BR112016010595B1 - Vetor de ácido nucleico, molécula de rna, composição, seus usos, bem como kit e processo de aumento de estabilidade e/ou eficiência de tradução de rna transcrito in vitro - Google Patents

Abstract

VETOR DE TRANSCRIÇÃO DE RNA E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a um vetor de transcrição de RNA aperfeiçoado, que é muito apropriado para a produção de mRNA para propósitos terapêuticos in vivo. Os aperfeiçoamentos no vetor residem na presença de um aperfeiçoador de tradução (TE) e um elemento de retenção nuclear (NRS), especialmente quando o último é o Elemento de Retenção Nuclear e Expressão? (ENE) de vírus de herpes associado com sarcoma de Kaposi (KSHV).

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção é genericamente relacionada a um vetor de transcrição de RNA aperfeiçoado, que é muito apropriado para a produção de mRNA para propósitos terapêuticos in vivo. Os aperfeiçoamentos no vetor em particular residem na presença de um intensificador de tradução e um elemento de retenção nuclear.

Antecedentes da Invenção

[002] Embora o sistema imune seja capaz de descriminar células saudáveis de células de tumor e agentes infecciosos, ele algumas vezes falha em reconhecer apropriadamente e reagir ao problema. Por isso, ciência médica focou sobre o desenvolvimento de várias estratégias que auxiliam o sistema imune na vigilância e eliminação de células de tumor e agentes infecciosos. Células dendríticas (DCs) são células apresentando antígeno (APCs) que são conhecidas como agentes chaves na instigação de respostas imunes e muito esforço foi colocado na exploração de DCs em imunoterapia. No caso de câncer, por exemplo, o objetivo é a indução e perpetuação de resposta imune específica para tumor através de desencadeamento de células T efetoras que podem diminuir especificamente carga de tumor e induzir memória imunológica para controle de recorrência de tumor. Uma vez antígenos associados com tumor (TAA) alvejáveis tenham sido identificados, eles podem ser usados para carregar as APCs profissionais, isto é, as células dendríticas, tanto in vivo como ex vivo.

[003] Diferentes formatos de antígenos foram avaliados com relação a DC para imunoterapia in vivo ou ex vivo tais como peptídeos, proteínas, extratos de células de tumor inteiro, DNA plasmídeo ou mRNA. Entre estas abordagens, mRNA codificando antígeno está emergindo como particularmente promissora. A vantagem sobre a vacinação clássica com peptídeos é que mRNA codifica a informação genética para o antígeno inteiro. O antígeno de inteiro comprimento é processado e todos os epítopos disponíveis são apresentados nas moléculas MHC do paciente, sem a necessidade de determinar peptídeos específicos HLA. Nenhum paciente precisa ser excluído do tratamento porque os peptídeos disponíveis não ajustam seu tipo de HLA. Em adição, mRNA não possui o risco de integração genômica proporcionando ao mesmo um favorável perfil de segurança comparado a vetores virais ou DNA. Devido sua natureza transiente, mRNA é somente expresso durante um curto período de tempo e é eventualmente degradado em produtos naturais. Além disso, mRNA atua como seu próprio adjuvante, impelindo sinais coestimuladores, o que é vantajoso no contexto de imunoterapia baseada em mRNA. Duas vias para liberação de mRNA exógeno em DCs foram aplicadas: tanto ex vivo com subsequente transferência adotiva de DCs transfectadas como através de administração direta de mRNA e absorção in vivo.

[004] Um estudo realizado por Diken et al. (2011) destaca que o estímulo de maturação e/ou cronometragem de sua liberação têm de ser cuidadosamente selecionadas quando a absorção de mRNA é dependente de macropinocitose, uma função de DCs imaturas que é perdida com maturação de DC. Consequentemente, co-liberação de clássicos estímulos de maturação, tal como lipo polissacarídeo (LPS), com TAA mRNA tem um impacto negativo sobre a biodisponibilidade do antígeno, um parâmetro que co-determina a indução de respostas de células T específicas de antígeno (Van Lint 2012; Diken 2011). Atualmente duas estratégias diferentes foram exploradas para carregar simultaneamente as DCs com TAA RNA e ativar as mesmas in vivo.

[005] Fotin-Mleczek et al. (2011) descreveu um sistema de dois componentes contendo mRNA livre e complexado com protamina, provendo uma fonte de antígeno para imunidade adaptativa junto com aperfeiçoado disparo do receptor de reconhecimento de patógeno, TLR7. Esta estratégia de imunização resultou na indução de uma forte resposta imune antitumor e em sustentadas respostas de memória, o que é importante, quando memória de células T deve evitar reaparecimento de tumor.

[006] Bonehill et al., 2008 avaliou o uso de específicas combinações de mRNA para propósitos adjuvantes, inicialmente para a ativação de DCs geradas ex vivo mas igualmente aplicáveis para administração e absorção direta in vivo (Bonehill, 2008). Isto conduziu a um pedido de patente (WO2009034172) onde os inventores descrevem que a capacidade estimuladora de célula T de células apresentando antígeno pulsadas com peptídeo antígeno ou células apresentando antígeno (co) eletroporadas com um mRNA codificando um TAA pode ser grandemente aperfeiçoada através de fornecimento das mesmas com diferentes adjuvantres moleculares através de eletroporação com uma mistura de moléculas de mRNA ou DNA codificando dois ou mais fatores imunoestimuladores. Prova de conceito é provida de que tais células apresentando antígeno modificadas pulsadas com um peptídeo específico de alvo ou co-eletroporadas com mRNA codificando um antígeno específico de alvo podem estimular células T específicas de antígeno in vitro e após vacinação e assim formam uma nova abordagem promissora para imunoterapia antitumor, antiviral, antibacteriana ou antifungos. Uma combinação preferida de fatores imunoestimuladores usados na invenção é CD40L e caTLR4, ou CD40L e CD70. Em outras realizações preferidas, a combinação de moléculas imunoestimuladoras CD40L, CD70 e caTLR4 é usada, que é chamada daqui por diante “TriMix”.

[007] A presente invenção refere-se a um vetor de transcrição de RNA contendo uma sequência intensificadora de tradução 5’ e uma sequência de retenção nuclear 3’. O vetor de acordo com a presente invenção, mostra um inesperado aperfeiçoamento em expressão das proteínas codificadas pelo mRNA transcrito in vivo em comparação comum vetor pUC vazio, ou com vetores que contêm tanto um intensificador de tradução ou uma sequência de retenção nuclear. Estes aperfeiçoamentos são em particular devidos à simultânea presença dos dois componentes: um intensificador de tradução e uma sequência de estabilização de RNA no vetor, e a sua incorporação no produto de expressão assim obtido. Além disso, aplicação in vivo de mRNA TriMix obtido do vetor da presente invenção em um modelo de câncer de camundongo resulta em um crescimento mais lento de tumores e uma aumentada expectativa de vida de ditos camundongos.

Sumário da Invenção

[008] Em um primeiro aspecto a presente invenção provê um vetor ácido nucleico compreendendo uma sequência intensificadora de tradução (TE) tendo pelo menos 80% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita e uma sequência de retenção nuclear representada por SEQ ID NO: 4.

[009] Em uma modalidade específica, a sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é selecionada da lista compreendendo mRNA codificando CD40L, CD70, ou caTLR4 ou mRNA específico para doença/antígeno.

[010] Em uma modalidade preferida, a sequência de tradução é representada por qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3, mais em particular SEQ ID NO: 1.

[011] Ainda em um aspecto, a presente invenção provê um processo de aumento de estabilidade e/ou eficiência de tradução de RNA transcrito in vitro; o dito processo compreendendo as etapas de:

[012] (i) fornecimento de um vetor de acordo com esta invenção, onde a dita sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é uma sequência de DNA que pode ser transcrita, que corresponde ao dito RNA a ser transcrito; e

[013] (ii) transcrição in vitro de sequência de DNA que pode ser transcrita.

[014] Ainda em uma modalidade, a presente invenção provê uma molécula de RNA compreendendo um intensificador de tradução (TE) tendo pelo menos 80% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita, e uma sequência de retenção nuclear representada por SEQ ID NO: 4.

[015] A dita molécula de RNA ainda pode compreender uma cauda poli-A.

[016] No contexto das moléculas de RNA da presente invenção, a dita sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita pode ser selecionada da lista compreendendo mRNA codificando CD40L, CD70, caTLR4 ou mRNA específico para doença/antígeno.

[017] Em uma modalidade preferida das moléculas de RNA, o intensificador de tradução é representado por qualquer uma de SEQ ID NO 1, 2 ou 3; mais em particular SEQ ID NO: 1.

[018] A presente invenção ainda provê uma composição compreendendo uma ou mais moléculas de RNA de acordo com esta invenção; mais em particular a dita uma ou mais moléculas de RNA representam moléculas de mRNA que codificam CD40L, CD70 e caTLR4.

[019] A composição de acordo com a presente invenção, ainda pode compreender mRNA codificando mRNA específico para doença/antígeno.

[020] A presente invenção ainda provê o uso da molécula(s) de RNA e/ou composição(s) compreendendo uma ou mais de ditas moléculas de RNA para múltiplos propósitos, tal como, por exemplo, para introdução in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira; ou para uso em medicina.

[021] Também é um aspecto da presente invenção prover um kit compreendendo um ou mais vetores; uma ou mais moléculas de RNA; ou uma composição de acordo com a presente invenção.

[022] A presente invenção também provê um processo para tratamento de um paciente em sua necessidade com uma ou mais moléculas de RNA ou uma composição de acordo com a presente invenção; onde as ditas moléculas de RNA podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente com intervalos.

[023] As moléculas de RNA ou composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente em sua necessidade através de qualquer via de administração apropriada tal como, por exemplo, intranodo, intradérmica, intralinfática e intratumoral. Além disso, quando tratando, por exemplo, pacientes de câncer, a administração das moléculas de RNA ou composições de acordo com a presente invenção pode ser usada em combinação com processos para liberação de mRNA de tumor a partir de tumor no paciente, tal como, por exemplo, ablação ou sonoporação. Declarações Numeradas da invenção 1. Um vetor ácido nucleico compreendendo uma sequência intensificadora de tradução (TE) tendo pelo menos 80% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita e uma sequência de retenção nuclear representada por SEQ ID NO: 4. 2. O vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, onde a dita sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é selecionada da lista compreendendo mRNA codificando CD40L, CD70, caTLR4 ou mRNA específico para doença/antígeno. 3. O vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma de reivindicações 1-2, onde o dito intensificador de tradução é representado por qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; mais em particular SEQ ID NO: 1. 4. Um processo de aumento de estabilidade e/ou eficiência de tradução de RNA transcrito in vitro; o dito processo compreendendo as etapas de: (i) fornecimento de um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, onde a dita sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é uma sequência de DNA que pode ser transcrita, que corresponde ao dito RNA a ser transcrito; e (ii) transcrição in vitro de dita sequência de DNA que pode ser transcrita. 5. Uma molécula de RNA compreendendo um intensificador de tradução (TE) tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para SERQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita, e uma sequência de retenção nuclear representada por SEQ ID NO: 4. 6. Uma molécula de RNA de acordo com a reivindicação 5 ainda compreendendo uma cauda poli-A. 7. Uma molécula de RNA de acordo com a reivindicação 5 ou 6, onde a dita sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é selecionada da lista compreendendo mRNA codificando CD40L, CD70, caTLR4 ou mRNA específico para doença/antígeno. 8. Uma molécula de RNA de acordo com qualquer uma de reivindicações 5-7, onde o dito intensificador de tradução é representado por SEQ ID NO: 1. 9. Uma composição compreendendo uma ou mais moléculas de RNA como reivindicadas em qualquer uma de reivindicações 5-8. 10. Composição de acordo com a reivindicação 9, onde a dita uma ou mais moléculas de RNA representam moléculas de mRNA que codificam CD40L, CD70 e caTLR4. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10 ainda compreendendo mRNA codificando mRNA específico para doença/antígeno. 12. O uso de uma molécula de RNA de acordo com qualquer uma de reivindicações 5-8, ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11 para introdução em uma célula hospedeira. 13. Uma molécula de RNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 508 ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11 para uso em medicina. 14. Um kit compreendendo um ou mais vetores de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3; uma ou mais moléculas de RNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-8; ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11. Breve Descrição dos Desenhos

[024] Com específica referência agora às figuras, é realçado que os particulares mostrados são a título de exemplo e somente para propósitos de discussão ilustrativa das diferentes realizações da presente invenção. Eles são apresentados na causa de fornecimento do que é acreditado ser a descrição mais fácil e útil dos princípios e aspectos conceituais da invenção. Neste sentido não é feita nenhuma tentativa para mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhes doque é necessário para um entendimento fundamental da invenção. A descrição tomada com os desenhos tornando aparente para aqueles versados na técnica como as várias formas da invenção podem ser realizadas na prática.

[025] Fig. 1: iDCs foram eletroporadas com mRNA TriMix codificado pelo vetor pUC, o vetor pUC-TE, vetor pUC-ENE ou o vetor pUC TE ENE. Valores de MFI (intensidade de fluorescência média) da população DC positiva são mostrados. Dados são apresentados como média +/- SEM (teste t emparelhado, * P < 0,05). N pUC = 6; N pUC-TE = 15; N pUC-ENE = 15; N pUC TE ENE = 19.

[026] Fig. 2: expressão de WT1 em DCs eletroporadas com mRNA WT1. iDCs foram eletroporadas com mRNA WT1 codificado pelos diferentes vetores e analisadas para sua expressão WT1através de marcação intracelular 4h, 24 h, e 48 h após eletroporação. Uma comparação de valores MFI após eletroporação das iDCs com os diferentes vetores codificando WT1 é mostrada. Dados são apresentados como média +/- SEM. (teste t emparelhado, * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001). N = 6

[027] Fig. 3: cinéticas de expressão de eGFP de DCs. iDCs foram co-eletroporadas com eGFP e mRNA TriMix codificado pelo vetor pUC ou o vetor pUC TE ENE. Expressão de eGFP foi analisada em vários pontos de tempo após eletroporação. O valor MFI da população de DC positiva eGFP foi analisado. Dados são apresentados como média +/- SEM. (teste t emparelhado, * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001). N = 9

[028] Fig. 4: Fenótipo de DCs imaturas e maduras. Valores MFI das moléculas indicadas foram investigados 24 horas após eletroporação de iDCs. Dados são apresentados como média +/- SEM. (teste t emparelhado, * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001). CD40 N = 9; CD70 N = 19; CD80 N = 12; CD 83 N = 12; CCR7 N = 12.

[029] Fig. 5: Modelo de tumor de dois lados com P815: tratamento simples de um tumor com tNGFR como um controle ou com pUC TE ENE TriMix. O tumor não tratado, contralateral foi usado para avaliar a resposta imune antitumor sistêmica. Crescimento de tumor foi mostrado para cada camundongo individual por grupo (n = 6) seguido por um resumo do volume de tumor médio. Sobrevivência foi visualizada em um gráfico Kaplan-Meier. Diferenças em sobrevivência foram analisadas pelo teste log-rank.

[030] Fig. 6: Modelo de tumor de dois lados com P815: tratamento simples de um tumor, com tNGFR ou 0,8 volumes de solução Hartman servindo como um controle. O tumor não tratado, contralateral foi usado para avaliar a resposta imune antitumor sistêmica. Crescimento de tumor foi mostrado para cada camundongo individual por grupo (n = 6) seguido por um resumo do volume de tumor médio. Sobrevivência foi visualizada em um gráfico Kaplan-Meier. Diferenças em sobrevivência foram analisadas pelo teste log-rank.

[031] Fig. 7: o vetor pUC TE ENE com seus elementos mais importantes.

[032] Fig. 8: Mostra uma comparação de sequência de 3 sequências TE variáveis (SEQ ID NO: 1, 2 e 3) como criadas por Clustal 2.1 de EMBL.

[033] Fig. 9: (A) expressão de WT1 em DCs eletroporadas com mRNA WT1. iDCs foram eletroporadas com 10 µg de mRNA WT1 codificado pelos diferentes vetores e analisadas para sua expressão de WT1 através de marcação intracelular 4h, 24h, e 48h após eletroporação. Uma comparação de valores MFI após eletroporação das iDCs com os diferentes vetores codificando WT1 é mostrada. N = 3 (B) expressão de eGFP em DCs eletroporadas com mRNA eGFP. iDCs foram eletroporadas com 10 µg de mRNA eGFP codificado pelos diferentes vetores e analisadas para sua expressão de eGFP através de marcação intracelular 4 horas, 24 horas, e 48 horas após eletroporação. Uma comparação de valores MFI após eletroporação das iDCs com os diferentes vetores codificando WT1 é mostrada. N = 3.

Descrição Detalhada da Invenção

[034] Em um primeiro aspecto a presente invenção provê um vetor de ácido nucleico compreendendo um intensificador de tradução (TE) e uma sequência de retenção nuclear. Mais em particular, o dito vetor de ácido nucleico compreende uma sequência intensificadora de tradução (TE) tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita e uma sequência de retenção nuclear representada por SEQ ID NO: 4.

[035] O termo “vetor” é aqui usado em seu significado mais genérico e compreende quaisquer veículos intermediários para um ácido nucleico, que, por exemplo, permitem que o dito ácido nucleico seja introduzido em células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas e, onde apropriado, seja integrado em um genoma. Tais vetores são preferivelmente replicados e/ou expressos na célula. Vetores compreendem plasmídeos, fagemídeos ou genomas de vírus. O termo “plasmídeo”, como aqui usado, genericamente refere-se a uma construção de material genético extra cromossômico, usualmente um duplex DNA circular, que pode replicar independentemente de DNA cromossômico.

[036] De acordo com a invenção, uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência de ácido nucleico refere-se a um ácido nucleico que é preferivelmente ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA). De acordo com a invenção, ácidos nucleicos compreendem DNA genômico, cDNA, mRNA, moléculas sintetizadas quimicamente e preparadas recombinantemente. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode estar na forma de uma molécula circular fechada covalentemente ou linear e de fita simples ou fita dupla. O termo “ácido nucleico” além disso também compreende uma derivação química de um ácido nucleico sobre uma base nucleotídeo, sobre o açúcar ou sobre o fosfato, e ácidos nucleicos contendo nucleotídeos não naturais e análogos de nucleotídeos.

[037] Os ácidos nucleicos descritos de acordo com a invenção são preferivelmente isolados. O termo “ácido nucleico isolado” significa de acordo com a invenção que o ácido nucleico foi 1/ amplificado in vitro, por exemplo, por reação de cadeia polimerase (PCR) 2/ produzido recombinantemente através de clonagem; 3/ purificado, por exemplo, por clivagem e fracionamento eletroforético com gel, ou 4/ sintetizado, por exemplo, através de síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico disponível para manipulação através de técnicas de DNA recombinante.

Intensificador de Tradução 5’ (TE)

[038] Regulação pós transcricional de tradução é controlada principalmente na fase de início de tradução. Um complexo de fatores de iniciação se liga à estrutura 5’CAP e recruta as subunidades ribossomais. Este complexo então começa um movimento de exploração ao longo de mRNA até um códon AUG em um contexto apropriado ser encontrado. A eficiência deste processo pode ser controlada através de numerosas características estruturais em ambas UTRs 5’ e 3’ (regiões não traduzidas) do mRNA. Estas características incluem regiões TOP (trato oligopirimidina terminal), IRES (sítio de entrada de ribossoma interno) e ORF’s À Montante (Quadros de Leitura Abertos) na UTR 5’. Nos motivos CITE UTR 3’ (intensificador de tradução independente Cap) foram descritos. O comprimento da cauda poli-A também foi mostrado desempenhar um papel importante em iniciação de tradução, uma vez que PABP (proteína de ligação Poli-A) precisa se associar a ambos, cauda poli-A e o complexo elF4 sobre o sítio CAP.

[039] IRES é um motivo que é capaz de recrutar ribossomas independentemente de interação com a estrutura 5’CAP. Os primeiros elementos IRES foram descritos em picornavírus (por exemplo, EMCV, vírus de encéfalo miocardite). Durante infecção tradução dependente de CAP é desligada, rendendo uma vantagem para a tradução independente de CAP das proteínas virais. Várias sequências IRES eucarióticas foram descritas em anos recentes. Em situações de tensão tradução dependente de CAP é regulada descendentemente, enquanto tradução independente de CAP de alguns genes essenciais pode continuar. Mais especificamente, células dendríticas que são ativadas através de, por exemplo, ligação de LPS sobre receptor 4 semelhante Toll também desligam tradução dependente de CAP, enquanto tradução independente de CAP de alguns genes protege as células de apoptose.

[040] Hu et al. estudaram uma sequência no líder 5’ do mRNA codificando a proteína de homeo domínio Gtx. Eles descreveram uma sequência que é complementar a sequências no RNA ribossomal 18S. Eles verificaram que este motivo teve uma profunda influência sobre a eficiência de tradução (Hu et al., 1999).

[041] Posteriormente, foi mostrado que este motivo funciona como um sítio interno de entrada de ribossoma (IRES) e mostrou que segmentos não se sobrepondo mais curtos deste líder 5’ podem aperfeiçoar a tradução de um segundo cistron em um mRNA dicistrônico. Um destes segmentos foi de 9 nucleotídeos em comprimento e quando múltiplas cópias deste módulo IRES foram ligadas, atividade IRES foi grandemente aperfeiçoada. Uma repetição tandem do mesmo segmento 9n, interespaçada por fragmento 9n da UTR 5’ de beta globina humana, foi mostrada funcionar como um Intensificador de Tradução (TE) em um mRNA monocistrônico quando posicionada na extremidade-5’ de mRNA, em frente da ORF.

[042] Portanto, no contexto da presente invenção, qualquer sequência funcionando como um Intensificador de Tradução para mRNA pode ser usada, por exemplo, aqueles elementos aqui descritos acima. Em particular, um intensificador de tradução é uma sequência no RNA transcrito que facilita tradução. Um possível modo de ação é através de aperfeiçoamento de ligação do ribossoma à extremidade 5’ do mRNA.

[043] Em um exemplo particular, o vetor de acordo com esta invenção pode render RNA que contém uma repetição tandem 10x da sequência 9n tipo selvagem da sequência líder Gtx: CCGGCGGGT. Estes motivos são ligados por uma sequência 9n derivada da UTR 5’ de beta globina humana: TTCTGACAT. Este fragmento de DNA pode ser clonado no plasmídeo entre a sequência promotora de bacteriófago e o ORF (Quadro de Leitura Aberto).

[044] Em uma modalidade particular, o intensificador de tradução de acordo com a presente invenção tem pelo menos 80% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Como evidente a partir de figura 8, SEQ ID NO 2 e 3 têm uma identidade de sequência de pelo menos 80% em comparação a SEQ ID NO: 1, e são assim apropriadas para serem usadas em conexão com a presente invenção. Mais preferivelmente, o intensificador de tradução de acordo com a presente invenção tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88% ou 89% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Como evidenciado a partir de figura 8, SEQ ID NO: 2 e 3 têm uma identidade de sequência de pelo menos 85% em comparação a SEQ ID NO: 1. Mesmo mais preferivelmente, o intensificador de tradução de acordo com a presente invenção tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1. Como evidente a partir de figura 8, SEQ ID NO: 3 tem uma identidade de sequência de pelo menos 90% em comparação a SEQ ID NO: 1. Mesmo mais preferivelmente, o intensificador de tradução é representado por qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; mais preferivelmente SEQ ID NO: 1.

Sequência de Retenção Nuclear

[045] A importância de processos de controle genético pós- transcricionais tornou-se crescentemente aparente em anos recentes. Entre estes processos, um que começa a receber considerável atenção é o controle de estabilidade de mRNA. Com o crescente reconhecimento de que degradação de mRNA tem um impacto profundo sobre expressão de gene e que taxas de decaimento de mRNA podem ser moduladas em resposta a sinais ambientais e do desenvolvimento, um vigoroso esforço de pesquisa alvejando o entendimento deste processo está ocorrendo agora. Significante progresso foi feito e estudos sobre os últimos 20 anos elucidaram um número de características genéricas de degradação de mRNA.

[046] Ambos, mRNAs celular e viral são submetidos a robustos caminhos de decaimento de RNA. Vírus desenvolveram diferentes processos para proteger seu mRNA de mecanismos de desadenilação do hospedeiro. O RNA não traduzido poliadenilado (PAN) de sarcoma de Kaposi associado com vírus herpes (KSHV) é muito abundante no núcleo de células infectadas. Este RNA é resistente a desadenilação e degradação. A acumulação de PAN depende da atividade de um elemento RNA de 79 nucleotídeos na região 3’, chamado ENE (Elemento de retenção Nuclear e Expressão). Conrad et al. publicaram em 2005 o primeiro artigo relacionado a ENE na descrição do mesmo como um elemento RNA de vírus de sarcoma de Kaposi que rende uma aumentada abundância nuclear de transcritos sem íntron (Conrad, 2005). O fragmento ENE contém uma específica estrutura grampo de cabelo rica em U que interage com a cauda poli-A. Como tal, uma estrutura secundária é obtida que resulta na retenção do RNA no núcleo e, portanto, o nome Elemento de Retenção Nuclear. Um efeito secundário, é a interação da estrutura grampo de cabelo rica em U com a cauda poli-A de mRNA resultando em um efeito ‘de proteção’ de degradação pelo hospedeiro, uma característica que é de particular interesse na produção de mRNA para propósitos imunoterapêuticos.

[047] RNA nuclear poliadenilado (PAN) (também conhecido como T1.1 ou nut-1 RNA) é um IncRNA produzido pelo vírus gama herpes oncogênico, vírus de herpes associado com sarcoma de Kaposi (KSHV) (Sun et al., 1996). RNA PAN acumula-se para níveis extraordinariamente altos (~500 000 cópias / célula) durante infecção lítica e é requerido para a produção de proteínas virais posteriores e vírus infeccioso (Sun et al., 1996). O elemento de retenção nuclear e expressão (ENE), localizado ~120 nts à montante de sítio de poliadenilação de RNA PAN, é essencial para esta alta acumulação no núcleo (Conrad and Steitz, 2005). O ENE inibe rápido decaimento de PAN RNA através de bloqueio de desadenilação (Conrad et al., 2006). RNA PAN não rende expressão de proteína. A retenção nuclear mantém o RNA afastado da maquinaria de tradução no citoplasma, enquanto a proteção da cauda poli-A proíbe ligação à PABP (proteína de ligação de poli-A) que é essencial para tradução eficiente. Portanto, uso desta sequência em transfecção não é óbvio.

[048] ENE KSHV é um elemento RNA de 79 nt de comprimento, composto por uma estrutura tronco - laço com um laço rico em U interno assimétrico, que em conjunção com pares de bases adjacentes constitui o núcleo funcional de ENE. A estrutura cristal do núcleo ENE ligada a oligo(A)9 revelou 5 grupos de três bases U-A-U consecutivos formados entre o laço rico em U e oligo(A)9 (Mitton-Fry et al., 2010), que são estendidos por interações menores -A com três pares de bases G-C do tronco inferior. Análises genéticas e bioquímicas indicam interações similares entre a cauda poli(A) de RNA PAN e o ENE in vivo (Mitton-Fry et al., 2010).

[049] Portanto, no contexto da presente invenção, qualquer sequência funcionando como um elemento de retenção nuclear para mRNA pode ser usado, por exemplo, aqueles elementos descritos aqui acima. Em particular, um elemento de retenção nuclear é uma sequência atuando cis que tem a capacidade para proteger o mRNA para decaimento citoplásmico.

[050] Em uma particular modalidade, o elemento de retenção nuclear também funciona como uma sequência de estabilização de RNA.

[051] Em um particular exemplo, o elemento de retenção nuclear é o Elemento de retenção Nuclear e Expressão de KSHV. Uma sequência de 79 pb isolada de RNA PAN (poliadenilado não traduzido) é colocada à montante a partir do estiramento A124 no plasmídeo de produção de RNA. O ENE forma um laço rico em U que se associa com a cauda poli-A e protege o mesmo de degradação.

[052] Em uma particular modalidade, o elemento de retenção nuclear de acordo com a presente invenção é representado por SEQ ID NO: 4.

Ainda elementos no vetor da presente invenção

[053] Ainda em uma modalidade, o vetor ácido nucleico da presente invenção, ainda pode conter elementos selecionados da lista compreendendo um promotor bacteriófago, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita e uma cauda poli-A.

[054] RNA mensageiro ou ácido ribonucleico (mRNA) consiste em um polímero de fita simples de 4 nucleotídeos (adenosina, guanosina, citidina e uridina monofosfato). Uma modificação de extremidade 5’ ou 5’CAP é necessária para reconhecimento do mRNA através de complexo de iniciação de tradução, própria ligação do mRNA aos ribossomas, assim como proteção de 5’-exonucleases. Esta modificação consiste em um nucleotídeo 7-metil guanosina adicionado ao primeiro nucleotídeo transcrito. A região codificante começa com um códon de partida (usualmente AUG) e termina com um códon de interrupção (usualmente UAA, UAG ou UGA). Antes de códon de partida e após o códon de interrupção, mRNA maduro contém uma região não traduzida 5’ (UTR) e uma UTR 3’. Estas regiões contribuem para a estabilidade ou instabilidade de mRNA e eficiência de tradução.

[055] Uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita, em particular um ácido nucleico codificando um peptídeo ou proteína, e uma sequência controle de expressão são “funcionalmente” ligadas uma à outra, se elas são ligadas covalentemente uma à outra em uma maneira tal que transcrição ou expressão da que pode ser transcrita e em particular ácido nucleico codificando está sob o controle ou sob a influência da sequência de controle de expressão.

[056] Os ácidos nucleicos aqui especificados, em particular ácidos nucleicos codificantes e que podem ser transcritos, podem ser combinados com qualquer sequência de controle de expressão, em particular promotores, que podem ser homólogos ou heterólogos para os ditos ácidos nucleicos, com o termo “homólogo” referindo-se ao fato de que um ácido nucleico também está funcionalmente ligado naturalmente à sequência de controle de expressão, e o termo “heterólogo” referindo-se ao fato de que um ácido nucleico não está naturalmente funcionalmente ligado à sequência de controle de expressão.

[057] O termo “sequências de controle de expressão” compreende de acordo com a invenção promotores, sequências de ligação ao ribossoma e outros elementos controles, que controlam transcrição de um gene ou tradução do RNA derivado. Em particulares realizações da invenção, as sequências de controle de expressão podem ser reguladas. A precisa estrutura de sequências de controle de expressão pode variar dependendo das espécies ou tipo de célula, mas, usualmente inclui sequências 5’- não transcritas e 5’- e 3- não traduzidas envolvidas em iniciação de transcrição e tradução, respectivamente, tal como uma caixa TATA, sequência de capeamento, sequência CAAT e semelhantes. Mais especificamente, sequências de controle de expressão não transcritas incluem uma região promotora que abrange uma sequência promotora para controle de transcrição do gene ligado a funcionalidade. Sequências de controle de expressão também podem incluir sequências intensificadoras ou sequências ativadoras à montante.

[058] Em particulares realizações, um ácido nucleico está funcionalmente ligado de acordo com a invenção a sequências de controle de expressão, as quais podem ser homólogas ou heterólogas com relação ao ácido nucleico.

[059] O termo “promotor” ou “região promotora” refere-se a uma sequência de DNA à montante (5’) da sequência codificante de um gene, que controla expressão de dita sequência codificante através de fornecimento de um sítio de reconhecimento e ligação para RNA polimerase. A região promotora ainda pode incluir sítios de reconhecimento ou ligação para ainda fatores envolvidos em regulação de transcrição de dito gene. Um promotor pode controlar transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Um promotor pode ser “induzível” e iniciar transcrição em resposta a um indutor, ou pode ser “constitutivo” se transcrição não é controlada por um indutor. Um promotor induzível é somente expresso em uma extensão muito pequena ou não é expresso, se um indutor está ausente. Na presença do indutor, o gene é “ligado” ou o nível de transcrição é aumentado. Isto é usualmente mediado por ligação de um específico fator de transcrição.

[060] Em uma particular modalidade, a sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é selecionada da lista compreendendo mRNA codificando CD40L (NM_000074), CD70 (NM_001252), caTLR4 ((uma versão truncada do gene TLR4 humano, que contém somente a região transmembrana e região citoplásmica do gene, precedidas pelo peptídeo sinal de LAMP1 (proteína de membrana associada com lisossoma)) ou mRNA específico para doença/antígeno.

[061] O promotor bacteriófago de acordo com esta invenção, pode ser qualquer promotor apropriado para transcrição de RNA e é preferivelmente selecionado da lista compreendendo promotor T7, promotor SP6 e promotor T3; mais em particular promotor T7.

[062] A cauda poli-A como usada no contexto desta invenção, preferivelmente consiste em entre cerca de 100-150 adenosinas, mais em particular 120-125 adenosinas, preferivelmente cerca de 124 adenosinas.

[063] Os termos “cassete poliadenila” ou “sequência poli-A” referem-se a uma sequência de resíduos adenila que está tipicamente localizada na extremidade 3’ de uma molécula de RNA. A invenção provê que uma tal sequência seja ligada durante transcrição de RNA por meio de um molde DNA nas bases de resíduos timidila repetidos na fita complementar para a fita codificante, enquanto a dita sequência normalmente não é codificada no DNA mas está ligada à extremidade 3’ livre do RNA por uma RNA polimerase independente de molde após transcrição no núcleo. De acordo com a invenção, uma sequência poli(A) deste tipo é entendida como significando uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100 e preferivelmente até 500, preferivelmente até 400, preferivelmente até 300, preferivelmente até 200, e em particular até 150 nucleotídeos A consecutivos, e em particular cerca de 120 nucleotídeos A consecutivos, onde o termo “nucleotídeos A” refere-se a resíduos adenila.

[064] A invenção ainda provê uma molécula de RNA obtenível através de transcrição do vetor de ácido nucleico de acordo com esta invenção.

[065] Ainda em um aspecto, a presente invenção provê um processo de aumento de estabilidade e/ou eficiência de tradução de RNA transcrito in vitro; o dito processo compreendendo as etapas de: (i) fornecimento de um vetor de acordo com esta invenção onde a dita sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é uma sequência de DNA que pode ser transcrita, que corresponde ao dito RNA a ser transcrito; e (ii) transcrição in vitro de sequência de DNA que pode ser transcrita.;

[066] assim como uma molécula de RNA obtenível através do dito processo.

[067] De acordo com a invenção, o termo “transcrição” compreende “transcrição in vitro” onde o termo “transcrição in vitro” refere-se a um processo onde RNA, em particular mRNA, é sintetizado in vitro em uma maneira livre de célula. A preparação de transcritos preferivelmente faz uso de vetores de clonagem que são genericamente referidos como vetores de transcrição e que são incluídos de acordo com a invenção sob o termo “vetor”.

[068] O termo “sequência de ácido nucleico transcrita de uma sequência de ácido nucleico” refere-se a RNA, onde apropriado como uma parte de uma molécula de RNA completa, que é um produto de transcrição da última sequência de ácido nucleico.

[069] O termo “ácidos nucleicos que podem ser transcritos para renderem um transcrito comum” significa que os ditos ácidos nucleicos são funcionalmente ligados uns aos outros em uma maneira tal que, onde apropriado após linearização tal como clivagem com enzima de restrição da molécula de ácido nucleico compreendendo os ditos ácidos nucleicos, em particular de uma molécula de ácido nucleico circular fechada, transcrição sob o controle de um promotor resulta em uma molécula de RNA compreendendo os transcritos dos ditos ácidos nucleicos ligados covalentemente uns aos outros, onde apropriado separados por sequências localizadas entre os mesmos.

[070] De acordo com a invenção, o termo “expressão” é usado em seu significado mais genérico e compreende produção de RNA e/ou proteína. Ele também compreende expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, expressão pode ser transiente ou estável. Com relação a RNA, o termo “expressão” ou “tradução” refere-se em particular à produção de peptídeos ou proteínas.

[071] O termo “sequência de ácido nucleico que é ativa de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou estabilidade de uma sequência de ácido nucleico” significa que um primeiro ácido nucleico é capaz de modificação, em um transcrito comum com o segundo ácido nucleico, a eficiência de tradução e/ou estabilidade de dito segundo ácido nucleico de modo que a dita eficiência de tradução e/ou estabilidade seja aumentada em comparação com a eficiência de tradução e/ou estabilidade do dito segundo ácido nucleico sem o dito primeiro ácido nucleico. Neste contexto, o termo “eficiência de tradução” refere-se à quantidade de produto de tradução provida por uma molécula de RNA dentro de um particular período de tempo e o termo “estabilidade” refere-se à meia-vida de uma molécula de RNA.

[072] Em uma particular modalidade, a presente invenção provê uma molécula de RNA compreendendo um intensificador de tradução (TE) e um elemento de retenção nuclear (ENE); ou uma composição compreendendo uma ou mais das ditas moléculas de RNA. Mais em particular, a presente invenção provê uma molécula de RNA compreendendo um intensificador de tradução (TE) tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita, e uma sequência de retenção nuclear representada por SEQ ID NO: 4; ou uma composição compreendendo a dita molécula de RNA.

[073] A dita molécula de RNA ainda pode compreender um ou mais elementos selecionados da lista compreendendo uma sequência de ácido nucleico traduzível, e uma cauda poli-A; onde a dita sequência de ácido nucleico traduzível pode ser selecionada da lista compreendendo mRNA codificando CD40L, CD70, caTLR4 ou mRNA específico doença/antígeno.

[074] No contexto da presente invenção, o elemento TE é preferivelmente posicionado na extremidade 5’ da molécula de RNA que pode ser transcrita / traduzida e a sequência de retenção nuclear (ENE) preferivelmente na extremidade 3’.

[075] “extremidade 3’ de um ácido nucleico” refere-se de acordo com a invenção àquela extremidade que tem um grupo hidroxila livre. “extremidade 5’ de um ácido nucleico” refere-se de acordo com a invenção àquela extremidade que tem um grupo fosfato livre.

[076] No contexto da presente invenção “mRNA” significa “RNA mensageiro” e refere-se a um transcrito que é produzido usando DNA como molde e que ele próprio codifica um peptídeo ou proteína. Um mRNA tipicamente compreende uma região 5’ não traduzida, uma região codificando proteína e uma região 3’-não traduzida. mRNA tem meia vida limitada em células. De acordo com a invenção, mRNA pode ser preparado a partir de um molde de DNA através de transcrição in vitro. Ele pode ser ainda modificado por modificações de estabilização e capeamento, em adição às modificações de acordo com a invenção.

[077] Em uma particular modalidade, a composição de acordo com esta invenção compreende mRNA codificando CD40L, CD70 e caTLR4 se ou não em combinação com mRNA codificando mRNA específico para doença/antígeno.

[078] O mRNA específico para doença/antígeno da presente invenção pode ser selecionado da lista não limitante compreendendo antígenos de tumor, antígenos derivados de patógeno, alérgenos.

[079] A presente invenção ainda provê o uso da molécula(s) de RNA e/ou composição(s) compreendendo uma ou mais de ditas moléculas de RNA para múltiplos propósitos, tal como, por exemplo, para introdução in vivo ou in vitro em uma célula hospedeira; ou para uso em medicina.

[080] É também um aspecto da presente invenção prover um kit compreendendo um ou mais vetores; uma ou mais moléculas de RNA ou uma composição de acordo com a presente invenção.

[081] A presente invenção também provê um processo para tratamento de um paciente em sua necessidade com uma ou mais moléculas de RNA ou uma composição de acordo com a invenção; onde, as ditas moléculas de RNA podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente com intervalos.

[082] A invenção provê ácidos nucleicos em particular RNA para serem administrados a um paciente. Ácidos nucleicos podem ser administrados através de processos ex vivo, isto é, através de reação de células de um paciente, modificação genética das ditas células (por exemplo, através de transfecção) e reintrodução de células modificadas no paciente. Processos de transfecção e transdução são conhecidos por aqueles versados na técnica. A invenção também provê ácidos nucleicos para serem administrados in vivo.

[083] De acordo com a invenção, o termo “transfecção” refere-se à introdução de um ou mais ácidos nucleicos em um organismo ou em uma célula hospedeira. Vários processos podem ser empregados de modo a introduzir-se de acordo com a invenção ácidos nucleicos em células in vitro ou in vivo. Tais processos incluem transfecção de precipitados de ácido nucleico - CaPO4, transfecção de ácidos nucleicos associados com DEAE, transfecção de infecção com vírus carreando os ácidos nucleicos de interesse, transfecção mediada por lipossoma, e semelhantes. Em particulares realizações, é dada preferência a direcionamento de ácido nucleico para particulares células. Em tais realizações, um carreador usado para administração de um ácido nucleico para uma célula (por exemplo, um retrovírus ou um lipossoma) pode ter uma molécula de orientação para alvo ligada. Por exemplo, uma molécula tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície sobre a célula alvejada, ou um ligante para um receptor sobre a célula alvo pode ser incorporado ou ligado ao carreador de ácido nucleico. Se administração de um ácido nucleico por lipossomas é desejada, proteínas ligando a uma membrana de superfície associada com endocitose podem ser incorporadas na formulação de lipossoma de modo a permitir alvejamento e/ou absorção. Tais proteínas incluem proteínas de capsídeo ou seus fragmentos que são específicas para um particular tipo de célula, anticorpos para proteínas que são internalizadas, proteínas alvejando um sítio intracelular, e semelhantes.

[084] As moléculas de RNA ou composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente em sua necessidade através de qualquer via de administração apropriada tal como, por exemplo, intranodo, intradérmica, intralinfática e intratumoral. Além disso, quando tratando, por exemplo, pacientes de câncer, a administração das moléculas de RNA ou composições de acordo com esta invenção, pode ser usada em combinação com processos para liberação de mRNA de tumor a partir de tumor no paciente, tal como, por exemplo, ablação ou sonoporação.

[085] De acordo com a invenção, processos padrões podem ser usados para preparação de ácidos nucleicos recombinantes, cultura de células, em particular eletroporação e lipofecção. Reações enzimáticas são realizadas de acordo com as instruções de fabricante ou em uma maneira conhecida per se.

[086] De acordo com a invenção, uma “sequência de ácido nucleico que é derivada de uma sequência de ácido nucleico” refere-se a um ácido nucleico contendo, em comparação com o ácido nucleico do qual ele é derivado, substituições, supressões e/ou adições de nucleotídeos simples ou múltiplas e que é preferivelmente complementar para o ácido nucleico do qual ele é derivado, isto é, há um certo grau de homologia entre os ditos ácidos nucleicos e as sequências de nucleotídeos de ditos ácidos nucleicos correspondem em uma maneira complementar ou direta significante.

[087] De acordo com a invenção, um ácido nucleico derivado de um ácido nucleico tem uma propriedade funcional do ácido nucleico do qual ele é derivado. Tais propriedades funcionais incluem em particular a habilidade para aumentar, em uma ligação funcional a um ácido nucleico que pode ser transcrito em RNA (sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita), a estabilidade e/ou eficiência de tradução de RNA produzido a partir deste ácido nucleico na molécula de RNA completa.

[088] Um ácido nucleico é “complementar” a outro ácido nucleico se as duas sequências podem hibridizar uma com a outra e formar um duplex estável, a dita hibridização sendo realizada preferivelmente sob condições que permitam específica hibridização entre polinucleotídeos (condições rigorosas). Condições rigorosas são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A laboratory manual, J Sambrook et al

[089] De acordo com a invenção, ácidos nucleicos complementares têm nucleotídeos, que são pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, e preferivelmente pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticos.

[090] De acordo com a invenção, uma primeira região de polinucleotídeo é considerada estar localizada à jusante de uma segunda região de polinucleotídeo, se a extremidade 5’ da dita primeira região de polinucleotídeo é a parte da dita primeira região de polinucleotídeo mais próxima da extremidade 3’ da dita segunda região de polinucleotídeo.

[091] A região não traduzida 3’ tipicamente se estende a partir de códon de terminação para um produto de tradução da sequência poli-A que é usualmente ligada após o processo de transcrição. As regiões não traduzidas 3’ de mRNA mamífero tipicamente têm uma região de homologia conhecida como a sequência de hexanucleotídeos AAUAAA. Esta sequência é presumivelmente o sinal de ligação poli-A e está frequentemente localizada de 10 a 30 bases à montante do sítio de ligação poli-A.

[092] Regiões não traduzidas 3’ podem conter uma ou mais repetições invertidas que podem dobrar para render estruturas de tronco - laço, que atuam como barreiras para exorribonucleases ou interagem com proteínas conhecidas para aumento de estabilidade de RNA (por exemplo, proteínas de ligação de RNA).

[093] Regiões não traduzidas 5’ e/ou 3’ podem, de acordo com a invenção, ser funcionalmente ligadas a um ácido nucleico que pode ser transcrito e em particular codificante, de modo que estas regiões sejam associadas com o ácido nucleico em uma maneira que a estabilidade e/ou eficiência de transfecção do RNA que é transcrito do dito ácido nucleico que pode ser transcrito são aumentadas.

[094] De acordo com a invenção, o termo “gene” refere-se a uma particular sequência de ácido nucleico, que é responsável pela produção de um ou mais produtos celulares e/ou para obtenção de um ou mais produtos celulares e/ou para obtenção de uma ou mais funções intercelulares ou intracelulares. Mais especificamente, o dito termo refere-se a uma seção de DNA, que compreende um ácido nucleico codificando uma proteína específica ou uma molécula de RNA funcional ou estrutural.

[095] De acordo com a invenção, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer célula que possa ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. O termo “célula hospedeira” compreende, de acordo com a invenção células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou eucarióticas (por exemplo, células de levedura e células de insetos). Preferência particular é dada a células de mamíferos tais como células de humanos, camundongos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas de uma multiplicidade de tipos de tecidos e compreendem células primárias e linhas de células. Exemplos específicos incluem queratinócitos, leucócitos de sangue periférico, células tronco de medula óssea e células-tronco embrionárias. Em outras realizações, a célula hospedeira é uma célula apresentando antígeno, em particular uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago. Um ácido nucleico pode estar presente na célula hospedeira em uma cópia simples ou em várias cópias e, em uma modalidade é expressa na célula hospedeira.

[096] De acordo com a invenção, um peptídeo ou proteína codificado por um ácido nucleico pode ser um peptídeo ou proteína que está localizado no citoplasma, no núcleo, na membrana, em organelas ou em forma secretada. Elas incluem proteínas estruturais, proteínas reguladoras, hormônios, neurotransmissores, fatores de regulação de crescimento, fatores de diferenciação, fatores de regulação de expressão de gene, proteínas associadas com DNA, enzimas, proteínas de soro, receptores, medicamentos, imunomoduladores, oncogenes, toxinas, antígenos de tumor ou antígenos. Os ditos peptídeos ou proteínas podem ter uma sequência ocorrendo naturalmente ou uma sequência mutante de modo a aperfeiçoar, inibir, regular, ou eliminar sua atividade biológica.

[097] O termo “peptídeo” refere-se a substâncias que compreendem dois ou mais, preferivelmente 3 ou mais, preferivelmente 4 ou mais, preferivelmente 6 ou mais, preferivelmente 8 ou mais, preferivelmente 10 ou mais, preferivelmente 13 ou mais, preferivelmente 16 ou mais, preferivelmente 100 ou mais ou preferivelmente 150 aminoácidos consecutivos ligados uns aos outros via ligações peptídicas. O termo “proteína” refere-se a peptídeos grandes, preferivelmente peptídeos tendo pelo menos 151 aminoácidos, mas os termos “peptídeo” e “proteína” são aqui usados como sinônimos. Os termos “peptídeo” e “proteína” compreendem de acordo com a invenção substâncias que contêm não somente componentes aminoácidos, mas também componentes não aminoácidos tais como estruturas de açúcares e fosfato, e também compreendem substâncias contendo ligações tais como ligações éster, tio éter ou dissulfeto.

[098] “Repórter” refere-se a uma molécula, tipicamente um peptídeo ou proteína, que é codificada por um gene repórter e medida em um ensaio repórter. Sistemas convencionais usualmente empregam um repórter enzimático e medem a atividade do dito repórter.

[099] De acordo com a invenção, dois elementos, tais como nucleotídeos ou aminoácidos são consecutivos, se eles são diretamente adjacentes um ao outro, sem qualquer interrupção.

[0100] “Endonucleases de restrição” ou “enzimas de restrição” refere-se a uma classe de enzimas que clivam ligações fosfodiéster em ambas as fitas de uma molécula de DNA dentro de específicas sequências de bases. Elas reconhecem específicos sítios de ligação, referidos como sequências de reconhecimento, sobre uma molécula de DNA de fita dupla. Os sítios nos quais as ditas ligações fosfodiéster no DNA são clivadas pelas ditas enzimas são referidos como sítios de clivagem. No caso de enzimas tipo IIS, o sítio de clivagem está localizado em uma distância definida do sítio de ligação de DNA.

Áreas de Aplicação

[0101] Uma área de aplicação da presente invenção é vacinação, isto é, o uso de mRNA modificado para inoculação ou o uso de uma composição farmacêutica compreendendo o mRNA modificado como um agente de inoculação, ou o uso de mRNA modificado na preparação de uma composição farmacêutica para propósitos de inoculação. Vacinação é baseada em introdução de um antígeno em um organismo ou sujeito, em particular em uma célula do organismo ou sujeito. No contexto da presente invenção, a informação genética codificando o antígeno é introduzida no organismo ou sujeito na forma de um mRNA modificado codificando o antígeno e/ou as diferentes fitas de mRNA TriMix. O mRNA ‘antígeno’ modificado contido na composição farmacêutica é traduzido em um antígeno, isto é, o polipeptídeo ou peptídeo antigênico codificado pelo mRNA modificado é expresso e uma resposta imune direcionada contra o polipeptídeo ou peptídeo antigênico é estimulado. Para vacinação contra um organismo patogênico, por exemplo, um vírus, uma bactéria, ou um protozoário, um antígeno de superfície de um tal organismo pode ser usado como um antígeno contra o qual uma resposta imune é elicitada. No contexto da presente invenção, uma composição farmacêutica compreendendo o mRNA modificado codificando um tal antígeno de superfície pode ser usada como uma vacina. Em aplicações onde uma vacina genética é usada para tratamento de câncer, a resposta imune é direcionada contra antígenos de tumor através de geração de um mRNA modificado codificando um antígeno(s) de tumor, em particular uma proteína que é expressa exclusivamente sobre células de câncer. Um tal mRNA modificado codificando um antígeno de tumor pode ser usado sozinho ou como um componente de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, onde administração de tanto o mRNA modificado como a sua composição resulta em expressão do antígeno(s) de câncer no organismo. Uma resposta imune para uma tal vacina pode, por isso, conferir ao sujeito vacinado um grau de imunidade protetora contra cânceres associados com o antígeno de câncer imunizante. Alternativamente, tais medidas podem ser usadas para vacinar um paciente de câncer com um mRNA modificado codificando um antígeno(s) de tumor expresso sobre as células de câncer de paciente de modo a estimular a resposta imune de paciente de câncer parta atacar quaisquer células de câncer expressando o antígeno codificado.

[0102] Para aplicações de terapia de gene, por exemplo, onde uma composição farmacêutica da invenção é usada, o mRNA modificado ali codifica pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo biológico ativo que não é formado ou é formado somente insuficientemente ou defeituosamente no paciente a ser tratado. Administração de um mRNA modificado codificando pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo ou uma sua composição biologicamente ativa a um tal paciente, por isso, restaura pelo menos parcialmente a expressão e/ou atividade do pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo no paciente e pelo que complementa o defeito genético de paciente. A direta introdução de um gene funcional, normal em um animal vivo tem sido estudada como um meio para substituir informação genética defeituosa. Em tais estudos, sequências de ácido nucleico são introduzidas diretamente em células de um animal vivo. Da mesma maneira, exemplos de polipeptídeos codificados por um mRNA modificado da invenção incluem, sem limitação, distrofina, o canal cloreto que é alterado defeituosamente em fibrose cística, enzimas que estão faltando ou defeituosas em distúrbios metabólicos como fenil cetonuria, galactosemia, homocistinuria, deficiência de adenosina desaminase, etc; assim como enzimas que estão envolvidas na síntese de neurotransmissores tais como dopamina, norepinefrina, e GABA, em particular tirosina hidroxilase e DOPA descarboxilase, e alfa-1-antitripsina, etc. Composições farmacêuticas da invenção também podem ser usadas para efetuar expressão de receptores de superfície de célula e/ou inibir parceiros de receptores de superfície de célula do mRNA modificado ali contido codifica tais proteínas ou peptídeos biologicamente ativos. Exemplos de tais proteínas que em uma maneira extracelular ou que ligam a receptores de superfície de célula incluem, por exemplo, ativador de plasminogênio de tecido (TPA), hormônios de crescimento, insulina, interferons, fator de estimulação de colônia de macrófago - granulócito (GM-CFS) e eritropoietina (EPO) etc.

[0103] Através de escolha de apropriados fatores de crescimento, a composição farmacêutica da presente invenção pode, por exemplo, ser usada para regeneração de tecido ou para interação com células tronco. Desta maneira doenças que são, por exemplo, caracterizadas por degeneração de tecido, entre as quais doenças neurodegenerativas como mal de Alzheimer, mal de Parkinson, etc. e outras condições degenerativas, comoartrose, podem ser tratadas. Nestes casos o mRNA modificado, em particular aquele contido na composição farmacêutica da presente invenção, preferivelmente codifica sem limitação, um membro de família TGF-Beta, fatores neurotróficos como NGF, neurotrofinas, etc. Processo de Tratamento

[0104] A presente invenção assim ainda provê um processo para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença ou distúrbio selecionado da lista não limitante compreendendo câncer, alergia e doenças infecciosas tais como infecções bacterianas, virais ou de fungos, por exemplo, infecção de HIV ou hepatite.

[0105] Os termos “câncer” e/ou “tumor” usados por toda a descrição não são pretendidos serem limitados aos tipos de câncer ou tumores que podem ter sido exemplificados. O termo por isso abrange todos os distúrbios proliferativos como neoplasma, displasia, lesões pré- malignas ou pré-cancerosas, crescimentos anormais de células, tumores benignos, tumores malignos, câncer ou metástase, onde o câncer é selecionado do grupo de: leucemia, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de CNS, melanoma, câncer de ovário, câncer de rim, câncer de próstata, câncer de mama, glioma, câncer de cólon, câncer de bexiga, sarcoma, câncer pancreático, câncer colo retal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer de osso, câncer de medula óssea, câncer de estômago, câncer de duodeno, câncer de esôfago, câncer de tiroide, câncer hematológico, e linfoma. Específicos antígenos para câncer podem, por exemplo, ser MelanA/MART1, antígenos de linha de germe - Câncer, gplOO, Tirosinase, CEA, PSA, Her-2/neu, survivina, telomerase.

[0106] O termo “doença infecciosa” ou “infecção” usado por toda a descrição não é pretendido ser limitado aos tipos de infecções que podem ter sido aqui exemplificados. O termo por isso abrange todos os agentes infecciosos para os quais vacinação pode ser benéfica para o sujeito. Exemplos não limitantes são as seguintes infecções ou distúrbios causados por vírus: síndrome de imunodeficiência adquirida - infecções por adenovírus - infecções por alfavírus - infecções por arbovírus - paralisia Bell - doença Borna - infecções por Bunyaviridae - infecções por Caliciviridae - catapora - resfriado comum - Condyloma Acuminata - infecções Coronaviridae - infecções por vírus Coxsackie - infecções por citomegalovírus - dengue - infecções por vírus DNA - Ecthyma contagiosa - encefalite - encefalite, arbovírus - encefalite, herpes simplex - infecções por vírus de Epstein-Barr - eritema infectiosum - exanthema subitum - síndrome de fadiga, crônica - infecções por hantavírus - febres hemorrágicas, virais - hepatite, viral, humana - herpes labialis - herpes simplex - herpes zoster - herpes zoster oticus - infecções por Herpesviridae - infecções por HIV - mononucleose infecciosa - influenza em pássaros - influenza, human - febre Lassa - sarampo - meningite, viral - Molluscum Contagiosum - Monkeypox - caxumba - mielite - infecções por vírus papiloma - infecções por vírus paramixo - febre Phlebotomus - poliomielite - infecções por vírus polioma - síndrome de pós poliomielite - raiva - infecções por vírus sincicial respiratório - febre do vale do Rift - infecções por vírus RNA - rubéola - síndrome respiratória aguda severa - doenças de vírus Slow - varíola - panencefalite esclerosante subaguda - doenças transportadas por carrapato - infecções por vírus de tumor - verrugas - febre do Oeste do Nilo - doenças de vírus - febre amarela - zoonoses - etc. Específicos antígenos para vírus podem ser HIV-gag, -tat, -rev ou -nef, ou antígenos de hepatite C.

[0107] Ainda exemplos não limitantes são as seguintes infecções ou distúrbios causados por bactérias ou fungos: abscesso - actinomicose - anaplasmose - antrax - artrite, reativa - aspergilose - bacteremia - infecções bacterianas e micoses - infecções por Bartonella - botulismo - abscesso de cérebro - brucelose - infecções por Burkholderia - infecções por Campylobacter - candidíase - candidíase, vulvovaginal - doença de coceira de gato - celulite - infecções por sistema nervoso central - cancroide - infecções por Chlamydia - infecções por Chlamydiaceae - cólera - infecções por Clostridium - coccidioidomicose - úlcera de córnea - infecção cruzada - criptococose - dermatomicoses - difteria - Ehrlichiose - empiema, pleural - endocardite, bacteriana - endoftalmite - enterocolite, pesudomembranosa - erisipela - infecções por Escherichia coli - fascite, necrotizante - gangrena Fournier - furunculose - infecções por Fusobacterium - gangrena gasosa - gonorreia - infecções por bactérias gram negativas - infecções por bactérias gram positivas - granuloma inguinal - Hidranitis Suppurativa - histoplasmose - Hordeolum - impetigo - infecções com Klebsiella - Legionelose - lepra - leptospirose - infecções por Listeria - angina de Ludwig - abscesso de pulmão - doença de Lyme - Linfogranuloma Venereum - maduro micose - melioidose - meningite, bacteriana - infecções por micobactéria - infecções por micoplasma - micoses - infecções nocardia - onicomicoses - ósteomielite - Paronychia - doença inflamatória pélvica - peste - infecções pneumocócicas - infecções por pseudômonas - psitacose - infecção puerperal - febre Q - febre de mordida de rato - febre recorrente - infecções do trato respiratório - abscesso retrofaringeal - febre reumática - rinoscleroma - infecções por Rickettsia - febre pintada de montanha rochosa - infecções por salmonela - febre escarlate - Scrub Typhus - sepse - doenças transmitidas sexualmente, bacterianas - doenças transmitidas sexualmente bacterianas - choque séptico - doenças de pele bacterianas - doenças de pele infecciosas - infecções estafilocócicas - infecções estreptocócicas - sífilis - sífilis congênita - tétano - doenças transportadas por carrapatos, tínea - Tinea Versicolor - tracoma - tuberculose - tuberculose espinhal - tularemia - febre tifoide - tifo epidêmico transportado por piolho - infecções do trato urinário - doença de Whipple - Tosse Whooping - infecções por Vibrio - bouba - infecções por Yersinia - zoonoses - zigomicose - etc.

[0108] Como aqui usado e a menos que de outro modo estabelecido, o termo “solvato” inclui qualquer combinação que possa ser formada pela molécula(s) de RNA desta invenção com um apropriado solvente inorgânico (por exemplo, hidratos) ou solvente orgânico, tal como mas não limitado a água para injeção, solução de Hartmann, PBS, NaCl 0,9%, meio de cultura livre de soro.

[0109] Genericamente, para uso farmacêutico, a molécula(s) de RNA da invenção pode ser formulada como uma preparação farmacêutica ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma molécula de RNA da invenção e pelo menos um carreador, diluente ou excipiente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente ainda um ou mais produtos farmaceuticamente ativos.

[0110] Por meio de exemplos não limitantes, uma tal formulação pode estar em uma forma apropriada para administração oral, para administração parenteral (tal como através de injeção intralinfática, intratumoral, intravenosa, intramuscular, ou subcutânea ou infusão intravenosa), para administração tópica (incluindo ocular), para administração através de inalação, através de um emplastro de pele, através de um implante, através de um supositório, etc. Tais apropriadas formas de administração - que podem ser sólidas, semissólidas ou líquidas, dependendo da maneira de administração - assim como processos e carreadores, diluentes e excipientes para uso na sua preparação, serão claras para aqueles versados; novamente é feita referência a, por exemplo, US-A-6 372 778, US-A-6 369 086, US-A-6 369 087 e US-A-6 372 733, assim como aos livros textos padrões, como a última edição Remington’s Pharmaceutical Sciences.

[0111] Alguns exemplos preferidos, mas não limitantes de tais preparações incluem comprimidos, pílulas, pulverizados, losangos, sachês, cachês, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis, pomadas, cremes, loções, cápsulas de gelatina macia e dura, supositórios, gotas oculares, soluções injetáveis estéreis e pulverizados embalados estéreis (que são usualmente reconstituídos antes de uso) para administração de uma pílula grande e/ou para administração contínua, que pode ser formulada com carreadores, excipientes e diluentes que são apropriados per se para tais formulações, tais como lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinil pirrolidona, polietileno glicol, celulose, água (estéril), metil celulose, hidróxi benzoatos de metila e propila, talco, estearato de magnésio, óleos comestíveis, óleos vegetais e óleos minerais ou suas misturas apropriadas. As formulações opcionalmente podem conter outras substâncias farmaceuticamente ativas (que podem ou não conduzir a um efeito sinergístico com os produtos da invenção) e outras substâncias que são comumente usadas em formulações farmacêuticas, tais como agentes lubrificantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes dispersantes, desintegrantes, agentes de volume, materiais de enchimento, agentes de preservação, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, reguladores de fluxo, agentes de liberação, etc. As composições também podem ser formuladas de modo a proverem liberação rápida, sustentada ou retardada do produto(s) ativo ali contido, por exemplo, usando lipossomas ou matrizes poliméricas hidrofílicas baseadas em géis naturais ou polímeros sintéticos. De modo a aperfeiçoar a solubilidade e/ou a estabilidade dos produtos de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, pode ser vantajoso empregar a-, ß- ou y-ciclo dextrinas ou seus derivados.

[0112] Mais em particular, as composições podem ser formuladas em uma formulação farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de partículas consistindo em uma dispersão sólida dos produtos da invenção e um ou mais polímeros solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis.

[0113] O termo “uma dispersão sólida” define um sistema em um estado sólido (como oposto a um estado líquido ou gasoso) compreendendo pelo menos dois componentes, onde um componente está disperso mais ou menos uniformemente por todo o outro componente ou componentes. Quando a dita dispersão dos componentes é tal que o sistema é química e fisicamente uniforme ou homogêneo na totalidade ou consiste em uma fase como definida em termodinâmica, uma tal dispersão sólida é referida como uma “solução sólida”. Soluções sólidas são sistemas físicos preferidos porque os componentes ali são usualmente facilmente biodisponíveis para os organismos para os quais eles são administrados.

[0114] Ainda pode ser conveniente formular os produtos na forma de nanopartículas que têm um modificador de superfície adsorvido sobre sua superfície em uma quantidade suficiente para manter um tamanho de partícula médio efetivo de menos que 1000 nm. Apropriados modificadores de superfície preferivelmente podem ser selecionados de excipientes farmacêuticos orgânicos e inorgânicos conhecidos. Tais excipientes incluem vários polímeros, oligômeros de baixo peso molecular, produtos naturais e tensoativos. Modificadores de superfície preferidos incluem tensoativos não iônicos e aniônicos.

[0115] Ainda uma outra maneira interessante de formular os produtos de acordo com a invenção envolve uma composição farmacêutica pelo que os produtos são incorporados em polímeros hidrofílicos e aplicação desta mistura como um filme de revestimento sobre muitas pérolas pequenas, assim rendendo uma composição com boa biodisponibilidade que pode ser convenientemente fabricada e que é apropriada para preparação de formas de dosagem farmacêutica para administração oral. Materiais apropriados para uso como núcleos nas pérolas são muitos, contanto que os ditos materiais sejam farmaceuticamente aceitáveis e tenham apropriadas dimensões e firmeza. Exemplos de tais materiais são polímeros, substâncias inorgânicas, substâncias orgânicas, e sacarídeos e seus derivados.

[0116] As preparações podem ser preparadas em uma maneira conhecida per se, que usualmente envolve mistura de pelo menos um produto de acordo com a invenção com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, e, se desejado, em combinação com outros produtos farmacêuticos, quando necessário sob condições assépticas. Novamente é feita referência a US-A-6 372 778, US-A-6 369 086, US-A-6 369 087 e US-A-6 372 733 e ainda a técnica anterior mencionada acima, assim como os livros textos padrões, tal como a última edição de Remington’s Pharmaceutical Sciences.

[0117] As preparações farmacêuticas da invenção estão preferivelmente em uma forma de dosagem unitária, e podem ser apropriadamente embaladas, por exemplo, em uma caixa, bolha, frasco, garrafa, sachê, ampola ou em qualquer outro retentor ou recipiente de dose simples ou doses múltiplas apropriados (que podem ser propriamente rotulados); opcionalmente com um ou mais livretos contendo informação de produto e/ou instruções para uso. Genericamente, tais dosagens unitárias conterão entre 0,1 e 1000 mg.

[0118] Os produtos podem ser administrados através de uma variedade de vias incluindo as vias intralinfática, intratumoral, oral, retal, ocular, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intranasal, dependendo principalmente da específica preparação usada e a condição a ser tratada ou prevenida. O pelo menos um produto da invenção genericamente será administrado em uma “quantidade efetiva”, pela qual é pretendida qualquer quantidade de um produto que, com apropriada administração, é suficiente para obter o desejado efeito terapêutico ou profilático no indivíduo ao qual ela é administrada. Usualmente, dependendo da condição a ser prevenida ou tratada e a via de administração, uma tal quantidade efetiva usualmente estará entre 0,01 a 1000 mg por quilograma de peso de corpo do paciente por dia, a qual pode ser administrada como uma dose simples diária, dividida em uma ou mais doses diárias, ou essencialmente continuamente, por exemplo, usando uma infusão em gotas. A quantidade(s) a ser administrada, a via de administração e ainda o regime de tratamento pode ser determinado pelo médico de tratamento, dependendo de fatores tais como a idade, gênero e condição genérica do paciente e a natureza e severidade da doença/sintomas a serem tratados. Novamente é feita referência a US-A-6 372 778, US-A-6 369 086, US-A-6 369 087 e US-A-6 372 733 e ainda a técnica anterior mencionada acima, assim como os livros padrões, tal como a última edição de Remington’s Pharmaceutical Sciences.

[0119] De acordo com o processo da presente invenção, a dita composição farmacêutica pode ser administrada separadamente em momentos diferentes durante o curso de terapia ou simultaneamente em formas de combinação simples ou dividida. A presente invenção é por isso para ser entendida como abrangendo todos tais regimes de tratamento simultâneo ou alternante e o termo “administração” é para ser interpretado da mesma maneira.

[0120] Para uma forma de administração oral, as composições da presente invenção podem ser misturadas com apropriados aditivos, tais como excipientes, estabilizantes, ou diluentes inertes, e colocadas por meio dos processos usuais nas apropriadas formas de administração, tais como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas duras, soluções aquosas, alcoólicas ou oleosas. Exemplos de apropriados carreadores inertes são goma arábica, magnésia, carbonato de magnésio, fosfato de potássio, lactose, glicose, ou amido, em particular amido de milho. Neste caso, a preparação pode ser realizada como grânulos secos ou úmidos. Apropriados excipientes ou solventes oleosos são óleos vegetais ou animais, tais como óleo de girassol e óleo de fígado de bacalhau. Apropriados solventes para soluções aquosas ou alcoólica são água, etanol, soluções de açúcar, ou suas misturas. Polietileno glicóis e polipropileno glicóis também são úteis como ainda auxiliares para outras formas de administração. Como comprimidos de liberação imediata, estas composições podem conter celulose microcristalina, fosfato de dicálcio, amido, estearato de magnésio, e lactose e/ou outros excipientes, ligantes, diluidores, desintegrantes, diluentes e lubrificantes conhecidos na técnica.

[0121] Quando administradas por aerossol nasal ou inalação, estas composições podem ser preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros apropriados preservativos, promotores de absorção para aperfeiçoar biodisponibilidade, flúor carbonetos, e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão conhecidos na técnica. Apropriadas formulações farmacêuticas para administração na forma de aerossóis ou sprays são, por exemplo, soluções, suspensões ou emulsões dos produtos da invenção ou seus sais fisiologicamente toleráveis em um solvente farmaceuticamente aceitável, tal como etanol ou água, ou uma mistura de tais solventes. Se requerido, a formulação também pode conter adicionalmente outros auxiliares farmacêuticos como tensoativos, emulsificantes, e estabilizadores assim como um propelente.

[0122] Para administração subcutânea, o produto de acordo com a invenção, se desejado com as substâncias usuais como solubilizantes, emulsificantes ou ainda auxiliares são colocados em solução, suspensão ou emulsão. Os produtos da invenção também podem ser liofilizados e os liofilizados obtidos usados, por exemplo, para a produção de injeção ou preparações de infusão. Apropriados solventes são, por exemplo, água, solução salina fisiológica em adição a também soluções de açúcar como soluções de glicose ou manitol, ou alternativamente misturas dos vários solventes mencionados. As soluções ou suspensões injetáveis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida, usando apropriados diluentes ou solventes não tóxicos, parenteralmente aceitáveis, como manitol, água, solução de Ringer, ou solução isotônica de cloreto de sódio, ou apropriados agentes de dispersão ou umectantes e de suspensão, como óleos fixos, suaves, estéreis, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos, e ácidos graxos, incluindo ácido oleico.

[0123] Quando administradas retalmente na forma de supositórios, estas formulações podem ser preparadas através de mistura de produtos de acordo com a invenção com um apropriado excipiente não irritante, como manteiga de cacau, ésteres de glicerídeos sintéticos ou polietileno glicóis, que são sólidos em temperaturas comuns, mas liquefazem e/ou dissolvem na cavidade retal para liberação de droga. Em realizações preferidas, os produtos e composições da invenção são usados localmente, por exemplo, topicamente ou em ambas aplicações absorvidas e não absorvidas.

[0124] As composições são de valor no campo veterinário, o que para os presentes propósitos não somente inclui a prevenção e/ou tratamento de doenças em animais, mas também - para animais economicamente importantes como gado, porcos, cabras, galinhas, peixes, etc. - aperfeiçoamento de crescimento e/ou peso do animal e/ou a quantidade e/ou a qualidade da alimentação ou outros produtos obtidos a partir do animal. Assim, ainda em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição para uso veterinário que contém pelo menos um produto da invenção e pelo menos um apropriado carreador (isto é, um carreador apropriado para uso veterinário). A invenção também refere-se ao uso de um produto da invenção na preparação de uma tal composição. Exemplos Material Genérico e Processos Experimentos in vitro: geração de monócito derivado de DCs

[0125] Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram usadas como uma fonte de precursores de DC e isoladas de produtos de leucaferese. DCs grau clínico foram geradas in vitro da fração aderente plástica como se segue. No dia 0, PBMC foram revestidas em uma densidade de 10x106 células/mL em meio apropriado para cultura de célula hematopoiética suplementado com plasma autólogo 2% (AP). As células foram deixadas por 2 horas para permitir aderência plástica dos monócitos a 37oC.

[0126] Células não aderentes foram removidas por lavagem, e as células aderentes foram cultivadas em meio suplementado com AP 1%, 1000 U/mL de GM-CSF e 500 U/mL de IL-4 na Cell Factory. Nos dias 2 e 4, meio contendo a quantidade de citocina de dia 0 foi adicionado à cultura de DC. No dia 6 de cultura de DC, as células foram colhidas e criopreservadas.

Experimentos in vitro: eletroporação de DCs

[0127] No dia 6, 4-8x106 DCs foram eletroporadas com mRNA como indicado. Antes de eletroporação, as DCs foram lavadas duas vezes, primeiro com PBS sem suplementos e em segundo com meio soro reduzido sem vermelho fenol. Após a segunda etapa de lavagem, as DCs foram ressuspensas em um volume final de 200 microlitros de meio de soro reduzido contendo o mRNA. Eletroporação foi realizada em uma cubeta de eletroporação de folga de 4 mm. Um pulso de decaimento exponencial foi usado com as seguintes condições: voltagem, 300 V; capacitância, 150 µF, e resistência, MQ resultando em um tempo de pulso de ~11 ms. Imediatamente após eletroporação, as DCs foram diluídas em meio suplementado com soro huAB 1% e OS/L-GLU e incubadas a 37oC em uma atmosfera de CO2 5% umedecida. Nenhuma citocina adicional foi adicionada às DCs após eletroporação. Experimentos in vivo: camundongos Fêmeas, camundongos DBA/2 de 6 a 12 semanas de idade. Experimentos in vivo: linhas de células de camundongos

[0128] A linhagem de células de mastocitoma P815 obtida de C. Uyttenhove (Université Catholique de Louvain, Louvain-La-Neuve, Belgium).

[0129] Experimentos in vivo: inoculação de célula de tumor e liberação in situ de mRNA

[0130] De modo a crescer tumores palpáveis, camundongos foram injetados com 5x105 células de tumor P815 subcutaneamente em ambos os flancos como indicado no experimento. Para liberação intratumoral de mRNA, camundongos foram anestesiados com isoflurano (Abbott). Tumores foram injetados com uma mistura contendo 10 µg de cada componente mRNA TriMix em um volume final de 50 µL de solução de Hartmann 0.8 / injetado em tumor quando ele atingiu um volume de cerca de 100 mm3. A mesma quantidade de mRNA foi usada entre os diferentes grupos. mRNA codificando tNGFR produzido de um vetor pGEM serviu como um controle.

Exemplo 1 Material específico e processos

[0131] Geração de iDCs e eletroporação são realizadas como descrito na parte de material genérico e processos acima. iDCs foram eletroporadas com 5 microgramas de cada componente de TriMix para permitir maturação das DCs. Todos as marcações citométricas foram realizados em PBS/BSA/azida. Para analisar a expressão de CD70, anti CD70 - isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi usado. Aquisição de dados foi realizada sobre um citômetro de fluxo FACSFortessa (BD) e analisados usando suporte lógico FACS Diva.

Resultado:

[0132] Vinte e quatro horas após eletroporação, DCs foram manchadas para sua expressão de superfície de CD70. Estes resultados mostram que após eletroporação de iDCs com TriMix, a intensidade de expressão de CD70 - intensidade de fluorescência média (MFI) - é significantemente maior após eletroporação com TriMix codificada pelo plasmídeo pUC TE ENE (SEQ ID NO: 5) contendo ambos elementos reguladores (TE + ENE), quando comparado ao pUC- vetor (base do plasmídeo pUC TE ENE), o vetor pUC TE e o vetor pUC ENE. Expressão de CD70 após eletroporação com TriMix codificada pelo plasmídeo pUC TE ENE é significantemente maior, enquanto o uso de pUC TE e pUC ENE resulta em um nível reduzido ou no máximo igual de expressão de CD70 comparado a pUC com falta destes elementos (figura 1). Portanto, a presença de ambos elementos (TE e ENE) no vetor parece ter um inesperado efeito sinergístico em termos de aumento de expressão de CD70 após eletroporação com TriMix codificada pelo plasmídeo pUC TE ENE.

Exemplo 2 Material específico & processos:

[0133] Geração de iDCs e condições de eletroporação são realizadas como descrito na parte acima de material genérico e processos. iDCs foram eletroporadas com 20 µg de WT1 codificando mRNA para permitir carga de antígeno. Para analisar expressão de WT1 intracelular, células foram fixadas e permeabilizadas, e manchadas intracelularmente com um anticorpo monoclonal anti-WT1 (clone 6F-H2; Dako Cytomation, Carpinteria, CA). Um anticorpo anti-camundongo marcado-PE emparelhado-isotipo IgG foi usado como Ab secundário (Becton & Dickinson, Erembodegem, Belgium). Anticorpo emparelhado- isotipo não reativo (eBioscience, Vienna, Áustria) foi usado como controle. Aquisição de dados foi realizada sobre um citômetro de fluxo FACSFortessa (BD) e analisados usando suporte lógico FACS Diva.

Resultado:

[0134] Estes resultados mostram que após eletroporação de iDC com WT1 codificado pelo vetor pUC TE ENE, uma expressão de WT1 mais prolongada é observada quando comparado aos outros vetores codificando mRNA WT1 (figura 2). Estes dados demonstram bem os diferentes modos de ação de ambos segmentos 5’TE e 3’ENE. Embora a expressão de mRNA do vetor pUC-TE seja alta após 4 horas, ela deteriora rapidamente. Tradução do RNA contendo ENE é menor que todas as outras durante o inteiro período. O vetor pUC TE ENE tem a alta capacidade de tradução de TE e o efeito de longa vida da sequência ENE. O nível de expressão de WT1 diminui em uma taxa significantemente menor que nos outros vetores.

Exemplo 3 Material específico & processos;

[0135] Geração de iDCs e condições de eletroporação são realizadas como descrito na parte acima de processos e material genérico. iDCs foram co-eletroporadas com 5 µg de mRNA codificando eGFP e TriMix (5 µg de cada componente) para permitir carga de antígeno e maturação das DCs. Expressão de eGFP foi avaliada por citometria de fluxo em vários pontos de tempo.

Resultado:

[0136] Expressão de eGFP foi seguida em vários pontos de tempo após eletroporação (figura 3). Estes resultados mostram que o nível de expressão de eGFP a partir de ambos vetores é comparável 4 horas após eletroporação. Entretanto, em pontos de tempos posteriores é claro que expressão a partir de pUC TE ENE derivado de mRNA é significantemente maior. Novamente isto aponta uma expressão do transgene mais estável e prolongada.

Exemplo 4 Material específico & processos:

[0137] Geração de iDCs e condições de eletroporação são realizadas como descrito acima. iDCs foram eletroporadas com 5 microgramas de cada componente de TriMix para permitir maturação das DCs. Todos as marcações citométricas de fluxo foram realizados em PBS/BSA/azida. Para analisar a expressão de moléculas de superfície sobre a superfície de célula das DCs, os seguintes anticorpos monoclonais foram usados:CD40-APC (Aloficocianina), CD70-FITC, CD80-PE, CD83-PE (Ficoeritrina), CD86-PE e CCR7-APC. Aquisição de dados foi realizada sobre um citômetro de fluxo FACS Fortessa (BD) e analisados usando suporte lógico FACS Diva.

Resultado:

[0138] Eletroporação de iDCs com mRNA TriMix codificado pelo vetor pUC TE ENE é capaz de induzir maturação das DCs (figura 4).

Exemplo 5: modelo de tumor de dois lados com P815: tratamento simples de um tumor Material específico e processos:

[0139] De modo a crescer tumores palpáveis, camundongos foram inoculados com 5x105 células de tumor P815 subcutaneamente em ambos os flancos. Terapia foi iniciada quando ambos tumores atingiram um volume injetável de cerca de 100 mm3. Através de uso de modelo de tumor de dois lados onde somente um tumor foi tratado, nós alvejamos avaliar o efeito sistêmico da estratégia de vacinação. Por isso, somente o tumor esquerdo foi injetado com mRNA controle ou mRNA TriMix pUC TE ENE (10 µg de cada componente mRNA) dissolvido em 0,8x solução de Hartmann. A resposta imune antitumor sistêmica foi avaliada através de medição de tamanho de ambos, tumor contralateral tratado e não tratado, e através de sobrevivência.

Resultado:

[0140] Através de uso de um modelo de tumor de dois lados, nós podemos avaliar o efeito sistêmico da estratégia de imunização. Liberação intratumoral simples de mRNA TriMix pUC TE ENE resultou em um crescimento de tumor significantemente reduzido de ambos, tumor contralateral tratado e não tratado (figura 5). O efeito de vacinação sobre o tumor distante pode ser uma indicação de que uma simples injeção de TriMix intratumoral pode ser usada para tratar múltiplas lesões de tumor.

Exemplo 6: modelo de tumor de dois lados com P815: tratamento simples de um tumor, solução Hartmann e tNGFR como controle Material específico & processos:

[0141] De modo a crescer tumores palpáveis, camundongos foram inoculados com 5x105 células de tumor P815 subcutaneamente em ambos os flancos. Terapia foi iniciada quando ambos tumores atingiram um volume injetável de cerca de 100 mm3. Através de uso de um modelo de tumor de dois lados através do qual somente um tumor foi tratado, nós alvejamos avaliar o efeito sistêmico da estratégia de vacinação. Por isso, somente o tumor esquerdo foi injetado tanto com veículo (solução de Hartmann 0,8), mRNA controle ou mRNA TriMix pUC TE ENE (10 µg de cada componente mRNA) dissolvido em solução de Hartmann 0,8x, todos em um volume total de 50 µL/tumor injetado. A resposta imune antitumor sistêmica foi avaliada através de medição de tamanho de ambos tumores contralaterais, tratado e não tratado, e através de sobrevivência.

Resultado:

[0142] Através de uso de um modelo de tumor de dois lados, nós podemos avaliar o efeito sistêmico da estratégia de imunização. Este experimento confirma as observações anteriores, isto é, 1. Liberação intratumoral simples de mRNA TriMix pUC TE ENE resultou em um crescimento de tumor significantemente reduzido de ambos tumores contralaterais tratado e não tratado. 2. Liberação intratumoral simples de mRNA TriMix pUC TE ENE resultou em uma sobrevivência prolongada de camundongos transportando tumor. 3. O efeito de vacinação foi mais pronunciado sobre tumores tratados.

[0143] Adicionalmente, tomando junto um grupo pelo qual tumores foram tratados com veículo, nós podemos mostrar o efeito adjuvante de próprio mRNA.

Exemplo 7: Comparação de diferentes sequências TE Material específico & processos;

[0144] Detalhes com relação aos específicos processos de ensaio podem ser encontrados em exemplos 2 e 3 como descrito acima. Resultado: Eletroporação de iDC com WT1 ou eGFP

[0145] Eletroporação de iDC com WT1 (Fig. 9A) ou eGFP (Fig. 9B) codificado pelos vetores pUCTE ENE tanto compreendendo um elemento terminal TE representado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 não resulta em uma significante diferença de expressão de WT1 ou eGFP respectivamente.

[0146] Estes dados indicam claramente que sequências tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1, tal como, por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, podem ser usadas intercambiavelmente como o elemento intensificador de tradução nos vetores de acordo com esta invenção. Referências Bonehill A, Tuyaerts S, Van Nuffel AM, Heirman C, Bos TJ, Fostier K, Neyns B, Thielemans K - Enhancing the T-cell stimulatory capacity of human dendritic cells by co-electroporation with CD40L, CD70 and constitutively active TLR4 encoding mRNA. - Mol Ther. 2008 Jun; 16(6):1170-80. Conrad NK, Steitz JA - A Kaposi's sarcoma virus RNA element that increases the nuclear abundance of intronless transcripts. - EMBO J. 2005 May 18;24(10):1831-41. Conrad NK, Mili S, Marshall EL, Shu MD, Steitz JA - Identification of a rapid mammalian deadenylation-dependent decay pathway and its inhibition by a viral RNA element. Mol Cell.2006;24:943-953. Diken M, Kreiter S, Selmi A, Britten CM, Huber C, Türeci O, Sahin U - Selective uptake of naked vaccine RNA by dendritic cells is driven by macropinocytosis and abrogated upon DC maturation. - Gene Ther. 2011 Jul; 18(7):702-8. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, Kallen KJ - Messenger RNA-based vaccines with dual activity induce balanced TLR-7 dependent adaptive immune responses and provide antitumor activity. - J Immunother. 2011 Jan;34(1):1-15. Hu MC, Tranque P, Edelman GM, Mauro VP. - rRNA-complementarity in the 5' untranslated region of mRNA specifying the Gtx homeodomain protein: evidence that base- pairing to 18S rRNA affects translational efficiency. - Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Feb 16;96(4):1339-44. Mitton-Fry RM, DeGregorio SJ, Wang J, Steitz TA, Steitz JA. - Poly(A) tail recognition by a viral RNA element through assembly of a triple helix. - Science. 2010;330:1244-1247. Sun R, Lin SF, Gradoville L, Miller G. - Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. - Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93:11883-11888. Van Lint Sandra, Goyvaerts Cleo, Maenhout Sarah, et al. - Preclinical Evaluation of TriMix and Antigen mRNA-Based Antitumor Therapy - Cancer Res 2012;72:1661-1671.

Claims (11)

1. Vetor de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência intensificadora de tradução (TE), a sequência sendo selecionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, uma sequência de ácido nucleico que é passível de transcrição e uma sequência de retenção nuclear de SEQ ID NO: 4; em que a dita sequência de ácido nucleico que é passível de transcrição é selecionada da lista compreendendo mRNA que codifica CD40L, CD70, caTLR4 ou mRNA específico para doença/antígeno.

2. Processo de aumento de estabilidade e/ou eficiência de tradução de RNA transcrito in vitro; caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) fornecimento de um vetor como definido na reivindicação 1, em que a dita sequência de ácido nucleico que é passível de transcrição é uma sequência de DNA que é passível de transcrição, que corresponde ao dito RNA a ser transcrito; e (ii) transcrição in vitro da dita sequência de DNA que é passível de transcrição.

3. Molécula de RNA, caracterizada pelo fato de que compreende um intensificador de tradução (TE), a sequência sendo selecionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, uma sequência de ácido nucleico que é passível de transcrição e uma sequência de retenção nuclear de SEQ ID NO: 4, em que a dita sequência de ácido nucleico que é passível de transcrição é selecionada da lista compreendendo mRNA que codifica CD40L, CD70, caTLR4 ou mRNA específico para doença/antígeno.

4. Molécula de RNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma cauda poli-A.

5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais moléculas de RNA como definida na reivindicação 3 ou 4.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita uma ou mais moléculas de RNA compreendem moléculas de mRNA que codificam CD40L, CD70 e caTLR4.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda mRNA codificando mRNA específico para doença/antígeno.

8. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que é para introdução em uma célula hospedeira.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de que é para vacinação, desencadear respostas imunes ou aplicações de terapia gênica.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de que é para o tratamento de câncer ou doenças infecciosas.

11. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais vetores como definido na reivindicação 1 ou 2; uma ou mais moléculas de RNA como definida na reivindicação 3 ou 4; ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 7.