CN1330754C - 显示针对内分泌细胞反应性的配体(包括抗体) - Google Patents
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Abstract
本发明提供了可识别自身免疫疾病的不同靶组织分泌细胞上分子的单克隆和多克隆抗体,使之可能用一种统一的方法预防和治疗自身免疫性疾病以及其它涉及激素失调,高胰岛素血症和胰岛素抗性的病症。还提供了一种方法,用于检测人血清或其它体液中类似的抗体,可用此方法构成诊断试剂盒。由本发明形成的治疗方法包括,以抗体,它们的靶分子和含有此抗体和它们靶分子编码序列的载体的制剂给药。
Description
发明领域
本发明描述了导致严重自身免疫性疾病和其它一些疾病的独特自身抗体的形成过程。为这种以单克隆和多克隆形式的抗体,并且也为此抗体识别的分子,提供了诊断和预防的用途。更具体地说,本发明准备应用这些抗体和它们识别的分子作为对儿童和成人具有同样特异性的自身抗体形成的特异性抑制剂。这些抗体和靶分子对广泛多种自身免疫性疾病和其它一些疾病具有诊断、预防和治疗用途。但是,对于本发明,大部分背景材料将集中于糖尿病,不是作为限制,而是作为说明和例证。
人自身免疫性疾病的范围:
与自身免疫现象有关的疾病包括涉及单一器官破坏性损伤的疾病和其中器官或组织损伤广泛散布存在的疾病。
在器官特异性的范围内,最通常受影响的器官是甲状腺,肾上腺,胃以及胰腺中的胰岛(它包含产生胰岛素的细胞),而在非器官特异性的方面,风湿症性障碍或系统性障碍(例如系统性红斑狼疮)占优势。在罕见的情况下,某些自身免疫性疾病与暴发性病毒感染有关,也可以导致器官破坏。对于自身免疫性,其损伤过程是缓慢的,有时需要几年之后才出现病症。下面是一些器官特异性自身免疫疾病,是由涉及对自身抗原免疫原耐受性衰竭的自身免疫现象引起的。
甲状腺 甲状腺自身免疫性疾病包括导致共同的组织病理学图象的多种临床病症。存在着单核淋巴细胞的扩散浸润。构成的疾病有原发性粘液水肿,Hashimoto氏甲状腺炎和Graves症。通常可从一种病症发展成另一种病症。原发性粘液水肿是自发性甲状腺机能减退的最常见形式,是其慢性炎症过程的最后阶段。完全不形成甲状腺肿,腺体几乎完全萎缩。
Hashimoto氏甲状腺炎也与甲状腺机能减退结合,但是与甲状腺肿相关联。在其不同的临床形式中,甲状腺激素的水平或者可以通过增加由垂体产生的促甲状腺激素(TSH)水平来补偿,或者尽管TSH水平提高了,但仍可以存在临床的甲状腺机能减退。在这二种自身免疫性破坏疾病中,妇女受影响的机率比男人高5倍。
甲状腺毒症的最通常形式是具有或不具有甲状腺肿或眼球突出的Graves症,其特征是时轻时重,尽管自身免疫过程导致对腺体的过度刺激,但是由于甲状腺刺激性抗体的产生,甲状腺最后常常发生破坏。存在妇女对男人5∶1的数量偏重。
对于所有的甲状腺自身免疫性疾病,针对此腺体的不同自身抗体证据,可证实临床诊断。自身抗体可以是针对甲状腺细胞质抗原如甲状腺球蛋白,针对细胞表面成分如甲状腺过氧化物酶,以及针对甲状腺细胞表面表达的TSH受体(即Graves症)。
胃 胃的自身免疫性疾病涉及胃底或胃窦,导致损伤这二个区域腺体的不同程度的炎症。通常将此过程称为胃炎。对于胃底胃炎,存在明显的粘膜萎缩,随之发生内在因子(IF)产生的丧失,导致维生素B12吸收障碍,结果将发展形成恶性贫血。在这些状况下,将产生对IF和胃壁细胞的抗体,90%受影响的病人存在这种抗体。胃壁细胞被破坏,但是主细胞和粘液细胞也被破坏,尽管不存在对后面二种细胞类型的循环抗体。存在妇女对男人3∶1的数量偏重。在某些患有胃窦胃炎的病人,已证实胃窦内存在对产生胃泌素细胞的自身抗体。这种类型的胃炎与胃溃疡有关,在部分病人也已证实存在刺激胃细胞的抗体。
肾上腺,生殖腺和胎盘 肾上腺的自身免疫性疾病(Addison氏病)的特征是,大量单核细胞浸润腺体,肾上腺炎,以及存在对肾上腺抗原的自身抗体。症状是由于肾上腺衰竭引起的高度色素沉着,衰弱,疲劳,低血压,胃-肠症状和低血糖。在此同样主要是妇女发生此疾病。借助于免疫荧光法,此自身抗体可使肾上腺皮质的三层着色,但是,一种亚型也可以同卵巢、睾丸和胎盘中的相似的类固醇生成细胞发生交叉反应。当后面的这些特异性存在时,它们与临床前或临床明显的性腺衰竭有关。
垂体 淋巴细胞垂体炎是一种罕见的自身免疫疾病,导致垂体机能减退,需要用激素替代治疗。在妇女中较普遍,并且此疾病与多种其它的器官特异性自身免疫现象或相关的疾病并存,可以检测出对促乳素分泌细胞的自身抗体,以及在大多数情况下还可检测出其它的器官特异性抗体。
多内分泌自身免疫性 患有器官特异性自身免疫症的病人,可能同时存在与内分泌器官或其它靶器官(如胃)衰竭有关的症状。但是,也常见多器官受损的综合征,并且,在患有只是单一器官特异性病症的病人,也可检测出针对未受影响器官的自身抗体。常常可在同一病人看到甲状腺和胃的自身免疫性。对于患有甲状腺病症的病人,由胃底胃炎引起的恶性贫血发生率高5倍,30-50%患有恶性贫血的病人也有甲状腺病史。
在肾上腺炎与甲状腺炎之间,以及肾上腺炎与胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)之间也存在关联。多数情况是同时以甲状腺毒症,和Addison氏症开始,很多患有Addison氏症的病人也至少有一种其它自身免疫性病症。虽然垂体炎和白斑病(一种导致皮肤不规则脱色斑块的病症,很可能是由于固有黑色素细胞的自身免疫性破坏引起的)是罕见的,但是,它们常常与其它明显的器官特异性病症同时存在。在这些自身免疫性病症中重叠的血清学特征(即存在循环抗体),远比明显病症的共存更常见。例如,在50%患有甲状腺病症的病人中和30%患有IDDM的病人中,存在壁细胞抗体。
关于IDDM病理学的现代认识
关于IDDM(I型糖尿病)病因学知识的现状,主要聚焦于,在循环中和胰岛(胰岛炎)中多种循环自身抗体,自身反应性T-细胞的环境下,以及在多种细胞因子的环境下,胰岛β细胞的自身免疫性破坏。因此,对于自身抗体的致病作用还远未被证实,但是已显示,它们的存在对于鉴定临床前期糖尿病,特别是对于IDDM病人的第一级亲属,具有预测性价值。从而认为导致IDDM的免疫学攻击是T细胞依赖性的β细胞破坏(Tisch and McDevitt,1996)。对此观点给予支持的证据是,疾病发作时在胰岛中存在单核细胞浸润(胰岛炎)(Gepts,1965,Roep and Devries,1992),免疫抑制药对延迟疾病发作的作用(Bougneres et al,1988),在与胰岛炎有关的IDDM病人中胰腺移植物的破坏(Sibley et al,1985),以及动物研究显示,脾T-细胞能够转移糖尿病,并且需要CD4和CD8二种T-细胞(Bendelac et al,1987)。并且还表明,具有对胰岛细胞抗原特异性的克隆的CD4T细胞系是致糖尿病的(Haskins and McDuffie,1992)。但是,至今尚没有T细胞可引起对胰岛β细胞初始损伤的证据,或者没有任何关于靶抗原可能是什么的指示。
最近已证明,循环T细胞对胰岛细胞抗原的自身反应性并不局限于IDDM病人,而是在健康的,年龄一致的对照也存在,虽然只有较低的反应强度。因此很可能是,T-细胞自身免疫现象是导致β细胞损伤的β细胞机能障碍的后果。
对NOD小鼠疾病过程中,细胞因子分布以及Th1和Th2平衡的检测研究已证明,在IDDM发作时,Th1细胞和Th1型细胞因子占优势Shimada et al(1996)完成了检测细胞因子水平改变和IDDM之间明显关联的详细研究。在疾病过程的不同时间,分离出从NOD和NOD-IAK及BALB/c对照小鼠得到的脾细胞,以便获得CD45RB低(记忆)CD4+T细胞;以抗-CD3激活这些细胞,分析了释放的细胞因子。在NOD小鼠高血糖症发作时或刚要发作之前,发现了IFNγ/IL4的高比率。作者提出,在NOD小鼠,IDDM的发展过程开始是一种炎症性β细胞功能障碍,直到病程后期才出现实际的β细胞破坏。
根据少年IDDM患者的临床表现,已经发现由相对于胰岛素或C-肽,血清胰岛素原水平升高指示的β细胞功能障碍(Ludvigsson andHeding,1982)。Roder et al(1994)研究了23名自身抗体阳性的IDDM病人家族人员,根据他们对静脉内注射葡萄糖的第一时期胰岛素反应(FPIR),将他们分为2组。11名家族成员具有减弱的FPIRs,并且他们禁食后胰岛素原/胰岛素或C-肽的比率,比具有正常FPIR的其余家族成员高2-3倍。在测定后1-28个月,具有低FPIRs和高胰岛素原/胰岛素比率的此11名家族成员中的9名成了糖尿病患者,相比之下,在其余的家族成员中没有人成为糖尿病患者。
β细胞的功能障碍和最后被破坏是IDDM的特征,但是,新近发作的和长期持续的1型糖尿病患者,在低血糖期间也都具有不良的胰高血糖素和肾上腺素分泌反应以及肝葡萄糖产生(Kleinbaum et al,1983)。应用多胰岛素血症低血糖箝制技术,精心控制的研究已证明,对于正常人,在180分钟胰岛素输注过程中胰高血糖素水平上升,但是对于糖尿病受试者,不上升(Berrou et al,1994)。在后一组受试者,肝葡萄糖的产生也被严重削弱了。对于许多1型糖尿病患者,这种低血糖反调节作用的缺陷难以进行充分的医药控制。
虽然在长期持续的糖尿病患者,胰高血糖素的分泌明显地受到了损害,但是对于糖尿病前个体的胰高血糖素分泌了解甚少。胰高血糖素分泌异常已在糖尿病动物模型上被证实。对糖尿病前小鼠和明显糖尿病NOD小鼠的研究揭示,同对照小鼠相比较,糖尿病前动物禁食时,血糖和血浆胰岛素水平正常,血浆胰高血糖素水平显著地升高(Ohnedaet al,1984)。因此,在糖尿病发作之前已存在潜在的代谢障碍。
从胰腺α-细胞分泌的胰高血糖素,通过刺激肝脏葡萄糖产生,同时也促进葡萄糖诱发的胰岛素分泌而对维持正常血糖的常规控制是一个重要的因子。在对禁食而不会伴有血糖降低的大鼠,免疫中和胰高血糖素之后胰岛素分泌减少证实了这点(Brand et al,1995)。
从FACS分离的单独β细胞在营养素刺激时胰岛素释放较弱。通过使此β细胞与分离的α细胞重新组合,或者通过加入(Bu)2cAMP或胰高血糖素,可以完全恢复这种分泌缺陷(Pipeleers et al,1985)。胰高血糖素在提高β细胞cAMP水平中是主要的因子(Rasmussen etal,1990)。与在完整胰岛中的β细胞相比较,分离的β细胞表现出较低的cAMP水平;胰岛中cAMP水平的升高或降低,伴随着对葡萄糖的分泌反应增强或减弱(Howell et al,1973)。通过与非β胰岛细胞重新聚集或加入胰高血糖素可恢复cAMP水平(Schnit andPipeleers,1985)。与胰高血糖素对β细胞直接作用的一致性是β细胞上存在胰高血糖素受体的证据(Van Schravendijk et al,1985)。还显示胰高血糖素可提高对葡萄糖反应时胰岛素分泌波动的幅度,而不影响分泌脉冲的周期性(Marchetti et al,1994)。
因为已充分地证实,细胞质Ca2+浓度升高对胰岛素分泌是必须的(Prentki and Matschinsky,1987),所以有人提出,胰高血糖素诱发的cAMP水平升高是通过提高Ca2+水平起作用。在从锁定的前体物光致释放的细胞内cAMP的作用下,测定Ca2+瞬变态的复杂实验证明,Ca2+瞬变态增加,占由cAMP产生的胞外排过程中总增加的10%(Ammala et al,1993)。借助于类似的方法Ammale et al(1993)还证实,cAMP可在本身不能引起分泌的Ca2+浓度下启动胞外排作用,并且还可在较高的Ca2+浓度下促进胞外排作用。Westerlundet al(1997)也证实,在[Ca2+]i仍然稳定的条件下胰岛素分泌继续保持波动。这些实验证明,cAMP对Ca2+通道激活作用的分泌作用设置了灵敏度阈值,从而,胰高血糖素的作用(在β细胞中提高cAMP水平)在控制葡萄糖诱发的快速胰岛素分泌脉冲的幅度中,成为头等重要。
胰高血糖素的分泌也是波动的。Storch et al(1993)曾报导,在肝硬变病人,血浆胰高血糖素浓度在4.1-6.5分钟的间隔内有相当大的改变。体外灌流的大鼠胰腺标本,分别以5.8和6.5分钟的脉冲分泌胰岛素和胰高血糖素,对于大鼠和犬胰腺标本反转灌流的方向不会影响激素分泌的周期性(Stagner和Samols,1988)。这排除了胰岛内激素直接相互作用,或者静脉内激素敏感性受体机制可能决定分泌周期的可能性。单独的小鼠胰岛在对葡萄糖刺激的反应中,以缓慢和快速二种波动脉冲分泌胰岛素(Bergsten et al,1994)。因此,胰岛素波动性分泌的机制存在于各胰岛内部;它不同于[Ca2+]i瞬变态,通过包括激活蛋白激酶C的实验证实了这种[Ca2+]i瞬变态,激活蛋白激酶C增加了波动的幅度而不影响它们的频率或改变[Ca2+]i(Deeney etal,1996)。这些报导说明,胰岛素和胰高血糖素分泌波动性的起博点是位于胰岛内部,并且不依赖外在的神经支配和激素直接相互作用。这点在人也已证实,在成功的胰腺移植中显示出现有低频率的,又有高频率的波动性(Sonnenberg et al,1992)。
NIDDM中起博点的作用
在2型非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM),β-细胞的功能障碍是突出的,这也是一种涉及胰岛素抗性的疾病。对这二种成分的相对重要性已有争议。在此疾病的初期,存在胰岛素波动性分泌作用的明显瓦解,高频率脉冲丧失,缓慢波动的幅度降低(Leahy,1990;Guillausseau,1994)。波动性分泌的丧失,对于胰岛素抗性可能是一个重要的可能性促进因素。设计用于鉴定NIDDM形成先兆的各种研究已得出结论,是β细胞功能障碍,而不是胰岛素抗性,是使之易患NIDDM的主要因素(Pimenta et al,1995;Davis et al,1995;Nijpelset al,1996)。因此,NIDDM的原因必定与诱发功能障碍的事件有关。对此有人提出,功能障碍是维持胰岛素和胰高血糖素波动性分泌的起博点瓦解的必然结果。
Parksen et al(1995)用禁食过夜的犬测定了与基础性胰岛素分泌相比较,波动性胰岛素分泌的贡献,已证实,犬多数胰岛素(70%)是作为脉冲分泌的。因此,这个系统瓦解将对总体胰岛素分泌具有主要的影响。
因此此疾病在诊断时的突然性和破坏性特点,在IDDM之前的β细胞功能障碍的自然病史是较难研究的。但是,O’Meara et al(1995)能够在导致IDDM形成的13个月的时间内研究一个病人。禁食时葡萄糖和糖基化血红蛋白的浓度仍然在正常范围内,胰岛素对静脉内输入葡萄糖的反应降低了。分泌波动的式样保持不变,但是分泌反应降低了。
发明详述
本发明涉及一种关于自身免疫性疾病病因的新概念,并且具体地描述了它对1型和2型糖尿病的应用作为一种说明而不是限制。本发明提供了用作药剂或用作诊断剂的具有抗抗-TCR Vβ抗体反应性的单克隆抗体或多克隆抗体,或者功能性等价配体。这些分子还可能表现具有抗GPI-连接的TCT Vβ链、磷脂、磷脂聚糖,单链DNA和/或双链DNA的反应性。本发明还提供将这些抗体用于制造药物,治疗IDDM,NIDDM,或者器官特异性或非器官特异性自身免疫疾病,以及有关的疾病。优选地是按照本发明应用一种单克隆抗体。
对于糖尿病,本发明提出α细胞功能的调节障碍,以具有类似于该单克隆抗体特异性的新鉴定的自身抗体,作为糖尿病致病过程的主要因素。为了使此新概念具体化,本发明证实,该单克隆抗体可识别α细胞(此种细胞可能具有作为胰岛中起博点的功能)的一套信号化分子上的共同抗原表位,α细胞是该致病性自身抗体的靶细胞。
本发明还对该自身抗体提供了检测方法,而且在预防和治疗包括IDDM和NIDDM在内的自身免疫性及相关疾病中,体现这类自身抗体和所述MoAbs,以及被这类MoAbs所识别分子的用途。
此单克隆抗体可使人胰岛培养细胞胰岛素分泌调节失常(详见实验部分和表1)。通过同时以该MoAbs(IgM)和抗-胰高血糖素MoAbs(IgG)染色胰切片,分别检测同荧光素标记抗-小鼠IgM和若丹明标记抗-小鼠IgG的结合,已将它们定位于α-细胞,抗体的染色图形相同,证明二种抗体染色了同样的产生胰高血糖素的α细胞。
有人认为,致病性自身抗体对α细胞的损害,导致丧失了对胰岛素分泌的葡萄糖反调节的反应性和细微的调整作用。胰岛素分泌的调节失常或者引起β细胞死亡,导致IDDM,或者致使β细胞在调节失常的状态下继续存活,导致NIDDM。这二种结局取决于个体的遗传易感性。对于IDDM,T细胞的致敏作用是继发于β细胞损害,并且可能加速其余β细胞的死亡。但是,本申请不希望受此理论的约束。
如在下面实验部分所述,可识别α细胞表面分子的MoAbs,是通过以抗-TCR Vβ单克隆抗体免疫小鼠而产生的。由所得到的克隆产生的单克隆抗体,或者只识别抗-Vβ免疫原,或者可识别此免疫原及磷脂酰肌醇,磷脂酰丝氨酸,心磷脂(二酰基甘油)和双链及单链DNA。后一种单克隆还可识别人胰腺α细胞(图1),甲状腺滤泡细胞(图2),肾上腺髓质细胞(图3),胃肠道细胞(图4),胃,唾液腺,卵巢,横纹肌,结缔组织,在此仅作为例子提到,并不局限于此。
如在此所使用的,名词“功能性等价物”意为具有所需结合位点的化合物,并包括可结合抗-TCR Vβ抗体的任何大分子或分子实体,这种结合具有10-4M或更小的离解常数,优选地是10-7M或更小,最优选地是10-9M或更小,并且,这种分子具有与在此所鉴别的抗抗-TCR Vβ抗体结合位点形状的等价互补的形状。
目前,产生对所需分子具有亲和性化合物的方法,直到最近仍比较原始。但是,现在已迅速地发展了组合化学和产生组合文库的概念,促进了对具有所需特点分子的合理设计和改进。可将这些技术用于产生与在此所鉴别的抗体具有相同或相似结合位点的分子。
通过合理的设计,应用例如标准的合成技术,与分子模拟和计算机形像化程序相结合,有可能产生这种化合物。应用这种技术,通过组合多种多样的构架材料和取代基成分,可使具有与该抗体结合位点类似构架的“引导”化合物最优化。
另一方面,或者作为分子整体结构导向性设计中的一个步骤,可能应用组合化学技术产生或精选化合物的结构,通过围绕构架产生同种的组合排列而模拟有关的结合位点。这些步骤可能包括以固相分裂和重组法进行标准的肽或有机分子合成,或者应用固相或溶液技术进行平行的组合单位合成(参见例如Hogan 1997,及其引证的参考文献)。
另外,或者作为本发明这方面分子的一部分,功能性等价物可能包括所鉴定抗体的片段或变异体,或者是表现出显著序列同源性的紧密相关的蛋白质。以“片段”表示整个蛋白质序列的任何一部分,并保持了结合于抗-TCR Vβ抗体的能力,而且这种结合具有10-4M或更小的离解常数,优选地为10-7M或更小,最优选地是10-9M或更小。因此,形成本发明一个方面的是一些片段,它们包含或者从蛋白质的末端,或者从其一级氨基酸序列的内部片段中删除单个或多个氨基酸。变异体可能包括例如,包含对该野生型抗体序列的氨基酸取代,插入或删除的突变体。
可应用噬菌体文库产生具有模拟在此所述抗体结合位点的生物活性肽。可使编码鉴定为结合位点参与者氨基酸残基的核酸,同编码骨架周围残基的核酸融合在一起,以便产生具有10-1000个残基的多肽单位,优选地是具有25-100个残基。通过将此核酸片段同编码噬菌体蛋白的核酸片段,例如噬菌体fd的pIII融合,可使融合分子呈现在噬菌体的表面。以抗-TCR Vβ抗体筛选此噬菌体文库之后,对所需的克隆进行鉴定。然后可使这些克隆经受几次诱变和筛选,以便增强所产生的分子对其靶标的亲和性。
本发明的抗体或功能性等价配体可以是脊椎动物来源或无脊椎动物来源的。优选地,此抗体是由通过E-B病毒转化而永生化的B细胞产生,或者是来源于应用从健康或患病人或动物获得B细胞的其它方法。
使来自动物或人的体液向下通过抗原结合柱,可分离出此抗体或等价配体。此动物可能预先用抗原免疫过,也可能已患病,或者已通过药物或饮食处理以致患病。
根据本发明更进一步的另一方面,提供了一种可被不是抗-TCRVβ抗体的,本发明第一方面的单克隆和多克隆抗体或者等价配体结合的肽,寡肽,多肽或蛋白质,将它们用作药剂或诊断试剂。其中特别优选的是,将由下述克隆1.1,1.2,1.3,3.1,4.1,5.1,5.2,或5.3所编码的蛋白质,及其片段和功能等价物,用于本发明的这一方面。还可以用这些分子制造药物,用于治疗IDDM,NIDDM,或者其它的器官特异性或非器官特异性自身免疫病和有关的疾病。
这些分子可被抗抗-Vβ抗体单克隆抗体识别,并且可通过筛选人胰cDNAλgt11文库进行鉴定。已有8个cDNA克隆被纯化和测序。克隆1.1,1.2和1.3编码分泌粒蛋白1样蛋白质;克隆3.1,4.1和5.1编码67kd的层粘连蛋白受体样蛋白质;克隆5.2编码一种由本发明者定名为ESRP1(内分泌调节蛋白1)的新分子。克隆5.3编码人酶原颗粒GP-2蛋白样蛋白质。
所有这些分子的一致特征是,它们都是借助于一种新型的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定物连接于细胞膜。对于细胞表面GPI-连接分子的调控和表达已有描述(Low,1989;Udenfriend and Kodudul a1995)。这些酰基残基借助于胰岛素激活的磷脂酶,对胰岛素的作用是敏感的(Chan et al 1988)。α细胞使这些分子的断裂产物进入胞内,并推定在此调节胰高血糖素的分泌。分子在膜上被重新合成和再表达需要时间,这是胰高血糖素周期性分泌的原因,并因此可解释胰高血糖素和胰岛素的波动性分泌。这种机制也可以认为是胰岛内的起博点。抗体结合于这些分子上遭受酶促断裂的区域,可以干扰酶的作用并因此瓦解对胰高血糖素和胰岛素分泌的调节。
对于人,可以通过多种机制生理性地产生具有相似特异性的抗体。首先,环境作用剂如感染或超抗原可以诱发T细胞的克隆表达,并且在此增殖时相中,不正常形成的部分TCR复合物被保持在细胞内,并被降解。在某些条件下T细胞会凋亡,释放出降解的TCR产物,此产物可以是致免疫性的,并可触发抗体产生的级联抗-Vβ和抗-抗-Vβ网络。其次,Bell et al(1994)已报导,用于GPI锚定附着的信号肽存在于TCRβ链的多肽序列中,并且,缺乏细胞质尾端序列的TCRβ链,可在没有TCRα的情况下,作为GPI-锚定的单体多肽在成熟的T细胞杂交瘤系上表达。在TCRβ转基因小鼠中已检测出GPI-连接的TCRβ链,但出在正常小鼠中没有。因此,这种Vβ链的不正常表达可以诱发级联的网络反应,导致产生对抗-抗-Vβ试剂具有相似特异性的抗体。在本发明的另一实施方案中,在人血清中检测出这种抗体(见实验部分中的表2)。
下面将对上述的cDNA克隆以及由它们编码的蛋白质作进一步详细的描述。
克隆1.1,1.2,1.3这三个克隆分别为1500bp,1400bp和900bp,编码分泌粒蛋白1(Sg1)样分子。分泌粒蛋白1是一种657个氨基酸长度的76kb多肽,以切割的20个残基的N-末端信号肽为先导(Benedum et al,1987)。它具有一个二硫键环形结构,是一种属于内分泌细胞和神经元分泌性颗粒的分泌蛋白,Pinplikar和Huttner(1992)曾证实,在神经内分泌细胞系PC12中,有一个胞外排性Sg1组分没有被释放,而是仍然与膜结合。这种表面Sg1(约占细胞总蛋白质的10%)进入细胞内并被降解后,指示可能的信号化特点。这种多肽具有细胞膜凹陷蛋白的特征(Chang et al,1994)。在小鼠Sg1基因的启动子区含有cAMP-反应性成分(Pohl et al,1990)。分泌粒蛋白属酸性蛋白家族。因为在外分泌细胞中没有发现它们,所以已将它们用作内分泌肿瘤的免疫组织化学诊断标志。此外,Sg1是一种肝素结合性粘附蛋白,显示具有底物粘附的介导作用(Chenet al,1992)。有趣的是,在啮齿类动物,大约在胚胎期13-14天开始积累Sg1 mRNA,到出生后20天达峰值(Foss-Peters etal,1989)。
克隆3.1,4.1,5.1另三个克隆3.1(900bp),4.1(900bp)和5.1(1000bp)编码67kd的层粘连蛋白受体样蛋白。层粘连蛋白是基底膜的主要成分,在多种细胞功能,如粘附,组织再造,伤口愈合,炎症,肿瘤细胞转移等中起重要的作用。在与其接触中,细胞外基质(ECM)同细胞的相互作用,是通过独特的细胞表面受体如67k的层粘连蛋白受体。这种层粘连蛋白结合蛋白还结合弹性蛋白,IV型胶原蛋白,并且是一种半乳糖外源凝集素,能够在含有β半乳糖素的糖结合亲和柱上使之纯化。用β半乳糖类如半乳糖和乳糖可以从弹性蛋白或层粘连蛋白亲和性柱上洗脱出这种蛋白质(Hinek,1994)。半乳糖类结合于该分子上的外源性凝集素位点,不仅具有从它们的结合位点取代ECM配体的作用,而且还可从细胞膜上分离出此67kd的蛋白质(Hinek et al,1992)。还已证实,在从来自动脉导管的平滑肌细胞上缺乏这种蛋白质,它们脱离弹性蛋白和它们具有转移能力之间,存在某种关系。
这种蛋白质的表面表达,可能是在翻译调节之下。表达高水平mRNA的转染细胞,通常在它们的表面不表达相应高水平的该蛋白(Landowski et al,1995)。显微荧光分光实验和视频显微镜实验已证实,弹性蛋白或活性肽VGVAPG结合于动脉平滑肌,可导致细胞内游离Ca2+瞬时增加。这暗示,细胞表面层粘连蛋白或弹性蛋白结合蛋白起一种真正受体的作用,介导细胞内的信号发送(Hinek,1994)。
关于这种蛋白质附着于细胞膜的模式仍然有争议,因为对预期氨基酸序列的分析没有揭示跨膜区的任何疏水性功能域特征。甲基酯化此纯蛋白,随后作气相色谱和质谱分析表明,此蛋白可被共价结合的脂肪酸,棕榈酸,硬脂酸和油酸酰化,但是其键合化学还没被明确地鉴定(Landowski et al,1995)。此蛋白质的酰化作用,使它除了依赖于层粘连蛋白结合的特性之外,还具有另一套特性。已显示脂质修饰作用将影响蛋白质-蛋白质的相互作用,并且酰基修饰基团还可能在信号转导中产生第二信使。
克隆5.2 由此大约1200bp cDNA克隆编码的多肽,与特征性功能蛋白没有显著的相似性。因此,不可能获得与任何已知蛋白质的任何功能性对比。但是被认为,此蛋白质与通过用于筛选胰文库的单克隆抗-抗-Vβ鉴定的蛋白质有共同的抗原表位,因此共有类似的功能特性。此后将把此蛋白质称为内分泌调节蛋白1(ESRP1)。
根据本发明的另一个实施方案,提供了蛋白质ESRP1,其片段和功能等价物。在下面图7中给出了此蛋白质的序列,编码的核酸序列构成了本发明此实施方案的另一方面,被提供在下面的图6中。
根据本发明的另一方面,是提供将此ESRP1蛋白质用于治疗和诊断。
本发明的ESRP1蛋白或功能等价物,可能从任何一种具有与在此所鉴别的化合物同类的蛋白质的生物体得到。以“同类蛋白质”表示一组在存在于多肽序列中的基元序列之间,具有共同功能并显示共同序列同源性的多肽。
优选地,此蛋白质,蛋白质片段或功能等价物是从哺乳动物,最好是从人得到。
根据本发明此实施方案的再一方面,提供了ESRP1蛋白质,其片段和功能等价物制造药物,用于治疗IDDM,NIDDM,器官特异性或非器官特异性自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,以及其它任何存在抗-磷脂抗体和/或高胰岛素血症和胰岛素抗性的疾病。
如在本说明书中普遍使用的名词“器官特异性或非器官特异性自身免疫疾病”,意指包括IDDM,NIDDM,甲状腺,肾上腺,性腺,胃和垂体的自身免疫性疾病,系统性红斑狼疮,全身性硬化症和Sjogren氏综合征。“心血管病”意指包括冠状动脉和颈动脉疾病,大血管和微血管咽峡炎,外周血管疾病,动脉粥样硬化和高血压。“癌症”意指包括乳房,结肠直肠,胃,子宫内膜,前列腺,头和颈及肺部肉瘤。“其它适合的疾病”意指包括多囊性卵巢综合征,肥胖,Cushing氏综合征和代谢综合征X。给出这些疾病是作为例证,不是作为限制。
克隆5.3 这个大约2000bp的cDNA克隆编码非常类似于人外分泌膜酶原颗粒蛋白GP-2的蛋白质。但是,克隆5.3具有不同的核酸,因此具有氨基酸差异,并被定位于内分泌胰腺。
因为与此cDNA克隆反应的抗体可染色此内分泌胰腺,所以认为它编码的此蛋白质是外分泌GP-2蛋白的内分泌对应物。但是,这并不使此蛋白质在内分泌细胞中具有与它在外分泌组织中相同的功能。在通过cDNA转染的内分泌或外分泌来源的细胞系中表达的大鼠GP-2,显示出定向于外分泌细胞的分泌颗粒,而不是内分泌细胞中的(Hoopset al,1993)。
在被分离的外分泌胰腺酶原颗粒膜中,主要的蛋白质是GP-2,其含量达总蛋白质的40%(Ronzio et al,1978)。人和大鼠的这种蛋白质都是借助于糖基磷脂酰肌醇(GPI)键附着于此膜颗粒,并且借助于磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)可从膜上释放出。GP-2在膜酶原颗粒中的高含量已导致有人假设,这种蛋白质对于颗粒的形成是重要的。但是有报导表明,GP-2 mRNA不存在于大鼠胚胎胰腺中,GP-2只是在出生后断奶过程中被表达。因为大鼠胚胎胰腺包含大量的颗粒,因此可以推论,GP-2对于颗粒的形成不是必要的(Dittie and Kern,1992)。这些观察已在对猪胰腺的研究中得到证实,在此,GP-2蛋白和mRNA也不存在于胎儿,只是在出生后21天才开始产生。因此,胎儿的颗粒中完全缺乏GP-2蛋白(Laine etal,1996)。在断奶时出现这种抗原可能解释,在实验性糖尿病动物模型,这时伴随形成胰岛炎的原因。
对于GP-2蛋白的精确功能作用尚不知道,但是因为这种蛋白质在酶原颗粒中,既以可溶性形式(40%)又以膜结合形式(60%)存在,所以它必然具有细胞内和细胞外二种功能。因为GP-2在啮齿类和猪是在出生后被表达,所以对此分子的耐受性必然是外周诱发性的,而不是在胚胎发育过程中胸腺内形成的。Pulendren et al(1995)以及Shokat和Goodnow(1995)已证实,胎中心B细胞遇到可溶性抗原时会凋亡。因此,可溶性GP-2可能通过结合于GP-2反应性胚胎中心B细胞的免疫球蛋白受体并触发凋亡而行使诱发耐性的作用。
借助于蛋白酶和磷脂酶可从膜上释放出膜结合形式的GP-2,已证明在所分泌的亲水性GP-2上存在肌醇1.2-(环)单磷酸,证实在从膜上断开GP-2的过程中,磷脂酶C的作用(Paul et al,1991)。借助于磷脂酶,蛋白酶或水解酶,从细胞表面蛋白的脂质锚定物得到的脂质产物如1.2-二酰甘油和磷脂酸或者肌醇聚糖可能被摄入细胞内,并参与第二信使途径。也可能通过它们NH2末端功能域的交联,将GPI-连接的蛋白质直接包括在信号转导中。此信号转导作用是借助于Src类蛋白酪氨酸激酶P56lck和P59fyn,并且涉及GPI锚定物(Shenoy-Searia et al,1992)。GP-2蛋白也显示具有酶活性,在猪的酶原颗粒膜中,它已被鉴定为具有二和三-磷酸酶活性的核苷磷酸酶。这意味着,它包含在细胞溶质内的需能过程中(Soriani andFreiburghans,1996)。
GP-2蛋白在其C-末端区延伸的450个氨基酸上,与人Uromodulm/Temm-Horsfall(THP)蛋白有53%的同一性和85%的相似性。THP也是GPI-连接的蛋白质,这二种蛋白质都属于包括精子受体Zp2和Zp3,以及β聚糖(TGF-βIII型受体)的蛋白质家族,其特征是,这些明显不同的蛋白质都具有一个共同的260残基的功能域(Brok and Sander,1992)。新近鉴定的,由2000bp cDNA克隆编码的α细胞蛋白必定也属于这类蛋白质,并且在控制α细胞的分泌过程中也必然具有主要的功能。
对于多项应用,可以使本发明第一方面的抗体或等价配体,或者可被这种抗体识别的肽,寡肽,多肽或蛋白质,与效应器或受体分子如标记物,毒素或生物活性分子相结合。根据本发明的另一方面,提供了一种根据本发明第一方面的抗体或等价配体,或者可被这种抗体识别的肽,寡肽,多肽或蛋白质,它们经化学修饰,结合于生物或合成物质,或缀合于酶、指示化合物、药物、毒素或放射性标记,用作药剂或诊断剂。
适合的标记对于本领域的技术人员是熟知的。例如,这些标记可能包括在其氨基端或羧基端,或者内部与抗体,其片断或等价配体结合的附加肽或多肽。此附加多肽的目的可能是有助于对此抗体,其片段或等价配体的检测,表达,分离或纯化,或者可能是使此抗体,其片段或等价配体如所希望的具有附加的特性。
特别适合于结合的候选物是报导性分子如虫荧光素酶,绿色荧光蛋白或辣根过氧化物酶。可以选择的标记是放射性标记,或者分光光度法可检测的分子,例如化学荧光或磷光基团。还可以使用连接分子如链亲和素或生物素。另外,其它一些肽或多肽也可以用作结合候选物。例如,适合的肽可能是,β-半乳糖苷酶,谷胱甘肽-S-转移酶,虫荧光素酶,聚组氨酸标记,分泌性信号肽,抗体的Fc区段,FLAG肽,纤维素结合功能区,钙调蛋白和麦芽糖结合蛋白。
这些结合分子可以通过化学方法结合,应用例如化学交联法。适合的方法对于本领域的技术人员是熟知的。可能包括例如,半胱氨酸残基的硫羟基交联或应用甲醛的交联。化学交联法多数情况下是用于结合非蛋白质化合物,例如环肽和标记物结合。
如果需要结合二个或几个蛋白质分子时,选用的方法通常是用遗传法结合这些分子。为了产生重组融合蛋白,可对编码所需蛋白质或蛋白质片段的基因或基因的一部分进行基因工程处理,致使形成一个如此排列的邻接基因,以致二个基因序列的密码可在读框内被转录。
还可以将本发明的化合物结合于一个支持载体,这样可用于从体内组织中取出,分离或提取出抗-抗-TCR Vβ抗体。此支持载体可能包括任何一种适合的惰性材料,包括凝胶,磁性的和其它的小珠,微球,结合柱及树脂。
本发明的蛋白质或肽化合物,优选地将以重组体形式被表达,在宿主细胞内,在表达载体中被编码的DNA表达。这种表达方法对于本领域的技术人员是熟知的,在D.M.Glover著的“DNA克隆:实用的方法”第II卷:“表达系统”或(IRL,出版1995),或D.M.Glover著的“DNA克隆:实用的方法”第IV卷,“哺乳动物系统”(IRL出版1995)中,对许多方法已有详述。还可以应用已知的基因工程技术制备蛋白质化合物,例如应用在“分子克隆:实验室手册”第二版(Sambrook et al,1989,冷泉港实验室出版)中,或在“蛋白质工程:实用技术”(A.R.Rees et al编著,IRL出版1993)中所述的位点定向诱变或随机诱变技术。
可选择适合的表达载体用于所选择的宿主。此载体可能包括一个编码本发明化合物的,有效地连接于一个表达控制序列的重组DNA分子,或者是一个包含有这种重组DNA分子的重组DNA克隆载体,并且这种重组DNA分子是在由宿主转录机构识别的启动子控制之下。
通常使用的适合的宿主包括原核生物如E.coli,或真核生物酵母,可使它们高水平地表达重组蛋白质,并可容易地使之大量生长,体外培养的哺乳动物细胞系是适合的,特别是当应用病毒驱动的表达系统如包括使用昆虫细胞作宿主的杆状病毒表达系统时。也可以在体内表达化合物,例如在昆虫幼虫或在哺乳动物组织内。
根据本发明的另一方面,提供了一种药剂组合物,它包含具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的单克隆或多克隆抗体或者功能等价的配体,或者包含可被这类抗体(不是抗-TCR Vβ抗体)识别的肽,寡肽,多肽或蛋白质,并与药剂学允许的赋形剂组合在一起。适合的赋形剂对于本领域的技术人员是熟知的,例如包括磷酸缓冲盐水(0.01M磷酸盐,0.138M NaCl,0.0027M KCl,pH7.4)。药剂组合物内还可以含有附加的防腐剂,以便确保在贮存中有较长的贮存寿命。
具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的单克隆或多克隆抗体,或功能等价的配体,或者是可被这种抗体识别的肽,寡肽,多肽或蛋白质,可能是构成该组合物的唯一活性成分,或者可以构成治疗药盒的一部分,用于局部(例如作为乳膏的一种成分),口服或注射给药。
根据本发明的另一方面,提供了具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的抗体或等价配体在制造药物中的用途,所述药物用于治疗IDDM,NIDDM,或者其它器官特异性或非器官特异性的自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,或者其它任何存在抗-膦脂抗体和/或高胰岛素血症及胰岛素抗性的疾病。
根据本发明的再一方面,提供了一种治疗方法,用于治疗IDDM,NIDDM,或者其它器官特异性或非器官特异性的自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,或者其它任何存在抗-磷脂抗体和/或高胰岛素血症及胰岛素抗性的疾病。
根据本发明的再一方面,提供了一种可被不是抗-TCR Vβ抗体的,具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的单克隆或多克隆抗体或等价配体结合的肽,家肽,多肽或蛋白质在制造药物中的用途,所述药物用于治疗IDDM,NIDDM,或者其它器官或非器官特异性的自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,或者其它任何存在抗-磷脂抗体和/或高胰岛素血症及胰岛素抗性的疾病。
根据本发明的另一个实施方案,提供了一种用于检测天然存在的自身抗体的方法,包括使血液,血浆或血清样品,或者其它体液同本发明第一方面的单克隆或多克隆抗体,或者,等价配体,以及靶分子相接触。然后测定特异性结合于该靶分子的这种天然存在的自身抗体的含量。可以用例如酶标记此单克隆或多克隆抗体,或者等价配体,这样,使标记的抗体或等价配体同自身抗体竞争靶分子,而形成复合物。因此,结合于该复合物的标记物含量,与存在于样品中自身抗体的浓度成反比。如果用酶作标记,复合物的形成将会使酶的活性受到抑制或失活,以致使抑制或激活的程度与样品中存在的自身抗体浓度成反比。
对于本发明此实施方案的一方面,是将该靶分子结合于与底物连接的酶,以致使抗体对靶分子的结合使酶激活,引起可用分光光度计检测的颜色改变,此靶分子可以是例如,可识别人或任何其它动物种类T细胞受体Vβ链上至少一个抗原表位的抗-TCR Vβ多克隆或单克隆免疫球蛋白分子,或者它的任何一部分。此靶分子可结合于与底物连接的酶,并存在于可同样品接触的探针上。
本发明还包括,用具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的抗体或等价配体,或者可被具有抗-抗-TCR Vβ抗体(例如ESRP1)反应性的单克隆或多克隆抗体,或等价配体结合的肽,寡肽,多肽或蛋白质,作为试剂盒中的一个成分,用于检测或定量测定病人体内天然存在的自身抗体的水平。这种试剂盒类似于一种放射免疫测定或ELISA试剂盒,并可能附带包括检测工具,使之可能精确地定量测定需检测的化合物。这种方法对于本领域的技术人员是显而易见的。
可以将这种抗体或等价配体,或者被单克隆或多克隆抗体,或等价配体结合的肽,寡肽,多肽或蛋白质,结合磁性小珠,琼脂糖小珠,或者可以固定在多孔试验板的小孔底部。这样使之有可能在温育后除去样品中未结合的化合物。按另一种方法,可以将蛋白质结合于SPA(闪烁近似测定法)小珠,在此情况下,没有必要除去未结合的配体。应用一系列未标记的标准,可将用这些标准获得的结果,同用待测样品所获得的结果进行比较。
还可以将具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的抗体或等价配体,或者可被具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的单克隆或多克隆抗体,或等价配体结合的肽,寡肽,多肽或蛋白质,用于检测来自病人组织中天然发生的自身抗体。可将本领域通用的任何一种技术用于这种检测方法,并可能包括应用印迹技术(Towbin et al,1979),结合柱,凝胶阻滞法,层析法,或者本领域广泛应用的任何一种其它适合的方法。
本发明还提供了一种cDNA,RNA或基因组DNA序列,包括编码本发明第一方面抗体或等价配体的序列,或者编码本发明第二方面肽,寡肽,多肽,或蛋白质的序列,将它们用作药剂或诊断剂。
对于蛋白质ESRP1,其优选的核酸分子包含与附图7中显示的任何一个核苷酸序列的任何部分等同或互补的核苷酸片断,或者是与其简并或基本同源的序列,或可与该序列杂交的序列。以“基本上同源的”表示序列显示具有至少50%序列同源性,优选地是具有60%序列同源性。包括在本发明该范围内的“杂交序列”,是在标准非严格条件下(6×SSC/50%甲酰胺,室温)结合,和在低严格性条件下(2×SSC,室温,或2×SSC,42℃)或者优选地在高严格性标准条件下,例如0.1×SSC,65℃结合的序列(在此SSC=0.15NaCl,0.015M柠檬酸钠,pH7.2)。
本发明的核酸序列可以是单链-或双链的DNA,cDNA或RNA。优选的核酸序列包括DNA。
本发明还包括包含本发明DNA序列的克隆和表达载体。这种表达载体将掺入在读框内与本发明核酸分子连接的适当的转录和翻译控制序列,例如增强子元件,启动子-操纵基因区,终止序列,mRNA稳定性序列,起始和终止密码子,或核糖体结合位点。
此外,在蛋白质序列内不存在天然有效的信号肽的情况下,可能方便地使某些宿主细胞分泌重组蛋白。因此,这种载体的另一些成分可能包括编码分泌信号化序列和加工序列的核酸序列。
本发明的载体包括质粒和病毒(包括噬菌体和真核生物病毒)。许多这类载体和表达系统是本领域熟知的,并有许多文献证明。特别适合的病毒载体包括基于杆状病毒,腺病毒和痘苗病的载体。
在原核细胞如E.coli中表达异源性多肽和多肽片段的方法,在本领域已很好在确立了,参见例如“分子克隆,实验室手册”第二版,Sambrook et al,1989,冷泉港实验室出版,或“DNA克隆:实用的方法”,第二卷:“表达系统”,D.M.Glover编著(IRL出版,1995)。为了产生异源性蛋白质,在培养的真核细胞中表达,对于本领域的技术人员也是一种可实现的选择,参见例如O’Reilly et al(1994)的“杆状病毒表达载体-实验室手册”(牛津大学出版社出版)或“DNA克隆:实用的技术”第IV卷:“哺乳动物系统”,D.M.Glover编著(IRL出版,1995)。
可选择或构建适当的载体用于表达适合按照本发明使用的肽或蛋白质,此载体含有适合的调节序列,包括启动子序列,终止子序列,聚腺苷酸化序列,增强子序列,标记基因和其它适合的序列。载体可以是质粒,病毒,例如噬菌体或适合的噬菌粒。更详细的内容可参见“分子克隆:实验室手册”。在“分子生物学中简要的方案”第二版,Ausubelet al编著(John Wiley & Sons,1992)中,或“蛋白质工程:实用的技术”(A.R.Pees et al编著,IRL出版,1993)中,详细地论述了许多用于操作核酸的已知技术的方案,例如,在制备核酸构建物中,诱变,测序,将DNA导入细胞和基因表达,以及对蛋白质的分析。例如,对于真核细胞,选择的载体是基于病毒的。
本发明的另一方面提供了一种宿主细胞,含有本发明第一方面的抗体或等价配体,或者是能编码本发明第二方面的肽、寡肽、多肽或蛋白质。还有另一方面是提供了一种方法,包括将这种核酸导入宿主细胞或生物体内。导入核酸的方法可采用任何可行的技术。对于真核细胞,适合的技术可包括磷酸钙转染法,DEAE-葡聚糖法,电穿孔法,脂质体介导的转染法,或者应用反转录病毒的转导法,或者应用其它病毒如痘苗病毒,或对于昆虫细胞应用杆状病毒。对于细菌细胞,适合的技术可包括氯化钙转化法,电穿孔法或者应用噬菌体的转染法。
导入核酸之后,随之可引起或使此核酸进行表达,例如,在使基因表达的条件下培养宿主细胞。
在一个实施方案中,是将本发明的核酸整合进入宿主细胞的基因组(例如染色体)。可按照标准的技术,通过引入启动与基因组重组的序列来促进整合作用。
被转化以致能在种系中表达或超量表达在此所述的一种或几种化合物的转基因动物随同产生它们的方法构成了本发明更进一步的一方面。现在已存在多种技术可将转基因导入生物体的胚胎或种系中,例如在Watson et al(1994)“重组DNA”(第二版),ScientificAmerican Books中所阐述的。
对于糖尿病本发明的治疗意义和对未被回答问题的应用
下述均以例证性方式给出,不是局限性的。
受损害的葡萄糖反调节作用:
在控制IDDM病人中的主要问题是出现低血糖,这可能部分地是医原性的,由于高强度胰岛素治疗导致对低血糖不能察觉,但是,主要是由于丧失了葡萄糖反调节作用。不良的葡萄糖反调节作用,是合并缺乏胰高血糖素和肾上腺素对低血糖水平反应的结果。已证实,小心地避免低血糖可以反转对低血糖的不察觉,但是不能反转不良的反调节作用(Cryer,1995)。
不仅长时间存在的,而且新诊断的IDDM病人都存在受损害的反调节作用。对20名患有新发作IDDM(5-6天)的儿童和47名长时间存在IDDM的儿童比较反调节性反应,揭示出与对照受试者相比较,二组儿童中胰高血糖素对低血糖的反应都较低。与对照相比较,在新IDDM病人肾上腺素的反应也降低了(Hoffman et al,1994)。
在此可提议,这种反调节缺乏的原因是,IDDM病人持续性自身抗-抗-Vβ抗体导致对上述信号化分子的下调作用,并取消了α细胞和肾上腺髓质细胞对降低血糖水平的应答。这与对一名新诊断的糖尿病病人,观察到丧失了抗-抗-Vβ对胰切片的染色是一致的,此病人偶然死亡(见实验部分,p39)。这也类似于Brent et al(1996)的发现:用针对GPI-连接的CD52蛋白的Campath-1H治疗类风湿性关节炎病人,导致某些受治疗的病人,T细胞和B细胞中的CD52和GPI-连接的蛋白质消失了。三个月内CD52-阴性的B细胞从循环中消失了,但是,CD52-阴性的T细胞持续存在了至少20个月。因此,阻止IDDM病人保持这些抗体将改善反调节的缺乏,防止低血糖。从出生时就阻止它们形成,将防止易感个体出现IDDM。NIDDM将被彻底治愈。这将伴随着一种方法,类似于对怀有Rh-阳性胎儿的Rh-阴性母亲,给予抗-D免疫球蛋白(抗-D Ig)的方法(Devey,1979)。Heyman(1990)论述了在这种类型的治疗中,涉及阻止抗体产生的可能机制。作为进一步的措施,以此致病性抗体免疫个体,将产生保护性抗-独特剂型抗体,然后在致病性抗体产生时,这种保护性抗体可同它形成复合物。
糖尿病患者的肾病
1型糖尿病肾脏受牵连的特征是,肾小球和肾小管的上皮和基底膜肥大,以及细胞外基质成分在肾小球系膜内积累(Lame et al,1990)。此疾病的发展导致小肾小球毛细血管腔消失,蛋白尿,滤过作用丧失。高血糖和产生TGT-β(转化生长因子-β)与糖尿病患者的肾病有关连。高葡萄糖浓度可使肾小球系膜细胞和近曲小管细胞培养物中TGF-β mRNA和蛋白质增加;TGF-β间接介导葡萄糖对细胞生长和胶原蛋白合成的作用。已显示给予针对TGF-β的抗血清将抑制实验性肾小球肾炎(Border,1990)。
有可能高血糖在糖尿病早期诱发TGF-β表达,如下事实可支持这点:在人糖尿病和在BB及NOD模型,都已证明在高血糖和肾肥大发作后的几天内,就增加了肾对TGF-β的表达(Yamamoeo et al,1993;Sharma and Ziyadeh,1994)。
TGF-β对其受体的结合是由一个膜锚定的蛋白多糖(β-多糖)协助的,此蛋白多糖把TGF-β呈递给II型信号化受体,一个横跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶(Lopes-Castillas et al,1994),β-多糖具有一个由细胞脱落的细胞外区段,它可以结合TGF-β,但不能将它呈递给信号化受体,并且随后作为强有力的抑制剂发挥其作用。β-多糖属于包括Uromodulin和胰分泌颗粒膜GP-2在内的蛋白质家族。已经证实了Uromodulin相关区域在TGF-β结合中的作用(Fukushimaet al,1993)。
以可溶形式和膜结合形式存在的,与GP-2(克隆5.3的产物)有关的α细胞分子,可能是一个与TGF-β作用抑制有关的蛋白质。由于致病性抗体长期作用引起的这些分子的下调作用,可能导致取消对TGF-β的抑制作用,因此促进了它在肾中的营养性特点。给予致病性抗体所识别分子的可溶性肽,将具有抑制TGF-β和抑制抗体产生的双重作用。
胰腺移植
为了治疗易导致严重低血糖事件的1型糖尿病,实行移植的逐渐增多。这具有建立胰岛素非依赖性和部分地恢复正常血糖的双重作用,但是,如果在不抵消根本的致糖尿糖条件的情况下实行这种手术,每当致病性抗体持续地形成,葡萄糖反调节问题将再次出现。
最近对13名应用分级低血糖箝制技术成功地胰腺移植病人的研究证明,胰高血糖素对低血糖的反应恢复了。但是,与正常对照或肾移植接受者相比较,胰腺移植接受者的禁食性和刺激性胰高血糖素水平都显著地较高。而且,与所有其它组相比较,C-肽的水平也升高了(Kendall et al,1997)。研究者对这些令人想起前糖尿病状态的观察没有评述。但是他们报告,对于胰腺移植接受者肾上腺素对低血糖的反应改善了,而显著地低于健康的对照受试者或非糖尿病肾移植接受者。从这些观察表明,将健康的胰腺移植给糖尿病病人,通过α细胞和肾上腺反应使时钟回调前糖尿病状态。对于潜在性糖尿病胰腺移植病人必须给予治疗,以便防止在移植之前致病性抗体的滴度进一步升高,确保手术完全成功。
自主性神经病
长期持续的糖尿病可能并发不可逆转的,不同于无察觉低血糖的自主性神经病(Cryer,1994;Dagogo-Jack et al,1993)。在Uendall et al(1997)的研究中,借助于胰腺移植消除了低血糖,使肾上腺素反应和对低血糖症状的识别都得到改善,尽管心脏的自主性功能障碍仍然存在。但是,通过胰腺移植未能恢复长期糖尿病病人不存在的去甲肾上腺素反应。
虽然尚未检测到致糖尿病单克隆抗体针对自主性神经节中神经细胞体的反应性,但可以预料,它们识别的抗原也存在于这些细胞体上。已经证实在不同的初级神经元上可表达独特的一套GPI-连接蛋白。其中的某些显示出与不同的髓鞘特征相对应(Rosen et al,1992)。这些分子将具有类似的信号化特点,并可能受到类似于对α细胞和肾上腺髓质细胞上分子的影响。
已发现GPI-连接的膜蛋白,睫状神经营养因子受体(CNTF)与某些形式的外周糖尿病性神经病相关联。对于通过喂给半乳糖诱发的高血糖或链脲佐菌素处理的实验动物,在高血糖1-2个月之后,坐骨神经内CNTF样活性的水平降低了。这与CNTF蛋白质减少相关联。但与mRNA无关。由Schwann细胞损伤引起的CNTF缺乏,可能在实验性糖尿病性神经病造成某些功能和结构异常。其中的一些异常是由于醛糖还原酶(AR)对己糖的代谢作用,可以借助于AR抑制剂来预防,但是,这种抑制剂只能部分地恢复CNTF缺乏,表明是某些因子,而不是由于AR活性引起的多元醇积累与CNTF表达减少有关(Mizisin etal,1997)。这证明,GPI-连接的分子在外周糖尿病性神经病以及自主性神经病中,可能起主要的作用。
对于SLE和原发性抗-磷脂综合征中,本发明的治疗意义,以及对未被回答问题的应用
将以例证性方式,而不是局限性的方式给出下面的内容。
已发现,具有针对阴离子磷脂如心磷脂特异性的抗体与血栓形成,习惯性流产和血小板减少症有关(Harris et al,1983;Cowchocltet al,1986;Harris et al,1986)。已有人对被称为狼疮抗凝血剂的系统性红斑狼疮(SLE)相关抗体持有相似的主张,可通过它们不完全的凝血致活酶时间来检测这种抗体(Thiagarajan et al,1980;Love and Santoro,1990)。已表明这种抗凝血剂的作用是由于这种抗体与阴离子磷脂的反应性(Sammaritano et al,1990)。此外,SLE病人具有针对天然双链DNA(ds DNA)的抗体,它对SLE可起诊断标记的作用(Veinstein et al,1983)。具有抗-磷脂抗体的大多数病人都患有SLE或者相关的自身免疫病症,但是,某些病人不患有其它可检测的疾病,被认为是患有“原发性抗-磷脂综合征”(PAPS)(Asherson et al,1989;Branch et al,1990)。近几年,通过被动转移人多克隆抗磷脂抗体诱导妊娠小鼠流产,已确定了这些抗体的致病性作用(Branch et al,1990)。通过被动转移人多克隆和小鼠单克隆抗心磷脂抗体,对新生小鼠也诱发了PAPS(Blank et al,1991)。
在许多神经病学状态时也出现抗-磷脂抗体或抗心磷脂抗体,在大脑局部缺血病灶,周期性偏头痛,舞蹈病,中风发作和其它一些疾病中它们有突出的作用(Levine and Welch,1987)。
至今,对抗-磷脂或抗-ds DNA抗体的起源仍不清楚。关于这方面的研究似乎都集中于抗-磷脂抗体的配体结合特性。来自病人的多克隆抗-磷脂抗体同大多数阴离子磷脂有交叉反应(Lafer et al,1981;Pengo et al,1987)。但是,当发现结合于多核苷酸如DNA的单克隆抗体也结合于心磷脂和其它阴离子磷脂时,注意力转移到其它一些配体(Schoenfeld et al,1983;Rauch et al,1984;Smeenk et al,1987)。认为这种交叉反应性是由于DNA和磷脂化学结构的相似性,它们二者都含有被3个碳原子隔开的磷酸二酯-连接的磷酸基(Lafer et al,1981)。来自革兰氏阳性菌的脂胞壁酸和来自革兰氏阴性菌的内毒素也含有磷酸酯,并认为外来抗原中的这些分子可能是产生抗-磷脂抗体的触发剂(Carroll et al,1985)。
最近发现,在某些SLE病人,抗-ds DNA抗体的形成与频繁的多瘤病毒再激活有关。但是,不存在病毒DNA时也检测了高滴度的抗-ds DNA(Rokvig et al,1997)。
在此已经证明,心磷脂和抗-ds DNA反应性都包含在抗-抗-TCR Vβ抗体的结合特异性中(表3,方法见实验部分)。这既是来自以抗-TCR Vβ单克隆抗体免疫小鼠的多克隆抗体的特征,也是由这种免疫小鼠产生的抗-抗-TCR Vβ单克隆试剂的特征。因此,该小鼠多克隆抗血清具有强有力的抗凝血作用。
对于抗-抗-TCR Vβ抗体形成可能的病理生理学机制前面已有论述(见p12)。还指出可用多克隆或单克隆抗-抗-TCR Vβ抗体防止它们形成,或者诱导保护性抗体(见p25)。这种方法可能阻止致病性抗-DNA和抗-磷脂抗体同时形成,导致缓解由这些抗体引起的疾病。
本发明对另一些激素调节障碍性疾病和存在β细胞功能障碍或者高胰岛素血症及胰岛素抗性的某些病症的应用
如前面已指出,抗-抗-Vβ抗体结合于胰岛α细胞和其它内分泌器官,暗示其靶分子与它们的分泌机制有关。这可能解释如下发现:对于一个病人,自身免疫内分泌性疾病可以影响一个以上器官,或者可以存在针对临床上“未受影响”器官的自身抗体。可以同时存在的疾病是甲状腺机能减退,甲状腺机能亢进(Grave氏病),糖尿病,Addison氏病,原发性性腺机能减退,自身免疫性胃炎和恶性贫血等,其中尤其是推测反映个体遗传易感性的疾病状态。
将以例证性而非限制性方式给出如下的内容。
自身免疫性甲状腺病
与一般人群相比较,在患有IDDM的病人中,自身免疫性甲状腺病的发病率显著地比较高(Payamn and Thomson,1989)。在甲状腺机能亢进时,常常可见异常的葡萄糖耐性和肝葡萄糖产生增加(Wennlund et al,1986)。Moghetti et al(1994)曾报导,对于8名新近诊断的甲状腺亢进受试者,在基础状态和胰岛素输注之后,其加速的葡糖异生作用是高胰增血糖素症的指示。在甲状腺亢进病人中,无论他们是否有高血糖症,在给予葡萄糖或进餐之后,胰高血糖素水平降低的百分数也显著地较低(Kabad and Eisenstein 1980;Bech et al,1996)。在甲状腺亢进的患者,胰岛素分泌也调节失常。在多种状态下,例如在高血糖箝制期间(O’Meara et al,1993),在禁食状态和进食之后(Bech et al,1996),与对照相比较,在甲状腺毒症病人免疫反应性胰岛素浓度都较高。免疫反应性胰岛素升高,可用胰岛素原分泌增加来解释。还有证据表明,甲状腺机能亢进时,ACTH(促肾上腺素皮质激素)皮质醇和生长激素的分泌增加了(Moghetti et al,1994,Gallegher et al,1971)。这与如下假说是一致的:激素分泌的正常负反馈控制的失调,是由于抗-抗-Vβ抗体结合于这些器官上的靶抗原引起的。甲状腺毒症时的胰高血糖素和胰岛素分泌失调,类似于前糖尿病状态和糖尿病状态,大多数糖尿病病人以相似的方式,夜间TSH波动减弱了(Coiro et al,1997)。多囊性卵巢综合征(PCOS)
患有PCOS的妇女胰岛素对静脉内注射葡萄糖早期持续增加的反应,表明存在原发性胰岛素分泌异常(Holte,1995),这些妇女在口服葡萄糖耐受性试验(OGTT)的过程中,也表现有高血糖和高胰岛素血症反应(Dunaif et al,1987)。但是,Ceolland et al(1990)曾报导,PCOS妇女尽管在OGTT过程中存在高血糖反应,也具有胰高血糖素减弱反应。这表明,第二线葡萄糖反调节激素即肾上腺素,在PCOS妇女必定升高了。与此一致的是,在一半雄性激素过多的妇女发现有肾上腺雄性激素过多(Ehrmann et al,1992)。在灌流的离体肾上腺和分子水平都已证明了肾上腺素对类固醇形成的作用(Ehrhart-Bornstein et al,1994;Guse-Behling et al,1992)。借助于对整个肾上腺髓质中混合的肾上腺皮质细胞(反之亦然)免疫染色的组织学证据,证实了肾上腺髓质通过旁路机制作为肾上腺皮质功能调节器的作用(Bronstein et al,1994)。可被本发明所述致病性自身抗体识别的分子,大量地呈现在肾上腺髓质细胞上(图3)。这种自身抗体可能是在PCOS中引起肾上腺雄性激素过多的肾上腺素分泌增多的原因。
肾上腺雄性激素过多常常与一般伴随有LH增加的卵巢雄性激素过多同时发生。卵巢类固醇生成的异常方式,只能部分地用LH对泡膜细胞的过度刺激以及对GnRH的过度反应来解释。胰岛素和胰岛素样生长因子,通过提高在卵巢类固醇生成中限速酶的水平,以及反转LH诱导的对这些酶的下调,可增加泡膜细胞对LH的促雄性征反应(Hernandeset al,1988;Magoffin et al,1990)。因此,已建议将高胰岛素血症作为卵巢功能失调的主要候选者(Ehrmenn et al,1995)。
高胰岛素血症似乎也对肾上腺雄性激素过多起作用,但不是直接的,而是通过与ACTH刺激协同(Mroghetti et al,1996)。垂体糖蛋白激素的分泌是波动性的,瓦解它们的脉冲会改变再现功能(Samnels et al,1990;Santore et al,1986)。已证明,培养的垂体泌乳细胞可表达GP2-连接的分子,用TRH处理这种分子会迅速水解(Bemites et al,1995)。磷脂酶C的抑制作用可阻止TRH的作用和第二信使的产生(Peres et al,1997)。已发现通过抑制磷脂酶C的活性可阻止大鼠垂体前叶细胞释放ACTH(Won andOrth,1995)。用磷脂酶C也可模拟ACTH的作用(Toster andVeitl,1995)。Villa et al(1995)曾报导,用肌醇磷酸多糖可以剂量依赖性方式抑制肾上腺皮质细胞中醛固酮的积累,证明了这种分子的调节作用。这些观察证明,在此所述的抗-抗-Vβ自身抗体,对磷脂酶C作用位点具有远程延伸性阻断作用。
肥胖症
高胰岛素血症是幼儿和成年人肥胖症的特征。Le Stunfl和Bougneres(1994)曾报导,在患有长期和短期肥胖症的儿童,对标准饮食的胰岛素反应增加了76%,禁食胰岛素水平在肥胖期间持续增加。与对照相比较,长期或短期肥胖儿童在标准饮食试验之后,还出现高血糖,这与新近肥胖的儿童葡萄糖异生作用增加的报导相一致(LeStunfl and Bougneres,1996)。
发现患有巨型肥胖症的妇女在达到正常体重之后,饭后胰岛素增加仍持续存在(Fletcher et al,1989)。因此,高胰岛素血症似乎是导致肥胖症的原发性异常。对于成年人肥胖症,高胰岛素血症还与禁食期间和饭后状态游离脂肪酸的水平增加有关(Golay et al,1986)。肥胖症的葡萄糖异生作用增加和高胰岛素血症,很可能是由于胰高血糖素分泌失调的结果。Borghi et al(1984)曾报导,在肥胖受试者,葡萄糖不能抑制胰高血糖素的分泌作用。Golland et al(1990)曾证实,与非肥胖的受试者相比较,肥胖妇女在大量口服葡萄糖后的60,90和120分钟,具有显著较高的胰高血糖素反应。这二个观察都证实,胰腺α细胞缺乏调节信号,类似于前糖尿病和糖尿病状态。
Cushing氏综合征
这种病症通常与无葡萄糖耐受力,糖尿病,中枢性肥胖,妇女多毛症及动脉血压升高相关联。主要的诊断特征是高皮质醇症,20-40%的病人可能是由于长时间持续的ACTH分泌过多引起(Doppman etal,1988);这可发生在不存在垂体腺瘤的情况下,皮质醇分泌增加可由于单侧或双侧肾上腺增生,具有或不具有自发分泌性微小或巨大结节(Hermns et al,1988)。
最近在对90名肥胖症和糖尿病病人的交叉组合研究(Cross-Sectional Study)中,报导了Cushing氏综合征的发生率是3.3%(Leibowitz et al,1996)。表现为不良控制糖尿病的Cushing氏症临床前和亚临床病例,相当明显地补充了这种病症的形态特征。按类似的方式,已报导在1型糖尿病有轻度的慢性高皮质醇症,表现为禁食性皮质醇升高和尿中游离皮质醇增加,以及对绵羊促肾上腺皮质激素-释放激素的反应性升高(Roy et al,1993)。
ACTH过度分泌可发生在不存在垂体腺瘤而存在高皮质醇症的情况下(Grant and Liddle,1960),暗示正常的负反馈控制失调了。有几个报告指出,由激活磷脂酶C释放的GPI-连接分子和肌醇磷酸多糖,具有调节垂体激素分泌和调节从它们刺激的肾上腺,甲状腺,性腺等分泌激素的作用(Fanjnl et al,1993,Shaver et al,1993,Villa et al,1995)。因此可以预料到,在此所述的自身抗体,在从瓦解激素的波动性分泌到抑制或过度分泌的范围内都具有致病性作用,并且甚至导致形成肿瘤,因为还已发现,针对GPI-连接分子的抗体通过引起对激活信号丧失抑制性输入而诱发细胞增殖(Robinsonand Hederer,1994,Benites et al,1995)。
代谢综合征X和心血管病
综合征X是高胰岛素血症,无葡萄糖耐性,极低密度脂蛋白(VLDL)和甘油三脂升高,高密度脂蛋白(HDL)降低和高血压的复合形式。中枢性肥胖也与这种综合征有关联。有人认为导致这种综合征的根本性异常是胰岛素抗性(Reaven,1988,Reaver,1995)。Hrneiar et al(1992)曾估算,一般人群中5-10%存在这种综合征,动脉高血压病人为15-30%,NIDDM病人为65-90%,多毛症妇女为10-20%,而心肌梗塞病人为30-50%。Piedrola et al(1996)曾报导,40名新近诊断的冠状动脉疾病患者中,82.5%具有胰岛素抗性,这40名中的27名具有异常的OGTT。高胰岛素血症和胰岛素抗性与外周血管、冠状动脉和颈动脉病变的严重程度相关联(Standl,1995,Reaven,1995),并且还涉及到微血管性咽炎和运动诱发的冠状动脉局部缺血(Vertergaard et al,1995)。
在对2930名对象的心血管病和综合征X的调查中,Ferrannini etal(1991)曾报导,每种综合征状态的分离形式非常罕见,而是常常连带有高胰岛素血症,暗示高胰岛素血症是此综合征的关键性特征。Sowers et al(1993)还提议,高胰岛素血症可能通过促进动脉粥样硬化和血管再造而促使形成高血压。还发现胰岛素抗性与颈动脉壁厚度增加(Suzuki et al,1996)和颈动脉斑块增加(Leakso et al,1991)相关联。最近Salonen et al(1998)基于预期性人群的研究支持这样一种假设:胰岛素抗性与高血压和血脂异常的病因学有牵连。Moller et al(1996)曾证明,在转基因小鼠,肌肉中单纯性缺乏胰岛素受体介导的信号传递,可引起胰岛素抗性,高胰岛素血症,肥胖症,血浆甘油三脂和游离脂肪酸增加。对NIDDM肌肉活组织检查显示,普遍地缺乏使胰岛素发挥功能的肌醇磷酸多糖介体(Asplin et al,1993)。在此所述的致病性抗体可能与这种介体有交叉反应,并且通过使它们下调和通过瓦解胰岛素的波动性分泌而诱发胰岛素抗性。
免疫介导的多系统性疾病
还发现,在多系统性疾病如系统性红斑狼疮和进行性系统硬化症,高胰岛素血症和胰岛素抗性也是显著的。在21名这种病人,禁食时血清胰岛素水平是正常对照的2倍,它们的甘油三脂显著地较高,HDL胆固醇水平较低(Mateucci et al,1996)。
癌症
高胰岛素血症,葡萄糖耐受型糖尿病,HGP和胰岛素抗性速率增加,与多种癌症有关连,包括乳房,结肠直肠,胃肠道癌,肉瘤,前列腺,头颈部和肺癌(Tayek,1992,Copeland,Leinster et al,1987,Copeland A1-Sumidaie et al,1987,Tayex,1995,Nagamani et al,1988)。Bruning et al(1992)曾证明,乳房癌的log相关危险性与log C-肽水平直线相关。这不取决于BMI(身体质量指数)或WHR(腰与髋的比例),223名患I期或II期乳房癌的妇女都有胰岛素抗性,并且与441名对照相比较,具有显著较高的C-肽水平。在最近对2569名组织学证实的乳房癌病例和2588名对照妇女的研究中,注意到乳房癌与新近发作的糖尿病有关(Talamani etal,1997)。在大鼠结肠肿瘤模型,还观察到胰岛素对肿瘤的直接促进作用(Tran et al,1996)。
恶性肿瘤还显示出如下特征:无葡萄糖耐性,吸收后高血糖,同胰岛素抗性相一致的葡萄糖总体利用降低,以及外周乳酸产生增加。胰岛素与胰高血糖素的比例也降低了,循环中的胰高血糖素水平增加与肿瘤负荷状况有关(Cersosimo et al,1991),这与许多癌症患者HGP增加相一致。Bartlett et al(1995)曾证明,在大鼠模型,通过激素治疗而提高胰岛素/胰高血糖素的比率,可选择性地支持宿主的组成代谢和抑制肿瘤生长动力学。因此,防止形成代谢紊乱性致糖尿病复合物,将能降低癌症发病率,以及缓解恶性肿瘤的症状。
本发明的诊断,预防和治疗用途
将以说明性而非限制性方式给出如下内容。
本发明将被用于预防和治疗自身免疫性疾病和有关的疾病,是通过注射含有如下成分的药物制剂:单克隆或多克隆抗-抗-Vβ抗体或者等价配体,可被这些抗体识别的肽片段或分子,以及包含编码这些肽或分子的RNA或DNA序列的功能活性载体。
设计注射抗体是为了通过负反馈机制抑制存在的B细胞,或者通过形成独特型抗体网络,产生保护性抗体,而防止形成具有相同特异性的自身抗体(见原文p17和25)。可被致病性抗-抗-Vβ抗体识别的可溶性肽或其靶分子,也将被用于诱发低剂量耐受性,特异性地阻断已激活的B细胞(见原文p17),或者按预定的较大剂量阻断特异性肾病介体如TGF-β的作用(见p27)。包含适当核酸序列的载体也将通过预定的方式被注射,以便使之可能在体内长期分泌将发挥耐受原功能的可溶性产物。用于产生这些抗体的,可被抗-抗-Vβ致病性抗体识别的肽,蛋白质或其它分子,以及抗-Vβ免疫原,将被用于组成诊断试剂盒,以便检测血液,血浆,血清,唾液或其它体液中是否存在抗-抗-Vβ抗体,而从确证对自身免疫性疾病的易感性,或者作为疾病进展或治疗效果的预后性指示。
下面将通过实施例,较详细地叙述本发明的各个不同方面和实施方案。应该理解的是,无需脱离本发明的范围,就可能对细节进行修改。
附图简述
图1.以借助于荧光素标记的第二试剂检测的单克隆抗-抗-Vβ抗体,对正常人胰腺切片的染色。
图2.以借助于荧光素标记的第二试剂检测的单克隆抗-抗-Vβ抗体,对正常人甲状腺切片的染色。
图3.以借助于荧光素标记的第二试剂检测的单克隆抗-抗-Vβ抗体,对正常人肾上腺切片的染色。
图4.以借助于荧光素标记的第二试剂检测的单克隆抗-抗-Vβ抗体,对正常人肠切片的染色。
图5.以抗-抗-Vβ单克隆抗体和荧光素标记的第二试剂对一名儿童胰腺切片的染色,此儿童诊断为糖尿病,死于不能被控制的酮酸中毒。
图6.ESRP1基因的序列。
图7.对ESRP1蛋白质的预测性蛋白序列。
实验
将以说明性方式,而不是限制性方式给予如下实施例。
制备单克隆抗体
以0.1ml抗TCR Vβ特异性的单克隆抗体杂交瘤培养物上清液,腹膜内注射,每周一次,对小鼠免疫4次。然后取出脾脏,制备单细胞悬液。应用本领域和相关领域技术人员熟知的标准技术,使此细胞与SP2骨髓瘤细胞融合。应用过氧化物酶标记的抗-Ig试剂,以ELASA法鉴别产生抗体的克隆。再针对免疫试剂,双链和单链DNA,以及阴离子磷脂,对克隆作进一步筛选。所采用的方法是本领域技术人员熟知的标准技术。
检测抗磷脂抗体
以用乙醇配制的50μl 50μg/ml的心磷脂,磷脂酰胆碱,磷脂酰丝氨酸,以及用甲醇配制的50μl 50μg的磷脂酰肌醇(Sigma),包被平底96孔塑料培养板(Falcon,Beceon-Dickinson)。对照孔只以稀释剂包被。将培养板置4℃蒸发至干。以用磷酸缓冲盐水(PBS)配制的0.1%人血清白蛋白(HSA)封闭未结合的位点。用含有0.05%Tween 20(RTM)的PBS洗此培养板,然后与在PBS Tween(RTM)中系列稀释的血清,或者MoAb培养物上清液共同温育。在37℃温育1小时,或者在4℃温育过夜之后,如上再次洗培养板,用1∶500稀释的生物素化抗-小鼠Ig(Amersham International plc)检测结合的抗体,在37℃温育30分钟,适当漂洗之后,随之与1∶500的链霉亲合素-生物素化辣根过氧化物酶复合物(Amersham Internationalplc)共同在37℃再温育30分钟。用邻-苯二胺(Sigma)作底物,用Anthos ELISA检测仪在450nm测定颜色。
检测抗-DNA抗体
先用在水中配制的50μm/ml聚-1-赖氨酸,通过在室温下温育1小时包被平底96孔塑料培养板。弃去聚-1-赖氨酸溶液之后,对每个孔加入50μl在含有1mM EDTA的PBS中配制的10μg/ml的单链或双链DNA(Sigma)溶液,将培养板在室温下温育1小时。用PBS洗此培养板。以在PBS中配制的0.1%HSA封闭剩余的结合位点。用含有0.05%Tween 20(RTM)的PBS洗此培养板之后,加入系列稀释的血清或MoAb培养物上清液共同温育。如上面对抗-磷脂抗体所述的测定抗体的结合。
测定抗-抗-Vβ抗体的抗凝血作用
用不同的抗-TCR Vβ单克隆抗体免疫几种纯系小鼠,对它们的抗血清进行测定。将5μl每种抗血清同95μl猛烈离心的正常人血浆混合,在37℃温育1小时。对此混合物加入100μl适当稀释的Russell’s蝰蛇毒液(Diagen)和100μl稀释的血小板代用品(Diagen),温育30秒钟。然后加入100μl 0.025M CaCl2,并测定凝固时间。存在正常小鼠血清时凝固时间大约是55秒钟,而存在该免疫血清时,凝固时间在10-30分钟之间。对照鼠抗血清不延长凝固时间至正常小鼠血清的凝固时间之上。
对糖尿病胰腺切片的染色
用抗-抗-Vβ单克隆抗体染色来自因故死亡(与糖尿病无关的原因)的,新近诊断为胰岛素依赖性糖尿病病人的胰腺切片,以及来自正常人尸体器官贡献者的胰腺切片。正常胰腺切片显示出如所预料的胰岛内染色(见图1),而对于糖尿病的胰腺切片,或者完全的染色,或染色非常微弱。这表明,在此病人,相关的α细胞抗原被下调了或者被关闭了。
与此不同的是,抗-抗-Vβ对来自三名诊断死于酮酸中毒儿童的胰腺切片的染色,显示出在胰岛区域之外有阳性染色细胞增多(图5)。这可能是由于大量的自身抗体在体内与类似于层粘连蛋白结合样蛋白质或其它靶蛋白质发生反应,引起α细胞在胰岛之外的增殖和移动。
上述二种情况可能符合于引起急性不能控制性酮酸中毒和死亡的不同遗传素质个体的反应范围,或者符合于具有脆弱β细胞的IDDM个体和具有较强壮β细胞的NIDDM个体的反应情况。
单克隆抗-抗-Vβ抗体在体外对完整人胰岛的作用
由器官贡献者尸体分离出人胰岛,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基洗,在24孔培养板内以大约每孔200个胰岛的浓度在相同的培养基内培养。3天后从双份孔内小心地取出培养基,保存于-20℃。然后,对照孔仅加入培养基,测定孔加入含有用等量新鲜培养基稀释的抗-抗-Vβ的杂交瘤培养物上清液,进行培养。24小时后,同上取出每个孔的上清液并保存,再添加单独的培养基或者同上稀释的杂交瘤上清液。这样每日重复一次,持续2周,周末除外,不取出上清液。在实验期的最后,应用DAKO胰岛素试剂盒,按照制造商的说明测定保存样品中的胰岛素。结果证明,在实验开始时,测定孔和对照孔中胰岛素水平几乎相同。加入抗体后24小时,与对照孔相比较,测定孔中胰岛素水平显著较高地上升了。在第3天,含抗体的孔内胰岛素分泌下降至对照孔的大约50%。在第4天,测定孔中胰岛素的分泌再次高于对照孔,而在第5天,其水平相似。在表1中给出了结果的光密度(OD)读数,表明虽然在对照孔胰岛素分泌相当恒定,但在第一周实验期间,测定孔内胰岛素有剧烈的波动。在第二周内,测定孔中的胰岛素下降了,至第10天未能检测出胰岛素分泌,而在对照孔,分泌仍远高于基础OD读数。虽然对于对照孔中分泌测定未进一步继续下去,但是,从对照孔中胰岛素分泌的缓慢降低速率表明分泌可能还要再持续几天。
表1
在体外单克隆抗-抗-TCR Vβ抗体对人胰岛的作用
天数 | 光密度 | 天数 | 光密度 | ||
待测 | 对照 | 待测 | 对照 | ||
1 | 2.117 2.063 | 2.042 1.848 | 8 | 0.699 | 1.114 |
2 | 2.784 2.751 | 2.143 2.044 | 9 | 0.777 | 1.049 |
3 | 1.236 1.057 | 2.256 2.240 | 10 | 0.585 | 0.979 |
4 | 2.513 2.377 | 2.124 2.187 | 11 | 0.482 | 0.842 |
5 | 2.446 2.450 | 2.506 2.545 |
应用Anthos 2001培养板测定仪在450nm测定光密度,并用650nm的参照滤光片。培养基的光密度是0.532。
证明在人血清中天然存在抗-抗-Vβ自身抗体
用分泌抗-TCR Vβ6抗体的杂交瘤细胞培养物上清液免疫小鼠,从脾脏产生-抗-抗-Vβ抗体。在ELISA试验中,这些抗-抗-Vβ单克隆显示出结合于抗-Vβ免疫原;因此可试验用此免疫试剂作抗原,检测人血清中自身抗-抗-Vβ抗体的存在。用抗-Vβ免疫原包被平底的96孔培养板过夜,封闭未结合的部位,并对孔内加入按1/30稀释的人血清。2小时之后洗此培养板,用过氧化物酶标记的抗-人Ig检测对人血清的结合。
表2显示用从3号前糖尿病患者获得的血清的结果,以后它们都成为了糖尿病患者。来自3名供血者的血清样品被意外地间隔了一段时间,证明在诊断前1年就具有最高水平的自身抗体。第一份样品的结合指数(待测OD/对照OD)从4.4上升至6.1发生在7个月之内,在诊断之前2个月降低至2.9。这证明这种自身抗体的短暂性特点,并且它可能不会长期持续存在而导致形成疾病,但是,使此抗体滴度升高的几种事件,可能是由于导致T-细胞增殖的病毒或其它的感染,以及出现了异常的GPI-连接的TCR Vβ链。但是,在3号病人,自身抗体在高水平至少已持续了7个月至1年。这可能已导致了如前面所述的在胰腺β细胞上信号分子的下调(见原文P25和40)。
表2
人血清中存在抗-抗-TCR Vβ自身抗体
供血清者号 | IDDM诊断 | 光密度 | |||
日期 | 日期 | 待测抗原 | 待测/对照 | 对照(培养基) | |
1 | 5/1989 | 1/1991 | 0.082,0.080 | 0.124,0.134 | |
2 | 2/19896/1989 | 1/1993 | 0.087,0.0760.079,0.074 | 1.5 | 0.058,0.0540.076,0.063 |
3 | 5/198712/198710/1988 | 12/1988 | 0.074,0.0720.109,0.0970.060,0.057 | 4.46.12.9 | 0.016,0.0170.016,0.0180.021,0.019 |
待测抗原是来自产生抗-TCR Vβ的单克隆细胞系的培养上清液。待测/对照指数是由平均待测OD除以平均对照OD而得到。
表3
单克隆抗-抗-TCR Vβ抗体的结合特异性
小孔包被试剂 | 光密度 | |
实验1 | 实验2 | |
抗-TCR Vβ(免疫原) | 0.413 | 0.399 |
培养基(对照) | 0.046 | 0.040 |
乙醇配制的心磷脂 | 1.002 | 0.998 |
乙醇(对照) | 0.156 | 0.126 |
双链DNA | 0.210 | 0.242 |
聚-1-赖氨酸(对照) | 0.119 | 0.129 |
应用Anthos 2001培养板测定仪在450nm测定光密度,并用650nm的参照滤光片。用抗-TCR Vβ作培养物上清液。
用单克隆抗体(MoAbs)筛选胰腺文库
λgt11中的文库具有被插入EcoRI位点的DNA序列,并可以在lac启动子控制下被表达为融合蛋白。因此,可以用抗体筛选它们。
在本发明,是将Webster et al,1992所述的方法(“分子生物学方法”第10卷,“免疫化学方法”M.Manson编著)用于筛选λgt11人胰腺文库(Promega)。简单地说,用噬菌体转染菌株Y1090,与熔化琼脂糖混合并在培养基板上作平板接种。培养此被琼脂糖包埋的细菌,生长成连续的菌落,并在噬菌体溶解细胞的地方形成噬菌斑。在噬菌体适当的稀释度下,每个预期的噬菌斑是由一个噬菌体感染1个细菌引起。然后用一片硝化纤维素膜(Protran BA85 0.45μm 82mmSchleicher and Schnell)覆盖琼脂培养板,此硝化纤维素膜已在异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)中浸泡过,IPTG可诱导β-半乳糖苷酶基因(在λgt11内),cDNA已在唯一的EcoRI位点插入此基因。如果此cDNA是在正确的读框内并取向正确,那末将产生融合蛋白,它是β-半乳糖苷酶蛋白在羧基端在延伸产物。将膜覆盖的培养板在稍低的温度下培育,使融合蛋白的产量增加。然后取下膜,洗去细菌碎片,用MoAbs探测,以便检测编码与此抗体反应的蛋白质序列的cDNA克隆。为了此过程,先将这些膜在洗液(用PBS配制的5%奶粉,含有0.02%Tween(RTM)20)中温育30分钟,以防止抗体的非特异性结合,然后在洗液中漂洗,并放入装有纯MoAb的培养皿中,在摇床上放置2-3小时。除去抗体,在摇床上用缓冲液洗膜3次,总共30分钟。然后除去缓冲洗液,在摇床上,在适当稀释的辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠抗体(Sigma)中浸泡此膜1小时。除去抗体溶液,在摇床上用缓冲洗液洗膜3次共30分钟。然后用ECL(增强化学发光)试剂(Amershem Life Sciences)检测抗体的结合。将等体积的2个试剂混合,覆盖在膜的蛋白质面上作用1分钟。吸干过剩的试剂,将膜封装在Saran包裹内,在暗盒内对放射自显影胶片(HyperfilmTM-ECL)曝光。将胶片显影,并同含有噬菌斑的琼脂培养板相对比。用巴士德吸管挑选出阳性噬菌斑,并转移至含有50μl氯仿作防腐剂的0.5ml噬菌体洗脱物(SM:0.1M NaCl,0.01M MgSO4·7H2O,0.05M Tris碱,0.01%w/v明胶(1型猪皮),调至pH7.5)中。对阳性噬菌斑进行再次筛选,直至膜上所有的噬菌斑都为阳性。
聚合酶链反应(PCR)扩增cDNA克隆
应用如下扩增混合物,对如上所述纯化的8个cDNA克隆噬菌斑进行扩增:Taq Plus(Stratagene)10×低盐反应缓冲液5μl dNTPs(Pharmacia)各为200μM。
正向和反向引物各25pM(正向:GTA GAC CCA AGC TTTCCT GGA GCA TGT CAG TAT AGG AGG,反向:CTGCTC GAG CGG CCG CAT GCT AGC GAC CGG CGCTCA GCT GG,Penkin Elmer),Taq Plus DNA聚合酶(Stratagene)1单位,cDNA模板2μl,加dH2O至50μl。
在94℃,7分钟的预循环,即热启动过程中加入DNA聚合酶。用100μl矿物油覆盖在反应混合物上。试管置于DNA热循环仪(Perkin-Elmer Cetus,Emeryville,CA)中,程序如下:
94℃(变性)1分钟,55℃(退火)2分钟,72℃(延伸)3分钟,共36个循环,最后的延伸为7分钟,将PCR产物保存于4℃待分析。
对PCR产物的分析
在TAE缓冲液(Tris碱242g,冰醋酸57.1ml,0.5M EDTA(pH8.0)100ml,加dH2O至1000ml)中制备含有0.5μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶。将10μl每种PCR产物随同2μl样品缓冲液加样。在PCR产物的二侧还以2μl 100个碱基对和1kb的DNA序列梯度(Gibco,BRL)加样作参照物。以100V使此凝胶电泳1小时。在紫外光下观察PCR产物,用Polaroid(RTM)667胶片(Polaroid,st.Albans.UK)照相。
DNA测序
应用ABI PRISM Dye终止循环快速测序反应试剂盒和ABI373A测序仪(Applied Biosystems,Perkin-Elmer,Fostar City,CA),通过测序来检查PCR产物。
循环测序反应混合物为如下:
快速终止反应混合物-8μl,PCR产物(10-30ng/ml)3-6μl,引物3.2pM,加dH2O至20μl,以50μl轻质矿物油覆盖。将试管置于DNA热循环仪中,按照如下程序循环:96℃30秒,50℃15秒,60℃4分钟,重复25个循环。将20μl延伸产物转移至1.5ml的微型离心管内,加入2μl 3M乙酸钠(pH4.6)和50μl 95%乙醇。旋转摇匀试管,并在冰浴上放置10分钟,然后以13000rpm转速离心15-30分钟。弃去乙醇液,用75%乙醇洗沉淀物。再次离心,仔细取出乙醇液,对沉淀作真空离心干燥。
样品的制备和加样
将此干燥的样品沉淀再悬浮于6μl加样缓冲液(5体积去离子甲酰胺,1体积在25mM EDTA(pH 8.0)中配制的50mg/ml兰葡聚糖)中。将样品旋转摇匀并离心。然后将它们在90℃加热2分钟,置冰浴中至加样。先将样品对6%丙烯酰胺凝胶加样,1500-2000V预电泳30分钟。加样后再将它们在2000V电泳12小时,借助于计算机对序列资料进行分析。
对8个cDNA克隆进行了纯化和测序。如上面所述,发现克隆1.1,1.2和1.3编码分泌粒蛋白1蛋白质,克隆3.1,4.1和5.1编码67kd层粘连蛋白受体样蛋白质,克隆5.2编码一种新分子,被称为ESRP1(内分泌调节蛋白1)。图7中给出了ESRP1的序列,它编码的推测氨基酸序列显示在图6中。
将cDNA克隆进入真核表达载体(pCRTM 3-Uni,Invivrogen)中
应用单向真核生物TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行此过程。此线性载体pCRTM 3-Uni,在其左臂没有5′-磷酸基。因此,只能连接具有5′-磷酸的PCR产物。所以按如下在连接反应之前将用于cDNA扩增的正向引物磷酸化:在1支无菌的0.5ml微型离心管内,将正向PCR引物(50-100pM)0.5-1μg,10×-激酶缓冲液1μl,10mMATP 1μl,加无菌水至9μl,T4多核苷酸激酶(10单位/μl)1μl,缓慢地混匀,在37℃温育30-40分钟,94℃5分钟,然后置于冰浴上。如前面所述,将磷酸化的正向引物立即用于制备PCR产物,然后取10μl PCR产物在琼脂糖凝胶上进行分析。
按如下进行连接反应:新鲜PCR产物(约10ng)0.5-1.0μl,无菌水5.0-5.5μl,10×连接缓冲液1μl,pCRTM 3-Uni载体(60ng)2μl,T4 DNA连接酶1μl。此混合物在14℃温育4小时或过夜。
将连接反应物转化进入TOP 10F′细胞(One Shot)。在冰浴上使One Shot细胞解冻,向其小瓶内加入2μl 0.5M β-巯基乙醇。使细胞与1-2μl连接反应物混合,在冰浴上温育30分钟。然后使细胞在42℃热刺激恰好30秒钟。再向此小瓶内加入SOC培养基450μl。然后使它们在培养箱内,37℃,225rpm旋转温育1小时。将转化的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养板上作平板接种,37℃培养过夜。挑选出转化体,培养后用于分离质粒。
质粒纯化
在含有氨苄青霉素的LB培养液中培养转化的TOP 10F′细胞,用Wijard Miniprep(Promega)试剂盒或无内毒素质粒试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA,成为超纯DNA。借助于PCR和测序,分析质粒DNA中插入片段的存在和取向。
参考文献
Ammala,C.,Ashcroft,F.M.and Rorsman,P.(1993).自然363,356-358。
Asherson,R.A.,Khamashta,M.A.,Ordi-Ros,J.,Derksen,R.H.W.M.,Machin.S.J.,Barquinero,J.,Outt,H.H.,Harris,E.N.,Vilardell-Torres,M.and Hughes,G.R.V.(1989).医学(Baltimore)68:366-374。
Asplin,I.,Galasko.G.and Lamer,J.(1993).国家科学院学报90:5924-5928。
Barrou,Z.,Seaquist,E.R.and Robertson,R.P.(1994).糖尿病43,661-666。
Barsky,S.H.,Rao,C.N.,Hyams,D.and Liotta,L.A.(1984).乳腺癌研究与治疗4,181-188。
Bartlett D.L.,Charland S.L.,Torosian M.H.(1995).外科学118:87-97。
Bech K.,Damsbo P.,Eldrup E.,Bech-Nielson,H.,Roder M.E.,Hartling S.G.,Volund A.and Madsbad S.(1996).临床内分泌学44:59-66。
Bell,L.M.,Solomon,K.R.,Gold,J.P.and Tan K-N.(1994).生物化学杂志269,22758-22763。
Bendelac,A.,Carnaud,C.,Boitard,C.and Bach,J.F.(1987).实验医学杂志166,823-832。
Benedum,U.M.,Lamoureux,A.,Konecki,D.S.,Rosa,P.,Hillie,A.,Baeuerle.P.A.,
Frank,R.,Lottspeich,F.,Mallet,J.and Huttner,W.B.(1987).EMBO杂志6,1203-1211。
Benitez L.,Fanjul L.F.,Ruiz de Galarreta C.M.,QuintanaAguiar J.,Gonzalez Reyes J.,Hernandez I.,Santana Delgado P.,Cabrera Oliva J.,Alonso Solis R.and Estevez Rosas I.(1995).神经科学通讯187:37-40。
Bergsten,P.(1995).美国生理学杂志268,E282-287。
Bergsten,P.,Grapengiesser,F.,Gylfe,E.,Tengholm,A.and Hellman,B.(1994).生物化学杂志269,8749-8753。
Blank.M.,Cohen,J.,Toder.V.and Schoenfeld,Y.(1991).美国国家科学院院报88,3069-3073。
Border,W.A.,Okuda,S.,Languino,L.R.,Sporn M.B.and Ruoslahti,E.(1990).自然346,371-374。
Borghi V.C.,Wajchenberg B.L.and Cesar F.P.(1984).代谢33:1068-1074。
Bornstein S.R.,Gonzalez-Hernandez J.A.,Ehrhart-Bornstein M.,Adler G.and Scherbaum W.A.(1994).内分泌学与代谢78:225-232。
Brok.P.and Sander,C.(1992).FEBS通讯300,237-240。
Bougneres,P.F.,Carel,J.C.,Castano,L.,Boitard,C.,Gardin,J.P.,Landais,P.,Ilors,J.,Mihatsch,M.J.,Paillard,M.,Chaussain,J.L.andBach,J.F.(1988).新英格兰医学杂志318,663-670。
Boyd,A.E.III.(1992).细胞生物化学杂志48,234-241。
Branch.D.W.,Dudley,D.J.,Mitchell,M.D.,Creighton,K.A.,Abbot,T.M.,Hammond,E.H.and Daynes,R.A.(1990).美国妇产科学杂志163,210-215。
Brand,C.L.,Jorgensen,P.N.,Knigge,U.,Warberg,J.,Svendsen,I.,Kristensen,J.S.and Holst,J.J.(1995)美国生理学杂志269(内分泌学与代谢)32,E469-477。
Brett,S.S.,Baxter,G,Cooper,H.,Rowan,W.,Regan,T.,Tite,J.andRapson,N.(1996)国际免疫学8,325-334。
Bruning P.F.,Boonfrer J.M.,vanNoord P.A.,Hart A.A.,deJong-Bakkar M.,Nooijen W.J.(1992).国际癌症杂志52:511-516。
Carroll,P.,Stafford,D.,Schwartz,S.and Stollar,B.D.(1985)免疫学杂志135,1086-1090。
Castano,L.and Eisenbarth,G.S.(1990)免疫年评8,647-680。
Cersosimo E.,Pisters P.W.Pesola G.,Rogatko A.,Vydelingum N.A.,Bajorunas D.,Brennan M.F.(1991).外科学109:459-467。
Chan,B.L.Lisanti,M.P.,Rodriguez-Boulan,E.and Saltiel,A.R.(1988)科学1670-1672。
Chen.M.,Tempst,P.and Yanker,B.A.(1992)神经化学杂志58,1691-1697。
Coiro V.,Volpi R.,Marchesi C.,Capretti L.,Speronti G.,CaffarriG.and Chiodera P.(1997).临床内分泌学47:305-310。
Copeland G.P.,A1-Sumidaie A.M.,Leinster S.L.,Davis J.C.,Hipkin L.H.(1987).欧洲肿瘤外科杂志13:11-16。
Copeland G.P.,Leinster S.J.,Davis J.C.,Hipkin L.J.(1987)英国外科杂志74:1031-1035。
Cowchock,F.S.,Smith,J.B.and Gocial,B.(1986)美国妇产科学杂志155.1002-1010。
Cryer,P.E.(1995)美国医师协会会刊107,67-70。
Cryer,P.E.(1994)糖尿病43,1378-1389。
Dagogo-Jack,S.,Craft,S.,Cryer P.(1993)临床研究杂志91,819-828。
Davey,M.G.(1979)血液之声36,50-64。
Deeney,J.T.,Vunningham.B.A.,Cliheda,S.,Bokvist,D.,Juntti-Berggren.L.,Lam,K.,Korchak,H.M.,Corkey,B.E.and Berggren,P.O.(1996)生物化学杂志271,18154-18160。
Dittie,A.and Kern,H.E.(1992)欧洲细胞生物学杂志58,243-258。
Doppman J.L.,Miller D.L.,Dwyer A.J.et al.(1988)放射学166:347-352。
Dunaif A.,Graf M.,Mandeli J.,Laumas V.and Dobrjaansky A.(1987)。临床内分泌学与代谢杂志65:499-507。
Dunaif A.,Segal K.R.,Futterweitt W.and Dobrjansky A.(1989)糖尿病38:1165-1174。
Ehrhart-Bornstien M.,Bornstein S.R.,Guse-Behling H.,StromeyerH.G.,Rasmussen T.N.,Scherbaum W.A.Adler G.and Holst J.J.(1994)神经内分泌学59:406-412。
Ehrmann D.A.,Rosenfield R.L.,Barnes R.B.,Brigell D.F.andSheikh Z.(1992)新英格兰医学杂志327:157-162。
Ehrmann D.A,.Barnes R.B.and Rosenfield R.L.(1995)内分泌学述评16:322-353。
Fanjul L.F.,Marrero I.,Estevez F.,Gonzalez J.,Quintana J.,Santana P.,Ruiz de Galarreta C.M.(1993)细胞生理学杂志155:273-281。
Ferrannini E.,Haffner S.M.,Mitchell B.D.and Stern M.P.(1991)糖尿病学34:416-422。
Fletcher J.M.,McNurlan M.A.,McHardy K.C.(1989)欧洲临床营养学杂志43:539-545。
Forss-Petter,S.,Danielson,P.,Battenberg,E.,Bloom,F.and Sutcliffe,J.G.(1989)分子神经科学杂志1,63-75。
Foster R.H.and Veitl S.,(1995)普通药理学26:955-959。
Fukushima,D.,Butzow,R.,Hildebrand,A.and Ruoslahti,E.(1993)生物化学杂志268,22710-22715。
Gallagher T.F.,Hellman L.,Finkelstein J.,Yoshida K.,WeitzmanE.D.,Roffwang H.D.and Fukushima D.K.(1971)内分泌与代谢杂志43:919-927。
Gepts,W.(1995)糖尿病14,619-663。
Giovannucci E.(1995)癌症病因及控制6:164-179。
Golay A.,Swislocki L.M.,Chen Y,-D.I.,Jaspan J.B.and ReavenM.(1986)临床内分泌与代谢杂志63:481-484。
Golland I.M.,Vaughan Williams.Shalet S.M.,Laing I.andElstein M.(1990).临床内分泌33:645-651。
Grant W.and Liddle M.D.(1960)临床内分泌与代谢杂志20:1539-1560。
Guillausseau,P.J.(1994)糖尿病代谢20,325-329。
Guse-Behling H.,Ehrhart-Bornstein M.,Bornstein S.R.,WatermanM.R.,Scherabaum W.A.and Adler G.(1992)内分泌学杂志135:229-237。
Harris,E.N.,Gharavi,A.N.,Boey,M.L.Patel,S.,Macworth-Young,C.G.and Hughes,G.R.V.(1983)柳叶刀ii,1211-1214。
Harris,E.N.,Chan.J.K.H.,Asherson R.A.Aber,V.R.,Charavi,A.E.and Hughes,E.R.V.(1986)国际医学文献146,2153-2156。
Hashimoto K.,Nishioka T.,Tokao T.,Numata Y.(1993)内分泌杂志40:705-709。
Haskins,K.and McDuffie,M.(1992)科学249,1433-1436。
Hermus A.R.,Pieters G.F.,Smals A.G.et al.(1988)新英格兰医学杂志318:1539-1560。
Hernandez E.R.,Ressnick Ce.,Holtzclaw W.D.,Payne D.E.,Adler E.Y.(1988)内分泌学122:2034-2040。
Heyman,B.(1990)今日免疫学11,310-313。
Hogan J.C.(1997)自然生物技术15,328-330。
Holte J.,Bergh T.,Berne C.,Wide L.and Lithell H.(1995)临床内分泌与代谢杂志80:2586-2593。
Hinek,A.(1994)细胞,粘附及通讯2,185-193。
Hoffman,R.P.,Arslanian,S.,Drash,A L.and Becker,D.J.(1994)小儿内分泌学杂志7,235-244。
Hoops,T.C.,Ivanov,I.,Cui,Z.,Colomer-Gould,V.and Rindler,M.J.(1993)生物化学杂志268,25694-25705。
Howell.S.L.,Green.I.C.and Montague W.(1973)生物化学杂志136,343-349。
Hrnciar J.,Hrnciarova M.,Jakubikova K.,Okapcova J.(1992).Vntr.Lek.38:427-437。
Kabadi V.M.and Eisenstein A.B.(1980)临床内分泌与代谢杂志50:392-396。
Kendall,D.M.,Rooney,D.P.,Smets,Y.F.C.,Bolding,L.S.andRobertson.R.P.(1997).糖尿病46,249-257。
Kirshner M.A.,Zucker I.R.,Jesperson D.(1976)新英格兰医学杂志294:637-640
Kleinbaum,J.and Shamoon,H.(1983).糖尿病32,493-498。
Laakso M.et al.,(1991)动脉粥样硬化与血栓形成11:1068-1076。
Lafer,E.M.Rauch,J.,Andrezejewski Jr C.,Mudd,D.Furie,B.Schwartz.R.S.and Stollar,D.(1981)实验医学杂志153,897-910。
Laine,J.,Pelletier,G.,Peng,M.and Le Bel,D.(1996)组织化学和细胞化学杂志44,418-499。
Landowski,T.H.,Dratz,E.A.and Starkey,J.R.(1995)生物化学34,11276-11287。
Landowski,T.H.and Uthayakumar,S.(1995)临床实验性转移13,357-372。
Lane,P.H.,Steffes,M.W.and Mauer,S.H.(1990)原发性肾病学10,254-259。
Leahy,J.L(1990)糖尿病护理13,992-1010。
Leibowitz G.,Tsur A.,Chayen S.D.,Salameh M.,Raz I.,CerasiE.and Gross D.J.(1996)临床内分泌学44:717-722。
Le Stunff C.and Bougneres P.(1994)糖尿病696-702。
Le Stunff C.L.and Bougneres P.F.(1996)美国生理学杂志271:E814-820。
Levine,S.R.and Welch,K.M.A.(1987)神经学文献44,876-883。
Lopez-Casilas,F.,Payne,H.M.,Andres,J.L.and Massague,J.(1994)细胞生理学杂志24,557-568。
Love,P.E.and Santoro,S.A.(1990)国际医学年报112,682-698。
Ludvigsson,J.and Heding,L.(1982)潜在性糖尿病学报19,351-358。Magoffin D.A.,Kurtz K.M.,Erickson G.F.(1990)分子内分泌学4:489-494。
Marchetti,P.,Scharp,D.W.,McLear,M.,Gingerich,R.,Finke,E.,Olack,B.,Swanson,C.,Giannarelli,R.,Navalesi,R.and Lacy,P.E.(1994)糖尿病43,827-830。
Massia,S.P.,Rao S.S.and Hubbell,J.A.(1993).生物化学杂志268,8053-8059。
Matteucci E.,Migliorini P.,Bertoni C.,Dolcher M.P.,MarchiniB.,Giampietro O.(1996)临床风湿病学15:20-24。
Mizisin,A,P.,Calcutt,N.A.,DiStefano,P.S.,Acheson,A.and Longo,F.M.(1997)糖尿病46,647-652。
Moghetti P.,Castello R.,Negri C.,Tosi F.,Spiazzi G.G.,BrunE.,Balducci R.Toscano V.,Muggeo M.(1996)临床内分泌学与代谢杂志81:881-886。
Moghetti P.,Vastello R.,Tosi F.,Zenti M.G.M.,Magnani C.,BolnerA.,Perobelli L.Muggeo M.(1994)临床内分泌与代谢杂志78:169-173。
Moller D.E.,Chang P.Y.,Yaspelkis B.B3rd.,Flier J.S.,Wallberg-Henriksson H.,Ivy J.L.(1996)内分泌学137:2397-2405。
Nagamani M.,Hannigan E.V.,Dinh T.V.,Stuart,C.A.(1988)临床内分泌学与代谢杂志67:144-148。
Nijpels,G.,Popp-Snijders,C.,Kostense,P.J.,Bouter,L.M.and Heine,R.J.(1996)内分泌学39,113-118。
Ohneda,A.,Kobayashi,T.,Nihei,J.,Tochino,Y.,Kananya,H.andMakino,S.(1984)内分泌学27,460-463。
O’Meara N.M.,Blackman J.D.,Sturis J.,Polonsky K.S.(1993)临床内分泌学与代谢杂志76:79-84。
Payami H.,Thongon G.(1989)遗传流行病学6:137-141。
Pengo,V.,Thiagarajan,P.,Shapiro,S.S.and Heine M.J.(1987)血液70,69-76。
Perez F.R.,Casabiel X.,Camina J.P.,Zugaza J.L.Casanueva F.F.(1997)内分泌学138:264-272。
Piedrola G.,Novo E.,Serrano-Gotarredona J.,Escobar-MorrealeH.F.,Villa E.,Luna J.D.,Garcia-Robles R.(1996).高血压杂志14:1477-1482。
Powers.A.C.,Prochazka,M.,Naggerr,J.,Leiter,E.H.and Eisenbarth,E.S.(1993).临床研究杂志92,359-371。
Pimenta,W.,Korythowski,M.,Mitrakou,A.,Jenssen,T.,Yki-Jarvinen,H.,Evron,W.,Dailey,G.and Gerich,J.(1995).JAMA 273,1855-1861。
Pimplikar,S.W.and Huttner,W.B.(1992).生物化学杂志267,4110-4118
Pipeleers,D.G.,Schuit,F.C.,in’t Veld,P.A.,Maes,E.,Hooge-Peters,E.C.,Van de Winkel.M.and Gepts,W.(1985).内分泌学177,824-833。
Porksen,N.,Nunn.S.,Steers,J.,Vore.S.,Veldhuis,J.and Butler,P.(1995).美国生理学杂志269,E478-488。
Prentki,M.and Matschinsky,F.M.(1987).生理学评述67,1185-1249。
Rassmussen,H.,Zawasich,K.S.,Ganessan,S.,Calle,R.and Zawalich,W.S.(1990).糖尿病护理13,655-666。
Rauch,J.Tannenbaum,H.,Stoller,B.D.and Schwartz R.S.(1984).欧洲免疫学杂志14,529-534。
Reaven G.M.(1995).生理学评述75:473-486。
Reaven G.M.(1988).糖尿病37:1595-1607。
Reinke M.,Nieke J.,Krestin G.P.,Saeger W.,Allolio B.,Winkelmann W.(1992).临床内分泌学与代谢75:826-832。
Rekvig,O.P.,Moens,U.,Sundsfjord,A.,Bredholt,G.,Osei,A.,Haaheim,H.,Traavik,T.,Arnesen,E.and Haga,H.-J.(1997).临床研究杂志p,2045-2054。
Robinson P.and Hederer R.(1994).巴西医学生物学研究杂志27:263-267。
Roder,M.E.,Knip,M.,Hartling,S.G.,Karjalainen,J.,Akerblom.K.,Binder,C.儿童糖尿病芬兰研究组,临床内分泌学与代谢杂志(1994).79,1570-1575。
Roep,B.O.,(1996).糖尿病45,1147-1156。
Roep,B.O.,DeVries,R.R.P.(1992).欧洲临床研究杂志22,697-771。
Rosen.C.L.,Lisanti,M.P.and Salazer,J.L(1992)细胞生物学杂志117,617-627。
Rosenfield R.L.(1996)临床内分泌学与代谢杂志81:878-880。
Roy M.S.,Roy A.,Gallucci W.T.,Collier B.,Young K.,KamilarisT.C.,Chrousos G.P.(1993).代谢42:696-700。
Salonen et al.,(1998)糖尿病47:270-275。
Sammaritano,L.R.,Gharavi,A.E.,and Lockshin M.D.(1990).原发性类风湿关节炎20,81-96。
Samuels M.H.,Veldhuis J.D.,Henry P.,Ridgway E.C.(1990).临床内分泌学与代谢杂志71:432-452。
Santoro N.,Filiconi M.,Crowley W.F.(1986).内分泌述评7:11-23。
Schoenfeld,Y.,Rauch,J.,Massicotte,H.,Datta,S.K.,Andre-Schwartz,J.,Stollar,B.D.and Schwartz,R.S.(1983).新英格兰医学杂志308,414-420。
Schuit,F.C.and Pipeleers,D.G.(1985).内分泌学117,834-840。
Serreze,D.V.,Chapman,H.D.,Vamum,D.S.,Hanson,M.S.,Reifsnyder,P.C.Richard.S.D.,Fleming,S.A.,Leiter,E.H.and Schultz,D.C.(1996).实验医学杂志184,2049-2053。
Sharma,K.,Ziyadeh,F.N.(1994).美国生理学杂志267,F1094-1101。
Shaver J.K.,Tezrlman S.,Siperstein A.E.,Duh Q.Y.,Clark O.H.(1993).外科学114:1064-1069。
Shenoy-Scaria,A.M.,Kwong,J.,Fujita,T.,Olszowy,M.W.,Shaw,A.S.and Lublin,D.M.(1992).免疫学杂志149,3535-3541。
Shimada,A.,Charlton,B.,Taylor-Edwards,C.and Fathman,C.G.(1996).糖尿病45,1063-1067。
Sibley,R.,Sutherland,D.E.R.,Goetz,F.and Michael,A.F.(1985).实验室研究53,132-144。
Smeenk,R.J.J.,Lucasson W.A.M.and Swaak,T.J.G.(1987).类风湿性关节炎30,607-617。
Sodoyez,J.L and Pipeleers,D.G.(1985).内分泌学117,841-848。
Sonnenberg,G.E.,Hoffman,R.G.,Johnson,C.P.and Kissebah,A.H.(1992).临床研究杂志90,545-553。
Soriani,M.and Freiburghaus A.U.(1996).国际生物化学及细胞生物学杂志28,683-695。
Sowers et al(1993)美国高血压杂志7:772-788。
Standl E.(1995).临床医学研究18:261-266。
Storch.M.J.,Rossle,M.and Kerp,C.(1993).Dtsch.Med.Wochenschr.118.134-138.
Suzuki et al(1996)高血压28:592-598。
Talamini R.,Franceschi S.,Favero A.,Negri E.,Parazzini F.,LaVecchia C.(1997).英国癌症杂志75:1699-1703。
Tayek J.A.(1992).美国营养学会杂志11:445-456。
Tayek J.A.(1995)美国营养学会杂志14:341-348。
Thiagarajan,P.,Shapiro,S.S.and Marco,L.D.(1980).临床研究杂志66,397-405。
Tisch.R.,and McDevitt H.(1996).细胞85:291-297。
Towbin,H.,Staeholin,T.and Gordon,J.(1979).美国国家科学院学报76,4350-4354。
Tran T.T.,Medline A.,Bruce W.R.(1996).癌症流行病学及预防生物标志5:1013-1015。
Udenfridnd,S.and Kodukula,K.(1995).生物化学年评64,563-591。Van Schravendijk,F.H.,Forriers,A.,Hoghe-Peters,E.L.,Rogiers,V.,DeMeyts,P.,
Veinstein,A.,Bordwell,B.,Stone,B.,Tibbetts,C.and Rothfield,N.F.(1983).美国医学杂志74,206-216。
Vestergaard H.,Skott P.,Steffensen R.,Wroblewski H.,PedersenO.,Dastrup J.(1995).代谢44:876-882。
Villa M.C.,Cozza E.N.,Lima C.,Ramirez M.I.,DeLederkremer R.M.(1995).细胞信号系统73:331-339。
Wennlund A.,Felig P.,Hagenfeldt L.,Wahren J.(1986).临床内分泌与代谢杂志65:174-180。
Westerlund,J.Gylfe E.,and Bergsten,P.(1997).临床研究杂志100:2547-2551。
Won J.G.,Orth D.N.(1995).内分泌学136:5399-5408。
Yamamoto,T.,Nakamura,T.,Noble,N.A.,Ruoslahti,E.and Border,W.A.(1993).美国国家科学院学报90,1814-1818。
Claims (31)
1.一种具有针对抗-TCR Vβ抗体上以及一种或多种选自糖基磷脂酰肌醇-连接(GPI-连接)的TCR Vβ链、磷脂、磷脂聚糖、单链DNA和双链DNA的分子上的共同表位的反应性的单克隆抗体或多克隆抗体或者其片段,其用作药剂或用作诊断剂。
2.一种具有针对抗-TCR Vβ抗体上以及一种或多种选自糖基磷脂酰肌醇-连接(GPI-连接)的TCR Vβ链、磷脂、磷脂聚糖、单链DNA和双链DNA的分子上的共同表位的反应性的抗体,其用作药剂或用作诊断剂。
3.权利要求1或2的抗体或其片段,其具有针对抗-TCR Vβ抗体和GPI-连接的TCR Vβ链的反应性,其用作药剂或用作诊断剂。
4.权利要求1或2的抗体或其片段,其具有针对抗-TCR Vβ抗体和所有如下化合物的反应性:GPI-连接的TCR Vβ链、磷脂酰肌醇、磷酯酰丝氨酸、心磷脂、磷脂聚糖、单链DNA和双链DNA,其用作药剂或用作诊断剂。
5.权利要求1或2的抗体或其片段,其中所述抗体或片段以10-4M或更低的离解常数结合抗-TCR Vβ抗体,其用作药剂或用作诊断剂。
6.权利要求5的抗体或其片段,其中所述抗体或片段以10-7M或更低的离解常数结合抗-TCR Vβ抗体,其用作药剂或用作诊断剂。
7.权利要求1或2的抗体,是一种单克隆抗体,其用作药剂或用作诊断剂。
8.权利要求1或2的抗体或其片段,是来源于脊椎动物或无脊椎动物,其用作药剂或用作诊断剂。
9.权利要求1或2的抗体或其片段,是从健康或患病人或动物获得的B细胞产生。
10.权利要求9的抗体或其片段,是由通过E-B病毒转化而永生化的B细胞产生。
11.权利要求1或2的抗体或其片段,是使来自动物或人的体液通过抗原结合柱而分离制得,其用作药剂或用作诊断剂。
12.权利要求11的抗体或其片段,其中的动物或人是用抗原免疫过,已患病,或者已通过药物或饮食处理以致患病,此抗体或其片段用作药剂或用作诊断剂。
13.权利要求1或2的抗体或其片段,它是经化学修饰的,结合于一种生物或合成物质,或者被缀合于一种酶,指示化合物,药物,毒素或放射活性标记物,其用作药剂或用作诊断剂。
14.上述权利要求中任何之一的抗体或其片段用于制造药物的用途,所述药物用于治疗胰岛素依赖性糖尿病IDDM,非胰岛素依赖性糖尿病NIDDM或者器官特异性或非器官特异性自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,或者任何其它存在抗-磷脂抗体和/或高胰岛素血症和胰岛素抗性的疾病。
15.一种可被不是抗-TCR Vβ抗体的,权利要求1-13中任何之一的单克隆或多克隆抗体或者其片段结合的肽,寡肽,多肽或蛋白质,其用作药剂或用作诊断剂。
16.可被不是抗-TCR Vβ抗体的权利要求1-13中任何之一的单克隆和多克隆抗体或者其片段结合的肽、寡肽、多肽或蛋白质用于制造药物的用途,所述药物用于治疗IDDM,NIDDM,器官特异性或非器官特异性自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,或者任何其它存在抗-磷脂抗体和/或高胰岛素血症和胰岛素抗性的疾病。
17.一种肽、寡肽、多肽或蛋白质,包含内分泌调节蛋白ESRP1序列。
18.权利要求17的肽、寡肽、多肽或蛋白质,其用作药剂或用作诊断剂。
19.权利要求17或18中的肽、寡肽、多肽或蛋白质用于制造药物的用途,所述药物用于治疗IDDM,NIDDM,器官特异性或非器官特异性自身免疫疾病,心血管病,恶性肿瘤和癌症,或者任何其它存在抗-磷脂抗体和/或高胰岛素血症和胰岛素抗性的疾病。
20.一种cDNA,RNA或基因组DNA序列,它编码具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应性的单克隆或多克隆抗体或者其片段,或者编码可被不是抗-TCR Vβ抗体的,具有抗-抗-TCR Vβ抗体反应活性的单克隆或多克隆抗体或者其片段结合的肽,寡肽,多肽或蛋白质,其用作药剂或用作诊断剂。
21.一种cDNA,RNA或基因组DNA序列,它编码ESRP1。
22.一种噬菌体克隆,包含权利要求21的cDNA、RNA或基因组DNA序列。
23.一种具有生物功能的质粒或病毒载体,包含权利要求22的cDNA、RNA或基因组DNA序列。
24.一种噬菌体克隆,所述克隆具有生物功能的质粒或病毒载体,包含权利要求21-23中任何之一的cDNA、RNA或基因组DNA序列,其用作药剂或用作诊断剂。
25.一种宿主细胞,它已被用权利要求23或24的质粒或载体稳定地转化或转染。
26.一种用于检测天然存在的自身抗体的方法,包括使血液,血浆或血清样品,或者其它体液样本同权利要求1-13中任何之一的单克隆抗体或多克隆抗体或者其片段,以及靶分子接触,然后测定特异性结合于靶分子的天然存在的自身抗体的含量。
27.权利要求26的方法,其中的抗体或其片段按照权利要求13被标记,以致标记的抗体或其片段与自身抗体竞争结合靶分子而形成复合物,从而,结合于该复合物的标记物含量与存在于样品中的自身抗体浓度成反比。
28.权利要求27的方法,其中的抗体或其片段被用酶标记,以致复合物的形成可抑制或灭活酶的活性,从而其抑制或激活的程度与存在于样品中自身抗体的浓度成反比。
29.权利要求27或28的方法,其中该靶分子是结合于与底物连接的酶,以致抗体对靶分子的结合可激活此酶,并引起可用分光光度计可测定的颜色改变。
30.权利要求26-28中任何之一的方法,其中的靶分子是结合于与底物连接的酶,并存在于可同样品接触的探测仪dipstick上。
31.权利要求27或28的方法,其中该靶分子是可识别人或任何动物种类T细胞受体Vβ链上至少一个抗原表位的抗-TCR Vβ多克隆或单克隆免疫球蛋白分子,或者它的任何一部分。
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Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003510049A (ja) * | 1999-09-23 | 2003-03-18 | ライジェル・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Traf4関連細胞周期タンパク質、組成物および使用法 |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
CN105017423B (zh) * | 2005-08-11 | 2019-06-04 | 阿皮·马托西安-罗杰斯 | 用于自身免疫性疾病治疗和诊断的TCR-V-β相关肽 |
AU2012241141B2 (en) * | 2005-08-11 | 2015-08-20 | Arpi Matossian-Rogers | TCR-V-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease |
CN101432302A (zh) | 2005-11-30 | 2009-05-13 | 艾博特公司 | 抗-Aβ球聚体抗体,其抗原结合部分,相应的杂交瘤、核酸、载体、宿主细胞,生产所述抗体的方法,包含所述抗体的组合物,所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法 |
CA2631195C (en) | 2005-11-30 | 2016-04-05 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
EP2124952A2 (en) | 2007-02-27 | 2009-12-02 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
US8613923B2 (en) | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
US8048420B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
CA2701793C (en) | 2007-10-05 | 2017-04-25 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
US8987419B2 (en) | 2010-04-15 | 2015-03-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
SG187173A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-02-28 | Ac Immune Sa | Safe and functional humanized anti beta-amyloid antibody |
MX358739B (es) | 2010-08-14 | 2018-09-03 | Abbvie Inc Star | Proteinas de union a amiloide beta. |
RU2616281C2 (ru) * | 2011-09-29 | 2017-04-13 | СЕЛЛСНЭП, ЭлЭлСи | Композиции и способы испытаний на токсикогенность |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991009623A1 (en) * | 1989-12-29 | 1991-07-11 | California Institute Of Technology | Diagnosis and treatment of diseases |
WO1992012996A2 (en) * | 1991-01-22 | 1992-08-06 | The Immune Response Corporation | Vaccination and methods against diseases resulting from pathogenic responses by specific t cell populations |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5216132A (en) * | 1990-01-12 | 1993-06-01 | Protein Design Labs, Inc. | Soluble t-cell antigen receptor chimeric antigens |
US5480895A (en) * | 1991-09-27 | 1996-01-02 | New York Society For The Relief Of The Ruptured And Crippled, Maintaining The Hospital For Special Surgery | Method of producing antibodies to a restricted population of T lymphocytes, antibodies produced therefrom and methods of use thereof |
US5891623A (en) * | 1992-11-09 | 1999-04-06 | Consorzio Per Le Biotecnologie | Diagnosis and treatment of AIDS onset |
US5595721A (en) * | 1993-09-16 | 1997-01-21 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20 |
US5589328A (en) * | 1994-08-04 | 1996-12-31 | Mahant; Vijay K. | Chemiluminescence assays based on indoxyl substrates, thioindoxyl substrates and other substrates |
-
1998
- 1998-07-20 US US09/463,158 patent/US6689359B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-20 KR KR1020057007380A patent/KR100670070B1/ko not_active IP Right Cessation
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WO1991009623A1 (en) * | 1989-12-29 | 1991-07-11 | California Institute Of Technology | Diagnosis and treatment of diseases |
WO1992012996A2 (en) * | 1991-01-22 | 1992-08-06 | The Immune Response Corporation | Vaccination and methods against diseases resulting from pathogenic responses by specific t cell populations |
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