregs dentro del microambiente tumoral es un parámetro bien establecido que está asociado con el resultado clínico en pacientes con cáncer ginecológico (Gooden MJ et al., (2011) British journal of Cancer 28; 105 (1):93-103). Los inventores compararon las proporciones agrupadas de células T CCR4+ Tconvs y CCR4+ CD8+ con CCR4+ Tregs dentro de los 3 primeros ciclos de tratamiento entre pacientes con % CCR4 aumentado y pacientes con % CCR4 constante. Los pacientes con % CCR4 aumentado tenían una relación media de Tconvs a Tregs más de 2 veces mayor (p<0.01) y una relación media de células T CD8+ a Tregs más de 3 veces mayor (p<0.05) en comparación con los pacientes con % CCR4 constante (Figura 3B).

La expresión de CCR4 en células T está asociada con una pérdida de citotoxicidad (Kondo T et al. (2009) International Immunology 21(5):523-32). Por lo tanto, los inventores determinaron si la función citotóxica de las células T CD4+ o CD8+ estaba afectada por el aumento de células CCR4+ dentro de estas poblaciones. Las frecuencias de las células CD107a+ dentro de las células T CD4+ y CD8+ se determinaron utilizando muestras de 3 de los 4 pacientes con % CCR4 aumentado en uno de los puntos de tiempo donde aumentaron las frecuencias de las células T CCR4+. La frecuencia media de células CD107a+ en las poblaciones de CD4+ y CD8+ aumentó en comparación con las muestras de pretratamiento, sin embargo, ninguno de los aumentos fue significativo (Figura 4A y B).

Ejemplo 3 Los pacientes con mayor capacidad para generar células T CD4 efectoras CCR4+ in vitro mediante pretratamiento con mafosfamida, responden in vivo a la ciclofosfamida con un “pico de CCR4”

Para determinar si el aumento en la frecuencia de células T CCR4+ se debió directamente a la ciclofosfamida, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes antes del tratamiento y de donantes sanos con mafosfamida, la isoforma bioactiva de la ciclofosfamida. Una titulación determinó que la dosis óptima no tóxica de mafosfamida era de 1.5 pg/ml (Figura 5). El donante sano junto con las PBMC del paciente antes del tratamiento se cultivaron durante 3 días con 1.5 pg/ml de mafosfamida o medio solo. Las PBMC tratadas con mafosfamida de donantes sanos y pacientes tenían una frecuencia significativamente mayor de células CCR4+ dentro de las células T CD3+ en comparación con los medios (sanos: 22.9 % ± 1.79 % en comparación con 15.4 % ± 1.47 % p<0.001 y cáncer: 24.4 % ± 3.14 % frente a 19.6 % ± 2.82 %, p<0.01, Figura 6A).

De manera similar a la observación in vivo, cuando se determinó la multiplicidad de cambios en la frecuencia de las células CCR4+ para Tregs, Tconvs y células T CD8+, en relación con los medios, las PBMC tratadas con mafosfamida tuvieron aumentos significativos en la frecuencia de células CCR4+ dentro de Tconvs. (Saludable: 1.45 veces, p<0.05 y Cáncer: 1.18 veces, p<0.05) y células T CD8+ (Saludable: 2.52 veces, p<0.05 Cáncer: 1.61 veces, p<0.05). No se observaron cambios significativos en las frecuencias de células CCR4+ dentro de Tregs (Figura 6B). Esta tendencia fue similar entre los donantes sanos y los pacientes con cáncer, sin embargo, los aumentos en las veces de las células T CCR4+ dentro de Tconvs (p<0.01) y las células T CD8+ (p<0.01) fueron mayores en los donantes sanos que en los pacientes con cáncer (Figura 6B). El tratamiento con mafosfamida no alteró el MFI de CCR4 en ninguna de las poblaciones celulares tanto en donantes sanos como en pacientes con cáncer (Figura 6B).

También similar a las observaciones in vivo, el control diferencial en la expresión de CCR4 por mafosfamida entre las poblaciones de células T reguladoras y efectoras dio como resultado un aumento significativo de más de 2 veces en las proporciones medias de CCR4+ ^c D4+ Tconvs a CCR4+ Tregs (p<0.05) y células T CCR4+ CD8+ a CCR4+ Tregs (p<0.05) en comparación con células no tratadas tanto para donantes sanos como para pacientes con cáncer (Figura 6C).

En la figura se muestra una comparación de la regulación en aumento en la frecuencia de los efectores de células T CD4 CCR4+ entre pacientes CCR4 constantes (n = 6) y pacientes con CCR4 pico (n = 4) (p<0.0005), representada como aumento de veces, en la figura 6D.

Los inventores investigaron además si los pacientes con % CCR4 aumentado se diferenciaban de los pacientes con % CCR4 constante en su respuesta a mafosfamida, ya que esto puede haber sido indicativo de un pretratamiento de sesgo de respuesta. Sin embargo, mientras que el aumento de veces en la frecuencia de células CCR4+ dentro de las células T CD3+ fue ligeramente mayor para pacientes con % CCR4 aumentado en comparación con pacientes con % CCR4 constante, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 8A). Cuando se compararon las veces de cambio en las células CCR4+ dentro de Tconvs y las células T CD8+ entre los pacientes con % CCR4 aumentado y los pacientes con % CCR4 constante, el aumento dentro de Tconvs fue significativamente mayor en los pacientes con % CCR4 aumentado en comparación con los pacientes con % CCR4 constante (1.32 en comparación con 1.09, p<0.05, Figura 8B y C).

Ejemplo 4 Paclitaxel no aumenta significativamente la frecuencia de células T CCR4+ en PMBC sanas

Para determinar si se produjo un aumento en la frecuencia de células T CCR4+ tras el tratamiento con paclitaxel (otro agente antineoplásico), se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes sanos con mafosfamida y paclitaxel. Las PBMC de donantes sanos se incubaron en medio solo, 1.5 pg/ml del metabolito activo de ciclofosfamida mafosfamida o 30 ng/ml de paclitaxel durante 72 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Se recogieron las células y se usó el análisis de citometría de flujo para determinar la expresión de CCR4 en células T CD8+ y CD4+CD25-. Las células T CD8+ y CD4+CD25- tratadas con mafosfamida de donantes sanos tuvieron un aumento significativamente mayor de células CCR4+ en relación con las células no tratadas en comparación con las células tratadas con paclitaxel (CD8+: 1.39 en comparación con 1.00 p<0.05 y CD4+CD25-: 1.14 en comparación a 1.04, p<0.01, Figura 7).

Ejemplo 5 Mecanismo de inducción de la expresión de CCR4 en células T

La expresión de CCR4 se induce en condiciones de polarización de T^h2. Por lo tanto, los inventores examinaron si la regulación en aumento de CCR4 se debía a la polarización de Th2 por mafosfamida. La expresión de IL-4 en PBMC se correlacionó con la expresión de CCR4 durante un transcurso de tiempo de 3 días a intervalos diarios. No hubo correlación entre la expresión de CCR4 y la expresión de IL-4 en las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ (Figura 9A). En cambio, la expresión de CCR4 se correlacionó positivamente con la frecuencia de células IL-2+ en células T tanto CD4+ como CD8+ (Figura 10).

Los inventores investigaron además si la mafosfamida inducía la expresión de CCR4 en poblaciones de células T CD4+ y CD8+ purificadas. Se determinó la multiplicidad de cambio en la frecuencia de CCR4+ entre las células no tratadas y las tratadas con mafosfamida y se comparó entre las PBMC completas y las células aisladas. No hubo diferencias en el aumento medio de la frecuencia de las células CCR4+ dentro de las células T CD4+ purificadas y CD8+ purificadas en comparación con las células T CD4+ y CD8+ contenidas en las PBMC completas (Figura 9B).

La mafosfamida parecía estar regulando directamente la expresión de CCR4. Dado que se ha demostrado previamente que la ciclofosfamida actúa como un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC), modulando la acetilación en la histona 3 (H3) y, además, dado que la modificación epigenética H3 se ha asociado con la expresión del gen CCR4, los inventores investigaron si el control de la expresión de CCR4 por mafosfamida se debió a modificaciones epigenéticas. Los niveles de acetilación de H3K9, H3K14 y H3K18 se determinaron después del tratamiento de PBMC con panobinostat (LBH589, un inhibidor pan HDAC), mafosfamida o IL-4. El MFI de las células positivas para H3K9, H3K14 o H3K18 se determinó y normalizó al de las células cultivadas en medios solos. Ni el tratamiento con mafosfamida ni con IL-4 dieron como resultado un cambio en la acetilación de H3K14 (Figura 11). Los cambios en la acetilación fueron evidentes en H3K9 y H3K18. Se establecieron puertas en células positivas y dentro de ellas se determinaron las MFI de H3K9 acetilado y H3K18 acetilado. Hubo un aumento significativo, cercano a 1.2 veces (p<0.05) en el MFI de H3K9 y H3K18 acetilados en células T CD4+ y CD8+ cuando las células se trataron con mafosfamida. El tratamiento de las células con IL-4 dio como resultado una disminución ligera pero significativa (p<0.05) en la acetilación de H3K9 en las células T CD8+ (Figura 9C). No hubo diferencias significativas en la acetilación de H3K9 o H3K18 cuando se compararon células CCR4+ con células CCR4- dentro de células T CD4+ y CD8+ (Figura 9C).

Ejemplo 6 La expresión de CCR4 inducida por mafosfamida facilita la migración celular hacia CCL22

Para determinar si la expresión de CCR4 inducida por ciclofosfamida era funcional y podía iniciar la migración celular en respuesta a CCL22, se realizaron ensayos de migración in vitro utilizando PBMC de donantes sanos tratados con 1.5 |jg/ml de mafosfamida. Los índices de migración se calcularon como se describió anteriormente (Govindaraj C et al. (2013) Clinical Immunology149(1):97-110). En la figura 12 se muestra la concentración sérica de CCL22 en pacientes.

Hubo un aumento significativo en el índice de migración de las PBMC tratadas con mafosfamida hacia CCL22 (p<0.05), mientras que el de las PBMC no tratadas permaneció sin cambios (Figura 13A). Para confirmar aún más que esta migración direccional estaba relacionada con la expresión de CCR4, los inventores correlacionaron la frecuencia de células T CCR4+ con el índice de migración y encontraron una correlación positiva significativa entre los dos parámetros (p<0.001, r=0.81, Figura 13B).

Se muestra que, mediante la regulación en aumento diferencial de la expresión de CCR4 en poblaciones de células efectoras y no en Tregs, la ciclofosfamida da como resultado un cambio en la proporción de células efectoras a Tregs que tienen potencial para migrar al tumor. Por lo tanto, los inventores investigaron si esto reflejaba un cambio real en la proporción de efector a Tregs dentro de las células que traficaban hacia CCL22. La proporción de células Tconvs y T CD8+ a Tregs dentro de las células que migraron hacia CCL22 se comparó entre las PBMC que habían sido o no tratadas con mafosfamida. Ambas proporciones medias de Tconvs a Tregs y de células T CD8+ a Tregs fueron más de 2 veces mayores en las células tratadas con mafosfamida en comparación con las células no tratadas; sin embargo, esta diferencia solo fue significativa para la proporción de Tconvs a Tregs (p<0.05, Figura 13C).

Ejemplo 7 LDCv aumenta las células T CCR4+ CD8+ en sangre periférica y las células T CD8 activadas en TIL en un modelo de ratón inmunocompetente de cáncer de ovario

Para probar la predicción del ensayo piloto en humanos en el Ejemplo 1 de que las células T CD8 efectoras bioactivas aumentarían proporcionalmente sobre Treg en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) por dosis bajas de ciclofosfamida (LDCy) in vivo, los inventores adaptaron un modelo cáncer de ovario (OC) de murino inmunocompetente basado en una línea celular ID8 de carcinoma epitelial singénico, que administrado por vía peritoneal (i.p.) o intrabursal (i.b.) recapitula aspectos clave de la patología del cáncer de ovario, incluidos los cambios vasculares, el crecimiento lento, la formación de ascitis tumoral y el patrón de diseminación (Chiriva-Internati M et al. (2010) PloS one 5, e10471).

Para abordar los efectos de LDCy sobre la inmunidad en animales portadores de tumores, se trataron animales con ID8 implantados (n = 5/grupo) después de la exposición (al comienzo del crecimiento tumoral detectable in vivo) con un ciclo de LDCy y se evaluaron los cambios en subconjuntos de células T ex vivo en los días 1, 7 y 14 después del tratamiento in vivo por citometría de flujo. La Figura 14 muestra los datos del día 14. En sangre periférica, los inventores encontraron aumentos claros en las células T CCR4+ CD8+ aparentes (Figura 14A), una tendencia hacia aumentos del efector de células T CCR4+ CD4 y, de manera similar a los resultados del ensayo en humanos, no hubo aumentos en CCR4+ Treg. Dado que CCR4 está regulado a la baja por CCL22 secretado localmente por el tumor (Mariani M et al., (2004) Eur J Immunol 34:231; de Lavareille A et al (2001) European Journal of Immunology 31:1037-1046), y La infiltración de células T mediada por CCR4 está asociada con un fenotipo activado (Kovacsovics-Bankowski M et al., (2014) Journal for immunotherapy of cancer 2:38), los inventores también probaron los cambios concomitantes en la frecuencia de las células T activadas en linfocitos infiltrantes de tumores (TILS) por cotinción con el marcador de activación CD69. La Figura 14B muestra las células T TILS CD69+CD8+ claramente aumentados después del tratamiento con LDCy, con una tendencia de nuevo hacia aumentos del efector de células T CD69+ CD4, pero ningún aumento de Treg CD69+ correlacionado adicionalmente con aumentos de células T CCR4+ en sangre (no mostrado).

Ejemplo 8 Predicción de respondedores al tratamiento con ciclofosfamida

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtienen de un sujeto con cáncer y se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll dentro de las 24 horas posteriores a la extracción de sangre. A continuación, las células se suspenden en medio AMI-V con suero humano al 5 %. A continuación, las PBMC se cultivan durante 3 días con 1.5 pg/ml de mafosfamida o medio solo en condiciones apropiadas durante 3 días. A continuación, las células se recolectan y se tiñen con marcadores de superficie celular apropiados, incluidos CCR4, CD3, CD8, CD4 y CD25, y un colorante de células muertas que se puede fijar (por ejemplo, PE) para distinguir las células muertas. Los niveles intracelulares de FoxP3 se determinan después de la fijación y permeabilización de las células seguidas de marcaje con anti-FoxP3. A continuación, las células se recaudan adecuadamente y se analizan mediante citometría de flujo con referencia a controles de isotipo coincidente. Las células teff que expresan FoxP3-, CD25-, CD4+ y CD8+ se analizan para determinar la expresión de CCR4. En algunos casos, las Treg que expresan FoxP3+, CD25+, CD4+ también se analizan para determinar la expresión de CCR4.

El nivel de expresión de CCR4 en células Teff cultivadas en presencia de mafosfamida se compara con el nivel de expresión de CCR4 en células cultivadas en ausencia de mafosfamida.

Los sujetos que demuestran un aumento en la expresión de CCR4 (es decir, regulación en aumento) después del tratamiento con mafosfamida en comparación con las células no tratadas se seleccionan para el tratamiento con ciclofosfamida en dosis bajas o un análogo, derivado o metabolito activo de la misma.

Observaciones

El énfasis de la inmunoterapia para el cáncer ha estado en mejorar la inmunosupresión y activar la función de las células T efectoras (Dougan M y Dranoff G (2009) Ann Rev Immunol. 27: 83-117). Sin embargo, estos esfuerzos son inútiles si las células inmunitarias beneficiosas no pueden llegar a donde se necesitan. Los datos presentados en este documento indican que es posible preidentificar a los pacientes que responderán inmunológicamente y se beneficiarán del tratamiento inmunoterapéutico con dosis bajas de ciclofosfamida (LDCy) utilizando un protocolo de detección in vitro. La prueba de detección puede combinarse con pruebas genéticas para proporcionar potencia adicional.

Los efectos de LDCy en la regulación en aumento de CCR4 fueron consistentes en las células T efectoras, pero no en las Treg con un aumento dramático en la supervivencia (> 300 días) para los pacientes que se observó que tenían una regulación en aumento de CCR4 in vivo durante el tratamiento e in vitro en el preensayo CUP.

Los datos en animales apoyaron la hipótesis de que LDCy aumenta las células T efectoras CCR4+ CD8+ en la sangre (pero no CCR4+ Treg) promoviendo sus tumores de migración posteriores, enriqueciendo el infiltrado tumoral en células T CD8 activadas. Es importante destacar que el análisis in vitro pretratamiento de PBMC humanas también predeciría que los pacientes no responderían al tratamiento con LDCy, lo que les permitiría pasar a otros tratamientos.

Estos datos sugieren que la ciclofosfamida es capaz de activar directamente la expresión de CCR4 en las células T efectoras. El ensayo de migración confirmó la capacidad de las células tratadas con mafosfamida para migrar en respuesta a CCL22 y también mostró que hubo un aumento en la proporción de células T efectoras a Tregs en la fracción migrada.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar a un sujeto con cáncer que responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma, comprendiendo el método detectar la expresión de CCR4 en células Teff obtenidas de un sujeto al que se le ha administrado previamente al menos una dosis o ciclo de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff indica que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento.

2. El método según la reivindicación 1, donde la detección comprende:

(i) poner en contacto in vitro las células Teff en una muestra biológica obtenida del sujeto con un agente que se une a CCR4 en la superficie de las células Teff; y

(ii) medir el nivel de expresión de CCR4 en las células,

donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff es indicativa de que el sujeto responderá clínicamente a un tratamiento in vivo adicional con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

3. El método según la reivindicación 2, donde el método comprende comparar el nivel de expresión de CCR4 medido según la etapa (ii) con el nivel de expresión de CCR4 en células Teff obtenidas del pretratamiento del sujeto con ciclofosfamida.

4. Un método para predecir si un sujeto con cáncer que no ha recibido previamente ciclofosfamida responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado del mismo, comprendiendo el método detectar la expresión de CCR4 en células Teff después de la exposición in vitro de las células Teff en un muestra biológica obtenida del sujeto a ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma, donde la regulación en aumento de la expresión de ^c CR4 en células Teff después de la exposición es indicativa de que el sujeto responderá al tratamiento.

5. El método según la reivindicación 4, donde detectar la expresión comprende:

(i) exponer la muestra biológica a ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma in vitro;

(ii) poner en contacto las células Teff en la muestra biológica obtenida del sujeto con un agente que se une a CCR4 en la superficie de las células Teff; y

(iii) medir el nivel de expresión de CCR4 en las células,

donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff es indicativa de que el sujeto responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

6. El método según la reivindicación 5, donde el método comprende comparar el nivel de expresión de CCR4 medido según la etapa (iii) con el nivel de expresión de CCR4 en células Teff obtenidas de la exposición previa del sujeto a ciclofosfamida o un análogo o derivado del mismo.

7. El método según la reivindicación 5, donde el método comprende comparar el nivel de expresión de CCR4 determinado en la etapa (iii) con el nivel de expresión de CCR4 en células Teff obtenidas de sujetos de control.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el sujeto tiene un cáncer ginecológico.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 u 8, donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en células Teff, pero no en células Tsupp identifica a un sujeto que responderá clínicamente al tratamiento con ciclofosfamida o un análogo o derivado de la misma.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde:

(i) las células Teff son células T colaboradoras y/o células T citotóxicas;

(ii) las células Teff comprenden células T CD4+ Th1 y/o células T citotóxicas CD8+; o

(iii) las células Teff comprenden células FoxP3-CD25-CD4+ y células T CD8+.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, donde las células se exponen a mafosfamida in vitro durante 3 días.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde:

(i) el sujeto tiene un cáncer que puede tratarse con ciclofosfamida o un análogo, derivado o metabolito activo del mismo;

(ii) el sujeto tiene un cáncer que secreta CCL22; y/o

(iii) el sujeto tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia mielocítica aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda (LLA), linfoma de células T (micosis fungoide), mieloma múltiple, neuroblastoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing; cáncer de mama, testicular, endometrial, ovárico, otros cánceres ginecológicos, incluido el cáncer de útero, cuello uterino, vulva o vagina, y cáncer de pulmón o una combinación de cualquiera de estos.

13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, donde la muestra biológica comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

14. Un método para evaluar la eficacia del tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida de un sujeto con cáncer, comprendiendo el método detectar en una primera muestra biológica que comprende células Teff, habiéndose obtenido previamente dicha primera muestra biológica del sujeto en un primer punto de tiempo, el nivel de expresión de CCR4, repitiendo este análisis con una segunda muestra biológica que comprende células Teff, habiéndose obtenido previamente dicha segunda muestra biológica del sujeto en un punto de tiempo posterior, y comparando el nivel de expresión de CCR4 en los dos puntos de tiempo donde la regulación en aumento de la expresión de CCR4 en las células Teff en la segunda muestra en comparación con la primera es indicativa de un tratamiento clínicamente efectivo,

donde el primer punto de tiempo fue antes o después de que el sujeto recibiera al menos una dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma y el último punto de tiempo fue después de que el sujeto recibiera una o más dosis de ciclofosfamida, o un análogo o derivado de la misma.

15. Uso de un complejo que comprende células Teff y un resto de unión a CCR4 unido a ellas en un método in vitro para identificar o predecir un sujeto que responderá a dosis bajas de ciclofosfamida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.