DE69830588T2

DE69830588T2 - Diagnose und behandlung von krankheiten mittels anti-t-zell rezeptor-vbeta-antikörper oder peptide, an denen diese antikörper spezifisch binden, und esrp1

Info

Publication number: DE69830588T2
Application number: DE69830588T
Authority: DE
Inventors: Arpi Matossian-Rogers
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-07-21
Filing date: 1998-07-20
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2018-07-21
Also published as: US6689359B1; DE69830588D1; KR20010022063A; ATE297983T1; PL338449A1; KR20050046825A; KR100567277B1; EA200000146A1; CN1264426A; EA003131B1; JP2002511765A; WO1999005175A2; EP0998556B1; SI0998556T1; IL133277A; IL176076A; EP1595951A1; PL204503B1; AU758455B2; ES2245034T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung beschreibt die Entwicklung einzigartiger Antikörper, welche die Ursache von verschiedenen Autoimmun- und anderen Krankheiten sind. Sie ergibt diagnostische und prophylaktische Anwendungen für solche Antikörper in monoklonaler und polyklonaler Form. Spezifischer ergibt die Erfindung die Verwendung dieser Antikörper als spezifische Inhibitoren für die Entwicklung von Autoantikörpern mit derselben Spezifität in Kindern und Erwachsenen. Diese Antikörper werden beansprucht als diagnostische, prophylaktische und behandelnde Verwendung in einer Vielzahl von Autoimmun- und anderen Krankheiten. Hingegen wird der meiste Hintergrund der Erfindung sich auf Diabetis konzentrieren, nicht als Begrenzung sondern als Veranschaulichung oder Beispiel.
Das Spektrum menschlicher Autoimmunkrankheiten
Krankheiten, die mit Autoimmunphänomenen verbunden sind, können innerhalb eines Spektrums klassifiziert werden, das von Zuständen reicht, die destruktive Beschädigungen eines einzelnen Organs involvieren, oder jenen, in welchen Organ- oder Gewebeschädigung weit verstreut ist.
Am organspezifischen Ende des Spektrums sind die am gewöhnlichsten beeinträchtigten Organe Schilddrüse, Nebennierendrüsen, Magen und Langerhans-Inseln (welche insulinerzeugende Zellen enthalten), im Pankreas, während am nicht organspezifischen Pol rheumatologische oder systemische (z.B. Lupus Erythematodes) Störungen vorherrschen. Autoimmunkrankheiten sind in seltenen Fällen verbunden mit plötzlich ausbrechenden viralen Infektionen, welche auch zu einer Organzerstörung führen können. Bei Autoimmunität ist der Schädigungsvorgang langsam und es braucht manchmal Jahre, bevor die Krankheit sich manifestiert hat. Die folgenden sind organspezifische Autoimmunkrankheiten, welche zu einem Autoimmunphänomen führen, das zu einem Zusammenbruch bei der immunologischen Toleranz der Eigenantigene führt.
Schilddrüse. Schilddrüsenautoimmunkrankheit involviert eine Vielzahl von klinischen Zuständen, welche in einem gewöhnlichen histopathologischen Bild resultieren. Es gibt diffuse Infiltration der Drüse durch mononukleare Lymphoidzellen. Die Krankheitskomponenten sind primäres Myxödem, Hashimoto Thyroiditis und Graves-Krankheit. Das Fortschreiten von einer zur anderen ist nicht ungewöhnlich. Primäres Myxödem ist am verbreitetsten von spontaner Hypothyroidismus und ist die letzte Stufe des chronischen Entzündungsvorgangs. Es gibt keine Kropfbildung und die Drüse ist nahezu vollständig ausgezehrt.
Hashimoto Thyroiditis ist auch mit Hypothyroidismus verbunden, aber ist mit Kropf verbunden. In verschiedenen klinischen Formen können die Gehalte von Thyroidhormon entweder durch verstärkte Gehalte an thyroidstimulierendem Hormon (TSH) ausgeglichen werden, das durch Schleimabsonderung erzeugt wird, oder es kann klinischer Hypothyroidismus sein, trotz erhöhter TSH-Gehalte. Bei beiden Autoimmunzerstörungszuständen sind Frauen fünfmal häufiger betroffen als Männer.
Die gewöhnlichste Form von Thyrotoxikose ist Graves-Krankheit mit oder ohne Kropf oder Exophthalmus. Sie ist gekennzeichnet durch Erleichterungen und Verschlimmerungen. Trotzdem führt der Autoimmunvorgang zur Hyperstimulierung der Drüse aufgrund der Erzeugung von schilddrüsenstimulierenden Antikörpern; endgültige Zerstörung der Schilddrüse tritt oft auf. Es gibt ein weibliches gegenüber männlichen vorherrschend von 5:1.
In allen Schilddrüsenautoimmunkrankheiten bestätigt das Anzeigen verschiedener Autoantikörper gegen die Drüse klinische Diagnose. Autoantikörper können gerichtet sein gegen schilddrüsencytoplasmatische Antigene, wie Thyroglobulin, Zelloberflächenbestandteile, wie Thyroidperoxidase und Thyrocytenoberflächen-exprimierte TSH-Rezeptoren (d.h. Graves-Krankheit).
Magen. Autoimmunkrankheiten des Magens involvieren entweder Fundus oder Antrum, was zu verschiedenen Entzündungsgraden führt, die diese beiden Regionen der Drüse beeinträchtigen. Allgemein wird dieser Vorgang Gastritis genannt. Bei der Fundusgastritis gibt es markante Atrophie der Mukosa mit konsequentem Verlust an Erzeugung intrinsischen Faktors (IF), was zur schlechten Absorption von Vitamin B12 und nachfolgenden Entwicklung von perniziöser Anämie führt. Bei diesen Bedingungen werden Antikörper gegen IF und Parietalzellen erzeugt und liegen in 90% der beeinträchtigten Patienten vor. Parietalzellen werden zerstört, aber Hauptzellen und Mukuszellen werden auch zerstört trotz der Abwesenheit von zirkulierenden Antikörpern gegen die letzteren beiden Zelltypen. Es gibt ein weibliches gegenüber männlichem vorherrschend von 3:1. Autoantikörper gegen Gastrin erzeugende Zellen in dem Antrum wurden in einigen Patienten mit Antrumgastritis gezeigt. Dieser Typ von Gastritis ist verbunden mit gastrischem Geschwür und bei einem Patientenanteil sind auch Antikörper gezeigt worden, die Gastritiszellen stimulieren.
Nebennieren, Keimdrüsen und Plazenta. Autoimmunkrankheit der Nebennieren (Addison's-Krankheit) ist gekennzeichnet durch starke mononukleare Zellinfiltration der Drüse, Adrenalitis und der Gegenwart von Autoantikörpern gegen Nebennierenantigene. Die Symptome sind Hyperpigmentierung, Schwäche, Müdigkeit, Anspannung, gastrointestinale Symptome und Hyperglykämie aufgrund von Nebennierenversagen. Auch hier tritt die Krankheit vorwiegend bei Frauen auf. Durch Immunofluoreszenz färben die Autoantikörper drei Lagen des Nebennierenkortex an, aber ein Untertyp kann auch mit analogen steroiderzeugenden Zellen im Eierstock, Hoden und Plazenta kreuzreagieren. Wenn diese letzteren Spezifitäten vorliegen, korrelieren sie mit präklinischem oder klinischem offenen Keimdrüsenversagen.
Schleimabsonderung. Lymphozytische Hypophysitis ist ein seltener Autoimmunzustand, der zu Hypopituitarismus führt, was eine Hormonersatztherapie erfordert. Es gibt ein Vorherrschen bei Frauen und die Krankheit zeigt sich mit einer Vielzahl von anderen organspezifischen Autoimmunphänomenen oder verbundenen Störungen. Autoantikörper gegen Prolaktin sekretierende Zellen können detektiert werden wie auch andere organspezifische Antikörper in den meisten Fällen.
Polyendokrinautoimmunität. Patienten mit organspezifischer Autoimmunkrankheit können sich mit Symptomen zeigen, die mit dem Versagen von Hormondrüsen oder anderen Zielorganen (z.B. Magen) verbunden sind. Hingegen sind Syndrome von mehrfach beeinträchtigten Organen nicht ungewöhnlich und Autoantikörper gegen nicht beeinträchtigte Organe sind auch in Patienten detektierbar, die lediglich unter einer organspezifischen Krankheit leiden. Schilddrüsen- und Gastritisautoimmunität werden häufig im selben Individuum beobachtet. Perniziöse Anämie, die aus Fundus-Gastritis resultiert, ist fünfmal häufiger in Patienten mit Thyroidstörungen und 30–50% von Patienten mit Perineumanämie haben auch eine Schilddrüsenkrankheitsgeschichte.
Verbindungen existieren auch zwischen Adrenalitis und Thyroiditis und Adrenalitis und insulinabhängiger Diabetis mellitus (IDDM). Oft beginnen Fälle mit Thyrotoxikose und Addison's Krankheit gleichzeitig und viele Patienten mit Addison's Krankheit haben wenigstens eine andere Autoimmunkrankheit. Obwohl Hypophysitis und Vitiligo (ein Zustand, welcher zu fleckenhafter Depigmentierung der Haut führt, wahrscheinlich aufgrund von Autoimmunzerstörung der verbleibenden Melanozyten) selten sind, koexistieren sie häufig mit anderen offenen organspezifischen Zuständen. Die serologischen Merkmale (das heißt die Gegenwart von zirkulierenden Autoantikörpern), welche unter diesen Autoimmunkrankheiten überlappen, ist wesentlich gewöhnlicher als die Koexistenz von sichtbarer Krankheit. Zum Beispiel liegen Parietalzellantikörper in 50% von Patienten mit Schilddrüsenstörungen und 30% von Patienten mit IDDM vor.
Gegenwärtige Kenntnis betreffend die Pathologie von IDDM
Der derzeitige Kenntnisstand betreffend die Ursachenforschung von IDDM (Typ I Diabetis) fokussiert auf die Autoimmunzerstörung von β-Inselzellen in einer Umgebung von einer Vielzahl von zirkulierenden Antikörpern, autoreaktiven T-Zellen in Zirkulation von Pankreasinseln (Insulitis) und einer Vielzahl von Cytokinen. Eine pathogene Rolle für Antikörper ist daher bei weitem nicht gezeigt worden, aber deren Gegenwart ist als vorhersagender Wert für die Identifizierung von präklinischer Diabetis gezeigt worden, speziell in den Verwandten ersten Grades von IDDM-Patienten. Konsequenterweise wird der zu IDDM führende immunologische Angriff als T-zellabhängige β-Zellzerstörung betrachtet (Tisch und McDevitt; 1996). Der Beweis, welcher diese Ansicht der Gegenwart von mononuklearen Zellinfiltraten (Insulitis) in den Inseln beim Krankheitsstart stützt (Gepts, 1965: Roep und DeVries, 1992), ist die Wirkung von immununterdrückenden Medikamenten bei der Verzögerung des Krankheitsstarts (Bougneres et al., 1988), die Zerstörung von Pankreastransplantaten bei IDDM-Patienten, verbunden mit Insulitis (Sibley et al., 1985) und Tieruntersuchungen, die zeigen, dass Milz-T-Zellen in der Lage sind, Diabetis zu übertragen und sowohl CD4- als auch CD8-T-Zellen erforderlich sind (Bendelac et al., 1987). Klonierte CD4-T-Zelllinien mit Spezifität für Inselzellantigene sind auch gezeigt worden, dass sie diabetogen sind (Haskins und McDuffie, 1992). Es gibt derzeit hingegen keinen Beweis, dass T-Zellen die anfängliche Schädigung von β-Inselzellen oder eine Indikation dahingehend hervorrufen, was das Zielantigen sein könnte.
Kürzlich hat man gezeigt, dass die Autoreaktivität von zirkulierenden T-Zellen gegen Inselzell-Antigenen nicht auf IDDM-Patienten begrenzt ist, sondern auch in gesunden altersgemischten Kontrollen vorliegt, wenn auch in geringerem Ausmaß. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass T-Zell-Autoimmunphänomene eine Konsequenz von β-Zellfehlfunktion ist, welche zu β-Zellschädigung führt.
Studien, welche die Cytokinprofile und Th1- und Th2-Gleichgewichte beim Krankheitsfortschritt in NOD-Mäusen untersuchen, haben gezeigt, dass Th1-Zellen und Th1-Typ-Cytokine beim Start von IDDM vorherrschen. Eine detaillierte Untersuchung, um die scheinbare Korrelation zwischen der Verschiebung bei den Cytokin-Gehalten und IDDM zu untersuchen, wurde ausgeführt von Shimada et al. (1996). Splenozyten, erhalten aus NOD und NOD-IA^k und BALB/c-Kontrollmäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden beim Krankheitsfortschritt getrennt, um CD45RB erniedrigte (Gedächtniszelle) CD45 + B-Zellen zu trennen; diesen wurden aktiviert mit Anti-CD3 und die freigesetzten Cytokine getestet. Ein hohes IFNγ/IL4-Verhältnis wurde in NOD-Mäusen oder genau vor dem Start von Hyperglykämie gefunden. Die Autoren schlugen vor, dass IDDM der NOD-Maus eine entzündliche Fehlfunktion der β-Zelle vorantreibt, ohne wirkliche Zerstörung der β-Zellen bis weit in den Krankheitsvorgang.
Die Fehlfunktion von β-Zellen, angezeigt durch erhöhten Serumproinsulingehalte relativ zu Insulin oder C-Peptid bemerkte man bei der klinischen Präsentation von jugendlichem IDDM (Ludvigsson und Heding, 1982). Roder et al. (1994) untersuchten 23 autoantikörperpositive Geschwister von IDDM-Patienten, welche in zwei Gruppen gemäß deren Erstphasen-Insulin-Antwort (FPIR) auf intravenöse Glukose aufgeteilt wurden. 11 Geschwister wiesen verminderte FPIRs auf und deren sich festigende Proinsulin-/Insulin- oder C-Peptidverhältnisse waren 2–3 höher als bei den verbleibenden Geschwistern, welche normale FPIRs hatten. Neun der 11 Geschwister mit niedrigen FPIRs und hohen Proinsulin-/Insulin-Verhältnissen wurden 1–28 Monate nach Testen diabetisch verglichen mit keinen unter den verbleibenden Geschwistern.
Fehlfunktion und eventuelle Zerstörung von β-Zellen ist charakteristisch für IDDM. Hingegen haben beide kürzliche gestartete- und langanhaltende Typ-I-Diabetis auch fehlerhafte Glukagon- und Epinephrin-Sekretionsantworten und hepatischen Glukose-Erzeugung bei Hypoglykämie (Kleinbaum et al. 1983). Sorgfältig kontrollierte Studien unter Verwendung einer hyperinsulinämischen Hypoglykämie-Clamp-Technik (Klemmentechnik) haben gezeigt, dass Glukagongehalte bei einer 180-Minuten-Insulin-Infusion in normalen, aber nicht diabetischen Subjekten anstiegen (Barrou et al, 1994). Die Erzeugung hepatischer Glukose beeinträchtigt auch die letztere Gruppe in ernstzunehmender Weise. Dieser Defekt bei der Gegenregulierung von Hypoglykämie ist hartnäckig gegenüber intensivem medizinischen Eingreifen bei vielen Typ-I-Diabetikern.
Obwohl es klar ist, dass die Sekretion von Glukagon bei Langzeit-Diabetikern beeinträchtigt ist, ist nicht viel über die Sekretion von Glukagon in prädiabetischen Individuen bekannt. Man zeigte Abnormitäten bei der Sekretion von Glukagon in Tiermodellen von Diabetis. Eine Untersuchung in prädiabetischen und offensichtlichen NOD-Mäusen enthüllte, dass die diabetischen Tiere beim Hungern Blutglukose und Plasmainsulingehalte normal waren, Plasmaglukagongehalte waren verglichen mit Kontrollmäusen merklich erhöht (Ohneda et al., 1984). Daher existierte eine zugrunde liegende metabolische Störung vor dem Start von Diabetis.
Glukagon, das aus pankreatischen α-Zellen sekretiert wurde, ist ein wichtiger Faktor beim Aufrechterhalten von normaler Kontrolle von Euglykämie durch Stimulation hepatischer Glukoseproduktion und auch beim Potenzieren von gukose-induzierter Insulin-Sekretion. Dies zeigte man durch einen Abfall bei der Sekretion von Insulin nach Immuno-Neutralisation von Glukagon in ausgehungerten Ratten, welche nicht durch einen Abfall von Blutglukose begleitet war (Brand et al., 1995).
Freisetzung von Insulin von FACS-getrennten einzelnen β-Zellen ist schwach in Erwiderung von der Nahrung. Dieser sekretorische Defekt kann vollständig wiederherstellt werden durch Rekombinieren der β-Zellen mit getrennten α-Zellen oder durch Zugabe von (Bu)₂ cAMP oder Glukagon (Pipeleers et al., 1985). Glukagon ist ein Hauptfaktor bei anwachsenden cAMP-Gehalten in β-Zellen (Rasmussen et al., 1990). Isolierte β-Zellen zeigen geringere Gehalte an cAMP als β-Zellen von intakten Inseln; erhöhte oder erniedrigte cAMP-Gehalte in Inseln sind parallel begleitet von steigenden oder fallenden Sekretionsantworten gegenüber Glukose (Howell et al., 1973). Die cAMP-Gehalte können durch Reaggregation mit nicht-β-Inselzellen oder Zugabe von Glukagon wiederhergestellt werden (Schuit und Pipeleers, 1985). Kompatibel mit einer direkten Wirkung von Glukagon auf β-Zellen ist der Nachweis von Glukagon-Rezeptoren an β-Zellen (Van Schravendijk et al., 1985). Man hat auch gezeigt, dass Glukagon die Amplitude von pulsartiger Freisetzung von Insulin in Erwiderung auf Glukose verstärkt, ohne die Periodizität der Sekretionspulse zu beeinträchtigen (Marchetti et al., 1994).
Da es wohl gut gesichert ist, dass der Anstieg bei cytoplasmatischen Ca²⁺-Konzentrationen essentiell für die Sekretion von Insulin ist (Prentki und Matschinsky, 1987), wurden glukagoninduzierte Anstiege bei den cAMP-Gehalten vorgeschlagen, als über erhöhte Ca²⁺-Gehalte wirkend. Komplizierte Experimente, die Ca²⁺-Transienten unter der Wirkung von photofreigesetztem intrazellulärem cAMP aus einem gesperrten Vorläufer (caged precursor) messen, zeigten, dass die Erhöhung bei Ca²⁺-Transienten für 10% des Gesamtanstieges bei Exocytose, erzeugt durch cAMP, verantwortlich war (Ammala et al., 1983). Durch ähnliche Verfahren zeigten Ammala et al., (1993) auch, dass cAMP-Exocytose bei einer Ca²⁺-Konzentration initiierte, welche selbst nicht in der Lage ist, Sekretion zu fördern und auch Exocytose bei höheren Ca²⁺-Konzentrationen verstärkt. Westerlund et al. (1997) zeigte auch, dass Sekretion von Insulin fortfuhr, pulsartig zu sein, unter Bedingungen, wenn [Ca²⁺]i stabil blieb. Diese Experimente zeigen, dass cAMP die Sensitivitätsschwelle für die Zirkulation von Ca²⁺-Kanal-Aktivierung festlegt, wodurch die Rolle von Glukagon (in ansteigenden cAMP-Gehalten in β-Zellen) von vorherrschender Bedeutung beim Kontrollieren der Amplitude von Glukose isolierten Hunger Insulin Sekretionspulsen wird.
Sekretion von Glukagon ist auch pulsartig. Storch et al., (1993) berichteten, dass die Plasmakonzentration von Glukagon in Leberzirrhose-Patienten beträchtlich in Intervallen von 4,1–6,5 Minuten variierte. In vitro perfundierte Rattenpankreas sekretierten sowohl Insulin- als auch Glukagon-Impulse von 5,6 und 6,5 Minuten jeweils; Umkehren der Richtung der Benutzung in Ratten- und Hundepankreas beeinträchtigte die Periodizität der Hormonsekretion nicht (Stagner und Samols, 1988). Dies verneint die direkte Möglichkeit, dass direkte intrainsuläre hormonelle Wechselwirkung oder ein hormonsensitivier Rezeptormechanismus für die Periodizität der Sekretion verantwortlich ist. Einzelne Mausinseln sekretieren Insulin in Erwiderung auf Glukose-Stimulation durch sowohl langsame als auch schnelle Oszillationspulse (Bergsten et al., 1994). Der Mechanismus daher für pulsartige Insulinsekretion liegt innerhalb von individuellen Inseln (dies ist unterschiedlich von [Ca²⁺]i-Transienten, gezeigt durch Experimente, die die Aktivierung von Proteinkinase C involvieren, welche die Amplitude von Oszillationen erhöhte, ohne deren Frequenz oder Wechsel beim [Ca²⁺]i zu beeinträchtigen (Deeney et al., 1996). Diese Berichte zeigen, dass der Schrittmacher für Pulsartigkeit von Insulin- und Glukagon-Sekretion innerhalb der Inseln lokalisiert ist und unabhängig von extrinsischer Innervation und direkter hormoneller Wechselwirkung ist. Dies ist auch bei Menschen durch den Nachweis von sowohl Niedrig- als auch Hochfrequenz-Pulsartigkeiten bei erfolgreichen Pankreastransplantationen gezeigt worden (Sonnenberg et al., 1992).
Die Rolle des Schrittmachers bei NIDDM
Beta-Zellfehlfunktion ist vorherrschend in Typ-2-nichtinsulinabhängiger Diabetis (NIDDM), welche eine Krankheit ist, die auch Insulinresistenz involviert. Die relative Bedeutung dieser beiden Verbindungen ist kontrovers. Frühzeitig bei der Krankheit gibt es eine markante Unterbrechung bei pulsartiger Sekretion von Insulin mit Verlust der Hochfrequenzpulse und Verminderung bei der Amplitude von langsamen Oszillationen (Leahy, 1990; Guillausseau, 1994). Der Verlust pulsartiger Sekretion kann ein wichtiger potenzieller Beitrag zu Insulinresistenz sein. Zahlreiche Studien, die man entworfen hat, um Vorhersagen für die Entwicklung von NIDDM zu identifizieren, führten dazu, dass β-Zellfehlfunktion eher als Insulinresistenz der Hauptfaktor ist, welcher NIDDM prädisponiert (Pimenta et al., 1995; Davis et al., 1995; Nijpels et al., 1996). Der Grund von NIDDM muss daher mit dem Ereignis verbunden sein, das die Fehlfunktion induziert. Es wird hier vorgeschlagen, dass die Fehlfunktion die Folge der Unterbrechung des Schrittmachers ist, welcher die pulsartige Sekretion von sowohl Insulin als auch Glukagon aufrechterhält.
Parksen et al. (1995) haben den Beitrag von pulsartiger gegenüber basaler Insulinsekretion in über Nacht gehungertem Hund untersucht und haben gezeigt, dass die Mehrheit an Insulin (70%) als Pulse sekretiert wurden. Die Unterbrechung dieses Systems würde daher eine Haupteinwirkung auf die Gesamt-Insulinsekretion haben.
Die natürliche Geschichte von β-Zellfehlfunktion, welche IDDM vorangeht, ist schwieriger zu untersuchen auf Grund der abrupten oder destruktiven Natur der Krankheit bei Diagnose. O'Meara et al., (1995) waren hingegen in der Lage, ein Individuum über einen 13-Monats-Zeitraum zu untersuchen, der zur Entwicklung von IDDM führte. Beim Hungern waren Konzentrationen von Glukose und glykosyliertem Hämoglobin noch im normalen Bereich, Insulinantworten gegenüber intravenöser Glukose waren vermindert. Das Oszillations-Sekretionsmuster wurde bewahrt, aber Sekretionsantworten waren vermindert.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Konzept bezüglich des Grunds von Autoimmunkrankheiten und beschreibt spezifisch seine Anwendung auf Typ-1- und 2-Diabetis als Veranschaulichung und nicht als eine Begrenzung. Die vorliegende Erfindung ergibt monoklonale oder polyklonale Antikörper oder funktionell äquivalente Fragmente davon mit Reaktivität gegen ein gemeinsames Epitop an einem Anti-TCR-Vβ-Antikörper und einer oder mehreren Gruppen von Molekülen, die aus einer Glykosyl-Phosphatidyl-Insitol-verknüpften (GPI-verknüpfter) TCR-Vβ-Kette bestehen; ein Phospholipid wie Phosphatidyl Inositol, Phosphatidyl Serin oder Cardiolipin, ein Phospholipid Glykan; Einzelstrang-DNA und Doppelstrang-DNA zur Verwendung als Medikament oder diagnostisches Mittel. Die Erfindung ergibt auch die Verwendung dieser Antikörper bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von IDDM, NIDDM oder organ- oder nicht organspezifischer Autoimmunität und verbunden Krankheiten. Bevorzugt wird ein monoklonaler Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet.
Im Hinblick auf Diabetis impliziert die Erfindung die Fehlregulierung von α-Zellfunktion durch neu identifizierte Autoantikörper mit ähnlicher Spezifität wie der monoklonale Antikörper als Hauptfaktor des diabetogenen Prozesses. Um dieses neue Konzept zu substantiieren, zeigt die Erfindung, dass die monoklonalen Antikörper ein gemeinsames Epitop an einem Set von Signalmolekülen an β-Zellen erkennen (welche als Schrittmacher bei den Inseln wirken können), welche Ziele der pathogenen Antikörper sind.
Die Erfindung ergibt auch die Detektion der Antikörper und führt weiterhin die Verwendung dieser und der erwähnten MoAbs in prophylaktischen und therapeutischen Eingriffen bei Autoimmunität und verbundenen Krankheiten, einschließlich IDDM und NIDDM aus.
Die monoklonalen Antikörper fehlregulierten Insulinsekretion aus menschlichen Inselzellkulturen (siehe im Experimentalteil für Details und Tabelle 1). Sie wurden auf α-Zellen durch gleichzeitiges Anfärben von Pankreasschnitten mit den MoAbs (IgM) und Antiglukagon MoAbs (IgG), Bindungsdetektieren mit fluoreszierendem Anti-Maus-IgM und rhodaminiertem Anti-Maus-IgG jeweils lokalisiert, wobei die Anfärbemuster der Antikörper identisch waren, was zeigt, dass beide dieselben Glukagon erzeugenden α-Zellen anfärbten.
Man vermutet, dass die Einwirkung der pathogenen Antikörper auf die α-Zellen einen Verlust von sowohl Glukose-Gegenregulations-Ansprechen als auch Feinabstimmung von Insulinsekretion hervorruft. Die Fehlregulation von Insulinsekretion führt entweder zum β-Zelltod, was zu IDDM oder anhaltendem Überleben der β-Zelle in fehlreguliertem Stadium führt, was zu NIDDM führt. Diese beiden Ausgänge sind abhängig von der genetischen Neigung des Individuums. Bei IDDM ist die T-Zell-Sensitivierung sekundär gegenüber β-Zellschädigung und kann den Tod der verbleibenden β-Zellen beschleunigen. Hingegen wünscht die Anmelderin, nicht an diese Theorie gebunden zu sein. Die MoAbs, welche die α-Zell-Moleküle identifizierten, wurden angezogen durch Immunisieren von Mäusen mit Anti-TCR-Vβ-monoklonalen Antikörpern, wie unten im Experimentalteil beschrieben. Monoklonale Antikörper, erzeugt aus resultierenden Klonen hatten entweder das Anti-Vβ-Immunogen allein oder erkannten das Immunogen und Phosphatidyl Inositol, Phosphatidyl Serin, Cardiolipin (Diacylglcyerol) und doppelsträngige und einzelsträngige DNA. Diese letzteren monoklonalen erkannten auch menschliche Pankreas α-Zellen (1), Follikelzellen der Schilddrüse (2), Zellen der Nebennieren-Medulla (3), Magen- und Darmtrakt (4), Magen, Speicheldrüsen, Eierstöcke, gestreiften Muskel, Bindegewebe, welche hier nur beispielhaft und nicht als Begrenzung angegeben sind.
Die Erfindung ermöglicht die Identifizierung von funktionell äquivalenten Liganden. Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck „funktionelles Äquivalent" gemeint als Verbindungen beschreibend, die die gewünschte Bindungsstelle bearbeiten und schließt jedes Makromolekül oder Moleküleinheit ein, die an Anti-TCR-Vβ-Antikörper mit einer Dissoziations-Konstante von 10^–4 M oder weniger, vorzugsweise 10^–7 M oder weniger, am bevorzugtesten 10^–9 M oder weniger, bindet und die eine äquivalente Formkomplementarität zu jener durch die Bindungsstellen der Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörper prozessierten aufweist, die hierin identifiziert sind.
Derzeitige Verfahren zur Erzeugung von Verbindungen mit Affinität für ein Molekül von Interesse waren bis vor kurzem relativ einfach. Die Absicht der kombinatorischen Chemie und die Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken wurden hingegen unter großer Geschwindigkeit entwickelt und erleichterten das rationelle Design und die Verbesserung von Molekülen mit gewünschten Eigenschaften. Diese Techniken können verwendet werden, um Moleküle zu erzeugen, die Bindungsstellen erzeugen, welche identisch oder ähnlich jenen der hierin identifizierten Antikörper sind.
Solche Verbindungen kann man durch rationales Design unter Verwendung von zum Beispiel Standardsynthesetechniken in Kombination mit molekularem Modellieren und Computer-Visualisierungsprogrammen erzeugen. Unter diesen Techniken ist die „Leit"-Verbindung mit einem ähnlichen Gerüst zur Antikörper-Bindungstelle optimiert durch Kombinieren einer Vielzahl von Gerüsten und Verbindungs-Substituenten.
Alternativ oder als ein Schritt beim strukturgeführten Design einer Moleküleinheit kann man kombinatorische Chemie verwenden, um die Struktur von Verbindungen zu erzeugen oder zu verfeinern, welche die relevante Bindungsstelle durch die Herstellung von kongenerischen kombinatorischen Bereichen um ein Gerüstnetzwerk nachahmen. Diese Schritte können Standard-Peptid oder Organomolekülsynthesen mit einer Festphasen-Abspaltung einschließen und Prozesse oder parallel kombinatorische Synthesen von Einheiten zu rekombinieren unter Verwendung von entweder Festphasen- oder Lösungstechniken (siehe zum Beispiel Hogen 1997 und darin genannte Referenzen).
Alternativ oder als ein Teil eines Moleküls wie oben beschrieben, können funktionelle äquivalente Fragmente oder Varianten der identifizierten Antikörper oder eng verbundenen Proteine umfassen, welche signifikante Sequenzhomologie zeigen. Die vorliegende Erfindung ergibt Fragmente der monoklonalen und polyklonalen Antikörper der Erfindung. Unter Fragmenten versteht man jeden Teil der Gesamtproteinsequenz, welcher das Vermögen beibehält, an einen Anti-TCR-Vβ-Antikörper mit einer Dissoziationskonstante von 10^–4 M oder weniger, vorzugsweise 10^–7 M oder weniger, am bevorzugtesten 10^–9 M oder weniger zu binden. Demgemäß bilden Fragmente, die Einzel- oder Mehrfachaminosäurendeletionen aus entweder dem Endteil des Proteins oder inneren Breichen der Primäraminosäuresequenz enthalten, einen ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung. Varianten können zum Beispiel Mutanten einschließen, die Aminosäuresubstitutionen, Insertionen oder Deletionen aus der Wildtyp-Sequenz des Antikörpers enthaften.
Biologisch aktive Peptide mit Bindungsstellen, welche die hierin beschriebenen Antikörper nachahmen, können erzeugt werden unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Nukleinsäuren, die Aminosäurereste kodieren, identifiziert als Teilnehmer an der Bindungsstelle, zusammen mit Nukleinsäuren, die die umgebenden Gerüstreste kodieren, können fusioniert werden, um eine Polypeptideinheit zwischen 10 und 1000 Resten, vorzugsweise zwischen 25 und 100 Resten zu bilden. Die Fusion dieses Nukleinsäurefragments mit einem kodierenden Phagenprotein, zum Beispiel pIII des Bakteriophagen fd, kann das Fusionsmolekül auf der Phagenoberfläche gezeigt werden. Screening der Phagenbibliothek mit Anti-TCR-Vβ-Antikörper wird dann die interessierenden Klone identifizieren. Diese Klone können dann iterativen Runden von Mutagenese und Screening unterzogen werden, um die Affinität von den generierten Molekülen für deren Ziel zu verbessern.
Die Antikörper oder funktionell äquivalenten Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung können von Wirbeltier- oder Nicht-Wirbeltier-Ursprung sein. Vorzugsweise werden die Antikörper abgeleitet von B-Zellen, die durch Epstein-Barr-Virus-Umformung oder anderen Verfahren unter Verwendung von B-Zellen immortalisiert worden sind, welche von gesunden oder kranken Menschen oder Tieren erhalten sind.
Den Antikörper oder das Fragment davon kann man isolieren durch Überführen von Körperfluid von Tieren oder Menschen über eine antigenkonjugierte Säule. Die Tiere können vorher mit Antigen immunisiert worden sein, möglicherweise krank oder manipuliert durch ein Medikament oder Diät, um eine Krankheit zu entwickeln.
Verschiedene Moleküle werden erkannt durch Anti-Anti-Vβ-monoklonale Antikörper und wurden identifiziert durch Screening einer humanen Pankreas λgt11-cDNA-Bibliothek. Acht cDNA-Klone wurden gereinigt und sequenziert. Die Klone 1.1, 1.2 und 1.3 kodieren für ein Secretogranin-1-artiges Protein; Klone 3.1, 4.1 und 5.1 kodierten für ein 67 kd laminrezeptorartiges Protein; Klon 5.2 kodierte für ein neues Molekül, das der Erfinder ESRP 1 genannt hat (endocrine secretion regulatory protein 1). Klon 5.3 kodierte für ein humanes Zymogengranulum GP-2-Proteinartiges Protein.
Die vereinigenden Merkmale all dieser Moleküle bestehen darin, dass sie an die Zellmembran über einen neuen Glykodylphosphatidylinositolanker (GPI) verknüpft sind. Die Regulation und Expression von GPI verknüpften Molekülen an Zelloberflächen ist beschrieben worden (Low, 1989, Udenfried und Kodukula, 1995). Diese Acylreste sind sensitiv gegenüber Insulineinwirkung über insulinaktivierten Phospohlipasen (Chan et al. 1988). Die Abspaltungsprodukte dieser Moleküle werden internalisiert durch die α-Zellen und hier postuliert als die Wechselwirkung von Glukagon regulierend. Die Moleküle erfordern Zeit, um resynthetisiert und reexprimiert zu werden an der Membran, welche für die Periodizität der Glukagon-Sekretion und so die pulsartige Sekretion von sowohl Glukagon als auch Insulin verantwortlich ist. Dieser Mechanismustyp kann für den Schrittmacher der Inseln verantwortlich sein. Antikörper, welche an die Region an diesen Molekülen binden, welche enzymatischer Spaltung unterliegen, können mit der Wirkung des Enzyms wechselwirken und dadurch die Regulation von Glukagon- und Insulinsekretion unterbrechen.
Es gibt verschiedene Mechanismen, durch welche Antikörper, welche ähnliche Spezifität haben, physiologisch in Menschen auftreten können. Zunächst können Umweltursachen wie Infektionen oder Superantigene klonale Expansion von T-Zellen induzieren und während dieser Fortpflanzungsphase werden abnormal entwickelte partielle TCR-Komplexe intrazellulär zurückgehalten und degradiert. T-Zellen können unter bestimmten Bedingungen Apoptose erleiden und abgebaute TCR-Produkte freisetzen, welche immunogen sein können und die Kaskade von Anti-Vβ und Anti-Anti-Vβ, Netzwerk von Antikörper-Produktion, auslösen. Zweitens ist durch Bell et al. (1994) berichtet worden, dass ein Signalpeptid für eine GPI-Anker-Anheftung in der TCR-β-Kettenpolypeptidsequenz vorliegt und dass TCR-β-Ketten, welchen cytoplasmatische Schwanzsequenz fehlt, exprimiert werden auf einer reifen T-Zell-Hybridomalinie als ein GPI verankertes monomeres Polypeptid in Abwesenheit von TCRα. GPI-verknüpfte TCR-β-Ketten detektierte man TCR-β transgenen Mäusen, aber nicht normalen Mäusen; daher kann die abnormale Expression solcher Vβ-Ketten eine Kaskade von Antworten des Netzwerks induzieren, welche in Antikörpern ähnlicher Spezifität gegen Anti-Anti-Vβ-Reagenzien resultiert. Solche Antikörper wurden detektiert in humanem Serum in einer anderen Ausführung der Erfindung (siehe Tabelle 2 im Experimentalteil).
Wie in dieser Beschreibung verwendet, versteht man den Ausdruck „organspezifische oder nicht organspezifische Autoimmunkrankheit" als IDDM, NIDDM, Autoimmunkrankheiten der Schilddrüse, Nebennierendrüse, Keimdrüsen, Magen und Schleimdrüse, systemischen Lupus erythematodes, systemische Sklerose und Sjögren-Syndrom einschließend. „Kardiovaskuläre Krankheit" ist gemeint als Herzinfarkt und Schlagadererkrankung, makro- und mikrovaskuläre Angina, periphere vaskuläre Krankheit, Atherosklerose und Bluthochdruck einschließend. „Krebs" ist gemeint als Brust-, Colorektal-, Magen-, Endometrial-, Prostata-, Kopf- und Hals-, Lungen-, Sarkomkrebs einschließend. „Andere Krankheiten" sind gemeint als polyzystisches Eierstocksyndrom, Fettleibigkeit, Cushing-Syndrom und metabolisches Syndrom X einschließend. Diese Krankheiten sind als Beispiele und nicht Begrenzungen angegeben.
Für viele Anwendungen kann ein Antikörper oder äquivalenter Ligand wie hierin beschrieben fusioniert werden an ein Effektor- oder Reportermolekül wie eine Markierung, Toxin oder bioaktives Molekül. Die Erfindung beabsichtigt auch einen Antikörper oder äquivalenten Liganden wie hierin beschrieben, welcher chemisch modifziert ist, gebunden an eine biologische oder synthetische Substanz oder konjugiert an ein Enzym, eine Indikatorverbindung, ein Medikament, ein Toxin oder eine Radioaktiv-Markierung zur Verwendung als Medikament oder diagnostisches Reagens.
Geeignete Markierungen werden Fachleuten wohlbekannt sein. Zum Beispiel können solche Markierungen ein zusätzliches Protein oder Polypeptid verschmolzen mit einem Antikörper, Fragment davon oder äquivalentem Liganden an seinem Amino- oder Carboxyterminus oder intern angefügt umfassen. Der Zweck des zusätzlichen Polypeptids kann darin bestehen, die Detektion oder Expression, Trennung oder Reinigung des Antikörpers, Fragments davon oder äquivalenten Liganden zu unterstützen und kann darin bestehen, zusätzliche Eigenschaften des Antikörpers, Fragment davon oder äquivalentem Liganden wie gewünscht zu verleihen.
Insbesondere geeignete Kandidaten zur Fusion werden Reportermoleküle wie Luciferase, Grünfluoreszenzprotein oder Meerrettichperoxidase sein. Markierungen der Wahl können Radiomarkierungen oder Moleküle sein, die spektroskopisch detektierbar sind wie zum Beispiel fluoreszierende oder phosphoreszierende chemische Gruppen. Verknüpfermoleküle wie Streptavidin oder Biotin können auch verwendet werden. Zusätzlich können andere Peptide oder Polypeptide als Kandidaten für Fusion verwendet werden. Geeignete Peptide können zum Beispiel β-Galaktosidase, Glutathion-S-Transferase, Luciferase, Polyhistidinschwänze, Sekretionssignalpeptide, die Fc-Region eines Antikörpers, das FLAG-Peptid, Zellulosebindungsdomänen, Calmodulin und das Maltosebindungsprotein sein.
Diese Fusionsmoleküle können chemisch unter Verwendung von Verfahren wie chemischem Kreuzvernetzen fusioniert werden. Geeignete Verfahren werden Fachleuten wohlbekannt sein und können zum Beispiel Kreuzvernetzung von Thiolgruppen, von Cysteinresten oder Kreuzvernetzung unter Verwendung von Formaldehyden sein. Man verwendet chemische Kreuzvernetzung in den meisten Fällen, um nicht-Proteinverbindungen wie zyklische Peptide oder Markierungen zu verschmelzen.
Wenn man wünscht, zwei oder mehr Proteinmoleküle zu fusionieren, wird das Verfahren der Wahl oft darin bestehen, die Moleküle genetisch zu fusionieren. Um ein rekombinantes Fusionsprotein zu erzeugen, werden die Gene oder Genteile, welche die Proteine oder Proteinfragmente von Interesse kodieren, so gebaut, dass sie ein aneinander liegendes Gen bilden, das so angeordnet ist, dass die Codons der beiden Gensequenzen in einem Raster transkribiert werden.
Die hier beschriebenen Verbindungen kann man an einen Träger binden, den man verwendet, um Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörper aus Körpergewebe zu entfernen, zu isolieren oder zu extrahieren. Der Träger kann jedes geeignete Inertmaterial umfassen und schließt Gele, magnetische oder andere Träger, Mikrokugeln, Bindungssäulen und Harze ein.
Protein- oder Peptidverbindungen, die hier beschrieben sind, werden vorzugsweise in rekombinanter Form durch Expression der kodierenden DNA in einem Expressionsvektor in einer Wirtszelle exprimiert werden. Solche Expressionsverfahren sind Fachleuten wohlbekannt und viele sind detailliert beschrieben in DANN cloning a practical approach, Volume II: Expression systems, herausgegeben von D. M. Glover (IRL Press, 1995) oder in DNA cloning: a practical approach, Volume IV: Mammalian systems, herausgegeben von D. M. Glover (IRL Press, 1995). Proteinverbindungen können unter Verwendung von bekannten Techniken von genetischem Engineering wie ortsspezifischer zufälliger Mutagenese hergestellt werden wie zum Beispiel beschrieben in Molecular Cloning: a Lobaratory Manual: 2. Aufl., (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) oder in Protein Engineering: A practical appraoch (edited by A. R. Rees et al., IRL Press 1993).
Geeignete Expressionsvektoren kann man für den Wirt der Wahl wählen. Der Vektor kann ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das Verbindungen kodiert, die hier beschrieben sind, operativ verknüpft mit einer Expressionskontrollsequenz oder ein rekombinantes DNA-Klonierungsvehikel oder Vektor, der solch ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, unter der Kontrolle eines Promoters, der von der Transkriptionsmaschinerie des Wirts erkannt wird.
Geeignete Wirte umfassen gewöhnlich verwendete prokaryotische Spezies wie E. coli oder eukaryotische Hefen, welche man herstellen kann, um hohe Gehalte von rekombinanten Proteinen zu exprimieren und welche leicht in großen Mengen angezogen werden können. Säugetierzelllinien, die in vitro angezogen werden, sind auch geeignet, insbesondere bei Verwendung von virusgetriebenen Expressionssystemen wie dem Baculovirus-Expressionssystem, welches die Verwendung von Insektenzellen als Wirte umfasst. Verbindungen kann man auch in vivo exprimieren, zum Beispiel in Insektenlarven oder in Säugetiergewebe.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung geliefert, die einen monoklonalen Antikörper oder Fragment davon mit Reaktivität gegen ein gemeinsames Epitop an einem Anti-TCR-Vβ-Antikörper und eines oder mehrere aus der Gruppe von Molekülen, bestehend aus einer GPI-verknüpften TCR-Vβ-Kette, einem Phospholipid wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin; einem Phospholipidglykan, Einzelstrang-DNA und Doppelstrang-DNA in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff. Geeignete Hilfsstoffe werden Fachleuten wohlbekannt sein und können zum Beispiel umfassen eine phosphatgepufferte Salzlösung (0,01 M Phosphatsalze, 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl, pH 7,4). Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch zusätzliche Konservierungsstoffe enthalten, um eine lange Lagerfähigkeit zu gewährleisten.
Der monoklonale oder polyklonale Antikörper oder ein Fragment davon mit Reaktivität gegen ein gemeinsames Epiotop an einem Anti-TCR-Vβ-Antikörper und einer oder mehrerer aus der Gruppe von Molekülen, bestehend aus GPI-verknüpften TCR-Vβ-Kette, einem Phospholipid wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin, einem Phospholipidglykan, Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA können eine einzige aktive Komponente der Zusammensetzung bilden oder können Teil einer therapeutischen Packung zur topischen (wie als Creme), oralen oder parenteralen Verabreichung bilden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Antikörpers oder Fragments davon mit Reaktivität gegen ein gemeinsames Epitop eines Anti-TCR-Vβ-Antikörpers bereitgestellt und einem oder mehr aus der Gruppe von Molekülen, bestehend aus einer GPI-verknüpften TCR-Vβ-Kette, einem Phospholipid wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin, einem Phospholipidglykan, Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von IDDM, NIDDM oder anderen organ- oder nicht organspezifischen Autoimmunkrankheit, kardiovaskulären Krankheit, Krebskachexie und Krebs oder jeder anderen Krankheit, wo Anti-Phospholipid-Antikörper und/oder Hyperinsulinämie und Insulinresistenz vorliegen.
Gemäß einer weiteren Ausführung der Erfindung stellt man ein Verfahren zur Detektion von natürlich auftretendem Autoantikörper bereit, umfassend das Kontaktieren einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe oder anderen Körperfluids mit einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder Fragment gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung und mit Zielmolekülen und Einschätzung der Menge des natürlich vorkommenden Antikörpers, der spezifisch an die Zielmoleküle bindet. Der monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragment davon können markiert werden zum Beispiel mit einem Enzym, so dass der markierte Antikörper oder Fragment mit den Autoantikörpern der Zielmoleküle kompetitiert, um Komplexe zu bilden. Die Menge an die Komplexe gebundener Markierung ist dadurch umgekehrt proportional zur Konzentration von Autoantikörpern, die in der Probe vorliegen. Wenn markiert mit einem Enzym, wird die Bildung der Komplexe die Aktivität des Enzyms so inhibieren oder inaktivieren, dass der Inhibitions- oder Aktivierungsgrad umgekehrt proportional zur Konzentration von Autoantikörpern ist, welche in der Probe vorliegen.
Unter einem Aspekt dieser Erfindung wird das Zielmolekül, welches zum Beispiel an ein Anti-TCR-Vβ-polyklonales oder -monoklonales Immunoglobulinmolekül oder Teil davon gebunden werden kann, welcher wenigstens ein Epitop an T-Zell-Rezeptor-β-Ketten in Menschen oder einer anderen Tierspezies identifiziert, an ein Enzym gebunden, das mit einem Substrat verknüpft ist, derart, dass das Binden des Antikörpers an die Zielmoleküle das Enzym aktiviert und eine Farbänderung hervorruft, die spektrophotometrisch messbar ist. Die Zielmoleküle können an ein Enzym gebunden werden, das mit dem Substrat verknüpft ist oder an einem Messstab vorliegen, welcher mit der Probe kontaktiert werden kann.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Antikörpers oder Fragments davon mit Reaktivität gegen ein gemeinsames Epitop an einem Anti-TCR-Vβ-Antikörper und eines oder mehrere aus der Gruppe von Molekülen, bestehend aus einer GPI-verknüpften TCR-Vβ-Kette, einem Phospholipid wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin, einem Phospholipidglykan, Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA als Bestandteil in einem Kit zur Detektion oder Quantifizierung von Gehalten von natürlich auftretenden Antikörpern in einem Patienten. Solch ein Kit wird einem Radioimmuntest- oder ELISA-Kit ähneln und würde zusätzlich Detektionsmittel umfassen, welche die akkurate Quantifizierung der Verbindung von Interesse erlauben. Solche Verfahren werden Fachleuten offensichtlich sein.
Der Antikörper oder Fragment davon können an Magnetträger, Agaroseträger gebunden sein oder können befestigt werden am Boden einer Mehrlochplatte. Dies wird das Entfernen der ungebundenen Verbindungen von der Probe nach Inkubierung erlauben. Alternativ kann das Protein an SPA-Perlen (Szintillations-Nachbarschafts-Assay, scintillation proximity assay) gebunden sein, in welchem Fall kein Bedarf besteht, ungebundenen Liganden zu entfernen. Unter Verwendung eines Sets von unmarkierten Standards können die mit diesen Standards erhaltenen Ergebnisse verglichen werden mit Ergebnissen, die mit der zu messenden Probe erhalten werden.
Der Antikörper oder Fragment davon mit Reaktivität gegen ein gemeinsames Epitop an einem Anti-TCR-Vβ-Antikörper oder einem oder mehreren aus der Gruppe von Molekülen, bestehend aus einer GPI-verknüpften TCR-Vβ-Kette oder einem Phospholipid wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin, einem Phospholipidglykan, Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA können auch zur Detektion von natürlich vorkommenden Antikörpern in Gewebe von einem Patienten verwendet werden. jede gewöhnliche Technik im Stand der Technik kann verwendet werden in einem solchen Detektionsverfahren und kann die Verwendung von Blot-Techniken (Towbin et al., 1979), Bindungssäulen, Gelretardation, Chromatographie und einer oder mehreren Verfahren umfassen, die im Stand der Technik weit verbreitet sind.
Die Erfindung ergibt auch eine cDNA-, RNA- oder genomische DNA-Sequenz, umfassend eine Sequenz, die einen Antikörper oder Fragment davon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung kodiert zur Verwendung als Medikament oder diagnostisches Mittel.
Unter „im Wesentlichen homolog" sind hier Sequenzen gemeint, die wenigstens 50% Sequenzhomologie, vorzugsweise 60% Sequenzhomologie zeigen. „Hybridisierende Sequenzen", die im Bereich der Erfindung eingeschlossen sind, sind solche, die unter Standard nicht-stringenten Bedingungen (6 × SSC/50% Formamid bei Raumtemperatur) binden und unter Konzentration von niedriger Stringenz (2 × SSC, Raumtemperatur oder 2 × SSC, 42°C) oder vorzugsweise unter Standardbedingungen von hoher Stringenz, zum Beispiel 0,1 × SSC, 65°C (worin SSC = 0,15 M NaCl 0,015 M Natriumcitrat, pH 7.2) gewaschen werden.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann Einzel- oder Doppelstrang-DNA, cDNA oder RNA sein. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäuresequenz DNA.
Die Erfindung schließt auch Klonierungs- und Expressionsvektoren ein, die DNA-Sequenzen der Erfindung enthalten. Solche Expressionsvektoren werden die geeigneten Transkriptions- und Translationskontrollsegeuenzen enthalten, zum Beispiel Verstärkerelemente, Promotor-Operator-Regionen, Terminierungs- Stopsequenzen, mRNA-Stabilitätssequenzen, Start- und Stopsequenzen oder ribosomale Bindungsstellen, die im Raster mit dem Nukleinsäuremolekül der Erfindung verknüpft sind.
Zusätzlich in Abwesenheit eines natürlichen effizienten Signalpeptids in der Proteinsequenz kann es passend sein, das rekombinante Protein zu veranlassen, aus bestimmten Wirten sekretiert zu werden. Demgemäß umfassen weitere Verbindungen solcher Vektoren Nukleinsäuresequenzen, die Sekretionssignal- und Bearbeitungssequenzen umfassen.
Die Vektoren gemäß der Erfindung umfassen Plasmide und Viren (einschließlich Bakteriophagen und eukaryotischer Viren). Viele solcher Vektoren und Expressionssysteme sind wohlbekannt und im Stand der Technik dokumentiert. Insbesondere geeignete virale Vektoren umfassen Baculovirus-, Adenovirus- und Vaccinia-Virus-basierte Vektoren.
Die Expression von heterologen Peptiden und Polypeptidfragmenten in prokaryotischen Zellen wie E. coli ist wohl etabliert im Stand der Technik; siehe zum Beispiel Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2. Auflage, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press oder DNA cloning: a practical approach, Volume II: Expression system verlegt von D. M. Glover (IRL Press, 1995). Die Expression in eukaryotischen Zellen in Kultur ist auch eine verfügbare Option für Fachleute zur Herstellung von heterologen Proteinen, siehe zum Beispiel O'Reilly et al., (1994) Baculovirus expression vectors – a laboratory manual (Oxford University Press) oder DNA cloning: a practical approach, Volume IV: Mammalian systems, verlegt von D. M. Glover (IRL Press, 1995).
Geeignete Vektoren können gewählt oder konstruiert werden zur Expression von Peptiden oder Proteinen, die geeignet sind zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, enthaltend die geeigneten Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Verstärkersequenzen, Markergenen und anderen Sequenzen wie geeignet. Vektoren können Plasmide, virale Vektoren, zum Beispiel Bakteriophage oder Phagemid, wie geeignet sein. Weitere Details siehe Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Handhabung von Nukleinsäuren, zum Beispiel bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, Analysen von Proteinen sind detailliert beschrieben in Short Protocols in Molecular Biology, 2. Auflage, Ausubel et al., eds., (John Wiley & Sons, 1992) oder Protein Engineering: A practical approach (verlegt von A. R. Rees et al., IRL Press 1993). Zum Beispiel in eukaryotischen Zellen sind die Vektoren der Wahl virusbasiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ergibt eine Wirtszelle, die einen Antikörper oder Fragment davon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung enthält. Ein noch weiterer Aspekt ergibt ein Verfahren, umfassend die Einführung solch einer Aminosäure in eine Wirtszelle oder Organismus. Die Einführung einer Aminosäure kann jede verfügbare Technik einsetzen. In eukaryotischen Zellen können geeignete Techniken Kalziumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation liposomvermittelte Transfektion oder Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder anderen Viren wie Vaccinia-Virus oder für Insektenzellen Baculovirus umfassen. In Bakterienzellen können geeignete Techniken Kalziumchloridtransformation, Elektroporation oder Transfektion unter Verwendung von Bakteriophagen einschließen.
Die Einführung der Nukleinsäure kann gefolgt sein durch Hervorrufen oder Zulassen von Expression von Nukleinsäure, zum Beispiel durch Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen zur Expression des Gens.
In einer Ausführung wird die Nukleinsäure der Erfindung in das Genom (zum Beispiel Chromosom) der Wirtszelle integriert. Die Integration kann durch ein Einschluss von Sequenzen gefördert werden, welche die Rekombination mit dem Genom in Übereinstimmung mit den Standardtechniken fördern.
Therapeutische Implikationen der Erfindung und Anwendungen auf unbeantwortete Fragen bei Diabetis:
Das Folgende wird exemplarisch und nicht als Begrenzung angegeben.
Beeinträchtige Glukose-Gegenregulation
Ein Hauptproblem bei der Handhabung von IDDM-Patienten ist das Auftreten von Hypoglykämie, welche teilweise iatrogen ist auf Grund intensiver Insulin-Behandlung, welche zu Hypoglykämie-Unbewusstsein führt, aber ist hauptsächlich geschädigter Glukose-Genregulation zuzuschreiben. Schadhafte Glukose-Gegenregulation ist das Ergebnis von kombinierten Fehlern der Glukagon- und Epinephrinantworten auf fallende Glukosegehalte. Man hat gezeigt, dass bedenkliches Vermeiden von Hypoglykämie umkehren kann, aber nicht defiziente Gegenregulation (Cryer, 1995).
Nicht nur langwierige, aber auch neu diagnostizierte IDDM-Patienten haben beeinträchtigte Gegenregulation. Ein Vergleich von Gegenregulationsantworten in zwanzig Kindern mit neu gestartetem IDDM (5–6 Tage) und 47 Kindern mit langanhaltender IDDM zeigte, dass Glukagonantworten auf Hypoglykämie in beiden Gruppen niedriger waren als in Kontrollsubjekten. Epinephrinantworten wurden auch vermindert in neuen IDDM-Patienten verglichen mit Kontrollen (Hoffman et al., 1994).
Es wird hierin vorgeschlagen, dass der Grund für diese Gegenregulationsdefekte das Vorherrschen von Auto-Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörpern in IDDM-Patienten ist, was die Herunterregulierung von Signalmolekülen hervorruft, die oben beschrieben sind und die Beseitigung der Antwort auf α-Zellen und Nebennieren-medulla-Zellen auf fallende Glukosegehalte. Dies ist in Übereinstimmung mit der Beobachtung des Verlustes von Anti-Anti-Vβ-Anfärbung von Pankreasschnitten aus neu diagnostiziertem diabetischen Patient, welcher zufällig starb (siehe Experimentalteil Seite 40). Es ist auch analog zu den Befunden von Brett et al. (1996), dass die Behandlung rheumatoider Arthritispatienten mit Campath-1H, welches gegen GPI-verknüpftes CD52-Protein ist, zum Verschwinden von VD52 und anderen GPI-verknüpften Proteinen an sowohl T-Zellen als auch B-Zellen von einigen der behandelten Patienten führte. Die CD52-negativen B-Zellen verschwanden aus dem Kreislauf innerhalb von 3 Monaten, hingegen bestanden die CD52-negativen T-Zellen für mindestens 20 Monate weiter. Die Verhinderung der Fortpflanzung dieser Antikörper in IDDM-Patienten sollte daher die Gegenregulationsdefekte, welche Hypoglykämie verhindern, verbessern. Blockieren von Entwicklung von der Geburt sollte IDDM in geeigneten Individuen verhindern. NIDDM sollte vollständig geheilt werden. Dies wird durch ein Verfahren analog zur Verabreichung von Anti-D Immunoglobulin (Anti-d Ig) an Rh-negative Mütter erzielt, die Rh-positive Föten tragen (Davey, 1979). Mögliche Mechanismen, welche beim Blockieren der Antikörperproduktion in diesen Therapietyp involviert sind, werden diskutiert von Heyman (1990). Als weitere Maßnahme sollte das Immunisieren von Individuen mit pathogenen Antikörpern schützende antiidiotype Antikörper erzeugen, welche dann mit den pathogenen Antikörpern komplexieren, wenn sie auftreten.
Diabetische Nephropathie
Nierenverwicklung in Typ-I-Diabetis ist gekennzeichnet durch epitheliale und Basalmembran-Hypertrophie der Glomeruli und Tubuli und Ansammlung von extrazellulären Matrixkomponenten im glomerularen Mesangium (Lane et al., 1990). Fortschreiten der Krankheit führt zum Auslöschen des glomerularen Kapillarlumens, Proteinurie und Verlust von Filtration. Hyperglykämie und Herstellung von TGF-β (transformierender Wachstumsfaktor-β) waren impliziert bei diabetischer Nephropathie. Hohe Glukosekonzentrationen erhöhen TGF-β mRNA und -Protein in Kulturen von mesangialen und proximalen Tubularzellen; das TGF-β vermittelt indirekte Wirkungen von Glukose auf Zellwachstum und Kollagensynthese. Verabreichung von Antiserum gegen TGF-β wurde gezeigt als experimentell Glomerulonephritis- bzw. Nierenentzündugns-unterdrückend (Broder, 1990).
Es ist wahrscheinlich, dass Hyperglykämie TGF-B Expression früh bei Diabetis induziert, dies wird gestützt durch die Tatsache, dass bei menschlicher Diabetis und in den BB- und NOD-Modellen vergrößerte renale Expression von TGF-β gezeigt worden ist in einigen Tagen nach dem Start von Hyperglykämie und Nieren-Hypertrophie (Yamamoto et al., 1993; Sharma und Ziyadeh, 1994).
Das Binden von TGF-β an seinen Rezeptor wird unterstützt durch ein membranverankertes Proteoglykan (β-Glykan) das TGF-β vom Typ-II-Signalrezeptor zeigt, einer Transmembran Serin-/Threoninkinase (Lopez-Castillas et al., 1994). Betaglykan hat eine extrazelluläre Region, welche durch Zellen vergossen wird, an TGF-β binden kann, aber nicht es einem Signalrezeptor präsentieren kann und folglich als wirksamer Inhibitor seiner Wirkung fungiert. Betaglykan gehört zu einer Proteinfamilie, welche Uromodulin und das Pankreassekretionsgranulummembran GP-2 umfasst. Die Rolle der uromodulinverbundenen Region bei TGF-β-Bindung ist gezeigt worden (Fukushima et al., 1993).
Das mit GP-2 (Produkt von Klon 5.3) verbundene α-Zellmolekül, welches in löslicher und membrangebundener Form vorliegt, kann eines der Proteine sein, die bei der Inhibition von TGF-β-Wirkung involviert sind. Die Runterregulierung dieser Moleküle auf Grund verlängerter Wirkung der pathogenen Antikörper kann in der Aufhebung von TGF-β-Inhibition resultieren, was so deren topische Eigenschaften auf die Niere fördern kann. Die Verabreichung löslicher Peptide der durch die pathogenen Antikörper erkannten Moleküle würde die Doppelrolle des Inhibierens von TGF-β und Unterdrückens von Antikörper-Produktion haben.
Pankreastransplantation
Transplantation vermehrt durchgeführt, um Typ I Diabetis zu behandeln, die zu ernsten hypoglykämischen Episoden neigt. Dies hat die Doppelrolle des Etablierens von Insulin-Unabhängigkeit und teilweisem Wiederherstellen von Normoglykämie. Wenn dieser Vorgang hingegen ohne Gegenregulieren der zugrunde liegenden diabetogenen Bedingungen ausgeführt wird, werden Glukose-Gegenregulationsprobleme wiederauftreten mit jeder nachfolgenden Episode von pathogener Antikörperentwicklung.
In einer kürzlichen Untersuchung von 13 erfolgreichen Pankreastransplantationspatienten unter Verwendung einer schrittweisen Hypoglykämie-Clamp-Technik wurde gezeigt, dass Glucagon-Antworten auf Hypoglykämie wiederhergestellt wurden. Hingegen waren sowohl hungernde als auch stimulierte Glucagon-Gehalte signifikant höher in den Pankreastransplantationsempfängern – verglichen mit normalen Kontrollen oder Lebertransplantationsempfängern. Weiterhin wurden C-Peptidegehalte auch angestiegen verglichen mit anderen Gruppen (Kendall et al., 1997). Die Autoren kommentierten nicht diese Beobachtungen, welche an einen prädiabetischen Zustand erinnern. Sie berichteten hingegen, dass Epinephrinantworten auf Hypoglykämie in den Pankreastransplantationsempfängern verbessert waren, aber signifikant niedriger waren als in gesunden Kontrollsubjekten oder nicht-diabetischen Nierentransplantationsempfängern. Es ist aus diesen Beobachtungen klar, dass Transplantation von gesundem Pankreas in einen diabetischen Patienten die Uhr zurückstellt auf den prädiabetischen Zustand, im Hinblick auf sowohl α-Zellen als auch Nebennierenantwort. Ein potenzieller Pankreastransplantations-Patient muss behandelt werden, um weitere Episoden des Anstiegs bei pathogenen Antikörpertitern vor Transplantation zu verhindern, um den vollständigen Erfolg des Vorganges zu sichern.
Autoimmune Neuropathie
Diabetis von langer Dauer kann verkompliziert werden durch autoimmune Neuropathie, welche irreversibel ist und verschieden von Hypoglykämieunbewusstsein ist (Cryer, 1994; Dagogo-Jack et al., 1993). Die Entfernung bei Hypoglykämie mittels Pankreastransplantation in der Untersuchung von Kendall et al. (1997) verbesserte sowohl die Epinephrinantwort als auch Hypoglykämiesymptomerkennung – trotz Vorherrschen von kardialer Autoimmuner Fehlfunktion. Eine Norepinephrinantwort hingegen, welche abwesend war bei lang Patienten mit andauernder Diabetis, wurde nicht wiederhergestellt durch Pankreastransplantation.
Obwohl diese Reaktivität von diabetogenen monoklonalen Antikörpern gegen neuronale Zellkörper in den autonomen Ganglien noch nicht getestet worden ist, wird erwartet, dass die Antigene sie erkennen und auch in diesen Zellkörpern vorliegen werden. Die Expression von einzigartigen Sätzen von GPI-verknüpften Proteinen an verschiedenen primären Neuronen ist gezeigt worden. Einige von diesen sind gezeigt worden als verschiedenen Umscheidungsmerkmalen entsprechend (Rosen et al., 1992). Solche Moleküle werden ähnliche Signaleigenschaften haben und können ähnlich zu jenen an α-Zellen und Nebennieren-medulla-Zellenbeeinträchtigt werden.
Das GPI-verknüpfte Membran-Protein, ziliar-neurotrophischer Faktor-Rezeptor (CNTF), war bereits in einige Formen von peripherer diabetischer Neuropathie verwickelt. Bei Hyperglykämie, induziert durch Galactosefüttern und Streptozotocin-Behandlung von Experimental-Tieren, wurden die Gehalte von CNTF-artige Aktivität im Ischiasnerv nach ein bis zwei Monaten Hyperglykämie vermindert. Dies ist verbunden worden mit der Verminderung von CNTF-Protein, aber nicht mRNA. Defizit von CNTF resultierend aus Schwann-Zell-Verletzung können zu bestimmten funktionellen und strukturellen Abnomalien in experimenteller diabetischer Neuropathie führen. Einige dieser Abnomalien sind dem Aldose-Reductase-Metabolismus (AR) von Hexosen zuzuschreiben und können verhindert werden durch AR-Inhibitoren. Hingegen war CNTF-Defizienz nur teilweise hergestellt worden durch diese Inhibitoren, welche anzeigen, dass andere Faktoren als Polyol-Ansammlung auf Grund AR-Aktivität in der Verminderung von CNTF-Expression (Mizisin et al., 1997) involviert sind. Dies zeigt, dass GPI-verknüpfte Moleküle eine signifikante Rolle bei sowohl peripherer diabetischer Neuropathie als auch bei autonomer Neuropathie bilden können.
Therapeutische Implikationen der Erfindung unter Anwendung auf unbeantwortete Fragen bei SLE im primären Anti-Phospholipid-Syndrom
Folgendes wird beispielhaft und nicht als Begrenzung angegeben.
Antikörper mit Spezifität gegen anionische Phospholipide wie Cardiolipin sind verbunden worden mit Thrombose, wiederholtem Fötus-Verlust und Thrombocytopenie (Harris et al., 1983; Cowock et al., 1986; Harris et al., 1986). Ähnliche Ansprüche wurden gemacht für systemischen Lupus erythematoides (SLE), verbunden mit Antikörpern, die Lupus-Antikoagulanz genannt werden, welche detektiert werden durch deren teilweise Thromboplastinzeit (Thiagarajan et al., 1980; Love und Santaro, 1990). Diese antikoagulante Wirkung wurde gezeigt als auf einer spezifische Reaktivität dieser Antikörper mit anionischen Phospholipiden beruhend (Sammaritano et al., 1990). Zusätzlich haben SLE-Patienten ein Antikörper gegen native Doppelstränge DNA (dsDNA), welche als diagnostische Marker für SLE dienen (Veinstein et al., 1983). Die meisten Patienten mit Antiphospholipid-Antikörpern haben SLE oder einen verbundenen Autoimmun-Zustand, einige hingegen haben keine detektierbare Krankheit und werden als "primäres Antiphospholipid-Syndrom" (PAPS) betrachtet (Asherson et al., 1989,; Branch et al., 1990). In den letzten Jahren ist die pathogene Bedeutung dieser Antikörper etabliert worden durch Induzieren von Fötus-Verlust in schwangeren Mäusen durch passive Überführung in menschliche polyklonale Antiphospholipid-Antikörper (Branch et al., 1990). PAPS ist auch induziert worden in nativen Mäusen durch passive Überführung von menschlichen polyklonalen und Maus-monoklonalen Anti-Cardiolipin-Antikörpern (Blank et al., 1991).
Antiphospholipid oder Anti-Cardiolipin-Antikörper treten auch in einer Anzahl von neurologischen Zuständen auf, und deren Rolle ist betont worden bei fokaler cerebraler Ischämie, Migräne, Chorea, Anfällen bzw. Krämpfen und anderen Zuständen (Levine und Welch, 1987).
Bis heute bleiben der Ursprung von Antiphospholipid- oder Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpern unbekannt. Studien in dieser Hinsicht scheinen sich auf die liganden Bindungseigenschaften von Antiphospholipid-Antikörpern zu konzentrieren. Polyklonale und Antiphospholipid-Antikörper von Patienten kreuzreagieren mit der Mehrheit von anionischen Phospholipiden (Lafer et al., 1981; Pengo et al., 1987). Die Aufmerksamkeit wurde hingegen anderen Liganden gewidmet, wenn monoklonale Antikörper, welche an Polynukleotide wie DNA binden, gezeigt worden als auch an Cardiolipin und andere anionische Phospholipide bindend (Schoenfeld et al., 1983; Rauch et al., 1984, Smeenk at al., 1987). Diese Kreuzreaktivität wird vermutet als auf der Ähnlichkeit in chemischer Struktur von DNA und Phospholipiden beruhend, welche beide Phosphodiester-verknüpfte Phosphat-Gruppen enthalten, die durch drei Kohlenstoff-Atome getrennt sind (Lafer et al., 1981). Lipoteichonsäuren von grampositiven Bakterien und Endotoxin aus gramnegativen Bakterien enthalten auch Phosphatester und derartige Moleküle in Fremd-Antigenen und werden als möglicher Auslöser für die Erzeugung von Antiphospholipid-Antikörpern betrachtet (Carrol et al., 1985).
Kürzlich wurde die Entwicklung von Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpern gezeigt als korrelierend mit häufigem Polyoma-Virus-Reaktivierungen in einigen SLE-Patienten. Hingegen wurden hohe Titer von Anti-Doppelstrang-DNA in Abwesenheit von viraler DNA detektiert (Rekvig et al., 1997).
Es ist bereits hier gezeigt worden, dass sowohl Cardiolipin- als auch Anti-Doppelstrang-DNA-Reaktivität innerhalb der Bindungspezifitäten von Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörpern (siehe Tabelle 3. Für Methoden siehe Experimentalteil). Dies ist ein Merkmal von sowohl polyklonalen Antikörpern aus Mäusen, die mit Anti-TCR-Vβ-monoklonalen Antikörpern immunisiert sind als auch Anti-Anti-TCR-Vβ-monoklonalen Reagenzien, erzeugt aus solchen immunisierten Mäusen. Weiterhin hat das polyklonale Maus-Antiserum eine wirkungsvolle antikoagulante Wirkung.
Die potenziellen Mechanismen für die pathophysiologische Entwicklung von Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörpern ist bereits diskutiert worden (siehe Seite 13). Die Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörpern bei der Verhinderung von deren Entwicklung oder Induktion von Schutz-Antikörpern ist herausgehoben worden (siehe Seite 23). Solchen Verfahren sollten die Entwicklung der in Kombination von pathogenen Anti-DNA und Antiphospholipid-Antikörpern verhindern, die zur Linderung der Krankheiten führen, welche durch diese Antikörper hervorgerufen werden.
Anwendung der Erfindung auf weitere Krankheiten von Hormon-Fehlregulation und Zuständen, wo β-Zell-Fehlfunktionen oder Hyperinsulinämie und Insulinresistenz vorliegen.
Wie oben angezeigt, binden Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörper an Insel-α-Zellen und andere endokrine Organe, was nahe legt, dass ihre Ziel-Moleküle involviert sind in deren Sekretionsmechanismen. Dies würde den Befund erklären, dass eine Autoimmun-Endokrin-Krankheit mehr als ein Organ in einem einzigen Patienten beeinträchtigen kann oder Autoantikörper gegen klinische "unbeeinträchtigte" Organe vorliegen können. Diese Krankheiten, welche koexistieren, sind Hypothyroidismus, Hyperthyroidismus (Grave's Krankheit), Diabetis mellitus, Addison-Krankheit, primärer Hypogonadismus, Autoimmungastritis und perniziöse Anämie, unter anderem, wobei das Krankheitsprofil vermutlich die genetische Neigung des Individuums reflektiert.
Folgendes wird exemplarisch und nicht als Begrenzung angegeben.
Autoimmune Schilddrüsenkrankheit
Das Auftreten von autoimmuner Schilddrüsenkrankheit ist wesentlich höher bei Patienten mit IDDM als in der allgemeinen Bevölkerung (Payami und Thomson, 1989). Abnormale Glucosetoleranz und erhöhte hepatische Glucoseerzeugung werden oft bei Hyperthyroidismus beobachtet (Wennlund et al., 1986). Die beschleunigte Gluconeogenese ist ein Anzeichen von Hyperglucagonämie, welche sowohl im basalen Zustand und nach Insulininfusion in 8 neu diagnostizierten Hyperthyroid-Subjekten durch Moghetti et al. (1994) berichtet wurde. Auch die prozentuale Abnahme bei Glucagongehalten nach Glucoseverabreichung oder einer Mahlzeit ist signifikant niedriger bei Hyperthyroid-Patienten, gleich ob sie hyperglykämisch sind oder nicht (Kabadi und Eisenstein, 1980; Bech et al., 1996). Insulin-Sekretion ist auch fehlreguliert bei Hyperthyroidindividuen. In einer Vielzahl von Zuständen wie bei Hyperglykämie-Clamp (O'Meara et al., 1993) im Hungerzustand und nach Mahlzeiten (Bech et al., 1996) waren immunoreaktive Insulin-Konzentrationen höher bei thyrotoxischen Patienten, verglichen mit Kontrollen. Der Anstieg bei immunoreaktivem Insulin wurde verstärkter Pro-Insulin-Sekretion angerechnet. Es gibt daher einen Nachweis für erhöhte Insulin-Sekretion von ACTH (Adrenocorticotrophin-Hormon), Cortisol und Wachstumshormon in Hyperthyroidismus (Moghetti et al., 1994; Gallagher et al., 1971), was konsistent mit der Hypothese der Fehlregulation der normalen negativen Feedbackkontrolle von Hormonsekretion auf Grund des Bindens von Anti-Anti-Vβ-Antikörpern an Zielantigenen an diesen Organen ist. Die fehlregulierte Glucagon- und Insulinsekretion in Thyrotoxikose ist ähnlich zu prädiabetischen und diabetischen Zuständen; in analoger Weise wird nächtliche TSH-Aufwallung bei den meisten diabetischen Patienten geglättet (Coiro et al., 1997).
Polyzystisches Eierstock-Syndrom (PCOS)
Es gibt andauernde verstärkte frühe Insulin-Antwort gegen intravenöse Glucose bei Frauen mit PCOS, was eine primäre Insulinsekretionsabnomalie anzeigt (Holte 1995). Solche Frauen haben eine hyperglykämische und eine hyperinsulinämische Antwort bei einem oralen Glucosetoleranz-Test (OGTT) (Dunaif et al., 1987). Golland et al., (1990) berichteten hingegen, dass PCOS-Frauen geglättete Glucagon-Antworten anstelle von Hyperglykämie bei OGTT hatten. Dies zeigt an, dass ein Zweitlinien-Glucose-Gegenregulations-Hormon, das heißt, Epinephrin in PCOS-Frauen erhöht sei muss. Konsistent damit ist, dass der adrenale Hyperandrogenismus in Frauen mit Androgen-Überschuss gefunden wurde (Ehrmann et al., 1992). Die Wirkung von Adrenalin auf Steroidgenese ist sowohl in perfundierten isolierten Nebennieren als auch auf molekularer Ebene gezeigt worden (Ehrhart-Bornstein et al., 1994; Guse-Behling et al., 1992). Der histologische Nachweis durch Immunoanfärben der Vermischung von adrenalen Kortikalzellen innerhalb der gesamten Nebennieren-medulla und umgekehrt bestätigt die Rolle der Nebennieren-medulla als Regulator von adrenokortikaler Funktion durch parakrinen Mechanismus (Bornstein et al., 1994). Die durch die pathogenen Antikörper erkannten Moleküle, die in dieser Erfindung beschrieben sind, sind häufig gezeigt an den Nebennieren-medulla-Zellen (3). Solche Autoantikörper können der Grund von verstärkter Adrenalin-Sekretion sein, was Nebennieren-Hyperandrogenismus in PCOS hervorruft.
Adrenaler Hyperandrogenismus trifft häufig mit Eierstock-Hyperandrogenismus zusammen, welcher allgemein begleitet ist von LH-Verstärkung. Das abnormale Muster von Eierstock-Steroidgenese kann nur teilweise durch LH-Hyperstimulation von thekalen Zellen und einer Hyperantwort auf GnRH erklärt werden. Insulin und insulinartige Wachstumsfaktoren verstärken die androgene Antwort von thekalen Zellen auf LH durch ansteigende Gehalte und geschwindigkeitsbestimmende Enzyme in der Eierstocksteroidgenese und Umkehren von LH-induzierter Herunterregulierung von diesen Enzymen (Hernandez et al., 1998; Magoffin et al., 1990). Daher wurde Hyperinsulinämie vorgeschlagen als Hauptkandidat von Eierstockfehlregulationen (Ehrmann et al., 1995).
Hyperinsulinämie scheint auch eine Rolle bei Nebennieren-Hyperandrogenismus zu spielen, hingegen nicht direkt durch Synergismus mit ACTH-Stimulation (Moghetti et al., 1996). Die Sekretion von Schleimdrüsen-Glycoproteinhormonen ist pulsartig und die Unterbrechung von deren Pulsen kann die reproduktive Funktion verändern (Samuels et al. 1990; Santoro et al. 1995). Es ist gezeigt worden, dass Schleimdrüsen-Lactotrophe GPI-verknüpfte Moleküle exprimieren, welche schnell hydrolysiert werden durch Behandlung mit TRH (Benitez et al., 1995). Phospholipase C-Inibition verhindert die Wirkung von TRH und Zweit-Messanger-Erzeugung (second messenger Erzeugung) (Perez et al., 1997). Von der Freisetzung von ACTH aus Rattenschleimdrüsen-Zellen wurde gezeigt, dass sie verhindert werden kann durch Inhibieren von Phospholipase C-Aktivität (Won und Orth, 1995). Die Wirkungen von ACTH wird auch nachgeahmt durch Phospholipase C (Forster und Veitl, 1995). Villa et al., (1995) berichteten, dass die Ansammlung von Aldosteron in Adrenocortical-Zellen inhibiert wurde in einer dosisabhängigen Weise durch Inositolphosphoglycane, was die regulatorische Rolle dieser Moleküle zeigt. Diese Beobachtungen zeigen die weitreichenden Wirkungen des Blockierens von Phospholipase C-Wirkungsstellen durch pathogene Anti-Vβ-Autoantikörper, die hier beschrieben sind.
Fettleibigkeit
Hyperinsulinämie ist charakteristisch sowohl bei jugendlicher als auch bei erwachsener Fettleibigkeit. Le Stunff und Bougneres (1994) berichteten einen 76%-Anstieg bei Insulin-Antwort auf eine Standardmahlzeit bei Kindern mit lang- und kurzdauernder Fettleibigkeit; Hungerinsulingehalte erhöhten sich mit der Dauer von Fettleibigkeit. Fettleibige Kinder von langer und kurzer Dauer sind auch hyperglykämisch nach Standardmahlzeit-Test, verglichen mit Kontrollen, was konsistent mit einem Bericht von verstärkter Gluconeogenese in seit kurzem fettleibigen Kindern ist (Le Stunff und Bougneres, 1996).
Verstärktes postprandiales Insulininkrement wurde gezeigt als anhaltend bei Frauen, nachdem ein normales Körpergewicht erzielt wurde (Fletcher et al., 1989). Daher scheint Hyperinsulinämie eine primäre Abnomalie zu sein, die zu Fettleibigkeit führt. Bei erwachsener Fettleibigkeit ist Hyperinsulinämie auch verbunden mit erhöhten Gehalten an freien Fettsäuren sowohl beim Hungern als auch bei Postprandialzuständen (Golay et al., 1986). Verstärkte Gluconeogenese und Hyperinsulinämie sind wahrscheinlich das Ergebnis von fehlregulierter Glucagon-Sekretion bei Fettleibigkeit. Borghi et al., (1984) berichteten, dass Glucose versagte, Glucagon-Sekretion in fettleibigen Subjekten zu unterdrücken. Golland et al., (1990) zeigten, dass fettleibige Frauen eine signifikant größere Glucagon-Antwort bei 60, 90 und 120 Minuten nach oraler Glucosezufuhr als es nicht-fettleibige Subjekte hatten. Diese beiden Beobachtungen zeigen die Abwesenheit von Regulationssignalen in pankreatischen α-Zellen, analog zu prädiabatischen und diabetischen Zuständen
Cushing-Syndrom
Diese Krankheit wird allgemein verbunden mit Glucoseintoleranz, Diabetis, zentraler Fettleibigkeit, Hirsutismus und erhöhtem arteriellen Blutdruck. Das Hauptdiagnosemerkmal ist Hypercortisolismus, welcher aus lang anhaltender ACTH-Hypersekretion in 20 bis 40% von Patienten (Doppmann et al., 1988) resultiert, dies kann in Abwesenheit von Speicheldrüsenadenomen auftreten, und verstärkte Cortisolsekretion kann unilateraler oder bilateraler adrenaler Hyperplasie mit oder ohne autonomem Sekretieren von Mikro- oder Makroknoten zuzuschreiben sein (Hermus et al., 1988).
In einer kürzlichen Durchschnittsstudie von 90 Patienten mit Fettleibigkeit und mit Diabetis wurde das Vorherrschen von Cushing-Syndrom mit 3,3% berichtet (Leibowitz et al., 1996). Präklinische und subklinische Fälle von Cushing-Krankheit, welche als schwach kontrollierte Diabetis vorliegt, tragen zu dieser Zahl beträchtlich bei. In analoger Weise ist milder chronischer Hypercortisolismus in Typ-I-Diabetis berichtet worden, reflektiert durch erhöhtes Hunger-Cortisol und freiem urinären Cortisol und einer verstärkten Antwort auf ovines Corticotropin-freisetzendes Hormon (Roy et al., 1993).
ACTH-Hypersekretion kann in Abwesenheit eines Speicheldrüsenadenoms auftreten, aber in Gegenwart von Hypercortisolämie (Grandt und Liddle, 1960), was eine Fehlregulation von normaler Feedbackkontrolle nahe legt. Mehrere Reporte zeigen die Rolle von GPI-verknpüften Molekülen und Inositolphosphoglykanen, die durch Aktivierung von Phospholipase C in Regulation von sowohl Speicheldrüsen-Hormonsekretion als auch Sekretion von Hormonen freigesetzt werden, welche sie aus Nebennieren, Schilddrüsen, Keimdrüsen und so weiter stimulieren (Fanjul et al., 1993; Shaver et al., 1993; Villa et al., 1995). Es wird daher erwartet, dass die hier beschriebenen Autoantikörper pathogene Wirkungen haben werden, die von der Unterbrechung von pulsartiger Sekretion von Hormonen bis zu inhibierter oder übertriebener Sekretion und selbst der Bildung von Tumoren reichen, da Antikörper gegen GPI-verknüpfte Moleküle auch gezeigt wurden als Zellvermehrung-induzierend durch Hervorrufen einer Inhibitionsverlust-Eingabe an Aktivierungssignale (Robinson und Hederer, 1994; Benitez et al., 1995).
Metabolisches Syndrom X und cardiovaskuläre Krankheiten
Syndrom X ist die Kombination von Hyperinsulinämie, Glucoseintoleranz, verstärkten, sehr niedrig dichten Lipoproteinen (VLDL) und Triglyzeriden, verstärkter Hochdichte-Lipoproteine (HDL) und Bluthochdruck. Zentrale Fettleibigkeit ist verbunden mit diesem Syndrom. Die primär verursachende Abnormalie dieses Syndroms wird betrachtet als Insulinresistenz seiend (Reaven, 1988; Reaven, 1995). Hrnciar et al., (1992) schätzten die Gegenwart des Syndroms auf 5 bis 10% in der allgemeinen Bevölkerung, auf 15 bis 20% von Patienten mit arteriellem Bluthochdruck, auf 65 bis 90% bei NIDDM, auf 10 bis 20% bei hirsutistischen Frauen und auf 30 bis 50% bei Patienten mit myokardialem Infarkt. Piedrola et al., (1996) berichteten, dass 82,5% von 40 neu diagnostizierten Coronararterien-Krankheitspatienten insulinresistent waren und 27 der 40 ein abnormales OGTT hatten. Hyperinsulinämie und Insulinresistenzen korrelieren mit der Ernstheit von peripherer vaskulärer, Herzinfarkt- und karotider Arterienkrankheit (Standl 1995, Reven 1995) und sind auch involviert in mikrovaskulärer Angina pectoris und üben induzierte coronare Ischämie aus (Vertergaard et al., 1995).
In einer Untersuchung von cardiovaskulärer Krankheit und Syndrom X in 2930 Subjekten berichteten Ferranini et al., (1991), dass isolierte Formen von jedem Zustand des Syndroms rar waren, aber immer assoziiert mit Hyperinsulinämie, was nahe legt, dass dies das Schlüsselmerkmal des Syndroms ist. Sowers et al., (1993) haben auch vorgeschlagen, das Hyperinsulinämie zur Entwicklung von Bluthochdruck durch Fördern von Arteriosklerose und vaskulärer Neugestaltung führen kann. Insulinresistenz wurde beobachtet als verbunden seiend mit erhöhter Karotidwanddicke (Suzuki et al., 1996) und Schlagaderplaques (Laakso et al., 1991). Eine neuere voraussehende Populations-basierte Studie von Salonen et al., (1998) stützt die Hypothese, dass Insulinresistenz impliziert ist in ätiologischem Bluthochdruck und Dyslipidämie. Moller et al., (1996) zeigten, dass ein reines Fehlen bei Muskelinsulin einer Rezeptor-vemittelten Signalsteuerung, verursacht durch Insulinresistenz hervorrief, Hyperinsulinämie, Fettleibigkeit, erhöhte Plasma-Triglyzeride und freie Fettsäuren in transgenen Mäusen. NIDDM Muskelbiopsien zeigten eine verallgemeinerte Defizienz von Inositolphosphoglycan-Mediatoren einer Insulinwirkung (Asplin et al., 1993). Die pathogenen Antikörper, die hier beschrieben sind, könnten kreuzreagieren mit solchen Mediatoren und Insulinresistenz sowohl durch Runterregulierung von ihnen als auch durch Unterbrechen der pulsartigen Sekretion von Insulin induzieren.
Immunologisch vermittelte Multisystem-Krankheiten
Hyperinsulinämie und Insulinresistenz sind auch gezeigt worden als vorherrschend in Multisystem-Krankheiten wie systemischer Lupus erythematoides und progressive systemische Sklerose. Der Hunger-Insulingehalt bei 21 solcher Patienten war doppelt so hoch wie bei normalen Kontrollen, und sie hatten signifikant höhere Triglyzeride und niedrigere HDL-Cholesterinwerte (Mateucci et al., 1996).
Krebs
Hyperinsulinämie, ein diabetisches Glucosetoleranzmuster, eine verstärkte Rate von HGP und Insulinresistenz werden mit vielen Krebsarten verbunden, einschließlich Brust-, Colorektal-, Gastrointestinal-, Sarkom-, Endometrial-, Prostata-, Kopf-, Hals- und Lungenkrebs (Tayek, 1992; Copeland, Leinster et al., 1987; Copeland, Al-Sumidaie et al., 1987; Tayek, 1995, Nagamani et al., 1988). Bruning et al. (1992) zeigten, dass der Logarithmus des relativen Risikos von Brustkrebs linear verbunden war mit dem Logarithmus von C-Peptidgehalten. Dies war unabhängig von dem BMI (Körpermaß-Index) oder WHR (Taille zu Hüften-Verhältnis); die 223 Frauen mit Stadium-I- oder Stadium-II-Brustkrebs waren Insulin-resistent und hatten signifikant höhere C-Peptidgehalte als die 441 Kontrollen. Eine kürzliche Untersuchung von 2569 histologisch bestätigten Fällen von Brustkrebs und 2588 Kontrollfrauen in Verbindung mit Brustkrebs mit Spätstart-Diabetis ist auch bemerkt worden (Talamani et al., 1997). Die direkte Rolle von Insulin beim Fördern von Tumoren ist im Rattenmodell von Darmtumoren gezeigt worden (Tran et al., 1996).
Krebs-Kachexie scheint gekennzeichnet zu sein durch Glucoseintoleranz, postabsorptive Hyperglykämie, verminderte Gesamtkörper-Glucose-Verwertung, konsistent mit Insulinresistenz und erhöhter peripherer Lactat-Erzeugung. Das Insulin zu Glucagon-Verhältnis ist auch vermindert, vergrößerte zirkulierende Glucagongehalte werden verbunden mit dem tumortragenden Zustand (Cersosimo et al., 1991), der konsistent ist mit erhöhtem HGP in vielen Krebsarten. Bartlett et al., (1995) zeigten, dass das verstärkte Insulin/Glucagonverhältnis durch Hormontherapie selektiv Wirts-Anabolismus unterstützte und Tumorwachstumskinetiken im Rattenmodell inhibierte. Die Verhinderung der Entwicklung des diabetogenen Komplexes von metabolischen Störungen wird daher das Auftreten von Krebsarten vermindern und Symptome von Krebs-Kachexie lindern.
Diagnostische, prophylaktische und therapeutische Verwendungen der Erfindung
Das Folgende wird veranschaulichend und nicht begrenzend angegeben.
Die Erfindung wird angewandt werden auf die Verhinderung und die Behandlung von Autoimmunkrankheiten und damit verbundenen Zuständen durch Einspritzen von pharmazeutischen Präparaten von monoklonalen oder polyklonalen Anti-Anti-Vβ-Antikörpern oder Fragmenten davon, die Peptidfragmente und funktional aktive Vektoren RNA oder DNA-Sequenzen enthalten, die für solche Peptide oder Moleküle kodieren.
Das Einspritzen von Antikörpern wird geplant werden, um die Entwicklung von Autoantikörpern derselben Spezifizität durch Feedback-Mechanismen zu vermeiden, welche vorhandene B-Zellen unterdrücken oder durch ein ideotypes Netzwerk von Antikörper-Entwicklung, was schützende Antikörper auftreten lässt (siehe Seite 18 und 23). Lösliche Peptide oder andere Ziel-Moleküle, die durch pathogenen Anti-Anti-Vβ-Antikörper erkannt werden, werden auch verwendet werden, um Niedrigdosis-Toleranz zu induzieren, die spezifische Blockierung von bereits aktivierten B-Zellen (siehe Seite 18) oder in breiten vordeterminierten Dosen die Wirkung von Mediatoren zu blockieren von spezifischer Nephropathie wie TGF-β (siehe Seite 24). Vektoren, die geeignete Nukleinsäure-Sequenzen enthalten werden auch eingespritzt, wenn durch vorbestimmte Diäten, um Langzeit-in-vivo-Sekretion von löslichen Produkten zu erlauben, welche als Tolerogene wirken werden. Die Peptide, Proteine oder Moleküle, die durch Anti-Anti-Vβ pathogene Antikörper erkannt werden und die Anti-Vβ-Immunogene, die bei der Generation dieser Antikörper verwendet werden, werden bei der Entwicklung von diagnostischen Kits verwendet werden, um die Gegenwart von Auto-Anti-Anti-Vβ-Antikörpern im Blut, Plasma, Serum, Speichel oder Körperfluiden zu detektieren und die Neigung zu Autoimmun-Krankheiten oder prognostische Indikationen des Fortschreitens von Krankheit oder Behandlungseffizienz abzusichern.
Verschiedene Aspekte und Ausführungen der vorliegenden Erfindung werden nun detaillierter und exemplarisch beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1 Anfärben von normalem humanen pankreatischen Schnitt mit einem monoklonalen Anti-Anti-Vβ-Antikörper, detektiert durch fluoreszierendes Zweitreagenz.
2 Anfärben von einem normalen humanen Schilddrüsenschnitt mit einem monoklonalen Anti-Anti-Vβ-Antikörper, detektiert durch ein fluoreszierendes Zweitreagenz.
3 Anfärben von normalem humanen Nebennierenschnitt mit monoklonalem Anti-Anti-Vβ-Antikörper, detektiert mit einem fluoreszierenden Zweitreagenz.
4 Anfärben von normalem humanen Darmschnitt mit einem monoklonalen Anti-Anti-Vβ-Antikörper, detektiert mit einem fluoreszierenden Zweitreagenz.
5 Anfärben mit einem Anti-Anti-Vβ-monoklonalen Antikörper und fluoreszierendem Zweitreagenz eines Pankreasschnitts von einem Kind, welches starb bei Diagnose von Diabetis bei unkontrollierter Ketoazidose.
6 Sequenz des ESRP1 Gens.
7 Vorhergesagte Protein-Sequenz des ESRP1-Proteins.
Experimentelles
Die folgenden Beispiele werden veranschaulichend und nicht als Begrenzung angegeben.
Entwicklung monoklonaler Antikörper
Mäuse wurden intraperitoneal (ip) immunisiert mit vierwöchentlichen Injektionen von 0,1 ml Körperhybridomakultur-Überstand gegen TCR-Vβ-Spezifitäten. Die Milzen wurden dann entfernt und Einzel-Zell-Suspensionen wurden hergestellt. Die Zellen wurden verschmolzen mit SP2 Myeloma-Zellen unter Verwendung von Standardtechniken, die Arbeitern auf dem Gebiet und damit verbundenen Gebieten bekannt sind. Die Antikörper-erzeugenden Klone wurde identifiziert im ELISA unter Verwendung von Peroxidase-konjugierten Anti-Ig-Reagenzien. Die Klone wurden weiter gescreent gegen Immunisierungsreagenz, doppelsträngige und einzelsträngige DNA und anionische Phospholipide. Die verwendeten Verfahren waren Standardtechniken, die Arbeitern auf dem Gebiet bekannt sind.
Detektion von Anti-Phospholipid-Antikörpern
Flexible 96-Lochplatten (Falcon, Becton-Dickinson) wurden beschichtet mit 50 μl von 50 μg/ml Äthanol von Cardiolipin, Phosphatidylcholinen, Phosphatidylserin und 50 μg/ml in Methanol von Phosphatidylinositol (Sigma). Die Kontroll-Löcher wurden beschichtet mit Verdünnungsmittel allein. Die Platten wurden bei 4°Celsius unter Eindampfen belassen. Ungebundene Stellen wurden blockiert mit 0,1% humanem Serum Albumin (HSA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Die Platten wurden gewaschen mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (RTM) und inkubiert mit seriellen Verdünnungen von Sera in PBS Tween (RTM) oder in MoAb-Kulturüberständen. Nach Inkubieren für eine Stunde bei 37°C oder über Nacht bei 4°Celsius wurden die Platten erneut wie oben gewaschen, und die gebundenen Antikörper wurden detektiert unter Verwendung einer 1:500 Verdünnung von biotinyliertem Antimaus Ig (Amersham International plc), für 30 min bei 37°Celsius inkubiert, gefolgt nach geeignetem Waschen durch eine weitere 30 min-Inkubation bei 37°Celsius mit 1:500 Streptavidin-biotinyliertem Meerrettich-Peroxidase-Komplex (Amersham International plc). O-phenylenediamin (Sigma) wurde verwendet als Substrat, und die Farbe wurde gelesen bei 450 nm unter Verwendung eines Anthos-ELISA-Lesers.
Detektion von Anti-DNA-Antikörpern
Löcher von flexible 96-Loch-Flachbodenplatten wurden zuerst beschichtet mit 50 μg/ml Poly-L-Lysin in Wasser durch Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach Abgießen der Poly-L-Lysinlösung wurde 50 μl einzelsträngige und doppelsträngige DNA-Lösung 10 μg/ml (Sigma) in PBS, enthaltend eine 1 mM EDTA zu jedem Loch zugegeben und die Platten für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen in PBS. Verbleibende Bindungsstellen wurden blockiert mit 0,1% HSA in PBS. Die Platten wurden gewaschen mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (RTM) und inkubiert mit seriellen Verdünnungen von Seren oder MoAb-Kulturüberständen. Das Binden von Antikörpern wurde detektiert und wie oben beschrieben für Phospholipid-Antikörper.
Testen auf die antikoagulierende Wirkung der Anti-Anti-Vβ-Antikörper
Antisera aus verschiedenen Stämmen geborener Mäuse, immunisiert durch verschiedene Anti-TCR-Vβ-monoklonale Antikörper, wurden getestet. 5 μl jedes Antiserums wurde gemischt mit 95 μl stark zentrifugiertem normalen Humanplasma und inkubiert bei 37°Celsius für eine Stunde. Dazu wurden 100 μl geeignet verdünntes Russell-Viper-Venom (Diagen) und 100 μl verdünnter Blutplättchen-Ersatz (Diagen) gegeben und für 30 sec inkubiert. 100 μl von 0,025 mol CaCl₂ wurde dann zugegeben und die Gerinnungszeit gemessen. Die Gerinnungszeit in Gegenwart von normalem Maus-Serum war etwa 55 sec, während in Gegenwart des Immunserums die Gerinnungszeit von 10 bis 30 min reichte. Ein murines Kontroll-Antiserum verlängerte die Gerinnungszeit über jene von normalem Maus-Serum.
Anfärben von diabetischen Pankreasschnitten
Pankreasschnitte aus einem kürzlich diagnostizierten Insulin-abhängigen Diabetis-Patienten, welcher zufällig starb (aus nicht mit Diabetis verbundenen Ursachen) und Pankreasschnitte aus normalen toten Organspendern wurden angefärbt mit Anti-Anti-Vβ-monoklonalen Antikörpern. Die normalen Pankreasschnitte zeigten Intrainselzellanfärbungen – wie erwartet (siehe 1), aber die diabetischen Pankreas färbten gar nicht oder sehr schwach an. Dies zeigt an, dass bei diesem Patienten die relevanten α-Zell-Antigene runterreguliert oder abgeschaltet waren.
Im Gegensatz dazu, zeigte Anti-Anti-Vβ-Anfärbung von Pankreasschnitten aus drei Kindern, welche starben mit der Diagnose von Ketoazidose, einer Vermehrung von positiven färbenden Zellen außerhalb der Einschließungen von Inseln (5). Dies kann auf Grund großer Mengen von Autoantikörpern sein, die in vivo mit Lamilin-bindungsartigem Protein oder anderen Ziel-Proteinen reagieren, die Migration von α-Zellen aus den Inseln hervorrufen.
Beide oben beschriebenen Szenarien passen in ein Spektrum von Antworten durch Individuen verschiedener genetischer Konstitution, um fulminante unkontrollierte Ketoazidose und Tod oder IDDM in Individuen mit fragilen Q-Zellen hervorzurufen und NIDDM in solchen mit robusteren β-Zellen.
Wirkung der monoklonalen Anti-Anti-Vβ-Antikörper auf intakte menschliche Inselzellen in vitro
Getrennte menschliche Inselzellen aus totem Organspender wurden gewaschen in RPMI 1640 Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum und kultiviert bei einer Konzentration von annähernd 200 Inseln pro Loch in demselben Medium in 24-Lochplatten. Drei Tage später wurde das Medium aus Duplikatlöchern vorsichtig entfernt und gelagert bei minus 20°Celsius. Die Kontroll-Löcher wurden dann kultiviert mit Medium alleine und der Test mit Hybridomakultur-Überstand, enthaltend Anti-Anti-Vβ, verdünnt mit einem gleichen Volumen frischem Medium. Nach 24 Stunden wurde der Überstand in jedem Loch entfernt und wie oben gelagert und wieder aufgefüllt mit Medium allein oder Hybridoma-Überstand wie oben verdünnt. Dies wurde täglich für zwei Wochen wiederholt, außer dass die Überstände nicht am Wochenende entfernt wurden. Am Ende des Experimentalzeitraums wurde das Insulin in den gelagerten Proben gemessen, unter Verwendung eines DAKO Insulin-Kits gemäß den Herstelleranweisungen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Insulingehalte in Test- und Kontroll-Löchern nahezu identisch wie beim Start des Experiments waren. 24 Stunden nach Zugabe vom Antikörper stieg der Insulingehalt in dem Testloch beträchtlich höher als in dem Kontroll-Loch. Am dritten Tag fiel die Insulinsekretion in dem antikörperhaltigen Loch auf annähernd 50% der Kontrolle. Am vierten Tag war die Insulinsekretion in dem Testloch wieder über dem Kontroll-Loch, während am fünften Tag die Gehalte ähnlich waren. Die Ergebnisse in den optischen Dichteauslesungen (OD) in Tabelle 1 zeigen, dass sie während Insulinfreisetzung in dem Kontroll-Loch quasi konstant waren, es starke Fluktuationen im Testloch bei der ersten Experimentalwoche gab. Über der zweiten Woche fiel Insulin in dem Testloch und um den 10. Tag konnte keine Sekretion detektiert werden, während die Kontrollloch-Sekretion deutlich über der Hintergrund-OD-Auslesung stand. Obwohl weitere Messungen von Sekretion in den Kontrolllöchern nicht durchgeführt wurden, zeigt die langsame Geschwindigkeit der Insulin-Sekretionsabnahme in dem Kontrollloch an, dass die Sekretion für einige Tage mehr durchgeführt hätte werden können.
Tabelle 1 Wirkung von monoklonalen Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörpern auf menschliche Inseln in vitro
Die optische Dichte wurde gemessen unter Verwendung eines Anthos 2001 Plattenlesers bei 450 nm mit Referenzfilter bei 650 nm. Die optische Dichte für das Kulturmedium war 0,532.
Demonstration von natürlich auftretenden Anti-Anti-Vβ-Autoantikörpern in Humansera
Anti-Anti-Vβ Antikörper wurden erzeugt aus Milzen von Mäusen, die immunisiert waren mit Kulturüberstand aus Hybridoma-Zell-Linien, die Anti-TCR-Vβ6-Antikörper sekretieren. Diese Anti-Anti-Anti-Vβ-monoklonalen wurden nachgewiesen als bindend an das Anti-Vβ-Immunogen im ELISA; daher wurde die Verwendung dieses Immunisierungs-Reagenzes als Antigen, um die Gegenwart von Autoanti-Anti-Vβ-Antikörpern im menschlichen Serum zu detektieren, untersucht. Das Anti-Vβ Immunogen wurde verwendet, um 96-Loch-Flachbodenplatten über Nacht zu beschichten und die ungebundenen Stellen blockiert und Humanserum in 1:30 Verdünnung zu den Löchern zugegeben. Nach zwei Stunden Inkubation wurden die Platten gewaschen und das Binden des Humanserums detektiert, unter Verwendung eines Peroxidase-konjugierten Anti-Mensch-Ig.
Tabelle 2 bildet die Ergebnisse mit Seren ab, die enthalten sind aus drei prädiabetischen Spendern, welche anschließend diabetisch wurden. Die Serumproben von Spender 3 waren zufällig beabstandet und zeigen den höchsten Gehalt an Autoantikörpern ein Jahr vor Diagnose. Ein Anstieg des Bindungs-Index (Test-OD/Kontroll-OD) von 4,4 bis 6,1 trat in sieben Monaten in der ersten Probe auf und fiel auf 2,9, zwei Monate vor Diagnose. Dies zeigt die transiente Natur dieses Autoantikörpers und dass es nicht langzeitiges Vorherrschen sein kann, was zur Krankheitsentwicklung führt, aber vielleicht einige Episoden von Anstiegen im Titer auf Grund von viralen oder anderen Infektionen, welche zur T-Zell-Proliferation führen und im Auftreten von abnormalen GPI-verknüpften TCR-Vβ-Ketten. Die Autoantikörper scheinen vorgeherrscht zu haben hingegen für wenigstens sieben Monate bis ein Jahr, bei hohen Gehalten bei Patient 3. Dies kann zur Herunterregulierung der Signal-Moleküle in pankreatischen β-Zellen, wie vorher erwähnt (Seiten 23 und 40) geführt haben.
Tabelle 2 Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörper sind in menschlichen Sera vorhanden
Das Test-Antigen war Kulturüberstand von einer Anti-TCR-Vβ-erzeugenden monoklonalen Zell-Linie.
Der Test-Kontroll-Index wurde erhalten durch Teilen der mittleren Test-OD durch das Mittel der Kontroll-OD.
Tabelle 3 Bindungsspezifitäten von monoklonalen Anti-Anti-TCR-Vβ-Antikörpern
Die optische Dichte wurde gemessen unter Verwendung eines Anthos 2001 Plattenlesers bei 450 nm mit Referenzfilter bei 650 nm. Der Anti-TCR-Vβ wurde als Kulturüberstand verwendet.
Screenen einer Pankreas-Bibliothek mit monoklonalen Antikörpern (MoAbs)
Die Bibliotheken in λgt11 haben DNA-Sequenzen in die EcoR1-Stelle eingefügt und können als Fusionsproteine unter Kontrolle des lac-Promoters exprimiert werden. Daher können sie mit Antikörpern gescreent werden.
Im vorliegenden Fall wurde das Verfahren beschrieben durch Webster et al., (1992) (Methods in Molecular Biology, Vol. 10. Immunomedicals protocols Ed. M. Manson) verwendet, um eine λgt11-humane Pankreas-Bibliothek (Promega) zu screenen. Kurz gesagt, wurde der Bakterienstamm Y 1090 transfiziert mit Bacteriophagen, gemischt mit geschmolzener Agarose und ausplattiert auf Mediumplatten. Die Agarose-eingebetteten Bakterien wachsen und bilden einen kontinuierlichen Rasen, außer wo Phage die Zellen lysiert, um klare Flecken bilden. Bei geeigneten Verdünnungen des Phagen tritt jeweils ein diskreter Fleck von einem Phagen auf, der das Bakterium infiziert. Agarplatten werden dann überlegt mit einem Nitrozellulose-Membranblatt (Protran, BA85 0,45 μm, 82 mm Schleicher und Schuell), welches getränkt wurde in Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG), welches das β-Galactosidase-Gen (im λgt11) induziert, in welches die cDNA an der einzigartigen EcoR1-Stelle eingefügt wurde. Wenn die cDNA im korrekten Leseraster und Orientierung ist, wird ein Fusionsprotein erzeugt, welches eine Verlängerung des β-Galactosidase-Proteins am Carboxyterminus ist. Membran-überlegte Platten werden dann inkubiert bei leicht höherer Temperatur, was die Erzeugung des Fusionsproteins anwachsen lässt. Die Membranen werden dann entfernt und gewaschen, um Bakterien-Debris zu entfernen und getestet mit MoAbs, um cDNA-Klone zu detektieren, die für Protein-Sequenzen kodieren, welche mit den Antikörpern reagieren. Für dieses Verfahren wurden die Membranen zuerst in Waschlösung (5% Milchpulver in PBS, enthaltend 0,02% Tween (RTM 20) für 30 min inkubiert, um nicht-spezifisches Binden von Antikörpern zu verhindern. Sie können dann in Waschlösung gespült werden und in Petrischalen platziert werden, welche sauberen MoAb enthalten und platziert werden auf einem Schüttler für zwei bis drei Stunden. Der Antikörperlösung wurde dann verworfen und die Membranen in drei Austauschen von Waschpuffer für insgesamt 30 min auf dem Schüttler gewaschen. Der Waschpuffer wurde dann entfernt, und die Membranen wurden getränkt in einem verdünnten Meerrettich-Peroxidase-markierten Anti-Maus-Antikörper (Sigma) für eine Stunde auf dem Schüttler. Die Antikörperlösung wurde dann abgegossen und die Membranen gewaschen mit drei Austauschen von Waschpuffer über 30 min auf einem Schüttler. Die Antikörperbindung wurde dann detektiert unter Verwendung von ECL-Reagenzien (Verstärkter-Chemilumineszenz) (Amersham Life Sciences). Gleiche Volumina von zwei Reagenzien wurden gemischt und überlegt auf der Proteinseite der Membran für 1 min. Das überschüssige Detektions-Reagenz wurde dann abgetropft und die Membranen in Saran-Wrap bedeckt und einem Autoradiographiefilm ausgesetzt (Hyperfilm^TMECL) in einer Kassette. Die Filme wurden entwickelt und mit den Agar-Platten in Übereinstimmung gebracht, die die Flecken enthalten. Positive Flecken wurden ausgepickt unter Verwendung von Pasteur-Pipetten und überführt in 0,5 ml Phagen-Elutionsmittel (SM:0.1 M NaCl, 0.01 M MgSO₄ 7H₂O 0.05 M Trisbase, 0.01% w/v Gelatine (Schweinehaut-Typ 1, eingestellt auf pH 7,5), enthaltend 50 μl Chloroform als Konservierungsmittel. Positive Flecken wurden erneut gescreent, bis alle Flecken auf der Membran positiv waren.
Polymerase Kettenreaktionsvermehrung (PCR) von cDNA-Klonen
Acht cDNA-Klone, Flecken, gereinigt wie oben beschrieben, wurden vermehrt unter Verwendung des folgenden Vermehrungsgemisches: Taq Plus (Stratagene) 10 × Niedrigsalz-Reaktionspuffer 5 μl.
dNTPs (Pharmacia) jeweils 200 μmol.
Vorwärts- und Rückwärtsstarter bzw. Forward- und Reverse-Primer, jeweils 25 pM und (Forward: GTA GAC CCA AGC TTT CCT GGA GCA TGT CAG TAT AGG AGG; Reverse: CTG CTC GAG CGG CCG CAT GCT AGC GAC CGG CGC TCA GCT GG; Perkin Elmer) Taq Plus DNA Polymerase (Stratagene) 1 Unit: cDNA Templat 2 μl; dH₂O 50 μl).
Die DNA-Polymerase wurde für einen 7 min Vorlauf bei 94°Celsius, das heißt, Heißstart zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde überlagert mit 100 μl Mineralöl. Die Röhrchen wurden platziert in einen DNA-Thermal Cycler (Perkin-Eimer Cetus, Emeryville, CA) programmiert wie folgt:
94°Celsius (Denatruieren) 1 min, 55°Celsius (Anlagern) 2 min, 72°Celsius (Verlängerung), 3 min für 36 Zyklen. Die letzte Verlängerung war 7 min. Die PCR-Produkte wurden gelagert bei 4°Celsius bis zur Analyse.
Analyse von PCR-Produkten
Ein 1% Agarose-Gel, enthaltend 0,5 μl/ml Ethidiumbromid wurde hergestellt in TAE-Puffer (Trisbase 242 Gramm, Eisessig 57,1 ml, 0,5 M EDTA (pH 8,0), 100 ml dH₂O bis zu 1000 ml). 10 μl jedes PCR-Produkts wurden in 2 μl Probepuffer geladen. 2 μl 100 Basenpaar und 1 kb DNA-Messleiter (Gibco, BRL) wurden auch aufgetragen an jeder Seite der PCR-Produkte als Referenz. Die Gene wurden laufen gelassen bei 100 Volt für eine Stunde. Die PCR-Produkte wurden visualisiert unter UV-Licht und fotografiert unter Verwendung von Polaroid (RTM) 667 Film (Polaroid St. Albans, UK).
DNA-Seguenzierung
Die Identität der PCR-Produkte wurde getestet durch Sequenzieren unter Verwendung von ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing ready reaction kit und ABI 373A Sequencer (Applied Biosystems. Perkin-Elmer, Foster City, CA.).
Das Zyklostiksequenzier-Reaktionsgemisch war wie folgt:
Terminator ready reaction mix – 8 μl. PCR-Produkte (10 bis 30 ng/μl, Primer 3.2 pM, dH₂O überlagert mit 50 μl leichtem Mineralöl. Die Röhrchen wurden in dem DNA-Thermal Cycler platziert und laufen gelassen gemäß dem folgenden Programm: 96°C für 30 sec, 50°Celsius für 15 sec, 60°Celsius für 4 min, wiederholt für 25 Zyklen. Die 20 μl Verlängerungs- bzw. Extensionsprodukte wurden überführt in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und 2 l 3 M Natriumacetat (pH 4,6) und 50 μl 95% Äthanol wurden zugegeben. Die Röhrchen wurden durchwirbelt und platziert auf Eis für 10 min und dann zentrifugiert bei 13.000 Umdrehungen/min für 15 bis 30 min. Die Äthanollösung wurde abgegossen und der Niederschlag gewaschen in 75% Äthanol. Die Röhrchen wurden zentrifugiert und die Äthanollösung wurde vorsichtig entfernt und der Niederschlag in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
Herstellung und Laden von Proben
Getrocknete Proben-Niederschläge wurden re-suspendiert in 6 μl Beladungspuffer (de-ionisiertes Formamid) 5 Volumen; 50 mg/ml Blau-Dextran in 25 mmol EDTA (pH 8,0) 1 Volumen). Die Proben wurden durchwirbelt und zentrifugiert. Sie wurden dann geheizt auf 90°Celsius für 2 min und auf Eis gehalten bis zum Auftragen. Die Proben wurden auf ein 6% Acrylamidgel geladen, vorgelaufen bei 30 min bei 1500 bis 2000 Volt. Nach Laden wurden sie elektrophorisiert bei 2000 Volt für 12 Stunden. Die Sequenzdaten wurden computeranalysiert.
Acht cDNA-Klone wurden gereinigt und sequenziert. Wie oben diskutiert, wurden Klone 1.1, 1.2 und 1.3 gefunden als ein Secretogranin-1-artiges Protein kodierend; Klone 3.1, 4.1 und 5.1 als kodierend für ein 67 kd Lamininrezeptorartiges Protein, Klon 5.2 kodierte für ein neues Molekül, das ESRP1 genannt werden ist (endokrines Sekretionsregulations-Protein 1). Die Sequenz von ESRP1 ist in 7 angegeben und die vorhergesagt Aminosäure-Sequenz, die es kodiert in 6 gezeigt.
Klonieren von cDNAs in einem eukaryotischen Expressions-Vektor (pCR^TM3-Uni Invitrogen)
Dies wurde getan unter Verwendung des unidirektionalen eukaryotischem TA-Klonierungs-Kit In vitro-Gen. Der linearisierte Vektor pCR^TM3-Uni hat keine 5'-Phosphatgruppe am linken Arm und wird daher nur PCR-Produkte mit 5'-Phosphat ligieren. Der in der Vermehrung der cDNA verwendete Vorwärts-Primer wurde daher phosphoryliert vor der Ligationsreaktion wie folgt: Forward-PCR-Primer (50 bis 100 pM) 0.5–1 μg, 10×-Kinase Puffer 1 μl, 10 mM ATP 1 μl, steriles Wasser auf 9 μl, T4 Polynukleotikkinase (10 E/μl), 1 μl wurden leicht gemischt in einem 0,5 ml sterilen Mikrozentrifugenrohr und inkubiert bei 37°Celsius für 30 bis 40 min und bei 94°Celsius für 5 min und dann auf Eis platziert. Der phosphorylierte Forward-Primer wurde dann unmittelbar verwendet, um ein PCR-Produkt – wie vorher beschrieben – zu machen und 10 μl PCR-Produkt wurden analysiert auf einem Agarose-Gel.
Die Ligationsreaktion wurde dann wie folgt angesetzt: Frisches PCR-Produkt (annähernd 10 ng) 0,5 bis 1,0 μl steriles Wasser, 5,0 bis 5,5 μl 10× Ligationspuffer 1 μl, pCR^TM3-Uni Vector (60 ng) 2 μl. T4 DNA Ligase 1 μl. Das Gemisch wurde bei 14°Celsius für vier Stunden oder über Nacht inkubiert.
Die Ligationsreaktionen wurden transformiert in Top 10 F'-Zellen (ein Schuss). Die Ein-Schuss-Zellen wurden auf Eis aufgetaut und 2 μl 0,5 M β-Mercaptotäthanol zu dem Gefäß zugegeben. Die Zellen wurden gemischt mit 1 bis 2 μl Ligationsreaktion und inkubiert auf Eis für 30 min. Die Zellen wurden dann hitzegeschockt bei 42°Celsius für exakt 30 sec. SOC-Medium, 450 μl wurde dann zu den Gefäßen gegeben. Sie wurden dann inkubiert an ihrer Seite bei 37°Celsius für eine Stunde bei 225 Umdrehungen/min in einem Inkubator. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Platten mit Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37°Celsius inkubiert. Die Transformanten wurden gepickt und kultiviert zur Isolation von Plasmiden.
Plasmid-Reinigung
Transformierte Top 10-F-Strichzellen wurden kultiviert in LB-Wachstumsmedium, enthaltend Ampicillin und Plasmid-DNA wurde gereinigt unter Verwendung von Wizard Miniprep (Promega) Kits oder Endotoxin Free-Plasmid-Kit (Qiagen) für ultrareine DNA. Plasmid-DNA wurde analysiert auf die Anwesenheit und Orientierung von Insert durch PCR und sequenziert.
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Claims

Antikörper oder Fragment davon mit Reaktivität gegen ein gewöhnliches Epitop auf einem anti-TCRVβ-Antikörper und eines oder mehreren aus der Gruppe von Molekülen, bestehend aus einer Glycosylphosphatidyl-Inositol-verknüpften (GPI-verknüpften)TCRVβ-Kette; einem Phospholipid, wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin; einem Phospholipidglycan; einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, welcher (welches) Reaktivität gegen einen anti-TCRVβ-Antikörper und eine GPI-verknüfte TCR-Vβ-Kette zeigt; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, welcher (welches) Reaktivität gegen einen anti-TCRVβ-Antikörper und alle aus der Gruppe, bestehend aus einer GPI-verknüpften TCRVβ-Kette; Phosphatidylinositol; Phosphatidylserin; Cardiolipin; einem Phospholipidglycan; einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA, zeigt; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper oder das Fragment einen anti-TCRVβ-Antikörper mit einer Dissoziationskonstante von 10^–4 M oder weniger bindet; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 4, wobei der Antikörper oder das Fragment einen anti-TCRVβ-Antikörper mit einer Dissoziationskonstante von 10^–7 M oder weniger bindet; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1–5, der ein monoklonaler Antikörper ist; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welcher (welches) von Wirbeltieren oder Wirbellosen stammt; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welcher (welches) von B-Zellen abgeleitet ist, die durch Transformation mit Epstein-Barr Virus oder anderen Verfahren immortalisiert wurden, unter Verwendung von B-Zellen, die von gesunden oder erkrankten Menschen oder Tieren erhalten wurden.
Antikörper oder Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welcher (welches) durch Hindurchleiten von Körperflüssigkeit von Tieren oder Menschen durch eine Antigen-konjugierte Säule isoliert wird; zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment nach Anspruch 9, wobei die Tiere oder Menschen mit Antigen immunisiert werden, erkrankt sind oder durch Arzneimittel oder Diät manipuliert wurden, so dass sie eine Erkrankung entwickeln, zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Antikörper oder Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welcher (welches) chemisch modifiziert, an eine biologische oder synthetische Substanz gebunden ist oder welcher (welches) an ein Enzym, eine Indikatorverbindung, ein Arzneimittel, ein Toxin oder eine radioaktive Markierung konjugiert ist, zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Verwendung eines Antikörpers oder Fragments, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche dargestellt, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von IDDM, NIDDM oder einer organ- oder nicht-organspezifischen Autoimmunerkrankung, kardiovaskulären Erkrankung, Krebskachexie und Krebs oder jeder anderen Erkrankung, bei der anti-Phospholipid Antikörper und/oder Hyperinsulinämie und Insulinresistenz vorhanden sind.
cDNA-, RNA- oder genomische DNA-Sequenz, die einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 1–5 kodiert, zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Bakteriophagenklon, der eine cDNA-, RNA- oder genomische DNA-Sequenz nach Anspruch 13 umfasst.
Biologisch funktionsfähiges Plasmid oder viraler Vektor, umfassend eine cDNA-, RNA- oder genomische DNA-Sequenz nach Anspruch 13.
Wirtszelle, die stabil mit einem Plasmid oder Vektor nach einem der Ansprüche 14 oder 15 transformiert oder transfiziert ist.
Bakteriophagenklon, biologisch funktionsfähiges Plasmid, viraler Vektor oder Wirtszelle, umfassend eine cDNA-, RNA- oder genomische DNA-Sequenz nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, zur Verwendung als ein pharmazeutisches oder als ein diagnostisches Mittel.
Verfahren zum Nachweis eines natürlich vorkommenden Autoantikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das in Kontakt bringen einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe oder einer Probe einer anderen Körperflüssigkeit mit einem Zielmolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem anti-TCRVβ-Antikörper oder Fragment davon, einer GPI-verknüpften TCRVβ-Kette; einem Phospholipid, wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin oder Cardiolipin; einem Phospholipidglycan; einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA; und das Einschätzen der Menge des natürlich vorkommenden Autoantikörpers, die spezifisch an das Zielmolekül bindet.
Verfahren zum Nachweis eines natürlich vorkommenden Autoantikörpers, umfassend das in Kontakt bringen einer Blut-, Plasma- oder Serumprobe oder einer Probe einer anderen Körperflüssigkeit mit einem Antikörper oder Fragment davon, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 dargestellt, und mit Zielmolekülen und das Einschätzen der Menge des natürlich vorkommenden Autoantikörpers, die spezifisch an die Zielmoleküle bindet.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 11 markiert ist, so dass der markierte Antikörper oder das Fragment davon mit den Autoantikörpern um die Zielmoleküle konkurriert, um Komplexe zu bilden, und wobei die Menge der in den Komplexen gebundenen Markierung umgekehrt proportional zur Konzentration der in der Probe vorhanden Autoantikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 20, wobei der Antikörper oder das Fragment davon mit einem Enzym markiert ist, so dass die Bildung der Komplexe die Aktivität des Enzyms inhibiert oder inaktiviert und wobei der Grad der Inhibition oder Aktivierung umgekehrt proportional zur Konzentration der in der Probe vorhanden Autoantikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 20 oder 21, wobei die Zielmoleküle an ein Enzym gebunden sind, das mit einem Substrat verknüpft ist, so dass das Binden von Antikörper an die Zielmoleküle das Enzym aktiviert und eine Farbänderung bewirkt, die spektrophotometrisch messbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18–22, wobei die Zielmoleküle an ein Enzym gebunden sind, das mit einem Substrat verknüpft ist, und auf einem Tauchstreifen, der mit der Probe in Kontakt gebracht werden kann, vorhanden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18–23, wobei das Zielmolekül ein anti-TCRVβ polyklonales oder monoklonales Immunglobulinmolekül oder jedes Fragment davon ist, welches mindestens ein Epitop auf T-Zellrezeptor Vβ Ketten in Menschen oder jeder Tierspezies identifiziert.