BR112016018721B1

BR112016018721B1 - Proteína de fusão p97 (melanotransferrina), composição farmacêutica que compreende a dita proteína de fusão e uso da proteína de fusão para tratar uma doença de depósito lisossômico

Info

Publication number: BR112016018721B1
Application number: BR112016018721-0A
Authority: BR
Inventors: Timothy Z. Vitalis; Reinhard Gabathuler
Original assignee: Bioasis Technologies Inc
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2024-04-16

Abstract

PROTEÍNAS DE FUSÃO P97-IDS. Trata-se de proteínas de fusão entre p97 (melanotransferrina) e iduronato-2-sulfatase (IDS) e composições e métodos relacionados de uso dos mesmos, por exemplo, para facilitar a entrega de IDS através da barreira hematoencefálica (BBB) e/ou aprimorar sua penetração de tecido em CNS e/ou tecidos periféricos, e, assim, tratar e/ou diagnosticar Síndrome de Hunter (Mucopolissacaridose tipo II; MPS II) e distúrbios de armazenamento lisossômico relacionados, incluindo aqueles que têm um componente do sistema nervoso central (CNS).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade nos termos do título 35, parágrafo 119(e) do código dos Estados Unidos da América, do Pedido no U.S. 61/941.896, depositado em 19 de fevereiro de 2014, incorporado a título de referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002]A Listagem de Sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto, em vez de cópia em papel e está aqui incorporada a título de referência ao relatório descritivo. O nome do arquivo de texto contendo a Listagem de Sequências é BIOA_009_01WO_ST25.txt. O arquivo de texto tem cerca de 153 KB, foi criado em 9 de fevereiro de 2015 e é apresentado eletronicamente através de EFS-Web.

ANTECEDENTES CAMPO DA TÉCNICA

[003]A presente invenção refere-se a proteínas de fusão entre p97 (melanotransferrina) e iduronato2-sulfatase (IDS) e composições e métodos relacionados de uso dos mesmos, por exemplo, para facilitar a entrega de IDS através da barreira hematoencefálica (BBB) e/ou aprimorar sua penetração de tecido em CNS e/ou tecidos periféricos, e, assim, tratar e/ou diagnosticar Síndrome de Hunter (Mucopolissacaridose tipo II; MPS II) e distúrbios de depósito lisossômico relacionados, incluindo aqueles que têm um componente do sistema nervoso central (CNS).

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[004]As doenças de depósito lisossômico (LSDs) resultam da ausência ou atividade reduzida de enzimas ou proteínas específicas dentro dos lipossomas de uma célula. Dentro das células, o efeito da ausência de atividade enzimática pode ser visto como um acúmulo de “material de depósito” não degradado dentro do lisossoma intracelular. Esse acúmulo faz com que os lisossomas inchem e sofram mal funcionamento, resultando em dano celular e de tecido. Como as doenças de depósito lisossômico tipicamente têm uma etiologia genética, muitos tecidos carecerão da enzima em questão. No entanto, diferentes tecidos sobre da ausência da mesma atividade enzimática de modo diferente. É determinado quão adversamente um tecido será afetado, em alguma extensão, pelo grau em que esse tecido gera o substrato da enzima ausente. Os tipos de tecido mais sobrecarregados pelo depósito, por sua vez, determinam como o fármaco deve ser administrado ao paciente.

[005] Um grande número de enzimas da doença de depósito lisossômico foi identificado e correlacionado com suas respectivas doenças. Uma vez que a enzima ausente ou deficiente tenha sido identificada, o tratamento pode focar no problema para entregar eficazmente a enzima de reposição aos tecidos afetados de um paciente. A Síndrome de Hunter ou Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é uma doença de depósito lisossômico (LSD) causada por uma deficiência em iduronato-2- sulfatase (I2S ou IDS). I2S é uma enzima lisossômica responsável pelo metabolismo de mucopolissacarídeos. A deficiência na atividade enzimática leva a uma variedade de patologias por fim e morte prematura. A terapia de reposição de enzima (ERT) com I2S recombinante (Elaprase®) pode tratar sintomas periféricos, mas os pacientes sofrem eventualmente de demência devido ao fato de que a enzima não pode atravessar a barreira hematoencefálica (BBB).

[006]A terapia de reposição de enzima intravenosa (ERT) pode ser benéfica para LSDs, tal como MPSII. No entanto, meios para intensificar a entrega da enzima terapêutica ao lisossoma em tais doenças poderiam ser vantajosos em termos de custo reduzido e eficácia terapêutica aumentada.

[007]Como um problema, a barreira hematoencefálica (BBB) bloqueia a transferência livre de muitos agentes do sangue para o cérebro. Por essa razão, não se espera que as LSDs que apresentam aspecto neurológico significativo sejam tão responsivas à ERT intravenosa. Para tais doenças, métodos para aprimorar a entrega da enzima através da BBB e nos lisossomas das células afetadas poderiam ser altamente desejáveis.

BREVE SUMÁRIO

[008]As modalidades da presente invenção incluem proteínas de fusão p97 (melanotransferrina ou MTf) que compreendem um polipeptídeo iduronato-2- sulfatase (IDS ou I2S) fundido a um polipeptídeo p97 e um ligante peptídico opcional (L) entre os mesmos.

[009]Em algumas modalidades, o polipeptídeo IDS é fundido ao N-terminal do polipeptídeo p97. Em certas modalidades, o polipeptídeo IDS é fundido ao C- terminal do polipeptídeo p97.

[010]Certas proteínas de fusão compreendem o ligante peptídico entre as mesmas. Em certas modalidades, o ligante peptídico é selecionado a partir de um ou mais dentre um ligante rígido, um ligante flexível e um ligante clivável enzimaticamente. Em certas modalidades, o ligante peptídico é um ligante rígido, que compreende, opcionalmente, a sequência (EAAAK)1-3 (SEQ ID NOS:36 a 38), tal como EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:38). Em algumas modalidades, o ligante peptídico é um ligante flexível. Em certas modalidades, o ligante peptídico é um ligante clivável enzimaticamente.

[011] Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende uma sequência de peptídeos sinal (SP) N-terminal, opcionalmente selecionada a partir da Tabela 4. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende a estrutura: (a) SP-IDS-L-p97 ou (b) SP-p97-L-IDS.

[012] Em modalidades particulares, o SP compreende a sequência MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO:149), e a proteína de fusão p97 compreende a estrutura: (a) SP-p97-IDS ou (b) SP-p97-L-IDS.

[013] Em certas modalidades, o SP compreende a sequência de SP p97 humano MRGPSGALWLLLALRTVLG (SEQ ID NO:39), e a proteína de fusão p97 compreende a estrutura: (a) SP-p97-IDS ou (b) SP-p97-L-IDS.

[014] Em certas modalidades, o SP compreende a sequência de SP IDS humano MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALG (SEQ ID NO:40), e a proteína de fusão p97 compreende a estrutura: (a) SP-IDS-p97 ou (b) SP-IDS-L-p97.

[015] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma etiqueta de purificação (TAG), opcionalmente selecionada a partir da Tabela 5. Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende a estrutura: (a) SP-TAG-IDS-L- p97 ou (b) SP-TAG-p97-L-IDS. Em certas modalidades, a etiqueta compreende uma etiqueta de poli-histidina, opcionalmente, uma etiqueta de poli-histidina 10X. Em algumas modalidades, a etiqueta compreende uma etiqueta FLAG DYKDDDDK (SEQ ID NO:122). Em modalidades específicas, a etiqueta compreende uma etiqueta de poli-histidina, por exemplo, uma etiqueta de poli-histidina 10X, e uma etiqueta FLAG.

[016] Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende um sítio de protease (PS), opcionalmente selecionado a partir da Tabela 6. Em modalidades particulares, a proteína de fusão compreende a estrutura: (a) SP-TAG-PS-IDS-L-p97 ou (b) SP-TAG-PS-p97-ligante-IDS. Em modalidades específicas, o sítio de PS compreende o sítio de protease TEV ENLYFQG (SEQ ID NO:135).

[017] Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende a estrutura (a) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO:149)-HIS TAG-TEV PS-IDS-L rígido- p97 ou (b) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO: 149)-HIS TAG-TEV PS- p97-L rígido-IDS.

[018] Em modalidades específicas, a proteína de fusão compreende a estrutura (a) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO: 149)-HIS TAG-TEV PS- IDS-(EAAAK)3-p97 ou (b) SP (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; SEQ ID NO: 149)-HIS TAG-TEV PS-p97-(EAAAK)3-IDS.

[019] Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende a estrutura (a) IDS SP-HIS TAG-TEV PS-IDS-L rígido-p97 ou (b) p97 SP-HIS TAG-TEV PS-p97-L rígido-IDS.

[020] Em modalidades particulares, a proteína de fusão compreende a estrutura (a) IDS SP-10xHIS TAG-TEV PS-IDS-(EAAAK)3-p97 (SEQ ID NO:29) ou (b) p97 SP-10xHIS TAG-TEV PS-p97-(EAAAK)3-IDS (SEQ ID NO:30).

[021] Em certas modalidades, o polipeptídeo IDS compreende, consiste ou consiste essencialmente em (a) uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs:31 a 35; (b) uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência apresentada nas SEQ ID NOs:31 a 35; (c) ou uma sequência de aminoácidos que difere das SEQ ID NOs:31 a 35 por adição, substituição, inserção ou deleção de cerca de 1 a 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IDS compreende, consiste ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:32 ou 33.

[022]Em certas modalidades, o polipeptídeo p97 compreende, consiste ou consiste essencialmente em (a) uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs:1 a 28; (b) uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1 a 28; (c) ou uma sequência de aminoácidos que difere das SEQ ID NOs: 1 a 28 por adição, substituição, inserção ou deleção de cerca de 1 a 50 aminoácidos. Em modalidades particulares, o polipeptídeo p97 compreende, consiste ou consiste essencialmente na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2 (p97 humano solúvel) ou SEQ ID NO:14 ou 148 (MTfpep).

[023] Em certas modalidades, a proteína de fusão compreende, consiste ou consiste essencialmente em (a) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 138 a 142 ou 29 a 30; (b) uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 138 a 142 ou 29 a 30; (c) ou uma sequência de aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 138 a 142 ou 29 a 30 por adição, substituição, inserção ou deleção de cerca de 1 a 50 aminoácidos. Em modalidades específicas, a proteína de fusão compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 138 a 142 ou 29 a 30.

[024] Estão também incluídos polinucleotídeos isolados que codificam uma proteína de fusão p97 descrita no presente documento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado é códon-otimizado para expressão em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de levedura ou uma célula de bactéria. Em modalidades particulares, o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs:143 a 147.

[025]Algumas modalidades incluem uma célula hospedeira recombinante que compreende um polinucleotídeo isolado descrito no presente documento, em que o polinucleotídeo isolado está ligado de modo operacional a qualquer um ou mais elementos reguladores.

[026] Estão também incluídos vetores que compreendem um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína de fusão p97 descrita no presente documento, que está ligada de modo operacional a um ou mais elementos reguladores.

[027] Estão também incluídas células hospedeiras recombinantes, que compreendem um vetor, um polinucleotídeo isolado e/ou uma proteína de fusão p97 descrita no presente documento. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula de levedura ou uma célula de bactéria. Em modalidades específicas, a célula de mamífero é uma célula do ovário de hamster chinês (CHO), uma célula HEK-293 ou uma célula de fibrossarcoma humano HT-1080.

[028]Certas modalidades incluem composições farmacêuticas que compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão p97 descrita no presente documento, em que a composição farmacêutica é estéril e não pirogênica.

[029]Também estão incluídos métodos para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma proteína de fusão p97 ou uma composição farmacêutica definida no presente documento. Em certas modalidades, a doença de depósito lisossômico é Síndrome de Hunter (MPS II). Em certas modalidades, a doença de depósito lisossômico tem envolvimento do sistema nervoso central (SNC). Em certas modalidades, o indivíduo está em risco de desenvolver envolvimento do SNC da doença de depósito lisossômico. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano do sexo masculino. Em certas modalidades, a proteína de fusão p97 ou a composição farmacêutica é administrada por infusão intravenosa (IV) ou injeção intraperitoneal (IP).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[030]As Figuras 1A e 1B ilustram a estrutura geral de proteínas de fusão exemplificativas que têm um peptídeo sinal (SP), uma etiqueta de purificação ou afinidade (TAG), um sítio de protease (PS) para remoção do SP e TAG, polipeptídeo p97 (melanotransferrina), um ligante (L) e um polipeptídeo iduronato-2-sulfatase (IDS).

[031]A Figura 2 mostra a avaliação de atividade enzimática de proteínas de fusão I2S-MTf e MTf-I2S conforme medida por sua capacidade de hidrolisar o substrato Sulfato de 4-Nitrocatecol (PNCS) em relação a IDS humano recombinante e controle negativo (fusão TZM-MTf). 1 ug de cada amostra foi usado no ensaio de atividade enzimática, e os dados apresentados são normalizados em rhIDS.

[032]A Figura 3 mostra a avaliação de atividade enzimática de proteínas de fusão MTfpep-I2S e I2S-MTfpep (com pró-peptídeo I2S) conforme medida por sua capacidade de hidrolisar o substrato PNCS em relação à fusão I2S-MTf e controle negativo (fusão TZM-MTf). 1 ug de cada amostra foi usado no ensaio de atividade enzimática, e os dados apresentados são normalizados em ensaio em branco de substrato.

[033]A Figura 4 mostra uma comparação da atividade enzimática de proteínas de fusão I2S-MTfpep (com pró-peptídeo I2S) e I2S-MTfpep (sem pró- peptídeo I2S) conforme medida por sua capacidade de hidrolisar o substrato PNCS. 1 ug de cada amostra foi usado no ensaio de atividade enzimática, e os dados apresentados são normalizados em ensaio em branco de substrato.

[034]A Figura 5 mostra a quantificação da distribuição relativa de proteínas de fusão MTfpep-I2S (com pró-peptídeo) e I2S-MTf entre capilares (C) e parênquima (P) no cérebro, em relação ao sinal total (T). A imageologia por microscopia confocal quantitativa mostra que ambas as proteínas de fusão MTfpep-I2S e I2S-MTf estavam fortemente associadas aos tecidos parenquimais do SNC.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[035]A prática da presente invenção empregará, a não ser que indicado especificamente em contrário, métodos convencionais de biologia molecular e conjuntos de procedimentos de DNA recombinante dentro da habilidade na técnica, muitos dos quais são descritos abaixo para o propósito de ilustração. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Consultar, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3- Edição, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5- Edição Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3- Edição 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3- Edição 2005).

[036]Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente documento estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

DEFINIÇÕES

[037]A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles de habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser também usados na prática ou testagem da presente invenção, certos métodos e materiais exemplificativos são descritos no presente documento. Para os propósitos da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

[038]Os artigos “uma” e “um” são usados no presente documento para se referir a um ou a mais de um (isto é, a pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[039] Por “cerca de” entende-se uma quantidade, um nível, um valor, um número, uma frequência, uma porcentagem, uma dimensão, um tamanho, uma quantia, um peso ou um comprimento que varia em tanto quanto 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% a uma quantidade, um nível, um valor, um número, uma frequência, uma porcentagem, uma dimensão, um tamanho, uma quantia, um peso ou um comprimento de referência.

[040]Conforme usado no presente documento, o termo “aminoácido” se destina a significar aminoácidos tanto de ocorrência natural como de ocorrência não natural, assim como análogos e miméticos de aminoácido. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem os 20 (L)-aminoácidos utilizados durante a biossíntese de proteína, assim como outros, tais como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, homocisteína, citrulina e ornitina, por exemplo. Os aminoácidos de ocorrência não natural incluem, por exemplo, (D)-aminoácidos, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina e similares, que são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Os análogos de aminoácido incluem formas modificadas de aminoácidos de ocorrência natural e não natural. Tais modificações podem incluir, por exemplo, substituição ou reposição de grupos químicos e porções químicas no aminoácido ou por derivação do aminoácido. Os miméticos de aminoácido incluem, por exemplo, estruturas orgânicas que exibem propriedades funcionalmente similares, tais como carga e espaçamento de carga característicos do aminoácido de referência. Por exemplo, uma estrutura orgânica que imita Arginina (Arg ou R) poderia ter uma porção química de carga positiva localizada em um espaço molecular similar e ter o mesmo grau de mobilidade que o grupo e-amino da cadeia lateral do aminoácido Arg de ocorrência natural. Os miméticos também incluir estruturas constritas de modo a manter as interações de espaçamento e carga ideais do aminoácido ou dos grupos funcionais aminoácido. Aqueles versados na técnica conhecem ou podem determinar quais estruturas constituem análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido funcionalmente equivalentes.

[041] Por todo este relatório descritivo, a não ser que o contexto exija de outro modo, os termos “compreender”, “compreende” e “que compreende” serão entendidos implicando a inclusão de uma determinada etapa, elemento ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa, elemento ou grupo de etapas ou elementos. Por “que consiste em” entende-se incluindo, e sem limitação, o que segue a frase “que consiste em”. Assim, a frase “que consiste em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente. Por “que consiste essencialmente em” entende- se incluindo quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na revelação para os elementos listados. Assim, a frase “que consiste essencialmente em” indica que os elementos listados são necessários ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes dependendo do fato de se afetam materialmente a atividade ou a ação dos elementos listados ou não.

[042]O termo “conjugado” se destina a se referir à entidade formada como resultado de fixação ou ligação covalente de um agente ou outra molécula, por exemplo, uma molécula biologicamente ativa, a um polipeptídeo p97 ou sequência p97. Um exemplo de um polipeptídeo conjugado é uma “proteína de fusão” ou “polipeptídeo de fusão”, ou seja, um polipeptídeo que é criado através da união de duas ou mais sequências de codificação, que codificavam originalmente polipeptídeos separados; a tradução das sequências de codificação unidas resulta em um único polipeptídeo de fusão, tipicamente com propriedades funcionais derivadas de cada um dos polipeptídeos separados.

[043]Conforme usado no presente documento, os termos “função” e “funcional” e similares referem-se a uma função biológica, enzimática ou terapêutica.

[044]“Homologia” refere-se ao número percentual de aminoácidos que são idênticos ou constituem substituições conservadoras. A homologia pode ser determinada com o uso de programas de comparação de sequências, tal como GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Research. 12, 387 a 395, 1984), que está incorporado ao presente documento a título de referência. Dessa forma, as sequências de um comprimento similar ou substancialmente diferente daquele citado no presente documento poderiam ser comparadas por inserção de lacunas no alinhamento, em que tais lacunas são determinadas, por exemplo, pelo algoritmo de comparação por GAP.

[045] Por “isolado” entende-se material que é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham o mesmo em seu estado nativo. Por exemplo, um “peptídeo isolado” ou um “polipeptídeo isolado” e similares, conforme usado no presente documento, inclui o isolamento e/ou a purificação in vitro de uma molécula de peptídeo ou polipeptídeo de seu ambiente celular natural e da associação com outros componentes da célula; isto é, não está significativamente associado a substâncias in vivo.

[046]O termo “ligação”, “ligante”, “porção química de ligante” ou “L” é usado no presente documento para referir-se a um ligante que pode ser usado para separar um polipeptídeo p97 de um agente de interesse ou para separar um primeiro agente de outro agente, por exemplo, nos casos em que dois ou mais agentes estão ligados para formar um conjugado ou proteína de fusão p97. O ligante pode ser fisiologicamente estável ou podem incluir um ligante liberável, tal como um ligante enzimaticamente degradável (por exemplo, ligantes proteoliticamente cliváveis). Em certos aspectos, o ligante pode ser um ligante peptídico, por exemplo, como parte de uma proteína de fusão p97. Em alguns aspectos, o ligante pode ser um ligante não peptídico ou um ligante não proteico. Em alguns aspectos, o ligante pode ser uma partícula, tal como uma nanopartícula.

[047]Os termos “modular” e “alterar” incluem “aumentar”, “intensificar” ou “estimular”, assim como “diminuir” ou “reduzir”, tipicamente em uma quantidade ou um grau estatisticamente significativo ou fisiologicamente significativo em relação a um controle. Uma quantidade “aumentada”, “estimulada” ou “intensificada” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente significativa” e pode incluir um aumento que é 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ou mais vezes (por exemplo, 500, 1.000 vezes) (incluindo todos os números inteiros e pontos decimais entre e acima de 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) a quantidade produzida por nenhuma composição (por exemplo, a ausência de uma proteína de fusão da invenção) ou uma composição de controle, amostra ou indivíduo de teste. Uma quantidade “diminuída” ou “reduzida” é tipicamente uma quantidade “estatisticamente significativa” e pode incluir uma diminuição de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% na quantidade produzida por nenhuma composição ou uma composição de controle, incluindo todos os números inteiros entre os mesmos. Como um exemplo não limitante, um controle poderia comparar a atividade, tal como a atividade enzimática, a quantidade ou a taxa de transporte/entrega através da barreira hematoencefálica, a taxa e/ou níveis de distribuição ao tecido do sistema nervoso central, e/ou a Cmax para plasma, tecidos do sistema nervoso central ou quaisquer outros tecidos não do sistema nervoso central sistêmicos ou periféricos, de uma proteína de fusão p97 em relação ao agente/proteína sozinha. Outros exemplos de comparações e quantidades “estatisticamente significativas” são descritos no presente documento.

[048] Em certas modalidades, a “pureza” de qualquer dado agente (por exemplo, um conjugado de p97, tal como uma proteína de fusão) em uma composição pode ser especificamente definida. Por exemplo, certas composições podem compreender um agente que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% puro, incluindo todos os decimais entre os mesmos, conforme medido, por exemplo, e sem limitação, por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), uma forma bem conhecida de cromatografia de coluna usada frequentemente em bioquímica e química analítica para separar, identificar e quantificar os compostos.

[049]Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável no presente documento para referência a um polímero de resíduos de aminoácido e a variantes e análogos sintéticos dos mesmos. Assim, esses termos se aplicam a polímeros de aminoácido, em que um ou mais resíduos de aminoácido são aminoácidos de ocorrência não natural sintéticos, tal como um análogo químico de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como polímeros de aminoácido de ocorrência natural. Os polipeptídeos descritos no presente documento são limitados a um comprimento específico do produto; assim, peptídeos, oligopeptídeos e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipeptídeo, e tais termos podem ser usados de forma intercambiável no presente documento a não ser que indicado especificamente de outro modo. Os polipeptídeos descritos no presente documento podem também compreender modificações pós- expressão, tal como glicosilações, acetilações, fosforilações e similares, assim como outras modificações conhecidas na técnica, tanto de ocorrência natural como de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser uma proteína inteira ou uma subsequência, fragmento, variante ou derivado da mesma.

[050] Uma ligação “fisiologicamente clivável” ou “hidrolisável” ou “degradável” é uma ligação que reage com água (isto é, é hidrolisada) sob condições fisiológicas. A tendência de uma ligação hidrolisar em água dependerá não somente do tipo geral de ligação que conecta dois átomos centrais, mas também dos substituintes ligados a esses átomos centrais. As ligações hidroliticamente instáveis ou fracas incluem, porém, sem limitação: éster carboxilato, éster fosfato, anidrido, acetal, cetal, éter aciloxialquílico, imina, ortoéster, tioéster, éster de tiol, carbonato e hidrazona, peptídeos e oligonucleotídeos.

[051] Um “ligante liberável” inclui, porém, sem limitação, um ligante fisiologicamente clivável e um ligante enzimaticamente degradável. Assim, um “ligante liberável” é um ligante que pode sofrer hidrólise espontânea ou clivagem por algum outro mecanismo (por exemplo, catalisado por enzima, catalisado por ácido, catalisado por base e assim por diante) sob condições fisiológicas. Por exemplo, um “ligante liberável” pode envolver uma reação de eliminação que tem uma abstração básica de um próton, (por exemplo, um átomo de hidrogênio ionizável, Hα), como a força de acionamento. Para os propósitos no presente documento, um “ligante liberável” é sinônimo de um “ligante degradável”. Uma “ligação enzimaticamente degradável” inclui uma ligação, por exemplo, uma sequência de aminoácidos que é submetida à degradação por uma ou mais enzimas, por exemplo, peptidases ou proteases. Em modalidades particulares, um ligante liberável tem uma meia-vida a pH 7,4, 25°C, por exemplo, um pH fisiológico, temperatura corporal humana (por exemplo, in vivo), de cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas ou cerca de 96 horas ou menos.

[052]O termo “sequência de referência” refere-se, de modo geral, a uma sequência codificadora de ácidos nucleicos, ou sequência de aminoácidos, a qual outra sequência está sendo comparada. Todas as sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos descritas no presente documento estão incluídas como sequências de referência, incluindo aquelas descritas por nome e aquelas descritas na Listagem de Sequências.

[053]Os termos “identidade de sequência” ou, por exemplo, que compreende una “sequência 50% idêntica a”, conforme usado no presente documento, refere-se à extensão em que as sequências são idênticas em uma base nucleotídeo por nucleotídeo ou uma base aminoácido por aminoácido ao longo do intervalo de comparação. Assim, uma “porcentagem de identidade de sequência” pode ser calculada comparando-se duas sequências idealmente alinhadas ao longo do intervalo de comparação, determinando-se o número de posições em que a base de ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys e Met) ocorre em ambas as sequências para produzir um número de posições correlacionadas, dividindo-se o número de posições correlacionadas pelo número total de posições no intervalo de comparação (isto é, o tamanho do intervalo) e multiplicando-se o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Estão incluídos nucleotídeos e polipeptídeos que têm pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências de referência descritas no presente documento (consultar, por exemplo, a Listagem de Sequências), tipicamente nos casos em que a variante de polipeptídeo mantém pelo menos uma atividade biológica do polipeptídeo de referência.

[054]Os termos usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos incluem “sequência de referência”, “intervalo de comparação”, “identidade de sequência”, “porcentagem de identidade de” e “identidade substancial”. Uma “sequência de referência” tem pelo menos 12, porém, frequentemente, 15 a 18 e frequentemente pelo menos 25 unidades monoméricas, inclusive de nucleotídeos e resíduos de aminoácido, de comprimento. Devido ao fato de que dois polinucleotídeos podem compreender, cada um, (1) uma sequência (isto é, apenas uma porção da sequência completa de polinucleotídeos) que é similar entre os dois polinucleotídeos e (2) uma sequência que é divergente entre os dois polinucleotídeos, em que comparações de sequências entre dois (ou mais) polinucleotídeos são tipicamente realizadas comparando-se sequências dos dois polinucleotídeos ao longo de um “intervalo de comparação” para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Um “intervalo de comparação” refere-se a um segmento conceitual de pelo menos 6 posições contíguas, comumente cerca de 50 a cerca de 100, mais comumente, cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência é comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências ser alinhadas de modo ideal. O intervalo de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de cerca de 20% ou menos em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. O alinhamento ideal de sequências para alinhar um intervalo de comparação pode ser conduzido por implantações computadorizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics Versão 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EUA) ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é, resultando na maior homologia percentual ao longo do intervalo de comparação) gerado por qualquer um dos vários métodos selecionados. Também pode ser feita referência a família BLAST de programas, conforme, por exemplo, revelado por Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3.389, 1997. Uma discussão detalhada da análise de sequências pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1.994 a 1.998, Capítulo 15.

[055] Por “estatisticamente significativo”, entende-se que o resultado improvavelmente teria ocorrido por acaso. A significância estatística pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. As medidas comumente usadas de significância incluem o vapor p, que é a frequência ou a probabilidade com que o evento observado poderia ocorrer, se a hipótese nula for verdadeira. Se o valor p obtido for menor que o nível de significância, então, a hipótese nula é rejeitada. Em casos simples, o nível de significância é definido a um valor p de 0,05 ou menos.

[056]O termo “solubilidade” refere-se à propriedade de uma proteína se dissolver em um solvente líquido e formar uma solução homogênea. A solubilidade é tipicamente expressa como uma concentração, por massa de soluto por volume unitário de solvente (g de soluto por kg de solvente, g por dl (100 ml), mg/ml, etc.), molaridade, modalidade, fração molar ou outras descrições similares de concentração. A quantidade de equilíbrio máxima de soluto que pode se dissolver por quantidade de solvente é a solubilidade desse soluto nesse solvente sob as condições especificadas, incluindo temperatura, pressão, pH e a natureza do solvente. Em certas modalidades, a solubilidade é medida em pH fisiológico, ou outro pH, por exemplo, em pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0 ou pH 7,4. Em certas modalidades, a solubilidade é medida em água ou um tampão fisiológico, tal como PBS ou NaCl (com ou sem NaP). Em modalidades especificas, a solubilidade é medida em pH relativamente mais baixo (por exemplo, pH 6,0) e teor de sal relativamente mais alto (por exemplo, 500 mM de NaCl e 10 mM de NaP). Em certas modalidades, a solubilidade é medida em um fluido biológico (solvente), tal como sangue ou soro. Em certas modalidades, a temperatura pode ser cerca da temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25 °C) ou cerca da temperatura corporal (aproximadamente 37 °C). Em certas modalidades, uma proteína de fusão de polipeptídeo p97 tem uma solubilidade de pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 mg/ml à temperatura ambiente ou a cerca de 37 °C.

[057]Um “indivíduo”, conforme usado no presente documento, inclui qualquer animal que exiba um sintoma ou esteja em risco de exibir um sintoma que pode ser tratado ou diagnosticado com uma proteína de fusão p97 da invenção. Os indivíduos (pacientes) adequados incluem animais de laboratório (tais como camundongo, rato, coelho ou porquinho da índia), animais de fazenda e animais domésticos ou animais de estimação (tais como um gato ou um cão). Os primatas não humanos e, de preferência, pacientes humanos, estão incluídos.

[058]“Substancialmente” ou “essencialmente” significa de modo quase total ou completo, por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de alguma dada quantidade.

[059] “Substancialmente isento” refere-se à ausência quase completa ou completa de uma dada quantidade, por exemplo, menos que cerca de 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou menos de alguma dada quantidade. Por exemplo, certas composições podem ser “substancialmente isentas” de proteínas celulares, membranas, ácidos nucleicos, endotoxinas ou outros contaminantes.

[060]“Tratamento” ou “tratar”, conforme usado no presente documento, inclui qualquer efeito desejável sobre os sintomas ou a patologia de uma doença ou afecção e pode incluir até mesmo alterações ou aprimoramentos mínimos em um ou mais marcadores mensuráveis da doença ou da afecção que é tratada. “Tratamento” ou “tratar” não indica necessariamente erradicação ou cura completa da doença ou da afecção ou sintomas associados à mesma. O indivíduo que recebe esse tratamento é qualquer indivíduo que precisa do mesmo. Os marcadores exemplificativos de aprimoramento clínico serão percebidos pelas pessoas versadas na técnica.

[061]O termo “tipo selvagem” refere-se a um gene ou produto de gene que tem as características que o gene ou produto de gene quando isolado de uma fonte de ocorrência natural. Um gene ou produto de gene do tipo selvagem (por exemplo, um polipeptídeo) é aquele que é mais frequentemente observado em uma população e, então, projetado arbitrariamente a forma “normal” ou “do tipo selvagem” do gene. PROTEÍNAS DE FUSÃO

[062]As modalidades da presente invenção referem-se, de modo geral, a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de polipeptídeos p97 (melanotransferrina; MTf) e uma sequência de polipeptídeos iduronato-2-sulfatase (IDS ou I2S), em que os polinucleotídeos codificam as proteínas de fusão, células hospedeiras e métodos para produzir proteínas de fusão e composições relacionadas e métodos de uso das mesmas. As proteínas de fusão exemplificativas (por exemplo, Tabela 1), as sequências de polipeptídeos p97 (por exemplo, Tabela 2) e as sequências de polipeptídeos IDS (por exemplo, Tabela 3) são descritas no presente documento. Os termos “p97” e “MTf” são usados de forma intercambiável no presente documento, assim como os termos “IDS” e “I2S”.

[063]São também descritos métodos e componentes exemplificativos para acoplar uma sequência de polipeptídeos p97 a uma sequência IDS. Em certas modalidades, a proteína de fusão p97 compreende uma ou mais sequências de peptídeos sinal (SP), etiquetas de purificação (TAG), sítios de clivagem de protease (PS) e/ou ligantes peptídicos (L), incluindo qualquer combinação dos anteriores, cujos exemplos são fornecidos no presente documento. Variantes e fragmentos de qualquer um dos anteriores são também descritos no presente documento.

[064] Em certas modalidades, a proteína de fusão p97 compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma das configurações ilustradas abaixo (N-terminal > C-terminal):

[065]- IDS-p97

[066] - p97-IDS

[067] - IDS-L-p97

[068] - p97-L-IDS

[069] - SP-IDS-p97

[070] - SP-p97-IDS

[071] - SP-IDS-L-p97

[072] - SP-P97-L-IDS

[073] - SP-PS-IDS-p97

[074] ■ SP-PS-P97-IDS

[075] ■ SP-PS-IDS-L-p97

[076] ■ SP-PS-p97-L-IDS

[077] ■ SP-TAG-PS-IDS-p97

[078] ■ SP-TAG-PS-p97-IDS

[079] ■ SP-TAG-PS-IDS-L-p97

[080] ■ SP-TAG-PS-p97-L-IDS

[081] ■ TAG-IDS-p97

[082] ■ TAG-p97-IDS

[083] ■ TAG-IDS-L-p97

[084] ■ TAG-p97-L-IDS

[085] ■ TAG-PS-IDS-p97

[086] ■ TAG-PS-p97-IDS

[087] ■ TAG-PS-IDS-L-p97

[088] ■ TAG-PS-p97-L-IDS

[089] ■ IDS SP-HIS TAG-TEV PS-IDS-L rígido-p97

[090] ■ IDS SP-HIS TAG-TEV PS-IDS-(EAAAK)3-p97

[091] ■ p97 SP-HIS TAG-TEV PS-p97-L rígido-IDS

[092] ■ p97 SP-HIS TAG-TEV PS-p97-(EAAAK)3-IDS

[093]As proteínas de fusão dessas e de configurações relacionadas podem ser construídas com o uso de qualquer uma das sequências IDS, p97, L, SP, TAG ou PS descritas no presente documento, incluindo variantes ou fragmentos ativos das mesmas.

[094]Os exemplos específicos de proteínas de fusão p97 são ilustrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Proteínas de fusão p97 exemplificativas

[095]Assim, em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende, consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos da Tabela 1, ou uma variante e/ou fragmento da mesma.

[096]Sequências de p97. Em certas modalidades, uma sequência de polipeptídeos p97 usada em uma composição e/ou proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente ou consiste em uma sequência de referência de p97 humano fornecida na Tabela 2 abaixo. Estão também incluídos variantes e fragmentos das mesmas.

[097] Em algumas modalidades, uma sequência de polipeptídeos p97 compreende uma sequência que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou homologia, ao longo de seu comprimento, a uma sequência de p97 humano na Tabela 2, ou um fragmento da mesma.

[098] Em modalidades específicas, a sequência de polipeptídeos p97 compreende, consiste ou consiste essencialmente na SEQ ID NO:2 (MTf solúvel) ou SEQ ID NO:14 (MTfpep). Em algumas modalidades, o MTfpep tem um resíduo de tirosina (Y) C-terminal, conforme apresentado na SEQ ID NO:148.

[099] Em modalidades particulares, uma sequência de polipeptídeos p97 compreende um fragmento de uma sequência de p97 humano na Tabela 2. Em certas modalidades, um fragmento de polipeptídeo p97 tem cerca de, pelo menos cerca de ou até cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 700, 710, 720, 730 ou mais aminoácidos de comprimento, incluindo todos os números inteiros e faixas entre os mesmos e que podem compreender toda ou uma porção da sequência de uma sequência de referência de p97.

[0100]Em certas modalidades, um fragmento de polipeptídeo p97 tem cerca de 5 a 700, 5 a 600, 5 a 500, 5 a 400, 5 a 300, 5 a 200, 5 a 100, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 25, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 10, 10 a 700, 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 10 a 15, 20 a 700, 20 a 600, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 20 a 50, 20 a 40, 20 a 30, 20 a 25, 30 a 700, 30 a 600, 30 a 500, 30 a 400, 30 a 300, 30 a 200, 30 a 100, 30 a 50, 30 a 40, 40 a 700, 40 a 600, 40 a 500, 40 a 400, 40 a 300, 40 a 200, 40 a 100, 40 a 50, 50 a 700, 50 a 600, 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 100, 60 a 700, 60 a 600, 60 a 500, 60 a 400, 60 a 300, 60 a 200, 60 a 100, 60 a 70, 70 a 700, 70 a 600, 70 a 500, 70 a 400, 70 a 300, 70 a 200, 70 a 100, 70 a 80, 80 a 700, 80 a 600, 80 a 500, 80 a 400, 80 a 300, 80 a 200, 80 a 100, 80 a 90, 90 a 700, 90 a 600, 90 a 500, 90 a 400, 90 a 300, 90 a 200, 90 a 100, 100 a 700, 100 a 600, 100 a 500, 100 a 400, 100 a 300, 100 a 250, 100 a 200, 100 a 150, 200 a 700, 200 a 600, 200 a 500, 200 a 400, 200 a 300 ou 200 a 250 aminoácidos de comprimento e compreende toda ou uma porção de uma sequência de referência de p97.

[0101]Em certas modalidades, as sequências de polipeptídeos p97 de interesse incluem sequências de aminoácidos p97, subsequências e/ou variantes de p97 que são eficazes para transportar um agente de interesse através da barreira hematoencefálica e para o sistema nervoso central (SNC). Em modalidades particulares, a variante ou fragmento compreende o N-lobo de p97 humano (resíduos 20 a 361 da SEQ ID NO:1). Em aspectos específicos, a variante ou fragmento compreende um sítio de ligação de Fe3+ funcional e intacto.

[0102]Em algumas modalidades, uma sequência de polipeptídeos p97 é uma forma solúvel de um polipeptídeo p97 (consultar Yang et al., Prot Exp Purif. 34:28 a 48, 2004), ou um fragmento ou variante do mesmo. Em alguns aspectos, o polipeptídeo p97 solúvel tem uma deleção de todo ou uma porção do domínio hidrofóbico (resíduos 710 a 738 da SEQ ID NO:1), sozinha ou em combinação com uma deleção de todo ou uma parte do peptídeo sinal (resíduos 1 a 19 da SEQ ID NO:1). Em aspectos específicos, o polipeptídeo p97 solúvel compreende ou consiste na SEQ ID NO:2 (aproximadamente os resíduos 20 a 710 ou 20 a 711 da SEQ ID NO:1), incluindo variantes ou fragmentos da mesma.

[0103]Em certas modalidades, por exemplo, aquelas que empregam lipossomas, a sequência de polipeptídeos p97 é uma forma lipídica solúvel de um polipeptídeo p97. Por exemplo, certas dessas modalidades e modalidades relacionadas incluem um polipeptídeo p97 que compreende todo ou uma porção do domínio hidrofóbico, opcionalmente com ou sem o peptídeo sinal.

[0104]Em certas outras modalidades, o fragmento ou a variante de p97 tem capacidade de ligar-se especificamente a um receptor de p97, um receptor de LRP1 e/ou um receptor de LRP1B.

[0105]As variantes e fragmentos de polipeptídeos p97 de referência e outros polipeptídeo de referência são descritos em mais detalhes abaixo.

[0106]Sequências de Iduronato-2-Sulfatase. Em certas modalidades, uma sequência de polipeptídeos IDS (ou I2S) usada em uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente ou consiste em uma ou mais sequências de IDS humano ilustradas na Tabela 3 abaixo.

[0107]Também estão incluídos variantes e fragmentos biologicamente ativos das sequências de IDS na Tabela 3 e na Listagem de Sequências. Em certos aspectos, um polipeptídeo IDS biologicamente ativo ou variantes/fragmentos do mesmo hidrolisa os grupos 2-sulfato das unidades de L-iduronato 2-sulfato de sulfato de dermatano, sulfato de heparano e/ou heparina, por exemplo, a cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da atividade de IDS humano do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO:31).

[0108]Ligantes. Conforme indicado acima, certas proteínas de fusão podem empregar um ou mais grupos ligantes, incluindo ligantes peptídicos. Tais ligantes podem ser ligantes rígidos, ligantes flexíveis, ligantes estáveis ou ligantes liberáveis, tais como ligantes enzimaticamente cliváveis. Consultar, por exemplo, Chen et al., Adv. Drug. Deliv. Ref., 65:1.357 a 1.369, 2012.

[0109]Por exemplo, para conjugados polipeptídeo-polipeptídeo, ligantes peptídicos podem separar os componentes em uma distância suficiente para garantir que cada polipeptídeo se dobre em suas estruturas secundárias e terciárias. Tal sequência de ligantes peptídicos pode ser incorporada na proteína de fusão com o uso de conjuntos de procedimentos padrão descritos no presente documento e conhecidos na técnica. As sequências de ligantes peptídicos adequadas podem ser escolhidas com base nos seguintes fatores: (1) sua capacidade de adotar uma conformação estendida rígida ou flexível; (2) sua incapacidade de adotar uma estrutura secundária que poderia interagir com epítopos funcionais no primeiro e no segundo polipeptídeos; e (3) a falta de resíduos hidrofóbicos ou carregados que podem reagir com os epítopos funcionais do polipeptídeo. As sequências de aminoácidos que podem ser empregadas de modo útil como ligantes incluem aquelas reveladas em Maratea et al., Gene 40:39 a 46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8.58 a 8.262, 1986; Patente n° US 4.935.233 e Patente n° US 4.751.180.

[0110]Em certas modalidades ilustrativas, um ligante peptídico está entre cerca de 1 a 5 aminoácidos, entre 5 a 10 aminoácidos, entre 5 a 25 aminoácidos, entre 5 a 50 aminoácidos, entre 10 a 25 aminoácidos, entre 10 a 50 aminoácidos, entre 10 a 100 aminoácidos, ou qualquer faixa intermediária de aminoácidos. Em outras modalidades ilustrativas, um ligante peptídico compreende cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais aminoácidos de comprimento. Os ligantes particulares podem ter um comprimento de aminoácidos geral de cerca de 1 a 200 aminoácidos, 1 a 150 aminoácidos, 1 a 100 aminoácidos, 1 a 90 aminoácidos, 1 a 80 aminoácidos, 1 a 70 aminoácidos, 1 a 60 aminoácidos, 1 a 50 aminoácidos, 1 a 40 aminoácidos, 1 a 30 aminoácidos, 1 a 20 aminoácidos, 1 a 10 aminoácidos, 1 a 5 aminoácidos, 1 a 4 aminoácidos, 1 a 3 aminoácidos, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos.

[0111]Um ligante peptídico pode empregar qualquer um ou mais aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos de ocorrência não natural, análogos de aminoácido e/ou miméticos de aminoácido, conforme descrito em outra parte no presente documento e conhecido na técnica. Certas sequências de aminoácidos que podem ser empregadas de modo útil como ligantes incluem aquelas reveladas em Maratea et al., Gene 40:39 a 46, 1985; Murphy et al., PNAS USA.. 83:8.258 a 8.262, 1986; Patente n° US 4.935.233 e a Patente n° U.S. 4.751.180. As sequências de ligantes peptídicos particulares contêm os resíduos Gly, Ser e/ou Asn. Outros aminoácidos neutros próximos, tal como Thr e Ala, podem ser também empregados na sequência de ligantes peptídicos, se desejado.

[0112]Em modalidades particulares, o ligante é um ligante rígido. Os exemplos de ligantes rígidos incluem, sem limitação, (EAAAK)x (SEQ ID NO:36) e A(EAAAK)x ALEA(EAAAK)xA (SEQ ID NO:41) e (Ala-Pro)x, em que x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais. Os exemplos específicos de ligantes rígidos incluem EAAAK (SEQ ID NO:36), (EAAAK)2 (SEQ ID NO:37), (EAAAK)3 (SEQ ID NO:38), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A (SEQ ID NO:42), PAPAP (SEQ ID NO:43) e AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO:44).

[0113]Em modalidades específicas, o ligante compreende, consiste ou consiste essencialmente em (EAAAK)3 ou EAAAKEAAAKEAAAK (SEQ ID NO:38)

[0114]Em algumas modalidades, o ligante é um ligante flexível. Em modalidades particulares, o ligante flexível é GGGGS (SEQ ID NO:45), (GGGGS)2 (SEQ ID NO:46), (GGGGS)3 (SEQ ID NO:47) ou Gly2-10 (SEQ ID NOS:48 a 54). Os exemplos adicionais de ligantes flexíveis são fornecidos abaixo.

[0115]Certos ligantes exemplificativos incluem ligantes contendo Gly, Ser e/ou Asn, conforme segue: ligantes [G]x, [S]x, [N]x, [GS]x, [GGS]x, [GSS]x, [GSGS]x (SEQ ID NO:55), [GGSG]x (SEQ ID NO:56), [GGGS]x (SEQ ID NO: 57), [GGGGS]x (SEQ ID NO: 45), [GN]x, [GGN]x, [GNN]x, [GNGN]x (SEQ ID NO: 58), [GGNG]x (SEQ ID NO: 59), [GGGN]x (SEQ ID NO: 60), [GGGGN]x (SEQ ID NO: 61), em que x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais. Outras combinações desses aminoácidos e de aminoácidos relacionados serão percebidas pelas pessoas versadas na técnica. Em modalidades específicas, o ligante compreende ou consiste em uma sequência [GGGGS]3 (SEQ ID NO: 47) ou GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47).

[0116]Em modalidades específicas, a sequência de ligantes compreende uma sequência de ligantes Gly3, que inclui três resíduos glicina. Em modalidades particulares, os ligantes flexíveis podem ser racionalmente projetados com o uso de um programa de computador com capacidade de modelar tanto os sítios de ligação de DNA como os próprios peptídeos (Desjarlais & Berg, PNAS. 90:2.256 a 2.260, 1993; e PNAS. 91:11.099 a 11.103, 1994) ou por métodos de exibição de fago.

[0117]Os ligantes peptídicos podem ser fisiologicamente estáveis ou podem incluir um ligante liberável, tal como um ligante fisiologicamente degradável ou enzimaticamente degradável (por exemplo, ligante proteolítica ou enzimaticamente clivável). Em certas modalidades, um ou mais ligantes liberáveis podem resultar em uma meia-vida mais curta e eliminação mais rápida da proteína de fusão. Essas modalidades e modalidades relacionadas podem ser usadas, por exemplo, para intensificar a solubilidade e a vida útil em circulação sanguínea de proteínas de fusão p97 na corrente sanguínea, enquanto também entrega um agente na corrente sanguínea (ou através da BBB) que, subsequente à degradação de ligante, está substancialmente isenta da sequência de p97. Esses aspectos são especialmente úteis naqueles casos em que o polipeptídeos ou outros agentes, quando permanentemente fundidos a uma sequência de p97, demonstram atividade reduzida. Com o uso dos ligantes conforme fornecidos no presente documento, tais polipeptídeos podem manter sua atividade terapêutica quando em forma conjugada ou fundida. Dessas e de outras formas, as propriedades das proteínas de fusão p97 podem ser adaptadas de modo mais eficaz para equilibrar a bioatividade e a meia- vida em circulação dos polipeptídeos ao longo do tempo.

[0118]Os exemplos específicos de ligantes enzimaticamente cliváveis incluem, sem limitação, um ligante clivável de Fator XIa/FVIIa (VSQTSKLTR^AETVFPDV) (SEQ ID NO:62), um ligante clivável de metaloprotease-1 de matriz (PLG^LWA) (SEQ ID NO:63), um ligante clivável de HIV protease (RVL^AEA) (SEQ ID NO:64), um ligante clivável de vírus da hepatite C NS3 (EDVVCC^SMSY) (SEQ ID NO:65), um ligante clivável de Fator Xa (GGIEGR/GS) (SEQ ID NO:66), um ligante clivável de Furina (TRHRQPR^GWE ou AGNRVRR^SVG ou RRRRRRR^R^R) (SEQ ID NOS:67 a 69) e um ligante clivável de Catepsina B (GFLG) (SEQ ID NO:70).

[0119]Os ligantes degradáveis enzimaticamente adequados para uso em modalidades particulares incluem, porém, sem limitação: uma sequência de aminoácidos clivada por uma serina protease, tal como trombina, quimotripsina, tripsina, elastase, calicreína ou subtilisina. Os exemplos ilustrativos de sequências de aminoácidos cliváveis por trombina incluem, porém, sem limitação: -Gly-Arg-Gly- Asp-(SEQ ID NO: 71), -Gly-Gly-Arg-, -Gly- Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-(SEQ ID NO:72), - Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-(SEQ ID NO: 73), -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-(SEQ ID NO: 74), -Gly-Pro- Arg-, -Val-Pro-Arg- e -Phe- Val -Arg-. Os exemplos ilustrativos de sequências de aminoácidos cliváveis por elastase incluem, porém, sem limitação: - Ala-Ala-Ala-, -Ala-Ala-Pro-Val-(SEQ ID NO:75), -Ala-Ala-Pro-Leu-(SEQ ID NO: 76), - Ala-Ala-Pro-Phe-(SEQ ID NO: 77), -Ala-Ala-Pro-Ala-(SEQ ID NO: 78) e -Ala-Tyr-Leu- Val-(SEQ ID NO: 79).

[0120]As ligações enzimaticamente degradáveis adequadas para uso em modalidades particulares também incluem sequências de aminoácidos que podem ser clivadas por uma metaloproteinase de matriz, tal como colagenase, estromelisina e gelatinase. Os exemplos ilustrativos de sequências de aminoácidos cliváveis por metaloproteinase de matriz incluem, porém, sem limitação: -Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z- (SEQ ID NO: 80), -Gly-Pro-, Leu-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO: 81), -Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z- (SEQ ID NO:82) e -Ala-Pro-Gly-Leu-Z-(SEQ ID NO: 83), em que Y e Z são aminoácidos. Os exemplos ilustrativos de sequências de aminoácidos cliváveis por colagenase incluem, porém, sem limitação: -Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Z-(SEQ ID NO: 84), -Pro- Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-(SEQ ID NO: 85), -Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp- (SEQ ID NO: 86), -Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-(SEQ ID NO: 87), -Pro-Leu-Gly-Leu- Tyr-Ala-(SEQ ID NO:88), -Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO: 89) e -Pro-Leu- Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO: 90), em que Z é um aminoácido. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de aminoácidos clivável por estromelisina é -Pro-Tyr- Ala-Tyr-Tyr-Met-Arg-(SEQ ID NO: 91); e um exemplo de uma sequência de aminoácidos clivável por gelatinase é -Pro-Leu-Gly-Met-Tyr-Ser-Arg-(SEQ ID NO: 92).

[0121]As ligações enzimaticamente degradáveis adequadas para uso em modalidades particulares também incluem sequências de aminoácidos que podem ser clivadas por uma enzima de conversão de angiotensina, tal como, por exemplo, - Asp-Lys-Pro-, -Gly-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO: 93) e -Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO: 94).

[0122]As ligações enzimaticamente degradáveis adequadas para uso em modalidades particulares também incluem sequências de aminoácidos que podem ser degradadas por catepsina B, tal como, por exemplo, -Val-Cit-, -Ala-Leu-Ala-Leu- (SEQ ID NO:95), -Gly-Phe-Leu-Gly- (SEQ ID NO:96) e -Phe-Lys-.

[0123]Em certas modalidades, no entanto, qualquer um ou mais dos ligantes peptídicos ou não peptídicos são opcionais. Por exemplo, as sequências de ligantes podem não ser necessárias em uma proteína de fusão em que o primeiro e o segundo polipeptídeos têm regiões de aminoácido não essencial N-terminais e/ou C- terminais que podem ser usadas para separar os domínios funcionais e impedir a interferência estérica.

[0124]Sequências de Peptídeos Sinal. Em certas modalidades, uma proteína de fusão p97 compreende uma ou mais sequências de peptídeos sinal (SP). Em modalidades particulares, a sequência de peptídeos sinal é uma sequência de sinalização N-terminal, isto é, a porção mais N-terminal da proteína de fusão.

[0125]Os exemplos específicos de sequências de sinalização são fornecidos na Tabela 4 abaixo. Consultar também Kober et al., Biotechnology and Bioengineering. 110:1.164 a 1.173, 2013.

[0126]Assim, em algumas modalidades, o peptídeo sinal compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma sequência de da Tabela 4. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal compreende a SEQ ID NO:149.

[0127]Em modalidades específicas, a sequência de peptídeos sinal correspondente à proteína mais N-terminal (p97 ou IDS) da proteína de fusão. Ou seja, em algumas modalidades, a sequência de peptídeos sinal N-terminal é a sequência de peptídeos sinal p97 humanos (SEQ ID NO:39), e a proteína de fusão p97 compreende a estrutura geral: p97 SP-p97-IDS. Em outras modalidades, a sequência de sinal N-terminal é a sequência de peptídeos sinal IDS humanos (SEQ ID NO:40), e a proteína de fusão p97 compreende a estrutura geral: IDS SP-IDS- p97. Opcionalmente, a proteína de fusão pode compreender, ainda, uma ou mais etiquetas de purificação e/ou sítios de protease, por exemplo, entre a sequência de sinalização N-terminal e as porções de p97/IDS da proteína de fusão, conforme descrito em outra parte no presente documento. Aqui, o sítio de protease está tipicamente posicionado no C-terminal da sequência de sinalização ou etiqueta de purificação de modo que o tratamento com a protease correspondente remova a sequência de sinalização N-terminal, etiqueta de purificação e a maior parte ou todo o sítio de protease da proteína de fusão.

[0128]Etiquetas de Purificação. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma ou mais etiquetas de purificação ou afinidade (TAG ou TAGs). Os exemplos não limitantes de etiquetas de purificação incluem etiquetas de poli-histidina (por exemplo, etiquetas 6xHis), avidina, etiquetas FLAG, etiquetas de glutationa S-transferase (GST), etiquetas de proteína de ligação de maltose, proteína de ligação de quitina (CBP) e outros. Também estão incluídas etiquetas de epítopo, que se ligam a anticorpos de alta afinidade, cujos exemplos incluem etiquetas V5, etiquetas Myc e etiquetas HA. Nos exemplos específicos, a etiqueta de purificação é uma etiqueta de poli-histidina (H5-10), por exemplo, H5, H6, H7, H8, H9 ou H10 (SEQ ID NOS:113 a 118).

[0129]Os exemplos não limitantes de etiquetas de purificação são fornecidos na Tabela 5 abaixo.

[0130]Assim, em certas modalidades, a etiqueta de purificação compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma sequência de da Tabela 5. Nas modalidades específicas, a etiqueta compreende uma etiqueta FLAG e uma etiqueta HIS, por exemplo, uma etiqueta 10X-HIS.

[0131]Sítios de Protease (PS). Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende um ou mais sítios de protease. Opcionalmente, os um ou mais sítios de protease estão posicionados no C-terminal da etiqueta de purificação e/ou da sequência de peptídeos sinal (se qualquer uma ou ambas estiverem presentes) de modo que o tratamento com a protease correspondente remova a sequência de sinalização, a etiqueta de purificação e/ou a maior parte ou todo o sítio de protease N-terminal da proteína de fusão.

[0132]Em modalidades particulares, por exemplo, nos casos em que a proteína de fusão compreende um ligante enzimaticamente clivável, o sítio de protease tipicamente difere daquele do ligante enzimaticamente clivável, de modo que o tratamento com a protease remova quaisquer sequências terminais (por exemplo, sequência de peptídeos sinal, etiqueta de purificação) sem clivar o ligante peptídico entre as sequências de p97 e IDS.

[0133]Os exemplos não limitantes de sítios de protease são fornecidos na Tabela 6 abaixo.

[0134]Assim, em certas modalidades, o sítio de protease compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma sequência de da Tabela 6. Em modalidades específicas, o sítio de protease compreende o sítio de protease TEV (SEQ ID NO:135).

[0135]Sequências Variantes. Certas modalidades incluem variantes do polipeptídeo de referência e sequências de polinucleotídeos descritas no presente documento, sejam descritas pelo nome ou por referência a um identificador de sequência, incluindo sequências p97, sequências IDS, sequências de ligantes, sequências de peptídeos sinal, etiquetas de purificação e sítios de protease (consultar, por exemplo, Tabelas 1 a 6 e a Listagem de Sequências). As sequências do tipo selvagem ou mais prevalentes desses polipeptídeos são conhecidas na técnica e podem ser usadas como uma comparação para as variantes e fragmentos descritos no presente documento.

[0136]Uma sequência “variante”, conforme o termo é usado no presente documento, refere-se a um polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeos que difere de uma sequência de referência revelada no presente documento em uma ou mais substituições, deleções (por exemplo, truncamentos), adições e/ou inserções. Certas variantes, assim, incluem fragmentos de uma sequência de referência descrita no presente documento. Os polipeptídeos variantes são biologicamente ativos, ou seja, continuam a possuir atividade enzimática ou de ligação de um polipeptídeo de referência. Tais variantes podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético e/ou de manipulação humana.

[0137]Em muitos casos, uma variante biologicamente ativa conterá uma ou mais substituições conservadoras. Uma “substituição conservadora” é aquela em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades similares, de modo que um versado na técnica de química de peptídeo possa esperar que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo seja substancialmente inalterada. Conforme descrita acima, modificações podem ser realizadas na estrutura dos polinucleotídeos e dos polipeptídeos da presente invenção e ainda obter uma molécula funcional que codifica um polipeptídeo variante ou derivado com as características desejáveis. Quando se deseja alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo para criar uma variante ou porção equivalente, ou mesmo aprimorada, de um polipeptídeo da invenção, um versado na técnica alterará tipicamente um ou mais dos códons da sequência DNA codificadora de acordo com a Tabela A abaixo.

[0138]Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda perceptível de capacidade de ligação interativa com estruturas, tal como, por exemplo, regiões de ligação a antígeno de anticorpos ou sítios de ligação em moléculas de substrato. Como é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que definem a atividade funcional biológica dessa proteína, certas substituições de sequência de aminoácidos podem ser realizadas em uma sequência de proteínas e, certamente, sua sequência de codificação de DNA subjacente e, todavia, obter uma proteína com propriedades similares. Contempla-se, assim, que várias alterações podem ser realizadas nas sequências de peptídeos das composições reveladas ou sequências de DNA correspondentes que codificam os ditos peptídeos sem perda perceptível de sua utilidade.

[0139]Ao realizar tais alterações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático de aminoácido ao conferir função biológica interativa em uma proteína é, de modo geral, entendida na técnica (Kyte & Doolittle, 1982, incorporado ao presente documento a título de referência). Aceita-se que o caráter hidropático do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que, por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e similares. Cada aminoácido recebeu um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte & Doolittle, 1982). Esses valores são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamate (3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (4,5). Sabe-se na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm um índice ou pontuação hidropática similar e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Ao realizar tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2 é preferencial, aqueles dentro de ±1 são particularmente preferenciais e aqueles dentro de ±0.5 são ainda mais particularmente preferenciais.

[0140]Entende-se também na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser realizada de modo eficaz com base na hidrofilicidade. A Patente n° US 4.554.101 (especificamente incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade) determina que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme controlada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína. Conforme detalhado na Patente n° US 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro que tem um valor de hidrofilicidade similar e ainda obter uma proteína biologicamente equivalente e, em particular, imunologicamente equivalente. Em tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2 é preferencial, aqueles dentro de ±1 são particularmente preferenciais e aqueles dentro de ±0.5 são ainda mais particularmente preferenciais.

[0141]Conforme descrito acima, as substituições de aminoácidos são, de modo geral, portanto, baseadas na similaridade relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. As substituições exemplificativas que levam em consideração várias das características anteriores são bem conhecidas na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

[0142]As substituições de aminoácido podem ser, ainda, realizadas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, os aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e os aminoácidos com grupos principais polares não carregados que têm valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos que podem representar alterações conservadoras incluem: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr, trp, his.

[0143]Uma variante pode conter também, ou alternativamente, alterações não conservadoras. Em uma modalidade preferencial, polipeptídeos variantes diferem de uma sequência nativa ou de referência por substituição, deleção ou adição de menos que cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 aminoácidos ou ainda 1 aminoácido. As variantes podem ser também (ou alternativamente) modificadas, por exemplo, pela deleção ou pela adição de aminoácidos que têm influência mínima na imunogenicidade, estrutura secundária, atividade enzimática e/ou natureza hidropática do polipeptídeo.

[0144]Em certas modalidades, uma sequência de polipeptídeos tem cerca de, pelo menos cerca de ou até cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1.000 ou mais aminoácidos contíguos de comprimento, incluindo todos os números inteiros entre os mesmos, e pode compreender toda ou uma porção de uma sequência de referência (consultar, por exemplo, a Listagem de Sequências).

[0145]Em outras modalidades específicas, uma sequência de polipeptídeos consiste em cerca de ou no máximo cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1.000 ou mais aminoácidos contíguos, incluindo todos os números inteiros entre os mesmos, e que pode compreender toda ou uma porção de uma sequência de referência (consultar, por exemplo, Listagem de Sequências).

[0146]Em ainda outras modalidades específicas, uma sequência de polipeptídeos te, cerca de 10 a 1.000, 10 a 900, 10 a 800, 10 a 700, 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20, 20 a 1.000, 20 a 900, 20 a 800, 20 a 700, 20 a 600, 20 a 500, 20 a 400, 20 a 300, 20 a 200, 20 a 100, 20 a 50, 20 a 40, 20 a 30, 50 a 1000, 50 a 900, 50 a 800, 50 a 700, 50 a 600, 50 a 500, 50 a 400, 50 a 300, 50 a 200, 50 a 100, 100 a 1000, 100 a 900, 100 a 800, 100 a 700, 100 a 600, 100 a 500, 100 a 400, 100 a 300, 100 a 200, 200 a 1.000, 200 a 900, 200 a 800, 200 a 700, 200 a 600, 200 a 500, 200 a 400 ou 200 a 300 aminoácidos contíguos, incluindo todas as faixas entre os mesmos, e compreende toda ou uma porção de uma sequência de referência. Em certas modalidades, a região C-terminal ou N-terminal de qualquer polipeptídeo de referência pode ser truncada por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 ou 800 ou mais aminoácidos, ou por cerca de 10 a 50, 20 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 350, 350 a 400, 400 a 450, 450 a 500, 500 a 550, 550 a 600, 600 a 650, 650 a 700, 700 a 750, 750 a 800 ou mais aminoácidos, incluindo todos os números inteiros e faixas entre os mesmos (por exemplo, 101, 102, 103, 104, 105), contanto que o polipeptídeo truncado mantenha as propriedades de ligação e/ou a atividade do polipeptídeo de referência. Tipicamente, o fragmento biologicamente ativo tem no mínimo cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 25% ou cerca de 50% de uma atividade do polipeptídeo de referência biologicamente ativo do qual o mesmo é derivado.

[0147]Em geral, as variantes exibirão pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de similaridade ou identidade de sequência ou homologia de sequência a uma sequência de polipeptídeos de referência. Além disso, são contempladas as sequências que diferem das sequências nativas ou precursoras pela adição (por exemplo, adição C-terminal, adição N-terminal, ambas), deleção, truncamento, inserção ou substituição (por exemplo, substituição conservadora) de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 aminoácidos (incluindo todos os números inteiros e faixas entre os mesmos), mas que mantêm as propriedades ou as atividades de uma sequência de polipeptídeos precursora ou de referência.

[0148]Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes diferem da sequência de referência em pelo menos um, porém, menos que 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 ou 2 resíduos de aminoácido. Em outras modalidades, os polipeptídeos variantes diferem de uma sequência de referência em pelo menos 1%, porém, menos que 20%, 15%, 10% ou 5% dos resíduos. (Se essa comparação exigir alinhamento, as sequências devem ser alinhadas para similaridade máxima. Sequências de deleções ou inserções “com saída de loop”, ou incompatibilidades, são consideradas diferenças.)

[0149]Cálculos de similaridade de sequência ou identidade de sequência entre as sequências (os termos são usados de forma intercambiável) são realizados conforme segue. Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos, ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou ambas dentre uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para alinhamento ideal e sequências não homólogas pode ser desconsideradas para propósitos de comparação). Em certas modalidades, o comprimento de uma sequência de referência para propósitos de comparação é pelo menos 30%, de preferência, pelo menos 40%, de maior preferência, pelo menos 50%, 60%, e, de preferência ainda maior, pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são, então, comparados. Quando uma posição na primeira sequência está ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então, as moléculas são idênticas nessa posição.

[0150]A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, considerando-se o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para alinhamento ideal das duas sequências.

[0151]A comparação de sequências e a determinação da identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas com o uso de um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferencial, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos é determinada com o uso do algoritmo de Needleman e Wunsch, (J. Mol. Biol. 48: 444 a 453, 1970) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, com o uso de uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em ainda outra modalidade preferencial, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos determinadas com o uso do programa GAP no pacote de software GCG, com o uso de uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjunto de parâmetros particularmente preferencial (e aquele que deve ser usado a não ser que especificado de outro modo) é uma matriz de pontuação Blossum 62 com uma penalidade para lacuna de 12, uma penalidade para extensão de lacuna de 4 e uma penalidade por lacuna de frameshift de 5.

[0152]A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos pode ser determinada com o uso do algoritmo de E. Meyers and W. Miller (Cabios. 4:11 a 17, 1989) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), com o uso de uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade para comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade para lacuna de 4.

[0153]As sequências de ácidos nucleicos e proteínas descritas no presente documento podem ser usadas como uma “sequência de consulta” para realizar uma busca contra bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais buscas podem ser realizadas com o uso dos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al., (1990, J. Mol. Biol, 215: 403 a 410). As buscas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácido nucleico da invenção. As buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25: 3.389 a 3.402, 1997). Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.

[0154]Em uma modalidade, conforme indicado acima, os polinucleotídeos e/ou os polipeptídeos podem ser avaliados com o uso de uma ferramenta de alinhamento BLAST. Um alinhamento local consiste simplesmente em um par de segmentos de sequência, um de cada uma das sequências que são comparadas. Uma modificação de algoritmos de Smith-Waterman ou Sellers encontrará todos os pares de segmentos cujas pontuações não podem ser aprimoradas por extensão ou aparamento, chamados de pares de segmentos de alta pontuação (HSPs). Os resultados dos alinhamentos BLAST incluem medidas estatísticas para indicar a probabilidade de que a pontuação BLAST possa ser esperada apenas por acaso.

[0155]A pontuação bruta, S, é calculada a partir do número de lacunas e substituições associadas a cada sequência alinhada, em que as pontuações de similaridade mais altas indicam um alinhamento mais significativo. As pontuações de substituição são dadas por uma tabela de pesquisa (consultar PAM, BLOSUM).

[0156]As pontuações de lacuna são tipicamente calculadas como a soma de G, a penalidade para abertura de lacuna e L, a penalidade para extensão da lacuna. Para uma lacuna de comprimento n, o custo de lacuna poderia ser G+Ln. A escolha de custos de lacuna, G e L, é empírica, mas é costumeiro escolher um valor alto para G (10 a 15), por exemplo, 11, e um valor baixo para L (1 a 2), por exemplo, 1.

[0157]A pontuação de bit, S’, é derivada da pontuação de alinhamento bruto S em que as propriedades estatísticas do sistema de pontuação usado foram consideradas. As pontuações de bit são normalizadas em relação ao sistema de pontuação, portanto, podem ser usadas para comparar pontuações de alinhamento de diferentes buscas. Os termos “pontuação de bit” e “pontuação de similaridade” são usados de forma intercambiável. A pontuação de bit gera uma indicação de quão bom é o alinhamento; quanto maior a pontuação, melhor o alinhamento.

[0158]O valor E, ou o valor esperado, descreve a probabilidade de que uma sequência com uma pontuação similar ocorre no banco de dado ao acaso. O mesmo é uma previsão do número de alinhamentos diferentes com pontuações equivalentes a ou melhores que S que se espera que ocorram em uma busca de banco de dados ao acaso. Quanto menor o Valor E, mais significativo o alinhamento. Por exemplo, um alinhamento que tem um valor E de um e-117 significa que uma sequência com uma pontuação similar tem pouca possibilidade de ocorrer simplesmente ao acaso. Adicionalmente, a pontuação esperada para alinhar um par aleatório de aminoácidos precisa ser negativa, de outro modo, alinhamentos longos tenderiam a ter pontuação alta independentemente de se os alinhamentos estavam relacionados. Adicionalmente, o algoritmo BLAST usa uma matriz, nucleotídeo ou aminoácido de substituição adequado e para alinhamentos com lacuna usa penalidades de criação e extensão de lacuna. Por exemplo, o alinhamento e a comparação BLAST de sequências de polipeptídeos são tipicamente realizados com o uso da matriz BLOSUM62, uma penalidade para existência de lacuna de 11 e uma penalidade para extensão de lacuna de 1.

[0159]Em uma modalidade, as pontuações de similaridade de sequência são relatadas a partir de análises BLAST realizadas com o uso da matriz BLOSUM62, uma penalidade para existência de lacuna de 11 e uma penalidade para extensão de lacuna de 1.

[0160]Em uma modalidade particular, as pontuações de identidade/similaridade de sequência fornecidas no presente documento referem-se ao valor obtido com o uso de GAP Versão 10 (GCG, Accelrys, San Diego, Calif.) com o uso dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos com o uso de Peso de Lacuna de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma sequência de aminoácidos com o uso de Peso de Lacuna de 8 e Peso de Comprimento de 2 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, PNAS USA. 89:10.915 a 10.919, 1992). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (J Mol Biol. 48:443 a 453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de correlações e minimiza o número de lacunas.

[0161]Em uma modalidade particular, o polipeptídeo variante compreende uma sequência de aminoácidos que pode ser alinhada de modo ideal com uma sequência de polipeptídeos de referência (consulte, por exemplo, a Listagem de Sequências) para gerar pontuações de bit de BLAST ou pontuações de similaridade de sequência de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1.000 ou mais, incluindo todos os números inteiros e faixas entre os mesmos, em que o alinhamento BLAST usou a matriz BLOSUM62, uma penalidade para existência de lacuna de 11 e uma penalidade para extensão de lacuna de 1.

[0162]Conforme observado acima, um polipeptídeo de referência pode ser alterado de várias formas, incluindo substituições, deleções, truncamentos, adições e inserções de aminoácidos. Os métodos para tais manipulações são, de modo geral, conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes de sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referência podem ser preparadas por mutações no DNA. Os métodos para mutagênese e alterações de sequência de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Kunkel (PNAS USA. 82: 488 a 492, 1985); Kunkel et al., (Methods in Enzymol. 154: 367 a 382, 1987), Patente no US 4.873.192, Watson, J. D. et al., (“Molecular Biology of the Gene”, Quarta Edição, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) e as referências citadas no mesmo. As diretrizes quanto a substituições de aminoácido adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

[0163]Os métodos para triar produtos de gene de bibliotecas combinatórias produzidos por tais modificações e para triar bibliotecas de cDNA para produtos de gene que têm uma propriedade selecionada são conhecidos na técnica. Tais métodos são adaptáveis para triagem rápida das bibliotecas de genes geradas por mutagênese combinatória de polipeptídeos de referência. Como um exemplo, mutagênese de conjunto recursivo (REM), uma técnica que intensifica a frequência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os ensaios de triagem para identificar variantes de polipeptídeo (Arkin e Yourvan, PNAS USA 89: 7.811 a 7.815, 1992; Delgrave et al., Protein Engineering. 6: 327 a 331, 1993).

[0164]Polinucleotídeos, Células Hospedeiras e Métodos de Produção. Certas modalidades referem-se a polinucleotídeos que codificam as proteínas de fusão descritas no presente documento, e vetores que compreendem tais polinucleotídeos, por exemplo, em que os polinucleotídeos estão ligados de modo operacional a um ou mais elementos reguladores. Estão também incluídas células hospedeiras recombinantes que compreendem tais polinucleotídeos, vetores, proteínas de fusão e métodos de produção recombinante do anterior.

[0165]As proteínas de fusão podem ser preparadas com o uso de técnicas padrão. De preferência, no entanto, uma proteína de fusão é expressa como uma proteína recombinante em um sistema de expressão, conforme descrito no presente documento e conhecido na técnica. As proteínas de fusão podem conter uma ou múltiplas cópias de uma sequência p97 e uma ou múltiplas cópias de uma sequência IDS, presente em qualquer disposição desejada.

[0166]Os polinucleotídeos e polinucleotídeos de fusão podem conter uma ou múltiplas cópias de um ácido nucleico que codifica uma sequência de polipeptídeos p97 e/ou podem conter uma ou múltiplas cópias de um ácido nucleico que codifica uma sequência IDS.

[0167]Para proteínas de fusão, as sequências de DNA que codificam a sequência de polipeptídeos p97, a sequência IDS de interesse e, opcionalmente, um componente de ligante peptídico podem ser mostrados separadamente e, então, ligados a um vetor de expressão adequado. A extremidade 3’ da sequência de DNA que codifica um componente polipeptídico pode estar ligada, com ou sem um ligante peptídico, à extremidade 5’ de uma sequência de DNA que codifica o(s) outro(s) componente(s) de polipeptídeo de modo que os quadros de leitura das sequências estejam em quadro. As sequências de DNA ligadas estão ligadas de modo operacional a elementos reguladores transcricionais e/ou translacionais. Os elementos reguladores responsáveis pela expressão de DNA estão usualmente localizados apenas em 5’ para a sequência de DNA que codifica os primeiros polipeptídeos. Similarmente, os códons de parada exigidos para finalizar sinais de terminação de tradução e transcrição estão apenas presentes em 3’ para a sequência de DNA que codifica o polipeptídeo mais C-terminal. Isso permite a tradução em um único polipeptídeo de fusão que mantém a atividade biológica de ambos os polipeptídeos componentes.

[0168]Técnicas similares, principalmente a disposição de elementos reguladores, tais como promotores, códons de parada e sinais de terminação de transcrição, podem ser aplicadas à produção recombinante de proteínas de não fusão.

[0169]Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras adequadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências conforme adequado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, ou fagomídeo, conforme adequado. Para detalhes adicionais, consultar, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2- edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construtos de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão de genes e análise de proteínas, são descritas em detalhes em Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, ou atualizações subsequentes à mesma.

[0170]Conforme será entendido por aqueles versados na técnica, pode ser vantajoso, em alguns casos, produzir sequências de nucleotídeos de codificação de polipeptídeo que possuem códons de ocorrência não natural. Por exemplo, os códons preferenciais por um hospedeiro procarionte ou eucarionte particular podem ser selecionados para aumentar a taxa de expressão de proteína ou para produzir um transcrito de RNA recombinante que têm as propriedades desejáveis, tal como uma meia-vida que é maior que aquela de um transcrito gerado a partir da sequência de ocorrência natural. Tais polinucleotídeos são comumente referidos como “otimizados por códon”. Qualquer um dos polinucleotídeos descritos no presente documento pode ser utilizado em uma forma otimizada por códon. Em certas modalidades, um polinucleotídeo pode ser otimizado por códon para uso em bactérias específicas, tal como E. coli, ou levedura, tal como S. cerevisiae (consultar, por exemplo, Burgess-Brown et al., Protein Expr Purif. 59:94 a 102, 2008).

[0171]As sequências de polinucleotídeos exemplificativos são fornecidas na Tabela 7 abaixo.

[0172]Assim, em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão ou fusão de anticorpo descrita no presente documento, ou uma porção do mesmo, compreende uma ou mais sequências de polinucleotídeos da Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOS:143 a 147), ou um fragmento/variante do mesmo.

[0173]Em algumas modalidades, ácidos nucleicos ou vetores que codificam um polipeptídeo p97 da matéria, um polipeptídeo IDS e/ou uma fusão p97-IDS são introduzidos diretamente em uma célula hospedeira, e a célula é incubada sob condições suficientes para induzir a expressão do(s) polipeptídeo(s) codificado(s). Portanto, de acordo com certas modalidades relacionadas, é fornecida uma célula hospedeira recombinante que compreende um polinucleotídeo ou um polinucleotídeo de fusão que codifica uma ou mais proteínas de fusão descritas no presente documento, e compreende opcionalmente polinucleotídeos exógenos adicionais.

[0174]A expressão de uma proteína de fusão na célula hospedeira pode ser atingida cultivando-se as células hospedeiras recombinantes (contendo o(s) polinucleotídeo(s)) sob condições adequadas. Após a produção por expressão, o(s) polipeptídeo(s) e/ou as proteínas de fusão podem ser isolados e/ou purificados com o uso de qualquer técnica adequada e, então, usados conforme desejado. O termo “célula hospedeira” é usado para referência a uma célula em que foi introduzido, ou que tem capacidade de ter introduzido na mesma, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um ou mais dos polipeptídeos descritos no presente documento e que expressa, ainda, ou tem capacidade de expressar um gene selecionado de interesse, tal como um gene que codifica qualquer polipeptídeo descrito no presente documento. O termo incluir a progênie da célula progenitora, seja ou não a progênie idêntica em morfologia ou em constituição genética ao progenitor original, contanto que o gene selecionado esteja presente. As células hospedeiras podem ser escolhidas por certas características, por exemplo, a expressão de aminoacil tRNA sintetase(s) que pode(m) incorporar aminoácidos não naturais no polipeptídeo.

[0175]Os sistemas para clonagem e expressão de uma proteína em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem células de mamífero, bactérias, levedura e sistemas de baculovírus. As linhagens celulares de mamífero disponíveis na técnica para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células renais de hamster filhote, células HEK-293, linhagem celular de fibrossarcoma humano HT-1080 (consultar, por exemplo, Moran, Nat. Biotechnol. 28:1.139 a 1.140, 2010), células de melanoma de camundongo NSO e muitos outros. Os exemplos adicionais de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem linhagem CV1 de rim de marcado transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para proliferação em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster filhote (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243 a 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44 a 68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., PNAS USA 77:4.216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma, tal como NSO e Sp2/0. Para uma análise de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para produção de polipeptídeo, consultar, por exemplo, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Volume 248 (B. K.C Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), páginas 255 a 268. Certos sistemas de expressão de célula de mamífero preferenciais incluem sistemas de expressão à base de célula CHO HEK293. Os sistemas de expressão de mamífero podem utilizar linhagens celulares fixadas, por exemplo, em frascos em T, garrafas cilíndricas ou fábricas celulares, ou culturas de suspensão, por exemplo, em ratocionadores de 1 l e 5 l spinners, biorreatores de tanque de agitação de 5 l, 14 l, 40 l, 100 l e 200 l, ou biorreatores WAVE de 20/50 l e 100/200 l, entre outros conhecidos na técnica.

[0176]Um hospedeiro bacteriano preferencial comum é E. coli. A expressão de proteínas em células procariontes, tal como E. coli, está bem estabelecida na técnica. Para uma análise, consultar, por exemplo. Pluckthun, A. Bio/Technology. 9:545 a 551 (1991). A expressão em células eucariontes em cultura está também disponível para aqueles versados na técnica como uma opção para a produção recombinante de polipeptídeos (consultar Ref, Curr. Opinion Biotech. 4:573 a 576, 1993; e Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553 a 560, 1995). Em modalidades específicas, a expressão de proteína pode ser controlada por uma RNA polimerase T7 (por exemplo, séries de vetor pET). Essas e modalidades relacionadas podem utilizar a cepa hospedeira de expressão BL21 (DE3), um lisógeno WE3 de BL21 que suporta a expressão mediada por T7 e é deficiente em proteases lon e ompT para estabilidade de proteína alvo aprimorada. Também estão incluídas as cepas hospedeiras de expressão que portam plasmídeos que codificam tRNAs raramente usados em E. coli, tal como as cepas Rosetta™ (DE3) e Rosetta 2 (DE3). A lise celular e a manipulação de amostra podem ser também aprimoradas com o uso de reagentes, tal como nuclease Benzonase® e Reagente de Extração de Proteína BugBuster®. Para cultura celular, os meios de autoindução podem aprimorar a eficácia de muitos sistemas de expressão, incluindo sistemas de expressão de alto rendimento. Os meios desse tipo (por exemplo, Overnight Express™ Autoinduction System) produzem gradualmente expressão de proteína através de desvio metabólico sem a adição de agentes de indução artificiais, tal como IPTG. As modalidades particulares empregam etiquetas de hexa-histidina (tal como fusões His^Tag®), seguidas por purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) ou técnicas relacionadas. Em certos aspectos, no entanto, as proteínas de grau clínico podem ser isoladas de corpos de inclusão de E. coli, com ou sem o uso de etiquetas de afinidade (consultar, por exemplo, Shimp et al., Protein Expr Purif. 50:58 a 67, 2006). Como um exemplo adicional, certas modalidades podem empregar um sistema de produção de alto rendimento de E. coli induzida por choque frio, devido ao fato de que a superexpressão de proteínas em Escherichia coli à baixa temperatura aprimora sua solubilidade e estabilidade (consultar, por exemplo, Qing et al., Nature Biotechnology. 22:877 a 882, 2004).

[0177]Adicionalmente, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida por sua capacidade de modular a expressão das sequências inseridas ou processar a proteína expressa da forma desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, porém, sem limitação, modificações pós-traducionais, tal como acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós- traducional, que cliva uma forma “pré-pró” da proteína, pode também ser usado para facilitar a inserção, flexão e/ou função correta. Células hospedeiras diferentes, tal como levedura, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 e W138, adicionalmente a células bacterianas, que têm ou mesmo carecem de maquinário celular e mecanismos característicos para tais atividades pós-traducionais, podem ser escolhidas para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína de fusão de interesse.

[0178]Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é, de modo geral, preferencial. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente um polinucleotídeo de interesse podem ser transformadas com o uso de vetores de expressão que podem conter origens virais de replicação e/ou elementos de expressão endógena e um gene marcador selecionável em um mesmo vetor ou em um vetor separado. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixadas proliferar por cerca de 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meios seletivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite a proliferação e recuperação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. Clones resistentes de células transformadas estavelmente podem ser proliferados com o uso de técnicas de cultura de tecido adequadas para o tipo de célula. A produção temporária, tal como por transfecção ou infecção temporária, pode ser também empregada. Os sistemas de expressão de mamífero exemplificativos que são adequados para a produção temporária incluem sistemas à base de HEK293 e CHO.

[0179]Células hospedeiras transformadas com uma sequência de polinucleotídeo de interesse podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e a recuperação da proteína da cultura celular. Certas modalidades específicas utilizam sistemas de expressão de célula isentos de soro. Os exemplos incluem células HEK293 e células CHO que podem proliferar em meio isento de soro (consultar, por exemplo, Rosser et al., Protein Expr. Purif. 40:237 a 243, 2005; e Patente n° US 6.210.922).

[0180]A(s) proteína(s) produzida(s) por uma célula recombinante pode ser purificada e distinguida de acordo com uma variedade de conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica. Os sistemas exemplificativos para realizar purificação de proteína e analisar a pureza de proteína incluem cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC) (por exemplo, sistemas AKTA e Bio-Rad FPLC), cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (por exemplo, HPLC de Beckman e Waters). As químicas exemplificativas para purificação incluem cromatografia de troca iônica (por exemplo, Q, S), cromatografia de exclusão de tamanho, gradientes de sal, purificação por afinidade (por exemplo, Ni, Co, FLAG, maltose, glutationa, proteína A/G), filtração de gel, fase reversa, cromatografia de troca iônica HyperD® cerâmica e colunas de interação hidrofóbica (HIC), entre outras conhecidas na técnica. Estão também incluídos métodos analíticos, tal como SDS-PAGE (por exemplo, coomassie, mancha de prata), imunoblot, Bradford e ELISA, que pode ser utilizado durante qualquer etapa do processo de produção ou purificação, tipicamente para medir a pureza da composição de proteína.

[0181]Estão também incluídos métodos para concentrar proteínas produzidas de modo recombinante, por exemplo, proteínas de fusão. Os exemplos incluem liofilização, que é tipicamente empregada quando a solução contém poucos componentes solúveis além da proteína de interesse. A liofilização é frequentemente realizada após a execução de HPLC e pode remover a maior parte ou todos os componentes voláteis da mistura. Estão também incluídas técnicas de ultrafiltração, que tipicamente empregam uma ou mais membranas permeáveis seletivas para concentrar uma solução de proteína. A membrana permite que água e moléculas pequenas passem através e retém a proteína; a solução pode ser forçada contra a membrana por bomba mecânica, pressão de gás ou centrifugação, entre outras técnicas.

[0182]Em certas modalidades, as proteínas de fusão têm uma pureza de pelo menos cerca de 90%, conforme medido de acordo com conjuntos de procedimentos de rotina na técnica. Em certas modalidades, tais como composições diagnósticas ou certas composições terapêuticas, as proteínas de fusão têm uma pureza de pelo menos cerca de 95%. Em modalidades específicas, tais como composições farmacêuticas ou terapêuticas, as proteínas de fusão têm uma pureza de pelo menos cerca de 97%, 98% ou 99%. Em outras modalidades, tal como quando são usadas como reagentes de referência ou pesquisa, as proteínas de fusão podem ser de pureza menos e podem ter uma pureza de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70% ou 80%. A pureza pode ser medida em geral ou em relação a componentes selecionados, tais como outras proteínas, por exemplo, pureza em uma base proteica.

[0183]Em certas modalidades, conforme observado acima, as composições descritas no presente documento são cerca de substancialmente isentas de endotoxina, incluindo, por exemplo, cerca de 95% isentas de endotoxina, de preferência, cerca de 99% isentas de endotoxina e, de maior preferência, cerca de 99,99% isentas de endotoxina. A presença de endotoxinas pode ser detectada de acordo com os conjuntos de procedimentos de rotina na técnica, conforme descrito no presente documento. Em modalidades específicas, as proteínas de fusão são produzidas a partir de uma célula eucarionte, tal como uma célula de mamífero ou ser humano, em um meio substancialmente isento de soro.

MÉTODOS DE USO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0184]Certas modalidades da presente invenção referem-se a métodos para usar as proteínas de fusão p97 descritas no presente documento. Os exemplos de tais métodos incluem métodos de tratamento e métodos de diagnóstico, incluindo, por exemplo, o uso de proteínas de fusão p97 para imageologia médica de certos órgãos/tecidos, tais como aqueles do sistema nervoso. Algumas modalidades incluem métodos para diagnosticar e/ou tratar distúrbios ou afecções do sistema nervoso central (SNC), ou distúrbios ou afecções que têm um componente do SNC. Os aspectos particulares incluem métodos para tratar um distúrbio de depósito lisossômico (LSD), incluindo aqueles que têm um componente do SNC.

[0185]De modo correspondente, certas modalidades incluem métodos para tratar um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar uma proteína de fusão p97 descrita no presente documento. Estão também incluídos métodos para entregar uma enzima IDS ao sistema nervoso (por exemplo, tecidos do sistema nervoso central) de um indivíduo que compreende administrar uma composição que compreende uma proteína de fusão p97 descrita no presente documento. Em certas dessas modalidades e modalidades relacionadas, os métodos aumentam a taxa de entrega do agente aos tecidos do sistema nervoso central, em relação, por exemplo, à entrega por uma composição que compreende uma enzima IDS de não fusão.

[0186]Em alguns casos, o indivíduo tem ou está em risco de ter uma doença de depósito lisossômico. Certos métodos, assim, referem-se ao tratamento de doenças de depósito lisossômico em um indivíduo que precisa do mesmo, opcionalmente aquelas doenças de depósito lisossômico associadas ao sistema nervoso central ou que têm envolvimento do SNC. As doenças de depósito lisossômico incluem mucopolissacaridose tipo II (Síndrome de Hunter). A Síndrome de Hunter é um distúrbio de multissistema ligado a X distinguido pelo acúmulo de glicosaminoglicanos (GAG). A vasta maioria de indivíduos afetados são do sexo masculino; em raras ocasiões, fêmeas portadoras manifestam as conclusões. A idade de início, a gravidade da doença e a taxa de progressão podem variar significativamente.

[0187]Naqueles com doença grave, o envolvimento do SNC (manifesto principalmente por deterioração cognitiva progressiva), doença das vias aéreas e doença cardíaca progressivas usualmente resultam em morte na primeira ou na segunda década de vida. Certas modalidades, portanto, incluem o tratamento de Síndrome de Hunter com envolvimento do SNC.

[0188]Naqueles com doença atenuada, o SNC não é (ou é minimamente) afetado, embora o efeito de acúmulo de GAG em outros sistemas de órgãos possa ser tão grave quanto naqueles que têm declínio cognitivo progressivo. A sobrevivência nos anos da fase adulta precoce com inteligência normal é comum na forma atenuada da doença. No entanto, os indivíduos com doença atenuada podem ainda se beneficiar da administração de uma proteína de fusão p97-IDS que tem penetração aprimorada nos tecidos do SNC, por exemplo, para reduzir o risco de progressão de Síndrome de Hunter atenuada para aquela com envolvimento do SNC.

[0189]As conclusões adicionais em ambas as formas de Síndrome de Hunter incluem: baixa estatura; macrocefalia com ou sem hidrocefalia comunicante; macroglossia; voz rouca; perda de audição condutiva ou senssorineural; hepatomegalia e/ou esplenomegalia; disostose multiplex e contraturas da articulação, incluindo anquilose da articulação temporomandibular; estenose espinhal; e síndrome do túnel carpal. Os indivíduos que passam por tratamento com as proteínas de fusão descritas no presente documento podem, assim, ter uma ou mais dessas conclusões de Síndrome de Hunter.

[0190]GAGs da urina e estudos do esqueleto podem estabelecer a presença de uma afecção de MPS, mas não são específicos para MPS II. O padrão ouro para diagnóstico de MPS II em um caso índice do sexo masculino é atividade de iduronato sulfatase (IDS) deficiente em células brancas, fibroblastos ou plasma na presença de atividade normal de pelo menos uma outra sulfatase. A testagem genética molecular de IDS, o único gene em que se sabe que a mutação está associada à Síndrome de Hunter, pode ser usada para confirmar o diagnóstico em um caso índice do sexo masculino com um fenótipo incomum ou um fenótipo que não corresponde aos resultados de testagem de GAG.

[0191]Os tratamentos comuns para Síndrome de Hunter incluem terapia de desenvolvimento, ocupacional e física; desvio para hidrocefalia; amigdalectomia e adenoidectomia; ventilação de pressão positiva (CPAP ou traqueostomia); liberação do túnel carpal; substituição da válvula cardíaca; reparo de hérnia inguinal. Portanto, em certos aspectos, um indivíduo para tratamento pelas proteínas de fusão descritas no presente documento pode estar prestes a passar, estar passando ou ter passado por um ou mais desses tratamentos.

[0192]O monitoramento da doença pode depender do envolvimento do sistema de órgãos e da gravidade da doença e usualmente inclui ecocardiogramas e avaliação cardíaca; avaliações pulmonares incluindo testagem de função pulmonar; audiogramas; exames dos olhos; avaliações de desenvolvimento; e exames neurológicos. Estudos adicionais podem incluir estudos do sono para apneia obstrutiva; velocidade de condução do nervo (NCV) para avaliar a síndrome do túnel carpal; avaliações para hidrocefalia; avaliações ortopédicas para monitorar doença do quadril. Assim, em alguns aspectos, um indivíduo para tratamento pelas proteínas de fusão descritas no presente documento pode estar prestes a passar, estar passando ou ter passado por um ou mais desses protocolos de monitoramento.

[0193]Para uso in vivo, por exemplo, para o tratamento de doença humana, imageologia médica ou testagem, as proteínas de fusão p97 descritas no presente documento estão, de modo geral, incorporadas em uma composição farmacêutica antes da administração. Uma composição farmacêutica compreende uma ou mais das proteínas de fusão p97 descritas no presente documento em combinação com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0194]Para preparar uma composição farmacêutica, uma quantidade eficaz ou desejada de uma ou mais proteínas de fusão são misturadas com qualquer carreador ou excipiente farmacêutico conhecido por aqueles versados na técnica que sejam adequados para o modo de administração particular. Um carreador farmacêutico pode ser líquido, semilíquido ou sólido. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea ou tópica podem incluir, por exemplo, um diluente estéril (tal como água), solução salina (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato; PBS), óleo fixado, polietilenoglicol, glicerina, propileno glicol ou outro solvente sintético; agentes antimicrobianos (tal como álcool benzílico e metil parabenos); antioxidantes (tal como ácido ascórbico e bissulfeto de sódio) e agentes quelantes (tal como ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA)); tampões (tais como acetatos, citratos e fosfatos). Se administrados por via intravenosa (por exemplo, por infusão IV), os carreadores adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) e soluções contendo agentes de espessamento e solubilização, tais como glicose, polietilenoglicol polipropilenoglicol, e misturas dos mesmos.

[0195]A administração de proteínas de fusão descritas no presente documento, na forma pura ou em uma composição farmacêutica adequada, pode ser executada por meio de qualquer um dos modos aceitos de administração de agentes para servir utilidades similares. As composições farmacêuticas podem ser preparadas combinando-se uma composição contendo proteína de fusão com um carreador, diluente ou excipiente fisiologicamente aceitável adequado e podem ser formuladas em preparações nas formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas e aerossóis. Adicionalmente, outros ingredientes farmaceuticamente ativos (incluindo outras moléculas pequenas conforme descrito em contra parte no presente documento) e/ou excipientes adequados, tais como sais, tampões e estabilizantes, podem, porém, sem necessidade, estar presentes na composição.

[0196]A administração pode ser atingida por uma variedade de vias diferentes, incluindo oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutânea ou tópica. Os modos preferenciais de administração dependem da natureza da afecção a ser tratada ou prevenida. As modalidades particulares incluem a administração por infusão IV. Algumas modalidades incluem a administração por injeção intraperitoneal (IP). Estão também incluídas combinações dos mesmos.

[0197]Os carreadores podem incluir, por exemplo, carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou para o mamífero que é exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o carreador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa com pH tamponado. Os exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tal como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo com baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; alcoóis de açúcar, tal como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tal como polietilenoglicol (PEG) de polissorbato 20 (TWEEN™) e poloxâmeros (PLURONICS™), e similares.

[0198]Em certos aspectos, uma proteína de fusão está ligada a ou encapsulada dentro de uma partícula, por exemplo, uma nanopartícula, esfera, formulação lipídica, partícula lipídica ou lipossoma, por exemplo, imunolipossoma. As proteínas de fusão podem ser capturadas em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de medicamento coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16â edição, Oslo, A., Ed., (1980). A(s) partícula(s) ou lipossomas podem, ainda, compreender outros agentes terapêuticos ou diagnósticos.

[0199]A dosagem e a duração exatas do tratamento são uma função da doença que é tratada e podem ser determinadas empiricamente com o uso de protocolos de teste padrão ou testando-se as composições em sistemas modelo conhecidos na técnica e extrapolando-se a partir dos mesmos. Testes clínicos controlados podem ser também realizados. As dosagens podem também variar com a gravidade da afecção a ser aliviada. Uma composição farmacêutica é, de modo geral, formulada e administrada para exercer um efeito terapeuticamente útil enquanto minimiza efeitos colaterais indesejáveis. A composição pode ser administrada uma vez ou pode ser dividida em diversas doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. Para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos podem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual.

[0200]As vias típicas para administrar essas e composições farmacêuticas relacionadas, assim, incluem, sem limitação, oral, tópica, transdérmica, inalação, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal e intranasal. O termo parenteral conforme usado no presente documento inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intraesternal ou técnicas de infusão. As composições farmacêuticas de acordo com certas modalidades da presente invenção são formuladas de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos nas mesmas seja biodisponíveis mediante administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um indivíduo ou paciente podem assumir a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que, por exemplo, um tablete pode ser uma unidade de dosagem única, e um contentor de um conjugado descrito no presente documento na forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem. Os métodos reais para preparar tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão percebidos, por aqueles versados na técnica; por exemplo, consultar Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20- Edição (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). A composição a ser administrada contém, tipicamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão descrita no presente documento para tratamento de uma doença ou afecção de interesse.

[0201]Uma composição farmacêutica pode estar na forma de um sólido ou um líquido. Em uma modalidade, o(s) carreador(es) é(são) particulado(s), de modo que as composições estejam, por exemplo, na forma de tablete ou pó. O(s) carreador(es) pode(m) ser líquido(s), com as composições sendo, por exemplo, um óleo oral, líquido injetável ou um aerossol, que é útil, por exemplo, em administração inalatória. Quando destinada à administração oral, a composição farmacêutica está, de preferência, na forma sólida ou líquida, em que as formas semissólida, semilíquida, suspensão e gel estão incluídas dentro das formas consideradas no presente documento como sólido ou líquido.

[0202]Como uma composição sólida para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em um pó, grânulo, tablete comprimido, pílula, cápsula, goma de mascar, pastilha ou similares. Tal composição sólida conterá tipicamente um ou mais diluentes inertes ou carreadores comestíveis. Adicionalmente, um ou mais dos seguintes pode estar presente: ligantes, tal como carboximetilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; excipientes, tal como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes, tal como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e similares; lubrificantes, tal como estearato de magnésio ou Sterotex; deslizantes, tal como dióxido de silício coloidal; agentes adoçantes, tal como sacarose ou sacarina; um agente saborizantes, tal como hortelã, salicilato de metila ou sabor de laranja; e um agente corante. Quando a composição farmacêutica está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, a mesma pode conter, adicionalmente a materiais do tipo acima, um carreador líquido, tal como polietilenoglicol ou óleo.

[0203]A composição farmacêutica pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, um xarope, uma solução, uma emulsão ou uma suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para entrega por injeção, como dois exemplos. Quando destinada à administração oral, a composição preferencial contém, adicionalmente aos presentes compostos, um ou mais agente adoçante, conservantes, corante/colorante e intensificador de sabor. Em uma composição destinada a ser administrada por injeção, um ou mais dentre um tensoativo, um conservante, um agente umectante, um agente dispersante, um agente suspensor, um tampão, um estabilizante e um agente isotônico podem estar incluídos.

[0204]As composições farmacêuticas líquidas, sejam soluções, suspensões ou outra forma similar, podem incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis, tal como água para injeção, solução salina, de preferência, solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como o solvente ou o meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tal como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como ácido etilenodiaminetetraacético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste de tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser confinada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses produzidos a partir de vidro ou plástico. A solução salina fisiológica é um adjuvante preferencial. Uma composição farmacêutica injetável é, de preferência, estéril.

[0205]Uma composição farmacêutica líquida destinada à administração parenteral ou oral deve conter uma quantidade de uma proteína de fusão de modo que uma dosagem adequada seja obtida. Tipicamente, essa quantidade é pelo menos 0,01% do agente de interesse na composição. Quando destinada à administração oral, essa quantidade pode ser variada para estar entre 0,1 e cerca de 70% do peso da composição. Certas composições farmacêuticas orais contêm entre cerca de 4% e cerca de 75% do agente de interesse. Em certas modalidades, as composições e preparações farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral contenha entre 0,01 a 10% em peso do agente de interesse antes da diluição.

[0206]A composição farmacêutica pode ser destinada à administração tópica, em cujo caso o carreador pode compreender adequadamente uma solução, uma emulsão, uma pomada ou uma base em gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolato, lanolina, polietilenoglicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes, tal como água e álcool, e emulsificantes e estabilizantes. Agentes espessantes podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se destinada à administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou um dispositivo de iontoforese.

[0207]A composição farmacêutica pode se destinar à administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório, que derreterá no reto e liberará o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietilenoglicol.

[0208]A composição farmacêutica pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um invólucro de revestimento ao redor dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o invólucro de revestimento são tipicamente inertes e podem ser selecionados a partir de, por exemplo, açúcar, goma-laca e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser envolvidos em uma cápsula de gelatina. A composição farmacêutica na forma líquida ou sólida pode incluir um agente que se liga ao conjugado ou agente e, assim, auxilia na entrega do composto. Os agentes adequados que podem atuar nessa capacidade incluem anticorpos monoclonais ou policlonais, uma ou mais proteínas ou um lipossoma.

[0209]A composição farmacêutica pode consistir essencialmente em unidades de dosagem que podem ser administradas como um aerossol. O termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas na faixa daqueles de natureza coloidal até sistemas que consistem em pacotes pressurizados. A entrega pode ser por um gás liquefeito ou comprimido ou por um sistema de bomba adequado que distribui os ingredientes ativos. Os aerossóis podem ser entregues em sistemas de fase única, bifásicos ou trifásicos para entregar o(s) ingrediente(s) ativo(s). A entrega do aerossol inclui o recipiente, ativadores, válvulas, subrecipientes necessários e similares, que juntos podem formar um kit. Um elemento de habilidade comum na técnica, sem experimentação indevida, pode determinar os aerossóis preferenciais.

[0210]As composições descritas no presente documento podem ser preparadas com carreadores que protegem as proteínas de fusão contra a eliminação rápida do corpo, tal como formulações ou revestimentos de liberação temporal. Tais carreadores incluem formulações de liberação controlada, tal como, porém, sem limitação, implantes sistemas de entrega microescapsulados e polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tal como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido polilático e outros conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0211]As composições farmacêuticas podem ser preparadas por metodologia bem conhecida na técnica farmacêutica. Por exemplo, uma composição farmacêutica destinada a ser administrada por injeção pode compreender um ou mais dos sais, tampões e/ou estabilizantes, com água destilada estéril de modo a formar uma solução. Um tensoativo pode ser adicionado para facilitar a formação de uma solução ou uma suspensão homogênea. Os tensoativos são compostos que interagir de modo não covalente com o conjugado de modo a facilitar a dissolução ou a suspensão homogênea do conjugado no sistema aquoso de entrega.

[0212]As composições podem ser administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, que variará dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado; a estabilidade metabólica e a duração da ação do composto; a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo e a dieta do paciente; o modo e a hora de administração; a taxa de excreção; a combinação de fármacos; a gravidade do distúrbio ou da afecção particular; e a terapia pela qual o indivíduo passa. De modo geral, um dose diária terapeuticamente eficaz é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 0,001 mg/kg (isto é, aproximadamente 0,07 mg) a cerca de 100 mg/kg (isto é, aproximadamente 7,0 g); de preferência, uma dose terapeuticamente eficaz é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 0,01 mg/kg (isto é, aproximadamente 0,7 mg) a cerca de 50 mg/kg (isto é, aproximadamente 3,5 g); de maior preferência, uma dose terapeuticamente eficaz é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 1 mg/kg (isto é, aproximadamente 70 mg) a cerca de 25 mg/kg (isto é, aproximadamente 1,75 g).

[0213]As composições descritas no presente documento podem ser também administradas simultaneamente com, antes da ou após a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos, conforme descrito no presente documento. Por exemplo, em uma modalidade, o conjugado é administrado com um agente anti- inflamatório. Os agentes ou fármacos anti-inflamatórios incluem, porém, sem limitação, esteroides e glicocorticoides (incluindo betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos anti- inflamatórios não esteroides (NSAIDS), incluindo aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicações anti-TNF, ciclofsfamida e micofenolato.

[0214]Tal terapia de combinação pode incluir a administração de uma formulação de dosagem farmacêutica única, que contém um composto da invenção (isto é, proteína de fusão) e um ou mais agentes ativos adicionais, assim como a administração de composições que compreendem conjugados da invenção e cada agente ativo em sua própria formulação de dosagem farmacêutica separada. Por exemplo, uma proteína de fusão, conforme descrito no presente documento, e o outro agente podem ser administrados ao paciente juntos em uma única composição de dosagem oral, tal como um tablete ou uma cápsula, ou cada agente é administrado em formulações de dosagem oral separadas. Similarmente, uma proteína de fusão, conforme descrito no presente documento, e o outro agente podem ser administrados ao paciente juntos em uma única composição de dosagem parenteral, tal como em uma solução salina ou outra solução fisiologicamente aceitável, ou cada agente é administrado em formulações de dosagem parenteral separadas. Nos casos em que formulações de dosagem separadas são usadas, as composições que compreendem as proteínas de fusão e um ou mais agentes ativos adicionais podem ser administradas essencialmente ao mesmo tempo, isto é, concorrentemente ou em tempo separadamente escalonados, isto é, sequencialmente e em qualquer ordem; a terapia de combinação é entendida como incluindo todos esses regimes.

[0215]As várias modalidades descritas no presente documento podem ser combinadas para fornecer modalidades adicionais. Todos os pedidos US, publicações de pedido de patente US, pedidos de patente US, patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações de não patente referidos deste relatório descritivo e/ou listados na Folha de dados do Pedido estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outras modalidades.

[0216]Essas e outras alterações podem ser realizadas nas modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas reveladas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados incluindo todas as modalidades possíveis juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações são designadas. De modo correspondente, as reivindicações não são limitadas pela revelação.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 ATIVIDADE IN VITRO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO

[0217]As proteínas de fusão de p97 humano (melanotransferrina; MTf) e iduronato-2-sulfatase humano (IDS) foram preparadas e testadas quanto á atividade enzimática in vitro. A Tabela E1 fornece as sequências de aminoácidos, e a Tabela E2 fornece as sequências de codificação de polinucleotídeo correspondentes das proteínas de fusão que foram preparadas e testadas.

[0218]As proteínas recombinantes foram preparadas e testadas quanto à atividade enzimática contra o substrato Sulfato de 4-Nitrocatecol (PNCS) em relação ao IDS humano recombinante e um controle negativo (fusão trastuzumabe-MTf). Os resultados são mostrados nas Figuras 2 a 4. Um μg de cada amostra foi usado no ensaio de atividade enzimática, e os dados apresentados são normalizados em ensaio em branco de substrato.

[0219]A Figura 2 mostra a avaliação de atividade enzimática de proteínas de fusão I2S-MTf e MTf-I2S conforme medida por sua capacidade de hidrolisar o substrato Sulfato de 4-Nitrocatecol (PNCS) em relação a IDS humano recombinante e controle negativo (fusão TZM-MTf). Esses dados mostram que as proteínas de fusão I2S-MTf e MTf-I2S não apenas têm atividade enzimática significativa, mas também têm atividade enzimática aumentada em relação a um IDS humano do tipo selvagem (não fusão).

[0220]A Figura 3 mostra a avaliação de atividade enzimática de proteínas de fusão MTfpep-I2S e I2S-MTfpep (com pró-peptídeo I2S) conforme medida por sua capacidade de hidrolisar o substrato PNCS em relação à fusão I2S-MTf e controle negativo (fusão TZM-MTf). Esses dados mostram que as proteínas de fusão MTfpep-I2S e I2S-MTfpep não apenas têm atividade enzimática significativa, mas também têm atividade enzimática aumentada em relação à proteína de fusão I2S- MTf significativamente ativa (da Figura 2) e, assim, atividade enzimática aumentada em relação ao IDS humano do tipo selvagem (não fusão).

[0221]A Figura 4 mostra uma comparação da atividade enzimática de proteínas de fusão I2S-MTfpep (com pró-peptídeo I2S) e I2S-MTfpep (sem pró- peptídeo I2S) conforme medida por sua capacidade de hidrolisar o substrato PNCS. Esses dados mostram que as proteínas de fusão MTfpep-I2S e I2S-MTfpep não apenas têm atividade enzimática significativa, mas também têm atividade enzimática aumentada em relação a um IDS humano do tipo selvagem (não fusão).

EXEMPLO 2 DISTRIBUIÇÃO IN VIVO DE FUSÕES I2S-MTF E MTFPEP-I2S NO CÉREBRO

[0222]A biodistribução cerebral das proteínas de fusão I2S-MTf e MTfpep- I2S em camundongos foi avaliada por imageologia de microscopia confocal quantitativa. Os equivalentes de dose terapêutica de I2S-MTf e MTfpep-I2S foram administrados em volume de 100 μl a camundongos por meio de injeção na veia da cauda. Antes da eutanásia, os camundongos foram injetados (i.v.) com Lecitina de Tomate-FITC (40 μg) por 10 min para manchar a vasculatura do cérebro. O sangue foi purificado por perfusão intracardíaca de 10 ml de solução salina com heparina a uma taxa de 1 ml por minuto. Os cérebros foram extirpados e congelados em OCT e armazenados a -80 °C. Os cérebros foram montados em Tissue Tek e cortados com um criostato a -20 °C. As seções foram montadas em lâmina para microscópio Superfrost Plus, fixadas em Acetona/MeOH frios (1:1) por 10 minutos à temperatura ambiente e lavadas com PBS. Coberturas de vidro foram montadas nas seções com o uso de reagente antidesbotamento Prolong Gold com DAPI (sondas moleculares, P36931). Microscopia confocal tridimensional (3D) e análise quantitativa foram realizadas.

[0223]A Figura 5 mostra a quantificação da distribuição relativa de proteínas de fusão MTfpep-I2S (com pró-peptídeo) e I2S-MTf entre capilares (C) e parênquima (P) no cérebro, em relação ao sinal total (T). O manchamento significativo de tecidos parenquimais em relação a capilares confirma que as proteínas de fusão MTfpep-I2S e I2S-MTf têm ambas capacidade de cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) e se acumular em tecidos do sistema nervoso central.

[0224]Em suma, os dados dos Exemplos 1 e 2 mostram que as proteínas de fusão MTfpep-I2S (com pró-peptídeo) e I2S-MTf não tem capacidade de cruzar a BBB e se acumular em tecidos do SNC, mas também têm atividade enzimática significativamente aumentada em relação ao IDS humano recombinante do tipo selvagem (não fusão).

EXEMPLO 3 ATIVIDADE IN VIVO DE FUSÕES I2S-MTF E MTFPEP-I2S EM MODELO DE CAMUNDONGO DE MPS II

[0225]A eficácia terapêutica das proteínas de fusão I2S-MTf e MTfpep-I2S é avaliada em um modelo de camundongo de Síndrome de Hunter ou Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) em relação a Idursulfase (Elaprase®), que é indicada para o tratamento de Síndrome de Hunter. Esses estudos são projetados para avaliar o efeito de administração intravenosa (IV) e intraperitoneal (IP) das proteínas de fusão em patologia do cérebro em um modelo de camundongo knock-out de Mucopolissacaridose II (MPSII).

[0226]Síndrome de Hunter. Conforme observado acima, a Síndrome de Hunter é uma doença recessiva ligada a X causada por níveis insuficientes da enzima lisossômica iduronato 2-sulfatase (IDS). Essa enzima cliva as porções químicas terminais 2-O-sulfato dos glicosaminoglicanos (GAG) dermatano-sulfato e heparano-sulfato. Devido à atividade enzimática de IDS ausente ou defeituosa em pacientes com síndrome de Hunter, GAG acumulam progressivamente nos lisossomas de uma variedade de tipos de célula. Isso leva à congestão celular, organomegalia, destruição de tecido e disfunção de sistema de órgãos.

[0227]Modelo de Camundongo. Camundongos IDS-KO têm pouca ou nenhuma atividade de IDS e exibem muitos dos efeitos celulares e clínicos observados em síndrome de Hunter, incluindo vacuolização de tecido aumentada, níveis de GAG e excreção urinária de GAG. Devido à natureza recessiva ligada a X da síndrome de Hunter, todos os estudos de farmacologia são realizados em camundongos machos. O cruzamento de animais é realizado conforme descrito por Garcia et al, 2007 (3). Em suma, fêmeas portadoras são cruzadas com camundongos machos do tipo selvagem da cepa de fundo C57Bl/6, produzindo fêmeas heterogêneas e camundongos knock-out machos hemizigotos, assim como machos e fêmeas do tipo selvagem (WT). Os camundongos machos IDS-KO são alternativamente obtidos por cruzamento de fêmeas portadoras com camundongos machos IDS-KO. O genótipo de todos os camundongos usados nesses experimentos é confirmado por reação em cadeia de polimerase de DNA obtido a partir de corte na cauda. Todos os camundongos IDS-KO são machos IKO (-/0) hemizigotos e entre 12 a 13 semanas de vida no começo da iniciação do tratamento (camundongos com menos de 12 semanas não são usados nesse estudo). Um grupo de machos da mesma ninhada WT não tradados (+/0) é usado como controle.

[0228]Idursulfase (Elaprase®). Idursulfase é um fármaco usado para tratar síndrome de Hunter (também chamada de MPS-II) (consultar Garcia et al., Mol Genet Metab. 91:183 a 190, 2007). A mesma é uma forma purificada da enzima lisossômica iduronato-2-sulfatase e é produzida por tecnologia de DNA recombinante em uma linhagem de células humanas.

[0229]Projeto de Estudo. O projeto de estudo é apresentado na Tabela E3 abaixo.

[0230]Todos os artigos de teste e controles de veículo são administrados por dois bolus lentos (uma injeção IV e uma IP), a serem realizados uma vez por semana por um total de 6 semanas.

[0231]Os pesos corporais são determinados em randomização no primeiro dia de tratamento e semanalmente depois disso. Observações clínicas são realizadas diariamente. Os animais são sacrificados aproximadamente 24 horas após o último tratamento.

[0232]Os órgãos selecionados (cérebro, fígado, rim e coração) são coletados, e seus pesos registrados. Os cérebros são conservados para análise de histopatologia e imunomanchamento. Os outros tecidos são divididos com uma metade ou um órgão pareado e conservado para histopatologia e imunomanchamento de uma maneira similar ao cérebro. A outra metade ou o órgão pareado é congelado e armazenado a -80 °C até ser avaliado por GAG.

[0233]Pontos finais de estudo: Os pontos finais primários são conforme segue:

[0234]^ Avaliação histológica: Manchamento com hematoxilina e eosina de seções do cérebro. Esse método é usado para avaliar se o tratamento tem um efeito sobre a redução do número/tamanho de vacúolos de armazenamento celular observados em camundongos IDS-KO; e

[0235]^ Avaliação imunoistoquímica de proteína de membrana associada a lisossoma 1 (LAMP-1) em seções do cérebro: Esse método é usado para determinar se o tratamento tem efeito sobre a redução da imunorreatividade de LAMP-1 elevada que é observada em camundongos IDS-KO.

[0236]Se possível, métodos qualitativos ou semiqulitativos são também empregados para análise dos pontos finais 1 e 2 (tal como pontuação, medições de área, varreduras de seção, etc.). O histopatologista que realiza essa análise é cego em relação à alocação de lâmina aos grupos de estudo. A área superficial do lisossoma é quantificada por varredura das áreas manchadas por LAMP1 (IHC) e comparada entre grupos experimentais.

[0237]Os pontos finais secundários são conforme segue:

[0238]^ Níveis de GAG em tecidos selecionados (fígado, rim e coração);

[0239]^ Manchamento H&E de tecidos selecionados e detecção de vacúolos de armazenamento celular; e

[0240]^ Avaliação imunoistoquímica de níveis de LAMP-1 em órgãos/tecidos selecionados.

[0241 ]Histopatologia (mancha H&E). Os tecidos são coletados e fixados em 10% de formalina tamponada neutra, então, processados e embebidos em parafina. Seções de parafina de 5 μm são preparadas e manchadas com hematoxilina e eosina (H&E) com o uso de procedimentos padrão.

[0242]Imunoistoquímica (LAMP-1). As lâminas desparafinizadas são incubadas de um dia para o outro com IgG anti-LAMP-1 de rato (Santa CruzBiotechnology) como o anticorpo primário ou IgG2a de rato como um anticorpo de controle (AbDSerotec, Raleigh, NC). Após a incubação de um dia para outro a 2 a 8 °C, IgG antirrato de coelho biotinilado (H&L)camundongo adsorvido (Vector Laboratories) é adicionada. Após 30 minutos de incubação a 37 °C, as amostras são lavadas e, então, tratadas com complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories) por 30 minutos. A proteína identificada é localizada por incubação com 3,39-diaminobenzidina. A área de células positivas para LAMP-1 é analisada com software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD).

[0243]Medições de GAG. Extratos de tecido são preparados homogeneizando-se tecido em um tampão de lise (10 mM de Tris, 5 mM de EDTA, 0,1% de Igepal CA-630, 2 mM de Pefabloc SC) com o uso de um triturador de vidro (Kontes Glass Company, Vineland, NJ) ou um homogeneizador de tecido motorizado (PowerGen Model 125, Omni International, Warrenton, VA). Os homogenatos são, então, submetidos a 5 ciclos de congelamento-descongelamento com o uso de um banho de etanol/gelo seco e um banho de água a 37 °C. Detritos de tecido são peletizados duas vezes por centrifugação à temperatura ambiente a 2.000 g por 12 minutos, e os sobrenadantes são coletados e analisados quanto à concentração total de proteína (mg/ml) com o uso de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL).

[0244]A concentração de GAG na urina e nos extratos de tecido é quantificada por um ensaio colorimétrico com o uso de corante azul de 1,9- dimetilmetileno (DMB) e uma curva padrão (1,56 a 25 μg/ml) preparada a partir de sulfato de dermatano (MP Biomedicals, Aurora, OH). Amostras de urina são testadas em diluições de 1/10, 1/20 e 1/40. Para evitar a interferência de ensaio de proteína, amostras de extrato de tecido são diluídas a concentrações de proteína de < 200 μg/ml. As concentrações de GAG na urina são ajustadas para concentrações de creatinina medidas com um kit comercialmente disponível (Sigma, St. Louis, MO, parte n° 555A) para compensar as diferenças em função renal e expressas como μg de GAG/mg de creatinina. Os níveis de GAG em extratos de tecido são ajustados para concentração de proteína (μg de GAG/mg de proteína) ou grama de tecido.

Claims

1. Proteína de fusão p97 (melanotransferrina) CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polipeptídeo iduronato-2-sulfatase (IDS) fundido ao N- terminal de um polipeptídeo p97 e um ligante peptídico opcional (L) entre os mesmos, em que o polipeptídeo p97 consiste na sequência de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

2. Proteína de fusão p97 (melanotransferrina) CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polipeptídeo iduronato-2-sulfatase (IDS) fundido ao C- terminal de um polipeptídeo p97 e um ligante peptídico opcional (L) entre os mesmos, em que o polipeptídeo p97 consiste na sequência de aminoácidos DSSHAFTLDELR.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo iduronato-2-sulfatase (IDS) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33.

4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante compreende a sequência de aminoácidos (EAAAK)1-3.

5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante tem a sequência de aminoácidos (EAAAK)3.

6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende uma sequência de peptídeo sinal N-terminal (SP).

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende uma etiqueta de purificação (TAG).

8. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende um sítio de protease (PS).

9. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a composição farmacêutica é estéril e não pirogênica.

10. Uso da proteína de fusão, como definida na reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença de depósito lisossômico em um indivíduo em necessidade do mesmo.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença de depósito lisossômico é Síndrome de Hunter (MPS II).

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença de depósito lisossômico tem envolvimento do sistema nervoso central (SNC).

13. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo está sob risco de desenvolver envolvimento do SNC da doença de depósito lisossômico.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um homem humano.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ou a composição farmacêutica é formulada para ser administrada por infusão intravenosa (IV).