CA2301154A1 - Identification et localisation de polypeptides epil exprimes, codes par le gene insl4 et leurs applications - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de polypeptides exprimés par le gène insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminés et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, telles que le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques, à la différentiation et/ou à la régénération de tissus, à moduler l'implantation embryonnaire et au traitement de pathologies liées à l'activité insulin-like, telles que le diabète et ses complications.
Description
2 PCT/FR98/01799 EXPRIMES, CODES PAR LE GENS INSL4 ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de nouveaux polypeptides exprimée par le gêne insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminêa et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activitë
desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, notamment angioprolifératives comme le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques et/ou à la régénération de tissus.
L'insuline, l'IGF-1, l'IGF-2 (« Insulin-like growth factors 1 and 2 ~ ou facteurs de croissance de type insuline 1 et 2) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire.
L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique.
Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-1 sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-2 a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale.
La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogic, z L.V, et al., 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau où
une expression très importante a été observée, reste à être élucidé.
On a adjoint, également, â cette famille les Ley I-L
qui sont actuellement clonés Bous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrite Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteum, le trophoblaste, les membranes foetales et le tissu mammaire (Adham, I.M. et al., 1993 ; Tashima, L.S. et al., 1995).
Cette famille peptidique présente en commun des caractêres structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire.
On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils appartiennent â la super-famille des récepteurs tyrosine-kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que c-erbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF).
La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-kinase qui produit une autophoaphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une channe d'événements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription.
Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives.
*rB
La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de nouveaux polypeptides exprimée par le gêne insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminêa et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activitë
desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, notamment angioprolifératives comme le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques et/ou à la régénération de tissus.
L'insuline, l'IGF-1, l'IGF-2 (« Insulin-like growth factors 1 and 2 ~ ou facteurs de croissance de type insuline 1 et 2) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire.
L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique.
Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-1 sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-2 a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale.
La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogic, z L.V, et al., 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau où
une expression très importante a été observée, reste à être élucidé.
On a adjoint, également, â cette famille les Ley I-L
qui sont actuellement clonés Bous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrite Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteum, le trophoblaste, les membranes foetales et le tissu mammaire (Adham, I.M. et al., 1993 ; Tashima, L.S. et al., 1995).
Cette famille peptidique présente en commun des caractêres structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire.
On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils appartiennent â la super-famille des récepteurs tyrosine-kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que c-erbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF).
La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-kinase qui produit une autophoaphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une channe d'événements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription.
Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives.
*rB
3 Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaine B, un peptide de jonction C ou chafne C et une chafne A.
Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré-prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à
partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'êlément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée.
Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C-terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit â la forme active de l'hormone.
Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression.
Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été
caractérisé~(WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de placenta précoce et localisë sur le chromosome 9p24.
Le gëne INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé « EPIL x (peptide inaulin-like de placenta précoce).
Pour plus de clarté dans la présente description, on désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique codante et tel que défini dans la figure 1.
Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré-prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à
partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'êlément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée.
Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C-terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit â la forme active de l'hormone.
Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression.
Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été
caractérisé~(WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de placenta précoce et localisë sur le chromosome 9p24.
Le gëne INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé « EPIL x (peptide inaulin-like de placenta précoce).
Pour plus de clarté dans la présente description, on désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique codante et tel que défini dans la figure 1.
4 La séquence d'acides aminés déduite a montré, en accord avec l'organisation générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chafne B et A et d'un peptide C de jonction ou chafne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant être probablement impliqués dans la formation de 3 ponta diaulfures.
Ces documenta décrivent l'organisation du gène INSL9 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 sont présents en particulier au niveau du tissu placentaire et utérin.
L'analyse par analogie de la séquence peptidique et nucléotidique de l'EPIL, comparée aux autres séquences des membres de la famille, ainsi que l'étude de la distribution des transcrits laisse supposer aux auteurs de ces documents que le polypeptide EPIL a une structure plus proche de l'insuline, de la relaxine et de LEY-IL que de l'IGF 1 et 2 (Chassin, D. et al., 1995). L'analyse par homologie de l'EPIL comparée aux autres membres de la famille ne permet pas de déduire les caractéristiques essentielles comme par exemple l'identification et la localisation de la forme exprimée du polypeptide EPIL codé par le gène INSL4.
La connaissance de ces caractéristiques essentielles permettrait en effet d'élaborer par exemple, des peptides synthétiqueè correspondant à des formes prédéterminées (pré-prohormone, prohormone ou hormone mature) exprimées ou â des domaines particuliers de ces formes prédéterminées (channes A, B ou peptide C). Ces peptides synthétiques peuvent être utilisés comme agonistes ou antagonistes de l'activité correspondante. Ils peuvent également être utilisés comme peptide antigénique et permettre l~obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre des formes ou domaines particuliers de cette hormone. La localisation tissulaire de la ou des formes exprimées par le gène INSL4 permettrait de préétablir le ou les types d'activité
biologique dans lesquels cette nouvelle hormone est WO 99/09172 PCT/P'R98/01799 impliquée. Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Compte tenu de ce qui précède, en particulier de l'analogie de structure entre l'insuline, la relaxine et le
Ces documenta décrivent l'organisation du gène INSL9 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 sont présents en particulier au niveau du tissu placentaire et utérin.
L'analyse par analogie de la séquence peptidique et nucléotidique de l'EPIL, comparée aux autres séquences des membres de la famille, ainsi que l'étude de la distribution des transcrits laisse supposer aux auteurs de ces documents que le polypeptide EPIL a une structure plus proche de l'insuline, de la relaxine et de LEY-IL que de l'IGF 1 et 2 (Chassin, D. et al., 1995). L'analyse par homologie de l'EPIL comparée aux autres membres de la famille ne permet pas de déduire les caractéristiques essentielles comme par exemple l'identification et la localisation de la forme exprimée du polypeptide EPIL codé par le gène INSL4.
La connaissance de ces caractéristiques essentielles permettrait en effet d'élaborer par exemple, des peptides synthétiqueè correspondant à des formes prédéterminées (pré-prohormone, prohormone ou hormone mature) exprimées ou â des domaines particuliers de ces formes prédéterminées (channes A, B ou peptide C). Ces peptides synthétiques peuvent être utilisés comme agonistes ou antagonistes de l'activité correspondante. Ils peuvent également être utilisés comme peptide antigénique et permettre l~obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre des formes ou domaines particuliers de cette hormone. La localisation tissulaire de la ou des formes exprimées par le gène INSL4 permettrait de préétablir le ou les types d'activité
biologique dans lesquels cette nouvelle hormone est WO 99/09172 PCT/P'R98/01799 impliquée. Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Compte tenu de ce qui précède, en particulier de l'analogie de structure entre l'insuline, la relaxine et le
5 polypeptide EPIL, laissant supposer ainsi que la forme exprimée et mature du polypeptide EPIL est unique et sous une forme dépourvue de chafne C, et compte tenu des pratiques habituelles d'identification et de localisation de la forme exprimée d'une hormone à partir de la connaissance de sa séquence codante, les inventeurs ont néanmoins utilisé des anticorps antichafne C, à partir de constructions de peptide mimant le domaine C du polypeptide EPIL putatif, en plus des anticorps antichafne A et B dans leur recherche d'identification et de localisation des formes exprimées.
Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante deux formes exprimées du polypeptide EPIL. Une forme pourvue de la chafne C et une forme dépourvue de la chafne C.
Les inventeurs ont également et de maniére tout aussi surprenante mis en évidence que ces deux formes exprimées étaient localisées à des niveaux tissulaires différents.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1 codé par le géne INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trôphoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d' une seule channe comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie â la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités
Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante deux formes exprimées du polypeptide EPIL. Une forme pourvue de la chafne C et une forme dépourvue de la chafne C.
Les inventeurs ont également et de maniére tout aussi surprenante mis en évidence que ces deux formes exprimées étaient localisées à des niveaux tissulaires différents.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1 codé par le géne INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trôphoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d' une seule channe comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie â la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités
6 comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
Dans la présente description, le terme de polypeptide désigne également une protéine ou un peptide.
I1 doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors comporter des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention a également pour objet un polypeptide EPIL
2 codé par le géne INSL9, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué .
a) d'une chafne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie â la figure 1 ; -b) d'une cha~ne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moine la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ;
ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie â la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
L'invention est relative aussi à un polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé
dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est
Dans la présente description, le terme de polypeptide désigne également une protéine ou un peptide.
I1 doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors comporter des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention a également pour objet un polypeptide EPIL
2 codé par le géne INSL9, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué .
a) d'une chafne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie â la figure 1 ; -b) d'une cha~ne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moine la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ;
ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie â la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
L'invention est relative aussi à un polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé
dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est
7 constitué d'une chafne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 7.14, extrémités incluses.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préfërentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain.
L'invention concerne en outre un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, notamment les cellules '15 endothéliales vasculaires foetales.
De préférence, le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
L'invention est également relative à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules musculaires lisses, en particulier les cellules musculaires lisses vasculaires constituant la paroi de vaisseaux tels que les vaisseaux embryonnaires ou de cordon ombilical.
L'invention comprend aussi un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selôn l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules stromales, notamment l'amnion et/ou les cellules de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l'allantoïde situés au niveau du cordon ombilical.
L' invention comprend en outre à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales, de préférence dans des cellules tumorales de tumeur angioproliférative telles que par exemple les cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préfërentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain.
L'invention concerne en outre un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, notamment les cellules '15 endothéliales vasculaires foetales.
De préférence, le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
L'invention est également relative à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules musculaires lisses, en particulier les cellules musculaires lisses vasculaires constituant la paroi de vaisseaux tels que les vaisseaux embryonnaires ou de cordon ombilical.
L'invention comprend aussi un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selôn l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules stromales, notamment l'amnion et/ou les cellules de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l'allantoïde situés au niveau du cordon ombilical.
L' invention comprend en outre à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales, de préférence dans des cellules tumorales de tumeur angioproliférative telles que par exemple les cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
8 Sont également préférées selon l'invention, les cellules tumorales de vaisseau intra-tumoral et les cellules épithéliales de Malpighi.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé
préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain.
L'invention comprend également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de différentiation, de prolifération et/ou de régénération des cellules humaines et/ou animales, notamment les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, de préférence de type vasculaire, les cellules épithéliales ou les cellules stromales, notamment de la décidue, ou les cellules de l'épithélium glandulaire.
Les polypeptides selon l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires et/ou dans le processus de vascularisation des tumeurs, de préférence les tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi.
Les pôlypeptides selon l'invention sont aussi caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, dans un processus de type insulin-like, notamment paracrine et/ou autocrine, de préférence un processus de réponse â un stress hypoxique et/ou à un stress hypoglycémique, notamment un processus favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
Les fragments de polypeptide selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs, font également partie de l'invention.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé
préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain.
L'invention comprend également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de différentiation, de prolifération et/ou de régénération des cellules humaines et/ou animales, notamment les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, de préférence de type vasculaire, les cellules épithéliales ou les cellules stromales, notamment de la décidue, ou les cellules de l'épithélium glandulaire.
Les polypeptides selon l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires et/ou dans le processus de vascularisation des tumeurs, de préférence les tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi.
Les pôlypeptides selon l'invention sont aussi caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, dans un processus de type insulin-like, notamment paracrine et/ou autocrine, de préférence un processus de réponse â un stress hypoxique et/ou à un stress hypoglycémique, notamment un processus favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
Les fragments de polypeptide selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs, font également partie de l'invention.
9 Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des activités d'un polypeptide selon l'invention notamment .
- la capacité de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules, comme en particulier les cellules endothéliales ou musculaires lisses, notamment les cellules vasculaires ;
- la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ; et/ou - la capacité de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, en neutralisant par exemple la fixation d'un polypeptide selon l'invention sur son récepteur cellulaire spécifique.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés.
L'invention comprend également les polypeptides homologues et variants des polypeptides selon l'invention.
On entendra désigner comme polypeptidea homologues, les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides selon l'invention, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de similitude avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention.
On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide aminé.
L'invention comprend en outre les séquences d'acide nucléique caractérisées en ce qu'elles codent pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention.
Les séquences complémentaires ou les séquences des ARN
correspondant auxdites séquences d'acide nucléique selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
L'invention comprend également les vecteurs de clonage 5 et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ainsi que les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression
- la capacité de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules, comme en particulier les cellules endothéliales ou musculaires lisses, notamment les cellules vasculaires ;
- la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ; et/ou - la capacité de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, en neutralisant par exemple la fixation d'un polypeptide selon l'invention sur son récepteur cellulaire spécifique.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés.
L'invention comprend également les polypeptides homologues et variants des polypeptides selon l'invention.
On entendra désigner comme polypeptidea homologues, les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides selon l'invention, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de similitude avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention.
On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide aminé.
L'invention comprend en outre les séquences d'acide nucléique caractérisées en ce qu'elles codent pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention.
Les séquences complémentaires ou les séquences des ARN
correspondant auxdites séquences d'acide nucléique selon l'invention, font aussi partie de l'invention.
L'invention comprend également les vecteurs de clonage 5 et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ainsi que les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression
10 et/ou la sécrétion desdites séquences dans lesdites cellules hôtes, font également partie de l'invention.
L'invention a égâlement pour objet une méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon l'invention. La méthode d'obtention d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante se caractérise de préférence en ce que l'on cultive les cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par lesdites méthodes, font aussi partie de l'invention.
L'invention comprend également les polypeptides ou un .
de leurs fragments selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par synthèse chimique.
Les pol~rpeptides correspondant aux polypeptides selon l'invention obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels, sont également compris dans l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits â partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence
L'invention a égâlement pour objet une méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon l'invention. La méthode d'obtention d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante se caractérise de préférence en ce que l'on cultive les cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par lesdites méthodes, font aussi partie de l'invention.
L'invention comprend également les polypeptides ou un .
de leurs fragments selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par synthèse chimique.
Les pol~rpeptides correspondant aux polypeptides selon l'invention obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels, sont également compris dans l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits â partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence
11 d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifëres comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules mutines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les cellules 3AsubE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription.
I1 doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié
par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédente. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifëres comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules mutines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les cellules 3AsubE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription.
I1 doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié
par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédente. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur
12 tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactêriennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifêres (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), des cellules humaines telles que les cellules 3AsubE d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).
Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier.
Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié
à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité â l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spêcifiques, etc.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine « porteuse ~ (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilitê au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaftre spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention
Ces cellules sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactêriennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifêres (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), des cellules humaines telles que les cellules 3AsubE d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).
Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier.
Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié
à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité â l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spêcifiques, etc.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine « porteuse ~ (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilitê au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaftre spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention
13 Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus â partir d'un sérum d'un animal immunisé contre, par exemple .
- un polypeptide selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kêhler et Milstein, 1975.
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Par ailleurs, l'invention concerne l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à
la présence anormale de polypeptide selon l'invention.
Ladite utilisation est comprise dans l'invention.
I1 est bien entendu qu'on entend par l'expression « plusieurs~anticorps ~ dans la présente description, au moins deux anticorps selon l'invention de spécificité
différente, c'est-à-dire capable de reconnaftre et de se lier â deux épitopes ou domaines différents de polypeptide selon l'invention. I1 est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de l'invention de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits ou nécessaires de l' invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou deux systèmes de révélation différents.
- un polypeptide selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kêhler et Milstein, 1975.
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Par ailleurs, l'invention concerne l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à
la présence anormale de polypeptide selon l'invention.
Ladite utilisation est comprise dans l'invention.
I1 est bien entendu qu'on entend par l'expression « plusieurs~anticorps ~ dans la présente description, au moins deux anticorps selon l'invention de spécificité
différente, c'est-à-dire capable de reconnaftre et de se lier â deux épitopes ou domaines différents de polypeptide selon l'invention. I1 est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de l'invention de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits ou nécessaires de l' invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou deux systèmes de révélation différents.
14 Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immuno-cytochimique ou immunohistochimique de l'expression de polypeptide selon l'invention sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à
l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale d'un polypeptide selon l'invention dans les tissus ou prélêvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où
l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.
L'invention concerne également des sondes ou amorces oligonucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement â
ladite séquence selon l'invention, de préférence les sondes pourront être'marquées.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes .
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 ~g/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 %
5 Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 â 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.
10 Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo-nucléotides de taille plus grande ou plus petits, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale d'un polypeptide selon l'invention dans les tissus ou prélêvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où
l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.
L'invention concerne également des sondes ou amorces oligonucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement â
ladite séquence selon l'invention, de préférence les sondes pourront être'marquées.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes .
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 ~g/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 %
5 Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 â 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.
10 Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo-nucléotides de taille plus grande ou plus petits, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
15 L'invention concerne en outre l'utilisation de sonde ou d'amorce, pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon l'invention, ainsi que pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention.
Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de maniêre générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence bases.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants selon l'invention, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure 30 assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. I1 faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression des polypeptides selon l'invention, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Ces oligonucléotides sens
Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de maniêre générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence bases.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants selon l'invention, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure 30 assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. I1 faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression des polypeptides selon l'invention, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Ces oligonucléotides sens
16 ou antisens font également partie des sondes selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liëes à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact de l' échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'invention ;
b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué
par un fluide, par exemple un sërum humain ou animal, du sang, le liquide amniotique ou des biopsies.
De préférence, dans le procédé précédent selon l'invention, l'anticorps utilisé à l'étape a) est fixé sur un support solide et la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage du complexe antigène-anticorps formé de l'étape b) est réalisé en utilisant un anticorps immunoconjugué ou marqué selon l'invention.
Les supports solides pouvant être utilisés, tels que des billes de polystyrène, les plaques de microtitration, sont bien connus dans le domaine des immunodosages et ne seront pas développés dans la présente description.
L'invention concerne également un kit, ou nécessaire, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, notamment dans le liquide amniotique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants .
a) un ou plusieurs anticorps selon l'invention, notamment pouvant être fixé sur un support solide ;
L'invention concerne également un procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liëes à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact de l' échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'invention ;
b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué
par un fluide, par exemple un sërum humain ou animal, du sang, le liquide amniotique ou des biopsies.
De préférence, dans le procédé précédent selon l'invention, l'anticorps utilisé à l'étape a) est fixé sur un support solide et la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage du complexe antigène-anticorps formé de l'étape b) est réalisé en utilisant un anticorps immunoconjugué ou marqué selon l'invention.
Les supports solides pouvant être utilisés, tels que des billes de polystyrène, les plaques de microtitration, sont bien connus dans le domaine des immunodosages et ne seront pas développés dans la présente description.
L'invention concerne également un kit, ou nécessaire, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, notamment dans le liquide amniotique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants .
a) un ou plusieurs anticorps selon l'invention, notamment pouvant être fixé sur un support solide ;
17 b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène s anticorps produits par la réaction immunologique, notamment un anticorps immunoconjugué ou marqué selon l'invention.
Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant Ia mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas où les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués â la fluoroscéine ou radiomarqués capables de reconnaftre spécifiquement les anticorps de l'invention ou les formes de polypeptide EPIL ou leurs fragmenta, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques dea enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif.
L'inventïon concerne en outre un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes .
a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ;
WO 99/09172 PC"fJFR98/01799
c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène s anticorps produits par la réaction immunologique, notamment un anticorps immunoconjugué ou marqué selon l'invention.
Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant Ia mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas où les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués â la fluoroscéine ou radiomarqués capables de reconnaftre spécifiquement les anticorps de l'invention ou les formes de polypeptide EPIL ou leurs fragmenta, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques dea enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif.
L'inventïon concerne en outre un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes .
a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ;
WO 99/09172 PC"fJFR98/01799
18 b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon l'invention à l'aide d'amorces selon l'invention ;
c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
L'invention concerne aussi un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact d'une sonde oligonuclëotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN
contenu dans l'échantillon biologique ;
b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spêcif ique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact d une sonde oligonucléotidique selon l'invention immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon l'invention et/ou rendu accessible â l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN
dudit ëchantillon biologique ;
b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN
*rB
c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
L'invention concerne aussi un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact d'une sonde oligonuclëotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN
contenu dans l'échantillon biologique ;
b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spêcif ique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact d une sonde oligonucléotidique selon l'invention immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon l'invention et/ou rendu accessible â l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN
dudit ëchantillon biologique ;
b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN
*rB
19 contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant aprês élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridë avec la sonde, avec une sonde oligo-nucléotidique, notamment marquée, selon l'invention.
L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spëcifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisë en ce qu'il comprend les éléments suivants .
a) une sonde oligonucléotidique selon l'invention ;
b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ;
75 c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention comprend en outre un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants .
a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invèntion pouvant être fournie préimmobilisée sur un support ;
b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'invention ;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires é une réaction d'amplification de l'ADN.
Les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales, notamment angioprolifératives et en particulier pour le diagnostic du Sarcome de Kaposi, font avantageusement partie de l'invention.
Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide ou de séquence nucléique selon l'invention, ou encore par diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules 5 tumorales, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédés ou kits peuvent être utilisés pour évaluer 10 l'efficacité d'un traitement thérapeutique de ladite pathologie.
Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont 15 bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, celles qui seront décrites ci-après.
L'invention est donc relative également â des méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce qu'elîes mettent en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon
L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spëcifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisë en ce qu'il comprend les éléments suivants .
a) une sonde oligonucléotidique selon l'invention ;
b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ;
75 c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention comprend en outre un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants .
a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invèntion pouvant être fournie préimmobilisée sur un support ;
b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'invention ;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires é une réaction d'amplification de l'ADN.
Les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales, notamment angioprolifératives et en particulier pour le diagnostic du Sarcome de Kaposi, font avantageusement partie de l'invention.
Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide ou de séquence nucléique selon l'invention, ou encore par diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules 5 tumorales, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédés ou kits peuvent être utilisés pour évaluer 10 l'efficacité d'un traitement thérapeutique de ladite pathologie.
Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont 15 bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, celles qui seront décrites ci-après.
L'invention est donc relative également â des méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce qu'elîes mettent en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon
20 l'invention ou une sonde, notamment marquée, et/ou une amorce selon l'invention.
On préfère les méthodes de marquage selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un procédé
selon l'invention.
Lea techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, telles que celle décrite à d'exemple 4, sont bien connues des immumocytochimistea ou des immunohistochimistea et ne seront pas développées dans la présente description.
Parmi les méthodes de marquage de cellule selon l'invention mettant en oeuvre une sonde de l'invention, on prêfère également les méthodes comprenant l'utilisation d'une sonde marquée selon l'invention et/ou les méthodes comprenant au moine une étape d'amplification dite par PCR
(réaction en chafne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible d'être présente â l'aide de couple d'amorces de séquence nucléique WO 99/09172 PC'T/FR98l01799
On préfère les méthodes de marquage selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un procédé
selon l'invention.
Lea techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, telles que celle décrite à d'exemple 4, sont bien connues des immumocytochimistea ou des immunohistochimistea et ne seront pas développées dans la présente description.
Parmi les méthodes de marquage de cellule selon l'invention mettant en oeuvre une sonde de l'invention, on prêfère également les méthodes comprenant l'utilisation d'une sonde marquée selon l'invention et/ou les méthodes comprenant au moine une étape d'amplification dite par PCR
(réaction en chafne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible d'être présente â l'aide de couple d'amorces de séquence nucléique WO 99/09172 PC'T/FR98l01799
21 selon l'invention. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder â la détection ou au dosage du produit ciblé, notamment par un procédé selon l'invention.
Par PCR-like on entendra dësigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymërase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient prëalablement d'effectuer une transcription réverse. I1 existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA
« Nucleic Acid Sequence Based Amplification ~ (Compton 1991), TAS « Transcription based Amplification System x (Guatelli et al. 1990), LCR « Ligase Chain Reaction (Landegren et al. 1988), « Endo Run Amplification ~ (ERA), « Cycling Probe Reaction x (CPR), et SDA « Strand Displacement Amplification ~ (Walker et al. 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité cormue et capable de s' hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contr8lée par exemple par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les sondes de l'invention, notamment marquées.
L'invention concerne en particulier les méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce que la cellule est
Par PCR-like on entendra dësigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymërase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient prëalablement d'effectuer une transcription réverse. I1 existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA
« Nucleic Acid Sequence Based Amplification ~ (Compton 1991), TAS « Transcription based Amplification System x (Guatelli et al. 1990), LCR « Ligase Chain Reaction (Landegren et al. 1988), « Endo Run Amplification ~ (ERA), « Cycling Probe Reaction x (CPR), et SDA « Strand Displacement Amplification ~ (Walker et al. 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité cormue et capable de s' hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contr8lée par exemple par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les sondes de l'invention, notamment marquées.
L'invention concerne en particulier les méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce que la cellule est
22 une cellule endothéliale, notamment vasculaire, une cellule musculaire lisse, une cellule stromale, notamment de la décidue, une cellule de l'épithélium glandulaire, notamment l'épithélium endomëtrial de l'utérus, ou une cellule tumorale, notamment angioprolifërative et celles du Sarcome de Kaposi en particulier.
L'invention a aussi pour objet une méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'invention et/ou une séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée.
L'invention a également pour objet une cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode d'obtention selon l'invention.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellules tumorales, notamment les cellules tumorales du Sarcome de kaposi, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention, une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou une cellule selon l'invention. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée ou sélectionnée selon l'invention.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un des polypeptides selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'activitë desdits polypeptides en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à ae lier é un acide nuclëique selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser
L'invention a aussi pour objet une méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'invention et/ou une séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée.
L'invention a également pour objet une cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode d'obtention selon l'invention.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellules tumorales, notamment les cellules tumorales du Sarcome de kaposi, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention, une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou une cellule selon l'invention. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée ou sélectionnée selon l'invention.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un des polypeptides selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'activitë desdits polypeptides en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à ae lier é un acide nuclëique selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser
23 l'expression du gène codant pour lesdits polypeptides en tant qu'inducteur ou répresseur.
Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules selon l'invention in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différentiation, la prolifération ou la régénération de cellules.
L'invention a en outre pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la prolifération et/ou la régénération de cellules humaines et/ou animales, en particulier de favoriser ou d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération desdites cellules, notamment les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, les cellules musculaires lisses, notamment vasculaires, les cellules épithéliales, les cellules stromales, notamment de la décidue, et/ou les cellules de l'épithélium glandulaire.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de dêcidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, notamment de favoriser ou d'inhiber le processus de décidualïsation et/ou d'implantation de l'embryon.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable moduler l'activité
insulin-like, de préférence de moduler la réponse de la cellule â un stress hypoxique et/ou hypoglycémique, notamment de favoriser l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
On entendra désigner par activité insulin-like dans la présente description, les activités bien connues de l'insuline, notamment celles qui seront décrites dans les exemples ci-après.
Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules selon l'invention in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différentiation, la prolifération ou la régénération de cellules.
L'invention a en outre pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la prolifération et/ou la régénération de cellules humaines et/ou animales, en particulier de favoriser ou d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération desdites cellules, notamment les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, les cellules musculaires lisses, notamment vasculaires, les cellules épithéliales, les cellules stromales, notamment de la décidue, et/ou les cellules de l'épithélium glandulaire.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de dêcidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, notamment de favoriser ou d'inhiber le processus de décidualïsation et/ou d'implantation de l'embryon.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable moduler l'activité
insulin-like, de préférence de moduler la réponse de la cellule â un stress hypoxique et/ou hypoglycémique, notamment de favoriser l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
On entendra désigner par activité insulin-like dans la présente description, les activités bien connues de l'insuline, notamment celles qui seront décrites dans les exemples ci-après.
24 Par exemple, l'invention comprend une méthode de sélection de composés capable de se lier é un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention ou capable de se lier à une séquence nucléotidique ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes .
a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique ;
b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique.
Les cellules transformées ou sélectionnées selon l'invention et exprimant ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique peuvent également être utilisées dans lesdites méthodes de sélection. Les méthodes de sélection de composés basées sur l'affinité d'un composé
pour un autre composé (recherche de ligands spécifiques) à
effet agoniste ou antagoniste sur une activité spécifique désirée (telle qu'une activité biochimique de type cellulaire) sont bien connues et ne seront pas décrites.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de'carbone ou tous autres composés déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthêse chimique ou biochimique, ces techniques étant connues de l'homme de l'art.
L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention à titre de médicament, de préférence choisis parmi .
a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention ;
b) un anticorps selon l'invention ;
c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l' invention ;
d) un vecteur selon l'invention ;
5 e) un vecteur selon l'invention, présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention ;
f) une sonde selon l'invention, comme par exemple les 10 séquences d'acide nucléique sens ou antisens telles que définies précédemment.
L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi.
15 Parmi lesdites tumeurs, les tumeurs du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome ou tout particulièrement un léiomyosarcome, sont également préférés.
On pourra, par exemple, se référer aux publications de 20 Clark, R.(1997) ; Ferrara, N., et al. (1997), ou de la revue Scrip N° 2209, pp.2l, et Scrip N° 2202 concernant l'article sur la société Genentech, pour les activités biologiques dans lesquelles sont impliqués l'IGF-1 et l'EGF
(facteur de croissance endothéliale), hormones apparentées
a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique ;
b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique.
Les cellules transformées ou sélectionnées selon l'invention et exprimant ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique peuvent également être utilisées dans lesdites méthodes de sélection. Les méthodes de sélection de composés basées sur l'affinité d'un composé
pour un autre composé (recherche de ligands spécifiques) à
effet agoniste ou antagoniste sur une activité spécifique désirée (telle qu'une activité biochimique de type cellulaire) sont bien connues et ne seront pas décrites.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de'carbone ou tous autres composés déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthêse chimique ou biochimique, ces techniques étant connues de l'homme de l'art.
L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention à titre de médicament, de préférence choisis parmi .
a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention ;
b) un anticorps selon l'invention ;
c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l' invention ;
d) un vecteur selon l'invention ;
5 e) un vecteur selon l'invention, présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention ;
f) une sonde selon l'invention, comme par exemple les 10 séquences d'acide nucléique sens ou antisens telles que définies précédemment.
L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi.
15 Parmi lesdites tumeurs, les tumeurs du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome ou tout particulièrement un léiomyosarcome, sont également préférés.
On pourra, par exemple, se référer aux publications de 20 Clark, R.(1997) ; Ferrara, N., et al. (1997), ou de la revue Scrip N° 2209, pp.2l, et Scrip N° 2202 concernant l'article sur la société Genentech, pour les activités biologiques dans lesquelles sont impliqués l'IGF-1 et l'EGF
(facteur de croissance endothéliale), hormones apparentées
25 au polypeptide EPIL.
L'invent'ion comprend également des composés selon l'invention, destinés â favoriser la vascularisation, de tissus spécifiques.
L'invention comprend aussi des composés selon l'invention, destinés au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de l'endométriose, de l'arthrite rhumatoide, de l'athéro sclérose ou de l'hyperthyroidie. Les traitements de lésions dues à l'athérosclérose ainsi qu'à la resténose après angioplastie étant parmi les traitements préférés.
En effet (Owens et al., 1996 et Murry et al., 1997), les facteurs de régulation de la croissance des cellules
L'invent'ion comprend également des composés selon l'invention, destinés â favoriser la vascularisation, de tissus spécifiques.
L'invention comprend aussi des composés selon l'invention, destinés au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de l'endométriose, de l'arthrite rhumatoide, de l'athéro sclérose ou de l'hyperthyroidie. Les traitements de lésions dues à l'athérosclérose ainsi qu'à la resténose après angioplastie étant parmi les traitements préférés.
En effet (Owens et al., 1996 et Murry et al., 1997), les facteurs de régulation de la croissance des cellules
26 musculaires lisses, notamment ceux favorisant cette croissance, jouent un rôle essentiel dans la formation des plaques d'athérosclérose qui sont constituées d'une population monoclonale de cellules musculaires lisses.
Ainsi, parmi les composés de l'invention, ceux permettant de moduler, en particulier d'inhiber, la croissance ou la prolifération des cellules musculaires lisses, pourront être utilisés pour le traitement des lésions induites par la formation de ces plaques, notamment pour le traitement de la resténose aprës angioplastie, dans le cadre du traitement de maladies cardiovasculaires.
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, destinés à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithélial, suite â une maladie dégénératrice ou â une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroide ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme.
L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser ou à inhiber l'implantation embryonnaire.
Enfin, l'invention comprend des composés selon l'invention, destinés à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées â une activité de type insulin-like, de préférence liées â un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, tel que l'hypoglycémie ou l'hyperglycémie. Parmi lesdites pathologies, le diabète, comme le diabète gestationnel, et les complications liées au diabète, notamment les complications d'ordre cardiovasculaires, sont notamment préférées .
Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés â un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ainsi, parmi les composés de l'invention, ceux permettant de moduler, en particulier d'inhiber, la croissance ou la prolifération des cellules musculaires lisses, pourront être utilisés pour le traitement des lésions induites par la formation de ces plaques, notamment pour le traitement de la resténose aprës angioplastie, dans le cadre du traitement de maladies cardiovasculaires.
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, destinés à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithélial, suite â une maladie dégénératrice ou â une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroide ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme.
L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser ou à inhiber l'implantation embryonnaire.
Enfin, l'invention comprend des composés selon l'invention, destinés à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées â une activité de type insulin-like, de préférence liées â un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, tel que l'hypoglycémie ou l'hyperglycémie. Parmi lesdites pathologies, le diabète, comme le diabète gestationnel, et les complications liées au diabète, notamment les complications d'ordre cardiovasculaires, sont notamment préférées .
Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés â un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
27 De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite « de remplacement ~ permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides.
La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gënea correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas où l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter , 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epatein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. I1 est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est-à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL.
Dana la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à
pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. I1
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite « de remplacement ~ permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides.
La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à-dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gënea correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas où l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter , 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epatein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. I1 est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est-à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL.
Dana la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à
pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. I1
28 est même intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contr8lée que l'on pourra bloquer lorsque cela sera nécessaire.
Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées â la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, ou à l'absence ou ê l'insuffisance de certaines cellules ou tissus, suite par exemple à un traumatisme.
Parmi les maladies liées à la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spêcifiques, comme en particulier les maladies liées à la présence de tumeurs, les inventeurs ont mis par exemple en évidence la présence anormale de quantité de polypeptides selon l'invention dans des tissus spécifiques chez des patients atteints du Sarcome de Kaposi, et ce en comparaison avec les tissus sains correspondants.
Le Sarcome de Kaposi (SK) peut être défini comme une maladie angioproliférative caractérisée par une prolifération de cellules fusiformes ("spindle-shaped cells") probablement d'origine hétérogène en majorité
endothéliale, mais aussi musculaire lisse, dendritique et/ou monocytaire, un processus de néoangiogenèse, une infiltration cellulaire inflammatoire ainsi que d'un oedème.
Le SK affecte la peau et/ou les muqueuses. I1 peut s'étendre aux tissus mous, os, et ganglions lymphatiques et affecter les organes viscéraux tels que les poumons, le tractus gastro-intestinal (intestin, foie et rate), les organes génitaux (prostate, vésicule séminale, testicules, vessie, pénis, col et vulve), le cerveau, les reins et les glandes surrénales.
L'étiologie du SK reste au jour d'aujourd'hui une énigme. Cependant, on reconna~t sur le plan épidémiologique 4 entités cliniques différentes (Tappero et al., 1993) .
Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées â la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, ou à l'absence ou ê l'insuffisance de certaines cellules ou tissus, suite par exemple à un traumatisme.
Parmi les maladies liées à la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spêcifiques, comme en particulier les maladies liées à la présence de tumeurs, les inventeurs ont mis par exemple en évidence la présence anormale de quantité de polypeptides selon l'invention dans des tissus spécifiques chez des patients atteints du Sarcome de Kaposi, et ce en comparaison avec les tissus sains correspondants.
Le Sarcome de Kaposi (SK) peut être défini comme une maladie angioproliférative caractérisée par une prolifération de cellules fusiformes ("spindle-shaped cells") probablement d'origine hétérogène en majorité
endothéliale, mais aussi musculaire lisse, dendritique et/ou monocytaire, un processus de néoangiogenèse, une infiltration cellulaire inflammatoire ainsi que d'un oedème.
Le SK affecte la peau et/ou les muqueuses. I1 peut s'étendre aux tissus mous, os, et ganglions lymphatiques et affecter les organes viscéraux tels que les poumons, le tractus gastro-intestinal (intestin, foie et rate), les organes génitaux (prostate, vésicule séminale, testicules, vessie, pénis, col et vulve), le cerveau, les reins et les glandes surrénales.
L'étiologie du SK reste au jour d'aujourd'hui une énigme. Cependant, on reconna~t sur le plan épidémiologique 4 entités cliniques différentes (Tappero et al., 1993) .
29 1. Classique, affectant les hommes (ratio hommes/femmes 10:1) entre 50 et 80 ans d'origine méditerranéenne ou juifs de l'Europe de l'Est, de localisation cutanée, d'évolution chronique, avec un cancer secondaire se développant dans 35 % des cas.
2. Endémique, affectant l'homme noir africain d'environ 35 ans (ratio hommes/femmes 13:1), d'évolution bénigne ou fatale en 5-8 ans, affectant le jeune enfant d'environ 3 ans, d'évolution fatale en 2-3 ans. Le SK représente entre 9 % et 12,8 % de toutes les nêoplasies au Zaire.
3. Iatrogène, affectant les receveurs d'un organe transplanté immunosupprimé, avec habituellement une rémission en cas d'arrêt du traitement immunosuppresseur.
4. Épidémique, associé au SIDA, avec environ 30 % dea patients atteints du SIDA développant un SK. I1 s ~ agit de la tumeur la plus fréquente associée à l'infection HIV-1.
Le risque de développer un SK est différent selon le mode de transmission du virus HIV avec un risque plus grand chez les hommes homosexuels et les femmes s'infectant par contact hétérosexuel avec un homme bisexuel par rapport aux hémophiles et aux utilisateurs de drogues intraveineuses.
I1 est de localisation multicentrique et symétrique, avec une évolution peu prévisible, la progression du SK étant le plus souvent corrélée ê l'état général du patient. Ainsi, les critères de stades élaborés par le AIDS Clinical Trials Group (ACTG)' tiennent compte du statut immunologique (CD4) et des infections opportunistes.
La plupart dea études traitant de la physiopathologie du SK sont basées sur des cultures primaires de cellules de SK associées au SIDA. La survie in vitro des cellules de SK
en culture semble dépendre de facteurs de croissance tels que OSM, VEGF, FGF-b, PDGF, IL-6 notamment. De plus, la protéine Tat du virus HIV-1 semble jouer un r8le inducteur synergique avec le FGF-b dans la formation du SK ce qui pourrait expliquer en partie l'évolution clinique plus agressive du SK associé au SIDA (Ensoli et al., 1994). En effet, dans les stades précoces de la maladie, le SK
associé au SIDA semble être une maladie strictement liée aux cytokines o~l les cytokines inflammatoires et angiogéniques et la protéine tat HIV-1 ont une influence sur l'induction et la progression du SK. De plus, il est 5 intéressant de noter que Barillari et al. en 1993 ont démontré que les cytokines inflammatoires auraient la capacité d'augmenter l'expression d'intégrine fixant la séquence RGD (Arg-Gly-Asp) au niveau de cellules du SK et de cellules normales endothéliales. Cette séquence 10 correspond aux rêgions des protéines de la matrice extracellulaire (collagène, fibronectine, laminine, tenascin et thrombospondin) qui se lient aux intégrines membranaires des cellules, modulant ainsi l'attachement cellulaire, donc, participant au processus de croissance et 15 différenciation et par conséquent à la tumorigenêse. Alors que la protéine tat du virus HIV contient des séquences RGD, on a démontré que les cytokines inflammatoires (IL-1 béta, TNF, IFN gamma) pouvaient par ailleurs augmenter la fixation de la protéine tat à la cellule SK.
20 La progression de la maladie est caractérisée par la prolifération des cellules fusiformes du SK (spindle celle) tant dans le SK classique que dans le SK associé au SIDA.
Récemment, on a démontré que le proto-oncogène Bcl-2, gène anti-apoptose, semblerait surexprimé dans les cellules 25 fusiformes de phénotype endothélial (facteur VIII RA) des lésions de SK classique et associé au SIDA avec un taux de cellules marquées plue élevé au stade nodulaire de la maladie (Bohan Morris et al., 1996). Ainsi, l'apparition de ce processus anti-apoptotique semble être un mécanisme
2. Endémique, affectant l'homme noir africain d'environ 35 ans (ratio hommes/femmes 13:1), d'évolution bénigne ou fatale en 5-8 ans, affectant le jeune enfant d'environ 3 ans, d'évolution fatale en 2-3 ans. Le SK représente entre 9 % et 12,8 % de toutes les nêoplasies au Zaire.
3. Iatrogène, affectant les receveurs d'un organe transplanté immunosupprimé, avec habituellement une rémission en cas d'arrêt du traitement immunosuppresseur.
4. Épidémique, associé au SIDA, avec environ 30 % dea patients atteints du SIDA développant un SK. I1 s ~ agit de la tumeur la plus fréquente associée à l'infection HIV-1.
Le risque de développer un SK est différent selon le mode de transmission du virus HIV avec un risque plus grand chez les hommes homosexuels et les femmes s'infectant par contact hétérosexuel avec un homme bisexuel par rapport aux hémophiles et aux utilisateurs de drogues intraveineuses.
I1 est de localisation multicentrique et symétrique, avec une évolution peu prévisible, la progression du SK étant le plus souvent corrélée ê l'état général du patient. Ainsi, les critères de stades élaborés par le AIDS Clinical Trials Group (ACTG)' tiennent compte du statut immunologique (CD4) et des infections opportunistes.
La plupart dea études traitant de la physiopathologie du SK sont basées sur des cultures primaires de cellules de SK associées au SIDA. La survie in vitro des cellules de SK
en culture semble dépendre de facteurs de croissance tels que OSM, VEGF, FGF-b, PDGF, IL-6 notamment. De plus, la protéine Tat du virus HIV-1 semble jouer un r8le inducteur synergique avec le FGF-b dans la formation du SK ce qui pourrait expliquer en partie l'évolution clinique plus agressive du SK associé au SIDA (Ensoli et al., 1994). En effet, dans les stades précoces de la maladie, le SK
associé au SIDA semble être une maladie strictement liée aux cytokines o~l les cytokines inflammatoires et angiogéniques et la protéine tat HIV-1 ont une influence sur l'induction et la progression du SK. De plus, il est 5 intéressant de noter que Barillari et al. en 1993 ont démontré que les cytokines inflammatoires auraient la capacité d'augmenter l'expression d'intégrine fixant la séquence RGD (Arg-Gly-Asp) au niveau de cellules du SK et de cellules normales endothéliales. Cette séquence 10 correspond aux rêgions des protéines de la matrice extracellulaire (collagène, fibronectine, laminine, tenascin et thrombospondin) qui se lient aux intégrines membranaires des cellules, modulant ainsi l'attachement cellulaire, donc, participant au processus de croissance et 15 différenciation et par conséquent à la tumorigenêse. Alors que la protéine tat du virus HIV contient des séquences RGD, on a démontré que les cytokines inflammatoires (IL-1 béta, TNF, IFN gamma) pouvaient par ailleurs augmenter la fixation de la protéine tat à la cellule SK.
20 La progression de la maladie est caractérisée par la prolifération des cellules fusiformes du SK (spindle celle) tant dans le SK classique que dans le SK associé au SIDA.
Récemment, on a démontré que le proto-oncogène Bcl-2, gène anti-apoptose, semblerait surexprimé dans les cellules 25 fusiformes de phénotype endothélial (facteur VIII RA) des lésions de SK classique et associé au SIDA avec un taux de cellules marquées plue élevé au stade nodulaire de la maladie (Bohan Morris et al., 1996). Ainsi, l'apparition de ce processus anti-apoptotique semble être un mécanisme
30 important dans la pathogénése du SK et pourrait être un marqueur de progression de la maladie.
Histologiquement; le SK classique et le SK associé au SIDA est indistinguable (Tappero et al., 1993). L'origine des cellules des lêsions de SK reste peu claire. Les cellules sont probablement des cellules mésenchymateuses de l'endothélium lymphatique ou vasculaire, de dendrocytes du
Histologiquement; le SK classique et le SK associé au SIDA est indistinguable (Tappero et al., 1993). L'origine des cellules des lêsions de SK reste peu claire. Les cellules sont probablement des cellules mésenchymateuses de l'endothélium lymphatique ou vasculaire, de dendrocytes du
31 derme exprimant le facteur XIIIa ou de cellules du muscle lisse vasculaire.
Les 3 stades histologiques patch, plaque et nodule sont corrélés à la clinique et à la progression de la lésion.
1. Patch . cliniquement, lésion maculaire, hiatolo-giquement, prolifération de petits, irréguliers espaces tapissés par un endothélium entourant des vaisseaux du dermes normaux. Associés ou non à une infiltration lymphocytaire inflammatoire variable.
2. Plaque . cliniquement, petite lésion palpable (papule), histologiquement, expansion de cellules fusiformes (spindle cells) dans le derme dispersées parmi le collagène du derme avec formation de canaux vasculaires irréguliers.
3. Nodule , cliniquement, large nodule palpable, histolo giquement, plage de cellules fusiformes avec atypie cytologique discrète à modérée, érythrocytes dans un réseau étendu d'espaces vasculaires en forme de fente (slit-like).
Récemment, le SK associé au SIDA semble répondre au traitement antiprotéase notamment par la trithérapie (4~"'e conférence internationale sur les rétrovirus et les infections opportunistes en Février 1997 à Washington).
Lorsque la tumeur échappe au traitement, un traitement par chimiothérapie peut être instauré (Bléomycine, Vincristine).
Sommairement, le traitement du SK en général peut être local (principalement la cryothérapie et radiothérapie) ou systémique (interféron, chimiothérapie). Le premier est généralement celui par lequel on débute parce que ayant moins d'effets secondaires à condition qu'il s'agisse d'une forme légère. Les localisations cutanées et de la muqueuse en sont les indications majeures de par leur accessibilité.
La cryothérapie â l'azote liquide, le laser offrent un résultat acceptable sur le plan cosmétique. Cependant, il y a persistance du SK dans le derme profond et l'incidence d'une récidive aprës un délai de 6 mois augmente. La chimiothérapie cytotoxique intralésionnelle par vinblastine ou vincristine permet une réponse partielle ou complète
Les 3 stades histologiques patch, plaque et nodule sont corrélés à la clinique et à la progression de la lésion.
1. Patch . cliniquement, lésion maculaire, hiatolo-giquement, prolifération de petits, irréguliers espaces tapissés par un endothélium entourant des vaisseaux du dermes normaux. Associés ou non à une infiltration lymphocytaire inflammatoire variable.
2. Plaque . cliniquement, petite lésion palpable (papule), histologiquement, expansion de cellules fusiformes (spindle cells) dans le derme dispersées parmi le collagène du derme avec formation de canaux vasculaires irréguliers.
3. Nodule , cliniquement, large nodule palpable, histolo giquement, plage de cellules fusiformes avec atypie cytologique discrète à modérée, érythrocytes dans un réseau étendu d'espaces vasculaires en forme de fente (slit-like).
Récemment, le SK associé au SIDA semble répondre au traitement antiprotéase notamment par la trithérapie (4~"'e conférence internationale sur les rétrovirus et les infections opportunistes en Février 1997 à Washington).
Lorsque la tumeur échappe au traitement, un traitement par chimiothérapie peut être instauré (Bléomycine, Vincristine).
Sommairement, le traitement du SK en général peut être local (principalement la cryothérapie et radiothérapie) ou systémique (interféron, chimiothérapie). Le premier est généralement celui par lequel on débute parce que ayant moins d'effets secondaires à condition qu'il s'agisse d'une forme légère. Les localisations cutanées et de la muqueuse en sont les indications majeures de par leur accessibilité.
La cryothérapie â l'azote liquide, le laser offrent un résultat acceptable sur le plan cosmétique. Cependant, il y a persistance du SK dans le derme profond et l'incidence d'une récidive aprës un délai de 6 mois augmente. La chimiothérapie cytotoxique intralésionnelle par vinblastine ou vincristine permet une réponse partielle ou complète
32 dans 60 à 88 % des cas avec pour les patients présentant un SK associé au SIDA un taux de récidive de 40 % en 4 à 6 mois. En outre, se pose le problème fréquent de séquelle cutanée comme l'hyperpigmentation post inflammatoire.
L'injection intralésionnelle d'interféron alpha ainsi que de TNF alpha reste encore au stade expérimental.
Les patienta n'ayant pas ou mal répondu au traitement local ou présentant une forme plus sévère par exemple avec ulcère ou forme extensive, peuvent bénéficier d'un traitement systémique avec en général une réponse clinique supérieure. Les agents chimiothérapeutiques le plus souvent associés sont la Bléomycine et la Vincristine. Cependant, il reste que ces traitements sont potentiellement immunosuppresseurs car relativement aplasiant. Le développement d'une thérapeutique basée sur des agents anti-angiogéniques comme l'IFN-alpha inhibant la production de FGF-b et d'IL-8 dans les cellules de SK, le human platelet factor-4 ou le développement d'inhibiteurs de facteur de croissance (cytokines) et/ou de récepteur spécifique aux cellules du SK reste d'actualité. Récemment, Masood et al. (1997) ont démontré l'action d'oligo-nucléotide antisens de VEGF sur la croissance tumorale sur un modèle in vivo (souris nude). En cours de développement, on cite généralement les analogues de TNP-450, l'acide cis-trans-rétinoique et plus récemment l'HAF ou hCG associated factor dont' le mécanisme d'action semble être lié au processus de l'apoptose (Lunardi Iskandar 1997). En outre, depuis que Huang et al.(1996) ont pu récemment mettre en évidence par PCR la présence d'ADN d'un nouveau virus de la famille Herpès, le HHV-8 au niveau de lésion de SK des 3 types, SK associé au SIDA, SK classique et SK endémique africain, une thérapeutique anti-virale est en cours de développement.
Pour le Sarcome de Kaposi et en général pour la plupart des maladies liées à la présence de tumeurs, il existe aujourd'hui d'une part un grand besoin de nouveaux outils moléculaires pour mieux comprendre le mécanisme
L'injection intralésionnelle d'interféron alpha ainsi que de TNF alpha reste encore au stade expérimental.
Les patienta n'ayant pas ou mal répondu au traitement local ou présentant une forme plus sévère par exemple avec ulcère ou forme extensive, peuvent bénéficier d'un traitement systémique avec en général une réponse clinique supérieure. Les agents chimiothérapeutiques le plus souvent associés sont la Bléomycine et la Vincristine. Cependant, il reste que ces traitements sont potentiellement immunosuppresseurs car relativement aplasiant. Le développement d'une thérapeutique basée sur des agents anti-angiogéniques comme l'IFN-alpha inhibant la production de FGF-b et d'IL-8 dans les cellules de SK, le human platelet factor-4 ou le développement d'inhibiteurs de facteur de croissance (cytokines) et/ou de récepteur spécifique aux cellules du SK reste d'actualité. Récemment, Masood et al. (1997) ont démontré l'action d'oligo-nucléotide antisens de VEGF sur la croissance tumorale sur un modèle in vivo (souris nude). En cours de développement, on cite généralement les analogues de TNP-450, l'acide cis-trans-rétinoique et plus récemment l'HAF ou hCG associated factor dont' le mécanisme d'action semble être lié au processus de l'apoptose (Lunardi Iskandar 1997). En outre, depuis que Huang et al.(1996) ont pu récemment mettre en évidence par PCR la présence d'ADN d'un nouveau virus de la famille Herpès, le HHV-8 au niveau de lésion de SK des 3 types, SK associé au SIDA, SK classique et SK endémique africain, une thérapeutique anti-virale est en cours de développement.
Pour le Sarcome de Kaposi et en général pour la plupart des maladies liées à la présence de tumeurs, il existe aujourd'hui d'une part un grand besoin de nouveaux outils moléculaires pour mieux comprendre le mécanisme
33 physiologique de cea maladies, mais également de nouveaux traitements thérapeutiques pour les combattre.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
Légende des Figures Maure 1 . Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL codé
par cette séquence.
~içrure 2 A. Représentation schématique de la structure du polypeptide EPIL et localisation des sites de liaisons des domaines du polypeptide EPIL reconnus par les anticorps 1661 et 7381.
B. Structures primaires de la partie amino-terminale de la chafne C de l'EPIL et de RLX-H2 (relaxine H2). Les résidus d'amino-acides identiques sont notés par *.
Fiqure 3 . Courbes d'inhibition compétitive, obtenues par méthode ELISA, de la fixation des anticorps 7381 et 1661, par différente peptides compétiteurs.
A. Inhibition de la fixation de l'anticorps 7381 (dilué
au 1/500) dirigé contre le peptide EPIL 59-108-Y adsorbé
sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 59-108 Y ( ~ ) , EPIL~ 88-108-Y (0) , RLX-H2 63-92 (A) et RLX-H2 74-92 (O) .
B. Inhibition de la fixation de l'anticorps 1661 (dilué
au 1/300) dirigé contre les peptides EPIL 23-52 et EPIL
115-139 adsorbés sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 23-52 (~), EPIL 115-139 (0), et par un mélange de peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 (0).
Figure 4 . Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps polyclonal 7383.
Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque avec le peptide EPIL 23-52 adsorbé.
*rB
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
Légende des Figures Maure 1 . Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL codé
par cette séquence.
~içrure 2 A. Représentation schématique de la structure du polypeptide EPIL et localisation des sites de liaisons des domaines du polypeptide EPIL reconnus par les anticorps 1661 et 7381.
B. Structures primaires de la partie amino-terminale de la chafne C de l'EPIL et de RLX-H2 (relaxine H2). Les résidus d'amino-acides identiques sont notés par *.
Fiqure 3 . Courbes d'inhibition compétitive, obtenues par méthode ELISA, de la fixation des anticorps 7381 et 1661, par différente peptides compétiteurs.
A. Inhibition de la fixation de l'anticorps 7381 (dilué
au 1/500) dirigé contre le peptide EPIL 59-108-Y adsorbé
sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 59-108 Y ( ~ ) , EPIL~ 88-108-Y (0) , RLX-H2 63-92 (A) et RLX-H2 74-92 (O) .
B. Inhibition de la fixation de l'anticorps 1661 (dilué
au 1/300) dirigé contre les peptides EPIL 23-52 et EPIL
115-139 adsorbés sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 23-52 (~), EPIL 115-139 (0), et par un mélange de peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 (0).
Figure 4 . Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps polyclonal 7383.
Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque avec le peptide EPIL 23-52 adsorbé.
*rB
34 Le pourcentage d'inhibition de la liaison de l'anticorps 7383 dilué au 1/500 est calculé en fonction de quantité croissante de peptide inhibiteur chafne B (23-52), ayant servi d'immunogène, dont la concentration molaire est exprimée en notation scientifique . 1,0 E-10 équivalent à
1, 0 x 10'10.
Fiaure 5 . Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps monoclonal EPIL 02.
La figure 5 représente l'analyse d'inhibition compétitive de l'anticorps EPIL 02 pour deux dilutions différentes . dilution au 1/2500 (D) et dilution au 1/5000 (1). Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque sur laquelle est adsorbée le peptide EPIL (125-137-Y).
FigSire 6 . Schéma représentant les caractéristiques de la construction du vecteur INSL4-pSec TAG CT"" contenant l'insert INSL4 de 418 pb.
ua re 7 . Détection immunohistochimique des poly-peptides EPIL 1 et EPIL 2.
Des coupes de tissus chorioniques villeux de placenta âgé de moins de 3 mois (6 â 8 semaines) (photographies A, B, E et F) ou de placenta à terme (photographies C et D) ont été marquées .
- avec des anticorps anti-EPIL 1 préabsorbés (photo graphies A et C) et des anticorps 7381 anti-EPIL 1, dilués tous les deux au 1/500 (photographies B et D) ;
- avec des anticorps anti-EPIL 2 prëabsorbés (photo-graphie E) et des anticorps 1161 anti-EPIL 2 (photographie F), tous les deux dilués au 1/300.
Les cytotrophoblastes de placenta égé de moins de 3 mois (photographie B) et de placenta à terme (photographie D) montrent un marquage prédominant avec les anticorps anti-EPIL 1 alors que les anticorps anti-EPIL 2 marquent à
la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie F).
Agrandissement . photographies A et B . x 400, photo-graphies C à F . x 1 000.
~'igix~e e . Analyse quantitative des niveaux de transcrits ARNm du gène INSL4 dans les cytotrophoblastes 5 (CT) comparée aux syncytiotrophoblastes (ST).
La quantification est réalisée par RT-PCR compétitive en utilisant un ADN standard quantitatif en témoin interne (IQS). L'électrophorèse est réalisé aur le séquenceur d'ADN
ABI de Perking Elmer et on mesure les surfaces de pic 10 obtenu. Les résultats sont exprimés en pourcentage de surface de pic obtenu avec l'ADNc cible et l'IQS
correspondant.
Les expériences ont été réalisées deux fois de manière indépendante, les barres représentant l'écart entre les 15 deux résultats obtenus.
Figure 9 . Analyse par immunoempreinte (Western blot) - Figure 9A : Anticorps monoclonal révélateur EPIL 02 (antichafne A) Ligne 1 . Surnageant obtenu après solubilisation des 20 protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Les bandes correspondant aux polypeptides EPIL recombinants sont très peu marquées et peu visibles compte tenu du facteur de dilution des polypeptides dans le surnageant brut de culture.
25 Ligne 2 . Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 3 . Eluat après chromatographie d'aff inné
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4 . Fraction 7 aprês chromatographie phase 30 inverse.
Ligne 5 . Fraction 8 aprês chromatographie phase inverse.
Ligne 6 . Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
1, 0 x 10'10.
Fiaure 5 . Courbe d'inhibition compétitive de la fixation de l'anticorps monoclonal EPIL 02.
La figure 5 représente l'analyse d'inhibition compétitive de l'anticorps EPIL 02 pour deux dilutions différentes . dilution au 1/2500 (D) et dilution au 1/5000 (1). Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque sur laquelle est adsorbée le peptide EPIL (125-137-Y).
FigSire 6 . Schéma représentant les caractéristiques de la construction du vecteur INSL4-pSec TAG CT"" contenant l'insert INSL4 de 418 pb.
ua re 7 . Détection immunohistochimique des poly-peptides EPIL 1 et EPIL 2.
Des coupes de tissus chorioniques villeux de placenta âgé de moins de 3 mois (6 â 8 semaines) (photographies A, B, E et F) ou de placenta à terme (photographies C et D) ont été marquées .
- avec des anticorps anti-EPIL 1 préabsorbés (photo graphies A et C) et des anticorps 7381 anti-EPIL 1, dilués tous les deux au 1/500 (photographies B et D) ;
- avec des anticorps anti-EPIL 2 prëabsorbés (photo-graphie E) et des anticorps 1161 anti-EPIL 2 (photographie F), tous les deux dilués au 1/300.
Les cytotrophoblastes de placenta égé de moins de 3 mois (photographie B) et de placenta à terme (photographie D) montrent un marquage prédominant avec les anticorps anti-EPIL 1 alors que les anticorps anti-EPIL 2 marquent à
la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie F).
Agrandissement . photographies A et B . x 400, photo-graphies C à F . x 1 000.
~'igix~e e . Analyse quantitative des niveaux de transcrits ARNm du gène INSL4 dans les cytotrophoblastes 5 (CT) comparée aux syncytiotrophoblastes (ST).
La quantification est réalisée par RT-PCR compétitive en utilisant un ADN standard quantitatif en témoin interne (IQS). L'électrophorèse est réalisé aur le séquenceur d'ADN
ABI de Perking Elmer et on mesure les surfaces de pic 10 obtenu. Les résultats sont exprimés en pourcentage de surface de pic obtenu avec l'ADNc cible et l'IQS
correspondant.
Les expériences ont été réalisées deux fois de manière indépendante, les barres représentant l'écart entre les 15 deux résultats obtenus.
Figure 9 . Analyse par immunoempreinte (Western blot) - Figure 9A : Anticorps monoclonal révélateur EPIL 02 (antichafne A) Ligne 1 . Surnageant obtenu après solubilisation des 20 protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Les bandes correspondant aux polypeptides EPIL recombinants sont très peu marquées et peu visibles compte tenu du facteur de dilution des polypeptides dans le surnageant brut de culture.
25 Ligne 2 . Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 3 . Eluat après chromatographie d'aff inné
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4 . Fraction 7 aprês chromatographie phase 30 inverse.
Ligne 5 . Fraction 8 aprês chromatographie phase inverse.
Ligne 6 . Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
35 Ligne 7 . Fraction 16 après chromatographie phase inverse.
36 - Figure 9B . Anticorps polyclonal révélateur 7381 (antichafne C) Ligne 1 . Etalon de masse moléculaire.
Ligne 2 . Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Ligne 3 . Effluent aprês chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4 . Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 5 . Fraction 7 après chromatographie phase inverse.
Ligne 6 . Fraction e après chromatographie phase inverse.
Ligne 7 . Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
- Figure 9C . Anticorps polyclonal révélateur 7383 (antichafne B) Ligne 1 . Surnageant obtenu apréa solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Ligne 2 . Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 3 . Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4 . Fraction 7 après chromatographie phase inverse.
Ligne' S . Fraction e après chromatographie phase inverse.
Ligne 6 . Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
Ligne 7 . Fraction 16 après chromatographie phase inverse.
Fiq~e 10 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cellrs") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement . X 100.
Figure 11 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818)
Ligne 2 . Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Ligne 3 . Effluent aprês chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4 . Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 5 . Fraction 7 après chromatographie phase inverse.
Ligne 6 . Fraction e après chromatographie phase inverse.
Ligne 7 . Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
- Figure 9C . Anticorps polyclonal révélateur 7383 (antichafne B) Ligne 1 . Surnageant obtenu apréa solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Ligne 2 . Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 3 . Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4 . Fraction 7 après chromatographie phase inverse.
Ligne' S . Fraction e après chromatographie phase inverse.
Ligne 6 . Fraction 9 après chromatographie phase inverse.
Ligne 7 . Fraction 16 après chromatographie phase inverse.
Fiq~e 10 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cellrs") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement . X 100.
Figure 11 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818)
37 Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle celle") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement :X 100.
figure 12 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB 2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement . X 200.
lL,~aure 13 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAH2).
Absence de marquage des cellulles tumorales ("Spindle cells") après inhibition de l'immunsérum 7381 (dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubatiton).
Agrandissement . X 200.
~~crure 14 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales (« Spindle celle ~) par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement . X 1000.
~icrure 15 . Sarcome de Kapoai classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des celules tumorales ("Spindle celle") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement . X 1000.
Facture 16 . Sarcome de Kapoai classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle celle") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) Agrandissement . X 400.
Figure 17 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle celle°) après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-lOBY (18 heures d'incubation).
WO 99/091?2 PCT/FR98101799
Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle celle") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement :X 100.
figure 12 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB 2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement . X 200.
lL,~aure 13 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAH2).
Absence de marquage des cellulles tumorales ("Spindle cells") après inhibition de l'immunsérum 7381 (dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubatiton).
Agrandissement . X 200.
~~crure 14 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales (« Spindle celle ~) par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement . X 1000.
~icrure 15 . Sarcome de Kapoai classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des celules tumorales ("Spindle celle") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement . X 1000.
Facture 16 . Sarcome de Kapoai classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle celle") par l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) Agrandissement . X 400.
Figure 17 . Sarcome de Kaposi classique (N° 320818) Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle celle°) après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500) par peptide 59-lOBY (18 heures d'incubation).
WO 99/091?2 PCT/FR98101799
38 Agrandissement . X 1000.
Fiaure 18 . Courbes d'inhibition obtenues avec l'anticorps monoclonal EPIL 08 pour différents peptides de la portion 59-108 de la chafne C du polypeptide EPIL
putatif .
Fiaure 19 . Courbe de calibration obtenue avec le peptide synthétique correspondant à la portion 76-139 du polypeptide EPIL putatif selon la méthode de radio-immunodosage à 2 sites et utilisant l'anticorps monoclonal EPIL 08 comme anticorps de capture et l'anticorps monoclonal EPIL 02 marqué â l'125I comme traceur.
Fiaur~ 20 . Courbes de dosages comparatifs de l'EPIL et de l'hCG dans le liquide amniotique pour un panel de femmes enceintes obtenues avec la méthode de radio-immunodosage à
2 sites pour le dosage de l'EPIL; d'autres courbes ont été
obtenues sur d'autres panels montrant des concentrations supérieures.
Fic~,~ 21 . Marquage des vaisseaux é l'intérieur des villosités trophoblastiques par l'anticorps 7381 dirigé
contre la région C de l'EPIL sur des trophoblastes agés de 8 semaines (X 200).
~'ia~re 22 . Marquage de cellules musculaires lisses des vaisseaux du cordon par l'anticorps 7381 dirigé contre la région C de l'EPIL (X 200).
Fiq~re 23 . Marquage des cellules de l'épithélium endométrial"de l'utérus par l'anticorps EPIL 08 dirigé
contre la région C de l'EPIL sur des trophoblastes agés de 9 semaines (X 200).
ExlrrtPLE 1 çar-actériBation de la ou des formes de ~olvnentide EPIL
exprimées dans les tissus Production d'anticorps anti-EPIL, spécifique de domaines particuliers du polypeptide EPIL.
Fiaure 18 . Courbes d'inhibition obtenues avec l'anticorps monoclonal EPIL 08 pour différents peptides de la portion 59-108 de la chafne C du polypeptide EPIL
putatif .
Fiaure 19 . Courbe de calibration obtenue avec le peptide synthétique correspondant à la portion 76-139 du polypeptide EPIL putatif selon la méthode de radio-immunodosage à 2 sites et utilisant l'anticorps monoclonal EPIL 08 comme anticorps de capture et l'anticorps monoclonal EPIL 02 marqué â l'125I comme traceur.
Fiaur~ 20 . Courbes de dosages comparatifs de l'EPIL et de l'hCG dans le liquide amniotique pour un panel de femmes enceintes obtenues avec la méthode de radio-immunodosage à
2 sites pour le dosage de l'EPIL; d'autres courbes ont été
obtenues sur d'autres panels montrant des concentrations supérieures.
Fic~,~ 21 . Marquage des vaisseaux é l'intérieur des villosités trophoblastiques par l'anticorps 7381 dirigé
contre la région C de l'EPIL sur des trophoblastes agés de 8 semaines (X 200).
~'ia~re 22 . Marquage de cellules musculaires lisses des vaisseaux du cordon par l'anticorps 7381 dirigé contre la région C de l'EPIL (X 200).
Fiq~re 23 . Marquage des cellules de l'épithélium endométrial"de l'utérus par l'anticorps EPIL 08 dirigé
contre la région C de l'EPIL sur des trophoblastes agés de 9 semaines (X 200).
ExlrrtPLE 1 çar-actériBation de la ou des formes de ~olvnentide EPIL
exprimées dans les tissus Production d'anticorps anti-EPIL, spécifique de domaines particuliers du polypeptide EPIL.
39 La stratégie de détection de la ou des formes exprimées du polypeptide EPIL, repose sur la production et l'utilisation d'anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre des peptides synthétiques, couplés à des protéines porteuses, mimant différentes régions de protéine putative.
1. Synthèse des peptides et préparation des immunogènes Des peptides synthétiques sont construits selon la méthode conventionnelle en phase solide sur un automate Applied Biosystems model 431A. Les peptides synthétisés sont prësentës lors de la description des anticorps (voir 3). Ces peptides sont purifiés par une chromatographie d'exclusion suivie d'une HPLC puis ils sont analysés (composition en acides aminés et séquençage peptidique).
Ils sont ensuite conjugués à des protéines porteuses afin de préparer des immunogênes.
2. Production et caractérisation des anticorps polyclonaux et monoclonaux La production des anticorps polyclonaux est réalisée par injection des immunogènes (conjugués peptide-protéine porteuse) chez des lapins femelles « Grand Fauve de Bourgogne x âgés de 70 jours environ. L'immunogène (150 ug) est injecté par voie intradermique multipoints au niveau du dos en présence d'adjuvant complet de Freund dans du sérum physiologique. Deux rappels suivants sont effectués à
respectivement J+21 et J+42 par injection de 25 ~g d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanëe. Un troisième rappel peut être effectué à J+7o. Une semaine après le rappel, un prélèvement de sang est réalisé
au niveau de l'oreille pour tester la présence d'anticorps.
Les lapins « bons rêpondeura ~ sont saignés à blanc par ponction intracardiaque.
La production des anticorps monoclonaux est réalisée par la technique d'hybridation cellulaire. Brièvement, des souris de souche BALB/c sont immunisées par l'injection de 50-100 ~cg de conjugué peptide-protéine porteuse en adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. Des rappels par voie infra-péritonéale (25 ~cg d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund) sont réalisés à trois mois d'intervalle jusqu'à obtenir une réponse immune, attestée par la présence d'anticorps détectables dans le sérum de 5 l'animal. La fusion cellulaire est effectuée 3 jours après injection i.v. Cintra veineuse) de l'immunogène. Elle consiste à prélever puis dissocier la rate de la souris et, dans un second temps, fusionner par le polyéthylèneglycol (PEG 1000) les lymphocytes ainsi libérés avec des cellules 10 myélomateuses, entretenues en culture continue: Les hybridomes sont sëlectionnés en milieu sélectif contenant de l'aminoptérine. La production d'anticorps monoclonaux par les hybridomes est analysée par une méthode immuno-enzymatique en phase solide (liaison au peptide 15 immunogène). Les hybridomes producteurs sont clonés deux fois par dilution limite et la production en masse d'anticorps est réalisée par injection des hybridomes en intrapéritonéal chez la souris Nude. Les anticorps monoclonaux sont ensuite purifiés à partir des liquides 20 d'ascite par une méthode de chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A (Pharmacia) après précipitation des protéines au sulfate d'ammonium.
Les caractéristiques de liaison des anticorps sont établies par des méthodes immunoenzymatiquea en phase 25 solide (ELISA) et radioimmunologiques CRIA). Brièvement, la méthode ELISA est réalisée en adsorbant un ou plusieurs peptides mimant une séquence d'un domaine du polypeptide putatif EPIL, dilué dans un tampon Phosphate 0,1 M, pH 7,4, sur un support solide (plaque de polystyrène COSTAR/EIA).
30 Après une incubation de 18 heures à + 4° C, les supports sont saturés par une solution d'albumine et les anticorps â
tester sont ajoutés pour une incubation de 1 heure â 37°C.
Après lavage, la liaison des anticorps est détectée par l'addition d'un anticorps secondaire marqué à la peroxydase 35 (RAM/IgG (H+L) Po, TEBU). La solution de chromogène (o-phénylène diamine) en présence d'Hz02 permet de révéler la réaction enzymatique. Une méthode par inhibition WO 99/09172 PCTlFR98/01799 compétitive peut être réalisée pour préciser la localisation des sites reconnus par les anticorps. Pour cela, les anticorps sont préalablement incubés avec des peptides synthétiques à différentes concentrations, par exemple représentatifs de séquences plus courtes que celle du peptide adsorbé sur le support. Le mélange est ensuite déposé sur le support et l'activité anticorps résiduelle est mesurée. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la liaison. La méthode RIA est développée de façon semblable, excepté le tait que le peptide est radiomarqué par un isotope l2sl selon le procédé dit du Iodogène. Les complexes immuns potentiellement formés avec l'anticorps sont précipités par le polyéthyléne glycol (PEG
6000) et, après lavage, la radioactivité est mesurée. I1 est aussi possible de réaliser une expérience d'inhibition compétitive comme décrit ci-dessus.
3. Caractéristiques des anticorps Les nombres associés aux séquences ci-dessous correspondent aux positions des acides aminés définies dans la séquence d'acides aminés de la figure 1.
Trois anticorps polyclonaux et deux anticorps monoclonaux dirigés contre des peptides synthétiques sont décrits ci-dessous .
~ Un anticorps polyclonal, numéroté 7381, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108 Tyrosine (Y) de la chafne C putative (figure 2) couplé par la benzidine à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse. Cet anticorps se lie à la séquence 59-108 du domaine C du polypeptide EPIL (figure 3A). I1 ne reconnaft pas la séquence analogue dans la relaxine H2 (RLX-H2), protéine qui présente la plus forte similitude structurale (67 %) dans le domaine C. Cet anticorps est capable de détecter le polypeptide recombinant comportant le domaine C, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, et de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 physiologique, par exemple au niveau du placenta (voir exemple 4 , concernant l'immunohistochimie).
~ Un anticorps polyclonal, numéroté 1661, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences 23-52 de la chafne B putative et 115-139 de la chafne A putative (figure 2) couplés par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse. Cet anticorps polyclonal comporte des anticorps majoritairement dirigés contre la région 115-139 de la chafne A et dans une moindre mesure contre la séquence 23-59 de la chafne 8 (figure 3B). I1 permet de détecter un polypeptide recombinant comportant les domaines A et/ou B, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, ainsi que le polypeptide EPIL natif et ses formes moléculaires comportant les domaines A et/ou B, tels que par exemple les polypeptides EPIL 1 et EPIL 2 (voir exemple 4).
~ Un anticorps polyclonal, numéroté 7383, et obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences (31 49) + (31-50) + (31-51) + (31-52) + (31-53) de la chafne B
putative couplés par le MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succimimide) à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse (figure 4).
~ Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 02 (IgG2a), est sélectionné après immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 125-137-Y de la chafne A putative couplé par la benzidine â
l'anatoxine tétanique, protéine porteuse (figure 5). Cet anticorps est utilisable pour la préparation de colonne de chromatographie d'affinité permettant de aëparer et de purifier le polypeptide d'origine recombinante (voir exemple 2).
~ Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 08 (IgG2a), est sélectionnê aprés immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108-Y de la chafne C putative couplé à la protéine porteuse. Cet anticorps reconnaft une séquence longue de 13 résidus d'acide aminé comprenant la portion 88-100 de la chafne C comme le montre les résultats obtenus par inhibition compétitive (Cf figure 18).
Production de la forme extra courte en cellule SF9 Les étapes suivantes sont réalisées .
1. Construction dans le vecteur d'expression pFastBacT""
La forme extra courte INSL4 (séquence codante) est insérée dans le vecteur d'expression d'eucaryote inférieur (baculovirus) pFastBacT"" (GIBCOBRL) au site Kpnl. Par la suite, une coinfection des cellules d'insecte SF9 par de l'ADN du baculovirus sauvage (AcMNPV, GIBCOBRL) et du vecteur de transfert contenant le gène d'intérêt est réalisée, afin de constituer une recombinaison homologue.
2. Séquençage Afin de vérifier la présence et l'orientation de la séquence codante INSL4 dans la construction recombinante, l'analyse du profil de restriction de l'ADN recombinant est réalisée grâce ê différentes endonucléases (Kpni, EcoRi) et par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN
INSL4 et du site multiple de clonage du bacmide pFastHacT"".
3. Analyse de l'expression du polypeptide EPIL
Après infection des cellules ovariennes d'insecte (Spodoptera frugiperda 9) et amplification du titre viral, l'expression du polypeptide recombinant EPIL, codé par le gène INSL4, est analysée par SDS-PAGE suivi d'immuno-empreintes.
4. Purificâtion et caractérisation du polypeptide recombinant EPIL
~ Solubilisation des protéines.
Environ 200 x 106 cellules Sf9 infectées sont centrifugées. Le culot de centrifugation est repris dans 1 ml de tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5 contenant 0,1 % NP 40 et 5 ~g/ml de leupeptin. Aprês agitation par basculement pendant 4 h â 4°C, le mélange est centrifugé 10 mn é
14 000 t/mn à + 4°C. Le surnageant est récupéré pour les étapes suivantes.
~ Chromatographie d'affinité.
Dans un premier temps, une colonne de Sépharose-CNBr EPIL 02 est préparée de la façon suivante. Trois grammes de gel sont mis à gonfler dans 20 ml d' HC1 pendant 4 heures .
Le gel est ensuite introduit dans une colonne (20 x 1,5 cm) puis rincé avec une solution de couplage (NaHC03 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,5). Après élimination de celle-ci, 1,5 à
4 mg d' anticorps monoclonal purifié EPIL 02, dilué dans la solution de couplage, sont ajoutés. Aprês 18 heures à + 4°C
sous agitation, les sites libres sont bloqués avec de l'éthanolamine 1 M puis la colonne est lavée avec une solution de CH3COONa 0,1 M, CH3COOH 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH
4. Enfin, la colonne est rincée par Na2HP04 0,05 M, pH
8,5.
Le surnageant récupéré après solubilisation est dilué
au 1/10 dans du tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5. Après dilution, la solution est mise en contact pendant 18 h à
+ 4°C avec le support Sépharose-CNBr-EPIL 02 en agitation lente. Dea lavages sont effectués avec un tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5 en présence de 0,01 % NP40. La procédure est automatisée sur un équipement FPLC (Pharmacia). Le temps de lavage est conditionné par le retour de la densité optique au niveau de base. Lea fractions recueillies constituent l'effluent. L'élution de l'antigène lié à l'anticorps s'effectue avec un tampon d'aciçle acétique 2,5 %. Les fractions recueillies constituent l'éluat. L'effluent et l'éluant sont analysés par une technique d'immunoempreinte avec comme anticorps révélateurs EPIL 02, 7381 et 7383.
~ Chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse.
WO 99!09172 PCT/FR98/01799 Deux chromatographies successives sont ensuite réalisées sur les fractions recueillies après élution avec l'acide acétique 2,5 %. Ces fractions sont rassemblées puis déposées tout d'abord sur une colonne Lichrosorb RPB C8 5 7 um (250 mm x 4 mm) montée sur un système HPLC Beckman GOLD. Le chargement s'effectue en continu par une vanne externe avec un débit de 2 ml/mn et les fractions sont recueillies par collection automatique toutes les 30 secondes. Deux phases mobiles sont utilisées . phase A .
10 TFA 0,1 % - 99,9 % HZO et phase B . TFA 0,08 - 4,92 % H20 -95 % CH3CN. Une analyse des fractions recueillies après chromatographie phase inverse C8 est réalisée par électrophorèse et SDS-PAGE/immunoempreinte utilisant les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383.
15 5. Analyse par immunoempreinte.
La présence ainsi que les masses moléculaires relatives (Mr) des formes moléculaires du polypeptide recombinant EPIL sont déterminées par électrophorêse suivie d'immuno-empreintes. Brièvement, la méthode consiste â faire migrer 20 les préparations protéiques à tester dans un gel de polyacrylamide (30 % w/v acrylamide, 0,8 % w/v bis acrylamide ; Tris-Hcl 1,5 m, pH 8,8) pendant 30 minutes sous 200 volts. Aprës migration, les protéines sont transférées sur un support de type papier filtre PVDF sous 25 l'influence d'un champ électrique. Le support est ensuite saturé dans' un tampon de blocage puis incubé avec les anticorps. Après lavage, la liaison éventuelle des anticorps est révélée soit par un anticorps secondaire marqué â la peroxydase soit par la méthode au luminol (kit 30 ECL, Amersham, NW). Les masses moléculaires relatives sont calculées à partir des standards de référence. Dans ces conditions, les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383 rêvêlent plusieurs fractions positives après chromatographie phase inverse et correspondent â des temps d'élution différents.
35 Ces fractions référencées 7, 8, 9 et 16 contiennent différentes populations de protéines variant par leur masse moléculaire relative (figure 9). Ces masses relatives sont comprises entre 13 kDa et 32 kDa.
6. Analyse par spectrométrie de masse par ionisation à
électro-spray en mode positif Cette étude est réalisée sur un analyseur PlatformII
(Micromas Ltd) utilisant comme étalon le myoglobine de cheval (Masse moléculaire . 16 951,50 t 0,17 Da). La fraction 7 obtenue aprës chromatographie phase inverse et positive après une analyse d'immunoempreinte avec les 3 anticorps EPIL 02, 7381 et 7383, est lyophilisée puis reprise dans une solution de CH3CN/H20 (V/V) et acide formique 0,1 %. L'analyse de cet échantillon révèle un mélange de deux produits présentant des masses moléculaires expérimentales moyennes .
75 M1 . 13 346,62 t 2,14 Da et M2 . 15 491,86 t 3,46 Da.
La masse moléculaire théorique du polypeptide EPIL 1 (1-139) correspond à une masse de 15.445,05 Da. La différence de masse de 43 Da par rapport â la masse moléculaire expérimentale M2 pourrait être attribuée à un groupement acétyl (CH3-CO-).
Ces résultats suggèrent la présence dans l'échantillon de la molécule EPIL 1 acétylée en position N-terminale.
Une masse moléculaire théorique égale à 13.347,46 Da est calculée lorsque les 18 premiers acides aminés du polypeptide EPIL 1 sont dëlétés et que 3 ponta disulfures sont réalisés entre les 6 cystéines. La masse expérimentale trouvée (13.346,62 t 2 Da) est proche de cette masse théorique calculée. Cette observation pourrait suggérer que la deuxiëme molécule présente majoritairement dans l'échantillon correspond à la molécule EPIL 1 sans le peptide signal 1-18 et avec une structure tertiaire présentant 3 ponts disulfures.
Production de la forage extra courte en cellules C80 Les étapes suivantes sont réalisées .
1. Construction La séquence codante correspondant à la forme extra courte INSL4 est clonée dans le vecteur d'expression eucaryote pSec Tag C~ (INVITROGEN) au site BamHl-Xbal (schéma figure 6). En parallèle, un vecteur de référence pSec Tag C, digéré par les mêmes endonucléasea de restriction (pSec Tag C MOCK), est construit. Après transformation de bactéries TOP10 (INVITROGEN), un clone recombinant est sélectionné 1/ par analyse par PCR, 2/ par une étude du profil de restriction de l'ADN recombinant vis-à-vis de différentes endonucléases (BamHl, Xbai, ECOR1) et 3/ par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN INSL4 et du site multiple de clonage du plasmide pSec Tag Ces) . La fonctionnalité du cadre ouvert de lecture est confirmée par une étude de transcription/traduction in vitro (TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation System, PROMEGA). Cette expérience met en évidence l'expression de deux espèces protéiques néosynthétisées.
Ces deux espèces, identifiées par l'anticorps 7381, spécifique du peptide C, et l' anticorps 7383 dirigé contre la chafne~ B, présentent des masses moléculaires respectivement égales à 15 et 20 kDa.
Afin d'obtenir une lignée produisant le polypeptide recombinant EPIL de façon stable, le vecteur d'expression ayant intégré le gène INSL4 est transfecté dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (lignée CHO). Deux méthodes de transfection peuvent être utilisées . la méthode au Phosphate de Calcium et l'électroporation.
L'utilisation de 10 à 20 ~g d'ADN plasmidique permet l'intégration génomique de l'ADN recombinant INSL4. Grâce à
la présence d'un marqueur de résistance aux antibiotiques présent dans le vecteur, les clones cellulaires recombinants stables, ayant intégré pSec Tag C INSL4 , sont sélectionnés par culture dans un milieu contenant 600 ~g/ml de ZEOCINTM (INVITROGEN).
2. Northern blot Les clones sélectionnés sont établis en culture.
L'étude de l'expression des transcrits pSec TagC INSL4 est rëalisée par Northern blot aprés extraction des ARNm. Vingt quatre heures après hybridation de la sonde INSL4 (insert BamHl-Xbal), l'expression du transcrit recombinant pSec Tag C INSL4 est mise en évidence dans toutes les cellules transfectées. La taille de l'ARNm, 900 pb, correspond à
celle attendue pour le transcrit putatif (907 pb).
3. RT-PCR
L'expression du transcrit recombinant INSL4 dans les cellules CHO est aussi confirmée par une analyse en RT-PCR.
L'analyse par RT-PCR des ARNm extraite des cellules CHO
transfectées par la construction CHO-pSec Tag C MOCK
(vecteur vide contrôle) ainsi que de ceux extraits des cellules parentales CHO montre l'absence d'expression du transcrit recombinant INSL4 après 30 cycles d'amplification.
4. Détection du polypeptide recombinant La purification des diverses formes hormonales placentaires recombinantea produites à partir des milieux de culture ,et des cellules transfectées montre, par la méthode des immunoempreintes, la présence de formes protéiques de 16,5 et 20 kDa dans les cellules transfectées, ainsi que des espèces protéiques de 6,5, 10 et 16,5 kDa dans le milieu des cellules CHO transfectées pSec Tag C INSL4.
Dét~ctioa des formes phveioloaiaues exprimées du poil rpet~tide EPIL
L'existence des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL dans les tissus humains normaux est recherchée par une méthode immunohistochimique grâce aux anticorps décrits ci-dessus. Cette technique est réalisée sur du placenta dans la mesure o~1 le gène INSL4 a été cloné
â partir de ce tissu, sur du tissu vasculaire de cordon ombilical et sur un tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi.
A) Echantillona de tissu 1) Échantillons de tissu placentaire Des villosités placentaires obtenues à partir de placenta précoce (7 semaines) et à terme ont été fournies par le Service de Gynécologie obstétrique de l'Hôpital Antoine Béclère, France, selon les procédures appropriées par le comité éthique.
Les tissus sont fixés en tampon à pH neutre contenant 10 % de formol puis inclus en paraffine.
On utilise également des cellules de cytotrophoblastes villeux et de syncytiotrophoblastes préalablement purifiées de placenta â terme. L'isolement des cellules de cytotrophoblastes à partir de placenta villeux est effectué
comme décrit par Guillaudeux T. et al. (1995) par digestion enzymatique et centrifugation en gradient de Percoll comme pour les cultures primaires. Les cytotrophoblastes villeux et les syncytiotrophoblastes villeux différenciée, formés in vitro à partir de cytotrophoblastes (â 4-5 jours de culture), sont hautement purifiés (moins de 1 % de cellules contaminantes). Pour plus de clarté, les cellules purifiées de cytotrophoblastes villeux et les cellules différenciées in vitro de syncytiotrophoblastes sont dénommées ici cytotrophoblastea et syncytiotrophoblastes respectivement.
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires L'analyse immunohistochimique des vaisseaux embryon-naires a été réalisée à la fois sur des coupes de villosités trophoblastiques de 10 SA (hôpital Antoine 5 Hëclère) et d'un cordon ombilical d'un embryon humain de il SA (h8pital Robert Debré, France), ces 2 prélèvements ayant été obtenus dans le cadre d'interruption volontaire de grossesse.
3) Tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de 10 Kapoai 28 biopsies cutanées de SK classique et associé au SIDA
ont été recherchées aux archives de l'Institut Gustave-Roussy et utilisées pour immunohistochimie.
I1 s'agit de tissus fixés dans une solution de Bouin, 15 inclus en paraffine. Les coupes de tissus (3 ~cm) ont été
montées sur des lames SuperFrost/Plus et déparaffinées au Xylène. Les coupes, une fois réhydratéea, ont été chauffées par microondes (3 x Smin.) dans une solution de tampon citraté (10 mM, pH 6).
20 B) rmmunohistochimie 1) Échantillons de tissu placentaire On utilise des tissus placentaires âgés de 6 à 12 semaines (n = 6) et des tissus de placenta à terme (n = 2).
On réalise des coupes de tissus de 3 ~cm, montées sur des 25 plaques SuperFroat/Plua et dégraissées sur xylêne. Les coupes réhydratées sont passées sur micro-ondes pendant 15 minutes en présence de tampon citrate 10 mM, pH 6,0. Après plusieurs lavages en tampon phosphate salin (PHS), les coupes sont incubées pendant 20 mn en présence de 30 l'anticorps donné.
Les coupes sont ensuite lavées puis marquées par un anticorps biotinylé suivi par une phosphatase alkaline couplée â la streptavidine. La révélation du marquage est ensuite obtenue par incubation en présence de la solution 35 de substrat chromogène (Fuchsine DAKO, New Fuschin substrate syatem, Carpinteria, CA). Les coupes de tissus témoins contr8le négatif sont réalisées avec des coupes incubées en présence d'anticorps non spécifiques (sérum préimmun) ou en présence d'anticorps préabsorbés sur un excès de peptide correspondant (figure 7).
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires et tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi Aprés lavage par un tampon TBS (Dako), les coupes ont été incubées avec l'antisérum donné pendant 20 min., puis lavées et révélées en utilisant un complexe anticorps biotinylé suivi d'une phosphatase alcaline couplée à la streptavidine (PA-streptavidine). Le marquage est complété
après incubation avec une solution chromogène du substrat (DAKO New Fuchsin substrats system, Carpinteria, CA).
L'anticorps polyclonal 7381 (immun sérum dilué au 1:500) a été utilisé comme anticorps primaire. Il s'agit d'un anticorps reconnaissant l'EPIL 1 ou l'EPIL 3 puisque reconnaissant la région 59-108 de la chafne du polypeptide EPIL.
Les contr8les négatifs utilisés sont le sérum prëimmun (Jo) et le 7381 immunsérum inhibé par le peptide correspondant (59-108Y) avec une incubation de 18 heures.
Les autres anticorps (Ac) primaires ont été choisis comme témoins positifs permettant de confirmer le diagnostic de SK . Ac antifacteur VIII (phénotype endothélial) et Ac antiactine du muscle lisse alpha vasculaire (phénotype muscle lisse).
Les conditions d'inhibition des Ac 7381 sont réalisées par incubation pendant 18 heures en présence de .
150 ~1 Ac 7381 dilué au 1/250 et 150 ~,1 de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis) à 2 10-4 M équivalent à
300 ~1 Ac 7381 dilué au 1/500 pour 10-4 M de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis).
Pour l'immunomarquage des échantillons suivants .
- villosité trophoblastique n° X991 formol (12SA), 8785 (cordon ombilical) 320818(2)(SK), 293905-7 (SK), 240444 (SK) , 293626-1 (SK) (coupes de 3 ~.m-microtome) , les anticorps(Ac) suivants ont été utilisés .
- 7381 imun sérum anti chafne C (59-108Y) dilué au 1/500 ;
- 7381 JO (préimmun) dilué au 1/500 ;
- Ac anti-facteur VIII dilué au 1/30 ;
- Ac monoclonal de souris anti-active de muscle lisse alpha humain prédilué (Dako, code N 1584) (lA4).
Analyse des transcrite ARNm des evtotrophoblaates et des svncvtiotrophoblaetea Les ARNm d'INSL4 sont quantifiés par la méthode RT-PCR
(reverse transcriptase-polymérise chafne réaction) comme décrit dans Hellet, D. et al. (1997). Brièvement, les transcrits TFIID sont quantifiés et utilisés comme ARNm endogène de contr8le. La PCR est réalisée sur 30 cycles d'amplification. Les sëquences nucléiques des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont les suivantes .
INSL4-F . F 5'-AACTCCTTAGAGAAGCCTAGCA-3' INSL4-R . 5'-TCGTACCTAAGGCTTGTCCATCT-3' TFIID-F . F 5'-ACAGGAGCCAAGAGTGAAGAA-3' TFIID-R . 5'-CCAGAAACAAAAATAAGGAGA-3' (F . colorant fluorescéine).
RESULTATS
1) Tissu placentaire Deux anticorps, désignés 7381 et 1661, dirigés respectivement contre les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 ont été sélectionnés.
L'anticorps 7381 dirigé contre le domaine 59-108-Y de la channe C conjugué avec une protéine porteuse s'est révélé totalement spécifique du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3. En effet, les expériences d'inhibition compétitive réalisées avec des peptides ou des sous-peptides analogues de 1a portion de la chafne C du polypeptide putatif EPIL ou de la portion correspondante de la relaxine humaine, démontrent que l'anticorps 7381 se lie seulement au domaine C du polypeptide putatif EPIL au niveau de sa portion 59-88 et ne reconnaft pas la chafne C de la relaxine humaine (Figure 3A). L'hormone relaxine est le seul membre de la superfamille des insulin-like présentant un pourcentage significatif (37 %) de similitude avec .le polypeptide putatif EPIL dans la portion du domaine C correspondant à
la région 59-88 du polypeptide EPIL.
L'anticorps 1661 a été obtenu par immunisation rëalisée avec un mélange de deux peptides analogues au domaine 115 139 de la chafne A et au domaine 23-52 de la chafne B. Ces deux régions du polypeptide putatif EPIL ne présentent pas de pourcentage significatif de similitude avec des régions correspondantes d'autres membres de la superfamille (< 16 %). Les expériences d'inhibition compétitive démontrent que cet anticorps polyclonal est principalement dirigé contre le domaine 115-139 de la chafne A et contient également une sous-population d'anticorps dirigée contre le domaine 23-52 de la chafne B (Figure 3B). Le parallélisme des courbes de compétition d'antigènes observées avec les peptides chafne A et chafne B reflète plus vraisemblablement des affinités similaires de ces deux sous-populations d'anticorps pour leurs épitopes chafne A
et chafne B, puisque la structure primaire de ces deux régions distinctes ne présente pas de similitude significative.
Les méthodes immunohistochimiques basées sur les anticorps 7381 et 1661 ont été utilisées pour détecter la présence des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement dans les tissus de placenta précoce (moins de 3 mois) et de placenta à terme. La Figure 7 représente les résultats obtenus à partir d'expériences réalisées sur des tissus d'au moins deux femmes enceintes. L'immuno-marquage réalisé avec l'anticorps 7381 dirigé contre le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est très important dans les cytotrophoblastes de placenta précoce alors qu'il est léger voire absent dans les syncytiotrophoblastes (Figure 7B).
Dans le placenta é terme, de rares cytotrophoblastes présentent une coloration intense alors que les syncytiotrophoblastes ne présentent pas de coloration appréciable (Figure 7D). De plus, cet anticorps anti-polypeptide EPIL 1 marque les cellules foetales endothéliales vasculaires, particulièrement dans le placenta précoce (figure 7H).
Les résl~ltats obtenus avec l'anticorps 1661 anti polypeptide EPIL 2 montrent qu'é la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce sont colorés (Figure 7F). Par opposition, cet anticorps ne marque pas les trophoblastes de placenta â
terme (résultats non présentés).
Analyse des transcrits ARNm Les résultats obtenus par la méthode RT-PCR et la méthode d'analyse quantitative par PCR montrent que les niveaux de transcrits d'ARNm d'INSL4 dans les syncytio-trophoblastes villeux différenciés in vitro obtenus à
partir de placenta à terme, sont dix fois plus (une unité
log) élevés que ceux observés dans les cytotrophoblastes (Figure 8). Par opposition, les niveaux de transcrits TFIID
sont similaires dans les deux types de cellules.
La détection d'ARNm n'implique pas que les protéines sont synthétisées, comme par exemple pour l'expression HLA
classe I dans le placenta. En effet, les cytotrophoblastes villeux expriment les ARNm d'HLA classe I, mais ne synthétisent pas les protéines correspondantes, alors que les trophoblastes extravilleux transcrivent et traduisent les gènes HLA de la classe I (Hunt, J. S. et al., 1990).
Cependant, le placenta, qui transcrit un nombre important de gènes, est aussi une source de nombreux polypeptidea, incluant les facteurs de croissance de type insulin-like, qui sont connus pour étre essentiels au stade précoce du développement embryonnaire et, après la naissance, et pour participer â la croissance et à l'activité fonctionnelle de presque tous les organes du corps humain (Le Roith, D.
1997 ) .
*rB
Ces résultats montrent pour la première fois que les trophoblastes non seulement expriment l'ARNm de 1!INSL4, mais contiennent des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 immunoréactifs. D'autre part, il est d'un grand 5 intérêt d'observer que l'immunomarquage important des tissus trophoblastiques de placenta précoce obtenu l'EPIL
2, est similaire à ceux décrits pour plusieurs facteurs de croissance, incluant le TGFa et l'EGF (Horowitz, G. M. et al., 1993).
10 Un autre résultat surprenant est l'expression importante de polypeptides EPIL 1 et /ou EPIL 3 dans les cytotrophoblastes comparée aux syncytiotrophoblastes, alors que, à la fois les études d'hybridation in situ réalisées sur des placenta précoces (résultats non représentés) et 15 l'analyse quantitative par PCR compétitive réalisée sur des placenta à terme indiquant que les transcrits d'INSL4 sont plus abondants dans les syncytiotrophoblastes. De plus, les polypeptides EPIL 2 sont détectés à la fois dans les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta 20 précoce avec des intensités du marquage similaires dans les deux types de cellules.
Prises ensemble, ces observations montrent que, in vivo, la maturation de l'EPIL diffère dans les cytotrophoblastes en comparaison avec les syncytio 25 trophoblastes.
Dans la superfamille des insulin-like, les peptides C
de jonction ou chafne C sont les médiateurs de la formation de la structure tertiaire des protéines et en particulier de l'assemblage correct des trois ponts disulfures de 30 l'hormone mature.
Ces résultats montrent que dans les cytotrophoblastes, le peptide C du polypeptide putatif EPIL est maintenu alors que l'EPIL 2 présent dans les syncytiotrophoblastes ne présente pas de peptide C de jonction. Ainsi, nous pouvons 35 déduire de ces résultats et de ces observations que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 contenant le peptide C peut être sécrété à partir des cytotrophoblastes dans le liquide amniotique et que l'EPIL 2 ne contenant pas le peptide C
peut être sécrété à partir des syncytiotrophoblastes dans la circulation maternelle. L'EPIL 3, correspondant au peptide C est par définition également reconnu par les anticorps antichafne C, tels que l'anticorps 7381. Cette forme du polypeptide putatif EPIL et qui correspond au sous-produit de clivage aboutissant à l'EPIL 2, peut également avoir une activité biologique autre que celle de participer à la formation de la structure tertiaire de 90 l'EPIL (Ido, Y. et al., 1997, Steiner, D. F. et al., 1997).
Cette capacité d'excrétion sélective de peptides différents dans des compartiments biologiques variés a déjà été
illustrée par d'autres hormones polypeptidiques comme pour l'HCG et ses sous-unités libres.
D'autre part, il est remarquable de voir que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est (sont) présents) également dans les cellules foetalea endothéliales vasculaires. Des résultats récents (Zhou, Y. et al., 1997), ont montré que les cytotrophoblastes extravilleux sont plastiques et ont la capacité d'acquérir des caractéristiques de cellules endothéliales. Ainsi, ces résultats établissent en fait que les cytotrophoblastes villeux et les cellules foetales endothéliales doivent très certainement partager des caractéristiques phénotypiques communes. Ces résultats montrent également que le polypeptide 'EPIL, en particulier l'EPIL 1, est impliqué
dans le processus de différentiation des cellules trophoblastiques, et de maniére générale le polypeptide EPIL est trCa certainement impliqué dans le processus de différentiation, de prolifération et de régénération des cellules, en particulier endothéliales comme les cellules vasculaires.
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires L'objectif de la série d'expérience par immuno histochimie est d'étudier plus précisément les vaisseaux embryonnaires intravillositaires ainsi que du cordon ombilical du Ier, Ilème et IIIème trimestre.
En utilisant l'antisérum 7381 à une dilution de 1:500, les expëriences d'immunohiatochimie confirment ia présence d'un immunomarquage au niveau des vaisseaux embryonnaires des villosités flottantes, notamment au niveau des cellules endothéliales sur un cas de prélèvement trophoblastigue de 12 SA. Cependant, on note pour la première fois que les vaisseaux embryonnaires de villosités primaires présentent un immunomarquage des cellules constituant la paroi du vaisseau, les cellules musculaires lisses, alors que les cellules endothéliales ne sont quasiment plus marquées.
De même, ce phénomène parait s' amplif ier au niveau des vaisseaux du cordon ombilical (cf Figure 22) avec, au niveau de Ia veine et des 2 artëres un marquage des cellules de la média donc des cellules musculaires lisses, avec une disparition complète du marquage des cellules endothéliales(cf. Tableaux 1 et 2 ci-après).
Tableau 1 Cellules Cellules Musculaires Endothéliales Lisses Vx embryonnaires 1. villosité + ++
flottante 2. tronc primaire + ++
ou secondaire (villosité) 3. cordon ombilical - ++
Légende du tableau 1 . Détection immunohiatochimique (PA, Dako, LSAB2) du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 par l'immun sérum 7381 (dilution 1/500) au niveau des vaisseaux embryonnaires de villosités trophoblastiques (12 SA) et d'un cordon ombilical (AA SA) du ter trimestre de grossesse (coupe 3~). On observe tant au niveau des villosités trophoblastiques des troncs primaires(cf figure 21) qu'au niveau du cordon ombilical un immunomarquage plus important des cellules musculaires lisses. (média)(cf figure 22) par rapport aux cellules endothéliales. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante . (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ;
(++) marquage de forte intensité.
Tableau 2 7381 Ante 7381 7381 Anti active im sr .
Marquage/Tissu im.sr. . facteur alpha-JO inhib 1/500 1/500 1/500 VIII muscle lisse Cytotrophoblaste+ - - - -Syncytio- - - - - -trophoblaste Vx embryonnaires (tronc primaire)+ - - + +
endothlium Mdia ++ - - - ++
Cordon ombilical (ii sa) Mdia+ - NT* Endoth+ Mdia+
vx {3 vx) (3 vx} (3 vx) Amnion + - NT NT -Vestigea embry.
Sac vitellin + + - -Allantoide ++ - -* . non testé.
Légende du tableau 2 . Analyse immunohistochimique (PA, Dako, LSAB2) avec l'immun sérum 7381 anti-peptide C
(dilution 1/500), l'anticorps polyconal anti-facteur VIII
(Dako, Réf. A0082) et monoclonal anti-active a muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 ~) de villosités trophoblastiques (tronc primaire) et d'un cordon ombilical du ler trimestre de grossesse. On observe une similitude de marquage entre l'immun sérum 7381. Par ailleurs, on relève une absence de marquage par l'anticorps polyclonal 7381 pré
immun et l'immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y.
L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante . (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité.
Vestiges embry. . vestiges embryonnaires ; Endoth. .
endothélium ; Vx . vaisseaux ; NT . non testé ; Im.sér. .
immun sérum ; JO . sérum préimmun.
La lecture des lames correspondant au cordon ombilical (cf. tableau 2 et figure 22)) met également en évidence les vestiges embryonnaires endodermiques dont notamment la vésicule (ou sac) vitelline (yolk sac) et l'allantoï.de. Ces structures sont visibles aux c8tés des trois vaisseaux et sont marquées par l' immun sérum 7381 antichafne C. I1 est intéressant de souligner que l'allantoide, ainsi que le yolk sac (sac vitellin) sont des structures embryonnaires (d'origine endodermique) très importantes sur le plan de la vasculogénèse. En effet, ces structures sont le siège de processus de différenciation des cellules hémangioblastiques (dérivées du mésoderme) en cellules angioblastiques et hématopoiétiques. En outre, il est intéressant de rappeler que ce processus de différenciation correspondant aux premières étapes de la vasculogënèse (dès Ia 3~'"e semaine de gestation) et semble être induit pas le VEGF synthétisé par l'endoderme (Risau, W., 1997).
R8le du polypeptide EPIL dans le processus de décidualisation et d'implantation embryonnaire Le processus de dëcidualisation de l'endomètre est essentiel pôur que l'implantation de l'embryon puisse se faire. Ce processus est dépendant des hormones stéroides ovariennes, notamment de la progestérone. Une des modifications durant la décidualisation concerne les cellules stromales de l'endomètre. En effet, les cellules stromales subissent au voisinage du site d'implantation des modifications morphologiques (polygonale, cytoplasme de taille agrandie, aspect de cellules ëpithéloides) et fonctionnelles (riche en glycogène et lipide, sécrétion autocrine et/ou paracrine de prolactine, relaxine, renin, IGF et IGFBP) (Speroff, L. et al., 1995 ; Edwards, R.G., 1995) .
Plus récemment, il a été démontré que les facteurs de croissance de la famille EGF (EGF, TGF-alpha, HB-EGF, amphiregulin, heregulin, betacellulin, epiregulin) pourraient jouer un r8le important dans les mécanismes 5 d'initiation de l'implantation, notamment de l'attachement.
En effet, dans les modêles murins, l'expression du récepteur à l'EGF (EGF-R) régulée par la progestérone et l'E2 a été démontrée tant au niveau du blastocyste que des cellules atromales utérines, ce qui fait des molécules de 10 cette grande famille de l'EGF des ligands potentiels à
activité modulatrice de l'implantation (SK Das, International Symposium on Embryo Implantation, Octobre 1997). I1 est intéressant de noter que dans l'espëce humaine, une étude a démontré la localisation du 15 transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) dans l'endomètre, la décidue et le trophoblaste (Horowitz, G.M.
et al., 1993). En outre, la décidualisation de cellules stromales est accompagnée de changements dans la motilité
cellulaire qui implique une modification de la matrice 20 extracellulaire (sécrétion de laminine par les cellules stromales, par exemple). I1 apparaft chez. le rat que l'expression de bFGF ou fibroblast growth factor basique au niveau des cellules utérines stromales, est dépendante de la progestérone et pourrait être un facteur de croissance 25 co-régulant les cellules atromales et étre donc impliqué
dans le processus de différenciation (décidualisation). Les cellules stromales décidualisées synthétisent et sécrètent de la prolactine (PRL). Une étude in vitro de cellules endométriales atromales a montrë que la production de PRL
30 est probalement régulée par l'effet combiné des hormones stéroidiennes (oestrogène et projestérone) et d'un peptide, la relaxine (Huang, J.R. et al., 1987). Plus récemment, alors que la source de relaxine endogène est le corps jaune, la présence de relaxine au niveau de l'épithêlium 35 glandulaire et des cellules stromales de l'endomètre a été
démontrée ainsi que son r8le autocrine/paracrine sur la sécrétion de PRL par l'endomètre in vitro (Bryant-Greewood et al., 1993 ; Zhu, H.H. et al., 1990 ; Rosenberg, M. et al., 1991).
Lorsque l'on considère l'expression d'EPIL 1 ou 3, nous avons démontré par immunohistochimie avec l'immun sérum antichafne C un marquage des cellules stromales décidualisées, ainsi que de l'épithélium glandulaire endométrial de la caduque ou décidue pariétale et basale de grossesses du ler trimestre (cf Figure 23). I1 est intéressant de noter que de façon similaire aux facteurs de croissance de la famille de l'EGF, notamment le TGF-alpha, la localisation d'EPIL 1 ou 3 est retrouvée â la fois au niveau du trophoblaste et au niveau de la décidue (notamment au niveau des glandes endométriales et des cellules stromales). Ainsi, le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans le processus d'implantation au moment de l'attachement, à l'instar de TGF-alpha. De plus, le polypeptide EPIL devrait également être impliqué dans la différenciation des cellules stromales internes qui constituent un des changements cellulaires de la décidualisation. En effet, à l'instar de la relaxine, le polypeptide EPIL devrait avoir un r8le stimulateur sur la synthèse de PRL par les cellules stromales et participer ainsi au processus de décidualisation.
Par ailleurs, en raison d'un marquage des cellules trophoblastiques de phénotype non invasif (cytotrophoblaste intravilleux), il est raisonnable de penser que le polypeptide EPIL sécrété par les cellules stromales et par les cellules de l'épithélium glandulaire de l'endomètre devrait jouer un r8le dans le contr8le de l'invasion des cytotrophoblastes extravilleux au même titre que le TGF-béta (Giudice, L., 1994).
3) Dosage des différentes formes du polypeptide EPIL, application au dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique a) Méthode de dosage On utilise par exemple un dosage « sandwich ~ par immuno-radiométrie à 2 sites (IRMA) pour la détection et le dosage des formes de polypeptide EPIL obtenues obtenues par voie recombinante, dans différentes fractions dans les procédures de chromatographie ou dans les échantillons biologiques o~1 ces formes sont susceptibles d'être présentes. Ce dosage peut être réalisé par exemple en utilisant une phase solide, telle que des billes de polystyrène (Precision Plastic Ball, Chicago, MN), revêtues d'anticorps monoclonal EPIL 08 comme anticorps de capture, et en utilisant l'anticorps monoclonal EPIL 02 marqué â
l'125I comme indicateur radiomarqué. Les billes revêtues d'anticorps monoclonal EPIL 08 sont par exemple incubées 2 heures en présence de l'échantillon à contrôler dilué dans du sérum de veau. On peut par exemple utiliser comme témoins des peptides synthétiques tels que le peptide correspondant à la portion 76-139 de l'EPIL, dans une gamme de concentrations telle qu'une gamme allant de 5 ng/mL à
2000 ng/mL. La sensibilité du dosage obtenue, environ 50 ng/mL avec une incubation de 2 heures de l'échantillon à
analyser, peut être améliorée par exemple en procédant pour l'incubation à 2 étapes d'incubations de 6 et 18 heures, environ 10 ng/mL (Cf figure 19).
b) Application au dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique Le dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique de femme enceinte est réalisé par dosage immuno-radiométrique suivant la méthode décrite précédemment. Des concentrations de polypeptides EPIL allant de 10 â plusieurs centaines de ng/mL sont détectées chez les femmes enceintes. La figure 20 présente les résultats obtenus sur un panel de femmes, d'autres résultats ont montré que les concentrations peuvent atteindre plusieurs centaines de ng/mL.
c) Application au dosage de l'EPIL dans le sérum Le dosage de l'EPIL dans le sérum est réalisé par dosage immuno-radiométrique suivant la méthode décrite précédemment. Des concentrations de polypeptides EPIL
allant de 10 é l00 ng/mL sont détectées.
4) Sarcome de Kaposi L'objectif de la série d'expérience par immuno-histochimie est d'étudier l'expression du polypeptide EPIL
1 ou EPIL 3 au niveau de biopsies de SK.
Les différentes immunohistochimiea effectuées avec l'antisérum polyclonal antichafne C dirigée contre l'EPIL 1 et/ou l'EPIL 3 (ac 7381 immunsérum dilué au 1:500) ont permis de détecter les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau d'environ 50 % des 28 cas de SK. L'immunomarquage est localisé au niveau des cellules tumorales fusiformes ou apindle celle ainsi qu'au niveau de vaisseaux intratumoraux et/ou vaisseaux de type "slit-like" (sana endothélium) et le plus souvent dans des lésions tardives de type nodulaire. L'intensité de l'immunomarquage est modéré (+ é
++) dans la majorité des cas, avec cependant sur 8 cas l'observation d'un immunomarquage intense (+++). Sur les 4 cas de SK associés au SIDA, seul un cas présente un marquage faible à modéré au niveau des cellules tumorales, les autres étant tous nëgatifa.
L'expérience dont les résultats sont représentée sur le tableau 3 (cf. tableau 3 ci-après) a permis de confirmer un immunomarquage intense, noté(3) sur le tableau, au niveau de 4 SK cutanés classiques de stade nodulaire.
L'immunomarquage est relativement hétérogène localisé au niveau du cytoplasme des cellules tumorales fusiformes (SC). En "outre, tous les cas de SK montrent un immunomarquage par l'immun sérum 7381 de l'épithélium malpighien (peau) ainsi que des glandes sébacées. On peut sur 1 cas noter un effet de gradient de marquage avec une intensité de marquage de la peau plus importante dans la région susjacente à la tumeur. Le marquage cutané concerne plut8t les cellules basales de l'épithélium malpighien avec un marquage cytoplasmique et nucléaire. A relever que la peau normale(saine) n'a pas présenté d'immunomarquage par l'immun sérum 7381 lors d'expériences effectuées parallèlement.
WO 99/09172 PCT/FR9$/01799 Les contrôles négatifs tant le sérum préimmun (7381 JO) que l'immun sérum 7381 préabsorbé par le peptide 59-108Y ne montrent aucun marquage.
Les figures 10, 12, 14 et 16 (X 100, X 200, X 1000, X 400, respectivement) correspondent aux résultats obtenus pour un cas de Sarcome de Kaposi cutané de type classique après immunohistochimie (PA, Dako LSA82) avec l'immun sérum 7381 antichafne C (dilution 1:500).
On observe un marquage relativement homogéne des cellules tumorales (SC) d'intensité marquée (++). En revanche, les cloisons fibreuses ne sont pas marquêes (figures 10 et 14).
Les figures 11, 13, 15 et 17 (X 100, X 200, X 1000 et X 1000, respectivement) correspondent au contrôle négatif après inhibition de l' immun sérum 7381 par le peptide 59 108 Y (18 heures d'incubation) en utilisant la même technique d'immunohistochimie. On observe une absence de marquage complète.
Tableau 3 7381 Anti 7381 im. 7381 im Ante actine sr Marquage sr. . facteur alpha-.
JO
inhib /Tissu 1/500 1/500 VIII muscle lisse Sarcome de Kaposi N1 S.C. ++ - + +
E.M. ++ - _ - -(noy>cyt) rsb ++
Vx + - - qq ++ (mdia et (Endoth.) cloison fibreuse) sarcome de Kaposi N2 S.C. ++ - - + qq ++ (<5 t) E.M. ++ - - - -(nooy>cyt) Vx - - - qq ++ +
(Endoth.) (mdia) Sarcome de Kaposi N3 S.C. ++ - -E.M. ++ - - - -(noycyt.
Couche basale ++) Vx - - - - ++
(mdia)(i0t) Sarcome de ' Kaposi N4 S.C. ++ - - - ++ (30 E.M. ++ - - - -(noycyt.
Couche basale ++) Vx - - - - ++
(mdia) SC . Spindle celle (cellules tumorales) Vaisseaux ; Vx . ;
5 EM . Epithlium malpighien Noyau ; nb . nombreux ; Noy . ;
qq . quelques ; Cyt . Cytoplasme Légende du tableau 3 . Analyse immunohistochimique (Pa, Dako, LSAB2) avec l'immun sérum 7381 antichafne C (dilution (1/500), l'anticorps polyclonal antifacteur VIII (Dako, Rëf. A0082) et monoclonal anti-active a muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 ~) de biopsie cutanée de Sarcome de Kaposi (type classique) au stade histologique nodulaire.
On observe que l'immun sérum 7381 marque les cellules tumorales "spindle celle" du SK de façon plus marquée et plus étendue que l'anticorps polyclonal antifacteur VIII et .monoclonal anti-active a muscle lisse. En outre, on note un marquage de l'épithélium malpighien de la peau .par l'immun sérum 7381 tant nucléaire que cytoplasmique avec une prédominance au niveau de la couche basale. On note une absence de marquage au niveau des quatre cas de SK lorsque l'anticorps polyclonal 7381 pré immun et l'immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y sont utilisée. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante . (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité.
Mises en évidence par immunohistochimie sur des biopsies et par dosage sérique, les cellules de SK semblent sécréter des cytokines dont certaines sont des facteurs angiogéniquea (VEGF, FGF-b, PDGF). Récemment, par IH et HIS, les kératinocytes épidermiques bordant une région ulcérée ou dans une région hyperplasique semblent être une des sources de VEGF. En outre, l'expression de l'ARNm des récepteurs KDR et flt-1, deux récepteurs tyrosine kinase de la cellule endothéliale, semble étre augmentée dans les cellules de SK elles-mémes, ce qui serait en faveur d'une double action paracrine (Kératiriocytes et macrophages) et autocrine directe de VEGF sur la cellule de SK (Brown et al., 1996). Plus récemment, Masood et al. (1997) ont démontré que le VEGF est un facteur de croissance autocrine pour le SK associë au SIDA faisant de lui le facteur angiogénique probablement le plus important dans ce type de tumeur.
Ces résultats montrent que l'expression du gène INSL4 appartenant à la famille de l'insuline, est localisée notamment au niveau du placenta, du cordon ombilical et au niveau de cellules tumorales telles que celles du sarcome de Kaposi. Des anticorps monoclonaux et polyclonaux ont été produits contre différente peptides synthétiques correspondant aux différentes chafnes A, C et B de polypeptide putatif natif.
Les anticorps polyclonaux de lapin reconnaissant la chaîne C (7381 immun sérum) et la chafne A et B (1661 immun sérum) ont permis de mettre en évidence le polypeptide EPIL
1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement au niveau du placenta avec une expression du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau des cellules cytotrophoblastiques. En outre, nous avions observé un surprenant marquage des cellules endothéliales embryonnaires intravillositaires par l'Ac polyclonal 7381. Récemment, Zhou et al. (1997) a montré combien la différenciation des cytotrophoblastes extravilleux en cellules à phénotype endothélial était importante dans la physiologie du développement placentaire. Notre observation, en revanche, objectivant l'immunomarquage du polypeptide EPIL 1 et /EPIL 3 au niveau cytotrophoblastique et des vaisseaux embryonnaires intra-villositaires nous permet d'en déduire que le polypeptide EPIL jouerait un r8le essentiel dans la vasculogénëse embryonnairë comme cela a été récemment démontré pour le VEGF, une cytokine angiogénique induisant la prolifération de cellules endothêliales et une augmentation de perméabilité vasculaire (Risau et al., 1997). En effet, il est intéressant de noter que Clark et al. en 1996 a démontré par immunohistochimie la présence de la protéine VEGF ainsi que de son récepteur Flt-1 au niveau du cytotrophoblaste intravilleux et de l'endothélium des vaisseaux embryonnaires intravillositaires.
Ces homologies d'immunomarquage avec le VEGF et d'autres cytokines que noua avons mis en évidence par la présence du polypeptide EPIL au niveau d'une tumeur angioproliférative, le Sarcome de Kaposi, montrent également que le polypeptide EPIL serait impliqué en tant que facteur de croissance des cellules tumorales comme le VEGF et d'autres cytokines dont leur r8le est bien connu.
En outre, il apparaft que l'IGF-I, un membre de la famille de l'insuline, induit l'expression de VEGF dans le cancer colorectal ainsi que sur un modèle in vitro d'ostéoblastes (Goad et al., 1996).
Ainsi ces résultats montrent que le polypeptide EPIL
est très certainement lié au processus de vasculogenèse embryonnaire et d'angiogenèse tumorale.
'v' 'k u 1 1 et /oui) Rappel du role physiologique de l'insuline Les hydrates de carbone (HC) ou glucides constituent la source principale d'énergie de l'organisme. Des systèmes régulateurs assurent un ajustement constant entre les besoins en HC et la formation de glucose. Les organes intervenant dans cette régulation sont le pancréas et le foie. Les cellules béta des flots de Langerhans du pancréas sont le lieu de synthëse et de sécrétion de l'insuline, mais aussi du glucagon et de la somatostatine. Le foie a une fonction de stockage du glucose par glycogenèae (comme les adipocytes) et de synthése du glucose par néoglucogenèse. I1 a comme fonction vitale de mettre du glucose â disposition par glycogénolyse en cas de besoin (hypoglycémie).
La proinsuline est formée de deux chafnea A et B avec une chafne C appelée peptide de connexion. L'insuline est biologiquement active après avoir subi un clivage de son peptide C. Elle agit sur un récepteur transmembranaire de la famille des tyrosine kinase qui par l'intermédiaire d'une cascade de phosphorylation intervient sur la régulation des enzymes des différentes voies métaboliques (glucide, lipide et protide).
L'insuline a pour principal r8le de permettre l'utilisation du glucose par la cellule ainsi que la synthèse des lipides et des protéines (anabolisme).
~ L'utilisation du glucose est facilitée, par exemple, dans le muscle/adipocyte par une action stimulatrice du glucose et de l'insuline sur son transporteur (GLUT-4).
L'insuline stimule ou inhibe l'expression d'une série d'enzymes intervenant dans la voie métabolique du glucose d'Emden-Meyerhof comme la glucokinase (GK), PFK2 et LPK
(action stimulante de l'insuline), PEPCK et F-1,6-P2ase (action inhibitrice de l'insuline). Par l'action de l'insuline, le glucose est alors métabolisé en pyruvate et l'actate, puis en C02, H20 et ATP après passage dans le cycle de Krebs ou cycle de l'acide citrique (au niveau des mitochodries par phosphorylation oxydative). I1 faut noter qu'une autre voie de dégradation du G6P (glucose 6-phosphate) est possible, la voie des pentoses phosphate, également stimulée par l'insuline et responsable de ia formation NADPH+, coenzyme essentiel â la biosynthêse des lipides. En outre, la voie des pentoses est la source de ribose essentiel pour la synthèse d'acide nucléique.
~ La synthése des lipides est également facilitée par l' insuline et se fait à partir de l' acétyl (CoA) . I1 y a aussi stimulation de la synthése des protéines par l'insuline.
Physiopathologie du diabéte I1 existe deux types de diabète . le type I ou diabète juvénile. I1 s'agit d'une maladie auto-immune caractérisée par une destruction des flots de Langerhans, donc pas une carence en insuline ; le type II ou diabète de l'adulte est en revanche caractérisé par une résistance à l'insuline.
Le diabête gestationnel . son diagnostic se fait pendant la grossesse (hyperglycémie à jeun) et généralement disparaft après l'accouchement. Durant le second trimestre, le taux d'insuline augmente considérablement en partie par l'augmentation d'activité hormonale anti-insuline. En effet, le placenta produit des hormones diabétogéniques comme l'hormone placentaire lactogène humaine (hPL), les oestrogènes et la progestérone. En outre, la prolactine pituitaire ainsi que le cortisol sont des antagonistes de l'insuline.
5 Les mécanismes physiopathologiques sont probablement multiples. On a mis en évidence, par exemple, une augmentation de la dégradation de l'insuline pendant la grossesse. Cette dégradation esst causée par des enzymes placentaires comparables aux insulinases hépathiques 10 (Freinkel, N. et al., 1991). Par un phénomène combinant d'une part la résistance à l'insuline d'origine hormonale (hPL, PRL) et l'augmentation de la dégradation de l'insuline, le taux d'insuline à disposition diminue et un mécanisme d'hypersécrétion pancréatique régulateur est 15 alors mis en route. Si le pancrëas présente un dysfonctionnement, il ne pourra répondre à ce nouvel état physiologique de la grossesse et une intolérance au glucose voire un diabète gestationnel peut en résulter (Becker, K.L. et al., 1990).
20 Les complications du diabéte La complication majeure est d'ordre cardiovasculaire.
Les mécanismes sous-jacents à cette complication diabétique sont ceux de l'athérosclérose et constitue la macro-angiopathie diabétique. Brièvement, dans le diabète, la 25 cellule endothéliale des vaisseaux subit différentes agressions physiques et chimiques comme l'hypertension artérielle, l'hyperglycémie, et l'hypercholestérolémie. Ces lésions répétées de l'endothélium vasculaire mènent par l'intermédiaire des macrophages, des plaquettes et des 30 facteurs de croissance à l'accumulation progressive de cellules musculaires lisses, de matrice extracellulaire et de lipides au niveau de l'intima et de la média. Ce sont ces lésions qui contribuent au rétrêcissement de la lumière vasculaire.
35 Fonctions insulin-like du polypeptide EPIL
~ EPIL est une protéine de type ORP (oxygen-related protein) ou GRP (glucose-related protein) comme le VEGF.
A partir du troisième trimestre, le placenta devient l'organe par lequel les échanges foeto-maternels se font notamment par l'intermédiaire d'un réseau vasculaire embryonnaire considérablement développé. I1 est intéressant de rappeler que récemment certains travaux ont démontré le rôle du VEGF dans la vasculogenèse embryonnaire avec une expression augmentée dès la 3~me semaine de gestation dans l'endoderme, responsable de la différenciation du mésenchyme sus-jacent en hémangioblastes (Rieau, W., 1997).
En outre, il a été démontré que le VEGF est une protéine régulée par l'oxygène (ORP) et le glucose (GRP). En effet, Stein et al. en 1995 démontre que l'hypoxie et l'hypoglycémie semblent augmenter l'expression du VEGF
notamment par un mécanisme de stabilisation de son ARN
messager (Stein, I. et al., 1995). De façon similaire, le transporteur du glucose GLUT-1 est stimulé par hypoglycémie et permet â la cellule dans un environnement hostile d'utiliser le maximum de glucose comme source d'énergie (Stein, I. et al., 1995).
Le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans ces processus de réponse à un stress soit hypoxique soit hypoglycémique par un effet insulin-like. En effet, en addition de l'homologie de structure du polypeptide EPIL et de l'insuline comme décrit précédemment, nous avons clairement démontré par immunohistochimie une localisation cellulaire similaire entre EPIL et VEGF avec un marquage du cytotrophoblaste, des cellules musculaires lisses des vaisseaux embryonnaires ainsi que des vestiges embryonnaires au niveau du cordon ombilical. La coexpression du polypeptide EPIL et VEGF au niveau de cellules et tissus identiques permet d'établir plusieurs mécanismes possibles. Comme nous l'avons dit plus haut, l'insuline permet une utilisation du glucose intracellulaire et permet par conséquent à la cellule de produire de l'ATP, du ribose (voie des pentoses).
L'insuline est une hormone anabolique permettant de plus la biosynthêse des lipides et protéines. Tant au niveau WO 99/09172 PC"T/FR98/01799 placentaire qu'au niveau d'un tissu néoplasique, le taux de division cellulaire est important et le besoin énergétique plus important. Si le processus de néovascularisation est important pour la survie d'un tissu en situation de stress (VEGF), il est vraisemblable que le polypeptide EPIL par un effet insulin-like para/autocrine intervienne dans ce processus en favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
~ Effet insulin-like d'EPIL et le placenta.
Le placenta est jusqu'à la fin du premier trimestre dans un environnement d' hypoxie relative . De même, on peut penser qu'en terme de nutriments notamment de glucose il se trouve trës certainement dans un état hypoglycémique.
Pourtant, il s'agit d'un tissu hautement mitogénique de type pseudotumoral, donc en besoin énergétique augmenté.
Aussi, le fait de produire une molécule à effet insulin-like avec amélioration de l'utilisation du glucose permettrait au placenta de poursuivre son développement et sa croissance. En outre, il faut rappeler que le placenta est â l'origine de la dégradation de l'insuline et qu'il est à l' origine de protéines diabétogènes comme l' hPL, les oestrogènes et la progestérone. Le polypeptide EPIL devrait ainsi jouer le r8le de l'insuline par un effet insulin-like auto/paracrine.
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1. Synthèse des peptides et préparation des immunogènes Des peptides synthétiques sont construits selon la méthode conventionnelle en phase solide sur un automate Applied Biosystems model 431A. Les peptides synthétisés sont prësentës lors de la description des anticorps (voir 3). Ces peptides sont purifiés par une chromatographie d'exclusion suivie d'une HPLC puis ils sont analysés (composition en acides aminés et séquençage peptidique).
Ils sont ensuite conjugués à des protéines porteuses afin de préparer des immunogênes.
2. Production et caractérisation des anticorps polyclonaux et monoclonaux La production des anticorps polyclonaux est réalisée par injection des immunogènes (conjugués peptide-protéine porteuse) chez des lapins femelles « Grand Fauve de Bourgogne x âgés de 70 jours environ. L'immunogène (150 ug) est injecté par voie intradermique multipoints au niveau du dos en présence d'adjuvant complet de Freund dans du sérum physiologique. Deux rappels suivants sont effectués à
respectivement J+21 et J+42 par injection de 25 ~g d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanëe. Un troisième rappel peut être effectué à J+7o. Une semaine après le rappel, un prélèvement de sang est réalisé
au niveau de l'oreille pour tester la présence d'anticorps.
Les lapins « bons rêpondeura ~ sont saignés à blanc par ponction intracardiaque.
La production des anticorps monoclonaux est réalisée par la technique d'hybridation cellulaire. Brièvement, des souris de souche BALB/c sont immunisées par l'injection de 50-100 ~cg de conjugué peptide-protéine porteuse en adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. Des rappels par voie infra-péritonéale (25 ~cg d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund) sont réalisés à trois mois d'intervalle jusqu'à obtenir une réponse immune, attestée par la présence d'anticorps détectables dans le sérum de 5 l'animal. La fusion cellulaire est effectuée 3 jours après injection i.v. Cintra veineuse) de l'immunogène. Elle consiste à prélever puis dissocier la rate de la souris et, dans un second temps, fusionner par le polyéthylèneglycol (PEG 1000) les lymphocytes ainsi libérés avec des cellules 10 myélomateuses, entretenues en culture continue: Les hybridomes sont sëlectionnés en milieu sélectif contenant de l'aminoptérine. La production d'anticorps monoclonaux par les hybridomes est analysée par une méthode immuno-enzymatique en phase solide (liaison au peptide 15 immunogène). Les hybridomes producteurs sont clonés deux fois par dilution limite et la production en masse d'anticorps est réalisée par injection des hybridomes en intrapéritonéal chez la souris Nude. Les anticorps monoclonaux sont ensuite purifiés à partir des liquides 20 d'ascite par une méthode de chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A (Pharmacia) après précipitation des protéines au sulfate d'ammonium.
Les caractéristiques de liaison des anticorps sont établies par des méthodes immunoenzymatiquea en phase 25 solide (ELISA) et radioimmunologiques CRIA). Brièvement, la méthode ELISA est réalisée en adsorbant un ou plusieurs peptides mimant une séquence d'un domaine du polypeptide putatif EPIL, dilué dans un tampon Phosphate 0,1 M, pH 7,4, sur un support solide (plaque de polystyrène COSTAR/EIA).
30 Après une incubation de 18 heures à + 4° C, les supports sont saturés par une solution d'albumine et les anticorps â
tester sont ajoutés pour une incubation de 1 heure â 37°C.
Après lavage, la liaison des anticorps est détectée par l'addition d'un anticorps secondaire marqué à la peroxydase 35 (RAM/IgG (H+L) Po, TEBU). La solution de chromogène (o-phénylène diamine) en présence d'Hz02 permet de révéler la réaction enzymatique. Une méthode par inhibition WO 99/09172 PCTlFR98/01799 compétitive peut être réalisée pour préciser la localisation des sites reconnus par les anticorps. Pour cela, les anticorps sont préalablement incubés avec des peptides synthétiques à différentes concentrations, par exemple représentatifs de séquences plus courtes que celle du peptide adsorbé sur le support. Le mélange est ensuite déposé sur le support et l'activité anticorps résiduelle est mesurée. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la liaison. La méthode RIA est développée de façon semblable, excepté le tait que le peptide est radiomarqué par un isotope l2sl selon le procédé dit du Iodogène. Les complexes immuns potentiellement formés avec l'anticorps sont précipités par le polyéthyléne glycol (PEG
6000) et, après lavage, la radioactivité est mesurée. I1 est aussi possible de réaliser une expérience d'inhibition compétitive comme décrit ci-dessus.
3. Caractéristiques des anticorps Les nombres associés aux séquences ci-dessous correspondent aux positions des acides aminés définies dans la séquence d'acides aminés de la figure 1.
Trois anticorps polyclonaux et deux anticorps monoclonaux dirigés contre des peptides synthétiques sont décrits ci-dessous .
~ Un anticorps polyclonal, numéroté 7381, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108 Tyrosine (Y) de la chafne C putative (figure 2) couplé par la benzidine à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse. Cet anticorps se lie à la séquence 59-108 du domaine C du polypeptide EPIL (figure 3A). I1 ne reconnaft pas la séquence analogue dans la relaxine H2 (RLX-H2), protéine qui présente la plus forte similitude structurale (67 %) dans le domaine C. Cet anticorps est capable de détecter le polypeptide recombinant comportant le domaine C, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, et de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 physiologique, par exemple au niveau du placenta (voir exemple 4 , concernant l'immunohistochimie).
~ Un anticorps polyclonal, numéroté 1661, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences 23-52 de la chafne B putative et 115-139 de la chafne A putative (figure 2) couplés par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse. Cet anticorps polyclonal comporte des anticorps majoritairement dirigés contre la région 115-139 de la chafne A et dans une moindre mesure contre la séquence 23-59 de la chafne 8 (figure 3B). I1 permet de détecter un polypeptide recombinant comportant les domaines A et/ou B, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, ainsi que le polypeptide EPIL natif et ses formes moléculaires comportant les domaines A et/ou B, tels que par exemple les polypeptides EPIL 1 et EPIL 2 (voir exemple 4).
~ Un anticorps polyclonal, numéroté 7383, et obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences (31 49) + (31-50) + (31-51) + (31-52) + (31-53) de la chafne B
putative couplés par le MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succimimide) à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse (figure 4).
~ Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 02 (IgG2a), est sélectionné après immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 125-137-Y de la chafne A putative couplé par la benzidine â
l'anatoxine tétanique, protéine porteuse (figure 5). Cet anticorps est utilisable pour la préparation de colonne de chromatographie d'affinité permettant de aëparer et de purifier le polypeptide d'origine recombinante (voir exemple 2).
~ Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 08 (IgG2a), est sélectionnê aprés immunisation de souris avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108-Y de la chafne C putative couplé à la protéine porteuse. Cet anticorps reconnaft une séquence longue de 13 résidus d'acide aminé comprenant la portion 88-100 de la chafne C comme le montre les résultats obtenus par inhibition compétitive (Cf figure 18).
Production de la forme extra courte en cellule SF9 Les étapes suivantes sont réalisées .
1. Construction dans le vecteur d'expression pFastBacT""
La forme extra courte INSL4 (séquence codante) est insérée dans le vecteur d'expression d'eucaryote inférieur (baculovirus) pFastBacT"" (GIBCOBRL) au site Kpnl. Par la suite, une coinfection des cellules d'insecte SF9 par de l'ADN du baculovirus sauvage (AcMNPV, GIBCOBRL) et du vecteur de transfert contenant le gène d'intérêt est réalisée, afin de constituer une recombinaison homologue.
2. Séquençage Afin de vérifier la présence et l'orientation de la séquence codante INSL4 dans la construction recombinante, l'analyse du profil de restriction de l'ADN recombinant est réalisée grâce ê différentes endonucléases (Kpni, EcoRi) et par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN
INSL4 et du site multiple de clonage du bacmide pFastHacT"".
3. Analyse de l'expression du polypeptide EPIL
Après infection des cellules ovariennes d'insecte (Spodoptera frugiperda 9) et amplification du titre viral, l'expression du polypeptide recombinant EPIL, codé par le gène INSL4, est analysée par SDS-PAGE suivi d'immuno-empreintes.
4. Purificâtion et caractérisation du polypeptide recombinant EPIL
~ Solubilisation des protéines.
Environ 200 x 106 cellules Sf9 infectées sont centrifugées. Le culot de centrifugation est repris dans 1 ml de tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5 contenant 0,1 % NP 40 et 5 ~g/ml de leupeptin. Aprês agitation par basculement pendant 4 h â 4°C, le mélange est centrifugé 10 mn é
14 000 t/mn à + 4°C. Le surnageant est récupéré pour les étapes suivantes.
~ Chromatographie d'affinité.
Dans un premier temps, une colonne de Sépharose-CNBr EPIL 02 est préparée de la façon suivante. Trois grammes de gel sont mis à gonfler dans 20 ml d' HC1 pendant 4 heures .
Le gel est ensuite introduit dans une colonne (20 x 1,5 cm) puis rincé avec une solution de couplage (NaHC03 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,5). Après élimination de celle-ci, 1,5 à
4 mg d' anticorps monoclonal purifié EPIL 02, dilué dans la solution de couplage, sont ajoutés. Aprês 18 heures à + 4°C
sous agitation, les sites libres sont bloqués avec de l'éthanolamine 1 M puis la colonne est lavée avec une solution de CH3COONa 0,1 M, CH3COOH 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH
4. Enfin, la colonne est rincée par Na2HP04 0,05 M, pH
8,5.
Le surnageant récupéré après solubilisation est dilué
au 1/10 dans du tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5. Après dilution, la solution est mise en contact pendant 18 h à
+ 4°C avec le support Sépharose-CNBr-EPIL 02 en agitation lente. Dea lavages sont effectués avec un tampon Na2HP04 0,05 M, pH 8,5 en présence de 0,01 % NP40. La procédure est automatisée sur un équipement FPLC (Pharmacia). Le temps de lavage est conditionné par le retour de la densité optique au niveau de base. Lea fractions recueillies constituent l'effluent. L'élution de l'antigène lié à l'anticorps s'effectue avec un tampon d'aciçle acétique 2,5 %. Les fractions recueillies constituent l'éluat. L'effluent et l'éluant sont analysés par une technique d'immunoempreinte avec comme anticorps révélateurs EPIL 02, 7381 et 7383.
~ Chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse.
WO 99!09172 PCT/FR98/01799 Deux chromatographies successives sont ensuite réalisées sur les fractions recueillies après élution avec l'acide acétique 2,5 %. Ces fractions sont rassemblées puis déposées tout d'abord sur une colonne Lichrosorb RPB C8 5 7 um (250 mm x 4 mm) montée sur un système HPLC Beckman GOLD. Le chargement s'effectue en continu par une vanne externe avec un débit de 2 ml/mn et les fractions sont recueillies par collection automatique toutes les 30 secondes. Deux phases mobiles sont utilisées . phase A .
10 TFA 0,1 % - 99,9 % HZO et phase B . TFA 0,08 - 4,92 % H20 -95 % CH3CN. Une analyse des fractions recueillies après chromatographie phase inverse C8 est réalisée par électrophorèse et SDS-PAGE/immunoempreinte utilisant les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383.
15 5. Analyse par immunoempreinte.
La présence ainsi que les masses moléculaires relatives (Mr) des formes moléculaires du polypeptide recombinant EPIL sont déterminées par électrophorêse suivie d'immuno-empreintes. Brièvement, la méthode consiste â faire migrer 20 les préparations protéiques à tester dans un gel de polyacrylamide (30 % w/v acrylamide, 0,8 % w/v bis acrylamide ; Tris-Hcl 1,5 m, pH 8,8) pendant 30 minutes sous 200 volts. Aprës migration, les protéines sont transférées sur un support de type papier filtre PVDF sous 25 l'influence d'un champ électrique. Le support est ensuite saturé dans' un tampon de blocage puis incubé avec les anticorps. Après lavage, la liaison éventuelle des anticorps est révélée soit par un anticorps secondaire marqué â la peroxydase soit par la méthode au luminol (kit 30 ECL, Amersham, NW). Les masses moléculaires relatives sont calculées à partir des standards de référence. Dans ces conditions, les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383 rêvêlent plusieurs fractions positives après chromatographie phase inverse et correspondent â des temps d'élution différents.
35 Ces fractions référencées 7, 8, 9 et 16 contiennent différentes populations de protéines variant par leur masse moléculaire relative (figure 9). Ces masses relatives sont comprises entre 13 kDa et 32 kDa.
6. Analyse par spectrométrie de masse par ionisation à
électro-spray en mode positif Cette étude est réalisée sur un analyseur PlatformII
(Micromas Ltd) utilisant comme étalon le myoglobine de cheval (Masse moléculaire . 16 951,50 t 0,17 Da). La fraction 7 obtenue aprës chromatographie phase inverse et positive après une analyse d'immunoempreinte avec les 3 anticorps EPIL 02, 7381 et 7383, est lyophilisée puis reprise dans une solution de CH3CN/H20 (V/V) et acide formique 0,1 %. L'analyse de cet échantillon révèle un mélange de deux produits présentant des masses moléculaires expérimentales moyennes .
75 M1 . 13 346,62 t 2,14 Da et M2 . 15 491,86 t 3,46 Da.
La masse moléculaire théorique du polypeptide EPIL 1 (1-139) correspond à une masse de 15.445,05 Da. La différence de masse de 43 Da par rapport â la masse moléculaire expérimentale M2 pourrait être attribuée à un groupement acétyl (CH3-CO-).
Ces résultats suggèrent la présence dans l'échantillon de la molécule EPIL 1 acétylée en position N-terminale.
Une masse moléculaire théorique égale à 13.347,46 Da est calculée lorsque les 18 premiers acides aminés du polypeptide EPIL 1 sont dëlétés et que 3 ponta disulfures sont réalisés entre les 6 cystéines. La masse expérimentale trouvée (13.346,62 t 2 Da) est proche de cette masse théorique calculée. Cette observation pourrait suggérer que la deuxiëme molécule présente majoritairement dans l'échantillon correspond à la molécule EPIL 1 sans le peptide signal 1-18 et avec une structure tertiaire présentant 3 ponts disulfures.
Production de la forage extra courte en cellules C80 Les étapes suivantes sont réalisées .
1. Construction La séquence codante correspondant à la forme extra courte INSL4 est clonée dans le vecteur d'expression eucaryote pSec Tag C~ (INVITROGEN) au site BamHl-Xbal (schéma figure 6). En parallèle, un vecteur de référence pSec Tag C, digéré par les mêmes endonucléasea de restriction (pSec Tag C MOCK), est construit. Après transformation de bactéries TOP10 (INVITROGEN), un clone recombinant est sélectionné 1/ par analyse par PCR, 2/ par une étude du profil de restriction de l'ADN recombinant vis-à-vis de différentes endonucléases (BamHl, Xbai, ECOR1) et 3/ par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN INSL4 et du site multiple de clonage du plasmide pSec Tag Ces) . La fonctionnalité du cadre ouvert de lecture est confirmée par une étude de transcription/traduction in vitro (TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation System, PROMEGA). Cette expérience met en évidence l'expression de deux espèces protéiques néosynthétisées.
Ces deux espèces, identifiées par l'anticorps 7381, spécifique du peptide C, et l' anticorps 7383 dirigé contre la chafne~ B, présentent des masses moléculaires respectivement égales à 15 et 20 kDa.
Afin d'obtenir une lignée produisant le polypeptide recombinant EPIL de façon stable, le vecteur d'expression ayant intégré le gène INSL4 est transfecté dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (lignée CHO). Deux méthodes de transfection peuvent être utilisées . la méthode au Phosphate de Calcium et l'électroporation.
L'utilisation de 10 à 20 ~g d'ADN plasmidique permet l'intégration génomique de l'ADN recombinant INSL4. Grâce à
la présence d'un marqueur de résistance aux antibiotiques présent dans le vecteur, les clones cellulaires recombinants stables, ayant intégré pSec Tag C INSL4 , sont sélectionnés par culture dans un milieu contenant 600 ~g/ml de ZEOCINTM (INVITROGEN).
2. Northern blot Les clones sélectionnés sont établis en culture.
L'étude de l'expression des transcrits pSec TagC INSL4 est rëalisée par Northern blot aprés extraction des ARNm. Vingt quatre heures après hybridation de la sonde INSL4 (insert BamHl-Xbal), l'expression du transcrit recombinant pSec Tag C INSL4 est mise en évidence dans toutes les cellules transfectées. La taille de l'ARNm, 900 pb, correspond à
celle attendue pour le transcrit putatif (907 pb).
3. RT-PCR
L'expression du transcrit recombinant INSL4 dans les cellules CHO est aussi confirmée par une analyse en RT-PCR.
L'analyse par RT-PCR des ARNm extraite des cellules CHO
transfectées par la construction CHO-pSec Tag C MOCK
(vecteur vide contrôle) ainsi que de ceux extraits des cellules parentales CHO montre l'absence d'expression du transcrit recombinant INSL4 après 30 cycles d'amplification.
4. Détection du polypeptide recombinant La purification des diverses formes hormonales placentaires recombinantea produites à partir des milieux de culture ,et des cellules transfectées montre, par la méthode des immunoempreintes, la présence de formes protéiques de 16,5 et 20 kDa dans les cellules transfectées, ainsi que des espèces protéiques de 6,5, 10 et 16,5 kDa dans le milieu des cellules CHO transfectées pSec Tag C INSL4.
Dét~ctioa des formes phveioloaiaues exprimées du poil rpet~tide EPIL
L'existence des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL dans les tissus humains normaux est recherchée par une méthode immunohistochimique grâce aux anticorps décrits ci-dessus. Cette technique est réalisée sur du placenta dans la mesure o~1 le gène INSL4 a été cloné
â partir de ce tissu, sur du tissu vasculaire de cordon ombilical et sur un tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi.
A) Echantillona de tissu 1) Échantillons de tissu placentaire Des villosités placentaires obtenues à partir de placenta précoce (7 semaines) et à terme ont été fournies par le Service de Gynécologie obstétrique de l'Hôpital Antoine Béclère, France, selon les procédures appropriées par le comité éthique.
Les tissus sont fixés en tampon à pH neutre contenant 10 % de formol puis inclus en paraffine.
On utilise également des cellules de cytotrophoblastes villeux et de syncytiotrophoblastes préalablement purifiées de placenta â terme. L'isolement des cellules de cytotrophoblastes à partir de placenta villeux est effectué
comme décrit par Guillaudeux T. et al. (1995) par digestion enzymatique et centrifugation en gradient de Percoll comme pour les cultures primaires. Les cytotrophoblastes villeux et les syncytiotrophoblastes villeux différenciée, formés in vitro à partir de cytotrophoblastes (â 4-5 jours de culture), sont hautement purifiés (moins de 1 % de cellules contaminantes). Pour plus de clarté, les cellules purifiées de cytotrophoblastes villeux et les cellules différenciées in vitro de syncytiotrophoblastes sont dénommées ici cytotrophoblastea et syncytiotrophoblastes respectivement.
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires L'analyse immunohistochimique des vaisseaux embryon-naires a été réalisée à la fois sur des coupes de villosités trophoblastiques de 10 SA (hôpital Antoine 5 Hëclère) et d'un cordon ombilical d'un embryon humain de il SA (h8pital Robert Debré, France), ces 2 prélèvements ayant été obtenus dans le cadre d'interruption volontaire de grossesse.
3) Tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de 10 Kapoai 28 biopsies cutanées de SK classique et associé au SIDA
ont été recherchées aux archives de l'Institut Gustave-Roussy et utilisées pour immunohistochimie.
I1 s'agit de tissus fixés dans une solution de Bouin, 15 inclus en paraffine. Les coupes de tissus (3 ~cm) ont été
montées sur des lames SuperFrost/Plus et déparaffinées au Xylène. Les coupes, une fois réhydratéea, ont été chauffées par microondes (3 x Smin.) dans une solution de tampon citraté (10 mM, pH 6).
20 B) rmmunohistochimie 1) Échantillons de tissu placentaire On utilise des tissus placentaires âgés de 6 à 12 semaines (n = 6) et des tissus de placenta à terme (n = 2).
On réalise des coupes de tissus de 3 ~cm, montées sur des 25 plaques SuperFroat/Plua et dégraissées sur xylêne. Les coupes réhydratées sont passées sur micro-ondes pendant 15 minutes en présence de tampon citrate 10 mM, pH 6,0. Après plusieurs lavages en tampon phosphate salin (PHS), les coupes sont incubées pendant 20 mn en présence de 30 l'anticorps donné.
Les coupes sont ensuite lavées puis marquées par un anticorps biotinylé suivi par une phosphatase alkaline couplée â la streptavidine. La révélation du marquage est ensuite obtenue par incubation en présence de la solution 35 de substrat chromogène (Fuchsine DAKO, New Fuschin substrate syatem, Carpinteria, CA). Les coupes de tissus témoins contr8le négatif sont réalisées avec des coupes incubées en présence d'anticorps non spécifiques (sérum préimmun) ou en présence d'anticorps préabsorbés sur un excès de peptide correspondant (figure 7).
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires et tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi Aprés lavage par un tampon TBS (Dako), les coupes ont été incubées avec l'antisérum donné pendant 20 min., puis lavées et révélées en utilisant un complexe anticorps biotinylé suivi d'une phosphatase alcaline couplée à la streptavidine (PA-streptavidine). Le marquage est complété
après incubation avec une solution chromogène du substrat (DAKO New Fuchsin substrats system, Carpinteria, CA).
L'anticorps polyclonal 7381 (immun sérum dilué au 1:500) a été utilisé comme anticorps primaire. Il s'agit d'un anticorps reconnaissant l'EPIL 1 ou l'EPIL 3 puisque reconnaissant la région 59-108 de la chafne du polypeptide EPIL.
Les contr8les négatifs utilisés sont le sérum prëimmun (Jo) et le 7381 immunsérum inhibé par le peptide correspondant (59-108Y) avec une incubation de 18 heures.
Les autres anticorps (Ac) primaires ont été choisis comme témoins positifs permettant de confirmer le diagnostic de SK . Ac antifacteur VIII (phénotype endothélial) et Ac antiactine du muscle lisse alpha vasculaire (phénotype muscle lisse).
Les conditions d'inhibition des Ac 7381 sont réalisées par incubation pendant 18 heures en présence de .
150 ~1 Ac 7381 dilué au 1/250 et 150 ~,1 de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis) à 2 10-4 M équivalent à
300 ~1 Ac 7381 dilué au 1/500 pour 10-4 M de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis).
Pour l'immunomarquage des échantillons suivants .
- villosité trophoblastique n° X991 formol (12SA), 8785 (cordon ombilical) 320818(2)(SK), 293905-7 (SK), 240444 (SK) , 293626-1 (SK) (coupes de 3 ~.m-microtome) , les anticorps(Ac) suivants ont été utilisés .
- 7381 imun sérum anti chafne C (59-108Y) dilué au 1/500 ;
- 7381 JO (préimmun) dilué au 1/500 ;
- Ac anti-facteur VIII dilué au 1/30 ;
- Ac monoclonal de souris anti-active de muscle lisse alpha humain prédilué (Dako, code N 1584) (lA4).
Analyse des transcrite ARNm des evtotrophoblaates et des svncvtiotrophoblaetea Les ARNm d'INSL4 sont quantifiés par la méthode RT-PCR
(reverse transcriptase-polymérise chafne réaction) comme décrit dans Hellet, D. et al. (1997). Brièvement, les transcrits TFIID sont quantifiés et utilisés comme ARNm endogène de contr8le. La PCR est réalisée sur 30 cycles d'amplification. Les sëquences nucléiques des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont les suivantes .
INSL4-F . F 5'-AACTCCTTAGAGAAGCCTAGCA-3' INSL4-R . 5'-TCGTACCTAAGGCTTGTCCATCT-3' TFIID-F . F 5'-ACAGGAGCCAAGAGTGAAGAA-3' TFIID-R . 5'-CCAGAAACAAAAATAAGGAGA-3' (F . colorant fluorescéine).
RESULTATS
1) Tissu placentaire Deux anticorps, désignés 7381 et 1661, dirigés respectivement contre les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 ont été sélectionnés.
L'anticorps 7381 dirigé contre le domaine 59-108-Y de la channe C conjugué avec une protéine porteuse s'est révélé totalement spécifique du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3. En effet, les expériences d'inhibition compétitive réalisées avec des peptides ou des sous-peptides analogues de 1a portion de la chafne C du polypeptide putatif EPIL ou de la portion correspondante de la relaxine humaine, démontrent que l'anticorps 7381 se lie seulement au domaine C du polypeptide putatif EPIL au niveau de sa portion 59-88 et ne reconnaft pas la chafne C de la relaxine humaine (Figure 3A). L'hormone relaxine est le seul membre de la superfamille des insulin-like présentant un pourcentage significatif (37 %) de similitude avec .le polypeptide putatif EPIL dans la portion du domaine C correspondant à
la région 59-88 du polypeptide EPIL.
L'anticorps 1661 a été obtenu par immunisation rëalisée avec un mélange de deux peptides analogues au domaine 115 139 de la chafne A et au domaine 23-52 de la chafne B. Ces deux régions du polypeptide putatif EPIL ne présentent pas de pourcentage significatif de similitude avec des régions correspondantes d'autres membres de la superfamille (< 16 %). Les expériences d'inhibition compétitive démontrent que cet anticorps polyclonal est principalement dirigé contre le domaine 115-139 de la chafne A et contient également une sous-population d'anticorps dirigée contre le domaine 23-52 de la chafne B (Figure 3B). Le parallélisme des courbes de compétition d'antigènes observées avec les peptides chafne A et chafne B reflète plus vraisemblablement des affinités similaires de ces deux sous-populations d'anticorps pour leurs épitopes chafne A
et chafne B, puisque la structure primaire de ces deux régions distinctes ne présente pas de similitude significative.
Les méthodes immunohistochimiques basées sur les anticorps 7381 et 1661 ont été utilisées pour détecter la présence des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement dans les tissus de placenta précoce (moins de 3 mois) et de placenta à terme. La Figure 7 représente les résultats obtenus à partir d'expériences réalisées sur des tissus d'au moins deux femmes enceintes. L'immuno-marquage réalisé avec l'anticorps 7381 dirigé contre le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est très important dans les cytotrophoblastes de placenta précoce alors qu'il est léger voire absent dans les syncytiotrophoblastes (Figure 7B).
Dans le placenta é terme, de rares cytotrophoblastes présentent une coloration intense alors que les syncytiotrophoblastes ne présentent pas de coloration appréciable (Figure 7D). De plus, cet anticorps anti-polypeptide EPIL 1 marque les cellules foetales endothéliales vasculaires, particulièrement dans le placenta précoce (figure 7H).
Les résl~ltats obtenus avec l'anticorps 1661 anti polypeptide EPIL 2 montrent qu'é la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce sont colorés (Figure 7F). Par opposition, cet anticorps ne marque pas les trophoblastes de placenta â
terme (résultats non présentés).
Analyse des transcrits ARNm Les résultats obtenus par la méthode RT-PCR et la méthode d'analyse quantitative par PCR montrent que les niveaux de transcrits d'ARNm d'INSL4 dans les syncytio-trophoblastes villeux différenciés in vitro obtenus à
partir de placenta à terme, sont dix fois plus (une unité
log) élevés que ceux observés dans les cytotrophoblastes (Figure 8). Par opposition, les niveaux de transcrits TFIID
sont similaires dans les deux types de cellules.
La détection d'ARNm n'implique pas que les protéines sont synthétisées, comme par exemple pour l'expression HLA
classe I dans le placenta. En effet, les cytotrophoblastes villeux expriment les ARNm d'HLA classe I, mais ne synthétisent pas les protéines correspondantes, alors que les trophoblastes extravilleux transcrivent et traduisent les gènes HLA de la classe I (Hunt, J. S. et al., 1990).
Cependant, le placenta, qui transcrit un nombre important de gènes, est aussi une source de nombreux polypeptidea, incluant les facteurs de croissance de type insulin-like, qui sont connus pour étre essentiels au stade précoce du développement embryonnaire et, après la naissance, et pour participer â la croissance et à l'activité fonctionnelle de presque tous les organes du corps humain (Le Roith, D.
1997 ) .
*rB
Ces résultats montrent pour la première fois que les trophoblastes non seulement expriment l'ARNm de 1!INSL4, mais contiennent des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 immunoréactifs. D'autre part, il est d'un grand 5 intérêt d'observer que l'immunomarquage important des tissus trophoblastiques de placenta précoce obtenu l'EPIL
2, est similaire à ceux décrits pour plusieurs facteurs de croissance, incluant le TGFa et l'EGF (Horowitz, G. M. et al., 1993).
10 Un autre résultat surprenant est l'expression importante de polypeptides EPIL 1 et /ou EPIL 3 dans les cytotrophoblastes comparée aux syncytiotrophoblastes, alors que, à la fois les études d'hybridation in situ réalisées sur des placenta précoces (résultats non représentés) et 15 l'analyse quantitative par PCR compétitive réalisée sur des placenta à terme indiquant que les transcrits d'INSL4 sont plus abondants dans les syncytiotrophoblastes. De plus, les polypeptides EPIL 2 sont détectés à la fois dans les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta 20 précoce avec des intensités du marquage similaires dans les deux types de cellules.
Prises ensemble, ces observations montrent que, in vivo, la maturation de l'EPIL diffère dans les cytotrophoblastes en comparaison avec les syncytio 25 trophoblastes.
Dans la superfamille des insulin-like, les peptides C
de jonction ou chafne C sont les médiateurs de la formation de la structure tertiaire des protéines et en particulier de l'assemblage correct des trois ponts disulfures de 30 l'hormone mature.
Ces résultats montrent que dans les cytotrophoblastes, le peptide C du polypeptide putatif EPIL est maintenu alors que l'EPIL 2 présent dans les syncytiotrophoblastes ne présente pas de peptide C de jonction. Ainsi, nous pouvons 35 déduire de ces résultats et de ces observations que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 contenant le peptide C peut être sécrété à partir des cytotrophoblastes dans le liquide amniotique et que l'EPIL 2 ne contenant pas le peptide C
peut être sécrété à partir des syncytiotrophoblastes dans la circulation maternelle. L'EPIL 3, correspondant au peptide C est par définition également reconnu par les anticorps antichafne C, tels que l'anticorps 7381. Cette forme du polypeptide putatif EPIL et qui correspond au sous-produit de clivage aboutissant à l'EPIL 2, peut également avoir une activité biologique autre que celle de participer à la formation de la structure tertiaire de 90 l'EPIL (Ido, Y. et al., 1997, Steiner, D. F. et al., 1997).
Cette capacité d'excrétion sélective de peptides différents dans des compartiments biologiques variés a déjà été
illustrée par d'autres hormones polypeptidiques comme pour l'HCG et ses sous-unités libres.
D'autre part, il est remarquable de voir que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est (sont) présents) également dans les cellules foetalea endothéliales vasculaires. Des résultats récents (Zhou, Y. et al., 1997), ont montré que les cytotrophoblastes extravilleux sont plastiques et ont la capacité d'acquérir des caractéristiques de cellules endothéliales. Ainsi, ces résultats établissent en fait que les cytotrophoblastes villeux et les cellules foetales endothéliales doivent très certainement partager des caractéristiques phénotypiques communes. Ces résultats montrent également que le polypeptide 'EPIL, en particulier l'EPIL 1, est impliqué
dans le processus de différentiation des cellules trophoblastiques, et de maniére générale le polypeptide EPIL est trCa certainement impliqué dans le processus de différentiation, de prolifération et de régénération des cellules, en particulier endothéliales comme les cellules vasculaires.
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires L'objectif de la série d'expérience par immuno histochimie est d'étudier plus précisément les vaisseaux embryonnaires intravillositaires ainsi que du cordon ombilical du Ier, Ilème et IIIème trimestre.
En utilisant l'antisérum 7381 à une dilution de 1:500, les expëriences d'immunohiatochimie confirment ia présence d'un immunomarquage au niveau des vaisseaux embryonnaires des villosités flottantes, notamment au niveau des cellules endothéliales sur un cas de prélèvement trophoblastigue de 12 SA. Cependant, on note pour la première fois que les vaisseaux embryonnaires de villosités primaires présentent un immunomarquage des cellules constituant la paroi du vaisseau, les cellules musculaires lisses, alors que les cellules endothéliales ne sont quasiment plus marquées.
De même, ce phénomène parait s' amplif ier au niveau des vaisseaux du cordon ombilical (cf Figure 22) avec, au niveau de Ia veine et des 2 artëres un marquage des cellules de la média donc des cellules musculaires lisses, avec une disparition complète du marquage des cellules endothéliales(cf. Tableaux 1 et 2 ci-après).
Tableau 1 Cellules Cellules Musculaires Endothéliales Lisses Vx embryonnaires 1. villosité + ++
flottante 2. tronc primaire + ++
ou secondaire (villosité) 3. cordon ombilical - ++
Légende du tableau 1 . Détection immunohiatochimique (PA, Dako, LSAB2) du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 par l'immun sérum 7381 (dilution 1/500) au niveau des vaisseaux embryonnaires de villosités trophoblastiques (12 SA) et d'un cordon ombilical (AA SA) du ter trimestre de grossesse (coupe 3~). On observe tant au niveau des villosités trophoblastiques des troncs primaires(cf figure 21) qu'au niveau du cordon ombilical un immunomarquage plus important des cellules musculaires lisses. (média)(cf figure 22) par rapport aux cellules endothéliales. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante . (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ;
(++) marquage de forte intensité.
Tableau 2 7381 Ante 7381 7381 Anti active im sr .
Marquage/Tissu im.sr. . facteur alpha-JO inhib 1/500 1/500 1/500 VIII muscle lisse Cytotrophoblaste+ - - - -Syncytio- - - - - -trophoblaste Vx embryonnaires (tronc primaire)+ - - + +
endothlium Mdia ++ - - - ++
Cordon ombilical (ii sa) Mdia+ - NT* Endoth+ Mdia+
vx {3 vx) (3 vx} (3 vx) Amnion + - NT NT -Vestigea embry.
Sac vitellin + + - -Allantoide ++ - -* . non testé.
Légende du tableau 2 . Analyse immunohistochimique (PA, Dako, LSAB2) avec l'immun sérum 7381 anti-peptide C
(dilution 1/500), l'anticorps polyconal anti-facteur VIII
(Dako, Réf. A0082) et monoclonal anti-active a muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 ~) de villosités trophoblastiques (tronc primaire) et d'un cordon ombilical du ler trimestre de grossesse. On observe une similitude de marquage entre l'immun sérum 7381. Par ailleurs, on relève une absence de marquage par l'anticorps polyclonal 7381 pré
immun et l'immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y.
L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante . (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité.
Vestiges embry. . vestiges embryonnaires ; Endoth. .
endothélium ; Vx . vaisseaux ; NT . non testé ; Im.sér. .
immun sérum ; JO . sérum préimmun.
La lecture des lames correspondant au cordon ombilical (cf. tableau 2 et figure 22)) met également en évidence les vestiges embryonnaires endodermiques dont notamment la vésicule (ou sac) vitelline (yolk sac) et l'allantoï.de. Ces structures sont visibles aux c8tés des trois vaisseaux et sont marquées par l' immun sérum 7381 antichafne C. I1 est intéressant de souligner que l'allantoide, ainsi que le yolk sac (sac vitellin) sont des structures embryonnaires (d'origine endodermique) très importantes sur le plan de la vasculogénèse. En effet, ces structures sont le siège de processus de différenciation des cellules hémangioblastiques (dérivées du mésoderme) en cellules angioblastiques et hématopoiétiques. En outre, il est intéressant de rappeler que ce processus de différenciation correspondant aux premières étapes de la vasculogënèse (dès Ia 3~'"e semaine de gestation) et semble être induit pas le VEGF synthétisé par l'endoderme (Risau, W., 1997).
R8le du polypeptide EPIL dans le processus de décidualisation et d'implantation embryonnaire Le processus de dëcidualisation de l'endomètre est essentiel pôur que l'implantation de l'embryon puisse se faire. Ce processus est dépendant des hormones stéroides ovariennes, notamment de la progestérone. Une des modifications durant la décidualisation concerne les cellules stromales de l'endomètre. En effet, les cellules stromales subissent au voisinage du site d'implantation des modifications morphologiques (polygonale, cytoplasme de taille agrandie, aspect de cellules ëpithéloides) et fonctionnelles (riche en glycogène et lipide, sécrétion autocrine et/ou paracrine de prolactine, relaxine, renin, IGF et IGFBP) (Speroff, L. et al., 1995 ; Edwards, R.G., 1995) .
Plus récemment, il a été démontré que les facteurs de croissance de la famille EGF (EGF, TGF-alpha, HB-EGF, amphiregulin, heregulin, betacellulin, epiregulin) pourraient jouer un r8le important dans les mécanismes 5 d'initiation de l'implantation, notamment de l'attachement.
En effet, dans les modêles murins, l'expression du récepteur à l'EGF (EGF-R) régulée par la progestérone et l'E2 a été démontrée tant au niveau du blastocyste que des cellules atromales utérines, ce qui fait des molécules de 10 cette grande famille de l'EGF des ligands potentiels à
activité modulatrice de l'implantation (SK Das, International Symposium on Embryo Implantation, Octobre 1997). I1 est intéressant de noter que dans l'espëce humaine, une étude a démontré la localisation du 15 transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) dans l'endomètre, la décidue et le trophoblaste (Horowitz, G.M.
et al., 1993). En outre, la décidualisation de cellules stromales est accompagnée de changements dans la motilité
cellulaire qui implique une modification de la matrice 20 extracellulaire (sécrétion de laminine par les cellules stromales, par exemple). I1 apparaft chez. le rat que l'expression de bFGF ou fibroblast growth factor basique au niveau des cellules utérines stromales, est dépendante de la progestérone et pourrait être un facteur de croissance 25 co-régulant les cellules atromales et étre donc impliqué
dans le processus de différenciation (décidualisation). Les cellules stromales décidualisées synthétisent et sécrètent de la prolactine (PRL). Une étude in vitro de cellules endométriales atromales a montrë que la production de PRL
30 est probalement régulée par l'effet combiné des hormones stéroidiennes (oestrogène et projestérone) et d'un peptide, la relaxine (Huang, J.R. et al., 1987). Plus récemment, alors que la source de relaxine endogène est le corps jaune, la présence de relaxine au niveau de l'épithêlium 35 glandulaire et des cellules stromales de l'endomètre a été
démontrée ainsi que son r8le autocrine/paracrine sur la sécrétion de PRL par l'endomètre in vitro (Bryant-Greewood et al., 1993 ; Zhu, H.H. et al., 1990 ; Rosenberg, M. et al., 1991).
Lorsque l'on considère l'expression d'EPIL 1 ou 3, nous avons démontré par immunohistochimie avec l'immun sérum antichafne C un marquage des cellules stromales décidualisées, ainsi que de l'épithélium glandulaire endométrial de la caduque ou décidue pariétale et basale de grossesses du ler trimestre (cf Figure 23). I1 est intéressant de noter que de façon similaire aux facteurs de croissance de la famille de l'EGF, notamment le TGF-alpha, la localisation d'EPIL 1 ou 3 est retrouvée â la fois au niveau du trophoblaste et au niveau de la décidue (notamment au niveau des glandes endométriales et des cellules stromales). Ainsi, le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans le processus d'implantation au moment de l'attachement, à l'instar de TGF-alpha. De plus, le polypeptide EPIL devrait également être impliqué dans la différenciation des cellules stromales internes qui constituent un des changements cellulaires de la décidualisation. En effet, à l'instar de la relaxine, le polypeptide EPIL devrait avoir un r8le stimulateur sur la synthèse de PRL par les cellules stromales et participer ainsi au processus de décidualisation.
Par ailleurs, en raison d'un marquage des cellules trophoblastiques de phénotype non invasif (cytotrophoblaste intravilleux), il est raisonnable de penser que le polypeptide EPIL sécrété par les cellules stromales et par les cellules de l'épithélium glandulaire de l'endomètre devrait jouer un r8le dans le contr8le de l'invasion des cytotrophoblastes extravilleux au même titre que le TGF-béta (Giudice, L., 1994).
3) Dosage des différentes formes du polypeptide EPIL, application au dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique a) Méthode de dosage On utilise par exemple un dosage « sandwich ~ par immuno-radiométrie à 2 sites (IRMA) pour la détection et le dosage des formes de polypeptide EPIL obtenues obtenues par voie recombinante, dans différentes fractions dans les procédures de chromatographie ou dans les échantillons biologiques o~1 ces formes sont susceptibles d'être présentes. Ce dosage peut être réalisé par exemple en utilisant une phase solide, telle que des billes de polystyrène (Precision Plastic Ball, Chicago, MN), revêtues d'anticorps monoclonal EPIL 08 comme anticorps de capture, et en utilisant l'anticorps monoclonal EPIL 02 marqué â
l'125I comme indicateur radiomarqué. Les billes revêtues d'anticorps monoclonal EPIL 08 sont par exemple incubées 2 heures en présence de l'échantillon à contrôler dilué dans du sérum de veau. On peut par exemple utiliser comme témoins des peptides synthétiques tels que le peptide correspondant à la portion 76-139 de l'EPIL, dans une gamme de concentrations telle qu'une gamme allant de 5 ng/mL à
2000 ng/mL. La sensibilité du dosage obtenue, environ 50 ng/mL avec une incubation de 2 heures de l'échantillon à
analyser, peut être améliorée par exemple en procédant pour l'incubation à 2 étapes d'incubations de 6 et 18 heures, environ 10 ng/mL (Cf figure 19).
b) Application au dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique Le dosage de l'EPIL dans le liquide amniotique de femme enceinte est réalisé par dosage immuno-radiométrique suivant la méthode décrite précédemment. Des concentrations de polypeptides EPIL allant de 10 â plusieurs centaines de ng/mL sont détectées chez les femmes enceintes. La figure 20 présente les résultats obtenus sur un panel de femmes, d'autres résultats ont montré que les concentrations peuvent atteindre plusieurs centaines de ng/mL.
c) Application au dosage de l'EPIL dans le sérum Le dosage de l'EPIL dans le sérum est réalisé par dosage immuno-radiométrique suivant la méthode décrite précédemment. Des concentrations de polypeptides EPIL
allant de 10 é l00 ng/mL sont détectées.
4) Sarcome de Kaposi L'objectif de la série d'expérience par immuno-histochimie est d'étudier l'expression du polypeptide EPIL
1 ou EPIL 3 au niveau de biopsies de SK.
Les différentes immunohistochimiea effectuées avec l'antisérum polyclonal antichafne C dirigée contre l'EPIL 1 et/ou l'EPIL 3 (ac 7381 immunsérum dilué au 1:500) ont permis de détecter les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau d'environ 50 % des 28 cas de SK. L'immunomarquage est localisé au niveau des cellules tumorales fusiformes ou apindle celle ainsi qu'au niveau de vaisseaux intratumoraux et/ou vaisseaux de type "slit-like" (sana endothélium) et le plus souvent dans des lésions tardives de type nodulaire. L'intensité de l'immunomarquage est modéré (+ é
++) dans la majorité des cas, avec cependant sur 8 cas l'observation d'un immunomarquage intense (+++). Sur les 4 cas de SK associés au SIDA, seul un cas présente un marquage faible à modéré au niveau des cellules tumorales, les autres étant tous nëgatifa.
L'expérience dont les résultats sont représentée sur le tableau 3 (cf. tableau 3 ci-après) a permis de confirmer un immunomarquage intense, noté(3) sur le tableau, au niveau de 4 SK cutanés classiques de stade nodulaire.
L'immunomarquage est relativement hétérogène localisé au niveau du cytoplasme des cellules tumorales fusiformes (SC). En "outre, tous les cas de SK montrent un immunomarquage par l'immun sérum 7381 de l'épithélium malpighien (peau) ainsi que des glandes sébacées. On peut sur 1 cas noter un effet de gradient de marquage avec une intensité de marquage de la peau plus importante dans la région susjacente à la tumeur. Le marquage cutané concerne plut8t les cellules basales de l'épithélium malpighien avec un marquage cytoplasmique et nucléaire. A relever que la peau normale(saine) n'a pas présenté d'immunomarquage par l'immun sérum 7381 lors d'expériences effectuées parallèlement.
WO 99/09172 PCT/FR9$/01799 Les contrôles négatifs tant le sérum préimmun (7381 JO) que l'immun sérum 7381 préabsorbé par le peptide 59-108Y ne montrent aucun marquage.
Les figures 10, 12, 14 et 16 (X 100, X 200, X 1000, X 400, respectivement) correspondent aux résultats obtenus pour un cas de Sarcome de Kaposi cutané de type classique après immunohistochimie (PA, Dako LSA82) avec l'immun sérum 7381 antichafne C (dilution 1:500).
On observe un marquage relativement homogéne des cellules tumorales (SC) d'intensité marquée (++). En revanche, les cloisons fibreuses ne sont pas marquêes (figures 10 et 14).
Les figures 11, 13, 15 et 17 (X 100, X 200, X 1000 et X 1000, respectivement) correspondent au contrôle négatif après inhibition de l' immun sérum 7381 par le peptide 59 108 Y (18 heures d'incubation) en utilisant la même technique d'immunohistochimie. On observe une absence de marquage complète.
Tableau 3 7381 Anti 7381 im. 7381 im Ante actine sr Marquage sr. . facteur alpha-.
JO
inhib /Tissu 1/500 1/500 VIII muscle lisse Sarcome de Kaposi N1 S.C. ++ - + +
E.M. ++ - _ - -(noy>cyt) rsb ++
Vx + - - qq ++ (mdia et (Endoth.) cloison fibreuse) sarcome de Kaposi N2 S.C. ++ - - + qq ++ (<5 t) E.M. ++ - - - -(nooy>cyt) Vx - - - qq ++ +
(Endoth.) (mdia) Sarcome de Kaposi N3 S.C. ++ - -E.M. ++ - - - -(noycyt.
Couche basale ++) Vx - - - - ++
(mdia)(i0t) Sarcome de ' Kaposi N4 S.C. ++ - - - ++ (30 E.M. ++ - - - -(noycyt.
Couche basale ++) Vx - - - - ++
(mdia) SC . Spindle celle (cellules tumorales) Vaisseaux ; Vx . ;
5 EM . Epithlium malpighien Noyau ; nb . nombreux ; Noy . ;
qq . quelques ; Cyt . Cytoplasme Légende du tableau 3 . Analyse immunohistochimique (Pa, Dako, LSAB2) avec l'immun sérum 7381 antichafne C (dilution (1/500), l'anticorps polyclonal antifacteur VIII (Dako, Rëf. A0082) et monoclonal anti-active a muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 ~) de biopsie cutanée de Sarcome de Kaposi (type classique) au stade histologique nodulaire.
On observe que l'immun sérum 7381 marque les cellules tumorales "spindle celle" du SK de façon plus marquée et plus étendue que l'anticorps polyclonal antifacteur VIII et .monoclonal anti-active a muscle lisse. En outre, on note un marquage de l'épithélium malpighien de la peau .par l'immun sérum 7381 tant nucléaire que cytoplasmique avec une prédominance au niveau de la couche basale. On note une absence de marquage au niveau des quatre cas de SK lorsque l'anticorps polyclonal 7381 pré immun et l'immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y sont utilisée. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante . (-) absence de marquage ; (+) marquage de faible intensité ; (++) marquage de forte intensité.
Mises en évidence par immunohistochimie sur des biopsies et par dosage sérique, les cellules de SK semblent sécréter des cytokines dont certaines sont des facteurs angiogéniquea (VEGF, FGF-b, PDGF). Récemment, par IH et HIS, les kératinocytes épidermiques bordant une région ulcérée ou dans une région hyperplasique semblent être une des sources de VEGF. En outre, l'expression de l'ARNm des récepteurs KDR et flt-1, deux récepteurs tyrosine kinase de la cellule endothéliale, semble étre augmentée dans les cellules de SK elles-mémes, ce qui serait en faveur d'une double action paracrine (Kératiriocytes et macrophages) et autocrine directe de VEGF sur la cellule de SK (Brown et al., 1996). Plus récemment, Masood et al. (1997) ont démontré que le VEGF est un facteur de croissance autocrine pour le SK associë au SIDA faisant de lui le facteur angiogénique probablement le plus important dans ce type de tumeur.
Ces résultats montrent que l'expression du gène INSL4 appartenant à la famille de l'insuline, est localisée notamment au niveau du placenta, du cordon ombilical et au niveau de cellules tumorales telles que celles du sarcome de Kaposi. Des anticorps monoclonaux et polyclonaux ont été produits contre différente peptides synthétiques correspondant aux différentes chafnes A, C et B de polypeptide putatif natif.
Les anticorps polyclonaux de lapin reconnaissant la chaîne C (7381 immun sérum) et la chafne A et B (1661 immun sérum) ont permis de mettre en évidence le polypeptide EPIL
1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement au niveau du placenta avec une expression du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau des cellules cytotrophoblastiques. En outre, nous avions observé un surprenant marquage des cellules endothéliales embryonnaires intravillositaires par l'Ac polyclonal 7381. Récemment, Zhou et al. (1997) a montré combien la différenciation des cytotrophoblastes extravilleux en cellules à phénotype endothélial était importante dans la physiologie du développement placentaire. Notre observation, en revanche, objectivant l'immunomarquage du polypeptide EPIL 1 et /EPIL 3 au niveau cytotrophoblastique et des vaisseaux embryonnaires intra-villositaires nous permet d'en déduire que le polypeptide EPIL jouerait un r8le essentiel dans la vasculogénëse embryonnairë comme cela a été récemment démontré pour le VEGF, une cytokine angiogénique induisant la prolifération de cellules endothêliales et une augmentation de perméabilité vasculaire (Risau et al., 1997). En effet, il est intéressant de noter que Clark et al. en 1996 a démontré par immunohistochimie la présence de la protéine VEGF ainsi que de son récepteur Flt-1 au niveau du cytotrophoblaste intravilleux et de l'endothélium des vaisseaux embryonnaires intravillositaires.
Ces homologies d'immunomarquage avec le VEGF et d'autres cytokines que noua avons mis en évidence par la présence du polypeptide EPIL au niveau d'une tumeur angioproliférative, le Sarcome de Kaposi, montrent également que le polypeptide EPIL serait impliqué en tant que facteur de croissance des cellules tumorales comme le VEGF et d'autres cytokines dont leur r8le est bien connu.
En outre, il apparaft que l'IGF-I, un membre de la famille de l'insuline, induit l'expression de VEGF dans le cancer colorectal ainsi que sur un modèle in vitro d'ostéoblastes (Goad et al., 1996).
Ainsi ces résultats montrent que le polypeptide EPIL
est très certainement lié au processus de vasculogenèse embryonnaire et d'angiogenèse tumorale.
'v' 'k u 1 1 et /oui) Rappel du role physiologique de l'insuline Les hydrates de carbone (HC) ou glucides constituent la source principale d'énergie de l'organisme. Des systèmes régulateurs assurent un ajustement constant entre les besoins en HC et la formation de glucose. Les organes intervenant dans cette régulation sont le pancréas et le foie. Les cellules béta des flots de Langerhans du pancréas sont le lieu de synthëse et de sécrétion de l'insuline, mais aussi du glucagon et de la somatostatine. Le foie a une fonction de stockage du glucose par glycogenèae (comme les adipocytes) et de synthése du glucose par néoglucogenèse. I1 a comme fonction vitale de mettre du glucose â disposition par glycogénolyse en cas de besoin (hypoglycémie).
La proinsuline est formée de deux chafnea A et B avec une chafne C appelée peptide de connexion. L'insuline est biologiquement active après avoir subi un clivage de son peptide C. Elle agit sur un récepteur transmembranaire de la famille des tyrosine kinase qui par l'intermédiaire d'une cascade de phosphorylation intervient sur la régulation des enzymes des différentes voies métaboliques (glucide, lipide et protide).
L'insuline a pour principal r8le de permettre l'utilisation du glucose par la cellule ainsi que la synthèse des lipides et des protéines (anabolisme).
~ L'utilisation du glucose est facilitée, par exemple, dans le muscle/adipocyte par une action stimulatrice du glucose et de l'insuline sur son transporteur (GLUT-4).
L'insuline stimule ou inhibe l'expression d'une série d'enzymes intervenant dans la voie métabolique du glucose d'Emden-Meyerhof comme la glucokinase (GK), PFK2 et LPK
(action stimulante de l'insuline), PEPCK et F-1,6-P2ase (action inhibitrice de l'insuline). Par l'action de l'insuline, le glucose est alors métabolisé en pyruvate et l'actate, puis en C02, H20 et ATP après passage dans le cycle de Krebs ou cycle de l'acide citrique (au niveau des mitochodries par phosphorylation oxydative). I1 faut noter qu'une autre voie de dégradation du G6P (glucose 6-phosphate) est possible, la voie des pentoses phosphate, également stimulée par l'insuline et responsable de ia formation NADPH+, coenzyme essentiel â la biosynthêse des lipides. En outre, la voie des pentoses est la source de ribose essentiel pour la synthèse d'acide nucléique.
~ La synthése des lipides est également facilitée par l' insuline et se fait à partir de l' acétyl (CoA) . I1 y a aussi stimulation de la synthése des protéines par l'insuline.
Physiopathologie du diabéte I1 existe deux types de diabète . le type I ou diabète juvénile. I1 s'agit d'une maladie auto-immune caractérisée par une destruction des flots de Langerhans, donc pas une carence en insuline ; le type II ou diabète de l'adulte est en revanche caractérisé par une résistance à l'insuline.
Le diabête gestationnel . son diagnostic se fait pendant la grossesse (hyperglycémie à jeun) et généralement disparaft après l'accouchement. Durant le second trimestre, le taux d'insuline augmente considérablement en partie par l'augmentation d'activité hormonale anti-insuline. En effet, le placenta produit des hormones diabétogéniques comme l'hormone placentaire lactogène humaine (hPL), les oestrogènes et la progestérone. En outre, la prolactine pituitaire ainsi que le cortisol sont des antagonistes de l'insuline.
5 Les mécanismes physiopathologiques sont probablement multiples. On a mis en évidence, par exemple, une augmentation de la dégradation de l'insuline pendant la grossesse. Cette dégradation esst causée par des enzymes placentaires comparables aux insulinases hépathiques 10 (Freinkel, N. et al., 1991). Par un phénomène combinant d'une part la résistance à l'insuline d'origine hormonale (hPL, PRL) et l'augmentation de la dégradation de l'insuline, le taux d'insuline à disposition diminue et un mécanisme d'hypersécrétion pancréatique régulateur est 15 alors mis en route. Si le pancrëas présente un dysfonctionnement, il ne pourra répondre à ce nouvel état physiologique de la grossesse et une intolérance au glucose voire un diabète gestationnel peut en résulter (Becker, K.L. et al., 1990).
20 Les complications du diabéte La complication majeure est d'ordre cardiovasculaire.
Les mécanismes sous-jacents à cette complication diabétique sont ceux de l'athérosclérose et constitue la macro-angiopathie diabétique. Brièvement, dans le diabète, la 25 cellule endothéliale des vaisseaux subit différentes agressions physiques et chimiques comme l'hypertension artérielle, l'hyperglycémie, et l'hypercholestérolémie. Ces lésions répétées de l'endothélium vasculaire mènent par l'intermédiaire des macrophages, des plaquettes et des 30 facteurs de croissance à l'accumulation progressive de cellules musculaires lisses, de matrice extracellulaire et de lipides au niveau de l'intima et de la média. Ce sont ces lésions qui contribuent au rétrêcissement de la lumière vasculaire.
35 Fonctions insulin-like du polypeptide EPIL
~ EPIL est une protéine de type ORP (oxygen-related protein) ou GRP (glucose-related protein) comme le VEGF.
A partir du troisième trimestre, le placenta devient l'organe par lequel les échanges foeto-maternels se font notamment par l'intermédiaire d'un réseau vasculaire embryonnaire considérablement développé. I1 est intéressant de rappeler que récemment certains travaux ont démontré le rôle du VEGF dans la vasculogenèse embryonnaire avec une expression augmentée dès la 3~me semaine de gestation dans l'endoderme, responsable de la différenciation du mésenchyme sus-jacent en hémangioblastes (Rieau, W., 1997).
En outre, il a été démontré que le VEGF est une protéine régulée par l'oxygène (ORP) et le glucose (GRP). En effet, Stein et al. en 1995 démontre que l'hypoxie et l'hypoglycémie semblent augmenter l'expression du VEGF
notamment par un mécanisme de stabilisation de son ARN
messager (Stein, I. et al., 1995). De façon similaire, le transporteur du glucose GLUT-1 est stimulé par hypoglycémie et permet â la cellule dans un environnement hostile d'utiliser le maximum de glucose comme source d'énergie (Stein, I. et al., 1995).
Le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans ces processus de réponse à un stress soit hypoxique soit hypoglycémique par un effet insulin-like. En effet, en addition de l'homologie de structure du polypeptide EPIL et de l'insuline comme décrit précédemment, nous avons clairement démontré par immunohistochimie une localisation cellulaire similaire entre EPIL et VEGF avec un marquage du cytotrophoblaste, des cellules musculaires lisses des vaisseaux embryonnaires ainsi que des vestiges embryonnaires au niveau du cordon ombilical. La coexpression du polypeptide EPIL et VEGF au niveau de cellules et tissus identiques permet d'établir plusieurs mécanismes possibles. Comme nous l'avons dit plus haut, l'insuline permet une utilisation du glucose intracellulaire et permet par conséquent à la cellule de produire de l'ATP, du ribose (voie des pentoses).
L'insuline est une hormone anabolique permettant de plus la biosynthêse des lipides et protéines. Tant au niveau WO 99/09172 PC"T/FR98/01799 placentaire qu'au niveau d'un tissu néoplasique, le taux de division cellulaire est important et le besoin énergétique plus important. Si le processus de néovascularisation est important pour la survie d'un tissu en situation de stress (VEGF), il est vraisemblable que le polypeptide EPIL par un effet insulin-like para/autocrine intervienne dans ce processus en favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
~ Effet insulin-like d'EPIL et le placenta.
Le placenta est jusqu'à la fin du premier trimestre dans un environnement d' hypoxie relative . De même, on peut penser qu'en terme de nutriments notamment de glucose il se trouve trës certainement dans un état hypoglycémique.
Pourtant, il s'agit d'un tissu hautement mitogénique de type pseudotumoral, donc en besoin énergétique augmenté.
Aussi, le fait de produire une molécule à effet insulin-like avec amélioration de l'utilisation du glucose permettrait au placenta de poursuivre son développement et sa croissance. En outre, il faut rappeler que le placenta est â l'origine de la dégradation de l'insuline et qu'il est à l' origine de protéines diabétogènes comme l' hPL, les oestrogènes et la progestérone. Le polypeptide EPIL devrait ainsi jouer le r8le de l'insuline par un effet insulin-like auto/paracrine.
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889-99.
Claims (106)
1. Polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4, caractérisé
en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminée définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139; extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminée du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminée définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139; extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminée du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
2. Polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4, caractérisé
en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué.
a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 ;
b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moine la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ;
ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué.
a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 ;
b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moine la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ;
ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
3. Polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé
en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les cellules trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses.
en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les cellules trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les cytotrophoblastes de placenta humain.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales.
6. Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules endothéliales sont des cellules endothéliales vasculaires.
7. Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules endothéliales vasculaires sont des cellules endothéliales vasculaires foetales.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 1, et 3 à
7, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
7, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules musculaires lisses.
10. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé en ce que les cellules musculaires lisses sont des cellules musculaires lisses vasculaires constituant la paroi de vaisseau.
11. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules musculaires lisses vasculaires sont des cellules constituant la paroi de vaisseau embryonnaire ou de cordon ombilical.
12. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans les cellules stromales.
13. Polypeptide selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules stromales sont des cellules de l'amnion et/ou de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l'allantoïde situés au niveau du cordon ombilical.
14. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales.
15. Polypeptide selon la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules tumorales de tumeur angioproliférative.
16. Polypeptide selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
17. Polypeptide selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules de vaisseau intra-tumoral.
18. Polypeptide selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules épithéliales de Malpighi.
19. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de placenta humain.
20. Polypeptide selon l'une des revendications 2 et 19, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la circulation maternelle.
21. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de différentiation de cellules humaines et/ou animales.
22. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de prolifération de cellules humaines et/ou animales.
23. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de régénération de cellules humaines et/ou animales.
24. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules endothéliales.
25. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules musculaires lisses, notamment vasculaires.
26. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules épithéliales.
27. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules stromales, notamment de la décidue, ou de l'épithélium glandulaire.
28. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires.
29. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de vascularisation des tumeurs.
30. Polypeptide selon la revendication 29, caractérisé en ce que les tumeurs sont des tumeurs angio-prolifératives.
31. Polypeptide selon l'une des revendication 29 et 30, caractérisé en ce que les tumeurs sont des tumeurs associées au Sarcome de Kaposi.
32. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
33. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans un processus de type insulin-like, notamment paracrine et/ou autocrine.
34. Polypeptide selon la revendication 33, caractérisé en ce que le processus de type insulin-like est un processus de réponse à un stress hypoxique et/ou à un stress hypoglycémique.
35. Polypeptide selon l'une des revendications 33 et 34, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans un processus favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
36. Fragment de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 35, caractérisé en ce qu'il est biologiquement actif.
37. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, sa séquence complémentaire ou la séquence de son ARN
correspondant.
correspondant.
38. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
39. Vecteur selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte.
40. Cellule hôte transformée par un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39.
41. Méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon la revendication 40.
42. Méthode de production d'un polypeptide recombinant selon la revendication 41, caractérisée en ce que l'on cultive les cellules transformées selon la revendication 40 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
43. Polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par une méthode selon l'une des revendications 41 et 42.
44. Polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il est obtenu par synthèse chimique.
45. Anticorps monoclonal et polyclonal ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44.
46. Anticorps selon la revendication 45, caractérisé en ce qu'il est immunoconjugué ou marqué.
47. Sonde ou amorce oligonucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement à une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
48. Sonde oligonucléotidique selon la revendication 47, caractérisée en ce qu'elle est marquée.
49. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide ou d'un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, ou pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36.
50. Utilisation d'une sonde ou amorce selon l'une des revendications 47 et 48, pour la détection, l'identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
51. Procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46 ;
b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé.
a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46 ;
b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé.
52. Procédé selon la revendication 51, caractérisé en ce l'anticorps utilisé à l'étape a) est fixé sur un support solide et en ce que la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage du complexe antigène-anticorps formé de l'étape b) est réalisé en utilisant un anticorps selon la revendication 46.
53. Procédé selon la revendication 51 ou 52, pour le dosage d'une des formes du polypeptide EPIL dans le liquide amniotique et/ou le sérum.
54. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants :
a) un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) le cas échéant les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
a) un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) le cas échéant les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
55. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ;
b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon la revendication 37 à l'aide d'amorces selon la revendication 47 ;
c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ;
b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon la revendication 37 à l'aide d'amorces selon la revendication 47 ;
c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
56. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 47 et 48 avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN contenu dans l'échantillon biologique;
b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN
de l'échantillon biologique.
a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 47 et 48 avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN contenu dans l'échantillon biologique;
b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN
de l'échantillon biologique.
57. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon la revendication 47 immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été
préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon la revendication 47 et/ou rendu accessible à
l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique;
b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48.
a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon la revendication 47 immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été
préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon la revendication 47 et/ou rendu accessible à
l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique;
b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48.
58. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants :
a) une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 47 et 48 ;
b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à
une réaction d'amplification de l'ADN.
a) une sonde oligonucléotidique selon l'une des revendications 47 et 48 ;
b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à
une réaction d'amplification de l'ADN.
59. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants :
a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 47 pouvant être fournie préimmobilisée sur un support ;
b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48 ;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à
une réaction d'amplification de l'ADN.
a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 47 pouvant être fournie préimmobilisée sur un support ;
b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48 ;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à
une réaction d'amplification de l'ADN.
60. Procédé ou kit selon l'une des revendications 51 à 59, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales.
61. Procédé ou kit selon la revendication 60, pour le diagnostic du Sarcome de Kaposi, notamment angioprolifératives.
62. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications 45 et 46.
63. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une amorce et/ou une sonde, notamment marquée, selon l'une des revendications 47 et 48.
64. Méthode de marquage selon l'une des revendications 62 et 63, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un procédé selon l'une des revendications 51 et 56.
65. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule endothéliale.
66. Méthode de marquage de cellule selon la revendication 65, caractérisée en ce que la cellule endothéliale est une cellule vasculaire.
67. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule musculaire lisse.
68. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule stromale, notamment de la décidue, ou de l'épithélium glandulaire, notamment l'épithélium endométrial de l'utérus.
69. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 62 à 64, caractérisée en ce que la cellule est une cellule tumorale, notamment angio-proliférative.
70. Méthode de marquage de cellule selon la revendication 69, caractérisée en ce que la cellule est une cellule tumorale du Sarcome de Kaposi.
71. Méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44 et/ou une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 62 à
70, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée.
70, et en ce qu'on isole ladite cellule marquée.
72. Cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode selon la revendication 71.
73. Procédé de détection de cellules tumorales, caractérisé
en ce qu'il met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 62 à 70.
en ce qu'il met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 62 à 70.
74. Procédé selon la revendication 73, pour la détection de cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
75. Méthode de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 35, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44, une séquence d'acide nucléique selon la revendication 47 ou une cellule selon l'une des revendications 40 et 72.
76. Méthode de sélection selon la revendication 75, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
77. Méthode de sélection selon la revendication 76, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
78. Méthode de sélection selon la revendication 76, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
79. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules endothéliales.
80. Méthode de sélection selon la revendication 79, caractérisée en ce que les cellules endothéliales sont des cellules vasculaires.
81. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules musculaires lisses.
82. Méthode de sélection selon la revendication 81, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules musculaires lisses vasculaires.
83. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules épithéliales.
84. Méthode de sélection selon l'une des revendications 76 à 78, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules stromales, notamment de la décidue, ou de l'épithélium glandulaire, notamment l'épithélium endométrial de l'utérus.
85. Méthode de sélection selon la revendication 75, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
86. Méthode de sélection selon la revendication 85, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
87. Méthode de sélection selon la revendication 85, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
88. Méthode de sélection selon la revendication 75, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler l'activité insulin-like.
89. Méthode de sélection selon la revendication 88, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la réponse de la cellule à un stress hypoxique et/ou hypoglycémique.
90. Méthode de sélection selon la revendication 89, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
91. Composé chimique ou biochimique, en ce qu'il est susceptible d'être sélectionné par une méthode selon l'une des revendications 75 à 90.
92. Composé selon la revendication 91, à titre de médicament.
93. Composé selon l'une des revendications 91 et 92, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44 ;
b)un anticorps selon la revendication 45 ;
un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36 ;
c)un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39 ;
d) un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39 présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité
d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à
36 ;et e)une sonde selon la revendication 47.
a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36, 43 et 44 ;
b)un anticorps selon la revendication 45 ;
un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des revendications 1 à 36 ;
c)un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39 ;
d) un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39 présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité
d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à
36 ;et e)une sonde selon la revendication 47.
94. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné au traitement des tumeurs.
95. Composé selon la revendication 94, destiné au traitement des tumeurs angioprolifératives.
96. Composé selon la revendication 95, destiné au traitement du Sarcome de Kaposi.
97. Composé selon l'une des revendications 94 et 95, caractérisé en ce que la tumeur est une tumeur du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome, ou un léiomyosarcome.
98. Composé selon la revendication 97, caractérisé en ce que la tumeur est un léiomyosarcome.
99. Composé selon selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à favoriser la vascularisation de tissus spécifiques.
100. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de l'endométriose, de l'arthrite rhumatoîde, de l'athérosclérose ou de l'hyperthyroîdie.
101. Composé selon la revendication 100, destiné au traitement de l'athérosclérose, notamment des lésions dues à la resténose après angioplastie.
102. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithéliale, suite à une maladie dégénératrice ou à
une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroîde ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme.
une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroîde ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un traumatisme.
103. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné à favoriser ou à inhiber l'implantation embryonnaire.
104. Composé selon l'une des revendications 92 et 93, destiné é prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à une activité de type insulin-like.
105. Composé selon l'une des revendication 104 destiné à
prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, notamment à une hypoglycémie ou à une hyperglycémie.
prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, notamment à une hypoglycémie ou à une hyperglycémie.
106. Composé selon l'une des revendication 104 et 105, caractérisé en ce que la pathologie est choisi parmi le diabète, notamment le diabète gestationnel, et les complications liées au diabète, notamment les complications d'ordre cardiovasculaires.
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