ES2666380T3 - Vector de transcripción de ARN y sus usos - Google Patents
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Abstract
Un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora de la traducción (TE) que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1, una secuencia de ácido nucleico transcribible y una secuencia de retención nuclear representada por la SEQ ID NO. 4.
Description
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Describieron una secuencia que es complementaria a las secuencias en el ARN ribosómico 18S. Descubrieron que este motivo tenía una profunda influencia en la eficiencia de la traducción (Hu et al., 1999).
Más tarde, se demostró que este motivo funciona como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y se demostró que los segmentos no superpuestos más cortos de este líder 5' podrían potenciar la traducción de un segundo cistrón en un ARNm dicistrónico. Uno de estos segmentos tenía 9 nucleótidos de longitud y cuando se unieron varias copias de este módulo IRES, la actividad de IRES se mejoró enormemente. Una repetición en tándem del mismo segmento 9n, intercalada por 9n fragmentos de la beta-globina UTR 5' humana, se demostró que funciona como un potenciador de la traducción (TE) en un ARNm monocistrónico cuando se coloca en el extremo 5' del ARNm, en frente del ORF.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, puede usarse cualquier secuencia que funcione como potenciador de la traducción para ARNm, por ejemplo, aquellos elementos descritos anteriormente en la presente memoria. En particular, un potenciador de la traducción es una secuencia en el ARN transcrito que facilita la traducción. Un posible modo de acción es mediante la potenciación de la unión del ribosoma al extremo 5' del ARNm.
En un ejemplo particular, el vector de acuerdo con esta invención puede producir ARN que contiene una repetición en tándem 10x de la secuencia 9n de tipo silvestre de la secuencia líder Gtx: CCGGCGGGT. Estos motivos están unidos por una secuencia 9n derivada de la UTR 5' de beta globina humana: TTCTGACAT. Este fragmento de ADN se puede clonar en el plásmido entre la secuencia promotora del bacteriófago y el ORF (marco de lectura abierto).
En una realización particular, el potenciador de la traducción de acuerdo con la presente invención tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. Como es evidente a partir de la Figura8, las SEQ ID NOs: 2 y 3 tienen una identidad de secuencia de al menos 80% en comparación con la SEQ ID NO: 1, y por lo tanto son adecuadas para usarse en conexión con la presente invención. Más preferiblemente, el potenciador de la traducción de acuerdo con la presente invención tiene al menos un 85%, 86%, 87%, 88% o 89% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. Como es evidente a partir de la Figura8, las SEQ ID NOs: 2 y 3 tienen una identidad de secuencia de al menos el 85% en comparación con la SEQ ID NO: 1. Incluso más preferiblemente, el potenciador de la traducción de acuerdo con la presente invención tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. Como es evidente a partir de la Figura8, la SEQ ID NO: 3 tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% en comparación con la SEQ ID NO: 1. Incluso más preferiblemente, el potenciador de la traducción está representado por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2 o 3; lo más preferiblemente la SEQ ID NO: 1.
Secuencia de retención nuclear
La importancia de los procesos de control genético postranscripcional se ha vuelto cada vez más evidente en los últimos años. Entre estos procesos, uno que comenzó a recibir considerable atención es el control de la estabilidad del ARNm. Con el creciente reconocimiento de que la degradación del ARNm tiene un profundo impacto en la expresión génica y que las tasas de degradación del ARNm pueden modularse en respuesta a señales ambientales y de desarrollo, ahora se está llevando a cabo un esfuerzo de investigación vigoroso para comprender este proceso. Se ha logrado un progreso significativo y los estudios en los últimos 20 años han dilucidado una serie de características generales de la degradación del ARNm.
Tanto los ARNm celulares como los virales están sujetos a rutas robustas de degradación del ARN. Los virus han desarrollado diferentes métodos para proteger su ARNm de los mecanismos de desadenilación del huésped. El ARN poliadenilado no traducido (PAN) del virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) es muy abundante en el núcleo de las células infectadas. Este ARN es resistente a la desadenilación y a la degradación. La acumulación de PAN depende de la actividad de un elemento de RNA de 79 nucleótidos en la región 3', llamado ENE (elemento de expresión y retención nuclear). Conrad et al. publicó en 2005 el primer artículo relacionado con ENE al describirlo como un elemento de ARN del virus del sarcoma de Kaposi que produjo una mayor abundancia nuclear de transcripciones sin intrón (Conrad, 2005). El fragmento ENE contiene una estructura de horquilla específica rica en U que interactúa con la cola de poli-A. Como tal, se obtiene una estructura secundaria que da como resultado la retención del ARN en el núcleo y de ahí el nombre de elemento de retención nuclear. Un efecto secundario es la interacción de la estructura de horquilla rica en U con la cola de poli-A del ARNm, que produce un efecto de "blindaje" de la degradación por el huésped, un rasgo que es de particular interés en la producción de ARNm con fines inmunoterapéuticos.
El ARN nuclear poliadenilado (PAN) (también conocido como ARN T1.1 o nut-1) es un IncARN producido por el virus gamma del herpes oncogénico, virus del herpes asociado con el sarcoma de Kaposi (KSHV) (Sun et al., 1996). El ARN PAN se acumula hasta niveles extraordinariamente altos (~500.000 copias/célula) durante la infección lítica y se requiere para la producción de proteínas virales tardías y virus infeccioso (Sun et al., 1996). El elemento de expresión y retención nuclear (ENE), localizado -120 nt secuencia arriba del sitio de poliadenilación del ARN PAN, es esencial para esta alta acumulación en el núcleo (Conrad y Steitz, 2005). El ENE inhibe la rápida descomposición del ARN PAN bloqueando la desadenilación (Conrad et al., 2006). El ARN PAN no produce expresión de proteína.
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El término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ADN secuencia arriba (5') de la secuencia codificante de un gen, que controla la expresión de dicha secuencia codificante proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa. La región promotora puede incluir sitios de unión o reconocimiento adicionales para otros factores implicados en la regulación de la transcripción de dicho gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariota o eucariota. Un promotor puede ser "inducible" e iniciar la transcripción en respuesta a un inductor, o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un inductor. Un promotor inducible se expresa solo en muy pequeña medida o no se expresa en absoluto, si falta un inductor. En presencia del inductor, el gen se "activa" o se aumenta el nivel de transcripción. Esto generalmente está mediado por la unión de un factor de transcripción específico.
En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico transcribible se selecciona del listado que comprende ARNm que codifica CD40L (NM_000074), CD70 (NM_001252), caTLR4 ((una versión truncada del gen TLR4 humano, que contiene solo la región transmembrana y citoplasmática del gen, precedida por el péptido señal de LAMP1 (proteína de membrana asociada a lisosomas) o ARNm específico del antígeno/enfermedad.
El promotor de bacteriófago de acuerdo con esta invención, puede ser cualquier promotor adecuado para la transcripción de ARN y preferiblemente se selecciona del listado que comprende el promotor T7, el promotor SP6 y el promotor T3; más en particular el promotor T7.
La cola de poli-A como se usa en el contexto de esta invención, preferiblemente consiste en entre y aproximadamente 100-150 adenosinas, más en particular 120-125 adenosinas, preferiblemente aproximadamente 124 adenosinas.
Los términos "casete de poliadenilo" o "secuencia de poli-A" se refieren a una secuencia de residuos de adenilo que típicamente se localiza en el extremo 3' de una molécula de ARN. La invención prevé que dicha secuencia esté unida durante la transcripción de ARN por medio de una plantilla de ADN con base en residuos de timidilo repetidos en la cadena complementaria a la cadena codificante, mientras que dicha secuencia normalmente no es codificada en el ADN, sino que está unida al extremo 3' libre del ARN mediante una ARN polimerasa independiente de la plantilla después de la transcripción en el núcleo. De acuerdo con la invención, una secuencia de poli(A) de este tipo se entiende que significa una secuencia de nucleótidos de al menos 20, preferiblemente al menos 40, preferiblemente al menos 80, preferiblemente al menos 100 y preferiblemente hasta 500, preferiblemente hasta 400, preferiblemente hasta 300, preferiblemente hasta 200, y en particular hasta 150 nucleótidos A consecutivos, y en particular aproximadamente 120 nucleótidos A consecutivos, en donde el término "nucleótidos A" se refiere a residuos de adenilo.
La invención proporciona además una molécula de ARN que puede obtenerse por transcripción del vector de ácido nucleico de acuerdo con esta invención.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para aumentar la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN transcrito in vitro; dicho método comprende las etapas de:
- (i)
- proporcionar un vector de acuerdo con esta invención en el que dicha secuencia de ácido nucleico transcribible es una secuencia de ADN transcribible, que corresponde a dicho ARN a transcribir; y
- (ii)
- transcribir in vitro la secuencia de ADN transcribible,
así como una molécula de ARN que puede obtenerse mediante dicho método.
De acuerdo con la invención, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro" en el que el término "transcripción in vitro" se refiere a un método en el que ARN, en particular ARNm, se sintetiza in vitro de una manera libre de células. La preparación de transcripciones preferiblemente hace uso de vectores de clonación que generalmente se denominan vectores de transcripción y que están incluidos de acuerdo con la invención bajo el término "vector".
El término "secuencia de ácido nucleico transcrita a partir de una secuencia de ácido nucleico" se refiere a ARN, cuando sea apropiado como parte de una molécula de ARN completa, que es un producto de transcripción de la última secuencia de ácido nucleico.
El término "ácidos nucleicos que pueden transcribirse para producir un transcrito común" significa que dichos ácidos nucleicos están funcionalmente unidos entre sí de tal manera que, cuando sea apropiado después de la linealización tal como la escisión por enzimas de restricción de la molécula de ácido nucleico que comprende dichos ácidos nucleicos, en particular de una molécula de ácido nucleico circular cerrada, la transcripción bajo el control de un promotor da como resultado una molécula de ARN que comprende los transcritos de dichos ácidos nucleicos unidos covalentemente entre sí, separados cuando sea apropiado por secuencias localizadas en medio.
De acuerdo con la invención, el término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción
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de ARN y/o proteína. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas.
El término "secuencia de ácido nucleico que es activa para aumentar la eficacia y/o estabilidad de traducción de una secuencia de ácido nucleico" significa que el primer ácido nucleico es capaz de modificar, en una transcripción común con el segundo ácido nucleico, la eficacia y/o estabilidad de la traducción de dicho segundo ácido nucleico de tal manera que dicha eficacia y/o estabilidad de traducción se incrementa en comparación con la eficacia y/o estabilidad de traducción de dicho segundo ácido nucleico sin dicho primer ácido nucleico. En este contexto, el término "eficacia de traducción" se refiere a la cantidad de producto de traducción proporcionada por una molécula de ARN dentro de un período de tiempo particular y el término "estabilidad" se refiere a la vida media de una molécula de ARN.
En una realización particular, la presente invención proporciona una molécula de ARN que comprende un potenciador de la traducción (TE) y un elemento de retención nuclear (ENE); o una composición que comprende una
o más de dichas moléculas de ARN. Más en particular, la presente invención proporciona una molécula de ARN que comprende un potenciador de la traducción (TE) que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, una secuencia de ácido nucleico transcribible y una secuencia de retención nuclear representada por la SEQ ID NO: 4; o una composición que comprende dicha molécula de ARN.
Dicha molécula de ARN puede comprender adicionalmente uno o más elementos seleccionados del listado que comprende una secuencia de ácido nucleico traducible, y una cola de poli-A; en el que dicha secuencia de ácido nucleico traducible puede seleccionarse del listado que comprende ARNm que codifica CD40L, CD70, caTLR4 o ARNm específico del antígeno/enfermedad.
En el contexto de la presente invención, el elemento TE se coloca preferiblemente en el extremo 5' de la molécula de ARN transcribible/traducible y la secuencia de retención nuclear (ENE) preferiblemente en el extremo 3'.
El "extremo 3' de un ácido nucleico" se refiere de acuerdo con la invención a ese extremo que tiene un grupo hidroxilo libre. El "extremo 5' de un ácido nucleico" se refiere de acuerdo con la invención a ese extremo que tiene un grupo fosfato libre.
En el contexto de la presente invención, "ARNm" significa "ARN mensajero" y se refiere a un transcrito que se produce usando ADN como plantilla y que a su vez codifica un péptido o proteína. Un ARNm típicamente comprende una región 5' no traducida, una región que codifica proteína y una región 3' no traducida. El ARNm tiene un tiempo medio limitado en las células. De acuerdo con la invención, el ARNm se puede preparar a partir de una plantilla de ADN mediante transcripción in vitro. Se puede modificar mediante estabilización de modificaciones y protección adicionales, además de las modificaciones de acuerdo con la invención.
En una realización particular, la composición de acuerdo con esta invención comprende ARNm que codifica CD40L, CD70 y caTLR4, ya sea en combinación o no con ARNm que codifica ARNm específico del antígeno/enfermedad.
El ARNm específico del antígeno/enfermedad de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar del listado no limitante que comprende antígenos tumorales, antígenos derivados de patógenos, alérgenos ...
La presente invención proporciona adicionalmente el uso de la molécula o moléculas de ARN y/o de la composición
o composiciones que comprenden una o más de dichas moléculas de ARN para múltiples propósitos, tales como por ejemplo para la introducción in vivo o in vitro en una célula huésped in vitro; o para usar como un medicamento. También es un aspecto de la presente invención proporcionar un kit que comprende uno o más vectores; una o más moléculas de ARN o una composición de acuerdo con la presente invención.
La presente divulgación también se refiere a los productos de la invención para uso en un método para tratar a un paciente que lo necesita con una o más moléculas de ARN o una composición de acuerdo con la invención; en donde, dichas moléculas de ARN pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente con intervalos.
La invención proporciona ácidos nucleicos en particular ARN para administrar a un paciente. Los ácidos nucleicos se pueden administrar mediante métodos ex vivo, es decir, removiendo células de un paciente, modificando genéticamente dichas células (por ejemplo, mediante transfección) y reintroduciendo las células modificadas en el paciente. Los métodos de transfección y transducción son conocidos por el trabajador experto. La invención también proporciona ácidos nucleicos para ser administrados in vivo.
De acuerdo con la invención, el término "transfección" se refiere a la introducción de uno o más ácidos nucleicos en un organismo o en una célula huésped. Se pueden emplear diversos métodos para introducir de acuerdo con la invención ácidos nucleicos en células in vitro o in vivo. Tales métodos incluyen la transfección de precipitados de ácido nucleico-CaP04, la transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, la transfección de infección con virus que portan los ácidos nucleicos de interés, transfección mediada por liposomas y similares. En realizaciones
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particulares, se da preferencia a dirigir el ácido nucleico a células particulares. En dichas realizaciones, un vehículo usado para administrar un ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede tener una molécula de direccionamiento unida. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie en la célula diana, o un ligando para un receptor en la célula diana puede incorporarse o unirse al portador de ácido nucleico. Si se desea la administración de un ácido nucleico por liposomas, las proteínas que se unen a una membrana superficial asociada con endocitosis se pueden incorporar en la formulación de liposomas con el fin de permitir el direccionamiento y/o absorción. Dichas proteínas incluyen proteínas de la cápside
o fragmentos de la mismas que son específicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se internalizan, proteínas dirigidas a un sitio intracelular, y similares.
Las moléculas de ARN o las composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un paciente que lo necesite por cualquier vía de administración adecuada tal como, por ejemplo, intranodal, intradérmica, intralinfática e intratumoral. Además, cuando se tratan por ejemplo pacientes con cáncer, la administración de las moléculas o composiciones de ARN de acuerdo con esta invención, puede usarse en combinación con métodos para liberar ARNm tumoral del tumor en el paciente, tal como por ejemplo ablación o sonoporación. De acuerdo con la invención, pueden usarse métodos estándar para preparar ácidos nucleicos recombinantes, cultivando células, en particular electroporación y lipofección. Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de una manera ya conocida.
De acuerdo con la invención, una "secuencia de ácido nucleico que se deriva de una secuencia de ácido nucleico" se refiere a un ácido nucleico que contiene, en comparación con el ácido nucleico del que deriva, sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de nucleótidos únicos o múltiples y que es preferiblemente complementaria al ácido nucleico del que se deriva, es decir, existe un cierto grado de homología entre dichos ácidos nucleicos y las secuencias de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos se corresponden de una manera directa o complementaria significativa. De acuerdo con la invención, un ácido nucleico derivado de un ácido nucleico tiene una propiedad funcional del ácido nucleico del que se deriva. Tales propiedades funcionales incluyen en particular la capacidad de aumentar, en un enlace funcional con un ácido nucleico que puede transcribirse en ARN (secuencia de ácido nucleico transcribible), la estabilidad y/o la eficacia de traducción del ARN producido a partir de este ácido nucleico en la molécula competa de ARN.
Un ácido nucleico es "complementario" a otro ácido nucleico si las dos secuencias pueden hibridarse entre sí y formar un dúplex estable, llevándose a cabo dicha hibridación preferiblemente en condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas). Se describen condiciones rigurosas, por ejemplo, en Molecular Cloning: A laboratory manual, J Sambrook et al.
De acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos complementarios tienen nucleótidos que son al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idénticos.
De acuerdo con la invención, se considera que una primera región polinucleotídica está localizada aguas abajo de una segunda región polinucleotídica, si el extremo 5' de dicha primera región polinucleotídica es la parte de dicha primera región polinucleotídica más próxima al extremo 3' de dicha segunda región polinucleotídica.
La región 3' no traducida típicamente se extiende desde el codón de terminación para un producto de traducción hasta la secuencia poli-A que habitualmente se une después del proceso de transcripción. Las regiones 3' no traducidas de ARNm de mamífero tienen típicamente una región de homología conocida como la secuencia de hexanucleótidos AAUAAA. Esta secuencia es presumiblemente la señal de unión de poli-A y se localiza frecuentemente entre 10 y 30 bases secuencia arriba del sitio de unión de poli-A.
Las regiones 3' no traducidas pueden contener una o más repeticiones invertidas que pueden plegarse para proporcionar estructuras de tallo-bucle, que actúan como barreras para exorribonucleasas o interactúan con proteínas que se sabe que aumentan la estabilidad del ARN (por ejemplo, proteínas de unión a ARN).
Las regiones 5' y/o 3' no traducidas pueden, de acuerdo con la invención, estar unidas funcionalmente a un ácido nucleico transcribible y en particular a un ácido nucleico codificante, de modo que estas regiones se asocien con el ácido nucleico de tal manera que la estabilidad y/o la eficacia de traducción del ARN que se transcribe a partir de dicho ácido nucleico transcribible se incrementan.
De acuerdo con la invención, el término "gen" se refiere a una secuencia particular de ácido nucleico, que es responsable de producir uno o más productos celulares y/o por lograr uno o más productos celulares y/o por lograr uno o más productos intercelulares o funciones intracelulares. Más específicamente, dicho término se refiere a una sección de ADN, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína específica o una molécula de ARN funcional o estructural.
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De acuerdo con la invención, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término "célula huésped" comprende, de acuerdo con la invención, células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células de levadura y células de insecto). Se da preferencia particular a células de mamífero tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células se pueden derivar de una multiplicidad de tipos de tejidos y comprenden células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de médula ósea y células madre embrionarias. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. Un ácido nucleico puede estar presente en la célula huésped en una sola o en varias copias y, en una realización, se expresa en la célula huésped.
De acuerdo con la invención, un péptido o proteína codificada por un ácido nucleico puede ser un péptido o proteína que se localiza en el citoplasma, en el núcleo, en la membrana, en los orgánulos o en forma secretada. Incluyen proteínas estructurales, proteínas reguladoras, hormonas, neurotransmisores, factores reguladores del crecimiento, factores de diferenciación, factores reguladores de la expresión génica, proteínas asociadas al ADN, enzimas, proteínas séricas, receptores, medicamentos, inmunomoduladores, oncogenes, toxinas, antígenos tumorales o antígenos. Dichos péptidos o proteínas pueden tener una secuencia natural o una secuencia mutada con el fin de potenciar, inhibir, regular o eliminar su actividad biológica.
El término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4
o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 o más, preferiblemente 100 o preferiblemente 150 aminoácidos consecutivos unidos entre sí a través de enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente péptidos que tienen al menos 151 aminoácidos, pero los términos "péptido" y "proteína" se usan aquí habitualmente como sinónimos. Los términos "péptido" y "proteína" comprenden de acuerdo con la invención sustancias que contienen no solo componentes de aminoácidos sino también componentes no aminoácidos tales como azúcares y estructuras de fosfato, y también comprenden sustancias que contienen enlaces tales como enlaces éster, tioéter o disulfuro.
El "informador" se refiere a una molécula, típicamente un péptido o proteína, que es codificada por un gen indicador y medida en un ensayo informador. Los sistemas convencionales usualmente emplean un informador enzimático y miden la actividad de dicho informador.
De acuerdo con la invención, dos elementos, tales como nucleótidos o aminoácidos son consecutivos, si están directamente adyacentes entre sí, sin ninguna interrupción. "Endonucleasas de restricción" o "enzimas de restricción" se refieren a una clase de enzimas que escinden enlaces fosfodiéster en ambas cadenas de una molécula de ADN dentro de secuencias de bases específicas. Reconocen sitios de unión específicos, conocidos como secuencias de reconocimiento, en una molécula de ADN de doble cadena. Los sitios en los que dichos enlaces fosfodiéster en el ADN se escinden mediante dichas enzimas se denominan sitios de escisión. En el caso de las enzimas tipo IIS, el sitio de escisión se localiza a una distancia definida del sitio de unión al ADN.
Áreas de aplicación
Un área de aplicación de la presente invención es la vacunación, es decir, el uso de ARNm modificado para inoculación o el uso de una composición farmacéutica que comprende el ARNm modificado como agente inoculante,
o el uso de ARNm modificado en la preparación de una composición farmacéutica para fines de inoculación. La vacunación se basa en la introducción de un antígeno en un organismo o sujeto, en particular en una célula del organismo o sujeto. En el contexto de la presente invención, la información genética que codifica el antígeno se introduce en el organismo o sujeto en forma de un ARNm modificado que codifica el antígeno y/o las diferentes cadenas de ARNm TriMix. El ARNm modificado 'antígeno' contenido en la composición farmacéutica se traduce en un antígeno, es decir, el polipéptido o péptido antigénico codificado por el ARNm modificado se expresa y se estimula una respuesta inmune dirigida contra el polipéptido o péptido antigénico. Para la vacunación contra un organismo patógeno, por ejemplo, un virus, una bacteria o un protozoo, se puede usar un antígeno de superficie de dicho organismo como un antígeno contra el cual se provoca una respuesta inmune. En el contexto de la presente invención, se puede usar como vacuna una composición farmacéutica que comprende el ARNm modificado que codifica dicho antígeno de superficie. En aplicaciones en las que se usa una vacuna genética para tratar el cáncer, la respuesta inmune se dirige contra antígenos tumorales generando un ARNm modificado que codifica un antígeno o antígenos tumorales, en particular una proteína que se expresa exclusivamente en células cancerosas. Dicho ARNm modificado que codifica un antígeno tumoral puede usarse solo o como un componente de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, en donde la administración del ARNm modificado o una composición del mismo da como resultado la expresión del antígeno o antígenos cancerígenos en el organismo. Una respuesta inmune a tal vacuna, por lo tanto, conferiría al sujeto vacunado un grado de inmunidad protectora contra cánceres asociados con el antígeno cancerígeno inmunizante. Alternativamente, tales medidas podrían usarse para vacunar a un paciente con cáncer con un ARNm modificado que codifica un antígeno o antígenos tumorales expresados en las células cancerosas del paciente para estimular la respuesta inmune del paciente con cáncer para atacar a cualquier célula cancerosa que exprese el antígeno codificado.
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actinomicosis -anaplasmosis -ántrax -artritis, reactiva -aspergilosis -bacteriemia -infecciones bacterianas y micosis -infecciones por Bartonella -botulismo -absceso cerebral -brucelosis -infecciones por Burkholderia infecciones por Campylobacter -candidiasis -candidiasis, vulvovaginal -enfermedad por arañazo de gato -celulitis infecciones por el sistema nervioso central -cancroide -infecciones por chlamydia -infecciones por clamidia -cólera -infecciones por Clostridium -Coccidioidomicosis -úlcera corneal -infección cruzada -criptococosis dermatomicosis -difteria -ehrlichiosis -empiema, pleural -endocarditis, bacteriana -endoftalmitis -enterocolitis, pseudomembranosa -erisipela -infecciones por Escherichia coli -fascitis, necrotizante -gangrena de Fournier forunculosis -infecciones por Fusobacterium -gangrena gaseosa -gonorrea -infecciones bacterianas Gram negativas -infecciones bacterianas Gram -positivas -granuloma inguinal -Hidradenitis supurativa -histoplasmosis orzuelo -impétigo -infecciones por Klebsiella -legionelosis -lepra -leptospirosis -infecciones por listeria -angina de Ludwig -absceso pulmonar -enfermedad de Lyme -linfogranuloma venéreo -maduromicosis -melioidosis meningitis, bacteriana -infecciones por micobacteriana -infecciones por micoplasma -micosis -infecciones por Nocardia -onicomicosis -osteomielitis -paroniquia -enfermedad inflamatoria pélvica -peste -infecciones neumocócicas -infecciones por Pseudomonas -psitacosis -infección puerperal -fiebre Q -fiebre por mordida de rata -fiebre recurrente -infecciones de las vías respiratorias -absceso retrofaringeo -fiebre reumática rinoescleroma -infecciones por Rickettsia -fiebre maculosa de las Montañas Rocosas -infecciones por salmonella fiebre escarlatina -tifus del matorral -sepsis -enfermedades de transmisión sexual, enfermedades bacterianas de transmisión sexual, choque séptico -enfermedades bacterianas de la piel -enfermedades infecciosas de la piel infecciones estafilocócicas -infecciones por estreptococos -sífilis -sífilis congénita -tétanos -enfermedades transmitidas por garrapatas -tiña -tiña Versicolor -tracoma -tuberculosis -tuberculosis espinal -tularemia -fiebre tifoidea -tifus, epidemia causada por piojos -infecciones del tracto urinario -enfermedad de Whipple -tos ferina infecciones por Vibrio -guijas -infecciones por Yersinia -zoonosis -zigomicosis -etc.
Como se usa en este documento y salvo que se indique lo contrario, el término "solvato" incluye cualquier combinación que pueda formarse mediante la molécula o moléculas de ARN de esta invención con un disolvente inorgánico adecuado (por ejemplo, hidratos) o disolvente orgánico, tal como, pero sin limitarse a, agua para inyección, solución de Hartmann, PBS, NaCl al 0,9%, medio de cultivo sin suero.
Generalmente, para uso farmacéutico, la molécula o moléculas de ARN de la invención se pueden formular como una preparación farmacéutica o composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ARN de la invención y al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y/o adyuvante, y opcionalmente uno o más productos farmacéuticamente activos adicionales.
Por medio de ejemplos no limitativos, dicha formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como mediante inyección intralinfática, intratumoral, intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para administración tópica (incluido la ocular), para administración por inhalación, mediante un parche para la piel, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Tales formas de administración adecuadas, que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, de acuerdo con la forma de administración, así como los métodos y los portadores, diluyentes y excipientes para usar en la preparación de los mismos, serán claras para el experto en la materia; se hace referencia nuevamente, por ejemplo, a los documentos US-A-6.372.778, US-A-6.369.086, US-A-6.369.087 y US-A-6.372.733, así como a los manuales estándar, tal como la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales preparaciones incluyen comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, bolsitas, cápsulas lisas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles, ungüentos, cremas, lociones, cápsulas de gelatina blandas y duras, supositorios, gotas oftálmicas, soluciones inyectables estériles y polvos estériles empacados (que usualmente se reconstituyen antes del uso) para administración en bolo y/o para administración continua, que pueden formularse con vehículos, excipientes y diluyentes que son por sí mismos adecuados para tales formulaciones, tales como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, celulosa, agua (estéril), metilcelulosa, metil y propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, aceites comestibles, aceites vegetales y aceites minerales o mezclas adecuadas de los mismos. Las formulaciones pueden contener opcionalmente otras sustancias farmacéuticamente activas (que pueden o no conducir a un efecto sinérgico con los productos de la invención) y otras sustancias que se usan comúnmente en formulaciones farmacéuticas, tales como agentes lubricantes, agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, agentes dispersantes, desintegrantes, agentes de carga, rellenos, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, reguladores de flujo, agentes de liberación, etc. Las composiciones también pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del producto o productos activos contenidos en las mismas, por ejemplo, usando liposomas o matrices poliméricas hidrofílicas basadas en geles naturales o polímeros sintéticos. Para mejorar la solubilidad y/o la estabilidad de los productos de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, puede ser ventajoso emplear α-ciclodextrinas, βciclodextrinas o γ-ciclodextrinas o sus derivados.
Más en particular, las composiciones se pueden formular en una formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de partículas que consisten en una dispersión sólida de los productos de la invención y uno o más polímeros solubles en agua farmacéuticamente aceptables.
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Experimentos in vivo: ratones
Ratones DBA/2 hembra de 6 a 12 semanas de edad.
Experimentos in vivo: líneas celulares de ratón
La línea celular de mastocitoma P815 se obtuvo de C. Uyttenhove (Universidad Católica de Lovaina, Lovaina-La-Neuve, Bélgica).
Experimentos in vivo: inoculación de células tumorales y administración in situ de ARNm
Para hacer crecer tumores palpables, a los ratones se les inyectaron 5 x 105 células tumorales P815 por vía subcutánea en ambos flancos, como se indicó en el experimento. Para la administración intratumoral de ARNm, los ratones se anestesiaron con isofluorano (Abbott). Los tumores se inyectaron con una mezcla que contenía 10 μg de cada componente de ARNm TriMix en un volumen final de 50 µL. Se inyectó el tumor con solución de Hartman 0,8x cuando alcanzó un volumen de aproximadamente 100 mm3. Se usó la misma cantidad de ARNm entre los diferentes grupos. El ARNm que codifica tNGFR producido a partir de un vector pGEM sirvió como control.
Ejemplo 1
Material y métodos específicos
La generación de iDC y las condiciones de electroporación se realizan como se describe en material y métodos generales más arriba. Las iDC se electroporaron con 5 μg de cada componente de TriMix para permitir la maduración de las DC. Todas las tinciones citométricas de flujo se realizaron en PBS/BSA/azida. Para analizar la expresión de CD70, se usó anti CD70-isotiocianato de fluoresceína (FITC). La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo FACSFortessa (BD) y se analizó mediante el software FACS Diva.
Resultado:
Veinticuatro horas después de la electroporación, las DC se tiñeron para su expresión en superficie de CD70. Estos resultados muestran que después de la electroporación de las iDC con TriMix, la intensidad de la expresión de CD70 -intensidad de fluorescencia media (MFI) -es significativamente mayor después de la electroporación con TriMix codificada por el plásmido pUC TE ENE (SEQ ID NO: 5) que contiene ambos elementos reguladores (TE + ENE), cuando se compara con el vector pUC (base del plásmido pUC TE ENE), el vector pUC TE y el vector pUC ENE. La expresión de CD70 después de electroporación con TriMix codificada por el plásmido pUC TE ENE es significativamente mayor, mientras que tanto el uso de pUC TE como de pUC ENE da como resultado niveles reducidos o a lo sumo iguales de expresión de CD70 en comparación con pUC que carece de estos elementos (Figura1). Por lo tanto, la presencia de ambos elementos (TE y ENE) en el vector parece tener un efecto sinérgico inesperado en términos de aumentar la expresión de CD70 después de la electroporación con TriMix codificada por el plásmido pUC TE ENE.
Ejemplo 2
Material y métodos específicos:
Las condiciones de generación y electroporación de iDC se realizan como se describe en material y métodos generales más arriba. Las iDC se electroporaron con 20 μg de ARNm que codifica WT1 para permitir la carga de antígeno. Para analizar la expresión de WT1 intracelular, las células se fijaron y se permeabilizaron, y se tiñeron intracelularmente con un anticuerpo monoclonal anti-WT1 (clon 6F-H2, Dako Cytomation, Carpinteria, CA). Se utilizó un anticuerpo antirratón marcado con PE con el mismo isotipo de IgG como Ab secundario (Becton y Dickinson, Erembodegem, Bélgica). El anticuerpo no reactivo del mismo isotipo (eBioscience, Viena, Austria) se utilizó como control. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo FACSFortessa (BD) y se analizó mediante el software FACS Diva.
Resultado:
Estos resultados muestran que después de la electroporación de iDC con WT1 codificado por el vector pUC TE ENE, se observa una expresión de WT1 más prolongada cuando se compara con los otros vectores que codifican el ARNm de WT1 (Figura 2). Estos datos muestran muy bien las diferentes formas de acción de los segmentos 5'TE y 3'ENE. Si bien la expresión del ARNm del vector pUC-TE es alta después de 4 horas, se deteriora rápidamente. La traducción del ARN que contiene ENE es más baja que todas las demás durante todo el período. El vector PUC TE ENE tiene la más alta traducibilidad del TE y el efecto más prolongado de la secuencia de ENE. El nivel de expresión de WT1 disminuye a una velocidad significativamente más lenta que en los otros vectores.
Ejemplo 3
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Material y métodos específicos:
Las condiciones de generación y electroporación de las iDC se llevan a cabo como se divulga en material y métodos general más arriba. Las iDC se electroporaron conjuntamente con 5 μg de ARNm que codifica eGFP y TriMix (5 μg de cada componente) para permitir la carga de antígeno y la maduración de las DC. La expresión de eGFP se evaluó mediante citometría de flujo en varios momentos.
Resultado:
Se siguió la expresión de eGFP en varios puntos de tiempo después de la electroporación (Figura 3). Estos resultados muestran que el nivel de expresión de eGFP de ambos vectores es comparable 4 horas después de la electroporación. Sin embargo, en puntos temporales posteriores está claro que la expresión del ARNm derivado de pUC TE ENE es significativamente mayor. De nuevo, esto apunta a una expresión más estable y prolongada del transgén.
Ejemplo 4
Material y métodos específicos:
Las condiciones de generación y electroporación de las iDC se realizan como se describió anteriormente. Las iDC se electroporaron con 5 μg de cada componente de TriMix para permitir la maduración de las DC. Todas las tinciones citométricas de flujo se realizaron en PBS/BSA/azida. Para analizar la expresión de moléculas de superficie en la superficie celular de las DC, se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales: CD40-APC (Aloficocianina), CD70-FITC, CD80-PE, CD83-PE (ficoeritrina), CD86-PE y CCR7-APC. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo FACSFortessa (BD) y se analizó mediante el software FACS Diva.
Resultado:
La electroporación de las iDC con ARNm de TriMix codificado por el vector pUC TE EEN es capaz de inducir la maduración de las DC (Figura 4).
Ejemplo 5: modelo tumoral bilateral con P815: tratamiento único de un tumor
Material y métodos específicos:
Para hacer crecer tumores palpables, se inocularon ratones con 5 x 105 células tumorales P815 por vía subcutánea en ambos flancos. La terapia se inició cuando ambos tumores alcanzaron un volumen inyectable de aproximadamente 100 mm3. Mediante el uso de un modelo de tumor de dos lados en el que solo se trató un tumor, se intentó evaluar el efecto sistémico de la estrategia de vacunación. Por lo tanto, solo el tumor izquierdo se inyectó con ARNm de control o ARNm TriMix de pUC TE ENE (10 μg de cada componente de ARNm) disuelto en solución de Hartmann 0,8 x. La respuesta inmune antitumoral sistémica se evaluó midiendo el tamaño de tumor contralateral tratado y no tratado y por supervivencia.
Resultado:
Mediante el uso de un modelo de tumor de dos lados, se podría evaluar el efecto sistémico de la estrategia de inmunización. La administración intratumoral individual de ARNm TriMix de pUC TE ENE dio como resultado un crecimiento tumoral significativamente reducido del tumor contralateral tratado y no tratado (Figura 5). El efecto de la vacunación en el tumor distante podría ser una indicación de que una sola inyección intratumoral de TriMix podría usarse para tratar múltiples lesiones tumorales.
Ejemplo 6: Modelo de tumor de dos lados con P815: tratamiento único de un tumor, solución Hartmann y tNGFR como control
Material y métodos específicos:
Para hacer crecer tumores palpables, se inocularon ratones con 5 x 105 células tumorales P815 por vía subcutánea en ambos flancos. La terapia se inició cuando ambos tumores alcanzaron un volumen inyectable de aproximadamente 100 mm3. Mediante el uso de un modelo de tumor de dos lados por el cual solo se trató un tumor, se intentó evaluar el efecto sistémico de la estrategia de vacunación. Por lo tanto, sólo el tumor izquierdo se inyectó con vehículo (0,8 solución de Hartmann), ARNm de control o ARNm TriMix de pUC TE ENE (10 µg de cada componente de ARNm) disuelto en solución de Hartmann 0,8x, todo en un volumen total de 50 µL/tumor inyectado. La respuesta inmune antitumoral sistémica se evaluó midiendo el tamaño de tumor contralateral tratado y no tratado y por supervivencia.
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