FR2767326A1 - Identification et localisation de polypeptides epil exprimes codes par le gene insl4 et leurs applications - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'identification et la localisation tissulaire de nouveaux polypeptides exprimés par le gène insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminés et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, telles que le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques, à la différentiation et/ou à la régénération de tissus, à moduler l'implantation embryonnaire et au traitement de pathologies liées à l'activité insulin-like, telles que le diabète et ses complications.
Description
IDEL i!_CATION ET LOCALISATION DE POLYPEPTIDES EPIL
EXPrIMS, CODES PAR. LE CEN' INSL4 ET LEURS APPLICATIONS.
La pr6sen-e inven:ion concerne l'identification e. la localisation tissulaire de nouveaux polypeptides exprimés par le gène insulin-like 4 (INSL4), leur séquence d'acides aminés et d'acide nucléique, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage, de sélection et de détection de cellules exprimant lesdits polypeptides ou10 leur séquence nucléique correspondante et des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdits polypeptides. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de tumeurs, notamment angioprolifératives comme le Sarcome de Kaposi, à la vascularisation de tissus spécifiques et/ou à la
régénération de tissus.
L'insuline, l'IGF-l, l'IGF-2 (" Insulin-like growth factors 1 and 2 " ou facteurs de croissance de type insuline 1 et 2) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le
métabolisme cellulaire.
L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique. Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-l sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux30 tissus. L'IGF-2 a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale. La relaxine induit un remodelage des tissus conjonct:fs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogic, L.V. et al., 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau o une expression très importante a été observée, reste à être élucidé. On a adjoint, également, à cette famille les Ley I-L qui sont actuellement clonés sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrits Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteum, le trophoblaste, les membranes foetales et le tissu mammaire
(Adham, I.M. et al., 1993; Tashima, L.S. et al., 1995).
Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure
tertiaire.
On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils
appartiennent à la super-famille des récepteurs tyrosine-
kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de
croissance et leurs analogues oncogènes tels que c-
erbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et
trk (récepteur de NGF).
La voie de transduction du signal intracellulaire pour
ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-
kinase qui produit une autophosphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaîne d'événements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-l (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte
différents processus cellulaires tels que la transcription.
Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives., Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaîne B, un peptide de jonction C ou chaîne C et une chaîne A.
Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré-
prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'élément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone
considérée.
Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C- terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de
maturation qui aboutit à la forme active de l'hormone.
Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression. Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été caractérisé (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de placenta
précoce et localisé sur le chromosome 9p24.
Le gène INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé " EPIL " (peptide insulin-like de placenta précoce).
Pour plus de clarté dans la présente description, on
désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique
codante et tel que défini dans la figure 1.
La séquence d'acides aminés déduite a montré, en accord avec l'organisation générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chaîne B et A et d'un peptide C de jonction ou chaîne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant être probablement impliqués dans la
formation de 3 ponts disulfures.
Ces documents décrivent l'organisation du gène INSL4 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 sont présents en particulier au niveau du tissu placentaire
et utérin.
L'analyse par analogie de la séquence peptidique et nucléotidique de l'EPIL, comparée aux autres séquences des membres de la famille, ainsi que l'étude de la distribution des transcrits laisse supposer aux auteurs de ces documents20 que le polypeptide EPIL a une structure plus proche de l'insuline, de la relaxine et de LEY-IL que de 1'IGF 1 et 2 (Chassin, D. et al., 1995). L'analyse par homologie de l'EPIL comparée aux autres membres de la famille ne permet pas de déduire les caractéristiques essentielles comme par exemple l'identification et la localisation de la forme
exprimée du polypeptide EPIL codé par le gène INSL4.
La connaissance de ces caractéristiques essentielles permettrait en effet d'élaborer par exemple, des peptides synthétiques correspondant à des formes prédéterminées30 (pré-prohormone, prohormone ou hormone mature) exprimées ou à des domaines particuliers de ces formes prédéterminées (chaînes A, B ou peptide C). Ces peptides synthétiques peuvent être utilisés comme agonistes ou antagonistes de l'activité correspondante. Ils peuvent également être utilisés comme peptide antigénique et permettre l'obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre des formes ou domaines particuliers de cette hormone. La localisation tissulaire de la ou des formes exprimées par le gène INSL4 permettrait de préétablir le ou les types d'activité biologique dans lesquels cette nouvelle hormone est impliquée. Ceci est justement l'objet de la présente invention. Compte tenu de ce qui précède, en particulier de l'analogie de structure entre l'insuline, la relaxine et le polypeptide EPIL, laissant supposer ainsi que la forme exprimée et mature du polypeptide EPIL est unique et sous une forme dépourvue de chaîne C, et compte tenu des pratiques habituelles d'identification et de localisation de la forme exprimée d'une hormone à partir de la connaissance de sa séquence codante, les inventeurs ont néanmoins utilisé des anticorps antichaîne C, à partir de constructions de peptide mimant le domaine C du polypeptide EPIL putatif, en plus des anticorps antichaîne A et B dans leur recherche d'identification et de localisation des
formes exprimées.
Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante deux formes exprimées du polypeptide EPIL. Une forme pourvue de la chaîne C et une forme dépourvue de la chaîne C. Les inventeurs ont également et de manière tout aussi surprenante mis en évidence que ces deux formes exprimées
étaient localisées à des niveaux tissulaires différents.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal *de:telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la
figure 1.
Dans la présente description, le terme de polypeptide
désigne également une protéine ou un peptide.
Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou encore par synthèse chimique et pouvant alors
comporter des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention a également pour objet un polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué: a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1; b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses; ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23,35 extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17,
extrémités incluses.
L'invention est relative aussi à un polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114,
extrémités incluses.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les cytotrophoblastes de
placenta humain.
L'invention concerne en outre un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, notamment les cellules
endothéliales vasculaires foetales.
De préférence, le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est sécrété dans
le liquide amniotique et/ou dans la circulation foetale.
L'invention est également relative à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules musculaires lisses, en particulier les cellules musculaires lisses vasculaires constituant la paroi de vaisseaux tels que les vaisseaux
embryonnaires ou de cordon ombilical.
L'invention comprend aussi un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules stromales, notamment l'amnion et/ou les cellules de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l'allantoïde situés au niveau du cordon ombilical. L'invention comprend en outre à un polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales, de préférence dans des cellules tumorales de tumeur angioproliférative telles que par exemple les cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi. Sont également préférées selon l'invention, les cellules tumorales de vaisseau intra-tumoral et les
cellules épithéliales de Malpighi.
L'invention concerne également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les syncytiotrophoblastes de
placenta humain.
L'invention comprend également un polypeptide EPIL 2 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans
la circulation maternelle.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de différentiation, de prolifération et/ou de régénération des cellules humaines et/ou animales, notamment les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, de préférence de type vasculaire, les cellules épithéliales ou les cellules stromales, notamment de la décidue, ou les cellules de
l'épithélium glandulaire.
Les polypeptides selon l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de vascularisation des cellules embryonnaires et/ou dans le processus de vascularisation des tumeurs, de préférence les tumeurs angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi. Les polypeptides selon l'invention sont aussi caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, dans un processus de type insulin-like, notamment paracrine et/ou autocrine, de préférence un processus de réponse à un stress hypoxique et/ou à un stress hypoglycémique, notamment, un processus favorisant l'utilisation du glucose
comme source d'énergie.
Les. fragments de polypeptide selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs, font également partie de l'invention. Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des activités d'un polypeptide selon l'invention notamment: - la capacité de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules, comme en particulier les cellules endothéliales ou musculaires lisses, notamment les cellules vasculaires; la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention; et/ou - la capacité de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, en neutralisant par exemple la fixation d'un polypeptide selon l'invention sur son récepteur
cellulaire spécifique.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et
acides aminés.
L'invention comprend également les polypeptides
homologues et variants des polypeptides selon l'invention.
On entendra désigner comme polypeptides homologues, les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides selon l'invention, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de similitude avec les séquences d'acides
aminés des polypeptides selon l'invention.
On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au
moins un résidu d'acide aminé.
L'invention comprend en outre les séquences d'acide nucléique caractérisées en ce qu'elles codent pour un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention. Les séquences complémentaires ou les séquences des ARN correspondant auxdites séquences d'acide nucléique selon
l'invention, font aussi partie de l'invention.
L'invention comprend également les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention ainsi que les cellules hôtes transformées
par lesdits vecteurs.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans lesdites
cellules hôtes, font également partie de l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule selon l'invention. La méthode d'obtention d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante se caractérise de préférence en ce que l'on cultive les cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et
que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par lesdites méthodes, font aussi partie de l'invention. L'invention comprend également les polypeptides ou un de leurs fragments selon l'invention, caractérisés en ce
qu'ils sont obtenus par synthèse chimique.
Les polypeptides correspondant aux polypeptides selon l'invention obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels, sont également
compris dans l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-
dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non
la structure tertiaire naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de
signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifères comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules murines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les
cellules 3ASUbE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que
des régions appropriées de régulation de la transcription.
Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la
lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Ces cellules sont utilisables dans une méthode de
production d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), des cellules humaines telles que les cellules 3AsubE d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple
(Luckow, 1993).
Les procédés de purification de polypeptide recombinant
ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier.
Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine " porteuse " (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de
fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon
l'invention, font partie de l'invention.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre,
par exemple:
- un polypeptide selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou de séquence d'acides
aminés de polypeptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes
décrite par Kôhler et Milstein, 1975.
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable
et/ou quantifiable.
Par ailleurs, l'invention concerne l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à
la présence anormale de polypeptide selon l'invention.
Ladite utilisation est comprise dans l'invention.
Il est bien entendu qu'on entend par l'expression
" plusieurs anticorps " dans la présente description, au
moins deux anticorps selon l'invention de spécificité différente, c'est-à-dire capable de reconnaître et de se lier à deux épitopes ou domaines différents de polypeptide selon l'invention. Il est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de l'invention de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits ou nécessaires de l'invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou
deux systèmes de révélation différents.
Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immuno-
cytochimique ou immunohistochimique de l'expression de polypeptide selon l'invention sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à
l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale d'un polypeptide selon l'invention dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de polypeptide selon l'invention, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide
selon l'invention.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation o l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être
observée de manière qualitative et/ou quantitative.
L'invention concerne également des sondes ou amorces oligonucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont
constituées d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement à30 ladite séquence selon l'invention, de préférence les sondes pourront être marquées.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force35 ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes: L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65 C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de
sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum
albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65 C, dans un tampon 2 x
SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.
Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci- avant pour un polynucléotide de taille définie,
seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo- nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon
l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
L'invention concerne en outre l'utilisation de sonde ou d'amorce, pour la détection, l'identification, la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon l'invention, ainsi que pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence
d'acide nucléique selonl'invention.
Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de manière générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence
bases.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants selon l'invention, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à- dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation' de l'expression des polypeptides selon l'invention, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Ces oligonucléotides sens ou antisens font également partie des sondes selon l'invention. L'invention concerne également un procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps selon l'invention; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou
dosage du complexe antigène-anticorps formé.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple un sérum humain ou animal, du
sang ou des biopsies.
L'invention concerne également un kit, ou nécessaire, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) un ou plusieurs anticorps selon l'invention; b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits
par la réaction immunologique.
Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps
éventuellement formé.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas o les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués à la fluoroscéïne ou radiomarqués capables de reconnaître spécifiquement les anticorps de l'invention, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif. L'invention concerne en outre un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique; b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon l'invention à l'aide d'amorces selon l'invention; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification. L'invention concerne aussi un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN contenu dans l'échantillon biologique; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ADN de
l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon l'invention et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant
pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligo-
nucléotidique, notamment marquée, selon l'invention.
L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide. nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une-sonde oligonucléotidique selon l'invention; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une5 réaction d'hybridation; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction
d'amplification de l'ADN.
L'invention comprend en outre un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention pouvant être fournie préimmobilisée sur un support; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'invention; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction
d'amplification de l'ADN.
Les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales, notamment angioprolifératives et en particulier pour le diagnostic du Sarcome de Kaposi, font
avantageusement partie de l'invention.
Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide ou de séquence nucléique selon l'invention, ou encore par diagnostic de pathologies liées à la présence de cellules tumorales, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédés ou kits peuvent être utilisés pour évaluer l'efficacité d'un traitement thérapeutique de ladite pathologie. Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple,
celles qui seront décrites ci-après.
L'invention est donc relative également à des méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon l'invention ou une sonde, notamment marquée, et/ou une
amorce selon l'invention.
On préfère les méthodes de marquage selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un procédé
selon l'invention.
Les techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, telles que celle décrite à l'exemple 4, sont bien connues des immumocytochimistes ou des immunohistochimistes et ne
seront pas développées dans la présente description.
Parmi les méthodes de marquage de cellule selon l'invention mettant en oeuvre une sonde de l'invention, on préfère également les méthodes comprenant l'utilisation d'une sonde marquée selon l'invention et/ou les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible selon l'invention susceptible d'être présente à l'aide de couple d'amorces de séquence nucléique selon l'invention. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé,
notamment par un procédé selon l'invention.
Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA " Nucleic Acid Sequence Based Amplification " (Compton 1991), TAS " Transcription based Amplification System " (Guatelli et al. 1990), LCR " Ligase Chain Reaction " (Landegren et al. 1988), " Endo Run Amplification " (ERA), " Cycling Probe Reaction " (CPR), et SDA " Strand Displacement Amplification " (Walker et al. 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces
que l'acide nucléique cible.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par exemple par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les sondes de l'invention, notamment marquées. L'invention concerne en particulier les méthodes de marquage de cellule, caractérisées en ce que la cellule est une cellule endothéliale, notamment vasculaire, une cellule musculaire lisse, une cellule stromale, notamment de la décidue, une cellule de l'épithélium glandulaire, ou une cellule tumorale, notamment angioproliférative et celles du
Sarcome de Kaposi en particulier.
L'invention a aussi pour objet une méthode d'obtention d'une cellule contenant un polypeptide selon l'invention et/ou une séquence d'acide nucléique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention, et en ce qu'on isole ladite
cellule marquée.
L'invention a également pour objet une cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode d'obtention selon l'invention. L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellules tumorales, notamment les cellules tumorales du Sarcome de kaposi, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre
une méthode de marquage selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention, une séquence d'acide nucléique selon l'invention ou une cellule selon l'invention. Ladite cellule pouvant être une cellule
transformée ou sélectionnée selon l'invention.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un des polypeptides selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'activité desdits polypeptides en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique
desdits polypeptides.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à se lier à un acide nucléique selon l'invention et pourront ainsi inhiber ou favoriser l'expression du gène codant pour lesdits polypeptides en
tant qu'inducteur ou répresseur.
Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules selon l'invention in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différentiation, la prolifération ou la
régénération de cellules.
L'invention a en outre pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la prolifération et/ou la régénération de cellules humaines et/ou animales, en particulier de favoriser ou d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération desdites cellules, notamment les cellules endothéliales, de préférence les cellules endothéliales vasculaires, les cellules musculaires lisses, notamment vasculaires, les cellules épithéliales, les cellules stromales, notamment de la décidue, et/ou les
cellules de l'épithélium glandulaire.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon, notamment de favoriser ou d'inhiber le processus
de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
L'invention a aussi pour aspect des méthodes de sélection selon l'invention, caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable moduler l'activité insulin-like, de préférence de moduler la réponse de la cellule à un stress hypoxique et/ou hypoglycémique, notamment de favoriser l'utilisation du glucose comme
source d'énergie.
On entendra désigner par activité insulin-like dans la
présente description, les activités bien connues de
l'insuline, notamment celles qui seront décrites dans les
exemples ci-après.
Par exemple, l'invention comprend une méthode de sélection de composés capable de se lier à un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention ou capable de se lier à une séquence nucléotidique ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique; b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique. Les cellules transformées ou sélectionnées selon l'invention et exprimant ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique peuvent également être utilisées dans lesdites méthodes de sélection. Les méthodes de sélection de composés basées sur l'affinité d'un composé pour un autre composé (recherche de ligands spécifiques) à effet agoniste ou antagoniste sur une activité spécifique désirée (telle qu'une activité biochimique de type
cellulaire) sont bien connues et ne seront pas décrites.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une
méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de carbone ou tous autres composés déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthèse chimique ou biochimique, ces techniques étant
connues de l'homme de l'art.
L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention à titre de médicament, de préférence choisis parmi: a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention; b) un anticorps selon l'invention; c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses fragments selon 1' invention; d) un vecteur selon l'invention; e) un vecteur selon l'invention, présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité d'un polypeptide selon l'invention; f) une sonde selon l'invention, comme par exemple les séquences d'acide nucléique sens ou antisens telles que
définies précédemment.
L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement des tumeurs, notamment des tumeurs
angioprolifératives comme par exemple le Sarcome de Kaposi.
Parmi lesdites tumeurs, les tumeurs du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un rhabdomyosarcome ou tout particulièrement
un léiomyosarcome, sont également préférés.
On pourra, par exemple, se référer aux publications de Clark, R.(1997); Ferrara, N., et al. (1997), ou de la revue Scrip N 2209, pp.21, et Scrip N 2202 concernant l'article sur la société Genentech, pour les activités biologiques dans lesquelles sont impliqués l'IGF-1 et l'EGF (facteur de croissance endothéliale), hormones apparentées
au polypeptide EPIL.
L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser la vascularisation de
tissus spécifiques.
L'invention comprend aussi des composés selon l'invention, destinés au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de
l'endométriose, de l'arthrite rhumatoide, de l'athéro-
sclérose ou de l'hyperthyroïdie. Les traitements de lésions dues à l'athérosclérose ainsi qu'à la resténose après
angioplastie étant parmi les traitements préférés.
En effet (Owens et al., 1996 et Murry et al., 1997), les facteurs de régulation de la croissance des cellules musculaires lisses, notamment ceux favorisant cette croissance, jouent un rôle essentiel dans la formation des plaques d'athérosclérose qui sont constituées d'une
population monoclonale de cellules musculaires lisses.
Ainsi, parmi les composés de l'invention, ceux permettant de moduler, en particulier d'inhiber, la croissance ou la prolifération des cellules musculaires lisses, pourront être utilisés pour le traitement des lésions induites par la formation de ces plaques, notamment pour le traitement de la resténose après angioplastie, dans le cadre du
traitement'de maladies cardiovasculaires.
L'invention comprend en outre des composés selon l'invention, destinés à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithélial, suite à une maladie dégénératrice ou à une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroide ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit tissu provoqué par un
traumatisme.
L'invention comprend également des composés selon l'invention, destinés à favoriser ou à inhiber
l'implantation embryonnaire.
Enfin, l'invention comprend des composés selon l'invention, destinés à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à une activité de type insulin-like, de préférence liées à un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, tel que l'hypoglycémie ou l'hyperglycémie. Parmi lesdites pathologies, le diabète, comme le diabète gestationnel, et les complications liées au diabète, notamment les complications d'ordre cardiovasculaires, sont notamment préférées. Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie
* intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge35 ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une 'thérapie dite " de remplacement " permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides. La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à- dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gènes correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas o l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est
exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992),des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter, 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epstein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans20 intégration dans le génome cellulaire. Il est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est-à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la
technique développée notamment par la société VICAL.
Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. Il est même intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contrôlée que l'on pourra bloquer lorsque cela sera nécessaire. Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées à la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, ou à l'absence ou à l'insuffisance de certaines. cellules ou tissus, suite par exemple à un traumatisme. Parmiles maladies liées à la différentiation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus spécifiques, comme en particulier les maladies liées à la présence de tumeurs, les inventeurs ont mis par exemple en évidence la présence anormale de quantité de polypeptides selon l'invention dans des tissus spécifiques chez des patients atteints du Sarcome de Kaposi, et ce en
comparaison avec les tissus sains correspondants.
Le Sarcome de Kaposi (SK) peut être défini comme une maladie angioproliférative caractérisée par une prolifération de cellules fusiformes ("spindle-shaped cells") probablement d'origine hétérogène en majorité endothéliale, mais aussi musculaire lisse, dendritique et/ou monocytaire, un processus de néoangiogenèse, une infiltration cellulaire inflammatoire ainsi que d'un oedème. Le SK affecte la peau et/ou les muqueuses. Il peut s'étendre aux tissus mous, os, et ganglions lymphatiques et affecter les organes viscéraux tels que les poumons, le tractus gastro-intestinal (intestin, foie et rate), les organes génitaux (prostate, vésicule séminale, testicules, vessie, pénis, col et vulve), le cerveau, les reins et les
glandes surrénales.
L'étiologie du SK reste au jour d'aujourd'hui une énigme. Cependant, on reconnaît sur le plan épidémiologique 4 entités cliniques différentes (Tappero et al., 1993): 1. Classique, affectant les hommes (ratio hommes/femmes 10:1) entre 50 et 80 ans d'origine méditerranéenne ou juifs de l'Europe de l'Est, de localisation cutanée, d'évolution chronique, avec un cancer secondaire se développant dans
% des cas.
2. Endémique, affectant l'homme noir africain d'environ 35 ans (ratio hommes/femmes 13:1), d'évolution bénigne ou fatale en 5-8 ans, affectant le jeune enfant d'environ 3 ans, d!évolution fatale en 2-3 ans. Le SK représente
entre 9 % et 12,8 % de toutes les néoplasies au Zaire.
3. Iatrogène, affectant les receveurs d'un organe transplanté immunosupprimé, avec habituellement une rémission en cas d'arrêt du traitement immunosuppresseur. 4. Epidémique, associé au SIDA, avec environ 30 % des patients atteints du SIDA développant un SK. Il s'agit de
la tumeur la plus fréquente associée à l'infection HIV-1.
Le risque de développer un SK est différent selon le mode de transmission du virus HIV avec un risque plus grand chez les hommes homosexuels et les femmes s'infectant par contact hétérosexuel avec un homme bisexuel par rapport aux
hémophiles et aux utilisateurs de drogues intraveineuses.
Il est de localisation multicentrique et symétrique, avec une évolution peu prévisible, la progression du SK étant le plus souvent corrélée à l'état général du patient. Ainsi, les critères de stades élaborés par le AIDS Clinical Trials Group (ACTG) tiennent compte du statut immunologique (CD4)
et des infections opportunistes.
La plupart des études traitant de la physiopathologie du SK sont basées sur des cultures primaires de cellules de SK associées au SIDA. La survie in vitro des cellules de SK en culture semble dépendre de facteurs de croissance tels que OSM,, VEGF, FGF-b, PDGF, IL-6 notamment. De plus, la protéine Tat du virus HIV-1 semble jouer un rôle inducteur synergique avec le FGF-b dans la formation du SK ce qui pourrait expliquer en partie l'évolution clinique plus agressive du SK associé au SIDA (Ensoli et al., 1994). En effet, dans les stades précoces de la maladie, le SK associé au SIDA semble être une maladie strictement liée aux cytokines o les cytokines inflammatoires et angiogéniques et la protéine tat HIV-1 ont une influence sur l'induction et la progression du SK. De plus, il est intéressant de noter que Barillari et al. en 1993 ont démontré que les cytokines inflammatoires auraient la capacité d'augmenter l'expression d'intégrine fixant la séquence RGD (Arg-Gly-Asp) au niveau de cellules du SK et de cellules normales endothéliales. Cette séquence correspond aux régions des protéines de la matrice extracellulaire (collagène,fibronectine, laminine, tenascin et thrombospondin) qui se lient aux intégrines membranaires des cellules, modulant ainsi l'attachement cellulaire, donc, participant au processus de croissance et différenciation et par conséquent à la tumorigenèse. Alors que la protéine tat du virus HIV contient des séquences RGD, on a démontré que les cytokines inflammatoires (IL-1 béta, TNF, IFN gamma) pouvaient par ailleurs augmenter la
fixation de la protéine tat à la cellule SK.
La progression de la maladie est caractérisée par la prolifération des cellules fusiformes du SK (spindle cells)
tant dans le SK classique que dans le SK associé au SIDA.
Récemment, on a démontré que le proto-oncogène Bcl-2, gène anti-apoptose, semblerait surexprimé dans les cellules fusiformes de phénotype endothélial (facteur VIII RA) des lésions de SK classique et associé au SIDA avec un taux de cellules marquées plus élevé au stade nodulaire de la maladie (Bohan Morris et al., 1996). Ainsi, l'apparition de ce processus anti-apoptotique semble être un mécanisme important dans la pathogénèse du SK et pourrait être un
marqueur de progression de la maladie.
Histologiquement, le SK classique et le SK associé au SIDA est indistinguable (Tappero et al., 1993). L'origine des cellules des lésions de SK reste peu claire. Les cellules sont probablement des cellules mésenchymateuses de l'endothélium lymphatique ou vasculaire, de dendrocytes du derme exprimant le facteur XIIIa ou de cellules du muscle
lisse vasculaire.
Les 3 stades histologiques patch, plaque et nodule sont
corrélés à la clinique et à la progression de la lésion.
1. Patch: cliniquement, lésion maculaire, histolo-
giquement, prolifération de petits, irréguliers espaces tapissés par un endothélium entourant des vaisseaux du dermes normaux. Associés ou non à une infiltration
lymphocytaire inflammatoire variable.
2. Plaque: cliniquement, petite lésion palpable (papule), histologiquement, expansion de cellules fusiformes (spindle cells) dans le derme dispersées parmi le collagène du derme
avec formation de canaux vasculaires irréguliers.
3. Nodule: cliniquement, large nodule palpable, histolo- giquement, plage de cellules fusiformes avec atypie cytologique discrète à modérée, érythrocytes dans un réseau
étendu d'espaces vasculaires en forme de fente (slit-like).
Récemment, le SK associé au SIDA semble répondre au traitement antiprotéase notamment par la trithérapie (4me conférence internationale sur les rétrovirus et les
infections opportunistes en Février 1997 à Washington).
Lorsque la tumeur échappe au traitement, un traitement par chimiothérapie peut être instauré (Bléomycine,
Vincristine).
Sommairement, le traitement du SK en général peut être
local (principalement la cryothérapie et radiothérapie) ou systémique (interféron, chimiothérapie). Le premier est généralement celui par lequel on débute parce que ayant moins d'effets secondaires à condition qu'il s'agisse d'une forme légère. Les localisations cutanées et de la muqueuse
en sont les indications majeures de par leur accessibilité.
La cryothérapie à l'azote liquide, le laser offrent un résultat acceptable sur le plan cosmétique. Cependant, il y a persistance du SK dans le derme profond et l'incidence d'une récidive après un délai de 6 mois augmente. La chimiothérapie cytotoxique intralésionnelle par vinblastine ou vincristine permet une réponse partielle ou complète dans 60 à 88 % des cas avec pour les patients présentant un SK associé au SIDA un taux de récidive de 40 % en 4 à 6 mois. En outre, se pose le problème fréquent de séquelle
cutanée comme l'hyperpigmentation post inflammatoire.
L'injection intralésionnelle d'interféron alpha ainsi que
de TNF alpha reste encore au stade expérimental.
Les patients n'ayant pas ou mal répondu au traitement local ou présentant une forme plus sévère par exemple avec ulcère ou forme extensive, peuvent bénéficier d'un traitement systémique avec en général une réponse clinique supérieure. Les agents chimiothérapeutiques le plus souvent associés sont la Bléomycine et la Vincristine. Cependant, il reste que ces traitements sont potentiellement immunosuppresseurs car relativement aplasiant. Le développement d'une thérapeutique basée sur des agents anti- angiogéniques comme l'IFN-alpha inhibant la production de FGF-b et d'IL- 8 dans les cellules de SK, le human platelet factor-4 ou le développement d'inhibiteurs de facteur de croissance (cytokines) et/ou de récepteur spécifique aux cellules du SK reste d'actualité. Récemment,
Masood et al. (1997) ont démontré l'action d'oligo-
nucléotide antisens de VEGF sur la croissance tumorale sur un modèle in vivo (souris nude). En cours de développement,
on cite généralement les analogues de TNP-450, l'acide cis-
trans-rétinoique et plus récemment 1'HAF ou hCG associated factor dont le mécanisme d'action semble être lié au processus de l'apoptose (Lunardi Iskandar 1997). En outre, depuis que Huang et al. (1996) ont pu récemment mettre en évidence par PCR la présence d'ADN d'un nouveau virus de la famille Herpès, le HHV-8 au niveau de lésion de SK des 3 types, SK associé au SIDA, SK classique et SK endémique africain, une thérapeutique anti-virale est en cours de développement. Pour le Sarcome de Kaposi et en général pour la plupart des maladies liées à la présence de tumeurs, il existe aujourd'hui d'une part un grand besoin de nouveaux outils moléculaires pour mieux comprendre le mécanisme physiologique de ces maladies, mais également de nouveaux
traitements thérapeutiques pour les combattre.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention
apparaissent dans la suite de la description avec les
exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après. Légende des Fiqures Fiqure 1: Séquence d'acide nucléique de 1'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL codé
par cette séquence.
Fiqure 2: A. Représentation schématique de la structure du polypeptide EPIL et localisation des sites de liaisons des domaines du polypeptide EPIL reconnus par les anticorps
1661 et 7381.
B. Structures primaires de la partie amino-terminale de la chaîne C de l'EPIL et de RLX-H2 (relaxine H2). Les
résidus d'amino-acides identiques sont notés par *.
Fiqure 3: Courbes d'inhibition compétitive, obtenues par méthode ELISA, de la fixation des anticorps 7381 et
1661, par différents peptides compétiteurs.
A. Inhibition de la fixation de l'anticorps 7381 (dilué au 1/500) dirigé contre le peptide EPIL 59-108-Y adsorbé
sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 59-108-
Y (C), EPIL 88-108-Y (E), RLX-H2 63-92 (A) et RLX-H2 74-92 (O). B. Inhibition de la fixation de l'anticorps 1661 (dilué au 1/300) dirigé contre les peptides EPIL 23-52 et EPIL -139 adsorbés sur microplaque, par les peptides compétiteurs EPIL 23-52 (+), EPIL 115-139 (E), et par un
mélange de peptides EPIL 23-52 et EPIL 115-139 (O).
Figure 4: Courbe d'inhibition compétitive de la
fixation de l'anticorps polyclonal 7383.
Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur
support microplaque avec le peptide EPIL 23-52 adsorbé.
Le pourcentage d'inhibition de la liaison de l'anticorps 7383 dilué au 1/500 est calculé en fonction de quantité croissante de peptide inhibiteur chaîne B (23-52), ayant servi d'immunogène, dont la concentration molaire est exprimée en notation scientifique: 1,0 E-10 équivalent à 1,0 x 10-10 Fiqure 5: Courbe d'inhibition compétitive de la
fixation de l'anticorps monoclonal EPIL 02.
La figure 5 représente l'analyse d'inhibition compétitive de l'anticorps EPIL 02 pour deux dilutions différente: dilution au 1/2500 (0) et dilution au 1/5000 (*). Les résultats ont été obtenus par méthode ELISA sur support microplaque sur laquelle est adsorbée le peptide
EPIL (125-137-Y).
Fiqure 6: Schéma représentant les caractéristiques de la construction du vecteur INSL4-pSec TAG CTM contenant
l'insert INSL4 de 418 pb.
Figure 7: Détection immunohistochimique des poly-
peptides EPIL 1 et EPIL 2.
Des coupes de tissus chorioniques villeux de placenta âgé de moins de 3 mois (6 à 8 semaines) (photographies A, B, E et F) ou de placenta à terme (photographies C et D) ont été marquées:
- avec des anticorps anti-EPIL 1 préabsorbés (photo-
graphies A et C) et des anticorps 7381 anti-EPIL 1, dilués tous les deux au 1/500 (photographies B et D);
- avec des anticorps anti-EPIL 2 préabsorbés (photo-
graphie E) et des anticorps 1161 anti-EPIL 2 (photographie
F), tous les deux dilués au 1/300.
Les cytotrophoblastes de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie B) et de placenta à terme (photographie D) montrent un marquage prédominant avec les anticorps anti-EPIL 1 alors que les anticorps anti-EPIL 2 marquent à la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes
de placenta âgé de moins de 3 mois (photographie F).
Agrandissement: photographies A et B: x 400, photo-
graphies C à F: x 1 000.
Figure 8: Analyse quantitative des niveaux de transcrits ARNm du gène INSL4 dans les cytotrophoblastes
(CT) comparée aux syncytiotrophoblastes (ST).
La quantification est réalisée par RT-PCR compétitive en utilisant un ADN standard quantitatif en témoin interne (IQS). L'électrophorèse est réalisé sur le séquenceur d'ADN ABI de Perking Elmer et on mesure les surfaces de pic obtenu. Les résultats sont exprimés en pourcentage de surface de pic obtenu avec 1'ADNc cible et l'IQS correspondant. Les expériences ont été réalisées deux fois de manière indépendante, les barres représentant l'écart entre les
deux résultats obtenus.
Fiqure 9: Analyse par immunoempreinte (Western blot) - Figure 9A: Anticorps monoclonal révélateur EPIL 02 (antichaîne A)
Ligne 1: Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Les bandes correspondant aux polypeptides EPIL recombinants sont très peu marquées et peu visibles compte tenu du facteur de dilution des polypeptides dans le surnageant15 brut de culture.
Ligne 2: Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 3: Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4: Fraction 7 après chromatographie phase inverse. Ligne 5: Fraction 8 après chromatographie phase inverse. Ligne 6: Fraction 9 après chromatographie phase
inverse.
Ligne 7: Fraction 16 après chromatographie phase inverse. - Figure 9B: Anticorps polyclonal révélateur 7381 (antichaîne C)
Ligne 1: Etalon de masse moléculaire.
Ligne 2: Surnageant obtenu après solubilisation des protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Ligne 3: Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4: Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 5: Fraction 7 après chromatographie phase inverse. Ligne 6: Fraction 8 après chromatographie phase inverse. Ligne 7: Fraction 9 après chromatographie phase inverse. - Figure 9C: Anticorps polyclonal révélateur 7383 (antichaîne B) Ligne 1: Surnageant obtenu après solubilisation des
protéines provenant des cultures cellulaires Sf9 infectées.
Ligne 2: Effluent après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 3: Eluat après chromatographie d'affinité
(Sépharose-CNBr-EPIL 02).
Ligne 4: Fraction 7 après chromatographie phase inverse. Ligne 5: Fraction 8 après chromatographie phase inverse. Ligne 6: Fraction 9 après chromatographie phase
inverse.
Ligne 7: Fraction 16 après chromatographie phase inverse. Fiqure 10: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par
l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement: X 100.
Figure 11: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution
1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement:X 100.
Fiqure 12: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB 2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par
l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement: X 200.
Fiqure 13: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des cellulles tumorales ("Spindle cells") après inhibition de l'immunsérum 7381 (dilution
1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubatiton).
Agrandissement: X 200.
Fiqure 14: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales (" Spindle cells ") par
l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement: X 1000.
Fiqure 15: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des celules tumorales ("Spindle cells") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution
1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement: X 1000.
Fiqure 16: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") par
l'immunsérum 7381 (Dilution 1/500).
Agrandissement: X 400.
Fiqure 17: Sarcome de Kaposi classique (N 320818)
Immunohistochimie (Phosphatase alcaline, Dako LSAB2).
Absence de marquage des cellules tumorales ("Spindle cells") après inhibition de l'immunsérum 7381 (Dilution
1/500) par peptide 59-108Y (18 heures d'incubation).
Agrandissement: X 1000.
EXEMPLE 1
Caractérisation de la ou des formes de polvpeptide EPIL exprimées dans les tissus Production d'anticorps anti-EPIL, spécifique de
domaines particuliers du polypeptide EPIL.
La stratégie de détection de la ou des formes exprimées du polypeptide EPIL, repose sur la production et l'utilisation d'anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre des peptides synthétiques, couplés à des protéines porteuses, mimant différentes régions de protéine putative.
1 Synthèse des peptides et préparation des immunogènes.
Des peptides synthétiques sont construits selon la méthode conventionnelle en phase solide sur un automate Applied Biosystems model 431A. Les peptides synthétisés
sont présentés lors de la description des anticorps (voir
3). Ces peptides sont purifiés par une chromatographie d'exclusion suivie d'une HPLC puis ils sont analysés
(composition en acides aminés et séquençage peptidique).
Ils sont ensuite conjugués à des protéines porteuses afin
de préparer des immunogènes.
2 Production et caractérisation des anticorps polyclonaux
et monoclonaux.
La production des anticorps polyclonaux est réalisée par injection des immunogènes (conjugués peptide-protéine porteuse) chez des lapins femelles " Grand Fauve de Bourgogne " âgés de 70 jours environ. L'immunogène (150 4g) est injecté par voie intradermique multipoints au niveau du dos en présence d'adjuvant complet de Freund dans du sérum physiologique. Deux rappels suivants sont effectués à respectivement J+21 et J+42 par injection de 25 gg
d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund par voie sous-
cutanée. Un troisième rappel peut être effectué à J+70. Une semaine après le rappel, un prélèvement de sang est réalisé
au niveau de l'oreille pour tester la présence d'anticorps.
Les lapins " bons répondeurs " sont saignés à blanc par
ponction intracardiaque.
La production des anticorps monoclonaux est réalisée par la technique d'hybridation cellulaire. Brièvement, des souris de souche BALB/c sont immunisées par l'injection de -100 Mg de conjugué peptide-protéine porteuse en adjuvant complet de' Freund par voie sous-cutanée. Des rappels par voie intra-péritonéale (25 tg d'immunogène en adjuvant incomplet de Freund) sont réalisés à trois mois d'intervalle jusqu'à obtenir une réponse immune, attestée par la présence d'anticorps détectables dans le sérum de l'animal. La fusion cellulaire est effectuée 3 jours après injection i.v. (intra veineuse) de l'immunogène. Elle consiste à prélever puis dissocier la rate de la souris et, dans un second temps, fusionner par le polyéthylèneglycol (PEG 1000) les lymphocytes ainsi libérés avec des cellules myélomateuses, entretenues en culture continue. Les hybridomes sont sélectionnés en milieu sélectif contenant de l'aminoptérine. La production d'anticorps monoclonaux
par les hybridomes est analysée par une méthode immuno-
enzymatique en phase solide (liaison au peptide immunogène). Les hybridomes producteurs sont clonés deux fois par dilution limite et la production en masse d'anticorps est réalisée par injection des hybridomes en intrapéritonéal chez la souris Nude. Les anticorps monoclonaux sont ensuite purifiés à partir des liquides d'ascite par une méthode de chromatographie d'affinité sur Sépharose- protéine A (Pharmacia) après précipitation des
protéines au sulfate d'ammonium.
Les caractéristiques de liaison des anticorps sont établies par des méthodes immunoenzymatiques en phase solide (ELISA) et radioimmunologiques (RIA). Brièvement, la méthode ELISA est réalisée en adsorbant un ou plusieurs peptides mimant une séquence d'un domaine du polypeptide putatif EPIL, dilué dans un tampon Phosphate 0,1 M, pH 7,4,
sur un support solide (plaque de polystyrène COSTAR/EIA).
Après une incubation de 18 heures à + 4 C, les supports sont saturés par une solution d'albumine et les anticorps à tester sont ajoutés pour une incubation de 1 heure à 37 C. Après lavage, la liaison des anticorps est détectée par l'addition d'un anticorps secondaire marqué à la peroxydase
(RAM/IgG (H+L) Po, TEBU). La solution de chromogène (o-
phénylène diamine) en présence d'H202 permet de révéler la réaction 'enzymatique. Une méthode par inhibition compétitive peut être réalisée pour préciser la localisation des sites reconnus par les anticorps. Pour cela, les anticorps sont préalablement incubés avec des peptides synthétiques à différentes concentrations, par exemple représentatifs de séquences plus courtes que celle du peptide adsorbé sur le support. Le mélange est ensuite déposé sur le support et l'activité anticorps résiduelle est mesurée. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la liaison. La méthode RIA est développée de façon semblable, excepté le fait que le peptide est radiomarqué par un isotope 125I selon le procédé dit du Iodogène. Les complexes immuns potentiellement formés avec l'anticorps sont précipités par le polyéthylène glycol (PEG 6000) et, après lavage, la radioactivité est mesurée. Il est aussi possible de réaliser une expérience d'inhibition
compétitive comme décrit ci-dessus.
3 Caractéristiques des anticorps.
Les nombres associés aux séquences ci-dessous correspondent aux positions des acides aminés définies dans
la séquence d'acides aminés de la figure 1.
Trois anticorps polyclonaux et un anticorps monoclonal
dirigés contre des peptides synthétiques sont décrits ci-
dessous: Un anticorps polyclonal, numéroté 7381, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un peptide synthétique mimant la séquence 59-108 Tyrosine (Y) de la chaîne C putative (figure 2) couplé par la benzidine à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse. Cet anticorps se lie à la séquence 59-108 du domaine C du polypeptide EPIL (figure 3A). Il ne reconnaît pas la séquence analogue dans la relaxine H2 (RLX-H2), protéine qui présente la plus forte similitude structurale (67 %) 41. dans le domaine C. Cet anticorps est capable de détecter le polypeptide recombinant comportant le domaine C, par exemple-dans une méthode d'immunoempreinte, et de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 ou EPIL 3 physiologique, par exemple au niveau du placenta (voir exemple 4, concernant l'immunohistochimie). * Un anticorps polyclonal, numéroté 1661, est obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un mélange de peptides synthétiques mimant les séquences 23-52 de la chaîne B putative et 115-139 de la chaîne A putative (figure 2) couplés par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse. Cet anticorps polyclonal comporte des anticorps majoritairement dirigés contre la région 115-139 de la chaîne A et dans une moindre mesure contre la séquence 23-59 de la chaîne B (figure 3B). Il permet de détecter un polypeptide recombinant comportant les domaines A et/ou B, par exemple dans une méthode d'immunoempreinte, ainsi que le polypeptide EPIL natif et ses formes moléculaires comportant les domaines A et/ou B,20 tels que par exemple les polypeptides EPIL 1 et EPIL 2
(voir exemple 4).
a Un anticorps polyclonal, numéroté 7383, et obtenu par immunisation de lapins avec un immunogène comportant un
mélange de peptides synthétiques mimant les séquences (31-
49) + (31-50) + (31-51) + (31-52) + (31-53) de la chaîne B putative couplés par le MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-
succimimide) à l'Hémocyanine de Patelle (KLH), protéine porteuse (figure 4).
* Un anticorps monoclonal, dénommé EPIL 02 (IgG2a), est sélectionné après immunisation de souris avec un immunogéne
comportant un peptide synthétique mimant la séquence 125-
137-Y de la chaîne A putative couplé par la benzidine à l'anatoxine tétanique, protéine porteuse (figure 5). Cet anticorps est utilisable pour la préparation de colonne de chromatographie d'affinité permettant de séparer et de purifier le polypeptide d'origine recombinante (voir
exemple 2).
EXEMPLE 2
Production de la forme extra courte en cellule SF9 Les étapes suivantes sont réalisées:
1 Construction dans le vecteur d'expression pFastBacTM.
La forme extra courte INSL4 (séquence codante) est insérée dans le vecteur d'expression d'eucaryote inférieur (baculovirus) pFastBacTM (GIBCOBRL) au site Kpnl. Par la suite, une coinfection des cellules d'insecte SF9 par de l'ADN du baculovirus sauvage (AcMNPV, GIBCOBRL) et du vecteur de transfert contenant le gène d'intérêt est
réalisée, afin de constituer une recombinaison homologue.
2 Séquençage.
Afin de vérifier la présence et l'orientation de la séquence codante INSL4 dans la construction recombinante, l'analyse du profil de restriction de l'ADN recombinant est réalisée grâce à différentes endonucléases (Kpnl, EcoRl) et par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN
INSL4 et du site multiple de clonage du bacmide pFastBacT.
3 Analyse de l'expression du polypeptide EPIL.
Après infection des cellules ovariennes d'insecte (Spodoptera frugiperda 9) et amplification du titre viral, l'expression du polypeptide recombinant EPIL, codé par le
gène INSL4, est analysée par SDS-PAGE suivi d'immuno-
empreintes. 4 Purification et caractérisation du polypeptide
recombinant EPIL.
* Solubilisation des protéines.
Environ 200 x 106 cellules Sf9 infectées sont centrifugées. Le culot de centrifugation est repris dans 1 ml de'tampon Na2HPO4 0,05 M, pH 8,5 contenant 0,1 % NP 40 et 5 ig/ml de leupeptin. Après agitation par basculement pendant 4 h à 4 C, le mélange est centrifugé 10 mn à 14 000 t/mn à + 4 C. Le surnageant est récupéré pour les
étapes suivantes.
* Chromatographie d'affinité.
Dans un premier temps, une colonne de Sépharose-CNBr-
EPIL 02 est préparée de la façon suivante. Trois grammes de
gel sont mis à gonfler dans 20 ml d'HCl pendant 4 heures.
Le gel est ensuite introduit dans une colonne (20 x 1,5 cm) puis rincé avec une solution de couplage (NaHCO3 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,5). Après élimination de celle-ci, 1,5 à 4 mg d'anticorps monoclonal purifié EPIL 02, dilué dans la solution de couplage, sont ajoutés. Après 18 heures à + 4 C sous agitation, les sites libres sont bloqués avec de l'éthanolamine 1 M puis la colonne est lavée avec une solution de CH3COONa 0,1 M, CH3COOH 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4 Enfin, la colonne est rincée par Na2HPO4 0,05 M, pH 8,5. Le surnageant récupéré après solubilisation est dilué au 1/10 dans du tampon Na2HPO4 0,05 M, pH 8,5. Après dilution, la solution est mise en contact pendant 18 h à + 4 C avec le support Sépharose-CNBr-EPIL 02 en agitation lente. Des lavages sont effectués avec un tampon Na2HPO4 0,05 M, pH 8,5 en présence de 0,01 % NP40. La procédure est automatisée sur un équipement FPLC (Pharmacia). Le temps de lavage est conditionné par le retour de la densité optique au niveau de base. Les fractions recueillies constituent l'effluent. L'élution de l'antigène lié à l'anticorps s'effectue avec un tampon d'acide acétique 2,5 %. Les fractions recueillies constituent l'éluat. L'effluent et l'éluant sont analysés par une technique d'immunoempreinte
avec comme anticorps révélateurs EPIL 02, 7381 et 7383.
a Chromatographie liquide haute performance (HPLC) en
phase inverse.
Deux chromatographies successives sont ensuite réalisées sur les fractions recueillies après élution avec l'acide acétique 2,5 %. Ces fractions sont rassemblées puis déposées tout d'abord sur une colonne Lichrosorb RPB C8 7 gm (250 mm x 4 mm) montée sur un système HPLC Beckman GOLD. Le chargement s'effectue en continu par une vanne externe avec un débit de 2 ml/mn et les fractions sont recueillies par collection automatique toutes les 30 secondes. Deux phases mobiles sont utilisées: phase A:
TFA 0,1 % - 99,9 % H20 et phase B: TFA 0,08 - 4,92 % H20 -
95 % CH3CN. Une analyse des fractions recueillies après chromatographie phase inverse C8 est réalisée par électrophorèse et SDSPAGE/immunoempreinte utilisant les
anticorps EPIL 02, 7381 et 7383.
Analyse par immunoempreinte. La présence ainsi que les masses moléculaires relatives (Mr) des formes moléculaires du polypeptide recombinant
EPIL sont déterminées par électrophorèse suivie d'immuno-
empreintes. Brièvement, la méthode consiste à faire migrer les préparations protéiques à tester dans un gel de polyacrylamide (30 % w/v acrylamide, 0,8 % w/v bis acrylamide; Tris-Hcl 1,5 m, pH 8, 8) pendant 30 minutes sous 200 volts. Après migration, les protéines sont transférées sur un support de type papier filtre PVDF sous l'influence d'un champ électrique. Le support est ensuite saturé dans un tampon de blocage puis incubé avec les anticorps. Après lavage, la liaison éventuelle des anticorps est révélée soit par un anticorps secondaire marqué à la peroxydase soit par la méthode au luminol (kit ECL, Amersham, NW). Les masses moléculaires relatives sont calculées à partir des standards de référence. Dans ces conditions, les anticorps EPIL 02, 7381 et 7383 révèlent plusieurs fractions positives après chromatographie phase
inverse et correspondent à des temps d'élution différents.
Ces fractions référencées 7, 8, 9 et 16 contiennent différentes populations de protéines variant par leur masse moléculaire relative (figure 9). Ces masses relatives sontcomprises entre 13 kDa et 32 kDa.
6 Analyse par spectrométrie de masse par ionisation à
électro-spray en mode positif.
Cette étude est réalisée sur un analyseur PlatformII (Micromas Ltd) utilisant comme étalon le myoglobine de cheval (Masse moléculaire: 16 951,50 0,17 Da). La fraction 7 obtenue après chromatographie phase inverse et positive après une analyse d'immunoempreinte avec les 3 anticorps EPIL 02, 7381 et 7383, est lyophilisée puis reprise dans une solution de CH3CN/H20 (V/V) et acide formique 0,1 %. L'analyse de cet échantillon révèle un mélange de deux produits présentant des masses moléculaires expérimentales moyennes: M1: 13 346,62 2,14 Da
et M2: 15 491,86 3,46 Da.
* La masse moléculaire théorique du polypeptide EPIL 1 (1-139) correspond à une masse de 15.445,05 Da. La différence de masse de 43 Da par rapport à la masse
moléculaire expérimentale M2 pourrait être attribuée à un groupement acétyl (CH3-CO-).
Ces résultats suggèrent la présence dans l'échantillon
de la molécule EPIL 1 acétylée en position N-terminale.
Une masse moléculaire théorique égale à 13.347,46 Da est calculée lorsque les 18 premiers acides aminés du polypeptide EPIL 1 sont délétés et que 3 ponts disulfures sont réalisés entre les 6 cystéines. La masse expérimentale trouvée (13.346,62 + 2 Da) est proche de cette masse théorique calculée. Cette observation pourrait suggérer que35 la deuxième molécule présente majoritairement dans l'échantillon correspond à la molécule EPIL 1 sans le peptide signal 1-18 et avec une structure tertiaire
présentant,3 ponts disulfures.
EXEMPLE 3
Production de la forme extra courte en cellules CHO Les étapes suivantes sont réalisées:
l0 1 Construction.
La séquence codante correspondant à la forme extra courte INSL4 est clonée dans le vecteur d'expression eucaryote pSec Tag C (INVITROGEN) au site BamH1-Xbal (schéma figure 6). En parallèle, un vecteur de référence pSec Tag C, digéré par les mêmes endonucléases de restriction (pSec Tag C MOCK), est construit. Après transformation de bactéries TOP10 (INVITROGEN), un clone recombinant est sélectionné 1/ par analyse par PCR, 2/ par une étude du profil de restriction de l'ADN recombinant vis-à-vis de différentes endonucléases (BamHl, Xbal, ECORl) et 3/ par séquençage automatique (amorces spécifiques de l'ADN INSL4 et du site multiple de clonage du plasmide pSec Tag CTM). La fonctionnalité du cadre ouvert de lecture est confirmée par une étude de transcription/traduction in vitro (TNT T7 Quick coupled Transcription/Translation System, PROMEGA). Cette expérience met en évidence
l'expression de deux espèces protéiques néosynthétisées.
Ces deux espèces, identifiées par l'anticorps 7381, spécifique du peptide C, et l'anticorps 7383 dirigé contre la chaîne B, présentent des masses moléculaires
respectivement égales à 15 et 20 kDa.
Afin d'obtenir une lignée produisant le polypeptide recombinant EPIL de façon stable, le vecteur d'expression ayant intégré le gène INSL4 est transfecté dans des cellules d'ovaire de hamster chinois (lignée CHO). Deux méthodes de transfection peuvent être utilisées: la
méthode au Phosphate de Calcium et l'électroporation.
L'utilisation de 10 à 20 pg d'ADN plasmidique permet l'intégration génomique de l'ADN recombinant INSL4. Grâce à la présence d'un marqueur de résistance aux antibiotiques présent dans le vecteur, les clones cellulaires recombinants stables, ayant intégré pSec Tag C INSL4, sont sélectionnés par culture dans un milieu contenant 600 úg/ml
de ZEOCINTM (INVITROGEN).
2 Northern blot.
Les clones sélectionnés sont établis en culture.
L'étude de l'expression des transcrits pSec TagC INSL4 est réalisée par Northern blot après extraction des ARNm. Vingt quatre heures après hybridation de la sonde INSL4 (insert BamHl-Xbal), l'expression du transcrit recombinant pSec Tag C INSL4 est mise en évidence dans toutes les cellules transfectées. La taille de l'ARNm, 900 pb, correspond à
celle attendue pour le transcrit putatif (907 pb).
3 RT-PCR.
L'expression du transcrit recombinant INSL4 dans les
cellules CHO est aussi confirmée par une analyse en RT-PCR.
L'analyse par RT-PCR des ARNm extraits des cellules CHO transfectées par la construction CHO-pSec Tag C MOCK (vecteur vide contrôle) ainsi que de ceux extraits des cellules parentales CHO montre l'absence d'expression du transcrit recombinant INSL4 après 30 cycles d'amplification.
4 Détection du polypeptide recombinant.
La purification des diverses formes hormonales placentaires recombinantes produites à partir des milieux de culture et des cellules transfectées montre, par la méthode des immunoempreintes, la présence de formes protéiques de 16,5 et 20 kDa dans les cellules transfectées, ainsi que des espèces protéiques de 6,5, 10 et 16,5 kDa dans le milieu des cellules CHO transfectées
pSec Tag C INSL4.
EXEMPLE 4
Détection des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL L'existence des formes physiologiques exprimées du polypeptide EPIL dans les tissus humains normaux est recherchée par une méthode immunohistochimique grâce aux anticorps décrits ci-dessus. Cette technique est réalisée sur du placenta dans la mesure o le gène INSL4 a été cloné à partir de ce tissu, sur du tissu vasculaire de cordon ombilical et sur un tissu spécifique de patients atteint du
Sarcome de Kaposi.
A) Echantillons de tissu 1) Echantillons de tissu placentaire Des villosités placentaires obtenues à partir de placenta précoce (7 semaines) et à terme ont été fournies par le Service de Gynécologie obstétrique de l'Hôpital Antoine Béclère, France, selon les procédures appropriées par le comité éthique. Les tissus sont fixés en tampon à pH neutre contenant
10 % de formol puis inclus en paraffine.
On utilise également des cellules de cytotrophoblastes villeux et de syncytiotrophoblastes préalablement purifiées de placenta à terme. L'isolement des cellules de cytotrophoblastes à partir de placenta villeux est effectué30 comme décrit par Guillaudeux T. et al. (1995) par digestion enzymatique et centrifugation en gradient de Percoll comme pour les cultures primaires. Les cytotrophoblastes villeux et les syncytiotrophoblastes villeux différenciés, formés in vitro à partir de cytotrophoblastes (à 4-5 jours de culture), sont hautement purifiés (moins de 1 % de cellules contaminantes). Pour plus de clarté, les cellules purifiées de cytotrophoblastes villeux et les cellules différenciées in vitro de syncytiotrophoblastes sont dénommées ici
cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes respectivement.
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires L'analyse immunohistochimique des vaisseaux embryon- naires a été réalisée à la fois sur des coupes de villosités trophoblastiques de 10 SA (hôpital Antoine Béclère) et d'un cordon ombilical d'un embryon humain de il SA (hôpital Robert Debré, France), ces 2 prélèvements ayant été obtenus dans le cadre d'interruption volontaire de grossesse. 3) Tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi 28 biopsies cutanées de SK classique et associé au SIDA
ont été recherchées aux archives de l'Institut Gustave-
Roussy et utilisées pour immunohistochimie.
Il s'agit de tissus fixés dans une solution de Bouin, inclus en paraffine. Les coupes de tissus (3 im) ont été montées sur des lames SuperFrost/Plus et déparaffinées au Xylène. Les coupes, une fois réhydratées, ont été chauffées par microondes (3 x 5min.) dans une solution de tampon
citraté (10 mM, pH 6).
B) Immunohistochimie 1) Echantillons de tissu placentaire On utilise des tissus placentaires âgés de 6 à 12
semaines (n = 6) et des tissus de placenta à terme (n = 2).
On réalise des coupes de tissus de 3 Im, montées sur des plaques SuperFrost/Plus et dégraissées sur xylène. Les coupes réhydratées sont passées sur micro-ondes pendant 15 minutes en présence de tampon citrate 10 mM, pH 6,0. Après plusieurs lavages en tampon phosphate salin (PBS), les coupes sont incubées pendant 20 mn en présence de
l'anticorps donné.
Les coupes sont ensuite lavées puis marquées par un anticorps biotinylé suivi par une phosphatase alkaline couplée à la streptavidine. La révélation du marquage est ensuite obtenue par incubation en présence de la solution de substrat chromogène (Fuchsine DAKO, New Fuschin substrate system, Carpinteria, CA). Les coupes de tissus témoins contrôle négatif sont réalisées avec des coupes incubées en présence d'anticorps non spécifiques (sérum préimmun) ou en présence d'anticorps préabsorbés sur un
excès de peptide correspondant (figure 7).
2) Tissu de vaisseaux embryonnaires et tissu spécifique de patients atteint du Sarcome de Kaposi Après lavage par un tampon TBS (Dako), les coupes ont été incubées avec l'antisérum donné pendant 20 min., puis lavées et révélées en utilisant un complexe anticorps biotinylé suivi d'une phosphatase alcaline couplée à la streptavidine (PA- streptavidine). Le marquage est complété après incubation avec une solution chromogène du substrat
(DAKO New Fuchsin substrate system, Carpinteria, CA).
L'anticorps polyclonal 7381 (immun sérum dilué au 1:500) a été utilisé comme anticorps primaire. Il s'agit d'un anticorps reconnaissant l'EPIL 1 ou l'EPIL 3 puisque reconnaissant la région 59-108 de la chaîne du polypeptide EPIL. Les contrôles négatifs utilisés sont le sérum préimmun (Jo) et le 7381 immunsérum inhibé par le peptide
correspondant (59-108Y) avec une incubation de 18 heures.
Les autres anticorps (Ac) primaires ont été choisis comme témoins positifs permettant de confirmer le diagnostic de SK: Ac antifacteur VIII (phénotype endothélial) et Ac antiactine du muscle lisse alpha vasculaire (phénotype
muscle lisse). -
Les conditions d'inhibition des Ac 7381 sont réalisées par incubation pendant 18 heures en présence de: pl Ac 7381 dilué au 1/250 et 150 jl de peptide correspondant (59-108Y) (629bBis) à 2 10 4 M équivalent à 300 Ml Ac 7381 dilué au 1/500 pour 10-4 M de peptide
correspondant (59-108Y) (629bBis).
Pour l'immunomarquage des échantillons suivants: - villosité trophoblastique n X991 formol (12SA), 8785 (cordon ombilical) 320818(2) (SK), 293905-7 (SK), 240444 (SK), 293626-1 (SK) (coupes de 3 um-microtome), les anticorps(Ac) suivants ont été utilisés: - 7381 imun sérum anti chaîne C (59-108Y) dilué au
1/500;
- 7381 J0 (préimmun) dilué au 1/500; - Ac anti-facteur VIII dilué au 1/30; - Ac monoclonal de souris anti-actine de muscle lisse
alpha humain prédilué (Dako, code N 1584) (1A4).
EXEMPLE 5
Analyse des transcrits ARNm des cytotrophoblastes et des syncytiotrophoblastes Les ARNm d'INSL4 sont quantifiés par la méthode RTPCR (reverse transcriptase-polymérase chaîne réaction) comme décrit dans Bellet, D. et al. (1997). Brièvement, les transcrits TFIID sont quantifiés et utilisés comme ARNm endogène de contrôle. La PCR est réalisée sur 30 cycles d'amplification. Les séquences nucléiques des amorces utilisées pour l'amplification par PCR sont les suivantes:
INSL4-F: F 5'-AACTCCTTAGAGAAGCCTAGCA-3'
INSL4-R: 5'-TCGTACCTAAGGCTTGTCCATCT-3'
TFIID-F: F 5'-ACAGGAGCCAAGAGTGAAGAA-3'
TFIID-R: 5'-CCAGAAACAAAAATAAGGAGA-3'
(F: colorant fluorescéine).
RESULTATS
1) Tissu placentaire Deux anticorps, désignés 7381 et 1661, dirigés respectivement contre les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3,
et EPIL 2 ont été sélectionnés.
L'anticorps 7381 dirigé contre le domaine 59-108-Y de la chaîne C conjugué avec une protéine porteuse s'est révélé totalement spécifique du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3. En effet, les expériences d'inhibition compétitive réalisées avec des peptides ou des sous- peptides analogues de la portion de la chaîne C du polypeptide putatif EPIL ou de la portion correspondante de la relaxine humaine, démontrent que l'anticorps 7381 se lie seulement au domaine C du polypeptide putatif EPIL au niveau de sa portion 59-88 et ne reconnaît pas la chaîne C de la relaxine humaine (Figure 3A). L'hormone relaxine est le seul membre de la superfamille des insulin-like présentant un pourcentage significatif (37 %) de similitude avec le polypeptide putatif EPIL dans la portion du domaine C correspondant à
la région 59-88 du polypeptide EPIL.
L'anticorps 1661 a été obtenu par immunisation réalisée
avec un mélange de deux peptides analogues au domaine 115-
139 de la chaîne A et au domaine 23-52 de la chaîne B. Ces deux régions du polypeptide putatif EPIL ne présentent pas de pourcentage significatif de similitude avec des régions correspondantes d'autres membres de la superfamille (< 16 %). Les expériences d'inhibition compétitive démontrent que cet anticorps polyclonal est principalement dirigé contre le domaine 115-139 de la chaîne A et contient également une sous-population d'anticorps dirigée contre le domaine 23-52 de la chaîne B (Figure 3B). Le parallélisme des courbes de compétition d'antigènes observées avec les peptides chaîne A et chaîne B reflète plus vraisemblablement des affinités similaires de ces deux sous-populations d'anticorps pour leurs épitopes chaîne A et chaîne B, puisque la structure primaire de ces deux régions distinctes ne présente pas de similitude
significative.
Les méthodes immunohistochimiques basées sur les anticorps 7381 et 1661 ont été utilisées pour détecter la présence des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement dans les tissus de placenta précoce (moins de 3 mois) et de placenta à terme. La Figure 7 représente les résultats obtenus à partir d'expériences réalisées sur
des tissus d'au moins deux femmes enceintes. L'immuno-
marquage réalisé avec l'anticorps 7381 dirigé contre le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est très important dans les cytotrophoblastes de placenta précoce alors qu'il est léger
voire absent dans les syncytiotrophoblastes (Figure 7B).
Dans le placenta à terme, de rares cytotrophoblastes présentent une coloration intense alors que les syncytiotrophoblastes ne présentent pas de coloration
appréciable (Figure 7D). De plus, cet anticorps anti-
polypeptide EPIL 1 marque les cellules foetales endothéliales vasculaires, particulièrement dans le
placenta précoce (figure 7B).
Les résultats obtenus avec l'anticorps 1661 anti-
polypeptide EPIL 2 montrent qu'à la fois les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce sont colorés (Figure 7F). Par opposition, cet anticorps ne marque pas les trophoblastes de placenta à
terme (résultats non présentés).
Analyse des transcrits ARNm Les résultats obtenus par la méthode RT-PCR et la méthode d'analyse quantitative par PCR montrent que les
niveaux de transcrits d'ARNm d'INSL4 dans les syncytio-
trophoblastes villeux différenciés in vitro obtenus à partir de placenta à terme, sont dix fois plus (une unité log) élevés que ceux observés dans les cytotrophoblastes (Figure 8). Par opposition, les niveaux de transcrits TFIID
sont similaires dans les deux types de cellules.
La détection d'ARNm n'implique pas que les protéines sont synthétisées, comme par exemple pour l'expression HLA classe I dans le placenta. En effet, les cytotrophoblastes villeux expriment les ARNm d'HLA classe I, mais ne synthétisent pas les protéines correspondantes, alors que les trophoblastes extravilleux transcrivent et traduisent
les gènes HLA de la classe I (Hunt, J. S. et al., 1990).
Cependant, le placenta, qui transcrit un nombre important de gènes, est aussi une source de nombreux polypeptides, incluant les facteurs de croissance de type insulin-like, qui sont connus pour être essentiels au stade précoce du développement embryonnaire et, après la naissance, et pour participer à la croissance et à l'activité fonctionnelle de presque tous les organes du corps humain (Le Roith, D.
1997).
Ces résultats montrent pour la première fois que les trophoblastes non seulement expriment l'ARNm de l'INSL4, mais contiennent des polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 immunoréactifs. D'autre part, il est d'un grand intérêt d'observer que l'immunomarquage important des tissus trophoblastiques de placenta précoce obtenu l'EPIL 2, est similaire à ceux décrits pour plusieurs facteurs de croissance, incluant le TGFa et 1'EGF (Horowitz, G. M. et
al., 1993).
Un autre résultat surprenant est l'expression importante de polypeptides EPIL 1 et /ou EPIL 3 dans les cytotrophoblastes comparée aux syncytiotrophoblastes, alors que, à la fois les études d'hybridation in situ réalisées sur des placenta précoces (résultats non représentés) et l'analyse quantitative par PCR compétitive réalisée sur des placenta à terme indiquant que les transcrits d'INSL4 sont plus abondants dans les syncytiotrophoblastes. De plus, les polypeptides EPIL 2 sont détectés à la fois dans les cytotrophoblastes et les syncytiotrophoblastes de placenta précoce avec des intensités du marquage similaires dans les
deux types de cellules.
Prises ensemble, ces observations montrent que, in vivo, la maturation de l'EPIL diffère dans les
cytotrophoblastes en comparaison avec les syncytio-
trophoblastes. Dans la superfamille des insulin-like, les peptides C de jonction ou chaîne C sont les médiateurs de la formation de la structure tertiaire des protéines et en particulier de l'assemblage correct des trois ponts disulfures de
l'hormone mature.
Ces résultats montrent que dans les cytotrophoblastes, le peptide C du polypeptide putatif EPIL est maintenu alors que l'EPIL 2 présent dans les syncytiotrophoblastes ne présente pas de peptide C de jonction. Ainsi, nous pouvons déduire de ces résultats et de ces observations que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 contenant le peptide C peut être sécrété à partir des cytotrophoblastes dans le liquide amniotique et que l'EPIL 2 ne contenant pas le peptide C peut être sécrété à partir des syncytiotrophoblastes dans la circulation maternelle. L'EPIL 3, correspondant au peptide C est par définition également reconnu par les anticorps antichaîne C, tels que l'anticorps 7381. Cette forme du polypeptide putatif EPIL et qui correspond au sous-produit de clivage aboutissant à l'EPIL 2, peut également avoir une activité biologique autre que celle de participer à la formation de la structure tertiaire de
l'EPIL (Ido, Y. et al., 1997, Steiner, D. F. et al., 1997).
Cette capacité d'excrétion sélective de peptides différents dans des compartiments biologiques variés a déjà été illustrée par d'autres hormones polypeptidiques comme pour
l'HCG et ses sous-unités libres.
D'autre part, il est remarquable de voir que le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 est (sont) présent(s) également dans les cellules foetales endothéliales vasculaires. Des résultats récents (Zhou, Y. et al., 1997), ont montré que les cytotrophoblastes extravilleux sont plastiques et ont la capacité d'acquérir des caractéristiques de cellules endothéliales. Ainsi, ces résultats établissent en fait que les cytotrophoblastes villeux et les cellules foetales endothéliales doivent très certainement partager des caractéristiques phénotypiques communes. Ces résultats montrent également que le polypeptide EPIL, en particulier l'EPIL 1, est impliqué dans le processus de différentiation des cellules trophoblastiques, et de manière générale le polypeptide EPIL est très certainement impliqué dans le processus de différentiation, de prolifération et de régénération des cellules, en particulier endothéliales comme les cellules vasculaires. 2) Tissu de vaisseaux embryonnaires
L'objectif de la série d'expérience par immuno-
histochimie est d'étudier plus précisément les vaisseaux embryonnaires intravillositaires ainsi que du cordon
ombilical du Ier, IIème et IIIème trimestre.
En utilisant l'antisérum 7381 à une dilution de 1:500, les expériences d'immunohistochimie confirment la présence d'un immunomarquage au niveau des vaisseaux embryonnaires des villosités flottantes, notamment au niveau des cellules endothéliales sur un cas de prélèvement trophoblastique de 12 SA. Cependant, on note pour la première fois que les vaisseaux embryonnaires de villosités primaires présentent un immunomarquage des cellules constituant la paroi du vaisseau, les cellules musculaires lisses, alors que les cellules endothéliales ne sont quasiment plus marquées.20 De même, ce phénomène paraît s'amplifier au niveau des vaisseaux du cordon ombilical avec, au niveau de la veine
et des 2 artères un marquage des cellules de la média donc des cellules musculaires lisses, avec une disparition complète du marquage des cellules endothéliales(cf.25 Tableaux 1 et 2 ci- après).
Tableau 1
Cellules Cellules Musculaires Endothéliales Lisses Vx embryonnaires 1. villosité + ++ flottante 2. tronc primaire + ++ ou secondaire (villosité) 3. cordon ombilical ++ Légende du tableau 1: Détection immunohistochimique (PA, Dako, LSAB2) du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 par l'immun sérum 7381 (dilution 1/500) au niveau des vaisseaux embryonnaires de villosités trophoblastiques (12 SA) et d'un cordon ombilical (AA SA) du 1er trimestre de grossesse (coupe 3L). On observe tant au niveau des villosités trophoblastiques des troncs primaires qu'au niveau du cordon ombilical un immunomarquage plus important des cellules musculaires lisses (média) par rapport aux cellules endothéliales. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante: (-) absence de marquage; (+) marquage de faible intensité; (++)
marquage de forte intensité.
Tableau 2
7381 Anti 7381 7381 38 Anti actine
Marquage/Tissu im.sér. J0 imhsb facteur alpha-
1/500 1/500 1/500 VIII muscle lisse Cytotrophoblaste + - -_ Syncytio- _ trophoblaste Vx embryonnaires (tronc primaire) endothélium + - - + + Média ++ - - - ++ Cordon ombilical (11 SA) Média+ - NT* Endoth+ Média+ Vx (3 vx) (3 vx) (3 vx) Amnion + - NT NT
Vestiges embry.
Sac vitellin ++ -
Allantoide ++ ++
*: non testé.
Légende du tableau 2: Analyse immunohistochimique (PA, Dako, LSAB2) avec l'immun sérum 7381 anti-peptide C (dilution 1/500), l'anticorps polyconal anti-facteur VIII (Dako, Réf. A0082) et monoclonal anti-actine a muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 y) de villosités trophoblastiques (tronc primaire) et d'un cordon ombilical du 1er trimestre de grossesse. On observe une similitude de marquage entre l'immun sérum 7381. Par ailleurs, on relève une absence de marquage par l'anticorps polyclonal 7381 pré
immun et l'immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y.
L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante: (-) absence de marquage; (+) marquage de faible intensité; (++) marquage de forte intensité.Vestiges embry.: vestiges embryonnaires; Endoth.: endothélium; Vx: vaisseaux; NT: non testé;
Im.sér.: immun sérum; JO: sérum préimmun.
La lecture des lames correspondant au cordon ombilical ( cf. tableau 2) met également en évidence les vestiges embryonnaires endodermiques dont notamment la vésicule (ou sac) vitelline (yolk sac) et l'allantoide. Ces structures sont visibles aux côtés des trois vaisseaux et sont marquees par l'immun sérum 7381 antichaîne C. Il est intéressant de souligner que l'allantoide, ainsi que le yolk sac (sac vitellin) sont des structures embryonnaires (d'origine endodermique) très importantes sur le plan de la vasculogénèse. En effet, ces structures sont le siège de processus de différenciation des cellules hémangioblastiques (dérivées du mésoderme) en cellules angioblastiques et hématopoïétiques. En outre, il est intéressant de rappeler que ce processus de différenciation correspondant aux premières étapes de la vasculogénèse (dès
la 3e semaine de gestation) et semble être induit pas le VEGF synthétisé par l'endoderme (Risau, W., 1997).
Rôle du polypeptide EPIL dans le processus de décidualisation et d'implantation embryonnaire Le processus de décidualisation de l'endomètre est essentiel pour que l'implantation de l'embryon puisse se faire. Ce processus est dépendant des hormones stéroides ovariennes, notamment de la progestérone. Une des modifications durant la décidualisation concerne les cellules stromales de l'endomètre. En effet, les cellules stromales subissent au voisinage du site d'implantation des modifications morphologiques (polygonale, cytoplasme de taille agrandie, aspect de cellules épithéloides) et fonctionnelles (riche en glycogène et lipide, sécrétion autocrine et/ou paracrine de prolactine, relaxine, renin, IGF et IGFBP) (Speroff, L. et al., 1995; Edwards, R.G.,
1995).
Plus récemment, il a été démontré que les facteurs de croissance de la famille EGF (EGF, TGF-alpha, HB-EGF, amphiregulin, heregulin, betacellulin, epiregulin) pourraient jouer un rôle important dans les mécanismes
d'initiation de l'implantation, notamment de l'attachement.
En effet, dans les modèles murins, l'expression du récepteur à 1'EGF (EGF-R) régulée par la progestérone et l'E2 a été démontrée tant au niveau du blastocyste que des cellules stromales utérines, ce qui fait des molécules de cette grande famille de l'EGF des ligands potentiels à activité modulatrice de l'implantation (SK Das, International Symposium on Embryo Implantation, Octobre 1997). Il est intéressant de noter que dans l'espèce humaine, une étude a démontré la localisation du transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) dans
l'endomètre, la décidue et le trophoblaste (Horowitz, G.M.
et al., 1993). En outre, la décidualisation de cellules stromales est accompagnée de changements dans la motilité cellulaire qui implique une modification de la matrice extracellulaire (sécrétion de laminine par les cellules stromales, par exemple). Il apparaît chez le rat que l'expression de bFGF ou fibroblast growth factor basique au niveau des cellules utérines stromales, est dépendante de la progestérone et pourrait être un facteur de croissance co-régulant les cellules stromales et être donc impliqué dans le processus de différenciation (décidualisation). Les cellules stromales décidualisées synthétisent et sécrètent de la prolactine (PRL). Une étude in vitro de cellules endométriales stromales a montré que la production de PRL est probalement régulée par l'effet combiné des hormones stéroidiennes (oestrogène et projestérone) et d'un peptide, la relaxine (Huang, J.R. et al., 1987). Plus récemment, alors que la source de relaxine endogène est le corps jaune, la présence de relaxine au niveau de l'épithélium glandulaire et des cellules stromales de l'endomètre a été démontrée ainsi que son rôle autocrine/paracrine sur la sécrétion de PRL par l'endomètre in vitro (Bryant-Greewood et al., 1993; Zhu, H.H. et al., 1990; Rosenberg, M. et
al., 1991).
Lorsque l'on considère l'expression d'EPIL 1 ou 3, nous avons démontré par immunohistochimie avec l'immun sérum antichaîne C un marquage des cellules stromales décidualisées, ainsi que de l'épithélium glandulaire endométrial de la caduque ou décidue pariétale et basale de grossesses du 1er trimestre. Il est intéressant de noter que de façon similaire aux facteurs de croissance de la famille de l'EGF, notamment le TGF-alpha, la localisation d'EPIL 1 ou 3 est retrouvée à la fois au niveau du trophoblaste et au niveau de la décidue (notamment au niveau des glandes endométriales et des cellules stromales). Ainsi, le polypeptide EPILdevrait être impliqué dans le processus d'implantation au moment de l'attachement, à l'instar de TGF-alpha. De plus, le polypeptide EPIL devrait également être impliqué dans la différenciation des cellules stromales internes qui constituent un des changements cellulaires de la décidualisation. En effet, à l'instar de la relaxine, le polypeptide EPIL devrait avoir un rôle stimulateur sur la synthèse de PRL par les cellules stromales et participer
ainsi au processus de décidualisation.
Par ailleurs, en raison d'un marquage des cellules trophoblastiques de phénotype non invasif (cytotrophoblaste intravilleux), il est raisonnable de penser que le polypeptide EPIL sécrété par les cellules stromales et par les cellules de l'épithélium glandulaire de l'endomètre devrait jouer un rôle dans le contrôle de l'invasion des
cytotrophoblastes extravilleux au même titre que le TGF- béta (Giudice, L., 1994).
3) Sarcome de Kaposi
L'objectif de la série d'expérience par immuno-
histochimie est d'étudier l'expression du polypeptide EPIL
1 ou EPIL 3 au niveau de biopsies de SK.
Les différentes immunohistochimies effectuées avec l'antisérum polyclonal antichaîne C dirigée contre l'EPIL 1 et/ou l'EPIL 3 (ac 7381 immunsérum dilué au 1:500) ont permis de détecter les polypeptides EPIL 1 et/ou EPIL 3 au, niveau d'environ 50 % des 28 cas de SK. L'immunomarquage est localisé au niveau des cellules tumorales fusiformes ou spindle cells ainsi qu'au niveau de vaisseaux intratumoraux et/ou vaisseaux de type "slit-like" (sans endothélium) et le plus souvent dans des lésions tardives de type nodulaire. L'intensité de l'immunomarquage est modéré (+ à ++) dans la majorité des cas, avec cependant sur 8 cas l'observation d'un immunomarquage intense (+++). Sur les 4 cas de SK associés au SIDA, seul un cas présente un marquage faible à modéré au niveau des cellules tumorales,
les autres étant tous négatifs.
L'expérience dont les résultats sont représentés sur le tableau 3 (cf. tableau 3 ci-après) a permis de confirmer un immunomarquage intense, noté(3) sur le tableau, au niveau
de 4 SK cutanés classiques de stade nodulaire.
L'immunomarquage est relativement hétérogène localisé au niveau du cytoplasme des cellules tumorales fusiformes (SC). En outre, tous les cas de SK montrent un immunomarquage par l'immun sérum 7381 de l'épithélium malpighien (peau) ainsi que des glandes sébacées. On peut sur 1 cas noter un effet de gradient de marquage avec une intensité de marquage de la peau plus importante dans la région susjacente à la tumeur. Le marquage cutané concerne plutôt les cellules basales de l'épithélium malpighien avec un marquage cytoplasmique et nucléaire. A relever que la peau normale(saine) n'a pas présenté d'immunomarquage par l'immun sérum 7381 lors d'expériences effectuées parallèlement. Les contrôles négatifs tant le sérum préimmun (7381
J0) que l'immun sérum 7381 préabsorbé par le peptide 59-
108Y ne montrent aucun marquage.
Les figures 10, 12, 14 et 16 (X 100, X 200, X 1000, X 400, respectivement) correspondent aux résultats obtenus pour un cas de Sarcome de Kaposi cutané de type classique après immunohistochimie (PA, Dako LSAB2) avec l'immun sérum
7381 antichaîne C (dilution 1:500).
On observe un marquage relativement homogène des cellules tumorales (SC) d'intensité marquée (++). En revanche, les cloisons fibreuses ne sont pas marquées
(figures 10 et 14).
Les figures 11, 13, 15 et 17 (X 100, X 200, X 1000 et X 1000, respectivement) correspondent au contrôle négatif
après inhibition de l'immun sérum 7381 par le peptide 59-
108 Y (18 heures d'incubation) en utilisant la même technique d'immunohistochimie. On observe une absence de
marquage complète.
Tableau 3
7381 Anti 7381 im. 7381. Anti actine
im. ser.
Marquage sér. JO ser. facteur alpha-
/Tissu 1/500 1/500 inhib VIII muscle 1/500 lisse Sarcome de Kaposi N01 S.C. ++ - - + +
E.M. ++ - - -
(noy>cyt) nb ++ Vx + - - qq ++ (média et (Endoth.) cloison fibreuse) Sarcome de Kaposi N 2 S.C. ++ - + qq ++ (<5 %)
E.M. ++ - - - -
(nooy>cyt) Vx - - qq ++ + (Endoth.) (média) Sarcome de Kaposi N 3 S.C. ++ - +
E.M. ++ - - -
(noy=cyt. Couche basale ++) Vx - ++ (média)(10%) Sarcome de Kaposi N 4 S.C. ++ - - - ++ (30 %)
E.M. ±+ - - --
(noy=cyt. Couche basale ++) Vx - - ++ (média) SC: Spindle cells (cellules tumorales); Vx : Vaisseaux; EM: Epithélium malpighien; Noy: Noyau; nb: nombreux; qq: quelques; Cyt: Cytoplasme Légende du tableau 3: Analyse immunohistochimique (Pa, Dako, LSAB2) avec l'immun sérum 7381 antichaîne C (dilution (1/500), l'anticorps polyclonal antifacteur VIII (Dako, Réf. A0082) et monoclonal anti-actine O muscle lisse (Dako, Réf. M1584) sur coupes (3 y) de biopsie cutanée de Sarcome
de Kaposi (type classique) au stade histologique nodulaire.
On observe que l'immun sérum 7381 marque les cellules tumorales "spindle cells" du SK de façon plus marquée et plus étendue que l'anticorps polyclonal antifacteur VIII et monoclonal anti-actine e muscle lisse. En outre, on note un marquage de l'épithélium malpighien de la peau par l'immun sérum 7381 tant nucléaire que cytoplasmique avec une prédominance au niveau de la couche basale. On note une absence de marquage au niveau des quatre cas de SK lorsque l'anticorps polyclonal 7381 pré immun et l'immun sérum 7381 inhibé par le peptide 59-108Y sont utilisés. L'intensité du marquage des cellules est représentée de la façon suivante: (-) absence de marquage; (+) marquage de faible
intensité; (++) marquage de forte intensité.
Mises en évidence par immunohistochimie sur des biopsies et par dosage sérique, les cellules de SK semblent sécréter des cytokines dont certaines sont des facteurs angiogéniques (VEGF, FGF-b, PDGF). Récemment, par IH et HIS, les kératinocytes épidermiques bordant une région ulcérée ou dans une région hyperplasique semblent être une des sources de VEGF. En outre, l'expression de l'ARNm des récepteurs KDR et flt-1, deux récepteurs tyrosine kinase de la cellule endothéliale, semble être augmentée dans les cellules de SK elles-mêmes, ce qui serait en faveur d'une double action paracrine (Kératinocytes et macrophages) et autocrine directe de VEGF sur la cellule de SK (Brown et al., 1996). Plus récemment, Masood et al. (1997) ont démontré que le VEGF est un facteur de croissance autocrine pour le SK associé au SIDA faisant de lui le facteur angiogénique probablement le plus important dans ce type de tumeur. Ces résultats montrent que l'expression du gène INSL4 appartenant à la famille de l'insuline, est localisée notamment au niveau du placenta, du cordon ombilical et au niveau de cellules tumorales telles que celles du sarcome de Kaposi. Des anticorps monoclonaux et polyclonaux ont été produits contre différents peptides synthétiques correspondant aux différentes chaînes A, C et B de
polypeptide putatif natif.
Les anticorps polyclonaux de lapin reconnaissant la chaîne C (7381 immun sérum) et la chaîne A et B (1661 immun sérum) ont permis de mettre en évidence le polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3, et EPIL 2 respectivement au niveau du placenta avec une expression du polypeptide EPIL 1 et/ou EPIL 3 au niveau des cellules cytotrophoblastiques. En outre, nous avions observé un surprenant marquage des cellules endothéliales embryonnaires intravillositaires par l'Ac polyclonal 7381. Récemment, Zhou et al. (1997) a montré combien la différenciation des cytotrophoblastes extravilleux en cellules à phénotype endothélial était importante dans la physiologie du développement placentaire. Notre observation, en revanche, objectivant l'immunomarquage du polypeptide EPIL 1 et /EPIL 3 au niveau cytotrophoblastique et des vaisseaux embryonnaires intra- villositaires nous permet d'en déduire que le polypeptide EPIL jouerait un rôle essentiel dans la vasculogénèse embryonnaire comme cela a été récemment démontré pour le VEGF, une cytokine angiogénique induisant la30 prolifération de cellules endothéliales et une augmentation de perméabilité vasculaire (Risau et al., 1997). En effet,
il est intéressant de noter que Clark et al. en 1996 a démontré par immunohistochimie la présence de la protéine VEGF ainsi que de son récepteur Flt-1 au niveau du35 cytotrophoblaste intravilleux et de l'endothélium des vaisseaux embryonnaires intravillositaires.
Ces homologies d'immunomarquage avec le VEGF et d'autres cytokines que nous avons mis en évidence par la présence du polypeptide EPIL au niveau d'une tumeur angioproliférative, le Sarcome de Kaposi, montrent également que le polypeptide EPIL serait impliqué en tant que facteur de croissance des cellules tumorales comme le
VEGF et d'autres cytokines dont leur rôle est bien connu.
En outre, il apparaît que l'IGF-I, un membre de la famille de l'insuline, induit l'expression de VEGF dans le cancer colorectal ainsi que sur un modèle in vitro
d'ostéoblastes (Goad et al., 1996).
Ainsi ces résultats montrent que le polypeptide EPIL est très certainement lié au processus de vasculogenèse
embryonnaire et d'angiogenèse tumorale.
Activité insulin-like du polypeptide EPIL (EPIL 1, 2 et/ou 3) Rappel du role physiologique de l'insuline Les hydrates de carbone (HC) ou glucides constituent la source principale d'énergie de l'organisme. Des systèmes régulateurs assurent un ajustement constant entre les besoins en HC et la formation de glucose. Les organes intervenant dans cette régulation sont le pancréas et le foie. Les cellules béta des îlots de Langerhans du pancréas sont le lieu de synthèse et de sécrétion de l'insuline, mais aussi du glucagon et de la somatostatine. Le foie a une fonction de stockage du glucose par glycogenèse (comme les adipocytes) et de synthèse du glucose par néoglucogenèse. Il a comme fonction vitale de mettre du glucose à disposition par glycogénolyse en cas de besoin (hypoglycémie). La proinsuline est formée de deux chaînes A et B avec une chaîne C appelée peptide de connexion. L'insuline est biologiquement active après avoir subi un clivage de son peptide C. Elle agit sur un récepteur transmembranaire de la famille des tyrosine kinase qui par l'intermédiaire d'une cascade de phosphorylation intervient sur la régulation des enzymes des différentes voies métaboliques
(glucide, lipide et protide).
L'insuline a pour principal rôle de permettre l'utilisation du glucose par la cellule ainsi que la synthèse des lipides et des protéines (anabolisme). * L'utilisation du glucose est facilitée, par exemple, dans le muscle/adipocyte par une action stimulatrice du
glucose et de l'insuline sur son transporteur (GLUT-4).
L'insuline stimule ou inhibe l'expression d'une série d'enzymes intervenant dans la voie métabolique du glucose d'Emden-Meyerhof comme la glucokinase (GK), PFK2 et LPK (action stimulante de l'insuline), PEPCK et F-1,6-P2ase (action inhibitrice de l'insuline). Par l'action de l'insuline, le glucose est alors métabolisé en pyruvate et l'actate, puis en C02, H20 et ATP après passage dans le cycle de Krebs ou cycle de l'acide citrique (au niveau des mitochodries par phosphorylation oxydative). Il faut
noter qu'une autre voie de dégradation du G6P (glucose 6-
phosphate) est possible, la voie des pentoses phosphate, également stimulée par l'insuline et responsable de la formation NADPH+, coenzyme essentiel à la biosynthèse des lipides. En outre, la voie des pentoses est la source de
ribose essentiel pour la synthèse d'acide nucléique.
* La synthèse des lipides est également facilitée par l'insuline et se fait à partir de l'acétyl(CoA). I1 y a aussi stimulation de la synthèse des protéines par l'insuline. Physiopathologie du diabète Il existe deux types de diabète: le type I ou diabète juvénile. Il s'agit d'une maladie auto-immune caractérisée par une destruction des îlots de Langerhans, donc pas une carence en insuline; le type II ou diabète de l'adulte est en revanche caractérisé par une résistance à l'insuline. Le diabète gestationnel: son diagnostic se fait pendant la grossesse (hyperglycémie à jeûn) et généralement disparaît après l'accouchement. Durant le second trimestre, le taux d'insuline augmente considérablement en partie par l'augmentation d'activité hormonale anti-insuline. En effet, le placenta produit des hormones diabétogéniques comme l'hormone placentaire lactogène humaine (hPL), les oestrogènes et la progestérone. En outre, la prolactine pituitaire ainsi que le cortisol sont des antagonistes de l'insuline. Les mécanismes physiopathologiques sont probablement multiples. On a mis en évidence, par exemple, une augmentation de la dégradation de l'insuline pendant la grossesse. Cette dégradation esst causée par des enzymes placentaires comparables aux insulinases hépathiques (Freinkel, N. et al., 1991). Par un phénomène combinant d'une part la résistance à l'insuline d'origine hormonale (hPL, PRL) et l'augmentation de la dégradation de l'insuline, le taux d'insuline à disposition diminue et un mécanisme d'hypersécrétion pancréatique régulateur est alors mis en route. Si le pancréas présente un dysfonctionnement, il ne pourra répondre à ce nouvel état physiologique de la grossesse et une intolérance au glucose voire un diabète gestationnel peut en résulter (Becker,
K.L. et al., 1990).
Les complications du diabète
La complication majeure est d'ordre cardiovasculaire.
Les mécanismes sous-jacents à cette complication diabétique
sont ceux de l'athérosclérose et constitue la macro-
angiopathie diabétique. Brièvement, dans le diabète, la cellule endothéliale des vaisseaux subit différentes agressions physiques et chimiques comme l'hypertension artérielle, l'hyperglycémie, et l'hypercholestérolémie. Ces lésions répétées de l'endothélium vasculaire mènent par l'intermédiaire des macrophages, des plaquettes et des facteurs de croissance à l'accumulation progressive de cellules musculaires lisses, de matrice extracellulaire et de lipides au niveau de l'intima et de la média. Ce sont ces lésions qui contribuent au rétrécissement de la lumière vasculaire. Fonctions insulin-like du polypeptide EPIL * EPIL est une protéine de type ORP (oxygen-related
protein) ou GRP (glucose-related protein) comme le VEGF.
A partir du troisième trimestre, le placenta devient l'organe par lequel les échanges foeto-maternels se font notamment par l'intermédiaire d'un réseau vasculaire embryonnaire considérablement développé. Il est intéressant de rappeler que récemment certains travaux ont démontré le rôle du VEGF dans la vasculogenèse embryonnaire avec une expression augmentée dès la 3ème semaine de gestation dans l'endoderme, responsable de la différenciation du
mésenchyme sus-jacent en hémangioblastes (Risau, W., 1997).
En outre, il a été démontré que le VEGF est une protéine régulée par l'oxygène (ORP) et le glucose (GRP). En effet, Stein et al. en 1995 démontre que l'hypoxie et l'hypoglycémie semblent augmenter l'expression du VEGF notamment par un mécanisme de stabilisation de son ARN messager (Stein, I. et al., 1995). De façon similaire, le transporteur du glucose GLUT-1 est stimulé par hypoglycémie et permet à la cellule dans un environnement hostile d'utiliser le maximum de glucose comme source d'énergie
(Stein, I. et al., 1995).
Le polypeptide EPIL devrait être impliqué dans ces processus de réponse à un stress soit hypoxique soit hypoglycémique par un effet insulin- like. En effet, en addition de l'homologie de structure du polypeptide EPIL et de l'insuline comme décrit précédemment, nous avons clairement démontré par immunohistochimie une localisation cellulaire similaire entre EPIL et VEGF avec un marquage du cytotrophoblaste, des cellules musculaires lisses des vaisseaux embryonnaires ainsi que des vestiges embryonnaires au niveau du cordon ombilical. La coexpression du polypeptide EPIL et VEGF au niveau de cellules et tissus identiques permet d'établir plusieurs35 mécanismes possibles. Comme nous l'avons dit plus haut, l'insuline permet une utilisation du glucose intracellulaire et permet par conséquent à la cellule de
produire de l'ATP, du ribose (voie des pentoses).
L'insuline est une hormone anabolique permettant de plus la biosynthèse des lipides et protéines. Tant au niveau placentaire qu'au niveau d'un tissu néoplasique, le taux de division cellulaire est important et le besoin énergétique plus important. Si le processus de néovascularisation est important pour la survie d'un tissu en situation de stress (VEGF), il est vraisemblable que le polypeptide EPIL par un effet insulin-like para/autocrine intervienne dans ce processus en favorisant l'utilisation du glucose comme
source d'énergie.
* Effet insulin-like d'EPIL et le placenta.
Le placenta est jusqu'à la fin du premier trimestre dans un environnement d'hypoxie relative. De même, on peut penser qu'en terme de nutriments notamment de glucose il se
trouve très certainement dans un état hypoglycémique.
Pourtant, il s'agit d'un tissu hautement mitogénique de
type pseudotumoral, donc en besoin énergétique augmenté.
Aussi, le fait de produire une molécule à effet insulin-
like avec amélioration de l'utilisation du glucose permettrait au placenta de poursuivre son développement et sa croissance. En outre, il faut rappeler que le placenta est à l'origine de la dégradation de l'insuline et qu'il est à l'origine de protéines diabétogènes comme l'hPL, les oestrogènes et la progestérone. Le polypeptide EPIL devrait
ainsi jouer le rôle de l'insuline par un effet insulin-like auto/paracrine.
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Claims (104)
1. Polypeptide EPIL 1 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain, et en ce qu'il est constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de
la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
2. Polypeptide EPIL 2 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué: a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1; b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses; ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
3. Polypeptide EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules humaines ou animales, notamment dans les cellules trophoblastes de placenta humain et en ce qu'il est constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les
positions 59 et 114, extrémités incluses.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3,
caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement
dans les cytotrophoblastes de placenta humain.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3,
caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules
endothéliales.
6. Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules endothéliales sont des cellules
endothéliales vasculaires.
7. Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules endothéliales vasculaires sont des
cellules endothéliales vasculaires foetales.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 1, et 3 à
7, caractérisé en ce qu'il est sécrété dans le liquide
amniotique et/ou dans la circulation foetale.
9. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3,
caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules
musculaires lisses.
10. Polypeptide selon la revendication 9, caractérisé en ce que les cellules musculaires lisses sont des cellules musculaires lisses vasculaires constituant la
paroi de vaisseau.
11. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules musculaires lisses vasculaires sont des cellules constituant la paroi de vaisseau
embryonnaire ou de cordon ombilical.
12. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3,
caractérisé en ce qu'il est exprimé dans les cellules stromales.
13. Polypeptide selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules stromales sont des cellules de l'amnion et/ou de vestige embryonnaire, de préférence le sac vitellin et l'allantoïde situés au niveau du
cordon ombilical.
14. Polypeptide selon l'une des revendications 1 et 3,
caractérisé en ce qu'il est présent dans les cellules tumorales.
15. Polypeptide selon la revendication 14, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules
tumorales de tumeur angioproliférative.
16. Polypeptide selon l'une des revendications 14 et 15,
caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des
cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
17. Polypeptide selon l'une des revendications 14 à 16,
caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des
cellules de vaisseau intra-tumoral.
18. Polypeptide selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules tumorales sont des cellules
épithéliales de Malpighi.
19. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est exprimé préférentiellement dans les
syncytiotrophoblastes de placenta humain.
20. Polypeptide selon l'une des revendications 2 et 19,
caractérisé en ce qu'il est sécrété dans la
circulation maternelle.
21. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de différentiation de cellules humaines et/ou animales.
22. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus
de prolifération de cellules humaines et/ou animales.
23. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus
de régénération de cellules humaines et/ou animales.
24. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23,
caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou
animales sont des cellules endothéliales.
25. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23,
caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules musculaires lisses,
notamment vasculaires.
26. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23,
caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou
animales sont des cellules épithéliales.
27. Polypeptide selon l'une des revendications 21 à 23,
caractérisé en ce que les cellules humaines et/ou animales sont des cellules stromales, notamment de la
décidue, ou de l'épithélium glandulaire.
28. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus
de vascularisation des cellules embryonnaires.
29. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus
de vascularisation des tumeurs.
30. Polypeptide selon la revendication 29, caractérisé en
ce que les tumeurs sont des tumeurs angio-
prolifératives.
31. Polypeptide selon l'une des revendication 29 et 30, caractérisé en ce que les tumeurs sont des tumeurs
associées au Sarcome de Kaposi.
32. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus
de décidualisation et/ou d'implantation de l'embryon.
33. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 20,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans un processus de type insulinlike, notamment paracrine et/ou autocrine.
34. Polypeptide selon la revendication 33, caractérisé en ce que le processus de type insulin-like est un processus de réponse à un stress hypoxique et/ou à un
stress hypoglycémique.
35. Polypeptide selon l'une des revendications 33 et 34,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans un processus favorisant l'utilisation du glucose comme source d'énergie.
36. Fragment de polypeptide selon l'une des revendications
1 à 35, caractérisé en ce qu'il est biologiquement actif.
37. Séquence d'acide nucléique caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide ou un de ses fragments selon
l'une des revendications 1 à 36, sa séquence
complémentaire ou la séquence de son ARN correspondant.
38. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une
séquence d'acide nucléique selon la revendication 37.
39. Vecteur selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule
hôte.
40. Cellule hôte transformée par un vecteur selon l'une
des revendications 38 et 39.
41. Méthode de production d'un polypeptide recombinant caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une cellule
selon la revendication 40.
42. Méthode de production d'un polypeptide recombinant selon la revendication 41, caractérisée en ce que l'on cultive les cellules transformées selon la revendication 40 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant, et que l'on
récupère ledit polypeptide recombinant.
43. Polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par
une méthode selon l'une des revendications 41 et 42.
44. Polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des
revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il est
obtenu par synthèse chimique.
45. Anticorps monoclonal et polyclonal ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide
ou un de ses fragments selon l'une des revendications
1 à 36, 43 et 44.
46. Anticorps selon la revendication 45, caractérisé en ce
qu'il est immunoconjugué ou marqué.
47. Sonde ou amorce oligonucléotidique, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 ou un de ses fragments, ou d'une séquence d'acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement à une séquence d'acide
nucléique selon la revendication 37.
48. Sonde oligonucléotidique selon la revendication 47,
caractérisée en ce qu'elle est marquée.
49. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps selon l'une
des revendications 45 et 46, pour la détection,
l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide ou d'un de ses fragments selon l'une des
revendications 1 à 36, 43 et 44, ou pour le diagnostic
de pathologies liées à l'expression anormale de
polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36.
50. Utilisation d'une sonde ou amorce selon l'une des
revendications 47 et 48, pour la détection,
l'identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide
nucléique selon la revendication 37.
51. Procédé pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des
revendications 1 à 36, 43 et 44, dans un échantillon
biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des
revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il
comprend les étapes suivantes: a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un
ou plusieurs anticorps selon l'une des revendications
et 46; b) mise en évidence, identification, localisationet/ou
dosage du complexe antigène-anticorps formé.
52. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des
revendications 1 à 36, 43 et 44, dans un échantillon
biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de polypeptide selon l'une des
revendications 1 à 36, caractérisé en ce qu'il
comprend les éléments suivants: a) un ou plusieurs anticorps selon l'une des
revendications 45 et 46;
b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène- anticorps produits par la réaction immunologique.
53. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique; b) amplification spécifique des séquences d'acide nucléique selon la revendication 37 à l'aide d'amorces selon la revendication 47; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
54. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique
selon l'une des revendications 47 et 48 avec un
échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN contenu dans l'échantillon biologique; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.
55. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon la revendication 47 immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, 1'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'amorces selon la revendication 47 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN dudit échantillon biologique; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, selon
l'une des revendications 47 et 48.
56. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique selon l'une des
revendications 47 et 48;
b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à
une réaction d'amplification de l'ADN.
57. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification.
et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37 dans un échantillon biologique, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 47 pouvant être fournie préimmobilisée sur un support; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, selon l'une des
revendications 47 et 48;
c) le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 47 ainsi que les réactifs nécessaires à
une réaction d'amplification de l'ADN.
58. Procédé ou kit selon l'une des revendications 51 à 57,
pour le diagnostic de pathologies liées à la présence
de cellules tumorales, notamment angioprolifératives.
59. Procédé ou kit selon la revendication 58, pour le
diagnostic du Sarcome de Kaposi.
60. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un ou plusieurs anticorps selon
l'une des revendications 45 et 46.
61. Méthode de marquage de cellule, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre une amorce et/ou une sonde,
notamment marquée, selon l'une des revendications 47
et 48.
62. Méthode de marquage selon l'une des revendications 60
et 61, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un
procédé selon l'une des revendications 51 et 54.
63. Méthode de marquage de cellule selon l'une des
revendications 60 à 62, caractérisée en ce que la
cellule est une cellule endothéliale.
64. Méthode de marquage de cellule selon la revendication 63, caractérisée en ce que la cellule endothéliale est
une cellule vasculaire.
65. Méthode de marquage de cellule selon l'une des
revendications 60 à 62, caractérisée en ce que la
cellule est une cellule musculaire lisse.
66. Méthode de marquage de cellule selon l'une des
revendications 60 à 62, caractérisée en ce que la
cellule est une cellule stromale, notamment de la
décidue, ou de l'épithélium glandulaire.
67. Méthode de marquage de cellule selon l'une des
revendications 60 à 62, caractérisée en ce que la
cellule est une cellule tumorale, notamment angio-
proliférative.
68. Méthode de marquage de cellule selon la revendication 67, caractérisée en ce que la cellule est une cellule
tumorale du Sarcome de Kaposi.
69. Méthode d'obtention d'une cellule contenant un
polypeptide selon l'une des revendications 1 à 36, 43
et 44 et/ou une séquence d'acide nucléique selon la revendication 37, caractérisée en ce qu'elle met en
oeuvre une méthode selon l'une des revendications 60 à
68, et en ce qu'on isole ladite cellule marquee.
70. Cellule en ce qu'elle est susceptible d'être sélectionnée par une méthode selon la revendication 69.
71. Procédé de détection de cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode
selon l'une des revendications 60 à 68.
72. Procédé selon la revendication 71, pour la détection
de cellules tumorales associées au Sarcome de Kaposi.
73. Méthode de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler l'activité d'un
polypeptide selon l'une des revendications 1 à 35,
caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une des
revendications 1 à 36, 43 et 44, une séquence d'acide
nucléique selon la revendication 47 ou une cellule
selon l'une des revendications 40 et 70.
74. Méthode de sélection selon la revendication 73, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
75. Méthode de sélection selon la revendication 74, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
76. Méthode de sélection selon la revendication 74, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber la différentiation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales.
77. Méthode de sélection selon l'une des revendications 74
à 76, caractérisée en ce que lesdites cellules sont
des cellules endothéliales.
78. Méthode de sélection selon la revendication 77, caractérisée en ce que les cellules endothéliales sont
des cellules vasculaires.
79. Méthode de sélection selon l'une des revendications 74
à 76, caractérisée en ce que lesdites cellules sont
des cellules musculaires lisses.
80. Méthode de sélection selon la revendication 79, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des
cellules musculaires lisses vasculaires.
81. Méthode de sélection selon l'une des revendications 74
à 76, caractérisée en ce que lesdites cellules sont
des cellules épithéliales.
82. Méthode de sélection selon l'une des revendications 74
à 76, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules stromales, notamment de la décidue, ou de
l'épithélium glandulaire.
83. Méthode de sélection selon la revendication 73, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler le processus de décidualisation
et/ou d'implantation de l'embryon.
84. Méthode de sélection selon la revendication 83, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser le processus de décidualisation
et/ou d'implantation de l'embryon.
85. Méthode de sélection selon la revendication 83, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber le processus de décidualisation
et/ou d'implantation de l'embryon.
86. Méthode de sélection selon la revendication 73, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est
capable de moduler l'activité insulin-like.
87. Méthode de sélection selon la revendication 86, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de moduler la réponse de la cellule à un
stress hypoxique et/ou hypoglycémique.
88. Méthode de sélection selon la revendication 87, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser l'utilisation du glucose comme
source d'énergie.
89. Composé chimique ou biochimique, en ce qu'il est susceptible d'être sélectionné par une méthode selon
l'une des revendications 73 à 88.
90. Composé selon la revendication 89, à titre de
médicament.
91. Composé selon l'une des revendications 89 et 90,
caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: a) un polypeptide ou un de ses fragments selon l'une
des revendications 1 à 36, 43 et 44;
b) un anticorps selon la revendication 45; c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide ou un de ses
fragments selon l'une des revendications 1 à 36;
d) un vecteur selon l'une des revendications 38 et
39;
e) un vecteur selon l'une des revendications 38 et 39
présentant à sa surface un marqueur spécifique de la cellule cible dont on cherche à moduler l'activité
d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à
36;
f) une sonde selon la revendication 47.
92. Composé selon l'une des revendications 90 et 91,
destiné au traitement des tumeurs.
93. Composé selon la revendication 92, destiné au
traitement des tumeurs angioprolifératives.
94. Composé selon la revendication 93, destiné au
*traitement du Sarcome de Kaposi.
95. Composé selon l'une des revendications 92 et 93,
caractérisé en ce que la tumeur est une tumeur du pancréas, du foie, de l'utérus, du sein, un angiosarcome, un glioblastome, un neuroblastome, un
rhabdomyosarcome, ou un léiomyosarcome.
96. Composé selon la revendication 95, caractérisé en ce
que la tumeur est un léiomyosarcome.
97. Composé selon selon l'une des revendications 90 et 91,
destiné à favoriser la vascularisation de tissus spécifiques.
98. Composé selon l'une des revendications 90 et 91,
destiné au traitement de la rétinopathie, de la dégénération de la macula, du psoriasis, de l'endométriose, de l'arthrite rhumatoide, de
l'athérosclérose ou de l'hyperthyroïdie.
99. Composé selon la revendication 98, destiné au traitement de l'athérosclérose, notamment des lésions
dues à la resténose après angioplastie.
100. Composé selon l'une des revendications 90 et 91,
destiné à régénérer et/ou à différencier un tissu, notamment endothélial, musculaire lisse ou épithéliale, suite à une maladie dégénératrice ou à une maladie des glandes endocrines, notamment la thyroide ou le pancréas, ou suite à un dommage dudit
tissu provoqué par un traumatisme.
101. Composé selon l'une des revendications 90 et 91,
destiné à favoriser ou à inhiber l'implantation
embryonnaire.
102. Composé selon l'une des revendications 90 et 91,
destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à une activité de
type insulin-like.
103. Composé selon l'une des revendication 102 destiné à prévenir et/ou traiter les pathologies directement ou indirectement liées à un dysfonctionnement du métabolisme des hydrates de carbone, notamment à une
hypoglycémie ou à une hyperglycémie.
104. Composé selon l'une des revendication 102 et 103, caractérisé en ce que la pathologie est choisi parmi le diabète, notamment le diabète gestationnel, et les complications liées au diabète, notamment les
complications d'ordre cardiovasculaires.
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