ES2646550T3 - Anticuerpos contra la proteína accesoria del receptor de interleucina-1 humana (IL1RAP) y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra la proteína accesoria del receptor de interleucina-1 humana (IL1RAP) y usos de los mismos Download PDF

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Thoas Fioretos
Marcus JÄRÅS
Cecilia Ann-Christin Malmborg Hager
Kjell SJÖSTRÖM
Agneta Svedberg
Karin Von Wachenfeldt
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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo con especificidad de unión por la proteína accesoria del receptor de Interleucina-1 humana (IL1RAP), que comprende: (i) una región variable de cadena pesada que comprende los tres CDR de una región variable como se define por SEQ ID NO: 1 o de una versión humanizada de la misma como se define mediante la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11 e (ii) una región variable de cadena ligera que comprende los tres CDR de una región variable como se define por SEQ ID NO: 2 o de una versión humanizada de la misma como se define mediante la SEQ ID NO: 15, 16 o 17.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos contra la protefna accesoria del receptor de interleucina-1 humana (IL1RAP) y usos de los mismos Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a agentes a base de anticuerpos para el tratamiento y diagnostico de enfermedades y afecciones asociadas a un biomarcador de IL-1 (especfficamente, IL1RAP) y/o que responde a la inhibicion de la senalizacion de IL-1. En particular, se proporcionan agentes a base de anticuerpos para el tratamiento y diagnostico de canceres, incluyendo pero sin limitacion a leucemia mieloide cronica (LMC), leucemia mieloide aguda (LMA) y canceres asociados a la formacion de tumor solido (tal como melanoma, cancer de pulmon, y cancer de la mama).
Antecedentes de la invencion
Biologfa de la interleucina-1
La interleucina-1 (IL-1) es una potente citocina proinflamatoria que puede ser producida por varios tipos de celulas, incluyendo fagocitos mononucleares, en respuesta a infeccion e inflamacion. La familia de la IL-1 consiste en siete agonistas, incluyendo IL-1a y IL-1 p, y tres antagonistas naturales del receptor, incluyendo el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 Ra) (Dinarello, CA, Blood 1996, 87(6): 2095-147). Se han identificado dos receptores de IL-1, IL-1R tipo I y IL-1R tipo II. Ambos receptores pueden interactuar con las tres formas de las moleculas de la familia de IL-1. El IL-1RI es responsable de mediar la actividad celular inducida por IL-1. Sin embargo, el complejo IL-1 / IL-1RI no puede enviar senales por si mismo, sino que es dependiente de la asociacion a una segunda cadena receptora, la protefna accesoria de IL-1R (IL1RAP) (Dinarello, CA, Blood 1996, 87(6): 2095-147). En contraste a IL-1RI, el IL-1RII no induce activacion celular con la union a IL-1 y entonces el IL-1RII funciona como un receptor regulador senuelo, llevando a una disminucion neta en la IL-1 disponible para unirse al IL-1RI.
Ademas de la senalizacion de IL1, la IL1RAP es crftica para mediar los efectos de IL33, a traves del complejo ST2/IL1RAP, y la IL36, a traves del complejo IL1Rrp2/MRAP (Garlanda et al., Immunity, 12 de diciembre de 2013;39(6): 1003-18).
La IL-1 es una potente citocina proinflamatoria, que es inducida en sitios de infeccion o inflamacion local y esta involucrada en la regulacion de varios eventos fisiologicos y celulares (resumido en Dinarello CA, CHEST, 2000, 118: 503-508 y Dinarello, CA, Clin Exp Rheumatol, 2002, 20(5 Supl 27): S1-13). Es capaz de activar muchos tipos de celulas incluyendo leucocitos y celulas endotelilales. La IL-1 induce y amplifica las respuestas inmunologicas al promover la produccion y expresion de moleculas de adhesion, citocinas, quimiocinas y otros mediadores inflamatorios tales como prostaglandina E2 y oxido nftrico (NO). En consecuencia, se amplifica y se sostiene la inflamacion local. Ademas, la produccion inducida por IL-1 de mediadores inflamatorios resulta en fiebre, dolor de cabeza, hipotension y perdida de peso. Ademas, la IL-1 es un factor de crecimiento hematopoyetico y ha mostrado reducir el nadir de leucocitos y plaquetas en pacientes durante el trasplante de medula osea. La IL-1 tambien ha mostrado promover la angiogenesis al inducir la produccion de factor de crecimiento endotelial vascular, promoviendo asf la formacion de pannus y suministro sangufneo en las articulaciones reumaticas. Finalmente, la IL- 1 ha mostrado promover la degradacion osea y de cartflago en enfermedades reumaticas.
El papel de la IL-1 en las enfermedades
La IL-1 esta implicada en un amplio intervalo de enfermedades y afecciones que varfan desde gota hasta cancer (para revisiones, vease Dinarello et al., 2012, Nature Reviews 11:633-652 y Dinarello, 2014, Mol. Med. 20 (supl. 1):S43-S58; incluyendo:
• enfermedades de articulaciones, huesos y musculo, tales como artritis reumatoide y artrosis;
• enfermedades autoinflamatorias sistemicas hereditarias, tales como fiebre mediterranea familiar;
• enfermedades autoinflamatorias sistemicas, tales como artritis idiopatica juvenil sistemica y enfermedad de Still de inicio en adultos;
• enfermedades inflamatorias comunes, tales como gota y diabetes tipo 2;
• enfermedades isquemicas de inicio agudo, tales como infarto al miocardio; y
• cancer.
Varias terapias para bloquear la actividad de IL-1 estan siendo aprobadas y en desarrollo. El direccionamiento a IL-1 comenzo en 1993 con la introduccion de anakinra (Kineret, Amgen), una forma recombinante del antagonista del receptor de natural (IL-1Ra), que bloquea la actividad tanto de IL-1 a como de IL-1 p; este agente terapeutico ha sido usado desde entonces para demonstrar un papel para IL-1 en muchas enfermedades (vease lo anterior). El Anakinra actualmente domina el campo de los agentes terapeuticos de IL-1 debido a su propio record de seguridad, semivida corta y multiples rutas de administracion. La neutralizacion de IL-1 con anticuerpos o receptores solubles tambien ha demostrado ser eficaz, y el receptor soluble senuelo rilonacept (Arcalyst, Regeneron) y el anticuerpo monoclonal
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neutralizante anti-IL-1 p canakinumab (Haris, Novartis) ahora ha sido aprobado. Otros enfoques terapeuticos, incluyendo la neutralizacion de IL-1a, una vacuna terapeutica dirigida a IL-1p y un IL-IRa quimerico, estan en ensayos clfnicos tempranos. Ademas, se han desarrollado los inhibidores de la molecula pequena oralmente activa de la produccion de L-1, tales como los inhibidores de caspasa 1, y estan siendo probados.
IL1RAP como un biomarcador para trastornos neoplasicos
Los biomarcadores de tumor son protefnas endogenas o metabolitos cuyas cantidades o modificaciones indican el estado del tumor, las caracterfsticas de la progresion, y la respuesta a terapias. Estan presentes en los tejidos del tumor o en los fluidos corporales y comprenden una amplia variedad de moleculas, incluyendo factores de transcripcion, receptores de la superficie celular, y protefnas secretadas. Los marcadores de tumor efectivos tienen mucha demanda porque tienen el potencial de reducir las tasas de mortalidad por cancer al facilitar el diagnostico de canceres en etapas tempranas y al ayudar a individualizar los tratamientos. Durante la ultima decada, una mejor compresion de la carcinogenesis y progresion del tumor ha revelado un gran numero de marcadores potenciales de tumor. Se predice que incluso mas seran descubiertos en el futuro cercano con la aplicacion de las tecnologfas actuales tales como microarreglos de tejidos, arreglos de anticuerpos, y espectrometrfa de masa.
La protefna accesoria del receptor de Interleucina-1 (IL1RAP) ha sido identificado previamente como biomarcador de la superficie celular asociado con trastornos neoplasicos hematologicos tales como leucemia mieloide cronica (LMC), leucemia mieloide aguda (LMA) y sfndromes mielodisplasicos (SMD) (por ejemplo, vease el documento WO 2011/021014 de Cantargia AB, Jaras et al., 2010, Proc NatI Acad Sci EE.UU. 107(37):16280-5, Askmyr et al., 2013, Blood. 121(18):3709-13 y Barreyro et al., 2012, Blood 120(6):1290-8). Mas recientemente, tambien se ha revelado la utilidad de la IL1RAP como un biomarcador de diagnostico y terapeutico para tumores solidos, tales como melanomas, (vease el documento WO 2012/098407 de Cantargia AB).
El documento WO 2012/098407 desvela agentes que comprenden o consisten en un resto de union con especificidad por la protefna accesoria del receptor de interleucina-1 (IL1RAP) para su uso en la induccion de la muerte celular y/o la inhibicion del crecimiento y/o la proliferacion de las celulas asociadas a un tumor solido, en el que las celulas expresan IL1RAP. El documento WO 2012/098407 tambien desvela agentes que comprenden o consisten en un resto de union con especificidad por la protefna accesoria del receptor de interleucina-1 (IL1RAP) para su uso en la deteccion de celulas patologicas asociadas a un tumor solido, en el que las celulas expresan IL1RAP. El documento WO 2012/098407 desvela ademas composiciones farmacologicas que comprenden los agentes y metodos desvelados de uso de las mimas.
La presente invencion entonces busca proporcionar anticuerpos mejorados para uso en el diagnostico y tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas al biomarcador de IL1RAP y/o que responden a la inhibicion de la senalizacion de IL-1 y/o IL-33.
Sumario de la invencion
Un primer aspecto de la invencion proporciona un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo (“polipeptidos de anticuerpo”) segun lo definido en las reivindicaciones del presente documento con especificidad de union para la protefna accesoria del receptor de Interleucina-1 (“IL1RAP”), en donde el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno es capaz de inhibir la union del anticuerpo “CAN04” de referencia a la IL1RAP humana.
Por "protefna accesoria del receptor de Interleucina-1", "IL1RAP" y "IL1-RAP" especfficamente se incluye la protefna humana IL1RAP, por ejemplo como se describe en el n.° de Acceso de GenBank AAB84059, Secuencia de Referencia de NcBi: NP_002173.1 y n.° de Acceso de UniProtKB/Swiss-Prot. Q9NPH3-1 (vease tambien Huang et al., 1997, Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94 (24), 12829-12832). La IL1RAP es tambien conocida en la literatura cientffica como IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL-IRAcP y EG3556.
Entonces, los polipeptidos de anticuerpo de la invencion tienen especificidad para IL1RAP. Por "especificidad" se quiere decir que el polipeptido de anticuerpo es capaz de unirse a IL1RAP in vivo, es decir, bajo las condiciones fisiologicas en las que existe la IL1RAP dentro del cuerpo humano. Preferiblemente, el polipeptido de anticuerpo no se une a ninguna otra protefna in vivo. Tal especificidad de union puede ser determinada por metodos bien conocidos en la tecnica, tal como ELISA, inmunohistoqufmica, inmunoprecipitacion, transferencias Western y citometrfa de flujo usando celulas transfectadas que expresan IL1RAP. Ventajosamente, el polipeptido de anticuerpo es capaz de unirse selectivamente a IL1RAP, es decir, se une al menos 10 veces mas fuertemente a IL1RAP que cualquier otra protefna.
Por "anticuerpo CAN04” de referencia”" se incluye un anticuerpo IgG intacto que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. A menos que se indique de otro modo, las referencias en la presente a "CAN04" se refieren a un anticuerpo IgG intacto que comprende (a) una cadena pesada que comprende una region variable como se define por sEq ID NO:1 y una region constante como se define por SEQ ID NO: 19, y (b) una cadena ligera que comprende una region variable como se define por SEQ ID NO:2 y una region constante como se define por SEQ ID NO: 18. Como alternativa, una
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version humanizada de CAN04 (“hCAN04”) puede usarse como el anticuerpo de referencia. Por ejemplo, el anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo IgG intacto que comprende (s) una cadena pesada que comprende una region variable como se define por cualquiera de SEQ ID NO:8 a 11 y una region constante como se define por SEQ ID NO: 19, y (b) una cadena ligera que comprende una region variable como se define por cualquiera de SEQ ID NO:15 a 17 y una region constante como se define por SEQ ID NO: 18.
Como se discute despues, el anticuerpo “CAN04” de referencia” se une al dominio 2 de IL1RAP. Entonces, sera apreciado que el anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno de la invencion tambien se unen al dominio 2 de IL1RAP
Por "capaz de inhibir la union del anticuerpo “CAN04” de referencia” a IL1RAP humana" se quiere decir que la presencia de los polipeptidos de anticuerpo de la invencion inhiben, totalmente o en parte, la union de “CAN04” a la IL1RAP humana. Tal inhibicion de union competitiva puede ser determinada usando ensayos y metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo usando placas BIAcore con IL1 RAP inmovilizada e incubando con el anticuerpo “CAN04” de referencia” con y sin un polipeptido de anticuerpo a ser probado. Como alternativa, puede usarse un enfoque de mapeo por pares, en el que el anticuerpo “CAN04” de referencia” se inmoviliza en la superficie de la placa de BIAcore, el antfgeno de IL1RAP se une al anticuerpo inmovilizado, y luego un segundo anticuerpo se prueba para la capacidad de union simultanea a IL1RAP (vease “BIAcore Assay Handbook”, GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012).
En una alternativa adicional, la inhibicion de union competitiva puede ser determinada usando citometrfa de flujo por ejemplo, para probar si un anticuerpo de prueba es capaz de inhibir la union del anticuerpo CAN04 de referencia a un antfgeno de superficie celular, las celulas que expresan el antfgeno pueden ser preincubadas con el anticuerpo de prueba por 20 min antes de que las celulas sean lavadas e incubadas con el anticuerpo CAN04 de referencia conjugado a un fluoroforo, que puede ser detectado por citometrfa de flujo. Si la preincubacion con el anticuerpo de prueba reduces la deteccion del anticuerpo CAN04 de referencia en la citometrfa de flujo, el anticuerpo de prueba inhibe la union del anticuerpo de referencia al antfgeno de la superficie celular. Si el anticuerpo a ser probado exhibe alta afinidad por IL1RAP, puede usarse entonces un periodo reducido de preincubacion (o incluso no hacer preincubacion).
En una alternativa adicional, la inhibicion de union competitiva puede ser determinada usando un ELISA (por ejemplo como se describe en el Ejemplo J).
Por "un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo" se incluye sustancialmente las moleculas de anticuerpo intacto, asf como anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos aislados, anticuerpos de una cadena, anticuerpos biespecfficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodfmeros y heterodfmeros de cadenas pesada y/o ligera de anticuerpos, y fragmentos de union a antfgeno y derivados de los mismos. Fragmentos de union a antfgeno y derivados adecuados incluyen, pero no se limitan necesariamente a, fragmentos de Fv (por ejemplo, Fv de una cadena y Fv unido a bisulfuro), fragmentos tipo Fab (por ejemplo fragmentos Fab, fragmentos Fab” y fragmentos F(ab)2), dominios de una variable (por ejemplo dominios de Vh y Vl) y anticuerpos de dominio (dAbs, incluyendo formatos simples y dobles [es decir, dAb- enlazador-dAb]). Las ventajas potenciales de usar fragmentos de anticuerpo, mas que anticuerpos enteros, son muchas veces. El menor tamano de los fragmentos puede llevar a mejores propiedades farmacologicas, tales como mejor penetracion de tejido solido. Mas aun, los fragmentos de union a antfgeno tales como fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse en y secretarse de E coli, facilitando asf la facil produccion de grandes cantidades de dichos fragmentos.
La expresion "un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo" tambien pretende comprender imitadores de anticuerpo (por ejemplo, estructuras de andamiaje sin anticuerpo que tienen un alto grado de estabilidad pero que permiten la variabilidad de ser introducidos en ciertas posiciones). Los expertos en la tecnica de la bioqufmica estaran familiarizados con muchas de esas moleculas, como se discute en Gebauer y Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-255. Imitadores de anticuerpos a modo de ejemplo incluyen: aficuerpos (tambien llamados Trinectinas; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLDs (tambien llamados Tetranectinas; Innovations Pharmac Technol. (2006), 27-30); adnectinas (tambien llamadas monocuerpos; Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95109); anticalinas (Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPins (ankirinas; Nat Biotechnol (2004), 22, 575582); avfmeros (Nat Biotechnol (2005), 23, 1556-1561); microcuerpos (FeBS J, (2007), 274, 86-95); aptameros de peptido (Expert. Opin. Biol. Ther (2005), 5, 783-797); dominios de Kunitz (J Pharmacol. Exp. Ther (2006) 318, 803809); afilinas (Trends. Biotechnol (2005), 23, 514-522); affmeros (Avacta Life Sciences, Wetherby, RU).
Tambien se describen en el presente documento los receptores quimericos de los linfocitos T (tambien conocidos como receptores quimericos de linfocitos T, inmunorreceptores quimericos, y receptores quimericos de antfgenos o CAR) (vease Pule et al., 2003, Cytotherapy 5(3):211-26). Estos son receptores disenados, que injertan una especificidad arbitraria sobre una celula efectora inmune. Normalmente, los CARs se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal sobre un linfocito T; con la transferencia de su secuencia codificadora facilitada por vectores retrovfricos. La forma mas comun de esas moleculas son las fusiones que comprenden un fragmento variable de una cadena (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal fusionado a transmembrana y
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endodominio de CD3-zeta. Cuando los linfocitos T expresan su molecula de fusion, reconocen y eliminan las celulas diana que expresan la especificidad transferida del anticuerpo monoclonal.
Los expertos en la tecnica apreciaran ademas que la invencion tambien abarca las versiones modificadas de los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de los mismos, por ejemplo, modificado por la union covalente de polietilenglicol u otro polimero adecuado (vease lo siguiente).
Los metodos para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser generados a traves de cualquiera de muchos metodos que emplean la induccion de la produccion in vivo de moleculas de anticuerpo, investigadas de bibliotecas de inmunoglobulina (Orlandi. et al., 1989. Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) o generacion de moleculas de anticuerpo monoclonal por lineas celulares moleculas en cultivo. Estos incluyen, pero no se limitan a, la tecnica del hibridoma, la tecnica del hibridoma de linfocitos B humanos, y la tecnica de virus de Epstein-Barr (EBV)-hibridoma (Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).
Los metodos adecuados para la produccion de anticuerpos monoclonales tambien se revelan en ''Monoclonal Antibodies: A manual of techniques'', H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies; Techniques and Applications" J G R Hurrell (CRC Press, 1982).
Del mismo modo, los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, cuyas revelaciones se incorporan en la presente como referencia). Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo segun la presente invencion pueden ser preparados por hidrolisis proteolitica del anticuerpo o por expresion en E coli o celulas de mamifero (por ejemplo cultivo de celulas de ovario de hamster Chino u otro sistema de expresion de proteinas) de ADN que codifica al fragmento. Como alternativa, los fragmentos de anticuerpo pueden ser obtenidos por digestion con pepsina o papaina de anticuerpos enteros por metodos convencionales.
Los anticuerpos de la invencion se definen con referencia a las regiones variables de un anticuerpo derivado de murino, designado “CAN04”, que comprende:
(a) una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de
Q
V Q L Q Q S G PELLKPGASVK I S C K A S
G
Y A F S S S W MNWVKQRPGK G L E W I
G
R
I Y P G D G N THYSGKFKGKA T L T A D K
S
S
S
I A Y M Q LSSLTSEDSAV Y F C G E G
Y
L D P M D Y W GQGTSVTVSS
[SEQID NO:1]
y
(b) una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2:
D
I Q M T Q T T S S L S A S L G D R V T I S C S A
S
Q G I N N Y L N W Y Q Q K P D G T V K L L I H Y
T
S G L H A G V P s R F S G S G S G T D Y S L T I
S
N L E P E D V A T Y Y C Q Q Y : S I L P W T F G
G
G
T K L E I K R
[SEQ ID NO:2]
El termino "aminoacido" como se usa en la presente incluye los veinte aminoacidos estandar codificados
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geneticamente y sus correspondientes estereoisomeros en la forma “D” (en comparacion a la forma natural “L”), aminoacidos omega y otros aminoacidos naturales, aminoacidos no convencionales (por ejemplo aminoacidos a,a- bisustituidos, N-alquil aminoacidos, etc.) y aminoacidos qufmicamente derivatizados (vease lo siguiente).
Cuando un aminoacido se enumera especfficamente, tal como "alanina" o "Ala" o "A", el termino se refiere tanto a la L-alanina como a la D-alanina a menos que explfcitamente se indique de otro modo. Otros aminoacidos no convencionales tambien pueden ser componentes adecuados para los polipeptidos de la presente invencion, en tanto que se retenga la propiedad funcional deseada por el polipeptido. Para los peptidos mostrados, cada residuo de aminoacido codificado, cuando sea apropiado, se representa por la designacion de una sola letra, correspondiente al nombre trivial del aminoacido convencional.
En una realizacion, los polipeptidos de anticuerpo como se definen en la presente comprenden o consisten en L- aminoacidos.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que cualquier anticuerpo IgG intacto que comprende las regiones variables anteriores puede ser usado como el anticuerpo de referencia para identificar los polipeptidos de anticuerpo de la invencion que inhiben competitivamente la union de CAN04 a IL1RAP.
Entonces, en una realizacion, el anticuerpo CAN04 usado como una referencia para un enlazador competitivo determinado es un anticuerpo IgG intacto que comprende:
(a) una cadena pesada que comprende un dominio variable de SEQ ID NO: 1 injertado en una region constante de IgG1 o IgG2a de murino
(b) una cadena ligera que comprende un dominio variable de SEQ ID NO: 2 injertado en una region constante kappa de murino.
Como alternativa, el anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo IgG intacto quimerico que comprende:
(a) una cadena pesada que comprende un dominio variable de SEQ ID NO: 1 injertado en una region constante de IgG1 humana (por ejemplo, como se codifica por el vector pFUSEss-CHIg-hGl de InvivoGen, San Diego, EE.UU.)
(b) una cadena ligera que comprende un dominio variable de SEQ ID NO: 2 injertado en una region constante kappa humana (por ejemplo, como se codifica por el vector pFUSE2ss-CLIg-hk de InvivoGen, San Diego, EE.UU.).
La union competitiva normalmente surge porque el anticuerpo de prueba se une a, o al menos muy cerca del epftopo en el antfgeno al que se une el anticuerpo de referencia (en este caso, CAN04). Sin embargo, sera apreciado por los expertos en la tecnica que la union competitiva puede tambien surgir en virtud de la interferencia esterica; entonces, el anticuerpo de prueba puede unirse a un epftopo diferente de ese al que se une el anticuerpo de referencia, pero puede ser aun de suficiente tamano o configuracion para impedir la union del anticuerpo de referencia al antfgeno.
Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de la presente invencion se identificaron despues de una extensa investigacion de un gran numero de anticuerpos anti-IL1RAP, con base en la exhibicion de propiedades que los hacen particularmente adecuados como agentes de diagnostico y terapeuticos para cancer.
Entonces, en una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno exhibe una o mas de las siguientes propiedades:
(a) una afinidad de union (Kd) para la IL1RAP humana de 200 pM o mayor, es decir, la Kd < 200 pM (por ejemplo, como se determina en el Ejemplo A);
(b) reactividad cruzada con IL1RAP de Macaca fascicuiaris (por ejemplo, como se determina en el Ejemplo D);
(c) una accion inhibidora en la senalizacion de IL1 (IL-1 a y/o IL-1p; por ejemplo, como se determina en el Ejemplo E);
(d) la capacidad de inducir citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos (ADCC) en una o mas lfneas celulares de cancer (tales como lfneas celulares de lMc, LLA y/o melanoma) (por ejemplo, como se determina en el Ejemplo F); y/o
(e) la capacidad de internalizacion con la union a una o mas lfneas celulares de cancer (tal como una lfnea celular de LMC, LMA y/o melanoma) (por ejemplo, como se determina en el Ejemplo G).
Ventajosamente, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno exhibe todas las propiedades anteriores.
En una realizacion alternativa, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno exhibe una o mas de las propiedades (a), (b), (c) y (e) anteriores, pero no es capaz de inducir ADCC.
El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno es capaz de unirse a un epftopo en el dominio extracelular de IL1 RAP
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que se superpone, al menos en parte, con el epftopo en IL1RAP al que el anticuerpo de referenda CAN04 es capaz de unirse. Entonces, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno puede ser capaz de unirse a un epftopo ubicado en/dentro del dominio 2 de ILlRAP (vease Wang et al., 2010, Nature Immunology, 11:905-912), es decir, dentro de los aminoacidos 135 a 234 de IL1RAP (vease el n.° de Acceso Q9NPH3 dentro de UniProtKB/Swiss-Prot). Por ejemplo, el epftopo en que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno puede ser ubicado dentro de los aminoacidos 135 a 154, 155 a 174, 175 a 194, 195 a 214 o entre los aminoacidos 215 a 234 de IL1RAP. Sin embargo, sera apreciado que el epftopo puede ser no lineal.
En una realizacion, el polipeptido de anticuerpo de la invencion comprende o consiste en un anticuerpo intacto (tal como un anticuerpo IgG1).
En una realizacion alternativa, el polipeptido de anticuerpo de la invencion comprende o consiste en un fragmento de union a antfgeno seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fv (por ejemplo Fv de una cadena y Fv unido a bisulfuro), fragmentos de tipo Fab (por ejemplo fragmentos Fab, fragmentos Fab” y fragmentos F(ab)2) y anticuerpos de dominio (por ejemplo dominios variables unicos de Vh o dominios variables de Vl).
En una realizacion preferida, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion comprende una region variable de cadena pesada que comprende los siguientes CDR:
a) GYAFSSS [SEQ ID NO: 3]
b) YPGDGN [SEQ ID NO: 4]; y
c) GYLDPMDY [SEQ ID NO: 5].
Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la correspondiente region del anticuerpo CAN04 de referencia, es decir, SEQ ID NO:1.
En otra realizacion preferida, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion comprende una region variable de cadena pesada que comprende los siguientes CDR:
a) GYAFSSSWMN [SEQ ID NO: 6];
b) RIYPGDGNTHYSGKFKG [SEQ ID NO: 7]; y
c) GYLDPMDY [SEQ ID NO: 5].
Por ejemplo, el polipeptido de anticuerpo puede comprender una region variable de cadena pesada que comprende los CDR de SEQ ID NO 6, 7 y 5.
Como se indico antes, el anticuerpo CAN04 de referencia es un anticuerpo de murino. Sin embargo, las cadenas pesada y ligera componentes de este anticuerpo pueden ser humanizadas para producir polipeptidos de anticuerpo mas adecuados para uso en seres humanos, por ejemplo debido a su inmunogenicidad reducida. Por ejemplo, los CDR de SEQ ID NO 3, 4 y 5 (o los CDR de SEQ ID NO 6, 7 y 5) pueden ser injertados en un marco de region variable humana.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que para terapia en seres humanos, se usan preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo de murino) son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo quimericos disenados geneticamente que tienen preferiblemente porciones mfnimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los que las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) se reemplazan por residuos de una region determinante de complementariedad de una especie no humana (anticuerpo de donador) tal como raton, rata o conejo que tiene la funcionalidad deseada. En algunos casos, los residuos de marco de Fv del anticuerpo humano se reemplazan por correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden tambien comprender residuos no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de marco o de region determinante de complementariedad. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de complementariedad corresponden a esas de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas, las regiones de marco corresponden a esas de una secuencia consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados optimamente tambien incluyen al menos una porcion de una region constante de anticuerpo, tal como una region Fc, normalmente derivada de un anticuerpo humano (vease, por ejemplo, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr Op. Struct Biol. 2:593-596).
Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica. En general, el anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacidos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos, llamados a menudo residuos importados, normalmente se toman de un dominio variable importado. La humanizacion puede realizarse esencialmente como se describe (vease, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al.,
1988, Science 239:1534-15361; documento US 4,816,567) al sustituir las regiones humanas determinantes de complementariedad con correspondientes regiones de roedor determinantes de complementariedad. En consecuencia, esos anticuerpos humanizados son anticuerpos quimericos, en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En 5 la practica, los anticuerpos humanizados pueden ser normalmente anticuerpos humanos en los que los residuos de la region determinante de complementariedad y posiblemente algunos residuos de marco se sustituyen por residuos de sitios analogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden tambien ser identificados usando varias tecnicas conocidas en la tecnica, 10 incluyendo bibliotecas de despliegue de fagos (vease, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991, J Mol. Biol 227:381; Marks et al., 1991, J Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, en: “Monoclonal antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, pag. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95).
Entonces, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de la invencion puede ser humanizado, por 15 ejemplo puede comprender una region variable de cadena pesada que tiene una de las siguientes secuencias de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO: 8 a 11:
a)
20
25
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV SCK ASGYAFSSSWMNWVRQAPGQGLE WMGRIYPGDGNTHYAQKFQGRVT LTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTVS S [SEQ ID NO: 8];
b)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCK ASGYAFTSSWMNWVRQAPGQGLE WMGRIYPGDGNTHYAQKFQGRVT LTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTVS S [SEQ ID NO: 9];
c)
Q
A
W
L
Y
S
VQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCK
SGYTFTSSWMNWVRQAPGKGLE
MGRIYPGDGQTHYAQKFQGRVT
TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV
YCGEGYLDPMDYWGQGTLVTVS
[SEQ ID NO: 10]; o
d)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV SCK ASGYTFTSSWMNWVRQAPGKGLE WMGRIYPGDGQTHYAQKFQGRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV YYCGEGYLDPM DYWGQGTLVTVS S [SEQID NO: 11].
5 En una realizacion preferida relacionada, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo comprende una region variable de cadena ligera que comprende los siguientes CDR:
a) SASQGINNYLN [SEQ ID NO: 12];
b) YTSGLHA [SEQ ID NO: 13]; y
10 c) QQYSILPWT [SEQ ID NO: 14].
Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la correspondiente region del anticuerpo CAN04 de referencia de murino, es decir, SEQ ID NO: 2.
15
Como en el caso de la region variable de cadena pesada detallada antes, sera apreciado que la region variable de cadena ligera del polipeptido de anticuerpo de la invencion puede ser humanizado para producir agentes mas adecuados para uso en seres humanos. Por ejemplo, los CDR de SEQ ID NO 12, 13 y 14 pueden ser injertados en un marco de region variable humana.
20
Entonces, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15 a 17 %:
25
a)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIT CS ASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLL IHYTSGLHAGVPSRFSGSGSGTD YTLTISSLQPEDVATYYCQQYSIL PWTFGGGTKVEIKR [SEQ ID NO: 15];
30 b)
DIQMTGSPSSLSASVGDRVTITCQ ASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLL IHYTSGLHAGVPSRFSGSGSGTD YTLTISSLEPEDVATYYCQQYSIL PWTFGGGTKVEIKR [SEQ ID NO: 16]; o
5
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c)
1
Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T 1 T C Q
s
Q G 1 N N Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L
H
Y T S G L H A G V P S R F S G S G S G T D
T
L T 1 S S L E E P E D V A T Y Y C Q Q Y S 1 L
W
T F G G G i T K V E 1 K R [SEQ ID NO : 17].
En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo comprende una region variable de cadena pesada de murino que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1 y una region variable de cadena ligera de murino que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2.
Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender una region variable de cadena pesada humanizada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO: 8 a l1 y una region variable de cadena ligera humanizada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15 a 17.
Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender:
a) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
b) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
c) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
d) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
e) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
f) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
g) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
h) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
i) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17;
j) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17;
k) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17; o
l) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que los anticuerpos humanizados o fragmentos de union a antfgeno antes definidos de la invencion pueden comprender ademas una region constante de cadena pesada, o parte de la misma (vease lo siguiente).
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En una realizacion, el polipeptido de anticuerpo comprende una region CH1, CH2 y/o CH3 de una cadena pesada e IgG (tal como una cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). Entonces, el polipeptido de anticuerpo puede comprender parte o todas las regiones constantes de una cadena pesada de IgG1. Por ejemplo, el polipeptido de anticuerpo puede ser un fragmento Fab que comprende las regiones constantes de CH1 y CL, combinadas con cualquiera de las regiones variables de cadena pesada y ligera definidas antes respectivamente.
Del mismo modo, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno definidos antes de la invencion pueden comprender ademas una region constante de cadena ligera, o parte de la misma (vease lo siguiente). Por ejemplo, el polipeptido de anticuerpo puede comprender una region CL de una cadena ligera kappa o lamda.
Por ejemplo, el polipeptido de anticuerpo puede comprender las siguientes regiones constantes:
(a) Region C de cadena kappa de Ig (Homo sapiens) (UnitProt el n.° de Acceso P01834)
TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN
SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS
fnrgec [SEQ ID NO: 18]
(b) Region C de cadena gamma-1 de Ig (Homo sapiens) (UnitProt el n.° de Acceso P01857)
ASTKGPSVFP
LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS
GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
KSCDKTHTCP
PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS
HEDPEVKFNW
YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
EYKCKVSNKA
LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC
LVKGFYPSDI
AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV
MHEALHNHYT QKSLSLSPGK [SEQ ID NO: 19]
En una realizacion alternativa, pueden utilizarse las variantes naturales de las regiones constantes anteriores pueden (por ejemplo vease Jefferis y Lefranc, 2009, MAbs 1(4):332- 8). Por ejemplo, la region constante de cadena ligera puede comprender o consistir de SEQ ID NO: 18 que tiene una mutacion W40R y/o V83L y/o la region constante de cadena pesada puede comprender o consistir de SEQ ID NO: 19 que tiene una mutacion K97R, D239E y/o L241M, o sin la lisina/K en la terminal C (en donde la posicion de las mutaciones de aminoacidos se definen usando el Esquema de Numeracion Eu, que difiere de la numeracion en SEQ ID NO: 18 y 19; vease Edelman et al., 1969, Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU., 63:78-85).
Entonces, polipeptidos de anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion comprenden:
(a) una cadena pesada que comprende una region variable de SEQ ID NO: 1, 8, 9, 10 o 11 junto con una region constante de SEQ ID NO: 19; y
(b) una cadena ligera que comprende una region variable de SEQ ID NO: 2, 15, 16 o 17 junto con una region constante de SEQ ID NO: 18.
En una realizacion relacionada, el polipeptido de anticuerpo puede comprender una region Fc de anticuerpo (por ejemplo las regiones CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG). Sera apreciado por un experto que la porcion Fc puede ser de un anticuerpo IgG, o de una clase diferente de anticuerpo (tal como IgM, IgA, IgD o IgE). En una realizacion, la region Fc es de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
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La region Fc puede ser natural (por ejemplo parte de un anticuerpo producido endogenamente) o puede ser artificial (por ejemplo comprende una o mas mutaciones puntuales con respecto a una region Fc natural).
Como esta bien documentado en la tecnica, la region Fc de un anticuerpo media su semivida en suero y las funciones efectoras, tales como citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
El diseno de la region Fc de un anticuerpo monoclonal terapeutico o protefna de fusion a Fc permite la generacion de moleculas que estan mejor adaptadas para la actividad farmacologica requerida de ellas (Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20(6):685-91).
(a) Regiones de Fc disenadas para una mayor semivida
Un enfoque para mejorar la eficacia de un anticuerpo terapeutico es aumentar su persistencia en suero, permitiendo asf mayores niveles en circulacion, administracion menos frecuente y dosis reducidas.
La semivida de un IgG depende de su union dependiente del pH al receptor neonatal FcRn. El FcRn, que se expresa en la superficie de celulas endotelilales, se une al IgG en una manera dependiente del pH y lo protege de la degradacion. Algunos anticuerpos que selectivamente se unen al FcRn a pH 6,0, pero no a pH 7,4, exhiben una mayor semivida en varios modelos animales.
Muchas mutaciones ubicadas en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, tal como T250Q/M428L (Hinton et al., 2004, J Biol Chem. 279(8):6213-6) y M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F (Vaccaro et al., 2005, Nat Biotechnol. 23(10):1283-8), han demostrado aumentar la afinidad de union a FcRn y la semivida de IgG1 in vivo.
(b) Regiones de Fc disenadas para una funcion efectora alterada
Dependiendo de la aplicacion del anticuerpo terapeutico o protefna de fusion Fc, puede ser deseable ya sea reducir o aumentar la funcion efectora (tal como ADCC).
Para los anticuerpos que se dirigen a las moleculas de la superficie celular, especialmente esas en celulas inmunes, puede requerirse abrogar las funciones efectoras para ciertas indicaciones clfnicas.
Por el contrario, para los anticuerpos ideados para uso oncologico (tal como en el tratamiento de leucemias y tumores solidos; vease lo siguiente), aumentar las funciones efectoras puede mejorar la actividad terapeutica.
Para los cuatro isotipos de IgG humana que se unen a los receptores de Fcy activadores (FcyRI, FcYRIla, FcYRIIIa), el receptor de FcYRIIb inhibidor, y el primer componente del complemento (C1q) con diferentes afinidades, produciendo funciones efectoras muy diferentes (Bruhns et al., 2009, Blood. 113(16):3716-25).
La union de IgG a FcyRs o C1q depende de los residuos ubicados en la region de bisagra y el dominio de CH2. Dos regiones del dominio de CH2 son crfticas para la union de FcyRs y C1q, y tienen secuencias unicas en IgG2 e IgG4. Las sustituciones en IgG1 humana de los residuos de IgG2 en las posiciones 233-236 y los residuos de IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 demostraron reducir en gran medida el ADCC y CDC (Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29(8):2613-24; Shields et al., 2001, J Biol Chem. 276(9):6591-604). Ademas, Idusogie et al. demostraron que la sustitucion de alanina en diferentes posiciones, incluyendo K322, redujeron apreciablemente la activacion del complemento (Idusogie et al., 2000, J inmunol 164(8):4178-84). De modo similar, las mutaciones en el dominio de CH2 de IgG2A de murino mostraron reducir la union a FcyRI, y C1q (Steurer. et al., 1995. J Immunol 155(3):1165- 74).
Se han hecho muchas mutaciones en el dominio de CH2 de IgG1 humana y su efecto en ADCC y CDC probado in vitro (vease las referencias citadas antes). Notablemente, la sustitucion de alanina en la posicion 333 fue reportada aumentando tanto el ADCC como el CDC (Shields et al., 2001, supra; Steurer et al., 1995, supra). Lazar et al describieron un mutante triple (S239D/1332E/A330L) con una mayor afinidad por FcYRIIIa y una menor afinidad por FcYRIIb resultando en un AdCC mejorado (Lazar et al., 2006, pNaS 103(11):4005-4010). Las mismas mutaciones se usaron para generar un anticuerpo con aumento en ADCC (Ryan et al., 2007, Mol. Cancer Ther 6:3009-3018). Richards et al estudiaron un mutante triple ligeramente diferente (S239D/I332E/G236A) con una mejor afinidad de FcYRIIIa y proporcion de FcYRIIa/FcYRIIb que media una mayor fagocitosis de las celulas diana por macrofagos (Richards et al., 2008. Mol Cancer Ther. 7(8):2517-27).
Debido a la falta de funciones efectoras, los anticuerpos IgG4 representan una subclase preferida de IgG para el bloqueo del receptor sin agotamiento celular (es decir, inhibicion de senalizacion de IL-1). Las moleculas de IgG4 pueden intercambiar medias moleculas en un proceso dinamico llamado intercambio de brazo Fab. Este fenomeno tambien puede ocurrir in vivo entre los anticuerpos terapeuticos y el IgG4 endogeno.
La mutacion S228P ha mostrado prevenir este proceso de recombinacion permitiendo el diseno de anticuerpos de IgG4 terapeuticos menos impredecibles (Labrijn et al., 2009, Nat Biotechnol 27(8):767-71).
Ejemplos de regiones de Fc disenadas se muestran en la Tabla 1 y Ejemplo J siguiente.
TABLA 1
Ejemplos de Fc Disenadas
Isotipo
Especie Mutaciones* Union FcR/C1q Funcion efectora
igG1
Humana T250Q/M428L 1 Aumento de union a FcRn Aumento de semivida
igG1
Humana M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F2 Aumento de union a FcRn Aumento de semivida
igG1
Humana M428L/N434S 3 Aumento de union a FcRn Aumento de semivida
igG1
Humana E233P/L234V/L235A/?G23 6 + A327G/A330S/P331S 4 5 Reduccion de union a FcyRI Reduccion de ADCC y CDC
igG1
Humana S239D/S298A/i332E + S239D/A330L/i332E 6 Aumento de union a FcYRIIIa Aumento de ADCC
igG1
Humana S239D/i332E 7 Aumento de union a FcYRIIIa Aumento de ADCC
igG1
Humana S298A/E333A/K334A 8 Aumento de union a FcYRIIIa Aumento de ADCC
igG1
Humana E333A9 Aumento de union a FcYRIIIa Aumento de ADCC y CDC
igG1
Humana P257i/Q311 10 Aumento de union a FcRn Vida media sin cambio
igG1
Humana K326W/E333S 11 Aumento de union a C1q Aumento de CDC
igG1
Humana S239D/i332E/G236A 12 Aumento de FcYRIIa/FcYRIIb ratio Aumento de fagocitosis de macrofago
igG1
Humana K322A 8 Reduccion de union a C1q Reduccion de CDC
N297S Reduccion de (abrogado) ADCC
N297Q Reduccion de (abrogado) ADCC
R292P + V305i +/- F243L 13 Aumento de ADCC
P247i/A339Q 14 Aumento de ADCC
igG4
Humana S228P 15 - Reduccion de intercambio del brazo Fab
igG2a
Raton L235E+ E318A/K320A/K322A 11 Reduccion de union a FcyRI y C1q Reduccion de ADCC y CDC
* La posicion de las mutaciones de los aminoacidos de Fc se define usando el Esquema de Numeracion Eu, que difiere de la numeracion en SEQ iD NO: 18 y 19 anteriores; vease Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 63:78-85)
Referencias a la Tabla 1
10
1. Hinton et al., 2004 J. Biol. Chem. 279(8):6213-6)
2. Vaccaro et al,. 2005 Nat Biotechnol. 23(10):1283-8)
3. Zalevsky et al., 2010 Nat. Biotechnology 28(2):157-159
4. Armour KL. et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24
15 5. Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604
6. Masuda et al., 2007, Mol Immunol. 44(12):3122-31
7. Bushfield et al., 2014, Leukemia 28(11 ):2213-21
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35
40
45
50
55
60
65
8. Okazaki et al., 2004, J Mol Biol.; 336(5): 1239-49
9. Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84
10. Datta-Mannan A. et al., 2007. Drug Metab. Dispos. 35: 86-94
11. Steurer W. et al., 1995. J Immunol. 155(3):1165- 74
12. Richards et al. 2008 Mol Cancer There. 7(8):2517-27
13. US 7,960,512 B2
14. EP 2 213 683
15. Labrijn AF. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71.
En otra realizacion, la funcion efectora de la region Fc puede ser alterada a traves de la modificacion de las porciones de carbohidrato dentro del dominio de CH2 en el mismo.
Por ejemplo, es sabido que los anticuerpos terapeuticos que carecen o son bajos en residuos de fucosa en la region Fc pueden exhibir una mejor actividad de ADCC en seres humanos (por ejemplo, vease Peipp et al., 2008, Blood 112(6):2390-9, Yamane-Ohnuki y Satoh, 2009, MAbs 1(3):230-26, lida et al., 2009, BMC Cancer 9;58. Los polipeptidos de anticuerpo bajos en fucosa pueden ser producidos por expresion en celulas cultivadas en un medio que contiene un inhibidor de manosidasa, tal como kinfunensina (vease el Ejemplo I en lo siguiente).
Otros metodos para modificar la glucosilacion de un anticuerpo en un formato bajo en fucosa incluyen el uso de la encima bacteriana GDP-6-desoxi-D-lixo-4-hexulosa reductasa en celulas no capaces de metabolizar rhamosa (por ejemplo usando la tecnologfa GIymaxX® de ProBioGen AG, Berlin, Alemania).
Otro metodo para crear anticuerpos bajos en fucosa en por inhibicion o agotamiento de alfa-(1,6)-fucosiltransferasa en celulas productoras de anticuerpos (por ejemplo usando la tecnologfa PoteHigent® CHOK1SV de Lonza Ltd, Basel, Suiza).
Como se indico antes, los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden ejercer una accion inhibidora en la senalizacion de IL-1 (vease el Ejemplo E), ya sea ademas de o en ausencia de cualquier funcion efectora mediada por Fc.
En una realizacion, los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden ejercer una accion inhibidora en una o mas citocinas adicionales (o alternativas) dentro de la superfamilia de IL- 1, incluyendo pero sin limitacion a IL-33 y/o IL-36.
La Interleucina-33 (IL-33) induce linfocitos T auxiliares, mastocitos, eosinofilos y basofilos para producir citocinas de tipo 2. Esta citocina fue llamada previamente NF-HEV “factor nuclear (NF) en venulas altamente endoteliales” (HEV) ya que originalmente fue identificado en esas celulas especializadas. La IL-33 media sus efectos biologicos al interactuar con los receptores ST2 (tambien conocidos como IL1RL1) y la protefna accesoria del receptor de IL-1 (IL1RAP), activando las moleculas intracelulares en las trayectorias de senalizacion de NF-kB y MAP cinasa que impulsan la produccion de citocinas de tipo 2 (por ejemplo IL-5 y IL-13) de celulas Th2 polarizadas. Se cree que la induccion de citocinas de tipo 2 por IL-33 induce los cambios graves patologicos observados en los organos mucosales despues de la administracion de IL-33.
La Interleucina-36 (IL-36) es una citocina que predominantemente actua en los linfocitos T CD4+ sin modificar a traves del receptor de IL-36. Se sabe que activan el NF-kB y las protemas cinasas activadas por mitogeno para jugar un papel en la patologfa de la piel. Tambien se ha encontrado que activan la proliferacion de linfocitos T y la liberacion de IL-2.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que el polipeptido de anticuerpo de la invencion puede inhibir la senalizacion de IL-1, IL-33 y/o IL-36 totalmente o en parte. Por ejemplo, la senalizacion puede ser inhibida por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 75 % o mas con respecto a la senalizacion en la ausencia del polipeptido de la invencion.
El grado de inhibicion de la senalizacion de IL-1, IL-33 y/o IL-36 por el polipeptido de la invencion puede ser determinado usando metodos bien conocidos en la tecnica.
Por ejemplo, la inhibicion de la senalizacion de IL-1 puede ser medida como se describe en el Ejemplo E en lo siguiente.
Del mismo modo, la inhibicion de la senalizacion de IL-33 puede ser medida como se describe en el Ejemplo E.
La inhibicion de la senalizacion de IL-36 puede ser medida por metodos conocido en la tecnica. Por ejemplo, el estimulo de IL-36 de fibroblastos sinoviales lleva a la activacion de NF-kB y MAP cinasa. Como alternativa, IL-36-a, -p y y aumentan la proliferacion de linfocitos T en respuesta al estimulo antiCD3/anti-CD28 (vease Vigne et al., 2012, Blood 120(17):3478-87.
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En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender ademas una porcion para aumentar la semivida in vivo del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno, tal como pero sin limitacion a polietilenglicol (PEG), albumina de suero humano, grupos de glucosilacion, acidos grasos y dextrano. Esas porciones adicionales pueden ser conjugadas o combinadas de otro modo con la porcion de union usando metodos bien conocidos en la tecnica.
Cualquiera o mas de los siguientes metodos conocidos para mejorar la semivida de las protefnas puede usarse para este proposito:
(a) PEGilacion
Un metodo ampliamente usado para mejorar la semivida de las protefnas es el enlace covalente de porciones de polietilenglicol (PEG) a la protefna. Los PEG son polfmeros solubles en agua que debido a su gran volumen hidrodinamico crean una proteccion alrededor del farmaco pegilado (Molineux, G., “Pegylation: engineering improved pharmaceuticals for enhanced therapy”. Cancer Treat Rev, 2002. 28 Supl A: pag. 13-6). Las protefnas pegiladas exhiben una menor eliminacion renal y proteolisis, menor toxicidad, menor inmunogenicidad y mayor solubilidad (Veronese, F. M. y J. M. Harris, “Introduction and overview of peptide and protein pegylation”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 453-6., Chapman, A.P., “PEGyiated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 531-45). La pegilacion ha sido empleada para muchos farmacos a base de protefnas incluyendo las primeras moleculas pegiladas asparaginasa y adenosina desaminasa (Veronese, F.M. y J.M. Harris, “Introduction and overview of peptide and protein pegylation”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 453-6., Veronese, F. M. y G. Pasut, “PEGyiation, successful approach to drug delivery”. Drug Discov Today, 2005. 10(21): pag. 1451-8)e.
Para obtener una protefna exitosamente pegilada, con una semivida aumentada al maximo y actividad biologica retenida, muchos parametros que pueden afectar el resultado son importantes y deben tomarse en consideracion. Las moleculas pEg pueden diferir, y las variantes de PEG que se han usado para la pegilacion de protefnas incluyen PEG y monometoxi-PEG. Ademas, pueden ser ya sea lineales o ramificadas (Wang, Y.S., et al., “Structural and biological characterization of pegyiated recombinant inferieron alpha-2b and its therapeutic implications”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 547-70). El tamano de las moleculas de PEG usadas puede variar y las porciones de PEG que varfan en tamano entre 1 y 40 kDa han sido enlazadas a protefnas (Wang, Y.S., et al., “Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 547-70., Sato, H., “Enzymatic procedure for site-specific pegylaton of proteins”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 487-504, Bowen, S., et al., “Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethytene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein”. Exp Hematol, 1999. 27(3): pag. 42532, Chapman, A.P., et al., “Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivo half-lives”. Nat Biotechnol, 1999. 17(8): pag. 780-3). Ademas, el numero de porciones PEG unidas a la protefna puede variar, y ejemplos de entre uno y seis unidades de PEG estando unidas a las protefnas han sido reportados (Wang, Y.S., et al., “Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 547-70., Bowen, S., et al., “Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethytene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein”. Exp Hematol, 1999. 27(3): pag. 42532]. Ademas, se ha utilizado la presencia o ausencia de un enlazador entre PEG asf como varios grupos reactivos para conjugacion. Entonces, el PEG puede ser enlazado a grupos amino de la terminal N, o a residuos de aminoacidos con grupos reactivos amino o hidroxilo (Lys, His, Ser, Thr y Tyr) directamente o usando acido Y-amino butfrico como un enlazador. Ademas, el PEG puede ser acoplado a grupos carboxilo (Asp, Glu, terminal C) o sulfhidrilo (Cys). Finalmente, los residuos Gln pueden ser especfficamente pegilados usando la enzima transglutaminasa y se han descrito derivados de alquilamina de PEG (Sato, H., “Enzymatic procedure for site- specific pegylation of proteins”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 487-504].
Se ha demostrado que aumentando el grado de pegilacion da como resultado un aumento en la semivida in vivo. Sin embargo, sera apreciado por los expertos en la tecnica que el proceso de pegilacion necesitara optimizarse para un polipeptido de anticuerpo particular en una base individual.
El PEG puede ser acoplado a enlaces bisulfuro naturales como se describe en WO 2005/007197. Los enlaces bisulfuro pueden ser estabilizados a traves de la adicion de un puente qufmico que no compromete la estructura terciaria de la protefna. Esto permite usar la selectividad del tiol de conjugacion de los dos sulfuros que comprenden un enlace bisulfuro para crear un puente para la union especffica de sitio del PEG. De este modo, se evita la necesidad de disenar residuos en un peptido para union de las moleculas diana.
Varios copolfmeros de bloque alternativos puede tambien ser conjugada covalentemente como se describe en WO 2003/059973. Los conjugados polimericos terapeuticos puede exhibir mejores propiedades termicas, cristalizacion, adhesion, hinchamiento, revestimiento, conformacion y biodistribucion dependiente del pH. Ademas, pueden lograr una circulacion prolongada, liberacion del bioactivo en el entorno proteolftico y acido de la lisosoma secundaria despues de la captacion celular del conjugado por pinocitosis y propiedades fisicoqufmicas mas favorables debido a las caracterfsticas de las moleculas grandes (por ejemplo mayor solubilidad del farmaco en los fluidos biologicos). Los copolfmeros de co-bloque, comprenden bloques hidrofilos e hidrofobos, que forman miscelas polimericas en
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solucion. Con la disociacion de las miscelas, las moleculas individuales del copolfmero de bloque se excretan de manera segura.
(b) Protefnas de Fusion Protefnas de fusion de IgG
Las moleculas de inmunoglobulina humanan G (IgG) tienen semividas en circulacion de aproximadamente 20 dfas. La porcion Fc de las moleculas de IgG se han usado extensamente para la creacion de protefnas de fusion que consisten en una parte de Fc y una protefna con un uso terapeutico. Esas protefnas de fusion exhiben una semivida prolongada en comparacion con sus contrapartes que carecen de Fc. Por ejemplo, esta estrategia se uso para el desarrollo de etanercept, un farmaco anti-reumatico compuesto de una protefna de fusion entre el receptor del factor de necrosis de tumor p75 humano soluble y la porcion Fc de IgG humana (Goldenberg, M. M., “Etanercept, a novel drug for the treatment of patients with severe, active rheumatoid arthritis”. Clin Ther, 1999. 21(1): pag. 75-87; discusion 1-2].
Las protefnas enlazadas a Fc se producen al crear protefnas de fusion entre Fc y la region de union a antfgeno del polipeptido de interes por protocolos estandar de ingenierfa genetica. El grupo de Fc se fusiona al extremo C de la protefna de interes. Debido a la presencia de residuos de cistefna en la region de bisagra de IgG, las protefnas de fusion Fc se expresan como homodfmeros enlazados a bisulfuro. Esto aumenta mas su tamano efectivo y semividas en circulacion. Ademas, las construcciones homodimericas pueden tener una mayor actividad funcional debido a una mejor avidez por su receptor / ligando en comparacion con la correspondiente forma monomerica.
Protefnas de fusion de albumina de suero humano
La albumina de suero humano (ASH) es la protefna sangufnea natural mas abundante en la circulacion y tiene una semivida de 19 dfas (Osborn, B. L., et al., “Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomoigus monkeys”. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 303(2): pag. 540-8]. Entonces, la ASH es un socio de fusion adecuado para la creacion de protefnas de fusion con mejor semivida. Las protefnas de fusion ASH exhiben una semivida prolongada debido a la capacidad de la ASH de estabilizar la protefna hacia proteolisis y de aumentar el tiempo de residencia en el cuerpo (Veronese, F. M. y J. M. Harris, “Introduction and overview of peptide and protein pegylation”. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): pag. 453-6]. Las protefnas de fusion de ASH, incluyendo IL-2, IFN-a y -p y hormona de crecimiento (GH), se han producido y mostrado tener mejores propiedades farmacocineticas. El albuferon (ASH-IFN-a) y albutropina (ASH-GH) exhiben semividas que son 18 y 6 veces mas largas en monos macacos, respectivamente, que las contrapartes respectivas que carecen de un grupo ASH (Osborn, B. L., et al., “Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomoigus monkeys”. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 303(2): pag. 540-8, Osborn, B.L., et al., “Albutropin: a growth hormone-albumin fusion with improved pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats and monkeys”. Eur J Pharmacol, 2002. 456(1-3): pag. 149-58].
Las protefnas enlazadas a ASH se producen al crear protefnas de fusion entre ASH y la protefna de interes por protocolos estandar de ingenierfa genetica. El grupo ASH puede ser agregado ya sea en el extremo N o C. Ya que la modificacion se agrega al extremo de la protefna, el riesgo de interferir con la estructura de la protefna y entonces con su funcion es considerablemente menor en comparacion con las modificaciones tales como la pegilacion al interior de la protefna. Ademas, la oportunidad de evitar la interferencia con el sitio activo de la protefna aumenta por el hecho de que el grupo ASH puede ser agregado en cualquiera del extremo N o C de la protefna de interes (Osborn, B.L., et al., “Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomoigus monkeys”. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 303(2): pag. 540-8, Osborn, B. L., et al., “Albutropin: a growth hormone-albumin fusion with improved pharmacokinetics and pharmacodynamics in rats and monkeys”. Eur J Pharmacol, 2002. 456(1-3): pag. 149-58, Syed, S., K. E. Kelly, y W. P. Sheffield, “Inhibition of thrombin by hirudin geneticLLAy fused to wild-type or mutant antithrombin”. Thromb Res, 1996. 84(6): pag. 419-29], dependiendo de cual es mas probable que resulte en una protefna de fusion con actividad biologica mantenida. Entonces, en el caso de albuferon y albutropin, el extremo C de la ASH se fusiono con el extremo N de IFN-a o GH, respectivamente, la creacion de una protefna de fusion hirudina-ASH funcionalmente activa, el grupo ASH tuvo que ser fusionado al extremo C de hirudina. Estos resultados indican que las propiedades de la protefna diana determinan si la fusion en el extremo C o N es optima.
(c) Glucosilacion
La introduccion de nuevos carbohidratos que contienen acido sialico en una protefna (glico-ingenierfa) ha demostrado mejorar la semivida in vivo. Este metodo puede ser usado para protefnas naturalmente glicosiladas o para protefnas que normalmente carecen de glucosilacion (Elliott, S., et al., “Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering”. Nat Biotechnol, 2003. 21(4): pag. 414-21).
La glucosilacion de protefnas puede ser en la forma de carbohidratos enlazados a N o enlazados a O. Los carbohidratos enlazados a N normalmente estan unidos a secuencias consenso (Asn-X-Ser/Thr) donde X es
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cualquier aminoacido excepto prolina. La O-glucosilacion ocurre en los residuos Ser/Thr.
Para la produccion de protefnas glucosiladas, puede requerirse la introduccion de nuevos sitios de glucosilacion. Para que ocurra la glucosilacion, la expresion puede ser realizada en sistemas de celulas de levadura, insectos o mamfferos. Sin embargo, el patron de glucosilacion en las celulas de levadura es diferente que en las celulas de mamffero, generando protefnas hiper-glucosiladas, asociadas a un riesgo de mayor inmunogenicidad. En contraste, las celulas de insecto pueden preferirse ya que el patron de glucosilacion es similar a ese en las celulas de mamfferos mientras que los ciclos celulares son mas cortos y por lo tanto es mas rapido el proceso de expresion. Darbepoetin-a es un ejemplo de una eritropoyetina humana modificada expresada en celulas CHO. Contiene dos sitios extra de N-glucosilacion, resultando en una mejora de tres veces la semivida in vivo (Elliott, S., et al., “Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through lycoengineering”. Nat Biotechnol, 2003. 21(4): pag. 414-21].
Un metodo alternativo de glucosilacion es la adicion qufmica de grupos de carbohidrato a las protefnas. En este metodo, la protefna se expresa desnuda, por ejemplo en E coli. Despues de la expresion y purificacion, la protefna es glucosilada en un procedimiento completamente sintetico libre de celulas. El metodo ofrece gran flexibilidad en terminos de numero, tamano y tipo de carbohidrato a ser agregado.
(d) Acilacion/miristoilacion de acido graso
Los acidos grasos tienen una alta afinidad y alta capacidad de union a ASH. Esta caracterfstica puede ser utilizada para mejorar la semivida de las protefnas. Entonces, puede unirse un acilo graso a los aminoacidos de las protefnas, generando asf las protefnas aciladas de acilo graso. Al alcanzar la circulacion, el grupo acilo graso es capaz de unirse a la ASH circulante, resultando en una mejor semivida in vivo de la protefna.
Este metodo fue usado para el desarrollo de la Insulina detemir, que fue acilada con acilo graso con miristato en LysB29 por tratamiento de insulina con esteres de succinimida-acido graso hidroxilo en dimetil formamida/DMSO (Kurtzhals, P., et al., “Albumin binding of insulins acylated with fatty acids: characterization of the ligand-protein interaction and correlation between binding affnity and timing of the insulin effect in vivo”. Biochem J, 1995. 312 (Pt 3): pag. 725-31, Hamilton-Wessler, M., et al., “Mechanism of protracted metabolic effects of fatty acidicylated insulin, NN304, in dogs: retention of NN304 by albumin”. Diabetologia, 1999. 42(10): pag. 1254-63). Esto genero un analogo de insulina con aumento de la semivida in vivo debido a la union de ASH.
(e) Dextrano
El dextrano resulta en una inmovilizacion de la protefna, resultando en una liberacion lenta y mejora asf la semivida de la protefna. El Dextrano-estreptocinasa, ha sido comercializado en Rusia para terapia trombolftica. Ademas, insulina, somatostatina (que se usa para terapia y diagnostico de tumores que expresan receptores de somatostatina) y el farmaco inactivante de ribosoma tricosantina conjugado a dextrano, tuvo semividas apreciablemente mejoradas (Baudys, M., et al., “Extending insulin action in vivo by conjugation to carboxymethyl dextran”. Bioconjug Chem, 1998. 9(2): pag. 176-83, Chan, W. L., et al., “Lowering of trichosanthin immunogenicity by site-specific coupling to dextran”. Biochem Pharmacol, 1999. 57(8): pag. 927-34, Wulbrand, U., et al., “A novel somatostatin conjugate with a high affinity to LLA five somatostatin receptor subtypes”. Cancer, 2002. 94(4 Supl): pag. 1293-7).
Ademas de los compuestos farmaceuticos a base de protefna, el dextrano ha sido usado para mejorar la semivida de antibioticos y farmacos citotoxicos (Yura, H., et al., “Synthesis and pharmacokinetics of a novel macromolecular prodrug of Tacrolimus (FK506), FK506-dextran conjugate”. J Control Release, 1999. 57(1): pag. 87-99, Nakashima, M., et al., “In vitro characteristics and in vivo plasma disposition of cisplatin conjugated with oxidized and dicarboxymethylated dextrans”. Biol Pharm Bull, 1999. 22(7): pag. 756-61, Kim, D. S., Y. J. Jung y Y. M. Kim, “Synthesis and properties of dextran-linked ampicillin”. Drug Dev Ind Pharm, 2001. 27(1): pag. 97-101).
La conjugacion del dextrano se realiza por aminacion reductiva usando dextrano activado con periodato por el uso de bromuros de cianogeno (Wulbrand, U., et al., A novel somatostatin conjugate with a high affinity to LLA five somatostatin receptor subtypes”. Cancer, 2002. 94(4 Supl): pag. 1293-7, Kim, D. S., Y. J. Jung y Y. M. Kim, “Synthesis and properties of dextran-linked ampicillin”. Drug Dev Ind Pharm, 2001. 27(1): pag. 97-101). El dextrano usado puede variar en tamano, y se ha usado el dextrano que varfa de 9 a 82 kDa (Kim, D. S., Y. J. Jung y Y. M. Kim, “Synthesis and properties of dextran-linked ampicillin”-. Drug Dev Ind Pharm, 2001. 27(1): pag. 97-101, Behe, M., et al., “Biodistribution, bioodhalf-life, and receptor binding of a somatostatin-dextran conjugate”. Med Oncol, 2001. 18(1): pag. 59-64).
Ademas de mejorar la semivida de los farmacos, la conjugacion del dextrano puede tambien reducir la inmunogenicidad (Chan, W.L., et al., “Lowering of trichosanthin immunogenicity by site-specific coupling to dextran”. Biochem Pharmacol, 1999. 57(8): pag. 927-34).
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Entonces, en una realizacion del primer aspecto de la invencion, el polipeptido de la invencion es o comprende un polipeptido de "fusion". Ademas de ser fusionado a una porcion para mejorar las propiedades farmacocineticas, sera apreciado que el polipeptido de la invencion puede tambien ser fusionado a un polipeptido tal como glutationa-S- transferasa (GST) o protefna A para facilitar la purificacion de dicho polipeptido. Ejemplos de esas fusiones son bien conocidos a los expertos en la tecnica. De modo similar, dicho polipeptido puede ser fusionado a una etiqueta oligo- histidina, tal como His6, o a un epftopo reconocido por un anticuerpo tal como el bien conocido epftopo de etiqueta Myc. Las fusiones a cualquier variante o derivado de dicho polipeptido tambien se incluyen en el alcance de la invencion. Sera apreciado que las fusiones (o variantes, derivados o fusiones de los mismos) que retienen o mejoran las propiedades deseables, tales como las propiedades de union a IL-1R o semivida in vivo son preferidos.
Entonces, la fusion puede comprender una secuencia de aminoacidos como se detLLAa antes junto con una porcion adicional que confiere un aspecto deseable en dicho polipeptido de la invencion; por ejemplo, la porcion puede ser util en detectar o aislar el polipeptido, o promover la captacion celular del polipeptido. La porcion puede ser, por ejemplo, una porcion de biotina, una porcion radioactiva, una porcion fluorescente, por ejemplo un fluoroforo pequeno o un fluoroforo fluorescente verde de protefna (GFP), como es bien sabido por los expertos en la tecnica. La porcion puede ser una etiqueta inmunogenica, por ejemplo una etiqueta Myc, como es sabido por los expertos en la tecnica o puede ser una molecula lipofila o dominio de polipeptido que es capaz de promover la captacion celular del polipeptido, como es sabido por los expertos en la tecnica.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden comprender o consistir de uno o mas aminoacidos que han sido modificados o derivatizados.
Los derivados qufmicos de uno o mas aminoacidos pueden lograrse por reaccion con un grupo secundario funcional. Esas moleculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, esas moleculas en las que los grupos amino libres han sido derivatizados para formar clorhidratos de amina, grupos p-toluen-sulfonilo, grupos carboxibenzoxi, grupos t- butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden ser derivatizados para formar sales, metil y etil esteres u otros tipos de esteres e hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden ser derivatizados para formar derivados de O-acilo o O-alquilo. Tambien se incluyen como derivados qufmicos esos peptidos que contienen derivados naturales de aminoacidos de los veinte aminoacidos estandar. Por ejemplo: 4- hidroxiprolina puede ser sustituida por prolina; 5-hidroxilisina puede ser sustituida por lisina; 3- metilhistidina puede ser sustituida por histidina; homoserina puede ser sustituida por serina y ornitina por lisina. Los derivados tambien incluyen peptidos que contienen una o mas adiciones o deleciones en tanto que se mantenga la actividad necesaria. Otras modificaciones incluidas son amidacion, acilacion del extremo amino (por ejemplo acetilacion o amidacion de acido tioglicolico), amidacion del extremo carboxilo (por ejemplo con amonfaco o metilamina), y modificaciones similares de los extremos.
Se apreciara ademas por los expertos en la tecnica que tambien pueden ser utiles los compuestos peptidomimeticos. El termino “peptidomimetico” se refiere a un compuesto que imita la conformacion y aspectos deseables de un peptido particular como un agente terapeutico.
Por ejemplo, dicho polipeptido incluye no solo moleculas en las que los residuos de aminoacidos se unen por enlaces peptfdicos (-CO-NH-) sino tambien moleculas en las que se invierte el enlace peptfdico. Esos peptidomimeticos retro-inversos pueden formarse usando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo tales como esos descritos en Meziere et al (1997) J Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque implica hacer pseudo-peptidos que contienen cambios que involucran la estructura principal, y no la orientacion de las cadenas secundarias. Los peptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en vez de enlaces peptfdicos CO-NH, son mucho mas resistentes a la proteolisis. Como alternativa, dicho polipeptido puede ser un compuesto peptidomimetico en donde uno o mas de los residuos de aminoacidos se enlaza por un enlace -y(CH2NH)- en vez del enlace amida convencional.
En una alternativa adicional, el enlace peptfdico puede ser dispensado con todo con la condicion de que se use una porcion enlazante adecuada que retenga la separacion entre los atomos de carbono de los residuos de aminoacidos; puede ser ventajoso que la porcion enlazante tenga sustancialmente la misma distribucion de carga y sustancialmente la misma planaridad como un enlace peptfdico.
Sera tambien apreciado que dicho polipeptido puede convenientemente ser bloqueado en su extremo N o C para ayudar a reducir la susceptibilidad a la digestion exo-proteolftica.
Tambien se ha usado varios aminoacidos sin codificar o modificados tales como D-aminoacidos y N-metil aminoacidos para modificar los peptidos de mamfferos. Ademas, puede establecerse una conformacion bioactiva asumida por una modificacion covalente, tal como ciclizacion o por incorporacion de lactama u otros tipos de puentes, por ejemplo vease Veber et al., 1978, Proc Natl. Acad. Sci EE.UU. 75:2636 y Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166.
Los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden ser aumentados con una porcion funcional para facilitar su uso destinado, por ejemplo como un agente de diagnostico (por ejemplo formacion de imagenes in vivo) o agente
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terapeutico. Entonces, en una realizacion, el polipeptido de anticuerpo se enlaza, directa o indirectamente, a una porcion terapeutica.
En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes comprende ademas una porcion terapeutica (por ejemplo citotoxica).
Puede usarse cualquier porcion terapeutica adecuada. Un porcion terapeutica adecuada es una que es capaz de reducir o inhibir el crecimiento, o en particular eliminar, una celula de cancer (o mastocitos o celulas progenitoras asociadas). Por ejemplo, el agente terapeutico puede ser una porcion citotoxica. La porcion citotoxica puede comprender o consistir de uno o mas radioisotopos. Por ejemplo, el uno o mas radioisotopos puede cada uno ser independientemente seleccionado del grupo que consiste en beta-emisores, emisores Auger, emisores de conversion de electrones, alfa-emisores, y emisores de energfa de bajo contenido de fotones. Puede ser deseable que el uno o mas radioisotopos tenga cada uno independientemente un patron de emision de energfa absorbida localmente que crea una dosis absorbida alta en la vecindad del agente. Radioisotopos a modo de ejemplo pueden beta-emisores de intervalo largo, tales como 90Y, 32P, 186Re/188Re; 166Ho, 76As/77As, 89Sr, 153Sm; beta-emisores de intervalo medio, tales como 13\ 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh; beta-emisores de intervalo bajo, tales como 45Ca o 35S; emisores de conversion o Auger, tales como 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 201Tl; y alfa-emisores, tales como 212Bi, 213Bi, 223Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb y 221At. Estan disponibles otros radionuclidos y sera posibles para uso en terapia.
En una realizacion preferida, el polipeptido de anticuerpo esta enlazado a (o etiquetado de otro modo con) el radioisotopo 177Lu.
Como alternativa, la porcion terapeutica puede comprender o consistir de uno o mas farmacos terapeuticos (tales como citotoxicos), por ejemplo, un farmaco citostatico; un farmaco anti- androgeno; cortisona y derivados de los mismos; un fosfonato; un inhibidor de testosterona-5-a- reductasa; un adendo de boro; una citocina; tapsigargina y sus metabolitos; una toxina (tal como saporina o calicamicina); un agente quimioterapeutico (tal como un antimetabolito); o cualquier otro farmaco citotoxico terapeutico util en el tratamiento de canceres.
Farmacos a modo de ejemplo terapeuticos/citotoxicos pueden incluir por ejemplo:
• Citostaticos, en particular esos con efectos secundarios limitantes de dosis, incluyendo pero sin limitacion a ciclofosfamida, clorambucil, ifosfamida, busulfano, lomustina, taxanos, fosfato de estramustina y otras mostazas de nitrogeno, antibioticos (incluyendo doxorubicina, calicamicinas y esperamicina), alcaloides vinca, azaridinas, compuestos que contiene platino, endostatina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, triazenos, analogos de acido folico, analogos de pirimidina, analogos de purina, enzimas, urea sustituida, derivados de metil-hidrazina, daunorubicina, aminas anfipaticas,
Anti-androgenos tales como flutamida y bikalutamida y metabolitos de los mismos;
Cortisona y derivados de la misma;
Fosfonatos tales como difosfonato y bufosfonato;
Inhibidores de Testosterona-5-a-reductasa;
• Adendos de boro;
Citocinas;
Tapsigargina y sus metabolitos.
Como alternativa, la porcion citotoxica puede comprender o consistir de una o mas porciones adecuadas para uso en terapia de activacion, tal como terapia de activacion de fotones, terapia de activacion de neutrones, terapia de electrones Auger inducida por neutrones, terapia de irradiacion de sincrotrones o terapia de activacion de fotones de rayos X de baja energfa.
Por ejemplo, con los polipeptidos de anticuerpo de la invencion habra el potencial de usar radiacion de sincrotrones (o rayos X de baja energfa) para el avance de la radioterapia, enfocandose principalmente en la llamada radioterapia de activacion de fotones (PAT), en la que la deposicion de energfa local de la irradiacion externa de rayos X aumenta en el tejido de cancer por la interaccion con un agente previamente administrado dirigido a un tumor Z grande.
La realizacion de tratamiento PAT usa rayos X monocromaticos de una fuente de sincrotones, tal como se ofrece por la lfnea de haz de luz biomedica ID17 en la Instalacion de Radiacion de Sincrotones de Europa (ESRF) en Grenoble, y como se anticipa que estara disponible en el futuro en otras instalaciones tales como la nueva instalacion de sincrotones Sueca, Max-IV. La investigacion en "terapia de tumor de electrones Auger inducidos", a ser realizada en la proxima Fuente de Fragmentacion Europea (ESS) en Lund, proporciona una realizacion adicional potencial de tratamiento. Los neutrones termicos y semitermicos producidos por el reactor se han usado por mucho tiempo para la Terapia de Captura de Neutrones de Boro, BNCT, tanto para experimentos preclfnicos como para tratamiento de tumores cerebrales con las partfculas alfa inducidas y el nucleo de retroceso (7L) que da una alta energfa absorbida localmente. Un enfoque similar es usar neutrones y moleculas adecuadas dirigidas a tumor marcadas con nucleos
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estables con una gran seccion transversal para los neutrones. Lo anticuerpos o peptidos pueden por ejemplo marcarse con Gadolinio estable (157Gd) y actuar como la molecula diana para los neutrones que son capturados por el nucleo de Gd, llamada Terapia de Captura de Neutrones por Gadolinio (GdNCT). Mediante las tecnicas de Monte Carlo, la distribucion de la dosis en el tumor y los tejidos circundantes se calcula como si resultara de Y-fotones, neutrones, retrocesos nucleares, asf como los rayos X caracterfsticos, conversion interna y electrones Auger de gadolinio u otros elementos potenciales.
Opcionalmente, el polipeptido de anticuerpo de la invencion puede comprender ademas una porcion detectable. Por ejemplo, una porcion detectable puede comprender o consistir de un radioisotopo, tal como un radioisotopo seleccionado del grupo que consiste en 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 123I y 01Tl Opcionalmente, el agente puede comprender un par de radionuclidos detectables y citotoxicos, tales como 86y/90y o 124I/211At. Como alternativa, el polipeptido de anticuerpo puede comprender un radioisotopo que es capaz de actuar simultaneamente en una manera multimodal como una porcion detectable y tambien como una porcion citotoxica para proporcionar los llamados "teragnosticos multimodales". Las porciones de union pueden entonces ser acopladas a nanopartfculas que tiene la capacidad de formacion de imagenes multiples (por ejemplo, SPECT, PET, MRI, Optica, o Ultrasonido) junto con la capacidad terapeutica usando farmacos citotoxicos, tales como radionuclidos o agentes de quimioterapia.
Como alternativa, la porcion detectable puede comprender o consistir de un isotopo paramagnetico, tal como un
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isotopo paramagnetico seleccionado del grupo que consiste en Gd, Mn, Dy, Cr y Fe.
En el caso de que el polipeptido de anticuerpo comprenda una porcion detectable, luego la porcion detectable puede ser detectable por una tecnica de formacion de imagen tal como formacion de imagen SPECT, PET, MRI, optica o de ultrasonido.
Las porciones terapeuticas y/o detectables (tales como un radioisotopo, porcion citotoxica o similares) pueden ser enlazadas directamente, o indirectamente, al anticuerpo o fragmento del mismo. Los enlazadores adecuados son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, grupos prosteticos, enlazadores no fenolicos (derivados de N- succimidil-benzoatos; dodecaborato), porciones quelantes tanto de quelantes macrocfclicos como de acfclicos, tales como derivados de acido 1,4,7,10-tetraazacidododecan-1,4,7,10,tetraacetico (DOTA), deferoxamina (DFO), derivados de acido dietilenetriaminpentaacetico (DTPA), derivados de acido S-2-(4-Isotiocianatobencil)-1,4,7- triazaciclononano-1,4,7-triacetico (NOTA) y derivados de acido 1,4,8,11- tetraazacidodocedan-1,4,8,11-tetraacetico (TETA), derivados de acido 3,6,9,15-Tetraazabicido[9.3.1]-pentadeca-1(15),11,13-trien-4-(S)-(4-isotiocianato-bencil)- 3,6,9-triacetico (PCTA), derivados de acido 5-S-(4-Aminobencil)-1-oxa-4,7,10-triazaciclododecan-4,7,10- tris(acetico) (DO3A) y otras porciones quelantes.
Un enlazador preferido es DTPA, por ejemplo como se usa en 177Lu-DTPA-[polipeptido de anticuerpo de la invencion]. Un enlazador mas preferido es deferoxamina, DFO, por ejemplo como se usado en 89Zr-DFO-[polipeptido de anticuerpo de la invencion].
Sin embargo, sera apreciado por los expertos en la tecnica que algunos usos medicos de los polipeptidos de anticuerpo de la invencion no requeriran la presencia de una porcion citotoxica o de diagnostico.
Entonces, cuando el efecto terapeutico del anticuerpo de la invencion es mediado por la inhibicion de la senalizacion de IL-1 (o senalizacion de IL-33 y/o IL-36), un puede ser adecuado un polipeptido de anticuerpo "desnudo". Por ejemplo, cuando el efecto terapeutico es mediado por un efecto directo del anticuerpo de la invencion en celulas inmunes, por ejemplo para reducir inflamacion, puede ser ventajoso para el anticuerpo carecer de cualquier actividad citotoxica.
Como se discutio antes, los metodos para la produccion de polipeptidos de anticuerpo de la invencion son bien conocidos en la tecnica.
Convenientemente, el polipeptido de anticuerpo es o comprende un polipeptido recombinante. Los metodos adecuados para la produccion de esos polipeptidos recombinantes son bien conocidos en la tecnica, tales como la expresion en celulas hospederas procarioticas o eucarioticas (por ejemplo, vease Green y Sambrook, 2012, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 4a edicion, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden tambien ser producidos usando un sistema de traduccion in vitro disponible en el comercio, tal como un lisado de reticulocitos de conejo o lisado de germen de trigo (disponible de Promega). Preferiblemente, el sistema de traduccion es un lisado de reticulocito de conejo. Convenientemente, el sistema de traduccion puede ser acoplado a un sistema de transcripcion, tal como el sistema de transcripcion- traduccion TNT (Promega). Este sistema tiene la ventaja de producir un transcrito de ARNm adecuado de un polinucleotido de ADN codificante en la misma reaccion como en la traduccion.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden como alternativa ser sintetizados artificialmente, por ejemplo usando tecnicas de sfntesis bien conocidas de fase lfquida o
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fase solida (tal como sfntesis de peptido de fase solida t-Boc o Fmoc).
Tambien se desvela en el presente documento una molecula de acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del primer aspecto de la invencion, o una cadena del polipeptido componente del mismo. Por "molecula de acido nucleico" incluimos ADN (por ejemplo ADN genomico o ADN complementario) y moleculas de ARNm, que pueden ser mono o bicatenadas. Por "aislado" se entiende que la molecula de acido nucleico no esta ubicada o proporcionada de otro modo dentro de una celula.
La molecula de acido nucleico puede ser una molecula de ADNc.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que la molecula de acido nucleico puede ser optimizada por codon para la expresion del polipeptido de anticuerpo en una celula hospedera particular, por ejemplo para la expresion en celulas humanas (por ejemplo, vease Angov, 2011, Biotechnol J 6(6):650-659).
Tambien se incluye dentro del alcance de la invencion lo siguiente:
(a) un vector (tal como un vector de expresion) que comprende una molecula de acido nucleico segun lo descrito anteriormente;
(b) una celula hospedera (tal como una celula de mamffero, por ejemplo, celula humana o celula de ovario de hamster Chino, por ejemplo celulas CHOK1SV) que comprende una molecula de acido nucleico segun lo descrito anteriormente o un vector segun lo descrito anteriormente; y
(c) un metodo de formacion de un polipeptido de anticuerpo segun lo descrito anteriormente que comprende cultivar una poblacion de celulas hospederas segun lo descrito anteriormente bajo condiciones en las que dicho polipeptido se expresa, y aislando al polipeptido de las mismas.
Un segundo aspecto de la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad farmaceuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun el primer aspecto de la invencion y un diluyente, vehfculo, adyuvante o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que tambien pueden incluirse compuestos adicionales en las composiciones farmaceuticas, incluyendo, agentes quelantes tales como EDTA, citrato, EGTA o glutationa.
Las composiciones farmaceuticas pueden ser preparadas en una manera conocida en la tecnica que es suficientemente estable en almacenamiento y adecuada para la administracion a seres humanos y animales. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas pueden ser liofilizadas, por ejemplo a traves de secado por congelamiento, secado por aspersion, enfriamiento por aspersion, o a traves del uso de formacion de partfculas de formacion supercrftica de partfculas.
Por "farmaceuticamente aceptable" se quiere decir un material no toxico que no disminuye la eficacia de la actividad de union a IL1RAP del polipeptido de anticuerpo de la invencion. Esos reguladores, vehfculos o excipientes farmaceuticamente aceptables, son bien conocidos en la tecnica (vease “Remmgton”s Pharmaceutical Sciences”, 18a edicion, A. R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y “handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3a edicion, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).
El termino "regulador" pretende significar una solucion acuosa que contiene una mezcla de acido-base con el proposito de establecer un pH. Ejemplos de reguladores son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, ATMP, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, acido imidazolelactico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
El termino "diluyente" pretende significar una solucion acuosa o no acuosa con el proposito de diluir el polipeptido de anticuerpo en la preparacion farmaceutica. El diluyente puede ser uno o mas de salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de girasol, aceite de mafz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodon o aceite de ajonjolf).
El termino "adyuvante" pretende significar cualquier compuesto agregado a la formulacion para aumentar el efecto biologico del polipeptido de anticuerpo de la invencion. El adyuvante puede ser uno o mas de sales de cinc, cobre o plata con diferentes aniones, por ejemplo, pero sin limitacion a fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidroxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato, y acetatos de diferente composicion de acilo. El adyuvante puede ser tambien polfmeros cationicos tales como eteres cationicos de celulosa, esteres cationicos de celulosa, acido hialuronico desacetilado, quitosan, dendrfmeros cationicos, polfmeros cationicos sinteticos tales como poli(vinil imidazol), y polipeptidos cationicos tales como polihistidina, polilisina, poliarginina, y peptidos que contienen esos aminoacidos.
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El excipiente puede ser uno o mas de carbohidratos, polfmeros, lipidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, y ciclodextrinas, que se agregan a la composicion, por ejemplo para facilitar la liofilizacion. Ejemplos de polfmeros son almidon, eteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietil celulosa, alginatos, carageninas, acido hialuronico y derivados del mismo, acido poliacrflico, polisulfonato, polietilenglicol/oxido de polietileno, copolfmeros de oxido de polietileno/oxido de polipropileno, alcohol polivinflico/acetato de polivinilo de diferentes grados de hidrolisis, y polivinilpirrolidona, todos de diferentes pesos moleculares, que son agregados a la composicion, por ejemplo, para el control de viscosidad, para lograr la bioadhesion, o para proteger el lfpido de degradacion qufmica o proteolftica. Ejemplos de lipidos son acidos grasos, fosfolfpidos, mono-, di-, y trigliceridos, ceramidas, esfingolfpidos y glucolfpidos, todos de diferente longitud de cadena de acilo y saturacion, lecitina de huevo, lecitina de soya, lecitina hidrogenada de huevo y de soya, que son agregados a la composicion por razones similares a esas para los polfmeros. Ejemplos de minerales son talco, oxido de magnesio, oxido de cinc y oxido de titanio, que son agregados a la composicion para obtener beneficios tales como la reduccion de acumulacion de lfquido o propiedades ventajosas de pigmento.
Los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden ser formulados en cualquier tipo de composicion farmaceutica conocida en la tecnica que sea adecuada para el suministro de los mismos.
En una realizacion, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden estar en la forma de una liposoma, en la que se combina el polipeptido de anticuerpo, ademas de otros vehfculos farmaceuticamente aceptables, con agentes anfipaticos tales como lipidos, que existen en formas agregadas como miscelas, monocapas insolubles y cristales lfquidos. Los lipidos adecuados para la formulacion liposomal incluyen, sin limitacion, monogliceridos, digliceridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolfpidos, saponina, acidos biliares, y similares. Los lipidos adecuados tambien incluyen los lipidos antes modificados por poli(etilenglicol) en el grupo delantero polar para prolongar el tiempo de circulacion en la corriente sangufnea. La preparacion de esas formulaciones liposomales puede ser encontrada en, por ejemplo, el documento US 4.235.871.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden estar en la forma de microesferas biodegradables. Los poliesteres alifaticos, tales como poli(acido lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA), copolfmeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(caprolactona) (PCL), y polianhfdridos ha sido usados ampliamente como polfmeros biodegradables en la produccion de microesferas. Las preparaciones de esas microesferas puede encontrarse en los documentos US 5.851.451 y en EP 0 213 303.
En otra realizacion, las composiciones farmaceuticas de la invencion se proporcionan en la forma de geles de polfmero, donde los polfmeros tales como almidon, eteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietil celulosa, alginatos, carrageninas, acido hialuronico y derivados de los mismos, acido poliacrflico, polivinil imidazol, polisulfonato, polietilenglicol/oxido de polietileno, copolfmeros de oxido de polietileno/oxido de polipropileno, alcohol polivinflico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrolisis, y polivinilpirrolidona se usan para espesar la solucion que contiene el agente. El polfmeros puede tambien comprender gelatina o colageno.
Como alternativa, el polipeptido de anticuerpo puede simplemente disolverse en salina, agua, polietilenglicol, propileneglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cartamo, aceite de mafz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodon o aceite de ajonjolf), goma de tragacanto, y/o varios reguladores.
Sera apreciado que las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir iones y un pH definido para potenciacion de la accion del polipeptido de anticuerpo activo.
Ademas, las composiciones pueden ser sometidas a operaciones farmaceuticas convencionales tales como esterilizacion y/o puede contener adyuvantes convencionales tales como conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, reguladores, rellenos, etc.
Las composiciones farmaceuticas segun la invencion pueden ser administradas a traves de cualquier ruta adecuada conocida por los expertos en la tecnica. Entonces, las rutas de administracion posibles incluyen parenteral (intravenosa, subcutanea, y intramuscular), topica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parenteral, vaginal y rectal. Tambien es posible la administracion de implantes.
En una realizacion preferida, las composiciones farmaceuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, por via intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutanea, o pueden ser administradas por tecnicas de infusion. Se usan convenientemente en la forma de una solucion acuosa esteril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer la solucion isotonica con la sangre. Las soluciones acuosas deben ser adecuadamente reguladas (preferiblemente a un pH de 3 a 9), si fuese necesario. La preparacion de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones esteriles se efectua facilmente por tecnicas farmaceuticas estandar bien conocidas por los expertos en la tecnica.
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Las formulaciones para la administracion parenteral incluyen soluciones para inyeccion esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacteriostaticos y solutos que hacen la formulacion isotonica con la sangre del destinatario; y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o dosis multiples sellados, por ejemplo, ampolletas y frascos y pueden ser almacenadas en una condicion seca por congelamiento (liofilizada) que requiere unicamente la adicion del vehfculo lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Soluciones y suspensiones de inyeccion extemporaneas pueden prepararse de polvos esteriles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito.
Entonces, las composiciones farmaceuticas de la invencion son especialmente adecuadas para administracion parenteral, por ejemplo intravenosa.
Como alternativa, las composiciones farmaceuticas puede ser administradas por via intranasal o por inhalacion (por ejemplo, en la forma de una presentacion de rocfo de aerosol de un recipiente presurizado, bomba, rocfo o nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluoro-metano, diclorotetrafluoro-etano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1,1,1,2,3,3,3- heptafluoropropano (HFA 227EA3), bioxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria puede determinarse proveyendo una valvula para suministrar una cantidad medida. El contenedor presurizado, bomba, rociador o nebulizador puede contener una solucion o suspension del polipeptido activo, por ejemplo usando una mezcla de etanol y el propulsor como el solvente, que puede ademas contener un lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitan. Las capsulas y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador pueden ser formuladas para contener una mezcla de polvo de un compuesto de la invencion y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidon.
Las formulaciones en aerosol o polvo seco se disponen preferiblemente de modo que cada dosis medida o “carga” contenga al menos 1 mg de un compuesto de la invencion para suministro al paciente. Sera apreciado que la dosis diaria total con un aerosol variara de paciente a paciente, y puede ser administrado en una unica dosis o, mas usualmente, en dosis divididas en todo el dfa.
Como alternativa, los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden ser administrados en la forma de un supositorio o pesario, o pueden aplicarse topicamente en la forma de una locion, solucion, crema, pomada o polvo fino. Los compuestos de la invencion tambien pueden ser administrados por via transdermica, por ejemplo, mediante el uso de un parche para la piel. Tambien pueden administrarse por la ruta ocular.
Para uso oftalmico, los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden formularse como suspensiones micronizadas en salina isotonica, ajustada en pH, esteril, o, preferiblemente, como soluciones en salina isotonica, ajustada en pH, esteril, opcionalmente en combinacion con un conservante tal como un cloruro de bencilalconio. Como alternativa, pueden ser formulados en una pomada tal como petrolato.
Para la aplicacion topica a la piel, el polipeptido de anticuerpo de la invencion puede ser formulado como una pomada adecuada que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o mas de los siguientes: aceite mineral, petrolato lfquido, petrolato blanco, propilenglicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, pueden formularse como una locion o crema adecuada suspendida o disuelta en, por ejemplo, una mezcla de uno o mas de lo siguiente: aceite mineral, monoestearato de sorbitan, un polietilenglicol, parafina lfquida, polisorbato 60, cera de cetil esteres, alcohol cetearflico, 2-octildodecanol, alcohol bencflico y agua.
Las composiciones farmaceuticas seran administradas a un paciente en una dosis farmaceuticamente efectiva. Una “cantidad terapeuticamente efectiva”, o “cantidad eficaz”, o “terapeuticamente efectiva”, como se usa en la presente, se refiere a esa cantidad que proporciona un efecto terapeutico para una afeccion dada y regimen de administracion. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir un efecto terapeutico deseado en asociacion con el aditivo y diluyente requeridos, es decir, un vehfculo o vehfculo de administracion. Ademas, se pretende significar una cantidad suficiente para reducir y mas preferiblemente prevenir, un deficit clfnicamente significativo en la actividad, funcion y respuesta del anfitrion. Alternativamente, una cantidad terapeuticamente efectiva es suficiente para causar una mejora en una afeccion clfnicamente significativa en un anfitrion. Como se aprecia por los expertos en la tecnica, la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad especffica. Las cantidades de dosis adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composicion activa calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el diluyente requerido. En los metodos y uso para la fabricacion de las composiciones de la invencion, se proporciona una cantidad terapeuticamente efectiva del componente activo. Una cantidad terapeuticamente efectiva puede ser determinada por un medico o veterinario con experiencia ordinaria con base en las caracterfsticas del paciente, tal como edad, peso, sexo, condicion, complicaciones, otras enfermedades, etc., como es bien conocido en la tecnica. La administracion de la dosis farmaceuticamente efectiva puede ser realizada tanto como una unica administracion en la forma de una unidad de dosis individual o como unidades de dosis mas pequenas y tambien por multiples administraciones de dosis subdivididas en intervalos especfficos. Como alternativa, la dosis puede proporcionarse como una infusion continua durante un periodo prolongado.
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En el contexto del uso en diagnostico de los polipeptidos de anticuerpo de la invencion, una “cantidad farmaceuticamente efectiva”, o “cantidad eficaz”, o “diagnosticamente efectiva”, como se usa en la presente, se refiere e esa cantidad que proporciona una senal detectable para el diagnostico, por ejemplo para fines de formacion de imagen in vivo.
Los polipeptidos de anticuerpo pueden ser formulados a varias concentraciones, dependiendo de la eficacia/toxicidad del polipeptido que se usa. Por ejemplo, la formulacion puede comprender el polipeptido de anticuerpo activo a una concentracion de entre 0,1 pM y 1 mM, mas preferiblemente entre 1 pM y 500 pM, entre 500 pM y 1 mM, entre 300 pM y 700 pM, entre 1 pM y 100 pM, entre 100 pM y 200 pM, entre 200 pM y 300 pM, entre 300 pM y 400 pM, entre 400 pM y 500 pM, entre 500 pM y 600 pM, entre 600 pM y 700 pM, entre 800 pM y 900 pM o entre 900 pM y 1 mM. Normalmente, la formulacion comprende el polipeptido de anticuerpo activo a una concentracion de entre 300 pM y 700 pM.
Normalmente, la dosis terapeutica del polipeptido de anticuerpo (con o sin una porcion terapeutica) en un paciente humano estara en el intervalo de 100 pg a 1 g por administracion (con base en un peso corporal de 70kg, por ejemplo entre 300 pg a 700 mg por administracion). Por ejemplo, la maxima dosis terapeutica puede estar en el intervalo de 0,1 a 10 mg/kg por administracion, por ejemplo entre 0,1 y 5 mg/kg o entre 1 y 5 mg/kg o entre 0,1 y 2 mg/kg. Sera apreciado que esa dosis puede ser administrada a diferentes intervalos, como se determina por el oncologo/medico; por ejemplo, una dosis puede ser administrada diariamente, dos veces a la semana, semanalmente, bisemanalmente o mensualmente.
Sera apreciado por los expertos en la tecnica que las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden ser administradas solas o en combinacion con otros agentes terapeuticos usados en el tratamiento de canceres, tales como antimetabolitos, agentes de alquilacion, antraciclinas y otros antibioticos citotoxicos, alcaloides vinca, etoposido, compuestos de platino, taxanos, inhibidores de topoisomerasa I, inmunosupresores antiproliferativos, corticosteroides, hormonas sexuales y antagonistas de hormonas, y otros anticuerpos terapeuticos (tales como trastuzumab).
Sera apreciado ademas por los expertos en la tecnica que los polipeptidos y formulaciones farmaceuticas de la presente invencion tienen utilidad tanto en los campos medicos como veterinarios. Entonces, los metodos desvelados en el presente documento pueden ser usados en el tratamiento tanto de seres humanos como de animales (tales como cabLLAos, perros y gatos). Preferiblemente, sin embargo, el paciente es un ser humano.
Para uso veterinario, un compuesto de la invencion es administrado como una formulacion convenientemente aceptable de acuerdo con la practica veterinaria normal y el cirujano veterinario determinara el regimen de dosificacion y la ruta de administracion que sera mas apropiada para un animal particular.
Un tercer aspecto de la invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion para uso en medicina.
En una realizacion, los polipeptidos de anticuerpo y formulaciones de la invencion pueden ser usados para tratar pacientes o sujetos que sufren de o estan en riesgo de sufrir una enfermedad o indicacion para la cual IL1RAP es un biomarcador.
Entonces, un octavo aspecto relacionado de la invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion para uso en inducir la muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o proliferacion de celulas patologicas asociadas a un trastorno neoplasico en un sujeto, o mastocitos o celulas progenitoras del mismo, en donde las celulas expresan IL1RAP.
Un cuarto aspecto relacionado ademas de la invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun el primer aspecto de la invencion para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico en un sujeto, en donde el trastorno neoplasico se asocia a celulas que expresan IL1RAP. Tambien se desvela un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de acuerdo con el primer aspecto de la invencion para su uso en el diagnostico de dichos trastornos neoplasicos.
Por “tratamiento” se incluye tanto tratamiento terapeutico como profilactico del paciente. El termino “profilactico” se usa para abarcar el uso de un agente, o formulacion del mismo, como se describe en la presente que ya sea previene o reduce la probabilidad de un trastorno neoplasico, o el esparcimiento, diseminacion, o metastasis de celulas de cancer en un paciente o sujeto. El termino “profilactico” tambien abarca el uso de un agente, o formulacion del mismo, como se describe en la presente para prevenir la recurrencia de un trastorno neoplasico en un paciente quien ha sido tratado previamente para el trastorno neoplasico.
Por "diagnostico" incluimos la deteccion de celulas cancerosas, ya sea in vivo (es decir, dentro del cuerpo de un paciente) o ex vivo (es decir, dentro de un tejido o muestra de celula removida del cuerpo de un paciente).
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Por "un trastorno neoplasico asociado a celulas que expresan IL1RAP" incluimos esos trastornos en donde las celulas patologicas que son responsables, directa o indirectamente, del trastorno expresan IL1RAP en la superficie celular. Sera apreciado que las celulas que expresan IL1RAP pueden ser celulas de cancer, por ejemplo celulas de tumor, en si. Ademas, esas celulas incluyen mastocitos patologicos (es decir, mastocitos de cancer o CSC) y celulas progenitoras que son responsables, directa o indirectamente, del desarrollo de un trastorno neoplasico en un individuo. Ejemplos de CSC se revelan en Visvader y Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8:755-768.
Como alternativa, o ademas, las celulas que expresan IL1RAP pueden ser asociadas indirectamente al trastorno neoplasico, por ejemplo, pueden mediar los procesos celulares requeridos para que sobrevivan las celulas neoplasicas. El agente anticuerpo de la invencion puede en este evento dirigirse a las celulas esenciales para el suministro sangufnea del tumor (angiogenesis) o celulas que inhiben una respuesta inmune benefica dirigida contra las malignas (por ejemplo macrofagos supresores o linfocitos T).
Dependiendo de si es terapeuticamente deseable eliminar las celulas diana que expresan IL1RAP, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun el primer aspecto de la invencion puede ser usado que es capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, cuando las celulas diana de IL1RAP son celulas de cancer (tales como celulas de LMC, LMA, LLA, melanoma, cancer de pulmon, etc.) puede ser ventajoso para el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno ser capaz de inducir ADCC para eliminar esas celulas. Sin embargo, sera apreciado que tambien puede lograrse un beneficio terapeutico usando un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que carece de actividad de ADCC, por ejemplo a traves de la inhibicion de la senalizacion de IL-1 (o IL-33 o IL-36) llevando a una reduccion en la angiogenesis en la vecindad de un tumor.
En una realizacion, el trastorno neoplasico es un trastorno neoplasico hematologico.
Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en leucemia mieloide cronica (LMC), trastornos mieloproliferativos (TMP), sfndrome mielodisplasico (sMd), leucemia linfoblastica aguda (LLA) y leucemia mieloide aguda (LMA).
En otra realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo es para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico asociado a la formacion de tumores solidos dentro del cuerpo del sujeto.
Entonces, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser para uso en el tratamiento de un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer cervical, cancer osofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de rinon, cancer de hfgado, linfomas, cancer de ovario, cancer pancreatico, y sarcomas.
En relacion a los aspectos terapeutico y profilactico de la invencion, sera apreciado por los expertos en la tecnica que la union del polipeptido de anticuerpo a IL1RAP presente en la superficie de las celulas asociadas al trastorno neoplasico puede llevar a una modulacion (es decir, un aumento o disminucion) de una actividad biologica de IL1RAP. Sin embargo, ese efecto modulador no es esencial; por ejemplo, los polipeptidos de anticuerpo de la invencion pueden producir un efecto terapeutico y profilactico simplemente por virtud de unirse a IL1RAP en la superficie de las celulas asociadas al tumor solido, que a su vez puede activar el sistema inmune para inducir la muerte celular (por ejemplo por ADCC y/o por la presencia dentro del agente de una porcion citotoxica/radioactiva).
Por "actividad biologica de IL1RAP" incluimos cualquier evento de interaccion o senalizacion que involucra la IL1RAP en las celulas asociadas al trastorno neoplasico. Por ejemplo, en una realizacion el polipeptido de anticuerpo es capaz de bloquear la union de uno o mas correceptores a IL1RAP (tal como IL1R1, ST2, C-KIT y/o IL1RL2).
Esa inhibicion de la actividad biologica de IL1RAP por un polipeptido de anticuerpo de la invencion puede ser en todo o en parte. Por ejemplo, el agente puede inhibir la actividad biologica de IL1RAP por al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y lo mas preferiblemente por 100 % en comparacion con la actividad biologica de IL1RAP en celulas asociadas al trastorno neoplasico que no han sido expuestas al polipeptido de anticuerpo. En una realizacion preferida, el polipeptido de anticuerpo es capaz de inhibir la actividad biologica de IL1RAP por 50 % o mas en comparacion a la actividad biologica de IL1RAP en celulas asociadas al trastorno neoplasico que no han sido expuestas al polipeptido de anticuerpo.
Del mismo modo, sera apreciado que la inhibicion del crecimiento y/o proliferacion de las celulas asociadas al trastorno neoplasico puede ser en todo o en parte. Por ejemplo, el polipeptido de anticuerpo puede inhibir el crecimiento y/o proliferacion de las celulas asociadas al trastorno neoplasico por al menos 10 %, preferiblemente al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y lo mas preferiblemente por 100 % en comparacion al crecimiento y/o proliferacion de celulas asociadas al trastorno neoplasico que no han sido expuestas al polipeptido de anticuerpo.
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Tambien se desvela el uso de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o diagnostico de un trastorno neoplasico en un sujeto, en donde el trastorno neoplasico se asocia a celulas que expresan IL1RAP.
El trastorno neoplasico puede ser un trastorno neoplasico hematologico.
Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en leucemia mieloide cronica (LMC), trastornos mieloproliferativos (TMP), sfndrome mielodisplasico (sMd), leucemia linfoblastica aguda (LLA) y leucemia mieloide aguda (LMA).
El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico asociado a la formacion de tumores solidos dentro del cuerpo del sujeto.
Entonces, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser para uso en el tratamiento de un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer cervical, cancer osofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de rinon, cancer de hfgado, linfomas, cancer de ovario, cancer pancreatico, y sarcomas.
Tambien se desvela en el presente documento un metodo para el tratamiento o diagnostico de un trastorno neoplasico en un sujeto, que comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion, en donde el trastorno neoplasico se asocia a las celulas que expresan IL1RAP.
El trastorno neoplasico puede ser un trastorno neoplasico hematologico.
Por ejemplo, el metodo puede ser para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en leucemia mieloide cronica (LMC), trastornos mieloproliferativos (TMP), sfndrome mielodisplasico (SMD), leucemia linfoblastica aguda (LLA) y leucemia mieloide aguda (LMA).
El metodo puede ser para uso en el tratamiento y/o diagnostico de un trastorno neoplasico asociado a la formacion de tumores solidos dentro del cuerpo del sujeto.
Entonces, el metodo puede ser para uso en el tratamiento de un trastorno neoplasico seleccionado del grupo que consiste en cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/SNC, cancer cervical, cancer osofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de rinon, cancer de hfgado, linfomas, cancer de ovario, cancer pancreatico, y sarcomas.
Los polipeptidos de anticuerpo y formulaciones de la invencion pueden ser usados para tratar pacientes o sujetos quienes sufren de o estan en riesgo de sufrir una enfermedad o afeccion susceptible de tratamiento con un inhibidor de la senalizacion de IL-1 (o IL- 33 o IL-36).
Entonces, un quinto aspecto de la invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion para uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion susceptible de tratamiento con un inhibidor de senalizacion de IL-1.
Esas afecciones o estados de enfermedad son bien conocidos en la tecnica (vease Dinarello et al., 2012, Nature Reviews 11:633-652 y Dinarello, 2014, Mol. Med. 20 (supl. 1):S43- S58) e incluyen, pero no se limitan a, las siguientes:
Artritis reumatoide, todos los tipos de artritis juvenil incluyendo artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico (SOJIA), artrosis, sfndrome autoinflamatorio frfo familiar (FCAS), enfermedad de Muckle-pozos, enfermedad inflamatoria de multi-sistemas de inicio neonatal (NOMID), fiebre Mediterranea familiar (FMF), sfndrome de artritis piogena, pioderma gangrenosa y acne (PAPA), enfermedad de Still de inicio en adultos, sfndrome de hiper IgD, diabetes mellitus tipo 2, sfndrome de activacion de macrofagos, sfndrome periodico asociado al receptor de TNF, enfermedad de Blau, espondilitis anquilosante, enfermedad de Sweets, artritis lupus, enfermedad de Alzheimer, psoriasis, asma, ateroesclerosis, sarcoidosis, dermatitis atopica, lupus eritomatoso sistemico, penfigo ampolloso, diabetes mellitus tipo I, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, gastritis por Helicobacter pylori, enfermedad de intestino inflamado, Hepatitis C, lesion de reperfusion isquemica, esclerosis multiple, meningitis Neiserial o neumococal, tuberculosis, sfndrome de Bechet, choque septico, enfermedad de injerto contra anfitrion, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Alzheimer, ateroesclerosis, Leucemia de linfocitos T de adultos, mieloma multiple, periodontitis, obesidad y enfermedades relacionadas con la obesidad (por ejemplo, sfndrome metabolico, cardiomegalia, fLLAa cardfaca congestiva, venas varicosas, sfndrome de ovario poliqufstico, enfermedad de reflujo esofagico (GERD), enfermedad de hfgado graso, cancer colorrectal, cancer de mama, cancer uterino, fLLAa renal cronica, accidente cerebro-vascular e hiperuricemia), enfermedad de discos
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intervertebrales, sfndrome de intestino irritable, sfndrome de Schnitzler, dermatitis alergica/atopica y gota.
Tambien se cree que el bloqueo de la senalizacion de IL-1 es benefica en el tratamiento de infarto al miocardio. Un ensayo clfnico extenso actualmente busca confirmar la eficacia del bloqueo del anticuerpo de IL1B (usando Canakinumab) despues de infarto al miocardio (el ensayo CANTOS; vease Ridker et al., 2011, Am Heart Journal 162(4):597-605).
Para esas indicaciones, sera apreciado que un beneficio terapeutico puede tambien lograrse usando un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que se une a IL1RAP y bloquea asf la senalizacion de IL-1 (o IL-33 o IL-36) asociada a las celulas inmunes. Ese anticuerpo puede ser modificado para que carezca de actividad de ADCC.
Tambien se desvela el uso de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afeccion susceptible de tratamiento con un inhibidor de la senalizacion de IL-1 (o IL_33 o IL-36).
Tambien se desvela un metodo para el tratamiento de una enfermedad o afeccion susceptible de tratamiento con un inhibidor de senalizacion de IL-1 (o IL_33 o IL-36) en un sujeto, que comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion.
Tambien se desvela un metodo para el tratamiento mediado por ADCC o aumento de una enfermedad o afeccion susceptible de tratamiento con un inhibidor de senalizacion de IL-1 (o IL-33 o IL-36) en un sujeto, que comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion capaz de inducir ADCC.
Un sexto aspecto de la invencion proporciona un metodo in vitro para la deteccion de celulas de cancer en un sujeto, el metodo comprende:
(a) proporcionar una muestra de celulas (por ejemplo mastocitos de globulos blancos/celulas progenitoras o tejido de biopsia) de un sujeto a ser probado;
(b) opcionalmente, extraer y/o purificar las celulas presente en la muestra;
(c) poner en contacto un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del
mismo segun el primer aspecto de la invencion con celulas presentes en la muestra;
(d) determinar si el polipeptido de anticuerpo se une a las celulas
en donde la union del polipeptido de anticuerpo a las celulas es indicativo de la presencia de celulas de cancer en el tejido de un sujeto.
Un septimo aspecto de la invencion proporciona un metodo in vitro para identificar un paciente con cancer quien podrfa beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion, el metodo comprende:
(a) proporcionar una muestra de celulas de cancer (por ejemplo mastocitos de globulos blancos/celulas progenitoras o tejido de biopsia) de un paciente a ser probado;
(b) opcionalmente, extraer y/o purificar las celulas presentes en la muestra;
(c) poner en contacto un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion con celulas presentes en la muestra;
(d) determinar si el polipeptido de anticuerpo se une a las celulas
en donde la union del polipeptido de anticuerpo a las celulas de cancer es indicativa de un paciente quien se podrfa beneficiar del tratamiento con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion.
Los expertos en la tecnica apreciaran que hay muchas maneras de realizar dicho ensayo. Por ejemplo, el inmunoensayo podrfa ser ya sea homogeneo o, mas preferiblemente, heterogeneo. El ensayo podrfa tambien se realizo en un formato ya sea competitivo o, mas preferiblemente, uno no competitivo.
En una realizacion, la expresion de IL1RAP en muestras de sangre (leucemia) o biopsias (tumores solidos) de pacientes se mide usando citometrfa de flujo o inmunohistoqufmica, con la expresion arriba de un valor de umbral siendo indicativo de un paciente quien podrfa beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun el primer aspecto de la invencion.
En realizaciones preferidas de los metodos anteriores jn vitro, el paso (d) se realiza por citometrfa de flujo, inmunohistoqufmica o ELISA.
Sin embargo, pueden usarse otros ensayos adecuados para detectar las interacciones anticuerpo-antfgeno in vitro.
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Tambien se desvela en el presente documento un metodo para tratar un paciente con cancer, el metodo comprende administrar a un sujeto identificado como que tiene cancer usando un metodo segun los sexto o septimo aspectos de la invencion un agente terapeutico efectivo en el tratamiento de dicho cancer. El agente terapeutico de ejemplo puede ser un polipeptido de anticuerpo segun el primer aspecto de la invencion.
El metodo puede comprender:
(a) disponer una muestra de celulas (por ejemplo mastocitos de globulos
blancos/celulas progenitoras o tejido de biopsia) de un sujeto a ser probado para la presencia de celulas de cancer que expresan IL1RAP arriba de un criterio de umbral usando un metodo segun el sexto o septimo aspecto de la invencion;
(b) seleccionar para el tratamiento a sujetos cuya muestra de celulas probadas en el paso (a) contiene celulas de cancer con expresion de IL1RAP arriba de un criterio de umbral; y
(c) administrar al sujeto seleccionado en el paso (b) un agente terapeutico efectivo en el tratamiento de dicho cancer, por ejemplo un polipeptido de anticuerpo segun el primer aspecto de la invencion.
El metodo puede comprender:
(a) obtener una muestra de celulas (por ejemplo, mastocitos de globulos blancos/celulas progenitoras o tejido de biopsia) de un sujeto
(b) probar dichas celulas para la presencia de celulas de cancer que expresan IL1RAP arriba de un criterio de umbral usando un metodo segun el sexto o septimo aspecto de la invencion;
(c) seleccionar para el tratamiento a sujetos cuya muestra de celulas probadas en el paso (b) contiene celulas de cancer con expresion de IL1RAP arriba de un criterio de umbral; y
(d) administrar al sujeto seleccionado en el paso (c) un agente terapeutico efectivo en el tratamiento de dicho cancer, por ejemplo un polipeptido de anticuerpo segun el primer aspecto de la invencion.
Las preferencias y opciones por un aspecto, caracterfstica o parametro dado de la invencion deben, a menos que el contexto lo indique de otro modo, ser considerado como revelado en combinacion con cualquiera y todas las preferencias y opciones para todos los otros aspectos, caracterfsticas y parametros de la invencion. Por ejemplo, se desvela un anticuerpo IgG1 intacto que comprende una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:9 y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:16 para uso en el tratamiento de LMA.
El anuncio o la discusion de un documento aparentemente publicado antes en esta especificacion no debe necesariamente tomarse como un reconocimiento de que el documento es parte del estado de la tecnica o es de conocimiento general comun.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el termino "comprende" en las reivindicaciones y/o la especificacion puede significar "uno," pero tambien es consistente con el significado de "uno o mas," "al menos uno," y "uno o mas que uno."
Los dibujos siguientes forman parte de la presente especificacion y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion puede ser comprendida mejor con referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detLLAada de las realizaciones especfficas presentadas en la presente.
Figura 1. Union del anticuerpo a modo de ejemplo en una ELISA indirecta a IL-1RAP humana. Se encontro que el anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion, CAN04, posee la afinidad mas alta para IL-1RAP humana.
Figuras 2. Union del anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) a celulas de LMC y LMA humana. (A) El grafico muestra el valor de MFI para las celulas KU812 tenidas con anticuerpos monoclonales direccionados a IL1RAP a una concentracion de 0,1 pg/ml, y revela que CAN04 tiene el MFI mas alto de los anticuerpos comparados. (B) El CAN04 muestra union especffica a cinco muestras de LMA primaria. (C) En tres muestras de LMC primaria, el CAN04 muestra union especffica.
Figura 3. Las variantes humanizadas a modo de ejemplo del anticuerpo CAN04 se unen todas a las celulas BV173 que expresan IL1RAP, con la variante 6 mostrando la intensidad fluorescente media mas alta.
Figuras 4. La capacidad del anticuerpo a modo de ejemplo CAN04 para bloquear la senalizacion de (A) IL-1p (B) IL-1 a, y (C) IL-33.
Figura 5. La expansion celular total de las celulas de LMC primitivas primarias en presencia de IL1b se reduce apreciablemente con el anticuerpo CAN04 a modo de ejemplo en comparacion tanto con el control como con un anticuerpo de referencia. El grafico muestra el resultado combinado de tres muestras individuales del paciente normalizadas al control que consiste en cultivar sin anticuerpo o con anticuerpo de isotipo de control.
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Figuras 6. El ensayo in vitro de ADCC muestra que el anticuerpo CAN04 a modo de ejemplo induce la eliminacion celular espedfica de las celulas de LMC. (A) Las celulas KU812, LAMA84, y BV173 fueron eliminadas espedficamente por adicion de 0,1 pg/ml de CAN04. (B) La eliminacion celular mediada por el anticuerpo CAN04 a modo de ejemplo es dependiente de la dosis como se muestra en las celulas diana BV173. (C) La eliminacion celular de las celulas primarias de dos pacientes con crisis blastica de LMC se indujo por 1 pg/ml de CAN04. (D). Las celulas de un tercer paciente con crisis blastica de LMC portando la mutacion T315I fueron sensibles al efecto de ADCC mediado por CAN04. Cada experimento se realizo al menos dos veces con celulas NK de diferentes donadores, y los datos presentados muestran un experimento representativo de cada uno.
Figura 7. El ensayo in vitro de ADCC muestra que el anticuerpo CAN04 a modo de ejemplo es eficiente para inducir eliminacion celular espedfica de celulas de melanoma (lmea celular SKMEL5). A todas las concentraciones probadas, tan poco como 0,1 pg/ml de CAN04 muestra una alta eliminacion espedfica. El experimento se realizo al menos dos veces con celulas NK de diferentes donadores, y los datos presentados muestran un experimento representativo.
Figuras 8 (A) Imagenes confocales (una seccion optica, aproximadamente 0,9 pm de espesor) mostrando las celulas LAMA incubadas por 2 horas con anticuerpos conjugados de CAN04-AF488 (verde) en hielo, o a 37 °C por 2 horas, o siendo incubadas con anticuerpos conjugados de CAN04-AF488 (verde) por 16 horas a 37 °C. Un anticuerpo definido claramente que se une a la membrana celular de la mayona de las celulas puede ser observado despues de 2 horas de incubacion en hielo ("Hielo 2h)". Despues de la incubacion por 2 horas con los anticuerpos conjugados de CAN04-AF488 (verde) a 37 °C, ademas de la union a la membrana, los anticuerpos comenzaron a entrar a las celulas (internalizacion) y ahora se localizan tambien en el citosol. Despues de 16 horas de incubacion a 37 °C, la union a la membrana celular aun esta presente y la internalizacion del anticuerpo ha producido la acumulacion de anticuerpos de CAN04- AF488 en la mayona de las celulas. La barra de escala (imagen derecha) representa 20 pm en todas las imagenes. (B) Control para la union espedfica de CAN04 e internalizacion: Las imagenes confocales (una seccion optica, aproximadamente 0,9 pm de espesor) muestra las celulas LAMA incubadas con anticuerpo de isotipo de control conjugado a AF488 en hielo o a 37 °C por 2 horas, o a 37 °C por 16 horas. El anticuerpo de isotipo de control no mostro union espedfica en cualquiera de estas condiciones. Se aprecio una union menor a desechos celulares y celulas necroticas (verde claro). La barra de escala (imagen derecha) representa 20 pm en todas las imagenes.
Figuras 9. El tratamiento con CAN04 redujo apreciablemente la carga de leucemia. (A) La frecuencia de las celulas leucemicas en la sangre periferica fue menor en ratones tratados con el anticuerpo CAN04 a modo de ejemplo en comparacion al isotipo de control en el dfa 36 despues del transplante (1,2 % contra 22,7 %, p<0,0001). (B) El conteo de plaquetas (PLT) permanecio a niveles normales con el CAN04 (p=0,0001). (C) Al momento del sacrificio la frecuencia de las celulas leucemicas en la medula osea se redujo con CAN04 (38,7 % contra 91,5 %; p<0,0001). (D) La frecuencia de las celulas leucemicas en el bazo fue menor en los ratones tratados con CAN04 en comparacion al isotipo de control (27.6 % contra 70,4 %; p = 0,0063).
Figuras 10. El efecto de la baja fucosa y mutaciones de Fc en la actividad de ADCC, como se determina usando celulas SKMEL5. (A) Actividad de ADCC en SKMEL-5 de CAN04 (Fc-1) con fucosa normal, CAN04 (Fc-1) con baja fucosa, Fc-4 y Fc-7. (B) Actividad de ADCC en SKMEL-5 de CAN04 (Fc-1) con fucosa normal, CAN04 (Fc- 1) con baja fucosa, Fc-2 y Fc- 3. (C) Actividad de ADCC en SKMEL-5 de CAN04 (Fc-1) con fucosa normal, CAN04 (Fc-1) con baja fucosa, Fc-5, Fc-6 y Fc-8.
Ejemplos
EJEMPLOS
A. Afinidad de union de los anticuerpos a modo de ejemplo de la invencion para la protelna IL1-RAP
(i) Estudio de Biacore - anticuerpos anti-ILIRAP de origen de murino Materiales y Metodos
Se inmovilizo IgG cabra anti-raton en una placa CM5 segun el manual tecnico del kit de captura y principio de operacion estandar de BIAcore T200 (Biacore Life Sciences, GE Healthcare Europe GmbH, Uppsala, Suecia).
El ciclo de analisis de union consistio de tres pasos: (i) captura del ligando en la superficie de la placa por el anticuerpo anti-raton inmovilizado; (ii) union del analito al ligando capturado; y (iii) disociacion del analito unido.
La superficie de la molecula de captura se regenero despues de cada ciclo de union usando las condiciones recomendadas por el fabricante.
Todos los ciclos de union se realizaron a 25 °C.
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Despues de cinco ciclos de arranque, cada anticuerpo (100 nM) se inyecto a un caudal de flujo de 30 pl/min, por 120 s, al comienzo del ciclo; luego el analito (100 nM) se inyecto a una velocidad de flujo de 30 pl/min, por 120 s, seguido por el monitoreo de la fase de disociacion por 300 s.
Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) se probo junto con dos anticuerpos anti-IL1RAP comparadores (CAN01 y CAN03).
Resultados y Conclusiones
Los resultados se muestran en la Tabla 2 siguiente:
El anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion, CAN04, exhibio la afinidad mas alta para la IL1RAP humana.
(ii) Estudio de ELISA - anticuerpos anti-ILIRAP de origen de murino Materiales y Metodos
Se realizo un ensayo ELISA indirecto. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Placas Nunc-MaxiSorp 96 Micro Well™ se revistieron con 100 ng de hILIRAP 21-367 recombinante (100 pl/pozo) diluido en PBS 0,01 M, pH 7,4, e incubado durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con regulador de lavado de ELISA (PBS 0,01 M, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4) seguido por un paso de bloqueo usando 150 pl/pozo de solucion de bloqueo de ELISA (PBS, 0,5 % de BSA, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4). Despues de 1 h de incubacion a temperatura ambiente (TA) en agitacion las placas se lavaron de nuevo usando regulador de lavado de ELISA. Las muestras se diluyeron en una dilucion serial de tres veces (variando de 1000 ng/ml a 0,5 ng/ml) en solucion de bloqueo de ELISA y luego se transfirieron a la placa de ELISA, 100 pl/pozo. Las placas se incubaron a TA por 1 h en agitacion y luego se lavaron con solucion de lavado de ELISA. 100 pl/pozo de IgG conejo anti-raton IgG conjugado a Fosfatasa Alcalina (DAKO, 1:1000) se agrego y se incubo 1 hora a TA en agitacion. Las placas se lavaron seguido por adicion de sustrato (sal hexahidratada de 4-Nitrofenil fosfatisa disodica, SIGMA, 1 mg/ml), 100 pl/pozo. Despues las placas se incubaron a TA en agitacion y se midio la absorbancia a 405 nm consecutivamente por 30 min. La absorbancia a 0 min se tomo como senal de fondo.
Resultados y Conclusiones
Los resultados se muestran en la Figura 1.
Se encontro que el anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion, CAN04, posee la afinidad mas alta para la union a IL-1RAP humana.
(iii) Estudio de ELISA - versiones humanizadas del anticuerpo “CAN04" a modo de ejemplo Materiales y Metodos
Los dominios variables de cadena pesada y ligera de dieciseis variantes humanizadas de CAN04 (hCAN04) se subclonaron en vectores con dominios constantes humanos:
- El dominio constante kappa por el dominio VL [SEQ ID NO:18]
- La constante de cadena pesada de IgG1za por el dominio VH [SEQ ID NO:19]
Los anticuerpos se expresaron transitoriamente en celulas CHOK1SV en un volumen de 200 ml (matraz de agitacion).
Los anticuerpos se purificaron usando cromatograffa de afinidad de la Protefna A.
Los anticuerpos purificados se analizaron por SDS-PAGE y SE-HPLC.
Se realizo un ensayo ELISA indirecto como se describio antes con la alteracion de que las muestras se diluyeron en una dilucion serial de tres veces iniciando a 3,5 nM y corridas en replicas de cuatro.
Tabla 2
Medicion de Kon, Koff y Kd
Anticuerpo ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M)
D
CAN01 2,34E+05
CAN03 2,26E+05
CAN04 4,27E+05
3,35E-04 1,43E-09
7,25E-05 3,21 E-10
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Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Afinidad hacia hIL1RAP determinada mediante ELISA
Anticuerpo
Cadena pesada* Cadena ligera** Kd (pM)
CAN04 (murino)
SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 2 88 ± 2
hCAN04 Variante
1 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 15 125 ± 2
hCAN04 Variante
2 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 15 171 ± 4
hCAN04 Variante
3 SEQ ID NO 10 SEQ ID NO 15 450 ± 68
hCAN04 Variante
4 SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 15 470 ± 50
hCAN04 Variante
5 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 16 135 ± 2
hCAN04 Variante
6 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 16 173 ± 4
hCAN04 Variante
7 SEQ ID NO 10 SEQ ID NO 16 526 ± 44
hCAN04 Variante
8 SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 16 402 ± 64
hCAN04 Variante
9 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 17 210 ± 4
hCAN04 Variante
10 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 17 301 ± 5
hCAN04 Variante
11 SEQ ID NO 10 SEQ ID NO 17 504 ± 26
hCAN04 Variante
12 SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 17 620 ± 68
* La cadena pesada tambien comprendio los dominios constantes de cadena pesada de IgGIza [SEQ ID NO: 19].
** La cadena ligera tambien comprendio un dominio constante kappa [SEQ ID NO: 18],_______________
Cuatro de las dieciseis versiones humanizadas de CAN04 mostraron minima o ninguna union a IL1RAP (no se muestran los datos).
B. Union de anticuerpos a modo de ejemplo de la invencion a celulas que expresan IL1RAP
(i) Estudio de citometrfa de flujo - anticuerpos anti-ILIRAP de origen de murino Materiales y Metodos
Celulas KU812 de la linea celular de leucemia mieloide cronica (LMC) se tineron con anticuerpos criados contra IL1RAP o un isotipo de control relevante. Para la deteccion, se uso un anti-mIg-APC secundario.
Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) se probo junto con siete anticuerpos comparadores anti- IL1RAP (CAN01, CAN02, CAN03, CAN05, CAN07, CAN08 y CAN09). Tambien se incluyo un anticuerpo de isotipo de control negativo.
Para el analisis de las celulas leucemicas primarias, tres muestras de paciente con LMC enriquecidas con CD34 y cinco muestras de paciente con leucemia mieloide aguda (LMA) enriquecidas por celulas mononucleares se tineron con CAN04-PE a concentraciones de 1 pg/ml y 5 pg/ml respectivamente, o un isotipo de control conjugado a PE. Las celulas se analizaron usando un citometro de flujo FACS CANTO (BD).
Resultados y Conclusiones
La tincion de las celulas leucemicas KU812 que expresan IL1RAP revela una mayor intensidad de fluorescencia media (MFI) para CAN04 en comparacion al isotipo de control y otros anticuerpos comparadores dirigidos a IL1RAP (Figura 2A). El marcado de las celulas primarias de cinco LMA y tres LMC pacientes usando CAN04 resulto en la tincion arriba del isotipo de control en los analisis citometricos de flujo (Figuras 2B a 2C). El presente estudio muestra que CAN04 se une especificamente a IL1RAP con un mayor MFI que otros anticuerpos monoclonales en una linea celular de LMC, y que CAN04 tambien se une a las celulas primarias de LMC y LMA.
(ii) Estudio de citometrfa de flujo - versiones humanizadas del anticuerpo “CAN04"
Materiales y Metodos
Celulas BV173 de la linea celular de leucemia mieloide cronica (LMC) se tineron con 1 pg/ml de anticuerpo de
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prueba o un isotipo de control relevante. Para la deteccion, se uso un anti-hIgG-PE secundario. Las celulas se analizaron usando un citometro de flujo FACS CANTO (BD).
Los anticuerpos de prueba incluyeron un anticuerpo quimerico anti-ILIRAP (“quimario”) y doce diferente versiones humanizadas del anticuerpo a modo de ejemplo CAN04 de la invencion (“Vari” a “Var 12”).
Resultados y Conclusiones
La tincion de las celulas leucemicas BV173 que expresan ILiRAP muestra que las variantes humanizadas de CAN04 se tinen con diferente intensidad, pero a todos niveles por arriba del isotipo de control (vease la Figura 3. Las variantes humanizadas 1, 2, 5, 6, 9 y 10 de CAN04 (vease la Tabla 3) exhiben el marcaje mas fuerte.
C Mapeo de epftopo / dominio de los anticuerpos a modo de ejemplo de la invencion
Materiales y Metodos
Para comprender donde se unen los diferentes clones de anticuerpo en el IL1RAP, se realizo un analisis estructural de la protefna revelando que la parte extracelular del receptor podrfa dividirse en tres distintos dominios en lo siguiente llamados dominios 1, 2 y 3 (D1, D2, D3) (vease Wang et al., 2010, Nature inmunology, 11:905-912). Para determinar el patron de union al dominio por los diferentes clones de anticuerpos, se genero un series de construcciones del receptor y la union a estos se probo en un ensayo ELISA.
Se realizo un ensayo ELISA indirecto. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Placas Nunc-MaxiSorp 96 Micro Well™ se revistieron con 100 ng de Rec hIL1RAP Domain123 (aa21-367) (control positivo), Rec hIL1RAP Domain12 (aa21-234), Domain1 (aa21-134) o Rec hIL1RAP Domain3 (aa235-367) (100 pl/pozo) diluido en PBS 0,01 M, pH 7,4, y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con regulador de lavado de ELISA (PBS 0,01 M, 0,05 % Tween 20, pH 7,4) seguido por un paso de bloqueo usando 150 pl/pozo de solucion de bloqueo de ELISA (PBS, 0,5 % de BSA, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4). Despues de 1 h de incubacion a temperatura ambiente (TA) en agitacion las placas se lavaron de nuevo usando regulador de lavado de ELISA. CAN01, CAN03, CAN04, CAN05, CAN07, CAN08 y KMT-1 (control positivo) se diluyeron en dilucion serial de tres veces (variando de 1000 ng/ml a 0,5 ng/ml) en solucion de bloqueo de ELISA y luego se transfirieron a la placa de ELISA, 100 pl/pozo. Las placas se incubaron a TA por 1 h en agitacion y luego se lavaron con solucion de lavado de ELISA. 100 pl/pozo de IgG conejo anti-raton conjugado a fosfatasa alcalina (DAKO, 1:1000) se agrego y se incubo 1 hora a TA en agitacion. Las placas se lavaron seguido por la adicion de sustrato (sal hexahidratada de 4-Nitrofenil fosfatisa disodica, SIGMA, 1 mg/ml), 100 pl/pozo. Despues las placas se incubaron a TA en agitacion y se midio la absorbancia a 405 nm consecutivamente por 30 min. La absorbancia a 0 min se tomo como senal de fondo.
Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) se probo junto con nueve anticuerpos monoclonales anti- IL1RAP comparadores (CAN01, CAN02, CAN03, CAN05, CAN07, CAN08, CAN10, y CAN11, junto con un anticuerpo policlonal anti-IL1RAP (KMT-1) como un control positivo.
Resultados y Conclusiones
Una mayorfa de los anticuerpos anti-IL1RAP probados para validacion de diana se unieron al dominio 3 (D3). Sin embargo, el anticuerpo a modo de ejemplo CAN04 de la invencion es distinto en que se une al dominio 2 (D2). Los datos completos del mapeo del dominio se encuentran resumidos en la Tabla 4 siguiente.
Tabla 4
Mapeo de epftopo de los clones del anticuerpo a modo de ejemplo anti-IL1RAP
Clon
Dominio123 Dominio12 Dominio1 Dominio3 Epitopo
(aa21-367)
(aa21-234) (aa21-134) (aa235-367) sugerido
CAN03
+ + D3
CAN05
+ + + D1
CAN07
+ + D3
CAN08
+ + D3
CAN04
+ + D2
CAN01
+ + D3
CAN02
+ nd*
KMT-1
+ + + + policlonal
nd* = no determinado ya que los datos de mapeo del epftopo no pudieron identificar claramente el dominio especffico para estas construcciones, lo que puede atribuirse a la union a un epftopo estructural que contiene elementos de secuencia de mas de un dominio, por ejemplo, la union D2-D3.___________
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D. Especificidad / reactividad cruzada de los anticuerpos a modo de ejemplo de la invention
Materiales y Metodos
Un aspecto importante de un anticuerpo candidato que lidere bien es que reaccione de forma cruzada con la misma o casi la misma potencia que la protefna homologa en una especie relevante en toxicologfa. Segun los lineamientos normativos generales, la union a uno de roedor y a uno no de roedor serfa el escenario preferido, pero para los anticuerpos este es raramente el caso, en cambio muchos laboratorios tienen problemas para identificar cualquier especie relevante en toxicologfa excepto para los primates.
Para el presente estudio, se esperaba la reaccion cruzada a primates no humanos tales como Macaca mulata (rhesus) o Macaca fascicularis (cynomolgus) ya que la protefna IL1RAP en estas especies comparte 99 % de homologfa a la protefna humana IL1RAP.
Un numero de anticuerpos lfderes potenciales se seleccionaron y probaron para unirse a IL1RAP recombinante de M. fascicularis (aa21-367) en un ensayo de ELISA.
Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) se probo junto con ocho anticuerpos monoclonales anti- IL1RAP comparadores (CAN01, CAN02, CAN03, CAN07, CAN08, CAN09, Mab676 de R&D, y un anticuerpo policlonal anti-IL1RAP (KMT-1).
Resultados y Conclusiones
Sorprendentemente, se encontro que muchos anticuerpos anti-IL1RAP comparadores probados no reaccionaron de manera cruzada con el IL1RAP de cynomolgus, entre ellos el anticuerpo de referencia comercial mAb676 de R&D, Tabla 5.
Tabla 5
Union a IL1RAP de macaco
(Los valores en negrita denotan los clones que se identifico reaccionan de manera cruzada con la IL1RAP
de M fascicularis)
Clon Union a rec. M. fascicularis IL1RAP (OD405)
CAN01
CAN02
CAN09
CAN03
CAN04
CAN07
CAN08
mAb676 (R&D) KMT-1
0,324
0,014
0,022
0,870
0,416
0,111
0,375
0,037
0,481
E. Inhibition de la senalizacion de IL-1a, IL-ip y IL-33 por los anticuerpos a modo de ejemplo de la invention
(i) Efecto de CAN04 en la senalizacion de IL-1 en la linea celular HEK-Blue IL-33/IL-1 p Materiales y Metodos
Ya que IL1 RAP es una parte funcional del complejo receptor de IL-1, los anticuerpos que se unen a IL1 RAP tambien pueden inhibir la senalizacion de IL-1. Ya que un numero de tipos de celulas de tumor han demostrado usar la IL-1 como un factor de crecimiento, esto puede ser un importante mecanismo adicional para mediar los efectos antitumor.
Para la prueba de la capacidad de los anticuerpos candidatos lfderes potenciales de bloquear la senalizacion de IL- 1, se establecio un ensayo de gen reportero dependiente de IL-1. Las celulas HEK-Blue IL-33/IL-1 p (InvivoGen) respondieron a la senalizacion de IL-1 por la liberacion de fosfatasa alcalina que puede ser cuantificada por un ensayo colorimetrico. Para probar la capacidad inhibidora de los candidatos lfderes, celulas HEK-Blue se colocaron en placas a 50 000 celulas/pozo y se incubaron con los anticuerpos de prueba 45 minutos antes del estfmulo con IL- 1a, IL-1 p o IL-33 en una concentracion final del ensayo de 0,3 ng/ml por cada ligando. Las concentraciones finales en el ensayo de los anticuerpos fueron 100 nM - 0,01 nM. En los pozos de control, los anticuerpos se reemplazaron por PBS. Las celulas se incubaron a 37 °C o/n antes de medir la cantidad de fosfatasa alcalina liberada. Los anticuerpos tambien se probaron para los efectos agonfsticos potenciales por incubar las celulas en la presencia de una alta concentracion de anticuerpo (10 mg/ml) en la ausencia de estfmulos adicionales. Cualquier efecto agonfstico de IL-1R podrfa entonces ser registrado como una liberacion de fosfatasa alcalina.
Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) se probo junto con dos anticuerpos monoclonales anti- IL1RAP comparadores (CAN01 y CAN03) y un isotipo de control negativo.
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Como se representa en la Figura 4A, el anticuerpo a modo de ejemplo CAN04 indujo una inhibicion pronunciada de senalizacion de IL-1p. El anticuerpo CAN03 comparador tambien produjo una inhibicion detectable pero apreciablemente menor que CAN04. Ninguno del CAN01 comparador ni el isotipo de control produjo cualquier inhibicion medible de la senalizacion de IL1.
Ademas de bloquear la IL-1p, CAN04 es tambien un potente inhibidor de la senalizacion de IL-1 a y IL-33; vease las Figuras 4B y 4C, respectivamente.
Ninguno de los candidatos probados mostro algun efecto agonfstico.
(ii) Efecto en celulas primarias de LMC Materiales y Metodos
Aspirados de medula osea o sangre periferica se extrajeron de tres pacientes con leucemia mieloide cronica (LMC) en fase cronica. Se aislaron celulas mononucleares por centrifugacion sobre Lymphoprep, y las muestras se enriquecieron por celulas CD34+ usando un anticuerpo anti-CD34 y perlas magneticas (Miltenyi biotech.) Las celulas CD34+ se mantuvieron en nitrogeno lfquido hasta su uso, cuando se descongelaron y tineron con anticuerpos contra CD34 y CD38. Se uso yoduro de propidio como un marcador viable. Usando un clasificador celular FACS Aria, se clasificaron las celulas viables CD34+CD38- a una densidad de 2500 celulas por pozo en placas tratadas de cultivo de tejido de 96 pozos con 100 pl de medio de cultivo Stemspan libre de suero sin suplementos. Despues del clasificado, IL1b y el anticuerpo de prueba se agregaron a los pozos en un total de 100 ul de Stemspan para producir un volumen final de 200 pl por pozo con 0-0,4 ng/ml de IL1b y 0-10 pg/ml de anticuerpo. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % CO2, por 7 dfas despues de lo cual se conto el numero de celulas viables (7AAD-) usando perlas de conteo Countbright y un FACS Canto.
Un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion (CAN04) se probo junto con anticuerpos monoclonales anti- IL1RAP comparadores (CAN01) y un anticuerpo de isotipo de control negativo.
Resultados y Conclusiones
Como se muestra en la Figura 5, el cultivo de celulas de LMC de fase cronica primaria CD34+CD38 en la presencia de IL1b resulta en una mayor expansion celular. El aumento inducido por IL1 en la expansion celular se redujo apreciablemente con la adicion del anticuerpo a modo de ejemplo CAN04 al cultivo (p<0,0001). Tambien en comparacion con otros anticuerpos dirigidos a IL1RAP, CAN01, el CAN04 es apreciablemente mas efectivo en reducir la expansion celular total (p = 0,0022). Concluimos que la union de CAN04 a IL1RAP interfiere con el estfmulo en la expansion celular inducida por IL1 en celulas de LMC primitivas primarias.
F. Efecto en ADCC de los anticuerpos a modo de ejemplo de la invencion
(i) Lfneas celulares de leucemia mieloide cronica (LMC)
Materiales y Metodos
Las lfneas celulares de leucemia mieloide cronica (LMC) KU812, LAMA84 y BV173, o celulas primarias de tres pacientes con LMC en crisis blastica se usaron como celulas diana en el ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo in vitro (ADCC). Brevemente, las celulas diana se marcaron con PKH26 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) segun las instrucciones del fabricante, y se sembraron en una placa de 96 pozos a una densidad de 5.000-10.000 celulas por pozo. Subsiguientemente, el anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion, CAN04, o anticuerpo de isotipo de control se agrego a los pozos en diferentes concentraciones y se incubo por 30 min antes de agregar 100,000 NK de celulas efectoras a cada pozo. Se extrajeron celulas de voluntarios sanos despues de consentimiento informado usando un kit de aislamiento celular negativo de celulas NK segun las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Se uso un anticuerpo IgGl humano no especffico como un isotipo de control negativo en los experimentos (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA). El grado de muerte celular se evaluo por deteccion de celulas positivas 7-AAD usando un citometro de flujo FACS CANTO (BD). Cada experimento se realizo al menos dos veces con celulas NK de diferentes donadores.
Resultados y Conclusiones
El ensayo de ADCC in vitro ADCC muestra que el anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion, CAN04, dirige las celulas NK a eliminar las lfneas celulares de LMC KU812, LAMA84 y BV173 a un mayor grado que el isotipo de control (Figura 6A). Una titulacion de la dosis de CAN04 usando celulas diana BV173 muestra que el efecto en la eliminacion celular es dependiente de la dosis con un mayor grado de eliminacion celular con el aumento en la concentracion de CAN04 (Figura 6B). La leucemia mieloide cronica que has progresado a crisis de blastos muestra
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solo un efecto transitorio al tratamiento con inhibidores de tirosina cinasa y entonces impone un problema mayor de tratamiento. El ensayo de ADCC con celulas primarias de dos pacientes con crisis blastica con LMC individual muestran que estas celulas fueron sensibles a la citotoxicidad inducida por CAN04 y celulas NK (Figura 6C). Ademas, las celulas de un tercer paciente con crisis blastica de LMC albergando la mutacion T315I que causa resistencia a muchos inhibidores de tirosina cinasa presentan una sensibilidad similar (Figura 6D). En conjunto, los experimentos muestran que el CAN04 tiene la capacidad de dirigir las celulas NK a una eliminacion celular especffica las lfneas celulares de LMC asf como celulas de LMC con crisis blastica primaria, y que el efecto citotoxico inducido por CAN04 es dependiente de la dosis.
(ii) Lfneas celulares de melanoma
Materiales y Metodos
La lfnea celular de melanoma maligno SKMEL-5 se uso como una diana para el ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo in vitro (ADCC). Brevemente, las celulas diana se marcaron con PKH26 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) segun las instrucciones del fabricante, y se sembraron en una placa de 96 pozos a una densidad de 5,000-10,000 celulas por pozo. Subsiguientemente, se agrego CAN04, o el anticuerpo de isotipo de control a los pozos en diferentes concentraciones y se incubo por 30 min antes de agregar 100.000 NK de celulas efectoras a cada pozo. Se extrajeron celulas de voluntarios sanos despues de consentimiento informado usando un kit de aislamiento celular negativo de celulas NK segun las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Se uso un anticuerpo IgG1 humano no especffico como un control en los experimentos (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA). El grado de muerte celular se evaluo por deteccion de celulas positivas 7- AAD usando un citometro de flujo FACS CANTO (BD). Cada experimento se realizo al menos dos veces con celulas NK de diferentes donadores.
Resultados y Conclusiones
El ensayo de ADCC in vitro mostro que el CAN04 se dirige a las celulas NK para eliminar la lfnea celular SKMEL-5 a un grado mucho mayor que un isotipo de control coincidente (Figura 7). La titulacion de la dosis de CAN04 mostro que el CAN04 es eficiente para inducir ADCC, a bajas concentraciones (Figura 7). En resumen, estos datos demuestran que el CAN04 tiene la capacidad de dirigir las celulas NK a una eliminacion celular especffica de SKMEL-5 en una manera dependiente de la dosis y que CAN04.
G. Internalizacion de los anticuerpos a modo de ejemplo de la invencion
Materiales y Metodos
Celulas y condiciones de cultivo: Celulas LAMA-84, una lfnea celular establecida de un paciente con leucemia mieloide cronica en crisis blastica, se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania) y se cultivaron segun la recomendacion por el proveedor. Brevemente, las celulas se cultivaron en RPMI 1640 con 10 % de FBS, 1 % de Glutamina y 1 % de Penicilina/ Estreptomicina en 5 % de CO2, 37 °C. Los cultivos celulares se dividieron a una densidad de 0,5 x 106 celulas/ml cada 2-3 dfas. Las celulas se usaron por hasta 12 pasajes despues de ser recibidas de DSMZ.
Las celulas de la suspension de lfnea celular LAMA-84 se lavaron una vez en salina regulada con fosfato (PBS) se suplementaron con 1 % de Albumina de Suero bovino (BSA) y se volvieron a suspender en PBS-BSA se suplementaron con 5 % de suero humano AB+ de Sigma y se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente (TA). El anticuerpo CAN04 selectivo de IL-1RAP marcado con AlexaFluor488 (AF488), o el anticuerpo de control de isotipo coincidente, se agrego a una concentracion final de 10 pg/ml. Las celulas se colocaron (incubadas) en hielo o a 37 °C por 2 o 16 horas.
Para el analisis de imagen con microscopfa confocal (Microscopio confocal LSM 510 Meta Zeiss), las celulas se lavaron dos veces en PBS-1 % de BSA, se centrifugaron brevemente seguido por resuspension en 3 % de fijacion de paraformaldehfdo (en PBS) por 20 minutos (a 4 °C). Luego las celulas se centrifugaron, se volvieron a suspender en PBS con 0,001 % de Triton X-100 (PBS-TX) y un marcador nuclear (DAPI), y se dejaron incubar por 5 minutos a TA. Despues de una breve centrifugacion las celulas se volvieron a suspender en PBS-TX y se colocaron en pozos de microscopio con fondo de vidrio. Luego las celulas se dejaron adherir por una hora. Se recolectaron datos de imagen a traves de escaneo confocal de las celulas proporcionando imagenes de alta resolucion de fluorescencia de AlexaFluor488 en secciones opticas delgadas a traves del centro de las celulas (representado por un marcado nuclear). Analisis posterior del anticuerpo de union a la membrana celular y/o anticuerpos internalizados se realizaron a traves de analisis de imagen por software (Zeiss Zen2010).
Resultados y Conclusiones
La relacion estructural de la union de CAN04 a la membrana celular y su capacidad de entrar a las celulas ("internalizar") se demuestra con los datos de formacion de imagen de alta resolucion registrados por medio de
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microscopfa de escaneo de laser confocal, y por analisis de imagen de estos datos.
Las representaciones de los datos de imagen se muestran en la Figura 8.
H. Eficacia terapeutica in vivo de un anticuerpo a modo de ejemplo de la invencion
Materiales y Metodos
Ratones sin acondicionar NOD/SCID se injertaron con dosis letales de celulas MA9Ras, generadas previamente por la transformacion de celulas CD34+ sangufneas de cordon umbilical humano por integracion retrovfrica de ADNc que dirigen la expresion de una fusion de MLL/AF9 y un gen NRAS activado. Los ratones leucemicos se trataron con el anticuerpo a modo de ejemplo CAN04 dirigido a IL1RAP, o un correspondiente anticuerpo de isotipo de control. Los anticuerpos se administraron por inyecciones intraperitoneales dos veces por semana a traves del experimento con el primer tratamiento dado el dfa tres despues del trasplante. Cada dosis de anticuerpo fue 500 pg, excepto por la primera que fue dada como un bolo de 1000 pg. Los ratones se sacrificaron con los signos de enfermedad severa segun el juicio de estar jorobados, con pelambre sucio, y poca movilidad, o debido a tumores solidos.
Resultados y Conclusiones
Ratones inmunodeficientes se injertaron con celulas leucemicas humanas y se trataron con CAN04, un anticuerpo monoclonal dirigido a IL1RAP. La frecuencia de las celulas leucemicas en la sangre periferica se redujo apreciablemente en el dfa 36 despues del trasplante, y el conteo de plaquetas permanecio normal en los ratones que recibieron CAN04 en comparacion con el anticuerpo de isotipo de control indicando una hematopoyesis mas funcional (Figuras 9A a 9B). El tratamiento de CAN04 resulto en una reduccion significativa de celulas leucemicas en la medula osea y bazo (Figuras 9C a 9D). Concluimos que la inmunoterapia de anti-IL1RAP reduce la leucemia humana en la sangre periferica, medula osea, y bazo, en el modelo de xenoinjerto MA9Ras. Los resultados soportan la inmunoterapia de anti-IL1RAP como una nueva estrategia terapeutica prometedora para LMA.
I. Efecto de (a) anticuerpos de baja fucosa y (b) mutaciones Fc en la actividad de ADCC
Materiales y Metodos
La variante humanizada de dominio variable de cadena pesada de CAN04 (que comprende SEQ ID No: 9) se subclono en el vector con el dominio constante humano IgG1za (SEQ ID NO:19).
La variante humanizada de dominio variable de cadena ligera de CAN04 (que comprende SEQ ID No: 16) se subclono en el vector con el dominio constante humano Kappa (SEQ ID NO:18).
Para examinar el efecto de baja fucosa, el anticuerpo hCAN04 "Fc-1" (vease lo siguiente) se expreso transitoriamente por cotransfeccion de los vectores resultantes en celulas HEK293 cultivadas en medio con Kinfunensina. El anticuerpo Fc-1, producido por expresion en la ausencia de Kinfunensina, se uso como el control de “fucosa normal”
Para resolver como varios mutantes con FC disenado de hCAN04 afectan la actividad de ADCC, las variantes de hCAN04 disenadas geneticamente se generaron como sigue:
Fc-1 = (CAN04 humanizado con Fc de tipo silvestre; es decir, hCAN04variante 6 en la Tabla 3)
Fc-2 = (como Fc-1 pero con mutaciones S239D/S298A/1332E)
Fc-3 = (como Fc-1 pero con mutaciones S239D/A330L/I332E)
Fc-4 = (como Fc-1 pero con mutaciones S239D/I332E)
Fc-5 = (como Fc-1 pero con mutaciones S298A/E333A/K334A)
Fc-6 = (como Fc-1 pero con mutacion N297Q)
Fc-7 = (como Fc-1 pero con mutacion N297S)
Fc-8 = (como Fc-1 pero con mutaciones P247I/A339Q).
En donde la posicion de las mutaciones del aminoacido se define usando el Esquema de Numeracion de Eu, que difiere de la numeracion en SEQ ID NO: 18 y 19 anteriores; vease Edelman et al., 1969, Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU., 63:78-85).
Los anticuerpos se purificaron usando cromatograffa de afinidad de la Protefna A. Los ensayos de ADCC se realizaron usando la lfnea celular SKMEL5.
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Una variante baja en fucosa de hCAN04, producida en la presencia de kinfunensina, fue superior a una variante de CAN04 de fucosa normal CAN04 (Figura 10).
El efecto de la mutacion de Fc en la actividad de ADCC fue dependiente de la mutacion(es) realizadas. Asf:
(a) La actividad de ADCC de las variantes Fc-6 y Fc-7 del CAN04 humanizado se abrogo por completo;
(b) La actividad de ADCC de las variantes Fc-3, Fc-4, y Fc-5 del CAN04 humanizado se mejoro, incluso con respecto a la variante baja en fucosa de CAN04;
(c) La actividad de ADCC de la variante de Fc-8 del CAN04 humanizado fue similar a esa de la forma baja en fucosa del CAN04
(d) La actividad de ADCC de la variante Fc-2 del CAN04 humanizado fue similar a esa de la forma de fucosa normal del CAN04.
J. Analisis de union competitive por ELISA
Protocolo
Todas las muestras deben ser analizadas por duplicado.
Revestir una placa Nunc-MaxiSorp 96 Micro Well™ con 100 ul/pozo de hILIRAP 21-367 recombinante (1 ug/ml) diluido en 0,01 M de PBS, pH 7,4.
Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
Lavar la placa con regulador de lavado de ELISA (PBS 0,01 M, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4).
Agregar 150 pl/pozo de solucion de bloqueo de ELISA (PBS, 0,5 % de BSA, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4). Incubar la placa por 1 h a temperatura ambiente (TA) bajo agitacion.
Lavar la placa con regulador de lavado de ELISA.
Agregar las muestras de los artfculos de prueba (por ejemplo, mAb 1, mAb 2) a los pozos (100 ul/pozo, 10 ug/ml).
Incubar la placa por 1 h a TA.
Lavar la placa con solucion de lavado de ELISA.
Agregar una solucion de anticuerpo de referencia CAN04 (100 ul/pozo, 1 ug/ml) a todos los pozos.
Incubar la placa por 1 h a TA.
Lavar la placa con regulador de lavado de ELISA.
Agregar 100 pl/pozo de un anticuerpo secundario adecuado conjugado a IgG alcalino de conejo anti-raton conjugado a fosfatasa alcalina (si los artfculos de prueba son anticuerpos humanos, un anticuerpo secundario adecuado serfa anticuerpo IgG Cabra Anti-raton (especffico de Fc)-fosfatasa alcalina, SIGMA, A1418).
Incubar la placa por 1 h a TA bajo agitacion.
Lavar la placa con regulador de lavado.
Agregar 100 pl de sustrato de pNPP por pozo. (sal hexahidratada de 4-Nitrofenil fosfatisa disodica, SIGMA, 1 mg/ml).
• Incubar la placa a TA bajo agitacion y medir la absorbancia a 405 nm consecutivamente por 30 min. La absorbancia a 0 min debe ser tomada como una senal de fondo.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union a antfgeno del mismo con especificidad de union por la protefna accesoria del receptor de Interleucina-1 humana (IL1RAP), que comprende:
    (i) una region variable de cadena pesada que comprende los tres CDR de una region variable como se define por SEQ ID NO: 1 o de una version humanizada de la misma como se define mediante la SEQ ID NO: 8, 9, 10 u 11 e
    (ii) una region variable de cadena ligera que comprende los tres CDR de una region variable como se define por SEQ ID NO: 2 o de una version humanizada de la misma como se define mediante la SEQ ID NO: 15, 16 o 17.
  2. 2. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno exhibe las siguientes propiedades:
    a) una afinidad de union (Kd) para la IL1RAP humana de 200 pM o mayor;
    b) reactividad cruzada con IL1RAP de Macaca fascicularis,
    c) una accion inhibidora en la senalizacion de IL1;
    d) capacidad de inducir ADCC en una o mas lfneas celulares de cancer; y
    e) capacidad de internalizacion con la union a una o mas lfneas celulares de cancer.
  3. 3. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una region variable de cadena pesada SEQ ID NO: 1 y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende:
    a) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
    b) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
    c) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
    d) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15;
    e) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
    f) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
    g) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
    h) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 16;
    i) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17;
    j) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17;
    k) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17; o
    l) una region variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11 y una region variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 17.
  5. 5. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una region constante de cadena pesada, o parte de la misma, y una region constante de cadena ligera, o parte de la misma.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
  6. 6. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una region Fc.
  7. 7. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende ademas un resto citotoxico y/o un resto detectable.
  8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un diluyente, un vehfculo o un excipiente farmaceuticamente aceptables.
  9. 9. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usarse en medicina.
  10. 10. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de reivindicaciones 1 a 7, para usarse en el tratamiento de un trastorno neoplasico en un sujeto, en donde el trastorno neoplasico esta asociado a celulas que expresan IL1RAP.
  11. 11. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo para usarse en el tratamiento de un trastorno neoplasico de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde el trastorno neoplasico es un trastorno neoplasico hematologico o esta asociado a la formacion de tumores solidos dentro del cuerpo del sujeto.
  12. 12. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo para usarse en el tratamiento de un trastorno neoplasico de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el trastorno neoplasico se selecciona del grupo que consiste en (a) leucemia mieloide cronica (LMC), trastornos mieloproliferativos (TMP), sfndrome mielodisplasico (SMD), leucemia linfoblastica aguda (LLA) y leucemia mieloide aguda (LMA) o (b) cancer de prostata, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer colorrectal, melanomas, cancer de vejiga, cancer de cerebro/sNe, cancer cervical, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de rinon, cancer de hfgado, linfomas, cancer de ovario, cancer pancreatico y sarcomas.
  13. 13. Un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o una afeccion susceptibles de tratamiento con un inhibidor de senalizacion de IL-1.
  14. 14. Un metodo in vitro de deteccion de celulas cancerosas en un sujeto, metodo que comprende:
    (a) proporcionar una muestra de celulas de un sujeto que se va a ensayar;
    (b) opcionalmente, extraer y/o purificar las celulas presentes en la muestra;
    (c) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con las celulas presentes en la muestra;
    (d) determinar si el anticuerpo o el fragmento de union a antfgeno del mismo se unen a las celulas,
    en el que la union del anticuerpo o del fragmento de union a antfgeno del mismo a las celulas es indicativa de la presencia de celulas cancerosas en el tejido de un sujeto.
  15. 15. Un metodo in vitro de identificacion de un paciente con cancer que se beneficiarfa del tratamiento con un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, metodo que comprende:
    (a) proporcionar una muestra de celulas cancerosas de un paciente que se va a ensayar;
    (b) opcionalmente, extraer y/o purificar las celulas presentes en la muestra;
    (c) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con las celulas presentes en la muestra;
    (d) determinar si el anticuerpo o el fragmento de union a antfgeno del mismo se unen a las celulas,
    en el que la union del anticuerpo o del fragmento de union a antfgeno del mismo a las celulas cancerosas es indicativa de un paciente que se beneficiarfa del tratamiento con un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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