ES2679994T3

ES2679994T3 - Péptidos relacionados con TCR-V-BETA para el tratamiento y diagnóstico de enfermedad autoinmune

Info

Publication number: ES2679994T3
Application number: ES12198289.6T
Authority: ES
Inventors: Arpi Matossian-Rogers
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-08-11
Filing date: 2006-08-09
Publication date: 2018-09-03
Anticipated expiration: 2026-08-09
Also published as: BRPI0614366A2; AU2006277785B2; EP1919952A2; EA015629B1; CA2618796A1; CU20080021A7; JP5738333B2; NZ595387A; EP2578602B1; IL222879A0; DK2594591T3; EP2594591A2; NZ566245A; IL189407A; WO2007017686A3; NZ595386A; AU2006277785A1; CU23793B7; GB2429013A; CY1120640T1

Abstract

Un péptido que comprende dos o más péptidos monoméricos enlazados entre sí, en el que cada uno de los péptidos monoméricos se selecciona de: (a) un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos QQYNSYPLT (SEQ ID NO:16); (b) una variante extendida de un péptido de (a) que incluye entre 1 y 5 residuos de aminoácidos adicionales en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal ; y (c) una variante truncada de un péptido de (a) que incluye 1 deleción de aminoácidos en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal, para su uso en terapia de una enfermedad.

Description

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DESCRIPCION

Péptidos relacionados con TCR-V-BETA para el tratamiento y diagnóstico de enfermedad autoinmune

La invención se refiere a péptidos derivados de anticuerpos con reactividad contra un epítopo de enlace a GPI y ligandos funcionalmente equivalentes. Estos péptidos pueden usarse en la terapia y diagnóstico de una variedad de enfermedades, todas las cuales se consideran provocada por la presencia inapropiada en el cuerpo de autoanticuerpos que son reactivos con los epítopos de enlace a GPI. En la presente se divulga un mecanismo de acción de estos autoanticuerpos que compromete el organismo, provocando así la enfermedad, y describe un método de prevención de la enfermedad y la detección de dicho autoanticuerpo.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a un nuevo concepto en relación con la causa de enfermedades autoinmunes, y otras enfermedades actualmente no consideradas autoinmunes. Este concepto fue descrito originalmente en la solicitud de patente internacional WO99/05175, donde la incidencia de autoanticuerpos de origen natural con una reactividad específica se ligó con varias enfermedades autoinmunes, como la diabetes. El concepto es que la mayoría de las enfermedades de origen infeccioso o no infeccioso, con o sin predisposición genética o afecciones relacionadas con el proceso de envejecimiento, se manifiestan o se agravan por la aparición de un autoanticuerpo multiespecífico. Una gran proporción de la población genera este autoanticuerpo, que compromete todos los sistemas y órganos que son afectados por niveles de glucosa en sangre, niveles de insulina, otros niveles hormonales controlados por o que afectan a la insulina y/o moléculas ligadas a GPI, otras moléculas reguladoras reconocidas por el autoanticuerpo y fosfolípidos. Estos autoanticuerpos tienen el potencial de acelerar el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad, promover cánceres, mediar en la manifestación de enfermedades ya sean o no con base en la predisposición genética, e interferir con la defensa de primera línea contra agentes infecciosos. Es decir, existe un problema patógeno subyacente que es la producción del autoanticuerpo que, dependiendo de la susceptibilidad individual, lleva a una o más afecciones o enfermedades problemáticas. Una analogía sería que para cualquier medicamento dado, puede haber uno o más efectos secundarios, ninguno de los cuales estaría presente en ausencia del fármaco. Por tanto, estos anticuerpos se consideran causantes de una multitud de diferentes trastornos manifestados a través del mismo mecanismo.

El autoanticuerpo patógeno está representado por un anticuerpo monoclonal que reconoce anticuerpos anti-TCR Vp, moléculas con capacidad de señalización, fosfolípidos que incluyen fosfatidil inositol, segundos mensajeros de la acción de la insulina, ADN de cadena sencilla y de cadena doble y elementos de enlace a GPI.

Aunque existen ciertas terapias para las enfermedades y afecciones que se tratan en la presente, la mayoría de estas enfermedades siguen siendo problemáticas y son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Por lo tanto, sigue habiendo una gran necesidad de derivar terapias nuevas que sean eficaces en la prevención, el tratamiento y el diagnóstico de estas afecciones. Por supuesto, en vista de la amplia variedad de enfermedades del tipo tratado en la presente, sería de gran beneficio si fuera posible derivar una única terapia que fuese efectiva para todas estas enfermedades.

El solicitante ha establecido ahora que ciertos péptidos o anticuerpos denominados anticuerpos que contrarrestan péptidos pueden usarse en la prevención, terapia y diagnóstico de una amplia variedad de enfermedades y afecciones.

La US 6.703.491 divulga la secuencia peptídica QQAAAAPAA. LA WO 01/27612 divulga las secuencias peptídicas QQYSSSPT, QQWSSNPYT, QQSNTWPLT y QQGRSYPLT. LaWO 01/68860 divulga la secuencia peptídica QYNSYPFT. Steinbergs et al. (Human Antibodies and Hybridomas, 7(3):106-112, enero de 1996) divulga la secuencia peptídica CQQYNSYPLT. La WO 99/12971 divulga la secuencia peptídica QQYNSYPLT.

Sumario de la invención

La invención proporciona un péptido que comprende dos o más péptidos monoméricos enlazados entre sí, en donde cada uno de los péptidos monoméricos se selecciona de:

(a) un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos QQYNSYPLT (SEQ ID NO: 16);

(b) una variante extendida de un péptido de (a) que incluye entre 1 y 5 residuos de aminoácidos adicionales en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal; o

(c) una variante truncada de un péptido de (a) que incluye 1 deleción de aminoácidos en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal,

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para su uso en la terapia de una enfermedad.

La invención también proporciona un péptido que comprende dos o más péptidos monoméricos enlazados entre sí, en donde cada uno de los péptidos monoméricos se selecciona de:

(a) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos QQYNSYPLT (SEQ ID NO: 16);

para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención, para su uso en la terapia de una enfermedad.

La invención también proporciona una célula huésped que incorpora la molécula de ácido nucleico de la invención, para su uso en la terapia de una enfermedad.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención, para uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.

La invención también proporciona una célula huésped que incorpora la molécula de ácido nucleico de la invención, para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(a) el péptido de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención, o la célula huésped de la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(b) el péptido de la invención mezclado con (i) por lo menos un péptido adicional junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o (ii) dos péptidos adicionales junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(c) una combinación de péptidos de la invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en terapia de una enfermedad.

(c) una combinación de péptidos de la invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.

La invención también proporciona un método in vitro para diagnosticar a un individuo la presencia o niveles de anticuerpos autoinmunes, dicho método comprendiendo poner en contacto una muestra de sangre, plasma o suero u otro fluido corporal con el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o péptido como se indica en la reivindicación 13 en presencia de un objetivo para dichos anticuerpos autoinmunes y evaluar la cantidad de dicho autoanticuerpo de origen natural que se une específicamente al objetivo.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto o realización expuesta en la presente tiene solo fines informativos.

En la presente se divulga un péptido derivado de un anticuerpo con reactividad contra un epítopo de enlace a GPI, o un ligando funcionalmente equivalente.

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El concepto que ha surgido de la investigación del Solicitante es que muchas enfermedades se manifiestan o se agravan por la aparición de un cierto autoanticuerpo. Este anticuerpo tiene reactividad contra un epítopo de enlace a GPI, pero es multiespecífico en el sentido de que también muestra reactividad contra epítopos en los anticuerpos anti-TCR Vp, moléculas con capacidad de señalización, fosfolípidos que incluyen fosfatidil inositol, fosfatidil serina y cardiolipina (diacil glicerol), y glicanos de fosfolípidos, segundos mensajeros de la acción de la insulina, ADN de cadena sencilla y doble y elementos del enlace GPI. Los elementos de este descubrimiento se informaron por primera vez en la solicitud de patente internacional WO99/05175 (A. Matossian-Rogers).

Uno de los trastornos ligados con la presencia de estos autoanticuerpos es la diabetes. El pensamiento actual con respecto a la causalidad de la diabetes no establece ningún vínculo mecanicista entre las infecciones y la teoría de la destrucción de las células T autoinmunes de células p (que posteriormente lleva a la aparición de muchos autoanticuerpos conocidos). Las observaciones calve de los aumentos iniciales en la producción de insulina y la secreción de glucagón desregulada en los diabéticos tampoco se ajustan a las teorías actuales.

Aplicando el concepto divulgado en la presente al caso específico de la diabetes, las infecciones dan como resultado la proliferación de células T monoclonales o policlonales y el aumento del número de células T que luego se regulan homeostáticamente. Esto implica la muerte de células T que liberan fragmentos del receptor de células T (TCR) que generan anticuerpos (anti-TCR Vp) mediante los cuales se identifican diferentes células T(1). Tales anticuerpos pueden a su vez estimular el desarrollo de anticuerpos anti-anti-TCR Vp. Estos anticuerpos anti-anti- TCR Vp monoclonales no solo se unen a los anticuerpos anti-TCR Vp sino también a las células a pancreáticas humanas en estudios in vitro (ver WO99/05175) Estos anticuerpos anti-anti-TCR Vp también son reactivos contra fosfolípidos como cardiolipina, fosfatidil serina y fosfatidil inositol.

Es concebible que los anticuerpos anti-anti-TCR Vp reconozcan moléculas enlazadas a GPI en células a debido a su reconocimiento reactivo cruzado de fosfatidil inositol, uno de los elementos de enlace a GPI. Se ha demostrado que el fosfatidilinositol inhibe significativamente la unión de un anticuerpo anti-GPI a la molécula objetivo enlazada a GPI(2). Los enlaces GPI son sensibles a la acción de la insulina a través de fosfolipasas activadas por insulina13,4 Se ha demostrado que las moléculas enlazadas a GPI, que se hidrolizan rápidamente por fosfolipasas, generan segundos mensajeros en lactotrofos pituitarios cultivados*51. Por tanto, es posible concebir cómo los anticuerpos que se unen a las moléculas enlazadas a GPI en las células a interrumpirían la retroalimentación negativa normal de la insulina sobre la secreción de glucagón por estas células, aumentando de este modo la producción de glucagón.

El glucagón participa en la secreción de insulina inducida por nutrientes estimulando la producción de cAMP en las células p de islotes; la producción de insulina a partir de células p purificadas aumenta marcadamente después de la adición de glucagón o células a(6). También se ha demostrado que el glucagón mejora la amplitud de la liberación de insulina pulsátil en respuesta a la glucosa(7). Por lo tanto, el efecto de tales anticuerpos sobre las células de los islotes pancreáticos debería ser la sobre-producción de insulina.

De hecho, se ha demostrado que esto es el caso y los datos presentados en la WO99/05175 apoyan esta contención. Cuando las células de islotes pancreáticos humanos aisladas de donantes cadavéricos se expusieron a anticuerpos anti-anti-TCR Vp monoclonales, se descubrió que la secreción de insulina estaba desregulada en comparación con las células control. Por tanto, la unión de los anticuerpos anti-anti-TCR Vp a las células a pancreáticas in vitro lleva a la desregulación de la secreción de insulina. Además, en los niños diabéticos recién diagnosticados, se descubrió que los autoanticuerpos se unían a los anticuerpos monoclonales anti-TCR Vp (ver Tabla 2). Estos autoanticuerpos son análogos a los anticuerpos anti-anti-TCR Vp. Estos autoanticuerpos pueden ser responsables de la falta de respuesta de las células a a estímulos fisiológicos normales en diabéticos que dan lugar a hiperglucemia y defectos contrarreguladores. Ciertamente, se sugiere un papel para estas moléculas por el hecho de que los anticuerpos anti-anti-TCR Vp monoclonales no se unen a los islotes de diabéticos tipo I establecidos, presumiblemente debido a que las moléculas objetivo están o reguladas por disminución o ya están saturadas con los autoanticuerpos.

Péptidos

Se han ideado ahora péptidos que se basan en la estructura de anticuerpos monoclonales que representan el autoanticuerpo poliespecífico descrito anteriormente. Se ha demostrado que tales péptidos son inmunogénicos en conejos y dan como resultado la generación de anticuerpos que reaccionan con un amplio espectro de sueros humanos. También se ha demostrado que dichos péptidos proporcionan efectos terapéuticos útiles en pacientes humanos. Por lo tanto se propone que los anticuerpos policlonales o monoclonales generados contra estos péptidos o ligandos equivalentes, y los mismos péptidos y ligandos equivalentes, puedan usarse tanto terapéuticamente como en técnicas analíticas para detectar cualitativa o cuantitativamente la presencia de los autoanticuerpos o contrarrestar los anticuerpos elaborados contra ellos.

Como se usa en la presente, el término "péptido" incluye cualquier fracción que comprende aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos. Este

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término se refiere tanto a cadenas cortas (5-20 aminoácidos) como a oligopéptidos de cadenas más largas (20-500 aminoácidos). Preferiblemente, el péptido comprende por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40 o por lo menos 45 aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados.

Preferiblemente, un péptido de acuerdo con la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo con reactividad contra un epítopo de enlace a GPI y uno o más de las siguientes fracciones: un anticuerpo anti-TCR Vp, una molécula con capacidad de señalización, un fosfolípido (incluyendo fosfatidil inositol, fosfatidil serina, cardiolipina (diacilglicerol) o fosfolípido glicano), un segundo mensajero de la acción de la insulina y ADN de cadena sencilla o doble. El anticuerpo también puede mostrar reactividad contra uno o más tipos de células, incluyendo células pancreáticas a humanas, células foliculares de la tiroides, células de la médula suprarrenal, el estómago y el tracto intestinal, las glándulas salivales, el ovario, el músculo estriado y el tejido conectivo dados como ejemplos de una lista no exhaustiva. El término "reactividad" significa que los anticuerpos tienen una afinidad sustancialmente mayor por los antígenos enumerados que su afinidad por otros antígenos con los que no se muestra una unión específica. Preferiblemente, esta afinidad sustancialmente mayor es de por lo menos 1,5 veces, más preferiblemente por lo menos 2 veces, más preferiblemente 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10.000 veces, 100.000 veces, 106 veces o más. Los expertos en la técnica entenderán que aunque los anticuerpos son altamente específicos, los anticuerpos particulares pueden ser altamente específicos para más de un antígeno. Se han usado varios términos en la técnica para describir este fenómeno, incluyendo el término "reactividad cruzada". Los antígenos con los que el anticuerpo reacciona de forma cruzada pueden ser estructuralmente similares o pueden ser estructuralmente distintos. Estos anticuerpos con reactividad contra un epítopo de enlace a GPI y una o más de las fracciones o tipos de células enumerados anteriormente son ejemplos de dicha "reactividad cruzada".

Un péptido de acuerdo con la divulgación puede ser por tanto un fragmento de un anticuerpo con las propiedades enumeradas anteriormente. Por ejemplo, tales fragmentos pueden derivarse de las regiones variables de anticuerpos apropiados - las porciones Fab, F(ab')2, Fv y ScFv son ejemplos de fragmentos de anticuerpos que tienen propiedades ventajosas. Los métodos para construir tales fragmentos de anticuerpos están bien documentados en la técnica (Molecular Immunology, Hames, B.D. and Glover D.M. eds., IRL Press, New York, 1996; Practical Immunology, Hay, F. y Westwood, O. Blackwell Science Ltd., 2002). Los anticuerpos preferidos a partir de los cuales derivar dichos fragmentos se describen en la solicitud de patente internacional WO99/05175.

Las regiones variables particularmente preferidas a partir de las que se pueden derivar los péptidos de acuerdo con la divulgación son aquellas cuyas secuencias se presentan en la presente como SEQ ID NO: 2 (cadena pesada) y 4 (cadena ligera). Los genes que codifican estas regiones variables se aislaron de células monoclonales murinas que secretan anticuerpos que reconocen los anticuerpos anti-TCR Vp. Las secuencias de ADN correspondientes se presentan en las SEQ ID NO: 1 y 3.

Otras regiones variables preferidas de las que pueden derivarse los péptidos de acuerdo con la divulgación son aquellas cuyas secuencias se presentan en la presente como SEQ ID NO: 18, 20, 34, 36, 50, 52, 66, 68, 82 y 84. Los genes que codifican estas regiones variables también se aislaron de células monoclonales murinas que secretan anticuerpos que reconocen anticuerpos anti-TCR Vp. Las secuencias de ADN correspondientes se presentan en las SEQ ID NO: 17, 19, 33, 35, 49, 51, 65, 67, 81 y 83.

Un péptido de acuerdo con la divulgación puede ser preferiblemente un fragmento de la región hipervariable de un anticuerpo con las propiedades enumeradas anteriormente. Las regiones hipervariables de un anticuerpo son las regiones que contactan directamente con una porción de la superficie del antígeno. Por esta razón, las regiones hipervariables también se denominan a veces regiones determinantes de la complementariedad, o CDR. Cada una de las cadenas pesada y ligera tiene tres CDR, designadas CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, y CDR- L3 en la presente.

Las regiones hipervariables particularmente preferidas de las que pueden derivarse los péptidos de acuerdo con la divulgación son aquellas cuyas secuencias se presentan en la presente como las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14 y 16.

Ciertos péptidos que se ajustan a las secuencias de estas regiones hipervariables se han construido y probado para su eficacia como antígenos capaces de unirse a anticuerpos anti-TCR Vp.

Estos péptidos tienen las secuencias de aminoácidos enumeradas en las SEQ ID NO: 8, 10 y 16 y son péptidos particularmente preferidos de acuerdo con la presente divulgación.

Otras regiones hipervariables preferidas de las cuales pueden derivarse los péptidos de acuerdo con la divulgación son aquellas cuyas secuencias que se presentan en la presente como SEQ ID NO: NOs:22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96.

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La divulgación también incluye que tales péptidos pueden enlazarse entre sí para formar dímeros o multímeros. Los dímeros o multímeros pueden ser homodímeros u homomultímeros, o pueden ser heterodímeros o heteromultímeros. Tales moléculas enlazadas pueden ser más eficaces que usar péptidos individuales en aislamiento, ya que la eficacia de unión puede aumentar debido a la mayor disponibilidad de los sitios de unión y/o el rango de epítopos mostrados. Los péptidos pueden enlazarse directamente, o pueden enlazarse entre sí mediante moléculas conectoras como aminoácidos (particularmente glicina), péptidos o grupos de enlace químico. Los multímeros preferidos incluyen homodímeros que comprenden las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:16. Los homodímeros que comprenden las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:16 y un residuos de cisteína N terminal adicional han demostrado que proporcionan efectos terapéuticos útiles en pacientes humanos (ver los Ejemplos 6 y 7 de la presente). Estos péptidos también pueden incluir combinaciones de los péptidos cuyas secuencias de aminoácidos se enumeran en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96. Las combinaciones preferidas de péptidos incluyen aquellas que incluyen los péptidos cuyas secuencias de aminoácidos se enumeran en las SEQ ID NO: 8, 10 y 16 (por ejemplo, SEQ ID NO: 8 y 10, SEQ ID NO: 8 y 16, SEQ ID NO: 10 y 16 y SEQ ID NO: 8, 10 y 16).

Los péptidos de acuerdo con los aspectos de la divulgación descritos con anterioridad pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes, modificados o por procesos naturales, como por procesamiento postraduccional o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes comúnmente en los polipéptidos de la presente divulgación están la glicosilación, la unión de lípidos, la sulfatación, la gamma-carboxilación, por ejemplo de residuos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ADP-ribosilación. Otras modificaciones potenciales incluyen la acetilación, la acilación, la amidación, la unión covalente de flavina, la unión covalente de una fracción resto hemo, la unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, la unión covalente de un derivado lipídico, la unión covalente de fosfatidilinositol, la reticulación (por ejemplo, entre residuos de cisteína), la ciclación, la formación de enlaces de disulfuro, la desmetilación, la formación de enlaces cruzados covalentes, la formación de cisteína, la formación de piroglutamato, la formilación, la formación de anclajes de GPI, la yodación, la metilación, la miristoilación, la oxidación, el procesamiento proteolítico, la fosforilación, la prenilación, la racemización, la selenoilación, la adición mediada por transferencia de ARN de aminoácidos a proteínas como la arginilación y ubiquitinación. Las modificaciones pueden tener lugar en cualquier sitio en un péptido, incluyendo el esqueleto del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos terminales amino o carboxilo.

Los péptidos de acuerdo con la divulgación pueden ser homólogos a los péptidos identificados explícitamente con anterioridad en las SEQ ID NO: NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96. Se dice que dos polipéptidos son "homólogos", como se usa el término en la presente, si la secuencia de uno de los polipéptidos tiene un grado de identidad o similitud suficientemente alto con la secuencia del otro polipéptido. "Identidad" indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud" indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Los grados de identidad y similitud pueden calcularse fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).

Típicamente, se considera que una identidad de más del 25% entre dos péptidos (preferiblemente, en una región específica como una región hipervariable) es una indicación de equivalencia funcional. Preferiblemente, los polipéptidos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la divulgación tienen un grado de identidad de secuencia con un péptido como se enumera en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96, o con fragmentos activos de los mismos, de más del 25%. Los polipéptidos más preferidos tienen grados de identidad superiores al 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%, respectivamente con estos péptidos, o con fragmentos activos de los mismos .

El porcentaje de identidad, como es referido en la presente, se determina usando BLAST versión 2.1.3 usando los parámetros predeterminados especificados por el NCBI (the National Center for Biotechnology Information;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [matriz Blosum 62; penalización por apertura de hueco=11 y penalización por extensión de hueco=1].

Los péptidos homólogos incluyen por lo tanto variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las especies de las que se derivan los péptidos) y mutantes (como mutantes que contienen sustituciones, inserciones, modificaciones o deleciones de aminoácidos) de los péptidos que se identifican explícitamente con anterioridad en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96.

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Tales mutantes pueden incluir péptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede ser o no uno que está codificado por el código genético. Tales sustituciones típicas se encuentran entre el grupo Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre los residuos básicos Lys y Arg; o entre los residuos aromáticos Phe y Tyr. Particularmente preferidas son las variantes en las que varios, es decir, entre 1 y 5, 1 y 3, 1 y 2 o solamente 1 aminoácido se sustituyen, delecionan o añaden en cualquier combinación. Especialmente preferidas son las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína. Tales mutantes también incluyen péptidos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente como se ha descrito anteriormente.

Tales variantes incluyen versiones ampliadas o truncadas de los péptidos identificados explícitamente en la presente en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96. Para variantes ampliadas, se considera altamente probable que la región antigénica de estos péptidos se pliegue correctamente y muestre actividad antigénica si se incluyen residuos adicionales C terminales y/o N terminales de las secuencias están incluidos en el fragmento peptídico. Por ejemplo, pueden incluirse5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o incluso tantos como 200 residuos de aminoácidos adicionales de los péptidos identificados en la presente explícitamente en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96, o de secuencias homólogas, en cualquiera o ambos de los extremos C terminal y/o N-terminal de los límites de los péptidos, sin perjudicar la capacidad de los fragmentos de polipéptidos para plegarse correctamente.

Para las variantes truncadas de estos péptidos, uno o más residuos de aminoácidos generalmente pueden delecionarse en uno o ambos del extremo C terminal o el extremo N terminal de los péptidos, sin comprometer la capacidad de estos péptidos para plegarse correctamente.

La razón para usar péptidos modificados, mutados o sustituidos puede ser, por ejemplo, generar péptidos que tengan propiedades terapéuticas y/o farmacocinéticas similares o mejoradas a las del péptido de tipo salvaje. Tales péptidos deberían retener la eficacia del péptido de tipo salvaje, por ejemplo, para unirse a su objetivo biológico. Por ejemplo, cuando la susceptibilidad del péptido a la escisión por peptidasas después de la inyección en el sujeto es un problema, la sustitución de un enlace peptídico particularmente sensible con un mimético de péptido no escindible puede proporcionar un péptido más estable y por tanto más útil como agente terapéutico. De manera similar, la sustitución de un residuo de L-aminoácido es una forma estándar de hacer que el péptido sea menos sensible a la proteólisis, y finalmente más similar a los compuestos orgánicos distintos de los péptidos. También son útiles los grupos bloqueadores amino-terminales tales como t-butiloxicarbonilo, acetilo, teilo, succinilo, metoxisuccinilo, suberilo, adipilo, azelailo, dansilo, benciloxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, metoxiazelailo, metoxadipilo, metoxiesperilo y 2,4,-dinitrofenilo. El bloqueo de los extremos N y C terminales cargados de los péptidos tendría el beneficio adicional de mejorar el paso del péptido a través de la membrana celular hidrófoba y dentro de la célula. Las técnicas para la síntesis y el desarrollo de miméticos de péptidos y otros miméticos no peptídicos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Hruby VJ y Balse PM, Curr Med Chem 2000, 7:945- 70; Golebiowski A et al., Curr Opin Drug Discov Devel 2001, 4: 428-34; Kim HO y Kahn M, Comb Chem High Throughput Screen 2000; 3: 167-8). Por ejemplo, se han descrito miniproteínas y miméticos sintéticos capaces de alterar las interacciones proteína-proteína e inhibir la formación de complejos de proteínas (Cochran AG, Curr Opin Chem Biol 2001, 5(6):654-659). También se han divulgado en la bibliografía varias metodologías, para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas, usando sistemas de traducción tanto in vitro como in vivo, para indagar y/o mejorar la estructura y la función de proteínas (ver, por ejemplo, Dougherty DA, Curr Opin Chem Biol 2000, 4:645- 52).

La bibliografía proporciona muchos modelos en los que se puede realizar la selección de sustituciones conservadoras de aminoácidos en base a estudios estadísticos y físico-químicos sobre la secuencia y/o la estructura de la proteína natural (por ejemplo, ver Bordo y Argos, J Mol Biol 1991,217: 721-9 ; Rogov y Nekrasov, Protein Eng 2001, 14: 459-463). Los experimentos de diseño de proteínas han demostrado que el uso de subconjuntos específicos de aminoácidos puede producir proteínas plegables y activas, ayudando en la clasificación de las sustituciones de aminoácidos que pueden acomodarse más fácilmente en la estructura de la proteína, y que pueden usarse para detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales ((Murphy LR et al., Protein Eng. 2000, 13:149-52).

Los péptidos de la divulgación pueden formar parte de proteínas de fusión. Por ejemplo, a menudo es ventajoso incluir una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden contener secuencias secretoras o líder, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación, o secuencias que confieren una estabilidad proteica más alta, por ejemplo durante la producción recombinante. Alternativa o adicionalmente, el péptido maduro puede fusionarse con otro compuesto, como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol). Los péptidos también pueden fusionarse a una sustancia biológica o sintética, pueden conjugarse con fracciones como enzimas, compuestos indicadores, fármacos, toxinas o marcadores (radiactivos, fluorescentes

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u otros).

Los péptidos de la presente divulgación pueden prepararse de cualquier manera adecuada. En particular, tales métodos de preparación incluyen producción recombinante, producción sintética o una combinación de estos métodos. Para la producción sintética, pueden usarse químicas basadas en t-Boc o FMOC en métodos de síntesis de péptidos en fase sólida (ver "Solid Phase Peptide Synthesis", eds. Stewart & Young, disponible de Pierce Chem. Co). Alternativamente, puede aplicarse síntesis en fase de solución (ver" Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", Lloyd-Williams, P., Albericio, F. and Giralt, E., CRC Press, 1997).).

Los péptidos de acuerdo con la divulgación pueden compartir una homología estructural significativa con los péptidos identificados explícitamente con anterioridad en las SeQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96. En particular, los péptidos de acuerdo con la divulgación puede compartir ciertos residuos de la región hipervariable importantes con las secuencias hipervariables identificadas en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96. Se han identificado residuos de la región hipervariable importantes presentes en las SEQ ID NO : 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96 mediante comparación de secuencias de regiones hipervariables.

Se clonaron y secuenciaron las regiones hipervariables de seis anticuerpos monoclonales IgM e IgG anti- anti-TCR Vp murinos con reacción cruzada (ver los Ejemplos 1 y 5 en la presente). El análisis de las secuencias de la región hipervariable de esos anticuerpos revela información importante referente a los residuos requeridos para la unión anti-TCR Vp de reactividad cruzada (es decir, reactividad multiespecífica contra un epítopo de enlace a GPI como se describe en la presente).

En primer lugar, el análisis de las secuencias sugiere que los aminoácidos específicos pueden ser esenciales en ciertas posiciones dentro de cada CDR (ver el Ejemplo 5). Por consiguiente, los péptidos de la divulgación pueden comprender o consistir de una de las siguientes secuencias, en donde "x" indica cualquier residuo de aminoácido, en donde "-" indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Consenso 1 Consenso 2 Consenso 3 Consenso 4 Consenso 5

G-Y-x-F-T-x-x-x-x-x-W (SEQ ID NO:162) x-I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x (SEQ ID NO:163) x-A-S-x-x-x-x-x-x-x-x (SEQ ID NO:164) x-x-S-x-x-x-S (SEQ ID NO:165)

Q-Q-x-x-x-x-P-x-x (SEQ ID NO:166)

En segundo lugar, el análisis de las secuencias permitió la generación de una "fórmula general" para cada CDR basada en las secuencias clonadas (ver el Ejemplo 5). Por consiguiente, los péptidos de la divulgación pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una de las siguientes 'fórmulas generales', en donde uno de los aminoácidos mostrados entre paréntesis se selecciona en cada posición donde sea relevante, en donde '-' indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Fórmula 1 Fórmula 2

Fórmula 3 Fórmula 4 Fórmula 5 Fórmula 6

G-Y-[TA]-F-T-[RNS]-[YN]-[WGN]-[IM]-[NF]-W

[NWY]-I-[YND]-[PT]-[SY]-[DNT]- [SG]-[YDE]-[TP]-[NRT]-Y- [NSA] [QD]-[KD]-F-K-[DG]

[LKE]-[RG]-[GML]-[LTY]-[LTG]-[PGN]-[DY]-[YAF]

[KR]-A-S-[QS]-[NDS]-[VI]-[DSG]-[TNS]-[NY]-[VLY]-[ANL]

[SYR]-[AT]-S-[YRI]-[RL]-[YHA]-S

Q-Q-[YG]-[NS]-[TS]-[YFS]-P-[LTP]-[TF]

Las "fórmulas generales" anteriores abarcan todas las secuencias de CDR de los anticuerpos de reacción cruzada que han sido clonados y secuenciados por el inventor.

En tercer lugar, el análisis de las secuencias permitió que se generase una fórmula de aminoácidos para cada CDR que tiene en cuenta no solo los aminoácidos completamente conservados, sino también el aminoácido(s) más común (predominante) en cada posición de la CDR (ver Ejemplo 5). Por consiguiente, los péptidos de la divulgación pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una de las fórmulas siguientes, en donde uno de los aminoácidos mostrados entre paréntesis se selecciona en cada posición donde sea relevante, en donde '-' indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Fórmula 7 G-Y-T-F-T-R-[YN]-W-[IM]-N-W

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Fórmula 8: N-I-Y-P-[SY]-D-[SG]-Y-T-N-Y-N-Q-K-F-K-[DG]

Fórmula 9: L-[RG]-G-L-L-P-[DY]-Y

Fórmula 10: K-A-S-Q-N-V-[DSG]-T-N-V-A

Fórmula 11: S-A-S-Y-R-Y-S

Fórmula 12: Q-Q-Y-N-S-Y-P-L-T

Se cree que los péptidos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una o más de las secuencias de consenso y fórmulas anteriores tendrán actividad biológica equivalente a los péptidos probados in vivo en los Ejemplos 6 y 7 de la presente, y serán útiles de acuerdo con la divulgación.

Las secuencias de la región hipervariable identificadas en los Ejemplos 1 y 5 también se usaron para identificar secuencias de regiones hipervariables conocidas con un alto nivel de identidad de secuencia con las secuencias identificadas por el inventor y con propiedades de unión relevantes (ver

El Ejemplo 8 y las Figuras 12A a 12E en la presente). Las secuencias de la región hipervariable conocidas se compararon con las secuencias de la región hipervariable identificadas en los Ejemplos 1 y 5, para analizar adicionalmente los residuos de la región hipervariable importantes para la unión anti-TCR Vp de reactividad cruzada (es decir, reactividad multiespecífico contra un epítopo de enlace a GPI como se describe en la presente). Se identificaron una serie adicional de secuencias de consenso y fórmulas usando el mismo tipo de análisis que el empleado en el Ejemplo 5 (ver Figuras 12A a 12E).

Por consiguiente, los péptidos de la divulgación pueden comprender o consistir de una de las siguientes secuencias, en donde "x" indica cualquier residuo de aminoácido, en donde "-" indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Consenso 6 Consenso 7 Consenso 8 Consenso 9 Consenso 10 Consenso 11 Consenso 12 Consenso 13 Consenso 14 Consenso 15

G-Y-T-F-T-x-x-x-x-x-W (SEQ ID NO:167) G-Y-x-F-x-x-Y-x-M-x-W (SEQ ID NO:168) x-I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x (SEQ ID NO:169) x-1-x-P-x-x-x-x-T-x-Y-x-x-K-F-x-G (SEQ ID NO:170) x-A-S-x-x-x-x-x-x-x-x (SEQ ID NO:171) x-A-S-x-x-x-x-x-x-L-x (SEQ ID NO:172) x-x-S-x-x-x-S (SEQ ID NO:173) x-T-S-x-L-x-x (SEQ ID NO:174)

Q-Q-x-x-S-x-P-x-T (SEQ ID NO:175) Q-Q-x-N-x-x-P-x-x (SEQ ID NO:176)

Los péptidos de la divulgación también pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una de las siguientes 'fórmulas generales', en donde uno de los aminoácidos mostrados entre paréntesis se selecciona en cada posición donde sea relevante, en donde '-' indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Fórmula 13 Fórmula 14 Fórmula 15

Fórmula 16

Fórmula 17 Fórmula 18 Fórmula 19 Fórmula 20 Fórmula 21 Fórmula 22

G-Y-T-F-T-[RNYSTDEG]-[NYF]-[WGAY]-[IMV]-[NGQH]-W

G-Y-[ATS]-F-[T/S]-[SDG]-Y-[NWV]-M-[FQHN]-W

[NWEAY]-I-[YND]-[PT]-[SYG]-[DTGY]-[SGD]-[YEGS]-[TP]-[NTYGS] Y-[NAI]-[QDE]-[KD]-F-K-[DGN]

[YWKNLR]-I-[DN]-P-[YAEFS]-[NYS]-[GD]-[DSG]-T-[RESKN]-Y-[SAN] [QSEP]-K-F-[KQT]-G

[KR]-A-S-[QS]-[NSDT]-[VI]-[DGSR]-[TSYNK]-[NADY]-[VYGL]-[ALD]

[RK]-A-S-[QR]-[DSG]-[IV]-[SN]-[NSG]-[YW]-L-[NHA]

[SRW]-[AT]-S-[YIT]-[RL]-[YAE]-S

[YLDTK]-T-S-[RNKV]-L-[HAG]-[SP]

Q-Q-[YGWR]-[NSAG]-S-[YSDW]-P-[LPYI]-T

Q-Q-[GNSTY]-N-[TES]-[FDWY]-P-[TYRF]-[FT]

Los péptidos de la divulgación también pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una de las fórmulas siguientes, en donde uno de los aminoácidos mostrados entre paréntesis se selecciona en cada posición donde sea relevante, en donde '-' indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Fórmula 23 Fórmula 24 Fórmula 25 Fórmula 26 Fórmula 27 Fórmula 28

G-Y-T-F-T-[RNS]-Y-W-[IM]-N-W

G-Y-T-F-T-S-Y-W-M-H-W

N-I-Y- P-S- D-S-Y-T- N-Y-N-Q- K- F- K-G

[YW]-I- N- P-Y-N-G- D-T-[ES]-Y-N-Q-K- F- K-G

K-A-S-Q-N-V-S-T-N-V-A

R-A-S-Q-S-I-S-N-Y-L-[NA]

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Fórmula 29 Fórmula 30 Fórmula 31 Fórmula 32

S-A-S-Y-R-Y-S Y-T-S-N-L-A-S Q-Q-Y-N-S-Y-P-L-T Q-Q-N- N- E- D- P-[YR]-T

Los péptidos de la divulgación también pueden comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una de las fórmulas siguientes, en donde uno de los aminoácidos mostrados entre paréntesis se selecciona en cada posición donde sea relevante, en donde 'x' indica cualquier residuo de aminoácido, en donde "-" indica un enlace peptídico, y en donde los péptidos se muestran en orientación terminal N a C:

Fórmula 33 Fórmula 34 Fórmula 35

[EYWSL]-I-[YSND]-[PSH]-[SGNY]-[GSNTD]-[SGD]-[YTGS]-[TIA]-

[NY]-[YN]-[NAP]-[QDSEP]-[KSL]-[FVK]-[KQS]-[GR]

E-I-[YSN]-[PS]-[SGN]-[GS]-[SG]-[TGS]-T-[NY]-Y-[NAP]-[QDS]

[KS] - [FVK] - [KQ] - [GR]

x-I-x- P-S-G-G-x-T-Y-x-A- D-[KS]-[FV]-K-G

Se cree que los péptidos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una o más de las secuencias de consenso y fórmulas anteriores también tendrán una actividad biológica equivalente a los péptidos probados in vivo en los Ejemplos 6 y 7 anteriores, y serán útiles de acuerdo con la divulgación.

Como se indica en otro sitio en la presente, los péptidos de la divulgación pueden enlazarse entre sí para formar dímeros o multímeros. Por tanto, la divulgación también incluye dímeros o multímeros de péptidos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una o más de las secuencias de consenso y fórmulas anteriores. Por ejemplo, la divulgación incluye heterodímeros de dos péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que cumplen los requisitos de dos secuencias de consenso o fórmulas diferentes descritas en la presente. Por ejemplo, la divulgación incluye homodímeros de dos péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que cumplen los requisitos de las mismas secuencias de consenso o fórmulas.

La divulgación también incluye péptidos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una secuencia de consenso o fórmula divulgada en la presente, y cuya secuencia de aminoácidos también tiene un grado de identidad de secuencia con cualquiera de sEq ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96 de más del 25%. Preferiblemente, tales péptidos tienen un grado de identidad mayor del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99%, respectivamente, con cualquiera de las SEQ ID nO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96.

Los péptidos de la divulgación también incluyen aquellos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una de las secuencias de consenso anteriores, que incluyen en una o más de las posiciones variables (es decir, las posiciones 'x' que no están completamente conservadas) , cualquiera de los aminoácidos divulgados en esa posición en una fórmula correspondiente de la presente (es decir, en una fórmula correspondiente a la misma CDR).

Por ejemplo, la secuencia de consenso y la "fórmula general" identificadas en la presente de las secuencias de CDR-H2 clonadas (ver el Ejemplo 5) son:

Consenso 2 x-I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x

Fórmula 2 [nwy] -i- [ynd] - [pt] - [sy] - [dnt] - [SG] - [yde] - [tp] - [nrt] -y-

[NSA]-[QD]-[KD]-F-K-[DG]

Por lo tanto, los péptidos de la divulgación incluyen combinaciones de esas secuencias, como péptidos que comprenden o consisten de las siguientes secuencias:

Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3 Combinación 4 Combinación 5 Combinación 6 Combinación 7 Combinación 8 Combinación 9 Combinación 10 Combinación 11

[NWY]-I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x x-I-[YND]-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x x-1 -x-[PT]-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x- F-K-x x-1 -x-x- [SY]-x-x-x-x-x-Y-x-x-x- F - K-x x-1 -x-x-x- [DNT]-x-x-x-x-Y-x-x-x- F-K-x x-I-x-x-x-x-[SG]-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x x-1 -x-x-x-x-x- [YDE]-x-x-Y-x-x-x- F-K-x x-1 -x-x-x-x-x-x-[TP]-x-Y-x-x-x-F-K-x x-1 -x-x-x-x-x-x-x-[NRT]-Y-x-x-x- F-K-x x-1 -x-x-x-x-x-x-x-x-Y-[NSA]-x-x- F- K-x x-1 -x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x- [QD]-x-F- K-x

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Combinación 12 x-I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-[KD]-F-K-x

Combinación 13 x-I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-[DG]

Los péptidos de la divulgación también incluyen combinaciones más complejas de las secuencias de consenso y fórmulas divulgadas en la presente. Por tanto, la divulgación también incluye péptidos que comprenden o consisten de las siguientes secuencias, por ejemplo:

Combinación 14: [NWY]-

Combinación 15: [NWY]-

Combinación 16: [NWY]-

Combinación 17: [NWY]-

Combinación 18: [NWY]-I

Combinación 19: [NWY]-I

Combinación 20: [NWY]-I

Combinación 21: [NWY]-I

Combinación 22: [NWY]-I

Combinación 23: [NWY]-I

Combinación 24: [NWY]-I

Combinación 25: [NWY]-I

I-[YND]-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x- F - K-x I -x-[PT]-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x- F - K-x I-x-x-[SY]-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x I -x-x-x-[ DNT]-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x I-x-x-x-x-[SG]-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-x I -x-x-x-x-x-[YDE]-x-x-Y-x-x-x- F- K-x I-x-x-x-x-x-x-[TP]-x-Y-x-x-x-F-K-x I-x-x-x-x-x-x-x-[NRT]-Y-x-x-x-F-K-x I -x-x-x-x-x-x-x-x-Y-[NSA]-x-x- F- K-x I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-[QD]-x-F-K-x I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-[KD]-F-K-x I-x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x-F-K-[DG]

Los ejemplos 8 y 9 de la presente describen un análisis de secuencias de regiones hipervariables conocidas de especificidades de unión relevantes. Ese análisis se basó en secuencias de regiones variables de cadena pesada y ligera disponibles en bases de datos públicas.

El primer aspecto de la divulgación también incluye ligandos que son funcionalmente equivalentes a los péptidos que se identifican explícitamente en la presente. Los ligandos funcionalmente equivalentes pueden ser estructuras que están derivadas biológicamente o pueden sintetizarse o seleccionarse de bibliotecas (como bibliotecas aleatorias o combinatorias de compuestos químicos) que pueden llevar a cabo las mismas funciones o unirse a las mismas estructuras objetivo que el autoanticuerpo o su anticuerpo monoclonal representativo y derivados de los mismos. Por ejemplo, tales compuestos pueden compartir una homología estructural significativa con las secuencias peptídicas que se identifican explícitamente en la presente en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 y 96. Tales compuestos pueden identificarse mediante técnicas como reconocimiento de plegamiento (ver, por ejemplo, Jones, D. T. (1997). Progress in protein structure prediction. Curr. Opin. Struct. Biol. 7(3), 377-387). Tales compuestos también pueden identificarse en métodos de selección que utilizan los anticuerpos que contrarrestan los péptidos o ligandos funcionalmente equivalentes del primer aspecto de la divulgación.

Se contempla que cualquier marco molecular capaz de retener las cadenas laterales de aminoácidos de estos péptidos en las posiciones necesarias para unirse al antígeno será adecuado para su uso de acuerdo con la presente divulgación. De particular idoneidad a este respecto pueden ser los péptidos cíclicos mantenidos en un marco preciso por sus grupos de enlace y enlaces. Las cadenas laterales de aminoácidos pueden mantenerse en una posición sustancialmente idéntica a su posición en los péptidos de tipo salvaje. Preferiblemente, los péptidos cíclicos comprenden entre 5 y 30 aminoácidos, preferiblemente entre 7 y 20 aminoácidos.

Los péptidos biológicamente activos con sitios de unión antigénica que imitan aquellos de acuerdo con la presente divulgación pueden generarse usando bibliotecas de fagos. Los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos identificados como participantes en el sitio antigénico, junto con el ácido nucleico que codifica los residuos del marco circundante pueden fusionarse para dar una unidad polipeptídica de entre 10 y 1000 residuos, preferiblemente entre 25 y 100 residuos. Mediante la fusión de este fragmento de ácido nucleico con el que codifica una proteína de fago, por ejemplo pIII del bacteriófago fd, la molécula de fusión puede mostrarse en la superficie del fago. La selección de la biblioteca de fagos con antígeno identificará entonces aquellos clones de interés. Estos clones pueden someterse luego a rondas iterativas de mutagénesis y selección para mejorar la afinidad de las moléculas generadas para el antígeno.

Además de los compuestos basados en péptidos, las moléculas sintéticas u orgánicas pueden ser funcionalmente equivalentes a los péptidos que se identifican explícitamente en la presente. La noción de química combinatoria y la generación de bibliotecas combinatorias se ha desarrollado a gran velocidad en los últimos años y ha facilitado el diseño racional y la mejora de las moléculas con las propiedades deseadas. Estas técnicas pueden usarse para generar moléculas que poseen sitios de unión que son idénticos o similares a los de los péptidos identificados en la presente.

Tales compuestos pueden generarse mediante diseño racional usando, por ejemplo, técnicas de síntesis estándar en combinación con modelado molecular y programas de visualización informáticos. Bajo estas técnicas, el compuesto "líder" con un marco similar al péptido básico se optimiza combinando una diversidad de andamiajes y

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sustituyentes de componentes.

Alternativamente, o como un paso en el diseño guiado por estructura de una entidad molecular, puede usarse química combinatoria para generar o refinar la estructura de compuestos que imitan el sitio del antígeno de estos péptidos mediante la producción de matrices combinatorias congenéricas alrededor de un andamiaje de marco. Estos pasos podrían incluir síntesis de péptidos o moléculas orgánicas estándar con un proceso de recombinación o división de fase sólida o síntesis de unidades combinatorias paralelas usando técnicas o de fase sólida o de solución (ver, por ejemplo Hogan, 1997 y las referencias citadas en la presente).

Anticuerpos que contienen péptidos

De acuerdo con una realización adicional del primer aspecto de la divulgación, se divulga un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66 u 82. También se divulga un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID nO: 4, 20, 36, 52, 68 u 84.

Por lo tanto, la divulgación incluye un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 18 y una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 20. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 34 y una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 36. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 52 y una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 54. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 66 y una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 68. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 82 y una región variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 84.

La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las secuencias de CDR presentadas en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14 y 16. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las secuencias de CDR presentadas en las SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28, 30 y 32. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las secuencia de CDR presentadas en las SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46 y 48. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las secuencias de CDR presentadas en las SEQ ID NO: 54, 56, 58, 60, 62 y 64. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las secuencias de CDR presentadas en las SEQ ID NO: 70, 72, 74, 76, 78 y 80. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de las secuencias de CDR presentadas en las SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94 y 96.

La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que tiene una identidad mayor al 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66 u 82. La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de la región variable de la cadena ligera que tiene una identidad mayor al 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68 u 84.

La divulgación también incluye anticuerpos que comprenden 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDR con más del 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 86, 88, 90, 92, 94 y 96.

La divulgación también incluye un anticuerpo que comprende 1,2, 3, 4, 5 ó 6 secuencia(s) de aminoácidos que cumplen los requisitos de las secuencias de consenso y las fórmulas descritas en la presente.

La divulgación también incluye fragmentos de estos anticuerpos, como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv y ScFv como se menciona en otra parte en la presente.

Anticuerpos que contrarrestan péptidos

De acuerdo con una realización adicional del primer aspecto de la divulgación, se divulga un anticuerpo, o ligando funcionalmente equivalente, que muestra reactividad contra un péptido del primer aspecto de la divulgación. Tales anticuerpos o ligandos funcionalmente equivalentes son útiles en el tratamiento y diagnóstico de

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enfermedades, en particular, porque pueden usarse terapéuticamente por transferencia pasiva.

Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, como un ratón, conejo, cabra o caballo, puede inmunizarse con un péptido del primer aspecto de la divulgación. El péptido usado para inmunizar al animal puede derivarse mediante tecnología de ADN recombinante o puede sintetizarse químicamente. Si se desea, el péptido puede conjugarse con una proteína portadora. Los portadores comúnmente usados con los que los péptidos pueden acoplarse químicamente incluyen albúmina de suero bovino, tiroglobulina y hemocianina de lapa californiana. El péptido acoplado se usa luego para inmunizar al animal. El suero del animal inmunizado se recoge y trata de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Los anticuerpos monoclonales para los péptidos del primer aspecto de la divulgación también pueden producirse fácilmente por un experto en la técnica. La metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridoma es bien conocida (ver, por ejemplo, Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra los péptidos del primer aspecto de la divulgación pueden seleccionarse para varias propiedades, es decir, para isotipo, epítopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles en la purificación de los péptidos individuales contra los que están dirigidos. Alternativamente, los genes que codifican los anticuerpos monoclonales de interés pueden aislarse de hibridomas, por ejemplo mediante técnicas de PCR conocidas en la técnica, y clonarse y expresarse en vectores apropiados.

También pueden ser de uso los anticuerpos quiméricos, en los que las regiones variables no humanas se unen o fusionan con regiones constantes humanas (ver, por ejemplo, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)).

El anticuerpo puede modificarse para hacerlo menos inmunogénico en un individuo, por ejemplo mediante humanización (ver Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147: 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 34181 (1991); y Hodgson et al., Bio/Technology 9: 421 (1991)). El término "anticuerpo humanizado", como se usa en la presente, se refiere a moléculas de anticuerpos en las que los aminoácidos de CDR y otros aminoácidos seleccionados en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo donante no humano han sido sustituidos en lugar de los aminoácidos equivalentes en un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado se parece en gran medida por tanto a un anticuerpo humano pero tiene la capacidad de unión del anticuerpo donante.

En una alternativa adicional, el anticuerpo puede ser un anticuerpo "biespecífico", que es un anticuerpo que tiene dos dominios de unión al antígeno diferentes, cada dominio estando dirigido contra un epítopo diferente.

La tecnología de presentación de fagos puede utilizarse para seleccionar genes que codifican anticuerpos con actividades de unión hacia los péptidos de la divulgación o de repertorios de genes V amplificados mediante PCR de linfocitos de humanos seleccionados por poseer los anticuerpos relevantes, o de bibliotecas no inmunes (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también puede mejorarse mediante trasposición de cadenas (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352, 624-628).

Los anticuerpos generados mediante las técnicas anteriores, ya sean policlonales o monoclonales, tienen utilidad adicional ya que pueden emplearse como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden marcarse con un reactivo analíticamente detectable como un radioisótopo, una molécula fluorescente o un enzima.

Moléculas de ácido nucleico

De acuerdo con un segundo aspecto de la divulgación, se divulga una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido, anticuerpo o ligando funcionalmente equivalente de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la divulgación descritas anteriormente. Una molécula de ácido nucleico que codifica tales péptidos puede ser idéntica a la secuencia codificante de las moléculas de ácido nucleico enumeradas en cualquiera de las sEq ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 ó 95. Estas moléculas también pueden tener una secuencia diferente que, como resultado de la degeneración del código genético, codifica un péptido como los enumerados en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94 ó 96, respectivamente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico purificada tiene la secuencia de ácido nucleico enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,

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Las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación pueden estar en forma de ARN, como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc, ADN sintético o ADN genómico. Tales moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse mediante clonación, mediante técnicas de síntesis química o mediante una combinación de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico pueden prepararse, por ejemplo, mediante síntesis química usando técnicas tales como síntesis química de fosforamidita en fase sólida, a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc o mediante separación de un organismo. Las moléculas de ARN generalmente pueden generarse mediante la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser de cadena doble o de cadena sencilla. El ADN de cadena sencilla puede ser la cadena codificante, también conocida como cadena de sentido, o puede ser la cadena no codificante, también denominada como cadena antisentido.

El término "molécula de ácido nucleico" también incluye análogos de ADN y ARN, como los que contienen esqueletos modificados, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA). El término "PNA", como se usa en la presente, se refiere a una molécula antisentido o un agente antigénico que comprende un oligonucleótido de por lo menos cinco nucleótidos de longitud enlazado a un esqueleto peptídico de residuos de aminoácidos, que preferiblemente termina en lisina. La lisina terminal confiere solubilidad a la composición. Los PNA pueden pegilarse para extender su esperanza de vida en una célula, donde se unen preferentemente a ADN complementario de cadena sencilla y ARN y detienen el alargamiento de la transcripción (Nielsen, P.E. y otros (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación pueden incluir, pero no están limitadas a, la secuencia codificante para el péptido o anticuerpo maduro por sí mismo; la secuencia codificante para el péptido o anticuerpo maduro y las secuencias codificantes adicionales, como las que codifican una secuencia líder o secretora, como una secuencia pro-, pre- o prepro- polipéptido; la secuencia codificante del péptido o anticuerpo maduro, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, junto con secuencias adicionales no codificantes, que incluyen secuencias no codificantes 5' y 3', como las secuencias transcritas, no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción (incluidas las señales de terminación), la unión a ribosomas y la estabilidad del ARNm. Las moléculas de ácido nucleico también pueden incluir secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales, como los que proporcionan funcionalidades adicionales.

Dentro del alcance de la divulgación están incluidas moléculas de ácido nucleico variantes que codifican los péptidos variantes que se han descrito anteriormente. Entre las variantes a este respecto están las variantes que difieren de las moléculas de ácido nucleico explícitamente identificadas en la presente por sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o inserciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden alterarse en regiones codificantes o no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras.

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación también pueden diseñarse, usando métodos generalmente conocidos en la técnica, por una variedad de razones, incluyendo la modificación de la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico (el polipéptido). La transposición de ADN por fragmentación aleatoria y el reensamblaje de PCR de fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos se mencionan como técnicas específicas que pueden usarse para diseñar las secuencias de nucleótidos. La mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones, etc.

Las realizaciones preferidas de este aspecto de la divulgación son moléculas de ácido nucleico que son por lo menos un 25% idénticas en toda su longitud a una molécula de ácido nucleico como se enumera en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 ó 95. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con este aspecto de la divulgación comprende una región que es por lo menos un 30% idéntica en toda su longitud a la molécula de ácido nucleico que tiene cualquiera de estas secuencias, más preferiblemente por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, un 99% o más idéntica.

De acuerdo con un tercer aspecto de la divulgación, se divulga una molécula de ácido nucleico purificada que hibrida en condiciones de alta rigurosidad con una molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la divulgación. Tales moléculas, que son parcial o totalmente complementarias a las moléculas de ácido nucleico del segundo aspecto de la divulgación, pueden ser útiles con propósitos antisentido o de exploración. Tales moléculas antisentido, como oligonucleótidos, pueden diseñarse para reconocer, unirse específicamente y evitar la transcripción de un ácido nucleico objetivo que codifica un polipéptido de la divulgación, como será conocido por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989); Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991). El término "hibridación" como se usa en la

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presente se refiere a la asociación de dos moléculas de ácido nucleico entre sí mediante enlaces de hidrógeno. Típicamente, una molécula se fijará a un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Luego, las dos moléculas pueden ponerse en contacto entre sí bajo condiciones que favorezcan el enlace de hidrógeno. La inhibición de la hibridación de una molécula completamente complementaria a una molécula objetivo puede examinarse usando un ensayo de hibridación, como se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al [supra]). Una molécula sustancialmente homóloga competirá luego e inhibirá la unión de una molécula completamente homóloga con la molécula objetivo bajo varias condiciones de rigurosidad, como se enseña en Wahl, G.M. y S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511).

"Rigurosidad" se refiere a las condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de moléculas muy similares sobre la asociación de moléculas que difieren. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad se definen como incubación durante la noche a 42° C en una solución que comprende 50% de formamida, 5XSSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5x de solución de Denhardts, 10% de dextrano sulfato y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0,1X SSC a aproximadamente 65° C. Las condiciones de baja rigurosidad implican que la reacción de hibridación se lleva a cabo a 35° C (ver Sambrook et al. [supra]). Preferiblemente, las condiciones usadas para la hibridación son aquellas de alta rigurosidad.

Vectores

En un cuarto aspecto, la divulgación incluye un vector, como un vector de expresión, que incorpora una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la divulgación. Los vectores de la presente divulgación comprenden moléculas de ácido nucleico de la divulgación y pueden ser vectores de clonación o expresión. Los péptidos de la divulgación pueden prepararse por tanto en forma recombinante por expresión de sus moléculas de ácido nucleico codificantes en vectores contenidos dentro de una célula huésped. Tales métodos de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica y muchos se describen con detalle por Sambrook et al (supra) y Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto).

Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector que sea adecuado para mantener, propagar o expresar moléculas de ácido nucleico para producir un polipéptido en el huésped requerido. La secuencia de nucleótidos apropiada puede insertarse en un sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias como, por ejemplo, las descritas en Sambrook et al., (supra). Generalmente, el gen codificante puede colocarse bajo el control de un elemento de control como un promotor, sitio de unión a ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de manera que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido deseado se transcriba en ARN en el célula huésped transformada

Los sistemas de expresión particularmente adecuados incluyen microorganismos como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plasmídicos o cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. También pueden emplearse sistemas de traducción libres células para producir los péptidos de la divulgación.

La introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido de la presente divulgación en células huésped puede efectuarse mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) and Sambrook et al., [supra]. En las células eucariotas, los sistemas de expresión pueden ser o transitorios (por ejemplo, episomales) o permanentes (integración cromosómica) de acuerdo con las necesidades del sistema.

El vector codificante puede incluir una secuencia que codifica una secuencia de control, como un péptido señal o secuencia líder, según se desee, por ejemplo, para la secreción del polipéptido traducido en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular . Estas señales pueden ser endógenas al péptido o pueden ser señales heterólogas. Las secuencias líder pueden ser eliminadas por un huésped bacteriano en el procesamiento postraduccional.

Además de las secuencias de control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras son aquellas regiones del vector no traducidas, como potenciadores, promotores y regiones no traducidas 5' y 3'. Estos interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Los ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que provocan que la expresión de un gen aumente o disminuya en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador o a varias condiciones de temperatura o metabólicas. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificante de ácido nucleico antes de la inserción en un

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vector. Alternativamente, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación también pueden usarse para crear animales transgénicos, particularmente animales roedores. Esto se puede hacer localmente mediante la modificación de células somáticas o mediante terapia de línea germinal para incorporar modificaciones heredables. Tales animales transgénicos pueden ser particularmente útiles en la generación de modelos animales para moléculas de fármacos eficaces como moduladores de los péptidos de la divulgación.

Células huésped

En un quinto aspecto, la divulgación incluye una célula huésped transformada con un vector del cuarto aspecto de la divulgación. Las células huésped de la divulgación, que pueden transformarse, transfectarse o transducirse con los vectores de la divulgación, pueden ser procariotas o eucariotas.

Para la producción a alto rendimiento a largo plazo de un péptido recombinante, puede preferirse una expresión estable. Los ejemplos de líneas celulares de mamífero adecuadas disponibles como huéspedes para la expresión son conocidos en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) incluyendo, pero no limitadas a, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, riñón de cría de hámster (BHK), riñón de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma de Bowes y carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2).

Un sistema preferido adicional es el sistema de baculovirus (disponible comercialmente en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA). Estas técnicas son generalmente conocidas por los expertos en la técnica y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Las células huésped particularmente adecuadas para su uso en este sistema incluyen células de insecto como células de Drosophila s2 y células Spodoptera Sf9.

Existen muchos sistemas de expresión genética en cultivos de células vegetales y vegetales completos conocidos en la técnica. Los ejemplos de sistemas de expresión genética vegetal de plantas adecuados incluyen los descritos en la US 5.693.506; US 5.659.122; y US 5.608.143. Se han descrito ejemplos adicionales de expresión genética en cultivo de células vegetales por Zenk, (1991) Phytochemistry 30, 3861-3863 .

Los ejemplos de células huésped bacterianas particularmente preferidas incluyen células de estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis . Los ejemplos de células huésped particularmente adecuadas para la expresión fúngica incluyen células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) y células de Aspergillus.

Métodos de expresión

De acuerdo con un sexto aspecto de la divulgación, se divulga un método para expresar un péptido, anticuerpo o ligando equivalente de acuerdo con cualquiera de las realizaciones del primer aspecto de la divulgación, el método comprendiendo expresar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo o tercer aspecto de la divulgación o un vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la divulgación en una célula huésped.

Tratamiento de la enfermedad

En un séptimo aspecto, la divulgación incluye un método para tratar una enfermedad en un paciente que comprende administrar al paciente un péptido, anticuerpo o ligando equivalente del primer aspecto de la divulgación, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la divulgación, o un vector del cuarto aspecto de la divulgación, o una célula huésped del quinto aspecto de la divulgación. Este aspecto de la divulgación también incluye un péptido, anticuerpo o ligando equivalente del primer aspecto de la divulgación, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la divulgación, o un vector del cuarto aspecto de la divulgación, o un célula huésped del quinto aspecto de la divulgación, para su uso en terapia o diagnóstico de la enfermedad.

Las enfermedades que son adecuadas para el tratamiento o diagnóstico de esta manera se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos con reactividad contra un epítopo de enlace a GPI, tales anticuerpos son preferiblemente también reactivos contra epítopos en anticuerpos anti-TCR Vp, moléculas con capacidad de señalización, fosfolípidos incluyendo fosfatidil inositol, fosfatidil serina y cardiolipina (diacil glicerol) y fosfolípidos glicanos, segundos mensajeros de la acción de la insulina, ADN de cadena sencilla y de cadena doble y elementos del enlace a GPI. Estos autoanticuerpos han sido identificados por el presente Solicitante y se considera que la presencia de tales anticuerpos en el cuerpo acelera el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad, promueve cánceres, media en la manifestación de enfermedades ya sea con base a la predisposición genética o no, e interfiere con la defensa de primera línea contra agentes infecciosos. La presencia de tales anticuerpos es, por tanto, un factor en común con todas las enfermedades que son adecuadas para el tratamiento o diagnóstico de acuerdo con la presente divulgación. Muchas de estas afecciones caen bajo las definiciones genéricas de diabetes

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mellitus dependiente de insulina (IDDM), diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), enfermedad autoinmune específica de órganos o no de órganos, enfermedad cardiovascular, caquexia del cáncer y cáncer o cualquier otra enfermedad en la que hay anticuerpos anti-fosfolípidos y/o hiperinsulinemia y/o hiperglucagonaemia y/o intolerancia a la glucosa y/o resistencia a la insulina. Algunas de estas afecciones se describen a continuación; debe señalarse, sin embargo, que estas enfermedades se enumeran a modo de ejemplo y que esta lista no es exhaustiva.

Las enfermedades que son adecuadas para el tratamiento o diagnóstico de esta manera incluyen, pero no están limitadas a, diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, psoriasis, eccema, vitíligo, acantosis, nigricans, alopecia areata, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, depresión, enfermedad de Parkinson, migraña, esclerosis múltiple, miastenia gravis, esclerosis lateral amiotrófica y otros trastornos de las neuronas motoras, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick y otras enfermedades neurodegenerativas, enfermedad tiroidea, neoplasia endocrina múltiple tipo 2A y B, síndrome de Cushing, enfermedad de Addison, síndrome de ovario poliquístico hipogonadismo , calvicie prematura en hombres, obesidad, síndrome X, desgaste fetal recurrente, aborto espontáneo recurrente, trombosis recurrente, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad gástrica autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, asma, fibrosis quística, osteoporosis y osteopenia, liquen plano, leucoplasia, aplásica y otras anemias, hemoglobinuria paroxística nocturna, apnea del sueño, insomnio, cáncer, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infecciones, y enfermedades de la inmunoregulación.

Los experimentos en pacientes humanos han demostrado que los péptidos como se divulgan en la presente pueden usarse con éxito para mejorar la tolerancia oral a la glucosa (ver el Ejemplo 6) y la regulación autoglucémica en pacientes diabéticos (ver el Ejemplo 7). Por consiguiente, las enfermedades que son adecuados para el tratamiento o diagnóstico de acuerdo con la invención incluyen, pero no están limitadas a, enfermedades asociadas con la intolerancia a la glucosa (por ejemplo, asociadas con una respuesta anormal en una prueba de tolerancia a la glucosa oral) y enfermedades asociadas con la pérdida o el deterioro de la regulación autoglucémica.

Un mecanismo de tratamiento adecuado puede implicar el uso de los péptidos descritos anteriormente, o ligandos funcionalmente equivalentes con la misma configuración o estructura tridimensional, que podrían eliminar activa o pasivamente los autoanticuerpos problemáticos o las células que generan autoanticuerpos objetivo para su destrucción. De acuerdo con este aspecto de la divulgación, los péptidos pueden usarse o individualmente o en combinación, solos o junto con agentes diseñados para promover su eficacia, en cadenas sencillas, dobles o múltiples con o sin elementos conectores y portadores. Un mecanismo de tratamiento es generando anticuerpos que contrarrestan contra estos autoanticuerpos de tal manera que los anticuerpos generados se unen a los autoanticuerpos y previenen por tanto el reconocimiento de sus células o moléculas o complejo objetivo con los autoanticuerpos ayudando por tanto a su eliminación o desconectando la producción de estos autoanticuerpos.

Alternativamente, se pueden usar anticuerpos que contrarrestan o ligandos equivalentes para el tratamiento pasivo y pueden derivarse de inmunizaciones animales que llevan a la producción de anticuerpos policlonales o derivación de anticuerpos monoclonales o de inmortalización de células B humanas, anticuerpos monoclonales humanos o mediante la selección de bibliotecas. La generación de tales anticuerpos y ligandos equivalentes se describe anteriormente.

Otros métodos de tratamiento pueden utilizar principios de inducción de tolerancia como deleción clonal, anergia, generación de supresores o de células veto para evitar que los autoanticuerpos se elaboren y/o secreten usando los péptidos de la divulgación o unidades reactivas mínimas de tales péptidos o anticuerpos que contrarrestan los péptidos que reaccionan con los autoanticuerpos de una manera que generará células supresoras, células veto, deleción clonal, anergia clonal u otros mecanismos que dan como resultado la prevención o formación o liberación de los autoanticuerpos relevantes. Estos métodos pueden incluir el uso de péptidos que son reconocidos por los autoanticuerpos o por los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos que representan estos autoanticuerpos y las secuencias de los mismos. También se puede evitar que los autoanticuerpos se unan a sus objetivos mediante inhibidores competitivos o no competitivos, que incluyen péptidos de la divulgación. Además, pueden usarse las moléculas objetivo o las unidades reactivas mínimas de tales moléculas enlazadas a una matriz para eliminar selectivamente los autoanticuerpos relevantes en un tipo de procedimiento de plasmaféresis.

También se puede evitar que los autoanticuerpos se unan a sus objetivos mediante inhibidores competitivos o no competitivos diseñados para evitar la unión de los péptidos de la divulgación o ligandos equivalentes a sitios objetivo relevantes en células o moléculas.

Los péptidos o derivados de ARN y ADNc de los mismos o alteraciones que retienen la eficacia u otras secuencias cuyos productos utilizan el mismo mecanismo de acción descrito en la presente pueden usarse en el contexto enseñado en la presente, y pueden envasarse con vectores adecuados como vacunas.

Las enfermedades que son adecuadas para el tratamiento o diagnóstico de acuerdo con la divulgación se describen con más detalle a continuación.

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Diabetes Mellitus Tipo I y II

La diabetes tipo I tiene una predisposición genética fuertemente asociada localizada en el locus del antígeno leucocitario humano HLA DQ. Aunque más del 90% de los pacientes con diabetes tipo I tienen los alelos predisponentes DQ8 y/o DQ2,(8,9) solo una minoría de individuos susceptibles progresa a la enfermedad clínica. Incluso en gemelos monocigóticos, la tasa de concordancia es solo del 50%.(10) Los factores ambientales desempeñan un papel importante en la patogénesis de la diabetes tipo I.(11)

El daño a las células p en los islotes pancreáticos durante el período preclínico se caracteriza por la aparición de autoanticuerpos asociados a la diabetes. Los anticuerpos más estudiados son contra la insulina

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(IAA),' 1 ácido glutámico descarboxilasa (GADA),' 1 anticuerpos para la molécula de IA-2 relacionada con la proteína tirosina fosfatasa(14) y anticuerpos para células de islotes citoplasmáticas.(15)

Un estudio finlandés publicado recientemente sobre la aparición de los anticuerpos asociados a la diabetes mencionados anteriormente en niños de 3 meses a 2 años de medad con susceptibilidad genética reveló que la seroconversión aumentó de forma constante desde los 6 meses de edad y apareció una proporción significativamente más alta de seroconversiones en los meses de otoño e invierno en comparación con la primavera y el verano. Esta variación estacional en el aumento de autoanticuerpos y el diagnóstico de la diabetes ha sido considerada atribuible a la preponderancia de infecciones durante estos meses.(9) El primer autoanticuerpo detectado en los niños en este estudio fue contra la insulina (IAA) lo que llevó a los autores a concluir que la insulina puede ser el autoantígeno primario en la mayoría de los casos de diabetes tipo I autoinmune. Las observaciones presentadas a favor de esta hipótesis fueron que la insulina es el único autoantígeno verdadero de células p verdadero conocido, en segundo lugar que las IAA son muy comunes en niños con diabetes tipo I recién diagnosticados y en tercer lugar que la diabetes tipo I puede transferirse experimentalmente mediante Células T reactivas a la insulina.(16,17)

Se ha postulado que el desarrollo de reactividad anti-insulina se debe al mimetismo antigénico; sin embargo, no existen datos experimentales hasta la fecha que vinculen los agentes infecciosos y la reactividad a la insulina antigénicamente. Las observaciones clave que preceden al diagnóstico de la diabetes tipo I o que se observan en diabéticos tipo I recién diagnosticados se han ignorado en la formulación de conceptos referentes a la causalidad de esta enfermedad. Tales observaciones son proporciones de proinsulina a insulina inmunorreactiva aumentadas antes del diagnóstico, lo que indica estrés en células p y resistencia a la insulina periférica y disfunción en la secreción de hormonas contrarreguladoras como el glucagón en diabéticos tipo I recién diagnosticados/18'20 Estas observaciones demuestran un proceso de enfermedad en curso que culmina en la muerte de células p en diabéticos tipo I. Las mismas anormalidades de las proporciones de proinsulina a insulina elevadas, resistencia a la insulina y el perfil alterado de la secreción de glucagón también se aplican a la diabetes tipo II.(21,22) Además, ambas enfermedades tienen un perfil similar de complicaciones.

Se ha propuesto una hipótesis unificada para la inducción de diabetes de ambos tipos I y II que abarca fenómenos pre-diabéticos y post-diabéticos en base a un autoanticuerpo recientemente identificado que tiene un amplio espectro de especificidades de reactividad cruzada. Una especificidad clave de este autoanticuerpo, que es indicativa de su derivación, es la reactividad contra anticuerpos para las cadenas TCR Vp. Los anticuerpos monoclonales producidos contra anticuerpos anti-TCR Vp monoclonales se usaron como un indicador de los posibles efectos de autoanticuerpos de especificidad similar. Tales anticuerpos monoclonales surgidos contra reactivos anti-TCR Vp tenían la capacidad de desregular la secreción de insulina de islotes pancreáticos humanos in vitro, provocando ciclos de hipersecreción seguidos de hiposecreción hasta que las células de los islotes dejaron de secretar.

Estos anticuerpos monoclonales producidos contra anticuerpos anti-TCR Vp se usaron para seleccionar una biblioteca de ADNc Agt11 humano e identificaron clones que codificaban para la proteína GP-2 (una molécula enlazada a glucosil fosfatidil inositol (GPI)), secretogranina I (una proteína adhesiva, serina fosforilada, tirosina sulfatada, doblete O-glicosilado que se une a la membrana a través de un péptido de giro unido a disulfuro N- terminal) proteína de unión a laminina (67kD asociada a metástasis, proteína adhesiva acilada de ácido graso) ESRPI (una molécula unida a disulfuro N-terminal recientemente identificada) entre otros. Estas moléculas tienen propiedades de señalización.

Los anticuerpos monoclonales tiñeron intensamente las células a de los islotes humanos, células en muchos otros órganos endocrinos, incluyendo tiroides, suprarrenales, estómago, intestino y otros tejidos como musculares y conectivo. Los clones productores de anticuerpos monoclonales se seleccionaron mediante selección frente a un reactivo monoclonal anti-TCR Vp y cardiolipina, usado como un indicador de fosfolípidos. Los sobrenadantes de clones con tales especificidades de reactividad cruzada también mostraron que reaccionaban con otros fosfolípidos aniónicos como fosfatidil inositol y fosfatidil serina; también reaccionaron con ADN de cadena sencilla y de cadena doble.

Se postula que los autoanticuerpos que reaccionan con reactivos anti-TCR-Vp también tienen las mismas

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reactividades cruzadas que antes y, por lo tanto, son la causa de la secreción de insulina desregulada como se demostró para el anticuerpo monoclonal de especificidad similar. Se postula que el mecanismo mediante el que estos anticuerpos desregulan la secreción de insulina se debe a la presión aumentada sobre las células p para secretar insulina provocada por la desregulación de las células a que lleva a una secreción aumentada de glucagón. El efecto potenciador del glucagón sobre la secreción de insulina es bien conocido. La secreción de insulina por células p separadas se amplifica mediante la adición de glucagón, células a o cAMP.(6) Los autoanticuerpos, uniéndose a fracciones de inositol fosfoglicanos de enlaces GPI, pueden evitar su escisión por fosfolipasas activadas por insulina y afectar de este modo a sus propiedades de señalización. Las propiedades de señalización de tales moléculas se han descrito completamente.231 Por la misma capacidad de unión a los fosfoinositolglicanos, los autoanticuerpos pueden erradicar los mediadores de la acción de la insulina y provocar de este modo resistencia a la insulina o alteración de la acción de la insulina. Se ha demostrado una generación/liberación inadecuada de fosfoglicanos de inositol en humanos resistentes a la insulina.*241

Cáncer

Se sabe que muchos cánceres, incluidos los de mama, colorrectal, gastrointestinal, sarcoma, endometrial, próstata, cabeza, cuello y pulmón, están asociados con hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina y una tasa aumentada de producción de glucosa hepática.*285-2891 Un estudio de 1992 de 223 mujeres con cáncer de mama en estadio 1 o estadio 2 demostró que tenían niveles séricos significativamente más altos de péptido C que los 441 sujetos control. El riesgo relativo logarítmico de cáncer de mama se relacionó linealmente con los niveles de péptido C logarítmicos independientemente del índice de masa corporal o la proporción cintura- cadera.*2901 Un estudio más reciente de 2569 mujeres con casos histológicamente confirmados de cáncer de mama en comparación con 2588 mujeres control notó una asociación de cáncer de mama con diabetes de aparición tardía,*2 11 y la evidencia sugiere que la insulina es un factor de crecimiento para la formación de tumores.*2921

La caquexia del cáncer también se caracteriza por intolerancia a la glucosa, tasa de recambio de glucosa aumentada en todo el cuerpo, gluconeogénesis aumentada y resistencia a la insulina que lleva una captación y utilización de la glucosa disminuida. *2931 La proporción de insulina/glucagón aumentada por terapia hormonal apoyó selectivamente el anabolismo del huésped e inhibió la cinética de crecimiento tumoral en un modelo de rata.*2941 Por lo tanto, la prevención del desarrollo del complejo diabetogénico de trastornos metabólicos reducirá la incidencia de cánceres y aliviará los síntomas de la caquexia por cáncer.

Se está reconociendo la implicación de moléculas enlazadas a GPI en la angiogénesis, metástasis, progresión del cáncer e incluso la inhibición del cáncer. Una de tales moléculas es el receptor de activador de plasminógenos de tipo uroquinasa uPAR. Hay una fuerte correlación entre la expresión de upAR y el fenotipo de células cancerígenas invasivas.*2951 La asociación de uPAR enlazado a GPI no escindido ocupado con su ligando uPA a proteoglicanos de sulfato de heparano {HSPG} y a integrin in vitro nectina, enfoca la plasmina en la superficie de la célula induciendo la proteólisis y ligación de vitronectina a su receptor avp3 promoviendo la angiogénesis.*211- 2171 La uPAR también interactúa con el citoesqueleto de actina provocando la formación de lamellipodia, pliegues y filopodios y por lo tanto la motilidad celular.*2281

Las funciones fisiológicas normales de uPAR se regulan a través de la escisión de uPAR mediante uPA que requiere un enlace GPI intacto.*2131 Ya se ha propuesto que las propiedades de uPAR causantes de la enfermedad pueden deberse al bloqueo del enlace a GPI por los anticuerpos de esta divulgación.

La hiperinsulinemia tiene un papel en la potenciación de los mecanismos dirigidos por uPAR mejorando la expresión de los HSPG asociados a células*2961 y del inhibidor-1 del activador del plasminógeno {PAI-11.*2971 Además de unirse a uPA, PAI-1 se une a la vitronectina y facilita la migración e invasión tumoral.*2981 El complejo uPAR-uPA- PAI-1 también se une a la proteína relacionada con lipoproteínas de baja densidad *LRP1 y el complejo entero se internaliza en células cancerosas en migración. Se ha demostrado que PAI-1 aumenta tanto la formación de filopodios y la migración de células cancerosas.*2991 PAI-1 también está involucrado en la angiogénesis. La angiogénesis estaba totalmente ausente en los anillos aórticos de los ratones PAI-1 -/- y podría restaurarse mediante la adición de PAI-1 recombinante purificado.*3001

Los niveles altos de uPA y uPAR se asocian con un riesgo aumentado de recaída en pacientes con cáncer de mama.*3011 uPAR también se expresa fuertemente en cánceres de tiroides*3021 y cánceres de ovario.*3031 La regulación por incremente de HSPG, particularmente los glipicanos enlazados a GPI se ha asociado con ciertos cánceres. El Glipicano 1 está regulado por incremento en los cánceres de páncreas y de mama.*304,3051 El glipicano 3 se expresa en tumores de Wilm, neuroblastomas y hepatoblastomas.*3063071 Los glipicanos se consideran reguladores potenciales de factores de crecimiento que se unen a heparina y son estimulados por IGF-I e IGF- II.*3081 La insulina suprime las proteínas de unión a IGF, haciendo que haya disponibles más IGF.*3091Los IGF están involucrados en la progresión de varios cánceres.*3101 Las moléculas enlazadas a GPI también están implicadas en la fisiopatología de la formación de tumores como reguladores negativos del crecimiento tumoral. La T-cadherina enlazada a GPI se modula modulada por disminución por factores de crecimiento, incluyendo IGF.*3111 La pérdida del gen de la T-cadherina se correlaciona con el desarrollo de cánceres de páncreas, pulmón, estómago y ovario

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mientras que la transfección de células tumorales con ADNc de T-cadherina da como resultado una disminución de las actividades proliferativas e invasivas de la enfermedad inflamatoria intestinal.*3081 La regulación por disminución o la desregulación de la T-cadherina a través de anticuerpos anti-GPI de esta divulgación podría comprometer el papel regulador de crecimiento negativo de la T-cadherina y moléculas similares favoreciendo el crecimiento tumoral.

Las moléculas enlazadas a GPI pueden estar implicadas en el reconocimiento por células asesinas naturales de células tumorales. Las proteínas de unión a UL16 (ULBP) son moléculas enlazadas a GPI que se inducen o regulan por incremento tras el agotamiento celular provocado por choque térmico, virus, transformación tumoral, carcinógenos, UV, etc. Estas moléculas son ligandos para el receptor de NKG2-D en células NK, células NKT , células T y§ así como células T CD8+. El enmascaramiento de estas ULBP enlazadas a GPI podría provocar la evasión de las células transformadas del reconocimiento mediado por células NK o T.(312)

El concepto unificador que ha surgido es que la mayoría de las enfermedades de origen infeccioso o no infeccioso con o sin predisposición genética o afecciones relacionadas con el proceso de envejecimiento se manifiestan o se agravan por la aparición del autoanticuerpo multiespecífico descrito anteriormente. Una gran proporción de la población genera este autoanticuerpo que compromete todos los sistemas y órganos son afectados por niveles de glucosa en sangre, niveles de insulina, otros niveles hormonales controlados o que afectan a la insulina y/o moléculas enlazadas a GPI, otras moléculas reguladoras reconocidas por el autoanticuerpo y fosfolípidos. Estos autoanticuerpos aceleran el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad, promueven cánceres, median en la manifestación de enfermedades ya se basen o no en la predisposición genética e interfieren con la defensa de primera línea contra agentes infecciosos. Es decir, existe un problema patógeno subyacente que es la producción del autoanticuerpo que, dependiendo de la susceptibilidad individual, lleva a una o más de las afecciones, algunas de las cuales se han descrito anteriormente. Una analogía sería que para cualquier fármaco dado, puede haber uno o más efectos secundarios, ninguno de los cuales estaría presente en ausencia del fármaco.

La siguiente tabla resume las enfermedades que son adecuadas para el tratamiento o diagnóstico de acuerdo con la divulgación, y además proporciona una indicación del vínculo entre cada enfermedad y el mecanismo de enfermedad centralizado divulgado en la presente y en la WO99/05175 . En la tabla, una puntuación (+) en la columna A indica que la enfermedad está asociada con tolerancia a la glucosa oral anormal (en una OGTT), una puntuación en la columna B indica que la enfermedad es una en la que hay presentes anticuerpos antifosfolípidos, una puntuación en la columna C indica que la enfermedad es una en la que están involucradas moléculas enlazadas a GPI, una puntuación en la columna D indica que la enfermedad está asociada con niveles anormales de insulina o resistencia a la insulina, un puntuación en la columna E indica que la enfermedad es más común en diabéticos , y una puntuación en la columna F indica que la enfermedad está asociada con un riesgo aumentado de desarrollar diabetes tipo 1 o 2.

Cabe señalar que la ausencia de una puntuación (+) en la siguiente tabla no indica que el vínculo relevante no haya sido informado o no exista, sino simplemente que el inventor no tiene conocimiento actualmente de ningún informe de tal vínculo en la bibliografía.

Enfermedad: A B C D E F

Psoriasis: + + + +

Eczema: +

Vitiligo: + + +

Acantosis nigricans: + +

Alopecia areata: +

Alzheimer: + + +

Esquizofrenia: + + +

Depresión: + +

Enfermedad de Parkinson: + + +

Migraña: + +

Esclerosis múltiple: + + + +

Miastenia gravis: + + +

Esclerosis lateral amiotrófica y otros trastornos de neuronas motoras: + + + +

Parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick y otras enfermedades neurodegenerativas: +

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Enfermedad: A B C D E F

Enfermedad de tiroides: + + +

Neoplasia endocrina múltiple tipo 2A y B: +

Síndrome de Cushing: + + +

Enfermedad de Addison: + +

Hipogonadismo PCOS: + + + +

Calvicie prematura en hombres: +

Obesidad: +

Síndrome X: + +

Desgaste fetal recurrente: + + +

Aborto espontáneo recurrente: + + +

Trombosis recurrente: + +

Lupus eritematoso sistémico: + +

Enfermedad celíaca: + + +

Enfermedad gástrica autoinmune: + +

Enfermedad inflamatoria intestinal: + +

Artritis Reumatoide: + + +

Espondilitis anquilosante: + +

Asma: + + +

Fibrosis quística: + +

Osteoporosis y osteopenia: + +

Liquen Planus: + +

Leucoplasia: + +

Aplásica y otras anemias: + + + +

Hemoglobinuria paroxística nocturna: +

Apnea del sueño: + +

Insomnio: + + + +

Cáncer: + + + + +

VIH: + + + +

Infección: + +

Enfermedades de inmunoregulación: +

Composiciones farmacéuticas

En un octavo aspecto, la divulgación incluye una composición farmacéutica que comprende un péptido, anticuerpo o ligando equivalente del primer aspecto de la divulgación, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la divulgación, o un vector del cuarto aspecto de la divulgación, o una célula huésped del quinto aspecto de la divulgación, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden ser adecuadas como reactivos terapéuticos o de diagnóstico, como vacunas, o como otras composiciones inmunogénicas, como se describe en detalle a continuación.

La composición farmacéutica puede incluir una combinación de péptidos de acuerdo con la divulgación (por ejemplo, ver los Ejemplos 6 y 7 de la presente). Tales péptidos pueden incorporarse a la composición como entidades monoméricas, o pueden enlazarse para formar cadenas dobles o múltiples. Tales cadenas pueden o,

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alternativamente, pueden no incluir elementos conectores entre las moléculas del componente monomérico.

Las composiciones farmacéuticas deben comprender preferiblemente una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido, anticuerpo o ligando equivalente, molécula de ácido nucleico, vector o célula huésped de la divulgación. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en la presente se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección objetivo, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente o en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Tal información puede usarse luego para determinar dosis y vías de administración útiles en humanos.

La cantidad eficaz precisa para un sujeto humano puede depender de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación rutinaria y está dentro del criterio del practicante clínico. En general, una dosis eficaz será de 0,0001 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg, más preferiblemente de 0,05 mg/kg a 10 mg/kg, incluso más preferiblemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg. Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Se ha demostrado que las composiciones que comprenden péptidos de acuerdo con la divulgación a dosis de 0,005 mg/kg a 0,05 mg/kg proporcionan efectos terapéuticos útiles en pacientes humanos (ver los Ejemplos 6 y 7 de la presente), sin efectos secundarios indeseables significativos. Por consiguiente, el inventor concibe que pueden usarse dosis más pequeñas, dosis equivalentes o dosis mayores de los péptidos en las composiciones de la divulgación. Por tanto, las dosis preferidas pueden comprender por lo menos 0,001 mg/kg, por lo menos 0,002 mg/kg, por lo menos 0,003 mg/kg, por lo menos 0,004 mg/kg, por lo menos 0,005 mg/kg, por lo menos 0,006 mg/kg, por lo menos 0,007 mg/kg, por lo menos 0,008 mg/kg, por lo menos 0,009 mg/kg, por lo menos 0,01 mg/kg, por lo menos 0,015 mg/kg, por lo menos 0,02 mg/kg, por lo menos 0,03 mg/kg, por lo menos 0,04 mg/kg, o por lo menos 0,05 mg/kg de los péptidos de acuerdo con la divulgación. Las dosis preferidas también pueden comprender menos de 1 mg/kg, menos de 0,9 mg/kg, menos de 0,08 mg/kg, menos de 0,07 mg/kg, menos de 0,06 mg/kg o menos de 0,05 mg/kg de los péptidos de acuerdo con la divulgación. Las dosis preferidas pueden comprender de 0,001 mg/kg a 1,0 mg/kg, de 0,0025 mg/kg a 0,075 mg/kg, o de 0,005 mg/kg a 0,05 mg/kg de los péptidos de acuerdo con la divulgación.

Una composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable, para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos como liposomas, siempre que el portador no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que pueda administrarse sin toxicidad indebida. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables en el mismo, por ejemplo, sales de ácidos minerales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Un tratamiento exhaustivo de portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., NJ 1991).

Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, y similares, pueden estar presentes en tales composiciones. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para su ingestión por el paciente.

Una vez formuladas, las composiciones de la divulgación pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a ser tratados pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta divulgación pueden administrarse por cualquier número de vías incluyendo, pero no limitadas a, medios orales, intravenosos, intramusculares, intraarteriales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, transdérmicos, transcutáneos, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, enterales, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. También pueden usarse pistolas génicas o hipoespráis para administrar las composiciones farmacéuticas de la divulgación (ver, por ejemplo,
www.powderject.com). Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o

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suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección.

La administración directa de las composiciones se realizará generalmente por inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará al espacio intersticial de un tejido. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis individual o un programa de dosis múltiples.

En un enfoque, la expresión de los genes que codifican los autoanticuerpos problemáticos descritos anteriormente puede inhibirse usando técnicas de bloqueo de la expresión, como el uso de moléculas de ácidos nucleicos antisentido (como se ha descrito anteriormente), ya sean generadas internamente o administradas por separado. Las modificaciones de la expresión génica pueden obtenerse diseñando secuencias complementarias o moléculas antisentido (ADN, ARN o ANP) a las regiones de control, 5' o reguladoras (secuencia señal, promotores, potenciadores e intrones) de los genes que codifican el autoanticuerpo. De manera similar, la inhibición puede lograrse usando la metodología de emparejamiento de bases de "triple hélice" (ver Gee, J.E. et al. (1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). La secuencia complementaria o molécula antisentido también puede estar diseñada para bloquear la traducción de ARNm evitando que el transcrito se una a los ribosomas. Tales oligonucleótidos pueden administrarse o pueden generarse in situ a partir de la expresión in vivo.

Puede emplearse terapia génica para efectuar la producción endógena de péptidos de la divulgación por las células relevantes en el sujeto. La terapia génica puede tener lugar in vivo o ex vivo. La terapia génica ex vivo requiere el aislamiento y la purificación de las células del paciente, la introducción de un gen terapéutico y la introducción de las células alteradas genéticamente de vuelta en el paciente. Por el contrario, la terapia génica in vivo no requiere aislamiento ni purificación de las células de un paciente.

El gen terapéutico esta típicamente "empaquetado" para la administración a un paciente. Los vehículos de administración génica pueden ser no víricos, como liposomas, o virus deficientes en la replicación, como adenovirus (ver Berkner, K.L., in Curr. Top.Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)) o vectores de virus adeno-asociados (AAV) (ver Muzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) y Patente U.S. N° 5.252.479 ). Por ejemplo, puede diseñarse una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de la divulgación para la expresión en un vector retroviral defectuoso en la replicación. Este constructo de expresión puede luego aislarse e introducirse en una célula de empaquetado transducida con un vector plásmido retroviral que contiene ARN que codifica el péptido, de tal manera que la célula de empaquetado produce ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden administrarse a un sujeto para diseñar células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo (ver Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (y las referencias citadas en la presente) en Human Molecular Genetics (1996) , T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).

Otro enfoque es la administración de "ADN desnudo" en el que el gen terapéutico se inyecta directamente en el torrente sanguíneo o el tejido muscular.

La divulgación también incluye que los péptidos, moléculas de ácido nucleico, vectores y células huésped de la divulgación pueden usarse en vacunas para generar anticuerpos contra la enfermedad que causa los autoanticuerpos. En consecuencia, este aspecto de la divulgación incluye una composición de vacuna que comprende un péptido, molécula de ácido nucleico, vector o célula huésped de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la divulgación descritas anteriormente. Las vacunas de acuerdo con la divulgación pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir enfermedades) o terapéuticas (es decir, para tratar enfermedades después de su incidencia). Tales vacunas comprenden inmunizar péptido o ácido nucleico, habitualmente en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables como se ha descrito con anterioridad, que incluyen cualquier portador que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Tales portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de vacuna de la divulgación incluyen, pero no están limitados a, adyuvantes que contienen minerales (incluyendo sales minerales, como sales de aluminio y sales de calcio, que pueden incluir hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc.), emulsiones oleosas, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similares a virus, derivados bacterianos y microbianos, inmunomoduladores humanos, bioadhesivos y mucoadhesivos, micropartículas, liposomas, formulaciones de éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno, polifosfaceno (PCPP), péptidos de muramilo, compuestos de imidazoquinolona, compuestos de tiosemicarbazona y compuestos de triptantrina, o combinaciones de los mismos.

Además, el péptido puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pyloriy otros patógenos. Los péptidos de acuerdo con la divulgación pueden usarse individualmente o en combinación, solos o junto con agentes diseñados para promover su eficacia, en cadenas simples, dobles o múltiples con o sin elementos conectores y portadores.

Como los péptidos pueden descomponerse en el estómago, las vacunas que comprenden péptidos se administran preferiblemente por vía parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o

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intradérmica). Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes.

Las formulaciones de vacunas de la divulgación pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o multidosis. Por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en un estado de congelación en seco que requiere solamente la adición del portador líquido estéril inmediatamente antes de su uso. La dosificación dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente mediante experimentación rutinaria.

Este aspecto de la divulgación también incluye un método para vacunar a un individuo contra una enfermedad o trastorno, que comprende administrar al individuo un péptido o una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la divulgación descritas anteriormente.

Puede ser deseable administrar una composición de la divulgación a un paciente durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo durante más de un día, durante más de una semana, durante más de un mes o durante varios meses desde una única administración. El inventor concibe varias formas de dosificación de depósito o implante de liberación lenta,. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del péptido que tiene un bajo grado de solubilidad en los fluidos corporales. Adicionalmente, el péptido puede formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para inyección. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para inyección contendría el péptido o sal dispersada para encapsularse en un polímero no antigénico, no tóxico y de degradación lenta, como un polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo como se describe en la US 3.773.919. Las formulaciones de depósito o implante, de liberación lenta adecuadas pueden ser identificadas por el experto en la técnica.

De acuerdo con un aspecto adicional más de la divulgación, se divulga un método para diagnosticar en un individuo la presencia de o niveles de anticuerpos autoinmunes, el método comprendiendo poner en contacto una muestra de sangre, plasma o suero u otro fluido corporal con un péptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la divulgación descritas anteriormente en presencia de un objetivo para los anticuerpos autoinmunes y evaluarla cantidad del autoanticuerpo de origen natural que se une específicamente al objetivo. Tal método implica un ensayo de unión competitiva en el que las moléculas objetivo que son capaces de unirse a los anticuerpos autoinmunes compiten específicamente con el péptido por la unión. De esta manera, los péptidos pueden usarse para detectar la presencia y cantidad de anticuerpos autoinmunes presentes en el individuo. Tal ensayo puede basarse en radioinmunoensayo, análisis de transferencia Western, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o tecnología ELISA). Las cantidades de autoanticuerpo expresadas en muestras del sujeto, control y enfermedad de tejidos biopsiados pueden compararse de esta manera con valores estándar. La desviación entre valores estándar y sujetos establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. Los ensayos de diagnóstico pueden usarse para distinguir entre ausencia, presencia y exceso de expresión de anticuerpo autoinmune y para monitorizar la regulación de los niveles de polipéptidos durante la intervención terapéutica. Tales ensayos también pueden usarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios animales, en ensayos clínicos o en la monitorización del tratamiento de un paciente individual.

El método anterior puede utilizar un péptido que está marcado de tal manera que el péptido marcado compite con los autoanticuerpos para que las moléculas objetivo formen complejos. En tal ensayo, la cantidad de marcador unido en los complejos es inversamente proporcional a la concentración de autoanticuerpos presentes en la muestra. El péptido puede marcarse con un enzima de tal manera que la formación de los complejos inhibe o inactiva la actividad del enzima. Alternativamente, el péptido puede estar marcado radiactivamente o fluorescentemente. En un escenario alternativo, las moléculas objetivo pueden estar unidas a un enzima enlazado con un sustrato de tal manera que la unión del anticuerpo autoinmune a las moléculas objetivo activa el enzima y provoca un cambio de color que se puede medir espectrofotométricamente. Las moléculas objetivo pueden unirse a un enzima enlazado a un sustrato y presentarse en una tira reactiva que puede ponerse en contacto con la muestra.

En todas estas metodologías, la molécula objetivo puede ser preferiblemente una molécula de inmunoglobulina policlonal o monoclonal anti-TCR Vp o cualquier parte de la misma que identifique por lo menos un epítopo en las cadenas Vp del receptor de células T en seres humanos o cualquier especie animal.

Para facilitar la detección del autoanticuerpo, la divulgación incluye un kit de diagnóstico que comprende un péptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de la divulgación descritas anteriormente; una molécula de inmunoglobulina objetivo anti-TCR Vp policlonal o monoclonal o cualquier parte de la misma que identifique por lo menos un epítopo en una cadena Vp del receptor de células T; y un reactivo útil para la detección de una reacción de unión entre el anticuerpo autoinmune y la molécula de inmunoglobulina objetivo. Tales kits serán de uso considerable en el diagnóstico de enfermedades o susceptibilidad a enfermedades.

De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgación, se divulga una matriz que incorpora uno o más

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péptidos de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación. Tales matrices son útiles para el diagnóstico de la enfermedad o la susceptibilidad a la enfermedad. Desarrollos recientes en el campo de matrices de péptidos, proteínas y anticuerpos permiten la detección simultánea de un gran número de polipéptidos. Las matrices de proteínas de baja densidad en membranas de filtro, como el sistema de matriz de proteínas universal (G Ge H, (2000) Nucleic Acids Res. 28(2), e3) permiten la formación de imágenes de antígenos dispuestos usando técnicas de ELISA estándar y un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) de barrido en una placa de vidrio ópticamente plana que contiene 96 pocillos. También se han desarrollado matrices de inmunosensores que permiten la detección simultánea de analitos clínicos. Usando tales matrices de proteínas, la expresión de proteínas (como autoanticuerpos) puede perfilarse en fluidos corporales, como en sueros de sujetos sanos o enfermos, así como en pacientes antes y después del tratamiento con fármacos.

En una realización alternativa, los anticuerpos policlonales o monoclonales generados contra los péptidos expresados biológicamente o sintetizados del primer aspecto de la divulgación o ligandos equivalentes pueden usarse en técnicas analíticas para detectar cualitativa o cuantitativamente la presencia de los autoanticuerpos o anticuerpos que contrarrestan elaborados contra ellos.

Se describirán ahora con más detalle varios aspectos y realizaciones a modo de ejemplo, con referencia particular a péptidos específicos. La invención se define en las reivindicaciones añadidas y cualquier otro aspecto o realización expuesta en la presente es solo con propósitos informativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figuras 1A y 1B. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo clonado.

Figura 2. Línea de células tumorales humanas en presencia de anticuerpo monoclonal irrelevante de control.

Figuras 3Ay3B. Línea de células tumorales humanas en presencia de anticuerpos anti-anti-TCR Vp que muestran morfologías típicas del citoesqueleto de actina y protuberancias celulares.

Figuras 4A a 4E. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo clonado.

Figura 5. Glucagón sérico (media ± DE) antes y después de la ingestión de 75 g de glucosa en el grupo tratado con NDX-1 el día 01 y el día 43.

Figura 6. Niveles de HbAlc en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 después de la retirada de los fármacos antidiabéticos. Se muestran los datos medios de todos los sujetos; las barras indican el error estándar de la media. Se excluyeron los datos obtenidos de los sujetos, después de restablecer la medicación antidiabética.

Figura 7. Niveles de glucosa capilar en ayunas en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 después de la retirada de los fármacos antidiabéticos. Se muestran los datos medios de todos los sujetos; las barras indican el error estándar de la media. Se excluyeron los datos obtenidos de los sujetos después de restablecer la medicación antidiabética.

Figura 8. Niveles de fructosamina sérica corregidos para la albúmina en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 después de la retirada de fármacos antidiabéticos. Se muestran los datos medios de todos los sujetos; las barras indican el error estándar de la media. Se excluyeron los datos obtenidos de los sujetos después de restablecer la medicación antidiabética.

Figura 9. Niveles de HbAlc en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 después de la retirada de fármacos antidiabéticos. Se muestran los datos medios de los sujetos; las barras indican el error estándar de la media. Se excluyeron los datos obtenidos de los sujetos después de restablecer la medicación antidiabética.

Figura 10. Niveles de glucosa capilar en ayunas en pacientes masculinos con diabetes mellitus tipo 2 después de la retirada de fármacos antidiabéticos. Se muestran los datos medios; las barras indican el error estándar de la media. Se excluyeron los datos obtenidos de los sujetos después de restablecer la medicación antidiabética.

Figura 11. Niveles de fructosamina en suero corregidos para la albúmina en pacientes masculinos con diabetes mellitus tipo 2 después de la retirada de fármacos antidiabéticos. Se muestran los datos medios; las barras indican el error estándar de la media. Se excluyeron los datos obtenidos de los sujetos después de restablecer la medicación antidiabética.

Figuras 12A a 12E. Alineamiento de secuencias de la región hipervariable a partir de secuencias de VH y VL conocidas contra secuencias de la región hipervariable identificadas en la presente.

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EJEMPLOS

Ejemplo 1: Secuenciación de anticuerpos

MÉTODOS

Aislamiento de ARN total

Se extrajo ARNm poli A+ se extrajo de 109 células monoclonales congeladas, que secretaban anticuerpos que reconocen anti-anti-TCR Vp y un elemento del enlace a GPI, usando el método de isotiocianato de guanidinio. El aislamiento de ARN total se llevó a cabo usando el kit Ambion RNAqeous (Cat. N° 1912, Lote N° 019K0158). Se resuspendieron aproximadamente 0,3 mg de células de hibridoma congeladas en 5 ml de solución de lisis/unión. Después de la lisis, se añadieron 5 ml de etanol al 64%, se mezcló y la mezcla de lisado/etanol se aplicó a unidades de filtro RNAqeous y se centrifugó para unir el ARN a la matriz del filtro. Los filtros se lavaron luego una vez con 700 pl de solución de lavado N° 1 y dos veces con 500 pl de solución de lavado 2/3, y se centrifugaron después de cada paso de lavado con un paso de centrifugación final después del lavado final. El ARN se eluyó de los filtros aplicando 2 x 60 pl de solución de elución precalentada (95° C) en el centro del filtro y centrifugación. El ARN eluido se precipitó con 0,5 x vol de cloruro de litio durante la noche a -20° C. Después del lavado en etanol al 70% frío, el sedimento de ARN se secó con aire y se resuspendió en 20 pl de agua estéril y se almacenó a -70° C.

Transcripción inversa del ARN en el ADNc de la Primera Cadena

Se construyó una cadena de ADN complementaria usando 1 pg del ARN aislado anteriormente.

La reacción de transcripción inversa se estableció como sigue usando el kit Ambion Retroscript (N° de Cat. 1710, Lote N° 078K0262):

pl

1 ARN (1 pg)

4 mezcla de dNTPs (2,5 mM cada uno)

2 cebadores de primera cadena de oligo dT

9 Agua esterilizada

Esta solución se incubó a 75° C durante 3 min y luego se colocó en hielo. Luego se añadió lo siguiente: pl

2 10 x tampón de RT-PCR alternativo

1 Inhibidor de ARNasa placentario

1 Transcriptasa inversa M-MLV

Se permitió que la reacción procediese a 42° C durante 90 minutos y se inactivó mediante incubación a 92° C durante 10 min. La reacción se almacenó luego a -20° C.

Reacción en cadena de la polimerasa de fragmentos de cadenas pesadas y ligeras de Ig

Se usó un conjunto de cebador de Ig de ratón (Apéndice 1, Novagen, N° de Cat. 69831-3, Lote N° N14754) para la PCR de los fragmentos de Ig de la cadena pesada y ligera de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el ADNc de la primera cadena preparado anteriormente.

Las reacciones se almacenaron a -20° C hasta que se necesitaron.

Clonación de productos de PCR

Todos los productos de PCR se clonaron en un sistema de clonación Blunt-end para facilitar la secuenciación. Los sistemas usados fueron pSTBlue-1 Perfectly Blunt™ Cloning (Novagen, N° de Cat. 70191-3) y Zero Blunt™ PCR Cloning Kit (Invitrogen, 25-0162). Luego fueron secuenciados mediante procedimientos estándar.

RESULTADOS

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos obtenidas para las regiones variables de cadena pesada y ligera se muestran en las Figuras 1Ay 1B (SEQ ID NO: 1 a 4). Se dedujeron las regiones hipervariables y están subrayadas en las Figuras 1Ay 1B (SEQ ID NO: 6 a 16).

Ejemplo 2: Péptidos de CDR de Homodímeros

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Se añadió una cisteína N terminal a cada una de las secuencias de la región hipervariable (CDR-L1-3 y CDR-H1-3, SEQ ID NO: 6 a 16) que se sintetizaron mediante síntesis del péptido Fmoc y se dimerizaron para formar homodímeros. Algunos de los homodímeros se biotilinaron; los homodímeros biotinilados se probaron luego mediante microscopía de fluorescencia por su capacidad para unirse a células a pancreáticas humanas (usadas como tejido humano indicador) usando antibiotina fluoresceinada como un reactivo del segundo paso. Se descubrió que los homodímeros de CDR-H2 (SEQ ID NO: 8), CDR-H3 (SEQ ID NO: 10) y CDR-L3 (SEQ ID NO: 16) se unían a las células a pancreáticas. Los péptidos de homodímeros no biotinilados se probaron después mediante ELISA para su capacidad para unirse al anticuerpo anti-TCR Vp y a cardiolipina como indicador de fosfolípidos (Tabla 1).

Tabla 1. lecturas de densidad óptica para los ELISA que muestran la unión de anticuerpos o péptidos de homodímeros anti-anti-TCR Vp monoclonales, CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L3 a anticuerpos^ anti-TCR Ve-

Antígeno: anticuerpo a-a-TCR Vp CDR-H2 CDR-H3 CDR-L3

anticuerpo a-TCRVp: 0.806 ± 0.056# 0.307 ± 0.018* 0.182 ± 0.009* 0.243 ± 0.008*

Medio de cultivo#/PBS *: 0.372 ± 0.037# 0.168 ± 0.010* 0.091 ± 0.020* 0.140 ± 0.018*

Prueba/control de proporción: 2.17 1.83 2.00 1.74

Cardiolipina**: 0.142 ± 0.070 0.151 ± 0.020 0.132 ± 0.009 0.254 ± 0.012

Alcohol**: 0.038 ± 0.014 0.063 ± 0.012 0.061 ± 0.006 0.114 ± 0.021

Prueba/control de proporción: 3.74 2.40 2.16 2.23

#La placa de microtitulación se recubrió con a-TCR Vp y se probó frente a a-a-TCR Vp o medio de cultivo. * La placa de microtitulación se recubrió con CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L3 y se probó frente a a-TCR Vp o medio de cultivo. **La placa de microtitulación se recubrió con cardiolipina en alcohol etílico o alcohol etílico y se analizó contra a- a-TCR Vp o CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L3. Cada media y desviación estándar es para tres observaciones.

Ejemplo 3: identificación de autoanticuerpos in vivo

La evidencia de la presencia en el suero humano de autoanticuerpos (representados por anti-anti-TCR Vp y los péptidos de esta divulgación) que se unen a los anticuerpos anti-TCR Vp se muestra en la Tabla 2. Como es probable que los autoanticuerpos se vuelvan ubicuos en la población adulta, los niveles indetectables tienen más probabilidades de encontrarse entre los niños. Esto es respaldado por los datos en la Tabla 2 que muestra niveles altos en niños diabéticos de Tipo I recién diagnosticados en comparación con los controles ICA positivos e ICA negativos.

Tabla 2. Reactividad de los sueros de niños diabéticos y no diabéticos recién diagnosticados contra ___________________________anticuerpo anti-TCR Vp monoclonal.___________________________

Tipo de sujeto: Número total de sujetos Número reactivo contra anti-TCR Vp Rango del índice de prueba/control * Índice medio

Diabéticos recién diagnosticados: 8 7 00 cd 00 2.7 ± 0.8

No diabéticos ICA positivos: 10 5 1.2 -1.5 1.3 ± 0.1

No diabéticos ICA negativos: 10 3 1.2 -2.1 1.6 ± 0.5

• El rango de índice se deriva tomando la proporción de las mediciones de densidad óptica comparando sueros de prueba diluidos 1 en 30 con el diluyente (medio de cultivo) solo. • La placa de microtitulación se recubrió con anticuerpo Anti-TCR Vp. • Los sueros se diluyeron 1 en 30 en medio de cultivo. • La unión se detectó usando peroxidasa de Ig antihumano y un sustrato apropiado.

Ejemplo 4: metástasis de cáncer

Los autoanticuerpos también están implicados en la metástasis de cáncer al unirse a moléculas enlazadas a GPI como uPAR que interacciona con el citoesqueleto de actina provocando motilidad celular (ver la página 51). Otros ejemplos donde la uPAR o moléculas similares pueden ser responsables de mantener el citoesqueleto son para la función de CFTR óptima que está comprometida en la fibrosis quística (ver la página 54) o en la artritis donde las células sinoviales que llevan tales moléculas invaden el cartílago y el hueso (ver la página 50).

La Figura 2 muestra una línea celular tumoral humana en presencia de un anticuerpo irrelevante, mientras

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que las Figuras 3a y 3b muestran el efecto del anticuerpo monoclonal anti-anti-TCR Vp en la misma línea celular tumoral demostrando cambios en el citoesqueleto de actina y protuberancias celulares indicativas de motilidad después de 30 minutos de incubación.

Ejemplo 5: Secuenciación de anticuerpos adicional

Los genes que codifican cinco anticuerpos monoclonales anti-anti-TCR Vp murinos de reacción cruzada adicionales se clonaron y se secuenciaron, usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior. Las líneas celulares de las cuales se obtuvieron las secuencias de anticuerpos monoclonales se designan líneas celulares 13.42a, 32.15, 32.17, 32.75 y 32.2 en la presente. Los anticuerpos producidos por las líneas celulares 32.15, 32.17, 32.75 y 32.2 son anticuerpos IgM, lo mismo que el anticuerpo clonado y secuenciado en el Ejemplo 1. El anticuerpo producido por la línea celular 13.42a es un anticuerpo IgG.

RESULTADOS

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para las regiones variables de cadena pesada y ligera se muestran en las Figuras 4A a 4E. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de VH y VL de la línea celular 13.42a se muestran en la Figura 4A (SEQ ID NO: 17-20). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de VH y VL de la línea celular 32.15 se muestran en la Figura 4B (SEQ ID NO: 33-36). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de VH y VL de la línea celular 32.17 se muestran en la Figura 4C (SEQ ID NO: 49-52). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de VH y VL de la línea celular 32.75 se muestran en la Figura 4D (SEQ ID NO: 6568). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de VH y VL de la línea celular 32.2 se muestran en la Figura 4E (SEQ ID NO: 81-84).

Se dedujeron las regiones hipervariables y están subrayadas en las Figuras 4A a 4E. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región hipervariable de la línea celular 13.42a se muestran en la Figura 4A (SEQ ID NO: 21-32). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región hipervariable de la línea celular 32.15 se muestran en la Figura 4B(SEQ ID NO: 37-48). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región hipervariable de la línea celular 32.17 se muestran en la Figura 4C (SEQ ID NO: 53-64). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región hipervariable de la línea celular 32.75 se muestran en la Figura 4D (SEQ ID NO: 69-80). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región hipervariable de la línea celular 32.2 se muestran en la Figura 4E (SEQ ID NO: 85-96).

Las secuencias de la región hipervariable determinados para líneas celulares 13.42a, 32.15, 32.17, 32.75 y 32.2 se compararon con las secuencias de la región hipervariable identificadas en el Ejemplo 1, para establecer que residuos de las regiones hipervariables son importantes para la unión anti-TCR Vp de reactividad cruzada (es decir, los residuos de regiones hipervariables importantes para reactividad multiespecífica contra un epítopo de enlace a GPI y anticuerpos anti TCR Vp, moléculas con capacidad de señalización, fosfolípidos que incluyen fosfatidil inositol, fosfatidil serina y cardiolipina (diacil glicerol), fosfolípidos glicanos, segundos mensajeros de acción de la insulina, ADN de cadena sencillas, o ADN de cadena doble). Las regiones hipervariables que se compararon se muestran en las Tablas 3 y 4 a continuación:

Tabla 3: Secuencias de regiones hipervariables de cadena pesada (CDR)

: CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3

Ejemplo 1: GYTFTRNWINW NIYPSDSYTNYNQKFKD LRGLLPDY

Línea celular 13.42a: GYAFTSYNMFW YIDPYNGDTRYSQKFKG KGMTTGYA

Línea celular 32.15: GYTFTNYGMNW WINTYTGEPTYADDFKG EGLYGNYF

Línea celular 32.17: GYTFTRNWINW NIYPSDSYTNYNQKFKD LRGLLPDY

Línea celular 32.75: GYTFTRNWINW NIYPSDSYTNYNQKFKD LRGLLPDY

Línea celular 32.2: GYTFTNYGMNW WINTYTGEPTYADDFKG EGLYGNYF

Residuos conservados: GY-FT----W LL

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Tabla 4: Aecuencias de regiones hipervariables de cadena ligera (CDRi

: CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3

Ejemplo 1: KASQNVDTNVA SASYRYS QQYNSYPLT

Línea celular 13.42a: RASQDISNYLN YTSRLHS QQGNTFPTF

Línea celular 32.15: KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNSYPLT

Línea celular 32.17: RASSSISSNYL RTSILAS QQGSSSPLT

Línea celular 32.75: KASQNVDTNVA SASYRYS QQYNSYPPT

Línea celular 32.2: KASQNVGTNVA SASYRYS QQYNSYPLT

Residuos conservados: -COMO------- --S --- S CL a a

El análisis de estas secuencias de regiones hipervariables revela información importante referente a los residuos requeridos para la unión anti-TCR Vp de reactividad cruzada (es decir, reactividad multiespecífica contra un epítopo de enlace a GPI como se describe en la presente).

En primer lugar, el análisis de las secuencias sugiere que los aminoácidos específicos pueden ser esenciales en ciertas posiciones dentro de cada CDR. Se generó una secuencia de consenso para cada CDR, que incorpora los aminoácidos que están completamente conservados en los seis anticuerpos que han sido clonados y secuenciados por el inventor. En las siguientes secuencias de consenso, 'x' puede ser cualquier aminoácido y '-' indica un enlace peptídico.

CDR-H1 G-Y-x-F-T-x-x-x-x-x-W CDR-H2 x-I -x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x- F - K-x

CDR-H3 Residuos no conservados completamente CDR-L1 x-A-S-x-x-x-x-x-x-x-x

CDR-L2 x-x-S-x-x-x-S CDR-L3 Q-Q-x-x-x-x-P-x-x

En segundo lugar, el análisis de las secuencias permitió la generación de una 'fórmula general' para cada CDR. En las siguientes fórmulas, donde se encontró que aparecían dos o más residuos de aminoácidos en una posición dada en una CDR, esos residuos se muestran entre paréntesis.

CDR-H1 G-Y-[TA]-F-T-[RNS]-[YN]-[WGN]-[IM]-[NF]-W

CDR-H2 [NWY]-I-[YND]-[PT]-[SY]-[DNT]-[SG]-[YDE]-[TP]-[NRT]-Y-

[NSA] - [QD] - [KD] -F-K- [DG]

CDR-H3 [LKE]-[RG]-[GML]-[LTY]-[LTG]-[PGN]-[DY]-[YAF]

CDR-L1 [KR]-A-S-[QS]-[NDS]-[VI]-[DSG]-[TNS]-[NY]-[VLY]-[ANL]

CDR-L2 [SYR]-[AT]-S-[YRI]-[RL]-[YHA]-S CDR-L3 Q-Q-[YG]-[NS]-[TS]-[YFS]-P-[LTP]-[TF]

Por tanto, las "fórmulas generales" anteriores abarcan cada una de las secuencias de CDR de los seis anticuerpos monoclonales IgM e IgG que han sido clonados y secuenciados por el inventor.

En tercer lugar, el análisis de las secuencias permitió que se generase una fórmula de aminoácidos para cada CDR que tiene en cuenta no solo los aminoácidos conservados, sino también el aminoácido(s) más común (predominante) en cada posición de CDR. En las fórmulas siguientes, se enumeran los aminoácidos conservados o predominantes, excepto cuando se encontró que los aminoácidos eran co-predominantes en una posición determinada (es decir, se encontró que los aminoácidos se producían un número igual de veces en las CDR clonadas y secuenciadas) , los aminoácidos co-predominantes se enumeran entre paréntesis.

CDR-H1 G-Y-T-F-T-R-[YN]-W-[IM]-N-W

CDR-H2 N-I-Y-P-[SY]-D-[SG]-Y-T-N-Y-N-Q-K-F-K-[DG]

CDR-H3 L-[RG]-G-L-L-P-[DY]-Y CDR-L1 K-A-S-Q-N-V-[DSG]-T-N-V-A CDR-L2 S-A-S-Y-R-Y-S CDR-L3 Q-Q-Y-N-S-Y-P-L-T

Se cree que los péptidos que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que cumple los

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requisitos de una o más de las secuencias de consenso y fórmulas anteriores tendrán una actividad biológica equivalente a los péptidos probados in vivo en los Ejemplos 6 y 7 a continuación, y serán útiles de acuerdo con la divulgación.

Ejemplo 6: Prueba de fase I/IIa

Doce sujetos masculinos con intolerancia a la glucosa participaron en un ensayo clínico controlado con placebo doble ciego de fase I/IIa para evaluar la seguridad y tolerabilidad de NDX-1. El NDX-1 es una mezcla de tres péptidos de acuerdo con la divulgación (B71, C80 y F90), mezclados en una proporción de 2:1:1. B71 es un homodímero de péptidos monoméricos derivados de CDR-H2, cada monómero comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 8 y adicionalmente un residuo de cisteína N terminal. La secuencia de aminoácidos del péptido monomérico B71 se da en la SEQ ID NO: 159. C80 es un homodímero de péptidos monoméricos derivados de CDR-H3, cada monómero comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 10 y adicionalmente un residuo de cisteína N terminal. La secuencia de aminoácidos del péptido monomérico C80 se da en la SEQ ID NO: 160. F90 es un homodímero de péptidos monoméricos derivados de CDR- L3, cada monómero comprendiendo la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 16 y adicionalmente un residuo de cisteína N terminal. La secuencia de aminoácidos de los péptidos monoméricos F90 se da en la SEQ ID NO: 161. Los pacientes fueron aleatorizados para recibir un total de 4 inyecciones intramusculares (IM) espaciadas una semana desde el día 01 de o la sustancia de prueba, la mezcla de péptidos NDX-1 o las inyecciones de placebo. 3 sujetos recibieron las inyecciones de placebo compuestas de alhidrogel al 0,1% en 1,1 ml de solución salina. 9 sujetos recibieron 0,99 mg de la mezcla de péptidos NDX-1 en 1,1 ml de solución salina que contenía alhidrogel al 0,1%. Las inyecciones de placebo y de prueba eran visiblemente idénticas

La mezcla de péptidos NDX-1 fue bien tolerada. En los sujetos tratados, las concentraciones de glucosa, insulina y glucagón en ayunas no cambiaron significativamente en comparación con el valor de referencia. Los sujetos se sometieron a una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) el día 01 antes de la primera inyección y el día 43. Se tomaron muestras de sangre antes y a los 30, 60, 90 y 120 minutos después de la ingesta de 75 g de glucosa en ambas ocasiones.

Los sujetos que habían recibido la mezcla de péptidos NDX-1 mostraron una disminución significativa en la concentración de glucosa en suero de dos horas en comparación con el grupo de placebo (p = 0,03). El tiempo requerido para que el glucagón alcance su nivel más bajo en el grupo NDX-1 fue de 113,3 ± 13,2 minutos en el día 01, que bajó a 63,3 ± 41 minutos en el día 43 (p=0,0027; ver Figura 5). También hubo diferencias significativas en los cambios porcentuales en la creatinina en plasma (p=0,0009), sodio (p=0,0344), cloruro (p=0,0041) y urea en plasma (p=0,0156) desde el valor de referencia hasta el final del ensayo que comparando los grupos NDX-1 y placebo. Estos cambios fueron consistentes con la progresión de la enfermedad en el grupo placebo pero no en el grupo tratado. Además, los resultados de 2 horas de glucosa y glucagón de los estudios OGTT en el grupo de prueba demuestran la eficacia de la mezcla de péptidos NDX-1 en la regulación autoglucémica.

Ejemplo 7: Ensayo de fase Ilb en diabéticos tipo 2

Se introdujeron 31 sujetos (21 hombres y 10 mujeres) con diabetes mellitus tipo 2 en uno o más medicamentos antidiabéticos orales en un estudio doble ciego aleatorizado de 16 semanas de duración. En el día 01, se suspendió toda la medicación antidiabética. Los pacientes fueron asignados al azar o al grupo placebo (grupo C) o uno de los 3 grupos de tratamiento descritos como Grupos A, B o D. Todos los grupos recibieron un total de 4 inyecciones IM espaciadas una semana comenzando el día 01. El grupo placebo (8 sujetos) recibió 1,2 ml de solución salina que contenía alhidrogel al 0,1%. El Grupo A (7 sujetos) recibió 1,51 mg de un péptido de acuerdo con la divulgación (designado como NDX-71 en la presente) en 1,2 ml de solución salina que contenía alhidrogel al 0,1%. El grupo B (8 sujetos) recibió 0,86 mg de NDX-71 en 1,2 ml de solución salina que contenía alhidrogel al 0,1%. El grupo D (8 sujetos) recibió una mezcla de 3 péptidos de la divulgación (0,92 mg de NDX-71, 0,68 mg de C80 y 0,71 mg de F90) en 1,2 ml de solución salina que contenía alhidrogel al 0,1%. El placebo y los medicamentos del estudio eran visiblemente idénticos. El péptido NDX-71 usado en este ejemplo era el péptido B71 usado en el Ejemplo 6. Los péptidos C80 y F90 usados en este ejemplo eran los péptidos C80 y F90 usados en el Ejemplo 6.

A intervalos regulares a lo largo del período de estudio, los pacientes se sometieron a análisis de sangre por seguridad clínica y para los parámetros de eficacia glucémica. Las sustancias de prueba fueron bien toleradas. Los parámetros de seguridad clínica en todos los grupos se mantuvieron sin cambios desde la referencia. No se informó de eventos adversos en el estudio atribuibles a las sustancias de prueba.

Durante los 4 meses posteriores al cese del fármaco, hubo un marcado deterioro del control glucémico en el grupo placebo, medido por HbA1c, glucosa en sangre en ayunas y fructosamina (ver Figuras 6-8) Los niveles medios de HbAlc aumentaron de 6,3% en el valor de referencia al 8,3% en el día 113. Sin embargo, en el grupo de tratamiento de dosis alta los niveles de HbAlc se mantuvieron casi constantes a lo largo del tiempo, desde 6,3 en el valor de referencia hasta 6,9 en el día 113 y fueron significativamente diferentes del grupo placebo (p=0,02; ver Figura 6).

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Los análisis de subconjuntos de los 21 voluntarios masculinos revelaron una importancia global o diferencias altamente significativas entre el placebo (grupo C) y los grupos A, B y D combinados para todos los parámetros glucémicos estudiados, es decir, HbAlc (p=0,004; ver Figura 9), glucosa en sangre en ayunas (p=0,024; ver Figura 10) y fructosamina corregida, (p=0,015; ver Figura 11) Las diferencias de tratamiento estadísticamente significativas entre el placebo (grupo C) y el grupo de dosis alta (grupo A) para los varios parámetros fueron: HbAlc p<0,001, glucosa en ayunas p=0,005 y fructosamina corregida p=0,001. El control glucémico en los grupos de tratamiento en comparación con el placebo demuestra el efecto deseado de la regulación auto-glucémica.

Este ejemplo demuestra que después del cese de la medicación antidiabética, los pacientes que recibieron la dosis de 1,51 mg de NDX-71 pudieron mantener un buen control glucémico en ausencia de su medicación antidiabética oral. Además, los efectos de NDX-71 fueron de larga duración ya que el efecto se observó incluso 3 meses después de la dosis final de NDX-71. Los sujetos que recibieron la dosis más baja de 0,86 mg de NDX-71 y la mezcla de los tres péptidos también mostraron mejoría en comparación con el placebo, lo que indica que NDX-71 tiene un efecto de respuesta a la dosis, y dosis más altas o inyecciones más frecuentes pueden producir resultados incluso más favorables.

Ejemplo 8: Análisis de Secuencias Conocidas

Usando las secuencias de las regiones hipervariables identificadas en los Ejemplos 1 y 5, se identificaron las secuencias de las regiones hipervariables de regiones VH y VL conocidas con propiedades de unión relevantes. Las secuencias de las regiones hipervariables de las regiones VH y VL conocidas se compararon luego con las secuencias de las regiones hipervariables identificadas en los Ejemplos 1 y 5 para analizar los residuos de las regiones hipervariables importantes para la unión anti-TCR Vp de reactividad cruzada (es decir, los residuos de las regiones hipervariables importantes para reactividad multiespecífica contra un epítopo de enlace GPI como se describe en la presente). Aplicando el mismo proceso de análisis de secuencia como se describe en el Ejemplo 5, se identificaron una serie adicional de secuencias de consenso y fórmulas, como se ilustra en las Figuras 12A a 12E.

Los números de acceso para las regiones VH y VL de la técnica anterior que se identificaron se enumeran en las Figuras 12A a 12E. Las especificidades de unión divulgadas en la técnica anterior para esas regiones VH y VL también se enumeran en las Figuras 12A a 12E, usando las siguientes abreviaturas:

Anti-RF: Factor anti-reumatoide

Anti-CL: Anti-cardiolipina

Anti-ARN: Anti-ARA

Anti-ADNs: ADN anti-cadena simple

Anti-NA: Anticuerpo antinuclear

Anti-VA: Alfa anti-variable

Anti-CD8
Anti-CD8

Anti-TG: Anti-tiroglobulina

Anti-3H1: Anticuerpo antiidiotípico 3H1

Anti-RO: Anti-Ro

Anti-Track: Anti-TrkA (receptor de NGF de alta

afinidad)

Las secuencias de las regiones hipervariables de IgG e IgM identificadas en los ejemplos 1 y 5 se analizaron por separado en este ejemplo, porque se descubrió que identificaban diferentes secuencias de consenso y fórmulas.

Para las secuencias de CDR-H1 de IgM, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12A):

IgM CDR-H1 G-Y-T-F-T-x-x-x-x-x-W

IgM CDR-H1 G-Y-T-F-T-[RNYSTDEG]-[NYF]-[WGAY]-[IMV]-[NGQH]-W

IgM CDR-H1 G-Y-T-F-T-[RNS]-Y-W-[IM]-N-W

Para la secuencia de CDR-H1 de IgG, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12A):

IgG CDR-H1 G-Y-x-F-x-x-Y-x-M-x-W

IgG CDR-H1 G-Y-[ATS]-F-[T/S]-[SDG]-Y-[NWV]-M-[FQHN]-W

IgG CDR-H1 G-Y-T-F-T-S-Y-W-M-H-W

Para las secuencias de CDR-H2 de IgM, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12B):

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x-1 -x-x-x-x-x-x-x-x-Y-x-x-x- F - K-x

[NWEAY]-I-[YND]-[PT]-[SYG]-[DTGY]-[SGD]-[YEGS]-[TP]- [NTYGS]-Y-[NAI]-[QDE]-[KD]-F-K-[DGN] N-I-Y-P-S-D-S-Y-T-N-Y-N-Q-K-F-K-G

CDR-H2 de IgG, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas

x-1 -x- P-x-x-x-x-T-x-Y-x-x- K- F -x-G

[YWKNLR]-I-[DN]-P-[YAEFS]-[NYS]-[GD]-[DSG]-T-[RESKN]-Y- [SAN]-[QSEP]-K-F-[KQT]-G IgG CDR-H2 [YW]-I-N-P-Y-N-G-D-T-[ES]-Y-N-Q-K-F-K-G

No se identificaron secuencias de consenso o fórmulas para CDR-H3, ya que se encontró que había un alto nivel de secuencia y variación de longitud en esa CDR.

Para las secuencias de CDR-L1,de IgM se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12C):

IgM CDR-L1 x-A-S-x-x-x-x-x-x-x-x

IgM CDR-L1 [KR] -A-S- [QS] - [NSDT] - [VI] - [DGSR] - [TSYNK] - [NADY] - [VYGL] -

[ALD]

IgM CDR-L1 K-A-S-Q-N-V-S-T-N-V-A

Para la secuencia de CDR-L1 de IgG, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12C):

IgG CDR-L1 x-A-S-x-x-x-x-x-x-L-x

IgG CDR-L1 [RK]-A-S-[QR]-[DSG]-[IV]-[SN]-[NSG]-[YW]-L-[NHA]

IgG CDR-L1 R-A-S-Q-S-I-S-N-Y-L-[NA]

Para las secuencias de CDR-L2 de IgM, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12D):

IgM CDR-L2 x-x-S-x-x-x-S

IgM CDR-L2 [SRW]-[AT]-S-[YIT]-[RL]-[YAE]-S

IgM CDR-L2 S-A-S-Y-R-Y-S

Para la secuencia de CDR-L2 de IgG, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12D):

IgG CDR-L2 x-T-S-x-L-x-x

IgG CDR-L2 [YLDTK]-T-S-[RNKV]-L-[HAG]-[SP]

IgG CDR-L2 Y-T-S-N-L-A-S

Para las secuencias de CDR-L3 de IgM, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12E):

IgM CDR-L3 Q-Q-x-x-S-x-P-x-T

IgM CDR-L3 Q-Q-[YGWR]-[NSAG]-S-[YSDW]-P-[LPYI]-T

IgM CDR-L3 Q-Q-Y-N-S-Y-P-L-T

Para la secuencia de CDR-L3 de IgG, se identificaron las siguientes secuencias de consenso y fórmulas (ver Figura 12E):

IgG CDR-L3 Q-Q-x-N-x-x-P-x-x

IgG CDR-L3 Q-Q-[GNSTY]-N-[TES]-[FDWY]-P-[TYRF]-[FT]

IgG CDR-L3 Q-Q-N-N-E-D-P-[YR]-T

Se sabe que todas las secuencias de regiones VH y VL analizadas en este ejemplo se unen a moléculas implicadas en el mecanismo de enfermedad centralizado divulgado en la presente y en la WO99/05175, como se ilustra en las Figuras 12A a 12E. Además, las secuencias de las regiones hipervariables analizadas comparten una homología estructural significativa con las secuencias de las regiones hipervariables identificadas por el inventor en los Ejemplos 1 y 5. Por consiguiente, se cree que los péptidos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumplen los requisitos de una de los las secuencias de consenso y fórmulas anteriores también

IgM CDR-H2 IgM CDR-H2

IgM CDR-H2

Para la secuencia de (ver Figura 12B):

IgG CDR-H2 IgG CDR-H2

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tendrán actividad biológica equivalente a los péptidos probados in vivo en los ejemplos 6 y 7 anteriores, y serán útiles de acuerdo con la divulgación.

Ejemplo 9: Análisis adicional de secuencias de CDR-H2

Se realizó un análisis adicional de secuencias de CDR-H2 en secuencias conocidas de la región VH y VL, y se revelaron residuos de aminoácidos adicionales que se cree que están implicados en la unión anti-TCR Vp de reactividad cruzada. En particular, las secuencias de CDR-H2 de sesenta y siete secuencias de la región VH conocidas con especificidades de unión relevantes se compararon con las secuencias de CDR-H2 identificadas por el inventor, para determinar los residuos que comúnmente tienen lugar en cada posición de CDR-H2 con la especificidad de unión requerida.

Se identificó la siguiente fórmula, que incluye en cada posición dentro de CDR-H2 cualquier residuo que se descubrió se daba en esa posición en seis o más de las sesenta y siete secuencias de CDR-H2 analizadas:

CDR-H2 [EYWSL]-I-[YSND]-[PSH]-[SGNY]-[GSNTD]-[SGD]-[YTGS]- [TIA] - [NY] - [YN] - [NAP] - [QDSEP] - [KSL] - [FVK] - [KQS] - [GR]

Se identificó la siguiente fórmula, que incluye en cada posición dentro de CDR-H2 cualquier residuo que se descubrió se daba en esa posición en diez o más de las sesenta y siete secuencias de CDR-H2 analizadas:

CDR-H2 E-I-[YSN]-[PS]-[SGN]-[GS]-[SG]-[TGS]-T-[NY]-Y-[NAP]- [QDS] - [KS] - [FVK] - [KQ] - [GR]

Se identificó la siguiente fórmula, que incluye en cada posición dentro de CDR-H2 cualquier residuo que se descubrió que tenía lugar en esa posición en veinte o más de las sesenta y siete secuencias de CDR-H2 analizadas. Las posiciones en las que no se encontró que se diese aminoácido veinte veces o más en las sesenta y siete secuencias de CDR-H2 analizadas se denotan con 'x', lo que significa que cualquier aminoácido puede estar presente en esa posición:

CDR-H2 x-I-x-P-S-G-G-x-T-Y-x-A-D-[KS]-[FV]-K-G

Se cree que los péptidos que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que cumple los requisitos de una o más de las fórmulas anteriores también tendrán una actividad biológica equivalente a los péptidos probados in vivo en los Ejemplos 6 y 7 anteriores, y serán útiles de acuerdo con la divulgación.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ARPI MATOSSIAN-ROGERS

<120> PÉPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES

<130> P053356EP

<140> EP_

<141> 2006-08-09

<150> EP06779101.2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<151> 2006-08-09

<150> PCT/GB2006/002977 <151> 2006-08-09

<150> GB 0516527.9 <151> 2005-08-11

<150> GB 0609920.4 <151> 2006-05-18

<150> GB 0609921.2 <151> 2006-05-18

<160> 176

<170> SeqWin99, versión 1.02

<210> 1 <211> 448 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Variable de cadena pesada que codifica ADN <400> 1

aatggagctg ggttattctc ttcttggtag caacagctac aactgcagca gcctggggct gagctggtga ggcctggggc aggcttctgg ctacaccttc accaggaact ggataaactg aaggccttga gtggatcgga aatatttatc cttctgatag agttcaagga caaggccaca gtgactgtag acaaatcctc tcagcagccc gacatctgag gactctgcgg tctattattg tacctgacta ctggggccaa ggcaccattc tcacagtctc caaatgtctt ccccctcgta agcttggg

<210>2 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Variable de cadena pesada de proteína <400> 2

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser 15 10

Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 20 25

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 35 40

aggtgtccac tcccaggtcc 60

ttcagtgaag ctgtcctgca 120

ggtgaagcag aggcctggac 180

ttatactaac tacaatcaaa 240

cagcacagcc tacatgcagc 300

tacaagattg aggggtttat 360

ctcagagagt cagtccttcc 420

” 448

Gln: Val Gln Leu Gln 15
Gln

Ser: Val Lys Leu 30 Ser Cys

Trp: lie Asn Trp Val Lys

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Gln: Arg 50 Pro Gly

Asp 65: Ser Tyr Thr

Thr: Val Asp Lys

Thr: Ser Glu Asp 100

Leu: Pro Asp 115 Tyr

Ser: Gln 130 Ser

<210>3 <211> 440 <212> ADN <213> Mus musculus

Gln: Gly Leu 55 Glu Trp lie

Asn: Tyr 70 Asn Gln Lys Phe

Ser 85: Ser Ser Thr Ala Tyr 90

Ser: Ala Val Tyr Tyr 105 Cys

Trp: Gly Gln Gly 120 Thr lie

Gly: Asn 60 lie Tyr Pro Ser

Lys 75: Asp Lys Ala Thr Val 80

Met: Gln Leu Ser Ser 95 Pro

Thr: Arg Leu Arg 110 Gly Leu

Leu: Thr Val 125 Ser Ser Glu

<220>

<221> Variable de cadena ligera que codifica ADN <400> 3

gggaattcat

ttgatggaga

gggtcagcgt

agaaaccagg

tccctgatcg

tgcagtctga

tcggtgctgg

tcccaccatc

ggagtcacag

cattgtgatg

cacctgcaag

gcaatctcct

cttcacaggc

agacttggca

gaccaagctg

cagtaagctt

acccaggtct

acccagtctc

gccagtcaga

aaagcactga

agtggatctg

gagtatttct

gagctgaaac

ttgtatacat

aaaaattcat

atgtggatac

tttactcggc

ggacagattt

gtcagcaata

gggctgatgc

gttgctgtgg: ttgtctggtg 60

gtccacatca: gtaggagaca 120

taatgtagcc: tggtatcaac 180

atcctaccgg: tacagtggag 240

cactctcacc: atcagcaatg 300

taacagctat: cctctcacgt 360

tgcaccaact: gtatccatct 420


: 440

<210>4 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Variable de cadena ligera de proteína <400> 4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val: Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp lie Val Met

1: 5 10 15

Thr: Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser



: 20 25 30

Val: Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr


: 35 40 45

Gln
Gln: Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu lie Tyr Ser Ala Ser

: 50 55 60

Tyr: Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

65: 70 75 80

Thr: Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala




: 85 90 95

Glu: Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 115 120 125

<210>5 <211> 33 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de ADN <400>5

ggctacacct tcaccaggaa ctggataaac tgg 33

<210>6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de proteína <400>6

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Trp lie Asn Trp 15 10

<210>7 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de ADN <400>7

aatatttatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa agttcaagga c 51

<210>8 <211> 17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de proteína <400>8

Asn lie Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Asp

<210>9

<211> 24

<212>ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de ADN <400>9

ttgaggggtt tattacctga ctac 24

<210> 10 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de proteína <400> 10

Leu Arg Gly Leu Leu Pro Asp Tyr 1 5

<210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de ADN <400> 11

aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc 33

<210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de proteína <400> 12

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala 15 10

<210> 13 <211> 21 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> Mus musculus <220>

<221> HV2 de cadena ligera de ADN <400> 13

tcggcatcct accggtacag t 21

<210> 14 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de proteína <400> 14

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 ” *

<210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de ADN <400> 15

cagcaatata acagctatcc tctcacg 27

<210> 16 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de proteína <400> 16

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 17 <211> 359 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VH-1 de línea celular 13.42a <400> 17

aggtcaagct gcaggagtca cctgcaaggc ttctggttat atggaaagag ccttgagtgg gccagaagtt caagggcaag tgcatctcaa cagcctgaca tgacgacggg ctatgctatg

ggacctgagc tggtgaagcc gcattcacta gctacaacat attggatata ttgatcctta gccacattga ctgttgacaa tctgaagact ctgcagtcta gactactggg gccaagggac

tggggcttca gtgaaggtat gttctgggtg aagcagagcc caatggtgat actagataca gtcctccagc acagcctaca ttactgtgca agaaagggga cacggtcacc gtctcctca

60

120

180

240

300

359

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VH-1 de línea celular 13.42a <400> 18

Val 1: Lys Leu Gln Glu 5 Ser Gly Pro Glu Leu 10 Val Lys Pro Gly Ala 15 Ser

Val: Lys Val Ser 20 Cys Lys Ala Ser Gly 25 Tyr Ala Phe Thr Ser 30 Tyr Asn

Met: Phe Trp 35 Val Lys Gln Ser His 40 Gly Lys Ser Leu Glu 45 Trp lie Gly

Tyr: lie 50 Asp Pro Tyr Asn Gly 55 Asp Thr Arg Tyr Ser 60 Gln Lys Phe Lys

Gly 65: Lys Ala Thr Leu Thr 70 Val Asp Lys Ser Ser 75 Ser Thr Ala Tyr Met 80

His: Leu Asn Ser Leu 85 Thr Ser Glu Asp Ser 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala

Arg: Lys Gly Met 100 Thr Thr Gly Tyr Ala 105 Met Asp Tyr Trp Gly 110 Gln Gly

Thr
Thr: Val 115 Thr Val Ser Ser

<210> 19 <211> 321 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VL de línea celular 13.42a <400> 19

gacatccaga tgactcagtc tccatcctcc atcagttgta gggcaagtca ggacattagt gatggaactg ttaaactcct gctctactac aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag accaagctgg aaatcaaacg g

<210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VL de línea celular 13.42a <400> 20

ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240

ggtaatacgt ttccgacgtt cggtggaggc 300

* ............. 321

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asp: lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1: 5 10 15

Asp: Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr



: 20 25 30

Leu: Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
Leu
Leu
Leu


: 35 40 45

Tyr
Tyr: Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

: 50 55 60

Ser: Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gln

65: 70 75 80

Glu: Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Thr




: 85 90 95

Phe: Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg



: 100 105

<210> 21 <211> 33 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de ADN de línea celular 13.42a <400> 21

ggttatgcat tcactagcta caacatgttc tgg 33

<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de proteína de línea celular 13.42a <400> 22

Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr Asn Met Phe Trp 15 10

<210> 23 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de ADN de línea celular 13.42a <400> 23

tatattgatc cttacaatgg tgatactaga tacagccaga agttcaaggg c 51

<210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<221> HV2 de cadena pesada de proteína de línea celular 13.42a <400> 24

Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 25 <211> 24 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de ADN de línea celular 13.42a <400> 25

aaggggatga cgacgggcta tgct 24

<210> 26 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de proteína de línea celular 13.42a <400> 26

Lys Gly Met Thr Thr Gly Tyr Ala 1 5 " "*

<210> 27 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de ADN de línea celular 13.42a <400> 27

agggcaagtc aggacattag taattattta aac 33

<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de proteína de línea celular Cell line 13.42a <400> 28

Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10

<210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de ADN de línea celular 13.42a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 29

tacacatcaa gattacactc a 21

<210> 30 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de proteína de línea celular 13.42a <400> 30

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5

<210> 31 <211> 27 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de ADN de línea celular 13.42a <400> 31

caacagggta atacgtttcc gacgttc 27

<210> 32 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de proteína de línea celular 13.42a <400> 32

gtcaagatct 60

aagcaggctc 120

ccaacatatg 180

actgcctatt 240

agggaagggt 300

tcctca 356

<210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Thr Phe 1 5

<210> 33 <211> 356 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VH de línea celular 32.15 <400> 33

aggtgcaact gcaggagtct ggacctgagc tgaagaagcc tggagagaca cctgcaaggc ttctgggtat accttcacaa actatggaat gaactgggtg caggaaaggg tttaaagtgg atgggctgga taaacaccta cactggagag ctgatgactt caagggacgg tttgccttct ctttggaaac ctctgccagc tgcagatcaa caacctcaaa aatgaggaca cggctacata tttctgtgca tgtatggtaa ctactttgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val 1: Gln Leu Gln Glu 5 Ser Gly Pro Glu Leu 10 Lys Lys Pro Gly Glu 15 Thr

Val: Lys lie Ser 20 Cys Lys Ala Ser Gly 25 Tyr Thr Phe Thr Asn 30 Tyr Gly

Met: Asn Trp 35 Val Lys Gln Ala Pro 40 Gly Lys Gly Leu Lys 45 Trp Met Gly

Trp: lie 50 Asn Thr Tyr Thr Gly 55 Glu Pro Thr Tyr Ala 60 Asp Asp Phe Lys

Gly 65: Arg Phe Ala Phe Ser 70 Leu Glu Thr Ser Ala 75 Ser Thr Ala Tyr Leu 80

Gln: lie Asn Asn Leu 85 Lys Asn Glu Asp Thr 90 Ala Thr Tyr Phe Cys 95 Ala

Arg: Glu Gly Leu 100 Tyr Gly Asn Tyr Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gln 110 Gly Thr

Thr: Val Thr 115 Val Ser Ser

<210> 35 <211> 324 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VL de línea celular 32.15 <400> 35

gacatccaga tgacacagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa acgg 324

<210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VL de línea celular 32.15 <400> 36

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asp 1: lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Lys Phe 10 Met Ser Thr Ser Val 15 Gly

Asp: Arg Val Ser 20 Val Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gln Asn Val Gly 30 Thr Asn

Val: Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Gln Ser Pro Lys 45 Ala Leu lie

Tyr: Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Ser Gly Val Pro Asp 60 Arg Phe Thr Gly

Ser 65: Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr lie 75 Ser Asn Val Gln Ser 80

Glu: Asp Leu Ala Glu 85 Tyr Phe Cys Gln Gln 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95 Leu

Thr: Phe Gly Ala 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Leu Lys Arg

<210> 37 <211> 33 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.15 <400> 37

gggtatacct tcacaaacta tggaatgaac tgg 33

<210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.15 <400> 38

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp 15 10

<210> 39 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.15 <400> 39

tggataaaca cctacactgg agagccaaca tatgctgatg acttcaaggg a 51

<210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 41 <211> 24 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.15 <400> 41

gaagggttgt atggtaacta cttt 24

<210> 42 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.15 <400> 42

Glu Gly Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe 1 5 ‘

<210> 43 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.15 <400> 43

aaggccagtc agaatgtggg tactaatgta gcc 33

<210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.15 <400> 44

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 15 10

<210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.15 <400> 45

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tcggcatcct accggtacag t 21

<210> 46 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.15 <400> 46

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 ” *

<210> 47 <211> 27 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.15 <400> 47

cagcaatata acagctatcc tctcacg 27

<210> 48 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.15 <400> 48

gtgaagctgt 60 aagcagaggc 120 actaactaca 180 acagcctaca 240 agattgaggg 300 350

<210> 50 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VH de línea celular 32.17 <400> 50

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 49 <211> 350 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de CH de línea celular 32.17 <400> 49

aggtcaaact gcaggagtca ggggctgagc tggtgaggcc tggggcttca cctgcaaggc ttctggctac accttcacca ggaactggat aaactgggtg ctggacaagg ccttgagtgg atcggaaata tttatccttc tgatagttat atcaaaagtt caaggacaag gccacagtga ctgtagacaa atcctccagc tgcagctcag cagcccgaca tctgaggact ctgcggtcta ttattgtaca gtttattacc tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val 1: Lys Leu Gln Glu 5 Ser Gly Ala Glu Leu 10 Val Arg Pro Gly Ala 15 Ser

Val: Lys Leu Ser 20 Cys Lys Ala Ser Gly 25 Tyr Thr Phe Thr Arg 30 Asn Trp

lie: Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly

35

40

45

Asn: lie 50 Tyr Pro Ser Asp Ser 55 Tyr Thr Asn Tyr Asn 60 Gln Lys Phe Lys

Asp 65: Lys Ala Thr Val Thr 70 Val Asp Lys Ser Ser 75 Ser Thr Ala Tyr Met 80

Gln: Leu Ser Ser Pro 85 Thr Ser Glu Asp Ser 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Thr

Arg: Leu Arg Gly 100 Leu Leu Pro Asp Tyr 105 Trp Gly Gln Gly Thr 110 Thr Val

Thr: Val Ser Ser

115

<210>51 <211> 327 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VL de línea celular 32.17 <400>51

gacattgtgc taacccaatc tccagtatcc ataactgcat ctcgagggga gaaggtcacc 60

atcacctgcc gtgccagctc aagtataagt tccaattact tacactgtta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccctaaact tttgatttat aggacatcca tcctggcatc tggagtccta 180

gacagcttca gtggcagtgg gtctgagagc tcttacactc tgacaatcag ctgcatgcag 240

gacgaagttg ctgccactta ctattgtcag caggggagta gtagccccct cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaacgg 327

<210> 52 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VL de línea celular 32.17

<400> 52

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asp lie Val Leu 1

Glu Lys Val Thr 20

Tyr Leu His Cys 35

lie Tyr Arg Thr

50 '

Gly Ser Gly Ser 65

Asp Glu Val Ala

Leu Thr Phe Gly 100

<210> 53 <211> 30 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.17 <400> 53

ggctacacct tcaccaggaa ctggataaac 30

<210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.17 <400> 54

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Trp lie Asn Trp 15 10

<210> 55 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.17 <400> 55

aatatttatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa agttcaagga c 51

<210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

Thr Gln Ser Pro Val Ser lie Thr Ala Ser Arg Gly 5 10 15

lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser lie Ser Ser Asn 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu 40 45

Ser lie Leu Ala Ser Gly Val Leu Asp Ser Phe Ser 55 60

Glu Ser Ser Tyr Thr Leu Thr lie Ser Cys Met Gln 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro 85 90 95

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 105 "

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asn lie Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Asp

<210> 57 <211> 24 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.17 <400> 57

ttgaggggtt tattacctga ctac 24

<210> 58 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.17 <400> 58

Leu Arg Gly Leu Leu Pro Asp Tyr 1 5

<210> 59 <211> 42 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.17 <400> 59

atcacctgcc gtgccagctc aagtataagt tccaattact ta 42

<210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.17 <400> 60

Arg Ala Ser Ser Ser lie Ser Ser Asn Tyr Leu 15 10

<210> 61 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.17 <400> 61

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aggacatcca tcctggcatc t 21

<210> 62 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.17 <400> 62

Arg Thr Ser lie Leu Ala Ser 1 5

<210> 63 <211> 27 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.17 <400> 63

cagcagggga gtagtagccc cctcacg 27

<210> 64 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.17 <400> 64

Gln Gln Gly Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5

<210> 65 <211> 350 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VH de línea celular 32.75

<400> 65

60 120 180 240 300 350

<210> 66 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

aggtcaaact gcaggagtca ggggctgagc cctgcaaggc ttctggctac accttcacca ctggacaagg ccttgagtgg atcggaaata atcaaaagtt caaggacaag gccacagtga tgcagctcag cagcccgaca tctgaggact gtttattacc tgactactgg ggccaaggga

tggtgaggcc tggggcttca gtgaagctgt ggaactggat aaactgggtg aagcagaggc tttatccttc tgatagttat actaactaca ctgtagacaa atcctccagc acagcctaca ctgcggtcta ttattgtaca agattgaggg ccacggtcac cgtctcctca

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val: Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser

1: 5 10 15

Val: Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Trp



: 20 25 30

lie: Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly


: 35 40 45

Asn: lie Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

: 50 55 60

Asp: Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65: 70 75 80

Gln: Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr




: 85 90 95

Arg: Leu Arg Gly Leu Leu Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val



: 100 105 110

Thr: Val Ser Ser


: 115

<210> 67 <211> 324 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VL de línea celular 32.75 <400> 67

gacatccaga tgacacagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atcctcctac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa acgg 324

<210> 68 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VL de línea celular 32.75 <400> 68

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asp lie Gln Met Thr 1 5

Asp Arg Val Ser Val * 20

Val Ala Trp Tyr Gln 35

Tyr Ser Ala Ser Tyr 50

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Glu Asp Leu Ala Glu 85

Thr Phe Gly Ala Gly 100 "

<210> 69 <211> 33 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.75 <400> 69

ggctacacct tcaccaggaa ctggataaac tgg 33

<210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.75 <400> 70

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Trp lie Asn Trp 15 10

<210> 71 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.75 <400> 71

aatatttatc cttctgatag ttatactaac tacaatcaaa agttcaagga c 51

<210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 10 15

Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn * 25 30

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu lie 40 45

Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gln Ser 70 75 80

Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 90 95

Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 105

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Asn lie Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Asp

<210> 73 <211> 24 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.75 ADN <400> 73

ttgaggggtt tattacctga ctac 24

<210> 74 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.75 <400> 74

Leu Arg Gly Leu Leu Pro Asp Tyr 1 5

<210> 75 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.75 <400> 75

aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc 33

<210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.75 <400> 76

Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala 15 10

<210> 77 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.75 <400> 77

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tcggcatcct accggtacag t 21

<210> 78 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.75 <400> 78

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 ” *

<210> 79 <211> 27 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.75 <400> 79

cagcaatata acagctatcc tcctacg 27

<210> 80 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.75 <400> 80

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

<210> 81 <211> 356 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VH1 de línea celular 32.2 <400> 81

aggtgaagct

cctgcaaggc

caggaaaggg

ctgatgactt

tgcagatcaa

tgtatggtaa

gcaggagtca

ttctgggtat

tttaaagtgg

caagggacgg

caacctcaaa

ctactttgac

ggacctgagc

accttcacaa

atgggctgga

tttgccttct

aatgaggaca

tactggggcc

tgaagaagcc actatggaat taaacaccta ctttggaaac cggctacata aagggaccac

tggagagaca

gaactgggtg

cactggagag

ctctgccagc

tttctgtgca

ggtcaccgtc

gtcaagatct

aagcaggctc

ccaacatatg

actgcctatt

agggaagggt

tcctca

<210> 82 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus

60

120

180

240

300

356

<220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val 1: Lys Leu Gln Glu 5 Ser Gly Pro Glu Leu 10 Lys Lys Pro Gly Glu 15 Thr

Val: Lys lie Ser 20 Cys Lys Ala Ser Gly 25 Tyr Thr Phe Thr Asn 30 Tyr Gly

Met: Asn Trp 35 Val Lys Gln Ala Pro 40 Gly Lys Gly Leu Lys 45 Trp Met Gly

Trp: lie 50 Asn Thr Tyr Thr Gly 55 Glu Pro Thr Tyr Ala 60 Asp Asp Phe Lys

Gln: lie Asn Asn Leu 85 Lys Asn Glu Asp Thr 90 Ala Thr Tyr Phe Cys 95 Ala

Thr: Val Thr 115 Val Ser Ser

<210> 83 <211> 324 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de ADN de VL de línea celular 32.2 <400> 83

gacatccaga tgacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggaaataaa acgg 324

<210> 84 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> Secuencia de aminoácidos de VL de línea celular 32.2 <400> 84

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser 15 10

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly ~ 20 25 30

Val Gly 15

Thr Asn

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Val: Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Gln Ser

Tyr: Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Ser Gly Val Pro

Ser 65: Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr lie 75

Glu: Asp Leu Ala Glu 85 Tyr Phe Cys Gln Gln 90 Tyr

Thr: Phe Gly Ala 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 lie Lys

Pro Lys Ala Leu lie 45

Asp Arg Phe Thr Gly 60

Ser Asn Val Gln Ser 80

Asn Ser Tyr Pro Leu 95

Arg

<210> 85 <211> 33 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.2

<400> 85

gggtatacct tcacaaacta tggaatgaac tgg 33

<210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.2 <400> 86

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp 15 10

<210> 87 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.2 <400> 87

tggataaaca cctacactgg agagccaaca tatgctgatg acttcaaggg a 51

<210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.2 <400> 88

Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 89 <211> 24 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de ADN de línea celular 32.2 <400> 89

gaagggttgt atggtaacta cttt 24

<210> 90 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena pesada de proteína de línea celular 32.2 <400> 90

Glu Gly Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe 1 5 *

<210> 91 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.2 <400> 91

aaggccagtc agaatgtggg tactaatgta gcc 33

<210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV1 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.2 <400> 92

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 15 10

<210> 93 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.2 <400> 93

tcggcatcct accggtacag t 21

<210> 94 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> HV2 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.2 <400> 94

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 ” *

<210> 95 <211> 27 <212>ADN <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de ADN de línea celular 32.2 <400> 95

cagcaatata acagctatcc tctcacg 27

<210> 96 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> HV3 de cadena ligera de proteína de línea celular 32.2 <400> 96

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> A39276 CDR-H1 <400> 97

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp lie Gly Trp 15 10

<210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> AAL59371.1 CDR-H1 <400> 98

Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Asn Ala lie Gln Trp 15 10

<210> 99 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<221> AAB32203.1 CDR-H1 <400> 99

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp 15 10

<210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAT76246.1 CDR-H1 <400> 100

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Trp 15 10

<210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAR90999.1 CDR-H1 <400> 101

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp 15 10

<210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46762.1 CDR-H1

<400> 102

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Tyr Val Asn Trp 15 10

<210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> AAG33839.1 CDR-H1 <400> 103

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr lie His Trp 15 10

<210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 104

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp 15 10

<210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> CAA84376.1 CDR-H1 <400> 105

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr lie His Trp 15 10

<210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46761.1 CDR-H1

<400> 106

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp 15 10

<210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB58061.1 CDR-H1 <400> 107

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met His Trp 15 10

<210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> F30502 CDR-H1 <400> 108

<210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 109

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp 15 10

<210> 110 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAT76236.1 CDR-H1 <400> 110

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp 15 10

<210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB32203.1 CDR-H2 <400> 111

Glu lie Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAT68292.1 CDR-H2 <400> 112

Ala lie Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> A39276 CDR-H2 <400> 113

Asn lie Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr lie Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB58061 CDR-H2 <400> 114

Tyr lie Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Asn

<210> 115 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> 1921302A CDR-H2 <400> 115

Asn lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAR91004.1 CDR-H2 <400> 116

Trp lie Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln 15 10 15

Gly

<210> 117 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> F30502 CDR-H2 <400> 117

Lys lie Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 118 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAT76236.1 CDR-H2 <400> 118

Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46758 CDR-H2 <400> 119

Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 15 10 15

Gly

<210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAE72083 CDR-H2 <400> 120

Leu lie Asn Pro Phe Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gln Lys Phe Thr 15 10 15

Gly

<210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> B30502 CDR-H2 <400> 121

Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 122 <400> 122 000

<210> 123 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAR91007.1 CDR-H2 <400> 123

Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln 15 10 15

Gly

<210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAS01840.1 CDR-L1 <400> 124

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 15 10

<210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAS01841.1 CDR-L1 <400> 125

Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala Val Ala 15 10

<210> 126 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAT76271.1 CDR-L1 <400> 126

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 15 10

<210> 127 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46763.1 CDR-L1 <400> 127

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAA20447.1 CDR-L1 <400> 128

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> PC4282 CDR-L1 <400> 129

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr Leu Ala 15 10

<210> 130 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> CAA56180.1 CDR-L1 <400> 130

Arg Ala Ser Gln Thr Val Arg Lys Asn Tyr Leu Ala 15 10

<210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> 1921302B CDR-L1 <400> 131

Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Asn Tyr Leu His 15 10

<210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> AAL59380.1 CDR-L1

<400> 132

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAL59377.1 CDR-L1 <400> 133

Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Ser Tyr Leu Asn 15 10

<210> 134 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> CAA63587.1 CDR-L1 <400> 134

Arg Ala Ser Gln Gly lie Ser Asn Trp Leu Ala 15 10

<210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> AAG30434.1 CDR-L1 <400> 135

Arg Ala Ser Gln Gly lie Ser Ser Tyr Leu Ala

15 10

<210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> CAA56181.1 CDR-L1 <400> 136

Arg Ala Ser Arg Gly lie Ser Asn Tyr Leu Ala 15 10

<210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAE72082.1 CDR-L1 <400> 137

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 138 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAS01840.1 CDR-L2 <400> 138

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 ” *

<210> 139 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> G30502 CDR-L2 <400> 139

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5

<210> 140 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> AAL59376.1 CDR-L2 <400> 140

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5

<210> 141 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAL59379.1 CDR-L2 <400> 141

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5

<210> 142 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAB46767.1 CDR-L2 <400> 143

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5

<210> 144 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46765.1 CDR-L2 <400> 144

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

<210> 145 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46766.1 CDR-L2 <400> 145

Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro 1 5

<210> 146 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46764.1 CDR-L2 <400> 146

Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro 1 5

<210> 147 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAG30433.1 CDR-L2 <400> 148

Lys Thr Ser Val Leu Gly Ser 1 5

<210> 149 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> CAC22102.1 CDR-L2 <400> 149

Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

<210> 150 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAS01840.1 CDR-L3 <400> 150

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 151 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB46766.1 CDR-L3 <400> 151

Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr 1 5

<210> 152 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> S67940 CDR-L3 <400> 153

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5

<210> 154 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> CAA56180.1 CDR-L3 <400> 154

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro lie Thr 1 5

<210> 155 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAB58062.1 CDR-L3 <400> 155

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5

<210> 156 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> AAS01844.1 CDR-L3 <400> 156

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr 1 5

<210> 157 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

<210> 158 <211>9 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> AAB46763.1 CDR-L3 <400> 158

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Phe Thr 1 5

<210> 159 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Péptido monomérico sintético <220>

<221> Péptido monomérico B71 <400> 159

Cys Asn lie Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 15 10 15

Lys Asp

<210> 160 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Péptido monomérico sintético <220>

<221> Péptido monomérico C80 <400> 160

Cys Leu Arg Gly Leu Leu Pro Asp Tyr 1 5 *

<210> 161 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Péptido monomérico sintético <220>

<221> Péptido monomérico F90 <400> 161

Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 15 10

<210> 162 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 162

Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp 15 10

<210> 163 <211> 17 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 2 <400> 163

Xaa lie Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Lys 1 5 10 15 *

Xaa

<210> 164 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 3 <400> 164

Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10

<210> 165 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 4 <400> 165

Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5

<210> 166 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 5 <400> 166

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 1 5

<210> 167 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<220>

<221> Secuencia de Consenso 6

<400> 167

Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp 15 10

<210> 168 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 7 <400> 168

Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa Trp 15 10

<210> 169 <211> 17 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 8 <400> 169

Xaa lie Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Lys

1 5 10 15 *

Xaa

<210> 170 <211> 17 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 9 <400> 170

Xaa lie Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Phe Xaa

15 10 15

Gly

<210> 171 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 10 <400> 171

Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 172 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 11 <400> 172

Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 15 10

<210> 173 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 12 <400> 173

Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5

<210> 174 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 13 <400> 174

Xaa Thr Ser Xaa Leu Xaa Xaa 1 5

<210> 175 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 14 <400> 175

Gln Gln Xaa Xaa Ser Xaa Pro Xaa Thr 1 5

<210> 176 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia de Consenso <220>

<221> Secuencia de Consenso 15 <400> 176

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1. Un péptido que comprende dos o más péptidos monoméricos enlazados entre sí, en el que cada uno de los péptidos monoméricos se selecciona de:

(a) un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos QQYNSYPLT (SEQ ID NO:16);

(b) una variante extendida de un péptido de (a) que incluye entre 1 y 5 residuos de aminoácidos adicionales en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal ; y

(c) una variante truncada de un péptido de (a) que incluye 1 deleción de aminoácidos en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal,

para su uso en terapia de una enfermedad.
2. Un péptido que comprende dos o más péptidos monoméricos enlazados entre sí, en el que cada uno de los péptidos monoméricos se selecciona de:

(a) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos QQYNSYPLT (SEQ ID NO:16);

(b) una variante extendida de un péptido de (a) que incluye entre 1 y 5 residuos de aminoácidos adicionales en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal ; y

(c) una variante truncada de un péptido de (a) que incluye 1 deleción de aminoácidos en el extremo C terminal y/o el extremo N terminal,

para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.
3. El péptido para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que cada uno de los péptidos monoméricos consiste de la secuencia de aminoácidos:

QQYNSYPLT (SEQ ID NO:16); o CQQYNSYPLT (SEQ ID NO:161).
4. El péptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el péptido es un homodímero o un homomultímero.
5. El péptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el péptido es un heterodímero o un heteromultímero.
6. El péptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los péptidos monoméricos están enlazados entre sí por un residuo de cisteína adicional, o en el que los péptidos monoméricos están enlazados entre sí por un residuo de cisteína adicional en el extremo N y/o C terminal de cada péptido.
7. El péptido para el uso de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 6, que es un homodímero de péptidos monoméricos, los péptidos monoméricos consistiendo de la secuencia CQQYNSYPLT (SEQ ID NO: 161).
8. El péptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está químicamente modificado, unido a una sustancia biológica o sintética, o que está conjugado con un enzima, un compuesto indicador, un fármaco, una toxina o un marcador radioactivo.
9. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 - 7, para su uso en terapia de una enfermedad.
10. Una célula huésped que incorpora la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en terapia de una enfermedad.
11. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.
12. Una célula huésped que incorpora la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.
13. Una composición farmacéutica que comprende

(a) el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

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(b) el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7 mezclado con (i) por lo menos un péptido adicional junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o (ii) dos péptidos adicionales junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(c) una combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7 junto con un portador farmacéuticamente aceptable,

para su uso en terapia de una enfermedad.
14. Una composición farmacéutica que comprende

a) el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, o la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 12, junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(b) el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7 mezclado con (i) por lo menos un péptido adicional junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o (ii) dos péptidos adicionales junto con un portador farmacéuticamente aceptable; o

(c) una combinación de péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7 junto con un portador farmacéuticamente aceptable,

para su uso en un método in vivo de diagnóstico de una enfermedad.
15. El péptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7, o la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de IDDM, NIDDM, hiperinsulinemia, hiperglucaglemia, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, psoriasis, vitíligo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, miastenia gravis, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades de neuronas motoras, enfermedad tiroidea, síndrome de Cushing y enfermedad de Addison, síndrome de ovario poliquístico, hipogonadismo, síndrome x, enfermedad celíaca, enfermedad gástrica autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, asma, fibrosis quística, osteoporosis y osteopenia, anemia, hemoglobinuria nocturna paroxística, insomnio, cáncer, VIH e infección.
16. El péptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2-7, la molécula de ácido nucleico para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, la célula huésped para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, o la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en vacunar a un individuo contra una enfermedad o trastorno.
17. Un método in vitro para diagnosticar a un individuo la presencia de o niveles de anticuerpos autoinmunes, dicho método comprendiendo poner en contacto una muestra de sangre, plasma o suero u otro fluido corporal con el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7 en presencia de un objetivo para dichos anticuerpos autoinmunes y evaluar la cantidad de dicho autoanticuerpo de origen natural que se une específicamente al objetivo.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17 en el que dicho objetivo es una molécula de inmunoglobulina policlonal o monoclonal anti-TCR Yp o cualquier parte de la misma que identifica por lo menos un epítopo en una cadena Vp del receptor de células T, y en el que dicho péptido, anticuerpo y/o objetivo está opcionalmente marcado.