ES2658154T3 - Uso de ICAM-1 para la prevención o el tratamiento de enfermedades neurológicas - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad neurológica, que comprende una proteína ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular 1), o un fragmento o una variante de la misma, como ingrediente activo, en la que la enfermedad neurológica es una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, epilepsia y deterioro cognitivo leve, y es provocada por al menos uno seleccionado entre el grupo que consiste en la formación de placa beta-amiloide en neuronas, la reducción de la expresión de neprilisina en neuronas y una combinación de los mismos.

Description

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En otro aspecto, las composiciones y los procedimientos que se describen en el presente documento comprenden uno o más polipéptidos de ICAM-1 unidos a una célula. En una realización, uno o más polipéptidos de ICAM-1 se unen covalentemente a una célula. En otra realización, los polipéptidos se embeben en la membrana celular. Una célula incluye, pero no se limita a, célula de mamífero, célula bacteriana, célula fúngica o una célula de insecto. En una realización, una célula es una célula humana. En otra realización, una célula es una célula madre humana. En otra realización, una célula es una célula madre mesenquimatosa humana. En otra realización, una célula es una célula del estroma humano. En otra realización, una célula es una célula sanguínea de cordón umbilical. Una célula sanguínea de cordón umbilical útil para las composiciones y los procedimientos que se describen en el presente documento incluye, pero no se limita a, células que normalmente se encuentran en, o se cultivan a partir de, las células que normalmente se encuentran en el cordón umbilical, la sangre de cordón umbilical, el saco amniótico y la placenta.

En otro aspecto, las composiciones y los procedimientos que se describen en el presente documento comprenden uno o más polipéptidos de ICAM-1 y una célula que secreta polipéptidos de ICAM-1.

En otro aspecto, las composiciones y los procedimientos que se describen en el presente documento comprenden uno o más polipéptidos de ICAM-1 conjugados con otro material biológico. Un material biológico incluye, pero no se limita a, diversos péptidos pequeños, otra proteína, un medio químico útil para aislar o identificar polipéptidos conjugados (conocido como "marcador" en la técnica).

En un aspecto, los polipéptidos de ICAM-1 que se describen en el presente documento se aíslan a partir de un organismo, tejidos o células. En una realización, la ICAM-1 se aísla a partir de células madre mesenquimatosas (CMM) o un cultivo de las mismas. Los ejemplos de la fuente de células madre mesenquimatosas incluyen, pero no se limitan a, el saco vitelino embrionario, la placenta, el cordón umbilical, la sangre de cordón umbilical, la piel, la sangre periférica, la médula ósea, el tejido adiposo, el músculo, el hígado, el tejido neural, el periostio, la membrana fetal, la membrana sinovial, el líquido sinovial, la membrana amniótica, el menisco, el ligamento cruzado anterior, los condrocitos articulares, los dientes de leche, los pericitos, el hueso trabecular, la almohadilla de grasa infra patelar, el bazo y el timo. En una realización, una fuente de CMM es una CMM derivada de sangre del cordón umbilical o una CMM derivada de médula ósea.

En el presente documento se describe un procedimiento de aislamiento de CMM de sangre del cordón umbilical. En una realización, la ICAM-1 se aísla recogiendo CMM derivadas de sangre de cordón umbilical. En una realización, se aíslan CMM derivadas de sangre del cordón umbilical mediante centrifugación. En otra realización, se aíslan CMM derivadas de sangre del cordón umbilical mediante clasificación de células activada por fluorescencia. En otra realización, se aíslan CMM derivadas de sangre del cordón umbilical mediante el uso de diversos marcadores incluyendo perlas magnéticas. En otra realización, se aíslan CMM derivadas de sangre del cordón umbilical mediante el uso de anticuerpos específicos de CMM. En algunos aspectos, pueden usarse otros procedimientos de separación y aislamiento de células. Estos procedimientos, que son bien conocidos en la técnica, incluyen, pero no se limitan a, separación por tamaño, peso o forma de una célula, diferencias en los tipos de moléculas de superficie celular, resistencia o atracción a productos químicos, proteínas u otras células y otras propiedades físicas o químicas útiles para distinguir las CMM de la no CMM.

En un aspecto, la ICAM-1 se produce mediante una tecnología de ADN recombinante. En una realización, se clonan ácidos nucleicos que codifican ICAM-1 o un fragmento de la misma en un sistema de expresión recombinante adecuado. En una realización, un sistema de expresión recombinante es un sistema de expresión bacteriano. En otra realización, un sistema de expresión recombinante es un sistema de expresión de células de insectos. En otra realización, un sistema de expresión recombinante es un sistema de expresión de mamífero. En una realización, un sistema de expresión recombinante bacteriano es un sistema de expresión de vector pET. En una realización, un vector pET útil para expresar ICAM-1 que se describe en el presente documento es el ADN plasmídico pET-28a. En otra realización, un sistema de expresión recombinante bacteriano útil para composiciones que se describen en el presente documento es un vector pET que contiene ácidos nucleicos que codifican una ICAM-1 que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. NO.: 2 (N.º de Referencia de GenBank NM_000201) o un fragmento de la misma: caagcttagcctggccgggaaacgggaggcgtggaggccgggagcagcccccggggtcatcgccctgccaccgccgcccgattgcttt agcttggaaattccggagctgaagcggccagcgagggaggatgaccctctcggcccgggcaccctgtcagtccggaaataactgcagca tttgttccggaggggaaggcgcgaggtttccgggaaagcagcaccgccccttggcccccaggtggctagcgctataaaggatcacgcgc cccagtcgacgctgagctcctctgctactcagagttgcaacctcagcctcgctatggctcccagcagcccccggcccgcgctgcccgcact cctggtcctgctcggggctctgttcccaggacctggcaatgcccagacatctgtgtccccctcaaaagtcatcctgccccggggaggctcc gtgctggtgacatgcagcacctcctgtgaccagcccaagttgttgggcatagagaccccgttgcctaaaaaggagttgctcctgcctggga acaaccggaaggtgtatgaactgagcaatgtgcaagaagatagccaaccaatgtgctattcaaactgccctgatgggcagtcaacagctaa aaccttcctcaccgtgtactggactccagaacgggtggaactggcacccctcccctcttggcagccagtgggcaagaaccttaccctacgc tgccaggtggagggtggggcaccccgggccaacctcaccgtggtgctgctccgtggggagaaggagctgaaacgggagccagctgtg ggggagcccgctgaggtcacgaccacggtgctggtgaggagagatcaccatggagccaatttctcgtgccgcactgaactggacctgcg gccccaagggctggagctgtttgagaacacctcggccccctaccagctccagacctttgtcctgccagcgactcccccacaacttgtcagc ccccgggtcctagaggtggacacgcaggggaccgtggtctgttccctggacgggctgttcccagtctcggaggcccaggtccacctggc actgggggaccagaggttgaaccccacagtcacctatggcaacgactccttctcggccaaggcctcagtcagtgtgaccgcagaggacg agggcacccagcggctgacgtgtgcagtaatactggggaaccagagccaggagacactgcagacagtgaccatctacagctttccggcg cccaacgtgattctgacgaagccagaggtctcagaagggaccgaggtgacagtgaagtgtgaggcccaccctagagccaaggtgacgct

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(continuación)

Gen diana

Secuencia de cebador Temperatura de hibridación (ºC) Tamaño del producto de PCR (pb)

Fragmento C

5’-CCGCCGCATATGCAGACATCTGTGTCCCCC-3’ (SEQ ID NO: 5) 5’-CGGGGATCCTCATCACTCCTGGCTCTGGTTCCC-3’ (SEQ ID NO: 8) 60 846

Fragmento D

5’-CCGCCGCATATGCAGACATCTGTGTCCCCC-3’ (SEQ ID NO: 5) 5’-CGGCGGGGATCCTCATCAAAACAGCTCCAGCCC-3’ (SEQ ID NO: 9) 60 549

El fragmento A preparado de este modo codifica los aminoácidos 28º a 483º en la secuencia de aminoácidos de la proteína ICAM-1; el fragmento B, los aminoácidos 28º a 380º; el fragmento C, los aminoácidos 28º a 300º; y el fragmento D, los aminoácidos 28º a 200º.

Los tamaños de los fragmentos de ICAM-1 preparados se confirmaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2 % (Invitrogen, EE.UU.). Los resultados de la electroforesis se muestran en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5, se confirmó que cuatro fragmentos tenían los tamaños precisos.

Los fragmentos se purificaron usando un Kit de Extracción en Gel (QIAGEN, EE.UU.) y se mezclaron con ADN plasmídico pET-28a (Novagen®, EE.UU.) tratado con NdeI/βamHI, seguido de ligadura con ADN ligasa T4 (NEB, EE.UU.). Se transformó E. coli BL21 (DE3) (Sigman, EE.UU.) con el plásmido ligado y el transformante se cultivó en medio de agar LB (BD, EE.UU.). Se recogieron las colonias individuales proliferadas, se colocaron en cada tubo de PCR y después se sometieron a una reacción PCR. Los insertos amplificados se confirmaron mediante una electroforesis como anteriormente (Figura 6), para seleccionar colonias. Las colonias escogidas se cultivaron en caldo LB (BD, EE.UU.) y se purificaron usando un Kit de Purificación de Plásmidos QIAGEN® (QIAGEN, EE.UU.) para obtener ADN. Los ADN purificados se digirieron con NdeI y βamHI y después se confirmaron de nuevo colonias individuales que contenían los genes deseados en gel de agarosa al 2 % con EtBr. Los ADN se purificaron usando un Kit de Purificación por PCR (QIAGEN, EE.UU.) y se confirmaron las secuencias precisas de los fragmentos insertados. Las colonias de las que se confirmó la secuencia de ADN se cultivaron en caldo LB en presencia de IPTG (Promega, EE.UU.). El cultivo resultante se centrifugó y las células precipitadas se trataron con urea 8 M (pH 8,0) para lisar las células. La proteína recombinante se separó usando agarosa Ni-NTA (níquel-ácido nitrilotriacético) (QIAGEN, EE.UU.) basándose en la unión entre 6X His unida al extremo N de la proteína recombinante y Ni-NTA, y se confirmó mediante EGPA-DDS y transferencia western.

Ejemplo de Preparación 1: Formulación para inyección

Para preparar una formulación para inyección, se disolvieron 100 mg de proteína ICAM-1 en agua y después se mezclaron con 10 ml de solución salina estéril al 0,9 %. La mezcla se incorporó en una forma de dosificación unitaria adecuada para la inyección.

Ejemplo de Preparación 2: Formulación para inhalación

Para preparar una formulación para la administración por inhalación, se mezclaron 20 mg de proteína ICAM-1 con 50 mg de ácido cítrico anhidro y 100 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9 %. La mezcla se incorporó en una unidad de entrega por inhalación, tal como un nebulizador, que es adecuada para la administración por inhalación.

Ejemplo de Preparación 3: Formulación para entrega nasal

Para preparar una solución de pulverización nasal, se mezclaron 10 g de proteína ICAM-1 con 30 ml de una solución de tampón fosfato 0,05 M (pH 4,4). La solución se colocó en un administrador nasal diseñado para entregar 100 µl de pulverización para cada aplicación.

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Claims (1)

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