ES2677478T3 - Conjugados de copolímero - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de polímero que comprende una unidad recurrente de fórmula (I), una unidad recurrente de fórmula (II) y una unidad recurrente de fórmula (III):**Fórmula** en las que: cada A1 y cada A2 son independientemente oxígeno o NR5, en el que R5 es hidrógeno o alquilo C1-4; cada R1 y cada R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio, un metal alcalino y un compuesto que comprende un fármaco anticancerígeno, siempre que al menos uno de R1 y R2 sea un compuesto que comprende un fármaco anticancerígeno; cada R3 y cada R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio y un metal alcalino; y cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION
Conjugados de copoKmero Campo
Esta solicitud se refiere en general a poUmeros solubles en agua biocompatibles con grupos funcionales colgantes y a metodos para fabricarlos, y particularmente a conjugados de copolfmero de poliglutamato-aminoacido utiles para una variedad de aplicaciones de administracion de farmacos, por ejemplo, anticancengenas.
Descripcion
Se ha usado una variedad de sistemas para la administracion de farmacos. Por ejemplo, tales sistemas incluyen capsulas, liposomas, micropartmulas, nanopartmulas y polfmeros. Varios sistemas biodegradables a base de poliester se han caracterizado y estudiado. Poli(acido lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA) y sus copolfmeros poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA) son algunos de los biomateriales mejor caracterizados con respecto al diseno y rendimiento para aplicaciones para administracion de farmacos. Veanse Uhrich, K.E.; et al, Chem. Rev. (1999) 99:3181-3198 y Panyam J. et al., Adv Drug Deliv Rev. (2003) 55:329-47. Tambien se han investigado sistemas biodegradables basados en poliortoesteres. Vease Heller, J. et al., Adv. Drug Del. Rev. (2002) 54:1015-1039. Adicionalmente, se han investigado sistemas de polianlddrido. Tales polianlddridos son normalmente biocompatibles y pueden degradarse in vivo para dar compuestos relativamente no toxicos que se eliminan del cuerpo como metabolitos. Vease Kumar, N. et al., Adv. Drug Del. Rev. (2002) 54:889-91.
Los polfmeros a base de aminoacidos se han considerado como una posible fuente de nuevos biomateriales. Se han investigado poliaminoacidos que tienen buena biocompatibilidad para administrar compuestos de bajo peso molecular. Se ha identificado un numero relativamente pequeno de poli(acidos glutamicos) y copolfmeros como materiales candidatos para la administracion de farmacos. Vease Bourke, S.L. et al., Adv. Drug Del. Rev. (2003) 55:447-466.
Los polipeptidos, protemas terapeuticas y farmacos anticancengenos hidrofobos administrados padecen a menudo una escasa biodisponibilidad. Tal escasa biodisponibilidad puede deberse a la incompatibilidad de las disoluciones bifasicas de farmacos hidrofobos y disoluciones acuosas y/o la rapida eliminacion de estas moleculas de la circulacion sangumea mediante degradacion enzimatica. Una tecnica para aumentar la eficacia de las protemas administradas y otros agentes de molecula pequena conlleva conjugar el agente administrado con un polfmero, tal como una molecula de polietilenglicol (“PEG”), que puede proporcionar proteccion frente a la degradacion enzimatica in vivo. Tal “pegilacion” a menudo mejora el tiempo de circulacion y, por tanto, la biodisponibilidad de un agente administrado.
Sin embargo, el PEG tiene desventajas en determinados aspectos. Por ejemplo, debido a que el PEG es un polfmero lineal, la proteccion esterica proporcionada por PEG es limitada, en comparacion con polfmeros ramificados. Otra desventaja de PEG es que es generalmente propenso a la derivatizacion en sus dos extremos terminales. Esto limita el numero de otras moleculas funcionales (por ejemplo, las utiles para la administracion de protemas o farmacos a tejidos espedficos) que pueden conjugarse con PEG.
El poli(acido glutamico) (PGA) es otro polfmero de eleccion para solubilizar farmacos anticancengenos hidrofobos. Se han notificado algunos farmacos anticancengenos conjugados con PGA. Vease Chun Li. Adv. Drug Del. Rev, (2002) 54:695-713. Sin embargo, ninguno de estos polfmeros de PGA esta actualmente aprobado por la FDA.
El paclitaxel, extrafdo de la corteza del arbol tejo del padfico (Wani et al., J Am Chem Soc. (1971) 93:2325-7), es un farmaco aprobado por la FDA para el tratamiento de cancer de ovario y cancer de mama. Sin embargo, como otros farmacos anticancengenos, el paclitaxel padece una escasa biodisponibilidad debido a su hidrofobicidad e insolubilidad en disolucion acuosa. Un modo para solubilizar el paclitaxel es formularlo en una mezcla de Cremophor-EL y etanol deshidratado (1:1, v/v) (Sparreboom et al., Cancer Research (1999) 59: 1454-1457). Esta formulacion se comercializa actualmente como Taxol® (Bristol-Myers Squibb). Otro metodo de solubilizacion de paclitaxel es mediante emulsionamiento usando homogeneizacion a alta cizalladura (Constantinides et al., Pharmaceutical Research (2000) 17:175-182). Se han adelantado conjugados de polfmero-paclitaxel en varios ensayos clmicos (Ruth Duncan, Nature Reviews Drug Discovery (2003) 2:347-360). El paclitaxel se ha formulado en nanopartmulas con protema albumina humana, que se ha usado en estudios clmicos (Damascelli et al., Cancer. (2001) 92:2592-602, e Ibrahim et al., Clin Cancer Res. (2002) 8: 1038-44). Esta formulacion se comercializa actualmente como Abraxane® (American Pharmaceutical Partners, Inc.).
Sumario
Los farmacos relativamente hidrofobos (tales como determinados polipeptidos, protemas terapeuticas y farmacos anticancengenos hidrofobos) padecen a menudo una escasa biodisponibilidad. Se cree que este problema se debe al menos en parte a la escasa solubilidad de estos farmacos en sistemas acuosos. Determinados farmacos
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degradables enzimaticamente tambien padecen escasa biodisponibilidad debido a que se degradan relativamente rapido en el sistema circulatorio, dando como resultado una rapida eliminacion del cuerpo. Adicionalmente, no se ha optimizado la liberacion controlada de paclitaxel a partir de un conjugado de polfmero.
Los inventores han descubierto una serie de copoKmeros de aminoacidos-poliglutamato novedosos que pueden conjugarse con farmacos, incluyendo farmacos anticancengenos, as^ como un modo para proporcionar una liberacion controlada de los farmacos a traves de la incorporacion de unidades de glutamina, leucina y/o alanina en los conjugados de polfmero. En algunas realizaciones, los conjugados de polfmero se acumulan preferentemente en determinados tejidos (por ejemplo, tejidos tumorales) y/o determinados receptores, y por tanto son utiles para administrar farmacos a partes espedficas del cuerpo (por ejemplo, farmacos anticancengenos a tumores). En algunas realizaciones, los conjugados de polfmero forman nanopartmulas que pueden solubilizar eficazmente el agente anticancengeno en un sistema acuoso dispersandolo a nivel molecular, y aumentando de ese modo la funcionalidad y/o biodisponibilidad.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a un conjugado de polfmero que puede incluir una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III), en las que: cada A1 y A2 pueden ser independientemente oxfgeno o NR5, en el que R5 puede ser hidrogeno o alquilo C1-4; y cada R1 y R2 puede seleccionarse independientemente de hidrogeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio, un metal alcalino y un compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno; siempre que al menos uno de R1 y R2 sea un compuesto que comprende un farmaco anticancengeno; y cada R3 y cada R4 puede seleccionarse independientemente de hidrogeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio y un metal alcalino, y R6 puede ser un grupo derivado de aminoacido. En algunas realizaciones, R6 puede seleccionarse independientemente de:
y
Otras realizaciones descritas en el presente documento se refieren a una composicion farmaceutica que puede incluir uno o mas conjugados de polfmero descritos en el presente documento, y que pueden incluir ademas al menos uno seleccionado de un excipiente, un portadory un diluyente farmaceuticamente aceptables.
Estas y otras realizaciones se describen en mayor detalle a continuacion.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 ilustra un esquema de reaccion para la preparacion de copolfmero de poli(L-glutamato)-poli(L-y-glutamil- glutamina).
La figura 2 muestra un grafico que ilustra la degradacion de poli(acido L-glutamico) (PGA) en presencia de enzima papama a pH = 6,2 y 5,0.
La figura 3 muestra un grafico que ilustra la degradacion de varios copolfmeros de poli(L-glutamato)-poli(L-y-glutamil- glutamina) con y sin enzima papama y PGA con enzima papama.
La figura 4 ilustra un esquema de reaccion para la preparacion de conjugado de poli(L-y-glutamil-glutamina)- paclitaxel (PTX).
La figura 5 ilustra un esquema de reaccion para la preparacion de conjugado de poli(L-glutamina)-poli(L-y-glutamil- glutamina)-PTX.
La figura 6 ilustra un esquema de reaccion para la preparacion de conjugado de poli(L-leucina)-poli(L-y-glutamil- glutamina)-PTX y un esquema de reaccion para la preparacion de conjugado de poli(L-alanina)-poli(L-y-glutamil- glutamina)-PTX.
La figura 7 ilustra un esquema de reaccion para la preparacion de conjugado de poli(L-leucina)-poli(L-y-glutamil- glutamina)-PTX y conjugado de poli(L-alanina)-poli(L-y-glutamil-glutamina)-PTX.
La figura 8 muestra un grafico que ilustra la liberacion de paclitaxel de varios conjugados de poli(L-glutamina)-poli(L- y-glutamil-glutamina)-PTX que tienen cantidades variables de unidades recurrentes de poli(L-glutamina) y el 20% en peso de PTX en plasma humano al 20%-solucion salina tamponada con fosfato (PBS) a 37°C.
La figura 9 muestra un grafico que ilustra la liberacion de paclitaxel de varios conjugados de poli(L-glutamina)-poli(L-
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Y-glutamil-glutamina)-PTX con pesos moleculares promedios en peso variables, el 20% en moles de unidades recurrentes de poli(L-glutamina) y el 20% en peso de PTX en plasma humano al 20% en PBS a 37°C.
La figura 10 muestra un grafico que ilustra la liberacion de paclitaxel a partir de varios conjugados de poli(L-leucina)- poli(L-Y-glutamil-glutamina)-PTX y conjugados de poli(L-alanina)-poli(L-Y-glutamil-glutamina)-PTX con cantidades variables de unidades recurrentes de poli(L-leucina) y poli(L-alanina), respectivamente, y el 20% en peso de PTX en plasma humano al 20% en PBS a 37°C.
La figura 11 muestra un grafico que ilustra el porcentaje de cambio de volumen tumoral tras la inyeccion con un conjugado de poli(L-glutamina)-poli(L-y-glutamil-glutamina)-PTX que tiene el 20% en peso de unidades recurrentes de poli(L-glutamina), el 20% en peso de PTX (dosificacion de 355 mpk, 267 mpk o 200 mpk (mpk es miligramo/kg)) o el control de veldculo.
La figura 12 muestra un grafico que ilustra el volumen tumoral a lo largo de varios dfas tras la administracion de un conjugado de poli(L-glutamina)-poli(L-y-glutamil-glutamina)-PTX que tiene el 20% en peso de unidades recurrentes de poli(L-glutamina), el 20% en peso de PTX (dosificacion de 355 mpk, 267 mpk o 200 mpk (mpk es miligramo/kg)) o el control de veldculo.
Descripcion detallada
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para un termino en el presente documento, prevalecen aquellas especificadas en esta seccion a menos que se establezca otra cosa.
El termino “ester” se usa en el presente documento en su sentido habitual, y por tanto incluye un resto qmmico con formula -(R)n-COOR', en donde R y R' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a traves de un carbono del anillo) y compuesto heteroalidclico (unido a traves de un carbono del anillo), y en donde n es 0 o 1.
El termino “amida” se usa en el presente documento en su sentido habitual, y por tanto incluye un resto qmmico con formula -(R)n-C(O)NHR' o -(R)n-NHC(O)R', en donde R y R' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (unido a traves de un carbono del anillo) y compuesto heteroalidclico (unido a traves de un carbono del anillo), y en donde n es 0 o 1. Una amida puede incluirse en una molecula de aminoacido o peptido unida a una molecula de farmaco tal como se describe en el presente documento, formando de ese modo un profarmaco.
Cualquier cadena lateral de amina, hidroxilo o carboxilo en los compuestos divulgados en el presente documento puede esterificarse o amidarse. Los procedimientos y grupos espedficos que van a usarse para lograr este fin los conocen los expertos en la tecnica y pueden encontrarse facilmente en fuentes de referencia tales como Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1999.
Tal como se usa en el presente documento, “alquilo” se refiere a una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que comprende un grupo hidrocarburo completamente saturado (sin dobles o triples enlaces). El grupo alquilo puede tener de 1 a 20 atomos de carbono (siempre que aparezca en el presente documento, un intervalo numerico tal como “de 1 a 20” se refiere a cada numero entero en el intervalo dado; por ejemplo, “de 1 a 20 atomos de carbono” significa que el grupo alquilo puede consistir en 1 atomo de carbono, 2 atomos de carbono, 3 atomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 20 atomos de carbono, aunque la presente definicion tambien cubre el caso del termino “alquilo” en donde no se designa ningun intervalo numerico). El grupo alquilo puede ser tambien un alquilo de tamano medio que tiene de 1 a 10 atomos de carbono. El grupo alquilo podna ser tambien un alquilo inferior que tiene de 1 a 5 atomos de carbono. El grupo alquilo de los compuestos puede designarse como “alquilo C1-C4” o designaciones similares. A modo de ejemplo solo, “alquilo C1-C4” indica que hay de uno a cuatro atomos de carbono en la cadena de alquilo, es decir, la cadena de alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y t-butilo. Los grupos alquilo tfpicos incluyen, pero no se limitan de ningun modo a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo y hexilo.
El grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido. Cuando esta sustituido, el/los grupo(s) sustituyente(s) es/son uno o mas grupos seleccionados individual e independientemente de alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo, heteroaralquilo, (heteroaliciclil)alquilo, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, ariloxilo, acilo, ester, mercapto, alquiltio, ariltio, ciano, halogeno, carbonilo, tiocarbonilo, O- carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C- carboxilo, C-carboxilo protegido, O-carboxilo, isocianato, tiocianato, isotiocianato, nitro, sililo, sulfenilo, sulfinilo, sulfonilo, haloalquilo (por ejemplo, mono, di y tri-haloalquilo), haloalcoxilo (por ejemplo, mono, di y tri-haloalcoxilo), trihalometanosulfonilo, trihalometanosulfonamido y amino, incluyendo grupos amino mono y disustituidos, y los derivados protegidos de los mismos. Siempre que se describa un sustituyente como “opcionalmente sustituido”, ese sustituyente puede estar sustituido con uno de los sustituyentes anteriores.
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Tal como se usa en el presente documento, “arilo” se refiere a un sistema de anillos aromaticos monodclico o multidclico carbodclico (todo de carbono) que tiene un sistema de electrones pi completamente deslocalizados. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, benceno, naftaleno y azuleno. Un grupo arilo de esta invencion puede estar sustituido o no sustituido. Cuando esta sustituido, se reemplazan atomos de hidrogeno por grupo(s) sustituyente(s) que es/son uno o mas grupos seleccionados independientemente de alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo, heteroaralquilo, (heteroaliciclil)alquilo, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, ariloxilo, acilo, ester, mercapto, ciano, halogeno, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N- sulfonamido, C-carboxilo, C-carboxilo protegido, O-carboxilo, isocianato, tiocianato, isotiocianato, nitro, sililo, sulfenilo, sulfinilo, sulfonilo, haloalquilo, haloalcoxilo, trihalometanosulfonilo, trihalometanosulfonamido y amino, incluyendo grupos amino mono y disustituidos, y los derivados protegidos de los mismos, a menos que se indiquen los grupos sustituyentes de otro modo.
El conjugado de polfmero puede contener uno o mas atomos de carbono quirales. El carbono quiral (que puede estar indicado por un asterisco *) puede tener la configuracion rectus (a mano derecha) o la configuracion sinister (a mano izquierda), y por tanto la unidad recurrente puede ser racemica, enantiomerica o estar enriquecida enantiomericamente. Los sfmbolos “n” y “*” (que designa un carbono quiral), tal como se usan en otra parte en el presente documento, tienen el mismo significado que se especifico anteriormente, a menos que se establezca otra cosa.
Se entiende que, en cualquier compuesto descrito en el presente documento que tiene uno o mas centros quirales, si no se indica expresamente una estereoqmmica absoluta, entonces cada centro puede ser independientemente de configuracion R o configuracion S o una mezcla de las mismas. Por tanto, los compuestos proporcionados en el presente documento pueden ser enantiomericamente puros o ser mezclas estereoisomericas. Ademas, se entiende que, en cualquier compuesto descrito en el presente documento que tiene uno o mas dobles enlaces que generan isomeros geometricos que pueden definirse como E o Z, cada doble enlace puede ser independientemente E o Z o una mezcla de los mismos. Asimismo, tambien se pretende que todas las formas tautomericas esten incluidas.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a un conjugado de polfmero que puede incluir una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III):
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en las que: cada A1 y A2 puede ser independientemente oxfgeno o NR5, en el que R5 puede ser hidrogeno o alquilo C1-4; y cada R1 y R2 puede seleccionarse independientemente de hidrogeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio, un metal alcalino y un compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno; siempre que al menos uno de R1 y R2 sea un compuesto que comprende un farmaco anticancengeno; y cada R3 y cada R4 puede seleccionarse independientemente de hidrogeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio y un metal alcalino, y R6 puede ser un grupo derivado de aminoacido. En algunas realizaciones, R6 puede seleccionarse

<, H O

CH2-C—CH3 ||
cH3 <Lh -f—ch2-ch2—c—nh2

independientemente de: • 3 • y ’ •
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En algunas realizaciones, la formula (I) puede ser
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y la formula (II) puede ser
En algunas realizaciones, la unidad recurrente de formula (III) puede ser
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En
otras realizaciones, la unidad recurrente de formula (III) puede ser
imagen7
En todavfa otras realizaciones,
imagen8
En algunas realizaciones, el otro de R1 y R2 puede
cada R3 y cada R4 puede ser un metal alcalino. Los ejemplos de metal alcalino adecuado
la unidad recurrente de formula (III) puede_ ser ser un metal alcalino
incluyen litio (Li), sodio (Na), potasio (K), rubidio (Rb) y cesio (Cs) En algunas realizaciones, el metal alcalino puede ser sodio. Los expertos en la tecnica comprenden que cuando A1, A2, A3 y A4 son oxfgeno, el otro de R1 y R2 puede ser un metal alcalino, cada R3 y cada R4 puede ser un metal alcalino, y las formulas (I) y (II) pueden ser unidades de glutamato. En otras realizaciones, el otro de R1 y R2 puede ser hidrogeno, y cada R3 y cada R4 puede ser hidrogeno. Los expertos en la tecnica comprenden que cuando A1, A2, A3 y A4 son oxfgeno, el otro de R1 y R2 puede ser hidrogeno, cada R3 y cada R4 puede ser hidrogeno, y las formulas (I) y (II) pueden ser unidades glutamicas.
La cantidad de un farmaco anticancengeno presente en el conjugado de polfmero puede variar a lo largo de un amplio intervalo. En algunas realizaciones, el conjugado de polfmero puede incluir una cantidad del farmaco anticancengeno en el intervalo del 1% al 50% (peso/peso) basandose en la razon en masa del farmaco anticancengeno con respecto al conjugado de polfmero. En otras realizaciones, el conjugado de polfmero puede incluir una cantidad del farmaco anticancengeno en el intervalo al 5% al 40% (peso/peso) basandose en la razon en masa del farmaco anticancengeno con respecto al conjugado de polfmero. En todavfa otras realizaciones, el conjugado de polfmero puede incluir una cantidad del farmaco anticancengeno en el intervalo del 10% al 30% (peso/peso). En todavfa aun otras realizaciones, el conjugado de polfmero puede incluir una cantidad del farmaco anticancengeno en el intervalo del 1% al 10% (peso/peso), del 1% al 5% (peso/peso), del 5% al 10% (peso/peso), del 10% al 20% (peso/peso), del 15% al 35% (peso/peso), del 30% al 40% (peso/peso), basandose en la razon en masa del farmaco anticancengeno con respecto al conjugado de polfmero. En algunas realizaciones, el conjugado de polfmero puede incluir una cantidad del farmaco anticancengeno del 20% (peso/peso) basandose en la razon en masa del farmaco anticancengeno con respecto al conjugado de polfmero. En otras realizaciones, el conjugado de polfmero puede incluir una cantidad del farmaco anticancengeno del 5% (peso/peso), el 10% (peso/peso), el 15%
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(peso/peso), el 25% (peso/peso), el 30% (peso/peso) basandose en la razon en masa del farmaco anticancengeno con respecto al conjugado de poUmero.
Ahora se ha encontrado que la cantidad del farmaco anticancengeno y las cantidades en porcentaje de las unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) pueden seleccionarse para controlar ventajosamente la solubilidad del conjugado de polfmero resultante. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, la cantidad del/de los agente(s) y las cantidades en porcentaje de las unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) se seleccionan de modo que el conjugado de polfmero sea soluble (o insoluble) a un pH y/o intervalo de pH particular de interes. En algunas realizaciones, el peso molecular del polfmero tambien se selecciona para controlar la solubilidad. Los ejemplos proporcionados a continuacion ilustran el control sobre la solubilidad (asf como comportamiento de degradacion) mediante la seleccion apropiada de la cantidad del farmaco anticancengeno, las cantidades en porcentaje de las unidades recurrentes de formula (I), formula (II), formula (III) y el peso molecular. Los expertos en la tecnica, informados por la orientacion proporcionada en el presente documento, pueden usar experimentacion de rutina para identificar las cantidades adecuadas del farmaco anticancengeno y las cantidades en porcentaje de las unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) que dan como resultado un conjugado de polfmero con caractensticas de solubilidad deseadas. Tal control sobre la solubilidad puede ser ventajoso, dependiendo de la aplicacion. Por ejemplo, las realizaciones de los conjugados de polfmero proporcionados en el presente documento pueden usarse para proporcionar una administracion mejorada de farmacos anticancengenos de otro modo escasamente solubles a tejidos seleccionados, preferiblemente reduciendo efectos secundarios no deseados, y/o pueden reducir la frecuencia con la que un sujeto necesita tomar el farmaco anticancengeno.
La cantidad del farmaco anticancengeno y las cantidades en porcentaje de las unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) se seleccionan preferiblemente para proporcionar una solubilidad del conjugado de polfmero que es mayor que la de un conjugado de poli(acido glutamico) comparable que comprende sustancialmente la misma cantidad del mismo farmaco anticancengeno. En algunas realizaciones, la solubilidad del conjugado de polfmero es mayor que la de un conjugado de poli(acido glutamico) comparable. La solubilidad se mide formando una disolucion de conjugado de polfmero que comprende al menos 5 mg/ml del conjugado de polfmero en NaCl acuoso al 0,9% en peso a aproximadamente 22°C, y determinando la claridad optica. La claridad optica puede determinarse de manera turbidimetrica, por ejemplo, mediante observacion visual o mediante metodos instrumentales apropiados conocidos para los expertos en la tecnica. La comparacion de la solubilidad resultante con respecto a una disolucion de conjugado de poli(acido glutamico) formada de manera similar muestra solubilidad mejorada tal como se demuestra por una mayor claridad optica a lo largo de un intervalo mas amplio de valores de pH. Por tanto, la solubilidad del conjugado de polfmero es mayor que la de un conjugado de poli(acido glutamico) comparable que comprende sustancialmente la misma cantidad del farmaco anticancengeno cuando una disolucion de conjugado de polfmero sometida a prueba, que comprende al menos 5 mg/ml del conjugado de polfmero en NaCl acuoso al 0,9% en peso a aproximadamente 22°C, tiene mayor claridad optica a lo largo de un intervalo de pH mas amplio que una disolucion de conjugado de poli(acido glutamico) sometida a prueba comparable. Los expertos en la tecnica entenderan que un conjugado de poli(acido glutamico) “comparable” es un material de control en el que la porcion polimerica del conjugado tiene un peso molecular que es aproximadamente el mismo que el del conjugado de polfmero objeto (que comprende una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III)) con la que se compara.
Los conjugados de polfmero que incluyen una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) son copolfmeros. En algunas realizaciones, un conjugado de polfmero descrito en el presente documento puede incluir dos o mas unidades recurrentes diferentes de formula (I), dos o mas unidades recurrentes diferentes de formula (II) y/o dos o mas unidades recurrentes diferentes de formula (III). Ademas, en algunas realizaciones, los conjugados de polfmero que pueden incluir una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) pueden incluir otras unidades recurrentes que no son de formula (I), ni de formula (II) y/o ni de formula (III). En otras realizaciones, los polfmeros pueden consistir solamente en unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III).
El compuesto que incluye el farmaco anticancengeno puede conjugarse con el polfmero de muchas maneras diferentes. En algunas realizaciones, el compuesto que incluye el farmaco anticancengeno puede unirse directamente al polfmero. En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno puede unirse directamente al polfmero a traves de un atomo de oxfgeno, de azufre, de nitrogeno y/o de carbono del farmaco anticancengeno. En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno puede unirse directamente a una unidad recurrente de formula (I). En otras realizaciones, el compuesto que incluye el farmaco anticancengeno puede incluir ademas un grupo conector. Un grupo conector es un grupo que une el farmaco anticancengeno (o el compuesto que incluye el farmaco anticancengeno) a la unidad recurrente. En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno puede unirse a una unidad recurrente de formula (I) a traves de un grupo conector. El grupo conector puede ser relativamente pequeno. Por ejemplo, el grupo conector puede comprender una amina, una amida, un eter, un ester, un grupo hidroxilo, un grupo carbonilo o un grupo tiol. Alternativamente, el grupo conector puede ser relativamente grande. Por ejemplo, el grupo conector puede comprender un grupo alquilo, un grupo alcoxilo, un grupo arilo, un grupo aril(alquilo Ci-a), un grupo heteroarilo, o un grupo heteroaril(alquilo Ci-a). En algunas realizaciones, el conector puede ser -NH(CH2)i-4-NH-. En algunas realizaciones, el conector puede ser -(CH2)i-4-aril-NH-. El grupo conector puede
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unirse al farmaco anticancengeno en cualquier posicion adecuada. Por ejemplo, el grupo conector puede unirse en lugar de un hidrogeno en un carbono del farmaco anticancengeno. El grupo conector puede anadirse al farmaco anticancengeno usando metodos conocidos para los expertos en la tecnica.
En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno puede seleccionarse de un taxano, Camptotheca y antraciclina. Cuando el agente comprende un taxano, el taxano puede ser paclitaxel. En otras realizaciones, el taxano puede ser docetaxel. Cuando el farmaco anticancengeno es paclitaxel, el paclitaxel puede conjugarse con la unidad recurrente de formula (I) en el atomo de oxfgeno mediante el carbono C2' del paclitaxel. Alternativamente o ademas, el paclitaxel puede conjugarse con la unidad recurrente de formula (I) en el atomo de oxfgeno mediante el carbono C7 del paclitaxel. Cuando el farmaco anticancengeno es una Camptotheca, la Camptotheca puede ser camptotecina. En algunas realizaciones, cuando el farmaco anticancengeno es antraciclina, la antraciclina puede ser doxorubicina.
El numero total de unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) puede variar. En algunas realizaciones, el numero total de unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) puede estar en el intervalo de desde 50 hasta 5000. En otras realizaciones, el numero total de unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) puede estar en el intervalo de desde 100 hasta 2000. En todavfa otras realizaciones, el numero total de unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III) puede estar en el intervalo de desde 150 hasta 15 000, desde 50 hasta 2000, desde 300 hasta 6000.
Asimismo, el porcentaje de unidades recurrentes de cada de una de las formulas (I), (II) y (III) individualmente en el conjugado de polfmero puede variar a lo largo de un amplio intervalo. Las tablas 1 y 2 proporcionan algunas realizaciones de un conjugado de polfmero que puede incluir unidades recurrentes de formula (I), unidades recurrentes de formula (II) y unidades recurrentes de formula (III). Por ejemplo, tal como se proporciona mediante la entrada 1, primera columna en la tabla 1, en algunas realizaciones, un conjugado de polfmero puede incluir del 1% en moles al 60% en moles de la unidad recurrente de formula (I) basandose en los moles totales de unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III). Como otro ejemplo, tal como se proporciona mediante la entrada 9, primera columna en la tabla 1, en algunas realizaciones, un conjugado de polfmero puede incluir al menos el 10% en moles de la unidad recurrente de formula (I) basandose en los moles totales de unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III). Como ejemplo adicional, tal como se proporciona en la entrada 1, tercera columna en la tabla 2, en algunas realizaciones, un conjugado de polfmero puede incluir del 5% en peso al 50% en peso de la unidad recurrente de formula (III) basandose en el peso total de unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III). La base para las realizaciones en la tabla 1 son los moles totales de unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III) en el conjugado de polfmero. La base para las realizaciones en la tabla 2 es el peso total de unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III) en el conjugado de polfmero.
Tabla 1
% en moles de formula (I)
% en moles de formula (II) % en moles de formula (III)
del 1% al 60%
del 1% al 70% del 1% al 70%
del 1% al 10%
del 1% al 10%
del 1% al 20%
del 1% al 20%
del 1% al 20%
del 1% al 30%
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del 1% al 50% del 10% al 70%
del 10% al 30%
del 20% al 70% del 10% al 20%
del 30% al 40%
del 40% al 60%
del 30% al 40%
del 20% al 70%
del 50% al 60% del 50% al 60%
al menos el 10%
al menos el 20%
al menos el 10%
al menos el 25%
al menos el 40% al menos el 30%
no mas del 40%
no mas del 70% no mas del 65%
no mas del 30%
no mas del 60% no mas del 45%
Tabla 2
% en peso de formula (I)
% en peso de formula (II) % en peso de formula (III)
del 1% al 60%
del 1% al 90%
del 1% al 60%
del 5% al 50%
del 5% al 80%
del 5% al 50%
del 7% al 40%
del 10% al 70% del 10% al 30%
del 10% al 30%
del 20% al 60% al menos el 10%
al menos el 10%
del 30% al 50% al menos el 20%
al menos el 25%
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al menos el 45% al menos el 40%
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En algunas realizaciones, la cantidad del agente, el porcentaje de la unidad recurrente de formula (I), el porcentaje de la unidad recurrente de formula (II), y el porcentaje de la unidad recurrente de formula (III) en el conjugado de polfmero se seleccionan para proporcionar una solubilidad del conjugado de polfmero que es mayor que la de un conjugado de poli(acido glutamico) comparable que comprende sustancialmente la misma cantidad del agente. El intervalo de valores de pH a lo largo del cual el conjugado de polfmero, que comprende unidades recurrentes de formula (I), formula (II) y formula (III), tiene mayor solubilidad que un conjugado de poli(acido glutamico) comparable puede ser estrecho o amplio. Tal como se indico anteriormente, la solubilidad se mide formando una disolucion de conjugado de polfmero que comprende al menos 5 mg/ml del conjugado de polfmero en NaCl acuoso al 0,9% en peso a 22°C, y determinando la claridad optica. En algunas realizaciones, el conjugado de polfmero puede ser soluble a lo largo de un intervalo de pH de al menos tres unidades de pH. En otras realizaciones, el conjugado de polfmero puede ser soluble a lo largo de un intervalo de pH de al menos 8 unidades de pH. En todavfa otras realizaciones, el conjugado de polfmero puede ser soluble a lo largo de un intervalo de pH de al menos 9 unidades de pH. En todavfa aun otras realizaciones, el intervalo de pH a lo largo del cual el conjugado de polfmero puede ser soluble incluye al menos un valor de pH en el intervalo de 2 a 5, por ejemplo, a pH = 2, pH = 3, pH = 4 y/o pH = 5. Preferiblemente, el intervalo de pH a lo largo del cual el conjugado de polfmero es soluble es mas amplio que el intervalo de pH a lo largo del cual el conjugado de poli(acido glutamico) comparable es soluble. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el conjugado de polfmero puede ser soluble a lo largo de un intervalo de pH que es al menos una unidad de pH mas amplio, preferiblemente al menos dos unidades de pH mas amplio, que el intervalo de pH a lo largo del cual el conjugado de poli(acido glutamico) comparable es soluble.
La cantidad de conjugado de polfmero colocado en la disolucion para medir la solubilidad tambien puede variar considerablemente. En algunas realizaciones, la solubilidad puede medirse cuando la disolucion de conjugado de polfmero sometido a prueba comprende al menos 5 mg/ml del conjugado de polfmero. En otras realizaciones, la solubilidad puede medirse cuando la disolucion de conjugado de polfmero sometido a prueba comprende al menos 10 mg/ml del conjugado de polfmero. En todavfa otras realizaciones, la solubilidad puede medirse cuando la disolucion de conjugado de polfmero sometido a prueba comprende al menos 25 mg/ml del conjugado de polfmero. En todavfa aun otras realizaciones, la solubilidad puede medirse cuando la disolucion de conjugado de polfmero sometido a prueba comprende al menos 100 mg/ml del conjugado de polfmero. En algunas realizaciones, la solubilidad puede medirse cuando la disolucion de conjugado de polfmero sometido a prueba comprende al menos 150 mg/ml del conjugado de polfmero. Los expertos en la tecnica entenderan que el conjugado de poli(acido glutamico) comparable se somete a prueba a la misma concentracion que la del conjugado de polfmero sometido a prueba.
Al variar las cantidades de unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III), las propiedades del conjugado de polfmero pueden ajustarse. Por ejemplo, al variar la cantidad de una unidad recurrente de formula (III), la degradacion del polfmero y/o la tasa de liberacion del compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno pueden ajustarse. Asimismo, variar una unidad recurrente de formula (III) tambien puede ajustar una o mas propiedades del conjugado de polfmero. En algunas realizaciones, aumentar el numero de unidades recurrentes de formula (III) en un conjugado de polfmero que incluye unidades recurrentes de las formulas (I), (II) y (III) puede proporcionar una tasa aumentada de liberacion del compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno. Una base de comparacion puede ser un conjugado de poli(L-y-glutamil-glutamina) comparable que no incluye unidades recurrentes de formula (III) (por ejemplo, peso molecular sustancialmente identico, porcentaje del compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno).
El peso molecular promedio en peso de los conjugados de polfmero que incluyen una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) puede variar. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede estar en el intervalo de 20 kDa a 300 kDa. En otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede estar en el intervalo de 30 kDa a 150 kDa. En todavfa otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede estar en el intervalo de 35 kDa a 85 kDa. En todavfa aun otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede estar en el intervalo de 50 kDa a 65 kDa. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede estar en el intervalo de 45 kDa a 70 kDa, de 35 kDa a 100 kDa, de 50 kDa a 85 kDa, de 50 kDa a 60 kDa. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede ser de al menos 40 kDa. En otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede ser de al menos 50 kDa. En otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede ser de al menos 60 kDa. En todavfa otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede ser de menos de 80 kDa. En todavfa aun otras realizaciones, el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede ser de menos de 70 kDa. En algunas realizaciones, variar el peso molecular puede modificar la tasa de liberacion del compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno. En algunas realizaciones, aumentar el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede aumentar la tasa de liberacion del compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno. En otras realizaciones, aumentar el peso molecular promedio en peso del conjugado de polfmero puede disminuir la tasa de liberacion del compuesto que puede incluir un farmaco anticancengeno.
Los polfmeros descritos en el presente documento pueden formarse para dar nanopartfculas en disolucion acuosa. Los conjugados que incluyen un polfmero descrito en el presente documento y un farmaco anticancengeno pueden
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formarse para dar nanopartfculas de manera similar. Tales nanopartfculas pueden usarse para administrar preferentemente un farmaco a un tejido seleccionado.
Los poKmeros que pueden incluir una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) pueden prepararse de diversas maneras. En algunas realizaciones, una unidad recurrente de formula (I) y una unidad recurrente de formula (II) pueden producirse partiendo de poli(acido glutamico) y un aminoacido, tal como acido glutamico. Alternativamente, en otras realizaciones, el polfmero puede crearse convirtiendo en primer lugar el material de poli(acido glutamico) de partida en su forma de sal. La forma de sal de poli(acido glutamico) puede obtenerse haciendo reaccionar poli(acido glutamico) con una base adecuada, por ejemplo, bicarbonato de sodio. Puede unirse un resto aminoacido o su forma de sal (por ejemplo, acido glutamico o glutamato) al grupo acido carboxflico colgante del poli(acido glutamico). El peso molecular promedio en peso del poli(acido glutamico) puede variar a lo largo de un amplio intervalo, pero es preferiblemente de desde 10 000 hasta 200 000 Dalton, y mas preferiblemente de desde 25 000 hasta 100 000 Dalton.
En algunas realizaciones, el aminoacido, tal como acido glutamico, puede protegerse mediante un grupo protector antes de la union al poli(acido glutamico) o poliglutamato. Un ejemplo de un resto aminoacido protegido adecuado para esta reaccion es clorhidrato de diester t-butilico de acido L-glutamico, mostrado a continuacion:
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La reaccion del poli(acido glutamico) o poliglutamato con el aminoacido puede tener lugar en presencia de cualquier disolvente adecuado. En algunas realizaciones, el disolvente puede ser un disolvente aprotico, por ejemplo, N,N’- dimetilformamida. En algunas realizaciones, puede usarse un agente de acoplamiento tal como EDC, DCC, CDI, DSC, HATU, HBTU, HCTU, PyBOP®, PyBroP®, TBTU y BOP. En otras realizaciones, la reaccion puede tener lugar en presencia de un catalizador (por ejemplo, DMAP).
La conjugacion de un compuesto que incluye un farmaco anticancengeno con un polfmero tal como se describe en el presente documento puede llevarse a cabo de diversas maneras. Un metodo para conjugar el compuesto que incluye un farmaco anticancengeno para formar una unidad recurrente de formula (I) es mediante el uso de calor (por ejemplo, calor de usar un metodo de microondas). Alternativamente, la conjugacion puede tener lugar a temperatura ambiente. Pueden usarse disolventes, agentes de acoplamiento, catalizadores y/o tampones apropiados tal como conocen generalmente los expertos en la tecnica y/o tal como se describe en el presente documento para formar el conjugado de polfmero. Como con el poli(acido glutamico), pueden usarse tanto la forma de sal como de acido del polfmero obtenido de poli(acido glutamico) y/o sal y un aminoacido como material de partida para formar el conjugado de polfmero. En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno puede ser un taxano, una Camptotheca y/o una antraciclina. En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno puede ser un taxano tal como paclitaxel o docetaxel. En otras realizaciones, el farmaco anticancengeno conjugado con el polfmero puede ser una Camptotheca, tal como camptotecina. En todavfa otras realizaciones, el farmaco anticancengeno conjugado con el polfmero puede ser una antraciclina, tal como doxorubicina. En algunas realizaciones, el farmaco anticancengeno conjugado con el polfmero puede ser paclitaxel, incluyendo paclitaxel conjugado con el polfmero mediante su atomo C2’ de oxfgeno y/o mediante su atomo C7 de oxfgeno. En algunas realizaciones, el paclitaxel puede acoplarse con el polfmero solo mediante el atomo C2’ de oxfgeno. En otras realizaciones, el paclitaxel puede acoplarse con el polfmero solo mediante el atomo C7 de oxfgeno. En todavfa otras realizaciones, el polfmero puede incluir tanto grupos de paclitaxel conjugados con C2’ como grupos de paclitaxel conjugados con C7.
En algunas realizaciones, el compuesto que incluye un farmaco anticancengeno puede acoplarse usando un agente de acoplamiento (por ejemplo, eDc y/o DCC) y/o un catalizador (por ejemplo, DMAP) en un disolvente (por ejemplo, un disolvente aprotico tal como DMF). Pueden usarse agentes adicionales, tales como piridina o hidroxibenzotriazol. En algunas realizaciones, la reaccion puede tener lugar a lo largo del periodo de 0,5-2 dfas. Pueden usarse metodos adecuados conocidos por los expertos en la tecnica para aislar y/o purificar el conjugado de polfmero. Por ejemplo, la mezcla de reaccion puede verterse en una disolucion acida para formar un precipitado. Cualquier precipitado que se forma puede entonces filtrarse y lavarse con agua. Opcionalmente, el precipitado puede purificarse mediante cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, el precipitado puede transferirse a acetona y disolverse, y la disolucion resultante puede filtrarse de nuevo en una disolucion de bicarbonato de sodio. Si se desea, la disolucion de reaccion resultante puede dializarse en agua usando una membrana de celulosa y el polfmero puede liofilizarse y aislarse. El contenido del compuesto que incluye un farmaco anticancengeno (tal como paclitaxel) en el polfmero resultante puede determinarse mediante espectrometna UV.
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Alternativamente, el compuesto que incluye el farmaco anticancengeno puede hacerse reaccionar con un aminoacido, tal como acido glutamico o glutamato, para formar un segundo compuesto en el que el compuesto que incluye el farmaco anticancengeno se une covalentemente al aminoacido. Entonces, el compuesto de aminoacido- agente puede hacerse reaccionar con poli(acido glutamico) o su sal para formar una unidad recurrente de formula (I). En algunas realizaciones, el paclitaxel puede hacerse reaccionar con acido glutamico para formar un compuesto en el que el paclitaxel se une covalentemente al grupo acido carboxflico colgante del acido glutamico. Entonces, el compuesto de acido glutamico-paclitaxel puede hacerse reaccionar con poli(acido glutamico) o su sal para formar una unidad recurrente de formula (I). Si se desea, el paclitaxel acoplado al aminoacido a traves del oxfgeno C2' puede separarse del paclitaxel acoplado al aminoacido a traves del oxfgeno C7 usando metodos de separacion conocidos (por ejemplo, HPLC).
Tras la formacion del conjugado de polfmero, tambien puede medirse cualquier cantidad libre de farmaco anticancengeno no unido covalentemente al polfmero. Por ejemplo, puede usarse cromatograffa en capa fina (CCF) para confirmar la ausencia sustancial de paclitaxel libre que permanece en las composiciones de polfmeros conjugados con paclitaxel.
Si los atomos de oxfgeno del aminoacido estan protegidos, los grupos protectores pueden retirarse usando metodos conocidos tales como usando un acido adecuado (por ejemplo, acido trifluoroacetico). Si se desea, la forma de sal del polfmero obtenido de hacer reaccionar poli(acido glutamico) con el aminoacido puede formarse tratando la forma de acido del polfmero con una disolucion de base adecuada, por ejemplo, disolucion de bicarbonato de sodio. El polfmero puede recuperarse y/o purificarse mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el disolvente puede retirarse mediante metodos adecuados, por ejemplo, evaporacion rotatoria. Adicionalmente, la mezcla de reaccion puede filtrarse en una disolucion acuosa acida para inducir precipitacion. El precipitado resultante puede entonces filtrarse y lavarse con agua. Se expone informacion adicional respecto a la preparacion de unidades recurrentes de las formulas (I) y (II) en la publicacion de patente estadounidense n.° 2007-0128118, presentada el 1 de diciembre de 2006, y particularmente con el proposito de describir la smtesis de los polfmeros descritos en la misma.
Puede utilizarse una variedad de metodos para incluir una o mas unidades recurrentes de formula (III) en la estructura principal del polfmero. En algunas realizaciones, puede incorporarse una unidad recurrente de formula (III) antes de la adicion de un compuesto que incluye un agente anticancengeno. Un metodo para formar un conjugado
imagen10
MU
de polimero que incluye una unidad recurrente de formula (III) que tiene la estructura es tal
como sigue. Puede hacerse reaccionar poli(acido glutamico) o su forma de sal con un aminoacido, tal como acido glutamico, en una cantidad que es de menos de 1,0 equivalentes del aminoacido a base de poli(acido glutamico) o su forma de sal. El polimero resultante que contiene tanto unidades recurrentes de formula (III) como
O
II Hi
—c—ch-nH—
T i T
ch2
I
ch2
I
o=c
I
OH
O
II Hi
-----C—CH-N-j—
puede entonces transformarse en
CH2
ch2
0=C
NH2
conocidos por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, el
usando metodos y reactivos acido carboxflico colgante de
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O
II H
C—CH-N
I
ch2
I
ch2
puede hacerse reaccionar con un agente de acoplamiento, tal como 1 -hidroxi-7- azabenzotriazol (HOAt) y hacerse reaccionar adicionalmente con NH3 en dioxano. Entonces, puede formarse una unidad recurrente de formula (I) a partir de un polfmero que contiene una o mas unidades recurrentes de formula (II) y una o mas unidades recurrentes de formula (III) usando uno o mas metodos descritos en el presente documento. En otras realizaciones, una unidad recurrente de formula (III) puede incorporarse antes de la adicion de un compuesto que incluye un agente anticancengeno.
El procedimiento para incorporar leucina y alanina en poli(acido glutamico) para convertirse en copolfmeros se ha descrito en la patente estadounidense n.° 3.350.365. N-Carboxi-a-anhudrido (NCA) de L-leucina o NCA de L-alanina y NCA de ester 5-bendlico de acido L-glutamico pueden copolimerizarse para formar poli(L-leucina)-poli(ester 5- bendlico de acido L-glutamico) y poli(L-alanina)-poli(ester 5-bendlico de acido L-glutamico). El grupo protector de ester 5-bendlico puede retirarse en HBr/acido acetico; por tanto, poli(L-leucina)-poli(ester 5-bendlico de acido L- glutamico) y poli(L-alanina)-poli(ester 5-bendlico de acido L-glutamico) se convierten en poli(L-leucina)-poli(acido L- glutamico) y poli(L-alanina)-poli(acido L-glutamico), respectivamente. El conjugado de poli(L-leucina)-poli(L-y- glutamil-glutamina)-PTX puede formarse acoplando otro acido glutamico sobre poli(L-leucina)-poli(acido L-glutamico) y tras la conjugacion de paclitaxel. De manera similar, el conjugado de poli(L-alanina)-poli(L-y-glutamil-glutamina)- PTX puede sintetizarse usando el mismo procedimiento de smtesis de conjugado de poli(L-leucina)-poli(L-y-glutamil- glutamina)-PTX. Se expone informacion adicional respecto a la preparacion de la conjugacion de paclitaxel en la publicacion de patente estadounidense n.° 2007-0128118, presentada el 1 de diciembre de 2006, y particularmente con el proposito de describir la smtesis de los conjugados de poliaminoacido-paclitaxel descritos en la misma.
Composiciones farmaceuticas
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a una composicion que puede incluir uno o mas conjugados de polfmero descritos en el presente documento y al menos uno seleccionado de un excipiente, un portador y un diluyente farmaceuticamente aceptables. En algunas realizaciones, se proporcionan profarmacos, metabolitos, estereoisomeros, hidratos, solvatos, polimorfos y sales farmaceuticamente aceptables de un conjugado de polfmero divulgado en el presente documento.
Un “profarmaco” se refiere a un agente que se convierte en el farmaco original in vivo.
El termino “composicion farmaceutica” se refiere a una mezcla de un conjugado de polfmero descrito en el presente documento con otros componentes qmmicos, tales como diluyentes o portadores. La composicion farmaceutica facilita la administracion de un conjugado de polfmero a un organismo. Existen multiples tecnicas de administracion de un compuesto en la tecnica incluyendo, pero sin limitarse a, administracion oral, mediante inyeccion, mediante aerosol, parenteral y topica. Tambien pueden obtenerse composiciones farmaceuticas haciendo reaccionar compuestos con acidos inorganicos u organicos tales como acido clorhudrico, acido bromhudrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluenosulfonico, acido salicilico.
El termino “portador” se refiere a un compuesto qmmico que facilita la incorporacion de un compuesto en celulas o tejidos. Por ejemplo, dimetilsulfoxido (DMSO) es un portador comunmente usado, ya que facilita la captacion de muchos compuestos organicos en las celulas o tejidos de un organismo.
El termino “diluyente” se refiere a compuestos qmmicos diluidos en agua que disolveran el compuesto de interes (por ejemplo, un conjugado de polfmero descrito en el presente documento) asf como estabilizaran la forma biologicamente activa del compuesto. En la tecnica se utilizan sales disueltas en disoluciones tamponadas como diluyentes. Una disolucion tamponada comunmente usada es solucion salina tamponada con fosfato porque imita las condiciones de sal de la sangre humana. Puesto que las sales tampon pueden controlar el pH de una disolucion a bajas concentraciones, un diluyente tamponado rara vez modifica la actividad biologica de un compuesto. El termino “fisiologicamente aceptable” se refiere a un portador o diluyente que no anula la actividad biologica ni las propiedades del compuesto.
El termino “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a una sal de un compuesto que no provoca una irritacion significativa a un organismo al que se le administra y no anula la actividad biologica ni las propiedades del compuesto. En algunas realizaciones, la sal es una sal de adicion de acido del compuesto. Pueden obtenerse sales
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farmaceuticas haciendo reaccionar un compuesto con acidos inorganicos tales como acido hidracido (por ejemplo, acido clortndrico o acido bromtndrico), acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico. Tambien pueden obtenerse sales farmaceuticas haciendo reaccionar un compuesto con un acido organico tal como acidos carboxflicos o sulfonicos alifaticos o aromaticos, por ejemplo acido acetico, succmico, lactico, malico, tartarico, cftrico, ascorbico, nicotmico, metanosulfonico, etanosulfonico, p-toluenosulfonico, salidlico o naftalenosulfonico. Tambien pueden obtenerse sales farmaceuticas haciendo reaccionar un compuesto con una base para formar una sal tal como una sal de amonio, una sal de metal alcalino, tal como una sal de sodio o de potasio, una sal de metal alcalinoterreo, tal como una sal de calcio o de magnesio, una sal de bases organicas tales como diciclohexilamina, N-metil-D- glucamina, tris(hidroximetil)metilamina, alquilamina C1-C7, ciclohexilamina, trietanolamina, etilendiamina, y sales con aminoacidos tales como arginina, lisina.
Si la fabricacion de formulaciones farmaceuticas implica mezclado mtimo de los excipientes farmaceuticos y el principio activo en su forma de sal, entonces puede ser deseable usar excipientes farmaceuticos que no sean basicos, es decir, o bien excipientes acidos o bien neutros.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica puede incluir uno o mas agentes tensioactivos, portadores, diluyentes, excipientes, agentes de suavizado, agentes de suspension, sustancias formadoras de pelfcula y agentes de ayuda al recubrimiento fisiologicamente aceptables, o una combinacion de los mismos; y un compuesto (por ejemplo, un conjugado de polfmero descrito en el presente documento) divulgado en el presente documento. En la tecnica farmaceutica se conocen bien portadores o diluyentes aceptables para uso terapeutico, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes, edulcorantes, perfumes, agentes aromatizantes en la composicion farmaceutica. Por ejemplo, pueden anadirse benzoato de sodio, acido ascorbico y esteres de acido p- hidroxibenzoico como conservantes. Ademas, pueden usarse antioxidantes y agentes de suspension. En diversas realizaciones, pueden usarse alcoholes, esteres, alcoholes alifaticos sulfatados como agentes tensioactivos; pueden usarse sacarosa, glucosa, lactosa, almidon, celulosa cristalizada, manitol, silicato anhidro ligero, aluminato de magnesio, aluminato de metasilicato de magnesio, silicato de aluminio sintetico, carbonato de calcio, carbonato acido de sodio, hidrogenofosfato de calcio, carboximetilcelulosa de calcio como excipientes; pueden usarse estearato de magnesio, talco, aceite endurecido como agentes de suavizado; aceite de coco, aceite de oliva, aceite de sesamo, aceite de cacahuete, soja como agentes de suspension o lubricantes; puede usarse acetato-ftalato de celulosa como derivado de un carbohidrato tal como celulosa o azucar, o copolfmero de metilacetato-metacrilato como derivado de polivinilo como agentes de suspension; y pueden usarse plastificantes tales como esteres ftalatos como agentes de suspension.
Las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente humano per se, o en composiciones farmaceuticas en las que se mezclan con otros principios activos, como en terapia de combinacion, o portadores, diluyentes, excipientes o combinaciones de los mismos. La formulacion adecuada es dependiente de la via de administracion elegida. Los expertos en la tecnica conocen tecnicas para la formulacion y administracion de los compuestos descritos en el presente documento.
Las composiciones farmaceuticas divulgadas en el presente documento pueden fabricarse de una manera que es conocida por sf misma, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolucion, granulacion, produccion de grageas, granulado en humedo, emulsificacion, encapsulacion, atrapamiento o preparacion de comprimidos. Adicionalmente, los principios activos estan contenidos en una cantidad eficaz para lograr su proposito previsto. Muchos de los compuestos usados en las combinaciones farmaceuticas divulgadas en el presente documento pueden proporcionarse como sales con contraiones farmaceuticamente compatibles.
En la tecnica existen multiples tecnicas de administracion de un compuesto incluyendo, pero sin limitarse a, administracion oral, rectal, topica, mediante aerosol, mediante inyeccion y parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutaneas, intravenosas, intramedulares, inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intraperitoneales, intranasales e intraoculares.
En diversas realizaciones, las composiciones farmaceuticas y los conjugados de polfmero divulgados en el presente documento pueden estar en forma de un lfquido inyectable.
Pueden preparase productos inyectables en formas convencionales, o bien como suspensiones o bien como disoluciones lfquidas, formas solidas adecuadas para disolucion o suspension en lfquido antes de la inyeccion, o como emulsiones. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albumina, glutamato de sodio, clorhidrato de cistema. Ademas, si se desea, las composiciones farmaceuticas inyectables pueden contener pequenas cantidades de sustancias auxiliares no toxicas, tales como agentes de humectacion, agentes de tamponamiento del pH. Los tampones fisiologicamente compatibles incluyen, pero no se limitan a, disolucion de Hanks, disolucion de Ringer o tampon de solucion salina fisiologico. Si se desea, pueden usarse preparaciones que potencian la absorcion (por ejemplo, liposomas).
Para administracion transmucosa, pueden usarse agentes penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse en la formulacion.
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Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua, incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos (por ejemplo, un polfmero divulgado en el presente documento) en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyeccion oleosas apropiadas. Los vetnculos o disolventes lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo, u otros aceites organicos tales como aceites de soja, pomelo o almendras, o esteres de acido grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones para inyeccion acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de disoluciones altamente concentradas. Pueden presentarse formulaciones para inyeccion en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis multiples, con un conservante anadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vetnculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizacion y/o dispersion. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su reconstitucion con un vehnculo adecuado, por ejemplo, agua esteril libre de pirogenos, antes de su uso.
Tambien puede administrase el compuesto de una manera mas bien local que sistemica, por ejemplo, mediante inyeccion del compuesto directamente en la zona infectada, a menudo en una formulacion de deposito o liberacion sostenida. Ademas, puede administrase el compuesto en un sistema de administracion de farmacos dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo espedfico de tejido. Los liposomas seran dirigidos a y los tomara selectivamente el organo.
Las composiciones farmaceuticas pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas de dosificacion unitarias que contienen el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lamina de metal o de plastico, tal como un envase de blister. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompanado de instrucciones para su administracion. El envase o dispensador tambien puede ir acompanado de un aviso asociado con el recipiente en forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, el uso o la venta de productos farmaceuticos, aviso que refleja la aprobacion por la agencia de la forma del farmaco para administracion humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser el etiquetado aprobado por la Administracion de Alimentos y Medicamentos (FDA) de Estados unidos para farmacos con receta, o el prospecto aprobado. Las composiciones que pueden incluir un compuesto descrito en el presente documento formulado en un portador farmaceutico compatible tambien pueden prepararse, colocarse en un recipiente adecuado y etiquetarse para el tratamiento de una afeccion indicada.
Metodos de administracion
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a un conjugado de polfmero o a la composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento o mejora de una enfermedad o estado que puede incluir administrar una cantidad eficaz de uno o mas de los conjugados de polfmero descritos en el presente documento (por ejemplo, un conjugado de polfmero que puede incluir una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III)) o una o mas de las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento a un sujeto que lo necesita. Otras realizaciones descritas en el presente documento se refieren a un conjugado de polfmero descrito en el presente documento para su uso en un metodo para administrar un farmaco anticancengeno a un tejido seleccionado. En algunas realizaciones, los conjugados de polfmero que pueden incluir una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) son para su uso en un metodo para tratar o mejorar una enfermedad o estado, tal como cancer. En otras realizaciones, un conjugado de polfmero descrito en el presente documento puede usarse para formar un medicamento para su uso en un metodo para tratar o mejorar una enfermedad o estado, por ejemplo, cancer. En todavfa otras realizaciones, un conjugado de polfmero descrito en el presente es para su uso en un metodo para tratar o mejorar una enfermedad o estado, incluyendo cancer. En algunas realizaciones, la enfermedad o estado puede ser un cancer tal como cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de colon, cancer de ovario, cancer de prostata y melanoma. En algunas realizaciones, la enfermedad o estado puede ser un tumor seleccionado del grupo que consiste en tumor de pulmon, tumor de mama, tumor de colon, tumor de ovario, tumor de prostata y tumor de melanoma. En algunas realizaciones, un conjugado de polfmero descrito en el presente documento puede administrarse por via intravenosa.
Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” se refiere a un animal que es el objeto de tratamiento, observacion o experimento. “Animal” incluye vertebrados e invertebrados de sangre fna y caliente tales como peces, moluscos, reptiles y, en particular, mamfferos. “Mairnfero” incluye, sin limitacion, ratones, ratas, conejos, cobayas, perros, gatos, ovejas, cabras, vacas, caballos, primates, tales como monos, chimpances y simios, y, en particular, humanos.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “tratar”, “tratamiento”, “terapeutico” o “terapia” no significan necesariamente la cura o supresion total de la enfermedad o estado. Cualquier alivio de cualquier signo o smtoma no deseado de una enfermedad o estado, en cualquier grado puede considerarse tratamiento y/o terapia. Ademas,
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el tratamiento puede incluir acciones que pueden empeorar la sensacion de bienestar global del paciente o su aspecto.
El termino “cantidad eficaz” se usa para indicar una cantidad de un compuesto activo, o agente farmaceutico, que provoca la respuesta biologica o medica indicada. Por ejemplo, una cantidad eficaz de compuesto puede ser la cantidad necesaria para prevenir, aliviar o mejorar los smtomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que esta tratandose. Esta respuesta puede producirse en un tejido, sistema, animal o humano e incluye el alivio de los signos o smtomas de la enfermedad que esta tratandose. La determinacion de una cantidad eficaz esta dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica, en vista de la divulgacion proporcionada en el presente documento. La cantidad eficaz de los compuestos divulgados en el presente documento requerida como dosis dependera de la via de administracion, el tipo de animal, incluyendo humano, que esta tratandose, y las caractensticas ffsicas del animal espedfico en consideracion. La dosis puede adaptarse para lograr un efecto deseado, pero dependera de factores tales como el peso, la dieta, la medicacion simultanea y otros factores que los expertos en las tecnicas medicas reconoceran.
Tal como sera facilmente evidente para un experto en la tecnica, la dosificacion util in vivo que va a administrarse y el modo particular de administracion variaran dependiendo de la edad, el peso, la gravedad de la afeccion y las especies de mairnfero tratadas, los compuestos particulares empleados y el uso espedfico para el cual estos compuestos se emplean. La determinacion de niveles de dosificacion eficaces, es decir, los niveles de dosificacion necesarios para lograr el resultado deseado, puede lograrlos un experto en la tecnica usando metodos de rutina, por ejemplo, ensayos clfnicos con humanos y estudios in vitro.
La dosificacion puede variar ampliamente, dependiendo de los efectos deseados y la indicacion terapeutica. Alternativamente, pueden basarse y calcularse las dosificaciones segun el area de superficie del paciente, tal como entienden los expertos en la tecnica. Aunque la dosificacion exacta se determinara para cada farmaco espedfico, en la mayona de los casos pueden hacerse algunas generalizaciones respecto a la dosificacion. El regimen de dosificacion diario para un paciente humano adulto puede ser, por ejemplo, una dosis oral de entre 0,01 mg y 3000 mg de cada principio activo, preferiblemente entre 1 mg y 700 mg, por ejemplo de 5 a 200 mg. La dosificacion puede ser individual o una serie de dos o mas administradas en el transcurso de uno o mas dfas, segun lo necesite el sujeto. En algunas realizaciones, los compuestos se administraran durante un periodo de terapia continua, por ejemplo durante una semana o mas, o durante meses o anos.
En casos en los que se han establecido dosificaciones en humanos para compuestos para al menos algun estado, pueden usarse esas mismas dosificaciones, o dosificaciones que estan entre el 0,1% y el 500%, mas preferiblemente entre el 25% y el 250% de la dosificacion en humanos establecida. Cuando no se establece dosificacion en humanos, como sera el caso para composicion farmaceuticas recien descubiertas, puede deducirse una dosificacion en humanos adecuada a partir de los valores de DE50 o DI50, u otros valores adecuados derivados de estudios in vitro o in vivo, tal como se califica mediante estudios de toxicidad y estudios de eficacia en animales.
En casos de administracion de una sal farmaceuticamente aceptable, las dosificaciones pueden calcularse como la base libre. Tal como entenderan los expertos en la tecnica, en determinadas situaciones puede ser necesario administrar los compuestos divulgados en el presente documento en cantidades que superan, o incluso superan con creces, el intervalo de dosificacion preferido establecido anteriormente con el fin de tratar de manera eficaz y agresiva enfermedades o infecciones particularmente agresivas.
El intervalo y la cantidad de dosificacion pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmaticos del resto activo que son suficientes para mantener los efectos moduladores, o la concentracion eficaz minima (MEC). La MEC variara para cada compuesto, pero puede estimarse a partir de datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependeran de las caractensticas individuales y la via de administracion. Sin embargo, pueden usarse bioensayos o ensayos de HPLC para determinar las concentraciones plasmaticas. Los intervalos de dosificacion tambien pueden determinarse usando el valor de MEC. Las composiciones deben administrarse usando un regimen que mantenga los niveles plasmaticos por encima de la MEC durante el 10-90% del tiempo, preferiblemente entre el 30-90% y lo mas preferiblemente entre el 50-90%. En casos de administracion local o captacion selectiva, la concentracion local eficaz del farmaco puede no estar relacionada con la concentracion plasmatica.
Debe indicarse que el medico encargado sabna como y cuando terminar, interrumpir o ajustar la administracion debido a toxicidad o disfunciones organicas. A la inversa, el medico encargado sabna tambien como ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clmica no fuera adecuada (descartando toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en la gestion del trastorno de interes variara con la gravedad del estado que va a tratarse y con la via de administracion. La gravedad del estado puede evaluarse, por ejemplo, en parte, mediante metodos de evaluacion de pronostico convencionales. Ademas, la dosis y quizas la frecuencia de la dosis tambien variaran segun la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Puede usarse un programa comparable al comentado anteriormente en medicina veterinaria.
Los compuestos divulgados en el presente documento pueden evaluarse para determinar su eficacia y toxicidad
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usando metodos conocidos. Por ejemplo, la toxicolog^a de un compuesto particular, o de un subconjunto de los compuestos, que comparten determinados restos qmmicos, puede establecerse determinando la toxicidad in vitro hacia una lmea celular, tal como una lmea celular de mairnfero, y preferiblemente de humano. Los resultados de tales estudios son a menudo predictivos de la toxicidad en animales, tales como mai^eras, o mas espedficamente, humanos. Alternativamente, la toxicidad de compuestos particulares en un modelo animal, tal como ratones, ratas, conejos o monos, puede determinarse usando metodos conocidos. La eficacia de un compuesto particular puede establecerse usando varios metodos reconocidos, tales como metodos in vitro, modelos animales o ensayos clmicos con humanos. Cuando se selecciona un modelo para determinar la eficacia, el experto en la tecnica puede guiarse por el estado de la tecnica para elegir un modelo, dosis, via de administracion y/o regimen apropiados.
Ejemplos
Se proporcionan los siguientes ejemplos con los propositos de describir adicionalmente las realizaciones descritas en el presente documento, y no limitan el alcance de las reivindicaciones.
Materiales:
Se adquirieron sales de sodio de poli-L-glutamato con diferentes pesos moleculares (pesos moleculares promedio de 41 400 (PGA(97k)), 17 600 (PGA(44k)), 16 000 (PGA(32k)) y 10 900 (PGA(21k)) Dalton basandose en dispersion de la luz de multiples angulos (MALS)); 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC); clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)- N'-etilcarbodiimida (EDC); hidroxibenzotriazol (HOBt); piridina; 4-dimetilaminopiridina (DMAP); N,N'-dimetilformamida (DMF); acetato de gadolinio; cloroformo; y bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich Chemical Company. Se convirtio poli-L-glutamato en poli(acido L-glutamico) usando disolucion de acido clortndrico 2 N. Se adquirio acido trifluoroacetico (TFA) de Bioscience. Se adquirieron clorhidrato de ester p-t-butilico y a-t-butilico del acido L- aspartico (H-Asp(OtBu)-OtBu HCl), clorhidrato de diester t-butflico del acido L-glutamico (H-Glu(OtBu)-OtBu HCl), ester a-bendlico del acido N-a-CBZ-L-glutamico (Z-Glu-OBzl) de Novabiochem (La Jolla, CA). Se adquirio paclitaxel de PoliMed (Houston, Texas). Todos los demas productos qmmicos y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Company (Saint Louis, MO).
Se obtuvo 1H-RMN de Joel (400 MHz) y se midieron los tamanos de partmula mediante ZetalPals (Brookhaven Instruments Corporation). Se llevo a cabo qmmica de microondas en Biotage. Se determinaron los pesos moleculares de polfmeros mediante cromatograffa de exclusion molecular (SEC) combinada con un detector de dispersion de la luz de multiples angulos (MALS) (Wyatt Corporation):
Condiciones de analisis de SEC-MALS:
■ Sistema de HPLC: Agilent 1200
■ Columna: Shodex SB 806M HQ (el lfmite de exclusion para el pululano es de 20 000 000, tamano de partmula: 13 micrometros, tamano (mm) DI x longitud; 8,0 x 300)
■ Fase movil: 1 x DPBS o 1% de LiBr en DPBS (pH 7,0)
■ Velocidad de flujo: 1 ml/min
■ Detector de MALS: DAWN HELEOS de Wyatt
■ Detector de DRI: Optilab rEX de Wyatt
■ Viscosfmetro en lmea: ViscoStar de Wyatt
■ Software: ASTRA 5.1.9 de Wyatt
■ Concentracion de muestra: 1-2 mg/ml
■ Volumen de inyeccion: 100 |il
Valor dn/dc de polfmero: se uso 0,185 en la medicion.
Se uso BSA como control antes de ejecutarse las muestras reales.
Usando el sistema y las condiciones descritas anteriormente (a continuacion en el presente documento, denominado sistema Heleos con detector de MALS), se encontro experimentalmente que el peso molecular promedio de los polfmeros de partida (pesos moleculares promedio de sales de sodio de poli-L-glutamato de 41 400, 17 600, 16 000 y 10 900 Dalton notificados por Sigma-Aldrich usando su sistema con mAlS) era de 49 000, 19 800, 19 450 y 9 400 Dalton, respectivamente.
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Se estimo el contenido de paclitaxel en conjugados de poKmero-paclitaxel mediante espectrometna UV/Vis (Lambda Bio 40, PerkinElmer) basandose en una curva patron generada con concentraciones conocidas de paclitaxel en metanol (X = 228 nm).
Ejemplo 1
Ac
H M
N-CH—-
CH
C HI 1 CHn
OH
OH
AcfN-CH-
CHj
H H N-C-
EDC/HOAt duster de Glu.HCI DIEA/DMSO
(j)H o CH-**-OR
CH,
i £
CHa
OAt
R = tBu
OR
H
N-GH-
CH2 CH,
CH, CHa r CH3
0=1 oH * 2
OBt
JZ
H H
N-C
HH3j'DiOx3nO
AcrN-CH
CHn CH-.
oH 0=j
NHo n
CHn
CHn
H
N-CH-
CHZ
CH,
0=1
NH o
itm Ti _ - OH-0-OR
H20 i if CH-U-OR CH-
ch2
CHS CHj
ch2
CHa Cll?
J R = tBu
0^ R = tBu H
OR
OR
OR
-NH2
-OR
R = tBu
TFA
H,0
H
Ac|-m-ch
CH:
CH2
H H
N-C-
CH3
CH,
H
-N-CH-
CHt
CH;
o=)
■NHr
DMF
DEC
DMAP
PTX
Ac
H
-N-CH-
CHj
CHZ
0=1
XL
H H M-C-
CHj
CH5
Jy
H
-N-CH-
CHa
CHn
r 9 nh, CH—1J—OH
NH O CH-U-OH HCl r 9 NH2 CH—U-ONa NH O CH—L
CHS
ch2 NaHC05 ch2 ch2
CH,
CHt CH2 CH:
H
H
H
OH
OH
ONa OPTX
■NH,
ON a
Los conjugados de polfmero que incluyen una unidad recurrente de formula (III) que tienen la estructura
o
-I—CHo-CHo—c—NH,
(Q) pueden prepararse segun el esquema general mostrado en el ejemplo 1.
Ejemplo 2
Ester de PGGA parcial-10% de Q
A PGA-OH (200 mg), EDC (446 mg, 2,33 mmol) y HOAt (317 mg, 2,33 mmol) pesados en un vial secado en horno (40 ml) con una barra magnetica se les anadieron 15 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 2 horas. Se anadieron diester de Glu.HCl (413 mg, 1,40 mmol) y DIEA (243 pl,
l, 40 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 2 h. Se anadio NH3/dioxano (6,2 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla de reaccion durante la noche (16 horas) a temperatura ambiental. Se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polimero. Se lavo el precipitado con agua (2x) y se aislo el polfmero con centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante. Rendimiento del 83,3% (446,8 mg), GPC (PM: 69,55 kDa).
Ejemplo 3
PGGA parcial-10% de Q-Na
Al ester obtenido del ejemplo 2 (446,8 mg) en un vial (40 ml) con barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (10 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 50 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polimero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3
ac. 0,3 N (20 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polimero. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-cPGGA- 10% de Q-acido, 25,9 mg, PM: 51,78 kDa, y forma de sal-PGGA-10% de Q-Na, 34,1 mg, PM: 72,34 kDa).
Ejemplo 4
Ester de PGGA parcial-20% de Q
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A PGA-OH (200 mg), EDC (446 mg, 2,33 mmol) y HOAt (317 mg, 2,33 mmol) pesados en un vial secado en horno (40 ml) con una barra magnetica se les anadieron 20 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperature ambiental durante 0,5 horas. Se anadieron diester de Glu.HCl (367 mg, 1,24 mmol) y DIEA (216 |il, 1,24 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 3 h. Se anadio NH3/dioxano (10 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla durante la noche (16 horas) a temperatura ambiental. Se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el precipitado con agua (2x). Se aislo el polfmero con centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante. Rendimiento del 74% (421 mg).
Ejemplo 5
PGGA parcial-20% de Q-Na
Al ester obtenido del ejemplo 4 (421 mg) en un vial (40 ml) con barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (10 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 50 ml agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (20 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-cPGGA-20% de Q-acido, 228,1 mg, PM: 50,91 kDa, y forma de sal-PGGA-20% de Q-Na, 68,2 mg, pM: 56,55 kDa).
Ejemplo 6
Ester de PGGA parcial-30% de Q
A PGA-OH (200 mg), EDC (446 mg, 2,33 mmol) y HOAt (317 mg, 2,33 mmol) pesados en un vial secado en horno (40 ml) con una barra magnetica se les anadieron 20 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 0,5 horas. Se anadieron diester de Glu.HCl (321 mg, 1,09 mmol) y DIEA (189 |il,
l, 09 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 3 h. Se anadio NH3/dioxano (10 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla de reaccion durante la noche (16 horas) a temperatura ambiental. Se vertio la disolucion lentamente en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el polfmero con agua (2x) y se aislo con centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante. Rendimiento del 75% (391,6 mg).
Ejemplo 7
PGGA parcial-30% de Q-Na
Al ester obtenido del ejemplo 6 (392 mg) en un vial (40 ml) con barra de agitacion magnetica, se le anadio TFA (10 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 50 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3
ac. 0,3 N (20 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-cPGGA- 30% de Q-acido, 221,7 mg, PM: 46,08 kDa, y forma de sal-PGGA-30% de Q-Na, 37,7 mg, PM: 75,43 kDa).
Ejemplo 8
Ester de PGGA parcial-40% de Q
A PGA-OH (200 mg), EDC (446 mg, 2,33 mmol) y HOAt (317 mg, 2,33 mmol) pesados en un vial secado en horno (40 ml) con una barra magnetica se les anadieron 20 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 0,5 horas. Se anadieron diester de Glu.HCl (275 mg, 0,93 mmol) y DIEA (162 |il, 0,93 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 3 h. Se anadio NH3/dioxano (10 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla durante la noche (16 horas) a temperatura ambiental. Se vertio la disolucion lentamente en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el polfmero con agua (2x) y se aislo con centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante. Rendimiento del 77,3% (367 mg).
Ejemplo 9
PGGA parcial-40% de Q-Na
Al ester obtenido del ejemplo 8 (367 mg) en un vial (40 ml) con barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (10 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 50 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24
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horas) para dar la forma de acido del poKmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (20 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-cPGGA-40% de Q- acido, 204 mg, PM: 43,1 kDa, y forma de sal-PGGA-40% de Q-Na, 62,6 mg, PM: 63,87 kDa).
Ejemplo 10
Ester de PGGA parcial-50% de Q
A PGA-OH (200 mg), EDC (446 mg, 2,33 mmol) y HOAt (317 mg, 2,33 mmol) pesados en un vial secado en horno (40 ml) con una barra magnetica se les anadieron 20 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 0,5 horas. Se anadieron diester de Glu.HCl (229 mg, 0,78 mmol) y DIEA (135 |il, 0,78 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 3 h. Se anadio NH3/dioxano (10 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla de reaccion durante la noche (16 horas) a temperatura ambiental. Se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el polfmero con agua (2x) y se aislo con centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante. Rendimiento del 80% (343 mg).
Ejemplo 11
PGGA parcial-50% de Q-Na
Al ester obtenido del ejemplo 10 (343 mg) en un vial (40 ml) con barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (10 ml). Se agito la reaccion a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 50 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (20 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-cPGGA- 50% de Q-acido, 195,1 mg, PM: 43,23 kDa, y forma de sal-PGGA-50% de Q-Na, 59,3 mg, PM: 48,13 kDa).
Ejemplo 12
Ester de PGGA parcial-20% de Q
A PGA-OH (1,9 g), EDC (4,2 g, 22,0 mmol) y HOAt (3,0 g, 22,0 mmol) pesados en un matraz secado en horno (250 ml) con una barra magnetica se les anadieron 100 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 40 min. Se anadieron diester de Glu.HCl (3,5 g, 1 1,82 mmol) y DIEA (2,05 ml, 11,82 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 h). Se anadio NH3/dioxano (90 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla durante 7 horas a temperatura ambiental. Se vertio la disolucion lentamente en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el polfmero con agua (2x) y se aislo mediante centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante (4,54 g, 96%, PM:
53,48 kDa).
Ejemplo 13
PGGA parcial-20% de Q-acido
Al ester obtenido del ejemplo 12 (4,54 g) en un matraz (100 ml) con barra de agitacion magnetica, se le anadio TFA (40 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 500 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (50 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-PGGA- 20% de Q-acido, 1,63 g, PM: 38,59 kDa, y forma de sal-PGGA-20% de Q-Na, 1,268 g, PM: 56,74 kDa).
Ejemplo 14
PGGA parcial-20% de Q-20% en peso de PTX
A PGGA parcial-20% de Q (200 mg) pesado en un vial de 40 ml secado en horno se le anadieron 10 ml de DMSO anhidro. Se burbujeo la disolucion con N2 seco durante 5 min. Entonces se anadieron DMAP (28,4 mg, 0,233 mmol) y EDC (193 mg, 1,0 mmol) en secuencia en la mezcla. Se agito la mezcla a un ajuste de 1500 rpm hasta que se disolvieron los solidos. Se anadio PTX (50 mg, 0,059 mmol) en una porcion y se agito la disolucion resultante a temperatura ambiental durante 48 horas. Se monitorizo la reaccion mediante CCF. Tras la finalizacion de la reaccion, se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl 0,2 N con agitacion fuerte. Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero (78,8 mg, PM:
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47,63 kDa). Se le anadio a una porcion de la forma de acido una disolucion de NaHCO3 acuosa 1 N para ajustar el pH a ~8. Se dializo la mezcla (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del poUmero (178 mg). Se filtro la mezcla usando un filtro de membrana de 0,20 |im. Se congelaron las muestras y se liofilizaron hasta un peso constante.
Ejemplo 15
Ester de PGGA parcial-20% de Q
A PGA-OH (10 g), EDC (22,3 g, 116,5 mmol) y HOAt (15,85 g, 116,5 mmol) pesados en un matraz secado en horno (2000 ml) con una barra magnetica se les anadieron 750 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 60 min. Se anadieron diester de Glu.HCl (18,3 g, 62,0 mmol) y DIEA (10,8 ml, 62,0 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 3 horas. Se anadio NH3/dioxano (500 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla de reaccion durante la noche a temperatura ambiental. Se vertio la disolucion lentamente en una disolucion de HCl ac. 0,2 N (volumen de 5x, con 100 g de NaCl) para precipitar el polfmero. Se filtro la mezcla y se lavo con agua (3x). Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante (21 g, 75%, PM: 53,36 kDa).
Ejemplo 16
PGGA parcial-30% de Q-acido
Al ester obtenido del ejemplo 15 (21 g) en un matraz (1000 ml) con barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (500 ml). Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 1000 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (50 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-PGGA-30% de Q-acido, 15 g con rendimiento del 83%, PM: 42,65 kDa, y forma de sal-PGGA-30% de Q-Na, 300 mg, PM: 66,20 kDa).
Ejemplo 17
PGGA parcial-30% de Q-20% en peso de PTX
A PGGA parcial-20% de Q (200 mg) pesado en un vial de 40 ml secado en horno se le anadieron 10 ml de DMSO anhidro. Se burbujeo la disolucion con N2 seco durante 5 min. Entonces se anadieron DMAP (28,4 mg, 0,233 mmol) y EDC (193 mg, 1,0 mmol) en secuencia en la mezcla de reaccion. Se agito la mezcla a un ajuste de 1500 rpm hasta que se disolvieron los solidos. Se anadio PTX (50 mg, 0,059 mmol) en una porcion y se agito la mezcla resultante a temperatura ambiental durante 48 horas. Se monitorizo la reaccion mediante CCF. Tras la finalizacion de la reaccion, se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl 0,2 N con agitacion fuerte. Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero (97,5 mg, PM: 61,32 kDa). Se le anadio a una porcion de la forma de acido una disolucion de NaHCO3 acuosa 1 N para ajustar el pH a ~8. Se dializo la mezcla (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero (164 mg). Se filtro la mezcla mediante un filtro de membrana de 0,20 |im. Se congelaron las muestras y se liofilizaron hasta un peso constante.
Ejemplo 18
Ester de PGGA parcial-40% de Q
A PGA-OH (1,9 g), EDC (4,2 g, 22,0 mmol) y HOAt (3,0 g, 22,0 mmol) pesados en un matraz secado en horno (250 ml) con una barra magnetica se les anadieron 100 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 40 min. Se anadieron diester de Glu.HCl (2,63 g, 8,9 mmol) y DIEA (1,54 ml, 8,9 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se anadio NH3/dioxano (95 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla durante 7 horas a temperatura ambiental. Se vertio la disolucion lentamente en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el polfmero con agua (2x) y se aislo mediante centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante (4,0 g, 99%, PM: 60,41 kDa).
Ejemplo 19
PGGA parcial-40% de Q-acido
Al ester obtenido del ejemplo 18 (4,0 g) en un matraz (100 ml) con barra de agitacion magnetica, se le anadio TFA (40 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vacfo. Al residuo se le anadieron 500 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24
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horas) para dar la forma de acido del poKmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (50 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-PGGA-40% de Q- acido, 1,63 g, PM: 38,39 kDa, y forma de sal-PGGA-40% de Q-Na, 1,452 g, PM: 42,52 kDa).
Ejemplo 20
PGGA parcial-40% de Q-20% en peso de PTX
A PGGA parcial-20% de Q (200 mg) pesado en un vial de 40 ml secado en horno, se le anadieron 10 ml de DMSO anhidro. Se burbujeo la mezcla con N2 seco durante 5 min. Entonces se anadieron DMAP (28,4 mg, 0,233 mmol) y EDC (193 mg, 1,0 mmol) en secuencia en la mezcla de reaccion. Se agito la mezcla a un ajuste de 1500 rpm hasta que se disolvieron los solidos. Se anadio PTX (50 mg, 0,059 mmol) en una porcion y se agito la mezcla resultante a temperatura ambiental durante 48 horas. Se monitorizo la reaccion mediante CCF. Tras la finalizacion de la reaccion, se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl 0,2 N con agitacion fuerte. Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero (97,5 mg, PM: 61,32 kDa). Se le anadio a una porcion de la forma de acido una disolucion de NaHCO3 acuosa 1 N para ajustar el pH a ~8. Se dializo la mezcla (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero (164 mg). Se filtro la disolucion mediante un filtro de membrana de 0,20 |im. Se congelaron las muestras y se liofilizaron hasta un peso constante.
Ejemplo 21
Ester de PGGA parcial-50% de Q
A PGA-OH (1,9 g), EDC (4,2 g, 22,0 mmol) y HOAt (3,0 g, 22,0 mmol) pesados en un matraz secado en horno (250 ml) con una barra magnetica se les anadieron 100 ml de DMSO anhidro. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiental durante 40 min. Se anadieron diester de Glu.HCl (2,63 g, 8,9 mmol) y DIEA (1,54 ml, 8,9 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se anadio N^/dioxano (95 ml, 0,5 M) y se agito la mezcla durante 7 horas a temperatura ambiental. Se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl ac. 0,2 N para precipitar el polfmero. Se lavo el polfmero con agua (2x), y se aislo mediante centrifugacion. Se congelo el polfmero resultante y se liofilizo hasta un peso constante (3,41 g, 93%, PM: 74,93 kDa).
Ejemplo 22
PGGA parcial-50% de Q-acido
Al ester obtenido del ejemplo 21 (4,0 g) en un matraz (100 ml) con barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (40 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadieron 500 ml de agua y se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero. Se retiro una porcion de la forma de acido y se disolvio en NaHCO3 ac. 0,3 N (50 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal. Se congelaron las dos muestras y se liofilizaron hasta pesos constantes (forma de acido-PGGA-50% de Q- acido, 2,13 g, PM: 40,08 kDa, y forma de sal-PGGA-50% de Q-Na, 0,502 g, PM: 39,56 kDa).
Ejemplo 23
PGGA parcial-50% de Q-20% en peso de PTX
A PGGA parcial-20% de Q (200 mg), pesado en un vial de 40 ml secado en horno se le anadieron 10 ml de DMSO anhidro. Se burbujeo la mezcla con N2 seco durante 5 min. Entonces se anadieron DMAP (28,4 mg, 0,233 mmol) y EDC (193 mg, 1,0 mmol) en secuencia en la mezcla de reaccion. Se agito la mezcla a un ajuste de 1500 rpm hasta que se disolvieron los solidos. Se anadio PTX (50 mg, 0,059 mmol) en una porcion y se agito la mezcla resultante a temperatura ambiental durante 48 horas. Se monitorizo la reaccion mediante CCF. Tras la finalizacion de la reaccion, se vertio lentamente la mezcla en una disolucion de HCl 0,2 N con agitacion fuerte. Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de acido del polfmero (163,2 mg, PM:
55,49 kDa). Se le anadio a una porcion de la forma de acido una disolucion de NaHCO3 acuosa 1 N para ajustar el pH a ~8. Se dializo la mezcla (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas) para dar la forma de sal del polfmero (150 mg). Se filtro la mezcla mediante una membrana de 0,20 |im. Se congelaron las muestras y se liofilizaron hasta un peso constante.
Ejemplo 24
Estudios de degradacion enzimatica de polimeros
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Se disolvieron por separado sal de sodio de poli(acido L-glutamico) (PGA) y enzima papama en un tampon acetato
de sodio (NaOAc 20 mM, EDTA 2 mM y DTT 5 mM, pH 5,0) a una concentracion de 4 mg/ml y 2 mg/ml,
respectivamente. Se anadio una disolucion de la enzima papama (0,2 ml) en el tampon acetato a una disolucion del PGA (2 ml) en el tampon acetato. Se anadio adicionalmente el tampon acetato (1,8 ml) a la mezcla de la disolucion de enzima-polfmero. Se agito la mezcla de reaccion a 25°C. Se envio un duplicado de 100 |il de la mezcla de reaccion para analisis molecular en un periodo de tiempo deseado. Se uso cromatograffa de permeacion en gel (GPC) con detector de dispersion de la luz para analizar el peso molecular de PGA a partir de la reaccion de degradacion enzimatica de polfmeros y los resultados se muestran en la figura 2.
Se disolvieron por separado sal de sodio de poli(acido L-glutamico) (PGA) y enzima papama en un tampon acetato
de sodio (NaOAc 20 mM, EDTA 2 mM y DTT 5 mM, pH 6,0) a una concentracion de 4 mg/ml y 2 mg/ml,
respectivamente. Se anadio una disolucion de la enzima papama (0,2 ml) en el tampon acetato a una disolucion del PGA (2 ml) en el tampon acetato. Se anadio adicionalmente el tampon acetato (1,8 ml) a la mezcla de la disolucion de enzima-polfmero. Se agito la mezcla de reaccion a 25°C. Se envio un duplicado de 100 |il de la mezcla de reaccion para analisis molecular en un periodo de tiempo deseado. Se uso cromatograffa de permeacion en gel (GPC) con detector de dispersion de la luz para analizar el peso molecular de PGA a partir de la reaccion de degradacion enzimatica de polfmeros y los resultados se muestran en la figura 2.
Se disolvieron por separado sal de sodio de poli(acido L-glutamico) (PGA), copolfmeros de poli(L-glutamato)-poli(L-y- glutamil-glutamina) y enzima papama en un tampon acetato de sodio (NaOAc 20 mM, EDTA 2 mM y DTT 5 mM, pH 5,0) a una concentracion de 4 mg/ml, 4 mg/ml y 2 mg/ml, respectivamente. Se anadio por separado una disolucion de la enzima papama (0,2 ml) en el tampon acetato a una disolucion del PGA (2 ml) y los copolfmeros (2 ml cada uno) en el tampon acetato. Se anadio adicionalmente el tampon acetato (1,8 ml) a cada una de las mezclas de la disolucion de enzima-polfmero. Se agito cada mezcla de reaccion a 25°C. Se envio un duplicado de 100 |il de la mezcla de reaccion para analisis molecular en un periodo de tiempo deseado. Se uso cromatograffa de permeacion en gel (GPC) con detector de dispersion de la luz para analizar el peso molecular de PGA a partir de la reaccion de degradacion enzimatica de polfmeros y los resultados se muestran en la figura 3.
Los resultados en la figura 3 ilustran el efecto de variar la cantidad de unidades recurrentes de poli(L-glutamato)- poli(L-y-glutamil-glutamina) en copolfmeros tambien contienen unidades recurrentes de sal de sodio de poli(acido L- glutamico), en condiciones de degradacion enzimatica. Tal como se muestra en los datos ilustrados en la figura 3, las cantidades relativas de poli(L-glutamato)-poli(L-y-glutamil-glutamina) en los copolfmeros estan correlacionadas generalmente con una degradacion mas lenta del copolfmero, en comparacion con PGA que no incorpora poli(L- glutamato)-poli(L-y-glutamil-glutamina) en estas condiciones.
En la figura 7 se muestra un esquema de smtesis para preparar PGGA-y% de alanina (A) o leucina (L)-35% de PTX. Ejemplo 25
Ester BN de PGA parcial-20% de alanina
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Se purgo un matraz de fondo redondo de 500 ml secado en horno (110°C durante la noche) equipado con una barra de agitacion con argon seco durante 5 min. Se sello el matraz con un septum y se vertio 1,4-dioxano anhidro (200 ml) directamente en el matraz mediante un embudo. Se anadieron antndrido de y-bencil-N-carboxil-L-glutamato (NCA-ester bendlico, 10 g) y NCA-alanina (1,09 g). Tras purgarse con argon seco, se agito la mezcla a 700 rpm hasta que se disolvieron todos los solidos. Se burbujeo nitrogeno anhidro a traves de la disolucion durante 10 min para retirar cualquier oxfgeno disuelto. Se anadio una disolucion de trietilamina (TEA) (0,132 ml) con 1,4-dioxano (1,0 mol) con agitacion vigorosa (700 rpm). Tras agitar durante una hora a temperatura ambiente, se dejo en reposo la mezcla de reaccion a temperatura ambiente sin alteracion a lo largo de 24 horas para proporcionar una disolucion transparente, incolora, viscosa. Entonces se vertio lentamente esta disolucion viscosa en un vaso de precipitados de 1 l equipado con una barra de agitacion y se anadio etanol de calidad analftica (500 ml) con agitacion (700 rpm). Tras agitar durante 20 min a temperatura ambiente, se aislo el polfmero fibroso mediante filtracion a traves de un embudo Buchner de ceramica de 3 pulgadas, usando un papel de filtro de piel de tiburon de 8-12 |im medio. Se lavo
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el producto con etanol de calidad analttica (3 x 600 ml). Entonces se rompio el poKmero humedo en pequenos pedazos y se seco al aire a temperatura ambiente durante una hora. Se seco adicionalmente el material a alto vado durante la noche para dar 7,97 g de un solido fibroso blanco como producto final (PM: 16,82 kDa).
Ejemplo 26
Ester BN de PGA parcial-10% de leucina
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Se purgo un matraz de fondo redondo de 500 ml secado en horno (110°C durante la noche) equipado con una barra de agitacion con argon seco durante 5 min. Se sello el matraz con un septum y se vertio 1,4-dioxano anhidro (200 ml) directamente en el matraz mediante un embudo. Se anadieron anddrido de y-bencil-N-carboxil-L-glutamato (NCA-ester bendlico, 10 g) y NCA-leucina (0,663 g). Tras purgarse con argon seco, se agito la mezcla a 700 rpm hasta que todo el solido se disolvio. Se burbujeo nitrogeno anhidro a traves de la disolucion durante 10 min para retirar cualquier oxfgeno disuelto. Se anadio una disolucion de TEA (0,118 ml) con 1,4-dioxano (1,0 ml) con agitacion vigorosa (700 rpm). Tras agitarse durante una hora a temperatura ambiente, se dejo en reposo la mezcla de reaccion a temperatura ambiente sin alteracion a lo largo de 24 horas para proporcionar una disolucion transparente, incolora, viscosa. Se vertio lentamente la disolucion viscosa en un vaso de precipitados de 1 l equipado con una barra de agitacion y se anadio etanol de calidad analftica (500 ml) con agitacion (700 rpm). Tras agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se aislo el polfmero fibroso mediante filtracion a traves de un embudo Buchner de ceramica de 3 pulgadas, usando un papel de filtro de piel de tiburon de 8-12 cm medio. Se lavo el producto con etanol de calidad analftica (3 x 600 ml). Entonces se rompio el polfmero humedo en pequenos pedazos y se seco al aire a temperatura ambiente durante una hora. Se seco adicionalmente el material a alto vado durante la noche para dar 8,35 g de un solido fibroso blanco como producto final (PM: 81,53 kDa).
Ejemplo 27
Sal de Na de PGA parcial-20% de alanina
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Se anadio copolfmero parcial (200 g) en un vial de vidrio de 50 ml. Se anadio DCM anddrido (40 ml) con agitacion. Entonces se sonico la disolucion de mezcla durante 30 min. Se anadio disolucion de HBr al 33% en acido acetico (1,0 ml) a la disolucion en una porcion. Se agito la mezcla (700 rpm) a temperatura ambiente durante la noche. Se vertio la disolucion de la mezcla en hexano (100 ml, enfriada previamente en un congelador a -20°C) a -20°C. Precipito un solido blanco. Se detuvo la agitacion tras 10 min y se permitio que los solidos sedimentaran durante 5 min a temperatura ambiente. Se retiro el disolvente mediante decantacion, y se lavo el solido humedo con acetona (2 X 40 ml). Tras decantar el sobrenadante, se anadio agua MilliQ (40 ml) y se ajusto el pH con NaOH 1 N (ac.) a pH = 10. Se disolvio completamente el solido tras agitar durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se dializo la disolucion usando tubos de 1 kDa. Durante las cuatro primeras horas de dialisis, se reemplazo el agua desionizada una vez cada hora y se uso agua MilliQ para el ultimo reemplazo. Entonces se filtro la disolucion dializada y se liofilizo hasta un peso constante.
Ejemplo 28
Sal de Na de PGA parcial-10% de leucina
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En un matraz de fondo redondo de 1000 ml secado en horno equipado con una barra de agitacion magnetica se anadio ester de copolimero de PGA parcial-10% de leucina (6 g) y DCM anhidrido (500 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiente hasta que se disolvieron los solidos. Se anadio HBr al 33% en acido acetico (25 ml) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas. Entonces se vertio la mezcla en hexano (1000 ml, enfriada previamente en un congelador a -20°C) a -20°C. Precipito un solido blanco. Se detuvo la agitacion tras 10 min y se permitio que el solido sedimentara durante 5 min a temperatura ambiente. Se retiro el disolvente mediante decantacion, y se lavo el solido humedo con acetona (2 X 400 ml). Tras decantar el sobrenadante, se anadio disolucion de NaHCO3 0,3 N (400 ml) y se continuo la agitacion hasta que se disolvio el solido completamente. Entonces se dializo la disolucion usando tubos de 1 kDa. Durante las cuatro primeras horas de dialisis, se reemplazo el agua desionizada una vez cada hora y se uso agua MilliQ para el ultimo reemplazo. Entonces se filtro la disolucion dializada y se liofilizo hasta un peso constante (3,93 g, PM: 20,84 kDa).
Ejemplo 29
Ester de PGGA parcial-20% de alanina
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Se pesaron PGA parcial-20% de alanina-Na (2 g), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (7,62 g, 39,75 mmol) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (2,44 g, 15,90 mmol) en un matraz de fondo redondo de 250 ml secado en horno con una barra de agitacion magnetica. Se anadio dimetilformamida (DMF) anhidra (100 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 0,5 horas. Se anadio diester de Glu.HCl (7,84 g, 26,49 mmol) y se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 24 horas bajo una atmosfera de nitrogeno. Se vertio la mezcla de reaccion lentamente en agua destilada (200 ml) con agitacion. Se formo un precipitado blanco. Se aislo el precipitado mediante filtracion y se lavo el residuo con agua desionizada (5 X 100 ml). Se seco el precipitado blanco y se liofilizo durante mas de 24 horas. Se seco adicionalmente el solido blanco mediante P2O5 a alto vacio durante la noche para proporcionar el producto final (4,10 g, PM: 31,67 kDa).
Ejemplo 30
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Se pesaron PGA parcial- 20% de leucina-Na (2,0 g), EDC (7,62 g, 39,75 mmol) y HOBt (2,44 g, 15,90 mmol) en un matraz de fondo redondo de 250 ml secado en horno con una barra de agitacion magnetica. Se anadio DMF anhidro (100 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 0,5 horas. Se anadio diester de Glu.HCl (7,84 g,
26,49 mmol). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante 24 horas bajo una atmosfera de nitrogeno. Se vertio la disolucion de reaccion lentamente en agua destilada (200 ml) con agitacion. Se formo un precipitado blanco. Se aislo el precipitado mediante filtracion y se lavo el residuo con agua desionizada (5 x 100 ml). Se seco el precipitado blanco y se liofilizo a lo largo de 24 horas. Se seco adicionalmente el solido blanco mediante P2O5 a alto vado durante la noche para proporcionar el producto final (4,4 g, PM: 66,64 kDa).
Ejemplo 31
PGGA-20% de alanina
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A ester de PGGA parcial-20% de alanina (4,0 g) en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con una barra de agitacion magnetica se le anadio acido trifluoroacetico (TFA) (25 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (aproximadamente 16 horas). Se retiro el acido trifluoroacetico mediante vado. Al residuo se le anadio agua (1000 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas). Se congelo la disolucion y se liofilizo hasta un peso constante (2,92 g, PM: 20,65 kDa).
Ejemplo 32
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A ester de PGGA parcial-10% de leucina (4,3 g) en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con una barra de agitacion magnetica se le anadio TFA (25 ml). Se agito la mezcla a temperatura ambiental durante la noche (aproximadamente 16 horas). Se retiro TFA mediante vado. Al residuo se le anadio agua (1000 ml). Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas). Se congelo la disolucion y se liofilizo hasta un peso constante (2,87 g, PM: 49,38 kDa)
Ejemplo 33
PGGA parcial-20% de alanina-35% de PTX
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A PGGA parcial-20% de alanina (200 mg) pesado en un vial de 40 ml secado en horno se le anadio DMSO anhidro (15 ml). Se burbujeo la disolucion con N2 seco durante 5 min. Se anadieron 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (28,4 mg, 0,233 mmol) y EDC (193 mg, 1,0 mmol) en secuencia en la mezcla con agitacion (1500 rpm) hasta que se disolvieron todos los solidos. Se anadio PTX (107,69 mg) en una porcion. Se agito la disolucion a temperatura ambiental durante 48 horas. Se monitorizo el avance de la reaccion mediante CCF y se continuo hasta que se completo segun se determina mediante CCF. Se vertio la disolucion lentamente en disolucion de HCl 0,2 N con agitacion fuerte. Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas). Se filtro la disolucion usando un filtro de membrana de 0,20 |im. Se congelo la disolucion y se liofilizo hasta un peso constante (0,165 g, PM: 29,21 kDa).
Ejemplo 34
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A PGGA parcial-10% de leucina (200 mg) pesado en un vial de 40 ml secado en horno se le anadio DMSO anhidro (15 ml). Se burbujeo la disolucion con N2 seco durante 5 min. Se anadieron DMAP (28,4 mg, 0,233 mmol) y EDC (193 mg, 1,0 mmol) en secuencia en la mezcla con agitacion (1500 rpm) hasta que se disolvieron todos los solidos. Se anadio PTX (107,69 mg) en una porcion y se agito la disolucion resultante a temperatura ambiental durante 48 horas. Se monitorizo el avance de la reaccion mediante CCF y se continuo hasta que se completo segun se determina mediante CCF. Entonces se vertio la disolucion lentamente en disolucion de HCl 0,2 N con agitacion fuerte. Se realizo dialisis (PMC: 1 kDa, 10x cambios de agua a lo largo de 24 horas). Se filtro la disolucion usando un filtro de membrana de 0,20 |im. Se congelo la disolucion y se liofilizo hasta un peso constante (0,372 g, PM: 82,46 kDa).
Ejemplo 35
Estudios de liberacion de farmacos anticancerigenos
Instrumento de CL-EM, metodologfa y normas.
Instrumento de CL-EM (Agilent LC 1100, MS G1956B)
Columna (Agilent Eclipse XDB C18, 5 |im, 150 x 4,6 mm, n.° SN B07016) Disolvente A: agua Milli Q con acido formico al 0,1%
Disolvente B: acetonitrilo de calidad para CL-EM con acido formico al 0,1%
Velocidad de flujo: 0,8 ml/min
Longitud de onda de deteccion: 230 nm
Temperatura de columna: 25°C
Temperatura de camara de muestra: 4°C
Gradiente: Tiempo **(min) % de A_____% de B
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15
5 95
20
5 95
21
80 20
24
80 20
Modo de deteccion de EM: positivo; intervalo: 70-200
Se ejecuto el patron de paclitaxel en metanol una vez tras cada conjunto de muestra para garantizar que la idoneidad del sistema era valida, lo que se definio como % de DER < 2%.
Conjugados de polfmero-paclitaxel con cantidades variables de poli(L-glutamina):
(1) PGGA-PTX (control)
(2) PGGA-50% de Q-20% de PTX
(3) PGGA-40% de Q-20% de PTX
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(4) PGGA-30% de Q-20% de PTX
(5) PGGA-20% de Q-20% de PTX
Se realizo analisis de la liberacion de farmaco de los conjugados de poKmero-paclitaxel mediante el metodo de CLEM. Se disolvio una disolucion de los conjugados de poUmero-paclitaxel (0,36 mg/ml como equivalente de paclitaxel) en 1 ml de plasma humano al 20% en PBS. Se colocaron los viales de muestra en una incubadora a 37°C con agitacion continua. En un intervalo de tiempo predefinido (4, 8, 24, 48, 72 y 96 h), se retiraron de la incubadora dos viales de cada farmaco mas un control y se extrajeron con 2 x 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) tal como sigue. Se retiro el EtOAc mediante SpeedVac. Se reconstituyo el residuo con 1 ml de metanol, se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,2 |im y se envio para analisis mediante CL-EM. Los resultados se muestran en la figura 8.
Los resultados de la figura 8 ilustran la tasa de liberacion de paclitaxel como una funcion del porcentaje de poli(L- glutamina) contenida dentro del conjugado de copolfmero a lo largo del tiempo. Los datos mostrados en la figura 8 muestran que la composicion de copolfmero de conjugados que contienen una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) puede usarse para controlar generalmente la tasa de liberacion de paclitaxel, en estas condiciones. Tal como se muestra en la figura 8, aumentar el porcentaje de poli(L-glutamina) contenida dentro del conjugado de polfmero proporciona una tasa de liberacion aumentada del farmaco anticancengeno, paclitaxel, a lo largo de varias horas en comparacion con el conjugado de polfmero de control.
Conjugados de polfmero-paclitaxel con pesos moleculares variables de PGGA:
(1) PGGA-PTX (control),
(2) PGGA de 19k Da-20% de Q-20% de PTX
(3) PGGA de 33k Da-20% de Q-20% de PTX
(4) PGGA de 47k Da-20% de Q-20% de PTX
Se realizo analisis de la liberacion de farmaco de los conjugados de polfmero-paclitaxel con pesos moleculares variables de PGGA mediante el metodo de CL-EM. Se disolvio una disolucion de los conjugados de polfmero- paclitaxel (0,36 mg/ml como equivalente de paclitaxel) en 1 ml de plasma humano al 20% en PBS. Se colocaron los viales de muestra en una incubadora a 37°C con agitacion continua. En un intervalo de tiempo predefinido (4, 8, 24, 48, 72 y 96 h), se retiraron de la incubadora dos viales de cada farmaco mas un control y se extrajeron con 2 x 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) tal como sigue. Se retiro el EtOAc mediante SpeedVac. Se reconstituyo el residuo con 1 ml de metanol, se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0,2 |im y se envio para analisis mediante CL-EM. Los resultados se muestran en la figura 9.
Los resultados de la figura 9 ilustran la tasa de liberacion de paclitaxel como una funcion del peso molecular de conjugados de copolfmero que contienen unidades recurrentes de poli(L-glutamina) a lo largo del tiempo. Los datos mostrados en la figura 9 muestran que el peso molecular de conjugados de copolfmero que contienen una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) de pesos moleculares variables puede usarse para controlar generalmente la tasa de liberacion de paclitaxel, en estas condiciones.
Conjugados de polfmero-paclitaxel que contienen cantidades variables de poli(L-alanina) o poli(L-leucina):
(1) PGGA-PTX (control),
(2) PGGA-20% de A-20% de PTX
(3) PGGA-10% de A-20% de PTX
(4) PGGA-20% de L-20% de PTX
(5) PGGA-10% de L-20% de PTX
Se realizo analisis de la liberacion de farmaco de los conjugados de polfmero-paclitaxel mediante el metodo de CLEM. Se disolvio una disolucion de los conjugados de polfmero-paclitaxel (0,36 mg/ml como equivalente de paclitaxel) en 1 ml de plasma humano al 20% en PBS. Se colocaron los viales de muestra en una incubadora a 37°C con agitacion continua. En un intervalo de tiempo predefinido (4, 8, 24, 48, 72 y 96 h), se retiraron de la incubadora dos viales de cada farmaco mas un control y se extrajeron con 2 x 2 ml de acetato de etilo (EtOAc) tal como sigue. Se retiro el EtOAc mediante SpeedVac. Se reconstituyo el residuo con 1 ml de metanol, se filtro a traves de un filtro de
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jeringa de 0,2 |im y se envio para analisis mediante CL-EM. Los resultados se muestran en la figura 10.
Los resultados de la figura 10 ilustran la tasa de liberacion de paclitaxel como una funcion de la cantidad de unidades recurrentes de poli(L-alanina) o poli(L-leucina) en el conjugado de copoUmero a lo largo del tiempo. Los datos mostrados en la figura 10 muestran que la composicion de copolfmero de conjugados que contienen una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) puede usarse para controlar generalmente la tasa de liberacion de paclitaxel, en estas condiciones. Tal como se muestra en la figura 10, aumentar el porcentaje de poli(L-alanina) o poli(L-leucina) contenidas dentro del conjugado de polfmero proporciona una tasa de liberacion aumentada del farmaco anticancengeno, paclitaxel, a lo largo de varias horas en comparacion con el conjugado de polfmero de control.
Ejemplo 36
Estudios de MTT de citotoxicidad in vitro
Se evaluaron conjugados de polfmeros descritos en el presente documento que conteman paclitaxel para determinar su efecto sobre la proliferacion de celulas de melanoma B16F0 a varias concentraciones diferentes del farmaco. Se llevo a cabo ensayo de MTT citotoxico segun se notifica en Monks et al. JNCI 1991, 83, 757-766.
Ejemplo 37
Ensayo in vivo
Establecimiento de xenoinjerto de tumor NCI-H460
Se adquirio la lmea celular NCI-H460 de la ATCC y se mantuvo en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 |ig/ml. Las celulas estaban en crecimiento en fase logantmica cuando se recogieron. Se tripsinizaron las celulas ligeramente con tripsina-EDTA y se recogieron del cultivo tisular. Se conto el numero de celulas viables y se determino en un hemocitometro en presencia de azul tripano (solo se contaron celulas viables). Se inocularon a cada raton por via subcutanea en el flanco derecho 0,1 ml de un inoculo de 3 x 106 celulas NCI-H460 usando una jeringa y aguja 25 G (un inoculo por raton). Se monitorizo el volumen tumoral dos veces a la semana. Tambien se tomaron mediciones de peso corporal. Se calculo el volumen tumoral usando la formula: Volumen tumoral = (longitud x (anchura)2)/2.
Eficacia de los articulos de prueba
Una vez que los tumores establecidos alcanzaron aproximadamente 75 - 125 mm3 (volumen tumoral promedio a 100 mm3), se asignaron los ratones a los grupos de control de vehnculo y diversos grupos de tratamiento, de modo que los volumenes tumorales medios en los grupos tratados estaban dentro del 10% del volumen tumoral medio en el grupo de control de vehfculo, y el % de cV del volumen tumoral era de menos del 25%. El mismo dfa, se inyectaron artfculos de prueba recien preparados y el grupo de control de vehfculo a traves de una vena de la cola a dosificaciones de 175 y 250 mg (equiv. de PTX)/kg, y un volumen de dosificacion de 10 ml/kg. Se monitorizo el volumen tumoral dos veces a la semana. Tambien se tomaron mediciones de peso corporal. Se calculo el volumen tumoral usando la formula proporcionada anteriormente. El volumen tumoral individual alcanzo 3000 mm3 o el tumor se ulcero y los animales se sacrificaron basandose en regulaciones del IACUC.
Medicion del peso corporal
Se monitorizaron los pesos corporales y se registraron diariamente durante la primera semana comenzando el primer dfa de tratamiento y dos veces a la semana despues de la primera semana, incluyendo el dfa de finalizacion del estudio.
Preparacion de disolucion de administracion
Las disoluciones de administracion se prepararon de manera reciente el dfa de administracion. Se disolvieron los artfculos de prueba en PBS (pH 7,4) a una concentracion de equivalente de PTX/ml para cumplir la dosificacion y el volumen de dosificacion de 10 ml por kilogramo. Se diluyo Abraxane (calidad clmica) en solucion salina a una concentracion de 8 mg/ml (equivalente de PTX).
Los resultados se muestran en las figuras 11 y 12. La figura 11 ilustra que el volumen del tumor disminuye en un mayor grado tras la inyeccion con un conjugado de polfmero que incluye una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) tal como se describe en el presente documento a diversas dosificaciones en comparacion con el control de vehfculo. La figura 12 muestra que los conjugados de polfmero que incluyen una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III) tal como se describe en el presente documento a diversas dosificaciones reducen el volumen tumoral en un mayor grado que el control de vehfculo.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    10
    15
    Un conjugado de poKmero que comprende una unidad recurrente de formula (I), una unidad recurrente de formula (II) y una unidad recurrente de formula (III):
    imagen1
    cada A1 y cada A2 son independientemente oxfgeno o NR5, en el que R5 es hidrogeno o alquilo C1-4;
    cada R1 y cada R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio, un metal alcalino y un compuesto que comprende un farmaco anticancengeno, siempre que al menos uno de R1 y R2 sea un compuesto que comprende un farmaco anticancengeno;
    cada R3 y cada R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, un grupo alquilo C1-10, un grupo arilo C6-20, amonio y un metal alcalino; y
    cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en
    imagen2
  2. 2. El conjugado de polfmero de la reivindicacion 1, en el que el compuesto que comprende el farmaco
    anticancengeno comprende ademas un grupo conector.
  3. 3. El conjugado de poKmero de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el compuesto que comprende el farmaco anticancengeno se une directamente a A1.
    5 4. El conjugado de polfmero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el farmaco anticancengeno
    se selecciona del grupo que consiste en un taxano, Camptotheca y antraciclina.
  4. 5.
    10
  5. 6.
    El conjugado de polfmero de la reivindicacion 4, en el que el taxano se selecciona del grupo que consiste en paclitaxel y docetaxel.
    El conjugado de polfmero de la reivindicacion 4, en el que el taxano es paclitaxel.
  6. 7.
    15
  7. 8.
    20 9.
  8. 10.
    El conjugado de polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el conjugado de polfmero comprende una cantidad del farmaco anticancengeno en el intervalo del 1% al 50% (peso/peso) basandose en la razon de masas del farmaco anticancengeno con respecto al conjugado de polfmero.
    El conjugado de polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el otro de R1 y R2 es un metal alcalino, y cada R3 y cada R4 son un metal alcalino.
    El conjugado de polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el otro de R1 y R2 es hidrogeno, y cada R3 y cada R4 son hidrogeno.
    El polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cada A1 y cada A2 son oxfgeno.
    25 11.
    El conjugado de polfmero segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cada R6 es
    imagen3
  9. 12.
    30
  10. 13.
    35
  11. 14.
    40
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    El conjugado de polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cada R6 es
    imagen4
    El conjugado de polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cada R6 es
    imagen5
    El conjugado de polfmero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el conjugado de polfmero comprende del 1% en moles al 70% en moles de la unidad recurrente de formula (III) basandose en los moles totales de unidades recurrentes de formulas (I), (II) y (III).
    Una composicion farmaceutica que comprende uno o mas compuestos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y al menos uno seleccionado de un excipiente, un portador y un diluyente farmaceuticamente aceptables.
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