KR20240008294A - Sqstm1 및 암 치료법에서의 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기에 대한 반응을 조절하고 예측하기 위한, SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다:
- 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법;
- 면역치료법, 바람직하게는 ICI와 화학치료법의 조합.
- 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법;
- 면역치료법, 바람직하게는 ICI와 화학치료법의 조합.
Description
본 발명은 단백질 SQSTM1 및 치료법에서의 이의 용도에 관한 것이다.
고등 진핵생물에서의 면역계는 외래 병원체 및 감염된 세포에 의한 침범에 대해 중추적인 역할을 한다. 외부 손상(insult)의 부재 시, 면역계는 또한 세포 표면에서 이례적인 항원 또는 비정상적으로 과발현된 단백질을 검출함으로써 초기(nascent) 형질전환된 세포를 신중하게 조사하고 효율적으로 인식한다.
전통적으로, 내재성 면역 세포-자연 살해 세포(NK), 수지상 세포(DC), 다형핵 백혈구 및 대식세포-는 1차 방어로서 모집되어, 형질전환된 세포를 세포용해성 사멸화에 의해 공격한다. 그 후에, 항원-제시 세포(APC), 예컨대 DC는 종양 항원을 처리하고 림프절로 이동하여, B 림프구 및 T 림프구에 의해 매개되는 더욱 집중된(focused) 적응 면역 반응을 프라이밍(prime)한다. MHC-II 및 MHC-I 수용체를 통한 각각 미접촉(na
ve) CD4+ 세포 및 CD8+ T 세포에 항원 제시 시, 이들 세포는 클론 확장(expansion) 및 분화를 겪어서 이펙터 또는 메모리 기능을 발휘한다. T 세포 기능은 핵에 축적되고 계열(lineage)-특이적 전사 인자를 활성화시키는 TCR-의존적 및 사이토카인-의존적 신호전달 캐스케이드에 의해 분자 수준에서 결정된다. 이는 다양한 기능을 발휘하고 특정 표면 및 핵 마커, 뿐만 아니라 분비된 이펙터 분자를 특징으로 하는 넓은 T 림프구 패널의 발달을 초래한다.
T 세포 하위세트(subset) 중에서, "연쇄 살해자(serial killer)"는 명백하게는 종양 부위로 이동하고 Th1 및 Th2 CD4+ 헬퍼와 협력하여, 형질전환된 세포를 공격하고 사멸화시키는 CD8+ 세포용해성 T 림프구(CTL)이다. CD4+ 세포는 면역-자극성 환경을 창출함으로써 "돕는" 한편, CTL은 Fas 리간드 및 전염증성 종양-괴사 인자(TNF), 뿐만 아니라 퍼포린(공극-형성 단백질) 및 그랜자임(세린 프로테아제)을 함유하는 세포독성 과립을 분비함으로써 표적 세포에서 세포자멸사를 유도한다. 케모카인 중에서, 수많은 연구는 종양 근절에서 IFN-γ의 중요성을 강조한다. 이 사이토카인은 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포에 의해 방출되고, APC의 발달 및 기능을 제어한다. 그 후에, 세포자멸적 종양 세포는 프로페셔널 식세포, 예컨대 대식세포 및 수지상 세포에 의해 신속하게 검출되고 포식되어, 종양 항원을 CTL에 제시하고 과도한 염증을 피한다. 이에 더하여, CD4+ 조절 T 세포(Treg)는 전염증성 반응을 억제시키는 형질전환 성장 인자 β(TGF-β), IL-10 및 IL-35를 분비하고, 이로써 조직 손상을 제한한다. 이상적으로, 세포독성 활성과 조절 활성 사이의 조정된 균형은 종양 세포 제거를 가능하게 하고, 주변의 건강한 조직의 무결성(integrity)을 보존한다.
이론적으로, 효과적인 면역 감시는 성공적인 T 세포 프라이밍 및 종양 근절을 산출할 것이다.
그러나, 임상적으로 진단된 종양은 신생물 세포가 면역 감시를 벗어나는 능력을 증명한다. 면역억제성 전략 중에서, T 세포 공동저해 경로는 종양 세포에 의해 장악되어, 항종양 반응을 우회한다. 염증 동안, 이들 공동저해 경로("면역 관문"이라고도 함)는 면역 세포와 상피 세포 상에서 발현되어, 공동자극성 신호의 균형을 이루고, T 세포 기능을 저해하고, 과도한 세포독성을 피한다.
프로그래밍된 사멸-1(PD-1) 및 이의 리간드 PD-L1과 PD-L2는 단연코 가장 유명한 면역 저해 커플을 형성한다. PD-L1은 다양한 암: 흑색종, 신경교종, 폐, 결장, 췌장, 유방, 소화관, 신장, 방광, 및 난소 암의 세포 표면에서 과발현되고, 불량한 전체 생존율과 연관이 있다. 이의 리간드 PD-L1에 결합될 때, PD-1 신호전달은 T 세포 활성화(IFN-γ 생산), 해당작용, 및 세포 주기 진행을 감소시킨다. 이러한 재프로그래밍의 기저를 이루는 신호전달 사건은 아직 더 탐구되어야 하지만, 현재로서는 결과적인 기능장애성(dysfunctional) T 세포가 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단함으로써 재활성화될 수 있음이 분명하다.
이들 관문에 대한 지식은 과학자가 이를 사용하여 종양에 대한 새로운 치료법: 관문 저해제 및 면역치료법을 개발하도록 이끌었다.
면역 관문 저해제(ICI), 특히 종양-침윤성 림프구(TIL)를 재활성화시키고 종양 발증에 대해 중요한 무기를 이루는 PD-1/PD-L1 차단 항체는 몇몇 진행성 암을 치료하고 전체 생존율을 연장시키는 데 효과적인 것으로 입증되었다.
안타깝게도, 호지킨 질환에서는 거의 87% 및 결합조직형성 흑색종(desmoplastic melanoma)에서는 70%의 객관적 반응율로 암 환자에서 최고의 임상적 유익성이 관찰되었음에도 불구하고, 폐암 및 흑색종과 같은 대다수의 다른 암은 관문 저해제 면역치료법에 대해 기껏해야 25% 내지 30%의 효능을 경험하였다. 결과적인 80%의 암 환자는 ICI에 대해 내재성 또는 획득 내성을 겪는다.
따라서, 병리학자가, 관문 저해제 면역치료법이 확인 종양(determined tumor)에 대해 효율적일 것인지 또는 효율적이지 않을 것인지의 여부를 결정하도록 도울 수 있는 바이오마커를 제공할 필요성이 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래 기술의 이러한 결점을 일소하는 것이다.
본 발명의 하나의 목표는 관문 저해제 면역치료법의 효능의 예측 마커로서의 기지의(known) 단백질의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 다른 목표는 이러한 종류의 면역치료법에 내성일 수 있는 종양을 예측하거나 효율적으로 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목표는 단독으로 존재하거나 조합된 면역치료법에 종양이 반응할 것인지 또는 반응하지 않을 것인지의 여부를 결정하기 위한 단순하고 사용준비가 된 키트를 제공하는 것이다.
그러므로, 본 발명은 하기에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한 p62라고도 하거나 SQSTM1/p62 단백질이라고도 하는 SQSTM1의 용도에 관한 것이다:
- 면역치료법, 바람직하게는 ICI라고도 하는 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법;
- DNA 수선을 방해하는 제제가 아닌 제제를 사용한 화학치료법; 또는
- 종양 세포의 면역치료법, 바람직하게는 ICI와 화학치료법의 조합.
본 발명은 발명자들에 의해 이루어진, SQSTM1/p62가 항암 치료법에 대한 반응의 중심적인 마커라는 예상치 못한 관찰에 기초한다. 그러므로, SQSTM1/p62 단백질의 발현을 조절함으로써, 면역치료법, DNA 수선을 방해하는 제제가 아닌 제제를 사용하는 화학치료법, 또는 면역치료법과 화학치료법의 조합에 대한 종양 세포의 반응을 변형시키거나 조절하는 것이 가능하다.
이는 유리하게는, SQSTM1이 부재하거나 상이한 수준으로 존재할 때 시험관내에서 종양 세포가 상기 치료법을 이용한 치료에 차별적으로 반응할 수 있을 것임을 의미한다.
본 발명은 하기를, 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한 SQSTM1/p62 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다:
- 면역치료법, 바람직하게는 ICI라고도 하는 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법;
- DNA 수선을 방해하는 제제가 아닌 제제를 사용한 화학치료법; 또는
- 종양 세포의 면역치료법, 바람직하게는 ICI와 화학치료법의 조합.
제1 자가포식 어댑터 단백질인 것으로 유명한 시퀘스토솜(Sequestosome) 1 단백질 또는 SQSTM1/p62는 가장 중요하게는 세포 성장, 세포 이동 및 세포 생존을 포함한 여러 가지 세포 기능을 제어하는 신호전달 허브이다. SQSTM1/p62는 내인성 신호전달 기능을 갖지 않지만, 키나제, 유비퀴틴 리가제(ligase), 및 다른 단백질과 상호작용하여 신호전달 경로를 구동한다(drive).
SQSTM1/p62 단백질은 암에서 탈조절되는 것으로 보고되었으나, SQSTM1/p62 단백질이 항암 치료법에 대한 내성 또는 감수성(sensibility)을 평가하기 위한 중심적인 마커일 수 있다는 것이 결코 교시되거나 시사되지 않았다.
본 발명에서, "화학치료법"은 화학치료 화합물을 이용한 치료 또는 방사선치료법의 사용에 의한 치료를 의미한다.
화학치료 화합물은 본 발명에 따라 암세포뿐만 아니라 정상 세포에서 DNA 손상, DNA 수선, DNA 복제, DNA 메틸화, 후생학적 변형, 내재성 방어, IFN 반응 또는 세포 분열에 영향을 미치는 화합물에 상응한다.
본 발명에서, 면역치료법 또는 암 면역치료법은 표적화된 항체, 암 백신, 입양 세포 전달, 종양-감염 바이러스, 합성 바이러스, 합성 RNA/DNA, 및 면역 관문 저해제, 사이토카인 및 아쥬반트를 포함한 다양한 형태를 포괄한다. 면역치료법의 목적은 암세포와 싸우는 신체의 자연 방어를 강화하는 것이다.
특정 면역치료법 중 하나는 면역 관문 저해제의 사용이다.
면역 관문은 면역계의 정상적인 부분이고, 신체에서 건강한 세포를 파괴할 정도로 면역 반응이 너무 강해지는 것을 방지한다. 면역 관문은 T 세포 표면 상의 단백질이 일부 종양 세포와 같은 다른 세포 상의 파트너 단백질을 인식하고 이에 결합할 때 연계된다(engage). 관문과 파트너 단백질이 함께 결합할 때, 이들은 T 세포에 "오프(off)" 신호를 전송한다. 이는 면역계가 암을 파괴하는 것을 방지할 수 있다. 면역 관문 저해제라고 하는 면역치료법 약물은 관문 단백질이 이의 파트너 단백질에 결합하는 것을 차단함으로써 작동한다. 이는 "오프" 신호가 전송되는 것을 방지하여, T 세포가 암세포를 사멸화시키게 한다. 하나의 이러한 약물은 CTLA-4 단백질, PD-1 단백질, 또는 이의 파트너 단백질 PD-L1이라고 하는 관문 단백질에 대해 작동한다.
유리하게는, 본 발명은 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한, SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명은 DNA 수선을 방해하는 제제가 아닌 제제를 사용하는 화학치료법에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한, SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명은 ICI와 화학치료법의 조합에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한, SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 용도에 관한 것으로서, 여기서 상기 SQSTM1/p62 단백질은 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 용도를 위한 상기 정의된 바와 같은 상기 조성물에 관한 것으로서, 여기서 상기 SQSTM1/p62 단백질은 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다.
인간 SQSTM1/p62 단백질은 이하에 나타낸 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
MASLTVKAYL LGKEDAAREI RRFSFCCSPE PEAEAEAAAG PGPCERLLSR VAALFPALRP GGFQAHYRDE DGDLVAFSSD EELTMAMSYV KDDIFRIYIK EKKECRRDHR PPCAQEAPRN MVHPNVICDG CNGPVVGTRY KCSVCPDYDL CSVCEGKGLH RGHTKLAFPS PFGHLSEGFS HSRWLRKVKH GHFGWPGWEM GPPGNWSPRP PRAGEARPGP TAESASGPSE DPSVNFLKNV GESVAAALSP LGIEVDIDVE HGGKRSRLTP VSPESSSTEE KSSSQPSSCC SDPSKPGGNV EGATQSLAEQ MRKIALESEG RPEEQMESDN CSGGDDDWTH LSSKEVDPST GELQSLQMPE SEGPSSLDPS QEGPTGLKEA ALYPHLPPEA DPRLIESLSQ MLSMGFSDEG GWLTRLLQTK NYDIGAALDT IQYSKHPPPL.
이 단백질은 NCBI 데이터베이스 NM_003900.5로 참조되고 서열 번호 2로서 나열된 바와 같은 핵산 분자에 의해 코딩된다.
따라서 유리한 구현예에서, 본 발명은 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명은 DNA 수선을 방해하는 제제가 아닌 제제를 사용하는 화학치료법에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명은 ICI와 화학치료법의 조합에 대한 반응을 바람직하게는 시험관내에서 조절하기 위한 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질의 용도에 관한 것이다.
하나의 다른 양태에서, 본 발명은 또한 종양 치료법에 대한 내성을 바람직하게는 시험관내에서 또는 생체외에서 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 치료법은 화학치료법 및/또는 면역치료법이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료 내 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* SQSTM1/p62 단백질이 상기 생물학적 시료에 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때 종양은 치료법에 내성인 경향이 있을 것임, 및
* SQSTM1/p62 단백질이 상기 생물학적 시료에 존재하거나 대조군 수준보다 높을 때 종양은 치료법에 대해 감수성이 있는 경향이 있을 것임.
본 발명에서, 발명자들은 SQSTM1/p62 단백질의 발현 또는 발현의 하향조절이 종양 치료법에 대한 내성 또는 감수성의 중요한 마커임을 보여주었다.
사실상, 발명자들은 종양 또는 종양 시료 내 SQSTM1/p62 단백질의 존재, 또는 발현 증가가 화학치료법, 면역치료법 또는 이들 치료법 둘 다에 대한 상기 종양 또는 상기 종양 시료의 감수성의 마커임을 보여주었다. 동일한 방식으로, SQSTM1/p62 단백질이 종양 또는 종양 시료에서 발현되지 않거나 비발현될(unexpressed) 때, 종양 또는 종양 시료는 화학치료법, 면역치료법 또는 이들 치료법 둘 다에 대해 내성일 것이다.
단백질, 즉, SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양의 변동은 결정적이다. 사실상, SQSTM1/p62 단백질의 존재의 생물학적 효과는 종양의 감수성/내성의 핵심이다. 따라서, 특히 전사 수준과 번역 수준 사이에 어떠한 상관관계도 없다면, SQSTM1/p62를 코딩하는 핵산 분자(즉, RNA)의 양을 평가하는 것은 충분하지 않다.
SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 양의 검출은 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 당업계에 알려진 임의의 기법에 의해, 특히 항체 또는 이의 유도체와 같은 면역학적 수단을 사용함으로써 수행될 수 있다. 이러한 검출은 면역조직화학, 면역블로팅, 인시츄(in situ) 면역형광에 의해, 또는 유세포측정기를 사용함으로써 수행될 수 있다.
SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양의 변동은 종양으로부터, 즉, 생검 또는 액체 생검으로부터, 또는 상기 종양으로부터 기원하는 순환 세포가 존재하는 혈액 시료로부터 기원하는 시료에서 평가된다. 혈액학적 종양, 예컨대 백혈병 또는 림프종의 경우, 생물학적 시료는 혈액 시료, 또는 골수로부터 또는 악성 세포가 이식된(engrafted) 기관으로부터 수득된 생검이다.
SQSTM1/p62의 존재, 부재 또는 양은 기준 시료 내 단백질의 존재, 부재, 또는 양과 비교되어 결정된다. 유리하게는, 기준 시료는 종양과 동일한 성질 또는 기원의 것이다. 이는, 종양이 폐 종양이라면, 기준 시료는 폐암을 앓지 않는 개체의 폐 또는 동일한 환자의 인접 대조군 조직으로부터 수득될 것임을 의미한다.
기준 시료는 음성 기준 시료, 즉, 종양에 상응하지 않는 것으로 알려진 시료, 또는 SQSTM1/p62 단백질의 양 또는 부재가 알려져 있는 양성 기준 시료일 수 있다. 본 발명에서 기준 시료는 예를 들어 인접한 건강한 조직으로부터 수득될 수 있다.
연구될 시료와 기준 시료 둘 다 사이에서 존재, 부재, 또는 양을 비교하기 위해, SQSTM1/p62 단백질의 검출은 당업계에 알려진 수단, 예컨대 발광 또는 형광, 갈색 비색 신호의 정량화에 의해 정량화될 수 있다. 과발현 암에서 점상(punctate) SQSTM1/p62-염색 패턴 대(versus) 건강한 조직에서 드물게 균일한 염색의 검출(아래 실시예 참조).
유리하게는, SQSTM1/p62 단백질은 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
따라서 유리하게는, 본 발명은 또한 종양 치료법에 대한 내성을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 치료법은 화학치료법 및/또는 면역치료법이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료 내 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질이 상기 생물학적 시료에 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때 종양은 치료법에 내성인 경향이 있을 것임, 및
* 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1/p62 단백질이 상기 생물학적 시료에 존재하거나 대조군 수준보다 높을 때 종양은 치료법에 대해 감수성이 있는 경향이 있을 것임.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것으로서, 여기서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재는 생물학적 시료에서 인시츄로, 바람직하게는 조직 생검 또는 액체 생검에서 평가된다.
당업계에 알려진 바와 같이, 조직 생검은 질환의 존재 또는 정도(extent)를 결정하기 위한 검사용의 시료 세포 또는 조직의 추출을 수반한다. 조직은 일반적으로 병리학자에 의해 현미경 하에 검사되고; 이는 또한 화학적으로 또는 프로테오믹 분석을 사용함으로써 분석될 수 있다.
액체 생검은 혈액과 같은 유체에서 순환하는 바이오마커를 사용한 종양의 분석에 상응한다. 몇몇 유형의 액체 생검 방법이 존재하는데, 방법 선택은 연구되고 있는 조건에 의존한다. 액체 생검은 암세포뿐만 아니라 단백질 및 순환 종양 핵산(DNA 또는 RNA-ctDNA)의 검출에 기초한다.
질환을 검출하거나 모니터링하기 위해 광범위하게 다양한 바이오마커가 연구될 수 있다.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것으로서, 여기서 인시츄 평가는 면역학적 수단에 의해 수행된다.
상기 언급된 바와 같이, SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양은 생물학적 시료에서 인시츄로 평가되며, 이는 SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재 또는 양이 종양으로부터 기원하는 세포 상에서 직접 평가됨을 의미한다.
조직 생검이 사용될 때, 면역조직화학 기법을 수행하여 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 결정하는 것이 유리하다. 따라서, 보편적으로 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제와 같은 표지화 색원체와 커플링된 2차 항체와 커플링된 특정 항-SQSTM1/p62 항체가 사용된다. 면역세포화학 기법이 또한 수행될 수 있다.
액체 생검이 사용될 때, 시료에서 또는 유세포측정기를 사용함으로써 SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위해 형광단에 커플링된 특정 항-SQSTM1/p62 항체를 사용하는 것이 유리하다. 분비된 SQSTM1/p62는 또한 잘 알려진 기법, 예컨대 항-SQSTM1/p62 항체를 사용하는 ELISA 또는 프로테오믹 접근법에 의해 검출될 수 있다.
이들 기법은 당업계에 잘 알려져 있고, 세포에서 단백질을 식별하는 데 있어서 지식을 갖는 당업자는 연구될 시료의 유형에 따라 가장 적절한 기법을 사용할 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 종양을 앓고 있는 환자의 생존율을 바람직하게는 시험관내에서 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료에서 평가된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때, 환자는 5년 후에 80% 초과의 생존율을 가질 것임, 및
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 5년 후에 70% 미만의 생존율을 가질 것임.
본 발명의 또 다른 양태에서, 발명자들은 상기 개시된 바와 같이 단백질 SQSTM1/p62의 발현 수준을 측정하는 것만으로도 종양을 앓고 있는 환자의 생존율을 예측하는 것이 가능함을 확인하였다.
발명자들은 단백질 SQSTM1/p62의 발현 수준이 비-종양의, 더 일반적으로는 건강하지 않은 생물학적 시료에서 관찰된 상대 발현 수준 이하일 때, 시료가 수득된 개체는 5년에 걸쳐 80% 초과의 생존 가능성을 가질 것이라고 언급하였다. 대조적으로, 단백질의 발현 수준, 즉, 양이 기준 시료에서의 수준 초과일 때, 시료가 수득된 개체는 5년에 걸쳐 80% 미만의 생존 가능성을 가질 것이다.
따라서, 발명자들은 종양 내 SQSTM1/p62 단백질의 증가된 발현이 예를 들어 종양 면역 회피로 인해 종양의 중증도 및 이의 잠재적인 공격성의 특질임을 확인하였다.
따라서, 생물학적 종양 시료 내 SQSTM1/p62 단백질의 양의 변동량을 평가하는 것은 환자의 성과를 결정하고 환자에게 적절한 치료법을 제공하는 데 유용할 수 있다.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 관한 것으로서, 여기서
- PD-L1 단백질, 및
- T CD8 림프구
의 존재, 부재, 또는 양은 SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양에 동시적으로(concomitantly) 평가되고, 대조군 시료에서 평가된 각각의 PD-L1 단백질 및 T CD8 림프구의 존재, 부재, 또는 양과 비교되고, 그리고
상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62 단백질, PD-L1 단백질 및 T CD8 림프구가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 5년 후에 50% 미만의 생존율을 가질 것이다.
발명자들은 또한 유리하게는 PD-L1 단백질 및 T CD8 림프구의 양을 추가로 평가하는 것이 5년에 걸쳐 생존율의 예후를 개선하는 데 유용할 수 있음을 확인하였다. 실제로, T CD8 림프구의 증가와 더불어 SQSTM1/p62 및 PD-L1 단백질의 증가로 인해, 파티셔너(partitioner)는 5년에 걸쳐 종양의 불량한 성과를 예상하는 것이 가능하다. 따라서, 당업자는 가능하게는 다른 화합물과 연관된 항-PD-L1 항체를 사용하는 면역치료법과 같은 적절한 치료법을 제안할 수 있었다.
본 발명에서, 상기 언급된 환자는 DNA 손상제, 예컨대 시스플라틴, 도세탁셀, 옥살리플라틴, DNA/후생학적 약물(주목할 만하게는 DNA 메틸라제 저해제, 5-아자시티딘, 데시타빈, HDAC 저해제, 히스톤 메틸라제 저해제), 세포 주기 저해제(CDK4/6 저해제, 예컨대 팔보시클립(palbociclib)/PD-0332991, 아베마시클립(Abemaciclib) 및 리보시클립(ribociclib)/LEE011), 내재성 방어, IFN 방어 등으로 추가로 치료될 수 있다.
본 발명은 또한 종양을 앓고 있고 화학치료법 및/또는 면역치료법으로 치료된 환자의 생존율을 바람직하게는 시험관내에서 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료에서 평가된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때, 환자는 20개월의 치료 후에 10% 이하의 생존율을 가질 것임, 및
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 20개월의 치료 후에 50% 이상의 생존율을 가질 것임.
본 발명은 또한 종양을 앓고 있고 화학치료법 또는 면역치료법으로 치료된 환자의 생존율을 바람직하게는 시험관내에서 예측하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료에서 평가된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때, 환자는 20개월의 치료 후에 10% 이하의 생존율을 가질 것임, 및
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 20개월의 치료 후에 50% 이상의 생존율을 가질 것임.
본 발명의 또 다른 양태에서, 발명자들은 또한 종양을 앓고 있고 면역치료법 또는 화학치료법을 사용함으로써 치료된 환자의 생존율의 예측이 SQSTM1/p62 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있음을 확인하였다.
발명자들은 종양을 갖고 있고 면역치료법, 화학치료법 또는 둘 다로 치료된 환자가 기준 양보다 많은 양의 SQSTM1/p62를 갖고 있을 때, 환자는 20개월에 걸쳐 양호한 성과를 갖는다고 언급하였다. 그러나, SQSTM1/p62의 양이 기준 수준보다 적을 때, 환자는 20개월에 걸쳐 불량한 성과를 가질 것이다.
따라서, 성과를 증가시키려는 의도로 상기 환자의 종양 내 SQSTM1/p62의 발현을 보강하는 것이 가능하다. 벡터 치료법 또는 화학적 치료법은 SQSTM1/p62 단백질의 양을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 당업자는 이러한 단백질 발현을 보강하는 최상의 방식을 쉽게 결정할 수 있었다.
본 발명은 또한 염증을 수반하는 병태를 치료하기 위한 용도를 위한 조성물에 관한 것으로서, 조성물은
- SQSTM1/p62 단백질, 또는
- 상기 SQSTM1/p62 단백질을 코딩하는 핵산 분자;
를 관문 저해제에 대한 면역치료 항체 또는 조합 또는 화학치료제와 관문 저해제에 대한 면역치료 항체의 조합과 함께 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 염증을 수반하는 병태를 치료하기 위한 용도를 위한 조성물에 관한 것으로서, 조성물은 SQSTM1/p62 단백질을 화학치료제 또는 관문 저해제에 대한 면역치료 항체, 또는 둘 다와 함께 포함한다.
더욱이, 본 발명은 염증을 수반하는 병태를 치료하기 위한 용도를 위한 조성물에 관한 것으로서, 조성물은 상기 SQSTM1/p62 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 화학치료제 또는 관문 저해제에 대한 면역치료 항체, 또는 둘 다와 함께 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 염증을 수반하는 병태를 치료하기 위한 용도를 위한 조성물에 관한 것으로서, 조성물은 SQSTM1/p62의 이펙터 중 하나를 화학치료제 또는 관문 저해제에 대한 면역치료 항체, 또는 둘 다와 함께 포함한다.
본 발명에서, 염증을 수반하는 병태는 예를 들어 암을 수반하는 병태 및 자가면역 질환, 뿐만 아니라 감염일 수 있다.
더욱이, 본 발명은 염증을 수반하는 병태를 치료하기 위한 용도를 위한 조성물에 관한 것으로서, 조성물은 SQSTM1/p62의 이펙터 중 하나를 코딩하는 핵산 분자를 화학치료제 또는 면역치료 항체, 또는 둘 다와 함께 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 발명자들은 예상 밖으로, SQSTM1/p62 단백질의 증가된 발현이 염증 및 염증을 수반하는 병태의 발증 또는 진행을 유의하게 감소시킬 수 있음을 발견하였다.
상기 조성물은 단백질 그 자체, 특히 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열로 구성된 단백질, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 함유할 수 있다.
상기 언급된 핵산 분자는 서열 번호 2로 표시된 분자일 수 있다.
유리하게는, SQSTM1/p62 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 화학치료제 및/또는 면역치료 항체는 당업자에 의해 결정된 소정량의 투여량으로 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 분리된 또는 순차적인 용도는 단백질과 화학치료제 및/또는 면역치료 항체 사이의 상용성(compatibiltiy)에 의존할 것이다.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 용도를 위한 상기 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것으로서, 여기서 상기 염증을 수반하는 병태는 암, 특히 원발성 종양 또는 전이성 종양이다.
원발성 종양은, 종양 진행이 시작되었고 암성 덩어리를 생성할 정도로 진행된 해부학적 위치에서 성장하는 종양이다. 대부분의 암은 이의 원발성 부위에서 발증한다.
전이성 종양은 이것이 시작된 신체 부분(원발성 부위)으로부터 신체의 다른 부분으로 확산된 종양이다. 암세포가 종양으로부터 떨어져 나올 때, 이들 암세포는 혈류 또는 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 이동할 수 있다.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 용도를 위한 상기 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것으로서, 여기서 상기 암은 폐암, 신장암, 방광암, 두경부암, 자궁암, 흑색종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 거대 B 세포 림프종(Large B cell lymphoma), 메클 질환(Merkel disease), 간세포 암종 및 위장암, 바람직하게는 미소부수체 불안정성을 갖는 위장암(gastro-intestinal cancer with minisatellite instability)이다.
메클 세포 암종은 종종 사람의 얼굴, 머리 또는 목 상에서 통상적으로 살색 또는 청적색 결절로 나타나는 희귀 유형의 피부암이다. 메클 세포 암종은 피부의 신경내분비 암종이라고도 한다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다:
- SQSTM1 단백질, 또는 상기 SQSTM1 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 상기 단편,
- 관문 저해제에 대한 면역치료법을 유도하는 데 유용한 항체, 및
- 화학치료제.
본 발명에 따른 키트는 유리하게는 서열 번호 1로 표시된 SQSTM1 단백질, 또는 SQSTM1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 함유하고, 상기 핵산 분자는 유리하게는 서열 번호 2로 표시된 분자이다.
.
상기 정의에 따른 키트에서 상기 항체는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항-CTLA-4 항체이다.
유리하게는, 본 발명은 또한 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다:
- SQSTM1 단백질, 또는 상기 SQSTM1 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 상기 단편,
- 면역치료법을 유도하는 데 유용한 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체, 및
- 화학치료제.
유리하게는, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 키트에 관한 것으로서, 여기서 상기 화학치료제는 백금 화합물, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀 화합물을 함유하는 화학치료제, 또는 방사선치료법이다.
백금을 함유하는 화합물의 예는 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 페난트리플라틴, 사트라플라틴 또는 피코플라틴이다.
DNA 메틸라제 저해제, 5-아자시티딘, 데시타빈 HDAC 저해제, 히스톤 메틸라제 저해제와 같은 다른 화합물, 세포 주기 저해제(CDK4/6 저해제, 예컨대 팔보시클립/PD-0332991, 아베마시클립 및 리보시클립/LEE011), 내재성 방어, IFN 반응이 또한 사용될 수 있다.
방사선치료법은 암의 초기 병기에서 또는 암이 확산되기 시작한 후에 사용될 수 있다. 가장 보편적인 유형은 하기이다:
- 기계를 사용하여 방사선 빔(beam)을 종양에 신중하게 조사하는 외부 방사선치료법;
- 방사성 금속의 작은 조각이 종양 부근의 환자의 신체 내부에 (통상적으로 일시적으로) 놓인, 방사선치료법 임플란트(근접치료법(brachytherapy));
- 환자가 방사성 액체를 삼키거나 이를 환자의 혈액 내로 주사한 방사선치료법 주사액, 캡슐, 또는 드링크제(방사성동위원소 치료법); 및
- 방사선이 유방암 수술 동안 종양에 직접 전달되는 내부빔(intrabeam) 방사선치료법.
방사선치료법에 사용되는 방사선의 양은 그레이(Gy)로 측정되고, 치료중인 암의 유형 및 병기에 따라 달라진다. 고형 상피 종양에 대한 전형적인 선량은 치유적 사례의 경우 60 내지 80 Gy인 한편, 림프종은 20 내지 40 Gy로 치료된다.
예방적 선량은 전형적으로 약 45 내지 60 Gy이고, 1.8 내지 2 Gy 분할된다(유방, 머리 및 목 암의 경우). 환자가 화학치료법을 받고 있는지의 여부, 환자 중복이환(patient comorbidity), 방사선치료법이 수술 전에 또는 후에 투여되고 있는지의 여부, 및 수술 성공의 정도(degree)를 포함한 많은 다른 인자가 선량을 선택할 때 방사선 종양학자에 의해 고려된다.
본 발명은 하기 도면 및 아래 실시예의 측면에서 더 잘 이해될 것이다.
본 발명은 또한, 종양을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료에서 평가된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62 단백질이 존재하거나 대조군 시료에서 수득되는 양 이상일 때, 면역치료법, 바람직하게는 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법은 화학치료법, 특히 DNA 손상 유도제와 연관되어 또는 연관되지 않은 채 환자에게 투여됨; 및
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 부재하거나 대조군 시료에서 수득되는 양 미만일 때, 면역치료법, 바람직하게는 면역 관문 저해제에 대한 면역치료법은 탁산-기초(taxane-based) 화학치료법의 구성원과 연관되어 환자에게 투여됨.
본 발명은 또한 종양 세포가 SQSTM1/p62 단백질의 발현을 갖거나 대조군 시료보다 더 많은 양의 SQSTM1/p62 단백질을 갖는 종양을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 용도를 위한, 가능하게는 화학치료제와 연관된 적어도 하나의 면역치료 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 종양 세포가 SQSTM1/p62 단백질의 발현을 갖거나 대조군 시료보다 더 적은 양의 SQSTM1/p62 단백질을 갖는 종양을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 용도를 위한, 탁산과 연관된 적어도 하나의 면역치료 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다시 말해, 본 발명은 SQSTM1/p62 단백질을 발현하지 않는 종양 또는 대조군 조직 내 SQSTM1/p62 단백질의 수준보다 낮은 수준에서 SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 종양을 치료하기 위한 용도를 위한, 탁산과 연관된 면역치료 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
특정 암을 치료하기 위해 사용되는 상기 언급된 조성물은 바람직하게는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-CTLA-4 항체를 함유한다. 이는 또한 상기 기재된 치료 방법에 적용된다.
다시 말해, 본 발명은 SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 종양 또는 대조군 조직 내 SQSTM1/p62 단백질의 수준보다 높은 수준에서 SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 종양을 치료하기 위한 용도를 위한, DNA 손상-유도제와 연관된 면역치료 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도 1 내지 도 3: 암 치료법에 대한 내성은 DNA 손상 수선 시그너처 및 "콜드" 면역원성 프로파일을 공유한다
[도 1] 도 1은 암 게놈 아틀라스 데이터베이스(TCGA, PanCancer Atlas, 상단) 및 상응하는 히트맵(하단)으로부터 콜드 인간 흑색종(SKCM)(CD8A에 대해 음성이고 HLA-B 전사물 수준에 대해 음성임)에서 DNA 수선의 유전자 세트의 유의한 활성화가 존재함을 보여주는 GSEA 분석을 나타낸다. 핵심 색상: 밝은 회색 및 짙은 회색은 저발현 및 고발현에 각각 상응한다.
[도 2] 도 2는 시스플라틴 내성 비소세포 폐암(NSCLC, 반응자 - R, 비-반응자 - NR, GEO, 전향적 연구)에서 DNA 수선의 유전자 세트의 유의한 활성화 및 동종이식편 거부의 저해, 백혈구 매개 세포독성 유전자세트를 보여주는 GSEA 플롯을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 ICI 내성 흑색종에서 DNA 수선 및 세포 주기 관문 유전자세트의 유의한 농축(enrichment)을 보여주는 GSEA 및 박스-플롯 분석을 나타낸다(항-PD-1, NR, cBioportal, https://portals.broadinstitute.org/ single-cell/ study/melanoma-immunotherapy-resistance#study-visualize, GSE115978).
도 4 내지 도 9: SQSTM1/p62는 면역치료법에 대한 반응의 강력한 예측자이다.
[도 4] 도 4는 SQSTM1이 "ICI에 대한 반응", "RT에 대한 반응"(RT: 방사선치료법) 및 "NF-kB 신호전달" 시그너처(GSEA, KEGG) 사이에서 차별적으로 발현된 유전자의 벤다이어그램의 교차점에 있음을 나타낸다.
[도 5] 도 5는 p62/SQSTM1의 구조 및 상호작용 파트너를 나타낸다. SQSTM1은 자가포식 머시너리와의 상호작용, 및 세포 사멸, 염증, DNA 수선 및 궁극적으로 암에 관여하는 신호전달 경로와의 상호작용에 필요한 다수의 도메인으로 이루어진다. PB1 Phox 및 Bem1; ZZ 아연 핑거; RIR 랩터 상호작용 영역; TBS Traf6 결합 부위; LIR Lc3 상호작용 영역; KIR Keap1 상호작용 영역; UBA Ub-연관; NLS 핵 위치화 신호; NES 핵 외수송 신호.
[도 6] 도 6은 암 게놈 아틀라스 데이터베이스(TCGA, PanCancer Atlas)로부터 인간 흑색종(SKCM) 및 폐암(LUAD)에서 SQSTM1 전사체 수준과 양성적으로 그리고 음성적으로 상관관계가 있는 항원 제시 및 DNA 수선 시그너처의 GSEA 플롯을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 ICI 반응자(R) 대 비-반응자(NR) 사이에서 가장 차별적으로 발현된 신호전달 스캐폴드 단백질의 목록을 나타낸다. 삽입도 ICI 반응자(R) 대 비-반응자(NR)에서 SQSTM1 mRNA 발현의 박스플롯이다(항-PD-1, 조정된 p-값, 흑색종, GSE115978).
[도 8] 도 8은 SQSTM1 고(H) 대 저(L)에서 그리고 SQSTM1 고/PD-L1 고/CD8 고(HHH) 대 면역치료법으로 치료된 다른 환자군에서 질환-특이적 생존율(DSS) 곡선을 보여주는 카플란-마이어 플롯을 나타낸다.
[도 9] 도 9는 LUAD 종양 섹션에서 SQSTM1, PD-L1 및 CD8 양성 및 음성 IHC 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 단일 SQSTM1 검정은, 면역치료법에 반응하는 "위음성"(고 SQSTM1 발현) 사례와 PD-L1 발현 평가 단독으로 관찰된 "위양성" 사례(콜드 미세환경 및 낮은 SQSTM1 발현을 갖는 비-반응자)를 정확하게 구별할 수 있었음을 주목한다.
도 10 내지 도 16: SQSTM1 결실은 "콜드" 표현형 및 DDA 내성을 유도하기에 충분하다.
[도 10] 도 10은 높은 그리고 낮은 SQSTM1 발현을 각각 갖는 190개의 폐암 세포주에 걸쳐 '핫' 표현형[CD274, 항원 제시(하단 좌측)], 시스플라틴/RT 감수성(RT 방사선치료법) 및 DNA 수선(하단, 좌측, 우측)과 연관된 유전자 세트의 유의한 농축을 보여주는 히트맵(상단) 및 상응하는 GSEA 프로파일을 나타낸다. 밝은 회색 및 짙은 회색은 저발현 및 고발현에 각각 상응한다.
[도 11] 도 11은 2개의 독립적인 SQSTM1 shRNA(SQSTM1 #1 및 #2 대 대조군 shRNA)와 함께 shRNA 넉다운(knockdown) 후 SQSTM1 단백질 수준에서 효율적인 저하를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 그 후에, SQSTM1 결실에 대한 A549 폐암 세포 반응을 HLA-B 및 DNA 수선에 관하여 검사하였다(RAD51 및 P-Thr68-CHK2 WB);
[도 12] 도 12는 shRNA 넉다운 후 케모카인 발현(CXCL10, IL29)을 나타낸다. A549 발현 대조군 또는 SQSTM1 shRNA, 뿐만 아니라 SQSTM1 플라스미드(구제(rescue)를 위해, #2 + SQ)로 형질주입된 shSQSTM1 세포에서의 유전자 발현을 qRT-qPCR에 의해 측정하였다. 유사한 결과는 3개의 독립적인 실험에서 관찰되었다.
[도 13] 도 13은 shRNA 넉다운 후 MHC-I 발현(HLA-A-C, qRT-PCR)을 나타낸다. A549 발현 대조군 또는 SQSTM1 shRNA, 뿐만 아니라 SQSTM1 플라스미드(구제를 위해, #2 + SQ)로 형질주입된 shSQSTM1 세포에서의 유전자 발현을 qRT-qPCR에 의해 측정하였다. 유사한 결과는 3개의 독립적인 실험에서 관찰되었다.
[도 14] 도 14는 SQSTM1 shRNA 넉다운 후 A549 세포 생존력(시스플라틴 용량-반응, IC50, Cis: 시스플라틴 5일)을 나타낸다.
[도 15] 도 15는 DDA 처리(Cis: 시스플라틴, 10 μM, Oxa: 옥사플라틴, 1.4 μM, Dox: 독소루비신, 50 nM, RT: 이온화 방사선, 10 Gy, 5일)에 반응한 HLA-B(좌측) 및 PD-L1(우측) 유전자 발현을 나타낸다.
[도 16] 도 16은 대조군, SQSTM1 또는 ATG5 shRNA로 형질주입된 A549에서 MHC-I(A-C, 상단, 유세포측정법) 및 PD-L1 세포-표면 발현(하단, 유세포측정법)을 나타낸다. 유사한 결과는 3개의 독립적인 실험에서 관찰되었다. HLA-B 및 PD-L1 발현의 최대 증강은 시스플라틴에 의해 달성되었고, 이는 다른 실험에 대해 선택되었다.
[도 17] 도 17은 DDA 내성에 미치는 SQSTM1 결실의 결과를 나타낸다. 지시된 DDA(N=3)로 5일 처리한 후 sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포에서 크리스탈 바이올렛 세포독성 검정(우측)으로부터의 IC50 농도이다.
도 18 내지 도 22: DNA 손상제는 PD-L1/MHC-I의 후기(late) 발현을 SQSTM1-의존적 방식으로 유도한다.
[도 18] 도 18: sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포를 10 μM의 시스플라틴으로 처리하였다. 지시된 시기에, 전반적인 DNA 손상(A)을 53BP1 초점 형성(focus formation)에 의해 측정하였다(우측 면역형광 염색, 53BP1 레드, Dapi, 청색. 좌측, 5개 초과의 반점(spot)을 갖는 세포 백분율).
[도 19] 도 19: 시스플라틴-처리 A549 세포에서 TBK1 및 JAK 경로의 SQSTM1-의존적 활성화이다. 세포를 용해시키고, TBK1 및 JAK 경로의 활성화를 항-포스포-Ser172-TBK1(P-TBK1) 및 항-포스포-Tyr701-STAT1(P STAT1)과 함께 WCL의 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다. 튜불린 및 TBK1은 로딩 대조군으로서 사용되었다(N=3).
[도 20] 도 20: I형 및 III형 인터페론의 상대 발현(좌측, 5일 - 5d, N=3), 및 IL29 발현의 동역학(kinetic)을 qRT-PCR에 의해 측정하였다(우측, N=3).
[도 21] 도 21: 시스플라틴-유도 HLA-B mRNA(좌측, qRT-PCR, N=3), 단백질(중간, 상부: 웨스턴 블롯, 하단: 튜불린으로 정규화된, ImageJ에 의한 밀도측정(densitometry)에 대한 배수 변화, N=4), 및 세포 표면 발현(유세포측정법, 우측, N=3)의 시간 경로이다. 형광 강도 중앙값(MFI) 및 양성 세포의 %가 제시된다.
[도 22] 도 22: 시스플라틴-유도 PD-L1 mRNA(좌측, qRT-PCR, N=3), 단백질(중간, 상부: 웨스턴 블롯, 하단: 튜불린으로 정규화된, ImageJ에 의한 밀도측정에 대한 배수 변화, N=4), 및 세포 표면 발현(유세포측정법, 우측, N=3)의 시간 경로이다. 형광 강도 중앙값(MFI) 및 양성 세포의 %가 제시된다.
도 23 내지 도 24: 시스플라틴은 SQSTM1과 독립적으로 세포 주기 정지 및 DNA 메틸화를 유도한다.
[도 23] 도 23: 시스플라틴-처리 sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포(10 μM, qRT-PCR; N = 3)에서 CDKN1A,및 DNMT1 유전자 발현이다.[도 24] 도 24: DNA 수선 시그너처, 세포 주기 및 DNA 메틸화와 ICI 반응을 상관관계 짓는 GSEA 및 박스-플롯 분석이다(항-PD-1, cBioportal, https://portals.broadinstitute.org/singlecell/study/melanoma-immunotherapy-resistance#study-visualize).
도 25: 면역원성 세포 사멸(ICD) 유도제는 HLA-B 및 PD-L1 발현을 SQSTMI-의존적 경로로 상향조절한다.
[도 25] 도 25: shSQSTM1 A549 세포는 ICD 유도제(방사선치료법, 10 Gy; Doxo, 50 nM)로 처리되었다. DDA-처리 sh대조군 및 shSQSTM1 A549(시간 경로; N = 3)에서 DNMT1, IFNL2/IL29, PD-L1 및 HLA-B의 qRT-PCR 발현이다.
도 26: 시스플라틴은 HLA-B 및 PD-L1 발현을 TBK1 및 JAK-의존적 방식으로 유도한다.
[도 26] 도 26: sh대조군 A549 세포는 TBK1 저해제 MRT 67307(10 μM) 또는 JAK1/JAK2 저해제 룩솔리티닙(5 μM)의 존재 또는 부재 하에 10 μM의 시스플라틴으로 처리되었다. 좌측, 포스포-TBK1, 및 포스포-STAT1 웨스턴 블롯(5일). 우측, IL-29, HLA-B 및 PD-L1의 qRT-PCR 발현이다(시스플라틴 처리 세포에 상응하는 100%(우측 패널; N=2)).
도 27 내지 도 28: IFN은 SQSTM1-결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현의 상향조절을 구제한다.
[도 27] 도 27은 자가포식 결함이 IFN 감수성을 증가시킴을 나타낸다. SQSTM1, ATG5 또는 ATG7 넉다운 A549 세포는 IFNG(50 ng/ml)에 의해 1시간 또는 24시간 처리되었다. 포스포-STAT1 및 IDO1의 웨스턴 블롯이다(액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었음, 좌측). PD-L1 발현은 PD-L1 발현의 qRT-PCR 및 세포 표면 염색에 의해 분석되었다(우측).
[도 28] 도 28은 시스플라틴(5d) 및 IFN(24h) 후의 포스포-TBK1, 포스포-STAT1, HLA-B 및 PD-L1 웨스턴 블롯을 나타낸다(TBK1은 로딩 대조군으로서 사용되었음; 우측 패널; N=3).
* < P 0.05 비모수 T-검정(만-휘트니)
도 29 내지 도 30: 도세탁셀은 SQSTM1-결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현을 유도한다.
[도 29] 도 29는 도세탁셀-처리 sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포(5 nM, qRT-PCR, N=2)에서 CDKN1A/p21, DNMT1, IFN-III, HLA-B 및 PD-L1의 상대 발현을 나타낸다.
[도 30] 도 30은 시스플라틴- 및 도세탁셀 처리 세포(5 nM, 5일, 액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었음)의 포스포-TBK1, 포스포-STAT1 및 HLA-B, 웨스턴 블롯을 나타낸다.
[도 31] 도 31은 SQSTM1 염색(원래 배율 × 400)의 대표적인 이미지를 나타낸다. 피부 흑색종은 증가된 세포질 및 핵 SQSTM1 염색 패턴을 보여준다.
실시예
실시예 1
최근 면역 관문 저해제(ICI)의 등장 후, 임상 암 시험의 난제는 ICI와 DNA-손상제(화학치료법 및 방사선치료법으로서 이하 DDA로 명명됨)의 최적의 조합을 개발하는 것이다. 내성 기전을 규명하는 것은 ICI 효율을 향상시키기 위한 새로운 예측 바이오마커 및 새로운 치료 접근법을 제안하는 데 필수적이다. 발명자들은 DDA 및 ICI에 대한 내성이 부분적으로는 내인성 종양 기전에 의해 매개되고, 이들 기전 중 일부는 공유될 수 있다고 가정하였다. 3개의 상보적인 접근법(인실리코(in silico), 환자 코호트 상에서 생체외, 및 시험관내)을 통해, 발명자들은 p62/SQSTM1 스캐폴드 단백질을 DDA 및 ICI에 대한 감수성을 예측하고 제어할 수 있는 핵심 분자 매개자로서 확인한다. 기계론적으로, DNA 손상에 반응하여, 발명자들은 SQSTM1이 DNA 수선의 저해에 필수적임을 발견하였다. SQSTM1-결실 종양 세포를 도세탁셀로 처리하는 것은 IFN 및 MHC 경로를 구제하여, 비-반응자에서 콜드 종양을 핫 종양으로 변화시키는 유망한 치료적 방안을 제공할 수 있다. 그러므로, 발명자들은 ICI 효능 및 환자 성과를 증가시키는 것을 목표로 SQSTM1을 이의 수준에 따라 ICI 단독, ii) 시스플라틴과 조합된 ICI, iii) 또는 도세탁셀과 조합된 ICI 사이에서 치료 결정을 안내하기 위한 예측 바이오마커로서 제안한다.
결과
발명자들은 교차-내성(cross-resistance)을 매개할 수 있는 공유된 분자 경로를 확인하기 위해 방사선치료법, 화학치료법 및 면역치료법으로 치료된 환자 코호트로부터 RNA 발현 시그너처를 비교하였다. 발명자들은 세포독성 T 림프구(CTL) 마커 CD8A와 CD8B, 면역 관문 유전자 CD274/PD-L1(이하 PD-L1로 지칭됨), 및 부류-I MHC 유전자(HLA-A, B, C)의 발현에 기초하여 종양을 면역 "핫" 및 "콜드"로 분류하였다. CD8+ T 세포의 농축을 2개의 세포용해성 효소인 그랜자임 B(GZM B) 및 퍼포린(PRF)의 존재에 의해 추가로 확증하였다.
1) DDA 전략과 ICI 전략 사이에서 교차-내성의 증거
면역치료법에 적격인 2개의 악성물인 폐 선암종, 및 흑색종의 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은, 콜드 종양의 2개 특질인 종양-침윤성 림프구(TIL)가 결여되었고 더 낮은 수준의 MHC-I을 발현한 사례가 DNA 수선 마커를 과발현하였음을 강조한다(도 1). 마찬가지로, 범암(pan-cancer) 분석은 다양한 종양 유형에 걸쳐 DNA 수선 시그너처와 "콜드" 종양 표현형의 연관성을 뒷받침하였다(FDR < 0.01, 데이터는 제시되지 않음). 주목할 만하게는, 이러한 더 높은 DNA 수선 시그너처는 대부분의 콜드 종양의 일관된 특징이었다. 게놈 안정성의 유의한 공급원으로서, 더 높은 DNA 수선-종양은 더 낮은 종양 돌연변이 부담(TMB)과 상관관계가 있는 경향이 있는데, 낮은 항원성이 있었고 ICI의 불량한 임상적 유익성의 3개의 예측성 바이오마커, T 세포-염증 종양 미세환경이 결여되어 있기 때문이다. 이러한 축적되는 증거를 고려하여, 발명자들은 i) 더 높은 DNA 수선이 ICI 치료법에 대한 환자를 최적으로 선택하는 또 다른 기회를 제시할 수 있음을 제안한다. 현재까지, DNA 수선 결함으로부터 발생하는 매우 작은 분율의 암이 ICI 치료법에 반응성인 것으로 발견되었다. 현재, 임상적으로 유의한 분율의 암이 DNA 수선 결함을 갖는 것으로 보인다. ii) 또한, 추론하자면, 면역억제된 콜드 종양은 DNA 수선에 내인성적으로 커플링되고 이로써 "핫" 종양보다 DDA에 대한 열등한 반응과 연관이 있는 것으로 예상될 것이다.
따라서, 발명자들은 핫/콜드 시그너처와 커플링된 DNA 수선이 3개의 치료 옵션인 화학치료법, 방사선치료법 및 면역치료법에 대한 임상 반응을 예측하는 데 적용될 수 있는지의 여부를 분석한다. 대신에, 유전자 발현에 기초한 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)은 LUAD(도 2)와 다른 암 유형의 독립적인 확증 코호트(데이터는 제시되지 않음) 둘 다에서 면역치료법 반응을 결정하는 3개 특징인 시스플라틴-감수성 및 방사선치료법(RT)-감수성 암 내에서 핫 시그너처(T-세포 마커 및 MHC-I)의 농축을 밝혀내었다. 대조적으로, 면역 결함성 '콜드' 시그너처는 DDA-내성 종양의 공유된 특징이며, 항종양 면역력이 시스플라틴/RT의 임상 활성에 중요함을 고도로 시사한다. 흥미롭게도, 발명자들은 DNA 수선 시그너처와 ICI 내성의 유의한 상관관계의 최초 증거를 제공한다(도 3). 추론하자면, 이러한 반복적인 임상적 상관관계는 DDA를 ICI와 조합하여 ICI/DDA 감수성 환자의 성과를 향상시키는 근거를 제공한다. 이러한 맥락으로, 시스플라틴/RT에 불응성인 환자의 하위군 또한 교차-내성을 획득하여, 2차 면역치료법으로부터의 유익성을 저하시킬 것이다. 이러한 공격적인 내성 종양 표현형을 설명하는 매력적인 가능성은 종래의 DDA에 대한 내성을 매개하는 것으로 알려진 높은 DNA 수선 경로가 또한 면역치료법에 대한 감소된 반응에 기여할 것임을 고려하는 것일 수 있다.
2) SQSTM1/p62는 ICI/DDA 민감도의 유망한 바이오마커이다
콜드 및 DNA 수선 시그너처의 공동발현은 ICI 및 DDA에 대한 반응이 종양 교차-내성을 촉진하는 데 긴밀하게 커플링되어 있을 뿐만 아니라 동일한 신호전달 경로에 의해 제어되는 경향이 있음을 시사한다. 그 후에, 발명자들의 전략은 콜드/핫 표현형 사이에서 차별적으로 발현되었고 가장 중요하게는 조합 ICI/DDA에 대한 민감도와 상관관계가 있는 신호전달 스캐폴드를 인실리코에서 확인하는 것이었다(도 4). 스크리닝된 잠재적인 신호전달 플랫폼으로부터, 발명자들은 스캐폴드 단백질 SQSTM1에 대한 관심에 초점을 맞추기로 결정하였는데, 그 이유는 다음과 같다: i) 이것이 염증, DNA 수선, 및 세포 사멸 경로의 몇몇 신호전달 파트너를 결합(docking)시킴으로써 신호를 세포 표면으로부터 핵으로 통합하고 전달하는 것을 돕는다(도 5). ii) 흥미롭게는, 이의 발현은 폐 선암종 및 흑색종에서 항원 제시와 양성적으로 상관관계가 있고 DNA 수선 시그너처(p = e-9)와 역의 상관관계가 있었다(도 6). iii) SQSTM1은 DDA 민감성-종양에서 가장 고도로 농축된 플랫폼인 반면, 이는 내성-종양에서는 그렇지 않다(데이터는 제시되지 않음). iv) 발명자들은 흑색종의 단일-세포 RNA-seq를 사용하여 비-반응자와의 비교 시 ICI 반응자에서 SQSTM1 과발현의 최초 증거를 제공한다(p = e-62)(도 7). 차단성 PD-1을 이용하는 1차(펨브롤리주맙) 또는 PD-1(니볼루맙) 면역치료제를 이용하는 2차로 치료된 진행성 LUAD 환자(IIIA기 내지 IV기, 진행중에 있음)의 2개의 독립적인 코호트를 사용함으로써 확증되었고(도 8), 여기서 IHC에 의한 SQSTM1/p62의 높은 검출은 또한 ICI 민감도와 상관관계가 있었다(p<0.0001). 놀랍게도, 낮은 SQSTM1 발현은, 낮은 CD8 T 림프구 침윤을 보여주었고 면역치료법에 반응하는 데 실패한 PD-L1 "위양성" 종양의 하위세트(8명의 환자, 10.4%)를 확인하기에 충분하였다(도 9). 전반적으로, 발명자들의 결과는 단독치료법으로서 ICI, DDA 및 잠재적으로 ICI + DDA 조합(진행중에 있음)에 대한 민감도를 예측하는 데 있어서 종양 SQSTM1의 임상적 활용성을 시사한다.
3) SQSTM1은 DDA-유도 독성 및 증강된 항원 제시에 필수적이다
상기 임상 결과를 고려하여, 발명자들의 연구 가설은 SQSTM1/p62의 발현이 ICI 및 DDA에 대한 교차-반응을 결정할 것이라는 것이다. CCLE로부터의 190개의 폐암 세포주의 패널을 사용하여, 발명자들은 최초로 GSEA에 의해, SQSTM1의 종양-세포-내인성 발현이 항원 제시와 양성적으로 상관관계가 있고 DNA 손상 수선 및 DDA/ICI 내성 유전자 시그너처와 역의 상관관계에 있음을 확인하였다(도 10). 이러한 맥락에서, SQSTM1의 발현은 ICI 및 DDA에 대해 내성인 가장 공격적인 암 유형 중 하나인 소세포 폐암 세포주(SCLC, p-값 = 6 e-16)에서 최저라는 점에 주목할 만하다(도 10 우측). 그 후에, 발명자들은 SQSTM1과 항암 치료법에 대한 교차-감수성 사이의 인과 관계를 평가하였다. 세포 모델로서, 발명자들은 원발성 ICI 내성과 연관된 2개의 분자 사건인 KRAS G12S 종양유전자(oncogene), 및 SKT11/LKB1 종양 억제자 유전자(Q37*)의 소실을 보유하는 한편 화학치료법에 감수성인 폐 선암종으로부터 유래된 A549 세포주를 선택하였다. 실험적으로, A549 세포에서 shRNA에 의한 SQSTM1 넉다운(도 11)은 인실리코에서 충실하게 관찰된 중증 표현형을 반복하기에(recapitulate) 충분하였고; mRNA 수준과 HLA-B 단백질 수준 둘 다에서(도 11) 케모카인 CXCL10, IFN-III IL29(도 12), 및 MHC-I(HLA-A, B, 및 C 도 13)의 하향조절에 의해 입증된 바와 같았다. 이 시나리오에 따라, SQSTM1의 재발현은 케모카인 및 HLA-B의 발현을 복구시켰다(도 12 및 도 13). 이전 관찰과 일치하게, SQSTM1의 침묵화는 DNA 수선 마커인 RAD51의 발현, 및 DNA 수선을 용이하게 하기 위해 세포 주기 진행을 지연시키는 관문 키나제 2(CHK2)의 인산화를 증가시키기에 충분하였다(도 11).
따라서, 발명자들은 ICI를 이용한 임상 시험에서 많은 FDA-승인 화학치료제에 대한 SQSTM1-결실 세포의 감수성을 조사한다. 백금 처리(시스플라틴, Cis) 시, ShSQSTM1 세포는 대조군 ShC 세포의 대량 사멸(IC50 24 ± 1.4 μM, 도 14)과 비교하여 일관되게 내성이었다(IC50 51 ± 5.3 μM로서, 대조군 ShC 세포의 2배임). 준치사(sublethal) 용량(10 μM)에서, 발명자들은 Cis가 ShC 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 mRNA의 강력한 과발현을 유도하였음을 관찰하였고(각각 60배 내지 37.8배 증가; 도 15) 세포 표면에서 MHC-I(HLA-A, B, C) 및 PD-L1의 증강된 존재에 의해 반영되었다(도 16). 시스플라틴의 내성과 전체적으로 일치하여, SQSTM1의 결실은 Cis-상향조절된 HLA-B 및 PD-L1 발현을 취소시켰다(도 15 및 도 16). 개념 증명으로서, 모든 이들 특징(즉, DDA 내성 및 저하된 HLA/PD-L1 발현)은 상이한 DNA 손상제, 예컨대 안트라사이클린(독소루비신, Dox, 50 nM), 옥살리플라틴(Oxa, 1.4 μM) 및 방사선치료법(RT, 10 Gy)을 사용하여 반복되었다(도 15 및 도 17).
SQSTM1이 스캐폴드 단백질과 선택적 자가포식 수용체 둘 다로서 기능한다는 점을 고려하여; 발명자들은 ATG5 shRNA에 의한 자가포식 저해(도 16) 또는 약물학적 bafA1 또는 클로로퀸 처리(데이터는 제시되지 않음)가 SQSTM1 결핍에 의해 유도된 표현형을 반복하지 않았으나 대신에 HLA-B 및 PD-L1의 증강된 발현을 유발하였음을 발견하였다. 더불어, 이들 결과는 암 치료법에 대한 내성이 적어도 부분적으로는 종양 세포의 내인성 특성이라는 언급을 나타낸다. 분자 수준에서, 이들 결과는 자가포식 경로보다는 SQSTM1 신호전달 스캐폴드가 DDA-유도 독성, HLA-B, 및 면역치료법에서 표적화되는 핵심 면역 관문 단백질인 PD-L1 발현에 중요함을 확립한다. 종합하자면, 이는 ICI/DDA 교차 반응에서 SQSTM1의 부가 기능을 밝혀내었다.
4) SQSTM1은 Cis에 의한 IFN/PD-L1/MHC-I의 후기 상향조절에 절대적으로 필요하다.
다음으로 발명자들은 SQSTM1의 소실이 DDA-유도 반응에 어떻게 영향을 미치는지 평가하였다. 직접적인 세포독성 효과 외에도, DDA의 치료 작용은 세포기질 내로의 DNA의 방출에 의존할 수 있고, 이는 DNA 바이러스로서 인식되고 있으며 16시간째에 초기 IFN 반응(IFN, HLA-B 및 PD-L1)을 프라이밍하는 것으로 제안되었다.
예상된 바와 같이, DDA는 CHK2의 인산화(데이터는 제시되지 않음) 및 53BP1-양성 초점의 형성(도 18)에 의해 시각화된 바와 같이 DNA 손상을 신속하게 유도하였고, 이는 6시간의 시스플라틴 처리 후 시작되었고, 16시간째에 피크값에 유사하게 도달한 다음, 하락하였다. 예상 밖으로, DDA-처리 ShC 세포에서, TBK1 및 STAT1의 인산화(도 19) 뿐만 아니라 IFN-I 및 IFN-III의 발현은 DNA 손상과 일치하지 않았으나, 이후에 제3일의 처리 즈음 시작되었다(도 20). 다운스트림에서, DDA-유도 HLA-B와 PD-L1 mRNA(우측) 및 단백질(중간 및 좌측) 발현의 동역학은 IFN을 따랐으며, 이는 제5일 즈음에 안정기(plateau) 값에 도달하였다(도 21 및 도 22). 본원에서 또한, 포스포-TBK1, IFN, HLA-B 및 PD-L1 발현의 DDA 상향조절은 SQSTM1의 부재 시 시간 경로 전반에 걸쳐 실패하였다(도 19 내지 도 22). 이러한 관찰은 발명자들로 하여금 DNA 손상과 면역원성 반응 사이에서 SQSTM1에 의해 제어되는 분자 경로를 확인하도록 촉구하였다.
이러한 동역학 불일치는 후기 IFNs/HLA-B/PD-L1 경로의 개시 시 초기 dsDNA의 주요 역할에 대한 논쟁 거리이다. 이는 LKB1/STK11에서 DNA 센서 STING의 침묵화와 일치하여 A549 세포를 돌연변이화시켰고 대신에 대안적인 SQSTM1-의존적 DAMP를 시사하였다.
5) SQSTM1 및 DNA 손상제.
놀랍게도, 발명자들은 세포 주기 저해제 CDKN1A/p21의 초기 유도가 대조군과 SQSTM1-결실 세포 둘 다에서 DDA-유도 DNA 손상(핵 초점, 도 18)을 충실히 추적하였음을 관찰하였다(도 23). 더불어, 이는 SQSTM1이 DNA 손상 반응의 초기 첫 단계에 필요하지 않으며 DSB 형성 및 세포 주기 정지 후에 작용함을 확인시켜 준다.
최근, 세포 주기 정지 및 DNA 탈메틸화를 유도하는 약물이 암세포에서 IFN/MHC-I/PD-L1 발현을 안내한다는 전임상 연구가 거의 이루어지지 않았다. 이러한 가설을 뒷받침하기 위해, 인실리코 분석에서 ICI 반응은 DNA 메틸라제의 발현과 역의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(도 24). PD-L1 발현을 상향조절하는 것으로 보고된 후생학적 조절제 패널(DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, LDS1, SETD1, TRIM28/KAP1, EZH2) 중에서 DNMT1의 발현만이 1일의 Cis 처리 시 초기에 감소한 한편, 다른 것들은 중간 또는 가변적인 반응을 보여주었다(도 23). 개시 사건으로서 DDA-매개 DNMT 하향조절을 뒷받침하기 위해, DNMT1을 저해하는 탈메틸화제인 5-아자시티딘(500 nM, 5-아자)에 의한 A549 ShC 세포의 처리는 HLA-B 및 PD-L1의 후기 발현을 반복하였다(5일 및 6일). 이 사건은 IFN-III IL28의 재활성화(5일)에 의해 일관되게 선행되었다
주목할 만하게는, SQSTM1의 부재 시, 발명자들은 시스플라틴 처리 시 CDKN1A/p21 및 DNMT1 발현의 유사한 하향조절을 관찰하였다(도 23). 그러나, 이는 P-TBK1/IFN/p-STATI로부터의 전체 다운스트림 경로의 활성화로 이어지지 않았다(도 19). 비정상적인 신호 전달과 일치하여, SQSTM1-결실 세포는 시스플라틴에 반응하여 mRNA, 단백질, 및 HLA-B와 PD-L1의 세포 표면 발현을 상향조절하지 않았다.
시스플라틴 외에도, 그 후 발명자들은 방사선치료법, 옥살리플라틴 및 독소루비신과 같은 다양한 면역원성 세포 사멸(ICD) 유도제로 이 경로의 후기 유도를 반복하였다. ICD 유도제와 상관없이, 이들은 이 경로가 전적으로 SQSTM1에 의존함을 보여주었다(도 25). 따라서, 이들 데이터는 DNA 손상제-유도 PD-L1/MHC-I 발현에 대한 SQSTM1의 신규의 전반적인 역할을 나타낸다.
6) DDA는 TBK1-IFN-JAK 경로의 활성화를 통해 HLA-B 및 PD-L1 발현을 유도한다
발명자들은 시스플라틴이 IFN의 전사에 관여하는 키나제인 TBK1의 인산화를 유도하였음을 보여준다. 일관되게는, 이들은 mRNA 수준에서 IFN-III을 검출하고, Cis와 TBK1 저해제 MRT 67307의 공동처리는 JAK/STAT 저해제 룩솔리티닙과 마찬가지로 IFN/HLA B/PD-L1을 유도하는 시스플라틴 능력을 차단하기에 충분하였다(도 26). . 전체적으로, 발명자들의 데이터는 준치사 용량 DDA가 I형 IFN이 아니라 III형 IFN의 발현을 유도할 수 있고, 뒤이어 HLA-B 및 PD-L1의 다운스트림 발현을 JAK-의존적 방식으로 유도할 수 있음을 시사한다.
7) IFN은 SQSTM1- 결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현의 상향조절을 구제한다.
그 후에, 발명자들은 IFNG의 첨가가 shC 및 shSQSTM1 세포에서 STAT1 인산화, HLA-B 및 PD-L1 발현을 유도함을 확인하였고, 이는 IFN 경로가 SQSTM1-결실 세포에서 기능적임을 나타내었다(도 27 및 도 28). 흥미롭게도 발명자들은 IFNG에 반응하여 ISG(IDO-1, HLA-B 및 PD-L1)의 발현이 Shc와 비교하여 SQSTM1-결실 세포에서 더 높다는 것을 관찰하였다. 이 패턴은 적어도 부분적으로는 IFN-자극 shATG5 및 ShATG7에서 반복되었고, 이는 자가포식-결핍 세포가 더 큰 IFN 감수성을 나타냄을 시사한다(도 27).
더불어, 이들 데이터는 DDA가 DNA 손상, G1 정지로부터 DNMT 하향조절 및 다운스트림 IFN 제어 MHC 및 PD-L1 발현으로의 순차적 경로를 구동하는 연구 모델을 강력하게 시사한다. 이 경로에서, 발명자들은 SQSTM1이 탈메틸화의 MHC/PD-L1 다운스트림의 생산을 제어한다고 결론내린다.
8) 탁산은 SQSTM1 -결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현의 상향조절을 구제한다
해당 단계에서, SQSTM1-결실 세포의 내성을 극복할 수 있는 표준 치료를 확인하는 데 관심이 있었다. 그 중에서, 미세소관 표적화제(MTA)는 DDA-내성 암에 대한 효능이 입증된 2차 화학치료법인 후보물질이다. 발명자들은 도세탁셀이 Shc 세포와 ShSQSTM1 세포 둘 다에서 성장 정지 및 DNMT1 하향조절을 유발하였음을 보여준다. 놀랍게도, SQSTM1의 부재에도 불구하고, 도세탁셀은 다운스트림 TBK1/STAT1 인산화(도 30) 및 IFN, HLA-B 및 PD-L1의 발현(도 29 및 30)을 유의하게 구제하였다. 주목할 만하게는, 도세탁셀은 다른 DDA에서 관찰된 동일한 후기 시간 경로를 따랐다. 본원에서 다시, 시스플라틴은 SQSTM1 양성 세포에서 HLA-B 및 PD-L1을 유도하는 데 가장 효과적인 약물로 남아 있는 한편, 도세탁셀은 SQSTM1-결실 세포에서 유일하게 효과적인 약물이었음을 언급할 가치가 있다. 전체적으로, 발명자들의 데이터는 HLA-B 및 PD-L1을 유도하는 도세탁셀의 새로운 특성을 밝혀내어, 특히 DDA-내성 환자에서 ICI와의 신규 조합을 탐구하는 근거를 제공한다. 특히 흥미롭게도, SQSTM1은 ICI/DDA 반응을 예측할 수 있을 뿐만 아니라 시스플라틴 또는 도세탁셀과의 2개의 ICI 조합 사이에서 치료 결정을 안내할 수 있는 강력한 바이오마커로 부상하고 있다.
논의
폐암은 암-관련 사망의 주된 원인이며, 피부, 결장, 전립선 및 췌장 암이 조합된 것보다 많다. DNA 손상제, 예컨대 백금-기초 화학치료제 및 이온화 방사선은 표준 치료이고, 약 80%의 폐암 환자가 치료 과정 동안 이들 치료법을 받을 것이다. 그러나, 초기 반응에도 불구하고, 거의 모든 환자는 결국 DDA-내성 재발을 발증시켜, 환자 생존에 관여한다. 오늘날, 항 PD-1 또는 항 PD-L1 중화 항체를 이용한 면역치료법은 진행성 환자에게 치료 유망성을 보여준다. 그러나, 이러한 유의한 발전에도 불구하고, 30% 내지 40%의 환자는 여전히 면역치료법에 대한 내성을 실증하였다.
순차적인 조합 ICI + DDA 치료법의 제한된 성공은 규정하기 어렵고 좁은 민감한 치료 범위로부터 비롯된 가능성이 있다. 더욱이, ICI/DDA에 대한 내성 환경은 알려져 있지 않으며, 반응자를 비-반응자로부터 정확하게 분간할 수 있는 바이오마커가 없다. 현재까지 PD-L1의 종양 발현은 PD-1/PD-L1 저해에 대한 증강된 객관적 반응률과 연관이 있지만, 조합 반응을 예측하는 데는 민감하지도, 특이하지도, 유용하지도 않다. 치료 개입에 중요하지만, DDA가 항원 제시 및 PD-L1을 상향조절하는 방법은 완전히 명확하지 않으며, 본 발명자들은 DDA-내성 종양에서 이 경로가 저해되는지의 여부도 이해하지 못한다.
발명자들의 데이터는 스캐폴드 단백질 SQSTM1이 ICI, DDA 및 잠재적으로 ICI/DDA 조합의 임상적 성과를 긍정적으로 예측할 수 있다는 도발적인 제안을 이끌었다. 이 가설은 발명자들이 환자 코호트를 사용하여 인실리코, 생체내 및 조작된 침묵 세포주를 사용하여 시험관내에서 만든 하기의 3개의 핵심 관찰에 기초한다: i) SQSTM1 mRNA 및 단백질 발현(IHC 점수)은 비-반응자보다 ICI, RT 및 Cis 반응자에서 유의하게 더 높다. ii) 기계론적으로, SQSTM1은 DNA 수선과 면역 IFN/MHC/PD-L1 경로 둘 다의 발현을 제어한다. iii) SQSTM1 소실은 ICI 및 DDA 치료법에 대한 내재적 내성을 구동하기에 충분하다. 발명자들은 현재 공동배양 검정 및 동계 생체내 뮤린 NSCLC 모델을 사용하여 종양 면역 미세환경, 특히 T 세포-매개 항종양 면역(T 세포 침윤 및 활성화)에 미치는 SQSTM1(zz 저해제, CRISP/CAS9)의 유전적 및 약리학적 저해 효과를 평가하는 것을 목표로 한다.
SQSTM1은 면역 종양 가소성의 분자 구동자이다
본원에서, 발명자들은 SQSTM1 발현이 뚜렷한 생물학, 면역 프로파일 및 치료적 취약성을 갖는 LUAD 및 SKCM의 하위군을 정의한다는 최초의 증거를 제공한다. 수준에 따라 SQSTM1은 2개의 완전히 상이한 면역억제 프로그램을 구동한다: SQSTM1 수준이 낮은 종양은 실제로 불량한 항원 제시 및 T 세포 배제가 있어서 "콜드" 미세환경과 연관이 있는 한편, SQSTM1 발현이 높은 종양은 PD-L1 발현, T 세포 침윤, 및 고갈이 있어서 "핫"하였다.
흥미롭게도, SQSTM1은 염증, 세포 생존(NF-κB), 산화적 해독 스트레스(NRF2) 및 세포 성장(mTOR)을 제어하는 핵심 신호전달 경로의 활성화에 관여하는 중요한 스캐폴드 단백질이고; 암 발증에 직접적인 영향을 갖는 모든 프로그램 사건이다. 이와 같이, 종양단백질 SQSTM1은 종양 성장을 면역 회피와 커플링한다. 놀랍지는 않으나, SQSTM1은 마우스에서 KRAS-G12D-유도 폐 종양형성에 필수적이다. 인간에서, SQSTM1 과발현은 폐, 위장, 전립선, 간, 신장 및 유방 암에서 더 불량한 생존율과 연관이 있었다. 역설적이게도, SQSTM1 소실 또한 콜드 암 유형인 전립선암 종양형성을 증가시키는 것으로 제시되었다. 이러한 측면에서, 발명자들이 종양 면역 회피를 부여하는 것으로 본원에서 밝혀낸 SQSTM1 획득 및 소실의 능력은 이러한 논란이 되는 결과를 설명하는 데 도움이 될 수 있다.
이들 신호전달 기능 외에도, SQSTM1은 종양 세포 생존 및 약물 내성을 촉진하는 세포 과정인 최초로 확인된 자가포식 수용체였다. 따라서, 자가포식은 SQSTM1의 제거를 매개하고, ATG5 shRNA에 의한 자가포식을 저해하는 것은 SQSTM1 축적 및 일관되게는 HLA-B 과발현을 초래하였다. 더불어, 이들 데이터는 종양유전자, 염증성 사이토카인 및 자가포식 분해를 수반하는 피드백 루프에 의한 SQSTM1 발현의 현저한 제어가 "핫" 표현형과 "콜드" 표현형 사이에서 종양 세포 가소성을 결정할 연구 모델을 강하게 시사한다.
SQSTM1은 DNA 수선의 저해를 통해 DDA 및 ICI 감수성을 지배한다
발명자들은 본원에서 SQSTM1 하향조절이 DDA 및 ICI에 대한 내성의 주요 구동자임을 보여준다. 기계론적으로, SQSTM1은 DNA 수선을 억제시켰고, 동시에 MHC-I의 발현에 필수적이었다. 따라서, SQSTM1은 DDA 감수성, 종양 DNA 불안정성, 종양 돌연변이 부담 및 종양 면역력 사이에서 분자 연결을 나타낸다. 잠재적인 기전에 대한 추가 조사, 핵 내 SQSTM1의 역할은 아직 잘 이해되지 않는다. SQSTM1은 2개의 핵 위치화 신호 및 1개의 핵 외수송 신호를 함유하며, 이는 SQSTM1이 핵과 세포질 구획 사이를 고속으로 지속적으로 왕복할 수 있게 한다. DNA 손상 시, 발명자들은 SQSTM1이 DNA 수선을 저해하는 것으로 보고된 핵 DNA 손상 초점(데이터는 제시되지 않음)으로 모집됨을 발견하였다. DNA 수선 외에도, SQSTM1은 또한 몇몇 핵 수용체의 전사 활성을 결합하고 조절하는 것으로 보고되었다. 후보 중에서, 핵 외수송의 저해 시, SQSTM1 및 종양 억제자 TP53은 DNA 수선, TP53-연관 세포 주기 정지 및 세포자멸사에 관여하는 전골수성 백혈병 단백질 핵체(PML-NB)로 모집되는 것으로 나타난다. 게놈의 수호자로서, TP53은 주로 DNA 수선 단백질의 발현을 유도함으로써 게놈 안정성에서 중심적인 역할을 한다. 따라서, SQSTM1이 Tp53과 전사 복합체를 형성함으로써 DNA 수선 반응을 조절하는지의 여부를 결정하는 것은 흥미로울 것이다. SQSTM1에 의해 제어되는 이러한 전사 인자를 확인하는 것은 콜드 불응성 암에 대한 PD-L1 발현을 구제할 수 있는 새로운 치료 표적을 발견함으로써 종양 면역 생물학에서 광범위한 유의성을 가질 것이다.
종합하자면, 발명자들은 SQSTM1이 IFN 경로의 재활성화를 통해 DDA, ICI 및 ICI/DDA에 대한 종양 교차-감수성에 기여한다는 최초의 증거를 제공한다. 이는 SQSTM1을 단독치료법으로서 ICI, DDA 및 콤보 둘 다에 대한 예측 바이오마커로서 제안한다. 놀랍게도, 사용된 치료법(방사선치료법, 면역원성 세포 사멸 유도제의 유도제, 및 비-ICD 화학치료법)에 관계없이, 발명자들의 데이터는 또한 DNA 손상제에 의한 HLA-B/PD-L1 발현의 유도에서 SQSTM1의 신규하고 전반적인 역할을 밝혀낸다.
발명자들의 결과를 개별화된 치료 결정으로 번역함
면역종양학에서 치료 결정은 ICI 조합의 도입으로 점점 더 어려워지고 있다. 치료법 반응을 정확하게 예측하거나 최적의 조합을 맞춤화하는 단일 마커는 아직 나타나지 않았다. ICI/DDA 반응을 예측하고 치료 결정을 안내할 수 있는 유망한 바이오마커가 본원에서 SQSTM1에 의해 시사된다. 발명자들의 목표는 현재 SQSTM1을 ICI/DDA 반응의 제1 예측 바이오마커로 확증하는 것이며, 이러한 바이오마커는 신속하게 임상으로 번역될 수 있고 궁극적으로 FDA-승인 조합 전략의 동반 시험으로서 사용될 수 있다. 실제로, 발명자들의 발견은 4개의 잠재적으로 영향력이 큰 임상적 의미를 갖는다:
(1) 이들은 발명자들이 ICI 및 DDA에 대한 종양 회피를 위해 SQSTM1을 하향조절하는 교차-내성 기전을 확인하였으므로 순차적 단독치료법보다는 동시적인 병용 요법을 권고한다.
(2) 이들은 2개의 상이한 ICI 조합 사이에서 치료 결정을 안내할 수 있을 것이다. SQSTM1을 항원 제시 및 PD-L1 발현에 연결함으로써, 이들은 ICI, DDA 또는 ICI/시스플라틴 치료법을 SQSTM1을 과발현하는 환자로 추가로 제한함으로써 환자 선택 전략을 재정의할 수 있고, 이로써 반응률을 증가시킬 수 있었다;
(3) 이들은 또한 KRAS 및 STK11 돌연변이를 갖고 있지만 SQSTM1을 과발현하는 상당한 수의 이전에 배제된 환자를 치료하기 위한 근거를 제공할 수 있는데, 이는 본 발명자들이 A549 세포를 사용하여 시스플라틴 및 도세탁셀이 이러한 콜드 하위군을 면역치료법으로 프라이밍할 수 있다는 원리의 증거를 제공하였기 때문이다.
(4) 이들은 ICI/MTA(미세소관 표적화제: 도세탁셀, 파클리탁셀) 콤보와 함께 낮은 수준의 SQSTM1-발현 LUAD로 환자를 치료할 수 있는 새로운 치료 기회를 제공한다.
ICI/시스플라틴 또는 대안적인 ICI/도세탁셀 전략으로 전환되어 궁극적으로 ICI 효능 및 환자 성과를 향상시켜야 하는 환자군을 확인하기 위해 SQSTM1 예측 값을 중심으로 시험을 설계하는 것은 더 크고 잘-설계된 코호트로 시급히 시험되어야 한다. SQSTM1 IHC 점수에 대한 시험이 임상적으로 확증된다면, 발명자들은 ICI 및 DDA의 활용을 다른 콜드 종양으로 확장하여 환자 성과를 향상시키기를 희망한다.
재료 및 방법
세포 배양
이 연구에서 제시된 대부분의 실험을 인간 KRAS G12S/SKT11 Q37* 공동돌연변이화된 NSCLC A549 세포(American Type Tissue Collection, ATCC)로 수행하였다. 모든 세포를 10% 우태 혈청(Dutcher), 2% 소듐 피루베이트 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life technologies)이 보충된 Dulbecco-변형 최소 필수 배지 및 Ham F-12 배지(DMEM/F12 Glutamax; Life Technologies)에서 유지시켰다. SQSTM1 넉다운 안정 세포주를 확립하기 위해, 세포를 SQSTM1의 mRNA 코딩 서열을 표적화하는 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 렌티바이러스로 형질도입하였다. 2개의 구별되는 SQSTM1 shRNA(Sigma, 인간, NM_003900, SQSTM1 #1, TRCN0000007237, 및 SQSTM1 #2, TRCN0000007236)를 사용하여 서열-의존적 표적외(off-target) 효과를 최소화하였다. 대조군으로서, 자가포식을 개시 단계에서 ATG5(Sigma, 인간, NM_004849, ATG5 #1, TRCN0000151963) 또는 ATG7 shRNA(Sigma, 인간, NM_006395, TRCN0000007584)에 의해 저해시켰다. 이러한 목적을 위해, 표적 및 대조군(Sigma; SHC002V) shRNA 렌티바이러스를 세포 내로 형질도입하였다. shRNA-매개 단백질 하향조절을 qRT-PCR 또는 특정 프라이머와 항체를 이용한 면역블로팅에 의해 제어하였다(shRNA, 프라이머 및 항체 세부사항에 대해 부록 표 1 내지 표 3을 참조).
[표 1]
[표 2]
[표 3]
세포 처리
모든 실험에 대해, 세포를 6-웰 플레이트 또는 60 mm 배양 접시에 시딩하고, 이들이 60% 내지 70% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 1% FBS가 보충된 신선한 DMEM에서 시스플라틴(Cis, 10 μM)으로 지시된 시간 동안 처리하였다. 유사한 조건 하에, 발명자들은 발명자들의 연구를 DNA 손상 및 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도하는 것으로 알려진 다른 화학치료제, 예컨대 안트라사이클린 독소루비신(Dox, 0.5 μM), 옥살리플라틴(Ox, 1.4 μM), 및 탁산(도세탁셀, D, 5 nM 및 파클리탁셀, P, 3 nM, 표 4)까지 확장하였다. 약물 농도는 용량-반응 곡선으로부터 각각의 약물에 의해 도달되는 혈액 농도의 피크에 기초하여 선택되었다[IC50: Shc A549(Cis = 24 μM +/-3.7, Dox = 364 nM +/-3, Ox = 2.61 μM +/-0.9, D= 364 nM+/-3, P= 1.4 nM +/-0.27), ShSQSTM1 A549(Cis = 47.7 μM +/-5, Dox = 486 nM +/-85, Ox = 4.51 μM +/-1, D= 21.3 nM +/-10, P= 3.7M +/- 0.7)].
대조군으로서, SQSTM1-결실 세포의 DDA 내성이 약물 유출과 관련이 없었음을 보장하기 위해, 160 ㎸/6.3 mA에서 작동하는 Faxitron X-선 시스템(CP 160 Option과 함께 모델 43855 F; Faxitron Bioptics)을 사용하여 세포를 10 Gy에서 방사선조사하였다. 방사선조사 직후, 세포를 트립신처리하고, 6-웰 플레이트에 신선한 10% FBS 배지와 함께 재시딩하였다. 모든 화학치료제를 Antoine-Lacassagne Cancer Centre로부터 입수하였다.
지시되는 경우, MRT67307(TBK1 저해제, 10 μM, Tocris) 또는 룩솔리티닙(JAK1/JAK2 저해제, 5 μM, Tocris)을 1% FBS 배지에 90분 동안 첨가한 후, 시스플라틴(10 μM)을 첨가하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 IFNγ(50 ng/ml, 24h, C-60724 Promokine)로 처리하였다.
본원에서 연구된 용량에서의 모든 약리학적 저해제는 18시간 내지 24시간 동안 세포 사멸을 유도하는 데 실패하였다. DNA 손상제가 내재성 방어를 활성화시키는 능력을 IFN, IFN-매개 신호전달, HLA-B의 발현, 및 PD-L1의 다운스트림 유도에 의해 확인하였다.
mRNA 수준의 상대적 정량화
TRI 시약(TR 118, MRC) 및 RNeasy Mini 키트(#74106, Qiagen)를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 정제하였다. 600 ng의 총 RNA를 DNAse I(18068015, Invivogen)로 처리하고, SuperScript III 역전사효소(Life Technologies)를 사용하여 역전사시켰다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석을 동일한 양의 cDNA 상에서 SYBR Green 마스터 믹스 및 Applied StepOne Plus PCR 시스템(Life technologies)을 사용하여 수행하였다. 사용된 IFN 반응 유전자의 프라이머는 표 2에 나열되어 있다. 상대 유전자 발현 변화를 2[-ΔΔCt] 방법을 사용하여 정량화하고, 비처리 세포 시료와 비교하여 하우스킵핑 유전자 RPLP0에 대해 정규화하였다.
웨스턴 블로팅
처리 후, 세포를 PBS에서 세척하고, 전체-세포 용해물(WCL)을, 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(1 mM Na3VO4, 10 mM β-글리세로포스페이트, 10 mM NaF 및 1:25, Complete TM)과 함께 3% SDS; 10% 글리세롤, 10 mM Na2PO4를 함유하는 TR3 용해 완충액으로 추출하고, 초음파처리하였다. WCL(5 내지 40 ㎍)을 이전에 기재된 바와 같이 SQSTM1, PD-L1, HLA-B, DNA 손상, 세포 주기 정지, 및 TBK1과 JAK 신호전달 경로(표 3)를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 튜불린, 액틴(#A3853, Sigma) 및 HSP90(클론 C45G5, #4877S, Cell Signaling Technology)을 로딩 대조군으로서 사용하였다. 세척 후, 1차 항체의 존재를 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합-항-마우스(1:6,000; sc-2005; Santa Cruz) 또는 -항-토끼(1:10,000; sc-45040; Santa Cruz)로 드러내고, Enhanced Chemiluminescence 검출 시스템 (Perkin Elmer)으로 시각화하였다.
유세포측정 분석
유세포측정법을 사용하여 PD-L1의 세포-표면 발현을 검사하였다. 10 μM 시스플라틴을 지시된 시간 동안 처리한 후, 세포를 트립신처리 없이 2.5 mM EDTA-PBS에서 수합하고, 항-PD-L1 항체(CD274, 브릴리언트 바이올렛 650 접합체, #329740, Biolegend) 또는 항-이소타입 항체(브릴리언트 바이올렛 650 접합체, #400351, Biolegend)로 표지하였다. 유세포측정 분석을 Cytoflex 유세포측정기(10,000개 세포, Cytoflex software) 상에서 수행하였다. MFI(PD-L1)에서 MFI(이소타입 대조군)를 차감하여 MFI(PD-L1-이소타입)을 계산한다.
데이터세트 분석
cBio 암 게놈 포탈(http://www.cbioportal.org/public-portal/) 및 Phantasus 소프트웨어(https://artyomovlab.wustl.edu/phantasus/)를 사용하여 암 게놈 아틀라스(TCGA) PanCancer Atlas 및 암 세포주 백과사전(CCLE)으로부터 데이터를 마이닝(mine)하였다.화학치료법, 방사선치료법 및 면역치료법으로 치료된 암 환자의 몇몇 데이터세트(RNAseq, DNA 마이크로어레이)를 Gene Expression Omnibus(GEO 데이터베이스, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)로부터 다운로드하였다. 각각의 종양에서 T-림프구 침윤, DNA 손상 반응, IFN (C2CGP, C2 반응물(reactome), C5BP, 및 "특징")의 시그너처는 유전자 세트 농축 분석(GSEA: Gene Set Enrichment Analysis) 및 ssGSEA 분석에 의해 CD274 / PD-L1, CD8A/B, HLA- 및 SQSTM1 발현의 유전자 발현과 상관관계가 있었다. TCGA 암-유형 약어의 완전한 목록에 대해서는, https://gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations을 참조하길 바란다.
환자 코호트
폐 선암종(LUAD)을 갖는 환자 코호트를 Laboratory of Clinical and Experimental Pathology(프랑스 니스 소재)에서 실시하였고, University 가 2010년 1월 1일과 2018년 4월 1일 사이에 조사하였다. 연구를 REMARK-가이드라인에 따라 수행하고, Ethics Commission of the Nice University Hospital에 의해 승인을 받아 서명 동의서에 대한 요건을 면제하였다. 처음에, 468명의 환자가 병리 기록에 따라 LUAD 진단의 선정 기준을 충족하였다. p40 및 TTF-1에 대한 면역조직화학적 염색은 연구에 포함된 종양의 선 분화를 확실하게 확인시켜 주었다. 더욱이, 모든 종양의 슬라이드를 병기-관련 특징(예컨대 흉막 침범)에 관하여 재평가하였다. 모든 종양은 UICC TNM-분류 8판에 따라 병기가 재분류되었다(re-staged). 사례 수집은 최종적으로 초기(I 내지 IIIA)의 287개 종양 및 말기(IIIB 내지 IV)의 181개 종양을 포함하였다. 아쥬반트 화학치료법 및/또는 방사선치료법을 70/181명(39%)의 환자에게 투여하였고, EGFR TKIs를 18/181명(10%)에게 투여하였고, 1차(펨브롤리주맙) 또는 2차(니볼루맙) 면역치료법을 37/181명(20%) 및 41/181명(23%)의 환자에게 각각 투여하였다. 15/181명(8%)의 환자는 임의의 아쥬반트 치료 전에 사망하였다.
면역조직화학 염색 및 채점
p62/SQSTM1, PD-L1/CD274, 및 CD8에 대한 면역조직화학 염색을 SQSTM1(희석 1/400, BD Transduction Laboratories™), PD-L1(클론 22C3, 희석 1/50, Dako, Inc.) 및 CD8(세포독성 T 세포; 클론 SP57, 사전희석됨; Ventana)(표 3)에 대해 이전에 기재된 바와 같이 자동화된 Ultra Ventana(Ventana, 미국 아리조나주 투쏜 소재)를 사용하여 4 μm 섹션 상에서 수행하고, 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다. 종양 세포의 다양한 하위세포성 구성요소에서 검출된 SQSTM1에 대한 면역조직화학 염색 패턴의 채점을 모든 전체 섹션에 걸쳐 수행하였다: 도트(dot)-유사 염색을 하기와 같이 0 내지 3으로 채점하였다: 점수 0은 5% 미만의 종양 세포에서 보이는 도트가 없거나 거의 없음, 점수 1은 5% 내지 25%의 종양 세포에 도트가 있음, 점수 2는 25% 내지 75%의 종양 세포에 도트가 있음, 점수 3은 75% 초과의 종양 세포에 도트가 있음. SQSTM1 세포질 염색을 하기와 같이 0 내지 3으로 채점하였다: 점수 0은 염색이 없거나 희미함, 점수 1은 약한 염색, 점수 2는 볼 수 있는 중간 염색, 및 점수 3은 강한 염색. SQSTM1 핵 면역조직화학 염색을 하기와 같이 0 내지 1로 채점하였다: 점수 0은 10% 미만의 핵에서 볼 수 있는 핵 염색 및 점수 1은 10% 초과의 핵에서 볼 수 있는 핵 염색. 채점을 2명의 유경험 병리학자(VH 및 PH)가 40x 대물렌즈 배율에서 수행하였다. 그 후에, 임상병리학적 특징과의 상관관계를 위해, 면역조직화학 점수를 낮음 또는 높음으로 그리고 단일 값의 예후 값에 따라 추가로 분류하였다. 도트-유사 및 세포질 SQSTM1 염색을 점수 0 내지 1의 경우 낮음으로, 점수 2 내지 3의 경우 높음으로 분류하였다. SQSTM1에 대한 조합된 도트-유사 및 세포질 염색을 0 내지 2의 합계 점수에 대해 낮음으로 그리고 3 이상의 원시값(raw value)의 합계 점수에 대해 높음으로 분류하였으며, 이는 최상의 예후 구분을 보여준다. SQSTM1 핵 염색 점수 0을 낮음으로, 점수 1을 높음으로 분류하였다. PD-L1 양성 종양 세포를 카운팅하고, 하나의 컷오프를 사용하였다(>50% PD-L1 양성 종양 세포). 종양내 CD8 양성 세포를 카운팅하고, 종양을 종양 발현자 없음(-), 낮음(+), 중간(++) 및 높음(+++)으로 분류하였다.
SQSTM1, PD-L1 및 CD8 상태에 따른 하위 분류. SQSTM1 도트-유사/세포질, PD-L1 및 CD8 염색의 조합은 사례를 3개의 하위유형으로 계층화하였다: 낮은 SQSTM1 도트-유사 세포질/낮은 PD-L1/낮은 CD8 염색(LLL); 높은 SQSTM1 도트-유사 세포질/높은 PD-L1/높은 CD8(HHH); 및 높은 SQSTM1 도트-유사 세포질/낮은 PD-L1; 높은 CD8 염색(HLH).
통계적 분석
통계적 분석을 위해, GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 크로스탭, 짝이 없는 비모수 T 검정, χ2 검정, ANOVA 및 Fisher의 정확 검정을 사용하여 군 비교를 수행하였다. 값을 평균 및 표준 편차(SD)로 제시한다. P < 0.05는 통계적 유의성을 달성한 것으로 설정되었다. 재발까지의 시간(TTR)을 포괄한 생존율 분석은 절제일로부터 국소 또는 전이성 재발 또는 질환-특이적 사망까지 측정되었다. 질환-특이적 생존율(DSS)은 진단 시점으로부터 질환-특이적 사망까지 결정되었다. 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(DFS)을 계산하였다. 카플란-마이어 곡선 및 로그-순위 검정을 단변량 생존율 분석에 사용하였다. 다변량 분석을 위해, Cox 회귀 분석을 사용하였다. 모든 통계 검정의 유의성 수준을 <0.05의 p-값으로 설정하였다.
실시예 2: SQSTM1은 진행성 흑색종에서 면역치료법 예측 바이오마커이다
발명자들은 항-PD1 면역치료법으로부터 유익성을 받는 또 다른 면역원성 고형 종양인 진행성 피부 흑색종(SKCM)에서 예측 바이오마커로서 SQSTM1의 관심을 확증하였다.
1. 근거
전이성 또는 진행성 흑색종은 치명적인 피부암으로서, 현재까지 5년 생존율이 30% 미만이다. 프로그래밍된 사멸-1(PD-1) 및 이의 리간드인 PD-L1을 표적화하는 면역 관문 저해제(ICI)의 개발은 5년 전체 생존율 중앙값을 52% 증가시키는 진정한 패러다임 전환을 나타낸다. 그러나, ICI에 대한 지속적인 반응은 단지 환자 하위세트로 제한된 반면, 환자의 40%는 단독치료법에서 ICI에 반응하지 않는다.
대부분의 임상 시험에서, 면역조직화학에 의해 평가된 PD-L1의 발현은 반응하는 환자의 선택을 허용하지 않는다(문헌[Robert C et al., 2015]). 발명자들은 SQSTM1 수준이 증가한 비-소세포 폐암 환자가 낮은 수준의 환자보다 더 양호한 반응을 갖는다는 최초의 증거를 제공하며, 이는 SQSTM1이 ICI에 대한 반응의 예측자임을 강하게 나타낸다. 본원에서 발명자들의 연구 목적은, SQSTM1 평가가 재발성 또는 전이성 흑색종 환자에서 효과적인 예측 바이오마커가 될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 ICI 반응에 대한 종양내 PD-L1 및 CD8+ T 림프구의 침윤의 정량화와 조합된 흑색종 세포에서 SQSTM1의 발현을 상관관계 짓는 것이었다.
2. 재료 및 방법
a) 환자 및 조직 시료(문헌[ M, et al. Oncoimmunology. 2021 Mar 19;10(1):1901446]). 이 후향적 코호트는 2013년 7월부터 2017년 2월 사이에 진단되고 University of Nice의 Archet 2 Hospital(프랑스 니스 소재)의 피부과에서 치료를 받은 연속적인 원발성 피부 악성 흑색종 환자 125명을 포함하였다. 처음에 I기 내지 II기 흑색종으로 진단된 환자는 국소 또는 원격 전이 재발 시점에 연구에 등록되었다. 전이로부터의 조직학적 재료의 가용성 및 정보에 입각한 서명된 동의서의 존재는 연구에 사례를 포함시키기 위한 필수 기준이었다.
125명의 환자 중에서, 91명(73%)은 국소 전이(전이 중 35개 및 림프절 전이 56개) 및 34명(27%)은 원격 전이(19개의 폐 및 15개의 피하 전이 부위)를 제시하였다.
이 연구에서 2개의 환자군이 구별되었다: 적어도 하나의 면역치료법(항-PD-1 저해제-펨브롤리주맙/니볼루맙 및/또는 항-CTLA4) 치료를 받은 58명(46%)의 환자군 및 면역치료법 치료를 받지 않았고 대신에 일부가 다른 치료(항-BRAF 및 항-MEK 제제와 함께 표적화된 치료법 또는 화학치료법)를 받은 67명(53%)의 환자군.
모든 종양 시편을 환자로부터의 정보에 입각한 서명된 동의서와 함께 사용하였다. 이 연구는 지역 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee, Nice University Hospital Center/hospital-related Biobank BB-0033-00025; http://www.biobank-cotedazur.fr/)의 승인을 받았고, 헬싱키 선언의 하기 지침에 따라 수행되었다.
b) 이전에 기재된 바와 같이 SQSTM1 항체를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 간략하게는, 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 연속 4 μm 조직 섹션을 새로 절단하고, 파라핀을 제거하고, 사전처리하고, BenchMark ULTRA 자동염색기(Ventana Medical Systems, 미국 아리조나주 투쏜 소재) 상에서 SQSTM1에 대한 단일클론 항체(BD Transduction Laboratories™, 610833)로 염색하였다. 기질로서 3,3-디아미노벤지딘(DAB, OptiView Kit, Roche Diagnostics, Ventana, 카탈로그 번호 760-700)과 함께 항-면역글로불린-커플링된 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하여 염색을 검출하였다. 핵 대조염색을 Mayer 헤마톡실린으로 수행하였다. 각각의 IHC 실행은 양성 대조군 및 음성 Ab 대조군(완충액, 1차 Ab 없음)을 함유하였다.
c) 면역조직화학의 평가. 관찰자간 및 관찰자내 변동성. SQSTM1(세포질 및/또는 핵)에 대한 면역조직화학 채점을 관찰자내 및 관찰자간 변동성에 대해 검사하였다. 2명의 병리학자는 독립적으로 임상병리학적 데이터에 대한 지식 없이 면역조직화학적 염색 결과를 평가하였다. 2명의 병리학자의 관찰자간 일치도는 높았다(α=0.97). 채점의 관찰자내 일치도 또한 높은 합의를 보여주었다. 불일치 결과는 다중헤드 현미경을 사용하여 해결되었다.
d) IHC 채점. 각각의 사례의 면역조직화학 염색의 강도, 백분율 및 하위세포 위치화를 기록하였다. 1차 항체를 생략한 염색을 음성 대조군으로서 수행하였다. 양성으로 염색된 세포의 강도와 백분율을 저전력 필드(x 100)에서 스캔한 다음, 고출력 필드(× 400)에서 평가하였다. SQSTM1 염색을 세포질 및 핵에서 확인하였다. SQSTM1 염색의 강도를 음성, 약함, 중간 및 강함 염색을 지칭하는 0, 1, 2 및 3으로 각각 기록하였다(아래 참조). SQSTM1 양성 세포의 백분율을 0% 내지 100%로 기록하였다. 염색 결과를 양성 세포의 백분율(P)에 강도(I)를 곱하여 수득된 신속(Q) 점수를 사용하여 채점하였다(Q=P × I; 최대=300; 문헌[Charafe-Jauffret et al., 2004]). 흑색종의 Q 점수의 중앙값을 컷오프 포인트로 사용하여 암을 '낮은 발현'과 '높은 발현'으로 분류하였다. 군들 사이의 차이를 조사하기 위해 χ2 검정 또는 스튜던트 t-검정을 사용하였다. 도 31.
3. 결과
SQSTM1은 핵세포질 왕복 단백질이지만 피부 발암과 면역치료법에 대한 반응과 하위세포성 위치화의 연관성은 지금까지 문서화되지 않았다.
발명자들은 ICI로 치료된 58명의 환자 중에서 면역조직화학에 의해 검출되고 디지털 분석 임상병리학적 특징 및 전체 생존율(OS)에 의해 정량화된 바와 같이 종양내 및 CD8+ T 림프구와 조합된 흑색종 세포에서 발현된 SQSTM1의 연관성을 후향적으로 평가하였다.
이들은 흑색종이 정상적인 피부보다 더 강한 SQSTM1 발현을 표시하였음을 발견하였다. ICI-치료 흑색종 중에서, 비-반응자 흑색종은 제한된 세포질 SQSTM1 염색을 나타내었다. 대조적으로, 반응자 흑색종은 세포질 및 핵 SQSTM1 발현에서 최고의 증가를 나타내었다. 2개 군(비-반응자 및 반응자) 사이의 세포질 및 핵 발현의 차이는 통계적으로 유의하였다(p-값 = 0.00026). 전체적으로, 이들 발견은 피부 흑색종의 ICI 예측 바이오마커로서 핵 및 세포질 SQSTM1 염색의 관심에 대한 최초의 증거를 제공하였다.
실시예 3: SQSTM1은 폐 선암종(LUAD)에서 면역치료법 계층화를 위한 액체 생검 내 순환 바이오마커이다
발명자들은 또한 LUAD에서 향상된 면역치료법 계층화를 위한 액체 생검 내 비침습적 순환 바이오마커로서 SQSTM1의 예측 값을 평가하였다.
1. 근거
분자 시험을 위한 적절한 종양 조직을 수득하는 것은 조직 생검에 접근할 수 없거나 수행하기가 극도로 어려운 진행성 또는 전이성 질환 환자에서 또는 종양 세포의 비율이 낮은 경우(분자 시험 및/또는 PD-L1 발현의 강력한 평가를 위해 추출된 핵산의 양이 적음) 점점 더 어려워지고 있다. 그러므로, 충족되지 않은 진단 필요성은 면역치료법으로부터 유익성을 받을 수 있는 환자를 확인하는 비침습적 접근법을 촉구한다. 최근에, i) 발명자들은 ISET® 플랫폼을 사용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 순환 종양 세포(CTC)를 특이적으로 단리하기 위한 프로토콜을 사용하였고(종양 세포의 크기에 의한 단리, 문헌[Hofman V 2011a/b]), ii) 발명자들은 모든 진행성 폐암(NSCLC) 환자가 아닌 일부 환자의 혈액에서 순환 종양 세포(CTC) 상의 PD-L1의 과발현을 성공적으로 보고하였고; iii) 발명자들은 CTC에서의 PD-L1 발현과, 매칭된 폐 생검을 상관관계 지었고; iv) 그러나, PD-L1 위양성 및 위음성 염색의 부정확성이 남아 있다(문헌[ M, et al. Ann Oncol. 2018 Jan 1;29(1):193-199]).
NSCLC 환자에서, 종양 생검에서 SQSTM1 발현은 PD-L1 저해제에 대한 향상된 유익성과 상관관계가 있었다. 그러므로, 발명자들은 CTC 둘 다에서 ISET 플랫폼 SQSTM1 발현을 사용하여 혈액 시료에서 PD-L1 및 SQSTM1 발현의 유병률(prevalence)을 평가함으로써 종양의 PD-L1 상태에 대한 비침습적 대용물로서 CTC의 유용성을 조사하고, 40명의 진행성 NSCLC 환자 코호트에서의 종양 조직과 매칭하였다.
2. 방법
a) CTC 포착. CTC 포착을 크기-기초 여과와 세포병리학적 평가를 조합한 방법(ISET® 기술)에 의해 수행하였다. 간략하게는, 혈액 시료를 K3EDTA 또는 혈액 수집 튜브(BCT)(Streck)에 채취하고, 제조업체의 권고사항에 따라 CTC 포착을 위해 SizE of Tumor(ISET® 시스템, Rarecells, 프랑스 파리 소재)에 의한 단리에 의해 여과하였다(문헌[ M, et al. Ann Oncol. 2018 Jan 1;29(1):193-199]). 필터를 악성(CNHC-MF) 또는 불확실(CNHC-UMF) 특징을 가진 순환 비-혈액 세포의 존재에 대해 분석하였다.
b) ISET 필터 상에서의 SQSTM1 발현. CTC 검출(≥2 CNHC-MF 및/또는 CNHC-UMF)을 제시한 시료를 하기와 같이 3개의 염색되지 않은 ISET 필터 스팟에서 면역세포화학에 의한 SQSTM1 발현의 추가 분석을 위해 선택하였다: 반응 완충액 10×(카탈로그# 950-300; Ventana)를 이용한 2분의 재수화 후, 필터를 BenchMark ULTRA 자동염색기(Ventana)에서 양전하 유리 슬라이드에 놓고, IHC에 대한 SQSTM1 염색 프로토콜을 따랐다(상기 기재된 바와 같음).
SQSTM1 ICC 분석은 SQSTM1의 세포질 및 핵 발현을 평가하고, SQSTM1을 발현하는 CTC 및 WBC의 백분율을 채점하였다. 혈액 시료 및 매칭된-종양 조직의 결과는 연구가 완료될 때까지 맹검이었다.
3. 결과
발명자들은 ISET®를 사용하여 LUAD 환자 혈액 시료로부터 CTC를 단리하고, 면역세포화학적 염색에 의해 SQSTM1을 성공적으로 검출하였다. 이 개념-증명 연구는 면역치료법 반응 환자 계층화를 위한 비침습적 실시간 액체 생검으로서 CTC/SQSTM1 검정의 예측 값을 실증하였다.
[도 1] 도 1은 암 게놈 아틀라스 데이터베이스(TCGA, PanCancer Atlas, 상단) 및 상응하는 히트맵(하단)으로부터 콜드 인간 흑색종(SKCM)(CD8A에 대해 음성이고 HLA-B 전사물 수준에 대해 음성임)에서 DNA 수선의 유전자 세트의 유의한 활성화가 존재함을 보여주는 GSEA 분석을 나타낸다. 핵심 색상: 밝은 회색 및 짙은 회색은 저발현 및 고발현에 각각 상응한다.
[도 2] 도 2는 시스플라틴 내성 비소세포 폐암(NSCLC, 반응자 - R, 비-반응자 - NR, GEO, 전향적 연구)에서 DNA 수선의 유전자 세트의 유의한 활성화 및 동종이식편 거부의 저해, 백혈구 매개 세포독성 유전자세트를 보여주는 GSEA 플롯을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 ICI 내성 흑색종에서 DNA 수선 및 세포 주기 관문 유전자세트의 유의한 농축(enrichment)을 보여주는 GSEA 및 박스-플롯 분석을 나타낸다(항-PD-1, NR, cBioportal, https://portals.broadinstitute.org/ single-cell/ study/melanoma-immunotherapy-resistance#study-visualize, GSE115978).
도 4 내지 도 9: SQSTM1/p62는 면역치료법에 대한 반응의 강력한 예측자이다.
[도 4] 도 4는 SQSTM1이 "ICI에 대한 반응", "RT에 대한 반응"(RT: 방사선치료법) 및 "NF-kB 신호전달" 시그너처(GSEA, KEGG) 사이에서 차별적으로 발현된 유전자의 벤다이어그램의 교차점에 있음을 나타낸다.
[도 5] 도 5는 p62/SQSTM1의 구조 및 상호작용 파트너를 나타낸다. SQSTM1은 자가포식 머시너리와의 상호작용, 및 세포 사멸, 염증, DNA 수선 및 궁극적으로 암에 관여하는 신호전달 경로와의 상호작용에 필요한 다수의 도메인으로 이루어진다. PB1 Phox 및 Bem1; ZZ 아연 핑거; RIR 랩터 상호작용 영역; TBS Traf6 결합 부위; LIR Lc3 상호작용 영역; KIR Keap1 상호작용 영역; UBA Ub-연관; NLS 핵 위치화 신호; NES 핵 외수송 신호.
[도 6] 도 6은 암 게놈 아틀라스 데이터베이스(TCGA, PanCancer Atlas)로부터 인간 흑색종(SKCM) 및 폐암(LUAD)에서 SQSTM1 전사체 수준과 양성적으로 그리고 음성적으로 상관관계가 있는 항원 제시 및 DNA 수선 시그너처의 GSEA 플롯을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 ICI 반응자(R) 대 비-반응자(NR) 사이에서 가장 차별적으로 발현된 신호전달 스캐폴드 단백질의 목록을 나타낸다. 삽입도 ICI 반응자(R) 대 비-반응자(NR)에서 SQSTM1 mRNA 발현의 박스플롯이다(항-PD-1, 조정된 p-값, 흑색종, GSE115978).
[도 8] 도 8은 SQSTM1 고(H) 대 저(L)에서 그리고 SQSTM1 고/PD-L1 고/CD8 고(HHH) 대 면역치료법으로 치료된 다른 환자군에서 질환-특이적 생존율(DSS) 곡선을 보여주는 카플란-마이어 플롯을 나타낸다.
[도 9] 도 9는 LUAD 종양 섹션에서 SQSTM1, PD-L1 및 CD8 양성 및 음성 IHC 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다. 단일 SQSTM1 검정은, 면역치료법에 반응하는 "위음성"(고 SQSTM1 발현) 사례와 PD-L1 발현 평가 단독으로 관찰된 "위양성" 사례(콜드 미세환경 및 낮은 SQSTM1 발현을 갖는 비-반응자)를 정확하게 구별할 수 있었음을 주목한다.
도 10 내지 도 16: SQSTM1 결실은 "콜드" 표현형 및 DDA 내성을 유도하기에 충분하다.
[도 10] 도 10은 높은 그리고 낮은 SQSTM1 발현을 각각 갖는 190개의 폐암 세포주에 걸쳐 '핫' 표현형[CD274, 항원 제시(하단 좌측)], 시스플라틴/RT 감수성(RT 방사선치료법) 및 DNA 수선(하단, 좌측, 우측)과 연관된 유전자 세트의 유의한 농축을 보여주는 히트맵(상단) 및 상응하는 GSEA 프로파일을 나타낸다. 밝은 회색 및 짙은 회색은 저발현 및 고발현에 각각 상응한다.
[도 11] 도 11은 2개의 독립적인 SQSTM1 shRNA(SQSTM1 #1 및 #2 대 대조군 shRNA)와 함께 shRNA 넉다운(knockdown) 후 SQSTM1 단백질 수준에서 효율적인 저하를 보여주는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 그 후에, SQSTM1 결실에 대한 A549 폐암 세포 반응을 HLA-B 및 DNA 수선에 관하여 검사하였다(RAD51 및 P-Thr68-CHK2 WB);
[도 12] 도 12는 shRNA 넉다운 후 케모카인 발현(CXCL10, IL29)을 나타낸다. A549 발현 대조군 또는 SQSTM1 shRNA, 뿐만 아니라 SQSTM1 플라스미드(구제(rescue)를 위해, #2 + SQ)로 형질주입된 shSQSTM1 세포에서의 유전자 발현을 qRT-qPCR에 의해 측정하였다. 유사한 결과는 3개의 독립적인 실험에서 관찰되었다.
[도 13] 도 13은 shRNA 넉다운 후 MHC-I 발현(HLA-A-C, qRT-PCR)을 나타낸다. A549 발현 대조군 또는 SQSTM1 shRNA, 뿐만 아니라 SQSTM1 플라스미드(구제를 위해, #2 + SQ)로 형질주입된 shSQSTM1 세포에서의 유전자 발현을 qRT-qPCR에 의해 측정하였다. 유사한 결과는 3개의 독립적인 실험에서 관찰되었다.
[도 14] 도 14는 SQSTM1 shRNA 넉다운 후 A549 세포 생존력(시스플라틴 용량-반응, IC50, Cis: 시스플라틴 5일)을 나타낸다.
[도 15] 도 15는 DDA 처리(Cis: 시스플라틴, 10 μM, Oxa: 옥사플라틴, 1.4 μM, Dox: 독소루비신, 50 nM, RT: 이온화 방사선, 10 Gy, 5일)에 반응한 HLA-B(좌측) 및 PD-L1(우측) 유전자 발현을 나타낸다.
[도 16] 도 16은 대조군, SQSTM1 또는 ATG5 shRNA로 형질주입된 A549에서 MHC-I(A-C, 상단, 유세포측정법) 및 PD-L1 세포-표면 발현(하단, 유세포측정법)을 나타낸다. 유사한 결과는 3개의 독립적인 실험에서 관찰되었다. HLA-B 및 PD-L1 발현의 최대 증강은 시스플라틴에 의해 달성되었고, 이는 다른 실험에 대해 선택되었다.
[도 17] 도 17은 DDA 내성에 미치는 SQSTM1 결실의 결과를 나타낸다. 지시된 DDA(N=3)로 5일 처리한 후 sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포에서 크리스탈 바이올렛 세포독성 검정(우측)으로부터의 IC50 농도이다.
도 18 내지 도 22: DNA 손상제는 PD-L1/MHC-I의 후기(late) 발현을 SQSTM1-의존적 방식으로 유도한다.
[도 18] 도 18: sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포를 10 μM의 시스플라틴으로 처리하였다. 지시된 시기에, 전반적인 DNA 손상(A)을 53BP1 초점 형성(focus formation)에 의해 측정하였다(우측 면역형광 염색, 53BP1 레드, Dapi, 청색. 좌측, 5개 초과의 반점(spot)을 갖는 세포 백분율).
[도 19] 도 19: 시스플라틴-처리 A549 세포에서 TBK1 및 JAK 경로의 SQSTM1-의존적 활성화이다. 세포를 용해시키고, TBK1 및 JAK 경로의 활성화를 항-포스포-Ser172-TBK1(P-TBK1) 및 항-포스포-Tyr701-STAT1(P STAT1)과 함께 WCL의 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다. 튜불린 및 TBK1은 로딩 대조군으로서 사용되었다(N=3).
[도 20] 도 20: I형 및 III형 인터페론의 상대 발현(좌측, 5일 - 5d, N=3), 및 IL29 발현의 동역학(kinetic)을 qRT-PCR에 의해 측정하였다(우측, N=3).
[도 21] 도 21: 시스플라틴-유도 HLA-B mRNA(좌측, qRT-PCR, N=3), 단백질(중간, 상부: 웨스턴 블롯, 하단: 튜불린으로 정규화된, ImageJ에 의한 밀도측정(densitometry)에 대한 배수 변화, N=4), 및 세포 표면 발현(유세포측정법, 우측, N=3)의 시간 경로이다. 형광 강도 중앙값(MFI) 및 양성 세포의 %가 제시된다.
[도 22] 도 22: 시스플라틴-유도 PD-L1 mRNA(좌측, qRT-PCR, N=3), 단백질(중간, 상부: 웨스턴 블롯, 하단: 튜불린으로 정규화된, ImageJ에 의한 밀도측정에 대한 배수 변화, N=4), 및 세포 표면 발현(유세포측정법, 우측, N=3)의 시간 경로이다. 형광 강도 중앙값(MFI) 및 양성 세포의 %가 제시된다.
도 23 내지 도 24: 시스플라틴은 SQSTM1과 독립적으로 세포 주기 정지 및 DNA 메틸화를 유도한다.
[도 23] 도 23: 시스플라틴-처리 sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포(10 μM, qRT-PCR; N = 3)에서 CDKN1A,및 DNMT1 유전자 발현이다.[도 24] 도 24: DNA 수선 시그너처, 세포 주기 및 DNA 메틸화와 ICI 반응을 상관관계 짓는 GSEA 및 박스-플롯 분석이다(항-PD-1, cBioportal, https://portals.broadinstitute.org/singlecell/study/melanoma-immunotherapy-resistance#study-visualize).
도 25: 면역원성 세포 사멸(ICD) 유도제는 HLA-B 및 PD-L1 발현을 SQSTMI-의존적 경로로 상향조절한다.
[도 25] 도 25: shSQSTM1 A549 세포는 ICD 유도제(방사선치료법, 10 Gy; Doxo, 50 nM)로 처리되었다. DDA-처리 sh대조군 및 shSQSTM1 A549(시간 경로; N = 3)에서 DNMT1, IFNL2/IL29, PD-L1 및 HLA-B의 qRT-PCR 발현이다.
도 26: 시스플라틴은 HLA-B 및 PD-L1 발현을 TBK1 및 JAK-의존적 방식으로 유도한다.
[도 26] 도 26: sh대조군 A549 세포는 TBK1 저해제 MRT 67307(10 μM) 또는 JAK1/JAK2 저해제 룩솔리티닙(5 μM)의 존재 또는 부재 하에 10 μM의 시스플라틴으로 처리되었다. 좌측, 포스포-TBK1, 및 포스포-STAT1 웨스턴 블롯(5일). 우측, IL-29, HLA-B 및 PD-L1의 qRT-PCR 발현이다(시스플라틴 처리 세포에 상응하는 100%(우측 패널; N=2)).
도 27 내지 도 28: IFN은 SQSTM1-결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현의 상향조절을 구제한다.
[도 27] 도 27은 자가포식 결함이 IFN 감수성을 증가시킴을 나타낸다. SQSTM1, ATG5 또는 ATG7 넉다운 A549 세포는 IFNG(50 ng/ml)에 의해 1시간 또는 24시간 처리되었다. 포스포-STAT1 및 IDO1의 웨스턴 블롯이다(액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었음, 좌측). PD-L1 발현은 PD-L1 발현의 qRT-PCR 및 세포 표면 염색에 의해 분석되었다(우측).
[도 28] 도 28은 시스플라틴(5d) 및 IFN(24h) 후의 포스포-TBK1, 포스포-STAT1, HLA-B 및 PD-L1 웨스턴 블롯을 나타낸다(TBK1은 로딩 대조군으로서 사용되었음; 우측 패널; N=3).
* < P 0.05 비모수 T-검정(만-휘트니)
도 29 내지 도 30: 도세탁셀은 SQSTM1-결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현을 유도한다.
[도 29] 도 29는 도세탁셀-처리 sh대조군 및 shSQSTM1 A549 세포(5 nM, qRT-PCR, N=2)에서 CDKN1A/p21, DNMT1, IFN-III, HLA-B 및 PD-L1의 상대 발현을 나타낸다.
[도 30] 도 30은 시스플라틴- 및 도세탁셀 처리 세포(5 nM, 5일, 액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었음)의 포스포-TBK1, 포스포-STAT1 및 HLA-B, 웨스턴 블롯을 나타낸다.
[도 31] 도 31은 SQSTM1 염색(원래 배율 × 400)의 대표적인 이미지를 나타낸다. 피부 흑색종은 증가된 세포질 및 핵 SQSTM1 염색 패턴을 보여준다.
실시예
실시예 1
최근 면역 관문 저해제(ICI)의 등장 후, 임상 암 시험의 난제는 ICI와 DNA-손상제(화학치료법 및 방사선치료법으로서 이하 DDA로 명명됨)의 최적의 조합을 개발하는 것이다. 내성 기전을 규명하는 것은 ICI 효율을 향상시키기 위한 새로운 예측 바이오마커 및 새로운 치료 접근법을 제안하는 데 필수적이다. 발명자들은 DDA 및 ICI에 대한 내성이 부분적으로는 내인성 종양 기전에 의해 매개되고, 이들 기전 중 일부는 공유될 수 있다고 가정하였다. 3개의 상보적인 접근법(인실리코(in silico), 환자 코호트 상에서 생체외, 및 시험관내)을 통해, 발명자들은 p62/SQSTM1 스캐폴드 단백질을 DDA 및 ICI에 대한 감수성을 예측하고 제어할 수 있는 핵심 분자 매개자로서 확인한다. 기계론적으로, DNA 손상에 반응하여, 발명자들은 SQSTM1이 DNA 수선의 저해에 필수적임을 발견하였다. SQSTM1-결실 종양 세포를 도세탁셀로 처리하는 것은 IFN 및 MHC 경로를 구제하여, 비-반응자에서 콜드 종양을 핫 종양으로 변화시키는 유망한 치료적 방안을 제공할 수 있다. 그러므로, 발명자들은 ICI 효능 및 환자 성과를 증가시키는 것을 목표로 SQSTM1을 이의 수준에 따라 ICI 단독, ii) 시스플라틴과 조합된 ICI, iii) 또는 도세탁셀과 조합된 ICI 사이에서 치료 결정을 안내하기 위한 예측 바이오마커로서 제안한다.
결과
발명자들은 교차-내성(cross-resistance)을 매개할 수 있는 공유된 분자 경로를 확인하기 위해 방사선치료법, 화학치료법 및 면역치료법으로 치료된 환자 코호트로부터 RNA 발현 시그너처를 비교하였다. 발명자들은 세포독성 T 림프구(CTL) 마커 CD8A와 CD8B, 면역 관문 유전자 CD274/PD-L1(이하 PD-L1로 지칭됨), 및 부류-I MHC 유전자(HLA-A, B, C)의 발현에 기초하여 종양을 면역 "핫" 및 "콜드"로 분류하였다. CD8+ T 세포의 농축을 2개의 세포용해성 효소인 그랜자임 B(GZM B) 및 퍼포린(PRF)의 존재에 의해 추가로 확증하였다.
1) DDA 전략과 ICI 전략 사이에서 교차-내성의 증거
면역치료법에 적격인 2개의 악성물인 폐 선암종, 및 흑색종의 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은, 콜드 종양의 2개 특질인 종양-침윤성 림프구(TIL)가 결여되었고 더 낮은 수준의 MHC-I을 발현한 사례가 DNA 수선 마커를 과발현하였음을 강조한다(도 1). 마찬가지로, 범암(pan-cancer) 분석은 다양한 종양 유형에 걸쳐 DNA 수선 시그너처와 "콜드" 종양 표현형의 연관성을 뒷받침하였다(FDR < 0.01, 데이터는 제시되지 않음). 주목할 만하게는, 이러한 더 높은 DNA 수선 시그너처는 대부분의 콜드 종양의 일관된 특징이었다. 게놈 안정성의 유의한 공급원으로서, 더 높은 DNA 수선-종양은 더 낮은 종양 돌연변이 부담(TMB)과 상관관계가 있는 경향이 있는데, 낮은 항원성이 있었고 ICI의 불량한 임상적 유익성의 3개의 예측성 바이오마커, T 세포-염증 종양 미세환경이 결여되어 있기 때문이다. 이러한 축적되는 증거를 고려하여, 발명자들은 i) 더 높은 DNA 수선이 ICI 치료법에 대한 환자를 최적으로 선택하는 또 다른 기회를 제시할 수 있음을 제안한다. 현재까지, DNA 수선 결함으로부터 발생하는 매우 작은 분율의 암이 ICI 치료법에 반응성인 것으로 발견되었다. 현재, 임상적으로 유의한 분율의 암이 DNA 수선 결함을 갖는 것으로 보인다. ii) 또한, 추론하자면, 면역억제된 콜드 종양은 DNA 수선에 내인성적으로 커플링되고 이로써 "핫" 종양보다 DDA에 대한 열등한 반응과 연관이 있는 것으로 예상될 것이다.
따라서, 발명자들은 핫/콜드 시그너처와 커플링된 DNA 수선이 3개의 치료 옵션인 화학치료법, 방사선치료법 및 면역치료법에 대한 임상 반응을 예측하는 데 적용될 수 있는지의 여부를 분석한다. 대신에, 유전자 발현에 기초한 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)은 LUAD(도 2)와 다른 암 유형의 독립적인 확증 코호트(데이터는 제시되지 않음) 둘 다에서 면역치료법 반응을 결정하는 3개 특징인 시스플라틴-감수성 및 방사선치료법(RT)-감수성 암 내에서 핫 시그너처(T-세포 마커 및 MHC-I)의 농축을 밝혀내었다. 대조적으로, 면역 결함성 '콜드' 시그너처는 DDA-내성 종양의 공유된 특징이며, 항종양 면역력이 시스플라틴/RT의 임상 활성에 중요함을 고도로 시사한다. 흥미롭게도, 발명자들은 DNA 수선 시그너처와 ICI 내성의 유의한 상관관계의 최초 증거를 제공한다(도 3). 추론하자면, 이러한 반복적인 임상적 상관관계는 DDA를 ICI와 조합하여 ICI/DDA 감수성 환자의 성과를 향상시키는 근거를 제공한다. 이러한 맥락으로, 시스플라틴/RT에 불응성인 환자의 하위군 또한 교차-내성을 획득하여, 2차 면역치료법으로부터의 유익성을 저하시킬 것이다. 이러한 공격적인 내성 종양 표현형을 설명하는 매력적인 가능성은 종래의 DDA에 대한 내성을 매개하는 것으로 알려진 높은 DNA 수선 경로가 또한 면역치료법에 대한 감소된 반응에 기여할 것임을 고려하는 것일 수 있다.
2) SQSTM1/p62는 ICI/DDA 민감도의 유망한 바이오마커이다
콜드 및 DNA 수선 시그너처의 공동발현은 ICI 및 DDA에 대한 반응이 종양 교차-내성을 촉진하는 데 긴밀하게 커플링되어 있을 뿐만 아니라 동일한 신호전달 경로에 의해 제어되는 경향이 있음을 시사한다. 그 후에, 발명자들의 전략은 콜드/핫 표현형 사이에서 차별적으로 발현되었고 가장 중요하게는 조합 ICI/DDA에 대한 민감도와 상관관계가 있는 신호전달 스캐폴드를 인실리코에서 확인하는 것이었다(도 4). 스크리닝된 잠재적인 신호전달 플랫폼으로부터, 발명자들은 스캐폴드 단백질 SQSTM1에 대한 관심에 초점을 맞추기로 결정하였는데, 그 이유는 다음과 같다: i) 이것이 염증, DNA 수선, 및 세포 사멸 경로의 몇몇 신호전달 파트너를 결합(docking)시킴으로써 신호를 세포 표면으로부터 핵으로 통합하고 전달하는 것을 돕는다(도 5). ii) 흥미롭게는, 이의 발현은 폐 선암종 및 흑색종에서 항원 제시와 양성적으로 상관관계가 있고 DNA 수선 시그너처(p = e-9)와 역의 상관관계가 있었다(도 6). iii) SQSTM1은 DDA 민감성-종양에서 가장 고도로 농축된 플랫폼인 반면, 이는 내성-종양에서는 그렇지 않다(데이터는 제시되지 않음). iv) 발명자들은 흑색종의 단일-세포 RNA-seq를 사용하여 비-반응자와의 비교 시 ICI 반응자에서 SQSTM1 과발현의 최초 증거를 제공한다(p = e-62)(도 7). 차단성 PD-1을 이용하는 1차(펨브롤리주맙) 또는 PD-1(니볼루맙) 면역치료제를 이용하는 2차로 치료된 진행성 LUAD 환자(IIIA기 내지 IV기, 진행중에 있음)의 2개의 독립적인 코호트를 사용함으로써 확증되었고(도 8), 여기서 IHC에 의한 SQSTM1/p62의 높은 검출은 또한 ICI 민감도와 상관관계가 있었다(p<0.0001). 놀랍게도, 낮은 SQSTM1 발현은, 낮은 CD8 T 림프구 침윤을 보여주었고 면역치료법에 반응하는 데 실패한 PD-L1 "위양성" 종양의 하위세트(8명의 환자, 10.4%)를 확인하기에 충분하였다(도 9). 전반적으로, 발명자들의 결과는 단독치료법으로서 ICI, DDA 및 잠재적으로 ICI + DDA 조합(진행중에 있음)에 대한 민감도를 예측하는 데 있어서 종양 SQSTM1의 임상적 활용성을 시사한다.
3) SQSTM1은 DDA-유도 독성 및 증강된 항원 제시에 필수적이다
상기 임상 결과를 고려하여, 발명자들의 연구 가설은 SQSTM1/p62의 발현이 ICI 및 DDA에 대한 교차-반응을 결정할 것이라는 것이다. CCLE로부터의 190개의 폐암 세포주의 패널을 사용하여, 발명자들은 최초로 GSEA에 의해, SQSTM1의 종양-세포-내인성 발현이 항원 제시와 양성적으로 상관관계가 있고 DNA 손상 수선 및 DDA/ICI 내성 유전자 시그너처와 역의 상관관계에 있음을 확인하였다(도 10). 이러한 맥락에서, SQSTM1의 발현은 ICI 및 DDA에 대해 내성인 가장 공격적인 암 유형 중 하나인 소세포 폐암 세포주(SCLC, p-값 = 6 e-16)에서 최저라는 점에 주목할 만하다(도 10 우측). 그 후에, 발명자들은 SQSTM1과 항암 치료법에 대한 교차-감수성 사이의 인과 관계를 평가하였다. 세포 모델로서, 발명자들은 원발성 ICI 내성과 연관된 2개의 분자 사건인 KRAS G12S 종양유전자(oncogene), 및 SKT11/LKB1 종양 억제자 유전자(Q37*)의 소실을 보유하는 한편 화학치료법에 감수성인 폐 선암종으로부터 유래된 A549 세포주를 선택하였다. 실험적으로, A549 세포에서 shRNA에 의한 SQSTM1 넉다운(도 11)은 인실리코에서 충실하게 관찰된 중증 표현형을 반복하기에(recapitulate) 충분하였고; mRNA 수준과 HLA-B 단백질 수준 둘 다에서(도 11) 케모카인 CXCL10, IFN-III IL29(도 12), 및 MHC-I(HLA-A, B, 및 C 도 13)의 하향조절에 의해 입증된 바와 같았다. 이 시나리오에 따라, SQSTM1의 재발현은 케모카인 및 HLA-B의 발현을 복구시켰다(도 12 및 도 13). 이전 관찰과 일치하게, SQSTM1의 침묵화는 DNA 수선 마커인 RAD51의 발현, 및 DNA 수선을 용이하게 하기 위해 세포 주기 진행을 지연시키는 관문 키나제 2(CHK2)의 인산화를 증가시키기에 충분하였다(도 11).
따라서, 발명자들은 ICI를 이용한 임상 시험에서 많은 FDA-승인 화학치료제에 대한 SQSTM1-결실 세포의 감수성을 조사한다. 백금 처리(시스플라틴, Cis) 시, ShSQSTM1 세포는 대조군 ShC 세포의 대량 사멸(IC50 24 ± 1.4 μM, 도 14)과 비교하여 일관되게 내성이었다(IC50 51 ± 5.3 μM로서, 대조군 ShC 세포의 2배임). 준치사(sublethal) 용량(10 μM)에서, 발명자들은 Cis가 ShC 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 mRNA의 강력한 과발현을 유도하였음을 관찰하였고(각각 60배 내지 37.8배 증가; 도 15) 세포 표면에서 MHC-I(HLA-A, B, C) 및 PD-L1의 증강된 존재에 의해 반영되었다(도 16). 시스플라틴의 내성과 전체적으로 일치하여, SQSTM1의 결실은 Cis-상향조절된 HLA-B 및 PD-L1 발현을 취소시켰다(도 15 및 도 16). 개념 증명으로서, 모든 이들 특징(즉, DDA 내성 및 저하된 HLA/PD-L1 발현)은 상이한 DNA 손상제, 예컨대 안트라사이클린(독소루비신, Dox, 50 nM), 옥살리플라틴(Oxa, 1.4 μM) 및 방사선치료법(RT, 10 Gy)을 사용하여 반복되었다(도 15 및 도 17).
SQSTM1이 스캐폴드 단백질과 선택적 자가포식 수용체 둘 다로서 기능한다는 점을 고려하여; 발명자들은 ATG5 shRNA에 의한 자가포식 저해(도 16) 또는 약물학적 bafA1 또는 클로로퀸 처리(데이터는 제시되지 않음)가 SQSTM1 결핍에 의해 유도된 표현형을 반복하지 않았으나 대신에 HLA-B 및 PD-L1의 증강된 발현을 유발하였음을 발견하였다. 더불어, 이들 결과는 암 치료법에 대한 내성이 적어도 부분적으로는 종양 세포의 내인성 특성이라는 언급을 나타낸다. 분자 수준에서, 이들 결과는 자가포식 경로보다는 SQSTM1 신호전달 스캐폴드가 DDA-유도 독성, HLA-B, 및 면역치료법에서 표적화되는 핵심 면역 관문 단백질인 PD-L1 발현에 중요함을 확립한다. 종합하자면, 이는 ICI/DDA 교차 반응에서 SQSTM1의 부가 기능을 밝혀내었다.
4) SQSTM1은 Cis에 의한 IFN/PD-L1/MHC-I의 후기 상향조절에 절대적으로 필요하다.
다음으로 발명자들은 SQSTM1의 소실이 DDA-유도 반응에 어떻게 영향을 미치는지 평가하였다. 직접적인 세포독성 효과 외에도, DDA의 치료 작용은 세포기질 내로의 DNA의 방출에 의존할 수 있고, 이는 DNA 바이러스로서 인식되고 있으며 16시간째에 초기 IFN 반응(IFN, HLA-B 및 PD-L1)을 프라이밍하는 것으로 제안되었다.
예상된 바와 같이, DDA는 CHK2의 인산화(데이터는 제시되지 않음) 및 53BP1-양성 초점의 형성(도 18)에 의해 시각화된 바와 같이 DNA 손상을 신속하게 유도하였고, 이는 6시간의 시스플라틴 처리 후 시작되었고, 16시간째에 피크값에 유사하게 도달한 다음, 하락하였다. 예상 밖으로, DDA-처리 ShC 세포에서, TBK1 및 STAT1의 인산화(도 19) 뿐만 아니라 IFN-I 및 IFN-III의 발현은 DNA 손상과 일치하지 않았으나, 이후에 제3일의 처리 즈음 시작되었다(도 20). 다운스트림에서, DDA-유도 HLA-B와 PD-L1 mRNA(우측) 및 단백질(중간 및 좌측) 발현의 동역학은 IFN을 따랐으며, 이는 제5일 즈음에 안정기(plateau) 값에 도달하였다(도 21 및 도 22). 본원에서 또한, 포스포-TBK1, IFN, HLA-B 및 PD-L1 발현의 DDA 상향조절은 SQSTM1의 부재 시 시간 경로 전반에 걸쳐 실패하였다(도 19 내지 도 22). 이러한 관찰은 발명자들로 하여금 DNA 손상과 면역원성 반응 사이에서 SQSTM1에 의해 제어되는 분자 경로를 확인하도록 촉구하였다.
이러한 동역학 불일치는 후기 IFNs/HLA-B/PD-L1 경로의 개시 시 초기 dsDNA의 주요 역할에 대한 논쟁 거리이다. 이는 LKB1/STK11에서 DNA 센서 STING의 침묵화와 일치하여 A549 세포를 돌연변이화시켰고 대신에 대안적인 SQSTM1-의존적 DAMP를 시사하였다.
5) SQSTM1 및 DNA 손상제.
놀랍게도, 발명자들은 세포 주기 저해제 CDKN1A/p21의 초기 유도가 대조군과 SQSTM1-결실 세포 둘 다에서 DDA-유도 DNA 손상(핵 초점, 도 18)을 충실히 추적하였음을 관찰하였다(도 23). 더불어, 이는 SQSTM1이 DNA 손상 반응의 초기 첫 단계에 필요하지 않으며 DSB 형성 및 세포 주기 정지 후에 작용함을 확인시켜 준다.
최근, 세포 주기 정지 및 DNA 탈메틸화를 유도하는 약물이 암세포에서 IFN/MHC-I/PD-L1 발현을 안내한다는 전임상 연구가 거의 이루어지지 않았다. 이러한 가설을 뒷받침하기 위해, 인실리코 분석에서 ICI 반응은 DNA 메틸라제의 발현과 역의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(도 24). PD-L1 발현을 상향조절하는 것으로 보고된 후생학적 조절제 패널(DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, LDS1, SETD1, TRIM28/KAP1, EZH2) 중에서 DNMT1의 발현만이 1일의 Cis 처리 시 초기에 감소한 한편, 다른 것들은 중간 또는 가변적인 반응을 보여주었다(도 23). 개시 사건으로서 DDA-매개 DNMT 하향조절을 뒷받침하기 위해, DNMT1을 저해하는 탈메틸화제인 5-아자시티딘(500 nM, 5-아자)에 의한 A549 ShC 세포의 처리는 HLA-B 및 PD-L1의 후기 발현을 반복하였다(5일 및 6일). 이 사건은 IFN-III IL28의 재활성화(5일)에 의해 일관되게 선행되었다
주목할 만하게는, SQSTM1의 부재 시, 발명자들은 시스플라틴 처리 시 CDKN1A/p21 및 DNMT1 발현의 유사한 하향조절을 관찰하였다(도 23). 그러나, 이는 P-TBK1/IFN/p-STATI로부터의 전체 다운스트림 경로의 활성화로 이어지지 않았다(도 19). 비정상적인 신호 전달과 일치하여, SQSTM1-결실 세포는 시스플라틴에 반응하여 mRNA, 단백질, 및 HLA-B와 PD-L1의 세포 표면 발현을 상향조절하지 않았다.
시스플라틴 외에도, 그 후 발명자들은 방사선치료법, 옥살리플라틴 및 독소루비신과 같은 다양한 면역원성 세포 사멸(ICD) 유도제로 이 경로의 후기 유도를 반복하였다. ICD 유도제와 상관없이, 이들은 이 경로가 전적으로 SQSTM1에 의존함을 보여주었다(도 25). 따라서, 이들 데이터는 DNA 손상제-유도 PD-L1/MHC-I 발현에 대한 SQSTM1의 신규의 전반적인 역할을 나타낸다.
6) DDA는 TBK1-IFN-JAK 경로의 활성화를 통해 HLA-B 및 PD-L1 발현을 유도한다
발명자들은 시스플라틴이 IFN의 전사에 관여하는 키나제인 TBK1의 인산화를 유도하였음을 보여준다. 일관되게는, 이들은 mRNA 수준에서 IFN-III을 검출하고, Cis와 TBK1 저해제 MRT 67307의 공동처리는 JAK/STAT 저해제 룩솔리티닙과 마찬가지로 IFN/HLA B/PD-L1을 유도하는 시스플라틴 능력을 차단하기에 충분하였다(도 26). . 전체적으로, 발명자들의 데이터는 준치사 용량 DDA가 I형 IFN이 아니라 III형 IFN의 발현을 유도할 수 있고, 뒤이어 HLA-B 및 PD-L1의 다운스트림 발현을 JAK-의존적 방식으로 유도할 수 있음을 시사한다.
7) IFN은 SQSTM1- 결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현의 상향조절을 구제한다.
그 후에, 발명자들은 IFNG의 첨가가 shC 및 shSQSTM1 세포에서 STAT1 인산화, HLA-B 및 PD-L1 발현을 유도함을 확인하였고, 이는 IFN 경로가 SQSTM1-결실 세포에서 기능적임을 나타내었다(도 27 및 도 28). 흥미롭게도 발명자들은 IFNG에 반응하여 ISG(IDO-1, HLA-B 및 PD-L1)의 발현이 Shc와 비교하여 SQSTM1-결실 세포에서 더 높다는 것을 관찰하였다. 이 패턴은 적어도 부분적으로는 IFN-자극 shATG5 및 ShATG7에서 반복되었고, 이는 자가포식-결핍 세포가 더 큰 IFN 감수성을 나타냄을 시사한다(도 27).
더불어, 이들 데이터는 DDA가 DNA 손상, G1 정지로부터 DNMT 하향조절 및 다운스트림 IFN 제어 MHC 및 PD-L1 발현으로의 순차적 경로를 구동하는 연구 모델을 강력하게 시사한다. 이 경로에서, 발명자들은 SQSTM1이 탈메틸화의 MHC/PD-L1 다운스트림의 생산을 제어한다고 결론내린다.
8) 탁산은 SQSTM1 -결실 세포에서 HLA-B 및 PD-L1 발현의 상향조절을 구제한다
해당 단계에서, SQSTM1-결실 세포의 내성을 극복할 수 있는 표준 치료를 확인하는 데 관심이 있었다. 그 중에서, 미세소관 표적화제(MTA)는 DDA-내성 암에 대한 효능이 입증된 2차 화학치료법인 후보물질이다. 발명자들은 도세탁셀이 Shc 세포와 ShSQSTM1 세포 둘 다에서 성장 정지 및 DNMT1 하향조절을 유발하였음을 보여준다. 놀랍게도, SQSTM1의 부재에도 불구하고, 도세탁셀은 다운스트림 TBK1/STAT1 인산화(도 30) 및 IFN, HLA-B 및 PD-L1의 발현(도 29 및 30)을 유의하게 구제하였다. 주목할 만하게는, 도세탁셀은 다른 DDA에서 관찰된 동일한 후기 시간 경로를 따랐다. 본원에서 다시, 시스플라틴은 SQSTM1 양성 세포에서 HLA-B 및 PD-L1을 유도하는 데 가장 효과적인 약물로 남아 있는 한편, 도세탁셀은 SQSTM1-결실 세포에서 유일하게 효과적인 약물이었음을 언급할 가치가 있다. 전체적으로, 발명자들의 데이터는 HLA-B 및 PD-L1을 유도하는 도세탁셀의 새로운 특성을 밝혀내어, 특히 DDA-내성 환자에서 ICI와의 신규 조합을 탐구하는 근거를 제공한다. 특히 흥미롭게도, SQSTM1은 ICI/DDA 반응을 예측할 수 있을 뿐만 아니라 시스플라틴 또는 도세탁셀과의 2개의 ICI 조합 사이에서 치료 결정을 안내할 수 있는 강력한 바이오마커로 부상하고 있다.
논의
폐암은 암-관련 사망의 주된 원인이며, 피부, 결장, 전립선 및 췌장 암이 조합된 것보다 많다. DNA 손상제, 예컨대 백금-기초 화학치료제 및 이온화 방사선은 표준 치료이고, 약 80%의 폐암 환자가 치료 과정 동안 이들 치료법을 받을 것이다. 그러나, 초기 반응에도 불구하고, 거의 모든 환자는 결국 DDA-내성 재발을 발증시켜, 환자 생존에 관여한다. 오늘날, 항 PD-1 또는 항 PD-L1 중화 항체를 이용한 면역치료법은 진행성 환자에게 치료 유망성을 보여준다. 그러나, 이러한 유의한 발전에도 불구하고, 30% 내지 40%의 환자는 여전히 면역치료법에 대한 내성을 실증하였다.
순차적인 조합 ICI + DDA 치료법의 제한된 성공은 규정하기 어렵고 좁은 민감한 치료 범위로부터 비롯된 가능성이 있다. 더욱이, ICI/DDA에 대한 내성 환경은 알려져 있지 않으며, 반응자를 비-반응자로부터 정확하게 분간할 수 있는 바이오마커가 없다. 현재까지 PD-L1의 종양 발현은 PD-1/PD-L1 저해에 대한 증강된 객관적 반응률과 연관이 있지만, 조합 반응을 예측하는 데는 민감하지도, 특이하지도, 유용하지도 않다. 치료 개입에 중요하지만, DDA가 항원 제시 및 PD-L1을 상향조절하는 방법은 완전히 명확하지 않으며, 본 발명자들은 DDA-내성 종양에서 이 경로가 저해되는지의 여부도 이해하지 못한다.
발명자들의 데이터는 스캐폴드 단백질 SQSTM1이 ICI, DDA 및 잠재적으로 ICI/DDA 조합의 임상적 성과를 긍정적으로 예측할 수 있다는 도발적인 제안을 이끌었다. 이 가설은 발명자들이 환자 코호트를 사용하여 인실리코, 생체내 및 조작된 침묵 세포주를 사용하여 시험관내에서 만든 하기의 3개의 핵심 관찰에 기초한다: i) SQSTM1 mRNA 및 단백질 발현(IHC 점수)은 비-반응자보다 ICI, RT 및 Cis 반응자에서 유의하게 더 높다. ii) 기계론적으로, SQSTM1은 DNA 수선과 면역 IFN/MHC/PD-L1 경로 둘 다의 발현을 제어한다. iii) SQSTM1 소실은 ICI 및 DDA 치료법에 대한 내재적 내성을 구동하기에 충분하다. 발명자들은 현재 공동배양 검정 및 동계 생체내 뮤린 NSCLC 모델을 사용하여 종양 면역 미세환경, 특히 T 세포-매개 항종양 면역(T 세포 침윤 및 활성화)에 미치는 SQSTM1(zz 저해제, CRISP/CAS9)의 유전적 및 약리학적 저해 효과를 평가하는 것을 목표로 한다.
SQSTM1은 면역 종양 가소성의 분자 구동자이다
본원에서, 발명자들은 SQSTM1 발현이 뚜렷한 생물학, 면역 프로파일 및 치료적 취약성을 갖는 LUAD 및 SKCM의 하위군을 정의한다는 최초의 증거를 제공한다. 수준에 따라 SQSTM1은 2개의 완전히 상이한 면역억제 프로그램을 구동한다: SQSTM1 수준이 낮은 종양은 실제로 불량한 항원 제시 및 T 세포 배제가 있어서 "콜드" 미세환경과 연관이 있는 한편, SQSTM1 발현이 높은 종양은 PD-L1 발현, T 세포 침윤, 및 고갈이 있어서 "핫"하였다.
흥미롭게도, SQSTM1은 염증, 세포 생존(NF-κB), 산화적 해독 스트레스(NRF2) 및 세포 성장(mTOR)을 제어하는 핵심 신호전달 경로의 활성화에 관여하는 중요한 스캐폴드 단백질이고; 암 발증에 직접적인 영향을 갖는 모든 프로그램 사건이다. 이와 같이, 종양단백질 SQSTM1은 종양 성장을 면역 회피와 커플링한다. 놀랍지는 않으나, SQSTM1은 마우스에서 KRAS-G12D-유도 폐 종양형성에 필수적이다. 인간에서, SQSTM1 과발현은 폐, 위장, 전립선, 간, 신장 및 유방 암에서 더 불량한 생존율과 연관이 있었다. 역설적이게도, SQSTM1 소실 또한 콜드 암 유형인 전립선암 종양형성을 증가시키는 것으로 제시되었다. 이러한 측면에서, 발명자들이 종양 면역 회피를 부여하는 것으로 본원에서 밝혀낸 SQSTM1 획득 및 소실의 능력은 이러한 논란이 되는 결과를 설명하는 데 도움이 될 수 있다.
이들 신호전달 기능 외에도, SQSTM1은 종양 세포 생존 및 약물 내성을 촉진하는 세포 과정인 최초로 확인된 자가포식 수용체였다. 따라서, 자가포식은 SQSTM1의 제거를 매개하고, ATG5 shRNA에 의한 자가포식을 저해하는 것은 SQSTM1 축적 및 일관되게는 HLA-B 과발현을 초래하였다. 더불어, 이들 데이터는 종양유전자, 염증성 사이토카인 및 자가포식 분해를 수반하는 피드백 루프에 의한 SQSTM1 발현의 현저한 제어가 "핫" 표현형과 "콜드" 표현형 사이에서 종양 세포 가소성을 결정할 연구 모델을 강하게 시사한다.
SQSTM1은 DNA 수선의 저해를 통해 DDA 및 ICI 감수성을 지배한다
발명자들은 본원에서 SQSTM1 하향조절이 DDA 및 ICI에 대한 내성의 주요 구동자임을 보여준다. 기계론적으로, SQSTM1은 DNA 수선을 억제시켰고, 동시에 MHC-I의 발현에 필수적이었다. 따라서, SQSTM1은 DDA 감수성, 종양 DNA 불안정성, 종양 돌연변이 부담 및 종양 면역력 사이에서 분자 연결을 나타낸다. 잠재적인 기전에 대한 추가 조사, 핵 내 SQSTM1의 역할은 아직 잘 이해되지 않는다. SQSTM1은 2개의 핵 위치화 신호 및 1개의 핵 외수송 신호를 함유하며, 이는 SQSTM1이 핵과 세포질 구획 사이를 고속으로 지속적으로 왕복할 수 있게 한다. DNA 손상 시, 발명자들은 SQSTM1이 DNA 수선을 저해하는 것으로 보고된 핵 DNA 손상 초점(데이터는 제시되지 않음)으로 모집됨을 발견하였다. DNA 수선 외에도, SQSTM1은 또한 몇몇 핵 수용체의 전사 활성을 결합하고 조절하는 것으로 보고되었다. 후보 중에서, 핵 외수송의 저해 시, SQSTM1 및 종양 억제자 TP53은 DNA 수선, TP53-연관 세포 주기 정지 및 세포자멸사에 관여하는 전골수성 백혈병 단백질 핵체(PML-NB)로 모집되는 것으로 나타난다. 게놈의 수호자로서, TP53은 주로 DNA 수선 단백질의 발현을 유도함으로써 게놈 안정성에서 중심적인 역할을 한다. 따라서, SQSTM1이 Tp53과 전사 복합체를 형성함으로써 DNA 수선 반응을 조절하는지의 여부를 결정하는 것은 흥미로울 것이다. SQSTM1에 의해 제어되는 이러한 전사 인자를 확인하는 것은 콜드 불응성 암에 대한 PD-L1 발현을 구제할 수 있는 새로운 치료 표적을 발견함으로써 종양 면역 생물학에서 광범위한 유의성을 가질 것이다.
종합하자면, 발명자들은 SQSTM1이 IFN 경로의 재활성화를 통해 DDA, ICI 및 ICI/DDA에 대한 종양 교차-감수성에 기여한다는 최초의 증거를 제공한다. 이는 SQSTM1을 단독치료법으로서 ICI, DDA 및 콤보 둘 다에 대한 예측 바이오마커로서 제안한다. 놀랍게도, 사용된 치료법(방사선치료법, 면역원성 세포 사멸 유도제의 유도제, 및 비-ICD 화학치료법)에 관계없이, 발명자들의 데이터는 또한 DNA 손상제에 의한 HLA-B/PD-L1 발현의 유도에서 SQSTM1의 신규하고 전반적인 역할을 밝혀낸다.
발명자들의 결과를 개별화된 치료 결정으로 번역함
면역종양학에서 치료 결정은 ICI 조합의 도입으로 점점 더 어려워지고 있다. 치료법 반응을 정확하게 예측하거나 최적의 조합을 맞춤화하는 단일 마커는 아직 나타나지 않았다. ICI/DDA 반응을 예측하고 치료 결정을 안내할 수 있는 유망한 바이오마커가 본원에서 SQSTM1에 의해 시사된다. 발명자들의 목표는 현재 SQSTM1을 ICI/DDA 반응의 제1 예측 바이오마커로 확증하는 것이며, 이러한 바이오마커는 신속하게 임상으로 번역될 수 있고 궁극적으로 FDA-승인 조합 전략의 동반 시험으로서 사용될 수 있다. 실제로, 발명자들의 발견은 4개의 잠재적으로 영향력이 큰 임상적 의미를 갖는다:
(1) 이들은 발명자들이 ICI 및 DDA에 대한 종양 회피를 위해 SQSTM1을 하향조절하는 교차-내성 기전을 확인하였으므로 순차적 단독치료법보다는 동시적인 병용 요법을 권고한다.
(2) 이들은 2개의 상이한 ICI 조합 사이에서 치료 결정을 안내할 수 있을 것이다. SQSTM1을 항원 제시 및 PD-L1 발현에 연결함으로써, 이들은 ICI, DDA 또는 ICI/시스플라틴 치료법을 SQSTM1을 과발현하는 환자로 추가로 제한함으로써 환자 선택 전략을 재정의할 수 있고, 이로써 반응률을 증가시킬 수 있었다;
(3) 이들은 또한 KRAS 및 STK11 돌연변이를 갖고 있지만 SQSTM1을 과발현하는 상당한 수의 이전에 배제된 환자를 치료하기 위한 근거를 제공할 수 있는데, 이는 본 발명자들이 A549 세포를 사용하여 시스플라틴 및 도세탁셀이 이러한 콜드 하위군을 면역치료법으로 프라이밍할 수 있다는 원리의 증거를 제공하였기 때문이다.
(4) 이들은 ICI/MTA(미세소관 표적화제: 도세탁셀, 파클리탁셀) 콤보와 함께 낮은 수준의 SQSTM1-발현 LUAD로 환자를 치료할 수 있는 새로운 치료 기회를 제공한다.
ICI/시스플라틴 또는 대안적인 ICI/도세탁셀 전략으로 전환되어 궁극적으로 ICI 효능 및 환자 성과를 향상시켜야 하는 환자군을 확인하기 위해 SQSTM1 예측 값을 중심으로 시험을 설계하는 것은 더 크고 잘-설계된 코호트로 시급히 시험되어야 한다. SQSTM1 IHC 점수에 대한 시험이 임상적으로 확증된다면, 발명자들은 ICI 및 DDA의 활용을 다른 콜드 종양으로 확장하여 환자 성과를 향상시키기를 희망한다.
재료 및 방법
세포 배양
이 연구에서 제시된 대부분의 실험을 인간 KRAS G12S/SKT11 Q37* 공동돌연변이화된 NSCLC A549 세포(American Type Tissue Collection, ATCC)로 수행하였다. 모든 세포를 10% 우태 혈청(Dutcher), 2% 소듐 피루베이트 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Life technologies)이 보충된 Dulbecco-변형 최소 필수 배지 및 Ham F-12 배지(DMEM/F12 Glutamax; Life Technologies)에서 유지시켰다. SQSTM1 넉다운 안정 세포주를 확립하기 위해, 세포를 SQSTM1의 mRNA 코딩 서열을 표적화하는 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 렌티바이러스로 형질도입하였다. 2개의 구별되는 SQSTM1 shRNA(Sigma, 인간, NM_003900, SQSTM1 #1, TRCN0000007237, 및 SQSTM1 #2, TRCN0000007236)를 사용하여 서열-의존적 표적외(off-target) 효과를 최소화하였다. 대조군으로서, 자가포식을 개시 단계에서 ATG5(Sigma, 인간, NM_004849, ATG5 #1, TRCN0000151963) 또는 ATG7 shRNA(Sigma, 인간, NM_006395, TRCN0000007584)에 의해 저해시켰다. 이러한 목적을 위해, 표적 및 대조군(Sigma; SHC002V) shRNA 렌티바이러스를 세포 내로 형질도입하였다. shRNA-매개 단백질 하향조절을 qRT-PCR 또는 특정 프라이머와 항체를 이용한 면역블로팅에 의해 제어하였다(shRNA, 프라이머 및 항체 세부사항에 대해 부록 표 1 내지 표 3을 참조).
[표 1]
[표 2]
[표 3]
세포 처리
모든 실험에 대해, 세포를 6-웰 플레이트 또는 60 mm 배양 접시에 시딩하고, 이들이 60% 내지 70% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 1% FBS가 보충된 신선한 DMEM에서 시스플라틴(Cis, 10 μM)으로 지시된 시간 동안 처리하였다. 유사한 조건 하에, 발명자들은 발명자들의 연구를 DNA 손상 및 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도하는 것으로 알려진 다른 화학치료제, 예컨대 안트라사이클린 독소루비신(Dox, 0.5 μM), 옥살리플라틴(Ox, 1.4 μM), 및 탁산(도세탁셀, D, 5 nM 및 파클리탁셀, P, 3 nM, 표 4)까지 확장하였다. 약물 농도는 용량-반응 곡선으로부터 각각의 약물에 의해 도달되는 혈액 농도의 피크에 기초하여 선택되었다[IC50: Shc A549(Cis = 24 μM +/-3.7, Dox = 364 nM +/-3, Ox = 2.61 μM +/-0.9, D= 364 nM+/-3, P= 1.4 nM +/-0.27), ShSQSTM1 A549(Cis = 47.7 μM +/-5, Dox = 486 nM +/-85, Ox = 4.51 μM +/-1, D= 21.3 nM +/-10, P= 3.7M +/- 0.7)].
대조군으로서, SQSTM1-결실 세포의 DDA 내성이 약물 유출과 관련이 없었음을 보장하기 위해, 160 ㎸/6.3 mA에서 작동하는 Faxitron X-선 시스템(CP 160 Option과 함께 모델 43855 F; Faxitron Bioptics)을 사용하여 세포를 10 Gy에서 방사선조사하였다. 방사선조사 직후, 세포를 트립신처리하고, 6-웰 플레이트에 신선한 10% FBS 배지와 함께 재시딩하였다. 모든 화학치료제를 Antoine-Lacassagne Cancer Centre로부터 입수하였다.
지시되는 경우, MRT67307(TBK1 저해제, 10 μM, Tocris) 또는 룩솔리티닙(JAK1/JAK2 저해제, 5 μM, Tocris)을 1% FBS 배지에 90분 동안 첨가한 후, 시스플라틴(10 μM)을 첨가하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 IFNγ(50 ng/ml, 24h, C-60724 Promokine)로 처리하였다.
본원에서 연구된 용량에서의 모든 약리학적 저해제는 18시간 내지 24시간 동안 세포 사멸을 유도하는 데 실패하였다. DNA 손상제가 내재성 방어를 활성화시키는 능력을 IFN, IFN-매개 신호전달, HLA-B의 발현, 및 PD-L1의 다운스트림 유도에 의해 확인하였다.
mRNA 수준의 상대적 정량화
TRI 시약(TR 118, MRC) 및 RNeasy Mini 키트(#74106, Qiagen)를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 정제하였다. 600 ng의 총 RNA를 DNAse I(18068015, Invivogen)로 처리하고, SuperScript III 역전사효소(Life Technologies)를 사용하여 역전사시켰다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석을 동일한 양의 cDNA 상에서 SYBR Green 마스터 믹스 및 Applied StepOne Plus PCR 시스템(Life technologies)을 사용하여 수행하였다. 사용된 IFN 반응 유전자의 프라이머는 표 2에 나열되어 있다. 상대 유전자 발현 변화를 2[-ΔΔCt] 방법을 사용하여 정량화하고, 비처리 세포 시료와 비교하여 하우스킵핑 유전자 RPLP0에 대해 정규화하였다.
웨스턴 블로팅
처리 후, 세포를 PBS에서 세척하고, 전체-세포 용해물(WCL)을, 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(1 mM Na3VO4, 10 mM β-글리세로포스페이트, 10 mM NaF 및 1:25, Complete TM)과 함께 3% SDS; 10% 글리세롤, 10 mM Na2PO4를 함유하는 TR3 용해 완충액으로 추출하고, 초음파처리하였다. WCL(5 내지 40 ㎍)을 이전에 기재된 바와 같이 SQSTM1, PD-L1, HLA-B, DNA 손상, 세포 주기 정지, 및 TBK1과 JAK 신호전달 경로(표 3)를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 튜불린, 액틴(#A3853, Sigma) 및 HSP90(클론 C45G5, #4877S, Cell Signaling Technology)을 로딩 대조군으로서 사용하였다. 세척 후, 1차 항체의 존재를 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합-항-마우스(1:6,000; sc-2005; Santa Cruz) 또는 -항-토끼(1:10,000; sc-45040; Santa Cruz)로 드러내고, Enhanced Chemiluminescence 검출 시스템 (Perkin Elmer)으로 시각화하였다.
유세포측정 분석
유세포측정법을 사용하여 PD-L1의 세포-표면 발현을 검사하였다. 10 μM 시스플라틴을 지시된 시간 동안 처리한 후, 세포를 트립신처리 없이 2.5 mM EDTA-PBS에서 수합하고, 항-PD-L1 항체(CD274, 브릴리언트 바이올렛 650 접합체, #329740, Biolegend) 또는 항-이소타입 항체(브릴리언트 바이올렛 650 접합체, #400351, Biolegend)로 표지하였다. 유세포측정 분석을 Cytoflex 유세포측정기(10,000개 세포, Cytoflex software) 상에서 수행하였다. MFI(PD-L1)에서 MFI(이소타입 대조군)를 차감하여 MFI(PD-L1-이소타입)을 계산한다.
데이터세트 분석
cBio 암 게놈 포탈(http://www.cbioportal.org/public-portal/) 및 Phantasus 소프트웨어(https://artyomovlab.wustl.edu/phantasus/)를 사용하여 암 게놈 아틀라스(TCGA) PanCancer Atlas 및 암 세포주 백과사전(CCLE)으로부터 데이터를 마이닝(mine)하였다.화학치료법, 방사선치료법 및 면역치료법으로 치료된 암 환자의 몇몇 데이터세트(RNAseq, DNA 마이크로어레이)를 Gene Expression Omnibus(GEO 데이터베이스, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)로부터 다운로드하였다. 각각의 종양에서 T-림프구 침윤, DNA 손상 반응, IFN (C2CGP, C2 반응물(reactome), C5BP, 및 "특징")의 시그너처는 유전자 세트 농축 분석(GSEA: Gene Set Enrichment Analysis) 및 ssGSEA 분석에 의해 CD274 / PD-L1, CD8A/B, HLA- 및 SQSTM1 발현의 유전자 발현과 상관관계가 있었다. TCGA 암-유형 약어의 완전한 목록에 대해서는, https://gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations을 참조하길 바란다.
환자 코호트
폐 선암종(LUAD)을 갖는 환자 코호트를 Laboratory of Clinical and Experimental Pathology(프랑스 니스 소재)에서 실시하였고, University 가 2010년 1월 1일과 2018년 4월 1일 사이에 조사하였다. 연구를 REMARK-가이드라인에 따라 수행하고, Ethics Commission of the Nice University Hospital에 의해 승인을 받아 서명 동의서에 대한 요건을 면제하였다. 처음에, 468명의 환자가 병리 기록에 따라 LUAD 진단의 선정 기준을 충족하였다. p40 및 TTF-1에 대한 면역조직화학적 염색은 연구에 포함된 종양의 선 분화를 확실하게 확인시켜 주었다. 더욱이, 모든 종양의 슬라이드를 병기-관련 특징(예컨대 흉막 침범)에 관하여 재평가하였다. 모든 종양은 UICC TNM-분류 8판에 따라 병기가 재분류되었다(re-staged). 사례 수집은 최종적으로 초기(I 내지 IIIA)의 287개 종양 및 말기(IIIB 내지 IV)의 181개 종양을 포함하였다. 아쥬반트 화학치료법 및/또는 방사선치료법을 70/181명(39%)의 환자에게 투여하였고, EGFR TKIs를 18/181명(10%)에게 투여하였고, 1차(펨브롤리주맙) 또는 2차(니볼루맙) 면역치료법을 37/181명(20%) 및 41/181명(23%)의 환자에게 각각 투여하였다. 15/181명(8%)의 환자는 임의의 아쥬반트 치료 전에 사망하였다.
면역조직화학 염색 및 채점
p62/SQSTM1, PD-L1/CD274, 및 CD8에 대한 면역조직화학 염색을 SQSTM1(희석 1/400, BD Transduction Laboratories™), PD-L1(클론 22C3, 희석 1/50, Dako, Inc.) 및 CD8(세포독성 T 세포; 클론 SP57, 사전희석됨; Ventana)(표 3)에 대해 이전에 기재된 바와 같이 자동화된 Ultra Ventana(Ventana, 미국 아리조나주 투쏜 소재)를 사용하여 4 μm 섹션 상에서 수행하고, 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다. 종양 세포의 다양한 하위세포성 구성요소에서 검출된 SQSTM1에 대한 면역조직화학 염색 패턴의 채점을 모든 전체 섹션에 걸쳐 수행하였다: 도트(dot)-유사 염색을 하기와 같이 0 내지 3으로 채점하였다: 점수 0은 5% 미만의 종양 세포에서 보이는 도트가 없거나 거의 없음, 점수 1은 5% 내지 25%의 종양 세포에 도트가 있음, 점수 2는 25% 내지 75%의 종양 세포에 도트가 있음, 점수 3은 75% 초과의 종양 세포에 도트가 있음. SQSTM1 세포질 염색을 하기와 같이 0 내지 3으로 채점하였다: 점수 0은 염색이 없거나 희미함, 점수 1은 약한 염색, 점수 2는 볼 수 있는 중간 염색, 및 점수 3은 강한 염색. SQSTM1 핵 면역조직화학 염색을 하기와 같이 0 내지 1로 채점하였다: 점수 0은 10% 미만의 핵에서 볼 수 있는 핵 염색 및 점수 1은 10% 초과의 핵에서 볼 수 있는 핵 염색. 채점을 2명의 유경험 병리학자(VH 및 PH)가 40x 대물렌즈 배율에서 수행하였다. 그 후에, 임상병리학적 특징과의 상관관계를 위해, 면역조직화학 점수를 낮음 또는 높음으로 그리고 단일 값의 예후 값에 따라 추가로 분류하였다. 도트-유사 및 세포질 SQSTM1 염색을 점수 0 내지 1의 경우 낮음으로, 점수 2 내지 3의 경우 높음으로 분류하였다. SQSTM1에 대한 조합된 도트-유사 및 세포질 염색을 0 내지 2의 합계 점수에 대해 낮음으로 그리고 3 이상의 원시값(raw value)의 합계 점수에 대해 높음으로 분류하였으며, 이는 최상의 예후 구분을 보여준다. SQSTM1 핵 염색 점수 0을 낮음으로, 점수 1을 높음으로 분류하였다. PD-L1 양성 종양 세포를 카운팅하고, 하나의 컷오프를 사용하였다(>50% PD-L1 양성 종양 세포). 종양내 CD8 양성 세포를 카운팅하고, 종양을 종양 발현자 없음(-), 낮음(+), 중간(++) 및 높음(+++)으로 분류하였다.
SQSTM1, PD-L1 및 CD8 상태에 따른 하위 분류. SQSTM1 도트-유사/세포질, PD-L1 및 CD8 염색의 조합은 사례를 3개의 하위유형으로 계층화하였다: 낮은 SQSTM1 도트-유사 세포질/낮은 PD-L1/낮은 CD8 염색(LLL); 높은 SQSTM1 도트-유사 세포질/높은 PD-L1/높은 CD8(HHH); 및 높은 SQSTM1 도트-유사 세포질/낮은 PD-L1; 높은 CD8 염색(HLH).
통계적 분석
통계적 분석을 위해, GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 크로스탭, 짝이 없는 비모수 T 검정, χ2 검정, ANOVA 및 Fisher의 정확 검정을 사용하여 군 비교를 수행하였다. 값을 평균 및 표준 편차(SD)로 제시한다. P < 0.05는 통계적 유의성을 달성한 것으로 설정되었다. 재발까지의 시간(TTR)을 포괄한 생존율 분석은 절제일로부터 국소 또는 전이성 재발 또는 질환-특이적 사망까지 측정되었다. 질환-특이적 생존율(DSS)은 진단 시점으로부터 질환-특이적 사망까지 결정되었다. 전체 생존율(OS) 및 무병 생존율(DFS)을 계산하였다. 카플란-마이어 곡선 및 로그-순위 검정을 단변량 생존율 분석에 사용하였다. 다변량 분석을 위해, Cox 회귀 분석을 사용하였다. 모든 통계 검정의 유의성 수준을 <0.05의 p-값으로 설정하였다.
실시예 2: SQSTM1은 진행성 흑색종에서 면역치료법 예측 바이오마커이다
발명자들은 항-PD1 면역치료법으로부터 유익성을 받는 또 다른 면역원성 고형 종양인 진행성 피부 흑색종(SKCM)에서 예측 바이오마커로서 SQSTM1의 관심을 확증하였다.
1. 근거
전이성 또는 진행성 흑색종은 치명적인 피부암으로서, 현재까지 5년 생존율이 30% 미만이다. 프로그래밍된 사멸-1(PD-1) 및 이의 리간드인 PD-L1을 표적화하는 면역 관문 저해제(ICI)의 개발은 5년 전체 생존율 중앙값을 52% 증가시키는 진정한 패러다임 전환을 나타낸다. 그러나, ICI에 대한 지속적인 반응은 단지 환자 하위세트로 제한된 반면, 환자의 40%는 단독치료법에서 ICI에 반응하지 않는다.
대부분의 임상 시험에서, 면역조직화학에 의해 평가된 PD-L1의 발현은 반응하는 환자의 선택을 허용하지 않는다(문헌[Robert C et al., 2015]). 발명자들은 SQSTM1 수준이 증가한 비-소세포 폐암 환자가 낮은 수준의 환자보다 더 양호한 반응을 갖는다는 최초의 증거를 제공하며, 이는 SQSTM1이 ICI에 대한 반응의 예측자임을 강하게 나타낸다. 본원에서 발명자들의 연구 목적은, SQSTM1 평가가 재발성 또는 전이성 흑색종 환자에서 효과적인 예측 바이오마커가 될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 ICI 반응에 대한 종양내 PD-L1 및 CD8+ T 림프구의 침윤의 정량화와 조합된 흑색종 세포에서 SQSTM1의 발현을 상관관계 짓는 것이었다.
2. 재료 및 방법
a) 환자 및 조직 시료(문헌[ M, et al. Oncoimmunology. 2021 Mar 19;10(1):1901446]). 이 후향적 코호트는 2013년 7월부터 2017년 2월 사이에 진단되고 University of Nice의 Archet 2 Hospital(프랑스 니스 소재)의 피부과에서 치료를 받은 연속적인 원발성 피부 악성 흑색종 환자 125명을 포함하였다. 처음에 I기 내지 II기 흑색종으로 진단된 환자는 국소 또는 원격 전이 재발 시점에 연구에 등록되었다. 전이로부터의 조직학적 재료의 가용성 및 정보에 입각한 서명된 동의서의 존재는 연구에 사례를 포함시키기 위한 필수 기준이었다.
125명의 환자 중에서, 91명(73%)은 국소 전이(전이 중 35개 및 림프절 전이 56개) 및 34명(27%)은 원격 전이(19개의 폐 및 15개의 피하 전이 부위)를 제시하였다.
이 연구에서 2개의 환자군이 구별되었다: 적어도 하나의 면역치료법(항-PD-1 저해제-펨브롤리주맙/니볼루맙 및/또는 항-CTLA4) 치료를 받은 58명(46%)의 환자군 및 면역치료법 치료를 받지 않았고 대신에 일부가 다른 치료(항-BRAF 및 항-MEK 제제와 함께 표적화된 치료법 또는 화학치료법)를 받은 67명(53%)의 환자군.
모든 종양 시편을 환자로부터의 정보에 입각한 서명된 동의서와 함께 사용하였다. 이 연구는 지역 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee, Nice University Hospital Center/hospital-related Biobank BB-0033-00025; http://www.biobank-cotedazur.fr/)의 승인을 받았고, 헬싱키 선언의 하기 지침에 따라 수행되었다.
b) 이전에 기재된 바와 같이 SQSTM1 항체를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 간략하게는, 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 연속 4 μm 조직 섹션을 새로 절단하고, 파라핀을 제거하고, 사전처리하고, BenchMark ULTRA 자동염색기(Ventana Medical Systems, 미국 아리조나주 투쏜 소재) 상에서 SQSTM1에 대한 단일클론 항체(BD Transduction Laboratories™, 610833)로 염색하였다. 기질로서 3,3-디아미노벤지딘(DAB, OptiView Kit, Roche Diagnostics, Ventana, 카탈로그 번호 760-700)과 함께 항-면역글로불린-커플링된 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용하여 염색을 검출하였다. 핵 대조염색을 Mayer 헤마톡실린으로 수행하였다. 각각의 IHC 실행은 양성 대조군 및 음성 Ab 대조군(완충액, 1차 Ab 없음)을 함유하였다.
c) 면역조직화학의 평가. 관찰자간 및 관찰자내 변동성. SQSTM1(세포질 및/또는 핵)에 대한 면역조직화학 채점을 관찰자내 및 관찰자간 변동성에 대해 검사하였다. 2명의 병리학자는 독립적으로 임상병리학적 데이터에 대한 지식 없이 면역조직화학적 염색 결과를 평가하였다. 2명의 병리학자의 관찰자간 일치도는 높았다(α=0.97). 채점의 관찰자내 일치도 또한 높은 합의를 보여주었다. 불일치 결과는 다중헤드 현미경을 사용하여 해결되었다.
d) IHC 채점. 각각의 사례의 면역조직화학 염색의 강도, 백분율 및 하위세포 위치화를 기록하였다. 1차 항체를 생략한 염색을 음성 대조군으로서 수행하였다. 양성으로 염색된 세포의 강도와 백분율을 저전력 필드(x 100)에서 스캔한 다음, 고출력 필드(× 400)에서 평가하였다. SQSTM1 염색을 세포질 및 핵에서 확인하였다. SQSTM1 염색의 강도를 음성, 약함, 중간 및 강함 염색을 지칭하는 0, 1, 2 및 3으로 각각 기록하였다(아래 참조). SQSTM1 양성 세포의 백분율을 0% 내지 100%로 기록하였다. 염색 결과를 양성 세포의 백분율(P)에 강도(I)를 곱하여 수득된 신속(Q) 점수를 사용하여 채점하였다(Q=P × I; 최대=300; 문헌[Charafe-Jauffret et al., 2004]). 흑색종의 Q 점수의 중앙값을 컷오프 포인트로 사용하여 암을 '낮은 발현'과 '높은 발현'으로 분류하였다. 군들 사이의 차이를 조사하기 위해 χ2 검정 또는 스튜던트 t-검정을 사용하였다. 도 31.
3. 결과
SQSTM1은 핵세포질 왕복 단백질이지만 피부 발암과 면역치료법에 대한 반응과 하위세포성 위치화의 연관성은 지금까지 문서화되지 않았다.
발명자들은 ICI로 치료된 58명의 환자 중에서 면역조직화학에 의해 검출되고 디지털 분석 임상병리학적 특징 및 전체 생존율(OS)에 의해 정량화된 바와 같이 종양내 및 CD8+ T 림프구와 조합된 흑색종 세포에서 발현된 SQSTM1의 연관성을 후향적으로 평가하였다.
이들은 흑색종이 정상적인 피부보다 더 강한 SQSTM1 발현을 표시하였음을 발견하였다. ICI-치료 흑색종 중에서, 비-반응자 흑색종은 제한된 세포질 SQSTM1 염색을 나타내었다. 대조적으로, 반응자 흑색종은 세포질 및 핵 SQSTM1 발현에서 최고의 증가를 나타내었다. 2개 군(비-반응자 및 반응자) 사이의 세포질 및 핵 발현의 차이는 통계적으로 유의하였다(p-값 = 0.00026). 전체적으로, 이들 발견은 피부 흑색종의 ICI 예측 바이오마커로서 핵 및 세포질 SQSTM1 염색의 관심에 대한 최초의 증거를 제공하였다.
실시예 3: SQSTM1은 폐 선암종(LUAD)에서 면역치료법 계층화를 위한 액체 생검 내 순환 바이오마커이다
발명자들은 또한 LUAD에서 향상된 면역치료법 계층화를 위한 액체 생검 내 비침습적 순환 바이오마커로서 SQSTM1의 예측 값을 평가하였다.
1. 근거
분자 시험을 위한 적절한 종양 조직을 수득하는 것은 조직 생검에 접근할 수 없거나 수행하기가 극도로 어려운 진행성 또는 전이성 질환 환자에서 또는 종양 세포의 비율이 낮은 경우(분자 시험 및/또는 PD-L1 발현의 강력한 평가를 위해 추출된 핵산의 양이 적음) 점점 더 어려워지고 있다. 그러므로, 충족되지 않은 진단 필요성은 면역치료법으로부터 유익성을 받을 수 있는 환자를 확인하는 비침습적 접근법을 촉구한다. 최근에, i) 발명자들은 ISET® 플랫폼을 사용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 순환 종양 세포(CTC)를 특이적으로 단리하기 위한 프로토콜을 사용하였고(종양 세포의 크기에 의한 단리, 문헌[Hofman V 2011a/b]), ii) 발명자들은 모든 진행성 폐암(NSCLC) 환자가 아닌 일부 환자의 혈액에서 순환 종양 세포(CTC) 상의 PD-L1의 과발현을 성공적으로 보고하였고; iii) 발명자들은 CTC에서의 PD-L1 발현과, 매칭된 폐 생검을 상관관계 지었고; iv) 그러나, PD-L1 위양성 및 위음성 염색의 부정확성이 남아 있다(문헌[ M, et al. Ann Oncol. 2018 Jan 1;29(1):193-199]).
NSCLC 환자에서, 종양 생검에서 SQSTM1 발현은 PD-L1 저해제에 대한 향상된 유익성과 상관관계가 있었다. 그러므로, 발명자들은 CTC 둘 다에서 ISET 플랫폼 SQSTM1 발현을 사용하여 혈액 시료에서 PD-L1 및 SQSTM1 발현의 유병률(prevalence)을 평가함으로써 종양의 PD-L1 상태에 대한 비침습적 대용물로서 CTC의 유용성을 조사하고, 40명의 진행성 NSCLC 환자 코호트에서의 종양 조직과 매칭하였다.
2. 방법
a) CTC 포착. CTC 포착을 크기-기초 여과와 세포병리학적 평가를 조합한 방법(ISET® 기술)에 의해 수행하였다. 간략하게는, 혈액 시료를 K3EDTA 또는 혈액 수집 튜브(BCT)(Streck)에 채취하고, 제조업체의 권고사항에 따라 CTC 포착을 위해 SizE of Tumor(ISET® 시스템, Rarecells, 프랑스 파리 소재)에 의한 단리에 의해 여과하였다(문헌[ M, et al. Ann Oncol. 2018 Jan 1;29(1):193-199]). 필터를 악성(CNHC-MF) 또는 불확실(CNHC-UMF) 특징을 가진 순환 비-혈액 세포의 존재에 대해 분석하였다.
b) ISET 필터 상에서의 SQSTM1 발현. CTC 검출(≥2 CNHC-MF 및/또는 CNHC-UMF)을 제시한 시료를 하기와 같이 3개의 염색되지 않은 ISET 필터 스팟에서 면역세포화학에 의한 SQSTM1 발현의 추가 분석을 위해 선택하였다: 반응 완충액 10×(카탈로그# 950-300; Ventana)를 이용한 2분의 재수화 후, 필터를 BenchMark ULTRA 자동염색기(Ventana)에서 양전하 유리 슬라이드에 놓고, IHC에 대한 SQSTM1 염색 프로토콜을 따랐다(상기 기재된 바와 같음).
SQSTM1 ICC 분석은 SQSTM1의 세포질 및 핵 발현을 평가하고, SQSTM1을 발현하는 CTC 및 WBC의 백분율을 채점하였다. 혈액 시료 및 매칭된-종양 조직의 결과는 연구가 완료될 때까지 맹검이었다.
3. 결과
발명자들은 ISET®를 사용하여 LUAD 환자 혈액 시료로부터 CTC를 단리하고, 면역세포화학적 염색에 의해 SQSTM1을 성공적으로 검출하였다. 이 개념-증명 연구는 면역치료법 반응 환자 계층화를 위한 비침습적 실시간 액체 생검으로서 CTC/SQSTM1 검정의 예측 값을 실증하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Centre National de la Recherche Scientifique
Universite Cote d'Azur
Institut National de la Sante Et de la Recherche Medicale
<120> SQSTM1 and its use in therapy
<130> BR124545
<150> EP20306577.6
<151> 2020-12-15
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Ser Leu Thr Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Lys Glu Asp Ala
1 5 10 15
Ala Arg Glu Ile Arg Arg Phe Ser Phe Cys Cys Ser Pro Glu Pro Glu
20 25 30
Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Cys Glu Arg Leu Leu
35 40 45
Ser Arg Val Ala Ala Leu Phe Pro Ala Leu Arg Pro Gly Gly Phe Gln
50 55 60
Ala His Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Asp Leu Val Ala Phe Ser Ser Asp
65 70 75 80
Glu Glu Leu Thr Met Ala Met Ser Tyr Val Lys Asp Asp Ile Phe Arg
85 90 95
Ile Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Glu Cys Arg Arg Asp His Arg Pro Pro
100 105 110
Cys Ala Gln Glu Ala Pro Arg Asn Met Val His Pro Asn Val Ile Cys
115 120 125
Asp Gly Cys Asn Gly Pro Val Val Gly Thr Arg Tyr Lys Cys Ser Val
130 135 140
Cys Pro Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Val Cys Glu Gly Lys Gly Leu His
145 150 155 160
Arg Gly His Thr Lys Leu Ala Phe Pro Ser Pro Phe Gly His Leu Ser
165 170 175
Glu Gly Phe Ser His Ser Arg Trp Leu Arg Lys Val Lys His Gly His
180 185 190
Phe Gly Trp Pro Gly Trp Glu Met Gly Pro Pro Gly Asn Trp Ser Pro
195 200 205
Arg Pro Pro Arg Ala Gly Glu Ala Arg Pro Gly Pro Thr Ala Glu Ser
210 215 220
Ala Ser Gly Pro Ser Glu Asp Pro Ser Val Asn Phe Leu Lys Asn Val
225 230 235 240
Gly Glu Ser Val Ala Ala Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ile Glu Val Asp
245 250 255
Ile Asp Val Glu His Gly Gly Lys Arg Ser Arg Leu Thr Pro Val Ser
260 265 270
Pro Glu Ser Ser Ser Thr Glu Glu Lys Ser Ser Ser Gln Pro Ser Ser
275 280 285
Cys Cys Ser Asp Pro Ser Lys Pro Gly Gly Asn Val Glu Gly Ala Thr
290 295 300
Gln Ser Leu Ala Glu Gln Met Arg Lys Ile Ala Leu Glu Ser Glu Gly
305 310 315 320
Arg Pro Glu Glu Gln Met Glu Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp
325 330 335
Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp Pro Ser Thr Gly Glu
340 345 350
Leu Gln Ser Leu Gln Met Pro Glu Ser Glu Gly Pro Ser Ser Leu Asp
355 360 365
Pro Ser Gln Glu Gly Pro Thr Gly Leu Lys Glu Ala Ala Leu Tyr Pro
370 375 380
His Leu Pro Pro Glu Ala Asp Pro Arg Leu Ile Glu Ser Leu Ser Gln
385 390 395 400
Met Leu Ser Met Gly Phe Ser Asp Glu Gly Gly Trp Leu Thr Arg Leu
405 410 415
Leu Gln Thr Lys Asn Tyr Asp Ile Gly Ala Ala Leu Asp Thr Ile Gln
420 425 430
Tyr Ser Lys His Pro Pro Pro Leu
435 440
<210> 2
<211> 2840
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
acggcccgtt ttccgccagc tcgccgctcg ctatggcgtc gctcaccgtg aaggcctacc 60
ttctgggcaa ggaggacgcg gcgcgcgaga ttcgccgctt cagcttctgc tgcagccccg 120
agcctgaggc ggaagccgag gctgcggcgg gtccgggacc ctgcgagcgg ctgctgagcc 180
gggtggccgc cctgttcccc gcgctgcggc ctggcggctt ccaggcgcac taccgcgatg 240
aggacgggga cttggttgcc ttttccagtg acgaggaatt gacaatggcc atgtcctacg 300
tgaaggatga catcttccga atctacatta aagagaaaaa agagtgccgg cgggaccacc 360
gcccaccgtg tgctcaggag gcgccccgca acatggtgca ccccaatgtg atctgcgatg 420
gctgcaatgg gcctgtggta ggaacccgct acaagtgcag cgtctgccca gactacgact 480
tgtgtagcgt ctgcgaggga aagggcttgc accgggggca caccaagctc gcattcccca 540
gccccttcgg gcacctgtct gagggcttct cgcacagccg ctggctccgg aaggtgaaac 600
acggacactt cgggtggcca ggatgggaaa tgggtccacc aggaaactgg agcccacgtc 660
ctcctcgtgc aggggaggcc cgccctggcc ccacggcaga atcagcttct ggtccatcgg 720
aggatccgag tgtgaatttc ctgaagaacg ttggggagag tgtggcagct gcccttagcc 780
ctctgggcat tgaagttgat atcgatgtgg agcacggagg gaaaagaagc cgcctgaccc 840
ccgtctctcc agagagttcc agcacagagg agaagagcag ctcacagcca agcagctgct 900
gctctgaccc cagcaagccg ggtgggaatg ttgagggcgc cacgcagtct ctggcggagc 960
agatgaggaa gatcgccttg gagtccgagg ggcgccctga ggaacagatg gagtcggata 1020
actgttcagg aggagatgat gactggaccc atctgtcttc aaaagaagtg gacccgtcta 1080
caggtgaact ccagtcccta cagatgccag aatccgaagg gccaagctct ctggacccct 1140
cccaggaggg acccacaggg ctgaaggaag ctgccttgta cccacatctc ccgccagagg 1200
ctgacccgcg gctgattgag tccctctccc agatgctgtc catgggcttc tctgatgaag 1260
gcggctggct caccaggctc ctgcagacca agaactatga catcggagcg gctctggaca 1320
ccatccagta ttcaaagcat cccccgccgt tgtgaccact tttgcccacc tcttctgcgt 1380
gcccctcttc tgtctcatag ttgtgttaag cttgcgtaga attgcaggtc tctgtacggg 1440
ccagtttctc tgccttcttc caggatcagg ggttagggtg caagaagcca tttagggcag 1500
caaaacaagt gacatgaagg gagggtccct gtgtgtgtgt gtgctgatgt ttcctgggtg 1560
ccctggctcc ttgcagcagg gctgggcctg cgagacccaa ggctcactgc agcgcgctcc 1620
tgacccctcc ctgcaggggc tacgttagca gcccagcaca tagcttgcct aatggctttc 1680
actttctctt ttgttttaaa tgactcatag gtccctgaca tttagttgat tattttctgc 1740
tacagacctg gtacactctg attttagata aagtaagcct aggtgttgtc agcaggcagg 1800
ctggggaggc cagtgttgtg ggcttcctgc tgggactgag aaggctcacg aagggcatcc 1860
gcaatgttgg tttcactgag agctgcctcc tggtctcttc accactgtag ttctctcatt 1920
tccaaaccat cagctgcttt taaaataaga tctctttgta gccatcctgt taaatttgta 1980
aacaatctaa ttaaatggca tcagcacttt aaccaatgac gtttgcatag agagaaatga 2040
ttgacagtaa gtttattgtt aatggttctt acagagtatc tttaaaagtg ccttagggga 2100
accctgtccc tcctaacaag tgtatctcga ttaataacct gccagtccca gatcacacat 2160
catcatcgaa gtcttcccca gttataaaga ggtcacatag tcgtgtgggt cgaggattct 2220
gtgcctccag gaccaggggc ccaccctctg cccagggagt ccttgcgtcc catgaggtct 2280
tcccgcaagg cctctcagac ccagatgtga cggggtgtgt ggcccgagga agctggacag 2340
cggcagtggg cctgctgagg ccttctcttg aggcctgtgc tctgggggtc ccttgcttag 2400
cctgtgctgg accagctggc ctggggtccc tctgaagaga ccttggctgc tcactgtcca 2460
catgtgaact ttttctaggt ggcaggacaa attgcgccca tttagaggat gtggctgtaa 2520
cctgctggat gggactccat agctccttcc caggacccct cagctccccg gcactgcagt 2580
ctgcagagtt ctcctggagg caggggctgc tgccttgttt caccttccat gtcaggccag 2640
cctgtccctg aaagagaaga tggccatgcc ctccatgtgt aagaacaatg ccagggccca 2700
ggaggaccgc ctgccctgcc tgggccttgg ctgggcctct ggttctgaca ctttctgctg 2760
gaagctgtca ggctgggaca ggctttgatt ttgagggtta gcaagacaaa gcaaataaat 2820
gccttccacc tcaccgcaaa 2840
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SQSTM1 fragment
<400> 3
gatcaacttc aatgcccaga ggttttt 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> SQSTM1 fragment
<400> 4
gttctcttta atgtagattc ggttttt 27
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ATG5 fragment
<400> 5
ccggcctgaa cagaatcatc cttaactcga gttaaggatg attctgttca ggttttttg 59
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ATG7 fragment
<400> 6
ccgggcctgc tgaggagctc tccatctcg 29
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> controle shRNA
<400> 7
agttggtgct cttcatcttg ttgttttt 28
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 8
tgagccgcga ctgtgatg 18
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 9
gtctcggtga caaagtcgaa gtt 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 10
gctgaggcat gagaatcgct tgaa 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 11
ggaggatcgc ttgaggttag gagtt 25
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 12
gggacaagaa tgccaccaaa 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 13
gaaccacatg acccagcg 18
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 14
aatgtgaatc cagccaggaa aggc 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 15
actggattac actccaggaa ccgt 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 16
ctgtcatgtc aggtccaaag cc 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 17
ttccctcaca ttgtcattga gcc 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 18
gacctctgtc ttacttgtgg agc 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 19
cgtcagatgg tgccagcaat ag 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 20
ctcaggttgc atgactggtg g 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 21
gaggcctctg tcaccttcaa c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 22
ggacgccttg gaagagtcac t 21
<210> 23
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 23
caggtcccaa ttc 13
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 24
gactccatct tggctgtga 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 25
tgatttctgc tctgacaacc t 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 26
tgcatcttct ccgtcatctc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 27
tagcagccga caccagcctg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 28
tgaatccaga atcgaaggcc a 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 29
tgcatcgatt ttgctcccct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 30
gggcattcca gaaagatgag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 31
ccgtgacagt aaatgcgttc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 32
ccctcaccct gagatgggag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 33
agctccgatg accacaactg 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 34
aggaaaggtg cttccgaggt ag 22
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 35
ggactgagga agacaaccag gt 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 36
gcatcagtac cccattctat cat 23
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 37
aggtgtaatc cgtctccaca ga 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 38
cagttccctc cagcttcaat g 21
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> oligonucleotide for PCR reaction
<400> 39
acccagccga caaaatgc 18
Claims (13)
- 종양 세포의 하기에 대한 반응을 시험관내에서 조절하기 위한, SQSTM1/p62 단백질의 용도:
- ICI라고도 하는 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor)에 대한 면역치료법;
또는
- ICI와 화학치료법의 조합. - 제1항에 있어서, 상기 SQSTM1/p62 단백질은 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는, 용도.
- 치료법에 대한 종양의 내성을 시험관내에서 예측하는 방법으로서, 상기 치료법은 ICI, 또는 ICI와 화학치료법의 조합이고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료 내 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* SQSTM1/p62 단백질이 상기 생물학적 시료에 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때 종양은 치료법에 내성인 경향이 있을 것임, 및
* SQSTM1/p62 단백질이 상기 생물학적 시료에 존재하거나 대조군 수준보다 높을 때 치료법에 대해 감수성이 있는 경향이 있을 것임. - 제3항에 있어서, SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재는 생물학적 시료에서 인시츄(in situ)로, 바람직하게는 조직 생검 또는 액체 생검에서 평가되는, 방법.
- 종양을 앓고 있는 환자의 생존율을 시험관내에서 예측하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료에서 평가된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때, 환자는 5년 후에 80% 초과의 생존율을 가질 것임, 및
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 5년 후에 70% 미만의 생존율을 가질 것임. - 제5항에 있어서,
- PD-L1 단백질, 및
- CD8+ T 림프구
의 존재, 부재, 또는 양은 SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양에 동시적으로(concomitantly) 평가되고, 대조군 시료에서 평가된 각각의 PD-L1 단백질 및 CD8+ T 림프구의 존재, 부재, 또는 양과 비교되고, 그리고
상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62 단백질, PD-L1 단백질 및 CD8+ Ｔ 림프구가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 5년 후에 50% 미만의 생존율을 가지게 될, 방법. - 종양을 앓고 있고, ICI 또는 ICI와 화학치료법의 조합으로 치료된 환자의 생존율을 시험관내에서 예측하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
- 종양으로부터 기원하는 생물학적 시료에서 SQSTM1/p62 단백질의 존재 또는 부재 또는 양을 평가하는 단계,
- SQSTM1/p62 단백질의 존재, 부재, 또는 양을 대조군 시료에서 평가된 SQSTM1/p62 단백질의 양과 비교하는 단계,
- 하기를 결론 내리는 단계:
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 부재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 이하일 때, 환자는 20개월의 치료 후에 10% 이하의 생존율을 가질 것임, 및
* 상기 생물학적 시료 내 SQSTM1/p62가 존재하거나 대조군 시료에서 수득된 양 초과일 때, 환자는 20개월의 치료 후에 50% 이상의 생존율을 가질 것임. - 염증을 수반하는 병태(pathology)를 치료하기 위한 용도를 위한 조성물로서:
- SQSTM1/p62 단백질; 또는
- 상기 SQSTM1/p62 단백질을 코딩하는 핵산 분자
를 관문 저해제에 대한 면역치료 항체 또는 화학치료제와 관문 저해제에 대한 면역치료 항체의 조합과 함께 포함하는,
용도를 위한 조성물. - 제8항에 있어서, 염증을 수반하는 상기 병태는 암, 특히 원발성 종양 또는 전이성 종양, 특히 폐암, 신장암, 방광암, 두경부암, 자궁암, 흑색종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 거대 B 세포 림프종(Large B cell lymphoma) 메클 질환(Merkel disease), 간세포 암종 및 위장암, 바람직하게는 미소부수체 불안정성을 갖는 위장암(gastro-intestinal cancer with minisatellite instability)인, 용도를 위한 조성물.
- 키트로서:
- SQSTM1 단백질,
- 관문 저해제에 대한 면역치료법을 유도하는 데 유용한 항체, 및
- 화학치료제를 포함하며, 바람직하게는 상기 화학치료제는 백금 화합물, 또는 파클리탁셀(Paclitaxel) 또는 도세탁셀(Docetaxel) 화합물을 함유하는 화학치료제, 또는 방사선치료법인, 키트. - 제12항에 있어서, 상기 항체는 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항- CTLA-4 항체인, 키트.
- SQSTM1/p62 단백질을 발현하지 않는 종양 또는 대조군 조직 내 SQSTM1/p62 단백질의 수준보다 낮은 수준에서 SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 종양을 치료하기 위한 용도를 위한, 탁산(taxane)과 연관된 면역치료 ICI 화합물을 포함하는 조성물.
- SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 종양 또는 대조군 조직 내 SQSTM1/p62 단백질의 수준보다 높은 수준에서 SQSTM1/p62 단백질을 발현하는 종양을 치료하기 위한 용도를 위한, DNA 손상-유도제와 연관된 면역치료 ICI 화합물을 포함하는 조성물.
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