PL204503B1 - Przeciwciało lub jego fragment, kompozycja je zawierająca i zastosowanie oraz polipeptyd i białko, cDNA, plazmid lub wektor wirusowy wraz z komórką gospodarza oraz sposób wykrywania naturalnych autoprzeciwciał - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotami wynalazku są przeciwciało lub jego fragment, kompozycja je zawierająca i zastosowanie oraz polipeptyd i białko, cDNA, plazmid lub wektor wirusowy wraz z komórką gospodarza oraz sposób wykrywania naturalnych autoprzeciwciał.

Wynalazek opisuje powstawanie unikalnych autoprzeciwciał, które są przyczyną wielu chorób autoimmunologicznych oraz innych chorób. Zapewnia też zastosowania diagnostyczne i profilaktyczne dla takich przeciwciał w postaci monoklonalnej i poliklonalnej, jak również dla cząsteczek rozpoznawanych przez przeciwciała.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy zastosowania tych przeciwciał i cząsteczek, które je rozpoznają, jako specyficznych inhibitorów powstawania autoprzeciwciał o tej samej specyficzności u dzieci i dorosłych. Te przeciwciała i cząsteczki docelowe zastrzega się do stosowania diagnostycznego, profilaktycznego i leczniczego w szeregu różnorodnych chorób autoimmunologicznych i w innych chorobach. Cukrzyca służy do zilustrowania lub jako przykład a nie w celu ograniczania wynalazku.

Zakres chorób autoimmunologicznych człowieka

Choroby związane ze zjawiskami autoimmunizacji można sklasyfikować jako stany obejmujące szeroko rozprzestrzenione destrukcyjne uszkodzenia pojedynczych narządów do uszkodzeń narządu lub tkanki.

W narzą dowo swoistych chorobach, najczęściej atakowanymi narzą dami są tarczyca, nadnercza, żołądek i wysepki Langerhansa (które zawierają komórki wytwarzające insulinę) w trzustce, podczas gdy jako choroby nieswoiste narządowo dominują zaburzenia reumatologiczne lub ogólnoustrojowe (np. uogólniony liszaj rumieniowaty). W rzadkich przypadkach choroby autoimmunologiczne są związane z infekcjami wirusowymi o gwałtownym przebiegu, których wynikiem także może być zniszczenie narządu. W zjawiskach autoimmunizacji, proces niszczenia jest powolny i niekiedy mijają lata zanim ujawni się choroba. W następstwie choroby pojawiają się specyficzne dla narządów choroby autoimmunologiczne, które są wynikiem zjawisk autoimmunizacji pociągających za sobą załamanie tolerancji immunologicznej wobec własnych antygenów.

Tarczyca. Choroba autoimmunologiczna tarczycy obejmuje szereg stanów klinicznych, których wynikiem jest wspólny obraz histopatologiczny. Występuje rozprzestrzeniająca się infiltracja gruczołu przez komórki limfocytów monojądrzastych. Na chorobę autoimmunologiczna składają się takie choroby jak: pierwotny obrzęk śluzowaty, zapalenie tarczycy Hashimoto i choroba Gravesa. Nierzadkie jest przechodzenie jednej z nich w inną. Pierwotny obrzęk śluzowaty jest najczęściej występującą postacią samorzutnej niedoczynności tarczycy i jest ostatnim etapem chronicznego procesu zapalnego. Wole nie powstaje a gruczoł ulega prawie całkowitej atrofii.

Zapalenie tarczycy Hashimoto także wiąże się z niedoczynnością tarczycy, ale występuje wytwarzanie wola. W jego różnych postaciach klinicznych poziomy hormonu tarczycy mogą albo być kompensowane przez zwiększone poziomy wytwarzanego przez przysadkę hormonu tyreotropowego (TSH), albo może wystąpić kliniczna niedoczynność tarczycy pomimo podwyższonych poziomów TSH. Oba te stany destrukcji autoimmunologicznej występują pięć razy częściej u kobiet niż u mężczyzn.

Najbardziej powszechną postacią nadczynności tarczycy jest choroba Gravesa, z wolem lub bez wola lub z wytrzeszczem. Charakteryzuje się ona okresami remisji i zaostrzenia. Pomimo tego, proces autoimmunologiczny prowadzi do nadmiernej stymulacji gruczołu w wyniku wytwarzania przeciwciał stymulujących tarczycę, często występuje ostateczne zniszczenie tarczycy. Zapadalność na tę chorobę jest wyższa u kobiet niż u mężczyzn i pozostaje w stosunku 5:1. We wszystkich autoimmunologicznych chorobach tarczycy, wy kazanie obecności różnych autoprzeciwciał skierowanych przeciw gruczołowi potwierdza diagnozę kliniczną. Autoprzeciwciała mogą być skierowane przeciw cytoplazmatycznym antygenom tarczycy, takim jak tyroglobulina, składnikom powierzchni komórek, takim jak peroksydaza tarczycy oraz receptorom TSH ulegającym ekspresji na powierzchni komórek tarczycy (np. choroba Gravesa).

Żołądek. Autoimmunologiczne choroby żołądka dotyczą albo dna albo jamy odźwiernikowej, prowadząc do różnych stopni zapalenia atakującego te dwa regiony gruczołu. Generalnie, proces ten nosi nazwę zapalenia żołądka. W zapaleniu dna żołądka występuje znaczna atrofia śluzówki, w konsekwencji, z utratą zdolności wytwarzania czynnika wewnętrznego (IF), prowadzącą do złego wchłaniania witaminy B12 i następnie rozwoju niedokrwistości złośliwej. W stanach tych są wytwarzane i występują u 90% pacjentów dotkniętych tą chorobą przeciwciała skierowane przeciw IF oraz komórkom okładzinowym. Komórki okładzinowe ulegają zniszczeniu ale niszczone są również komórki

PL 204 503 B1 główne i komórki śluzowe, pomimo braku w układzie krążenia przeciwciał skierowanych przeciw tym dwóm ostatnim rodzajom komórek. Zapadalność na tę chorobę jest wyższa u kobiet niż u mężczyzn i pozostaje w stosunku 3:1. U niektórych pacjentów z zapaleniem jamy odźwiernikowej żołądka wykazano obecność autoprzeciwciał skierowanych przeciw komórkom wytwarzającym gastrynę. Ten rodzaj zapalenia żołądka jest związany z owrzodzeniem żołądka a u części pacjentów wykazano także obecność przeciwciał stymulujących komórki żołądka.

Nadnercza, gruczoły płciowe i łożysko. Autoimmunologiczna choroba nadnerczy (choroba Addisona) charakteryzuje się silną infiltracją gruczołu komórkami monojądrzastymi, zapaleniem nadnerczy i obecnością autoprzeciwciał skierowanych przeciw antygenom nadnerczy. Objawami są przebarwienia, osłabienie, zmęczenie, obniżone ciśnienie krwi, objawy ze strony układu pokarmowego oraz hipoglikemia w wyniku niedomogi kory nadnerczy. Również w tym przypadku choroba występuje głównie u kobiet.

W badaniach immunofluorescencyjnych autoprzeciwciała wybarwiają trzy warstwy kory nadnerczy ale ich część może także reagować krzyżowo z analogicznymi komórkami wytwarzającymi steroidy w jajnikach, jądrach i łożysku. Jeśli występują te zjawiska to są one skorelowane z przedklinicznymi lub klinicznymi jawnymi niedomogami gruczołów płciowych.

Przysadka mózgowa. Limfocytarne zapalenie przysadki mózgowej jest rzadkim stanem autoimmunologicznym, którego wynikiem jest niedoczynność przysadki wymagająca hormonalnej terapii substytucyjnej. Istnieje przewaga występowania tej choroby u kobiet, a choroba występuje z szeregiem innych narządowo swoistych zjawisk autoimmunologicznych lub związanych zaburzeń. W większości przypadków wykryć można autoprzeciwciała skierowane przeciw komórkom wydzielającym prolaktynę, jak również inne narządowo swoiste przeciwciała.

Choroba autoimmunologiczna wielu narządów wydzielania wewnętrznego. U pacjentów z narządowo swoistą chorobą autoimmunologiczna mogą występować objawy związane z nie domogą gruczołów wydzielania wewnętrznego lub innych narządów docelowych (np. żołądka). Jednakże, również u pacjentów cierpiących na tylko jedną narządowo swoistą chorobę objawy zaatakowania wielu narządów nie są rzadkie i wykrywalne są autoprzeciwciała skierowane przeciw nie zaatakowanym narządom. Choroby autoimmunologiczne tarczycy i żołądka widoczne są często u tego samego osobnika. Niedokrwistość złośliwa, będąca wynikiem zapalenia dna żołądka, jest pięciokrotnie częstsza u pacjentów z zaburzeniami tarczycy, a 30-50% pacjentów z niedokrwistością złośliwą przechodziło także choroby tarczycy.

Istnieją również powiązania pomiędzy zapaleniem nadnerczy i zapaleniem tarczycy oraz zapaleniem nadnerczy i cukrzycą insulinozależną (IDDM). Często choroby te rozpoczynają się jednocześnie z nadczynnością tarczycy i chorobą Addisona, a wielu pacjentów z chorobą Addisona cierpi na co najmniej jedną inną chorobę autoimmunologiczną. Chociaż zapalenie przysadki mózgowej i bielactwo nabyte (stan, który prowadzi do plamistych odbarwień skóry, najprawdopodobniej z powodu autoimmunologicznego niszczenia istniejących melanocytów) są chorobami rzadkimi, często współwystępują one z innymi jawnymi, narządowo swoistymi stanami. Cechy serologiczne (tj. obecność autoprzeciwciał w układzie krążenia), które wskazują na zaburzenia autoimmunologiczne, są dużo bardziej powszechne, niż współwystępowanie jawnej choroby. Na przykład, przeciwciała skierowane przeciw komórkom okładzinowym obecne są u 50% pacjentów z zaburzeniami tarczycy i 30% pacjentów z IDDM.

Obecny stan wiedzy dotyczący patologii IDDM

Obecny stan wiedzy dotyczący etiologii IDDM (cukrzycy typu I) skupia się na autoimmunologicznym niszczeniu komórek wysepek P w środowisku różnorodnych, obecnych w układzie krążenia, autoprzeciwciał, autoreaktywnych komórek T w krążeniu i w wysepkach trzustkowych (zapalenie wysepek trzustkowych) oraz różnych cytokin. Nie wykazano zatem dotąd patogennej roli autoprzeciwciał, ale wykazano, że ich obecność ma wartość diagnostyczną dla identyfikacji przedklinicznej cukrzycy, szczególnie u krewnych pierwszego stopnia pacjentów z IDDM. W konsekwencji, atak immunologiczny, którego wynikiem jest IDDM, uważa się za zależne od komórek T niszczenie komórek P (Tisch i McDevitt, 1996). Dowodami, które potwierdzają ten poglą d są obecność infiltratów komórek monoją drzastych (zapalenie wysepek trzustkowych) w wysepkach w momencie wystąpienia choroby (Gepts, 1965; Roep i DeVries, 1992), opóźniający wystąpienie choroby wpływ leków immunosupresyjnych (Bougneres i in., 1988), destrukcja przeszczepów trzustki u pacjentów z IDDM, której towarzyszy zapalenie wysepek trzustkowych (Sibley i in., 1985) oraz badania na zwierzętach, wykazujące, że śledzionowe komórki T są zdolne do przekazywania cukrzycy oraz, że wymagane są zarówno komórki

PL 204 503 B1

CD4, jak i CD8 (Bendelac i in., 1987). Wykazano również, że diabetogenne są sklonowane linie komórek T CD4, wykazujące specyficzność wobec antygenów komórek wysepek (Haskins i McDuffie, 1992). Jednakże, brak dotąd dowodów, że komórki T powodują początkowe uszkodzenie komórek wysepek β, bądź jakiegokolwiek wskazania, jakie mogłyby być antygeny docelowe.

Ostatnio wykazano, że autoreaktywność komórek T obecnych w układzie krążenia wobec antygenów komórek wysepek nie jest ograniczona do pacjentów z IDDM ale występuje również u zdrowych, dobranych wiekowo pacjentów kontrolnych chociaż w mniejszym stopniu. Dlatego też jest bardzo prawdopodobne, że zjawiska autoimmunizacji komórek T są konsekwencją dysfunkcji komórek β prowadzącej do uszkodzenia komórek β. Badania sprawdzające profile cytokin i wahania poziomów Th1 i Th2 podczas postępu choroby u myszy NOD wykazały, że przy wystąpieniu IDDM dominują komórki Th1 i cytokiny typu Th1. Szczegółowe badania mają na celu sprawdzenie rzeczywistej korelacji pomiędzy zmianą poziomu cytokin i IDDM przeprowadzili Shimada i in. (1996). Rozdzielono limfocyty śledziony otrzymane z NOD i NOD-IA^K oraz kontrolnych myszy BALB/c w różnych czasach podczas procesu chorobowego w celu otrzymania komórek T CD4 (pamięci) wykazujących małą ekspresję CD45RB; aktywowano je przeciwciałami skierowanymi przeciw CD3 i oznaczano uwalniane cytokiny. U myszy NOD stwierdzono wysoki stosunek IFNy/IL4 przy, lub bezpośrednio przed wystąpieniem hiperglikemii. Autorzy zaproponowali, że IDDM u myszy NOD rozwija się jako zapalna dysfunkcja komórek β, bez istotnego niszczenia komórek β aż do późniejszego etapu procesu chorobowego.

Dysfunkcję komórek β, na którą wskazują podwyższone poziomy proinsuliny w surowicy w stosunku do insuliny lub peptydu C, zauważono przy klinicznym ujawnieniu się młodzieńczej IMDD (Ludvigsson i Heding, 1982). Roder i in. (1994) badali 23 osoby dodatnie pod względem autoprzeciwciał, będące rodzeństwem pacjentów z IDDM, które podzielono na 2 grupy na podstawie ich odpowiedzi insuliny pierwszej fazy (FPIR) na podawaną dożylnie glukozę. Wśród badanego rodzeństwa u jedenastu osób stwierdzono obniżenie FPIR a występujący u nich na czczo stosunek proinsulina/insulina lub peptyd C był 2-3-krotnie wyższy niż u reszty rodzeństwa, które posiadało normalne FPIR. Dziewięcioro z 11 osób badanego rodzeństwa z niskimi FPIR i wysokimi stosunkami proinsulina/insulina zachorowało na cukrzycę w ciągu 1-28 miesięcy po badaniu, w porównaniu z brakiem zachorowań w grupie reszty rodzeństwa.

Dysfunkcja i ewentualne zniszczenie komórek β są charakterystyczne dla IDDM, jednakże, u osób chorych na cukrzycę typu I, zarówno tych którzy niedawno zachorowali, jak i tych u których trwa już ona długo, stwierdzono również wadliwe odpowiedzi wydzielania glukagonu i epinefryny oraz wątrobowe wytwarzanie glukozy podczas hipoglikemii (Kleinbaum i in., 1983). Dokładnie kontrolowane badania z zastosowaniem techniki obciążenia insuliną do stanu hipoglikemii wykazały, że poziomy glukagonu wzrastają podczas trwającej 180 minut infuzji insuliny u osób zdrowych ale nie u osób chorych na cukrzycę (Barrou i in., 1994). U tej ostatniej grupy występuje także poważne osłabienie wątrobowego wytwarzania glukozy. Ten defekt kontrregulacji hipoglikemii jest oporny na leczenie u wielu osób chorych na cukrzycę typu 1.

Chociaż jest jasne, że wydzielanie glukagonu jest osłabione u osób długo chorujących na cukrzycę, niewiele wiadomo o wydzielaniu glukagonu u osobników w stanie przedcukrzycowym. Nieprawidłowości pod względem wydzielania glukagonu wykazano na zwierzęcych modelach cukrzycy. Badania myszy NOD w stanie przedcukrzycowym i z jawną cukrzycą ujawniły, że u zwierząt w stanie przedcukrzycowym, na czczo, poziomy glukozy i insuliny we krwi były normalne, poziomy glukagonu w osoczu były znacznie podwyższone w porównaniu z myszami kontrolnymi (Ohneda i in., 1994). Dlatego też, leżące u podstaw zaburzenie metaboliczne występuje przed pojawieniem się cukrzycy.

Glukagon wydzielany z trzustkowych komórek α jest ważnym czynnikiem w utrzymywaniu normalnej kontroli prawidłowego stężenia cukru we krwi poprzez stymulację wątrobowego wytwarzania glukozy, a także wzmacnianie indukowanego glukozą wydzielania insuliny. Wykazano to poprzez obniżanie wydzielania insuliny po neutralizacji immunologicznej glukagonu u głodzonych szczurów, któremu nie towarzyszyło obniżanie poziomu glukozy we krwi (Brand i in., 1995).

Uwalnianie insuliny z rozdzielonych przez FACS pojedynczych komórek β jest słabe w odpowiedzi na prowokację składnikiem odżywczym. Ten defekt wydzielania można w pełni naprawić przez ponowne połączenie komórek β z oddzielonymi komórkami α, bądź przez dodanie (Bu)2 cAMP lub glukagonu (Pipeleers i in., 1985). Glukagon jest głównym czynnikiem podwyższającym poziomy cAMP w komórkach β (Rasmussen i in., 1990). Izolowane komórki β wykazują niższe poziomy cAMP niż komórki β w nie naruszonych wysepkach, podwyższone lub obniżone poziomy cAMP w wysepkach występowały równolegle z podwyższaniem lub obniżaniem odpowiedzi wydzielniczej na glukozę (Howell

PL 204 503 B1 i in., 1973). Poziomy cAMP można przywrócić do stanu normalnego przez reagregację z komórkami nie-β wysepek lub dodanie glukagonu (Schuit i Pipeleers, 1985). Zgodne z bezpośrednim wpływem glukagonu na komórki β jest wykazanie obecności receptorów glukagonu na komórkach β (Van Schravendijk i in., 1985). Wykazano również, że glukagon wzmacnia amplitudę pulsacyjnego uwalniania insuliny w odpowiedzi na glukozę bez wpływania na periodyczność pulsów wydzielania (Marchetti i in., 1994).

Ponieważ dobrze wiadomo, że cytoplazmatyczne stężenie Ca²⁺ ma zasadnicze znaczenie dla wydzielania insuliny (Prentki i Matschinsky, 1987), zaproponowano, że indukowane glukagonem wzrosty poziomów cAMP działają poprzez podwyższone poziomy Ca²⁺. Skomplikowane doświadczenia pomiarów krótkotrwałych impulsów stężeń Ca²⁺ pojawiających się pod wpływem wewnątrz komórkowego cAMP uwalnianego z cząsteczki prekursorowej pod wpływem światła wykazały, że wzrost krótkotrwałych impulsów stężeń Ca²⁺ odpowiada za 10% całkowitego wzrostu egzocytozy zachodzącej pod wpływem cAMP (Ammala i in., 1993). Podobnymi metodami Ammala i in., (1993) wykazali również, że cAMP inicjuje egzocytozę przy stężeniu Ca²⁺, które samo z siebie jest niezdolne do pobudzania wydzielania a także wzmacnia wydzielanie przy wyższych stężeniach Ca²⁺. Westerlund i in. (1997) wykazali również, że wydzielanie insuliny nadal za chodziło pulsacyjnie w warunkach, w których [Ca²⁺]i pozo stawało na stałym poziomie. Doświadczenia te wykazują, że cAMP wyznacza próg wrażliwości aktywacji kanałów wapniowych dla działania wydzielniczego, skutkiem czego rola glukagonu (w podwyższaniu poziomów cAMP w komórkach β) staje się szczególnie istotna w kontrolowaniu amplitudy indukowanych glukozą szybkich pulsów wydzielania insuliny.

Wydzielanie glukagonu również jest pulsacyjne. Storch i in., (1993) donieśli, że stężenie glukagonu w osoczu u pacjentów z marskością wątroby podlegał znacznym wahaniom w odstępach 4,1-6,5 minut. Poddawane perfuzji in vitro trzustki szczurów wydzielały zarówno insulinę, jak i glukagon w pulsach odpowiednio co 5,8 i 6,5 minut, odwracanie kierunku perfuzji w trzustkach szczurów i psów nie wpływało na periodyczność wydzielania hormonów (Stagner i Samols, 1988). Zaprzecza to możliwości, że za periodyczność wydzielania odpowiedzialne są bezpośrednie interakcje hormonalne wewnątrz wysepek, bądź mechanizm receptorowy wrażliwy na stężenie hormonów we krwi. Pojedyncze wysepki myszy wydzielają insulinę w odpowiedzi na stymulację glukozą przez zarówno szybkie, jak i wolne oscylacyjne pulsy (Bergsten i in., 1994). Stąd też wynika, że mechanizm pulsacyjnego wydzielania insuliny zlokalizowany jest w pojedynczych wysepkach; jest to mechanizm inny niż po legający na powstawaniu krótkotrwałych impulsów stężeń [Ca²⁺]i jak wykazano przez doświadczenia dotyczące aktywacji kinazy białkowej C, która zwiększała amplitudę oscylacji bez wpływania na ich częstotliwość lub zmiany w [Ca²⁺]i (Deeney i in., 1996). Doniesienia te wykazują, że czynnik narzucający rytm pulsacyjnego wydzielania insuliny i glukagonu zlokalizowany jest wewnątrz wysepek oraz że jest on niezależny od zewnętrznego unerwienia i bezpośrednich interakcji hormonalnych. Ustalono to również u człowieka poprzez wykazanie obecności pulsów o zarówno niskiej, jak i wysokiej częstotliwości w udanych przeszczepach trzustki (Sonnenberg i in., 1992).

Rola czynnika narzucającego rytm w INDDM

Dysfunkcja komórek beta jest znaczna w insulinoniezależnej cukrzycy typu 2 (NIDDM), która jest chorobą obejmującą także oporność na insulinę. Znaczenie zależności tych dwóch składowych jest kontrowersyjne. Na wczesnym etapie choroby zachodzi wyraźne uszkodzenie pod względem pulsacyjnego wydzielania insuliny z utratą pulsów o wysokiej częstotliwości oraz obniżeniem amplitudy wolnych oscylacji (Leahy, 1990, Guillausseau, 1994). Utrata pulsacyjności wydzielania może być ważnym potencjalnym czynnikiem przyczyniającym się do powstania oporności na insulinę. Z różnych badań mających na celu identyfikację czynników sprzyjających rozwojowi NIDDM wypływa wniosek, że głównym czynnikiem predysponującym do NIDDM jest raczej dysfunkcja komórek β, niż oporność na insulinę (Pimenta i in., 1995; Davis i in., 1995, Nijpels i in., 1996). Dlatego też, przyczyna NIDDM musi być związana ze zjawiskiem, które indukuje tę dysfunkcję. W tym opisie proponuje się, że dysfunkcja ta jest konsekwencją uszkodzenia czynnika narzucającego rytm, który utrzymuje pulsacyjne wydzielanie zarówno glukagonu, jak i insuliny.

Parksen i in. (1995) badali udział pulsacyjnego wydzielania insuliny w stosunku do jej podstawowego wydzielania u głodzonych przez noc psów i wykazali, że większość insuliny (70%) ulegała wydzielaniu w postaci pulsów. Dlatego też, uszkodzenie tego układu mieć główny wpływ na całkowite wydzielanie insuliny.

Naturalny przebieg dysfunkcji komórek β poprzedzający wystąpienie IDDM jest trudniejszy do badania z powodu nagłego i destrukcyjnego charakteru choroby w momencie diagnozy. O'Meara i in., (1995) byli, jednakże, w stanie przeprowadzić badania osobnika w ciągu prowadzącego do rozwoju

PL 204 503 B1

IDDM okresu 13 miesięcy. Gdy stężenia glukozy na czczo i glikozylowanej hemoglobiny nadal pozostawały w normalnym zakresie, odpowiedzi insuliny na podawaną dożylnie glukozę były obniżone. Wzór oscylacyjnego wydzielania pozostawał zachowany ale odpowiedzi wydzielnicze były obniżone.

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało lub jego fragment, które wykazuje zdolność wiązania przeciwciała νβ skierowanego przeciw receptorowi (TCR) komórek T oraz dowolnego z następujących związków: fosfolipid, glikan fosfolipidu, jednoniciowe DNA i dwuniciowe DNA.

Przeciwciało lub jego fragment zawiera fosfolipidy, który stanowi fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna lub kardiolipina (diacyloglicerol).

Przeciwciało lub jego fragment według wynalazku posiada zdolność wiązania z jednym lub więcej spośród ludzkich komórek wysepek trzustkowych, komórek pęcherzykowych tarczycy, komórek rdzenia nadnerczy, żołądka i układu jelitowego, gruczołów ślinowych, mięśnia prążkowanego i tkanki łącznej.

Przeciwciało lub jego fragment wiąże się z przeciwciałem anti-TCR Ve ze stałą dysocjacji 10^-4 M lub mniejszą lub 10^-7 M lub mniejszą.

Przeciwciało korzystnie stanowi przeciwciało monoklinalne i korzystnie pochodzi ono z kręgowców lub bezkręgowców, przykładowo pochodzi z otrzymanych od ludzi lub od zwierząt, zdrowych lub chorych, komórek B unieśmiertelnionych przez transformację wirusem Epsteina-Barra lub inną metodą. Przeciwciało lub jego fragment jest izolowane przez przepuszczanie płynów ciała pochodzących od ludzi lub od zwierząt, przez kolumnę ze skoniugowanym antygenem. Zwierzęta lub ludzie, z których jest izolowane, są immunizowani antygenem, są chorzy lub poddano ich manipulacjom lekiem bądź dietą tak, że rozwinęła się u nich choroba.

Przeciwciało lub jego fragment posiada cząsteczkę efektorową lub reporterową. Poza tym przeciwciało lub jego fragment jest zmodyfikowane chemicznie, związane z substancją biologiczną lub chemiczną, bądź jest skoniugowane z enzymem, związkiem wskaźnikowym, lekiem, toksyną lub znacznikiem radioaktywnym.

Kompozycja, zawierająca przeciwciało lub jego fragment określony powyżej do stosowania jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny, według wynalazku zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Zastosowanie omawianego przeciwciała lub jego fragmentu do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu IDDM, NIDDM lub narządowo swoistej albo narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby sercowo-naczyniowej, wyniszczenia rakowego, raka lub jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny bądź oporność na insulinę także stanowi przedmiot wynalazku.

Polipeptyd zawiera sekwencję ESRP1 określoną SEQ ID NO:2, a stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny. Peptyd ma zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu IDDM, NIDDM lub narządowo swoistej bądź narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby sercowo-naczyniowej, wyniszczenia rakowego, raka lub jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny bądź oporność na insulinę.

Białko według wynalazku zawiera sekwencję ESRP1 wskazaną w SEQ ID NO: 2 a stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny. Sekwencja cDNA posiada sekwencję kodującą ESRP1 jak przedstawia SEQ ID NO:1.

Natomiast klon bakteriofaga posiada tę sekwencję cDNA a stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny. Biologicznie funkcjonalny plazmid lub wektor wirusowy zgodnie z wynalazkiem obejmuje sekwencje cDNA jakie określono i stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny. Komórka gospodarza jest stabilnie stransformowana lub stransfekowana takim plazmidem lub wektorem i jest stosowana jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wykrywania naturalnie występujących auto-przeciwciał wykazujących zdolność wiązania zarówno przeciwciała ve skierowanego przeciw receptorowi (TCR) komórek T jak i epitopu łącznika glikozylofosfatydyloinozytolu GPI, który obejmuje etap, w którym kontaktuje się próbkę płynu ciała z docelową cząsteczką wybraną spośród przeciwciała anti-TCR Ve lub jego fragmentu, który posiada zdolność wiązania epitopu na łańcuchu TCR Ve; łączonego GPI łańcucha TCR Ve; fosfolipidu takiego jak fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, kardiolipina; glikanu fosfolipidu; jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA, białka podobnego do sekretograniny 1, białka 67kD podobnego do receptora lamininy, białka regulującego wydzielanie wewnętrzne 1 (ESRP1); białka

PL 204 503 B1 podobnego do ludzkiego białka błonowego ziarnistości zymogenu GP-2, po czym szacuje się ilość naturalnie występującego autoprzeciwciała wiążącego się specyficznie do cząsteczki docelowej.

Próbką płynu ciała jest próbka krwi, osocza lub surowicy.

Sposób wykrywania naturalnie występującego auto-przeciwciała wykazującego zdolność wiązania zarówno przeciwciała νβ skierowanego przeciw receptorowi (TCR) komórek T, jak i epitopu łącznika glikozylofosfatydyloinozytolu GPI, charakteryzuje się tym, że kontaktuje się próbkę płynu ciała z przeciwciałem lub jego fragmentem i z docelowymi cząsteczkami oraz określa się ilość naturalnie występującego auto-przeciwciała, która wiąże się specyficznie z cząsteczkami docelowymi, przy czym cząsteczka docelowa jest wybrana spośród grupy obejmującej przeciwciało anti-TCR Ve lub jego fragment, który posiada zdolność wiązania epitopu na łańcuchu TCR Ve; łączony GPI łańcuch TCR Ve; fosfolipid taki jak fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna lub kardiolipina; glikan fosfolipidu; jednoniciowy DNA, dwuniciowy DNA, białko podobne do sekretograniny 1, białko 67kD podobne do receptora lamininy, białko regulujące wydzielanie wewnętrzne 1 (ESRP1) oraz białko podobne do ludzkiego białka błonowego ziarnistości zymogenu GP-2. Próbką płynu ciała jest korzystnie próbka krwi, osocza lub surowicy.

Przeciwciało lub jego fragment skoniugowane ze znacznikiem radioaktywnym jak określono powyżej i tak wyznakowane przeciwciało lub jego fragment współzawodniczą z autoprzeciwciałami o cząsteczki docelowe, tworząc kompleksy, przy czym ilość związanego znacznika jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia autoprzeciwciał obecnych w próbce. Stosuje się przeciwciało lub jego fragment wyznakowane enzymem tak, że utworzenie kompleksów hamuje lub inaktywuje aktywność enzymu, a tym samym stopień hamowania lub aktywacji jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia autoprzeciwciał obecnych w próbce.

Cząsteczki docelowe związane z enzymem połączonym z substratem stosuje się tak, że wiązanie przeciwciała z cząsteczką docelową aktywuje enzym i powoduje zmianę barwy, którą mierzy się spektrofotometrycznie a korzystnie są one umieszczone na głębokościomierzu zwilżeniowym, który kontaktuje się z próbką.

Wynalazek dotyczy nowej koncepcji dotyczącej przyczyny chorób autoimmunologicznych i w szczególności opisuje jej zastosowanie do cukrzycy typu 1 i typu 2 w celu zilustrowania a nie ograniczania. Wynalazek przedstawia przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, bądź funkcjonalnie równoważne ligandy, o reaktywności wobec przeciwciała skierowanego przeciw ve TCR, do stosowania jako czynnik farmaceutyczny lub diagnostyczny. Cząsteczki te mogą również wykazywać reaktywność wobec połączonych z GPI łańcuchów ve TCR, fosfolipidów, fosfolipidoglikanów, jednoniciowego DNA i/lub dwuniciowego DNA. Wynalazek dotyczy także stosowania tych przeciwciał do produkcji leków przeznaczonych do leczenia IDDM, NIDDM lub narządowo swoistych bądź narządowo nieswoistych chorób autoimmunologicznych i zbliżonych. Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem stosuje się przeciwciało monoklonalne.

W odniesieniu do cukrzycy wynalazek wysuwa koncepcję, że głównym czynnikiem w procesie powstawania cukrzycy jest rozregulowanie funkcji komórek a przez ostatnio zidentyfikowane autoprzeciwciała o podobnej specyficzności, jak te przeciwciała monoklonalne. W celu udowodnienia tej nowej koncepcji, wynalazek wykazuje, że przeciwciała monoklonalne rozpoznają wspólny epitop dla zestawu cząsteczek szlaku przekazywania sygnałów na komórkach α (które mogą działać jako czynnik narzucający rytm w wysepkach), będących celami rzeczonych patogennych autoprzeciwciał. Wynalazek zapewnia także wykrywanie tych autoprzeciwciał, a ponadto wprowadza w życie ich zastosowanie i przeciwciał monoklonalnych oraz cząsteczek rozpoznawanych przez te przeciwciała monoklonalne w profilaktycznych i terapeutycznych interwencjach w przypadku chorób autoimmunologicznych i zbliżonych włącznie z IDDM i NIDDM. Przeciwciała monoklonalne rozregulowują wydzielanie insuliny z hodowli komórek ludzkich wysepek (dla zapoznania się ze szczegółami patrz część doświadczalna i Tablica 1). Zlokalizowano je przy komórkach α dzięki jednoczesnemu wybarwianiu skrawków trzustki tymi przeciwciałami monoklonalnymi (IgM) a także przeciwciałami monoklonalnymi (IgG) skierowanymi przeciw glukagonowi, z zastosowaniem detekcji dzięki wiązaniu odpowiednio wyznakowanych fluoresceiną przeciwciał skierowanych przeciw mysim IgM oraz wyznakowanych rodaminą przeciwciał skierowanych przeciw mysim IgG, wzory wybarwiania przeciwciałami były identyczne, wykazując, że oba były wybarwieniami tych samych komórek α wytwarzających glukagon.

Uważa się, że wpływ patogennych autoprzeciwciał na komórkę α powoduje utratę zarówno zdolności odpowiedzi kontrregulacyjnej na glukozę, jak i precyzyjnej regulacji wydzielania insuliny. Wynikiem rozregulowania wydzielania insuliny jest albo śmierć komórek β prowadząca do IDDM albo

PL 204 503 B1 komórki β nadal żyją ale w stanie rozregulowanym, co prowadzi do NIDDM. Te dwa rezultaty uzależnione są od genetycznej podatności osobnika. W IDDM uczulenie komórek T ma drugorzędne znaczenie w uszkadzaniu komórek β i może przyspieszać śmierć pozostających komórek β. Jednakże, autorzy zgłoszenia nie chcą ograniczać się tą teorią.

Przeciwciała monoklonalne, które rozpoznają cząsteczki powierzchni komórek α, wywoływano przez immunizację myszy przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw νβ TCR, jak opisano poniżej w części doświadczalnej. Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez uzyskane w wyniku klony albo rozpoznawały sam immunogen skierowany przeciw νβ albo rozpoznawały immunogen, jak również fosfatydyloinozytol, fosfatydyloserynę, kardiolipinę (diacyloglicerol) oraz dwuniciowy i jednoniciowy DNA. Te ostatnie przeciwciała monoklonalne rozpoznawały również komórki α trzustki ludzkiej (Fig. 1), pęcherzykowe komórki tarczycy (Fig. 2), komórki rdzenia nadnerczy (Fig. 3), żołądka i przewodu pokarmowego (Fig. 4), żołądka, gruczołów ślinowych, jajników, mięśni poprzecznie prążkowanych, tkanki łącznej, co podaje się w opisie dla przykładu a nie dla ograniczania.

W znaczeniu stosowanym w opisie termin „funkcjonalny równoważnik w zamierzeniu opisuje związki, które posiadają pożądane miejsce wiązania i obejmuje jakąkolwiek makrocząsteczkę lub jednostkę molekularną, która wiąże przeciwciało skierowane przeciw νβ TCR ze stałą dysocjacji 10^-4 M lub niższą, korzystnie 10^-7 M lub niższą, najkorzystniej 10^-9 M lub niższą, i która wykazuje równoważną komplementarność pod względem kształtu do tej posiadanej przez miejsca wiążące zidentyfikowanych w opisie przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw νβ TCR. Do niedawna, metody tworzenia związków o powinowactwie wobec cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania były stosunkowo bardzo proste. Jednakże, wykorzystywanie myśli chemii kombinatorycznej i tworzenie kombinatorycznych bibliotek bardzo przyspieszyło i ułatwiło racjonalne projektowanie oraz ulepszanie cząsteczek o pożądanych właściwościach. Techniki te można stosować do tworzenia cząsteczek posiadających miejsca wiązania identyczne lub podobne do tych dla przeciwciał zidentyfikowanych w opisie. Takie związki można tworzyć dzięki racjonalnemu projektowaniu, stosując na przykład standardowe techniki syntezy w połączeniu z programami do modelowania molekularnego i wizualizacji komputerowej. Podczas stosowania tych technik, „wiodący związek o zrębie podobnym do miejsca wiążącego przeciwciała optymalizuje się przez kombinację różnorodnych struktur podstawowych i składowych podstawników. Alternatywnie, bądź jako jeden z etapów opartego na strukturze projektowania jednostki molekularnej, do tworzenia lub udoskonalania struktury związków, które naśladują będące przedmiotem zainteresowania miejsce wiążące, można stosować kombinatoryczną chemię, poprzez wytwarzanie kombinatorycznie szeregów struktur pokrewnych z strukturą podstawową zrębu. Etapy te mogą obejmować standardową syntezę peptydu lub cząsteczki organicznej z procesami rozszczepiania na fazie stałej i ponownego łączenia, bądź równoległą kombinatoryczną syntezę jednostkową z zastosowaniem albo technik fazy stałej, albo w roztworze (patrz, na przykład, Hogan, 1997 i cytowane tam odnośniki).

Alternatywnie bądź jako część cząsteczki według tego aspektu wynalazku, funkcjonalne równoważniki mogą obejmować fragmenty lub warianty zidentyfikowanych przeciwciał lub ściśle zbliżonych białek wykazujących znaczącą homologię sekwencji. Przez fragmenty rozumie się jakąkolwiek część sekwencji całego białka, która zachowuje zdolność do wiązania z przeciwciałem skierowanym przeciw νβ TCR ze stałą dysocjacji 10^-4M lub niższą, korzystnie 10^-7M lub niższą, najkorzystniej 10^-9 lub niższą. Zgodnie z tym, fragmenty zawierające pojedyncze lub wielokrotne delecje aminokwasowe na którymkolwiek z końców białka lub w wewnętrznych odcinków pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej, stanowią pierwszy aspekt wynalazku. Warianty mogą obejmować, na przykład, mutanty zawierające podstawienia, insercje lub delecje aminokwasowe sekwencji typu dzikiego przeciwciała. Biologicznie aktywne peptydy z miejscami wiązania, które naśladują opisane przeciwciała można tworzyć stosując biblioteki fagowe. Kwasy nukleinowe kodujące reszty aminokwasowe zidentyfikowane jako uczestniczące w miejscu wiązania wraz z kwasem nukleinowym kodującym otaczające reszty zrębu, można poddawać fuzji w celu otrzymania jednostki polipeptydowej o długości pomiędzy 10 a 1000 reszt, korzystnie pomiędzy 25 a 100 reszt. Dzięki fuzji fragmentu kwasu nukleinowego z tym kodującym białko fagowe, na przykład pIII bakteriofaga fd, cząsteczka fuzyjna może ulegać prezentacji na powierzchni faga. Przeszukanie biblioteki fagowej przeciwciałem skierowanym przeciw Ve TCR pozwoli na zidentyfikowanie tych klonów, które są przedmiotem zainteresowania. Klony te można następnie poddawać wielokrotnym turom mutagenezy i przeszukiwania w celu poprawienia powinowactwa utworzonych cząsteczek.

PL 204 503 B1

Przeciwciała lub funkcjonalnie równoważne ligandy według wynalazku mogą pochodzić z kręgowców lub bezkręgowców. Korzystnie, przeciwciała otrzymuje się z komórek B unieśmiertelnionych poprzez transformację wirusem Epsteina-Barra, bądź innymi metodami z zastosowaniem komórek B otrzymanych ze zdrowych lub chorych ludzi lub zwierząt. Przeciwciało lub równoważny ligand można wyizolować przez przepuszczanie płynu ciała ze zwierząt lub ludzi przez kolumnę ze skoniugowanym antygenem. Zwierzęta można wcześniej immunizować antygenem, mogą one być chore, bądź można je poddawać manipulacjom lekiem lub dietą tak aby nastąpił rozwój choroby.

Według innego aspektu wynalazku zapewnia się peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko, które jest wiązane przez monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało bądź równoważny ligand według pierwszego aspektu wynalazku, który nie jest przeciwciałem skierowanym przeciw Ve TCR, do stosowania jako czynnik farmaceutyczny lub diagnostyczny.

Szczególnie korzystne do stosowania w tym aspekcie wynalazku są białka kodowane przez opisane poniżej klony 1.1, 1.2, 1.3, 3.1, 4.1, 5.1, 5.2 lub 5.3, ich fragmenty oraz ich funkcjonalne równoważniki. Takie cząsteczki można stosować również produkcji lekarstwa do leczenia IDDM, NIDDM lub innych narządowo swoistych bądź narządowo nieswoistych chorób autoimmunologicznych i zbliżonych.

Cząsteczki te rozpoznawane są przez przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve i zidentyfikowano je dzięki przeszukaniu biblioteki cDNA trzustki ludzkiej w λgt11. Oczyszczono i zsekwencjonowano osiem klonów cDNA. Klony 1.1, 1.2 i 1.3 kodują białko podobne do sekretograniny 1, klony 3.1, 4.1 i 5.1 kodowały białko podobne do receptora lamininy o masie cząsteczkowej 67 kDa, klon 5.2 kodował nową cząsteczkę, którą autor wynalazku nazwał ESPR1 (od ang. endocrine secrection regulatory protein 1, białko regulujące wydzielanie wewnętrzne 1). Klon 5.3 koduje ludzkie białko podobne do ziarnistości zymogenu białka GP-2.

Wspólną cechą charakterystyczną wszystkich tych cząsteczek jest to, że połączone są one z błoną komórkową poprzez nowo odkrytą cząsteczkę zakotwiczającą glikozylofosfatydyloinozytol (GPI). Regulacja i ekspresja cząsteczek połączonych poprzez GPI na powierzchniach komórkowych zostały opisane (Low, 1989; Udenfriend i Kodukula, 1995). Te reszty acylowe wrażliwe są na działanie insuliny poprzez działanie fosfolipaz aktywowanych insuliną (Chan i in., 1988). Produkty rozszczepienia tych cząsteczek ulegają internalizacji do komórek α i w opisie postuluje się, że regulują wydzielanie glukagonu. Ponowna synteza i ponowna ekspresja cząsteczek na błonie wymagają czasu, który odpowiada za periodyczność wydzielania glukagonu a zatem pulsacyjne wydzielanie zarówno glukagonu jak i insuliny. Ten rodzaj mechanizmu może odpowiadać za czynnik narzucający rytm w wysepkach. Przeciwciała, które wiążą się z regionem tych cząsteczek, który podlega enzymatycznemu rozszczepianiu mogą zakłócać działanie enzymu i niszczyć regulację wydzielania glukagonu i insuliny.

Istnieją różne mechanizmy, dzięki którym przeciwciała o podobnej specyficzności mogą powstawać fizjologicznie u ludzi. Po pierwsze, czynniki środowiskowe, takie jak infekcje lub superantygeny mogą indukować klonalną ekspansję komórek T a podczas tej fazy proliferacji nienormalnie utworzone kompleksy TCR są zatrzymywane wewnątrz komórki i degradowane. Komórki T w pewnych warunkach mogą ulegać apoptozie i uwalniać zdegradowane produkty TCR, które mogą być immunogenne i wyzwalać kaskadę wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciw Ve oraz przeciwciał skierowanych przeciwko przeciwciałom skierowanych przeciw Ve. Po drugie, Bell i in., (1994) donieśli, że peptyd sygnałowy dla przyłączania cząsteczki zakotwiczającej GPI obecny jest w sekwencji polipeptydowej łańcucha β TCR oraz że łańcuchy β TCR pozbawione sekwencji końca cytoplazmatycznego w nieobecności α TCR ulegają ekspresji w linii hybrydom dojrzałej komórki T w postaci zakotwiczonego poprzez GPI polipeptydu monomerycznego. Połączone z GPI łańcuchy β TCR wykryto u myszy transgenicznych pod względem β TCR ale nie u myszy normalnych, dlatego też nienormalna ekspresja takich łańcuchów ve może indukować kaskadę odpowiedzi, w wyniku czego powstają przeciwciała o specyficzności podobnej do reagentów skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve. Takie przeciwciała wykryto w surowicach ludzkich w innym rozwiązaniu tego wynalazku (patrz Tablica 2 w części doświadczalnej).

Wymienione powyżej klony cDNA oraz kodowane przez nie białka opisano bardziej szczegółowo poniżej:

Klony 1.1, 1.2, 1.3. Te trzy klony, o długościach odpowiednio 1500 par zasad, 1400 par zasad i 900 par zasad, kodują cząsteczkę podobną do sekretograniny 1 (Sg1). Sekretogranina 1 jest polipeptydem o długości 657 aminokwasów a poprzedza ją odszczepiany N-końcowy peptyd sygnałowy o długości 20 reszt (Benedum i in., 1987). Posiada ona strukturę pętli z wiązaniami dwusiarczkowymi

PL 204 503 B1 i jest białkiem sekrecyjnym kierowanym do granuli wydzielniczych komórek wydzielania wewnętrznego i neuronów. Pimplikar i Huttner, (1992) wykazali, że w linii komórek nerwowych wydzielania wewnętrznego, PC12, część ulegającej egzocytozie Sg1 nie była uwalniana ale pozostawała związana z błoną plazmatyczną. Powierzchniowa Sg1 (około 10% całkowitego białka komórkowego) ulegała internalizacji i degradacji, co wskazuje na możliwe właściwości przekazywania sygnałów. Polipeptyd ten posiada cechy charakterystyczne białka kaweolarnego (Chang i in., 1994). Region promotorowy genu Sg1 myszy zawiera element odpowiadający na cAMP (Pohl i in., 1990). Sekretograniny są rodziną kwaśnych białek. Ponieważ nie występują one w komórkach wydzielania zewnętrznego, wykorzystywano je jako immunohistochemiczne markery diagnostyczne nowotworów wewnątrzwydzielniczych. Ponadto, Sg1 jest wiążącym heparynę białkiem adhezyjnym i wykazano, że pośredniczy w adhezji do podłoża (Chen i in., 1992). Interesujące jest, że u gryzoni akumulacja mRNA Sg1 rozpoczyna się około 13-14 dnia rozwoju zarodkowego a maksimum osiąga 20 dnia po urodzeniu (Foss-Peters i in., 1989).

Klony 3.1, 4.1, 5.1. Trzy inne klony 3.1 (900 par zasad), 4.1 (900 par zasad) i 5.1 (1000 par zasad) kodują białko podobne do receptora lamininy o masie cząsteczkowej 67 kDa. Laminina jest głównym składnikiem błon podstawnych, która odgrywa ważną rolę w szeregu funkcji komórkowych takich jak adhezja, przebudowa tkanek, gojeniu ran, stanach zapalnych, przerzutach komórek nowotworowych itp. Oddziaływania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z komórkami pozostającymi z nią w styczności przebiega poprzez odrębne receptory na powierzchniach komórkowych, takie jak receptor lamininy o masie cząsteczkowej 67 kd. To białko wiążące lamininę wiąże również elastynę i kolagen typu IV oraz jest galaktolektyną, co umożliwia jego oczyszczanie na zawierającej β-galaktocukry kolumnie do chromatografii powinowactwa do glikokoniugatów. Cukry beta-galaktozowe, takie jak galaktoza i laktoza, mogą eluować to białko z kolumn do chromatografii powinowactwa do elastyny lub lamininy (Hinek, 1994). Wiązanie galaktocukrów z lektynowym miejscem na cząsteczce nie tylko wywiera wpływ usuwania ligandów ECM z miejsc ich wiązania, ale także prowadzi do oddysocjowania białka o masie cząsteczkowej 67 kd od błony komórkowej (Hinek i in., 1992). Wykazano również, że występuje współzależność pomiędzy niedoborem tego białka na komórkach z mięśni gładkich z przewodu tętniczego, ich odłączaniem od elastyny oraz ich zdolnością do migracji. Powierzchniowa ekspresja tego białka prawdopodobnie pozostaje pod kontrolą translacyjną. W stransfekowanych komórkach, w których zachodzi ekspresja wysokich poziomów mRNA, nie zawsze dochodzi do odpowiadająco wysokich poziomów białka na ich powierzchniach. (Landowski i in., 1995). Doświadczenia mikrospektrofluorymetryczne i wideomikroskopowe wykazały, że wynikiem wiązania elastyny lub aktywnego peptydu VGVAPG z mięśniami gładkimi aorty jest krótkotrwały wzrost stężenia wolnego wewnątrzkomórkowego Ca²⁺. Sugeruje to, że wiążące lamininę lub elastynę białko powierzchni komórkowych jest rzeczywistym receptorem pośredniczącym w przekazywaniu sygnałów wewnątrzkomórkowych (Hinek, 1994).

Nadal występują kontrowersje dotyczące sposobu połączenia tego białka z błoną komórkową, jako że analiza przewidywanej sekwencji aminokwasowej nie ujawniła jakichkolwiek hydrofobowych domen charakterystycznych dla regionu transbłonowego. Estryfikacja grupami metylowymi oczyszczonego białka a następnie chromatografia gazowa i spektrometria masowa wskazały, że białko jest acylowane przez kowalencyjnie związane kwasy tłuszczowe, palmitynian, stearynian i oleinian, ale nie rozstrzygnięto ostatecznie chemii wiązania (Landowski i in., 1995). Acylacja tego białka nadaje mu dalszy zestaw właściwości, poza tymi zależnymi od wiązania lamininy. Wykazano, że modyfikacje lipidami wpływają na oddziaływania białko-białko a acylowe grupy modyfikujące mogą również tworzyć przekaźniki drugiego rzędu w przekazywaniu sygnałów.

Klon 5.2. Polipeptyd kodowany przez ten klon cDNA o długości około 1200 par zasad nie wykazuje żadnego znaczącego podobieństwa do białka scharakteryzowanego funkcjonalnie. Dlatego też, nie jest możliwe otrzymanie jakichkolwiek po równań funkcjonalnych z jakimikolwiek znanymi białkami. Uważa się jednakże, że białko to posiada wspólny epitop z białkami zidentyfikowanymi przez przeciwciała monoklonalne, skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve, zastosowane do przeszukiwania biblioteki trzustkowej, i dlatego też posiada podobne właściwości funkcjonalne. Białko to będzie odtąd nazywane białkiem regulującym wydzielanie wewnętrzne 1 (ESRP1).

Według dalszego rozwiązania wynalazku, zapewnia się białko ESRP1, jego fragmenty i funkcjonalne równoważniki. Sekwencję białka podano na Fig. 7. Sekwencja kodującego kwasu nukleinowego stanowi dalszy aspekt tego rozwiązania wynalazku i podano ją na Fig. 6 poniżej. Według dalszego aspektu wynalazku, zapewnia się białko ESRPl do stosowania w leczeniu lub diagnozie.

Białko ESRPl lub funkcjonalny równoważnik według wynalazku może pochodzić z jakiegokolwiek organizmu posiadającego białko z tej samej rodziny, co związki tu zidentyfikowane. Przez rodziPL 204 503 B1 nę białek rozumie się grupę polipeptydów, które posiadają wspólną funkcję i wykazują homologię sekwencji pomiędzy motywami obecnymi w sekwencjach polipeptydowych. Korzystnie, białko, fragment białka lub funkcjonalny równoważnik pochodzi ze ssaka, korzystnie z człowieka. Według jeszcze dalszego aspektu tego rozwiązania wynalazku, zapewnia się zastosowanie białka ESRP1, jego fragmentów i funkcjonalnych równoważników w produkcji lekarstwa do leczenia IDDM, NIDDM, narządowo swoistej lub narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby układu krążenia, wyniszczenia rakowego i raka oraz jakichkolwiek innych chorób, w których występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny oraz oporność na insulinę.

W znaczeniu stosowanym w tym opisie, termin „narzą dowo swoista lub narzą dowo nieswoista choroba autoimmunologiczna obejmuje IDDM, NIDDM, choroby autoimmunologiczne tarczycy, nadnerczy, gruczołów rozrodczych, żołądka i przysadki mózgowej, uogólniony liszaj rumieniowaty, stwardnienie układowe i zespół Sjorgena.

„Choroba układu krwionośnego obejmuje chorobę tętnic szyjnej i wieńcowej, dusznica bolesna makro- i mikronaczyniowa, chorobę naczyń obwodowych, miażdżycę i nadciśnienie.

„Rak obejmuje mięsaki piersi, okrężnicy i odbytnicy, żołądka, śluzówki macicy, gruczołu krokowego, głowy i szyi oraz płuc.

„Inna odpowiednia choroba obejmuje zespół wielotorbielatowości jajnika, otyłość, zespół Cushinga i zespół metaboliczny X.

Choroby te podano jako przykłady, a nie jako ograniczenie.

Klon 5.3. Ten klon cDNA o długości około 2000 par zasad koduje białko, które jest bardzo podobne do ludzkiego białka błonowego ziarnistości zymogenu GP-2. Jednakże, klon 5.3 posiada kilka różnic w kwasie nukleinowym, a w konsekwencji aminokwasowych, i zlokalizowany jest w wewnątrzwydzielniczej części trzustki.

Ponieważ przeciwciało reaktywne wobec tego klonu cDNA wybarwia wewnątrzwydzielniczą część trzustki, białko kodowane przez ten klon uważa się za odpowiednik białka GP-2 komórek wydzielania zewnętrznego w komórkach wydzielania wewnętrznego. Nie nadaje to, jednakże, temu białku takiej samej funkcji w komórkach wydzielania wewnętrznego, jaką posiada ono w tkance zewnątrzwydzielniczej. Wykazano, że GP-2 szczura, ulegające ekspresji w liniach komórkowych pochodzących od komórek wydzielania wewnętrznego lub zewnętrznego dzięki transfekcji cDNA, jest kierowane do ziarnistości sekrecyjnych w komórkach wydzielania zewnętrznego, ale nie w komórkach wydzielania wewnętrznego (Hoops i in., 1993).

Głównym białkiem w błonach wyizolowanych ziarnistości zymogenu zewnątrzwydzielniczej części trzustki jest GP-2, które stanowi do 40% białka całkowitego (Ronzio i in., 1978). Białka zarówno człowieka, jak i szczura, połączone są z błoną ziarnistości poprzez połączenie z glikozylofosfatydyloinozytolem (GPI) i mogą być uwalniane z błony przez specyficzną wobec fosfatydyloinozytolu fosfolipazę C (PI-PLC). Wysoka zawartość GP-2 w błonach ziarnistości zymogenu doprowadziła do hipotezy, że białko to jest ważne w tworzeniu ziarnistości. Donoszono jednakże, że mRNA GP-2 nie występuje w zarodkowej trzustce szczura i GP-2 ulega ekspresji tylko po urodzeniu, podczas okresu odstawienia od matki. Ponieważ zarodkowe trzustki szczura zawierają wiele ziarnistości, można wnioskować, że GP-2 nie ma zasadniczego znaczenia dla tworzenia ziarnistości (Dittie i Kern, 1992). Obserwacje te potwierdzono w badaniach trzustek świń, w których białko i mRNA GP-2 również nie występowały w płodach a ich wytwarzanie rozpoczynało się 21 dni po urodzeniu. Dlatego też, ziarnistości płodowe są całkowicie pozbawione białka GP-2 (Laine i in., 1996). Pojawianie się antygenów w okresie odstawienia od matki mogłoby wyjaśnić współwystępowanie rozwoju zapalenia wysepek trzustkowych w tym czasie w doświadczalnych zwierzęcych modelach cukrzycy.

Dokładna rola(e) funkcjonalna białka GP-2 nie jest znana, ale ponieważ białko występuje w ziarnistoś ciach zymogenu zarówno w postaci rozpuszczalnej (40%), jak i zwią zanej z bł oną (60%), musi posiadać funkcje zarówno wewnątrzkomórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe. Ponieważ białko GP-2 u gryzoni i świń ulega ekspresji po urodzeniu, tolerancja na tę cząsteczkę podczas rozwoju zarodkowego musi być indukowana raczej obwodowo niż wewnątrztrzustkowo. Pulendran i in. (1995) oraz Shokat i Goodnow (1995) wykazali, że zawiązek komórek B ulega apoptozie po napotkaniu rozpuszczalnego antygenu. Dlatego też, rozpuszczalne GP-2 może posiadać rolę w indukowaniu tolerancji poprzez wiązanie z immunoglobulinowym receptorem GP-2 komórek B z reaktywnego zawiązka i wyzwalanie apoptozy. Związana z błoną postać GP-2 może być uwalniana z błony przez proteazy i fosfolipazy: na wydzielanym hydrofilowym GP-2 wykazano obecność 1,2-(cyklicznego)monofosforanu inozytolu, potwierdzając działanie fosfolipazy C w odszczepianiu GP-2 z błony

PL 204 503 B1 (Paul i in., 1991). Lipidowe produkty, takie jak 1,2-diacyloglicerol i kwas fosfatydylowy lub inozytologlikan powstające z lipidowych czynników zakotwiczających białek powierzchni komórkowych dzięki fosfolipazom, proteazom lub hydrolazom, mogą ulegać internalizacji i uczestniczyć w szlakach przekaźników drugiego rzędu. Białka połączone z GPI mogą również bezpośrednio uczestniczyć w przekazywaniu sygnałów poprzez sieciowanie ich domen NH2-końcowych. Przekazywanie sygnałów przebiega poprzez białkowe kinazy tyrozynowe z rodziny src, p56 lek oraz p59 fyn, i bierze w nim udział zakotwiczający GPI (Shenoy-Scaria i in., 1992). Wykazano również, że białko GP-2 posiada właściwości enzymatyczne i zidentyfikowano je jako fosfatazę nukleozydową o aktywnościach di- i trifosfatazy w błonie ziarnistości zymogenu świni. Sugeruje to, że uczestniczy ono w wymagających energii procesach w cytozolu (Sorani i Freiburghaus, 1996).

Białko GP-2 wykazuje 53% identyczności i 85% podobieństwa do ludzkiej uromoduliny/białka Tamm-Horsfall (THP) na odcinku o długości 450 aminokwasów w regionie C-końcowym. THP również jest połączony z GPI a oba białka należą do rodziny białkowej obejmującej receptory plemnika Zp2 i Zp3 oraz β-glikan (receptor typu III TGF-β) i charakteryzuje się domeną o długości 260 reszt, wspólną dla tych w rzeczywistości różnych białek (Bork i Sander, 1992). Nowo zidentyfikowane białko komórek α, kodowane przez klon cDNA o długości 2000 par zasad, musi również należeć do tej rodziny białek i musi posiadać istotną funkcję w kontrolowaniu procesów wydzielniczych komórek α.

Do wielu zastosowań przeciwciało lub równoważny ligand według pierwszego aspektu wynalazku, bądź peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko rozpoznawane przez takie przeciwciało, można poddawać fuzji z cząsteczką efektorową lub reporterową, taką jak znacznik, toksyna lub cząsteczka posiadająca aktywność biologiczną. Według dalszego aspektu wynalazku, zapewnia się przeciwciało lub równoważny ligand według pierwszego aspektu wynalazku, peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko rozpoznawane przez takie przeciwciało, które zmodyfikowano chemicznie, związano z substancją biologiczną lub syntetyczną lub skoniugowano z enzymem, związkiem wskaźnikowym, lekiem, toksyną lub znacznikiem promieniotwórczym, do stosowania jako czynnik farmaceutyczny lub diagnostyczny.

Odpowiednie znaczniki będą znane specjalistom w tej dziedzinie. Na przykład, znaczniki takie mogą obejmować dodatkowe białko lub polipeptyd poddane fuzji z przeciwciałem, jego fragmentem lub równoważnym ligandem na jego końcu aminowym lub karboksylowym, bądź dodane wewnątrz cząsteczki. Celem dodatkowego polipeptydu może być wspomaganie detekcji, ekspresji, wydzielania lub oczyszczania przeciwciała, jego fragmentu lub równoważnego ligandu lub może nim być dostarczenie dodatkowych właściwości przeciwciału, jego fragmentowi lub równoważnemu ligandowi, w zależności od potrzeb.

Szczególnie odpowiednimi kandydatami do fuzji będą cząsteczki reporterowe, takie jak lucyferaza, białko fluoryzujące na zielono lub peroksydaza chrzanowa. Znacznikami z wyboru mogą być znaczniki promieniotwórcze lub cząsteczki, które można wykrywać spektroskopowo, na przykład wykazujące fluorescencję lub fosforescencję grupy chemiczne. Można również zastosować cząsteczki łącznikowe, takie jak streptawidyna lub biotyna. Ponadto, jako kandydatów do fuzji można stosować inne peptydy lub polipeptydy. Odpowiednimi peptydami mogą być, na przykład, β-galaktozydaza, transferaza S-glutationowa, lucyferaza, znaczniki polihistynowe, peptydy sygnałowe sekrecji, region Fc przeciwciała, peptyd FLAG, domena wiążąca celulozę, kalmodulina i białko wiążące maltozę.

Cząsteczki fuzyjne można tworzyć przez fuzję chemiczną, stosując takie metody, jak sieciowanie chemiczne. Odpowiednie metody będą znane specjalistom w tej dziedzinie i mogą obejmować, na przykład, sieciowanie grup tiolowych reszt cysteinowych lub sieciowanie z zastosowaniem formaldehydów. Sieciowanie chemiczne będzie w większości przypadków stosowane do fuzji związków niebiałkowych, takich jak cykliczne peptydy i znaczniki.

Jeśli pożądane jest uzyskanie fuzji dwóch lub więcej cząsteczek białkowych, metodą z wyboru często będzie stosowanie genetycznej fuzji cząsteczek. W celu utworzenia zrekombinowanego białka fuzyjnego, geny lub części genów, które kodują będące przedmiotem zainteresowania białka lub fragmenty białek, modyfikuje się technikami inżynierii genetycznej tak, aby utworzyły jeden ciągły gen uporządkowany tak, że kodony dwóch sekwencji genowych ulegają transkrypcji w jednej ramce odczytu.

Związki według wynalazku mogą również być związane z nośnikiem, który można stosować do usuwania, izolowania lub ekstrakcji przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve TCR z tkanek organizmu. Nośnik może stanowić jakikolwiek odpowiedni materiał obojętny i może on obejmować żele, perełki magnetyczne i inne, mikrokuleczki, kolumny wiążące i żywice.

PL 204 503 B1

Ekspresję związków białkowych lub peptydowych według wynalazku będzie się korzystnie prowadzić w postaci zrekombinowanej, przez ekspresję kodującego DNA w wektorze ekspresyjnym w komórce gospodarza. Takie metody ekspresji są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie, a wiele z nich opisano szczegółowo w DNA cloning: a practical approach, Volume II: Expression systems, pod redakcją D. M. Glovera (IRL Press, 1995) lub w DNA cloning: a practical approach, Volume IV: Mammalian systems, pod redakcją D. M. Glovera (IRL Press, 1995). Związki białkowe można również przygotowywać stosując znane techniki inżynierii genetycznej, takie jak ukierunkowana lub losowa mutageneza, opisane na przykład w Molecular Cloning: a Laboratory Manual, wydanie 2, (Sambrook i in., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) lub w Protein Engineering: A practical approach (pod redakcją A.R. Reesa i in., IRL Press, 1993).

Dla wybranego gospodarza można wybrać odpowiednie wektory ekspresyjne. Wektor może obejmować zrekombinowaną cząsteczkę DNA kodującą związki według wynalazku połączone umożliwiając działanie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję bądź zrekombinowany DNA nośnika lub wektora klonującego zawierający taką zrekombinowaną cząsteczkę DNA pod kontrolą promotora rozpoznawanego przez maszynerię transkrypcyjną gospodarza.

Odpowiedni gospodarze obejmują powszechnie stosowane gatunki prokariotyczne, takie jak E. coli, lub eukariotyczne drożdże, które można zmodyfikować tak, aby eksprymowały zrekombinowane białka na wysokich poziomach i które można łatwo hodować w dużych ilościach. Odpowiednie są także ssacze linie komórkowe hodowane in vitro, szczególnie jeśli stosuje się wirusowy układ ekspresyjny, taki jak bakulowirusowy układ ekspresyjny, który obejmuje stosowanie komórek owadów jako gospodarzy. Związki mogą również ulegać ekspresji in vivo, na przykład w larwach owadów lub tkankach ssaków.

Według dalszego aspektu wynalazku opisano kompozycję farmaceutyczną obejmującą przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne bądź funkcjonalnie równoważny ligand wykazujący reaktywność wobec przeciwciała skierowanego przeciw Ve TCR, lub peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko rozpoznawane przez takie przeciwciała (które nie są przeciwciałem skierowanym przeciw Ve TCR) w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką. Odpowiednie zaróbki będą dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i mogą, na przykład, obejmować sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanami (0,01M sole fosforanowe, 0,138M NaCl, 0,0027M KCl, pH 7,4). Kompozycje farmaceutyczne mogą także zawierać dodatkowe środki konserwujące dla zapewnienia długiego dopuszczalnego okresu przechowywania.

Przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne, bądź funkcjonalnie równoważny ligand wykazujący reaktywność wobec przeciwciała skierowanego przeciw ve TCR, lub peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko rozpoznawane przez takie przeciwciało, mogą stanowić jedyny aktywny składnik kompozycji lub mogą stanowić część preparatu terapeutycznego do podawania miejscowego (tak jak składnik kremu), doustnego lub pozajelitowego.

Według dalszego aspektu wynalazku, zapewnia się stosowanie przeciwciała lub równoważnego ligandu wykazującego reaktywność wobec przeciwciała skierowanego przeciw ve TCR do produkcji lekarstwa do leczenia IDDM, NIDDM lub innej, narządowo swoistej lub narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby układu krwionośnego, wyniszczenia rakowego lub raka, bądź jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny oraz oporność na insulinę.

Wynalazek dotyczy także zastosowania do wytwarzania leku do leczenia IDDM, NIDDM lub innej, narządowo swoistej lub narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby układu krwionośnego, wyniszczenia rakowego lub raka, bądź jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny oraz oporność na insulinę.

Zastosowanie peptydu, oligopeptydu, polipeptydu lub białka, które jest wiązane przez przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne, bądź funkcjonalnie równoważny ligand wykazujący reaktywność wobec przeciwciała skierowanego przeciw Ve TCR, które nie jest przeciwciałem skierowanym przeciw Ve TCR do produkcji lekarstwa przeznaczonego do leczenia IDDM, NIDDM lub innej narządowo swoistej lub narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby układu krwionośnego, wyniszczenia rakowego lub raka, bądź jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny oraz oporność na insulinę jest innym aspektem wynalazku.

PL 204 503 B1

Kolejno, sposób wykrywania naturalnie występującego autoprzeciwciała, obejmujący zetknięcie próbki krwi, osocza lub surowicy, bądź innego płynu ciała, z przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym, bądź równoważnym ligandem według pierwszego aspektu wynalazku oraz z cząsteczkami docelowymi i ocenę ilości rzeczonego naturalnie występującego autoprzeciwciała, które specyficznie wiąże się z cząsteczkami docelowymi. Przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne, bądź równoważny ligand może zostać wyznakowany, na przykład enzymem, tak że wyznakowane przeciwciało lub równoważny ligand współzawodniczy z autoprzeciwciałami o tworzenie kompleksów z cząsteczkami docelowymi. Ilość znacznika związanego w takich kompleksach jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia autoprzeciwciał obecnych w próbce. Jeśli znacznikiem jest enzym, tworzenie kompleksów będzie hamować lub inaktywować aktywność enzymu, tak że stopień inhibicji lub aktywacji jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia autoprzeciwciał obecnych w próbce.

W jednym aspekcie tego rozwiązania wynalazku, cząsteczka docelowa, którą może być na przykład cząsteczka poliklonalnej lub monoklonalnej immunoglobuliny skierowanej przeciw Ve TCR lub jej jakakolwiek część, która rozpoznaje co najmniej jeden epitop łańcuchów Ve receptora komórek T u ludzi lub jakiegokolwiek innego gatunku zwierzęcego, jest związana z enzymem połączonym z substratem, tak że wiązanie przeciwciała z cząsteczkami docelowymi aktywuje enzym i powoduje zmianę barwy, którą można mierzyć spektrofotometrycznie. Cząsteczki docelowe mogą być związane z enzymem, który jest połączony z substratem, i może być obecny na głębokościomierzu zwilżeniowym, który można kontaktować z rzeczoną próbką.

Wynalazek obejmuje także stosowanie przeciwciała lub równoważnego ligandu o reaktywności wobec przeciwciała skierowanego przeciw Ve TCR, bądź peptydu, oligopeptydu, polipeptydu lub białka, które jest wiązane przez przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne lub równoważny ligand o reaktywności wobec przeciwciała skierowanego przeciw ve TCR (na przykład ESRP1) jako składnika zestawu do wykrywania lub oznaczania ilościowego poziomów naturalnie występujących autoprzeciwciał u pacjenta. Taki zestaw będzie przypominać zestaw do oznaczenia radioimmunologicznego lub ELISA i będzie dodatkowo zawierać czynnik zapewniający detekcję, który umożliwia dokładne oznaczenie ilościowe związku będącego przedmiotem zainteresowania. Takie metody będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

Przeciwciało lub równoważny ligand, bądź peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko, które jest wiązane przez przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne lub równoważny ligand, mogą być związane z perełkami magnetycznymi, perełkami agarozowymi lub mogą być zimmobilizowane na dnie wielostudzienkowej płytki. Będzie to umożliwiać usuwanie związków niezwiązanych po inkubacji z próbki. Alternatywnie, białko może być związane z perełkami SPA (Scintillation Proximity Assay, w którym to przypadku nie zachodzi potrzeba usuwania niezwiązanego ligandu. Stosując zestaw niewyznakowanych standardów, wyniki otrzymane dla tych standardów można porównać z wynikami otrzymanymi dla mierzonej próbki.

Przeciwciało lub równoważny ligand o wykazujący reaktywność wobec przeciwciała skierowanego przeciw Ve TCR, bądź peptydu, oligopeptydu, polipeptydu lub białka, które jest wiązane przez przeciwciało lub równoważny ligand wykazujący reaktywność wobec przeciwciała skierowanego przeciw Ve TCR, można również stosować do wykrywania naturalnie występujących autoprzeciwciał w tkance pochodzącej od pacjenta. W takim sposobie wykrywania można stosować jakąkolwiek powszechnie znaną technikę, i może ona obejmować techniki blottingu (Towbin i in., 1979), kolumny wiążące, zatrzymywanie na żelu, chromatografię lub którąkolwiek z innych odpowiednich metod, które są szeroko stosowane w tej dziedzinie.

Wynalazek dotyczy także sekwencji cDNA, RNA lub genomowego DNA, obejmując sekwencję kodującą przeciwciało lub równoważny ligand według pierwszego aspektu wynalazku, bądź sekwencję kodującą peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko według drugiego aspektu wynalazku, do stosowania jako czynnik farmaceutyczny lub diagnostyczny.

W odniesieniu do białka ESRP1, korzystna cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje fragment nukleotydowy identyczny lub komplementarny do którejkolwiek części dowolnej z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurze 7, lub sekwencji, która jest zdgenerowana lub zasadniczo do niej homologiczna, bądź która hybrydyzuje z tą sekwencją. Przez „zasadniczo homologiczne rozumie się sekwencje wykazujące co najmniej 50% homologii sekwencyjnej, korzystnie 60% homologii sekwencyjnej. „Sekwencjami hybrydyzującymi objętymi zakresem wynalazku są te wiążące się w standardowych łagodnych warunkach (6x SSC/50% formamid w temperaturze pokojowej) i przemywane w warunkach o niskiej surowości (2xSSC, temperatura pokojowa lub 2xSSC, temperatura 42°C) lub, koPL 204 503 B1 rzystnie, w standardowych warunkach o wysokiej surowości, np. 0,1xSSC, temperatura 65°, gdzie SSC =0,14M NaCl, 0,015M cytrynian sodowy, pH 7,2).

Sekwencją kwasu nukleinowego według wynalazku może jedno- lub dwuniciowy DNA, cDNA lub RNA. Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje DNA.

Wynalazek obejmuje także wektory klonujące i ekspresyjne zawierające sekwencje DNA według wynalazku. Takie wektory ekspresyjne będą zawierać odpowiednie sekwencje kontrolujące transkrypcję i translację, na przykład elementy wzmacniające, regiony promotor-operator, sekwencje terminalne stop, sekwencje odpowiedzialne za stabilność mRNA, kodony start i stop lub miejsca wiązania rybosomów, połączone w ramce odczytu z cząsteczkami kwasu nukleinowego według wynalazku.

Dodatkowo, w nieobecności naturalnie efektywnego peptydu sygnałowego w sekwencji białka, może być dogodne spowodowanie, aby zrekombinowane białko ulegało sekrecji z określonego gospodarza. A zatem, dalsze składniki takich wektorów mogą obejmować sekwencje kwasów nukleinowych kodujące sygnały wydzielania i odszczepiania peptydu sygnałowego.

Wektory według wynalazku obejmują plazmidy i wirusy (włącznie z bakteriofagami i wirusami organizmów eukariotycznych). Wiele takich wektorów i układów ekspresyjnych jest dobrze znanych i zostało udokumentowanych w nauce. Szczególnie odpowiednie wektory wirusowe obejmują wektory oparte na bakulowirusach, adenowirusach oraz wirusie ospy bydlęcej.

Ekspresja heterologicznych polipeptydów i fragmentów polipeptydów w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli, jest dobrze opracowana w nauce; patrz na przykład Molecular Cloning: a Laboratory Manual, wydanie 2, Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press, lub DNA cloning; a practical approach, Volume II: Expression systems, pod redakcją D.M. Glovara (IRL Press, 1995). Ekspresja w komórkach eukariotycznych w hodowli jest również możliwością dostępną dla specjalistów w tej dziedzinie do wytwarzania białek heterologicznych; patrz na przykład O'Reilly i in., (1994) Baculovirus expression vectors - a laboratory manual (Oxford University Press), lub DNA cloning: a practical approach, Volume IV: Mammalian systems, pod redakcją D. M. Glovera (IRL Press, 1995).

Można wybrać lub skonstruować wektory odpowiednie do ekspresji peptydów lub białek odpowiednich do stosowania według wynalazku, zawierające odpowiednie sekwencje regulujące, włącznie z sekwencjami promotorowymi, sekwencjami terminacji, sekwencjami poliadenylacji, sekwencjami wzmacniającymi, genami markerowymi i innymi sekwencjami, jeśli jest to pożądane. Wektory mogą być plazmidami, wektorami wirusowymi, np. bakteriofagowymi, bądź wektorami fagemidowymi, w zależności od potrzeb. Dla dalszych szczegółów patrz Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Wiele znanych technik i protokołów manipulacji kwasami nukleinowymi, na przykład przygotowywania konstrukcji kwasów nukleinowych, mutagenezy, sekwencjonowania, wprowadzania DNA do komórek oraz ekspresji genów, a także analizy białek, opisano szczegółowo w Short Protocols in Molecular Biology, wydanie drugie, Ausubel i in., red., (John Wiley & Sons, 1992), lub w Protein Engineering: A practical approach (pod redakcją A. R. Reesa i in., IRL Press, 1993). Na przykład, w komórkach eukariotycznych, wektorami z wyboru są wektory oparte na wirusach.

Dalszy aspekt wynalazku zapewnia komórkę gospodarza zawierającą przeciwciało lub równoważny ligand według pierwszego aspektu wynalazku, bądź kodującą peptyd, oligopeptyd, polipeptyd lub białko według drugiego aspektu wynalazku. Jeszcze dalszy aspekt wynalazku zapewnia sposób obejmujący wprowadzanie takiego kwasu nukleinowego do komórki lub organizmu gospodarza. Wprowadzanie kwasu nukleinowego można przeprowadzać jakąkolwiek dostępną techniką. Dla komórek eukariotycznych odpowiednie techniki mogą obejmować transfekcję z wykorzystaniem fosforanu wapniowego, DEAE-dekstranu, elektropolację, transfekcję za pośrednictwem liposomów lub transdukcję z zastosowaniem retrowirusa lub innych wirusów, takich jak wirus ospy bydlęcej lub, dla komórek owadzich, bakulowirus. Dla komórek bakteryjnych odpowiednie mogą obejmować transformację z zastosowaniem chlorku wapniowego, elektropolację lub transfekcję z zastosowaniem bakteriofaga.

Po wprowadzeniu kwasu nukleinowego można powodować lub umożliwiać ekspresję z kwasu nukleinowego, np. przez hodowanie komórek gospodarza w warunkach odpowiednich dla ekspresji genu.

W jednym rozwiązaniu kwas nukleinowy według wynalazku ulega integracji z genomem (np. chromosomem) komórki gospodarza. Integrację można pobudzać przez wprowadzenie sekwencji, które sprzyjają rekombinacji z genomem, zgodnie ze standardowymi technikami.

PL 204 503 B1

Zwierzęta transgeniczne stransformowane tak, aby zachodziła w nich ekspresja lub nadekspresja w linii zarodowej jednego lub więcej opisanych związków wraz ze sposobami ich tworzenia, stanowią dalszy aspekt wynalazku. Obecnie istnieje wiele technik wprowadzania transgenów do zarodka lub linii zarodowej organizmu, takich jak, na przykład, przedstawionych w Watson i in., (1994) Recombinant DNA (wydanie 2), Scientific American Books.

Terapeutyczne implikacje wynalazku oraz zastosowanie do wyjaśnienia pytań pozostających bez odpowiedzi dotyczących cukrzycy

Przedstawione poniżej informacje podano dla przykładu a nie dla ograniczania wynalazku.

Osłabiona kontrregulacja przez glukozę

Głównym problemem w prowadzeniu pacjentów z IDDM jest występowanie hipoglikemii, która może częściowo być jatrogenna w wyniku intensywnego leczenia insuliną, prowadzącego do nieświadomej hipoglikemii, ale przede wszystkim jest wynikiem osłabienia kontrregulacji przez glukozę. Wadliwa kontrregulacja przez glukozę jest wynikiem łącznej niedostatecznej odpowiedzi glukagonu i epinefryny na obniżające się poziomy glukozy. Wykazano, że skrupulatne unikanie hipoglikemii może nie dopuścić do nieświadomej hipoglikemii ale nie odwróci wadliwej kontrregulacji (Cryer, 1995).

Nie tylko długo chorujący ale również świeżo zdiagnozowani pacjenci z IDDM posiadają osłabioną kontrregulację. Porównanie odpowiedzi kontrregulacji u dwudziestorga dzieci ze świeżo zdiagnozowaną IDDM (5-6 dni) oraz 47 dzieci z długo trwającą IDDM ujawniło, że odpowiedzi glukagonu na hipoglikemię w obu grupach były niższe niż u osób kontrolnych. Odpowiedzi epinefryny również były obniżone u nowych pacjentów z IDDM w porównaniu z osobami kontrolnymi (Hoffman i in., 1994).

W wynalazku proponuje się, że przyczyną defektów kontrregulacji jest występowanie przeciwciał skierowanych przeciw autoprzeciwciałom skierowanym przeciw νβ u pacjentów z IDDM, powodująca zmniejszanie ilości opisanych powyżej cząsteczek sygnałowych i zniesienie odpowiedzi komórek alfa oraz komórek rdzenia nadnerczy na obniżające się poziomy glukozy. Jest to zgodne z obserwacją utraty wybarwiania, przeciwciałami skierowanymi przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw νβ, skrawków trzustkowych pochodzących od pacjenta z nowo zdiagnozowaną cukrzycą, który zginął w wypadku (patrz część doświadczalna, str. 68). Jest to również analogiczne do stwierdzenia Bretta i in. (1996), że wynikiem leczenia pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów Campath-1H, który skierowany jest przeciw połączonemu z GPI białku CD52, był, u niektórych leczonych pacjentów, zanik CD52 i innych białek połączonych z GPI zarówno na komórkach T, jak i komórkach B. CD52-negatywne komórki B zanikały w krążeniu w ciągu 3 miesięcy, jednakże, CD52-negatywne komórki T były obecne w ciągu co najmniej 20 miesięcy. Dlatego też, zapobieganie unieśmiertelnieniu tych przeciwciał u pacjentów z IDDM powinno poprawiać defekty kontrregulacji, zapobiegając hipoglikemii. Blokowanie ich powstawania od chwili urodzenia powinno zapobiegać IDDM u podatnych osobników. NIDDM powinna ulegać całkowitemu wyleczeniu. Będzie się to przeprowadzać analogicznie do podawania przeciwciał skierowanych przeciw immunoglobulinom D (skierowanych przeciw IgD) matkom Rh-ujemnym noszącym płody Rh-pozytywne (Davrey, 1979). Możliwe mechanizmy, które uczestniczą w blokowaniu wytwarzania przeciwciał w leczeniu tego rodzaju zostały przedyskutowane przez Heymana (1990). Jak dalej stwierdzono, immunizowanie osobników z patogennymi przeciwciałami powinno prowadzić do powstawania chroniących przeciwciał antyidiotypowych, które następnie tworzą kompleks z przeciwciałami patogennymi jeśli one powstaną.

Nefropatia cukrzycowa

Wpływ cukrzycy typu I na nerki charakteryzuje hipertrofia nabłonka i błony podstawnej kłębuszków nerkowych i kanalików nerkowych oraz akumulacja składników macierzy zewnątrzkomórkowej w mezangium kłębuszków nerkowych (Lane i in., 1990). Postępy choroby prowadzą do zamknięcia światła włośniczek kłębkowych, białkomoczu i utraty zdolności filtracji. W nefropatii cukrzycowej zakłada się udział hiperglikemii oraz wytwarzania TGF-β (transformującego czynnika wzrostowego β). Wysokie stężenia glukozy zwiększają poziomy mRNA i białka TGF-β w hodowlach komórek kanalików mezangialnych i proksymalnych, TGF-β bezpośrednio pośredniczy we wpływie glukozy na wzrost komórkowy i syntezę kolagenu. Wykazano, że podawanie antysurowicy skierowanej przeciw TGF-β hamuje doświadczalne zapalenie kłębuszków nerkowych (Border, 1990).

Jest prawdopodobne, że hiperglikemia indukuje ekspresję TGF-β na wczesnym etapie cukrzycy, potwierdza to fakt, że zarówno w cukrzycy człowieka, jak i modelach BB i NOD, zwiększoną ekspresję TGF-β wykazano w ciągu kilku dni po wystąpieniu hiperglikemii i przerostu nerek (Yamamoto i in., 1993; Sharma i Ziyadeh, 1994).

PL 204 503 B1

Wiązanie TGF-β z jego receptorem jest wspomagane przez błonowy proteoglikan zakotwiczający (β glikan), który prezentuje TGF-β receptorowi sygnałowemu II typu, transbłonowej kinazie serynowo/treoninowej (Lopez-Castillas i in., 1994). Betaglikan posiada region zewnątrzkomórkowy, utracony przez komórki i może wiązać TGF-β, ale nie może go prezentować receptorowi sygnałowemu i w konsekwencji działa jako silny inhibitor jego działania. Betaglikan należy do rodziny białek, która obejmuje uromodulinę i błonową GP-2 trzustkowych ziarnistości wydzielniczych. Wykazano rolę regionu podobnego do uromoduliny w wiązaniu TGF-β (Fukushima i in., 1993).

Podobna do GP-2 cząsteczka komórek α (produkt klonu 5.3), która istnieje w postaciach rozpuszczalnej oraz związanej z błoną, może być jednym z białek uczestniczących w hamowaniu działania TGF-β. Wynikiem zmniejszania ilości tych cząsteczek na skutek przedłużonego działania patogennych przeciwciał może być zniesienie hamowania TGF-β i pobudzanie troficznych właściwości nerki. Podawanie rozpuszczalnych peptydów cząsteczek rozpoznawanych przez patogenne przeciwciała mogłoby posiadać podwójną rolę - hamowania TGF-β i hamowania wytwarzania przeciwciał.

Przeszczepy trzustki

Przeszczepy w coraz większym stopniu przeprowadza się w celu leczenia cukrzycy typu 1 ze skłonnościami do występowania epizodów ciężkiej hipoglikemii. Odgrywają one podwójną rolę uniezależnienia się od insuliny i częściowego przywracania normoglikemii. Jeśli, jednakże, tę procedurę prowadzi się bez przeciwdziałania leżącym u podłoża stanom diabetogennym, problemy z kontrregulacją będą ponownie się pojawiać z każdym kolejnym przypadkiem powstawania patogennych przeciwciał.

W ostatnich badaniach 13 pacjentów z uwieńczonymi powodzeniem przeszczepami trzustki z zastosowaniem techniki z wywoływaniem stopniowych stanów hipoglikemicznych, wykazano, że przywrócone zostały odpowiedzi glukagonu na hipoglikemię. Jednakże, zarówno po głodzeniu, jak i stymulowane poziomy glukagonu były znacząco wyższe u biorców przeszczepów trzustki w porównaniu ze zdrowymi osobnikami kontrolnymi lub biorcami przeszczepów nerki. Ponadto, podwyższone były również poziomy peptydu C w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami (Kendall i in., 1997). Autorzy nie skomentowali tych obserwacji, które przypominają stan przedcukrzycowy. Donieśli oni, jednakże, że odpowiedzi epinefryny na hipoglikemię uległy poprawie u biorców przeszczepów trzustki ale były znacząco niższe niż u zdrowych osobników kontrolnych lub nie chorujących na cukrzycę biorców przeszczepu nerki. Na podstawie tych obserwacji jest oczywiste, że przeszczepy zdrowych trzustek pacjentom z cukrzycą wracają do stanu przedcukrzycowego pod względem odpowiedzi zarówno komórek α, jak i nadnerczy. Potencjalnego biorcę przeszczepu trzustki z cukrzycą trzeba przed przeszczepem leczyć w celu zapobiegania dalszym epizodom wzrostów zmian patogennych przeciwciał dla zapewnienia pełnego ich sukcesu.

Neuropatia autonomicznego układu nerwowego

W długo trwającej cukrzycy mogą występować powikłania ze strony autonomicznego układu autonomicznego, która jest nieodwracalna i odmienna od stanów nieświadomej hipoglikemii (Cryer, 1994; Dagogo-Jack i in., 1993). Wyeliminowanie hipoglikemii poprzez przeszczep trzustki w badaniach Kendalla i in. (1997) poprawiło zarówno odpowiedź epinefryny, jak i rozpoznawanie objawów hipoglikemii pomimo występowania dysfunkcji serca o podłożu autonomicznego układu nerwowego. Przeszczep trzustki nie przywracał jednakże odpowiedzi norepinefryny, która nie występowała u pacjentów z długo trwającą cukrzycą.

Chociaż nie testowano jeszcze reaktywności diabetogennych przeciwciał monoklonalnych wobec ciał komórkowych neuronów w zwojach autonomicznego układu nerwowego przypuszcza się, że rozpoznawane przez nie antygeny mogą również występować na ciałach tych komórek. Wykazano ekspresję unikalnych zestawów białek połączonych z GPI na różnych neuronach w hodowlach pierwotnych. Stwierdzono, że niektóre z nich odpowiadają na różne właściwości otoczenia (Rosen i in., 1992). Cząsteczki takie będą miały podobne właściwości sygnałowe i mogą podlegać podobnym wpływom jak komórki α i komórki rdzenia nadnerczy.

Stwierdzono już, że połączone z GPI białko błonowe, receptor rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF), bierze udział w niektórych postaciach obwodowej neuropatii cukrzycowej. W hiperglikemii indukowanej przez karmienie galaktozą lub traktowanie zwierząt doświadczalnych streptozotocyną, poziomy aktywności podobnej do CNTF w nerwie kulszowym były obniżone po 1-2 miesiącach hiperglikemii. Towarzyszyło temu zmniejszanie poziomu białka ale nie mRNA CNTF. Niedobory CNTF występujące w wyniku uszkodzeń komórek Schwanna mogą przyczyniać się do pewnych funkcjonalnych i strukturalnych zaburzeń w doświadczalnej neuropatii cukrzycowej. Niektóre z tych zaburzeń spowodowane są katalizowanym przez reduktazę aldozową (AR) metabolizmem heksoz i mogą im

PL 204 503 B1 zapobiegać inhibitory AR. Jednakże, niedobór CNTF tylko częściowo ulegał poprawie pod wpływem tych inhibitorów co wskazuje, że inne czynniki niż akumulacja polioli w wyniku aktywności AR uczestniczą w obniżaniu ekspresji CNTF (Mizisin i in, 1997). Wykazuje to, że cząsteczki połączone z GPI mogą odgrywać znaczącą rolę w obwodowej neuropatii cukrzycowej, jak również neuropatii autonomicznego układu nerwowego.

Terapeutyczne implikacje wynalazku i zastosowanie do wyjaśnienia pytań pozostających bez odpowiedzi dotyczących SLE i pierwotnego zespołu związanego z obecnością przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom

Przedstawione poniżej informacje podano dla przykładu a nie w celu ograniczania wynalazku.

Przeciwciała wykazujące specyficzność wobec fosfolipidów anionowych, takich jak kardiolipina, wiążą się z zakrzepicą, nawracającymi poronieniami i małopłytkowością (Harris i in., 1983; Cowchock i in., 1986; Harris i in., 1986). Dotyczy to także przeciwciał związanych z uogólnionym liszajem rumieniowatym (SLE), nazwanych liszajowymi czynnikami przeciwkrzepliwymi, które wykrywa się przez ich częściowy czas tromboplastynowy (Thiagarajan i in., 1980; Love i Santoro, 1990). Wykazano, że wpływ przeciwkrzepliwy spowodowany jest specyficzną reaktywnością tych przeciwciał wobec fosfolipidów anionowych (Sammaritano i in., 1990). Ponadto, pacjenci ze SLE posiadają przeciwciała skierowane przeciw dwuniciowemu DNA (dsDNA), które służą jako markery diagnostyczne SLE (Veinstein i in., 1983). Większość pacjentów z przeciwciałami skierowanymi przeciw fosfolipidom posiada SLE lub zbliżony stan autoimmunologiczny, w niektórych jednakże nie wykrywa się choroby i uważa się ich za posiadających „pierwotny zespół związany z obecnością przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom (PAPS) (Asherson i in., 1989; Branch i in., 1990). W ostatnich latach patogenne znaczenie tych przeciwciał zostało ustalone przez indukowanie poronień u ciężarnych myszy przez bierne przeniesienie ludzkich poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom (Branch i in., 1990). PAPS indukowano również u normalnych myszy przez bierne przeniesienie ludzkich poliklonalnych oraz mysich monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw kardiolipinie (Blan i in., 1991).

Przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i przeciw kardiolipinie występują również w licznych stanach neurologicznych i ich znaczenie podkreślono w ogniskowym niedokrwieniu mózgu, migrenie, pląsawicy, padaczce i innych stanach (Levine i Welch, 1987).

Pochodzenie przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom lub przeciw dsDNA pozostaje dotąd nieznane. Badania w tym względzie skupiały się na właściwościach wiązania ligandu przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom. Poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom pochodzące od pacjentów reagują krzyżowo z większością fosfolipidów anionowych (Lafer i in., 1981; Pengo i in., 1987). Jednakże, zwrócono uwagę na inne ligandy gdy wykazano, że przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z polinukleotydami takimi jak DNA, wiążą się także z kardiolipiną i innymi fosfolipidami anionowymi (Schoenfeld i in., 1983; Rauch i in., 1984; Smeenk i in., 1987). Uważa się, że ta reaktywność krzyżowa spowodowana jest podobieństwem struktury chemicznej DNA i fosfolipidów, które zawierają połączone wiązaniami fosfodiestrowymi grupy fosforanowe, które są rozdzielonymi trzema atomami węgla (Lafer i in., 1981). Kwasy lipotejchowe z bakterii Gram-dodatnich oraz endotoksyna z bakterii Gram-ujemnych również zawierają estry fosforanowe i uważa się, że takie cząsteczki w obcych antygenach mogą wyzwalać tworzenie przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom (Carroll i in., 1985).

Ostatnio wykazano, że powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw dsDNA skorelowane jest z częstymi przypadkami ponownego uaktywniania się wirusa polyoma u niektórych pacjentów z SLE. Jednakże, wysokie miana przeciwciał skierowanych przeciw dsDNA wykrywano również w nieobecności wirusowego DNA (Rekvig i in., 1997).

Wykazano już w opisie, że reaktywności wobec kardiolipiny i przeciw dsDNA wchodzi w zakres specyficzności wiązania przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve TCR (patrz Tablica 3. Dla zapoznania się z metodami patrz część doświadczalna). Jest to zarówno cechą charakterystyczną poliklonalnych przeciwciał z myszy immunizowanych przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw Ve TCR, jak i reagentów skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve TCR pochodzących z takich immunizowanych myszy. Ponadto, rzeczone poliklonalne surowice myszy wywierają silny wpływ przeciwkrzepliwy.

Potencjalny mechanizm patofizjologicznego powstawania przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve TCR już dyskutowano (patrz strona 21). Stosowanie poliklonalnych lub monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve TCR w zapobieganiu ich powstawania lub indukowaniu przeciwciał ochronnych przedstawiono już

PL 204 503 B1 w tym opisie. Takie metody powinny zapobiegać powstawaniu kombinacji patogennych przeciwciał skierowanych przeciw DNA i przeciw fosfolipidom, dając w wyniku złagodzenie chorób powodowanych przez te przeciwciała.

Zastosowanie wynalazku do kolejnych chorób rozregulowania hormonalnego i stanów, w których występują dysfunkcja komórek β lub nadmierne wydzielanie insuliny oraz oporność na insulinę

Jak wskazano uprzednio, przeciwciała skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve wiążą się z komórkami α wysepek i innymi narządami wydzielania wewnętrznego, sugerując, że ich cząsteczki docelowe są zaangażowane w ich mechanizmach wydzielania. Mogłoby to wyjaśnić stwierdzenie, że autoimmunologiczna choroba wydzielania wewnętrznego może wpływać na więcej niż jeden narząd u pojedynczego pacjenta lub mogą występować autoprzeciwciała skierowane przeciw klinicznie „niezaatakowanemu narządowi. Chorobami, które mogą współwystępować są między innymi niedoczynność tarczycy, nadczynność tarczycy (choroba Gravesa), cukrzyca, choroba Addisona, pierwotna niedoczynność gruczołów płciowych, autoimmunologiczne zapalenie żołądka oraz niedokrwistość złośliwa, przy czym profil chorób przypuszczalnie odzwierciedla podatność genetyczną osobnika.

Przedstawione poniżej informacje podano dla przykładu a nie w celu ograniczania wynalazku.

Autoimmunologiczna choroba tarczycy

Występowanie autoimmunologicznej choroby tarczycy jest znacznie częstsze wśród pacjentów z IDDM niż w populacji ogólnej (Payami i Thomson, 1989). W nadczynności tarczycy często obserwuje się nienormalną tolerancję glukozy i zwiększone wytwarzanie glukozy w wątrobie (Wennlund i in., 1986). Przyspieszona glukoneogeneza wskazuje na nadmierne wydzielanie glukagonu, o której Moghetti i in. (1994) donieśli zarówno w stanie podstawowym jak i po infuzji insuliny u 8 świeżo zdiagnozowanych osób z nadczynnością tarczycy. Również procentowe obniżanie poziomów glukagonu po podaniu glukozy lub posiłku jest znacząco niższe wśród pacjentów z nadczynnością tarczycy, niezależnie od tego, czy występuje u nich hiperglikemia czy nie (Kabadi i Eisenstein, 1980; Bech i in., 1996). U osobników z nadczynnością tarczycy rozregulowane jest również wydzielanie insuliny. W różnych stanach takich jak podczas wywołanej hiperglikemii (O'Meara i in., 1993), w stanie na czczo oraz po posiłku (Bech i in., 1996) stężenia immunoreaktywnej insuliny były wyższe u pacjentów nadczynnością tarczycy w porównaniu z kontrolnymi. Wzrost stężenia immunoreaktywnej insuliny odpowiadał za zwiększone wydzielanie proinsuliny. Istnieją również dowody na podwyższone wydzielanie hormonu adenokortykotropowego (ACTH), kortyzolu i hormonu wzrostu w nadczynności tarczycy (Moghetti i in., 1994; Gallangher i in., 1971), co jest zgodne z hipotezą, że do rozregulowywania normalnej kontroli przez ujemne sprzężenie zwrotne wydzielania hormonów dochodzi w wyniku wiązania przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve z docelowymi antygenami na tych narządach. Rozregulowanie wydzielania glukagonu i insuliny w nadczynności tarczycy jest podobne do stanów przedcukrzycowych i cukrzycy, u większości pacjentów z cukrzycą analogicznie występuje zmniejszone nocne wydzielanie TSH (Coiro i in., 1997).

Zespół wielotorbielatowości jajnika (PCOS)

U kobiet z PCOS występuje wzmocniona wczesna odpowiedź insulinowa na podawaną dożylnie glukozę co wskazuje na pierwotne zaburzenia wydzielania insuliny (Holte, 1995). Takie kobiety posiadają wykazują także odpowiedzi hiperglikemiczną i nadmiernego wydzielania insuliny podczas doustnego testu tolerancji na glukozę (OGTT) (Dunaif i in., 1987). Golland i in. (1990) podali jednak, że u kobiety z PCOS występują obniżone odpowiedzi glukagonu pomimo hiperglikemii podczas OGTT. Wskazuje to, że u kobiet z PCOS musi być podwyższony poziom hormonu drugiej linii w kontrregulacji glukozy, tj. epinefryna. Zgodne z tym jest nadmierne wydzielanie androgenów nadnerczy stwierdzane u połowy kobiet z nadmiarem androgenów (Ehrmann i in., 1992). Wpływ adrenaliny na steroidogenezę wykazano zarówno w perfundowanych wyizolowanych nadnerczach, jak i na poziomie molekularnym (Ehrhart-Bornstein i in., 1994; Guse-Behling i in., 1992). Histologiczne wykazanie poprzez wybarwianie immunologiczne komórek kory nadnerczy w całym rdzeniu nadnerczy i odwrotnie potwierdza rolę rdzenia nadnerczy jako regulatora funkcji kory nadnerczy poprzez mechanizm parakrynny (Bornstein i in., 1994). Cząsteczki rozpoznawane przez patogenne przeciwciała opisane w tym wynalazku licznie występują na komórkach rdzenia nadnerczy (Fig. 3). Takie autoprzeciwciała mogą stanowić przyczynę zwiększonego wydzielania adrenaliny powodującego nadmierne wydzielanie androgenów nadnerczy w PCOS.

PL 204 503 B1

Nadmierne wydzielanie androgenów nadnerczy często współwystępuje z nadmiernym wydzielaniem androgenów jajnika, któremu generalnie towarzyszy podwyższenie LH. Nienormalny wzór steroidogenezy w jajnikach można częściowo wyjaśnić nadmierną stymulacją przez LH komórek osłonki pęcherzyka Graafa oraz nadmierną odpowiedzią na GnRH. Insulina oraz insulinopodobne czynniki wzrostowe zwiększają androgenną odpowiedź komórek osłonki pęcherzyka Graafa na LH, poprzez zwiększanie poziomów enzymów determinujących szybkość steroidogenezy w jajnikach oraz indukowanym LH zmniejszaniem ilości tych enzymów (Hernandez i in., 1988; Magoffin i in., 1990). Dlatego zaproponowano, że główną przyczyną rozregulowania pracy jajników jest nadmierne wydzielanie insuliny (Ehrmann i in., 1995).

Nadmierne wydzielanie insuliny wydaje się także odgrywać rolę w nadmiernym wydzielaniu androgenów nadnerczy jednakże nie bezpośrednio a poprzez synergizm ze stymulacją ACTH (Moghetti i in., 1996). Wydzielanie hormonów glikoproteinowych przez przysadkę mózgową jest pulsacyjne i zniszczenie tych pulsów może zmieniać funkcje rozrodcze (Samuels i in., 1990; Santoro i in., 1986). Wykazano, że w hodowlach laktotropów przysadkowych zachodzi ekspresja cząsteczek połączonych z GPI, które ulegają szybkiej hydrolizie pod wpływem traktowania TRH (Benitez i in., 1995). Zahamowanie fosfolipazy C zapobiega działaniu TRH i tworzeniu przekaźników drugiego rzędu (Perez i in., 1997). Wykazano, że zahamowanie aktywności fosfolipazy C zapobiega uwalnianiu ACTH z komórek przedniej części przysadki mózgowej szczura (Won i Orth, 1995). Fosfolipaza C naśladuje również wpływ ACTH (Foster i Veitl, 1995). Villa i in. (1995) donieśli, że akumulacja aldosteronu w komórkach kory nadnerczy hamowana była zależnie od dawki przez inozytolofosfoglikany, co wykazuje regulującą rolę tych cząsteczek. Obserwacje te pokazują daleko sięgające wpływy miejsc blokujących działanie fosfolipazy C przez opisane patogenne autoprzeciwciała skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve.

Otyłość

Nadmierne wydzielanie insuliny jest charakterystyczne zarówno dla otyłości młodzieńczej jak i u dorosłych. Le Stunff i Bougneres (1994) donieśli o 75% wzroście odpowiedzi insuliny na standardowy posiłek u dzieci z długo i z krótko trwającą otyłością, poziomy insuliny na czczo wzrastały wraz z czasem trwania otyłości. Dzieci otyłe przez długi i krótki okres czasu wykazywały również hiperglikemię po teście standardowego posiłku w porównaniu z kontrolami, co jest zgodne z doniesieniem o zwiększonej glukoneogenezie u dzieci otyłych od niedawna (Le Stunff i Bougneres, 1996).

Wykazano, że podwyższone poposiłkowe wydzielanie insuliny występuje u znacznie otyłych kobiet po osiągnięciu normalnej wagi ciała (Fletcher i in., 1986). Dlatego też, nadmierne wydzielanie insuliny wydaje się być głównym zaburzeniem prowadzącym do otyłości. W otyłości u dorosłych nadmiernemu wydzielaniu insuliny towarzyszą także podwyższone poziomy wolnych kwasów tłuszczowych zarówno podczas głodzenia jak i po posiłku (Golay i in., 1986). Podwyższona glukoneogeneza i nadmierne wydzielanie insuliny są prawdopodobnie wynikiem rozregulowanego wydzielania glukagonu w stanie otyłości.

Borghi i in. (1984) podali, że glukoza hamuje w stopniu niedostatecznym wydzielanie glukagonu u osób otyłych. Golland i in. (1990) wykazali, że otyłe kobiety wykazują znacząco większą odpowiedź glukagonu w 60, 90 i 120 minucie po doustnym obciążeniu glukozą niż osoby szczupłe. Obie te obserwacje wykazują brak sygnałów regulujących w trzustkowych komórkach a, analogiczny jak w stanach przedcukrzycowym i cukrzycy.

Zespół Cushinga

Chorobie tej powszechnie towarzyszą nietolerancja glukozy, cukrzyca, centralna otyłość, nadmierne owłosienie oraz podwyższone tętnicze ciśnienie krwi. Główną cechą diagnostyczną jest hiperkortyzolemia, która może być wynikiem długotrwałego nadmiernego wydzielania ACTH u 20-40% pacjentów (Doppman i in., 1988), może to występować przy braku gruczolaka przysadki mózgowej a zwiększone wydzielanie kortyzolu może być spowodowane jednostronnym lub dwustronnym rozrostem kory nadnerczy, z lub bez autonomicznie wydzielających mikro- lub makroguzków (Hermus i in., 1988).

W ostatnich przekrojowych badaniach 90 pacjentów z otyłością i cukrzycą, zapadalność na zespół Cushinga została określona na 3,3% (Leibowitz i in., 1996). Przedkliniczne i subkliniczne przypadki zespołu Cushinga, które występują jako słabo kontrolowana cukrzyca znacząco zwiększają tę liczbę. Donoszono też o analogicznej łagodnej przewlekłej hiperkortyzolemii w cukrzycy typu 1, przejawiającej się przez podwyższony poziom kortyzolu na czczo i wolnego kortyzolu w moczu oraz zwiększoną odpowiedź na owczy hormon uwalniający kortykotropinę (Roy i in., 1993).

PL 204 503 B1

Nadmierne wydzielanie ACTH może występować w nieobecności gruczolaka przysadki mózgowej ale w obecności hiperkortyzolemii (Grant i Liddle, 1960), co sugeruje rozregulowanie normalnej kontroli na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego. Kilka doniesień wskazuje na rolę cząsteczek połączonych z GPI oraz inozytolofosfoglikanów uwalnianych pod wpływem aktywacji fosfolipazy C w regulacji zarówno wydzielania hormonów przysadki mózgowej, jak i stymulowanym przez nie wydzielaniu hormonów z nadnerczy, tarczycy, gruczołów płciowych itp. (Fanjul i in., 1993; Shaver i in., 1993; Villa i in., 1995). Dlatego też, przypuszcza się, że opisane autoprzeciwciała wywierać będą patogenny wpływ w zakresie od niszczenia pulsacyjnego wydzielania hormonów do zahamowanego lub nadmiernego wydzielania a nawet tworzenia nowotworów, ponieważ wykazano również, że przeciwciała skierowane przeciw cząsteczkom połączonym z GPI indukują proliferację komórkową poprzez powodowanie utraty hamowania sygnałów aktywujących (Robinson i Hederer, 1994; Benitez i in., 1995).

Zespół metaboliczny X i choroby układu krążenia

Zespół X jest kombinacją nadmiernego wydzielania insuliny, nietolerancji glukozy, podwyższonych poziomów lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) oraz triglicerydów, obniżonych poziomów lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) oraz nadciśnienia. Zespołowi temu towarzyszy również centralna otyłość. Za pierwotne przyczynowe zaburzenie tego zespołu uważa się oporność na insulinę (Reaven, 1988; Reaven, 1995). Hrnciar i in. (1992) ocenili częstość występowania zespołu X na 5-10% populacji ogólnej, 15-30% pacjentów z nadciśnieniem tętniczym, 65-90% z NIDDM, 10-20% kobiet z nadmiernym owłosieniem oraz 30-50% pacjentów z zawałem serca. Piedrola i in. (1996) podali, że 82,5% z 40 nowo zdiagnozowanych pacjentów z chorobą wień cową wykazywało oporność na insulinę, a 27 z 40 miało nienormalny poziom OGTT. Nadmierne wydzielanie insuliny i oporność na insulinę skorelowane są z poważnymi chorobami naczyń obwodowych wieńcowych i szyjnych (Standl, 1995; Reaven, 1995), a także mają udział w mikronaczyniowej dusznicy bolesnej i indukowanym wysiłkiem niedokrwieniu wieńcowym (Vertergaard i in., 1995).

Dokonując przeglądu 2930 osób pod kątem chorób sercowo-naczyniowych i zespołu X, Ferrannini i in. (1991) podali, że pojedyncze postacie każdego objawu zespołu występowały rzadko ale zawsze były związane z nadmiernym wydzielaniem insuliny, co sugeruje, że jest to cecha o kluczowym znaczeniu dla zespołu. Sowers i in. również sugerowali, że nadmierne wydzielanie insuliny może uczestniczyć w powstawaniu nadciśnienia przez pobudzanie miażdżycy i przebudowy naczyń. Obserwowano, że oporności na insulinę towarzyszy zwiększona grubość ściany tętnicy szyjnej (Suzuki i in., 1996) oraz płytek tętnicy szyjnej (Laakso i in., 1991). Ostatnie prospektywne badania populacyjne Salonena i in. (1998) podtrzymują hipotezę o udziale oporności na insulinę w etiologii nadciśnienia i niewłaściwej lipidemii. Molier i in. (1996) wykazali, że niewielki defekt w mięśniowym przekazywaniu sygnałów za pośrednictwem receptorów insulinowych powodował oporność na insulinę, nadmierne wydzielanie insuliny, otyłość oraz podwyższone poziomy triglicerydów i wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu myszy transgenicznych. W NIDDM biopsje mięśniowe wskazują ogólny niedobór inozytolofosfoglikanu, mediatora działania insuliny (Asplin i in., 1993). Opisane patogenne przeciwciała mogą reagować krzyżowo z takimi mediatorami i indukować oporność na insulinę zarówno przez zmniejszanie ich ilości, a także przez zaburzanie pulsacyjnego wydzielania insuliny.

Choroby wieloukładowe o podłożu immunologicznym

Wykazano również, że nadmierne wydzielanie insuliny i oporność na insulinę mają istotne znaczenie w chorobach wieloukładowych, takich jak liszaj rumieniowaty i postępujące uogólnione stwardnienie. Poziomy insuliny na czczo w surowicach 21 takich pacjentów były dwukrotnie wyższe od poziomów u zdrowych osób kontrolnych i posiadali oni znacząco wyższe poziomy triglicerydów i niższe poziomy cholesterolu HDL (Mateucci i in., 1996).

Rak

Nadmierne wydzielanie insuliny, cukrzycowy wzór tolerancji glukozy, podwyższony poziom HGP i oporność na insulinę towarzyszą wielu rakom, włącznie z rakiem piersi, okrężnicy i odbytnicy, układu pokarmowego, mięsakiem, rakiem śluzówki macicy, gruczołu krokowego, głowy i szyi oraz płuc (Tayek, 1992; Copeland, Leinster i in., 1987; Copeland, Al-Sumidaie i in., 1987; Tayek, 1995; Nagamani i in., 1988). Bruning i in. (1992) wykazali, ż e logarytm wzgl ędnego ryzyka raka piersi jest liniowo zależny od logarytmu poziomów peptydu C.

Było to niezależne od BMI (wskaźnik masy ciała) lub WHR (stosunku talii do bioder); 223 kobiety z etapem I lub etapem II raka piersi były oporne na insulinę i posiadały znacząco wyższe poziomy peptydu C, niż 441 kobiet kontrolnych. W ostatnich badaniach 2569 histologicznie potwierdzonych

PL 204 503 B1 przypadków raka piersi oraz 2588 kobiet kontrolnych również zaobserwowano związek pomiędzy rakiem piersi, późnym wystąpieniem (Talamani i in., 1997).

Bezpośrednią rolę insuliny w pobudzaniu nowotworów wykazano w szczurzym modelu nowotworów okrężnicy (Tran i in., 1996).

Wyniszczenie rakowe również okazało się charakteryzować nietolerancją glukozy, postabsorpcyjną hiperglikemią, zmniejszonym całkowitym zużyciem glukozy przez organizm zgodnym z opornością na insulinę i zwiększeniem obwodowego wytwarzania mleczanu. Stosunek insuliny do glukagonu także jest obniżony, zwiększonym poziomom glukagonu w krążeniu towarzyszy stan powstawania nowotworu (Cersosimo i in., 1991), co jest zgodne z podwyższeniem HGP w wielu rakach. Bartlett i in. (1995) wykazali, że zwiększenie stosunku insulina/glukagon przez leczenie hormonalne selektywnie podtrzymywało anabolizm gospodarza i hamowało kinetyki wzrostu nowotworów w modelu szczurzym. Dlatego też, zapobieganie powstawaniu zaburzeń metabolicznych kompleksu diabetogennego obniżać będzie ilość przypadków raków i łagodzić objawy wyniszczenia rakowego.

Diagnostyczne, profilaktyczne i terapeutyczne zastosowania wynalazku.

Przedstawione poniżej informacje podano dla przykładu a nie w celu ograniczania wynalazku.

Wynalazek stosowany będzie do zapobiegania i leczenia chorób autoimmunologicznych i zbliżonych przez iniekcję farmaceutycznych preparatów monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw vp, bądź równoważnych ligandów, fragmentów peptydowych lub cząsteczek rozpoznawanych przez te przeciwciała oraz funkcjonalnie aktywnych wektorów zawierających sekwencje RNA lub DNA kodujące takie peptydy lub cząsteczki.

Iniekcja przeciwciała będzie przeznaczona do zapobiegania powstawania autoprzeciwciał o takiej samej specyficzności przez hamowanie istniejących komórek B na zasadzie mechanizmu sprzężenia zwrotnego lub przez wywołanie idiotypowej sieci przeciwciał, powodując powstawanie przeciwciał ochronnych (patrz strony 29 i 43). Rozpuszczalne peptydy lub inne cząsteczki docelowe rozpoznawane przez przeciwciała skierowane przeciw patogennym przeciwciałom skierowanym przeciw Ve będą również stosowane do indukowania tolerancji na niską dawkę, specyficznego blokowania już aktywowanych komórek B (patrz strona 29) lub, w większych wstępnie określonych dawkach, do blokowania działania pośredników swoistej nefropatii, takich jak TGF-β (patrz strona 46). Wektory zawierające odpowiednie sekwencje kwasów nukleinowych będzie się również podawać przez iniekcje we wstępnie określonym reżimie w celu umożliwiania długotrwałego wydzielania in vivo rozpuszczalnych produktów, które będą działały jako geny tolerancji. Peptydy, białka i inne cząsteczki, rozpoznawane przez przeciwciała skierowane przeciw patogennym przeciwciałom skierowanym przeciw ve i immunogenom skierowanym przeciw Ve stosowane do wytwarzania tych przeciwciał stosować się będzie do opracowywania zestawów diagnostycznych do wykrywania obecności przeciwciał skierowanych przeciw autoprzeciwciałom skierowanym przeciw ve we krwi, osoczu, surowicy, ślinie lub innych płynach ciała, w celu określenia podatności na chorobę autoimmunologiczną lub jako wskaźnik prognozujący postęp choroby lub skuteczność leczenia.

Różne aspekty i rozwiązania wynalazku zostaną tu opisane bardziej szczegółowo dla przykładu. Powinno być oczywiste, że bez odchodzenia od zakresu wynalazku można dokonywać modyfikacji szczegółów.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Fig. 1. Skrawek normalnej trzustki ludzkiej wybarwiony monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve, wywołany drugim odczynnikiem wyznakowanym fluoresceiną.

Fig. 2. Skrawek normalnej tarczycy ludzkiej wybarwiony monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve, wywołany drugim odczynnikiem wyznakowanym fluoresceiną.

Fig. 3. Skrawek normalnego nadnercza ludzkiego wybarwiony monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve, wywołany drugim odczynnikiem wyznakowanym fluoresceiną.

Fig. 4. Skrawek normalnego jelita ludzkiego wybarwiony monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve, wywołany drugim odczynnikiem wyznakowanym fluoresceiną.

Fig. 5. Wybarwiony przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve i wywołany drugim odczynnikiem wyznakowanym fluoresceiną skrawek trzustki dziecka, które zmarło w momencie diagnozy cukrzycy w wyniku niekontrolowanej kwasicy ketonowej.

PL 204 503 B1

Fig. 6. Sekwencja genu ESRP1.

Fig. 7. Przewidywana sekwencja białka ESRP1.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Poniższe przykłady podano w celu zilustrowania, a nie ograniczania wynalazku.

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych

Myszy immunizowano dootrzewnowo (ip) stosując w tygodniowych odstępach 4 iniekcje 0,1 ml zawierającego przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw przeciwciałom wykazującym specyficzność wobec vβ TCR supernatantu hodowli hybrydomy.

Następnie usunięto śledziony i przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki poddano fuzji z komórkami szpiczaka Sp2, stosując standardowe techniki znane osobom pracującym w tej dziedzinie i dziedzinach pokrewnych. Klony wytwarzające przeciwciała zidentyfikowano w oznaczeniu ELISA, stosując skoniugowane z peroksydazą reagenty skierowane przeciw Ig. Następnie klony przeszukano wobec czynnika immunizującego, dwu- i jednoniciowego DNA oraz fosfolipidów anionowych. Zastosowane metody były standardowymi technikami znanymi osobom pracującym w tej dziedzinie.

Wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom

Giętkie 96-studzienkowe płytki o płaskim dnie (Falcon, Becton-Dickinson) opłaszczano 50 μl roztworów kardiolipiny, fosfatydylocholiny, fosfatydyloseryny o stężeniu 50 nl/ml w etanolu oraz roztworu fosfatydyloinozytolu o stężeniu 50 nl/ml w metanolu (Sigma). Studzienki kontrolne opłaszczano samym rozcieńczalnikiem. Płytki pozostawiano w temperaturze 4°C do chwili odparowania. Niezwiązane miejsca blokowano 0,1% albuminą surowicy ludzkiej (HSA) w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami (PBS). Płytki przemywano PBS zawierającą 0,05% Tween 20 (RTM) i inkubowano z szeregiem kolejnych rozcieńczeń surowic w PBS Tween (RTM) lub zawierających przeciwciała monoklonalne supernatantów hodowli. Po inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C lub przez noc w temperaturze 4°C, płytki ponownie przemywano, jak opisano powyżej i związane przeciwciała wykrywano stosując rozcieńczenie 1:500 biotynylowanego przeciwciała skierowanego przeciw Ig myszy (Amersham International plc), inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, a po odpowiednim przemywaniu inkubowano w ciągu dalszych 30 minut w temperaturze 37°C z rozcieńczeniem 1:500 kompleksu straptawidyna-biotynylowana peroksydaza chrzanowa (Amersham International plc). Jako substrat stosowano o-fenylenodiaminę (Sigma), a barwę odczytywano przy długości fali 450 nm stosując czytnik ELISA Anthos.

Wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciw DNA

Płaskodenne studzienki 96-studzienkowych giętkich płytek opłaszczano najpierw roztworem poli-L-lizyny o stężeniu 50 ng/ml w wodzie poprzez inkubowanie w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Po usunięciu roztworu poli-L-lizyny, do każdej studzienki dodawano 50 nl roztworu jednoniciowego lub dwuniciowego DNA (Sigma) o stężeniu 10 ng/ml w PBS zawierającej 1 mM EDTA i płytki inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano PBS. Pozostające miejsca wiążące blokowano 0,1% HSA w PBS. Płytki przemywano PBS zawierającą 0,05% Tween 20 (RTM) i inkubowano z szeregiem kolejnych rozcieńczeń surowic lub zawierających przeciwciała monoklonalne supernatantów hodowlanych. Wiązanie przeciwciała wykrywano opisanym sposobem dla przeciwciał skierowanych przeciw fosfolipidom.

Testowanie przeciwkrzepliwego wpływu przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw νβ

Testowano antysurowice z kilku wsobnych szczepów myszy immunizowanych różnymi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw Vβ TCR. 5 nl każdej surowicy mieszano z 95 nl silnie odwirowanego normalnego osocza ludzkiego i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny.

Do mieszaniny tej dodawano 100 nl odpowiednio rozcieńczonego jadu żmii Russella (Diagen) i 100 nl rozcieńczonego substytutu płytek krwi (Diagen) i inkubowano w ciągu 30 sekund. Następnie dodawano 100 nl 0,025M CaCl2 i mierzono czas krzepnięcia. Czas krzepnięcia w obecności normalnej surowicy mysiej wynosił około 55 sekund, podczas gdy w obecności rzeczonej surowicy odpornościowej czas krzepnięcia pozostawał w zakresie od 10 do 30 minut. Kontrolna antysurowica mysia nie wydłużała czasu krzepnięcia powyżej tego dla normalnej surowicy mysiej.

Wybarwianie skrawków trzustki chorych na cukrzycę

Skrawki trzustki pochodzące od pacjenta, u którego ostatnio zdiagnozowano cukrzycę insulinozależną, i który zmarł w wyniku wypadku (z przyczyn nie związanych z cukrzycą) i skrawki trzustki pochodzące od normalnych pośmiertnych dawców narządów wybarwiano przeciwciałami monoklinalnymi

PL 204 503 B1 skierowanymi przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Ve. Skrawki normalnej trzustki wykazywały, jak oczekiwano, barwienie wewnątrz wysepek (patrz Fig. 1), ale trzustka chorego na cukrzycę albo nie wybarwiała się w ogóle albo wybarwiała bardzo słabo. Wskazuje to, że u tego pacjenta odpowiednie antygeny komórek α były o znacznie obniżonej ilości lub w ogóle nie funkcjonowały.

W przeciwieństwie do tego, wybarwianie przeciwciałami skierowanymi przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw ve skrawków trzustek trojga dzieci, które zmarły w momencie diagnozy z powodu kwasicy ketonowej, wykazało proliferację pozytywnie wybarwionych komórek poza granicami wysepek (Fig. 5). Mogło to być spowodowane dużymi ilościami autoprzeciwciała reagującego in vivo z białkiem podobnym do białka wiążącego lamininę lub innymi białkami docelowymi, powodującego proliferację i migrację komórek a na zewnątrz wysepek.

Oba opisane powyżej scenariusze mogłyby pasować do zakresu odpowiedzi osobników o różnych skłonnościach genetycznych, prowadzących do powstawania gwałtownej niekontrolowanej kwasicy ketonowej i śmierci lub IDDM u osobników z wrażliwymi komórkami β, i NIDDM u tych z silniejszymi komórkami β.

Wpływ monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw V beta na nienaruszone wysepki ludzkie in vitro

Wydzielone ludzkie wysepki pośmiertnych dawców narządów przemywano podłożem RPMI 1640 zawierającym 10% płodową surowicę cielęcą i hodowano w stężeniu około 200 wysepek na studzienkę w tym samym podłożu w 24-studzienkowych płytkach. Po trzech dniach podłoże ze studzienek z dwukrotnymi powtórzeniami ostrożnie usuwano i przechowywano w temperaturze -20°C. Następnie hodowle w studzienkach kontrolnych prowadzono z samym podłożem i testowano supernatantem z hodowli hybrydomy, zawierającym przeciwciała skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw vp, rozcieńczonym równą objętością świeżego podłoża.

Po 24 godzinach usuwano supernatant z każdej studzienki i przechowywano, jak opisano powyżej, a studzienki ponownie napełniano samym podłożem lub supernatantem z hodowli hybrydomy rozcieńczonym jak powyżej. Powtarzano to codziennie w ciągu 2 tygodni, a wyjątkowo nie usuwano supernatantów podczas weekendu. Po zakończeniu okresu doświadczenia w przechowywanych próbkach mierzono insulinę stosując zestaw do oznaczania insuliny DAKO zgodnie z zaleceniami producenta. Wyniki wykazały, że poziomy insuliny w studzienkach testowych i kontrolnych były prawie identyczne na początku doświadczenia. Po dwudziestu czterech godzinach od dodania przeciwciał, poziom insuliny w studzience testowej wzrósł do znacząco wyższego poziomu niż w studzience kontrolnej. Trzeciego dnia wydzielanie insuliny w studzience zawierającej przeciwciało obniżyło się do około 50% kontroli. Czwartego dnia wydzielanie insuliny w studzience testowej ponownie było wyższe niż w studzience kontrolnej, podczas gdy w piątym dniu poziomy były podobne.

Wyniki podane jako odczyty gęstości optycznej w Tablicy 1 wykazują, że o ile wydzielanie insuliny w studzience kontrolnej było naprawdę stałe w studzience testowej podczas pierwszego tygodnia doświadczenia występowały ostre fluktuacje. Podczas drugiego tygodnia stężenie insuliny w studzience testowej malało i dziesiątego dnia nie można było wykryć żadnej sekrecji, podczas gdy w studzience kontrolnej było dużo powyżej tła odczytu OD.

Chociaż nie przeprowadzono dalszych pomiarów wydzielania w studzienkach kontrolnych, niska szybkość zmniejszania się wydzielania insuliny w studzience kontrolnej wskazuje, że wydzielanie mogło trwać kilka dni dłużej.

T A B L I C A 1

Wpływ monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw vp TCR na wysepki ludzkie in vivo

Dzień	Gęstość optyczna
Test	Kontrola
1	2	3
1	2,117, 2,063	2,042, 1,848
2	2,784, 2,751	2,143, 2,044
3	1,236, 1,057	2,256, 2,240
4	2,513, 2,377	2,124, 2,187
5	2,446, 2,450	2,506, 2,545

PL 204 503 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
8	0,699	1,114
9	0,777	1,049
10	0,585	0,979
11	0,482	0,842

Gęstość optyczną mierzono stosując czytnik płytek Anthos 2001 przy długości fali 450 nm z filtrem odniesienia dla długości fali 650 nm.

Gęstość optyczna podłoża hodowlanego wynosiła 0,532.

Wykazanie obecności naturalnie występujących przeciwciał skierowanych przeciw autoprzeciwciałom skierowanym przeciw νβ w surowicach ludzkich

Przeciwciała skierowanie przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw νβ pochodziły ze śledzion myszy immunizowanych supernatantem hodowlanym linii komórek hybrydom wydzielających przeciwciała skierowane przeciw VβTCR. Wykazano, że te przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw νβ wiążą się z immunogenem skierowanym przeciw νβ w oznaczeniu ELISA, dlatego też badano stosowanie tego czynnika immunizującego jako antygenu do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Vβ w surowicy ludzkiej. Skierowany przeciw νβ immunogen zastosowano do opłaszczania przez noc 96-studzienkowych płytek płaskodennych, niezwiązane miejsca zablokowano surowicami ludzkimi dodanymi do studzienek w rozcieńczeniu 1/30. Po inkubacji w ciągu 2 godzin, płytki przemywano i wiązanie surowicy ludzkiej wykrywano stosując skoniugowane z peroksydazą przeciwciało skierowane przeciw ludzkim Ig.

Tablica 2 przedstawia wyniki dla surowic otrzymanych z trzech dawców w stanie przedcukrzycowym, którzy następnie zachorowali na cukrzycę. Odstępy czasowe pomiędzy próbkami surowicy od trzech dawców były przypadkowe i wykazywały najwyższy poziom autoprzeciwciała jeden rok przed diagnozą. Wzrost wskaźnika wiązania (OD testu/OD kontroli) z 4,4 do 6,1 nastąpił w ciągu 7 miesięcy od pierwszej próbki i obniżył się do 2,9 dwa miesiące przed diagnozą. Wskazuje to na przejściowy charakter tego autoprzeciwciała oraz że nie występuje długotrwale i to prowadzi do rozwoju choroby, ale być może kilka epizodów wzrostu miana w wyniku infekcji wirusowych lub innych, prowadzących do proliferacji limfocytów T i pojawiania się nienormalnych, połączonych z GPI łańcuchów Vβ TCR. Autoprzeciwciała okazały się występować, jednakże, w ciągu co najmniej siedmiu miesięcy do roku, na wysokich poziomach u pacjenta 3. Może to prowadzić do zmniejszenia ilości cząsteczek sygnałowych na komórkach β.

T A B L I C A 2

Przeciwciała skierowane przeciw autoprzeciwciałom skierowanym przeciw νβ TCR występują w surowicach ludzkich

Dawca numer	Surowica data	Diagnoza IDDM data	Gęstość optyczna
testowany antygen	test/ kontrola	kontrola (podłoże)
1	5/1989	1/1991	0,082,	0,080		0,124,	0,134
2	2/1989	1/1993	0,087,	0,076	1,5	0,058,	0,054
6/1989		0,079,	0,074		0,076,	0,063
	5/1987	12/1988	0,074,	0,072	4,4	0,016,	0,017
3	12/1987		0,109,	0,097	6,1	0,016,	0,018
	10/1988		0,060,	0,057	2,9	0,021,	0,019

Testowanym antygenem był supernatant hodowlany monoklonalnej linii komórkowej wytwarzającej przeciwciała skierowane przeciw νβ TCR.

Wskaźnik test/kontrola otrzymano przez podzielenie średniej OD testu przez średnią OD kontroli.

PL 204 503 B1

T A B L I C A 3

Specyficzności wiązania monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw przeciwciałom skierowanym przeciw Vp TCR

Czynnik spłaszczający studzienkę	Gęstość optyczna
Doświadczenie 1	Doświadczenie 2
Przeciwciało skierowane przeciw vp
TCR (immunogen)	0,413	0,399
Podłoże hodowlane
(kontrola)	0,046	0,040
Kardiolipina w etanolu	1,002	0,998
Etanol (kontrola)	0,156	0,126
dsDNA	0,210	0,242
Poli-L-lizyna
(kontrola	0,119	0,129

Gęstość optyczną mierzono stosując czytnik płytek Anthos 2001 przy długości fali 450 nm, z filtrem odniesienia przy długości fali 650 mm.

Przeciwciało skierowane przeciw ve stosowano jako supernatant hodowlany.

Przeszukiwanie biblioteki trzustkowej przeciwciałami monoklonalnymi (MoAb)

Biblioteki w λgt11 posiadają sekwencje DNA wstawione w miejscu EcoR1 i można prowadzić ich ekspresję w postaci białek fuzyjnych pod kontrolą promotora lac. Dlatego też, można je przeszukiwać przeciwciałami.

W tym przypadku, do przeszukania ludzkiej biblioteki trzustkowej w λgt11 (Promega), zastosowano metodę opisaną przez Webstera i in., 1992 (Methods in Molecular Biology, tom 10. Immunochemical protocols. Red. M. Manson. Krótko, szczep bakteryjny Y1090 stransfekowano bakteriofagiem zmieszanym ze stopioną agarozą i wysiano na płytki z podłożem. Zanurzone w agarozie bakterie rosły i wytwarzały ciągłą murawę, z wyjątkiem miejsc, w których fag lizował komórki z utworzeniem łysinek fagowych. Przy odpowiednim rozcieńczeniu faga, każda oddzielna łysinka powstaje z jednego faga infekującego jedną komórkę. Na płytki agarowe nakłada się następnie arkusz membrany nitrocelulozowej (Protran BA85, wielkość porów 0,45 μm, średnica 82 mm, Schleicher i Schuell), którą nasączono izopropylo-e-D-tiogalaktozydem (IPTG), który indukuje gen β-galaktozydazy (w λgt11), do którego wstawiano cDNA w unikalnym miejscu EcoR1. Jeśli cDNA ten znajduje się we właściwej ramce odczytu i właściwej orientacji, wytwarzane będzie białko fuzyjne, które jest wydłużonym na końcu karboksylowym białkiem β-galaktozydazy. Płytki z nałożoną membraną inkubuje się w nieznacznie niższej temperaturze, umożliwiając zwiększenie wytwarzania białek fuzyjnych. Następnie membrany usuwa się i przemywa w celu usunięcia pozostałości komórek bakteryjnych i przeszukuje, jako sondę stosując MaAb, w celu wykrycia klonów cDNA kodujących sekwencje białek, które reagują z przeciwciałami.

W procedurze tej, membrany najpierw inkubowano w roztworze do przemywania (5% mleko w proszku w PBS zawierającym 0,02% Tween (RTM) 20) w ciągu 30 minut, dla zapobiegnięcia niespecyficznego wiązania przeciwciała. Następnie płukano je roztworem do przemywania i umieszczano w szalkach Petri'ego zawierających czyste MoAb i umieszczano na wytrząsarce na 2-3 godziny. Następnie przeciwciało usuwano a membrany płukano w 3 zmianach buforu do przemywania na wytrząsarce w ciągu łącznie 30 minut. Bufor do przemywania następnie usuwano a membrany zanurzano w odpowiednio rozcieńczonej peroksydazie chrzanowej wyznakowanej przeciwciałem skierowanym przeciw immunoglobulinom myszy (Sigma) na 1 godzinę. Następnie usuwano roztwór przeciwciała i membrany płukano 3 zmianami buforu do przemywania w ciągu 30 minut na wytrząsarce. Następnie wykrywano wiązanie przeciwciała stosując odczynniki do ECL (wzmocnionej chemiluminescencji) (Amersham Life Sciences). Mieszano stosowne objętości dwóch odczynników i nakładano na białkową stronę membrany na 1 minutę. Nadmiar odczynnika wykrywającego odsączano a membrany pokrywano folią Sarah i poddawano ekspozycji na błonę autoradiograficzną (Hyperfilm™-ECL) w kasecie. Błony wywoływano i dopasowywano do płytek agarowych zawierających łysinki. Pozytywne łysinki

PL 204 503 B1 pobierano stosując pipety pasteurowskie i przenoszono do 0,5ml roztworu do elucji fagów (SM: 0,1 M NaCl, 0,01 M MgSO₄-7H₂O, 0,05 M zasady Tris, 0,01% w/v żelatyna (ze skóry świni, typ 1), pH doprowadzone do 7,5) zawierającego 50 nl chloroformu jako czynnika konserwującego. Pozytywne łysinki poddawano ponownym przeszukiwaniom, aż wszystkie łysinki na membranie były pozytywne.

Amplifikacja klonów cDNA przez reakcję łańcuchową polimerazy

Osiem klonów cDNA z oczyszczonych łysinek zamplifikowano stosując następującą mieszaninę amplifikacyjną: Taq Plus 10x Low Salt Reaction Buffer (Stratagene), 5 nl dNTP (Pharmacia), każdy o stężeniu 200 nM, startery, zgodnie z kierunkiem transkrypcji i odwrócone w stosunku do kierunku transkrypcji, każdy o stężeniu 25pM (zgodny z kierunkiem transkrypcji: GTA GAC CCA AGC TTT CCT GGA GCA TGT CAG TAT AGG AGG; odwrócony w stosunku do kierunku transkrypcji: CTG CTC GAG CGG CCG CAT GCT AGC GAC CGG CGC TCA GCT GG; Perkin Elmer), polimeraza Taq Plus (Stratagene), 1 jednostka; matryca cDNA, 2 nl, dH2O, do 50 nl.

Polimerazę DNA dodawano podczas preinkubacji w ciągu 7 minut w temperaturze 94°C, tj. stosując „gorący start.

Na mieszaninę reakcyjną nawarstwiano 100 nl oleju mineralnego.

Probówki umieszczano w DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA) zaprogramowanym następująco:

94°C (denaturacja), 1 minuta; 55°C (hybrydyzacja), 2 minuty; 72°C (wydłużanie), 3 minuty; 36 cykli.

Ostatnie wydłużanie trwało 7 minut.

Produkty PCR przechowywano w temperaturze 4°C do czasu analizy.

Analiza produktów PCR

1% żel agarozowy zawierający 0,5 ng/ml bromku etydyny przygotowywano w buforze TAE (zasada Tris, 242 g, lodowaty kwas octowy, 57,1 ml, 0,5 M EDTA (pH 8,0), 100 ml, dH2O do 1000 ml). 10 nl każdego z produktów PCR nakładano w 2 nl buforu do próbek. Po obu stronach produktów PCR nakładano również 2 nl DNA wzorcowego o długości 100 par zasad i 1 kb (Gibco, BRL) dla porównania. Elektroforezę prowadzono przy napięciu 100 V w ciągu 1 godziny. Produkty PCR uwidaczniano w świetle UV i fotografowano stosując film Polaroid (RTM) 667 (Polaroid, St. Albans, Wielka Brytania).

Sekwencjonowanie DNA

Tożsamość produktów PCR sprawdzano przez sekwencjonowanie, stosując gotowy zestaw reakcyjny ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing i sekwenator ABI 373A (Applied Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA).

Mieszanina reakcyjna cykli sekwencjonowania była następująca: gotowa terminacyjna mieszanina reakcyjna - 8 nl, produkty PCR (od 10 do 30 ng/nl), 3-6 nl, starter, 3,2 pM, dH2) do 20 nl, nawarstwione 50 nl lekkiego oleju mineralnego. Probówki umieszczano w DNA Thermal Cycler i inkubowano zgodnie z następującym programem: 96°C w ciągu 30 sekund, 50°C w ciągu 15 sekund, 60°C w ciągu 4 minut, powtarzane przez 25 cykli. 20 nl produktów wydłużania przenoszono do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml i dodawano 21 3M octanu sodowego (pH 4,6) i 50 nl 95% etanolu.

Probówki wytrząsano i umieszczano w lodzie na 10 minut, następnie wirowano przy 13000 obrotach na minutę w ciągu 15-30 minut. Roztwór metanolu usuwano a osad przemywano 75% etanolem. Probówki ponownie wirowano ostrożnie usuwano osad etanolu a osad suszono w wirówce próżniowej.

Przygotowywanie i nakładanie próbek

Wysuszone osady próbek ponownie zawieszano w 6 nl buforu do nakładania 5 objętości dejonizowanego formamidu, 1 objętość Blue Dextran o stężeniu 50 mg/ml w 25 mM EDTA (pH 8,0)). Próbki wytrząsano i wirowano. Następnie ogrzewano je w temperaturze 90°C w ciągu 2 minut i utrzymywano w lodzie do chwili, kiedy były gotowe do nakładania. Próbki nakładano na 6% żel akryloamidowy, poddany preelektroforezie w ciągu 30 minut przy napięciu 1500-2000V. Po nałożeniu prowadzono elektroforezę w ciągu 12 godzin przy napięciu 2000V. Dane sekwencyjne analizowano stosując komputer.

Oczyszczono i zsekwencjonowano osiem klonów cDNA. Jak dyskutowano powyżej, stwierdzono, że klony 1.1, 1.2 i 1.3 kodują białko podobne do sekretograniny 1; klony 3,1, 4,1 i 5,1 kodowały białko podobne do receptora lamininy o masie cząsteczkowej 67 kd; klon 5.2 kodował nową cząsteczkę, którą nazwano ESRPl (białko regulujące wydzielanie wewnętrzna 1). Sekwencję ESRPl podano na Fig. 7, a kodowaną przez nią przewidywaną sekwencję aminokwasową przedstawiono na Fig. 6.

PL 204 503 B1

Klonowanie cDNA w eukariotycznym wektorze ekspresyjnym (pCR™3-Uni, Invitrogen)

Dokonano tego stosując Unidirectional Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen). Przeprowadzony w postać liniową pCR™3-Uni nie posiada 5'-końcowej grupy fosforanowej na lewym ramieniu, i dlatego też będzie ulegał ligacji jedynie z produktami PCR posiadającymi 5'-końcowy fosforan. Dlatego też, zgodny z kierunkiem transkrypcji starter zastosowany do amplifikacji cDNA poddano fosforylacji przed reakcją ligacji: w jałowej probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml delikatnie zmieszano zgodny z kierunkiem transkrypcji starter PCR (50-100 pM), 0,5-1 μg, 10x bufor do kinazy, 1 gl, 10 mM ATP, 1 gl, jałowa woda, do 9 gl, kinaza polinukleotydowa T4 (10 jednostek/gl), 1 gl, i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 30-40 minut oraz w temperaturze 94°C w ciągu 5 minut, a następnie umieszczano w lodzie. Ufosforylowany starter zgodny z kierunkiem transkrypcji stosowano następnie bezpośrednio do przygotowania produktu PCR, jak opisano uprzednio, i 10 gl produktu PCR poddawano analizie w żelu agarozowym.

Mieszanina do reakcji ligacji zawierała: świeży produkt PCR (około 10 ng), 0,5-1,0 gl, jałowa woda, 5,0-5,5 gl, 10x bufor do ligacji, 1 gl, wektor pCR™3-Uni (60 ng), 2 gl, ligaza DNA T4, 1 gl. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 14°C w ciągu 4 godzin lub przez noc.

Ligacyjnymi mieszaninami reakcyjnymi transformowano komórki Top 10F' (One Shot). Komórki One Shot rozmrażano w lodzie i do naczynek dodawano 2 gl 0,5 M β-merkaptoetanolu.

Komórki mieszano z 1-2 gl ligacyjnej mieszaniny reakcyjnej i inkubowano w lodzie w ciągu 30 minut. Następnie komórki poddawano szokowi termicznemu w temperaturze 42°C w ciągu dokładnie 30 sekund. Następnie do naczynek dodawano 450 gl podłoża SOC. Naczynka inkubowano następnie na boku w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny przy 225 obrotach na minutę w inkubatorze. Stransformowane komórki wysiewano na płytki LB z ampicyliną i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Transformanty pobrano i hodowano w celu wyizolowania plazmidów.

Oczyszczanie plazmidów

Stransformowane komórki Top 10F' hodowano w bulionie LB zawierającym ampicylinę i plazmidowy DNA oczyszczano stosując zestawy Wizard Miniprep (Promega) lub Endotoxin Free Plasmid Kit (Quiagen) do otrzymywania ultra-czystego DNA. Plazmidowy DNA analizowano pod kątem obecności i orientacji wstawki przez PCR i sekwencjonowanie.

Literatura:

Ammala, C, Ashcroft, F.M. i Rorsman, P. (1993). Nature 363, 356-358.

Asherson, R.A., Khamashta, M.A., Ordi-Ros,J., Derksen, R.H.W.M., Machin. S.J., Barquinero,J.,Outt. H.H., Harris, E.N., Vilardell-Torres,M. i Hughes. G.R.V.(1989). Medicine (Baltimore)

68:366-374.

Asplin. I., Galasko. G. i Lamer, J. (1993).Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5924-5928.

Barrou, Z., Seaquist, E.R. i Robertson. R.P.(1994). Diabetes 43, 661-666.

Barsky, S.H., Rao.C.N., Hyams. D. i Liotta, L.A. (1984). Breast Cancer Res.Treat. 4, 181-188.

Bartiett D.L., Charland S.L.. Torosian M.H. (1995). Surgery 118:87-97.

Bech K.. Damsbo P., Eldrup E., Bech-Nielson,H., Roder M.E., Hartling S.G.. Volund A. i Madsbad S. (1996). Clin. Endocrinol. 44:59-66.

Bell. L.M., Solomon, K.R., Gold, J.P. 1 Tan K-N. (1994). J.Biol.Chem. 269, 22758-22763.

Bendelac, A., Camaud, C, Boitard, C. i Bach, J.F. (1987). J.Exp.Med. 166. 823-832

Benedum, U.M.. Lamoureux, A.. Konecki. D.S., Rosa, P., Hillie. A.. Baeuerle. P.A.,

Frank. R., Lottspeich. F.. Mallet, J. i Huttner, W.B. (1987). EMBO J. 6, 1203-1211.

Benitez L., Fanjul L.F., Ruiz de Galarreta CM., Quintana Aguiar J., Gonzalez Reyes J., Hernandez I., Santana Delgado P., Cabrera Oliva J., Alonso Solis R. i Estevez Rosas I.(1995). Neuroscience Lett. 187:37-40.

Bergsten, P. (1995). Am.J.Physiol. 268, E282-287.

Bergsten, P., Grapengiesser, F., Gylfe, E., Tengholm, A. i Hellman, B. (1994). J. Biol.Chem. 269, 8749-8753.

Blank. M.. Cohen. J.. Toder. V. i Schoenfeld,Y. (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88.3069-3073.

Border. W.A., Okuda, S., Languino, L.R., Spom M.B. i Ruoslahti, E. (1990). Nature 346.371-374.

Borghi V.C., Wajchenberg B.L. i Cesar F.P. (1984). Metabolism 33:1068-1074.

Bornstein S.R., Gonzalez-Hernandez J.A., Ehrhart-Bornstein M., Adler G. i Scherbaum W.A. (1994). J.Clin. Endocrinol. Metab. 78: 225-232.

PL 204 503 B1

Bork. P. i Sander, C. (1992). FEBS Lett. 300,237-240.

Bougneres. P.F.. Carel, J.C.. Castano, L., Boitard, C. Gardin. J.P., Landais. P.. Ilors, J..Mihatsch. M.J.. Paillard, M.. Chaussain, J.L. i Bach. J.F. (1988). N.Eng.J.Med.318, 663-670.

Boyd. A.E. III. (1992). J.Cell.Biochem. 48,234-241.

Branch. D.W., Dudley, D.J., Mitchell, M.D., Creighton, K.A., Abbot,T.M..Hammond, E.H. i Daynes.R.A. (1990). Am. J. Obstet. Gynecol. 163,210-215.

Brand. C.L., Jorgensen, P.N., Knigge, U., Warberg, J., Svendsen, I.. Kristensen. J.S. i Hoist.

J.J. (1995). Am.J.Physiol. 269 (Endocrinol. Metab.) 32,E 469-477.

Brett, S.S.. Baxter, G.. Cooper, H., Rowan, W.. Regan, T., Tite, J. i Rapson, N.(1996).Int. Immunol. 8. 325-334.

BruningP.F., Boonfrer J.M., vanNoord P.A., Hart A.A., deJong-Bakkar M.,Nooijen W.J.(1992). Int.J. Cancer. 52:511-516.

Carroll. P., Stafford, D., Schwartz, S. i Stollar, B.D. (1985). J.Immunol. 135. 1086-1090.

Castano, L. i Eisenbarth, G.S. (1990). Ann. Rev. Immuol. 8, 647-680.

Cersosimo E., Pisters P.W. Pesola G., Rogatko A., Vydelingum N.A., Bajorunas D., Brennan M.F. (1991). Surgery 109: 459-467.

Chan. B.L. Lisanti.M.P., Rodriguez-Boulan, E. i Saltiel. A.R. (1988). Science 1670-1672.

Chen. M., Tempst, P. i Yanker, B.A. (1992). J.Neurochem. 58, 1691-1697.

Coiro V.,Volpi R., Marchesi C, Capretti L., Speronti G., Caffarri G. i Chiodera P.(1997). Clin. Endocrinol. 47:305-310.

Copeland G.P., AJ-Sumidaie A.M., Leinster S.J., Davis J.C., Hipkin L.H. (1987). Eur J.Surg.

Oncol. 13: 11-16.

Copeland G.P., Leinster S.J., Davis J.C., Hipkin L.J.(1987). Br. J. Surg. 74: 1031-1035. Cowchock, F.S.. Smith, J.B. 1 GociakB. (1986). Am. J. Obstet. Gynecol. 155,1002-1010.

Cryer. P.E. (1995). Proc. Assoc. Am. Physicians 107, 67-70.

Cryer, P.E. (1994). Diabetes 43,1378-1389.

Dagogo-Jack, S., Craft, S.. Cryer P. (1993). J.Clin.Invest. 91, 819-828.

Davey, M.G. (1979). Vox. Sang. 36, 50-64.

Deeney, J.T., Cunningham. B.A., Cliheda, S., Bokvist, K., Juntti-Berggren. L., Lam, K.,Korchak. H.M.. Corkey. B.E. i Berggren, P.O. (1996). J. Biol.Chem. 271. 18154-18160.

Dittie, A. and Kern, H.E. (1992). Eur.J.Cell.Biol.58,243-258.

Doppman J.L., Miller D.L., Dwyer A.J. el al. (1988). Radiology 166:347-352.

Dunaif A., Graf M., Mandeli J., Laumas V. i Dobrjaansky A. (1987). J. Clin. Endocrinol. Metab.

65:499-507.

Dunaif A., Segal K.R., Futterweitt W. i Dobrjansky A. (1989). Diabetes 38:1165-1174. Ehrhart-Bornstien M., Bornstein S.R., Guse-Behling H..Stromeyer H.G.. Rasmussen T.N.,

Scherbaum W.A. Adler G. i Holst J.J. (1994). Neuroendocrinol. 59:406-412.

Ehrmann D.A., Rosenfield R.L., Barnes R.B., Brigell D.F. i Sheikh Z. (1992). N. Engl. J. Med.

327: 157-162.

Ehrmann D.A., Barnes R.B. i Rosenfield R.L. (1995). Endocr. Rev. 16: 322-353.

Fanjul L.F., Marrero I., Estevez F.,Gonzalez J., Quintana J., Santana P.. Ruiz de Galarreta CM.

(1993). J. Cell. Physiol. 155:273-281.

Ferrannini E., Haffner S.M., Mitchell B.D. i Stern M.P. (1991).Diabetologia 34:416-422.

Fletcher J.M., McNurlan M.A.. McHardy K.C (1989). Eur. J. Clin. Nutr. 43: 539-545.

Forss-Petter, S., Danielson, P., Battenberg, E., Bloom, F. i Sutcliffe, J.G. (1989).J.

Mol.Neurosci. 1,63-75.

Foster R.H. Veitl S.. (1995). Gen. Pharmacol. 26:955-959.

Fukushima, D., Butzow, R., Hildebrand, A. i Ruoslahti, E. (1993). J.Biol.Chem.268, 22710-22715. Gallagher T.F.. Hellman L., Finkelstein J.,Yoshida K..Weitzman E.D., Roffwang H.D. and Fukushima D.K. (1971). J. Endocrinol. Metab. 43:919-927.

Gepts, W. (1995). Diabetes 14, 619-663.

Giovannucci E. (1995). Cancer Causes Control. 6:164-179.

Golay A., Swislocki L.M., Chen Y.-D.I., Jaspan J.B. i Reaven M. (1986). J. Clin. Endocrionol.

Metab. 63:481-484.

Golland I.M., Vaughan Williams. Shalet S.M., Laing I. i Elstein M. (1990). Clin. Endocrinol.

33:645-651.

PL 204 503 B1

Grant W. i Liddle M.D, (1960). J.Clin.Endocrinol. Metab. 20:1539-1560.

Guillausseau. P.J. (1994). Diabete Metab. 20.325-329.

Guse-Behling H., Ehrhart-Bornstein M:, Bornstein S.R., Waterman M.R..Scherabaum W.A. i Adler G. (1992). J. Endocrinol. 135:229-237.

Harris. E.N., Gharavi,A.N, Boey, M.L. Patel, S., Macworth-Young.C.G. i Hughes, G.R.V.(1983).

Lancet ii,1211-1214.

Harris. E.N.. Chan. J.K.H., Asherson R.A. Aber, V.R.. Gharavi,A.E. i Hughes.E.R.V. (1986).

Arch. Intern. Med. 146,2153-2156.

Hashimoto K.. Nishioka T., Tokao T., Numata Y. (1993). Endoer. J. 40:705-709.

Haskins. K. i McDuffie, M. (1992). Science 249, 1433-1436.

Hermus A.R., Pieters G.F., Smals A.G. et. al. (1988). N.Engl. J. Med. 318:1539-1560. Hernandez E.R.. Ressnick Cc.Holtzclaw W.D., Payne D.E., Adler E.Y. (1988). Endocrinol.

122:2034-2040.

Heyman. B. (1990). Immunology Today 11,310-313.

Hogan J.C. (1997) Nature Biotech. 15, 328-330.

Holte J.. Bergh T. Berne C, Wide L. i Lithell H. (1995). J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:2586-2593. Hinek. A. (1994). Cell. Adhesion i Communication 2, 185-193.

Hoffman, R.P., Arslanian, S., Drash, A L. i Becker, D.J. (1994). J. Pediatr.Endocrinol. 7,235-244. Hoops. T.C., Ivanov, I., Cui, Z., Colomer-Gould, V. i Rindler, M.J. (1993). J. Biol. Chem.

268,25694-25705.

Howell. S.L., Green. I.C.. i Montague W. (1973). Biochem J. 136, 343-349.

Hrnciar J., Hrnciarova M., Jakubikova K., Okapcova J. (1992). Vntr. Lek. 38:427-437.

Kabadi V.M. i Eisenstein A.B. (1980). J. Clin. Endocrinol. Metab. 50: 392-396.

Kendall, D.M., Rooney, D.P., Smets, Y.F.C.. Bolding, L. S. i Robertson. R. P.( 1997). Diabetes

46, 249-257.

Kirshner M.A., Zucker I.R., Jesperson D. (1976). N. Engl. J. Med. 294:637-640.

Kleinbaum, J. i Shamoon, H. (1983). Diabetes 32,493-498.

Laakso M. et al, (1991) Aterioscler. Thromb. 11: 1068-1076.

Lafer, E.M. Rauch,J.. Andrezejewski Jr C, Mudd,D. Furie,B. Schwartz. R.S. i Stollal.D. ! 1981).

J.Exp. Med. 153, 897-910.

Laine, J., Pelletier. G., Peng, M. i Le Bel, D. (1996). J. Histochem. i Cytochem., 44.481-499. Landowski. T. H.. Dratz. E.A. i Starkey, J.R. (1995). Biochemistry 34, 11276-11287.

Landowski, T.H. . i Uthayakumar, S. (1995). Clin. Exp. Metastasis 13, 357-372.

Lane, P.H., Steffes, M.W. i Mauer, S.H. (1990). Semin. Nephrol., 10, 254-259.

Leahy. J.L. (1990). Diabetes Care. 13, 992-1010.

Leibowitz G., Tsur A., Chayen S.D.., Salameh M.,Raz I., Cerasi E. i Gross D.J. (1996). Clin.

Endocrinol. 44:717-722.

Le Stunff C. i Bougneres P. (1994). Diabetes:696-702.

Le Stunff C.L. i Bougneres P.F. (1996). Am.J. Physiol. 271 :E814-820.

Levine, S.R. i Welch,K.M.A. (1987). Arch. Neurol. 44,876-883.

Lopez-Casillas, F., Payne, H.M., Andres, J.L. i Massague, J. (1994). J. Cell. Biol., 24, 557-568. Love, P.E. i Santoro, S.A. (1990). Ann. Intern. Med. 112,682-698.

Ludvigsson, J. i Heding, L. (1982). Acta Diabetol Lat., 19, 351-358.

Magoffin D.A., Kurtz K.M.. Erickson G. F. (1990). Mol. Endrocrinol. 4:489-494.

Marchetti, P., Scharp, D.W., McLear, M., Gingerich, R., Finke, E.. Olack. B.. Swanson, C, Giannarelli, R., Navalesi, R. i Lacy, P.E. (1994). Diabetes, 43. 827-830.

Massia, S.P., Rao S.S. i Hubbell, J.A. (1993). J. Biol. Chem., 268, 8053-8059.

Matteucci E., Migliorini P., Bertoni C., Dolcher M.P., Marchini B., Giampietro O.(1996).

Clin.Rheumatol. 15: 20-24.

Mizisin, A.P., Calcutt, N.A., DiStefano, P.S., Acheson, A. i Longo, F.M. (1997). Diabetes, 46,

647-652.

Moghetti P., Castello R., Negri C., Tosi F., Spiazzi G.G., Brun E., Balducci R. Toscano

V.,Muggeo M. (1996). J. Clin. EndocrinoI.Metab. 81:881-886.

Moghetti P., Castello R.. Tosi F., Zenti M. G.M., Magnani C. Bolner A.. Perobelli L.Muggeo M.

(1994). J. Clin. Endocrinol. Metab. 78:169-173.

PL 204 503 B1

Moller D.E., Chang P.Y., Yaspelkis B.B3rd., Flier J.S., Wallberg-Henriksson H., Ivy J.L. (1996). Endocrinology. 137:2397-2405.

Nagamani M., Hannigan E.V., Dinh T.V., Stuart, C.A. (1988). J. Clin. Endocrinol. Metab. 67:144-148. Nijpels, G., Popp-Snijders, C., Kostense, P.J., Bouter, L.M. i Heine, R.J. (1996). Diabetologia,

39, 113-118.

Ohneda, A., Kobayashi, T., Nihei, J., Tochino, Y., Kanaya, H. i Makino, S. (1984).Diabetologia 27,460-463.

O'Meara N.M., Blackman J.D., Sturis J., Polonsky K.S. (1993). J. Clin. Endocrinol. Metab.76:79-84.

Payami H., Thongon G. (1989). Genet. Epidemiol. 6:137-141

Pengo,V., Thiagarajan,P., Shapiro,S.S. i Heine M.J. (1987). Blood 70,69-76.

Perez F.R., Casabiel X., Camina J.P., Zugaza J.L. Casanueva F.F. (1997). Endocrinol.

138:264-272.

Piedrola G., Novo E., Serrano-Gotarredona J., Escobar-Morreale H.F., Villa E.. Luna J.D.. Garcia-Robles R. (1996). J. Hypertens 14:1477-1482.

Powers. A.C., Prochazka, M., Naggert, J., Leiter, E.H. i i Eisenbarth, E.S. (1993). J. Clin. Invest. 92,359-371.

Pimenta, W., Korythowski, M., Mitrakou, A., Jenssen, T., Yki-Jarvinen, H.. Evron,W., Dailey, G. i Gerich, J. (1995). JAMA 273,1855-1861.

Pimplikar. S.W. . i Huttner, W.B. (1992). J. Biol. Chem. 267,4110-4118.

Pipeleers, D.G., Schuit, F.C., in't Veld, P.A., Maes, E., Hooge-Peters, E.C., Van de Winkel. Mil Gepts, W. (1985). Endocrinology 117, 824-833.

Porksen, N.. Munn. S., Steers, J.. Vore. S., Veldhuis, J. i Butler. P. (1995). Am. J. Physiol. 269, E478-488.

Prentki. M. i Matschinsky, F.M. (1987). Physiol. Rev. 67, 1185-1249.

Rassmussen, H., Zawasich, K.S., Ganessan, S., Calle, R. i Zawalich, W.S.(1990). Diabetes Care 13. 655-666.

Rauch, J. Tannenbaum, H.,Stoller,B.D. i Schwartz R.S. (1984). Eur. J. Immunol. 14, 529-534. Reaven G.M. (1995). Physiol. Rev. 75:473-486.

Reaven G.M. (1988). Diabetes 37: 1595-1607.

Reinke M., Nieke J., Krestin G.P., Saeger W., Allolio B., Winkelmann W. (1992). J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 826-832.

Rekvig, O.P., Moens,U., Sundsfjord, A., Bredholt,G., Osei,A., Haaheim, H., Traavik,T.,Arnesen,E. i Haga, H.-J. (1997). J. Clin. Invest. Pp,2045-2054.

Robinson P. i Hederer R. (1994). Braz. J. Med. Biol. Res. 27: 263-267.

Roder, M.E., Knip, M, Hartling, S.G., Karjalainen. J., Akerblorn. K., Binder, C. i the Childhood Diabetes in Finland Study Group. J. Clin. Endocrinol. Metab. (1994). 79, 1570-1575.

Roep. B. O. (1996). Diabetes 45, 1147-1156.

Roep, B. O., DeVries, R.R.P. (1992). Eur. J. Clin. Invest. 22, 697-771.

Rosen. C.L., Lisanti, M.P. i Salazer, J.L. (1992). J. Cell. Biol. 117, 617-627.

Rosenfield R.L (1996). J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:878-880.

Roy M.S., Roy A., Gallucci W.T., Collier B., Young K., Kamilaris T.C., Chrousos G.P. (1993). Metabolism 42:696-700.

Salonen et al., (1998) Diabetes 47: 270-275.

Sammaritano, L.R., Gharavi, A.E., i Lockshin M.D. (1990). Semin. Arthritis Rheum. 20.81-96. Samuels M.H., Veldhuis J.D., Henry P., Ridgway E.C. (1990). J. Clin. Endocrinol. Metab.

71:432-452.

Santoro N., Filiconi M., Crowley W.F. (1986). Endoer. Rev. 7:11-23.

Schoenfeld.Y., Rauch,J, Massicotte,H.. Datta,S.K, Andre-Schwartz. J., Stollar.B.D. ' Schwartz,R.S. (1983). N. Engl. J. Med. 308,414-420.

Schuit, F.C. i Pipeleers, D.G. (1985). Endocrinology 117, 834-840.

Serreze, D.V., Chapman, H.D., Varnum, D.S., Hanson, M.S., Reifsnyder, P.C.Richard. S.D., Fleming, S.A., Leiter, E.H. i Schultz, D.C. (1996). J. Exp. Med. 184. 2049-2053.

Sharma, K.,Ziyadeh, F.N. (1994). Am. J. Physiol. 267, F1094-1101.

Shaver J.K., Tezrlman S., Siperstein A.E., Duh Q.Y., Clark O.H. (1993). Surgery 114:1064-1069. Shenoy-Scaria, A.M., Kwong, J., Fujita, T., Olszowy, M.W., Shaw, A.S. i Lublin, D.M. (1992). J.

Immunol. 149, 3535-3541.

PL 204 503 B1

Shimada, A., Charlton, B., Taylor-Edwards, C. i Fathman, C.G. (1996). Diabetes 45, 1063-1067. Sibley, R., Sutherland, D.E.R., Goetz, F. i Michael, A.F. (1985). Lab. Invest. 53, 132-144. Smeenk, R.J.J., Lucasson W.A.M. i Swaak, T.J.G. (1987). Arthritis Rheum. 30,607-617. Sodoyez. J.L i Pipeleers, D.G. (1985). Endocrinology 117,841-848.

Sonnenberg, G.E.. Hoffman, R.G., Johnson, CP. i Kissebah, A.H. (1992). J. Clin. Invest. 90, 545-553.

Soriani. M. i Freiburghaus A.U. (1996). Int. J. Biochem. Cell. Biol. 28, 683-695.

Sowers et al (1993) Am J. Hypertens. 7:772-788.

Standi E. (1995). Clin. Invest. Med. 18:261-266.

Storch. M.J., Rossle, M. i Kerp, C. (1993). Dtsch. Med. Wochenschr. 118, 134-138.

Suzuki et al (1996) Hypertension 28: 592-598.

Talamini R., Franceschi S., Favero A., Negri E., Parazzini F., La Vecchia C. (11997). Br. J. Cancer 75:1699-1703.

Tayek J.A. (1992). J.Am. Coll.Nutr. 11:445-456.

Tayek J.A. (1995). J. Am.Coll.Nutr. 14:341-348.

Thiagarajan, P., Shapiro, S.S. i Marco, L.D. (1980).

J.Clin. Invest. 66,397-405.

Tisch.R., i McDevittH.( 1996). Cell 85:291-297.

Towbin, H., Staeholin, T. i Gordon, J. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Tran T.T., Medline A., Bruce W.R. (1996). Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 5:1013-1015. Udenfriend, S. i Kodukula, K. (1995). Ann. Rev. Biochem. 64, 563-591.

Van Schravendijk, F.H., Forriers, A., Hoghe-Peters, E.L., Rogiers, V., De Meyts, P.,

Veinstein, A., BordwelI,B., Stone,B., Tibbetts, C. i . Rothfield, N.F. (1983). Am. J. Med. 74,206-216. Vestergaard H.,Skott P., Steffensen R., Wroblewski H., Pedersen O.' Kastrup J. (1995). Metabolism 44:876-882.

Villa M.C., Cozza E.N., Lima C, Ramirez M.I., De Lederkremer R.M. (1995). Cell.Signal. 73:331-339. Wennlund A., Felig P., Hagenfeldt L., Wahren J. (1986). J. Clin. Endocrinol. Metab. 65:174-180. Westerlund. J. Gylfe E.,. i Bergsten,P. (1997). J.Clin..Invest. 100:2547-2551.

Won J.G., Orth D.N. (1995). Endocrinology 136: 5399-5408.

Yamamoto, T., Nakamura, T., Noble, N.A., Ruoslahti, E. i Border, W.A. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1814-1818.

Claims (35)

1. Przeciwciało lub jego fragment, znamienne tym, że wykazuje zdolność wiązania przeciwciała Vβ skierowanego przeciw receptorowi (TCR) komórek T oraz dowolnego z następujących związków: fosfolipid, glikan fosfolipidu, jednoniciowe DNA i dwuniciowe DNA.

2. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że fosfolipid stanowi fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna lub kardiolipina (diacyloglicerol).

3. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada zdolność wiązania z jednym lub więcej spośród ludzkich komórek wysepek trzustkowych, komórek pęcherzykowych tarczycy, komórek rdzenia nadnerczy, żołądka i układu jelitowego, gruczołów ślinowych, mięśnia prążkowanego i tkanki łącznej.

4. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiąże się z przeciwciałem anti-TCR Vβ ze stałą dysocjacji 10^-4 M lub mniejszą.

5. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 4, znamienne tym, że to przeciwciało lub jego fragment wiąże się z przeciwciałem anti-TCR Vβ ze stałą dysocjacji 10^-7 M lub mniejszą.

6. Przeciwciało według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że stanowi przeciwciało monoklonalne.

7. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że pochodzi z kręgowców lub bezkręgowców.

8. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że pochodzi z otrzymanych od ludzi lub od zwierząt, zdrowych lub chorych, komórek B unieśmiertelnionych przez transformację wirusem Epsteina-Barra lub inną metodą.

PL 204 503 B1

9. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że jest izolowane przez przepuszczanie płynów ciała pochodzących od ludzi lub od zwierząt, przez kolumnę ze skoniugowanym antygenem.

10. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 9, znamienne tym, że zwierzęta lub ludzie, z których jest izolowane, są immunizowani antygenem, są chorzy lub poddano ich manipulacjom lekiem bądź dietą tak, że rozwinęła się u nich choroba.

11. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że posiada cząsteczkę efektorową lub reporterową.

12. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że jest zmodyfikowane chemicznie, związane z substancją biologiczną lub chemiczną, bądź jest skoniugowane z enzymem, związkiem wskaźnikowym, lekiem, toksyną lub znacznikiem radioaktywnym.

13. Kompozycja, zawierająca przeciwciało lub jego fragment określony w zastrz. 1 do stosowania jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny, znamienna tym, że zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

14. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu określonego w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu IDDM, NIDDM lub narządowo swoistej albo narządowo nieswoistej choroby auto-immunologicznej, choroby sercowo-naczyniowej, wyniszczenia rakowego, raka lub jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny bądź oporność na insulinę.

15. Polipeptyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję ESRP1 określoną SEQ ID NO:2.

16. Polipeptyd jak określono w zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny.

17. Zastosowanie peptydu określonego w zastrz. 15 do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy typu IDDM, NIDDM lub narządowo swoistej bądź narządowo nieswoistej choroby autoimmunologicznej, choroby sercowo-naczyniowej, wyniszczenia rakowego, raka lub jakiejkolwiek innej choroby, w której występują przeciwciała skierowane przeciw fosfolipidom i/lub nadmierne wydzielanie insuliny bądź oporność na insulinę.

18. Białko, znamienne tym, że zawiera sekwencję ESRP1 wskazaną w SEQ ID NO:2.

19. Białko jak określono w zastrz. 18, znamienny tym, że stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny.

20. Sekwencja cDNA, znamienna tym, że posiada sekwencję kodującą ESRP1 jak przedstawia SEQ ID NO:1.

21. Klon bakteriofaga, znamienny tym, że posiada sekwencję cDNA jak określono w zastrz. 20.

22. Klon bakteriofaga według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny.

23. Biologicznie funkcjonalny plazmid lub wektor wirusowy, znamienny tym, że obejmuje sekwencje cDNA jak określono w zastrz. 20.

24. Biologicznie funkcjonalny plazmid lub wektor wirusowy według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się go jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny.

25. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest stabilnie stransformowana lub stransfekowana plazmidem lub wektorem, jak określono w zastrz. 23.

26. Komórka gospodarza, według zastrz. 25, znamienna tym, że stosuje się ją jako środek farmaceutyczny lub diagnostyczny.

27. Sposób wykrywania naturalnie występujących auto-przeciwciał wykazujących zdolność wiązania zarówno przeciwciała Ve skierowanego przeciw receptorowi (TCR) komórek T jak i epitopu łącznika glikozylofosfatydyloinozytolu GPI, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym kontaktuje się próbkę płynu ciała z docelową cząsteczką wybraną spośród przeciwciała anti-TCR Ve lub jego fragmentu, który posiada zdolność wiązania epitopu na łańcuchu TCR Ve; łączonego GPI łańcucha TCR Ve; fosfolipidu takiego jak fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, kardiolipina; glikanu fosfolipidu; jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA, białka podobnego do sekretograniny 1, białka 67kD podobnego do receptora lamininy, białka regulującego wydzielanie wewnętrzne 1 (ESRP1); białka podobnego do ludzkiego białka błonowego ziarnistości zymogenu GP-2, po czym szacuje się ilość naturalnie występującego autoprzeciwciała wiążącego się specyficznie do cząsteczki docelowej.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że próbką płynu ciała jest próbka krwi, osocza lub surowicy.

PL 204 503 B1

29. Sposób wykrywania naturalnie występującego auto-przeciwciała wykazującego zdolność wiązania zarówno przeciwciała Ve skierowanego przeciw receptorowi (TCR) komórek T, jak i epitopu łącznika glikozylofosfatydyloinozytolu GPI, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę płynu ciała z przeciwciałem lub jego fragmentem z zastrz. 1 i z docelowymi cząsteczkami oraz określa się ilość naturalnie występującego auto-przeciwciała, która wiąże się specyficznie z cząsteczkami docelowymi, przy czym cząsteczka docelowa jest wybrana spośród grupy obejmującej przeciwciało anti-TCR Ve lub jego fragment, który posiada zdolność wiązania epitopu na łańcuchu TCR Ve; łączony GPI łańcuch TCR Ve; fosfolipid taki jak fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna lub kardiolipina; glikan fosfolipidu; jednoniciowy DNA, dwuniciowy DNA, białko podobne do sekretograniny 1, białko 67kD podobne do receptora lamininy, białko regulujące wydzielanie wewnętrzne 1 (ESRP1) oraz białko podobne do ludzkiego białka błonowego ziarnistości zymogenu GP-2.

30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że próbką płynu ciała jest próbka krwi, osocza lub surowicy.

31. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało lub jego fragment skoniugowane ze znacznikiem radioaktywnym jak określono w zastrz. 12, i tak wyznakowane przeciwciało lub jego fragment współzawodniczą z autoprzeciwciałami o cząsteczki docelowe, tworząc kompleksy, przy czym ilość związanego znacznika jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia autoprzeciwciał obecnych w próbce.

32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało lub jego fragment wyznakowane enzymem tak, że utworzenie kompleksów hamuje lub inaktywuje aktywność enzymu, a tym samym stopień hamowania lub aktywacji jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia autoprzeciwciał obecnych w próbce.

33. Sposób według zastrz. 29 albo 30, znamienny tym, że stosuje się cząsteczki docelowe związane z enzymem połączonym z substratem tak, że wiązanie przeciwciała z cząsteczką docelową aktywuje enzym i powoduje zmianę barwy, którą mierzy się spektrofotometrycznie.

34. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że stosuje się cząsteczki docelowe związane z enzymem połączonym z substratem i umieszczone na głębokościomierzu zwilżeniowym, który kontaktuje się z próbką.

35. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że stosuje się cząsteczki docelowe związane z enzymem połączonym z substratem i umieszczone na głębokościomierzu zwilżeniowym, który kontaktuje się z próbką.