CN116710475A

CN116710475A - Sqstm1及其在癌症疗法中的用途

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Publication number: CN116710475A
Application number: CN202180084480.2A
Authority: CN
Inventors: B·莫格拉比; N·亚兹贝克; A·贝雷德; G·丹德瑞; I·格罗斯让; P·霍夫曼
Original assignee: Blue Coast University; National Institute Of Medical Research And Health; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Blue Coast University; National Institute Of Medical Research And Health; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-09-05
Also published as: WO2022129180A1; EP4237431A1; KR20240008294A; JP2023553569A

Abstract

本发明涉及SQSTM1/p62蛋白用于调节和预测对以下项的反应的用途：‑针对免疫检查点抑制剂的免疫疗法；‑免疫疗法优选ICI和化学疗法的组合。

Description

SQSTM1及其在癌症疗法中的用途

本发明涉及蛋白质SQSTM1及其在疗法中的用途。

高等真核生物中的免疫系统对外来病原体和感染细胞的侵袭起着核心作用。在没有外部损伤的情况下，免疫系统还通过检测在细胞表面的异常抗原或异常过表达的蛋白质来仔细地调查并有效地识别新生的转化细胞。

经典地，先天免疫细胞(自然杀伤细胞(NK)、树突细胞(DC)、多形核白细胞和巨噬细胞)被募集作为通过细胞溶解杀伤来攻击转化细胞的第一道防线。然后，抗原呈递细胞(APC)(诸如DC)加工肿瘤抗原并迁移至淋巴结，以引发由B淋巴细胞和T淋巴细胞介导的更集中的适应性免疫反应。在抗原通过MHC-II和MHC-I受体分别呈递给幼稚CD4+和CD8+T细胞时，这些细胞经历克隆扩增和分化以发挥效应子功能或记忆功能。T细胞功能在分子水平上由TCR依赖性和细胞因子依赖性信号传导级联指挥，这些信号传导级联在细胞核中结束并激活谱系特异性转录因子。这导致产生了一大组发挥不同功能并且特征在于特定的表面标志物和核标志物以及分泌的效应分子的T淋巴细胞。

在T细胞亚群中，″系列杀伤细胞″明确地是CD8+细胞溶解T淋巴细胞(CTL)，这些细胞迁移至肿瘤位点并与Th1和Th2 CD4+辅助细胞协作以攻击和杀伤转化细胞。尽管CD4+细胞通过产生免疫刺激性环境而″帮助″，但CTL通过分泌Fas配体和促炎症肿瘤坏死因子(TNF)以及含有穿孔素(成孔蛋白)和粒酶(丝氨酸蛋白酶)的细胞毒性颗粒而在靶细胞中诱导凋亡性死亡。在趋化因子中，许多研究强调IFN-γ在肿瘤根除中的重要性。该细胞因子由活化的CD4和CD8 T细胞释放，并且控制APC的发育和功能。凋亡的肿瘤细胞然后被快速检测并被专职吞噬细胞诸如巨噬细胞和树突细胞吞噬，以将肿瘤抗原呈递给CTL并避免过度的炎症。此外，CD4+调节性T细胞(Treg)分泌转化生长因子β(TGF-β)、IL-10和IL-35，它们抑制促炎症反应，从而限制组织损伤。理想地，在细胞毒性和调节活性之间的调谐平衡允许肿瘤细胞去除并且保持周围健康组织的完整性。

理论上，有效的免疫监视将产生成功的T细胞启动和肿瘤根除。

然而，临床诊断的肿瘤证明肿瘤细胞能够逃避免疫监视。在免疫抑制策略中，肿瘤细胞操纵T细胞共抑制途径以规避抗肿瘤反应。在炎症期间，这些共抑制途径(也称为″免疫检查点″)在免疫和上皮细胞上表达，以平衡共刺激信号、抑制T细胞功能和避免过度的细胞毒性。

程序性死亡蛋白-1(PD-1)及其配体PD-L1和PD-L2形成到目前为止最著名的免疫抑制对。PD-L1在以下多种癌症的细胞表面过表达：黑色素瘤、神经胶质瘤、肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肠癌、肾癌、膀胱癌和卵巢癌，并且与差的总体存活期相关。当与其配体PD-L1结合时，PD-1信号传导降低T细胞活化(IFN-γ产生)、糖酵解和细胞周期进展。尽管这种重新编程潜在的信号传导事件仍有待探索，但现在清楚的是，所产生的功能障碍的T细胞可通过阻断PD-1/PD-L1相互作用来恢复活力。

关于这些检查点的知识已导致科学家使用它们来开发针对肿瘤的新疗法：检查点抑制剂免疫疗法。

免疫检查点抑制剂(ICI)已经证明在治疗几种晚期癌症和延长总体存活期方面有效，特别是PD-1/PD-L1阻断抗体，这些抗体恢复肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并构成抵抗肿瘤发展的有价值的武器。

不幸的是，尽管在癌症患者中观察到最高的临床益处，在霍奇金病中具有接近87％的客观反应并且在结缔组织增生性黑色素瘤中具有70％的客观反应，但是绝大多数其他癌症诸如肺癌和黑色素瘤最多经历25％-30％的检查点抑制剂免疫疗法功效。所得的80％的癌症患者遭受对ICI的先天性或获得性抗性。

因此，需要提供可帮助病理学家确定检查点抑制剂免疫疗法对确定的肿瘤是否有效的生物标志物。

因此，本发明的目的是避免现有技术的这种缺陷。

本发明的一个目的是提供已知的蛋白质作为检查点抑制剂免疫疗法的功效的预测性标志物的用途。

本发明的另一个目的是提供一种预测或有效地治疗可能对这类免疫疗法有抗性的肿瘤的方法。

本发明的另一个目的是提供一种简单的即用型试剂盒，以确定肿瘤将是否对单独或组合的免疫疗法有反应。

因此，本发明涉及SQSTM1(也称为p62或称为SQSTM1/p62蛋白)用于调节(优选在体外)肿瘤细胞对以下项的反应的用途：

-免疫疗法，优选针对免疫检查点抑制剂(也称为ICI)的免疫疗法；

-使用不是干扰DNA修复的药剂的化学疗法；或者

-免疫疗法(优选ICI)和化学疗法的组合。

本发明基于本发明人意想不到的观察结果，即SQSTM1/p62是对抗癌疗法有反应的中心标志物。因此，通过调节SQSTM1/p62蛋白的表达，有可能改变或调节肿瘤细胞对免疫疗法、使用不是干扰DNA修复的药剂的化学疗法、或免疫疗法和化学疗法的组合的反应。

这有利地意味着当SQSTM1存在或不存在或处于不同水平时，肿瘤细胞在体外对使用上述疗法的治疗可作出不同的反应。

本发明涉及一种包含SQSTM1/p62蛋白的组合物，其用于调节(优选在体外)肿瘤细胞的：

-使用不是干扰DNA修复的药剂的化学疗法；或者

-免疫疗法(优选ICI)和化学疗法的组合。

作为第一个自噬衔接蛋白而著名的死骨片(Sequestosome)1蛋白或SQSTM1/p62最重要地是控制包括细胞生长、细胞迁移和细胞存活在内的多种细胞功能的信号传导中枢。SQSTM1/p62不具有内在信号传导功能，但与激酶、泛素连接酶和其他蛋白质相互作用以驱动信号传导途径。

据报道SQSTM1/p62蛋白在癌症中失调，但从未教导或暗示SQSTM1/p62蛋白可能是用于评价对抗癌疗法的抗性或敏感性的中心标志物。

在本发明中，″化学疗法″意指使用化学治疗化合物的治疗或使用放射疗法的治疗。

根据本发明，化学治疗化合物对应于影响在癌细胞中以及在正常细胞中的DNA损伤、DNA修复、DNA复制、DNA甲基化、表观遗传修饰、先天性防御、IFN反应或细胞分裂的化合物。

在本发明中，免疫疗法或癌症免疫疗法涵盖各种形式，包括靶向抗体、癌症疫苗、过继细胞转移、肿瘤感染病毒、合成病毒、合成RNA/DNA和免疫检查点抑制剂、细胞因子和佐剂。免疫疗法的目的是提高身体对抗癌细胞的天然防御。

特异性免疫疗法中的一种是使用免疫检查点抑制剂。

免疫检查点是免疫系统的正常部分，并且防止免疫反应太强以至于破坏体内的健康细胞。当T细胞表面上的蛋白质识别并结合其他细胞(诸如一些肿瘤细胞)上的伴侣蛋白时，免疫检查点参与。当检查点和伴侣蛋白结合在一起时，它们向T细胞发送″关闭″信号。这可防止免疫系统破坏癌症。免疫疗法药物(称为免疫检查点抑制剂)通过阻断检查点蛋白与其伴侣蛋白的结合而起作用。这防止″关闭″信号被发送，从而允许T细胞杀死癌细胞。一种这样的药物作用于检测点蛋白(称为CTLA-4蛋白)、PD-1蛋白或其伴侣蛋白PD-L1。

有利地，本发明涉及SQSTM1/p62蛋白用于调节(优选在体外)对针对免疫检查点抑制剂的免疫疗法的反应的用途。

有利地，本发明涉及SQSTM1/p62蛋白用于调节(优选在体外)对使用不是干扰DNA修复的药剂的化学疗法的反应的用途。

有利地，本发明涉及SQSTM1/p62蛋白用于调节(优选在体外)对ICI和化学疗法的组合的反应的用途。

有利地，本发明涉及如上文所定义的用途，其中所述SQSTM1/p62蛋白包含如SEQID NO：1所示的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

有利地，本发明涉及如上文所定义的上述组合物，用于如上文所定义的用途，其中所述SQSTM1/p62蛋白包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

人SQSTM1/p62蛋白包含如下文呈现的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：

该蛋白由NCBI数据库NM_003900.5中所引用并且列为SEQ ID NO：2的核酸分子编码。

因此，在有利的实施方案中，本发明涉及如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白用于调节(优选在体外)对针对免疫检查点抑制剂的免疫疗法的反应的用途。

有利地，本发明涉及如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白用于调节(优选在体外)对使用不是干扰DNA修复的药剂的化学疗法的反应的用途。

有利地，本发明涉及如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白用于调节(优选在体外)对ICI和化学疗法的组合的反应的用途。

在一个其他方面，本发明还涉及一种用于预测(优选在体外或离体)对肿瘤疗法的抗性的方法，所述疗法是化学疗法和/或免疫疗法，所述方法包括：

-评价源自肿瘤的生物样品中SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在或量，

-将SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量与对照样品中SQSTM1/p62蛋白的量进行比较，

-结论是

*当所述生物样品中SQSTM1/p62蛋白不存在或低于或等于在对照样品中获得的量时，肿瘤将可能对疗法有抗性，以及

*当所述生物样品中SQSTM1/p62蛋白存在或高于对照水平时，肿瘤将可能对疗法敏感。

在本发明中，本发明人已经表明SQSTM1/p62蛋白的表达或表达的下调是对肿瘤疗法的抗性或敏感性的有价值的标志物。

事实上，本发明人已经表明，肿瘤或肿瘤样品中SQSTM1/p62蛋白的存在或表达的增加是所述肿瘤或所述肿瘤样品对化学疗法、免疫疗法或这两种疗法的敏感性的标志物。以相同的方式，当SQSTM1/p62蛋白在肿瘤中不表达或未表达时，肿瘤或肿瘤样品将对化学疗法、免疫疗法或这两种疗法具有抗性。

蛋白质(即SQSTM1/p62蛋白)的存在或不存在或量的变化是决定性的。事实上，SQSTM1/p62蛋白的存在的生物效应是肿瘤的敏感性/抗性的关键点。因此，特别是如果在转录水平和翻译水平之间没有相关性，评价编码SQSTM1/p62的核酸分子(即RNA)的量是不够的。

SQSTM1/p62蛋白的存在或量的检测可通过本领域已知的任何技术进行以特异性地检测蛋白质，特别是通过使用免疫学手段诸如抗体或其衍生物。这种检测可通过免疫组织化学、免疫印迹、原位免疫荧光或通过使用流式细胞仪来进行。

在源自肿瘤(即来自活检或液体活检，或来自其中存在源自所述肿瘤的循环细胞的血液样品)的样品中评价SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量的变化。在血液肿瘤(诸如白血病或淋巴瘤)的情况下，生物样品是血液样品或从骨髓或从移植了恶性细胞的器官获得的活检。

将SQSTM1/p62的存在、不存在或量与参考样品中蛋白质的存在、不存在或量进行比较来确定。有利地，参考样品与肿瘤具有相同的性质或来源。这意味着，如果肿瘤是肺肿瘤，参考样品将从不受肺癌影响的个体的肺获得，或者从同一患者的相邻对照组织获得。

参考样品可为阴性参考样品，即已知不对应于肿瘤的样品，或者为已知SQSTM1/p62蛋白的量或不存在的阳性参考样品。本发明中的参考样品可从例如邻近的健康组织获得。

为了比较在待研究样品和参考样品之间的存在、不存在或量，SQSTM1/p62蛋白的检测可通过本领域已知的手段(诸如发光或荧光、褐色比色信号的定量)来定量。对过表达癌症中点状SQSTM1/p62染色模式的检测与对健康组织中几乎不均匀染色的检测(参见下文实施例)。

有利地，SQSTM1/p62蛋白包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

因此，有利地，本发明还涉及一种用于预测对肿瘤疗法的抗性的方法，所述疗法是化学疗法和/或免疫疗法，所述方法包括：

-评价源自肿瘤的生物样品中如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在或量，

-将SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量与对照样品中如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白的量进行比较，

-结论是

*当所述生物样品中如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白不存在或低于或等于在对照样品中获得的量时，肿瘤将可能对疗法有抗性，以及

*当所述生物样品中如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1/p62蛋白存在或高于对照水平时，肿瘤将可能对疗法敏感。

有利地，本发明涉及如上文所定义的方法，其中在生物样品中(优选在组织活检或液体活检中)原位评价SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在。

如本领域已知的，组织活检涉及提取样品细胞或组织用于检查以确定疾病的存在或程度。组织通常由病理学家在显微镜下检查；也可进行化学分析或通过使用蛋白质组学分析进行分析。

液体活检对应于使用在诸如血液等流体中循环的生物标志物的肿瘤分析。有几种类型的液体活检方法；方法选择取决于所研究的病症。液体活检基于癌细胞的检测、以及蛋白质和循环的肿瘤核酸(DNA或RNA-ctDNA)的检测。

可研究多种生物标志物以检测或监测疾病。

有利地，本发明涉及如上文所定义的方法，其中原位评价通过免疫学手段来进行。

如上文所述，在生物样品中原位评价SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量，这意味着在源自肿瘤的细胞上直接评价SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量。

当使用组织活检时，有利的是进行免疫组织化学技术以确定蛋白质的存在或不存在或量。因此，使用特异性抗SQSTM1/p62抗体，其通常与二抗偶联，该二抗与标记色原质诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联。也可进行免疫细胞化学技术。

当使用液体活检时，有利的是使用与荧光团偶联的特异性抗SQSTM1/p62抗体以便在样品中或通过使用流式细胞仪检测表达SQSTM1/p62蛋白的细胞。也可通过熟知的技术(诸如使用抗SQSTM1/p62抗体的ELISA或蛋白质组学方法)检测所分泌的SQSTM1/p62。

这些技术是本领域熟知的，并且具有鉴定细胞中的蛋白质的知识的技术人员将根据待研究样品的类型使用最适当的技术。

在另一个方面，本发明还涉及一种用于预测(优选在体外)患有肿瘤的患者的存活率的方法，所述方法包括：

-将SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量与对照样品中评价的SQSTM1/p62蛋白的量进行比较，

-结论是

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62不存在或低于或等于在对照样品中获得的量时，则患者在五年后将具有高于80％的存活率，以及

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62存在或高于在对照样品中获得的量时，则患者在五年后将具有低于70％的存活率。

在本发明的另一个方面，本发明人已确定，通过仅测量如上文所公开的蛋白质SQSTM1/p62的表达水平，有可能预测患有肿瘤的患者的存活率。

本发明人注意到，当蛋白质SQSTM1/p62的表达水平低于或等于在非肿瘤、以及更一般地非健康生物样品中观察到的相对表达水平时，则从其获得样品的个体将具有高于80％的存活期超过五年的可能性。相反，当蛋白质的表达水平(即量)高于参考样品中的水平时，则从其获得样品的个体将具有低于80％的存活期超过五年的可能性。

因此，本发明人已确定SQSTM1/p62蛋白在肿瘤中的表达增加是肿瘤严重性及其潜在攻击性的标志，例如由于肿瘤免疫逃避。

因此，评估生物肿瘤样品中SQSTM1/p62蛋白的量的变化量可用于确定患者的结果，并为他/她提供当的疗法。

有利地，本发明涉及如上文所定义的方法，其中将以下项的存在、不存在或量：

-PD-L1蛋白，和

-T CD8淋巴细胞

与SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在或量同时评价，并且与在对照样品中评价的相应PD-L1蛋白和T CD8淋巴细胞的存在、不存在或量进行比较，

并且其中

当所述生物样品中的SQSTM1/p62蛋白、PD-L1蛋白和T CD8淋巴细胞存在或高于在对照样品中获得的量时，患者在五年后将具有低于50％的存活率。

本发明人还有利地确定了为了改善存活期超过五年的预后，进一步评估PD-L1蛋白和T CD8淋巴细胞的量可能是有用的。实际上，SQSTM1/p62和PD-L1蛋白的增加连同T CD8淋巴细胞的增加，允许分割者预测在五年内肿瘤的不良结果。因此，他可提出一种适当的疗法，诸如使用抗PD-L1抗体(可能与其他化合物缔合)的免疫疗法。

在本发明中，上文所述的患者可进一步用以下来治疗：DNA损伤剂(诸如顺铂、多西他赛、奥沙利铂)、DNA/表观遗传药物(特别是DNA甲基化酶抑制剂、5-氮杂胞苷、地西他滨、HDAC抑制剂、组蛋白甲基化酶抑制剂)、细胞周期抑制剂(CDK4/6抑制剂诸如哌柏西利(palbociclib)/PD-0332991、阿贝西利(Abemaciclib)和瑞博西利(ribociclib)/LEE011)、先天性防御、IFN反应等。

本发明还涉及一种用于预测(优选在体外)患有肿瘤并且用化学疗法和/或免疫疗法治疗的患者的存活率的方法，所述方法包括：

-结论是

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62不存在或低于或等于在对照样品中获得的量时，则患者在治疗20个月后将具有低于或等于10％的存活率，以及

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62存在或高于在对照样品中获得的量时，则患者在治疗20个月后将具有等于或高于50％的存活率。

本发明还涉及一种用于预测(优选在体外)患有肿瘤并且用化学疗法或免疫疗法或两者治疗的患者的存活率的方法，所述方法包括：

-结论是

在本发明的另一个方面，本发明人还已确定了可通过测量SQSTM1/p62蛋白的表达水平来评估患有肿瘤并且通过使用免疫疗法或化学疗法治疗的患者的存活率的预测。

本发明人已注意到，当患有肿瘤并且用免疫疗法或化学疗法或两者治疗的患者具有高于参考量的SQSTM1/p62的量时，则该患者在20个月内将具有良好的结果。然而，当SQSTM1/p62的量低于参考水平时，患者在20个月内将具有不良的结果。

因此，有可能在所述患者的肿瘤中加强SQSTM1/p62的表达，以便旨在增加结果。为了增加SQSTM1/p62蛋白的量，可使用载体疗法或化学疗法。技术人员可容易地确定加强这种蛋白质表达的最佳方式。

本发明还涉及一种组合物，该组合物包含：

-SQSTM1/p62蛋白，或

-编码所述SQSTM1/p62蛋白的核酸分子；

连同针对检查点抑制剂的免疫治疗抗体或化学治疗剂与针对检查点抑制剂的免疫治疗抗体的组合，

该组合物用于治疗涉及炎症的病理的用途。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含SQSTM1/p62蛋白，

连同化学治疗剂或针对检查点抑制剂的免疫治疗抗体或两者，

该组合物用于治疗涉及炎症的病理的用途。

此外，本发明涉及一种组合物，该组合物包含编码所述SQSTM1/p62蛋白的核酸分子、

该组合物用于治疗涉及炎症的病理的用途。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含SQSTM1/p62的效应物中的一种；

该组合物用于治疗涉及炎症的病理的用途。

在本发明中，涉及炎症的病理可为例如涉及癌症和自身免疫性疾病以及感染的病理。

此外，本发明涉及一种组合物，该组合物包含编码SQSTM1/p62的效应物中的一种的核酸分子；

连同化学治疗剂或免疫治疗抗体或两者，

该组合物用于治疗涉及炎症的病理的用途。

如上文所述，本发明人已出乎意料地发现SQSTM1/p62蛋白表达的增加可显著地降低炎症和涉及炎症的病理的发展或进展。

上述组合物可含有蛋白质本身，特别是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或编码所述蛋白质的核酸分子。

上文所述的核酸分子可为如SEQ ID NO：2所示的分子。

有利地，SQSTM1/p62蛋白或编码所述蛋白质的核酸分子以及化学治疗剂和/或免疫治疗抗体可以由技术人员所确定的确定剂量同时、分开或序贯使用。分开或序贯使用将取决于在蛋白质和化学治疗剂和/或免疫治疗抗体之间的相容性。

有利地，本发明涉及用于如上文所定义的用途的如上文所定义的组合物，其中所述涉及炎症的病理是癌症，特别是原发性肿瘤或转移性肿瘤。

原发性肿瘤是在肿瘤进展开始并发展产生癌性团块的解剖部位生长的肿瘤。大多数癌症在其原发部位发展。

转移性肿瘤是从其开始的身体部分(原发部位)向身体的其他部分扩散的肿瘤。当癌细胞脱离肿瘤时，它们可通过血流或淋巴系统行进到身体的其他部分。

有利地，本发明涉及用于如上文所定义的用途的如上文所定义的组合物，其中所述癌症是肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、子宫癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、梅克尔病、肝细胞癌和胃肠癌(优选具有小卫星不稳定性的胃肠癌)。

梅克尔细胞癌是常常出现在你的面部、头部或脖子上、通常表现为肉色或蓝红色结节的一种罕见类型的皮肤癌。梅克尔细胞癌也称为皮肤的神经内分泌癌。

本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包含：

-SQSTM1蛋白或编码所述SQSTM1蛋白或所述其片段的核酸分子，

-可用于诱导针对检查点抑制剂的免疫疗法的抗体，和

-化学治疗剂。

根据本发明的试剂盒有利地含有如SEQ ID NO：1所示的SQSTM1蛋白，或编码SQSTM1蛋白的核酸分子，该核酸分子有利地为如SEQ ID NO∶2所示的分子。

根据上述定义的试剂盒，其中所述抗体是抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。

有利地，本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包含：

-SQSTM1蛋白或编码所述SQSTM1蛋白或所述其片段的核酸分子，

-可用于诱导免疫疗法的抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体，和

-化学治疗剂。

有利地，本发明涉及如上文所定义的试剂盒，其中所述化学治疗剂是含有铂化合物的化学治疗剂、或紫杉醇或多西他赛化合物、或放射疗法。

含铂的化合物的示例是例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、三铂四硝酸酯、菲铂(phenanthriplatin)、沙铂或吡铂。

也可使用其他化合物(诸如DNA甲基化酶抑制剂、5-氮杂胞苷、地西他滨HDAC抑制剂、组蛋白甲基化酶抑制剂)、细胞周期抑制剂(CDK4/6抑制剂，诸如哌柏西利/PD-0332991、阿贝西利和瑞博西利/LEE011)、先天性防御、IFN反应。

放射疗法可用于癌症的早期阶段或癌症开始扩散之后。最常见的类型是：

-外部放射疗法，其中使用机器将放射束小心地瞄准肿瘤；-放射疗法植入物(近距离放射疗法)，其中将小片放射性金属(通常暂时)放置在你的肿瘤附近的身体内；

-放射疗法注射剂、胶囊或饮料(放射性同位素疗法)，其中你吞咽放射性液体，或者已将其注射到你的血液中；以及

-束内放射疗法，其中在乳腺癌手术期间将放射直接递送至肿瘤处。

放射疗法中使用的放射的量以戈瑞(Gy)测量，并且根据所治疗癌症的类型和阶段而变化。对于治愈病例，上皮实体瘤的典型剂量范围为60Gy至80Gy，而淋巴瘤用20Gy至40Gy进行治疗。

预防剂量通常为约45Gy-60Gy/1.8Gy-2Gy(对于乳腺癌、头癌和颈癌)。当选择剂量时，放射肿瘤学家要考虑许多其他因素，包括患者是否正在接受化学疗法、患者并存病、放射疗法是在手术之前还是在手术之后施用、以及手术成功的程度。

根据以下附图和以下实施例将更好地理解本发明。

本发明还涉及一种用于治疗患有肿瘤的个体的方法，所述方法包括以下步骤：

-结论是

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62蛋白存在或高于或等于在对照样品中获得的量时，则将与或不与化学疗法(特别是DNA损伤诱导剂联合)缔合的免疫疗法(优选针对免疫检查点抑制剂的免疫疗法)施用于患者；以及

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62不存在或低于在对照样品中获得的量时，则将免疫疗法(优选针对免疫检查点抑制剂的免疫疗法)与基于紫杉烷的化学疗法中的一员联合施用于患者。

本发明还涉及一种包含可能与化学治疗剂缔合的至少一种免疫治疗化合物的组合物，该组合物用于治疗患有肿瘤的患者的用途，该肿瘤的细胞具有SQSTM1/p62蛋白的表达或具有比对照样品高的SQSTM1/p62蛋白的量。

本发明还涉及一种包含与紫杉烷类缔合的至少一种免疫治疗化合物的组合物，该组合物用于治疗患有肿瘤的患者的用途，该肿瘤的细胞不具有SQSTM1/p62蛋白的表达或具有比对照样品低的SQSTM1/p62蛋白的量。

换句话说，本发明涉及一种包含与紫杉烷类缔合的免疫治疗化合物的组合物，该组合物用于治疗不表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤或以比对照组织中的SQSTM1/p62蛋白水平低的水平表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤的用途。

为了治疗特定癌症而使用的上文所述的组合物优选地含有抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。这也适用于上述治疗方法。

换句话说，本发明涉及一种包含与DNA损伤诱导剂缔合的免疫治疗化合物的组合物，该组合物用于治疗表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤或以比对照组织中的SQSTM1/p62蛋白水平高的水平表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤的用途。

附图说明

图1至图3：对癌症疗法的抗性共享DNA损伤修复标签和″冷性(COLD)″免疫原性谱。

[图1]图1表示来自癌症基因组图表集(The Cancer Genome Atlas)数据库(TCGA，PanCancer Atlas，上)和相应的热图(下)的GSEA分析，其显示在人冷性黑色素瘤(SKCM)(呈CD8A阴性以及对HLA-B转录物水平呈阴性)中存在DNA修复基因集的显著活化。关键颜色：浅灰色和深灰色分别对应于低表达和高表达。

[图2]图2表示GSEA图，其显示在顺铂抗性非小细胞肺癌(NSCLC，反应者-R，非反应者-NR，GEO前瞻性研究)中的DNA修复的基因集、同种异体移植物排斥的抑制的基因集和白细胞介导的细胞毒性基因集的显著活化。

[图3]图3表示GSEA和箱式图分析，其显示在ICI抗性黑色素瘤中的DNA修复基因集和细胞周期检查点基因集的显著富集(抗PD-1，NR，cBioportal，https：//portrtals.broadinstitute.org/single-cell/study/melanoma-immunotherapy-resistance#study-visualize，GSE115978)。

图4至图9：SQSTM1/p62是对免疫疗法有反应的有力预测因子。

[图4]图4表示SQSTM1处于″对ICI有反应″、″对RT有反应″(RT：放射疗法)和″NF-kB信号传导″标签(GSEA，KEGG)之间的差异表达基因的维恩图的交集处。

[图5]图5表示p62/SQSTM1的结构和相互作用配偶体。SQSTM1由其与自噬机制相互作用以及与在细胞死亡、炎症、DNA修复和最终癌症中涉及的信号传导途径相互作用所需的多个结构域构成。PB1：Phox和Bem1；ZZ：锌指；RIR：Raptor相互作用区；TBS：Traf6结合位点；LIR：Lc3相互作用区；KIR：Keap1相互作用区；UBA：Ub相关的；NLS：核定位信号；NES：核输出信号。

[图6]图6表示来自癌症基因组图表集数据库(TCGA，PanCancer Atlas)的在人黑色素瘤(SKCM)和肺癌(LUAD)中与SQSTM1转录水平正相关和负相关的抗原呈递和DNA修复标签的GSEA图。

[图7]图7表示在ICI反应者(R)与非反应者(NR)之间最差异表达的信号传导支架蛋白的列表。插图。在ICI反应者(R)与非反应者(NR)中SQSTM1 mRNA表达的箱式图(抗PD-1，调整的p值，黑色素瘤，GSE115978)。

[图8]图8表示Kaplan-Meier图，其显示在SQSTM1高(H)与低(L)中和在SQSTM1高/PD-L1高/CD8高(HHH)与用免疫疗法治疗的其他组的患者中的疾病特异性存活(DSS)曲线。

[图9]图9表示在LUAD肿瘤切片上的SQSTM1、PD-L1和CD8阳性和阴性IHC染色的代表性图像。注意，单个SQSTM1测定可准确地区分对免疫疗法有反应的″假阴性″(高SQSTM1表达)病例与单独用PD-L1表达评估观察到的″假阳性″病例(具有冷性微环境和低SQSTM1表达的非反应者)。

图10至图16：SQSTM1耗尽足以诱导″冷性″表型和DDA抗性。

[图10]图10表示热图(上)和相应的GSEA曲线，其显示在分别具有高和低SQSTM1表达的190个肺癌细胞系中与″热性″表型[CD274，抗原呈递(左下)]、顺铂/RT敏感性(RT放射疗法)和DNA修复(下、左、右)相关的基因集的显著富集。浅灰色和深灰色分别对应于低表达和高表达。

[图11]图11表示显示在用两个独立的SQSTM1 shRNA(SQSTM1#1和#2相对于对照shRNA)进行shRNA敲低后SQSTM1蛋白水平有效降低的蛋白质印迹。然后就HLA-B和DNA修复检查对SQSTM1缺失的A549肺癌细胞反应(RAD51和P-Thr68-CHK2 WB)；

[图12]图12表示在shRNA敲低后的趋化因子表达(CXCL10、IL29)。通过qRT-qPCR测量表达对照或SQSTM1 shRNA(用于拯救，#2+SQ)的A549以及用SQSTM1质粒转染的shSQSTM1细胞中的基因表达。在3个独立实验中观察到类似的结果。

[图13]图13表示在shRNA敲低后的MHC-I表达(HLA-A-C，qRT-PCR)。通过qRT-qPCR测量表达对照或SQSTM1 shRNA(用于拯救，#2+SQ)的A549以及用SQSTM1质粒转染的shSQSTM1细胞中的基因表达。在3个独立实验中观察到类似的结果。

[图14]图14表示在SQSTM1 shRNA敲低后的A549细胞活力(顺铂剂量反应，IC50，Cis：顺铂5天)。

[图15]图15表示对DDA处理有反应的HLA-B(左)和PD-L1(右)基因表达(Cis：顺铂，10μM，Oxa：奥沙利铂，1.4μM，Dox：多柔比星，50nM，RT：电离辐射，10Gy，五天)。

[图16]图16表示在用对照、SQSTM1或ATG5 shRNA转导的A549中的MHC-I(A-C，上，流式细胞术)和PD-L1细胞表面表达(下，流式细胞术)。在3个独立实验中观察到类似的结果。HLA-B和PD-L1表达的最大增强通过顺铂实现，顺铂被选择用于其他实验。

[图17]图17表示SQSTM1耗尽对DDA抗性的结果。在用所指示的DDA处理五天后，来自shControl和shSQSTM1 A549细胞中的结晶紫细胞毒性测定(右)的IC50浓度(N＝3)。

图18至图22：DNA损伤剂以SQSTMl依赖性方式诱导PD-L1/MHC-I的晚期表达。

[图18]图18：将shControl和shSQSTMl A549细胞用10μM顺铂处理。在所指示的时间，通过53BP1焦点形成来测量总体DNA损伤(A)(右，免疫荧光染色，53BP1红色，Dapi，蓝色。左，超过五个斑点的细胞百分比)。

[图19]图19：在顺铂处理的A549细胞中TBK1和JAK途径的SQSTM1依赖性活化。裂解细胞，并且通过用抗磷酸化-Ser172-TBK1(P-TBK1)和抗磷酸化-Tyr701-STAT1(P STAT1)对WCL的蛋白质印迹评估TBK1和JAK途径的活化。将微管蛋白和TBK1用作上样对照(N＝3)。

[图20]图20：通过qRT-PCR测量I型和III型干扰素的相对表达(左，五天-5d，N＝3)和IL29表达的动力学(右，N＝3)。

[图21]图21：顺铂诱导的HLA-B mRNA(左，qRT-PCR，N＝3)、蛋白质(中，上：蛋白质印迹，下：归一化至微管蛋白的、通过ImageJ的光密度测定法倍数变化，N＝4)和细胞表面表达(流式细胞术，右，N＝3)的时间过程。指示了中值荧光强度(MFI)和阳性细胞％。

[图22]图22：顺铂诱导的PD-L1 mRNA(左，qRT-PCR，N＝3)、蛋白质(中，上：蛋白质印迹，下：归一化至微管蛋白的、通过ImageJ的光密度测定法倍数变化，N＝4)和细胞表面表达(流式细胞术，右，N＝3)的时间过程。指示了中值荧光强度(MFI)和阳性细胞％。

图23至图24：顺铂诱导细胞周期停滞和独立于SQSTM1的DNA甲基化。

[图23]图23：在顺铂处理的shControl和shSQSTM1 A549细胞中的CDKNLA和DNMT1基因表达(10μM，qRT-PCR；N＝3)。[图24]图24：将ICI反应与DNA修复标签、细胞周期和DNA甲基化相关联的GSEA和箱式图分析(抗PD-1，cBioportal，https：//portals.broadinstitute.org/singlecell/study/melanoma-immunotherapy-resistance#study-visualize)。

图25：免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂通过SQSTMI依赖性途径上调HLA-B和PD-L1表达。

[图25]图25：用ICD诱导剂处理shSQSTM1 A549细胞(放射疗法，10Gy；Doxo，50nM)。在DDA处理的shControl和shSQSTM1 A549中DNMT1、IFNL2/IL29、PD-L1和HLA-B的qRT-PCR表达(时间过程；N＝3)。

图26：顺铂以TBK1和JAK依赖性方式诱导HLA-B和PD-L1表达。

[图26]图26：在存在或不存在TBK1抑制剂MRT 67307(10μM)或JAK1/JAK2抑制剂鲁索替尼(Ruxolitinib)(5μM)的情况下，用10μM顺铂处理shControl A549细胞。左，磷酸化-TBK1和磷酸化-STAT1蛋白质印迹(5天)。右，IL-29、HLA-B和PD-L1的qRT-PCR表达(100％对应于顺铂处理的细胞(右小图；N＝2)。

图27至图28：在SQSTM1耗尽细胞中IFN拯救HLA-B和PD-L1表达的上调。

[图27]图27表示自噬缺陷增加IFN敏感性。将SQSTM1、ATG5或ATG7敲低A549细胞用IFNG(50ng/ml)处理1h或24h。磷酸化-STAT1和IDO1的蛋白质印迹(将肌动蛋白用作上样对照，左)。通过qRT-PCR和PD-L1表达的细胞表面染色分析PD-L1表达(右)。

[图28]图28表示在顺铂(5d)和IFN(24h)后的磷酸化-TBK1、磷酸化-STAT1、HLA-B和PD-L1蛋白质印迹(将TBK1用作上样对照；右小图；N＝3)。

*＜P 0.05非参数T检验(Mann-Whitney)

图29至图30：在SQSTM1耗尽细胞中多西他赛诱导HLA-B和PD-L1表达。

[图29]图29表示在多西他赛处理的shControl和shSQSTM1 A549细胞中CDKN1A/p21、DNMT1、IFN-III、HLA-B和PD-L1的相对表达(5nM，qRT-PCR，N＝2)。

[图30]图30表示顺铂和多西他赛处理的细胞的磷酸化-TBK1、磷酸化-STAT1和HLA-B蛋白质印迹(5nM，5天，将肌动蛋白用作上样对照)。

[图31]图31表示SQSTM1染色的代表性图像(原始放大倍数×400)。皮肤黑色素瘤显示出增加的细胞质和细胞核SQSTM1染色模式。

实施例

实施例1

在最近出现免疫检查点抑制剂(ICI)后，临床癌症试验的挑战是开发ICI与DNA损伤剂(化学疗法和放射疗法，下文称为DDA)的最佳组合。阐明抗性机制对于提出新的预测性生物标志物和新的治疗方法以改善ICI功效是必要的。本发明人假设对DDA和ICI的抗性部分地由内在肿瘤机制介导，其中一些可能是共享的。通过三种互补方法(在计算机上、在患者队列上离体和在体外)，本发明人将p62/SQSTM1支架蛋白鉴定为能够预测和控制敏感性DDA和ICI的关键分子介质。在机制上，响应于DNA损伤，本发明人发现SQSTM1对于抑制DNA修复是必需的。用多西他赛治疗SQSTM1耗尽的肿瘤细胞可拯救IFN和MHC途径，从而提供在非应答者中将冷性肿瘤转化成热性肿瘤的有希望的治疗途径。取决于其水平，本发明人因此提出SQSTM1作为用于指导在单独的ICI、ii)ICI与顺铂组合、或iii)ICI与多西他赛组合之间的治疗决策的预测性生物标志物，旨在增加ICI功效和患者结果。

结果

本发明人比较了来自用放射疗法、化学疗法和免疫疗法治疗的患者队列的RNA表达标签，以鉴定可能介导交叉抗性的共享分子途径。本发明人基于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)标志物CD8A和CD8B、免疫检查点基因CD274/PD-L1(下文称为PD-L1)和I类MHC基因(HLA-A、B、C)的表达将肿瘤分类为免疫″热性″和″冷性″。在CD8+T细胞中的富集进一步通过两种细胞溶解酶粒酶B(GZM B)和穿孔素(PRF)的存在来验证。

1)在DDA和ICI策略之间交叉抗性的证据

符合免疫疗法资格的两种恶性肿瘤肺腺癌和黑色素瘤的基因集富集分析(GSEA)强调缺乏肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并表达较低水平的MHC-I(冷性肿瘤的两个特征)的病例过表达DNA修复标志物(图1)。同样地，泛癌分析支持DNA修复标签与不同肿瘤类型的″冷性″肿瘤表型的关联(FDR<0.01，数据未显示)。值得注意的是，这种较高的DNA修复标签是大多数冷性肿瘤的一致标志。作为基因组稳定性的重要来源，较高的DNA修复肿瘤倾向于与较低的肿瘤突变负荷(TMB)相关，因为它是低抗原性的并且缺乏T细胞发炎的肿瘤微环境，这是ICI的不良临床益处的三个预测性生物标志物。考虑到这种积累的证据，本发明人提出i)较高的DNA修复可提供另一个机会最佳地选择用于ICI疗法的患者。到目前为止，发现从DNA修复缺陷发生的非常小部分的癌症对ICI疗法有反应。现在似乎临床上显著部分的癌症具有DNA修复缺陷。ii)而且，据推断，可预期免疫抑制的冷性肿瘤固有地与DNA修复偶联，从而与比″热性″肿瘤更差的对DDA的反应相关。

因此，本发明人分析了与热性/冷性标签偶联的DNA修复是否可适用于预测对三种治疗选择的临床反应：化学疗法、放射疗法和免疫疗法。相反，基于基因表达的分级聚类揭示了在顺铂敏感性和放射疗法(RT)敏感性癌症中热性标签(T细胞标志物和MHC-I)的富集，这三个标志决定了在LUAD(图2)和其他癌症类型的独立验证队列中的免疫疗法反应(数据未显示)。相反，免疫缺陷的″冷性″标签是DDA抗性肿瘤的共享特征，高度表明抗肿瘤免疫对于顺铂/RT的临床活性是关键的。有趣的是，本发明人提供了DNA修复标签与ICI抗性显著相关的第一个证据(图3)。通过推断，此类再发生的临床相关性提供了将DDA与ICI组合以改善ICI/DDA敏感性患者的结果的基本原理。沿着这条线，顺铂/RT难治的患者亚群也将获得交叉抗性，从而降低来自二线免疫疗法的益处。解释这种攻击性抗性肿瘤表型的有吸引力的可能性可能是考虑到已知介导对常规DDA的抗性的高DNA修复途径也可能促成对免疫疗法的反应减少。

2)SQSTM1/p62是ICI/DDA反应性的有希望的生物标志物

冷性和DNA修复标签的共表达表明，对ICI和DDA的反应不仅紧密偶联以促进肿瘤交叉抗性，而且可能由同一信号传导途径控制。然后，本发明人的策略是计算机模拟鉴定在冷性/热性表型之间差异地表达并且最重要地与对ICI/DDA组合的反应相关的信号传导支架(图4)。从筛选的潜在信号传导平台，本发明人决定将他们的注意力集中在支架蛋白SQSTM1上，因为：i)其通过停靠炎症、DNA修复和细胞死亡途径的几个信号传导配偶体来帮助整合信号并将信号从细胞表面传递至细胞核(图5)；ii)有趣的是，其表达在肺腺癌和黑色素瘤中与抗原呈递正相关，并且与DNA修复标签负相关(p＝e-9)(图6)；iii)SQSTM1在DDA敏感性肿瘤中是最高度富集的平台，然而其在抗性肿瘤中则不是(数据未显示)；iv)本发明人使用黑色素瘤的单细胞RNA测序提供了与非反应者相比在ICI反应者中SQSTM1过表达的第一个证据(p＝e-62)(图7)。这通过使用在第一线中使用阻断PD-1(帕博利珠单抗)或在第二线中使用PD-1(纳武单抗)免疫疗法治疗的晚期LUAD患者(IIIA-IV期，在进行中)的两个独立队列来验证(图8)，其中通过IHC对SQSTM1/p62的高检测再次与ICI反应性相关(p＜0.0001)。惊人的是，低SQSTM1表达足以鉴定PD-L1″假阳性″肿瘤亚组(8名患者，10.4％)，其显示低CD8 T淋巴细胞浸润并且未能对免疫疗法有反应(图9)。总之，本发明人的结果表明肿瘤SQSTM1在预测对ICI、作为单一疗法的DDA和潜在的ICI+DDA组合(在进行中)的反应性中的临床效用。

3)SQSTM1对于DDA诱导的毒性和增强的抗原呈递是必需的

考虑到上述临床结果，本发明人的工作假设是SQSTM1/p62的表达可能决定对ICI和DDA的交叉反应。使用来自CCLE的一组190个肺癌细胞系，本发明人首先通过GSEA确认SQSTM1的肿瘤细胞内在表达与抗原呈递正相关，并且与DNA损伤修复和DDA/ICI抗性基因标签负相关(图10)。沿着此线，值得指出的是，SQSTM1的表达在小细胞肺癌细胞系(SCLC，p值＝6e-16)中是最低的，小细胞肺癌是对ICI和DDA具有抗性的最具侵袭性的癌症类型之一(图10右)。然后，本发明人评估了在SQSTM1和对抗癌疗法的交叉敏感性之间的因果关系。作为细胞模型，本发明人选择从肺腺癌来源的A549细胞系，该肺腺癌携带KRAS G12S癌基因和丢失SKT11/LKB1肿瘤抑制基因(Q37*)，这两个分子事件与原发性ICI抗性相关，同时对化学疗法敏感。在实验上，通过shRNA在A549细胞中的SQSTM1敲低(图11)足以忠实地重述了计算机模拟观察到的严重表型；由趋化因子CXCL10、IFN-III IL29(图12)和MHC-I(HLA-A、B和C，图13)在mRNA水平上和在HLA-B蛋白水平上(图11)的下调所证实。在这种情景下，SQSTM1的再表达恢复了趋化因子和HLA-B的表达(图12和图13)。与先前的观察结果一致，SQSTM1的沉默也足以增加DNA修复标志物RAD51的表达和检查点激酶2(CHK2)的磷酸化，这延迟了细胞周期进展以促进DNA修复(图11)。

因此，本发明人在使用ICI的临床试验中探索了SQSTM1耗尽细胞对许多FDA批准的化学治疗剂的敏感性。与对照ShC细胞的大量死亡(IC5024±1.4μM，图14)相比，在铂处理(顺铂，Cis)后，ShSQSTM1细胞始终具有抗性(IC5051±5.3μM，为对照ShC细胞的两倍)。在亚致死剂量(10μM)下，本发明人观察到Cis在ShC细胞中诱导HLA-B和PD-L1mRNA的稳健过表达(分别达60倍和37.8倍；图15)由在细胞表面的MHC-I(HLA-A、B、C)和PD-L1的增强的存在所反映(图16)。与顺铂的抗性完全一致，SQSTM1的耗尽消除了Cis上调的HLA-B和PD-L1表达(图15和图16)。作为概念验证，使用不同的DNA损伤剂诸如蒽环类(多柔比星，Dox，50nM)、奥沙利铂(Oxa，1.4μM)和放射疗法(RT，10Gy)重述了所有这些特征(即，DDA抗性和降低的HLA/PD-L1表达)(图15和图17)。

考虑到SQSTM1既作为支架蛋白又作为选择性自噬受体起作用；本发明人发现，通过ATG5 shRNA(图16)或药理学bafA1或氯喹处理(数据未显示)抑制自噬没有重述由SQSTM1缺陷诱导的表型，而是导致HLA-B和PD-L1的表达增强。总之，这些结果指向如下观点：对癌症疗法的抗性至少部分是肿瘤细胞的内在特性。在分子水平上，这些结果确定SQSTM1信号传导支架而不是自噬途径对于DDA诱导的毒性、HLA-B和PD-L1表达(免疫疗法中靶向的关键免疫检查点蛋白)是关键的。总之，这揭示了SQSTM1在ICI/DDA交叉反应中的附加功能。

4)SQ_STM1是Cis对IFN/PD-L1/MHC-I的后期上调所绝对必需的。

本发明人接下来评估了SQSTM1的丢失如何影响DDA诱导的反应。除了直接的细胞毒性作用之外，已经提出DDA的治疗作用可能取决于DNA向胞质溶胶中的释放，该DNA被识别为DNA病毒，在16h时引发早期IFN反应(IFN、HLA-B和PD-L1)。

如所预期的，DDA快速诱导DNA损伤，如通过CHK2的磷酸化(数据未显示)和53BP1阳性焦点的形成(图18)可视化的，它们在顺铂处理6小时后开始，类似地在16小时达到峰值，然后下降。出乎意料地，在DDA处理的ShC细胞中，TBK1和STAT1的磷酸化(图19)以及IFN-I和IFN-III的表达与DNA损伤的不一致，但在处理的大约第3天之后开始(图20)。下游，DDA诱导的HLA-B和PD-L1 mRNA(右)和蛋白质(中和左)表达的动力学遵循IFN的动力学，在大约第5天达到平台值(图21和图22)。同样，在整个时间过程中，在不存在SQSTM1的情况下，磷酸化-TBK1、IFN、HLA-B和PD-L1表达的DDA上调失败(图19至图22)。这一观察结果促使我们鉴定在DNA损伤和免疫原性反应之间由SQSTM1控制的分子途径。

这种动力学差异反对早期dsDNA在晚期IFN/HLA-B/PD-L1途径的起始中的主要作用。这与LKB1/STK11突变的A549细胞中的DNA传感器STING的沉默一致，并且反而提示了另一种SQSTM1依赖性DAMP。

5)SQSTM1和DNA损伤剂。

值得注意的是，本发明人观察到细胞周期抑制剂CDKN1A/p21的早期诱导忠实地跟踪了在对照和SQSTM1耗尽细胞中DDA诱导的DNA损伤(核焦点，图18)的早期诱导(图23)。总之，这确定了SQSTM1对于DNA损伤反应的早期第一步骤是不必要的，并且在DSB形成和细胞周期停滞之后起作用。

最近，少数临床前研究已经证明诱导细胞周期停滞和DNA去甲基化的药物引导癌细胞中的IFN/MHC-I/PD-L1表达。为了支持这种假设，从计算机模拟分析中证明ICI反应与DNA甲基化酶的表达负相关(图24)。在报道上调PD-L1表达的一组表观遗传调节因子(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、LDS1、SETD1、TRIM28/KAP1、EZH2)中，仅DNMT1的表达在Cis处理的1d早期下降，而其他显示适度的或可变的反应(图23)。在支持作为起始事件的DDA介导的DNMT下调中，用抑制DNMT1的去甲基化剂5-氮杂胞苷(500nM，5-Aza)处理A549 ShC细胞，重述了HLA-B和PD-L1的晚期表达(在5天和6天时)。该事件始终在IFN-III IL28再活化(5天)之前。

值得注意的是，在不存在SQSTM1的情况下，我们观察到在顺铂处理时CDKN1A/p21和DNMT1表达的类似下调(图23)。但是，这之后没有化来自P-TBK1/IFN/p-STATI的整个下游途径(图19)。与它们的异常信号传导一致，SQSTM1耗尽细胞不会响应于顺铂而上调的HLA-B和PD-L1的mRNA、蛋白质和细胞表面表达。

除了顺铂之外，本发明人然后用不同的免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂诸如放射疗法、奥沙利铂和多柔比星重述了该途径的晚期诱导。不管1CD诱导剂如何，他们都显示该途径完全取决于SQSTM1(图25)。因此，这些数据揭示了SQSTM1对DNA损伤剂诱导的PD-L1/MHC-I表达的新的全局性作用。

6)通过活化TBK1-IFN-JAK途径的DDA诱导以及HLA-B和PD-L1表达

本发明人显示顺铂诱导的TBK1(一种参与IFN转录的激酶)磷酸化。一致地，他们在mRNA水平检测IFN-III，并且Cis与TBK1抑制剂MRT 67307的共处理足以阻断顺铂诱导IFN/HLA B/PD-L1的能力，JAK/STAT抑制剂鲁索替尼也是如此(图26)。。总之，本发明人的数据表明，亚致死剂量DDA可诱导III型而非I型IFN的表达，接着是HLA-B和PD-L1以JAK依赖性方式的下游表达。

7)在SQSTM1耗尽细胞中IFN拯救HLA-B和PD-L1表达的上调。

然后，本发明人检查了IFNG的添加在shC和shSQSTM1细胞中诱导了STAT1磷酸化、HLA-B和PD-L1表达，表明IFN途径在SQSTM1耗尽细胞中是有功能的(图27和图28)。令人感兴趣的是，我们观察到与Shc相比，对于SQSTM1耗尽细胞，ISG(IDO-1、HLA-B和PD-L1)响应于IFNG的表达更高。在IFN刺激的shATG5和ShATG7中至少部分地重述了该模式，表明自噬缺陷型细胞表现出更高的IFN敏感性(图27)。

总之，这些数据高度提示了一种工作模型，其中DDA驱动从DNA损伤、G1停滞、向DNMT下调、以及下游IFN控制的MHC和PD-L1表达的连续途径。在该途径中，我们得出结论：SQSTM1控制去甲基化下游的MHC/PD-L1产生。

8)紫杉烷在SQSTM1耗尽细胞中拯救HLA-B和PD-L1的表达

在该阶段，感兴趣的是确定可克服SQSTM1耗尽细胞的抗性的标准护理治疗。其中，微管靶向剂(MTA)是二线化学疗法的候选物，已证明对DDA抗性癌症有功效。我们显示多西他赛确实在Shc和ShSQSTM1细胞两者中触发生长停滞和DNMT1下调。令人惊奇的是，尽管不存在SQSTM1，多西他赛显著地拯救了下游TBK1/STAT1磷酸化(图30)和IFN、HLA-B和PD-L1的表达(图29和图30)。值得注意的是，多西他赛遵循对于其他DDA所观察到的相同的晚期时间过程。再次，值得指出的是，顺铂仍然是用于在SQSTM1阳性细胞中诱导HLA-B和PD-L1的最有效药物，而多西他赛是在SQSTM1耗尽细胞中唯一有效的药物。总之，我们的数据揭示了多西他赛在诱导HLA-B和PD-L1中的新特性，提供了探索与ICI的新组合的基本原理，特别是在DDA抗性患者中。特别令人感兴趣的是，SQSTM1显现为强大的生物标志物，其不仅可预测ICI/DDA反应，而且还可指导与顺铂或多西他赛的两种ICI组合之间的治疗决策。

讨论

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，超过皮肤癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌的组合。DNA损伤剂(诸如基于铂的化学治疗剂和电离辐射)是标准护理治疗，并且约80％的肺癌患者将在他们的治疗过程中接受这些疗法。然而，尽管最初有反应，几乎所有患者最终都发展为DDA抗性复发，影响患者存活。目前，用抗PD-1或抗PD-L1中和抗体的免疫疗法显示出对晚期患者的治疗前景。然而，尽管有这种显著的进步，30％-40％的患者仍然表现出对免疫疗法的抗性。

序贯组合ICI+DDA疗法的有限成功仍然是难以捉摸的，并且可能是由于狭窄的敏感性治疗窗口。此外，对ICI/DDA的抗性的情景是未知的，尚没有能够准确地将反应者与非反应者分开的生物标志物。迄今为止，PD-L1的肿瘤表达与对PD-1/PD-L1抑制的增强的客观反应率相关，但对于预测组合反应既不是敏感的、特异性的也不是有用的。尽管对于治疗干预是关键的，但是DDA如何上调抗原呈递和PD-L1还不完全清楚，我们也不了解该途径在DDA抗性肿瘤中是否被抑制。

本发明人的数据导致了支架蛋白SQSTM1可积极预测ICI、DDA和潜在的ICI/DDA组合的临床结果的刺激提议。该假设基于本发明人已进行的三个关键的观察，即使用患者队列的计算机模拟、体内观察和使用工程化沉默细胞系的体外观察：i)在ICI、RT和Cis反应者中的SQSTM1 mRNA和蛋白质表达(IHC评分)显著高于非反应者中；ii)在机制上，SQSTM1控制DNA修复和免疫IFN/MHC/PD-L1途径的表达两者；iii)SQSTM1丢失足以驱动对ICI和DDA疗法的先天性抗性。本发明人现在旨在使用共培养测定和同系体内鼠NSCLC模型评价SQSTM1(zz抑制剂，CRISP/CAS9)对肿瘤免疫微环境的遗传和药理学抑制的作用，特别是T细胞介导的抗肿瘤免疫(T细胞浸润和活化)。

SQSTM1是免疫肿瘤可塑性的分子驱动剂

在此，本发明人提供了SQSTM1表达限定具有不同生物学、免疫谱和治疗脆弱性的LUAD和SKCM亚组的第一个证据。取决于其水平，SQSTM1驱动两个完全不同的免疫抑制程序：具有低SQSTM1水平的肿瘤确实与″冷性″微环境、与差的抗原呈递和T细胞清除相关，而具有高SQSTM1表达的那些肿瘤是″热性″的，具有PD-L1表达、T细胞浸润和耗竭。

令人感兴趣的是，SQSTM1是关键支架蛋白，其参与控制炎症、细胞存活(NF-κB)、氧化解毒应激(NRF2)和细胞生长(mTOR)的关键信号传导途径的活化；对癌症发展具有直接影响的所有程序事件。因此，癌蛋白SQSTM1将肿瘤生长与免疫逃避偶联。不令人惊讶地，SQSTM1对于小鼠中KRAS-G12D诱导的肺肿瘤发生是必需的。在人类中，SQSTM1过表达与肺癌、胃肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌和乳腺癌中较差的存活相关。矛盾的是，SQSTM1丢失也显示增加前列腺癌的肿瘤发生，其是一种冷性癌症类型。在这点上，本发明人在本文中揭示的SQSTM1获得和丢失赋予肿瘤免疫逃避的能力可帮助解释这些有争议的结果。

除了这些信号传导功能之外，SQSTM1是第一个被鉴定的自噬受体，其是促进肿瘤细胞存活和药物抗性的细胞过程。因此，自噬介导SQSTM1的清除，并且通过ATG5 shRNA抑制自噬导致SQSTM1积累并且一致地导致HLA-B过表达。总之，这些数据高度提示了一种工作模型，其中通过涉及癌基因、炎症细胞因子和自噬降解的反馈环对SQSTM1表达的显著控制可能决定肿瘤细胞在″热性″和″冷性″表型之间的可塑性。

SQSTM1通过抑制DNA修复来支配DDA和ICI敏感性

本发明人在此显示SQSTM1下调是对DDA和ICI抗性的主要驱动因素。在机制上，SQSTM1抑制DNA修复并同时对MHC-I的表达是必需的。因此，SQSTM1代表在DDA敏感性、肿瘤DNA不稳定性、肿瘤突变负荷和肿瘤免疫之间的分子联系。对潜在机制的进一步研究，SQSTM1在细胞核内的作用仍然不十分清楚。SQSTM1包含两个核定位信号和一个核输出信号，其允许SQSTM1以高速率在细胞核和胞质区室之间连续穿梭。在DNA损伤时，本发明人发现SQSTM1被募集到核DNA损伤焦点(数据未显示)，据报道其在该焦点处抑制DNA修复。除DNA修复之外，还报道SQSTM1结合并调节几种核受体的转录活性。在候选物中，在抑制核输出蛋白时，SQSTM1和肿瘤抑制因子TP53似乎被募集到前髓细胞性白血病蛋白核体(PML-NB)，其参与DNA修复、TP53相关的细胞周期停滞和凋亡。作为基因组的保护者，TP53在基因组稳定性中起着中心作用，主要通过诱导DNA修复蛋白的表达而起作用。因此，确定SQSTM1是否通过与Tp53形成转录复合物来调节DNA修复反应将是令人感兴趣的。通过发现可拯救冷性难治性癌症的PD-L1表达的新治疗靶标，鉴定由SQSTM1控制的此类转录因子将在肿瘤免疫生物学中具有深远的意义。

总之，本发明人提供了SQSTM1通过IFN途径的再活化促成肿瘤对DDA、ICI和ICI/DDA的交叉敏感性的第一个证据。这提出SQSTM1作为ICI、DDA作为单一疗法和组合两者的预测性生物标志物。值得注意的是，不管所使用的疗法如何(放射疗法、免疫原性细胞死亡的诱导剂和非1CD化学疗法)，本发明人的数据还揭示了SQSTM1在通过DNA损伤剂诱导HLA-B/PD-L1表达中的新的全局性作用。

将本发明人的结果转化为个体化的治疗决策。

免疫肿瘤学中的治疗决策随着ICI组合的引入而越来越具有挑战性。还没有出现准确预测疗法反应的单一标志物，也没有定制最佳的组合。通过SQSTM1在此提出了有希望的生物标志物，其预测ICI/DDA反应并且可指导治疗决策。本发明人的目的现在是验证SQSTM1作为ICI/DDA反应的第一预测性生物标志物，其可快速地转化到临床测试并且最终用作FDA批准的组合策略的伴随测试。实际上，本发明人的发现具有四个潜在的高影响临床意义：

(1)他们推荐同时联合疗法而不是序贯单一疗法，因为本发明人已经确定了针对肿瘤对ICI和DDA的逃逸下调SQSTM1的交叉抗性机制。

(2)他们可指导在两种不同的ICI组合之间的治疗决策。通过将SQSTM1与抗原呈递和PD-L1表达相联系，他们可通过进一步将ICI、DDA或ICI/顺铂疗法限制于过表达SQSTM1的患者来重新定义患者选择策略，从而增加反应率；

(3)他们还可提供治疗大量先前排除的携带KRAS和STK11突变但过表达SQSTM1的患者的基本原理，因为本发明人已经使用A549细胞提供了顺铂和多西他赛可引发该冷性亚组进行免疫疗法的原理的证据。

(4)他们提供了用ICI/MTA(微管靶向剂：多西他赛、紫杉醇)组合治疗那些患有表达低水平SQSTM1的LUAD的患者的新的治疗机会。

设计围绕SQSTM1预测价值的试验应当用较大的、设计良好的队列进行紧急测试，以确定应当转换为ICI/顺铂或替代性ICI/多西他赛策略的患者组，最终改善ICI功效和患者结果。如果用于SQSTM1 IHC评分的测试被临床验证，本发明人希望将ICI和DDA的利用扩展到其他冷性肿瘤，从而改善患者结果。

材料和方

细胞培养

该研究中呈现的大多数实验是用人KRAS G12S/SKT11 Q37*共突变的NSCLC A549细胞(美国典型组织保藏中心(American Type Tissue Collection)，ATCC)进行的。将所有细胞维持在达尔伯克(Dulbecco)改良的最低必需培养基和汉氏(Ham′s)F-12培养基(DMEM/F12 Glutamax；Life Technologies)中，所述培养基补充有10％胎牛血清(Dutcher)、2％丙酮酸钠和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)。为了建立SQSTM1敲低稳定细胞系，用靶向SQSTM1的mRNA编码序列的小发夹RNA(shRNA)慢病毒转导细胞。使用两种不同的SQSTM1shRNA(Sigma，人的，NM_003900，SQSTM1#1，TRCN0000007237，以及SQSTM1#2，TRCN0000007236)来最小化序列依赖性脱靶效应。作为对照，自噬在起始步骤被ATG5(Sigma，人的，NM_004849，ATG5#1，TRCN0000151963)或ATG7 shRNA(Sigma，人的，NM_006395，TRCN0000007584)抑制。为此目的，将靶向和对照(Sigma；SHC002V)shRNA慢病毒转导到细胞中。通过qRT-PCR或使用特异性引物和抗体的免疫印迹来控制shRNA介导的蛋白质下调(关于shRNA、引物和抗体细节，参见补充表1至表3)。

[表1]

[表2]

[表3]

细胞治疗

对于所有实验，将细胞接种在6孔板或60mm培养皿中并孵育，直到它们达到60％-70％融合为止。然后将细胞在补充有1％FBS的新鲜DMEM中用顺铂(Cis，10μM)治疗指定的时间。在类似的条件下，本发明人将其研究扩展到已知诱导DNA损伤和免疫原性细胞死亡(ICD)的其他化学治疗剂，诸如蒽环类多柔比星(Dox，0.5μM)、奥沙利铂(Ox，1.4μM)和紫杉烷类(多西他赛，D，5nM和紫杉醇，P，3nM，表4)。基于由每种药物所达到的血液浓度的峰值，通过剂量反应曲线选择药物浓度[IC50：Shc A549(Cis＝24μM+/-3.7，Dox＝364nM+/-3，Ox＝2.61μM+/-0.9，D＝364nM+/-3，P＝1.4nM+/-0.27)；ShSQSTM1 A549(Cis＝47.7μM+/-5，Dox＝486nM+/-85，Ox＝4.51μM+/-1，D＝21.3nM+/-10，P＝3.7M+/-0.7)]。

作为对照，为了确保SQSTM1耗尽细胞的DDA抗性与药物流出无关，使用在160kV/6.3mA下运行的Faxitron X射线系统(具有CP160选项的模型43855F；Faxitron Bioptics)以10Gy辐照细胞。辐射后立即使细胞受胰蛋白酶作用并且用新鲜的10％FBS培养基重新接种在6孔板中。所有化学治疗剂均从Antoine-Lacassagne癌症中心获得。

当指出时，在添加顺铂(10μM)之前，将MRT67307(TBK1抑制剂，10μM，Tocris)或鲁索替尼(JAK1/JAK2抑制剂，5μM，Tocris)添加到1％FBS培养基中90分钟。作为阳性对照，用IFNγ(50ng/ml，24h，C-60724Promokine)处理细胞。

在本文所研究的剂量下的所有药理学抑制剂均未能诱导细胞死亡达18h-24h。通过IFN的下游诱导、IFN介导的信号传导、HLA-B和PD-L1的表达来检查DNA损伤剂活化先天性防御的能力。

mRNA水平的相对定量

使用TRI试剂(TR118，MRC)和RNeasy Mini试剂盒(#74106，Qiagen)从细胞中纯化总RNA。用DNAse I(18068015，Invivogen)处理600ng总RNA，并且使用SuperScript III逆转录酶(Life Technologies)进行逆转录。使用SYBR Green主混合物和Applied StepOnePlus PCR系统(Life technologies)对等量的cDNA进行定量实时聚合酶链式反应分析。所使用的IFN反应基因的引物列于表2中。与未处理的细胞样品相比，使用2[-ΔΔCt]方法定量相对基因表达变化，并且归一化至管家基因RPLP0。

蛋白质印迹

处理后，在PBS中洗涤细胞，并用TR3裂解缓冲液提取全细胞裂解物(WCL)，该裂解缓冲液含有3％SDS；10％甘油、10mM Na2PO4与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(1mM Na3VO4、10mM β-甘油磷酸盐、10mMNaF和1∶25，Complete TM)，并且进行超声处理。如先前所述，用特异性地识别SQSTM1、PD-L1、HLA-B、DNA损伤、细胞周期停滞以及TBK1和JAK信号传导途径的抗体(表3)通过蛋白质印迹分析WCL(5μg-40μg)。将微管蛋白、肌动蛋白(#A3853，Sigma)和HSP90(克隆C45G5，#4877S，Cell Signaling Technology)用作上样对照。洗涤后，用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠抗体(1∶6,000；sc-2005；Santa Cruz)或抗兔抗体(1∶10,000；sc-45040；Santa Cruz)揭示一抗的存在，并且用增强化学发光检测系统(Perkin Elmer)可视化。

流式细胞术分析

使用流式细胞术检查PD-L1的细胞表面表达。在10μM顺铂处理指定的时间后，在2.5mM EDTA-PBS中收获细胞，不进行胰蛋白酶消化，用抗PD-L1抗体(CD274，亮紫650缀合物，#329740，Biolegend)或抗同种型抗体(亮紫650缀合物，#400351，Biolegend)标记。在Cytoflex流式细胞仪上进行流式细胞术分析(10,000个细胞，Cytoflex软件)。将MFI(PD-L1同种型)计算为MFI(PD-L1)减去MFI(同种型对照)。

数据集分析

使用cBio癌症基因组门户(http：//www.cbioportal.org/public-portal/)和Phantasus软件(https：//artyomovlab.wustl.edu/phantasus/)从癌症基因组图表集数据库(TCGA)PanCancer Atlas和癌症细胞系百科全书(Cancer Cell-line Encyclopedia，CCLE)挖掘数据料。从基因表达合集(GEO数据库，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)下载用化学疗法、放射疗法和免疫疗法治疗的癌症患者的几个数据集(RNAseq，DNA微阵列)。将每个肿瘤内的T淋巴细胞浸润、DNA损伤反应、IFN的标签(C2CGP、C2生物过程(reactome)、C5BP和″标志″)通过基因集富集分析(Gene SetEnrichment Analysis，GSEA)和ssGSEA分析与CD274/PD-L1、CD8A/B、HLA-和SQSTM1表达的基因表达相关联。对于TCGA癌症类型缩写的完整列表，请参见https：//gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations。

患者队列

在2010年1月1日和2018年4月1日之间在法国蔚蓝海岸大学(Universityd'Azur)的临床和实验病理学实验室(Laboratory of Clinical and ExperimentalPathology)(法国尼斯(Nice，France))进行患有肺腺癌(LUAD)的患者队列的研究。根据REMARK指南进行研究，并且得到尼斯大学附属医院(Nice University Hospital)伦理委员会的批准，该委员会放弃了书面知情同意书的要求。最初，468名患者满足根据病理记录的LUAD诊断的入选标准。p40和TTF-1的免疫组织化学染色最后证实了该研究中包括的肿瘤的腺分化。此外，关于阶段相关特征(诸如胸膜侵入)重新评价了所有肿瘤的切片。根据UICCTNM分类的第8版将所有肿瘤重新分期。病例收集最终包括来自早期阶段(I-IIIA)的287个肿瘤和来自晚期阶段(IIIB-IV)的181个肿瘤。在70/181(39％)的患者中施用辅助化学疗法和/或放射疗法，在18/181(10％)的患者中施用EGFR TKI，并且分别在37/181(20％)和41/181(23％)的患者中施用第一线(帕博利珠单抗)或第二线(纳武单抗)免疫疗法。15/181(8％)的患者在任何辅助治疗之前死亡。

免疫组织化学染色和评分

使用自动化Ultra Ventana(Ventana，Tucson，AZ)在4μm切片上进行p62/SQSTM1、PD-L1/CD274和CD8的免疫组织化学染色，如之前对于SQSTM1(稀释1/400，BD TransductionLaboratories^TM)、PD-L1(克隆22C3，稀释1/50，Dako，Inc.)和CD8(细胞毒性T细胞；克隆SP57，预稀释；Ventana)(表3)所述，并且根据制造商的说明使用。对所有完整切片进行在肿瘤细胞的各种亚细胞组分中检测到的SQSTM1的免疫组织化学染色模式的评分：点样染色从0至3如下进行评分：评分0-在＜5％的肿瘤细胞中没有可见点或几乎没有可见点，评分1-在5％-25％的肿瘤细胞中有点，评分2-在25％-75％的肿瘤细胞中有点，评分3-在>75％的肿瘤细胞中有点。SQSTM1细胞质染色从0至3如下进行评分：评分0-无染色或轻微染色，评分1-弱染色，评分2-中等染色可见，评分3-强染色。SQSTM1核免疫组织化学染色从0至1如下进行评分：评分0-在＜10％的细胞核中可见核染色，以及评分1-在>10％的细胞核中可见核染色。由两个有经验的病理学家(VH和PH)在40x物镜放大倍数下进行评分。为了与临床病理学特征相关，然后根据单个值的预后值将免疫组织化学评分进一步分类为低或高。将点状和细胞质SQSTM1染色分类为低(评分0-1)和高(评分2-3)。将组合的点状和细胞质SQSTM1染色分类为低(总评分为0-2)和高(总评分为3和更大的原始值)，显示最佳的预后区分。将SQSTM1核染色评分0分类为低，将评分1分类为高。对PD-L1阳性肿瘤细胞进行计数，并且使用一个截断值(>50％PD-L1阳性肿瘤细胞)。对肿瘤内CD8阳性细胞进行计数，并且将肿瘤分类为无(-)、低(+)、中(++)和高(+++)肿瘤表达者。

根据SQSTM1、PD-L1和CD8状态进行亚分类。SQSTM1点状/细胞质、PD-L1和CD8染色的组合将病例分层为3种亚类型：低SQSTM1点状-细胞质/低PD-L1/低CD8染色(LLL)；高SQSTM1点状-细胞质/高PD-L1/高CD8(HHH)；和高SQSTM1点状-细胞质/低PD-L1/高CD8染色(HLH)。

统计分析

对于统计分析，使用GraphPad Prism 6软件来分析数据。使用列联表(crosstab)、未配对非参数T检验、χ2检验、ANOVA和Fisher精确检验进行各组比较。值表示为平均值和标准偏差(SD)。将P＜0.05设定为实现统计学显著性。从切除当天到局部或转移性复发或疾病特异性死亡进行存活分析，其涵盖至复发的时间(TTR)。从诊断的时间到疾病特异性死亡确定疾病特异性存活(DSS)。计算总体存活期(OS)和无疾病存活期(DFS)。对于单变量存活分析，使用Kaplan-Meier曲线和时序检验。对于多变量分析，使用Cox回归分析。将所有统计检验的显著性水平设定为p值＜0.05。

实施例2：SQSTM1是晚期黑色素瘤中的免疫疗法预测性生物标志物。

本发明人验证了SQSTM1在受益于抗PD1免疫疗法的另一种免疫原性实体瘤晚期皮肤黑色素瘤(SKCM)中作为预测性生物标志物的利益。

1.基本原理

转移性或晚期黑色素瘤是致命的皮肤癌，到目前为止5年存活率低于30％。靶向程序性死亡蛋白1(PD-1)及其配体PD-L1的免疫检查点抑制剂(ICI)的开发代表了真正的范式转变，5年中值总体存活期增加了52％。然而，对ICI的持久反应仅限于一个患者亚组，然而在单一疗法中40％的患者对ICI不反应。

在大多数临床试验中，通过免疫组织化学评估的PD-L1的表达不允许选择反应的患者(Robert C等人，2015)。我们提供了具有增加水平的SQSTM1的非小细胞肺癌癌症患者具有比具有低水平SQSTMl的那些患者更好的反应的第一个证据，高度表明SQSTM1是对ICI反应的预测因子。在此，我们研究的目的是将黑色素瘤细胞中SQSTM1的表达结合肿瘤内PD-L1的定量和CD8+T淋巴细胞的浸润与ICI反应相关联，以确定SQSTM1评价是否可作为复发或转移性黑色素瘤患者中有效的预测性生物标志物。

2.材料和方法

a)患者和组织样品(IliéM等人Oncoimmunology.2021年3月19日；10(1)：1901446)。该回顾性队列包括125名患者，其在2013年7月至2017年2月之间诊断为连续的原发性皮肤恶性黑色素瘤并且在尼斯大学Archet 2Hospital(法国尼斯)的皮肤科治疗。最初诊断为I-II期黑色素瘤的患者在局部或远端转移性复发的时候入组该研究。来自转移的组织学材料的可用性和签署的知情同意书的存在是在研究中包括病例所必需的标准。

在125名患者中，91名(73％)表现出局部转移(35名在移行中(in transit)和56名淋巴结转移)，34名(27％)表现出远端转移(19名肺转移部位和15名皮下转移部位)。

在该研究中区分了两组患者：一组接受至少一种免疫疗法治疗(抗PD-1抑制剂-帕博利珠单抗/纳武单抗和/或抗CTLA4)的58名患者(46％)和一组不接受免疫疗法治疗的67名患者(53％)，尽管一些患者具有其他治疗(化学疗法或用抗BRAF剂和抗MEK剂的靶向疗法)。

所有肿瘤标本均在患者签署知情同意书的情况下使用。该研究得到当地伦理委员会(人类研究伦理委员会(Human Research EthicsCommittee)，尼斯大学附属医院中心/医院相关Biobank BB-0033-00025；http：//www.biobank-cotedazur.fr/)的批准，并且在赫尔辛基声明(Declaration of Helsinki)的指南下进行。

b)如先前所述，根据标准方案使用SQSTM1抗体进行免疫组织化学(IHC)。简言之，新鲜切割福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)连续4μm组织切片，脱石蜡，预处理，并在BenchMark ULTRA自动染色机(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ，USA)上用针对SQSTM1的单克隆抗体(BD Transduction Laboratories^TM，610833)染色。使用以3，3-二氨基联苯胺(DAB，OptiView试剂盒，Roche Diagnostics，Ventana，目录号760-700)作为底物的抗免疫球蛋白缀合的辣根过氧化物酶检测染色。用Mayer苏木精进行核复染。每个IHC运行包含阳性对照和阴性Ab对照(缓冲液，无一抗)。

c)免疫组织化学评价。观察者间和观察者内的可变性。对于观察者间和观察者内的可变性，检查SQSTM1(细胞质和/或细胞核)的免疫组织化学评分。两个病理学家在不知道临床病理学数据的情况下独立地评价免疫组织化学染色结果。两个病理学家的观察者间一致性很高(α＝0.97)。评分的观察者内一致性也显示出高度一致性。使用多头显微镜分辨差异结果。

d)IHC评分。记录每个病例的免疫组织化学染色的强度、百分比和亚细胞定位。进行省略一抗的染色作为阴性对照。在低功率场(x100)扫描阳性染色细胞的强度和百分比，然后在高功率场(x400)进行评价。在细胞质和细胞核中鉴定SQSTM1染色。将SQSTM1染色的强度记录为0、1、2和3，分别指阴性、弱染色、中等染色和强染色(参见下文)。从0％至100％记录SQSTM1阳性细胞的百分比。使用快速(Q)评分对染色结果进行评分，其通过将阳性细胞的百分比(P)乘以强度(I)获得(Q＝P×I；最大值＝300；Charafe-Jauffret等人，2004)。将黑色素瘤的Q评分的中值用作将癌症分类为表现出′低表达′和′高表达′的截断点。使用χ2检验或学生t检验来研究各组间的差异。图32。

3.结果

SQSTM1是核质穿梭蛋白，但迄今为止未记录有其亚细胞定位与皮肤癌发生的关联以及对免疫疗法的反应。

本发明人回顾性地评估了与肿瘤内和CD8+T淋巴细胞组合在黑色素瘤细胞中表达的SQSTM1的关联性，如通过免疫组织化学所检测和通过数字分析临床病理学特征和在用ICI治疗的58名患者中的总体存活期(OS)所定量的。

他们发现黑色素瘤显示出比正常皮肤更强的SQSTM1表达。在ICI治疗的黑色素瘤中，非反应者黑色素瘤表现出有限的细胞质SQSTM1染色。相反，反应者黑色素瘤表现出最高的细胞质和细胞核SQSTM1表达增加。两组(非反应者和反应者)之间细胞质和细胞核表达的差异是统计学显著的(p值＝0.00026)。总之，这些发现提供了细胞核和细胞质SQSTM1染色作为皮肤黑色素瘤的ICI预测性生物标志物的利益的第一个证据。

实施例3：SQSTM1是在液体活检中用于肺腺癌(LUAD)中免疫疗法分层的循环生物标志物

本发明人还评价了SQSTM1作为液体活检中的非侵入性循环生物标志物用于LUAD中改善的免疫疗法分层的预测价值。

1.基本原理

在组织活检难以接近、极难以进行的患有晚期或转移性疾病的患者中或者如果存在低百分比的肿瘤细胞(导致少量的提取核酸用于分子测试和/或用于PD-L1表达的稳健评估)，获得足够的用于分子测试的肿瘤组织越来越具有挑战性。因此，未满足的诊断需要迫切要求识别可受益于免疫疗法的患者的非侵入性方法。近年来，i)本发明人使用一个方案以采用平台(Isolation by SizE of Tumor cells，Hofman V 2011a/b)从肺癌患者的血液中特异性地分离循环肿瘤细胞(CTC)，ii)本发明人成功报道了PD-L1在一些但不是全部患有晚期肺癌(NSCLC)患者的血液中的循环肿瘤细胞(CTC)上的过表达；iii)本发明人将CTC中的PD-L1表达和匹配的肺活检相关联；iv)然而，PD-L1假阳性和假阴性染色的不准确性仍然存在(IliéM等人Ann Onco1.2018年1月1日；29(1)：193-199)。

在NSCLC患者中，肿瘤活检中的SQSTM1表达与PD-L1抑制剂的改进的益处相关。因此，本发明人在40名晚期NSCLC患者的队列中通过使用ISET平台评价血液样品中PD-L1和SQSTM1表达的流行、以及在CTC和匹配的肿瘤组织两者中的SQSTM1表达研究了CTC作为肿瘤的PD-L1状态的非侵入性替代物的效用。

2.方法

A)CTC捕获。通过将基于大小的过滤与细胞病理学评价(技术)相结合的方法进行CTC捕获。简言之，根据制造商的建议，将血液样品吸入K3EDTA或采血管(BCT)(Streck)中，并且通过Isolation by SizE of Tumor(系统，Rarecells，Paris，France)过滤以捕获CTC(IliéM等人Ann Oncol.2018年1月1日；29(1)：193-199)。分析过滤器是否存在具有恶性(CNHC-MF)或不确定(CNHC-UMF)特征的循环非血液细胞。

b)ISET过滤器上的SQSTM1表达。选择呈现CTC检测(≥2CNHC-MF和/或CNHC-UMF)的样品用于通过免疫细胞化学在三个未染色的ISET过滤器点上进一步分析SQSTMl表达，具体如下：在用反应缓冲液10×(目录号950-300；Ventana)再水合2分钟后，将过滤器置于BenchMark ULTRA自动染色器(Ventana)中的带正电荷的载玻片上，并且遵循针对IHC的SQSTM1染色方案(如上文所述)。

SQSTM1 ICC分析评估了SQSTM1的细胞质和细胞核表达，并且对表达SQSTM1的CTC和WBC的百分比进行评分。将来自血液样品和匹配的肿瘤组织的结果设盲直到研究完成为止。

3.结果

本发明人使用从LUAD患者血液样品中分离了CTC并且通过免疫细胞化学染色成功地检测到SQSTM1。该概念验证研究证明了CTC/SQSTM1测定作为非侵入性实时液体活检用于免疫疗法反应患者分层的预测价值。

序列表

<110> 法国国家科学研究中心

（Centre National de la Recherche Scientifique）、

法国蔚蓝海岸大学（Universite Cote d'Azur）、

法国国家健康与医学研究院

（Institut National de la Sante Et de la Recherche Medicale）

<120> SQSTM1及其在疗法中的用途

<130> BR124545

<150> EP20306577.6

<151> 2020-12-15

<160> 39

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala

1 5 10 15

Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu

20 25 30

Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu

35 40 45

Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln

50 55 60

Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp

65 70 75 80

Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg

85 90 95

Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Glu Cys Arg Arg Asp His Arg Pro Pro

100 105 110

Cys Ala Gln Glu Ala Pro Arg Asn Met Val His Pro Asn Val Ile Cys

115 120 125

Asp Gly Cys Asn Gly Pro Val Val Gly Thr Arg Tyr Lys Cys Ser Val

130 135 140

Cys Pro Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Val Cys Glu Gly Lys Gly Leu His

145 150 155 160

Arg Gly His Thr Lys Leu Ala Phe Pro Ser Pro Phe Gly His Leu Ser

165 170 175

Glu Gly Phe Ser His Ser Arg Trp Leu Arg Lys Val Lys His Gly His

180 185 190

Phe Gly Trp Pro Gly Trp Glu Met Gly Pro Pro Gly Asn Trp Ser Pro

195 200 205

Arg Pro Pro Arg Ala Gly Glu Ala Arg Pro Gly Pro Thr Ala Glu Ser

210 215 220

Ala Ser Gly Pro Ser Glu Asp Pro Ser Val Asn Phe Leu Lys Asn Val

225 230 235 240

Gly Glu Ser Val Ala Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ile Glu Val Asp

245 250 255

Ile Asp Val Glu His Gly Gly Lys Arg Ser Arg Leu Thr Pro Val Ser

260 265 270

Pro Glu Ser Ser Ser Thr Glu Glu Lys Ser Ser Ser Gln Pro Ser Ser

275 280 285

Cys Cys Ser Asp Pro Ser Lys Pro Gly Gly Asn Val Glu Gly Ala Thr

290 295 300

Gln Ser Leu Ala Glu Gln Met Arg Lys Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gly

305 310 315 320

Arg Pro Glu Glu Gln Met Glu Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp

325 330 335

Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp Pro Ser Thr Gly Glu

340 345 350

Leu Gln Ser Leu Gln Met Pro Glu Ser Glu Gly Pro Ser Ser Leu Asp

355 360 365

Pro Ser Gln Glu Gly Pro Thr Gly Leu Lys Glu Ala Ala Leu Tyr Pro

370 375 380

His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Pro Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gln

385 390 395 400

Met Leu Ser Met Gly Phe Ser Asp Glu Gly Gly Trp Leu Thr Arg Leu

405 410 415

Leu Gln Thr Lys Asn Tyr Asp Ile Gly Ala Ala Leu Asp Thr Ile Gln

420 425 430

Tyr Ser Lys His Pro Pro Pro Leu

435 440

<210> 2

<211> 2840

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

acggcccgtt ttccgccagc tcgccgctcg ctatggcgtc gctcaccgtg aaggcctacc 60

ttctgggcaa ggaggacgcg gcgcgcgaga ttcgccgctt cagcttctgc tgcagccccg 120

agcctgaggc ggaagccgag gctgcggcgg gtccgggacc ctgcgagcgg ctgctgagcc 180

gggtggccgc cctgttcccc gcgctgcggc ctggcggctt ccaggcgcac taccgcgatg 240

aggacgggga cttggttgcc ttttccagtg acgaggaatt gacaatggcc atgtcctacg 300

tgaaggatga catcttccga atctacatta aagagaaaaa agagtgccgg cgggaccacc 360

gcccaccgtg tgctcaggag gcgccccgca acatggtgca ccccaatgtg atctgcgatg 420

gctgcaatgg gcctgtggta ggaacccgct acaagtgcag cgtctgccca gactacgact 480

tgtgtagcgt ctgcgaggga aagggcttgc accgggggca caccaagctc gcattcccca 540

gccccttcgg gcacctgtct gagggcttct cgcacagccg ctggctccgg aaggtgaaac 600

acggacactt cgggtggcca ggatgggaaa tgggtccacc aggaaactgg agcccacgtc 660

ctcctcgtgc aggggaggcc cgccctggcc ccacggcaga atcagcttct ggtccatcgg 720

aggatccgag tgtgaatttc ctgaagaacg ttggggagag tgtggcagct gcccttagcc 780

ctctgggcat tgaagttgat atcgatgtgg agcacggagg gaaaagaagc cgcctgaccc 840

ccgtctctcc agagagttcc agcacagagg agaagagcag ctcacagcca agcagctgct 900

gctctgaccc cagcaagccg ggtgggaatg ttgagggcgc cacgcagtct ctggcggagc 960

agatgaggaa gatcgccttg gagtccgagg ggcgccctga ggaacagatg gagtcggata 1020

actgttcagg aggagatgat gactggaccc atctgtcttc aaaagaagtg gacccgtcta 1080

caggtgaact ccagtcccta cagatgccag aatccgaagg gccaagctct ctggacccct 1140

cccaggaggg acccacaggg ctgaaggaag ctgccttgta cccacatctc ccgccagagg 1200

ctgacccgcg gctgattgag tccctctccc agatgctgtc catgggcttc tctgatgaag 1260

gcggctggct caccaggctc ctgcagacca agaactatga catcggagcg gctctggaca 1320

ccatccagta ttcaaagcat cccccgccgt tgtgaccact tttgcccacc tcttctgcgt 1380

gcccctcttc tgtctcatag ttgtgttaag cttgcgtaga attgcaggtc tctgtacggg 1440

ccagtttctc tgccttcttc caggatcagg ggttagggtg caagaagcca tttagggcag 1500

caaaacaagt gacatgaagg gagggtccct gtgtgtgtgt gtgctgatgt ttcctgggtg 1560

ccctggctcc ttgcagcagg gctgggcctg cgagacccaa ggctcactgc agcgcgctcc 1620

tgacccctcc ctgcaggggc tacgttagca gcccagcaca tagcttgcct aatggctttc 1680

actttctctt ttgttttaaa tgactcatag gtccctgaca tttagttgat tattttctgc 1740

tacagacctg gtacactctg attttagata aagtaagcct aggtgttgtc agcaggcagg 1800

ctggggaggc cagtgttgtg ggcttcctgc tgggactgag aaggctcacg aagggcatcc 1860

gcaatgttgg tttcactgag agctgcctcc tggtctcttc accactgtag ttctctcatt 1920

tccaaaccat cagctgcttt taaaataaga tctctttgta gccatcctgt taaatttgta 1980

aacaatctaa ttaaatggca tcagcacttt aaccaatgac gtttgcatag agagaaatga 2040

ttgacagtaa gtttattgtt aatggttctt acagagtatc tttaaaagtg ccttagggga 2100

accctgtccc tcctaacaag tgtatctcga ttaataacct gccagtccca gatcacacat 2160

catcatcgaa gtcttcccca gttataaaga ggtcacatag tcgtgtgggt cgaggattct 2220

gtgcctccag gaccaggggc ccaccctctg cccagggagt ccttgcgtcc catgaggtct 2280

tcccgcaagg cctctcagac ccagatgtga cggggtgtgt ggcccgagga agctggacag 2340

cggcagtggg cctgctgagg ccttctcttg aggcctgtgc tctgggggtc ccttgcttag 2400

cctgtgctgg accagctggc ctggggtccc tctgaagaga ccttggctgc tcactgtcca 2460

catgtgaact ttttctaggt ggcaggacaa attgcgccca tttagaggat gtggctgtaa 2520

cctgctggat gggactccat agctccttcc caggacccct cagctccccg gcactgcagt 2580

ctgcagagtt ctcctggagg caggggctgc tgccttgttt caccttccat gtcaggccag 2640

cctgtccctg aaagagaaga tggccatgcc ctccatgtgt aagaacaatg ccagggccca 2700

ggaggaccgc ctgccctgcc tgggccttgg ctgggcctct ggttctgaca ctttctgctg 2760

gaagctgtca ggctgggaca ggctttgatt ttgagggtta gcaagacaaa gcaaataaat 2820

gccttccacc tcaccgcaaa 2840

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SQSTM1片段

<400> 3

gatcaacttc aatgcccaga ggttttt 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SQSTM1片段

<400> 4

gttctcttta atgtagattc ggttttt 27

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG5片段

<400> 5

ccggcctgaa cagaatcatc cttaactcga gttaaggatg attctgttca ggttttttg 59

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ATG7片段

<400> 6

ccgggcctgc tgaggagctc tccatctcg 29

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照shRNA

<400> 7

agttggtgct cttcatcttg ttgttttt 28

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 8

tgagccgcga ctgtgatg 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 9

gtctcggtga caaagtcgaa gtt 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 10

gctgaggcat gagaatcgct tgaa 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 11

ggaggatcgc ttgaggttag gagtt 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 12

gggacaagaa tgccaccaaa 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 13

gaaccacatg acccagcg 18

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 14

aatgtgaatc cagccaggaa aggc 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 15

actggattac actccaggaa ccgt 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 16

ctgtcatgtc aggtccaaag cc 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 17

ttccctcaca ttgtcattga gcc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 18

gacctctgtc ttacttgtgg agc 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 19

cgtcagatgg tgccagcaat ag 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 20

ctcaggttgc atgactggtg g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 21

gaggcctctg tcaccttcaa c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 22

ggacgccttg gaagagtcac t 21

<210> 23

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 23

caggtcccaa ttc 13

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 24

gactccatct tggctgtga 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 25

tgatttctgc tctgacaacc t 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 26

tgcatcttct ccgtcatctc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 27

tagcagccga caccagcctg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 28

tgaatccaga atcgaaggcc a 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 29

tgcatcgatt ttgctcccct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 30

gggcattcca gaaagatgag 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 31

ccgtgacagt aaatgcgttc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 32

ccctcaccct gagatgggag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 33

agctccgatg accacaactg 20

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 34

aggaaaggtg cttccgaggt ag 22

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 35

ggactgagga agacaaccag gt 22

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 36

gcatcagtac cccattctat cat 23

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 37

aggtgtaatc cgtctccaca ga 22

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 38

cagttccctc cagcttcaat g 21

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR反应的寡核苷酸

<400> 39

acccagccga caaaatgc 18

Claims

1.SQSTM1/p62蛋白用于体外调节肿瘤细胞对以下项的反应的用途：

-针对免疫检查点抑制剂也称为ICI的免疫疗法；

或者

-ICI和化学疗法的组合。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述SQSTM1/p62蛋白包含如SEQID NO：1所示的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。

3.一种用于体外预测肿瘤对疗法的抗性的方法，所述疗法是ICI或者ICI和化学疗法的组合，所述方法包括：

-评价源自所述肿瘤的生物样品中SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在或量，

-将所述SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量与对照样品中所述SQSTM1/p62蛋白的量进行比较，

-结论是

*当所述生物样品中SQSTM1/p62蛋白不存在或低于或等于在所述对照样品中获得的量时，所述肿瘤将可能对所述疗法有抗性，以及

*当所述生物样品中SQSTM1/p62蛋白存在或高于对照水平时，所述肿瘤将可能对所述疗法敏感。

4.根据权利要求3所述的方法，其中在所述生物样品中，优选地在组织活检或液体活检中，原位评价所述SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在。

5.一种用于体外预测患有肿瘤的患者的存活率的方法，所述方法包括：

-将所述SQSTM1/p62蛋白的存在、不存在或量与对照样品中评价的所述SQSTM1/p62蛋白的量进行比较，

-结论是

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62不存在或低于或等于在所述对照样品中获得的量时，则所述患者在5年后将具有高于80％的存活率，以及

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62存在或高于在所述对照样品中获得的量时，则所述患者在5年后将具有低于70％的存活率。

6.根据权利要求5所述的方法，其中将以下项的存在、不存在或量：

-PD-L1蛋白，和

-CD8+T淋巴细胞，

与SQSTM1/p62蛋白的存在或不存在或量同时评价，并且与在对照样品中评价的相应PD-L1蛋白和CD8+T淋巴细胞的存在、不存在或量进行比较，

并且其中

当所述生物样品中的SQSTM1/p62蛋白、PD-L1蛋白和CD8+T淋巴细胞存在或高于在所述对照样品中获得的量时，则所述患者在5年后将具有低于50％的存活率。

7.一种用于体外预测患有肿瘤并且用ICI或者ICI和化学疗法的组合治疗的患者的存活率的方法，所述方法包括：

-结论是

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62不存在或低于或等于在所述对照样品中获得的量时，则所述患者在治疗20个月后将具有低于或等于10％的存活率，以及

*当所述生物样品中的SQSTM1/p62存在或高于在所述对照样品中获得的量时，则所述患者在治疗20个月后将具有等于或高于50％的存活率。

8.一种组合物，所述组合物包含：

-SQSTM1/p62蛋白；或者

-编码所述SQSTM1/p62蛋白的核酸分子；

所述组合物用于治疗涉及炎症的病理的用途。

9.根据权利要求8所述的用于其用途的组合物，其中所述涉及炎症的病理是癌症，特别是原发性肿瘤或转移性肿瘤，特别是肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、子宫癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、大B细胞淋巴瘤、梅克尔病、肝细胞癌和胃肠癌，优选具有小卫星不稳定性的胃肠癌。

10.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

-SQSTM1蛋白，

-可用于诱导针对检查点抑制剂的免疫疗法的抗体，和

-化学治疗剂，优选地所述化学治疗剂是含有铂化合物的化学治疗剂、或紫杉醇或多西他赛化合物、或放射疗法。

11.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述抗体是抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。

12.一种包含与紫杉烷类缔合的免疫治疗ICI化合物的组合物，所述组合物用于治疗不表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤或以比对照组织中的SQSTM1/p62蛋白水平低的水平表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤的用途。

13.一种包含与DNA损伤诱导剂缔合的免疫治疗ICI化合物的组合物，所述组合物用于治疗表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤或以比对照组织中的SQSTM1/p62蛋白水平高的水平表达SQSTM1/p62蛋白的肿瘤的用途。