ES2646192T3 - Antagonistas del receptor 2 de somatostatina - Google Patents

Abstract

Antagonista de somatostatina que se une a SSTR2, en el que el antagonista de somatostatina es: (xxvii) DOTA-Cpa-c[DCys-Tyr-DAph(Cbm)-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2 ; en el que Cpa se refiere a cloro-Phe y Aph(Cbm) se refiere a 4-ureido-fenilalanina.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

15

25

35

45

55

65

receptor en presencia o ausencia de la sustancia candidata, puede obtenerse información sobre el efecto de la sustancia candidata sobre la función normal del receptor y determinar así su función como agonista o como antagonista en comparación con un análogo selectivo para SSTR2 conocido. Los péptidos SRIF cíclicos descritos en los siguientes Ejemplos son antagonistas, y pueden emplearse para intervenir en la función normal de SSTR2.

Los péptidos descritos en el presente documento pueden sintetizarse mediante síntesis en solución clásica, pero los péptidos amidados se sintetizan preferentemente mediante una técnica en fase sólida, como sobre una resina metilbenzhidrilamina (MBHA) o una resina BHA, tal como se conoce en esta técnica. Los péptidos con un carboxilo libre C-terminal pueden sintetizarse como se muestra en la patente estadounidense nº 7.019.109. Los péptidos con un extremo C-terminal amidado pueden sintetizarse como se muestra en la patente estadounidense nº 5.874.227. La síntesis en fase sólida se lleva a cabo de manera que añada aminoácidos en la cadena que comienza en el extremo C-terminal de manera progresiva. Los grupos protectores de cadena lateral, que se conocen en la técnica, se incluyen como parte de cualquier aminoácido que tenga una cadena lateral particularmente reactiva y, opcionalmente, pueden utilizarse en el caso de otros tales como Trp, en los que dichos aminoácidos se acoplan a la cadena que se está formando sobre la resina. Tal síntesis proporciona una peptidoresina intermedia completamente protegida. Los grupos protectores generalmente se separan y el péptido se escinde del soporte de resina antes de oxidarse para crear un enlace disulfuro entre las cadenas laterales Cys.

Los análogos de SRIF descritos en el presente documento también son útiles para indicaciones terapéuticas, tales como moduladores de somatostatina. En este uso, los análogos son generalmente eficaces a niveles inferiores a aproximadamente 100 microgramos por kilogramo de peso corporal, inferiores a aproximadamente 1.000 microgramos por kilogramo de peso corporal, inferiores a aproximadamente 100 microgramos por kilogramo de peso corporal, inferiores a aproximadamente 10 microgramos por kilogramo de peso corporal, o inferiores a aproximadamente 1 microgramo por kilogramo de peso corporal. Para una acción prolongada, puede ser deseable utilizar niveles de dosificación de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 miligramos por kilogramo de peso corporal. Estos análogos son solubles en agua y, por lo tanto, pueden prepararse como soluciones relativamente concentradas para la administración.

Los péptidos divulgados en el presente documento no solo proporcionan ligandos más selectivos para la unión de SSTR2, sino que el uso de péptidos marcados, por ejemplo, una versión marcada radiactivamente de los péptidos descritos en el presente documento puede facilitar la selección de fármacos para antagonistas aún más eficaces.

Los ensayos de cribado, que se conocen en la técnica, pueden emplear el polipéptido receptor SSTR2 directamente del huésped recombinante, y pueden utilizarse para identificar agentes útiles para bloquear o imitar determinados aspectos de la somatostatina según se desee, eliminando al mismo tiempo los aspectos no deseados de la hormona que pueden surgir de la activación o el bloqueo de otros receptores. A este respecto, si se desea un análogo radioyodado para fines de cribado, se puede añadir Tyr en el extremo N-terminal en lugar de DOTA, o puede utilizarse Tyr en la posición 2 en lugar de Cpa, o puede fijarse un radioligando adecuado mediante un quelante DOTA. Los ensayos de unión competitiva con los compuestos candidatos pueden llevarse a cabo en primer lugar de esta manera con SSTR2 para buscar una alta afinidad de unión; a continuación, mediante cribado de los múltiples receptores de SRIF, podría confirmarse si hubo una unión selectiva sólo a este receptor, como se desea. Pueden utilizarse péptidos no marcados radiactivamente para tratar enfermedades de todos los órganos que se sabe expresan SSTR2, incluidos el pulmón, el tracto gastrointestinal y los riñones.

Debido a que las adiciones al extremo N-terminal del análogo de SRIF no parecen influir negativamente en la unión selectiva, debe quedar claro que estos compuestos pueden complejarse con un núclido radiactivo con el fin de llevar ese agente a un tumor o a otro tejido para el cual se desea la apoptosis. Por ejemplo, pueden utilizarse quelantes adecuados, tales como DOTA o DTPA u otros, para complejar el análogo de SRIF con un metal altamente radiactivo como se ha indicado anteriormente en el presente documento. Algunos ejemplos de grupos quelantes adecuados para quelar un átomo de metal radiactivo son los quelantes tetradentados o grupos derivados del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido ciclohexil-1,2-diaminotetraacético (CDTA), ácido etilenglicol-0,0'-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido N,N-bis(hidroxibencil)etilendiamina-N,N'-diacético (HBED), ácido trietilen tetramina hexaacético (TTHA), ácido 1,4,7,1 Otetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA), ácido hidroxietildiamina triacético (HEDTA), ácido 1,4,8,11tetraazaciclo-tetradecano-N,N',N",N"'-tetraacético (TETA), DTPA sustituido, EDTA sustituido. Se divulgan otros quelantes, así como agentes radiactivos, en los documentos WO 95/22341 y WO 04/082722 y en las publicaciones de patente estadounidense 2004/0242842 y 2005/0070470. Los quelantes pueden derivarse, por ejemplo, de EDTA y DOTA. Algunas sales adecuadas son 111In-oxina, 99mTc-tartrato, que generalmente puede formarse de manera simple en condiciones que no son perjudiciales para el antagonista peptídico.

La solubilidad de los antagonistas de SRIF puede mejorarse por acilación del grupo amino N-terminal utilizando un compuesto hidrófilo, tal como, por ejemplo, ácido hidroorótico (Hor) o similar, o mediante reacción con un isocianato adecuado, tal como como metilisocianato o isopropilisocianato, para crear un resto urea en el extremo N-terminal. También pueden enlazarse otros agentes al extremo N-terminal que aumentan la duración de la acción del antagonista de SRIF como se conoce en esta técnica.

15

25

35

45

55

65

Estos antagonistas de SRIF o sales no tóxicas de los mismos, combinados con un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable para formar una composición farmacéutica, pueden administrarse a animales, incluidos seres humanos y otros mamíferos, por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, percutánea, por ejemplo, por vía intranasal, intracerebrospinal u oral. Tal composición farmacéutica diseñada para utilizarse para detectar tumores humanos malignos, incluida la metástasis de los mismos, en tejidos puede incluir, además de un material de transporte farmacéuticamente aceptable, y un adyuvante opcional farmacéuticamente aceptable, el antagonista peptídico marcado como sustancia activa, en una cantidad suficiente para formar imágenes externas, para la detección mediante una sonda detectora de gamma o para combatir o controlar los tumores. Los antagonistas peptídicos deben tener una pureza de al menos aproximadamente un 90% y, preferentemente, deben tener una pureza de al menos aproximadamente un 98%; sin embargo, son eficaces purezas inferiores y pueden utilizarse con mamíferos que no sean seres humanos. Esta pureza se refiere a que el péptido deseado constituye el % en peso indicado de todos los péptidos y fragmentos peptídicos similares presentes. La administración a seres humanos debe estar bajo la dirección de un médico para combatir tumores y cánceres específicos o para intervenir en otras afecciones en las que los receptores SSTR2 ejercen una función de control, tal como el acoplamiento a una tirosina fosfatasa de manera que pueda llevarse a cabo la estimulación de esta enzima para intervenir en los efectos antiproliferativos de SRIF. La dosificación requerida variará en función de la afección particular que se está tratando, de la gravedad de la afección y de la duración del tratamiento deseado.

Los tumores expresan con frecuencia varios tipos de receptores peptídicos (Reubi, J. y Waser, B., Eur. J. Nucl. Med. Molec. Imaging, 30:781-793, 2003). Tales grupos de múltiples receptores peptídicos pueden incluir receptores sst2, así como receptores de bombesina, receptores de CCK, receptores de VIP, receptores de GLP-1, receptores de neurotensina, receptores de secretina, receptores de neuromedina B y receptores de CRF, etc. En tal caso, la administración de antagonistas de SSTR2, en combinación como un cóctel, con uno o más antagonistas marcados radiactivamente para estos diversos receptores debería mejorar considerablemente la dianización in vivo a tales tumores.

Tales antagonistas peptídicos se administran con frecuencia en forma de sales no tóxicas farmacéutica o veterinariamente aceptables, tales como sales de adición de ácido o complejos metálicos, por ejemplo, con zinc, hierro, calcio, bario, magnesio, aluminio o similares. Son ilustrativas de tales sales no tóxicas el clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, tannato, oxalato, fumarato, gluconato, alginato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartrato y similares.

También puede ser deseable suministrar estos antagonistas de SRIF durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, durante períodos de una semana a un año a partir de una sola administración, y pueden utilizarse formas farmacéuticas de liberación lenta, de depósito o de implante como se conoce en esta técnica. Una forma farmacéutica puede contener, por ejemplo, una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del compuesto que tenga un bajo grado de solubilidad en los fluidos corporales, por ejemplo, una sal de adición de ácido con un ácido polibásico, una sal con un catión de metal polivalente, o una combinación de las dos sales. Una sal relativamente insoluble también puede formularse en un gel, por ejemplo, un gel de estearato de aluminio. Una formulación de depósito de liberación lenta adecuada para inyección puede contener también un antagonista de SRIF, o una sal del mismo, dispersado o encapsulado en un polímero no tóxico o no antigénico de degradación lenta, tal como un polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo, según se describe en la patente estadounidense nº 3.773.919.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de los antagonistas peptídicos deben administrarse bajo la dirección de un médico, y las composiciones farmacéuticas contendrán normalmente el péptido junto con un transportador convencional farmacéutica o veterinariamente aceptable. Se considera que una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad predeterminada calculada para conseguir el efecto deseado. La dosificación necesaria variará en función del tratamiento particular y de la duración del tratamiento deseado; sin embargo, se prevé el uso de dosis de entre aproximadamente 10 microgramos y aproximadamente 1 miligramo por kilogramo de peso corporal al día para el tratamiento terapéutico. Puede ser particularmente ventajoso administrar tales compuestos en forma de depósito o de larga duración como se ha descrito anteriormente. Una cantidad terapéuticamente eficaz es por lo general una cantidad de un antagonista de SRIF que, cuando se administra periféricamente, por ejemplo, por vía intravenosa, en una composición fisiológicamente aceptable, es suficiente para conseguir una concentración plasmática de la misma de aproximadamente 0,1 µg/ml a aproximadamente 100 µg/ml, de aproximadamente 1 µg/ml a aproximadamente 50 µg/ml, o al menos de aproximadamente 2 µg/ml (normalmente de 5 µg/ml a 10 µg/ml). En estas cantidades, pueden utilizarse para influir de manera deseable en la secreción gástrica.

Cuando la composición vaya a utilizarse para la obtención de imágenes o tratamientos terapéuticos, el escaso período de validez del compuesto marcado radiactivamente y/o la corta semivida del radionúclido puede requerir que el usuario lleve a cabo la reacción de marcado con el radionúclido en el hospital clínico o el laboratorio. En tales casos, los diversos ingredientes de reacción pueden proporcionarse al usuario en forma de "kit". Las manipulaciones necesarias para realizar la reacción deseada deberían ser lo más simples posible para permitir al usuario preparar la composición marcada radiactiva del kit utilizando instalaciones que se estén normalmente a su disposición. Por consiguiente, un kit para preparar una composición radiofarmacéutica, para detectar y localizar

15

25

35

45

55

65

tumores malignos y sus metástasis en tejidos podría comprender (i) un péptido selectivo para SSTR2, un agente de formulación y/o transportador inerte farmacéuticamente aceptable con adyuvantes opcionales, (ii) una solución de una sal o quelato de un isótopo de metal radioactivo, y (iii) instrucciones de uso con una receta para la reacción de los ingredientes presentes en el kit.

Un antagonista peptídico para utilizarse como ingrediente de un kit de este tipo puede derivatizarse mediante una reacción con un quelante. El conjugado peptídico resultante proporciona facilidad para fijar con firmeza el radionúclido de manera simple. Los ácidos di o poliacéticos que contienen N o sus derivados, tales como los compuestos mencionados anteriormente, han demostrado ser especialmente adecuados para fijar diversos radionúclidos metálicos, tales como 111In y 113mIn, a las moléculas peptídicas. El kit a suministrar al usuario también puede comprender los demás ingredientes definidos anteriormente, junto con instrucciones de uso, mientras que la solución de una sal o quelato del radionúclido con un período de validez limitado, puede suministrarse al usuario por separado.

186Re

Un kit para preparar una composición radiofarmacéutica marcada con 99mTc, o 188Re puede comprender, por ejemplo, además de los ingredientes definidos en los (i) y (ii) anteriores, un agente reductor y, si se desea, un quelante, y (iii) instrucciones de uso, con una receta para hacer reaccionar los ingredientes del kit con 99mTc en forma de solución de pertecnetato, o con 186Re o 188Re en forma de solución de perrenato. Si se desea, pueden combinarse diversos ingredientes del kit, siempre que sean compatibles. El kit debe comprender un agente reductor para reducir el pertecnetato o perrenato, por ejemplo, un ditionito, un agente reductor metálico o un agente reductor estabilizador de complejos, por ejemplo, SnCl2, Sn(II)-tartrato, Sn(II)-fosfonato o -piro-fosfato, o Sn(II)glucoheptonato. La solución de pertecnetato o perrenato puede obtenerse sencillamente de un proveedor adecuado. Cuando el radionúclido está presente en el propio kit, la reacción de formación del complejo con el péptido puede producirse sencillamente combinando los componentes en un medio neutro y haciendo que reaccionen. Para ello, puede hacerse reaccionar el radionúclido con el péptido en forma de quelato unido a un quelante comparativamente débil, según se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Cuando el kit comprende un péptido derivatizado tal como se ha definido anteriormente en el presente documento, y está destinado a la preparación de una composición radiofarmacéutica, marcado con 99mTc, 186Re o 188Re, el radionúclido se añadirá preferentemente por separado en forma de solución de pertecnetato o perrenato. En ese caso, el kit comprenderá un agente reductor adecuado y, si se desea, un quelante, el primero para reducir el pertecnetato o el perrenato. Como agente reductor puede utilizarse, por ejemplo, un ditionito o un agente reductor metálico. Los ingredientes pueden combinarse opcionalmente, siempre que sean compatibles. Un kit monocomponente de este tipo, en el que los ingredientes combinados están preferentemente liofilizados, es adecuado para que el usuario lo haga reaccionar con la solución de radionúclido. Puede utilizarse un agente reductor metálico, por ejemplo, Sn(II), Ce(III), Fe(II), Cu(I), Ti(III) o Sb(III); Sn(II). El constituyente peptídico de los kits puede suministrarse como solución, por ejemplo, en forma de solución salina fisiológica, o en alguna solución tampón, pero está presente preferentemente en estado seco, por ejemplo, en estado liofilizado. Cuando se utiliza como componente para un líquido de inyección, debe ser estéril. Cuando el constituyente está en estado seco, el usuario debe utilizar una solución salina fisiológica estéril como disolvente. Si se desea, el constituyente puede estabilizarse de forma convencional con estabilizadores adecuados, por ejemplo, ácido ascórbico, ácido gentísico o sales de estos ácidos.

Aunque las reivindicaciones definen de diversas maneras la invención en términos de una secuencia peptídica, debe entenderse que ésta pretende incluir sales no tóxicas de la misma que se sabe son el equivalente completo de la misma y que se administran con mayor frecuencia.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferentes de la invención. Los expertos en la materia deben entender que las técnicas divulgadas en los ejemplos que a continuación siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la puesta en práctica de la invención, y por lo tanto puede considerarse que constituyen modos preferentes para su puesta en práctica.

EJEMPLOS

Los siguientes Ejemplos ilustran la provisión de un número de antagonistas peptídicos de SRIF. En cada péptido, los residuos de cisteína en las posiciones 3 y 14 (numeración según SRIF) están unidas por el enlace disulfuro de ciclación, y pueden ser anotados como "(ciclo 3-14)" o "c[ ]".

Ejemplo 1.

Se sintetiza el análogo de somatostatina DOTA-des-AA1,4,5,6,11,12,13[Cpa2,D-Cys3,Tyr7,D-4Aph(Cbm)8]-SRIF2Nal-NH2 que tiene la estructura: (ciclo 3-14) DOTA-Cpa-D-Cys-Tyr-D-4Aph(Cbm)-Lys-Thr-Cys-2Nal-NH2. (Péptido 28). Se utilizó una metodología en fase sólida empleando la estrategia BOC para sintetizar el octapéptido de manera progresiva sobre una resina MBHA, generalmente según se describe en el "Ejemplo II" de la patente ’277. Se preparó previamente Boc-D-4Aph(Cbm)-OH y se acopló en la posición 8.

imagen6

imagen7

15

25

35

45

55

65

ligando de somatostatina universal radioligando 125I-[Leu,D-Trp22,Tyr25]-somatostatina-28 que se une con fuerte afinidad hacia los cinco receptores. Se utilizaron concentraciones crecientes del péptido no marcado que iban de 0,1 nM-1.000 nM. Se procesó en paralelo la somatostatina-28 no marcada utilizando las mismas concentraciones crecientes, como control. Los valores de CI50 se calcularon después de la cuantificación de los datos utilizando un sistema de procesamiento de imágenes asistido por ordenador como se conoce en esta técnica.

A concentraciones de 100 nM, el Péptido nº 28 tuvo efectos mínimos sobre la unión del radioligando SRIF-28 a SSTR1, SSTR3, SSTR4 y SSTR5. Por el contrario, se unía selectivamente a SSTR2, desplazando la unión del radioligando para SSTR2 humano con un valor de CI50 de aproximadamente 1,8 nM.

Las potencias de determinados análogos de SRIF para inhibir la unión del radioligando 125I-[Leu8, D-Tip22, Tyr24]SRIF-28 a los diversos receptores de SRIF humanos clonados se muestran en la siguiente Tabla 1 en la que los valores de CI50 se dan en concentración nanomolar. Los números entre paréntesis indican el número de veces que se llevó a cabo el ensayo de unión particular.

Tabla 1

Compuesto

CI50 (nM)

hSSTR1

hSSTR2 hSSTR3 hSSTR4 hSSTR5

Péptido nº 28 406-034-15

>1.000 (2) 1,8 ± 0,2 (3) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 14 363-246-15

>1.000 (3) 9,4 ± 1,6 (3) >1.000 (2) 816 ± 114 (3) >1.000 (3)

Péptido nº 33 363-300-15

>1.000 (2) 230; 219 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 5 406-032-20

>1.000 (2) 1,5 60 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 30 363-298-15

>1.000 (2) 1,7 ± 0,3 (3) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 31 406-094-15

>1.000 (2) 0,6 ± 0,05 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 3 406-092-15

>1.000 (2) 0,53 ± 0,06 (2) >1.000 (2) >1.000 (2) >1.000 (2)

Péptido nº 32 406-090-15

>1.000 (2) 1,02 ± 0,88 (2) >1.000 (2) 493 ± 206 (2) >1.000 (2)

Además, ninguno de los péptidos ensayados y presentados en la Tabla 1 mostró internalización significativa en las células, mientras que antagonizaban la internalización inducida por octreótido. Los péptidos nº 28, 5, 30, 31, 3 y 32 presentaron muy buenas propiedades de unión y excelentes propiedades de dianización del tumor in vivo, a saber, una enorme captación en los tumores sst2 a las 4 horas y a las 24 horas, y una excelente relación entre tumor y riñón; tal puede bloquearse mediante un exceso de péptido frío.

Implantación de células HEK-sst2 en ratones desnudos

Se mantuvo, trató y atendió a los animales de conformidad con las directrices de la normativa suiza (aprobación 789). Se implantaron por vía subcutánea a ratones hembra desnudos atímicos diez millones de células HEK-sst2 recién suspendidas en PBS estéril. Diez a catorce días después de la inoculación, los ratones mostraron masas tumorales palpables sólidas (peso del tumor 60 mg-150 mg) y se utilizaron para los experimentos de biodistribución in vivo.

La confirmación de que los tumores transfectados expresaban efectivamente únicamente sst2 se obtuvo en muestras de tumores resecados ensayadas in vitro con autorradiografía de receptores de somatostatina utilizando ligandos selectivos de subtipo.

Biodistribución in vivo de antagonistas y agonistas marcados con 111In

Se inyectaron a los ratones en una vena de la cola 10 pmol de péptido marcado radiactivamente con 111In (aproximadamente 0,15 MBq-0,2 MBq) en 0,1 ml de solución de NaCl (0,9%, con BSA al 0,1%). Se estudió la biodistribución a las 4 horas o a las 24 horas después de la inyección. Los órganos de interés se recogieron, se secaron con papel de filtro, se pesaron, se midió su radiactividad y se calculó el porcentaje de actividad inyectada por gramo (%IA/g).

111In

En un experimento se inyectaron 5 µ Ci de Péptido nº 28 marcado con en ratones desnudos portadores de tumores HEK-sst2, 3-4 ratones por grupo de muestra. La presencia de 2.000 veces (por mol) más cantidad de compuesto no marcado inhibía la unión. Los resultados de biodistribución se presentan en la Tabla 2.

imagen8

imagen9

imagen10

15

25

35

45

55

65

se adquirió de Macrocyclics Inc. (Dallas, TX, EE.UU.). Todos los reactivos y disolventes eran de calidad ACS y se utilizaron sin purificación adicional.

Síntesis de péptidos. Los péptidos se sintetizaron mediante el método en fase sólida, ya sea manualmente

o en un sintetizador CS-Bio Peptide Synthesizer modelo CS536. Se utilizó un exceso de 3 equivalentes de aminoácido Boc (1,2 mmol), basándose en la sustitución original de la resina para cada acoplamiento. Los acoplamientos de péptidos fueron mediados durante 1 hora por DIC/HOBt (1,2 mmol/1,8 mmol) en dimetilformamida (DMF) y supervisados mediante el ensayo cualitativo de ninhidrina (Kaiser, E. et al., Anal. Biochem., 34:595-598, 1970). La eliminación de Boc se consiguió con ácido trifluoroacético (TFA) (60% en CH2Cb, m-cresol o etanoditiol al 1%-2%) durante 20 minutos. Al tratamiento con TFA le siguió un lavado con alcohol isopropílico (m-cresol al 1%) y, a continuación, lavados sucesivos con una solución de trietilamina (TEA) (10% en CH2Cb), metanol, solución de trietilamina, metanol y CH2Cb completaron la secuencia de neutralización. Se introdujo en la resina el grupo ureido (Cbm) en el extremo N-terminal de 13. El grupo Boc N-terminal del péptido totalmente ensamblado se desprotegió con TFA; después de la neutralización, siguió la carbamoilación con NaOCN (100 mg, 0,65 mmol) en Nmetilpirrolidinona (NMP) (4 ml) y 3 ml de ácido acético glacial por gramo de resina inicial. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y el ensayo de ninhidrina indicó la finalización de la reacción. A continuación, se desprotegió el péptido completo y se escindió de la resina mediante HF que contenía los eliminadores anisol (10% v/v) y sulfuro de metilo (5% v/v) durante 60 minutos a 0°C. Los péptidos brutos precipitados con éter dietílico se ciclaron en ácido acético al 75% (200 ml) añadiendo yodo (solución al 10% en metanol) hasta la aparición de un color naranja estable. Cuarenta minutos más tarde, se añadió ácido ascórbico para inactivar el exceso de yodo.

Para la síntesis de 9, se utilizó Fmoc-D/L-Agl(NMe,Boc)-OH no resuelto, y los dos diastereómeros se separaron fácilmente durante las etapas de purificación mediante HPLC convencional (Miller, C. y Rivier, l., Biopolymers, 40:265-317, 1996). La configuración óptica de los dos diastereómeros se infirió provisionalmente a partir de una comparación del comportamiento de la elución mediante HPLC con análogo sintetizado por separado como diastereómeros de configuración óptica conocida. En resumen: después del acoplamiento Fmoc-DAgl(Boc)-OH en la posición 7, se eliminó el grupo Boc protector de la cadena lateral con TFA al 60%, se lavó, se neutralizó y la resina peptídica de 0,9 g (0,36 mmol/g) se hinchó en diclorometano, se añadió Dod-Cl (130 mg; 0,5 mmol) junto con DIEPA (500 µl). La mezcla se agitó durante una hora para terminar la alquilación. La resina se lavó, y se agitó después de añadir formaldehído (2 ml, solución al 37%) en NMP (18 ml) y ácido acético (100 µl). Después de 5 minutos, se añadió cianoborohidruro sódico (300 mg) y la mezcla se agitó durante 60 minutos. Después de eliminar el grupo Dod con TFA (60%) durante 30 minutos, se utilizó cloruro de benzoilo (500 µl) para acilar el grupo amino secundario libre de la cadena lateral (Kaljuste K. y Unden, A., Int. J. Pept. Prot. Res., 42:118-124, 1993). A la eliminación del grupo protector Nα-Fmoc con piperidina al 20% en NMP en dos tratamientos sucesivos de 5 y 15 minutos siguió el protocolo de elongación convencional una vez finalizado el péptido. El péptido se escindió, se desprotegió y se cicló. En la HPLC, este diastereómero de configuración D coeluyó con el diastereómero de elución más temprana de la síntesis realizada con el aminoácido no resuelto, por lo tanto, el péptido de elución más lenta (9) se identificó provisionalmente como el análogo que contenía L-Agl(NMe,benzoilo)7.

En general, para la síntesis de los conjugados DOTA-péptido, la cadena lateral de Lys9 estaba protegida con un grupo protector Fmoc que permanece después de la escisión mediante HF. A una solución del [Lys(Fmoc)9]sst2-antagonista purificado mediante RP-HPLC (20 µM) en DMF seco (800 µl) se añadió una solución de DOTA-NHS-éster (38 mg, 48 µM) en DMF (160 µl) y N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA) (40 µl, 24 µM). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El desarrollo de la reacción se siguió mediante HPLC analítica. Al término de la reacción, se realizó una purificación mediante RP-HPLC preparativa, lo que produjo el DOTA[Lys(Fmoc)9]-sst2-antagonista puro. La eliminación del grupo protector Fmoc de la cadena lateral de Lys se consiguió con solución de piperidina/DMF al 20% que dio como resultado el DOTA-sst2-antagonista, que se purificó adicionalmente mediante RP-HPLC preparativa.

Purificación de péptidos. Los péptidos liofilizados brutos se purificaron mediante RP-HPLC preparativa en un cartucho de 5 cm x 30 cm, preparado en el laboratorio con sílice Vydac C18 300Å de fase inversa (tamaño de partícula de 15 µm-20 µm). Los péptidos eluidos con un caudal de 100 ml/min utilizando un gradiente lineal de aumentos del 1% de B cada 3 minutos desde el % de B basal (eluyente A = TEAP 0,25 N pH 2,25, eluyente B = CH3CN al 60%, A al 40%). Todos los péptidos se sometieron a una segunda etapa de purificación llevada a cabo con los eluyentes A = TFA al 0,1% en agua y B = CH3CN al 60%/A al 40% en el mismo cartucho utilizando un gradiente lineal de aumentos del 1% de B por minuto desde el % de B basal. El cribado mediante HPLC analítica de la purificación se realizó en una columna Vydac C18 (0,46 cm x 25 cm, tamaño de partícula de 5 µm, tamaño de porode 300Å) conectada a un inyector Rheodyne, dos bombas Waters modelo 501, un programador y controlador del sistema, un detector de UV Kratos 750 y un registrador gráfico D-5000 de Houston Instruments. Las fracciones que contenían el producto se agruparon y se sometieron a liofilización.

Caracterización de los análogos de SRIF (FIG. 4). La pureza de los péptidos finales se determinó mediante RP-HPLC analítica realizada con un gradiente lineal utilizando TEAP 0,1 M pH 2,5 como eluyente A y CH3CN al 60%/A al 40% como eluyente B en un cromatógrafo de líquidos 1090 serie II de Hewlett-Packard conectado a una columna Vydac C18 (0,21 cm x 15 cm, tamaño de partícula de 5 µm, tamaño de poro de 300Å), un controlador

imagen11

15

25

35

45

55

65

peroxidasa de rábano picante (ABTS). La DO405 se midió después de una incubación de aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se calculó la cantidad de sst2 que quedaba en la superficie celular después del tratamiento con ligando como la absorbancia medida en las células tratadas expresada como porcentaje de la absorbancia en las células no tratadas. Se determinó la absorbancia no específica en experimentos en los que las células HEK293-sst2 se incubaron sin el anticuerpo anti-T7.

Cada punto de datos representa la media ±EEM de tres experimentos realizados por duplicado.

Ensayo de liberación de calcio. Se midió la liberación de calcio intracelular en células HEK-sst2 utilizando el kit de ensayo de calcio Fluo-4NW como se ha descrito anteriormente (Magrys, A. et al., J. Clin. Immunol., 27:181192, 2007; Michel, N. et al., Mol. Biol. Cell, 17:3578-3590, 2006). En resumen, se sembraron células HEK-sst2

(25.000 células por pocillo) en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (20 µg/ml) y se cultivaron durante un día a 37°C y CO2 al 5% en medio de cultivo. El día del experimento, las células se lavaron con tampón de ensayo (1 x HBSS, HEPES 20 mM) que contenía probenecid 2,5 mM, y, a continuación, se cargaron con 100 µl/pocillo de colorante Fluo-4NW en tampón de ensayo que contenía probenecid 2,5 mM durante 30 minutos a 37°C y CO2 al 5% y, a continuación, durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. Para medir la movilización de calcio intracelular después de la estimulación con los análogos de SRIF a ensayar, las células cargadas con colorante se transfirieron a un SpectraMax M2e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se registró la movilización de calcio intracelular en un cinético durante 60 segundos a temperatura ambiente, supervisando la emisión de fluorescencia a 520 nm (con λex = 485 nm) en presencia de los análogos a las concentraciones indicadas. Se midió la fluorescencia máxima (Fmax) después de añadir ionomicina 25 µM. Se recogieron las mediciones basales (control) para las células no tratadas cargadas con colorante. Los datos se muestran como porcentaje de Fmax (% de Fmax). Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces por triplicado.

Todos los análogos mostrados en la FIG. 4 se sintetizaron manual o automáticamente sobre una resina MBHA mediante la estrategia Boc, diisopropilcarbodiimida (DIC)/HOBt (1-hidroxibenzotriazol) para la formación del enlace amida y ácido trifluoroacético (TFA) para la eliminación de Boc. Las resinas peptídicas se trataron con fluoruro de hidrógeno (HF) en presencia de eliminadores para liberar los péptidos lineales brutos completamente desprotegidos. La ciclación de las cisteínas estuvo mediada por yodo en un medio ácido. La purificación se llevó a cabo utilizando múltiples etapas de HPLC. Se acopló DOTA a los análogos protegidos Lys(Fmoc)9 en solución. La pureza de los péptidos se caracterizó mediante HPLC, electroforesis capilar de zona y espectrometría de masas. Los valores (M+H)+ de masa monoisotópica observados de cada péptido se corresponden con los valores de masa (M) calculados.

Para investigar sus propiedades de unión a los sst, los péptidos se ensayaron para determinar su capacidad para unirse a las secciones de criostato de los sedimentos de membrana de células que expresaban los cinco sst humanos (FIG. 5). Para cada uno de los compuestos ensayados, se realizaron experimentos de desplazamiento completo con el radioligando de SRIF universal [Leu8,DTrp22,125I-Tyr25]SRIF-28 utilizando concentraciones crecientes del péptido no marcado que variaban de 0,1 nM-1.000 nM. El SRIF-28 no marcado se procesó en paralelo utilizando las mismas concentraciones crecientes, como control.

Se notificó que la inversión de la quiralidad en las posiciones 2 y 3 en el armazón de octreótido (H-DPhe2C[Cys3-The7-DTrp8-Lys9-Thr10-Cys14]-Thr15-ol, numeración de SRIF) era la modificación estructural clave que convertía un agonista de SRIF en un antagonista. Sustituciones adicionales dieron como resultado los antagonistas parcialmente selectivos acetil-pNO2Phe-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-DTyr-NH2 o H-Cpa-c[DCys-Tyr-DTrp-Lys-Thr-Cys]-2Nal-NH2. Estos antagonistas presentan de manera preferencial una alta afinidad de unión por sst2, y menor o ninguna afinidad hacia sst3, sst4 y los sst5. Ninguno de los análogos se une a sst1. Utilizando estos compuestos “cabeza de serie”, se diseñaron antagonistas de SRIF que eran más afines (> 3 veces) y más selectivos para sst2 que los notificados hasta ahora (Bass, R. et al., Mol. Pharmacal., 50:709-715, 1996; Hocart, S. et al., J. Med. Chem., 42:1863-1871, 1999).

Se sintetizaron análogos de antagonistas como acetil-pNO2Phe2-C[DCys3-Tyr7-DTrp8-Lys9-Thr10-Cys14]DTyr15-NH2 (1) y H-Cpa2-c[DCys3-Tyr7-DTrp8-Lys9-Thr10-Cys14]-2Nal15-NH2 (7) para investigar el efecto de diferentes sustituciones sobre la afinidad de unión, la selectividad del subtipo de receptor, la hidrofilia global, así como el agonismo y antagonismo.

La sustitución del grupo acetilo N-terminal por DOTA en 1 (CI50 = 3,6 nM hacia sst2) dio como resultado 2, que se unió a sst2 con una CI50 = 1,5 nM, lo que sugiere que el resto DOTA, que es crucial para el marcado radiactivo con 111In, 90Y o 177Lu para la dianización in vivo, es bien tolerado por sst2 (FIG. 5).

La introducción de DAph(Cbm)8 en lugar de DTrp8 en 2 produjo 3 (CI50 = 0,75 nM). Cabe señalar que estas dos sustituciones son acumulativas, dando así como resultado el antagonista de sst2 más potente de esta serie, sin afinidad de unión cuantificable hacia ninguno de los demás receptores. La sustitución adicional de DTyr15 en 3 por 2Nal15 produjo 5 con una afinidad de unión similar por sst2 (CI50 = 1,3 nM). El análogo 4, un péptido con la misma secuencia que 5 pero sin DOTA en su extremo N-terminal todavía tenía una excelente afinidad de unión por sst2 (CI50 = 2,6 nM) y también se unió de forma apreciable a sst3 (CI50 = 384 nM). La sustitución de Tyr en la posición 7

imagen12

imagen13

imagen14

Claims (1)

1. imagen1