ES2645416T3 - Polipéptidos de filagrina recombinantes para la importación a células - Google Patents

Abstract

Un polipéptido recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina; y (b) una secuencia señal de importación a células que comprende un motivo de dos a quince aminoácidos, en el que el motivo incluye al menos un resto arginina y al menos un resto metionina.

Description

Polipéptidos de filagrina recombinantes para la importación a células

Antecedentes de la invención

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. n.º de serie 61/263,604, presentada el 23 de noviembre, 2009.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la química de proteínas, el transporte intracelular de proteínas, el cuidado de la piel y el tratamiento y la prevención de enfermedades de la piel. Más en concreto, se refiere a procedimientos, composiciones y kits que emplean polipéptidos de filagrina recombinantes que incluyen una secuencia señal de importación a células unida o ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de filagrina con una secuencia señal de importación a células unida.

2. Descripción de la técnica relacionada

Las enfermedades de la piel son una causa habitual de morbilidad en EE. UU. Por ejemplo, la ictiosis vulgar y la dermatitis atópica tienen una incidencia combinada de 1 en 250. Son los trastornos de queratinización más habituales. Estas enfermedades se caracterizan por hiperlinealidad, queratosis pilosa y piel irritada, escamosa y a menudo inflamada. La ictiosis vulgar y la dermatitis atópica también están asociadas con uno de los trastornos relacionados con un solo gen más comunes en el ser humano, el trastorno del gel de filagrina (FLG).

El FLG es un gen de 3 exones localizado en el complejo de diferenciación epidérmico ("Epidermal Differentiation Complex", EDC) en el cromosoma 1q21. En pacientes sanos, el gen FLG codifica la proteína de (pro)filagrina, una proteína fundamental para la queratinización y la escamificación de células epiteliales, la formación de la barrera epidérmica y la hidratación apropiadas. Sin embargo, en casi 50% de los pacientes con estas enfermedades, está presente una de dos mutaciones sin sentido en el exón 3 (R501X y 2282del4) (Hoffjan, 2007). Estas mutaciones impiden que la poliproteína de profilagrina pueda romperse proteolíticamente para producir la proteína FLG activa. La proteína de FLG se expresa en el citoplasma de células epiteliales; está ausente del núcleo in vivo. También se ha demostrado una correlación entre el número de repeticiones en la filagrina y la predisposición a una piel seca (véase la solicitud de patente de EE. UU. n.º de publicación 2003/0124553). La administración de un polipéptido que comprende profilagrina se ha propuesto como tratamiento para la piel seca (solicitud de patente de EE. UU. n.º de publicación 2003/0124553).

A pesar de la información disponible con respecto a FLG y su papel en las enfermedades de la piel, son necesarios unos procedimientos más eficaces para tratar las enfermedades o los trastornos de la piel.

Sandilands y col., Journal of Cell Science, vol. 122, n.º 9, 22 de abril, 2009, pp. 1285-1294 divulgan el uso de la filagrina en terapia.

El uso de péptidos de captación celular para transportar proteínas de fusión terapéuticas a la epidermis de la piel se divulga en el documento WO 03/078470; documento US 2004/186045; Zorko y col., Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 57, n.º 4, 28 de febrero, 2005, pp. 529-545; y Mae y col., Current Opinion in Pharmacology, vol. 6, n.º 5, 1 de octubre 2006, pp. 509-514.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la captación de un polipéptido de filagrina hacia el interior de una célula puede ser sorprendente y eficazmente potenciada por la unión al polipéptido de filagrina de una secuencia de importación a células. La secuencia de importación a células, por ejemplo, puede ser una secuencia que comprende un motivo de dos a quince aminoácidos, en el que el motivo incluye al menos un resto arginina y al menos un resto metionina. Las composiciones que incluyen los polipéptidos de la presente invención poseen una mayor eficacia terapéutica, comparado con polipéptidos que no incluyen la secuencia señal de importación a células.

Algunas realizaciones de la presente invención incluyen un polipéptido recombinante que incluye (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina; y (b) una secuencia señal de importación a células que incluye un motivo de dos a quince aminoácidos, en el que el motivo incluye al menos un resto arginina y al menos un resto metionina. La secuencia de aminoácidos de filagrina puede incluir cualquier número de aminoácidos de una proteína de filagrina nativa. En algunas realizaciones, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de filagrina incluye 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 o más aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas

en la siguiente tabla 2, o cualquier intervalo de aminoácidos que se deriva de estas, con la condición de que la secuencia de aminoácidos de filagrina, cuando se conjuga con una secuencia señal de importación a células, conserve al menos parte de la función de una secuencia de aminoácidos de filagrina nativa conjugada con la misma secuencia de importación a células. Las funciones no limitantes de una secuencia de aminoácidos de filagrina nativa incluyen la reducción de la exfoliación de la piel, la reducción del enrojecimiento de la piel, la reducción del picor en la piel, la reducción de la formación de costras en la piel, la reducción de la sequedad de la piel, la reducción de la formación de escamas en la piel, la reducción de la inflamación de la piel, la reducción del agrietamiento de la piel, la reducción de la formación de ampollas en la piel, la reducción de la formación de cicatrices en la piel, la reducción de la exudación de la piel y la reducción del sangrado de la piel.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de filagrina incluye cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en la tabla 2. En realizaciones concretas, la secuencia de aminoácidos de filagrina incluye SEQ ID NO:1.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de filagrina presenta al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de una filagrina nativa, o cualquier intervalo de porcentaje de identidad de secuencia que se deriva de estos. Los ejemplos de secuencias de filagrina se exponen en la siguiente tabla 2. En realizaciones concretas, la secuencia de aminoácidos de filagrina presenta al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1. La "identidad de secuencia" se define como el porcentaje de restos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos aminoácidos en las correspondientes posiciones en una secuencia de polipéptido nativa, después de alinear las secuencias y de introducir huecos si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. Los valores del porcentaje de identidad de secuencia pueden ser generados por el software NCBI BLAST2.0 de Altschul y col. (1997). Los parámetros se ajustan a los valores por defecto, con la excepción de la penalización por desapareamiento, que se ajusta a -1.

Con respecto a la secuencia de importación a células, en algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos incluye un resto arginina unido covalentemente a un resto metionina. En algunas realizaciones, el resto arginina y el resto metionina están separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 restos aminoácidos intermedios. En una realización concreta, la secuencia de importación a células comprende SEQ ID NO:23.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye un conector entre la secuencia de aminoácidos de filagrina y la secuencia de aminoácidos de importación a células. El conector puede ser cualquier conector conocido por los expertos en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de conectores se analizan en la siguiente memoria descriptiva.

En algunas realizaciones, el polipéptido incluye SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22. En una realización concreta, el polipéptido es SEQ ID NO:21.

El polipéptido puede definirse también como una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos de filagrina y la secuencia de aminoácidos de importación a células. La secuencia de aminoácidos de filagrina puede estar unida al N-terminal de la secuencia señal de importación a células o puede estar unida al C-terminal de la secuencia señal de importación a células.

Otras realizaciones de la presente invención incluyen un ácido nucleico que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico según se expuso anteriormente. Otras realizaciones incluyen un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de filagrina. La secuencia de aminoácidos de filagrina es cualquier secuencia de aminoácidos de filagrina expuesta en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está incluido en un vector vírico. Los ejemplos no limitantes de vectores víricos incluyen vectores lentivíricos, vectores víricos adenoasociados, y vectores adenovíricos.

Otras realizaciones de la presente invención se refieren a una composición para su uso en el cuidado de la piel que incluye una cantidad eficaz de un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de filagrina y una secuencia señal de importación a células, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención tal como se expuso anteriormente. El polipéptido puede ser cualquiera de las quimeras de polipéptidos mencionadas anteriormente. El ácido nucleico puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente.

En algunas realizaciones, la composición incluye además un componente lipídico. El componente lipídico puede tener una carga neta neutra. Puede incluir solo lípidos neutros o puede incluir opcionalmente lípidos catiónicos y aniónicos, de modo que la carga neta de los lípidos en el componente lipídico sea neutra.

El componente lipídico puede incluir un lípido neutro. Por ejemplo, el lípido neutro puede ser un fosfolípido neutro. Los ejemplos no limitantes de fosfolípidos neutros incluyen fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina. Otros ejemplos de fosfolípidos neutros incluyen 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC), fosfatidilcolina de huevo ("egg phosphatidylcholine", EPC), dilauriloilfosfatidilcolina ("DLPC"), dimiristoilfosfatidilcolina ("DMPC"), dipalmitoilfosfatidilcolina ("DPPC"), diestearoilfosfatidilcolina ("DSPC"), 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina ("MPPC"), 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina ("PMPC"), 1-palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina ("PSPC"), 1estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina ("SPPC"), dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC"), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3fosfocolina ("DAPC"), 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DBPC"), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DEPC"), palmitoiloleoilfosfatidilcolina ("POPC"), lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina diestearoilfosfatidiletanolamina ("DSPE"), dimiristoilfosfatidiletanolamina ("DMPE"), dipalmitoilfosfatidiletanolamina ("DPPE"), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina ("POPE"), y lisofosfatidiletanolamina.

El componente lipídico puede incluir un lípido cargado negativamente. Por ejemplo, el lípido cargado negativamente puede ser un fosfolípido cargado negativamente. Los ejemplos no limitantes de fosfolípidos cargados negativamente incluyen fosfatidilserina y fosfatidilglicerol. Otros ejemplos incluyen dimiristoilfosfatidilserina ("DMPS"), dipalmitoilfosfatidilserina ("DPPS"), fosfatidilserina cerebral ("BPS"), dilauriloilfosfatidilglicerol ("DLPG"), dimiristoilfosfatidilglicerol ("DMPG"), dipalmitoilfosfatidilglicerol ("DPPG"), diestearoilfosfatidilglicerol ("DSPG"), y dioleoilfosfatidilglicerol ("DOPG").

El componente lipídico puede incluir opcionalmente colesterol de polietilenglicol (PEG).

Otros posibles componentes lipídicos incluyen lípidos catiónicos. Los ejemplos no limitantes de lípidos catiónicos incluyen 1,2-dioleil-3-trimetilamoniopropano (DOTAP), 1,2-dioleoil-3-dimetilamoniopropano (DODAP), bromuro de dimetildioctadecilamono (DDAB), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), y DCcolesterol.

El componente lipídico puede incluir un único tipo de lípido o puede incluir dos o más tipos diferentes de lípidos. En algunas realizaciones, la composición incluye liposomas. Los liposomas se analizan en detalle en otro punto de esta memoria descriptiva.

En algunas realizaciones, la composición es una disolución, una emulsión, una crema, una loción, un gel o un ungüento. La emulsión puede ser una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite.

La composición puede incluir cualquier cantidad de polipéptido quimérico o de ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico según se expone en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición incluye del 0,001% al 5,0% en peso de polipéptido.

La presente invención también se refiere, en general, a procedimientos para transportar un polipéptido de filagrina hacia el interior de una célula, que comprenden poner en contacto una célula con cualquiera de los polipéptidos quiméricos mencionados anteriormente, con lo que el polipéptido de filagrina se transporta hacia el interior de la célula. La célula puede ser cualquier tipo de célula. En realizaciones concretas, la célula es una célula de la piel. Por ejemplo, la célula de la piel puede ser una célula basal, una célula escamosa, un melanocito o un queratinocito.

También se describen procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad de la piel o un trastorno de la piel en un sujeto, que implican administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que incluye (a) un polipéptido quimérico recombinante según se expuso anteriormente, o (b) un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos quiméricos mencionados anteriormente. El sujeto puede ser cualquier sujeto, pero, en realizaciones concretas, el sujeto es un mamífero. Los ejemplos no limitantes de mamíferos incluyen ratones, ratas, conejos, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, caballos, vacas, primates y seres humanos. En realizaciones concretas, el sujeto es un ser humano. Por ejemplo, el ser humano puede padecer una enfermedad o un trastorno de la piel, o estar en riesgo de desarrollarlos. En algunas realizaciones, el ser humano es un paciente con una enfermedad de la piel. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de la piel se exponen en otro punto de esta memoria descriptiva. En realizaciones concretas, la enfermedad de la piel es la ictiosis vulgar o la dermatitis atópica.

La composición puede administrarse al sujeto empleando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica. En realizaciones concretas, la administración implica aplicar por vía tópica la composición a una superficie de la piel del sujeto. La superficie de la piel puede ser una superficie mucósica, o puede ser una superficie de la piel que no incluya mucosas. La mucosa puede incluir la mucosa oral, la mucosa vaginal, la mucosa cervical o la mucosa anal.

Las composiciones expuestas en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más agentes adicionales que pueden aplicarse al tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno de la piel en un

sujeto. Los ejemplos no limitantes de agentes adicionales incluyen un hidratante, un agente exfoliante, un agente antiinflamatorio o un agente antimicrobiano. En otro punto de esta memoria descriptiva se detallan otros. En algunas realizaciones, la composición incluye un componente lipídico, que incluye cualquiera de los componentes lipídicos expuestos anteriormente. La composición puede incluir opcionalmente liposomas.

La composición puede formularse de cualquier manera conocida por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la composición es una disolución, una emulsión, una crema, una loción, un gel o un ungüento. La emulsión puede ser una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. La composición puede incluir cualquier cantidad de uno o más ingredientes activos. Por ejemplo, la composición puede incluir de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5,0% en peso de polipéptido quimérico u otro ingrediente.

Otros aspectos de la presente invención se refieren a kits. El kit puede incluir un recipiente sellado que incluye un polipéptido recombinante, según se indicó anteriormente, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico, según se expuso anteriormente. El recipiente sellado puede ser cualquier tipo de recipiente sellado. Los ejemplos no limitantes de recipientes sellados incluyen un vial, una botella, un dispensador o un paquete. El kit puede incluir opcionalmente un aplicador. El kit puede incluir un recipiente sellado que incluye cualquiera de las composiciones expuestas en el presente documento.

Se contempla específicamente que cualquier limitación analizada con respecto a una realización de la invención pueda aplicarse a cualquier otra realización de la invención. Además, cualquier composición de la invención puede utilizarse en cualquier procedimiento de la invención, y cualquier procedimiento de la invención puede utilizarse para producir o para utilizar cualquier composición de la invención.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se emplea para indicar "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiera solo a la alternativa o que la alternativa sea mutuamente excluyente, aunque la memoria descriptiva apoya una definición que se refiere solo a alternativas e "y/o."

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se emplea para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo y/o el procedimiento que se está empleando para determinar el valor.

Tal como se emplea en la memoria descriptiva, "un" o "una" pueden significar uno o más, a menos que se indique claramente lo contrario. Tal como se emplea en la memoria descriptiva en las reivindicaciones, cuando se emplean junto con la palabra "comprende," los términos "un" o "una" pueden significar uno o más de uno. Tal como se emplea en la memoria descriptiva, "otro" puede significar al menos un segundo o más.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, tan solo se ofrecen como ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Descripción de ejemplos de realizaciones

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la eficacia terapéutica de la filagrina, como agente para tratar o prevenir enfermedades de la piel, puede mejorar significativamente uniendo una secuencia señal de importación a células al polipéptido de filagrina. La secuencia de importación a células puede incluir, por ejemplo, un motivo de dos a quince aminoácidos que incluye al menos un resto arginina y al menos un resto metionina. Estos polipéptidos y los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos tienen aplicación en el tratamiento o la prevención de una amplia diversidad de trastornos, que incluyen enfermedades o trastornos de la piel asociados con una queratinización anómala o una diferenciación epidérmica anómala.

A. Polipéptidos

1. Polipéptidos en general

La presente invención se refiere a polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos de filagrina y una secuencia señal de importación a células. Tal como se emplea en el presente documento, un "polipéptido" se define en general en el presente documento como una secuencia peptídica de aproximadamente 2 a aproximadamente 10.000 o más restos aminoácidos.

El término “aminoácido” no solo incluye los 20 aminoácidos habituales en proteínas sintetizadas de modo natural, sino que también incluye cualquier aminoácido modificado, poco habitual o sintético. Los expertos en la técnica están familiarizados con los aminoácidos modificados, poco habituales o sintéticos. Los ejemplos de aminoácidos modificados y poco habituales se muestran en la siguiente tabla 1.

Tabla 1 -Aminoácidos modificados y poco habituales

Abrev.

Aminoácido Abrev. Aminoácido

Aad

ácido 2-aminoadípico EtAsn N-etilasparagina

Baad

ácido 3-aminoadípico Hyl hidroxilisina

Bala

-alanina, ácido -aminopropiónico AHyl alo-hidroxilisina

Abu

ácido 2-aminobutírico 3Hyp 3-hidroxiprolina

4Abu

ácido 4-aminobutírico, ácido piperidínico 4Hyp 4-hidroxiprolina

Acp

ácido 6-aminocaproico Ide isodesmosina

Ahe

ácido 2-aminoheptanoico AIle alo-isoleucina

Aib

ácido 2-aminoisobutírico MeGly N-metilglicina, sarcosina

Baib

ácido 3-aminoisobutírico MeIle N-metilisoleucina

Apm

ácido 2-aminopimélico MeLys 6-N-metil-lisina

Dbu

ácido 2,4-diaminobutírico MeVal N-metilvalina

Des

desmosina Nva norvalina

Dpm

ácido 2,2’-diaminopimélico Nle norleucina

Dpr

ácido 2,3-diaminopropiónico Orn ornitina

EtGly

N-etilglicina

Los polipéptidos que se incluyen en los procedimientos expuestos en el presente documento son quiméricos porque comprenden una secuencia de aminoácidos de filagrina y una secuencia señal de importación a células. 5 Los polipéptidos expuestos en el presente documento pueden comprender una o más secuencias señal de importación a células, que pueden o no ser idénticas. De modo similar, los polipéptidos expuestos en el presente documento pueden comprender una o más secuencias de aminoácidos de filagrina, que pueden o no ser idénticas.

En ciertas realizaciones de la presente invención, el polipéptido es un polipéptido de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos de filagrina unida en el N-o C-terminal a una secuencia señal de importación a células.

10 En otras realizaciones, el polipéptido comprende un conector interpuesto entre la secuencia de aminoácidos de filagrina y la secuencia señal de importación a células. Los conectores se analizan con más detalle en la memoria descriptiva a continuación.

Además, los polipéptidos expuestos en la presente pueden comprender una secuencia de cualquier número de restos aminoácidos adicionales en el N-o C-terminal de la secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de

15 aminoácidos de filagrina y la secuencia señal de importación a células. Por ejemplo, puede haber una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 3 a aproximadamente 10.000 o más restos aminoácidos en el N-terminal, en el C-terminal, o en ambos N-terminal y C-terminal de la secuencia de aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos de filagrina y la secuencia señal de importación a células.

El polipéptido puede incluir la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epitopo de anticuerpo

20 u otro marcador, para facilitar la búsqueda o la purificación del polipéptido. El uso de 6xHis y GST (glutatión S transferasa) como marcadores es muy conocido. La inclusión de un sitio de ruptura en la zona de unión de la fusión, o cerca de esta, facilita la retirada del polipéptido superfluo después de la purificación. Otras secuencias de aminoácidos que pueden incluirse en el polipéptido incluyen dominios funcionales, tales como sitios activos de enzimas, tales como una hidrolasa, dominios de glicosilación, señales de transporte dirigido celular o regiones

25 transmembrana. El polipéptido puede incluir además uno o más restos de transporte a tejidos adicionales.

Los polipéptidos de la presente invención pueden poseer deleciones y/o sustituciones de aminoácidos con relación a la secuencia nativa; por tanto, se contemplan las secuencias con una deleción, las secuencias con una sustitución y las secuencias con una deleción y una sustitución para su inclusión en los polipéptidos de la presente

invención. En algunas realizaciones, estos polipéptidos pueden incluir además inserciones o aminoácidos añadidos, tales como conectores.

Los variantes de sustitución o de reemplazo generalmente contienen un intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, en particular para aumentar su eficacia o su especificidad. Las sustituciones de este tipo preferentemente son conservativas, es decir, un aminoácido se reemplaza por otro de forma y carga similares. Las sustituciones conservativas son muy conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano o tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.

Además de una deleción o sustitución, los polipéptidos pueden poseer una inserción de uno o más restos. Esto puede incluir la adición de uno o más restos aminoácidos.

La expresión "equivalente biológicamente funcional" se entiende en la técnica y se define con detalle a continuación en el presente documento. Por consiguiente, se incluyen las secuencias que tienen entre aproximadamente 70% y aproximadamente 80%, o entre aproximadamente 81% y aproximadamente 90%, o incluso entre aproximadamente 91% y aproximadamente 99% aminoácidos idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la filagrina nativa o la secuencia señal de importación a células, con la condición de que se mantenga la actividad biológica de la secuencia nativa.

Por tanto, la secuencia de aminoácidos de filagrina puede ser un equivalente biológicamente funcional al homólogo nativo. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de filagrina puede ser funcionalmente equivalente en términos de la capacidad para mantener la salud epidérmica. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de filagrina pueden tener una actividad biológica mayor que sus homólogos nativos.

A continuación se ofrece un análisis basado en el cambio de los aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente, o incluso una molécula de segunda generación mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en un polipéptido sin una pérdida apreciable de función, tal como la capacidad para interaccionar con una célula endotelial de un vaso sanguíneo. Puesto que la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido definen la actividad funcional biológica del polipéptido, pueden realizarse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia polipeptídica y producir, no obstante, un polipéptido con propiedades similares.

Al hacer dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende en general en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo de los aminoácidos contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que, a su vez, define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de modo eficaz basándose en la hidrofilicidad. La patente de EE. UU. 4.554.101 indica que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Tal como se detalla en la patente de EE. UU. 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los restos aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0  1); glutamato (+3,0  1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5  1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente e inmunológicamente equivalente. Cuando se realizan estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad estén dentro de  2, se prefieren en particular los que estén dentro de  1, y aún se prefieren más en particular los que estén dentro de  0,5.

Tal como se resumió anteriormente, las sustituciones de aminoácidos están basadas en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Los ejemplos de sustituciones que toman en cuenta las diversas características anteriores son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

2. Secuencias de aminoácidos de filagrina

Las secuencias de aminoácidos de filagrina contempladas para su inclusión en los polipéptidos, las composiciones y los procedimientos de la presente invención pueden obtenerse a partir de cualquier fuente. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de filagrina puede obtenerse de una fuente natural o puede sintetizarse de modo 5 químico. La secuencia de aminoácidos de filagrina puede proceder de cualquier especie. Por ejemplo, puede ser una secuencia de aminoácidos de filagrina de mamífero. Los ejemplos no limitantes incluyen una secuencia de aminoácidos de ratón, rata, conejo, cabra, oveja, caballo, vaca, perro, gato, primate o ser humano. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos de filagrina es una secuencia de aminoácidos humana. Se exponen ejemplos no limitantes de proteínas de filagrina en la tabla 2.

10 Tabla 2 -Ejemplos de secuencias de proteínas de filagrina

Secuencia

n.º de registro de GenBank SEQ ID NO:

Filagrina, Homo sapiens

1

Filagrina, Homo sapiens

NP_002007 2 2

Filagrina, Homo sapiens

AAA52454 3

Filagrina, Homo sapiens

CAI19595 4

Filagrina, Homo sapiens

P20930 5

Filagrina, Mus musculus

6

Filagrina, Mus musculus

AAM23016 7

Filagrina, Mus musculus

AAA75559 8

Filagrina, Mus musculus

AAA37626 9

Filagrina, Mus musculus

AAA37625 10

Filagrina, Mus musculus

XP_485270 11

Filagrina, Mus musculus

P11088 12

Filagrina, Mus musculus

EDL00668.1 13

Filagrina, Rattus norvegicus

EDL87862 14

Filagrina, Pan troglodytes

XP_001134714 15

Filagrina, Pan troglodytes

XP_513808 16

Filagrina, Bos taurus

XP_001255583 17

Filagrina, Macaca mulatta

XP_001101725.1 18

Filagrina, Macaca mulatta

XP_001109011.1 19

3. Secuencias señal de importación a células

Se contempla cualquier secuencia señal de importación a células que facilite la entrada de la secuencia de aminoácidos de filagrina hacia el interior de una célula como secuencia señal de importación a células de la 15 presente invención. En algunas realizaciones, la secuencia señal incluye un motivo de dos a quince aminoácidos, en el que el motivo incluye al menos un resto aminoácido de arginina y al menos un resto aminoácido de metionina. El resto aminoácido de arginina y el resto aminoácido de metionina pueden ser restos consecutivos dentro del motivo o pueden estar separados por uno o más aminoácidos intermedios. En algunas realizaciones de los polipéptidos recombinantes de la presente invención, el polipéptido incluye más de un motivo de dos a quince 20 aminoácidos, en el que cada motivo incluye al menos un resto aminoácido de arginina y al menos un resto aminoácido de metionina. Los motivos pueden incluir secuencias de aminoácidos idénticas o pueden tener secuencias de aminoácidos diferentes. Los motivos de repetición ricos en metionina/arginina se analizan en Datar

y col. (1993). Se exponen ejemplos no limitantes de proteínas de filagrina en la tabla 3. Tabla 3 -Ejemplos de secuencias señal de importanción a células

Secuencia

SEQ ID NO:

RMRRMRRMRR

23

RGRRGRRGRR

24

RRRRRRRRRR

25

RARRARRARR

26

RTRRTRRTRR

27

RSRRSRRSRR

28

RVRRVRRVRR

29

RKRRKRRKRR

30

RRRRRRR

31

RRRRRRRR

32

RRRRRRRRR

33

RRRRRRRRRRR

34

RRRRRRRRRRRR

35

RRRRRRRRRRRRR

36

RRRRRRRRRRRRRR

37

RRRRRRRRRRRRRRR

38

4. Procedimientos de síntesis de polipéptidos

5 En ciertas realizaciones de la presente invención, el polipéptido es codificado por una única secuencia de ácido nucleico recombinante empleando técnicas recombinantes. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos de filagrina y la secuencia señal de importación a células son codificadas por secuencias de ácidos nucleicos distintas y después se unen mediante conjugación química. En otras realizaciones, el polipéptido se ha sintetizado de novo.

a. Técnicas recombinantes

10 En ciertas realizaciones de la presente invención, el polipéptido quimérico es codificado por un único polinucleótido recombinante empleando técnicas recombinantes muy conocidas por los expertos en la técnica. El polinucleótido puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos adicionales que dirigen la expresión del polipéptido quimérico en células hospedantes apropiadas.

Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden emplearse otras secuencias de ADN que

15 codifiquen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos, o una secuencia funcionalmente equivalente, en la práctica de la invención para la clonación y la expresión de la proteína quimérica. Estas secuencias de ADN incluyen las secuencias capaces de hibridarse con las secuencias quiméricas o sus secuencias complementarias bajo condiciones rigurosas. En una realización, la expresión "condiciones rigurosas", tal como se emplea en el presente documento, se refiere a las condiciones de hibridación que (1) emplean una baja fuerza iónica y una alta

20 temperatura para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/SDS al 0,1% a 50 °C; (2) durante la hibridación, emplean un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (en vol/vol) con un tampón de albúmina de suero bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 0,75 M, pirofosfato de sodio 0,075 M, 5x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado

25 (50 g/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2x SSC y SDS al 0,1%.

Las secuencias de ADN alteradas que pueden emplearse según la invención incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes restos nucleotídicos que producen una secuencia que codifica el mismo polinucleótido u otro funcionalmente equivalente. El polinucleótido puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos aminoácidos dentro de una secuencia quimérica, que producen un cambio silencioso produciendo así un polinucleótido quimérico funcionalmente equivalente. Estas sustituciones de aminoácidos pueden realizarse basándose en similitudes en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados, tal como se analizó anteriormente.

Las secuencias de ADN de la invención pueden modificarse para alterar una secuencia codificadora quimérica por una diversidad de razones, que incluyen, pero no se limitan a alteraciones que pueden modificar el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones empleando técnicas muy conocidas en la técnica, por ejemplo, la mutagénesis específica dirigida a sitio, insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, fosforilación, etc.

Para expresar un polipéptido quimérico biológicamente activo, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico, o un equivalente funcional, se inserta en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora insertada. Los productos del gen quimérico, así como las células hospedantes o las líneas celulares transfectadas

o transformadas con los vectores de expresión quiméricos recombinantes, pueden emplearse para una diversidad de fines. Estos incluyen, pero no se limitan a la generación de anticuerpos (concretamente, monoclonales o policlonales) que se unen a epitopos de las proteínas para facilitar su purificación.

Pueden emplearse procedimientos que son muy conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificadoras quiméricas y señales de control transcripcional/traduccional adecuadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y la recombinación/recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col., 2001.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresión/hospedante para expresar la secuencia codificadora del polipéptido quimérico. Estos incluyen, pero no se limitan a microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen la secuencia codificadora de la proteína quimérica; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen la secuencia codificadora de la proteína quimérica; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificadora de la proteína quimérica; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido de Ti) que contienen la secuencia codificadora de la proteína quimérica; o sistemas de células animales. Debe advertirse que puesto que la mayoría de las proteínas inductoras de la apoptosis provocan la muerte celular programada en células de mamífero, se prefiere que la proteína quimérica de la invención se exprese en células procariotas o de eucariotas inferiores. La sección 6 ilustra que IL2-Bax puede expresarse con eficacia en E. coli.

Los elementos de expresión de cada sistema varían en su potencia y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedante/vector utilizado, puede emplearse cualquiera de una serie de elementos de la transcripción y la traducción adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles, en el vector de expresión. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden emplearse promotores inducibles, tales como pL del bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac; promotor de citomegalovirus) y similares; cuando se clona en sistemas de células de insecto, pueden utilizarse promotores, tales como el promotor de polihedrina de baculovirus; cuando se clona en sistemas de células vegetales, pueden utilizarse promotores derivados del genoma de células vegetales (por ejemplo, promotores de choque térmico; el promotor para la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor para la proteína de unión a clorofila α/β) o de virus de plantas (por ejemplo, el promotor de 35S de ARN de CaMV; el promotor de proteína de la envuelta de TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, pueden utilizarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K de virus de vaccinia); cuando se generan líneas celulares que contienen múltiples copias de ADN quimérico, pueden emplearse vectores basados en SV40, BPV y EBV con un marcador seleccionable apropiado.

En sistemas bacterianos, puede seleccionarse de forma ventajosa una serie de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el polipéptido quimérico expresado. Por ejemplo, cuando sea necesario producir grandes cantidades de polipéptido quimérico, pueden resultar deseables vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de los productos de proteínas que puedan purificarse con facilidad. Estos vectores incluyen, pero no se limitan al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther y col., 1983), en el que la secuencia que codifica la

proteína quimérica puede acoplarse al vector dentro de marco con la región codificadora de lacZ de modo que se produce una proteína híbrida AS-lacZ ; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, 1989); y similares.

Un sistema de expresión alternativo que puede emplearse para expresar un polipéptido quimérico es un sistema de insecto. En este sistema se emplea el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificadora de la proteína quimérica puede clonarse en regiones no fundamentales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control del promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). La inserción correcta de la secuencia que codifica el polipéptido quimérico hará que el gen de polihedrina se inactive y se produzcan virus recombinantes no ocluidos (es decir, virus que carecen de la envuelta proteica codificada por el gen de polihedrina). Entonces, estos virus recombinantes se emplean para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que el gen insertado se expresa (por ejemplo, véase Smith y col., 1983; patente de EE. UU. n.º 4.215.051).

También pueden ser necesarias secuencias de inicio específicas para lograr una traducción eficaz de las secuencias codificadoras de la proteína quimérica insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en que el gen quimérico completo, incluyendo su propio codón de inicio y secuencias adyacentes, se inserta en el vector de expresión adecuado, puede que no sean necesarias más señales de control de la traducción. Sin embargo, en los casos en que la secuencia codificadora de la proteína quimérica no incluye su propio codón de inicio, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas que incluyan el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe encontrarse en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora de la proteína quimérica para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales de control traduccional y codones de inicio exógenos pueden tener una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., apropiados (véase Bittner y col., 1987).

Además, puede elegirse una cepa de célula hospedante que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, ruptura) de los productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. La presencia de sitios de N-glicosilación consenso en una proteína quimérica puede requerir una modificación apropiada para conseguir una función óptima de la proteína quimérica. Diferentes células hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas de hospedante apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína quimérica. Para este fin, pueden emplearse células hospedantes eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria, la glicosilación y la fosforilación de la proteína quimérica. Estas células hospedantes de mamífero incluyen, pero no se limitan a CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, W138, y similares.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de polipéptidos quiméricos recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse líneas celulares que expresan de modo estable el polipéptido quimérico. En lugar de emplear vectores de expresión que contengan orígenes de la replicación víricos, pueden transformarse células hospedantes con una secuencia codificadora quimérica controlada por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias de promotores, de potenciadores, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, las células modificadas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y después cambiarlas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren el plásmido de forma estable en sus cromosomas y que crezcan formando focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares.

Pueden emplearse una serie de sistemas de selección que incluyen, pero no se limitan a los genes de timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler y col., 1977), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalski y Szybalski, 1962) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., 1980) en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Además, puede emplearse la resistencia a antimetabolitos como base para la selección del gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., 1980; O’Hare y col., 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colbere-Garapin y col., 1981); e hydro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., 1984). Se han descrito otros genes seleccionables, concretamente trpB, que permite a las células utilizar el indol en lugar del triptófano; hisD, que permite a las células utilizar el histinol en lugar de la histidina (Hartman y Mulligan, 1988); y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DLornitina, DFMO (véase McConlogue, 1986).

b. Síntesis de novo

En una realización alternativa de la invención, el polipéptido quimérico puede sintetizarse de novo por completo o en parte, empleando procedimientos químicos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Caruthers y col., 1980; Crea y Horn, 1980; y Chow y Kempe, 1981). Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos componentes pueden sintetizarse mediante técnicas en fase sólida, escindirse de la resina y purificarse mediante una cromatografía líquida de alta resolución preparativa, seguido de un enlace químico para formar una proteína quimérica (por ejemplo, véase Creighton, 1983). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmarse por medio del análisis o secuenciación de los aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, 1983).

Las técnicas de síntesis de polipéptidos son muy conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Bodanszky y col., 1976). Estos procedimientos sintéticos implican la adición secuencial de uno o más restos aminoácidos o restos aminoácidos protegidos adecuados a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer resto aminoácido se protege por medio de un grupo protector adecuado que se puede retirar selectivamente. Se emplea un grupo protector que se puede retirar selectivamente diferente para aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como lisina.

Empleando la síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo entonces se retira selectivamente y se mezcla el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido de modo adecuado y se hace reaccionar con el resto que ya está unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo entonces se retira de este resto aminoácido recién añadido y después se añade el siguiente aminoácido (protegido de modo adecuado), etc. Después de que todos los aminoácidos deseados hayan sido unidos en la secuencia apropiada, cualquier grupo protector de grupo lateral y terminal remanente (y el soporte sólido) se retira secuencialmente o al mismo tiempo, para proporcionar el péptido final. Estos restos de grupos protectores pueden utilizarse en el desarrollo de la síntesis, pero se retiran antes de que los péptidos se empleen. Pueden ser necesarias otras reacciones, tal como se describe en otro punto en el presente documento, para formar enlaces intramoleculares para restringir la conformación.

c. Conectores

Como alternativa, los dos restos del polipéptido quimérico producido mediante procedimientos sintéticos o recombinantes pueden conjugarse por medio de conectores según procedimientos muy conocidos en la técnica (Brinkmann y Pastan, 1994). Tal como se emplea en el presente documento, un "conector" es un producto químico

o péptido o polipéptido que une una secuencia de aminoácidos de transporte endotelial con una secuencia de aminoácidos citotóxica.

Las dos secuencias codificadoras pueden condensarse directamente sin ningún conector o empleando un policonector flexible, tal como un conector compuesto del pentámero Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:19) repetido de 1 a 3 veces. Este conector se ha empleado para construir anticuerpos monocatenarios (Fvmc) insertándose entre VH y VL (Bird y col., 1988; Huston y col., 1988). El conector se diseña para permitir la interacción correcta entre dos láminas beta que forman la región variable del anticuerpo monocatenario. Otros conectores que pueden utilizarse incluyen Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (SEQ ID NO:20) (Chaudhary y col., 1990) y Lys-Glu-Ser-Gly-SerVal-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:21) (Bird y col., 1988).

También pueden unirse múltiples péptidos o polipéptidos a través de un enlace que puede romperse de modo biológico, tal como una secuencia de aminoácidos o conector de ruptura selectiva. Por ejemplo, se contemplan conectores peptídicos que incluyen un sitio de ruptura para una enzima preferentemente localizada o activa dentro de un entorno tumoral. Los ejemplos de formas de dichos conectores peptídicos son los que son rotos por uroquinasa, plasmina, trombina, factor IXa, factor Xa, o una metaloproteinasa, tal como colagenasa, gelatinasa o estromelisina. Como alternativa, los polipéptidos pueden unirse a un adyuvante. Como directriz general, puede considerarse que cualquier conector conocido por los expertos en la técnica se contempla para su uso como conector en la presente invención.

Se contempla que pueden aplicarse entrecruzadores a las moléculas polipeptídicas de la presente invención. Los reactivos entrecruzadores se emplean para formar puentes moleculares que enlazan grupos funcionales de dos moléculas diferentes, por ejemplo, un agente estabilizante y coagulante. Para enlazar dos polipéptidos diferentes de modo discontinuo, pueden emplearse entrecruzadores heterobifuncionales que eliminsn la formación de homopolímeros no deseada. Los reactivos de entrecruzamiento bifuncionales se han empleado mucho para una diversidad de fines, que incluyen la preparación de matrices de afinidad, la modificación y la estabilización de diversas estructuras, la identificación de sitios de unión y los estudios estructurales. En el contexto de la invención, este entrecruzador puede utilizarse para estabilizar el polipéptido o para hacer que sea más útil como producto terapéutico, por ejemplo, mejorando la capacidad de transporte dirigido del polipéptido o su eficacia global. Los

entrecruzadores también pueden romperse, tales como los disulfuros, los conectores sensibles a ácidos y otros. Los reactivos homobifuncionales que portan dos grupos funcionales idénticos han demostrado ser muy eficaces para inducir el entrecruzamiento entre macromoléculas idénticas y diferentes, o subunidades de una macromolécula, y para la unión de polipéptidos a sitios de unión específicos sobre compañeros de unión. Los 5 reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Aprovechando las diferentes reactividades de los dos grupos funcionales diferentes, el entrecruzamiento puede controlarse de modo selectivo y secuencial. Los reactivos de entrecruzamiento bifuncionales pueden dividirse según la especificidad de sus grupos funcionales, por ejemplo, grupos específicos de amino, sulfhidrilo, guanidino, indol, carboxilo. De estos, los reactivos dirigidos a grupos amino libre se han convertido en especialmente populares por su disponibilidad

10 comercial, facilidad de síntesis y las condiciones de reacción suaves que pueden aplicarse. La mayoría de los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales contienen un grupo reactivo a amina primara y un grupo reactivo a tiol.

En otro ejemplo, se describen reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales y procedimientos para la utilización de los reactivos de entrecruzamiento (patente de EE. UU. 5.889.155). Los reactivos entrecruzadores 15 mezclan un resto hidrazida nucleófilo con un resto maleimido electrófilo, que permiten el acoplamiento, por ejemplo, de aldehídos a tioles libres. El reactivo entrecruzador puede modificarse para que entrecruce diversos grupos funcionales y, por tanto, es útil para entrecruzar polipéptidos y azúcares. En los casos en que un polipéptido concreto, tal como gelonina, no contenga en su secuencia nativa un resto adecuado para un reactivo entrecruzador concreto, pueden realizarse cambios en aminoácidos conservativos, genéticos o sintéticos en la

20 secuencia primaria. La tabla 4 detalla ciertos ejemplos de entrecruzadores heterobifuncionales considerados útiles en la presente invención.

Tabla 4 -Entrecruzadores heterobifuncionales

Conector

Reactivo hacia Ventajas y aplicaciones Longitud del brazo espaciador después del entrecruzamiento

SMPT

Aminas primarias Sulfihidrilos -Mayor estabilidad 11,2 A

SPDP

Aminas primarias Sulfihidrilos -Tiolación -Reticulación que puede romperse 6,8 A

LC-SPDP

Aminas primarias Sulfihidrilos -Brazo espaciador extendido 15,6 A

Sulfo-LC-SPDP

Aminas primarias Sulfihidrilos -Brazo espaciador extendido -Hidrosoluble 15,6 A

SMCC

Aminas primarias Sulfihidrilos -Grupo reactivo a maleimida estable -Conjugación de enzima-anticuerpo -Congugación de hapteno-proteína vehículo 11,6 A

Sulfo-SMCC

Aminas primarias Sulfihidrilos -Grupo reactivo a maleimida estable -Hidrosoluble -Conjugación de enzima-anticuerpo 11,6 A

MBS

Aminas primarias Sulfihidrilos -Conjugación de enzima-anticuerpo -Congugación de hapteno-proteína vehículo 9,9 A

Sulfo-MBS

Aminas primarias Sulfihidrilos -Hidrosoluble 9,9 A

SIAB

Aminas primarias Sulfihidrilos -Conjugación de enzima-anticuerpo 10,6 A

Sulfo-SIAB

Aminas primarias Sulfihidrilos -Hidrosoluble 10,6 A

SMPB

Aminas primarias Sulfihidrilos -Brazo espaciador extendido -Conjugación de enzima-anticuerpo 14,5 A

Sulfo-SMPB

Aminas primarias Sulfihidrilos -Brazo espaciador extendido -Hidrosoluble 14,5 A

EDC/Sulfo-NHS

Aminas primarias Grupos carboxilo -Congugación de hapteno-vehículo 0

ABH

Carbohidratos No selectivo -Reacciona con grupos azúcar 11,9 A

d. Purificación de proteínas

En ciertas realizaciones de la presente invención, el polipéptido se ha purificado. En general, "purificado" se refiere a una composición de polipéptidos que se ha sometido a un fraccionamiento para retirar diversos otros componentes y cuya composición conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se emplea la expresión "sustancialmente purificado", esta denominación se refiere a una composición en la que el polipéptido

o péptido forma el componente principal de la composición, por ejemplo, constituye de aproximadamente 50% a aproximadamente 99,9% o más de las proteínas en la composición.

Los expertos en la técnica conocerán diversos procedimientos para cuantificar el grado de purificación del polipéptido a la luz de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos de técnicas incluyen cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad y similares. Las condiciones reales empleadas para purificar un polipéptido concreto dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica.

Para la purificación con cromatografía de afinidad, puede emplearse cualquier anticuerpo que se una específicamente al polipéptido. Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedantes, que incluyen, pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, etc., pueden inmunizarse mediante una inyección de una proteína quimérica o uno de sus fragmentos. La proteína puede estar unida a un vehículo adecuado, tal como albúmina de suero bovina (BSA), por medio de un grupo funcional de la cadena lateral o conectores unidos a un grupo funcional de la cadena lateral. Pueden emplearse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante, que incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacillo de Calmetter-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra un polipéptido quimérico empleando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma, descrita originariamente por Kohler y Milstein (1975), la técnica del hibridoma de células B humanas (Cote y col., 1983), y la técnica del EBV-hibridoma (Cole y col., 1985). Además, pueden emplearse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984; Neuberger y col., 1984; Takeda y col., 1985) cortando y empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con la especificidad de antígeno apropiada, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Como alternativa, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patentes de EE. UU. n.º 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios específicos de una proteína quimérica para la purificación y la detección de proteínas quiméricas.

B. Ácidos nucleicos

La presente invención incluye ácidos nucleicos que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención.

La expresión "ácido nucleico" es muy conocida en la técnica. Un "ácido nucleico", tal como se emplea en el presente documento, se refiere en general a una molécula (concretamente, una hebra) de ADN, ARN o uno de sus derivados o análogos, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o en el ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C). La expresión "ácido nucleico" incluye los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido", cada uno un subgénero de la expresión "ácido nucleico". El término "oligonucleótido" se refiere a una molécula con una longitud de entre 3 y aproximadamente 100 nucleobases. El término "polinucleótido" se refiere al menos a una molécula con una longitud mayor que aproximadamente 100 nucleobases.

Estas definiciones se refieren a una molécula de ácido nucleico monocatenaria o bicatenaria. Los ácidos nucleicos bicatenarios se forman mediante una unión totalmente complementaria aunque, en algunas realizaciones, un ácido nucleico bicatenario puede formarse mediante una unión parcial o sustancialmente complementaria. Así, un ácido nucleico puede incluir una molécula bicatenaria que comprende una o más hebras complementarias o "complementos" de una secuencia concreta, que generalmente comprende una molécula. Tal como se emplea en el presente documento, un ácido nucleico monocatenario puede indicarse con el sufijo "mc" y un ácido nucleico bicatenario con el sufijo "bc".

1. Nucleobases

Tal como se emplea en el presente documento, una "nucleobase" se refiere a una base heterocíclica, tal como, por ejemplo, una nucleobase natural (es decir, una A, T, G, C o un U) que se encuentra en al menos un ácido nucleico natural (es decir, ADN y ARN) y los derivados y análogos naturales o no naturales de dicha nucleobase. Una nucleobase en general puede formar uno o más enlaces de hidrógeno con al menos una nucleobase natural

("asociarse" o "hibridarse"), de modo que puede sustituir al apareamiento de nucleobases natural (por ejemplo, un enlace de hidrógeno entre A y T, G y C, y A y U).

Las nucleobases de "purina" y/o "pirimidina" incluyen nucleobases de purina y/o pirimidina naturales y también sus derivados y análogos, que incluyen, pero no se limitan a una purina o pirimidina sustituida con uno o más de un resto alquilo, carboxialquilo, amino, hidroxilo, halógeno (es decir, flúor, cloro, bromo, o yodo), tiol o alquiltiol. Los restos alquilo preferidos (por ejemplo, alquilo, carboxialquilo, etc.) comprenden de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Una nucleobase puede estar comprendida en un nucleósido o un nucleótido, empleando cualquier procedimiento de síntesis química o natural descrito en el presente documento o conocido por los expertos en la técnica.

2. Nucleósidos

Tal como se emplea en el presente documento, el término "nucleósido" se refiere a una unidad química individual que comprende una nucleobase unida covalentemente a un resto conector de nucleobase. Un ejemplo no limitante de un "resto conector de nucleobase" es un azúcar que comprende 5 átomos de carbono (es decir, un "azúcar de 5 carbonos") que incluye, pero no se limita a una desoxirribosa, una ribosa, una arabinosa, o un derivado o análogo de un azúcar de 5 carbonos. Los ejemplos no limitantes de un derivado o análogo de un azúcar de 5 carbonos incluyen una 2’-fluoro-2’-desoxirribosa o un azúcar carbocíclico en el que un carbono es sustituido por un átomo de oxígeno en el anillo de azúcar.

En la técnica se conocen diferentes tipos de uniones covalentes de una nucleobase a un resto conector de nucleobase. Como ejemplo no limitante, un nucleósido que comprende una purina (es decir, A o G) o una nucleobase de 7-desazapurina generalmente enlaza covalentemente la posición 9 de una purina o una 7desazapurina con la posición 1’ de un azúcar de 5 carbonos. En otro ejemplo no limitante, un nucleósido que comprende una nucleobase de pirimidina (es decir, C, T o U) generalmente enlaza covalentemente la posición 1 de una pirimidina con la posición 1’ de un azúcar de 5 carbonos (Kornberg y Baker, 1992).

3. Nucleótidos

Tal como se emplea en el presente documento, el término "nucleótido" se refiere a un nucleósido que comprende además un "resto de esqueleto". Un resto de esqueleto generalmente enlaza covalentemente un nucleótido con otra molécula que comprende un nucleótido, o con otro nucleótido para formar un ácido nucleico. El "resto de esqueleto" en nucleótidos naturales generalmente comprende un resto fósforo, que está unido covalentemente al azúcar de 5 carbonos. La unión del resto de esqueleto generalmente se produce en la posición 3’ o 5’ del azúcar de 5 carbonos. Sin embargo, en la técnica se conocen otros tipos de uniones, en particular cuando un nucleótido comprende derivados o análogos de un resto fósforo o azúcar de 5 carbonos natural.

4. Análogos de ácidos nucleicos

Un ácido nucleico puede comprender, o estar compuesto enteramente por un derivado o análogo de una nucleobase, un resto conector de nucleobase y/o un resto de esqueleto que puede estar presente en un ácido nucleico natural. Tal como se emplea en el presente documento, un "derivado" se refiere a una forma químicamente modificada o alterada de una molécula natural, mientras que los términos "mimético" o "análogo" se refieren a una molécula que puede o no parecerse estructuralmente a un resto o molécula natural, pero que posee funciones similares. Tal como se emplea en el presente documento, un "resto" se refiere en general a un componente químico o molecular más pequeño de una estructura química o molecular más grande. Los análogos

o derivados de nucleobases, nucleósidos y nucleótidos son muy conocidos en la técnica y han sido descritos (véase, por ejemplo, Scheit, 1980).

Otros ejemplos no limitantes de nucleótidos, nucleótidos o ácidos nucleicos que comprenden derivados o análogos de azúcares de 5 carbonos y/o restos de esqueleto incluyen los incluidos en la patente de EE. UU. 5.681.947, que describe oligonucleótidos que comprenden derivados de purina que forman triples hélices con ADNbc y/o evitan la expresión de ADNbc; las patentes de EE. UU. 5.652.099 y 5.763.167, que describen ácidos nucleicos que incorporan análogos fluorescentes de nucleósidos encontrados en el ADN o ARN, en particular para su uso como sondas de ácidos nucleicos fluorescentes; la patente de EE. UU. 5.614.617, que describe análogos de oligonucleótidos con sustituciones en los anillos de pirimidina que poseen una mayor estabilidad frente a nucleasas; las patentes de EE. UU. 5.670.663, 5.872.232 y 5.859.221, que describen análogos de oligonucleótidos con azúcares de 5 carbonos modificados (concretamente, restos 2’-desoxifuranosilo modificados) empleados en la detección de ácidos nucleicos; la patente de EE. UU. 5.446.137, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un resto azúcar de 5 carbonos sustituido en la posición 4’ con un sustituyente distinto del hidrógeno, que pueden utilizarse en ensayo de hibridación; la patente de EE. UU. 5.886.165, que describe oligonucleótidos con desoxirribonucleótidos con enlaces internucleotídicos 3’-5’ y ribonucleótidos con enlaces internucleotídicos 2’-5’; la

patente de EE. UU. 5.714.606, que describe un enlace internucleotídico modificado, en el que un oxígeno en la posición 3’ del enlace internucleotídico se reemplaza por un carbono para potenciar la resistencia a nucleasas de los ácidos nucleicos; la patente de EE. UU. 5.672.697, que describe oligonucleótidos que contienen uno o más enlaces internucleotídicos metilenfosfonato 5’ que potencian la resistencia a nucleasas; las patentes de EE. UU.

5.466.786 y 5.792.847, que describen el enlace de un resto sustituyente que puede comprender un fármaco o un marcador con el carbono 2’ de un oligonucleótido para proporcionar una mayor estabilidad frente a nucleasas y mayor capacidad para transportar fármacos o restos de detección; la patente de EE. UU. 5.223.618, que describe análogos de oligonucleótidos con un enlace de esqueleto de 2 o 3 carbonos que une la posición 4’ y la posición 3’ del resto azúcar de 5 carbonos adyacente para potenciar la captación celular, la resistencia a nucleasas y la hibridación de un ARN diana; la patente de EE. UU. 5.470.967, que describe oligonucleótidos que comprenden al menos un enlace internucleotídico sulfamato o sulfamida que son útiles como sondas de hibridación de ácidos nucleicos; las patentes de EE. UU. 5.378.825, 5.777.092, 5.623.070, 5.610.289 y 5.602.240, que describen oligonucleótidos con un resto conector de tres o cuatro átomos que reemplaza al resto de esqueleto de fosfodiéster, empleado para mejorar la resistencia a nucleasas, la captación celular y la regulación de la expresión del ARN; la patente de EE. UU. 5.858.988, que describe un agente de transporte hidrófobo unido a la posición 2’-O de oligonucleótidos para potenciar su permeabilidad de membrana y su estabilidad; la patente de EE. UU. 5.214.136, que describe oligonucleótidos conjugados con antraquinona en el extremo 5’ terminal que poseen una hibridación potenciada al ADN o ARN, y una mayor estabilidad frente a nucleasas; la patente de EE. UU. 5.700.922, que describe quimeras de ANP-ADN-ANP, en las que el ADN comprende nucleótidos de 2’-desoxieritro-pentofuranosilo para una mayor resistencia a nucleasas, afinidad de unión y capacidad para activar la ARNasa H; y la patente de EE. UU. 5.708.154, que describe un ARN unido a un ADN para formar un híbrido de ADN-ARN.

5. Ácidos nucleicos de poliéter

En ciertas realizaciones, se contempla que un ácido nucleico que comprende un derivado o análogo de un nucleósido o nucleótido pueda utilizarse en los procedimientos y las composiciones de la invención. Un ejemplo no limitante es un "ácido nucleico de poliéter", descrito en la patente de EE. UU. 5.908.845. En un ácido nucleico de poliéter, una o más nucleobases están unidas a átomos de carbono quirales en un esqueleto de poliéter.

6. Preparación de ácidos nucleicos

Puede fabricarse un ácido nucleico mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, tal como síntesis química, producción enzimática o producción biológica. Los ejemplos no limitantes de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, un oligonucleótido sintético) incluyen un ácido nucleico fabricado mediante una síntesis química in vitro empleando la química de fosfotriéster, fosfita o fosforamidita, y técnicas en fase sólida, tales como las descritas en el documento EP 266.032, o mediante intermedios de desoxinucleósido H-fosfonato, según se describe en Froehler y col., 1986, y la patente de EE. UU. 5.705.629. En los procedimientos de la presente invención, pueden utilizarse uno o más oligonucleótidos. Se han divulgado diversos mecanismos diferentes de síntesis de oligonucleótidos, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. 4.659.774, 4.816.571, 5.141.813, 5.264.566, 4.959.463, 5.428.148, 5.554.744, 5.574.146, 5.602.244.

Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido de modo enzimático incluye un ácido nucleico producido por enzimas en reacciones de amplificación, tales como PCR™ (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU.

4.683.202 y la patente de EE. UU. 4.682.195) o la síntesis de un oligonucleótido descrito en la patente de EE. UU. 5.645.897, que se incorpora en el presente documento por referencia. Un ejemplo no limitante de un ácido nucleico producido de modo biológico incluye un ácido nucleico producido (concretamente, replicado) en una célula viva, tal como un vector de ADN recombinante replicado en bacterias (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, que se incorpora en el presente documento por referencia).

7. Purificación de ácidos nucleicos

Un ácido nucleico puede purificarse en geles de poliacrilamida, gradientes de centrifugación de cloruro de cesio o mediante cualquier otro medio conocido por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001).

En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que es un ácido nucleico aislado. Tal como se emplea en el presente documento, la expresión "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN o ADN) que se ha aislado, o de otra forma se ha retirado de la mayor parte de los ácidos nucleicos genómicos y transcritos totales de una o más células. En ciertas realizaciones, un "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico que se ha aislado, o de otra forma se ha retirado de la mayor parte de los componentes celulares o componentes de una reacción in vitro, tales como, por ejemplo, macromoléculas, tales como lípidos o proteínas, moléculas biológicas pequeñas y similares.

C. Preparaciones de lípidos

Algunas realizaciones de la presente invención se refieren a composiciones que contienen polipéptidos o ácidos nucleicos que incluyen un componente lipídico. Un componente lipídico puede incluir un único tipo de lípido o puede incluir más de un tipo de lípido.

Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser naturales o pueden ser lípidos sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas de grasa que aparecen en el citoplasma en la naturaleza, así como la clase de compuestos que son muy conocidos por los expertos en la técnica que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Algunas de las realizaciones de las composiciones de la presente invención incluyen liposomas. Un "liposoma" es un término genérico que incluye una diversidad de vehículos de lípidos unilaminares, multilaminares y multivesiculares formados por la generación de agregados o bicapas lipídicas cerradas. Los liposomas pueden caracterizarse como que presentan estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio interno acuoso. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de una disolución acuosa. Los componentes lipídicos sufren una autorredisposición antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). Sin embargo, la presente invención también incluye composiciones que tengan diferentes estructuras en disolución que la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas de lípidos. También se contemplan los complejos de lipofectaminaácido nucleico.

1. Liposomas neutros

La "composición de lípidos o liposomas neutros" o la "composición de lípidos o liposomas no cargados", tal como se emplean en el presente documento, se definen como composiciones de lípidos o liposomas que contienen uno o más lípidos que producen una carga neta fundamentalmente neutra (sustancialmente no cargados). "Fundamentalmente neutra" o "fundamentalmente no cargados" significa que pocos lípidos, o ninguno, dentro de una población concreta (por ejemplo, una población de liposomas) incluyen una carga que no es cancelada por una carga opuesta de otro componente (por ejemplo, menos del 10% de los componentes incluyen una carga no cancelada, más preferentemente menos del 5% y lo más preferentemente menos del 1%). En ciertas realizaciones de la presente invención, puede prepararse una composición en la que el componente lipídico de la composición es fundamentalmente neutro pero no está en forma de liposomas.

En ciertas realizaciones, las composiciones de lípidos o liposomas neutros pueden incluir en su mayor parte lípidos y/ fosfolípidos que son, en sí mismos, neutros. En ciertas realizaciones, pueden incorporarse lípidos anfipáticos en las composiciones de lípidos o liposomas neutros, o emplearse para generarlas. Por ejemplo, puede generarse un liposoma neutro combinando lípidos cargados positiva y negativamente de modo que sus cargas se cancelen sustancialmente entre sí. Para dicho liposoma, están presentes pocos lípidos cargados, o ninguno, cuya carga no sea cancelada por un lípido de carga opuesta (por ejemplo, menos del 10% de los lípidos cargados tienen una carga que no es cancelada, más preferentemente menos del 5% y lo más preferentemente menos del 1%). También se reconoce que la anterior estrategia puede utilizarse para generar una composición de lípidos neutros, en la que el componente lipídico de la composición no está en forma de liposomas.

2. Fosfolípidos

Las composiciones que contienen lípidos de la presente invención pueden comprender fosfolípidos. En ciertas realizaciones, puede utilizarse un único tipo de fosfolípido para la creación de composiciones de lípidos, tales como liposomas (por ejemplo, DOPC empleado para generar liposomas neutros). En otras realizaciones, puede emplearse más de un tipo de fosfolípido.

Los fosfolípidos incluyen glicerofosfolípidos y ciertos esfingolípidos. Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a dioleoilfosfatidilcolina ("DOPC"), fosfatidilcolina de huevo ("EPC"), dilauriloilfosfatidilcolina ("DLPC"), dimiristoilfosfatidilcolina ("DMPC"), dipalmitoilfosfatidilcolina ("DPPC"), diestearoilfosfatidilcolina ("DSPC"), 1miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina ("MPPC"), 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina ("PMPC"), 1-palmitoil-2estearoilfosfatidilcolina ("PSPC"), 1-estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina ("SPPC"), dilauriloilfosfatidilglicerol ("DLPG"), dimiristoilfosfatidilglicerol ("DMPG"), dipalmitoilfosfatidilglicerol ("DPPG"), diestearoilfosfatidilglicerol ("DSPG"), diestearoilesfingomielina ("DSSP"), diestearoilfosfatidiletanolamina ("DSPE"), dioleoilfosfatidilglicerol ("DOPG"), ácido dimiristoilfosfatídico ("DMPA"), ácido dipalmitoilfosfatídico ("DPPA"), dimiristoilfosfatidiletanolamina ("DMPE"), dipalmitoilfosfatidiletanolamina ("DPPE"), dimiristoilfosfatidilserina ("DMPS"), dipalmitoilfosfatidilserina ("DPPS"), fosfatidilserina cerebral ("BPS"), esfingomielina cerebral ("BSP"), dipalmitoilesfingomielina ("DPSP"), dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC"), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina

("DAPC"), 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DBPC"), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina ("DEPC"), dioleoilfosfatidiletanolamina ("DOPE"), palmitoiloeoilfosfatidilcolina ("POPC"), palmitoiloeoilfosfatidiletanolamina ("POPE"), lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, y dilinoleoilfosfatidilcolina.

Los fosfolípidos incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolinas, fosfatidilgliceroles y fosfatidiletanolaminas; debido a que las fosfatidiletanolaminas y las fosfatidilcolinas no están cargadas bajo condiciones fisiológicas (es decir, a aproximadamente pH 7), estos compuestos pueden ser particularmente útiles para generar liposomas neutros. En ciertas realizaciones, se emplea el fosfolípido DOPC para producir composiciones de lípidos o liposomas no cargados. En ciertas realizaciones, también puede emplearse un lípido que no sea un fosfolípido (por ejemplo, un colesterol).

Los fosfolípidos pueden proceder de fuentes naturales o sintéticas. Sin embargo, los fosfolípidos procedentes de fuentes naturales, tales como fosfatidilcolina de huevo o de soja, ácido fosfatídico cerebral, fosfatidilinositol cerebral o vegetal, cardiolipina cardíaca y fosfatidiletanolamina bacteriana o vegetal, no se emplean en ciertas realizaciones como fosfatida principal (es decir, que constituye 50% o más de la composición de fosfatidas totales), porque esto puede provocar inestabilidad y pérdidas por filtración de los liposomas resultantes.

3. Producción de liposomas

Las composiciones de lípidos y liposomas de la presente invención pueden fabricarse por medio de diferentes procedimientos. Por ejemplo, un nucleótido (por ejemplo, ARNmc) puede encapsularse en un liposoma neutro empleando un procedimiento que emplea etanol y calcio (Bailey y Sullivan, 2000). El tamaño de los liposomas varía dependiendo del procedimiento de síntesis. Un liposoma suspendido en una disolución acuosa en general tiene la forma de una vesícula esférica, y puede tener una o más capas concéntricas de moléculas de bicapa lipídica. Cada capa consiste en una disposición en paralelo de moléculas representadas por la fórmula XY, en la que X es un resto hidrofílico e Y es un resto hidrofóbico. En una suspensión acuosa, las capas concéntricas se disponen de tal modo que los restos hidrofílicos tienden a permanecer en contacto con la fase acuosa, y las regiones hidrofóbicas tienden a autoasociarse. Por ejemplo, cuando están presentes fases acuosas dentro y fuera del liposoma, las moléculas lipídicas pueden formar una bicapa, conocida como lamela, con la disposición XY-YX. Se forman agregados de lípidos cuando las partes hidrofílicas e hidrofóbicas de más de una molécula de lípido se asocian entre sí. El tamaño y la forma de estos agregados dependerá de muchas variables diferentes, tales como la naturaleza del disolvente y la presencia de otros compuestos en la disolución.

Los lípidos adecuados para su uso según la presente invención pueden obtenerse de fuentes comerciales. Por ejemplo, la dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC") puede obtenerse en Sigma Chemical Co., el fosfato de dicetilo ("DCP") puede obtenerse en K & K Laboratories (Plainview, N.Y.); el colesterol ("Chol") puede obtenerse de Calbiochem-Behring; el dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Las disoluciones madre de los lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden conservarse a aproximadamente -20 °C. El cloroformo puede emplearse como único disolvente, puesto que se evapora con más facilidad que el metanol.

Los liposomas dentro del alcance de la presente invención pueden prepararse según técnicas de laboratorio conocidas. En ciertas realizaciones, los liposomas se preparan mezclando lípidos liposómicos en un disolvente en un recipiente (por ejemplo, un matraz de vidrio con forma de pera). El recipiente generalmente tendrá un volumen diez veces mayor que el volumen de la suspensión prevista de liposomas. Empleando un evaporador rotatorio, el disolvente puede retirarse a aproximadamente 40 °C a presión negativa. El disolvente puede retirarse dentro de aproximadamente 5 minutos a 2 horas, dependiendo del volumen deseado de los liposomas. La composición puede secarse aún más en un secador al vacío. Los lípidos secados pueden hidratarse a aproximadamente 25-50 mM de fosfolípidos en agua apirógena estéril mediante agitación hasta que toda la película lipídica se haya resuspendido. Los liposomas acuosos entonces pueden separarse en partes alícuotas, colocarse cada una en un vial, liofilizarse y sellarse al vacío. Los liposomas también pueden prepararse según otros procedimientos de laboratorio conocidos.

D. Composiciones

1. Combinaciones y cantidades de ingredientes

Se contempla que las composiciones de la presente invención puedan incluir una serie de combinaciones de los polipéptidos y ácidos nucleicos divulgados a través de esta memoria descriptiva. Además, las composiciones pueden incluir cualquier número de combinaciones de ingredientes adicionales descritos a través de esta memoria descriptiva. Las concentraciones de los polipéptidos, ácidos nucleicos e ingredientes adicionales pueden variar. En realizaciones no limitantes, por ejemplo, las composiciones pueden incluir, en su forma final, por ejemplo al menos aproximadamente 0,0001%, 0,0002%, 0,0003%, 0,0004%, 0,0005%, 0,0006%, 0,0007%, 0,0008%, 0,0009%, 0,0010%, 0,0011%, 0,0012%, 0,0013%, 0,0014%, 0,0015%, 0,0016%, 0,0017%, 0,0018%, 0,0019%, 0,0020%,

0,0021%, 0,0022%, 0,0023%, 0,0024%, 0,0025%, 0,0026%, 0,0027%, 0,0028%, 0,0029%, 0,0030%, 0,0031%, 0,0032%, 0,0033%, 0,0034%, 0,0035%, 0,0036%, 0,0037%, 0,0038%, 0,0039%, 0,0040%, 0,0041%, 0,0042%, 0,0043%, 0,0044%, 0,0045%, 0,0046%, 0,0047%, 0,0048%, 0,0049%, 0,0050%, 0,0051%, 0,0052%, 0,0053%, 0,0054%, 0,0055%, 0,0056%, 0,0057%, 0,0058%, 0,0059%, 0,0060%, 0,0061%, 0,0062%, 0,0063%, 0,0064%, 0,0065%, 0,0066%, 0,0067%, 0,0068%, 0,0069%, 0,0070%, 0,0071%, 0,0072%, 0,0073%, 0,0074%, 0,0075%, 0,0076%, 0,0077%, 0,0078%, 0,0079%, 0,0080%, 0,0081%, 0,0082%, 0,0083%, 0,0084%, 0,0085%, 0,0086%, 0,0087%, 0,0088%, 0,0089%, 0,0090%, 0,0091%, 0,0092%, 0,0093%, 0,0094%, 0,0095%, 0,0096%, 0,0097%, 0,0098%, 0,0099%, 0,0100%, 0,0200%, 0,0250%, 0,0275%, 0,0300%, 0,0325%, 0,0350%, 0,0375%, 0,0400%, 0,0425%, 0,0450%, 0,0475%, 0,0500%, 0,0525%, 0,0550%, 0,0575%, 0,0600%, 0,0625%, 0,0650%, 0,0675%, 0,0700%, 0,0725%, 0,0750%, 0,0775%, 0,0800%, 0,0825%, 0,0850%, 0,0875%, 0,0900%, 0,0925%, 0,0950%, 0,0975%, 0,1000%, 0,1250%, 0,1500%, 0,1750%, 0,2000%, 0,2250%, 0,2500%, 0,2750%, 0,3000%, 0,3250%, 0,3500%, 0,3750%, 0,4000%, 0,4250%, 0,4500%, 0,4750%, 0,5000%, 0,5250%, 0,550%, 0,5750%, 0,6000%, 0,6250%, 0,6500%, 0,6750%, 0,7000%, 0,7250%, 0,7500%, 0,7750%, 0,8000%, 0,8250%, 0,8500%, 0,8750%, 0,9000%, 0,9250%, 0,9500%, 0,9750%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%, 4,6%, 4,7%, 4,8%, 4,9%, 5,0%, 5,1%, 5,2%, 5,3%, 5,4%, 5,5%, 5,6%, 5,7%, 5,8%, 5,9%, 6,0%, 6,1%, 6,2%, 6,3%, 6,4%, 6,5%, 6,6%, 6,7%, 6,8%, 6,9%, 7,0%, 7,1%, 7,2%, 7,3%, 7,4%, 7,5%, 7,6%, 7,7%, 7,8%, 7,9%, 8,0%, 8,1%, 8,2%, 8,3%, 8,4%, 8,5%, 8,6%, 8,7%, 8,8%, 8,9%, 9,0%, 9,1%, 9,2%, 9,3%, 9,4%, 9,5%, 9,6%, 9,7%, 9,8%, 9,9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% o más, o cualquier intervalo o número entero derivables de estos, de al menos uno de los polipéptidos, ácidos nucleicos u otros ingredientes. En aspectos no limitantes, el porcentaje de dichos ingredientes puede calcularse en peso o volumen del peso total de las composiciones. Las concentraciones pueden variar dependiendo del efecto deseado de la composición o del producto en que se incorporan las composiciones.

2. Vehículos de las composiciones

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en todo tipo de vehículos. Los ejemplos no limitantes de vehículos adecuados incluyen emulsiones (por ejemplo, emulsiones de agua en aceite, de agua en aceite en agua, de aceite en agua, de aceite en agua en aceite, de aceite en agua en silicona), cremas, lociones, disoluciones (acuosas e hidroalcohólicas), bases anhidras (tales como barras de labios, polvos), geles y ungüentos u otros procedimientos o cualquier combinación de los anteriores, tal como sabrán los expertos en la técnica. Las variaciones y otros vehículos apropiados serán evidentes para los expertos en la técnica y serán apropiados para su uso en la presente invención. En ciertos aspectos, las concentraciones y las combinaciones de los ingredientes pueden seleccionarse de tal forma que las combinaciones sean químicamente compatibles y no formen complejos que precipiten del producto terminado. También se contempla que los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención y otros ingredientes identificados a lo largo de esta memoria descriptiva puedan encapsularse para el transporte a un área diana, tal como la piel. Los ejemplos no limitantes de técnicas de encapsulación incluyen el uso de liposomas, vesículas y/o nanopartículas (por ejemplo, partículas coloidales biodegradables y no biodegradables que comprenden materiales poliméricos en los que las que el ingrediente se atrapa, se encapsula y/o se absorbe, cuyos ejemplos incluyen nanoesferas, nanocápsulas y liposomas) que pueden emplearse como vehículo de transporte para transportar dichos ingredientes a la piel (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6.387.398; la patente de EE. UU. n.º 6.203.802; la patente de EE. UU. n.º 5.411.744).

También se contemplan composiciones farmacéuticamente aceptables o farmacológicamente aceptables. Las expresiones "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" incluyen composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administran a un ser humano. Generalmente, estas composiciones se preparan como composiciones tópicas, disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para la disolución o la suspensión en líquidos antes del uso. Las vías de administración pueden variar según la localización y la naturaleza del trastorno que se va a tratar, e incluyen, por ejemplo, la formulación y administración tópica, por inhalación, intradérmica, transdérmica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, percutánea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, por perfusión, lavado, inyección directa y oral.

3. Productos

Las composiciones de la presente invención pueden incorporarse en productos. Los ejemplos no limitantes de productos incluyen productos para el cuidado de la piel, productos cosméticos, productos con una base alimentaria, productos farmacéuticos, etc. Solo como ejemplo, los productos para el cuidado de la piel no limitantes incluyen productos protectores solares, productos para el bronceado de la piel sin sol, productos para el cabello, productos para las uñas, cremas hidratantes, lociones hidratantes, cremas y lociones beneficiosas para la piel, suavizantes, lociones de día, geles, ungüentos, barras de labios u otros productos o aplicaciones conocidos

para el cuidado de la piel. Además, los productos cosméticos pueden formularse como productos sin aclarado o con aclarado.

4. Ingredientes adicionales

Las composiciones de la presente invención pueden incluir opcionalmente ingredientes adicionales. Los ejemplos no limitantes de ingredientes adicionales incluyen ingredientes farmacéuticos e ingredientes cosméticos (activos y no activos).

a. Ingredientes farmacéuticos

También se contemplan ingredientes farmacéuticos como útiles con las composiciones de la presente invención. Los ejemplos no limitantes de ingredientes farmacéuticos incluyen analgésicos, anestésicos, antihistaminas, agentes antiinflamatorios que incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroideos, antibióticos, antifúngicos, antivíricos, antimicrobianos, principios activos anticáncer, escabicidas, pediculicidas, antineoplásicos, antitranspirantes, antipruríticos, agentes antipsoriáticos, agentes antiseborreicos, proteínas y péptidos biológicamente activos, agentes para el tratamiento de quemaduras, agentes cauterizantes, agentes de despigmentación, depilatorios, agentes para el tratamiento del sarpullido producido por pañales, enzimas, estimulantes del crecimiento capilar, retardantes del crecimiento capilar, que incluyen DFMO y sus sales y análogos, hemostáticos, queratolíticos, agentes para el tratamiento aftas dolorosas, agentes para el tratamiento del herpes labial, agentes de tratamiento dental y periodontal, agentes fotosensibilizantes, agentes de barrera/protectores de la piel, esteroides, que incluyen hormonas y corticosteroides, agentes para el tratamiento de quemaduras solares, pantallas solares, principios activos transdérmicos, principios activos nasales, principios activos vaginales, agentes para el tratamiento de verrugas, agentes para el tratamiento de heridas, agentes para la curación de heridas, etc.

Otros agentes farmacéuticos contemplados para su inclusión en las composiciones de la presente invención incluyen agentes que pueden aplicarse para el tratamiento de la ictiosis vulgar y la dermatitis atópica. Los ejemplos incluyen alfa-hidroxiácidos, tales como ácido láctico y glicólico, retinoides, otros derivados de la vitamina A, inhibidores de calcineurina, ciclosporina, gamma-1b interferón o un corticosteroide tópico u oral.

b. Ingredientes cosméticos

The CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook (2004) describe una amplia diversidad de ingredientes cosméticos no limitantes que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención. Los ejemplos de estas clases de ingredientes incluyen: fragancias (artificiales y naturales), tintes e ingredientes coloreados (por ejemplo, Blue 1, Blue 1 Lake, Red 40, dióxido de titanio, azul D&C n.º 4, verde D&C n.º 5, naranja D&C n.º 4, rojo D&C n.º 17, rojo D&C n.º 33, violeta D&C n.º 2, amarillo D&C n.º 10, y amarillo D&C n.º 11), adsorbentes, emulgentes, estabilizantes, lubricantes, disolventes, hidratantes (que incluyen, por ejemplo, emolientes, humectantes, formadores de película, agentes oclusivos y agentes que afectan a los mecanismo de hidratación naturales de la piel), agentes exfoliantes, repelentes del agua, absorbentes de UV (absorbentes físicos y químicos, tales como ácido para-aminobenzoico ("PABA") y los correspondientes derivados de PABA, dióxido de titanio, óxido de cinc, etc.), aceites esenciales, vitaminas (por ejemplo, A, B, C, D, E, y K), metales traza (por ejemplo, cinc, calcio y selenio), antiirritantes (por ejemplo, esteroides y antiinflamatorios no esteroideos), extractos botánicos (por ejemplo, aloe vera, camomila, extracto de pepino, ginkgo biloba, ginseng, y romero), agentes antimicrobianos, antioxidantes (por ejemplo, BHT y tocoferol), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA disodio y EDTA tetrasodio), conservantes (por ejemplo, metilparabeno y propilparabeno), ajustadores del pH (por ejemplo, hidróxido de sodio y ácido cítrico), absorbentes (por ejemplo, almidón octenilsuccinato de aluminio, caolín, almidón de maíz, almidón de avena, ciclodextrina, talco y zeolita), agentes para aclarar y blanquear la piel (por ejemplo, hidroquinona y lactato de niacinamida), humectantes (por ejemplo, glicerina, propilenglicol, butilenglicol, pentilenglicol, sorbitol, urea, y manitol), exfoliantes (por ejemplo, alfa-hidroxiácidos y beta-hidroxiácidos, tales como ácido láctico, ácido glicólico y ácido salicílico; y sus sales), agentes impermeabilizantes (por ejemplo, hidroxiestearato de magnesio/aluminio), agentes acondicionadores de la piel (por ejemplo, extractos de aloe, alantoína, bisabolol, ceramidas, dimeticona, ácido hialurónico y glicirrizato de dipotasio), agentes espesantes (por ejemplo, sustancias que pueden aumentar la viscosidad de una composición, tales como polímeros de ácidos carboxílicos, polímeros de poliacrilato reticulados, polímeros de poliacrilamida, polisacáridos y gomas) y compuestos que contienen silicona (por ejemplo, aceites de silicona y poliorganosiloxanos).

E. Enfermedades que se van a tratar o prevenir

Las enfermedades o los trastornos contemplados para el tratamiento o la prevención empleando los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención incluyen cualquier enfermedad o trastorno del cual se sabe o se sospecha que un aumento en la filagrina intracelular sería beneficioso. Los ejemplos no limitantes de dichas enfermedades incluyen enfermedades o trastornos de la piel. La enfermedad o el trastorno puede ser piel

seca, piel que se exfolia, piel que se descama, piel inflamada, piel agrietada, piel cuarteada, acné, callos, helomas, aftas dolorosas, carbuncos, celulitis, herpes labial, caspa, dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, dermatitis seborreica, costra láctea, dermatitis numular, dermatitis por estasis, dermatitis perioral, dermatitis herpetiforme, epidermolisis bullosa, eritrasma, erisipelas, foliculitis, infección por herpes, impétigo, ictiosis, hiperhidrosis, prurito inguinal, queloides, queratoacantoma, queratosis actínica, queratosis pilar, queratosis seborreica, hiperqueratosis, liquen plano, pénfigo, fotosensibilidad, pitiriasis rosa, psoriasis, rosácea, sarna, escleroderma, quite sebáceo, herpes zoster, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosa y verrugas.

F. Kits

También se contemplan kits para su uso en ciertos aspectos de la presente invención. Por ejemplo, un polipéptido

o un ácido nucleico de la presente invención puede incluirse en un kit. Un kit puede incluir un recipiente sellado. Los ejemplos no limitantes de recipientes incluyen una botella, un tubo metálico, un tubo laminado, un tubo de plástico, un dispensador, un recipiente presurizado, un recipiente de barrera, un paquete, un compartimento, un recipiente de barra de labios, un recipiente compacto, bandejas cosméticas que pueden contener composiciones cosméticas u otros tipos de recipientes, tales como recipientes de plástico moldeado por inyección o soplado que contienen las dispersiones o las composiciones o las botellas, dispensadores o paquetes deseados. Otros ejemplos de recipientes incluyen viales o botellas de vidrio o plástico. El kit y/o el recipiente puede incluir indicaciones sobre su superficie. Las indicaciones, por ejemplo, pueden ser una palabra, una frase, una abreviatura, un dibujo o un símbolo.

Los recipientes pueden dispensar una cantidad predeterminada de una composición de la presente invención. En otras realizaciones, el recipiente puede ser apretado (por ejemplo, un tubo de metal, laminado o de plástico) para que dispense una cantidad deseada de la composición. La composición puede dispensarse en forma de un pulverizado, un aerosol, un líquido, un fluido o un semisólido. Los recipientes pueden contar con mecanismos de pulverización, bombeado o apretado. Un kit también puede incluir instrucciones para emplear el kit y/o las composiciones. Las instrucciones pueden incluir una explicación acerca de cómo aplicar, administrar, usar y mantener las composiciones.

G. Tratamientos en combinación

Para aumentar la eficacia del polipéptido de la presente invención, o la construcción de expresión que lo codifica, puede resultar deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno en los que un péptido de filagrina puede ser beneficioso. Por ejemplo, los polipéptidos quiméricos de la presente invención pueden administrase junto con otro tratamiento de una enfermedad de la piel, tal como la dermatitis atópica o la ictiosis vulgar. Los ejemplos no limitantes de estas enfermedades o trastornos se han expuesto anteriormente.

La terapia puede preceder o seguir al tratamiento con el otro agente en intervalos que varían de minutos a semanas. Las terapias pueden administrarse al mismo tiempo. En realizaciones en las que la segunda terapia se aplica por separado, en general se asegurará de que no pase un tiempo significativo entre el momento de cada administración, de modo que las dos terapias aún sean capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En estos casos, se contempla que puedan administrarse ambas terapias dentro de aproximadamente 12-24 h entre cada una y, más preferentemente, dentro de aproximadamente 6-12 h entre cada una. En algunas situaciones, puede resultar deseable extender significativamente el periodo de tiempo para el tratamiento, dejando que transcurra un periodo de tiempo de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

Pueden emplearse diversas combinaciones, en las que el polipéptido o polinucleótido de la presente invención sería "A" y el segundo agente sería "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de las composiciones y agentes terapéuticos de la presente invención a un sujeto seguirá los protocolos generales para la administración de agentes terapéuticos, tomando en cuenta la toxicidad, si existe. Se prevé que los ciclos de tratamiento se repitan según sea necesario. También se contempla que puedan aplicarse diversas terapias convencionales en combinación con los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención. Los ejemplos no limitantes incluyen los agentes farmacéuticos expuestos anteriormente. Otros ejemplos incluyen procedimientos, tales como la dermoabrasión, la terapia con láser, el rejuvenecimiento con láser, el tratamiento con rayos ultravioleta y el injerto de piel.

H. Ejemplos

Ejemplo 1

Tratamiento de la piel de ratón con filagrina recombinante

Se aisló la proteína de FLG y se crearon varios péptidos de FLG, que consisten en regiones de repetición parciales

o completas. Estas proteínas se modificaron para que contuvieran una señal de importación a células (formada por repeticiones de arginina y metionina, el marcador "RMR"), lo cual se ha empleado con éxito para dirigir la internalización de proteínas por células. Las proteínas que se sintetizaron incluyen (1) FLG humana con el marcador RMR; (2) FLG de ratón con el marcador RMR; y (3) FLG de ratón sin el marcador RMR.

Se realizaron múltiples experimentos de inmunohistoquímica ("immunohistochemistry", IHC) para determinar si la FLG con el marcador RMR puede ser captada por células HEK 293, una línea celular derivada de células de riñón embrionario. En estos experimentos, la proteína de FLG de ratón, con y sin la señal de importación de RMR, se aplicó a células HEK 293 a diversas concentraciones a lo largo de diversos momentos. Las proteínas de FLG después se tiñeron con un tinte de fluorescencia FITC y se fotografiaron bajo un microscopio confocal Olympus IX81. Los experimentos de tinción preliminares demostraron que FLG con el marcador RMR se internaliza en células HEK 293 en mayor grado que la FLG sin el marcador. En particular, MuFLG con RMR demostró entrar en la célula a una tasa mayor que MuFLG sin RMR después de 4,5 horas, lo cual fue observado y documentado mediante la formación de imágenes empleando una cámara Olympus IX81 a 40X. Aunque la FLG sin RMR sí es captada por las células hasta cierto grado, probablemente debido a la importación pasiva, se descubrió una mayor fluorescencia con el marcador RMR que sin él. La tinción inmunohistoquímica demostró que aunque la FLG más RMR se internaliza, esta permanece en el citoplasma. Las células HEK 293 teñidas con tinte FITC (verde para la FLG) y DAPI (azul para el núcleo) demostraron que FLG+RMR entra en la célula pero está ausente del núcleo después de una hora, documentando así la robusta internalización de FLG-RMR y su localización en el citoplasma. Merece la pena advertir que la proteína de FLG activa (RMR-) se expresa en el citoplasma, pero está ausente del núcleo in vivo.

Se están realizando más estudios para estudiar las proteínas en líneas celulares de queratinocitos de ratón y humanos. Las líneas celulares que se están preparando incluyen epidermis humana reconstruida ("reconstructed human epidermis", RHE), un polímero de queratinocitos derivado de ser humano, y queratinocitos CL-177 de ratón. Mediante técnicas, tales como la inmunotransferencia de proteínas y la inmunohistoquímica, se determina la cantidad y la localización de la FLG. Para certificar que la importación y la expresión de FLG pueden duplicarse in vivo, es necesario el ensayo de estas proteínas en ratones.

Hasta la fecha, la proteína de FLG-RMR, mezclada con una disolución vehículo (en este caso, crema ABSORBASE), se ensayó en un modelo de ratón de cola escamosa ("flaky tail", ft), un modelo de ratón que carece de la profilagrina normal de alto peso molecular y en el que las proteínas de filagrina cortadas producen una piel seca y escamosa. Los experimentos iniciales ensayaron la eficacia del transporte y la importación de los péptidos de FLG-RMR producidos en ratones C57B1 normales y con cola escamosa. Se afeitó el pelo del lateral de cada ratón y se aplicó la proteína de FLGRMR con una crema vehículo. Veinticuatro horas después de la aplicación de la mezcla de proteína-crema vehículo, se realizó una biopsia de la piel tratada y se analizó para determinar los cambios en el fenotipo de la capa dérmica y la presencia de la proteína de FLG-RMR. Secciones congeladas de la piel tratada indicaron la existencia de diferentes evidentes entre la piel tratada y no tratada con la proteína de FLG-RMR comparadas con el control.

Experimentos futuros incluirán el ensayo de otras disoluciones vehículo y diversas concentraciones de FLG-RMR en múltiples momentos para determinar las condiciones óptimas y se realizará un ensayo experimental. En este ensayo, los ratones con cola escamosa se dividirán en cuatro cohortes: (1) vehículo con proteína de FLG y marcador RMR; (2) vehículo con proteína de FLG sin marcador RMR; (3) solo vehículo; (4) vehículo con proteína desnaturalizada y marcador RMR. Habrá cinco ratones por cohorte y los respectivos tratamientos se aplicarán a la cola, a un área afeita de la piel y a un área no afeitada de la piel después de que los ratones hayan alcanzado P60-P90. En diversos momentos después de haber aplicado el tratamiento, los ratones recibirán eutanasia y se tomarán biopsias de troquelados dérmicos de cada ratón. Se realizarán experimentos de inmunotransferencia para determinar la cantidad de proteína captada. Demostrando que la proteína de FLG puede ser transportada mediante un vehículo portador en un modelo de ratón, se pueden contemplar ensayos clínicos en seres humanos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> STOUT, J. TIMOTHY

<120> POLIPÉPTIDOS DE FILAGRINA RECOMBINANTES PARA LA IMPORTACIÓN A CÉLULAS

<130> CLFR.P0333WO

<140> DESCONOCIDO

<141> 5 <150> 61/263.604

<151>

<160> 38 10 <170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 344

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 4061

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 416

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 4061

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 4061

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 269

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210> 7

<211> 554

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<211> 336

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

<210> 9

<211> 250

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

<210> 10

<211> 255

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

<210> 11

<211> 3541

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

<210> 12

<211> 336

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

<210> 13

<211> 357

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

<210> 14

<211> 366

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 14

<210> 15

<211> 3088

<212> PRT

<213> Pan troglodytes

<400> 15

<210> 16

<211> 2764

<212> PRT

<213> Pan troglodytes

<400> 16

<210> 17

<211> 1656

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 17

<210> 18

<211> 1183

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 18

<210> 19

<211> 2265

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 19

<210> 20

<211> 10 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 20

15 <210> 21

<211> 354

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 21

<210> 22

<211> 279

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 22

10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 23

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 24

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 25

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 26

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 27

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 28

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 29

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 30 <210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 31

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 33

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 34

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 36

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 37

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 38

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina; y (b) una secuencia señal de importación a células que comprende un motivo de dos a quince aminoácidos, en el que el motivo incluye al menos un resto arginina y al menos un resto metionina.

2. 2.

   El polipéptido de la reivindicación 1, en el que:

   (a)

   la secuencia de aminoácidos de filagrina comprende SEQ ID NO:1,

   (b)

   el motivo comprende la secuencia de aminoácidos de RM o MR,

   (c)

   el motivo comprende SEQ ID NO:23, o

   (d)

   el polipéptido comprende SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22, o preferentemente consiste en SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22.

3. 3.

   El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido se define además como una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos de filagrina y la secuencia de aminoácidos de importación a células, o en el que la secuencia de aminoácidos de filagrina está unida al N-o C-terminal de la secuencia de señal de importación a células.

4. 4.

   Una composición para su uso en el cuidado de la piel, que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   La composición de la reivindicación 4, comprendiendo la composición un componente lipídico, en particular un fosfolípido, o en la que la composición comprende del 0,001% al 5,0% en peso del polipéptido.

6. 6.

   La composición de la reivindicación 4, en la que la composición es una disolución, una crema, una loción, un gel, un ungüento o una emulsión, en particular una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite.

7. 7.

   Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. 8.

   Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. 9.

   La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad de la piel o un trastorno de la piel de los cuales se sabe o se sospecha que un aumento en la filagrina intracelular sería beneficioso.

10. 10.

    La composición para el uso de la reivindicación 9, en la que el sujeto es un ser humano o en el que la enfermedad de la piel es la ictiosis vulgar o la dermatitis atópica.

11. 11.

    La composición para el uso de la reivindicación 9, en la que la composición es para la aplicación tópica a una superficie de la piel de un sujeto, o en el que la composición comprende además al menos un agente adicional, en particular un hidratante, un agente exfoliante, un agente antiinflamatorio o un agente antimicrobiano.

12. 12.

    Un kit que comprende un recipiente sellado que comprende un polipéptido recombinante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición farmacéutica de la reivindicación 8.

13. 13.

    El kit de la reivindicación 12, en el que el recipiente sellado es un vial, una botella, un dispensador o un paquete, o en el que el kit comprende además un aplicador.

14. 14.

    El uso del polipéptido expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad de la piel o un trastorno de la piel de los cuales se sabe o se sospecha que un aumento en la filagrina intracelular sería beneficioso.