CN111316101B - 预测对环磷酰胺疗法的反应者 - Google Patents

Abstract

本公开基于检测T效应细胞上CC趋化因子受体4(CCR4)的表达，以对受试者进行诊断或预防性预测，特别是那些对低剂量环磷酰胺治疗有反应的妇科癌症受试者。

Description

预测对环磷酰胺疗法的反应者

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本申请要求2017年5月19日提交的澳大利亚申请号AU2017901908的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开基于检测T效应细胞上CC趋化因子受体4(CCR4)的表达以诊断性或预防性预测受试者，特别是对低剂量环磷酰胺治疗反应的那些妇科癌症受试者。

背景技术

妇科癌症是女性生殖道的癌症，包括宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵巢癌。在全球范围内，这些癌症占女性所有癌症发病率的15％以上，每年诊断的超过100万例(BrayF等人，(2013)1；132(5):1133-45)。年死亡率接近50万，占报道的女性所有癌症相关死亡的14％。子宫癌、宫颈癌和卵巢癌是最常见的妇科癌症，而阴道癌和外阴癌很少见，占女性每年癌症发病率的不到0.6％。

澳大利亚的流行模式与由发展中国家宫颈癌的高流行所驱动的全球趋势不同。平均每天有12名澳大利亚女性被诊断出患有妇科癌症，每年的总发病率超过4500例，占报道的所有女性癌症病例的近10％(2012年国家妇科癌症报告，Australia C编辑，SurryHills，NSW2012)。子宫癌和卵巢癌是澳大利亚最关注的公共健康问题，因为子宫癌最普遍，占妇科癌症病例的44％。卵巢癌占病例的28％，其占妇科癌症死亡人数的一半以上。

由妇科癌症引起的过早死亡对经济产生负面影响。妇科癌症占女性癌症造成的所有疾病负担的8％以上，2012年，伤残调整生命年(DALY)超过22000。在2004-2005财政年度内，妇科癌症住院花费了国家6300万澳元，其中大部分钱用于卵巢癌(2500万澳元)、子宫癌(2200万澳元)和宫颈癌(1100万澳元)。

大多数卵巢癌和子宫癌是由于偶发的体细胞突变而引起的，而5％的卵巢癌和10％的子宫癌具有遗传基础(Whang JD等人，(1997)Oct；12(5):383-9)。尚不清楚特异性遗传突变在肿瘤发生中的作用，但是在肿瘤抑制基因和致癌基因中存在几种遗传异常，通常与疾病的发作有关。引起偶发的卵巢癌的最常见体细胞突变是p53基因。在子宫癌中也经常见到p53突变。

卵巢癌(OC)是女性癌症死亡的第五大常见原因。目前这些女性中有一半以上在诊断后五年内死亡(Luvero D等人，(2014)Therapeutic Advances in Medical Oncology 6:229-239)。卵巢癌有几种形式，包括上皮癌、卵巢种系癌和卵巢基质癌。上皮性卵巢癌是该疾病的最常见形式。

卵巢癌是一种主要影响绝经后女性的疾病，其诊断的年龄中位数为63岁。但是，这种疾病会影响所有年龄段的女性。

卵巢癌分期的分类基于局限性(localisation)程度以及疾病超出卵巢的扩散程度。1期卵巢癌限于一个或两个卵巢。2期疾病涉及伴有骨盆延伸的一个或两个卵巢中的肿瘤。3期疾病涉及一个或两个卵巢中的肿瘤，并在显微镜下证实了骨盆外的腹膜转移和/或区域淋巴结转移。4期卵巢癌的特征在于是超出腹膜腔的远处转移。卵巢癌倾向于在晚期被诊断，这是由于原发灶的地形位置所致。仅当肿瘤发展到足以引起身体不适时，症状才会显现。即使这样，症状(包括腹痛或骨盆痛、尿频和呕吐)仍然模糊不清，并且经常被误认为是其他疾病，如胃炎、肠易激综合症或泌尿系统感染。相比之下，子宫癌由于在就诊患者中经常见到的异常阴道出血而被早期诊断。出现后，可通过组织活检的组织学分析诊断患者，并根据扩散程度和器官受累程度对疾病进行分期。

卵巢癌通过从卵巢上皮局部脱落进入腹膜腔、然后植入腹膜并局部侵袭肠和膀胱而扩散。在诊断的卵巢癌的所有分期，卵巢癌中存在的淋巴结受累明显。

卵巢癌患者的生存率与该疾病诊断时的分期有关，晚期疾病的5年生存率降低。

通常以明显的临床症状表现检测卵巢癌，最明显的表现是腹痛、附件包块、腹胀和尿急。在早期(即1期)检测出卵巢癌使得使用标准手术和化疗的治愈率约为90％。

当前的早期检测卵巢癌的筛选方法还不够。当前的卵巢癌筛查实践采用CA125和经阴道超声检查(超声检查)的使用。血清CA125水平升高与卵巢癌相关，随后利用经阴道超声有助于检测卵巢癌的存在。卵巢疾病的确诊基于侵入性程序，如剖腹手术。然而，由于有限的敏感性、有限的特异性和不良的阳性预测值<3％的问题，使用CA125对于一般人群的筛选无效(Bast(2003)J.Clin Oncol.21(10Suppl):200-205)。

妇科癌症(如卵巢癌)的一线治疗包括减瘤手术，以去除所有肉眼可见的疾病，使残留疾病小于2cm。根据疾病的扩散情况，手术可包括腹腔镜或全子宫切除术、双侧输卵管卵巢切除术和淋巴结切除术。根据疾病的分期，手术后还可以建议对子宫癌患者进行卡铂和表柔比星辅助放疗或化疗，对卵巢癌进行卡铂和紫杉醇辅助放疗或化疗。在某些情况下，由于存在医学合并症或由于疾病的扩散程度，患者不适合手术。这些患者接受子宫癌的原发放疗或卵巢癌的化疗。

尽管妇科癌症的初次治疗相对成功，但经常发生疾病复发。复发性疾病的二线治疗包括放疗、激素疗法或化疗。用于子宫癌和卵巢癌的标准化疗分别包括基于铂的顺铂和卡铂，反应率徘徊在20％左右(Fung-Kee-Fung M等人，(2007)Current oncology Oct；14(5):195-208)。疾病复发的患者的后续治疗选择基于疾病分类。如果疾病复发发生在基于铂的治疗的最后一个周期后不到6个月，则该疾病被认为对铂有抗药性，而铂敏感疾病则在治疗后6个月以上复发。对于铂抗性疾病的治疗，使用的可选化疗策略包括用紫杉烷(多西紫杉醇和紫杉醇)、蒽环类药物(多柔比星和多柔比星脂质体)、草氮磷类药物(环磷酰胺和异环磷酰胺)、吉西他滨、依托泊苷和拓扑替康治疗，每种药物具有相对可比的反应率，介于12％至30％之间(Handolias D等人，(2013)Asia-Pacific journal of clinicaloncology 2013年5月29日)。

有两种类型的标准可用于评估患者对治疗的反应：实体肿瘤的反应评估标准(RECIST)或妇科癌症组间(GCIG)CA125反应标准。RECIST标准使用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)来测量靶标肿瘤的最大直径或新病变的任何全新(de-novo)出现，GCIC则测量CA125的血清水平。组合使用这两个标准，可以将患者的反应分类为完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)和进展性疾病(PD)(Rustin GJ等人，(2011)Internationaljournal of gynaecological cancer society Feb；21(2):419-23)。

低剂量环磷酰胺通常用于治疗晚期和/或复发性癌症，如复发性卵巢癌(Handolias等人(2013)Asia Pac J Clin Oncol 12(1):e154–e160)。然而，低剂量环磷酰胺仅对25-44％的复发性卵巢癌女性产生临床益处(Liu等人(2010)J Immunother 33:53-59；Ghiringhelli等人(2007)Cancer Immunol Immunother56(5):641-8)。目前尚不清楚谁将对哪种药物反应，并且当人们意识到某种特定药物不起作用时，进一步治疗可能无效。因此，能够在治疗开始之前或在治疗的第一个周期内预测将对低剂量环磷酰胺治疗反应的受试者将是有益的。这使得能够在治疗方案早期将低剂量的环磷酰胺给予将对治疗产生反应的受试者，并将预测对治疗无反应的受试者转入其他治疗方案。

因此，在本领域中需要可以预测将对化疗产生反应的受试者的方法。特别地，需要可靠地筛选将从化疗治疗中受益的受试者的预后方法。

发明内容

本公开基于诊断和预后方法，该方法用于预测或鉴定将对用低剂量环磷酰胺(或其类似物、衍生物或活性代谢物)治疗反应的受试者。特别地，本公开基于以下令人惊讶的发现：来自患有妇科癌症的受试者的T效应细胞(Teff)上CC趋化因子受体4(CCR4)的表达可以选择性地鉴定将对低剂量环磷酰胺治疗反应的受试者。

不希望被理论所束缚，发明人已经表明，用环磷酰胺治疗可富集效应CD4和CD8T细胞中的卵巢癌环境，使得可以在肿瘤部位局部增强它们的活性，例如通过使用检查点抑制剂。

本公开提供了诊断和预后方法，以鉴定所谓的反应患者(即将对环磷酰胺反应的患者)的亚组。该方法基于以下发现：在患有妇科癌症(例如卵巢癌)的受试者中，效应CD4和CD8 T细胞中CCR4的上调与更好的生存结果相关。

诊断方法(在本文中称为CCR4上调治疗前(CUP诊断))可用于在接受低剂量环磷酰胺(LDCy)后早期鉴定反应患者。预后方法(在本文中称为CUP预后)可用于在接受LDCy之前鉴定反应患者。两项测试均基于检测效应CD4和CD8T细胞而非调节性T细胞(Treg)上的特异性CCR4上调。这些方法鉴定在LDCy治疗后其有益效应T细胞将迁移到肿瘤中的受试者。然后可以用例如检查点抑制剂治疗此类受试者，所述检查点抑制剂防止那些有益效应T细胞在肿瘤环境中被Treg关闭。

大多数CD8 T细胞和CD4 T辅助1(T_H1)细胞记忆效应细胞通常不表达CCR4。因此，在没有外部干预的情况下，抑制性CCR4+Treg优先被募集到肿瘤微环境中，而不是有益的CD8 T细胞或T_H1细胞。

特别地，本发明人发现，环磷酰胺状态可用于鉴定将对环磷酰胺治疗(包括其类似物或衍生物)反应的癌症受试者。

因此，一方面，本公开提供了一种用于鉴定将对环磷酰胺或其类似物或衍生物治疗产生临床反应的癌症受试者的方法，该方法包括检测施用至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物后受试者Teff细胞上CCR4的表达，其中Teff细胞上CCR4表达的上调指示所述受试者将对治疗产生临床反应。

在某些示例中，受试者进行了至少一个周期的环磷酰胺治疗。

在一个示例中，受试者患有妇科癌症。在另一个示例中，受试者患有卵巢癌。

在一个示例中，方法鉴定将对用低剂量环磷酰胺或其类似物或衍生物的进一步治疗反应的受试者。在一个示例中，方法鉴定将对一个或更多进一步剂量的低剂量环磷酰胺反应的受试者。

在一个示例中，方法包括检测在Teff和T抑制细胞(Tsupp)上CCR4的表达，其中在Teff而不是Tsupp上CCR4表达的上调鉴定将对环磷酰胺或其类似物或衍生物的治疗产生临床反应的受试者。

在一个示例中，Teff细胞是辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD4+和CD8+T细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD4+CD25-T细胞。在又一个示例中，Teff细胞是FoxP3-CD25-CD4+(Tconv)和CD8+T细胞。在又一个示例中，Teff细胞是CD8+T细胞。

在一个示例中，Tsupp细胞是调节性T细胞(Treg)。

在一个示例中，方法包括检测先前已经施用另一剂量的低剂量环磷酰胺的受试者的Teff和T supp细胞上CCR4表达的上调。

在一个示例中，Teff细胞和Treg细胞是CD3+T细胞。在一个示例中，辅助T细胞包括一种或多种以下的T_H1细胞、T_H2细胞、T_H9细胞、T_H17细胞、T_H22细胞和T_FH细胞。

在一个示例中，CD8+细胞也是CD69+。

在一个示例中，方法包括检测从受试者获得的生物样品中Teff细胞上CCR4的表达。

在另一个示例中，检测包括：

(i)使从受试者获得的生物样品中的Teff细胞与试剂接触，所述试剂结合Teff细胞表面上的CCR4；和

(ii)测量细胞上CCR4的表达水平，

其中Teff细胞上CCR4表达的上调指示该受试者将对环磷酰胺或其类似物或衍生物的进一步体内治疗产生临床反应。

在一个示例中，方法进一步包括从生物样品中分离或纯化Teff细胞。

在另一个示例中，方法包括比较根据步骤(ii)测量的CCR4的表达水平与来自用环磷酰胺治疗前的受试者的Teff细胞上的CCR4的表达水平。这可以提供有关Teff细胞的基线CCR4表达的信息。

在一个示例中，方法进一步包括从受试者获得包含Teff细胞的生物样品。获得生物样品的方法是本领域技术人员熟悉的。例如，生物样品是血液样品。

可以在至少一个剂量的环磷酰胺之后在合适的时间从受试者获得含有Teff细胞的生物样品。例如，在环磷酰胺已经具有足够的时间发挥对受试者免疫系统的作用，特别是发挥对受试者Teff细胞的作用时，获得生物样品。在另一个示例中，在允许足够的时间以检测Teff细胞上CCR4表达的任何上调之后，获得生物样品。例如，可以在一个剂量的低剂量的环磷酰胺之后数天或数周从受试者获得生物样品。例如，可以在第一剂量的环磷酰胺之后至少七、十四、十八、二十或二十八天后从受试者获得生物样品。可以在第一剂量的环磷酰胺后1、2、3、4、5、6、7或8周获得生物样品。

在另一个示例中，如果受试者被鉴定为将对环磷酰胺治疗产生临床反应的受试者，则方法进一步包括用低剂量的环磷酰胺治疗该受试者。

本公开的方法还可用于预防性鉴定将对环磷酰胺或其类似物或衍生物治疗产生临床反应的受试者，这些受试者先前未接受过环磷酰胺。

在另一方面，本公开还提供了一种用于预测先前未接受环磷酰胺的癌症受试者是否将对环磷酰胺或其类似物或衍生物的治疗产生临床反应的方法，该方法包括检测从受试者获得的生物样品中存在的Teff细胞在体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物后，在Teff细胞上CCR4的表达，其中暴露后Teff细胞上CCR4表达的上调指示所述受试者将对治疗反应。在一个示例中，该方法进一步包括检测Teff细胞上CCR4表达的上调。

在一个示例中，受试者患有妇科癌症。妇科癌症可以选自子宫癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌或阴道癌。在一个特定的示例中，受试者患有卵巢癌。

在一个示例中，方法鉴定将对低剂量环磷酰胺或其类似物或衍生物的治疗产生临床反应的受试者。

在另一个示例中，受试者是先前已经接受蒽环霉素、抗代谢物、紫杉烷或靶向疗法中的一种或多种治疗的受试者。例如，该受试者是接受过一种或多种以下试剂治疗的受试者，所述试剂包括表柔比星、多柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、长春瑞滨、曲妥珠单抗、拉帕替尼和贝伐单抗。

在一个示例中，受试者对非环磷酰胺化疗剂(例如铂剂)是难治性的。

在一个示例中，方法包括检测在Teff和T抑制细胞(Tsupp)上CCR4的表达，其中在Teff而不是Tsupp上CCR4表达的上调将受试者鉴定为将对环磷酰胺或其类似物或衍生物治疗产生临床反应。

在一个示例中，Teff细胞是辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD4+和CD8+T细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD4+CD25-T细胞。在又一个示例中，Teff细胞是FoxP3-CD25-CD4+(Tconv)和CD8+T细胞。在又一个示例中，Teff细胞是CD8+T细胞。在一个示例中，CD8+T细胞也是CD69+。

在一个示例中，Tsupp细胞是调节性T细胞(Treg)。

在一个示例中，Teff和/或Tsupp细胞存在于从受试者获得的生物样品中。

在一个示例中，检测表达包括：

(i)使生物样品在体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物；

(ii)使来自受试者的生物样品中的Teff细胞与试剂接触，所述试剂结合Teff细胞表面上的CCR4；和

(iii)测量细胞上CCR4的表达水平，

其中Teff细胞上CCR4表达的上调指示受试者将对环磷酰胺或其类似物或衍生物治疗产生临床反应。

在另一个示例中，体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物持续至少24小时、至少48或至少72小时。在一个示例中，体外暴露持续约1天、约2天或约3天或大于3天。

在另一个示例中，使生物样品在体外暴露于马磷酰胺、异环磷酰胺或曲洛磷胺。在一个特定的示例中，使生物样品在体外暴露于马磷酰胺。

在一个示例中，方法包括从生物样品中分离或纯化Teff细胞。

在另一个示例中，方法包括比较根据步骤(iii)测量的CCR4的表达水平与来自预暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物的受试者的Teff细胞上的CCR4的表达水平。

在另一个示例中，方法包括比较步骤(iii)中确定的CCR4表达的水平与来自对照受试者的Teff细胞上的CCR4表达的水平。在一个示例中，对照受试者是指从合并的患有妇科癌症(更优选患有卵巢癌)的受试者群获得的Teff细胞中的平均CCR4表达。在另一个示例中，对照受试者是未接受化疗的受试者。

在另一个示例中，方法进一步包括如果预测受试者对环磷酰胺治疗产生临床反应，则用低剂量的环磷酰胺治疗该受试者。

本公开的方法可以用于鉴定或预测将对低剂量的环磷酰胺治疗反应的受试者。在一个示例中，受试者患有可以用环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物治疗的癌症。在另一个示例中，受试者患有分泌C-C基序趋化因子22(CCL22)的癌症。

例如，受试者的癌症可以选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、急性粒细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(蕈样真菌病)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤；乳腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、卵巢癌、其他妇科癌(包括子宫癌、宫颈癌、外阴癌或阴道癌)、肺癌或以上任何的组合。

在一个特定的示例中，受试者患有卵巢癌。

在一些示例中，受试者患有早期癌症。在一些示例中，受试者患有晚期难治性癌症。

根据本公开的受试者可以是男人或女人。在一个示例中，所述受试者是成年人类受试者(例如18岁或以上的受试者)。

本文所述的方法优选地鉴定或预测将对低剂量环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物治疗反应的受试者。治疗的持续时间通常由主治医生确定。

术语“低剂量环磷酰胺”是主治医生理解的剂量。在一个示例中，低剂量环磷酰胺是指如本文实施例中所述的剂量。不希望受理论的束缚，低剂量环磷酰胺应理解为是指向受试者提供临床益处、同时避免以毒性高剂量施用时该试剂的一些或全部副作用的化疗剂量。在一个示例中，低剂量环磷酰胺是指每天两次口服施用25至50mg之间的剂量。

在根据本文描述的方法的进一步的示例中，在包含Teff细胞的生物样品中检测Teff细胞上CCR4表达的上调。生物样品优选是存在效应T细胞的任何样品，包括但不限于骨髓、脾脏、淋巴结、淋巴集结(peyer's patch)、粘膜相关的淋巴组织、肠相关的淋巴组织或血液。在另一个示例中，生物样品是血液样品，如全血或血清样品。在另一个示例中，生物样品包括外周血单个核细胞(PBMC)。

在另一个示例中，生物样品是腹水。在另一个示例中，样品是来自癌症累及器官的肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)。在一些示例中，对生物样品进行预处理以去除红细胞。如果生物样品是器官、脾活检组织，则可以通过使用机械手段(例如用镊子将组织分开)从组织制备细胞悬液。可以采用如离心的其他方式来浓缩细胞。在其他示例中，可以处理样品以从组织中去除细胞外基质成分等。

在一些示例中，将生物样品冷冻并储存用于以后分析。

Teff细胞上CCR4表达的检测可以在体内或体外进行。

在另一个示例中，根据本文所述的任何方法，该方法还包括：

(i)从受试者获得生物样品，所述生物样品包含效应T细胞；和

(ii)从所述生物样品制备细胞悬液。

在一些示例中，可以对生物样品进行纯化或富集淋巴细胞(例如，Teff细胞)。例如，可以使用分选程序(例如FACS)以去除不希望的细胞，如巨噬细胞、树突细胞和B细胞。在一个示例中，基于CD3的表达对细胞进行分选。在另一个示例中，基于其B细胞标志物(例如，B220)的表达负性分选B细胞。在另一个示例中，可以使用磁性标记的珠(例如，Dynabeads)纯化细胞。

生物样品可以包含异质性细胞群，其中至少一部分T细胞是T效应细胞。例如，细胞群可包含至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少30％或更多的T效应细胞。在另一个示例中，生物样品可以包含纯化的或富集的T效应细胞群。例如，细胞群可包含至少20％、至少30％、至少60％、至少70％或更多的效应T细胞。

可以根据本领域已知的方法进行细胞上CCR4表达的检测。在一个示例中，通过流式细胞术进行细胞上CCR4表达的检测。

测量CCR4表达的上调可以是定性的或定量的。根据所使用的方法，CCR4表达水平的差异可以表示为绝对值、比率或倍数变化。

在根据本文描述的任何方法的一个示例中，Teff细胞包括CD4⁺和/或CD8⁺T细胞。在一个示例中，CD4⁺细胞是辅助T细胞1(T_H1)或T_H2细胞。在一些示例中，细胞包含CD4+效应T细胞。在一些示例中，细胞样品包含CD8⁺效应T细胞。在另一个示例中，细胞包括常规的T(Tconv)细胞。在另一个示例中，Tconv包含CD4+T_H1T细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞。在另一个示例中，Teff包含CD25^-CD4⁺细胞。在另一个示例中，Teff包含FoxP3^-CD25^-CD4⁺细胞。在另一个示例中，Teff包含CD8⁺细胞。在另一个示例中，Teff包含CD8⁺CD69⁺细胞。在另一个示例中，Teff细胞包含FoxP3-CD25-CD4+细胞和CD8+T细胞的组合。

在一些示例中，定量或定性确定CCR4表达的上调。在一些示例中，通过比较用环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物在体内治疗之前和之后来自相同受试者的Teff细胞中CCR4的表达水平来确定CCR4表达的上调。

在一些示例中，通过比较在体外暴露于环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物之前和之后，来自相同受试者的Teff细胞中CCR4的表达水平来确定CCR4的上调。

在一些示例中，可以在每个环磷酰胺治疗周期之后确定Teff细胞上的CCR4表达。在另一个示例中，如果受试者正在连续接受每日的环磷酰胺，则可以在给定的时间点确定Teff上的CCR4表达。例如，可以每7天、每14天或每月从受试者获得含有Teff细胞的生物样品，以监测环磷酰胺治疗的有效性。如果CCR4的表达水平随时间降低，这将提醒临床医生该受试者无反应，并且他们应研究替代治疗方式，包括例如替代的化疗药物。因此，在一些示例中，该方法不需要与基线或治疗前水平进行比较。如果受试者正在接受连续的低剂量环磷酰胺，可在低剂量环磷酰胺的周期之间或在给定的时间间隔比较Teff细胞上CCR4的表达。

在一些示例中，在施用至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之前、或在(体外测定的情况下)使生物样品暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物之前的任何时间，从受试者获得包含Teff细胞的生物样品，以提供Teff细胞上CCR4的治疗前或基线水平。

在一个示例中，在施用至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之前、或在暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物之前至少30天、至少20天、至少15天、至少两周、至少一周或少于一周获得基线样品。

关于本文所述的预后方法，可在使样品体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物之前的任何时间从受试者获得生物样品。在一些示例中，可以在使样品在体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物之前至少两周、之前一周、之前至少72、48、24小时或更短时间获得生物样品。在一些示例中，生物样品先前已经被冷冻并存储以在方便的时间用于分析。

关于本文所述的诊断方法，本方法提供了在根据任何方案接受低剂量环磷酰胺治疗的受试者中对低剂量环磷酰胺反应者的鉴定。在一些示例中，在从受试者获得生物样品之前，受试者已经接受了两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或更多剂量的环磷酰胺。在一个示例中，生物样品获自进行低剂量环磷酰胺治疗方案的受试者。在一个示例中，生物样品获自接受一个周期低剂量环磷酰胺的受试者。在另一个示例中，生物样品获自处于低剂量环磷酰胺治疗周期之间的受试者，但是该受试者已经接受了至少一个剂量的低剂量环磷酰胺。

在一些示例中，与合适的对照、治疗前或基线水平的CCR4表达相比，CCR4在Teff细胞上的表达被上调至少1.5、2、3、4、5、6、7或更高倍。

在一些示例中，在细胞毒性T细胞和/或辅助T细胞(即，Teff细胞)上的CCR4表达水平与在调节性T细胞上的CCR4表达水平相比的比率，可用于鉴定或预测将对环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物产生阳性反应的受试者。

在一些示例中，在细胞毒性T细胞和/或辅助T细胞(即Teff细胞)上的CCR4表达相对于Treg上的CCR4表达的比率，增加至少两倍、或至少三倍、或至少四倍或更多。在另一个示例中，与Treg相比，在CD4+T细胞(常规的T细胞；Tconv)上的CCR4表达增加至少两倍或至少三倍。在另一个示例中，与Treg相比，CD8+T细胞上的CCR4表达增加至少三倍或至少四倍。

在另一个示例中，CCR4上调可以表示为百分比。例如，与Treg相比，CCR4表达可以增加5％、10％、15％、20％、50％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或600％或更高。

如果受试者被鉴定为将对环磷酰胺产生临床反应，则本文所述的方法还包括治疗受试者的步骤。

本领域技术人员将理解，许多不同的方案可用于用低剂量环磷酰胺治疗患者。治疗的时间表和持续时间通常由临床医生决定，并且可能取决于包括受试者的年龄和癌症分期的因素。例如，受试者可以接受节律性低剂量环磷酰胺化疗。节律性化疗是指频繁地以低剂量重复施用并且没有长的无药期。例如，可以连续3天、连续14天或连续30天或更长时间施用环磷酰胺。

在另一个示例中，受试者可以接受周期性的低剂量环磷酰胺。受试者可以接受任何数量的治疗周期，例如，在2至10、3至8、4至6个周期。或者，受试者可以接受4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、20或更多个治疗周期。

在其他示例中，受试者可以连续至少3至7天的期间接受低剂量的环磷酰胺，然后中断给定的时间，例如1至2周。在一个示例中，受试者可在治疗周期中以每两周间隔接受低剂量的环磷酰胺。例如，受试者可以每两周间隔连续3天每天接受环磷酰胺。

可以将环磷酰胺全身或口服施用给受试者。全身的施用形式包括直接静脉内注射或静脉内输注。

在一个示例中，方法包括用治疗有效量的低剂量环磷酰胺治疗受试者。在另一个示例中，以足以提供免疫调节作用的量施用环磷酰胺。

受试者可以单剂量或分开的剂量接受低剂量的环磷酰胺。在一个示例中，受试者每天可接受50至300mg剂量的环磷酰胺。在一个示例中，每天两次(早晨和晚上)口服施用50mg。

本公开还提供了用于评估低剂量环磷酰胺治疗癌症受试者的功效的方法，该方法包括在第一时间点检测包含Teff细胞的第一生物样品中CCR4的表达水平，在之后的时间点用包含Teff细胞的第二生物样品重复该分析，并且比较两个时间点上CCR4的表达水平，其中第二样品中Teff细胞上CCR4表达比第一样品中的CCR4表达上调指示临床有效的治疗。

在一个示例中，第一时间点是在受试者已经接受至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之前或之后。

本公开还提供了一种评估受试者中卵巢癌的消退或进展的监测方法，所述方法包括在第一时间点检测包含Teff细胞的第一生物样品中CCR4的表达水平，在之后的时间点用包含Teff细胞的第二生物样品重复该分析，并且比较两个时间点上CCR4的表达水平，其中第二样品中Teff细胞上CCR4表达比第一样品中的CCR4表达上调指示卵巢癌的消退。

在一个示例中，第一时间点是在受试者已经接受至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之前或之后。在一个示例中，第一时间点是治疗前或基线，而第二时间点是在环磷酰胺治疗之后。在另一个示例中，第一和第二时间点都在受试者中环磷酰胺治疗之后。

在一些示例中，比较CCR4表达水平与从健康(非癌症)受试者获得的CCR4表达的基线水平。在其他示例中，可以在每个周期的环磷酰胺之前测量CCR4在Teff上的表达，以监测受试者的环磷酰胺反应。

在一些示例中，本文描述的方法进一步包括向受试者施用治疗剂，所述治疗剂选自检查点抑制剂、抗癌疫苗、单克隆抗体、另外的化疗剂、细胞因子、溶瘤病毒、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和免疫调节剂或以上任意的组合。检查点抑制剂可以是靶向PD-1或PD-L1的抑制剂(例如PD-1或PD-L1抑制剂)。在一个示例中，PD-1或PDL-1选自派姆单抗(keytruda)、尼武单抗(opdivo)和阿佐单抗(Tecentriq)。在一个示例中，检查点抑制剂是靶向CTLA-4的试剂。

在另一个示例中，另外的化疗剂选自阿霉素、长春新碱、多柔比星、卡铂或氨甲蝶呤或其组合。

在一个示例中，免疫调节剂选自来那度胺和泊马度胺或其组合。

本文描述的方法也可以用于治疗受试者癌症的方法中。

在另一方面，本公开还提供了一种在有此需要的受试者中治疗妇科癌症的方法，所述方法包括：

(i)进行本文所述的方法以鉴定或预测将对低剂量的环磷酰胺反应的受试者；和

(ii)如果鉴定或预测受试者是将对低剂量环磷酰胺治疗产生临床反应的受试者，则向所述受试者施用低的环磷酰胺。

在一个示例中，该方法还包括：

(i)使从受试者获得的生物样品中的Teff细胞与试剂接触，所述试剂结合Teff细胞表面上的CCR4；和

(ii)测量细胞上CCR4的表达水平。

在一个示例中，该方法进一步包括从生物样品中分离或纯化Teff细胞。

本公开还提供了一种用低剂量环磷酰胺治疗卵巢癌受试者的方法，该受试者先前已经根据本文所述的方法被鉴定或预测为对低剂量环磷酰胺反应。

在另一方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中治疗卵巢癌的方法，该方法包括：

(i)检测来自施用至少一个剂量或周期的环磷酰胺治疗或其类似物或衍生物后的受试者的Teff细胞上的CCR4的表达；

(ii)测量Teff细胞的CCR4表达的上调水平；

(iii)如果受试者的Teff细胞上的CCR4表达上调，则进一步向该受试者施用低的环磷酰胺。

本公开还提供了一种复合物，其包含Teff细胞和与其结合的CCR4结合部分，所述复合物用于根据本文所述的方法鉴定或预测将对低剂量环磷酰胺反应的受试者的方法中，或用于所述方法中时。

本文公开的方法可以与其他筛选方法组合使用，以基于一种或多种与给定癌症正相关的生物标志物的表达来鉴定癌症受试者。在一个示例中，可以进一步筛选获自受试者的生物样品中一种或多种在卵巢癌中过表达的生物标志物，其中该生物标志物选自HE4、CA125、glycodelin、MMP-7、Muc-1、PAI-1、CTHRC1、抑制素A、PLAU-R、催乳素、KLK-10、KLK-6、SLPI、α-1抗胰蛋白酶、lmp-2、MAL2、Cox-1、蛋白激酶C-iota、钙粘蛋白-6、ADPRT、蛋白裂解酶(matriptase)、叶酸受体、claudin 4、间皮素、水通道蛋白5、丝切蛋白1、凝溶胶蛋白、簇蛋白、α-四连蛋白、玻连蛋白、PAPP-A和卵泡抑素(folistatin)。

本公开还提供了一种试剂盒，其包含用于本文所述的任何方法中或在本文所述的任何方法中使用时检测Teff细胞上CCR4表达的试剂。在一个示例中，试剂盒包含收集生物样品的容器，和一种或多种与表面抗原结合的结合试剂，所述表面抗原选自CD3、CD8、CD4、CD25、CCR4和FoxP3。

任选地，本文提供的任何方法可以与任何其他已知方法结合使用，特别是已知的癌症诊断、预后、预测和/或监测方法。

在一些示例中，本公开的方法和试剂盒有利地允许癌症患者分层。这允许针对给定的个体受试者确定更优化的抗癌治疗或方案。这也允许根据治疗的第一周期内CCR4水平的变化对治疗方案进行调整。在一些实施方案中，本公开的方法和试剂盒有利地允许通过对生物标志物的测试来预测、分层和/或监测，所述生物标志物的测试可以在容易获得的样品如血液样品上进行。

附图说明

图1显示了人CCR4的序列。

图2环磷酰胺增加T细胞上CCR4的表达。从癌症患者获得外周血单个核细胞(PBMC)，所述癌症患者为治疗前和连续3天每天两次口服50mg环磷酰胺治疗的每个周期后的癌症患者。使用流式细胞术确定CCR4在T细胞上的表达。确定CCR4+T细胞频率的变化，4名患者在治疗后显示CCR4+T细胞的频率显著增加。(A)比较治疗后CCR4+T细胞频率无变化的患者(恒定％CCR4，n＝6)和在治疗后至少一次CCR4+T细胞频率显著增加的患者(增加的CCR4％，n＝4)之间CD3+T细胞上CCR4的表达。(B)还比较了两组患者之间的总体生存。(C)CCR4+T细胞频率增加和发生疾病稳定的时间点。*表示p<0.05，与治疗前水平相比倍数变化的统计学显著性，图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图3，在效应T细胞群体上CCR4表达上调。在CCR4+T细胞频率显著增加的时间点，对％CCR4增加的患者中的FoxP3+CD25+CD4+T细胞(Treg)、FoxP3-CD25-CD4+T细胞(Tconv)和CD8+T细胞进行分析(来自4例患者，n＝6)。绘制了与治疗前水平相比，CCR4细胞的这些频率的增加倍数，以及CCR4的平均荧光强度(MFI)的增加倍数。*p<0.05，与治疗前水平相比倍数变化具有统计学意义。B针对所有患者，计算治疗的前3个周期中的Tconv与Treg和CD8+T细胞与Treg的比率。然后比较恒定的％CCR4患者(来自6名患者，n＝12)和增加的％CCR4患者(来自4名患者，n＝11)之间的这些比率。*表示p<0.05，**表示p<0.01，患者组之间具有统计学显著性，图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图4，在CCR4表达上调后，T细胞保留其细胞毒性。在CCR4+T细胞频率显著增加的时间点评估来自增加的％CCR4+T细胞患者的T细胞的细胞毒性功能。在蛋白转运抑制剂和抗CD107a的存在下，用50ng/ml的佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和1μg/ml的离子霉素刺激PBMC 6小时。A和B，然后通过流式细胞术确定在CD4+和CD8+T细胞上CD107a的表达，并与治疗前水平进行比较(n＝3名患者)。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图5，马磷酰胺的最佳剂量。如上所述，用不同浓度的马磷酰胺处理健康供体的PBMC。使用流式细胞术(n＝6个供体)确定CCR4+T细胞(右y轴)和活细胞(左y轴)的频率。*代表p<0.05，***代表p<0.001，与未处理相比具有统计学显著性。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图6，马磷酰胺诱导CCR4在T细胞上的表达。将健康供体和癌症患者治疗前的PBMC在具有或不具有1.5μg/ml的马磷酰胺下培养72小时。A然后使用流式细胞术确定CD3+T细胞上CCR4的表达，并在未经马磷酰胺处理和经马磷酰胺处理的细胞之间进行比较(健康供体n＝20，癌症患者n＝10)。**表示p<0.01，****表示p<0.0001，在处理和未处理的细胞之间有统计学显著性。B然后确定Treg、Tconv和CD8+T细胞的CCR4+T细胞的频率以及CCR4的MFI，并将处理值相对于未处理值归一化(健康供体n＝14，癌症患者n＝10)。**代表p<0.01，***代表p<0.001，与未处理水平相比倍数变化有统计学显著性。C确定了马磷酰胺处理的细胞的Tconv与Treg的比率以及CD8+T细胞与Treg的比率，并将其与未处理的细胞进行比较(健康供体n＝11，癌症患者n＝10)。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，处理组之间有统计学显著性。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。D比较CCR4稳定(n＝6)和CCR4峰值(n＝4)患者之间CCR4+CD4 T细胞效应子频率的上调(p<0.0005)。

图7，紫杉醇(抗肿瘤剂)不诱导CCR4在T细胞上的表达。健康供体PBMC在37℃、5％CO₂湿润孵育箱中与单独的介质、1.5μg/ml马磷酰胺或30ng/ml紫杉醇一起培养72小时。然后使用流式细胞术确定CD8+和CD4+CD25-T细胞上CCR4的表达，并将％CCR4表达相对于单独的介质归一化(n＝8)。*表示p<0.05，**表示p<0.01，在经处理的和单独介质的细胞之间有统计学显著性。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图8，恒定％CCR4患者和增加％CCR4患者之间CCR4+T细胞频率上调的比较。(A)、(B)和(C)，在接受马磷酰胺体外处理后，比较了恒定％CCR4的患者(n＝6位患者)和增加％CCR4的患者(n＝4位患者)之间的癌症患者治疗前样品中CD3+T细胞、Tconv和CD8+T细胞上CCR4表达的倍数变化。*表示p<0.05，患者组之间有统计学显著性。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图9：马磷酰胺诱导CCR4的机制。健康供体PBMC在有或没有1.5μg/ml的马磷酰胺的情况下培养24、48和72小时。在孵育的最后6小时，用50ng/ml的佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和1μg/ml的离子霉素刺激细胞。在孵育的最后4小时加入3μg/ml Brefaldin A。A使用流式细胞术确定IL-4+细胞的频率，并使用spearman相关性分析将其与未刺激细胞中的CCR4+T细胞的相应频率相关联(n＝18个点，来自6个供体)。B使用荧光活化细胞分选法纯化CD4+和CD8+T细胞，然后在有或没有1.5μg/ml的马磷酰胺中、在20单位/ml的IL-2存在下培养72小时。然后使用流式细胞术确定CCR4+细胞的频率，并计算与未处理样品的倍数变化。比较了纯化的T细胞和来自全PBMC(n＝3个供体)培养物的T细胞中CCR4+T细胞频率的倍数变化。C PBMC与1.5μg/ml的马磷酰胺(mafos)或10ng/ml的IL-4或20单位/ml的IL-2培养72小时。在孵育的最后4小时，将50nM LBH589加入到IL-2培养物中。使用流式细胞术(n＝6供体)确定H3K9、H3K14和H3K18的细胞内乙酰化水平。计算H3K9、H3K14和H3K18乙酰化的MFI，并且对于CD4+和CD8+T细胞，相对于未处理水平归一化，对于CCR4+和CCR4-细胞，在其中归一化。*表示p<0.05，与未处理水平的倍数变化有统计学显著性。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图10，CCR4诱导的机制。将健康供体PBMC与有或没有1.5μg/ml的马磷酰胺培养24、48和72小时。然后如上所述刺激细胞用于细胞内细胞因子分析。A和B使用Spearman相关性分析，将CD4+和CD8+T细胞中IL-2+细胞的频率与未处理细胞中CCR4表达的相应频率相关联(n＝18个点，来自6个供体)。

图11，H3K9、H3K14和H3K18乙酰化的代表性图。用1.5μg/ml的马磷酰胺处理健康供体PBMC 72小时。如方法部分所述，使用流式细胞术确定H3K9、H3K14和H3K18的乙酰化。基于同种型设置阳性细胞的门。为了比较乙酰化水平的变化，然后将每个处理组阳性门内的细胞的MFI相对于介质的MFI进行归一化。

图12马磷酰胺诱导的CCR4表达允许T细胞向CCL22迁移。如上所述，用马磷酰胺(mafos)处理健康供体的PBMC。然后将细胞以2.5×105细胞/100μl的浓度接种到transwell插入物中，并允许其迁移至包含CCL22(100ng/ml)或包含单独的介质的底部室，持续2小时。A通过将向CCL22迁移的细胞数除以向介质迁移的细胞数来计算迁移指数。绘制了未经处理的和经过马磷酰胺处理的细胞的迁移指数(n＝7)。*表示p<0.05，与未处理水平的倍数变化有统计学显著性。B使用spearman相关性分析使迁移指数与CCR4+T细胞的相应频率相关联(n＝14个点；来自7个供体)。C比较未处理的和马磷酰胺处理的细胞之间的Tconv与Treg的比率以及CD8+T细胞与迁移的Treg的比率(n＝7个供体)。*表示p<0.05，处理组之间有统计学显著性。图表示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图13，CCL22的血清浓度。使用多重珠免疫测定法试剂盒(Multiplex BeadImmunoassay Kit)确定来自治疗前患者(n＝10例患者)和健康供体(n＝5例供体)血清中的CCL22浓度。*表示p<0.05，在患者和健康供体之间有统计学显著性。图显示平均值±平均值的标准误(SEM)。

图14，在携带ID8肿瘤的动物中，由LDCy治疗14天后，外周血中表达CCR4的CD8 T细胞增加，相对于对照盐水处理的小鼠进行归一化；随后伴随针对表达CD69的活化CD8 T细胞的肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)增加，**表示p<0.02。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。类似于或等同于本文描述的那些材料和方法的任何材料和方法都可以用于实践或测试本公开。从业者特别参见Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Supplement 47，John Wiley&Sons，New York，1999；Colowick和Kaplan编辑，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.；Weir和Blackwell编辑，Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，BlackwellScientific Publications，1986；Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，MackEaston，Pa.(1990))中的本领域的定义和术语以及本领域技术人员已知的其他方法。

在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组的引用应视为包含一个或多个(即一个或多个)这些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。

本领域技术人员将理解，本文所描述的公开内容除了具体描述的内容之外还可易于进行变化和修改。应当理解，本公开包括所有这样的变化和修改。本公开还单独地或共同地包括在本说明书中提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。

本公开内容不限于本文所述的具体实施方案的范围，这些具体实施方案仅旨在举例说明的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。

除非另有明确说明，否则本文公开的任何示例均应被认为采用必要的变通而应用于任何其他示例。

在整个说明书中，单词“包括”或其变型如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述的元素、整数或步骤或元素、整数或步骤组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或元素、整数或步骤组。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被理解为对这两种含义或任一含义提供明确的支持。此外，在倒数第二个和最后一个特征之间包括短语“和/或”的列表或特征意味着所列出的特征中的任何一个或多个可以以任何组合存在。

除非上下文另有指示，否则提及单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”也应理解为暗示包括复数形式。

如本公开中所使用的，术语“或”旨在表示包括性的“或”而不是排他性的“或”。也就是说，除非另有说明或从上下文可以清楚看出，否则“X使用A或B”旨在表示任何自然的包括性排列。也就是说，如果X使用A、X使用B、或X使用A和B两者，那么在任何前述情况下都满足“X使用A或B”。此外，A和B中的至少一个和/或等等通常是指A或B或A和B两者。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数和单数形式的术语“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”，例如可选地包括复数指示物，除非本公开内容另外明确指出。

除非另有说明，否则本文所用的术语“环磷酰胺”也包括环磷酰胺的类似物、衍生物或活性代谢物。

如本文所用，除非有相反的说明，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-1％。

本说明书中所包括的关于文献、作用、材料、装置、物品等的任何讨论均不应被视为承认因为其存在于本申请的每项权利要求的优先权日之前，所以任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或为本公开相关领域中的公知常识。

选择的定义和短语

如本文所用，术语“受试者”是指包括人和非人动物的哺乳动物。更特别地，哺乳动物是人。更特别地，受试者是女性。术语如“受试者”、“患者”或“个体”是在本公开上下文中可以互换使用的术语。在某些示例中，受试者可以是成年或儿童(儿科)受试者。本文所用的术语“成年”应理解为是指年龄等于或大于18岁的人受试者。受试者可以是60至85岁之间的成年人受试者。

术语“低剂量环磷酰胺”意指在抑制受试者癌症中是活性的、但具有最小副作用的剂量。低剂量环磷酰胺的组成通常由医师决定，该术语并不旨在限于特定剂量。临床上，低剂量环磷酰胺应理解为是指每天口服约1.2-2g/m²的剂量或每天口服约25-150mg的剂量。

本文所用的术语“剂量”是指给定量的环磷酰胺的单次施用。

本文使用的术语“测量表达水平”旨在具有广泛的含义，并且可以涵盖定性或定量测量。本文其他地方讨论了测量表达水平的方法。举例来说，可以通过测量对于给定标志物是阳性的细胞与合适的同种型或其他合适的对照之间荧光强度的log(或线性)增加来定量地确定CCR4在Teff细胞上的表达。数据可以表示为直方图，其中将平均荧光强度(由直方图上的峰表示)与对照的平均荧光强度进行比较。沿直方图的X轴向右移动表示阳性染色，因此表示标志物的表达。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“处理(treating)”是指临床干预，其设计为改变临床病理过程中被治疗个体或细胞的自然进程。理想的治疗效果包括降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除了与疾病相关的一种或多种症状，则成功地“治疗”了个体。所述治疗优选是抗癌治疗。本文提到的“抗癌治疗”包括针对治疗癌症的任何治疗。治疗可以包括手术、化疗放射和/或药物。

如本文所用，术语“治疗癌症”并非意图是绝对术语。在一些方面，本公开的方法试图减小肿瘤的大小或癌细胞的数量，使癌症缓解，或防止癌细胞的大小或细胞数量的增长。在某些情况下，“治疗癌症”可改善预后和/或生存。

如本文所用，术语“预后”是指疾病严重程度的风险预测、或与疾病(优选癌症)相关的可能病程和临床结果的风险预测。它涵盖了技术人员可估计和/或确定将发生给定结果的概率的方法。与预后相关的结果可以是发病率和/或死亡率。特别地，预后可能与“无进展生存”(PFS)相关，PFS是指患者带病存活而疾病没有进展的时间长度。因此，PFS可以是从治疗开始到癌症进展日期的时间，或者是从治疗结束到癌症进展日期的时间。预后可以与总体生存有关。“总体生存”(OS)是指在死亡发生之前患者带病存活的时间长度。例如总体生存可以定义为从癌症的诊断、治疗开始或治疗完成直到死亡的时间。总体生存通常表示为“总体生存率”，其是研究或治疗组中被诊断为患有疾病(如癌症)、或开始治疗、或完成治疗后仍存活一定时间的人的百分比。总体生存率可以用例如五年生存率来表示，其是研究或治疗组中被诊断或开始治疗或完成治疗后五年还活着的人的百分比。

本领域技术人员可获得关于患有特定类型癌症的患者的平均(例如中位数、平均值或众数)OS和PFS的统计学信息。因此，可以确定与该平均值相比受试者是否具有或有可能具有增加或减少的OS或PFS。

如本文所用，术语“增加的生存”是指患有疾病(如癌症)的受试者的寿命或生活质量的增加。例如，增加生存还包括促进癌症的缓解、防止肿瘤的侵袭、防止肿瘤的复发、减慢肿瘤的生长、防止肿瘤的生长、减小肿瘤的大小、减少总的癌细胞计数等。

“进展”或“进展”是指疾病恶化，即严重程度增加，例如肿瘤负荷增加、肿瘤大小和/或重量增加、癌症变成恶性或更恶性、和/或转移发生或转移的发生率和/或转移速率增加。

“消退”是指疾病改善，即，严重程度降低，例如，肿瘤负荷降低、肿瘤大小和/或重量减小或变得不可检测、癌症恶性度减少、和/或转移的发生率和/或转移速率降低。

如本文所使用的术语“预测”或“预测”是指确定特定结果的可能性。

“有效量”是指以一定剂量和时间段内至少达到期望的治疗或预防结果所需的有效的量。可以在一次或多次施用中提供有效量。在本公开的一些示例中，术语“有效量”用于指实现如上所述的疾病或病症的治疗所必需的量。有效量可以根据待治疗的疾病或病症以及还根据与所治疗的哺乳动物有关的体重、年龄、种族背景、性别、健康和/或身体状况和其他因素而变化。通常，有效量将落在可以由医师通过常规试验和实验确定的相对较宽的范围内(例如“剂量”范围)。有效量可以以单个剂量或在治疗期间内重复一次或多次的剂量施用。

“治疗有效量”至少是实现特定疾病(例如癌症)可测量的改善所需的最小浓度。本文中的治疗有效量可以根据如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及细胞组合物在个体中引起期望的反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是这样的量，其中治疗的有益作用超过了组合物的任何毒性或有害作用。在癌症的情况下，治疗有效量可以降低癌症的严重程度、抑制或延迟癌症的进展和/或在某种程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。

如本文所用，术语“卵巢癌”意指通过探索性剖腹手术后分类为前恶性病理学、恶性病理学和癌症的那些病症(FIGO 1-4期)。卵巢癌的分期和分类在本文其他地方描述。“卵巢癌早期”是指分类为1期或2期癌的那些疾病状态。卵巢癌的早期检测可以显著提高5年生存率。

本文所使用的术语“鉴定受试者”可以与术语“筛查受试者”互换使用。这些术语指的是鉴定对环磷酰胺(特别是低剂量环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物)具有增加的反应可能性的受试者的策略。本公开的筛选方法并不旨在确定性将受试者诊断为反应者或非反应者。而是，此类方法旨在鉴定对环磷酰胺治疗具有增加的反应可能性的受试者。这样的筛选方法可以与用于确定性诊断卵巢癌或妇科癌症的一种或多种其他方法组合使用，所述其他方法包括盆腔检查、经阴道超声、CT扫描、MRI、剖腹手术、腹腔镜检查和组织样品活检。

本文所用的术语“生物标志物”是指与正常或健康细胞或组织相比，在组织或细胞中的表达水平被改变的任何基因或蛋白质。

如本文所用，术语“分层”或“分层”是指基于特定标准将群分为亚群。更具体地，它是指基于特定标准将一组受试者或患者分成至少两组，在本申请的上下文中，包括或由细胞样品中的CCR4表达组成。

如本文所用，术语“上调”或“CCR4表达的上调”是指与没有暴露于环磷酰胺、或者先前暴露于环磷酰胺(包括其类似物、衍生物或活性代谢物)的CCR4表达水平相比，暴露于环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物后，显著或实质性增加的CCR4表达水平。更具体地，它是指蛋白表达的水平，并且更特别地，是指细胞表面蛋白表达的水平。

如本文所用，术语“稳定的疾病”是指既不生长也不缩小的癌症或肿瘤。

如本文所用，术语“进展性疾病”是指正在恶化或扩散的癌症或肿瘤。

详细披露

本公开提供了基于受试者的Teff细胞上CCR4表达的上调，针对低剂量环磷酰胺治疗来筛选或分层受试者(特别是癌症受试者)的方法。

本发明人发现，用低剂量环磷酰胺(LDCy)治疗癌症患者，通过改变其可比较的CCR4表达模式，改变了有益的Teff细胞相对于T调节细胞(Treg)进入癌症微环境的可比较的迁移能力。基于此发现，发明人开发了一种免疫预测测试(称为CCR4上调治疗前(CUP诊断))，可用于早期鉴定在接受低剂量环磷酰胺(LDCy)之后的反应患者。因此，该测试可以鉴定将从环磷酰胺治疗中收到最大益处的患者。

本发明人发现，在Teff细胞上CCR4表达增加的受试者与更长的生存率正相关。

这些发现是意想不到的，因为早期工作已经证明某些癌症中Treg中CCR4的表达增加。

通常，从待评估的受试者获得细胞样品，并确定样品中Teff细胞上CCR4的表达水平。用环磷酰胺治疗后CCR4的表达增加(即上调)表明受试者具有更大的可能性对环磷酰胺或对环磷酰胺进一步的治疗周期反应。用环磷酰胺治疗后，CCR4表达的稳定水平表明受试者不太可能对该试剂的进一步治疗产生反应。

此外，可以在接受LDCy治疗之前鉴定反应患者(CUP预后)。因此，只有那些被鉴定为反应者的患者才能被选择进行环磷酰胺化疗的治疗。

LDCy目前通常用作在患者接受其他治疗后的二线治疗，这些其他治疗通常产生对紫杉烷或铂类药物的抗性。在这种情况下，其为25-44％的卵巢癌患者带来临床益处(Handolias，D.等人(2013)Oral cyclophosphamide in recurrent ovariancancer.Asia-Pacific journal of clinical oncology)。

由于降低对患者的毒性和/或不良事件的频率，施用低剂量化疗是优选的。此外，口服形式环磷酰胺的可利用度使得该试剂对于资源匮乏的环境(例如，没有医院或很难去医院的情况)特别有吸引力。

目前，环磷酰胺被给予处于晚期或末期卵巢癌的患者。鉴定将对环磷酰胺治疗反应的患者的能力将是有利的，因为其为被鉴定为无反应者的患者提供了替代的有益治疗，而不耽误治疗。此外，考虑到其在患者中比铂和紫杉烷试剂更好的耐受性，这将为其在一线治疗中的用途打开大门。

此外，鉴定反应者的能力对于其在许多其他癌症中快速使用具有巨大的潜力，在这样的癌症中LDCy是晚期治疗选择(如乳腺癌)。另外，本文所述的方法将使LDCy与其他癌症疗法(例如检查点抑制剂)有效组合。例如，本文所述的方法将鉴定这样的患者，在LDcy治疗后其有益的免疫细胞将迁移到肿瘤中，与检查点抑制剂的联合施用将防止这些有益的免疫细胞在肿瘤环境中被如Treg的免疫抑制细胞关闭。

此外，在(目前没有使用LDCy的)初次复发时使用LDCy，为患者在亚临床复发的第一证据(基于铂的一线化疗后3个月CA125升高)时提供了强大而低毒的治疗选择。

效应T细胞

本公开的方法包括检测和/或测量CCR4在效应T细胞上的表达。术语“效应T细胞”是指对刺激反应而被活化的T细胞。此类T细胞包括辅助T细胞和细胞毒性(杀伤性)T细胞。

细胞毒性(杀伤性)T细胞参与感染和转化细胞的破坏，因此有助于保护宿主免受病毒感染和癌症的侵害。细胞毒性(杀伤性)T细胞也与移植排斥有关。这些细胞在其细胞表面表达CD8糖蛋白，有时也称为CD8+T细胞。在细胞毒性(杀伤性)T细胞上存在的其他细胞表面标志物包括CD3和αβTCR。它们对于EOMES、T-bet和BLIMP1转录因子也是阳性的。

辅助T细胞(Τ_H)促进并协助免疫应答，特别是已经描述了它们通过释放T细胞细胞因子来帮助其他T细胞的活性。辅助T细胞包括T_H1、T_H2、T_H22、T_H17、T_H9和T_FH。这些细胞表达表面蛋白CD4，有时也称为CD4+T细胞。其他细胞表面标志物包括CD3和αβTCR。在T_H细胞上表达的其他标志物包括IL-12R、IFNγR、CXCR3、IL-17RB、IL-1R。因此，Teff细胞也可以包含这些标志物中的一种或多种。

在一个示例中，Teff细胞是辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD4+和CD8+T细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD4+CD25-T细胞。在又一个示例中，Teff细胞是FoxP3-CD25-CD4+(Tconv)和CD8+T细胞。在又一个示例中，Teff细胞是CD8+T细胞。在一个示例中，CD8+细胞也是CD69+。

在一个示例中，Teff细胞是CD3+T细胞。在一个示例中，辅助T细胞包括以下中的一种或多种：T_H1细胞、T_H2细胞、T_H9细胞、T_H17细胞、T_H22细胞和T_FH细胞。

调节性T细胞

调节性T细胞以前被称为抑制性T细胞，是指调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和预防自身免疫性疾病的T细胞亚群。它们的功能是抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖(Bettelli E等人(2006)Nature 441(7090):235-238)。

调节性T细胞的特征在于CD4、CD25和CD127的表达。调节性T细胞也可以表达CD3+FoxP3+CD25+CD4+。人的调节性T细胞的特征在于高水平的CD25表达。

趋化因子和趋化因子受体

CCR4(也称为CC趋化因子受体4和趋化因子(C-C基序)受体4)是一种G蛋白偶联受体。CCR4是趋化因子(胸腺和活化调节的趋化因子(也称为CCL17)和巨噬细胞衍生的趋化因子(也称为CCL22))的受体。CCR4主要在2型辅助T细胞(T_H2)和调节性T(Treg)细胞上表达。在其他健康的细胞和组织上存在CCR4的有限表达，例如，记忆性CD8+T细胞，其分泌1型(白介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF))和2型(IL-4)细胞因子的组合(Kondo，T.&Takiguchi，M.(2009).International immunology 21，523-532(2009))。

CCR4受体使T细胞能够迁移到富含其配体CCL2、CCL4、CCL5、CCL17和/或CCL22的炎症部位(Cronshaw，D.G.，Owen，C.，Brown，Z.&Ward，S.G.(2004)Journal of immunology172，7761-7770)。卵巢癌细胞和浸润肿瘤腹水的巨噬细胞分泌大量的CCL22(Yigit，R.等人Cytokine analysis as a tool to understand tumour-host interaction in ovariancancer.European journal of cancer 47，1883-1889(2011))。在没有外部干预的情况下，优先将抑制性CCR4+Treg募集到肿瘤微环境中，而不是有益的CD8 T细胞或T_H1细胞(CD4+效应细胞)。

本公开的方法包括确定CCR4的表达，特别是在效应T细胞如CD4+和CD8+T细胞上的CCR4的表达，或由确定CCR4的表达组成。

在卵巢癌腹水中，生物活性的Treg抑制局部效应T细胞反应。

可在公开的数据库中获得人CCR4的序列。例如，人CCR4的蛋白序列可作为UniProt参考P51679获得。代表性序列示于图1。

目的

本申请的方法和试剂盒可用于通过确定CCR4的表达来鉴定将对化疗剂治疗反应的受试者。在一些实施方案中，待评估的受试者患有癌症。如本文所用，“癌症”是特征在于瘤形成(即细胞的异常生长或分裂)的病症的统称。癌细胞因此可以被称为“肿瘤性”。癌细胞的集合通常被称为“肿瘤”，并且术语“肿瘤”和“癌症”在本文可互换使用。肿瘤可能是良性或恶性的。优选地，其是恶性的。

癌症可以是任何癌症，如癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤等。在一些实施方案中，癌症是癌、肉瘤和/或神经胶质瘤。在一些实施方案中，癌症是癌。

合适的癌症的示例包括但不限于肾癌、卵巢癌、胰腺癌、食道癌、宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠道癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、成人T细胞白血病、喉癌、脑癌、神经母细胞瘤、胃癌、子宫内膜癌和黑色素瘤。

在一些实施方案中，所述癌症是妇科癌症。如本文所用，“妇科癌症”是源自生殖器官的异常细胞的不受控制的生长和扩散。妇科癌症的示例包括但不限于宫颈癌、妊娠滋养细胞疾病(GTD)、原发性腹膜癌、输卵管癌、胎盘癌、卵巢癌、子宫/子宫内膜癌、阴道癌和外阴癌。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。

优选地，癌症表达CCL22。CCL22(也称为巨噬细胞衍生的趋化因子或MDC)是一种由肿瘤细胞和肿瘤浸润巨噬细胞产生的趋化因子。CCL22与CCR4结合，并参与调节性T细胞(Treg)趋化进入肿瘤微环境，从而降低抗癌免疫力。表达CCL22的癌症的示例包括但不限于胰腺癌、肝细胞癌(HCC)、胃癌、Lewis细胞癌、肺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。

如本文所述的本发明的方法可以在可能患有癌症的任何受试者上进行。该方法通常在哺乳动物如人，其他灵长类动物如猴子，实验室哺乳动物如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠，家畜哺乳动物如马、牛、绵羊、猪或家养宠物如猫、狗上进行。在一些实施方案中，受试者是人。但是，在其他实施方案中，方法可以用于任何合适的动物模型中。正在接受医疗照看的受试者可以称为“患者”。因此，本文中对“受试者”的任何提及应被理解为包括对患者(优选人类患者)的提及。

在一些实施方案中，受试者可能显示复发的证据。在一些实施方案中，受试者可能显示第一次复发的证据。在一些实施方案中，受试者可能显示亚临床复发的证据。例如，在卵巢癌的情况下，在一线基于铂的化疗后三个月，受试者血液中可能具有升高的CA125水平。因此，本公开的方法可在第一次复发时增加化疗剂(如低剂量环磷酰胺)的使用(当前未使用)。这将为出现第一次亚临床复发的患者提供有力且低毒性的治疗选择。

本申请的方法和试剂盒可用于在治疗开始之前(药物与受试者的血液/细胞样品的体外孵育)或治疗开始之后(体外的血液/细胞样品)鉴定将对治疗反应的受试者。例如，受试者可能已经开始或正在开始用化疗剂治疗。在一些实施方案中，待评估的受试者尚未用化疗剂治疗。在一些实施方案中，可以评估受试者以确定用化疗剂治疗是否可能改善生存。因此，方法包括在确定CCR4表达之前将源自受试者的细胞样品与化疗剂孵育。在一些实施方案中，待评估的受试者已经开始治疗，例如，待评估的受试者处在用化疗剂治疗的第一周期内。在该实施方案中，该方法包括确定源自被治疗的受试者的细胞样品中的CCR4表达。

卵巢癌

卵巢癌是从卵巢开始的异常恶性细胞的生长。它通常与模糊不明确的症状相关，如腹胀、盆腔或腹部疼痛、进食困难和/或感觉很快饱胀和出现尿路症状。一旦诊断卵巢癌，就进行癌症分期，以确定疾病的进展程度。

通常，卵巢癌分期包括从盆腔和腹部的不同部位采集组织样品，以确定疾病是否已经扩散，如果已经扩散，则扩散了多远。使用国际妇科联合会(InternationalFederation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期系统对卵巢癌进行分期，该系统描述了四个主要分期：

1期-癌症仅在卵巢(或双卵巢)内发现，并没有扩散到腹部或盆腔的器官和组织、淋巴结或远处。

2期-癌症已经扩散到盆腔内的其他器官，例如子宫、输卵管、膀胱、乙状结肠或直肠。它尚未扩散到淋巴结或远处。

3期-癌症已超过盆腔扩散到腹衬，和/或扩散到腹背部的淋巴结(腹膜后淋巴结)。

4期-癌症已扩散到脾脏、肝脏、肺或腹膜腔外的其他器官内。

FIGO分期是长期生存的重要预测指标。其还可用于帮助鉴定治疗选择。4期是卵巢癌的最晚期形式，与最低的五年生存率相关。

本发明的方法可用于患有任何临床阶段的卵巢癌的受试者。

生物样品和细胞

本公开的方法和试剂盒包括确定从受试者(优选癌症受试者)获得的生物样品中CCR4的表达。生物样品是从存在Teff细胞的受试者获得的任何样品。如本文所用，术语“获得的”被广义地定义为，并且是指直接源自受试者的细胞、组织或器官以及细胞，包括源自已经以某种方式培养或处理的组织或器官的细胞。

在一些示例中，生物样品选自但不限于骨髓、脾脏、淋巴结、淋巴集结、粘膜相关的淋巴组织、肠相关的淋巴组织或血液。在一些示例中，细胞包括来自全血样品的细胞。

可以通过多种技术从受试者获得生物样品，包括例如通过静脉穿刺、刮擦或擦拭区域或通过使用针头抽吸体液或组织。收集各种生物样品的方法是本领域众所周知的。

在一些示例中，将细胞纯化。如本文所用，“纯化的”是指已经与其他细胞类型至少部分地分离的细胞，所述细胞通常以其天然存在的状态与其他细胞类型相关联。通常，当所选择的细胞类型为存在的总细胞数量的至少50％或60％时，则纯化所选择的细胞类型。例如，所选择的细胞类型为存在的总细胞数量的至少75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％。可以通过流式细胞术和其他合适的技术检查细胞的纯度。

在一些示例中，细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC可以包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞和树突细胞。可以使用本领域技术人员已知的任何技术从全血样品中分离PBMC。例如，可以通过Ficoll密度梯度离心、细胞制备管(如BDCPT)或SepMate管分离PBMC。

在一些示例中，基于特定细胞表面标志物的表达选择细胞。在一些示例中，基于CD3的细胞表面表达选择细胞。在其他示例中，基于与T效应(Teff)细胞或T调节性(Treg)细胞相关的标志物的表达选择细胞。

例如，Treg细胞包括表达细胞表面蛋白CD4、CD25和CD27的细胞。在一个示例中，Treg细胞是CD27^hi。在一个示例中，Teff细胞是CD4+或CD8+。在一些示例中，Teff细胞是CD25-CD4+细胞。在一些示例中，Treg细胞带有表面标志物CD3+FoxP3+CD25+CD4+。在一些示例中，Teff细胞是CD3+FoxP3-CD25-CD4+细胞(也称为Tconv)。在其他示例中，Teff细胞是CD3+CD8+细胞。在另一个示例中，Teff细胞是CD69⁺CD8⁺。在另一个示例中，Teff细胞是CCR4+CD8+T细胞或CCR4+CD4+T细胞。

可以使用本领域技术人员已知的任何技术基于细胞表面表达来选择细胞。这些技术可以基于阳性和阴性检测。在阳性检测技术中，期望的细胞用抗体标记并定量。基于抗原的细胞表面表达选择细胞的合适技术包括但不限于流式细胞术、免疫吸附技术、基于RosetteSep全血的细胞分离等。在免疫吸附技术中，用单克隆抗体选择细胞，优先地与表面结合并可从其余细胞除去，所述表面例如珠的柱、烧瓶、磁性颗粒。示例性免疫吸附技术包括但不限于基于磁性抗体的细胞分离，如Life Technologies和StemcellTechnologies EasySep^TM、RoboSep^TM和StemSep^TM。

所述细胞可以是新鲜获得的细胞或已经被储存或冷冻保存的细胞。可以在纯化之前或之后在合适的介质中培养细胞，例如在含有5％正常人血清(HS，Sigma-Aldrich，美国)的AIM-V介质(Life Technologies，美国)(完全AIM-V介质)中培养。

检测和测量细胞上CCR4的表达

本发明人发现低剂量的环磷酰胺治疗增加血液中的效应CCR4⁺CD8⁺T细胞，但不增加CCR4+Treg。本公开的方法和试剂盒包括检测Teff细胞上CCR4表达的上调。本领域中可用的用于检测CCR4表达的任何方法都可以用于本公开的方法中。在一个示例中，在蛋白质水平上检测CCR4的表达。在一些示例中，检测CCR4表达的上调将预后性地鉴定将对环磷酰胺治疗反应的受试者。在其他示例中，检测CCR4表达的上调将在先前的环磷酰胺治疗之后诊断将对进一步的环磷酰胺周期反应的受试者。

如本文所用，术语“CCR4的上调”是指与环磷酰胺或其类似物或衍生物治疗前或暴露前Teff细胞上的CCR4表达水平相比，暴露于或施用环磷酰胺或其类似物或衍生物后，Teff细胞上的CCR4表达水平实质上或显著更高。在一些方法中，术语“CCR4的上调”可以指在受试者在两个时间点都接受环磷酰胺的情况下，在与第二时间点相比的第一时间点之间，Teff细胞上CCR4的表达水平实质上或显著更高。

在一个示例中，显著更高是指大于所使用的评估方法的标准误差的水平。在一个示例中，显著更高是指p＜0.05、p＜0.01或p＜0.001的统计学显著性。

在一个示例中，通过测量在生物样品中存在的T效应细胞上CCR4的细胞表面表达来确定CCR4的检测。在另一个示例中，通过流式细胞术测量CCR4的表达。在另一个示例中，确定根据以上讨论的细胞表面表达谱限定的Teff细胞上的CCR4表达。在一个示例中，确定在CD3+T细胞上的CCR4检测。

在另一个示例中，在也是CD8+T细胞的细胞上确定CCR4表达的检测。在另一个示例中，在是CD3+、CD8+T细胞的细胞上确定CCR4表达的检测。在另一个示例中，在是CD25-CD4+细胞的细胞上确定CCR4表达的检测。在另一个示例中，在是FoxP3-CD25-CD4+细胞的细胞上确定CCR4表达的检测。在另一个示例中，还确定是FoxP3+CD25+CD4+的细胞(即Treg)上的CCR4表达的检测以确认在这些细胞上不存在CCR4的上调。

在一些示例中，CCR4的上调是指当通过流式细胞术评估时，CCR4的表达水平高至少2个log、高至少3个log、高至少3.5个log或高至少4个log。

在一些示例中，CCR4表达的上调是指通过流式细胞术观察到的CCR4的平均荧光强度(MFI)的增加。

在一些示例中，CCR4表达的上调是指环磷酰胺治疗后CCR4的表达水平是环磷酰胺治疗之前CCR4的表达水平的至少2、3、4、5、6或7倍或更高。

在一些示例中，与治疗前相比，环磷酰胺治疗后CCR4表达水平的上调为至少5％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少80％、至少100％、至少有200％、至少300％或更高。

在一些示例中，与治疗前相比，在暴露于马磷酰胺后，CCR4表达水平的上调为至少5％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％或更高。

技术人员将理解，CCR4表达的上调可以多种方式表示，包括但不限于如本文实施例中所示的％CCR4+细胞的倍数变化或CCR4+T conv/CCR4+Treg的比率。

在一些示例中，可以建立CCR4的阈值水平，在该阈值水平以上则被认为在生物样品中被上调。选择阈值的方法包括但不限于分析CCR4的ROC图或分析正常受试者群的CCR4表达水平。如本文所用，术语“正常”是指来自未患癌症的健康人的相应生物样品中的表达水平。这样的样品可以以标准化形式存在。示例性阈值或“截断值”包括平均CCR4表达水平加上两个标准差(从正常受试者群中确定)；选自ROC曲线的表达水平，代表敏感性和特异性的最高值；在统计学上显著高于治疗前观察到的CCR4表达水平的CCR4表达水平，p＜0.05。本领域技术人员将理解，可以使用用于选择适当的阈值表达值的其他方法来实践本文公开的方法。

优选在至少一个周期的环磷酰胺治疗后观察CCR4表达的上调。在一些示例中，在一个、两个或三个周期的环磷酰胺治疗后观察CCR4表达的上调。

本发明人已经确定可以将对环磷酰胺治疗不反应的受试者鉴定为具有基本上保持与基线或治疗前CCR4水平相同的CCR4表达水平。因此，本公开还提供了一种用于鉴定不太可能对环磷酰胺、其类似物、衍生物或活性代谢物的治疗反应的受试者的方法，该方法包括确定来自受试者的Teff细胞上CCR4的表达，所述细胞上CCR4的稳定表达鉴定将对所述治疗无反应的受试者。

在本文中，术语“稳定表达”是指与治疗前相比或与CCR4表达明显增加的受试者(称为CCR4峰(spike)受试者)相比，CCR4表达水平的频率不变。换句话说，在环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物的治疗前和治疗后或暴露前和暴露后，在受试者中观察到的CCR4表达水平没有统计学上的显著差异。在一些示例中，在第一、第二、第三、第四或进一步的周期的环磷酰胺处理后，CCR4表达水平保持稳定。

可以使用可用于鉴定和定量表达CCR4的细胞的任何技术来确定CCR4的表达。例如，可通过使源自所述受试者的细胞样品与结合CCR4的抗体接触，使样品和抗体经受允许抗体结合的条件并确定所述样品中所述趋化因子的量，来确定CCR4的量。可以使用任何合适的抗体，并且在本文其他地方描述这些抗体的示例。例如，可以通过标准技术(例如通过免疫实验动物)制备适当的CCR4抗体或识别其特定表位的抗体，在标记等方面对抗体进行适当的修饰。可用于确定CCR4表达的方法的示例包括但不限于流式细胞术、免疫沉淀、免疫组织化学或用抗体染色细胞、基于珠的多重免疫测定法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

还提供了评估环磷酰胺在受试者中的功效的方法。这样的方法通常包括比较在开始治疗前(即基线或治疗前)获得的第一生物样品中的CCR4表达水平与在施用至少一部分治疗(例如一个或多个周期的环磷酰胺)之后获得的第二生物样品中的CCR4表达水平。第二样品中显著或实质上更高的CCR4表达水平是治疗功效的阳性指示。显著或实质上更低的CCR4表达水平是治疗功效的阴性指示。本文所使用的术语“治疗功效的阳性指示”是指该治疗在受试者癌症的治疗中产生有益的结果(例如肿瘤消退等)。“治疗功效的阴性指示”旨在表示该治疗对于受试者癌症的治疗没有有益作用。

本公开还提供了用于评估受试者中卵巢癌的消退或进展的监测方法，该方法包括在第一时间点在第一生物样品中检测在Teff细胞上的CCR4表达水平，用在之后的时间点获得的第二生物样品重复该分析，和比较两个时间点的Teff细胞上的CCR4表达水平，其中在第一时间点和第二时间点之间Teff细胞上CCR4表达的上调表明卵巢癌消退。

在一个示例中，第一时间点是治疗前或基线，第二时间点是在环磷酰胺治疗之后。在一个示例中，第一时间点是第一周期的环磷酰胺之后，第二时间点是第二或第三周期的环磷酰胺之后。在之后的时间点的生物样品中，Teff细胞上显著或实质上更高的CCR4表达水平，表明卵巢癌已经消退。而显著更低的表达水平表明卵巢癌已经进展。如本文所用，“卵巢癌的消退”旨在表示受试者关于卵巢癌的状况已经改善，其特征在于例如减小的肿瘤大小。“卵巢癌的进展”是指受试者关于卵巢癌的状况恶化，其特征在于例如增大的肿瘤大小、转移等。

本公开的方法可用于在开始环磷酰胺或其类似物或其衍生物的治疗之前，预测受试者是否将对环磷酰胺或其类似物或衍生物反应。例如，可以使用来自显示第一复发体征的受试者的细胞、显示其癌症亚临床复发的受试者、或已经被正式诊断为患有癌症的受试者的细胞来进行预后方法。此类方法通常包括比较暴露于环磷酰胺之前获得的第一生物样品中的Teff细胞上的CCR4表达水平与已经体外暴露于马磷酰胺的第二生物样品中的CCR4表达水平。第二样品中Teff细胞上显著或实质上更高的CCR4表达水平是受试者将对环磷酰胺治疗反应的阳性指示。显著或实质上更低的CCR4表达水平是受试者对环磷酰胺治疗反应的阴性指示。换句话说，受试者将对环磷酰胺治疗不反应或将不是最佳反应。

本公开还提供了一种预测先前未用环磷酰胺治疗的受试者是否将对用环磷酰胺或其类似物或衍生物的治疗反应的方法，该方法包括在体外暴露于环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物后，分析来自受试者的效应T细胞(Teff)的CCR4表达，其中所述细胞上CCR4表达的上调将受试者鉴定为将对体内环磷酰胺治疗呈阳性反应。

在一个示例中，对包含Teff细胞的生物样品进行分析。

可以使用可用于鉴定和定量表达CCR4的细胞的任何技术来确定CCR4的表达。在一个示例中，可通过使源自所述受试者的细胞样品与任何细胞表面结合剂(例如Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和可变结构域片段(dAb)、可变重链(VH)和可变轻链(VL)片段；肽；适体、纳米抗体或其他非抗体亲和试剂)接触来确定CCR4的量。抗体可以是单克隆的或多克隆的，但特别是单克隆抗体。试剂(例如抗体)可以源自任何来源，包括动物(例如仓鼠、小鼠、大鼠、兔子等或人或灵长类动物)。抗体可以部分或完全人源化的。

在某些示例中，使用抗体检测CCR4的表达。术语“抗体”广泛涵盖抗体的天然存在形式和重组抗体，如单链抗体、嵌合和人源化抗体及其抗原结合片段。在一些示例中，抗体用可检测物质标记以促进在生物样品中的检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的示例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光物质的示例包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和丹磺酰氯。

在一些示例中，使用与人CCR4结合的市售抗体来实践本公开的方法。合适的与人CCR4结合的商业抗体的示例可以从Lifespan Biosciences，Invitrogen，EnzoLifesciences，Inc，Abeam，Miltenyi Biotec，Bio Legend，BD Biosciences，Santa CruzBiotechnology，Inc and Abbexa Ltd.购买。

可以通过标准技术，例如通过免疫实验动物制备适当的CCR4抗体或识别其特定表位的抗体，在标记等方面对抗体进行适当的修饰。可用于确定CCR4表达的方法的示例包括但不限于流式细胞术、免疫沉淀、免疫组织化学或用抗体对细胞染色以及酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

化疗

本公开的方法可以用于鉴定将对环磷酰胺或其类似物或衍生物反应的受试者。本公开的方法还可用于预测先前未接受环磷酰胺的受试者是否将对环磷酰胺反应。

卵巢癌是一种分子异质性疾病，分子差异驱动独特的临床行为。尽管如此，在过去的二十年中，用于卵巢癌的主要基于铂/紫杉烷的化疗治疗仍未取得进展，导致卵巢癌的生存改善停滞不前，五年中值生存率保持不变，约为40％。超过12000名女性参与的III期临床试验，并没有改变治疗前景(Bookman，MA(2011)Eur J Cancer 47S3)。

环磷酰胺是一种化疗剂，长期以来一直用于治疗癌症(Arnold等人(1958)Nature181(4613):931)和自身免疫性疾病。在高剂量时，它具有免疫抑制作用，而在低的无毒剂量时，它具有免疫刺激作用。目前，高剂量的环磷酰胺被用作免疫抑制剂，以治疗自身免疫性疾病，如狼疮或骨髓移植的调理，因为它会引起一般的淋巴衰竭(Dussan等人(2008)Lupus.17(12):1079-85；Rossi等人(2003)Bone marrow transplant.31(6):441-6.)。低剂量环磷酰胺可用于治疗癌症(Liu等人(2010)J Immunother 33(1):53-9；Lutsiak等人(2005)Blood.105(7):2862-8；Ghiringhelli等人(2007).Cancer Immunol Immunother 56(5):641-8；Kishimoto等人(1990)Circulation.82(3):982-9；Brodsky&Jones.(2008)Autoimmunity 41(8):596-600)，并且，与高剂量的环磷酰胺相比，低剂量环磷酰胺通常具有良好的耐受性，且副作用的风险显著降低。

因此，LDCy在多种癌症中用作免疫治疗剂。它是芥子烷基化剂的草氮磷(oxazaphosphorine)家族的成员。环磷酰胺是一种惰性前药。然而，施用后，环磷酰胺在肝脏中被细胞色素酶P450水解成其药理活性形式的4-羟基环磷酰胺，与它的互变异构体醛磷酰胺(aldophosphamide)处于平衡状态(Clarke&Waxman(1989)Cancer Res 49(9):2344-50；Yu等人(1999)J.Pharm.Exp.Ther.288(3):928-37)。在靶细胞的细胞质中，这两种产物通过自发的β-消除作用转化为磷酰胺芥子和丙烯醛(Brode&Cooke，(2008)Crit.Rev.Immunol.28(2):109-26)。两种代谢物都是细胞毒性烷基化剂，而磷酰胺芥子也引起DNA交联，导致细胞死亡。

在一个示例中，环磷酰胺及其药学上可接受的盐、其类似物或衍生物包括但不限于环磷酰胺、4-羟基环磷酰胺、醛磷酰胺、磷酰胺芥子、丙烯醛、马磷酰胺、4-氢过氧环磷酰胺、异环磷酰胺、曲洛磷胺等。

化疗剂

在一些实施方案中，方法进一步包括施用另外的化疗剂。可以在用化疗剂治疗之前、基本上同时或之后将另外的化疗剂施用于受试者。在一些实施方案中，在另外的化疗剂之前施用化疗剂。在一些实施方案中，在化疗剂之前施用另外的化疗剂。

在整个说明书中，“化疗剂”和“癌症治疗剂”可互换使用。癌症治疗剂或化疗剂的示例包括烷基化剂类，如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替帕、异环磷酰胺、卡马汀、洛莫斯汀、司莫斯汀、链脲霉素、去卡巴嗪、氨甲蝶呤和丝裂霉素C；烷基磺酸盐/酯类，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氧乙胺、盐酸甲氧乙胺、美法仑、新恩比兴、酚非那汀、泼尼松汀、曲磷酰胺、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，如卡马汀、氯唑霉素、铁莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀、拉尼莫司汀；抗生素类，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、加利车霉素、丁香霉素、卡米霉素、卡因菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、6-重氮-5-氧代-正亮霉素、多柔比星、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺古霉素、寡霉素、坡洛霉素、波菲霉素、嘌呤霉素、奎拉霉素、罗丹霉素、链霉菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如树新蝶呤、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲蝶呤；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻虫啉、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫呋、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟啶、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如钙雌酮、丙酸去氧孕甾烷酮、表固醇、美吡坦、睾丸内酯；抗肾上腺素类，如氨基谷氨酰胺、米托坦、三氯四环；叶酸补充剂，如叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲酯；去氧胺；地美辛；重氮醌；儿茶素；依利醋铵；依他净；硝酸镓；羟基脲；伦蒂南；拉尼达明；米托瓜；米托蒽醌；莫匹达莫；硝苯胺；喷司他丁；菲纳姆；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙嗪；PSK.RTM；唑烷；西佐非兰；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三嗪；2，2'，2”-三氯三乙胺；氨基甲酸酯；长春地碱；达卡巴嗪；甘露汀；米托布诺醇；米托内醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；噻替帕；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL^TM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫杉醇(TAXOTEPvE^TM，Pvhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱；曲妥珠单抗、多西紫杉醇、铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；长春瑞滨(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；西罗达；伊班膦酸盐；CPT-1 1；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物如Targretin^TM(蓓萨罗丁)、Panretin^TM(阿利维酸)；ONTAKT^TM(丹尼洛丁)；拉霉素；卡培他滨以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、三恶芬、酮咯芬、LY 1 1701、奥那普利通和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其他癌症治疗剂包括索拉非尼和其他蛋白激酶抑制剂，如阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、福司他替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、穆布替尼、尼洛替尼、帕尼替尼、帕唑帕尼、哌加他尼、雷尼单抗、鲁索替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维罗非尼和舒尼替尼；西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司和其他mTOR抑制剂。其他示例包括但不限于拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、拓扑替康、喜树碱及其类似物或代谢物、和多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷和柔红霉素)；DNA嵌入剂(例如顺铂、奥沙利铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基产生剂，如博来霉素；和核苷模拟物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、喷司他汀和羟基脲)。此外，破坏细胞复制的示例性化疗剂包括紫杉醇、多西紫杉醇和相关类似物；长春新碱、长春花碱及相关类似物；沙利度胺、来那度胺及相关类似物(例如CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)；NF-κB抑制剂，包括IκB激酶抑制剂；与癌症中过表达的蛋白结合的抗体，以及已知在癌症中被上调、过表达或活化的其他蛋白质或酶的抑制剂，抑制它们下调细胞复制。

本领域技术人员将意识到，将其他化疗剂归为一类(例如烷基化剂)并不排除将其也归为另一类。

确定受试者的临床反应

确定受试者是否已经对治疗产生临床反应的方法是本领域技术人员已知的。该术语被广义地定义，并且可以例如通过根据各种标准评估与治疗相关的毒性和对治疗的反应来确定，所述各种标准如美国国家癌症研究所的通用毒性标准(NCI-CTC)或实体瘤反应评估标准(RECIST)的标准。还可以评估无进展(PFS)和总体生存(OS)。RESIST标准使用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)来测量目标肿瘤的最大直径或新病变的任何新生外观。

在一些示例中，根据妇科癌症小组间(GCIG)CA125反应标准确定临床反应。GCIC测量CA125的血清水平。生物标志物CA125是由某些妇科肿瘤产生和脱落的糖蛋白。使用GCIG和RECIST的组合，可以将患者反应分为完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)和进展性疾病(PD)(Rustin GJ等人(2011)PubMed PMID 21270624)。

治疗方法

本公开还涉及在预测的反应可能性基础上治疗有此需要的受试者中的癌症(例如妇科癌症)的方法。例如，本公开提供了治疗受试者的方法，所述受试者已经基于CCR4在受试者Teff细胞上的表达被鉴定为对用环磷酰胺或其类似物或衍生物的治疗呈阳性反应。因此，在另一方面，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括根据本文所述的方法鉴定将对环磷酰胺或其类似物或衍生物的治疗呈阳性反应的受试者，和用环磷酰胺或其类似物或衍生物治疗所述受试者。

向受试者施用的环磷酰胺或其类似物或衍生物的量将由主治医师决定。例如，向受试者施用的环磷酰胺的量可以取决于所治疗的受试者、受试者的体重、癌症的严重程度、施用方式和施用方案。可以个体地调整量和治疗方案，以提供足以维持治疗或预防作用的活性成分水平。

在一些示例中，施用低剂量的环磷酰胺。在一些示例中，施用50mg环磷酰胺。在一些示例中，施用100mg或150mg的环磷酰胺。

在一些示例中，至少每天两次、至少每天、至少每两天、至少每三天、至少每四天、至少每五天、至少每六天、至少每周、至少每两周或至少每月施用环磷酰胺。

在一些示例中，施用是节律性的。

在一些示例中，环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物口服或全身施用。

在一些示例中，以循环方式施用环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物。例如，环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物可以施用两天、三天、四天、五天、六天或七天的期间，然后停止施用一段时间(例如，但不限于一、二、三、四周)。然后可以根据主治医师的判断重复该周期。在一个示例中，施用环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物三天，然后休息X天(例如14天)。在一个示例中，每天两次施用50mg的环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物，持续三天，然后休息X天(例如14天)。

在一些实施方案中，治疗方法还可以包括施用治疗剂，所述治疗剂选自化疗剂、检查点抑制剂、疫苗和免疫调节剂。本领域技术人员将意识到，将治疗剂分类为一类(例如检查点抑制剂)并不排除其也被分类为另一类。

在一些实施方案中，治疗方法还可以包括施用基于非药物的治疗。如本文所用，“基于非药物”的治疗包括但不限于放疗或手术或类似方法。例如，可以在施用化疗剂之前切除肿瘤。

向受试者施用的治疗的频率和类型将由主治医师决定。

组合疗法

检查点抑制剂

在一些实施方案中，该方法进一步包括施用检查点抑制剂。可以在环磷酰胺治疗之前、基本上同时或之后将检查点抑制剂施用于受试者。在一些实施方案中，在检查点抑制剂之前施用环磷酰胺。在一些实施方案中，在环磷酰胺之前施用检查点抑制剂。

如本文所用，“检查点抑制剂”包括以统计学上显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制通路的任何试剂。例如，检查点抑制剂可影响Treg功能。检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂或小分子。在一些实施方案中，检查点抑制剂结合并阻断或抑制免疫检查点受体。在一些实施方案中，检查点抑制剂结合并阻断或抑制免疫检查点受体配体。在一些实施方案中，检查点抑制剂可以靶向阻断或抑制CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，并在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体及其组合。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。在一些实施方案中，检查点抑制剂与检查点蛋白的配体相互作用，该配体可以是CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。检查点蛋白配体包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。

在一些实施方案中，检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。在一些实施方案中，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂或小分子，其结合或阻断或抑制CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD 160和CGEN-15049中的一种或多种的活性。检查点抑制剂的示例包括但不限于替西木单抗(Tremelimumab)(抗CTLA-4抗体)、抗OX40、PD-LI单克隆抗体(抗B7-HI；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、纳武单抗(Nivolumab)(抗PDI抗体)、CT-011(抗PDI抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDLI抗体)、BMS-936559(抗PDLI抗体)、MPLDL3280A(抗PDLI抗体)、MSB0010718C(抗PDLI抗体)和Yervoy/伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4抗体)。

疫苗

在一些实施方案中，该方法进一步包括施用疫苗。可以在环磷酰胺治疗之前、基本上同时或之后向受试者施用疫苗。在一些实施方案中，在疫苗之前施用环磷酰胺。在一些实施方案中，在环磷酰胺之前施用疫苗。

可以使用任何合适的疫苗。如本文所用，疫苗包括但不限于癌症疫苗。如本文所用，“癌症疫苗”是指引发免疫系统攻击体内癌细胞的疫苗。因此，与预防疾病不同，癌症疫苗刺激免疫系统(例如通过诱导CD8 T细胞和/或CD4 T细胞)以攻击已经存在的疾病。在一些实施方案中，癌症疫苗可以使用癌细胞、细胞部分或纯抗原来增加针对体内已经存在的癌细胞的免疫应答。癌症疫苗的非限制性示例包括肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、DNA或RNA疫苗和基于载体的疫苗。

在一些实施方案中，疫苗是包含抗原和佐剂以及任选载体的抗原疫苗。合适的佐剂的示例包括Montanide ISO720、铝等。与包含数千种抗原的整个肿瘤细胞不同，抗原疫苗通过使用一种或多种抗原来加强免疫系统。这些抗原可以是肽、蛋白质、mRNA或DNA。抗原疫苗可能对特定类型的癌症是特异的，因为每种肿瘤类型都可以通过特定的抗原谱来识别。为了使这些疫苗的效力最大化，根据特定癌症的抗原谱，在疫苗中结合多种抗原可能是有益的。

在一些实施方案中，癌症疫苗可以由已经从受试者中去除的实际癌细胞制成。一旦去除，癌细胞通常在实验室通过放射线或通过癌细胞裂解物的产生而被修饰，因此它们不会形成更多的癌症。例如，可以通过添加化学物质或新基因来进一步修饰癌细胞，以使该细胞更有可能被受试者的免疫系统视为异物。然后将修饰的细胞注射回受试者中。免疫系统能够识别这些细胞上的抗原，并通过自然的生理过程寻找并攻击/杀死表达预期抗原的细胞。

在一些实施方案中，癌症疫苗包括树突细胞疫苗。树突细胞疫苗通常是自体疫苗，通常必须针对每个受试者单独制备。产生这些疫苗的方法复杂且昂贵。例如，从受试者的血液中去除免疫细胞，并将其暴露于癌细胞或癌症抗原，以及暴露于使其变成树突细胞并帮助其生长的其他化学物质中。然后将树突细胞注射回受试者，其在受试者中引起对体内癌细胞的免疫应答。

在一些实施方案中，癌症疫苗包括DNA和/或RNA疫苗。

癌症疫苗的非限制性示例包括DCVax，其是Sipuleucel-T(或)。DCVax是一种使用活化的树突细胞的平台技术，旨在重振和训练免疫系统攻击癌症。DCVax使用许多活性剂来击中癌症的许多靶标(Liau，LM等人Journal of Neurosurgery90:1115-1124，1999；Prins RM等人J Immunother.2013Feb；36(2):152-7)。Sipuleucel-T是一种树突细胞疫苗，用于治疗无法通过传统化疗或激素疗法治疗的晚期前列腺癌。对于这种疫苗，从受试者中分离受试者的自身免疫细胞，然后将免疫细胞暴露于化学物质以将其转化为树突细胞。树突细胞暴露于前列腺酸性磷酸酶(PAP)，当重新引入受试者体内时，会产生针对前列腺癌的免疫应答。

免疫调节剂

在一些实施方案中，该方法进一步包括施用免疫调节剂。免疫调节剂可以在用环磷酰胺治疗之前、基本上同时或之后施用给受试者。在一些实施方案中，在免疫调节剂之前施用环磷酰胺。在一些实施方案中，免疫调节剂在环磷酰胺之前施用。

如本文所用，“免疫调节剂”包括通过宿主的免疫系统诱导或增加免疫原性和癌细胞的免疫识别的化合物。例如，免疫调节剂可以是免疫调节抗体、癌症疫苗、治疗性细胞因子、细胞疗法或其组合。在一些实施方案中，免疫调节抗体选自抗CTLA-4、抗PDL1、抗PDL2、抗PD1、抗CD137、抗CD40或抗OX-40抗体。在一些实施方案中，癌症疫苗如本文所定义。例如，癌症疫苗可以选自抗独特型抗体、血管生成抑制剂、肿瘤抗原特异性肽或重组蛋白。在一些实施方案中，细胞疗法选自T细胞、干细胞、树突细胞、基因或药理学修饰的免疫和/或癌细胞。

本领域技术人员将认识到，在不脱离本公开的广泛一般范围的情况下，可以对上述实施方案进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是说明性的而非限制性的。

以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，而绝不以任何方式限制本公开的其余部分。无需进一步阐述，可以认为，本领域技术人员可以基于本文的描述最大程度地利用本发明。本文引用的所有出版物均通过引用整体并入本文。在提到URL或其他这样的标识符或地址的地方，应当理解，这样的标识符可以改变并且互联网上的特定信息可以存在或消失，但是可以通过搜索互联网来找到等效信息。对其的引用证明了此类信息的可获得性和公开传播。

实施例

方法

1.1试验设计和患者细节

在一项双中心II期临床试验中，招募了十(10)名年龄在62-82岁之间的患有妇科癌症的人患者。患者患有晚期难治性妇科肿瘤，并从澳大利亚墨尔本皇家女性医院(n＝3)和比利时鲁汶大学医院(n＝7)招募，参见表1。使用RECIST和GCIG CA125标准确定疾病进展(Rustin GJ等人，(2011)Official journal of the International GynaecologicalCancer Society Feb；21(2):419-23)。从招募之时起，已获得患者的书面同意并收集了治疗前的血液样品。患者每天两次(早晨和傍晚)连续3天口服50mg环磷酰胺，并于2周后将血液收集在EDTA包被的全血试管和用于血清的血清分离试管中(BD Vacutainer，BD，美国)。以两周间隔重复治疗周期和采血，长达8个周期。对于健康样品，从澳大利亚红十字会血液服务处获得的常规献血中获得了血沉棕黄层。

表1患者总结

1.2分离外周血单个核细胞

通过Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech，瑞典)密度梯度离心在采血后24小时内分离外周血单个核细胞(PBMC)。然后在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dPBS，Sigma-Aldrich，美国)中洗涤细胞。将分离的PBMC在含有10％DMSO(Sigma-Aldrich，美国)和90％热灭活的胎牛血清(GIBCO，Life Technologies，美国)或90％人AB血清(Sera LaboratoriesInternational，英国)的冷冻介质中在-80℃下以1℃/min的速度冷冻，然后储存在液氮中。解冻时，将每瓶冷冻的PBMC在37℃水浴中快速解冻，并重新悬浮在含有5％正常人血清(HS，Sigma-Aldrich，美国)的AIM-V介质(Life Technologies，美国)中(完全AIM-V介质)。

1.3计数细胞

使用玻璃血球计数器(Hausser Scientific，美国)在倒置显微镜(LeicaMicrosystems，德国)上对细胞计数。用台盼蓝染色剂(GIBCO，Life Technologies，USA)稀释细胞以确定细胞活力。

计算细胞计数的公式：

总细胞＝细胞计数×稀释因子×管中细胞体积×10 ⁴。

1.4血清CCL22检测

按照制造商的说明，使用多重珠免疫测定试剂盒(Multiple Bead ImmunoassayKit)(人趋化因子5-plex组，Life Technologies，美国)确定癌症患者和健康供体血清中的CCL22浓度。在Bio-Plex 200系统(Bio-Rad，美国)上获取样品，至少收集100个事件。使用Bio-Plex Manager版本5软件(Bio-Rad，美国)分析结果。

1.5流式细胞术分析

为了确定PBMC中T细胞群的频率和表型，使用以下表面抗体进行了多色流式细胞术：抗CD3、抗CD8、抗CD4、抗CD25和抗CCR4。将抗体在含有5％HS(染色缓冲液)的dPBS中稀释。细胞在室温下以10⁷细胞/150μl抗体混合物的终浓度染色15分钟。然后将细胞用染色缓冲液洗涤两次。使用可固定的死细胞染料(活/死，可固定的水性死细胞染色试剂盒，LifeTechnologies，美国)来区分死细胞和活细胞。将染料在染色缓冲液中以1/500稀释，并将细胞在室温下以10⁷细胞/150μl稀释染料的终浓度孵育15分钟，然后在染色缓冲液中洗涤两次。使用固定/透化缓冲液试剂盒(eBioscience，美国)固定和透化细胞后，确定细胞内FoxP3的水平。将固定/透化浓缩物用稀释液1：3稀释。然后将细胞在4℃下重悬于50μl稀释的固定/透化溶液中30分钟。在固定/透化洗涤缓冲液(eBioscience，美国)中稀释细胞内抗FoxP3和抗Ki67。在固定/透化洗涤缓冲液洗涤细胞，然后将其以10⁷细胞/150μl的终浓度重悬于稀释的细胞内抗体中，并在室温下孵育15分钟。然后将细胞洗涤两次，并重悬于含1％多聚甲醛的dPBS中(PFA，Sigma-Aldrich，美国)。使用FACSDiva软件在Becton DickinsonLSR II流式细胞仪上获取流式细胞术数据，每个样品至少获取100000个事件。荧光减一(FMO)对照和同种型匹配的抗体也用于实现准确的门控。使用Flowjo软件(TreeStar，美国)分析数据。抗体列表如表2所示。

1.6T细胞细胞毒性测定法

通过在48孔板中用完全AIM-V介质以10⁶个细胞/500μl/孔培养PBMC，确定T细胞的细胞毒性能力。然后在蛋白转运抑制剂(1/1500稀释原液，BD GolgiStop，BD Biosciences，美国)和抗CD107a(1/20稀释原液，BD Pharmingen，美国)存在下、在37℃、5％CO₂的湿润孵育箱中、用50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA，Sigma-Aldrich，美国)和1μg/ml离子霉素(Sigma-Aldrich，美国)刺激细胞6小时。在孵育的最后4小时以3μg/ml添加布雷菲德菌素A(eBioscience，美国)。孵育后，洗涤细胞，并如上所述标记表面标志物。使用流式细胞术分析细胞，未刺激的细胞、荧光减一(FMO)和同种型匹配的抗体也用作对照。如上所述收集和分析数据。

1.7体外药物实验

为了研究环磷酰胺在体外对T细胞的作用，用马磷酰胺(Niomech，德国)，一种环磷酰胺的药理活性肝代谢物的类似物处理来自患者、治疗前和健康供体的PBMC。使用时，将马磷酰胺在无菌Milli Q水中以80mg/ml的浓度重构。通过用如上所述的相应抗体标记细胞，然后使用荧光活化的细胞分选法纯化CD4+和CD8+T细胞。在37℃、5％CO₂的湿润孵育箱中，将全PBMC或纯化的CD4+和CD8+T细胞在96孔板中以3x10⁵个细胞/150μl/孔在完全AIM-V介质中与浓度为1.5μg/ml的马磷酰胺或介质培养72小时。对于纯化的细胞培养物，以20单位/ml的浓度添加IL-2以维持细胞活力。孵育后，洗涤细胞，并如上所述使用流式细胞术确定在Treg和效应T细胞上的CCR4表达。为了确定体外处理后T细胞的细胞因子分泌谱，如上所述，在24、48和72小时的时间过程中，用马磷酰胺处理细胞。对于每个时间点，在孵育的最后6小时中，如上所述用PMA和离子霉素刺激细胞。然后洗涤细胞并标记表面标志物，然后如上所述使用抗IL-4(BD Pharmingen，美国)和抗IL-2(BD Pharmingen，美国)进行细胞内细胞因子染色。

1.8组蛋白3乙酰化检测

使用流式细胞术评估组蛋白3在赖氨酸(H3K)9、H3K14和H3K18上的乙酰化。首先如上所述将细胞在1.5μg/ml的马磷酰胺或10ng/ml的IL-4(R&D systems，USA)中或与20单位/ml的IL-2(R&D systems，USA)培养72小时。在培养的最后4小时内，将50nM帕比司他(LBH589，泛组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂)添加到IL-2培养物中。如上所述收获细胞并准备用于流式细胞术分析。表面标记、固定和透化后，将细胞用未缀合的抗H3K9、抗H3K14和抗H3K18(Cell Signaling Technology，美国)标记。使用Alexa Fluor 488缀合的驴抗兔Ig抗体(Biolegend，美国)进行二次标记。如上所述收集和分析数据。

1.9迁移测定法

如上所述，用马磷酰胺处理来自健康供体的PBMC。孵育72小时后，洗涤细胞，以2.5x10⁵细胞/100μl/插入物，将活细胞接种到含有0.5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，美国)的AIM-V介质的24孔透孔插入物中(Corning，USA)。将AIM-V介质中的100ng/ml的600μl CCL22(R&D Systems，美国)或AIM-V介质单独加入到每孔的透孔插入物下方。将细胞在37℃、5％CO₂的湿润孵育箱中孵育2小时，然后对其进行计数并使用流式细胞术确定T细胞亚群。通过用向CCL22迁移的细胞百分比除以向单独的介质迁移的细胞百分比来计算迁移指数。

1.10统计

为了确定统计学显著性，使用了非参数检验。为了比较患者体外和体内治疗后和治疗前样品之间的差异，进行了Wilcoxon匹配配对符号秩检验(matched-pairs signedrank tests)，同时使用Mann-Whitney检验来比较患者组之间或患者与健康供体之间的差异。为了确定治疗后倍数变化的显著性，进行了Wlcoxon符号秩检验，以检验平均值等于1的无效假设。Spearman相关性检验用于确定参数之间的相关性。使用GraphPad Prism(v.6，GraphPad Software，Inc，美国)进行统计分析。p＜0.05被认为是显著的。给出平均值±平均值的标准误差(SEM)。

表2抗体清单

实施例1治疗后CCR4+T细胞的增加与患有妇科恶性肿瘤患者的生存增加相关

为了研究环磷酰胺对T细胞内CCR4表达的影响，比较了每个个体患者治疗前CCR4+细胞的频率(n＝7-8个时间点的平均值)与每个周期的治疗后的频率(n＝3-6个时间点的平均值)。在10名患者中，4名在至少一个周期的治疗后，CD3⁺T细胞中CCR4⁺细胞的频率显著增加(增加的％CCR4或CCR4峰，图2A)，这发生前3个周期的治疗中，而在其他6名患者中，CD3⁺T细胞内的CCR4⁺细胞的频率保持相对恒定(恒定的％CCR4+或CCR4稳定，图2和表3)。

表3：环磷酰胺治疗后％CCR4表达的变化

患者ID	治疗前	周期1	周期2	周期3	周期4	周期5
							pt1	13.4	20.3
pt2	13.9	13.3
							pt3	30.9	32.2	26.1		34.5	22.6
pt4	15.4	13.6	14.4
							pt5	11.6	9.5	13.4
pt6	18.4	16.4	14.9	58.8***
							pt7	23.4	20.1
pt8	22.0	55.5***	33.0	11.6	10.6	10.6
							pt9	10.2	52.3***	77.2***	9.9	6.1	7.0
pt10	11.5	42.4***	60.1***

***与治疗前相比有显著差异p<0.001

“CCR4峰”患者的生存时间显著长于CCR4稳定的患者(约3倍更长)，平均总体生存几乎为1年多，分别为476±80天相较于163±37天(p＜0.01)。疾病稳定的时机恰好与其CCR4⁺T细胞中的个体峰时间一致(未显示)。6名具有“CCR4稳定”细胞的患者在治疗后均未达到稳定的疾病(如图2B所示)。在4名CCR4峰患者中，另外3名达到了稳定的疾病，有趣的是，疾病稳定与其CCR4+T细胞增加的时间完全一致(图2C)。具有不变的恒定％CCR4细胞的6名患者(CCR4稳定)中在治疗后均未达到疾病稳定(图2C)。

实施例2：CCR4表达在CD8⁺T细胞和效应T细胞上而不是Treq上增加

低剂量环磷酰胺治疗导致亚组患者CD3+T细胞内CCR4+细胞的频率瞬时增加。为了进一步确定表达CCR4的特定T细胞亚群，发明人将他们的分析集中在CD3+T细胞内观察到CCR4+细胞频率增加的时间点上的这些患者。然后将T细胞分为调节性T细胞、FoxP3+CD25+CD4+(Treg)和为FoxP3-CD25-CD4+(Tconv)或CD8+T细胞的效应T细胞亚群(图3A)。确定各个亚组内CCR4+细胞的频率，并将治疗后值相对于治疗前值进行归一化。CD3+T细胞内CCR4+细胞频率的增加是由效应T细胞群上CCR4表达的增加驱动的，因为Tconv和CD8+T细胞均显示与治疗前水平相比CCR4+细胞的频率显著增加了5倍(两种情况中p<0.05)(图3A)。Treg中CCR4+细胞的频率没有显著增加(图3A)。相对于治疗前水平，还评估了Treg、Tconv和CD8+T细胞内CCR4平均荧光强度(MFI)的倍数变化，在所有3个群中CCR4 MFI均保持不变(图3A)。

肿瘤微环境中效应T细胞与Treg的比率是一个公认的参数，其与妇科癌症患者的临床结果相关(Gooden MJ等人，(2011)British journal of Cancer 28；105(1):93-103)。发明人比较了增加的％CCR4患者和恒定的％CCR4患者之间在前3个周期的治疗中CCR4+Tconv和CCR4+CD8+T细胞与CCR4+Treg的合并比率。与恒定的％CCR4患者相比，增加的％CCR4患者中Tconv相对于Treg的平均比率高2倍以上(p<0.01)，而CD8+T细胞相对于Treg的平均比率高3倍以上(p<0.05)(图3B)。

T细胞上CCR4的表达与细胞毒性的丧失有关(Kondo T等人(2009)InternationalImmunology 21(5):523-32)。因此，发明人确定了CD4+或CD8+T细胞的细胞毒性功能是否受到这些群体中CCR4+细胞增加的影响。在CCR4+T细胞频率增加的某个时间点，使用从4名增加的％CCR4患者中的3名获得的样品确定CD4+和CD8+T细胞中的CD107a+细胞的频率。与治疗前样品相比，CD4+和CD8+群中CD107a+细胞的平均频率均增加了，但是增加均不显著(图4A和B)。

实施例3通过体外马磷酰胺的前-处理而提高产生CCR4+效应CD4 T细胞的能力的 患者，体内对环磷酰胺的反应具有“CCR4峰”

为了确定CCR4+T细胞频率的增加是否直接归因于环磷酰胺，将患者治疗前和健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)与马磷酰胺(环磷酰胺的生物活性同种型)培养。滴定法确定最佳无毒马磷酰胺剂量为1.5μg/ml(图5)。将健康供体以及患者治疗前的PBMC与1.5μg/ml的马磷酰胺或单独的介质一起培养3天。与介质相比，马磷酰胺处理的来自健康供体和患者的PBMC的CD3+T细胞中CCR4+细胞的频率显著更高(健康：22.9％±1.79％相较于15.4％±1.47％，p<0.001，癌症：24.4％±3.14％相较于19.6％±2.82％，p<0.01，图6A)。

与体内观察的类似，当确定Treg、Tconv和CD8+T细胞的CCR4+细胞频率的倍数变化时，相对于介质，马磷酰胺处理的PBMC在Tconv(健康：1.45倍，p<0.05；癌症：1.18倍，p<0.05)和CD8+T细胞(健康：2.52倍，p<0.05；癌症：1.61倍，p<0.05)内CCR4+细胞的频率显著增加。在Treg内CCR4+细胞的频率中未观察到显著变化(图6B)。健康供体和癌症患者之间的这种趋势相似，但是健康供体中Tconv(p<0.01)和CD8+T细胞(p<0.01)内的CCR4+T细胞的倍数增加高于癌症患者(图6B)。在健康供体和癌症患者中，马磷酰胺治疗均不会改变CCR4在任何细胞群上的MFI(图6B)。

同样类似地在体内观察中，与健康供体和癌症患者的未处理细胞相比，效应和调节性T细胞群之间通过马磷酰胺对CCR4表达的差异控制导致CCR4+CD4+Tconv相对于CCR4+Treg的平均比率(p<0.05)和CCR4+CD8+T细胞相对于CCR4+Treg的平均比率(p<0.05)超过2倍的显著增加(图6C)。

CCR4稳定患者(n＝6)和CCR4峰患者(n＝4)之间CCR4+CD4 T细胞效应物频率上调的比较(p<0.0005)以倍数增加表示，如图6D所示。

发明人进一步研究了患者％CCR4的增加是否能在对马磷酰胺反应中区分其与恒定的％CCR4患者，因为这可能已经指示了治疗前的反应偏向。然而，尽管与恒定的CCR4+患者相比，增加的％CCR4患者中CD3+T细胞中CCR4+细胞频率的倍数增加略高，但这种差异在统计学上并不显著(图8A)。当比较增加的％CCR4患者和恒定的％CCR4患者之间Tconv和CD8+T细胞内CCR4+细胞的倍数变化时，增加的％CCR4患者比稳定的％CCR4患者中Tconv内的倍数增加显著更高(1.32相较于1.09，p＜0.05，图8B和C)。

实施例4紫杉醇并不显著增加健康PMBC中的CCR4+T细胞的频率

为了确定在用紫杉醇(另一种抗肿瘤药)治疗后CCR4+T细胞的频率是否增加，将健康患者的外周血单个核细胞(PBMC)与马磷酰胺和紫杉醇培养。健康供体PBMC可以在37℃、5％CO₂的湿润孵育箱在单独介质中、1.5μg/ml的环磷酰胺活性代谢物(马磷酰胺)或30ng/ml的紫杉醇中孵育72小时。收获细胞，并使用流式细胞术分析确定CCR4在CD8+和CD4+CD25-T细胞上的表达。与紫杉醇处理的细胞相比，马磷酰胺处理的来自健康供体的CD8+和CD4+CD25-T细胞相对于未经处理的细胞，CCR4+细胞具有显著更高的倍数增加(CD8+：1.39相较于1.00；p<0.05和CD4+CD25-：1.14相较于1.04，p<0.01，图7)。

实施例5在T细胞上诱导CCR4表达的机制

在T_H2极化条件下诱导CCR4的表达。因此，发明人检查了CCR4上调是否是由于马磷酰胺导致的Th2极化所致。在3天的时程中以每天间隔将PBMC上IL-4的表达与CCR4的表达相关联。在CD4+和CD8+T细胞群中，CCR4表达和IL-4表达之间没有相关性(图9A)。相反，在CD4+和CD8+T细胞中CCR4表达与IL-2+细胞的频率呈正相关(图10)。

发明人进一步研究了马磷酰胺是否在纯化的CD4+和CD8+T细胞群上诱导CCR4表达。确定了未处理的细胞和马磷酰胺处理的细胞之间CCR4+频率的倍数变化，并比较了全PBMC和分离的细胞。与全PBMC中包含的CD4+和CD8+T细胞相比，纯化的CD4+和纯化的CD8+T细胞中CCR4+细胞频率的平均倍数增加没有差异(图9B)。

马磷酰胺似乎直接调节CCR4表达。由于先前已证明环磷酰胺作为组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂起作用，调节组蛋白3(H3)上的乙酰化，此外，由于表观遗传修饰H3已与CCR4基因表达相关，因此发明人研究了马磷酰胺对CCR4表达的控制是否归因于表观遗传修饰。在用帕比司他(LBH589，一种pan HDAC抑制剂)、马磷酰胺或IL-4处理PBMC后，确定H3K9、H3K14和H3K18的乙酰化水平。确定H3K9、H3K14或H3K18阳性细胞的MFI，并将其针对单独介质中培养的细胞进行归一化。马磷酰胺或IL-4处理均不会导致H3K14的乙酰化的变化(图11)。在H3K9和H3K18中乙酰化的改变很明显。将门设置在阳性细胞上，并在其中确定乙酰化H3K9和乙酰化H3K18的MFI。当用马磷酰胺处理细胞时，CD4+和CD8+T细胞中乙酰化的H3K9和H3K18的MFI显著增加，接近1.2倍增加(p<0.05)。用IL-4处理细胞导致CD8+T细胞中H3K9的乙酰化略有但是是显著的下降(p<0.05)(图9C)。当CD4+和CD8+T细胞内，CCR4+细胞与CCR4-细胞进行比较时，H3K9或H3K18的乙酰化没有显著差异(图9C)。

实施例6马磷酰胺诱导的CCR4表达促进向CCL22的细胞迁移

为了确定环磷酰胺诱导的CCR4表达是否是功能性的并且是否响应CCL22引发细胞迁移，使用1.5μg/ml马磷酰胺处理的健康供体PBMC进行了体外迁移测定法。如先前所述计算迁移指数(Govindaraj C等人(2013)Clinical Immunology149(1):97-110)。患者的血清CCL22浓度如图12所示。

马磷酰胺处理的PBMC向CCL22的迁移指数显著增加(p<0.05)，而未经处理的PBMC的迁移指数保持不变(图13A)。为了进一步证实该定向迁移与CCR4表达相关，发明人将CCR4+T细胞的频率与迁移指数相关联，并且发现两个参数之间显著正相关(p＜0.001，r＝0.81，图13B)。

结果表明，通过差异性地上调效应细胞群而不是Treg上的CCR4表达，环磷酰胺导致效应细胞与Treg的比率的变化，而Treg具有迁移到肿瘤的潜能。因此，本发明人研究了这是否反映了向CCL22运输的细胞中效应物与Treg的比率的实际变化。比较了已用或未用马磷酰胺处理的PBMC之间向CCL22迁移的细胞中Tconv和CD8+T细胞相对于Treg的比率。与未经处理的细胞相比，在马磷酰胺处理的细胞中，Tconv相对于Treg的平均比率和CD8+T细胞相对于Treg的平均比率都高出2倍以上，但是，这种差异仅对于Tcon相对于Treg的比率是显著性的(p<0.05，图13C)。

实施例7在卵巢癌的免疫活性小鼠模型中LDCy增加外周血和TIL中活化的CD8 T细 胞中的CCR4⁺CD8⁺T细胞

为了测试实施例1中试点人试验的预测，即体内低剂量的环磷酰胺(LDCy)将使生物活性效应CD8 T细胞相对于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的Treg成比例地增加，发明人采用了一种基于腹膜内(i.p.)或囊内(i.b.)施用同基因上皮癌细胞系ID8的免疫活性小鼠卵巢癌(OC)模型，其可代表卵巢癌病理的关键方面，包括血管变化、生长缓慢、肿瘤性腹水的形成和传播方式(Chiriva-Internati M等人(2010)PloS one 5，e10471)。

为了解决LDCy对荷瘤动物免疫力的影响，将植入ID8的动物(n＝5只/组)在攻击后(体内开始出现可检测的肿瘤生长)用一个周期的LDCy治疗，并在体内治疗第1、7和14天后通过流式细胞术离体评估T细胞亚组的变化。图14显示了第14天的数据。发明人发现，在外周血中CCR4⁺CD8⁺T细胞明显增加(图14A)，CCR4⁺CD4 T效应细胞增加的趋势，并且与人试验结果相似，CCR4⁺Treg没有增加。由于CCR4被肿瘤局部分泌的CCL22下调(Mariani M等人，(2004)Eur J Immunol 34:231；de Lavareille A等人(2001)European Journal ofImmunology 31:1037-1046)，以及CCR4介导的T细胞浸润与活化的表型相关(Kovacsovics-Bankowski M等人，(2014)Journal for immunotherapy of cancer 2:38)，发明人还通过与CD69活化标志物共染色，测试了伴随的肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)中活化T细胞频率的变化。图14B显示在LDCy治疗后，TILS CD69+CD8+T细胞明显增加，以及再次地显示CD69⁺CD4 T效应细胞增加的倾向，但没有CD69⁺Treg的增加进一步与血液中CCR4⁺T细胞的增加相关(未显示)。

实施例8预测环磷酰胺治疗的反应者

从癌症受试者获得外周血单个核细胞(PBMC)，并在采血后24小时内通过Ficoll密度梯度离心法进行分离。然后将细胞悬浮在含有5％人血清的AMI-V介质中。然后将PBMC与1.5μg/ml的马磷酰胺或单独的介质在适当条件下培养3天。然后收集细胞并用合适的细胞表面标志物进行染色，包括CCR4、CD3、CD8、CD4和CD25以及可固定的死细胞染料(例如PE)以区分死细胞。在固定和透化细胞、并用抗-FoxP3标记后，确定细胞内的FoxP3水平。然后对细胞进行适当的门控和流式细胞术分析，匹配的同种型对照作为参考。分析表达FoxP3-、CD25-、CD4+和CD8+的Teff细胞的CCR4表达。在某些情况下，还分析表达FoxP3+、CD25+、CD4+的Treg的CCR4表达。

比较存在马磷酰胺的情况下培养的Teff细胞上CCR4的表达水平与不存在马磷酰胺的情况下培养的细胞上的CCR4表达水平。

与未处理的细胞相比较，在马磷酰胺处理后表现出CCR4表达增加(即上调)的受试者被选择使用低剂量环磷酰胺或其类似物、衍生物或活性代谢物治疗。

备注

癌症免疫疗法的重点一直放在改善免疫抑制和活化效应T细胞功能上(Dougan M和Dranoff G(2009)Ann Rev Immunol.27:83-117)。但是，如果有益的免疫细胞不能到达需要他们的地方，这些努力是徒劳的。本文提供的数据表明，使用体外筛选方案，可以预先鉴定将对免疫治疗性低剂量环磷酰胺(LDCy)治疗产生免疫应答并受益的患者。筛选测试可以与遗传测试组合以提供额外的功能。

LDCy对效应T细胞上而不是Treg上CCR4的上调作用，与治疗期间和体外CUP预试验中观察到的体内CCR4上调患者中具有显著生存增加(>300天)的作用是一致的。

动物数据支持以下假设：LDCy增加血液中的效应CCR4+CD8+T细胞(而不是CCR4+Treg)，促进其随后的迁移肿瘤，从而使肿瘤浸润在活化的CD8 T细胞中富集。重要的是，对人PBMC的治疗前体外分析还将预测对LDCy治疗无反应的患者，从而使他们能够继续进行其他治疗。

这些数据表明环磷酰胺能够直接启动效应T细胞中CCR4的表达。迁移测定法证实了马磷酰胺处理的细胞响应CCL22而发生迁移的能力，并且还表明在迁移的级分中效应T细胞相对于Treg的比率增加。

Claims (26)

1.和Teff细胞上CCR4结合的化合物在制备组合物或试剂盒中的用途，其中：

所述组合物或试剂盒用于确定妇科癌对环磷酰胺治疗产生的反应，所述确定包括检测生物样品中Teff细胞上CCR4表达的上调，所述生物样品包含施用至少一个剂量或周期的环磷酰胺或其类似物或衍生物后获自受试者的Teff细胞和Tsupp细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其中在Teff细胞上而不是Tsupp细胞上检测表达的上调。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述Teff细胞是辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述Tsupp细胞是调节性T细胞。

5. 根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述检测包括：

（i）使从所述受试者获得的生物样品中的Teff细胞在体外与试剂接触，所述试剂结合Teff细胞表面上的CCR4；和

（ii）测量细胞上CCR4的表达水平。

6.根据权利要求5所述的用途，其中还包括从所述生物样品中分离或纯化Teff细胞。

7.根据权利要求5所述的用途，其包括比较根据步骤（ii）测量的CCR4的表达水平与来自用环磷酰胺治疗前的受试者的Teff细胞上的CCR4的表达水平。

8.根据权利要求6所述的用途，其包括比较根据步骤（ii）测量的CCR4的表达水平与来自用环磷酰胺治疗前的受试者的Teff细胞上的CCR4的表达水平。

9.根据权利要求5所述的用途，进一步包括从所述受试者获得包含Teff细胞的生物样品。

10.和Teff细胞上CCR4结合的化合物在制备组合物或试剂盒中的用途，其中：

所述组合物或试剂盒用于确定妇科癌对环磷酰胺治疗产生的反应，所述确定包括检测生物样品中Teff细胞上CCR4表达的上调，所述生物样品包含从先前未接受环磷酰胺或其类似物或衍生物的受试者获得的Teff细胞和Tsupp细胞，包括检测Teff细胞在体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物后，Teff细胞上CCR4表达的上调。

11.根据权利要求10所述的用途，其中在Teff细胞上而不是Tsupp细胞上检测表达的上调。

12.根据权利要求10所述的用途，其中所述Teff细胞是辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。

13.根据权利要求10所述的用途，其中所述Tsupp细胞是调节性T细胞。

14.根据权利要求10所述的用途，其中检测表达包括：

（i）使所述生物样品在体外暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物；

（ii）使来自所述受试者的生物样品中的Teff细胞与试剂接触，所述试剂结合Teff细胞表面上的CCR4；和

（iii）测量细胞上CCR4的表达水平。

15.根据权利要求10所述的用途，其中使所述生物样品中的细胞在体外暴露于马磷酰胺3天。

16.根据权利要求14所述的用途，其中使所述生物样品中的细胞在体外暴露于马磷酰胺3天。

17.根据权利要求14所述的用途，还包括比较暴露前Teff细胞上的CCR4的表达水平与暴露于环磷酰胺或其类似物或衍生物后Teff细胞上的CCR4的表达水平。

18.根据权利要求1或10所述的用途，其中所述受试者患有分泌CCL22的妇科癌。

19.根据权利要求1或10所述的用途，其中所述受试者患有选自以下的妇科癌：卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、外阴癌、阴道癌、或以上任何的组合。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述子宫癌是子宫内膜癌。

21.根据权利要求1或10所述的用途，其中所述生物样品包括外周血单个核细胞。

22. 根据权利要求1或10所述的用途，其中所述检测还包括：

（i）从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含效应T细胞；和

（ii）从所述生物样品制备细胞悬液。

23.和Teff细胞上CCR4结合的化合物在制备组合物或试剂盒中的用途，其中：

所述组合物或试剂盒用于评估低剂量环磷酰胺治疗妇科癌症受试者疗效，所述评估方法包括在所述受试者接受至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之前或之后的第一时间点检测包含Teff细胞的第一生物样品中CCR4的表达水平，在所述受试者接受一个或多个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之后的在后时间点用包含Teff细胞的第二生物样品重复该分析，并且比较两个时间点上CCR4的表达水平，其中第二样品中Teff细胞上CCR4表达比第一样品中的CCR4表达上调指示临床有效的治疗。

24.和Teff细胞上CCR4结合的化合物在制备组合物或试剂盒中的用途，其中：

所述组合物或试剂盒用于评估受试者中卵巢癌的消退的监测方法，所述评估方法包括在所述受试者接受至少一个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之前或之后的第一时间点检测包含Teff细胞的第一生物样品中CCR4的表达水平，在所述受试者接受一个或多个剂量的环磷酰胺或其类似物或衍生物之后的在后时间点用包含Teff细胞的第二生物样品重复该分析，并且比较两个时间点上CCR4的表达水平，其中第二样品中Teff细胞上CCR4表达比第一样品中的CCR4表达上调指示卵巢癌的消退。

25. 根据权利要求1或10所述的用途，其中所述Teff细胞包括CD4+ T_H1 T细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞。

26.根据权利要求1或10所述的用途，其中所述Teff细胞包括FoxP3-CD25-CD4+细胞和CD8+T细胞。