ES2661967T3 - Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis - Google Patents

Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis Download PDF

Info

Publication number
ES2661967T3
ES2661967T3 ES10821435.4T ES10821435T ES2661967T3 ES 2661967 T3 ES2661967 T3 ES 2661967T3 ES 10821435 T ES10821435 T ES 10821435T ES 2661967 T3 ES2661967 T3 ES 2661967T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sgsh
seq
amino acid
acid sequence
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10821435.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Andrea Ballabio
Alessandro FRALDI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fondazione Telethon
Original Assignee
Fondazione Telethon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondazione Telethon filed Critical Fondazione Telethon
Application granted granted Critical
Publication of ES2661967T3 publication Critical patent/ES2661967T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y310/00—Hydrolases acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10)
    • C12Y310/01—Hydrolases acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10) acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10.1)
    • C12Y310/01001—N-Sulfoglucosamine sulfohydrolase (3.10.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Una secuencia nucleotídica que codifica una sulfatasa quimérica, consistiendo dicha sulfatasa quimérica en el orden de secuencia N-terminal-C-terminal: a) un péptido señal o bien de la secuencia aminoacídica de α- antitripsina humana (hAAT) o la secuencia aminoacídica de iduronato-2-sulfatasa (IDS) humana, perteneciendo dicha secuencia al siguiente grupo de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 4; b) una secuencia aminoacídica de sulfatasa humana desprovista de su péptido señal y c) el dominio de unión a LDLR de ApoB.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis Campo de la invención
La invención se refiere a un enfoque terapéutico, o bien terapia génica mediada por vector vírico o mediante la administración de sulfatasas modificadas, en particular la enzima sulfamidasa, para cruzar la barrera hematoencefálica y tratar la patología del SNC en mucopolisacaridosis (MPS), en particular MPS de tipo IIIA.
Antecedentes de la invención
La mucopolisacaridosis de tipo IlIA (MPS-IlIA) es una enfermedad hereditaria causada por la deficiencia de sulfamidasa (SGSH), una enzima implicada en la degradación por etapas de macromoléculas grandes llamadas sulfatos de heparano. Como consecuencia, se acumulan sustratos no degradados en las células y tejidos de los pacientes afectados, causando daño celular. El sistema nervioso central (SNC) es la diana predominante del daño y, de hecho, los pacientes de MPS-IIIA muestran un retardo mental grave y debilitación neuropatológica que conduce en última instancia a la muerte (a menudo <20 años). Los síntomas clínicos incluyen hiperactividad, comportamiento agresivo y alteración del sueño (1).
Se ha identificado un modelo de ratón de origen natural de MPS-IIIA con patofisiología y síntomas que se parecen a la afección humana (2-4). Estos ratones representan un modelo ideal para estudiar la fisiopatología de este trastorno y para ensayar nuevos protocolos terapéuticos.
El tratamiento de lesiones cerebrales representa el objetivo principal de cualquier enfoque terapéutico para MPS- IIIA. Una vía para alcanzar el cerebro consiste en la inyección directa de una molécula terapéutica directamente en el cerebro. Se han ensayado una serie de diferentes protocolos de terapia de reemplazo enzimático (ERT). En estos protocolos, se administraba una enzima sulfamidasa recombinante mediante inyección directa en el cerebro de ratones con MPS-IIIA.Estas estrategias son capaces de retardar la aparición de cambios neurodegenerativos cuando se administra sulfamidasa en ratones jóvenes (5, 6). Además, se desarrolló exitosamente un protocolo de terapia génica basado en la inyección intracerebral del gen SGSH a través de vectores de AAV por los autores de la invención (7). Aunque se ha mostrado que estos enfoques directos orientados al cerebro son clínicamente eficaces, representan enfoques altamente invasivos para la aplicabilidad terapéutica humana.
Puesto que cada neurona en el cerebro está perfundida por su propio vaso sanguíneo, es una vía poco invasiva alternativa para alcanzar el cerebro la administración intravenosa de la molécula terapéutica (8). Sin embargo, esta muy densa red de microvasos que forma la barrera hematoencefálica (BHE) no es permeable a todas las moléculas y podría impedir un suministro eficaz de agentes terapéuticos (9). Es más, la administración intravenosa de enzima lisosómicas ha producido un efecto terapéutico sobre la patología somática de muchas LSD, pero tiene poco o ningún efecto sobre la patología del SNC debido a la impermeabilidad de la BHE a las moléculas grandes (10). En MPS-IIIA, se ha demostrado que la inyección intravenosa de sulfamidasa no altera la patología ni procesos conductuales que aparecen en el cerebro de ratón con MPS-IIIA cuando se suministra la enzima después de formarse la BHE (11).
De forma importante, un reciente estudio de Urayama et al. demostró que la sulfamidasa se transporta a través de la BHE en ratones neonatos mediante transporte mediado por el receptor de 6-fosfato de manosa, pero el flujo de entrada al cerebro adulto era despreciable (12).
Resulta evidente que, en tal contexto, el reto real para la terapia de MPS-IIIA y en general para todas las LSD que afectan al SNC es desarrollar estrategias de tratamiento sistémico del SNC que puedan superar el obstáculo principal representado por la BHE. Es una estrategia eficaz para cruzar la BHE la orientación de proteínas al SNC mediante transcitosis mediada por receptor (13). Los receptores de la BHE bien caracterizados incluyen: receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), receptor de transferrina (TfR) y receptor de factor de crecimiento similar a insulina (IGFR). La familia de LDLR representa un grupo de receptores de superficie celular que se unen a complejos de apolipoproteína (Apo) (portadores lipídicos) para internalización en los lisosomas (14-16). Sobre la superficie de la BHE, la unión de LDLR a Apo da como resultado la transcitosis al lado luminal de la BHE, donde se libera la apolipoproteína para captarse por neuronas y astrocitos. Un estudio reciente ha demostrado que fusionar el dominio de unión a LDLR de Apo con una enzima lisosómica da como resultado un suministro eficaz de la enzima quimérica al SNC (17).
El documento WO2004108071 hace referencia a un polipéptido quimérico orientado al SNC que comprende un dominio de unión a receptor de BHE, tal como el dominio de unión a apolipoproteína B, para uso terapéutico en enfermedades de almacenamiento lisosómico.
El documento WO2004064750 hace referencia a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido lisosómico quimérico (específicamente la glucosidasa ácida lisosómica GAA implicada en el trastorno de almacenamiento lisosómico enfermedad de almacenamiento de glicógeno de tipo II) que comprende una secuencia señal secretora (concretamente, Vi-antitripsina y alfa-1-antitripsina) y a los vectores de AAV relacionados.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El documento W020050025 hace referencia a un compuesto que comprende un resto de unión a megalina conjugado con un agente de interés para suministro de fármaco mediado por receptor, particularmente por transcitosis, a través de la barrera hematoencefálica. Además, el documento hace referencia a un método de tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico basado en la administración de una composición que comprende un resto de unión a megalina. La apolipoproteína A y la mucopolisacaridosis IIIA se mencionan.
El documento W02009131698 hace referencia a una terapia basada en una enzima NaGlu quimérica caracterizada por un dominio de unión de apolipoproteína B y dirigida específicamente a mucopolisacaridosis IIIB.
Cardone et al. (Hum Mol Gen, 2006 15(7): 1225) describe la corrección del síndrome de Hunter (la enfermedad de almacenamiento lisosómico mucopolisacaridosis de tipo II) en el modelo de ratón de MPSII mediante suministro génico mediado por AAV2/8-TBG dirigido al hígado.
El documento WO2007092563 hace referencia a un método y a composiciones para tolerizar el cerebro de un mamífero ante el polipéptido esfingomielinasa ácida administrado exógenamente mediante el suministro primero de una cantidad eficaz de un transgén que codifica el polipéptido al tejido hepático de mamífero y la administración entonces de una cantidad eficaz del transgén al sistema nervioso central (SNC) del mamífero. El enfoque terapéutico está dirigido a la enfermedad de Niemann-Pick, una enfermedad de almacenamiento lisosómico. Se mencionan promotores específicos de hígado y AAV de tipo 8.
El documento W02009075815 hace referencia a métodos de tratamiento de la enfermedad de Pompe (una enfermedad de almacenamiento lisosómico) que implica la administración de un vector de AAV en el contexto de la terapia de reemplazo enzimático. Se mencionan un promotor específico de hígado (promotor de globulina de unión a hormona tiroidea) y AAV de tipo 8.
Ninguno de los documentos citados en la técnica anterior divulga o siquiera sugiere la enzima sulfamidasa modificada de la presente invención, ni que pueda tener un efecto terapéutico para el tratamiento de MPS de tipo IIIA.
Descripción de la invención
Como se divulga en la técnica antecedente, la patología cerebral es el rasgo más común de los trastornos de almacenamiento lisosómico. Por lo tanto, el tratamiento de lesiones cerebrales representa el objetivo principal de cualquier terapia eficaz para estos trastornos.
El obstáculo principal para tratar eficazmente el cerebro mediante el suministro sistémico de un agente terapéutico es la barrera hematoencefálica (BHE).
Los autores desarrollaron un enfoque terapéutico no invasivo para tratar la patología cerebral en mucopolisacaridosis de tipo IIIA (MPS-IIIA), una enfermedad de almacenamiento lisosómico con una grave afectación del sistema nervioso central. Esta estrategia está basada en la construcción de una sulfamidasa quimérica (la enzima sulfatasa que es deficiente en MPS-IIIA), optimizada con dos secuencias aminoacídicas (una en el extremo N y otra en el extremo C de la proteína) que confieren a la sulfamidasa modificada la capacidad de secretarse en gran medida y orientarse eficazmente al cerebro cruzando la barrera hematoencefálica (BHE). La enzima modificada se expresa por el serotipo 8 de virus adenoasociado (AAV), que se orienta específicamente al hígado y lo vuelve un órgano fabricante de la enzima terapéutica.
La sulfamidasa modificada puede usarse eficazmente tanto para terapia génica como para terapia de reemplazo enzimático (ERT).
El enfoque de modificación puede usarse para otras enzimas lisosómicas que son deficientes en otras mucopolisacaridosis con afectación grave del SNC.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención una secuencia nucleotídica que codifica una sulfatasa quimérica, consistiendo esencialmente dicha sulfatasa quimérica en el orden de secuencia N-terminal-C-terminal: a) un péptido señal de la secuencia aminoacídica de a-antitripsina humana (hAAT) o la secuencia aminoacídica de iduronato-2- sulfatasa (IDS) humana, perteneciendo dicha secuencia al siguiente grupo
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA (SEQ ID No. 2) o MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALG
(SEQ ID No. 4 o 6); b) una secuencia aminoacídica de sulfatasa humana desprovista de su péptido señal; c) el dominio de unión a LDLR de ApoB.
En una realización preferida, la sulfatasa humana es sulfamidasa humana, más preferiblemente la secuencia aminoacídica derivada de sulfamidasa humana tiene la secuencia:
MSCPVPACCALLLVLGLCRARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALA
RRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLP
LLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFL
QTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYD
PLDVLVPYFVPOTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVI
FTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEIIPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILD
WFSIPYPSYAJFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSV
QHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYY
RARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAP
nCA'l rrk[ SPGkOP[ ll\n (SEQ ID No. 8). Tal secuencia se codifica por la secuencia nucleotídica de SEQ 5 ID No. 7: 5'-
ATG AGCTGCCCCGT GCCCGCCTGCTGCGCGCT GCT GCT AGTCCTGGGGCT
CTGCCGGGCGCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAG
GCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTG
GACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGT
CAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGC’CTGCCCCAGC
ATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCC
TTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCG
CACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGT
TTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTC’CTCCAGGTGGGGCGG
AAC ATC ACT AG A ATT AAGCTGCTCGT CC GG AA ATT CCT GC AG ACT C AGG A
T GACCGGCCTTT CTT CCTCT ACGT CGCCTTCCACG ACCCCC ACCGCTGT G
GGCACTCCCAGCCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGA
GAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCC
ACTGG ACGT GCT GGT GCCTTACTTCGTCCCC AACACCCCGGCAGCCCG AG
CCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTT
GGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACT
GGTG AT CTT CACGT CCG ACAACGGGATCCCCTT CCCC AGCGGCAGG ACC A
ACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAG
CACCCAAAACGC FGGGGCCAAGICAGCGAGGCCI ACGIGAGCCTCC FAGA
CCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACG
CCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCG
GCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCA
CCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACT
TCCGCCTCGTGCACAACC'TCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAG
GACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGC
TGGTC AGCCCACGGGCTGGT ACAAGGACCTCCGTCATT ACT ACT ACCGGG
CGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAAC
CTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACC'A
GCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCG
ACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAAT
GAGCTGTGA-3’.
En una realización preferida, el dominio de unión a LDLR de ApoB codificado tiene la secuencia:
SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS(seq ID No: 10).
En una realización preferida, la secuencia nucleotídica tiene la secuencia perteneciente al siguiente grupo:
5 SECUENCIAS CON FLAG (el experto sustituirá fácilmente la secuencia FLAG por cualquier otra secuencia espadadora adecuada):
a) Ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH-3xflag (1611) (SEQ ID No. 11).
5'-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTG
CCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCG
CGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCC
ACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGC
CTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTG
GCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCAC
CACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCA
AGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGA
CC'GTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTC
CAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCT
GCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACC
CCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAG
TTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCA
GGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCC
CGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATG
GACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCT
GAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCA
GCGGC AGG ACCAACCTGT ACTGGCCGGGC ACTGCTG AACCCTT ACTGGT G
TCATCCCCGGAGCACCC.AAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGT
GAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGT
ACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGG
TCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGG
CAGCC AG AGCC ACC ACG AGGT CACCAT GTCCT ACCCCAT GCGCTCCGT GC
AGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTT
CCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAA
CCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATT
ACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCAC
GAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGAT
GCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGG
TGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAG
CCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGA
CC AT G AC GGTG ATT AT AAAG ATC AT G AC AT CG ACT AC AAGG AT G ACG AT G
ACAAGTAGTGA-3’
b) Ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH-3xflag (1614 pb) (SEQ ID No. 13).
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCT
GAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCC
TCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATC
GCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAA
T GCCTT C ACCTCGGTC AGC AGCT GCT CTCCC AGCCGCGCCAGCCTCCTC A
CTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTG
CACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAG
CCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGG
AGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTC
CrCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATT
CCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACG
ACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAG
AAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCC
CCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACA
CCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGC
ATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGT
CCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCC
CCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTG
GTGTCATCCCCGGAGCACCCA.AAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTA
CGT G AGCC’T CCT AG ACCTC ACGCCC ACC AT CTT GG ATTGGTT CTCGAT CC
CGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGC
CGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTT
TGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCG
TGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCC
TTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCT
GAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTC
ATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCC
CACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGA
GATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCT
GGGT GT GCGCCCCCG ACGGC GTCCT GG AGGAG AAGCT CT CTCCCC AGT GC
CAGCCCCTACACAATGAGCTCTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAA
AGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACG
ATG AC AAGTAGTGA-3 ’
c) Ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH-3xflag-ApoB (1734 pb) (SEQ ID No. 15). 5'-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTG CCTGGT CCCT GT CTCC CTGGCT CGT CCCCGG A ACGC ACT GCT GCTCCTCG CGG ATG ACGG AGGCTTT GAG AGT GGCGCGT ACA ACAACAGCGCCATCGCC ACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGC CTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTG GCCTGCCCCAGCAT CAGAATGGGAT GTACGGGCTGC ACC AGG ACGTGCAC CACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCA AGCI GG I GI GCGC'ACAGGCA J’C'A I CGGGA AGAAGCAC'G IGGGGCCGGAGA CCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTC CAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCT
GCAGACTCAGGATGACCGGC'CTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACC CCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAG TTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCA GGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCC CGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATG GACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCT GAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCA GC GGC AGG ACCAACCT GT ACTGGCCGGGC'ACTGCTG AACCCTT ACT GGT G TCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGT G AGCCT CCT AG ACCT CACGCCCACC AT CTTGG ATT GGTTCT CG ATCCCGT ACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGG TCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGG CAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGC AGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTT C CC AT CG ACC AGG ACTT CT AC'GT CTC ACCC ACCTT C C AG G ACCT CCTG AA CCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATT ACT ACT ACCGGGCGCGCTGGG AGCTCT ACGACCGG AGCCGGG ACCCCC AC GAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGAT GCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGG TGT GCGCCCCCG ACGGCGT CCTGGAGG AG AAGCTCTCTCCCC AGT GCC AG CCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGA CCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATG ACAAG ATCTCTGTCATT G ATGCACTGC AGT ACAAATT AG AGGGC ACCACA AG ATT G AC A AG A A A A AGGGG ATTG A AGTT AGCC AC AGCTCTGTCTCTG AG CAACAAATTTGTGGAGGGT AGT AG ATCTT AGT G A-3 ’
d) Ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH-3xflag-ApoB (1737 pb) (SEQ ID No. 17).
5 ATGCCCCCGCCCCGC ACCGGC’CGCGGCCT GCT GT GGCT GGGCCTGGT GCT G AGC AGCGT GTGCGT GGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGC ACTGCT GCTCC TCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATC GCCACCCCGCACCIGGACGCC l'l GGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAA TGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCA CTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTG
CACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAG
CCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGG
AGACC'GTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTC
CTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATT
CCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACG
ACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAG
AAGTTTGGCAACGGAGAGAGC'GGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCC
CCAGGCCT ACG ACCC ACTGG ACGT GCT GGTGCCTT ACTTCGTCCCC AAC A
CCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGC
ATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGT
CCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCC
CCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTG
GTGTCATCCCCGGAGCACCeAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTA
CGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCC
CGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGC
CGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTT
TGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCG
TGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCC
TTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCT
GAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTC
ATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCC
CACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGA
GATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCT
GGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGC
CAGCCCCT ACACAATGAGCTCTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACT ACAA
AGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACG
ATGACAAGATCTCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACC
ArAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCT
G AGCAAC AAATTT GT GG AGGGT AGT AG ATCTT AGTGA-3 ’
SECUENCIAS SIN FLAG:
e) Ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH (SEQ ID No. 19).
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTG
CCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCG CGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCC ACCCC GC ACCT GG ACGCCTT GGCCCGCCGC AGCCT CCT CTTT CGC AAT GC CTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTG GCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCAC CACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCA AGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGC'ACGTGGGGCCGGAGA CCGT GT ACCC GTTTG ACTTT GC GT ACACGG AGG AG AAT GGCT CCGTCCT C CAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCT GCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACC CCC AC CGCT GT GGGC ACT CCC AACCCC AGT ACGG AACCTTCTGT G AGAAG TTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCA GGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCC CGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATG GACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCT G A ACG ACAC ACT GGT G ATCTT CACGT CCG AC A ACGGG AT CCCCTT CCCC A GCGGC AGG ACCA ACCT GT ACTGGCCGGGC ACTGCTG AACCCTT ACTGGT G TCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGT G AGCCT CCT AG ACCTC ACGCCCACC AT CTTGG ATT GGTTCTCG ATCCCGT ACCCC AGCT ACGCCATCTTTGGCT CG AAG ACC AT CC ACCT C ACTGGCCGG TCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGG CAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGC AGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTT CCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAA CCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGCiTACAAGGACCTCCGTCATT ACT ACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCT ACGACCGGAGCCGGGACCCCCAC GAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGAT GCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGG TGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAG CCCCTCC AC AATG AGCTGTG A-3 ’
f) Ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH (SEQ ID No. 21).
5-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCT
GAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCC
TCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATC
GCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAA
TGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCA
CTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTG
CACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAG
CCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGG
AG ACC’GTGT ACCCGTTT GACTTTGCGT ACACGG AGGAG AAT GGCTCCGTC
CTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATT
CCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACG
ACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAG
AAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCC
CCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACA
CCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGC
ATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGT
CCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCC
CCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTG
GTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTA
CGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCC
CGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGAC'CATCCACCTCACTGGC
CGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTT
TGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCG
TGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCC
TTTCCCAT CG ACC AGG ACTTCT ACGT CTC ACCCACCTTCC AGG ACCTCCT
GAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTC
ATTACT ACT ACCGGGCGCGCTGGG AGCTCTACGACCGG AGCCGGG ACCCC
CACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGA
GATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCT
GGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGC
CAGCCCC1ACACAATGAGCTCTGA-3’
g) Ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH-ApoB (SEQ ID No. 23).
5 AT GC CGT CTT CT GTCT CGT GGGGC AT CCTCCT GCT GGC AGGCCT GT GCT G

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Una secuencia nucleotídica que codifica una sulfatasa quimérica, consistiendo dicha sulfatasa quimérica en el orden de secuencia N-terminal-C-terminal: a) un péptido señal o bien de la secuencia aminoacídica de a- antitripsina humana (hAAT) o la secuencia aminoacídica de iduronato-2-sulfatasa (IDS) humana, perteneciendo dicha secuencia al siguiente grupo de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 4; b) una secuencia aminoacídica de sulfatasa humana desprovista de su péptido señal y c) el dominio de unión a LDLR de ApoB.
  2. 2. La secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, en la que la sulfatasa humana es sulfamidasa humana.
  3. 3. La secuencia nucleotídica según la reivindicación 2, en la que la sulfamidasa humana tiene la secuencia de SEQ ID No. 8.
  4. 4. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de unión a LDLR de ApoB tiene la secuencia de SEQ ID No. 10.
  5. 5. La secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene la secuencia perteneciente al siguiente grupo:
    a) ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH-3xflag de SEQ ID No. 11,
    b) ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH-3xflag de SEQ ID No. 13,
    c) ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH-3xflag-ApoB de SEQ ID No. 15,
    d) ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH-3xflag-ApoB de SEQ ID No. 17,
    e) ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH de SEQ ID No. 19,
    f) ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH de SEQ ID No. 21,
    g) ensamblaje del módulo hAATsp-SGSH-ApoB de SEQ ID No. 23,
    h) ensamblaje del módulo hIDSsp-SGSH-ApoB de SEQ ID No. 25.
  6. 6. Un plásmido recombinante que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores bajo el control de un promotor específico del hígado, preferiblemente el promotor específico del hígado es el promotor de globulina de hormona tiroidea humana (TBG), más preferiblemente el promotor de globulina de hormona tiroidea humana (TBG) tiene la secuencia de SEQ ID No. 27.
  7. 7. El plásmido recombinante según la reivindicación 6, que es capaz de ensamblarse en un vector vírico para terapia génica de trastornos lisosómicos pertenecientes al grupo de: vector lentivíricos, vectores adenovíricos dependientes de auxiliares o vectores de AAV, preferiblemente es el plásmido recombinante AAV2.1.
  8. 8. Un vector vírico que comprende el plásmido recombinante según la reivindicación 6 o 7.
  9. 9. El vector vírico según la reivindicación 8 perteneciente al grupo de vectores víricos de AAV, preferiblemente el vector de AAV de serotipo 8.
  10. 10. Una sulfatasa quimérica consistente en el orden de secuencia N-terminal-C-terminal: a) un péptido señal de o bien la secuencia aminoacídica de a-antitripsina humana (hAAT) o la secuencia aminoacídica de iduronato-2- sulfatasa (IDS) humana, perteneciendo dicha secuencia aminoacídica al siguiente grupo de SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 4; b) una secuencia aminoacídica de sulfatasa humana desprovista de su péptido señal y c) el dominio de unión a LDLR de ApoB.
  11. 11. La sulfatasa quimérica según la reivindicación 10, en la que la sulfatasa humana es sulfamidasa humana, preferiblemente la secuencia aminoacídica de sulfamidasa humana tiene la secuencia de SEQ ID No 8.
  12. 12. La sulfatasa quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 anteriores, en la que el dominio de unión a LDLR de ApoB tiene la secuencia de SEQ ID No 10.
  13. 13. La sulfatasa quimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 10 a 12, que tiene la secuencia perteneciente al siguiente grupo:
    a) hAATsp-SGSH-3xflag de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 12,
    b) hIDSsp-SGSH-3xflag de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 14,
    c) hAATsp-SGSH-3xflag-ApoB de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 16,
    d) hIDSsp-SGSH-3xflag-ApoB de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 18,
    e) hAATsp-SGSH de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 20,
    f) hIDSsp-SGSH de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 22,
    g) hAATsp-SGSH-ApoB de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 24,
    5 h) hIDSsp-SGSH-ApoB de secuencia aminoacídica SEQ ID No. 26.
  14. 14. El plásmido recombinante según la reivindicación 6 o 7 o el vector vírico según la reivindicación 8 o 9 o la sulfatasa quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 anteriores para uso como medicamento.
  15. 15. El plásmido recombinante o vector vírico o sulfatasa quimérica según la reivindicación 14 para uso en el tratamiento de trastornos lisosómicos.
    10 16. El plásmido recombinante o vector vírico o sulfatasa quimérica según la reivindicación 14 para uso en el
    tratamiento de MPS, preferiblemente la MPS es MPS de tipo IIIA.
  16. 17. El plásmido recombinante o vector vírico o sulfatasa quimérica para uso según la reivindicación 15 o 16, en los que dicho uso es mediante terapia génica.
  17. 18. Una composición farmacéutica que comprende el plásmido recombinante según la reivindicación 6 o 7 o el 15 vector vírico según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 anteriores o la sulfatasa quimérica según cualquiera de
    las reivindicaciones 10 a 13 anteriores y diluyentes y/o excipientes y/o portadores adecuados.
  18. 19. La composición farmacéutica según la reivindicación 18 para uso en el tratamiento de trastornos lisosómicos, preferiblemente MPS, más preferiblemente MPS de tipo IIIA.
    MPS-IIIA MPSIIIA
    no inyectados ^^V2/8-TBG-GFP
    imagen1
    Figura 1
    imagen2
    Actividad de SGSH normalizada en suero (u.a.)
    Actividad de SGSH en suero
    imagen3
    MPS-IIIA inyectados MPS-IIIA control
    imagen4
    £ OO
    & oa
    lO OG
    1< <30
    ÍO W
    co
    h-
    Figura 2A
    Actividad de SGSH {20 }j.g de proteina)
    Actividad de SGSH en el hígado
    imagen5
    6000 5000 4000 3000 2000 1000 o
    MPS-iitA Normal MP5-B!AS6SHínj.
    imagen6
    U ratones a los 7 días
    5
    '& ratones a las 3 sem. \ % ratones a las 5 sem. É ratones a las 10 sem j
    r>VlW>WA>AIMW/W>VlVlV>,mWMAIMMW/M>VlV
    Figura 2B
    MPSIIIA-GFP Inj.
    imagen7
    GFP
    Figura 3
    MPS-IIIA No inyectados
    imagen8
    dapi
    Actividad hepática/20 ug de proteina
    Actividad hepática en ratones adultos con MPSIIIA
    imagen9
    Figura 4A
    imagen10
    .............i
    illllll
    ..—_—....
    wmm
    5; ; i
    Actividad sérica en ratones adultos
    S 10
    i|M
    HÍ¡iÍi
    p;: . ~*~HET GFP
    -*-KO SGSH INI.
    KO GFP
    1 semana
    2 semanas
    3 semanas
    4 semanas
    5 semanas
    Figura 4B
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    Figura 5
    imagen14
    imagen15
    imagen16
    co
    imagen17
    Figura 6
    imagen18
    imagen19
    ineficaz
    Actividad total de SGSH (U.A.)
    MEF con MPS-IIIA
    13Ü0C
    16000
    14000
    12000
    10000
    soco
    6000
    4000
    2000
    0
    imagen20
    medio
    sedimento
    NT SGSH
    AAT- IDS- SGSH SGSH
    AAT- IDS-
    SGSH- SGSH- APO APO
    Figura 7A
    % de eficacia de secreción (medio/medio+sedimento)
    Eficacia de secreción en MEF con MPSIIIA
    60
    50
    40
    50
    20
    10
    0
    imagen21
    m'Mm
    VÍ i '
    VÍ i '
    fm
    ■ : i
    Wmam*
    mam
    NT
    SGSH AAT-SGSH IDS-SGSH AAT-
    SGSH-
    APO
    IDS- SGSH- APO
    Figura 7B
    ¿ntí-Flag
    MEF MPSIIIA
    imagen22
    Pulso y seguimiento
    tO 6h I6h 24h seguimiento
    imagen23
    SGSH AAT-SGSH IDS-SÜSH AAT-SGSH-Apo IDS-SGSH-Apo
    imagen24
    Figura 8
    imagen25
    imagen26
    imagen27
    Actividad de SGSH en 20 ug de proteína
    o
    EL
    n>
    CL
    EL
    ÍD
    (/>
    O
    </>
    3
    n
    (D
    —i
    IT
    -i
    O
    EL
    0)
    su
    r+
    o
    *
    <fí
    a>
    EL
    c
    r+
    o
    Actividad de SGSH en
    imagen28
    imagen29
    imagen30
    imagen31
    Actividad de SGSH en hígado Actividad de SGSH en suero
    imagen32
    I TBG «SFP 3
    pb
    {$«»*} ' átoneü í3ííw>?> |
    ffl
    secuencias de AAV adicionales
    imagen33
    intrón mise de SV40 0
    ' ?k‘ll (í
    " ' *GFP
    Ma&ü(5.0,5»)
    FIG. 10
ES10821435.4T 2010-12-22 2010-12-22 Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis Active ES2661967T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2010/056024 WO2012085622A1 (en) 2010-12-22 2010-12-22 Therapeutic strategies to treat cns pathology in mucopolysaccharidoses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2661967T3 true ES2661967T3 (es) 2018-04-04

Family

ID=44343645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10821435.4T Active ES2661967T3 (es) 2010-12-22 2010-12-22 Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9206401B2 (es)
EP (1) EP2654800B1 (es)
JP (1) JP6023073B2 (es)
AU (1) AU2010366066B2 (es)
CA (1) CA2822559C (es)
ES (1) ES2661967T3 (es)
WO (1) WO2012085622A1 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2661042C (en) 2006-08-18 2012-12-11 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
HUE044865T2 (hu) 2009-10-09 2019-11-28 Armagen Inc Eljárások és készítmények a központi idegrendszerben iduronát-2-szulfatáz-aktivitás növelésére
ES2661967T3 (es) * 2010-12-22 2018-04-04 Fondazione Telethon Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis
US20130039888A1 (en) 2011-06-08 2013-02-14 Nationwide Children's Hospital Inc. Products and methods for delivery of polynucleotides by adeno-associated virus for lysosomal storage disorders
WO2015012944A1 (en) * 2013-07-22 2015-01-29 Armagen Technologies, Inc Methods and compositions for increasing enzyme activity in the cns
LT2970413T (lt) 2014-04-01 2018-10-10 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Modifikuota sulfamidazė ir jos gamyba
US20170191041A1 (en) * 2014-07-11 2017-07-06 Biostrategies LC Materials and methods for treating disorders associated with sulfatase enzymes
JP6430980B2 (ja) * 2016-03-09 2018-11-28 フォンダッツィオーネ・テレソン ムコ多糖症におけるｃｎｓ病変を処置するための治療戦略
KR20240001721A (ko) * 2016-09-12 2024-01-03 제네똥 산-알파 글루코시다제 변이체 및 이의 용도
EP3293203A1 (en) * 2016-09-12 2018-03-14 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
WO2018117613A1 (ko) * 2016-12-19 2018-06-28 한미약품 주식회사 뇌 표적 지속성 단백질 결합체
WO2019070577A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Denali Therapeutics Inc. FUSION PROTEINS COMPRISING SUBSTITUTE ENZYM THERAPY ENZYMES
WO2019207167A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Fondazione Telethon Therapy of sulfatase deficiencies
CN108795985A (zh) * 2018-05-31 2018-11-13 深圳市免疫基因治疗研究院 一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
JP2023505851A (ja) 2019-12-10 2023-02-13 武田薬品工業株式会社 ハンター病治療用のアデノ随伴ウイルスベクター
IT202200007808A1 (it) 2022-04-20 2023-10-20 Luigi Michele Pavone Composizioni terapeutiche per malattie causate da accumulo di eparan solfato

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060122376A1 (en) * 1991-02-07 2006-06-08 Chiron Corporation Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
WO2004055157A2 (en) * 2002-08-13 2004-07-01 Whitley Chester B Methods of using vectors to treat metabolic disorders
US20050142141A1 (en) 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
US20040248262A1 (en) * 2003-01-22 2004-12-09 Koeberl Dwight D. Constructs for expressing lysomal polypeptides
WO2004108071A2 (en) * 2003-06-05 2004-12-16 Salk Institute For Biological Studies Targeting polypeptides to the central nervous system
US7863238B2 (en) * 2004-06-10 2011-01-04 Saint Louis University Proteins with an attached short peptide of acidic amino acids
WO2006007560A2 (en) * 2004-07-01 2006-01-19 University Of Pennsylvania Targeted protein replacement for the treatment of lysosomal storage disorders
SI2245145T1 (sl) * 2008-01-18 2017-05-31 Biomarin Pharmaceutical Inc. Izdelava aktivnih visoko fosforiliranih humanih encimov lizosomske sulfataze in njihova uporaba
EP3000481A3 (en) * 2009-07-14 2016-05-11 Mayo Foundation for Medical Education and Research Peptide-mediated non-covalent delivery of active agent agents across the blood brain barrier
EP2333074A1 (en) * 2009-12-14 2011-06-15 Robert Steinfeld Substances and methods for the treatment of lysosmal storage diseases
CA2805413A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for cns delivery of heparan n-sulfatase
ES2661967T3 (es) * 2010-12-22 2018-04-04 Fondazione Telethon Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis

Also Published As

Publication number Publication date
CA2822559A1 (en) 2012-06-28
US20130302308A1 (en) 2013-11-14
JP6023073B2 (ja) 2016-11-09
EP2654800A1 (en) 2013-10-30
US9487766B2 (en) 2016-11-08
CA2822559C (en) 2021-11-30
JP2014507934A (ja) 2014-04-03
US20160122731A1 (en) 2016-05-05
US9206401B2 (en) 2015-12-08
WO2012085622A1 (en) 2012-06-28
AU2010366066A1 (en) 2013-07-11
EP2654800B1 (en) 2017-12-06
AU2010366066B2 (en) 2016-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2661967T3 (es) Estrategias terapéuticas para tratar patologías del SNC en mucopolisacaridosis
JP7332157B2 (ja) アンジオテンシン変換酵素２（ａｃｅ２）の活性な低分子量変異体
EP2841086B1 (en) Compositions for use in treating neural injury by inhibiting the activity of lar family phosphatases
CA2641070C (en) Enzyme replacement therapy for treating lysosomal storage diseases
JP6329483B2 (ja) 組換えヒトｎａｇｌｕタンパク質およびその利用
ES2679374T3 (es) Proteínas de fusión terapéuticas dirigidas de enzima lisosómica y usos de las mismas
ES2689468T3 (es) Purificación de iduronato-2-sulfatasa
JP2022513067A (ja) ポンペ病を処置するための治療用アデノ随伴ウイルス
US20230174977A1 (en) Engineered circular polynucleotides
TW202132570A (zh) 用於治療龐貝症及溶酶體病症之包含肝特異性啟動子之治療性腺相關病毒
US20230346947A1 (en) Compositions and methods for inhibiting the activity of lar family phosphatases
JP6430980B2 (ja) ムコ多糖症におけるｃｎｓ病変を処置するための治療戦略
ES2618899T3 (es) Zimógeno de proteína C y procedimientos de utilización del mismo para prevenir las metástasis del cáncer
US20170266264A1 (en) Truncated lysosomal acid lipase
ES2824623T3 (es) Proceso para la producción y purificación de alfa-manosidasa lisosómica recombinante
BR112016018721B1 (pt) Proteína de fusão p97 (melanotransferrina), composição farmacêutica que compreende a dita proteína de fusão e uso da proteína de fusão para tratar uma doença de depósito lisossômico