ES2644416T3 - Conservación mediante vaporización - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Conservacion mediante vaporizacion CAMPO DE LA INVENCION

Esta es una invencion en el campo de equipos y metodos para estabilizacion (conservacion) de moleculas, virus (vacunas), celulas y pequenos espedmenes multicelulares biologicamente activos a temperatures ambiente. La invencion descrita aqu puede ser utilizada en una escala menor, as^ como a escala industrial. Mas particularmente, la invencion se relaciona con metodos y equipos para facilitar el almacenamiento a largo plazo y transporte de estos materiales biologicos labiles a temperaturas ambiente en un estado seco, lfquido amorfo muy viscoso o vftreo.

Esta invencion tambien se relaciona con un proceso tecnologico para integrar las siguientes etapas: conservacion de los materiales biologicos mediante vaporizacion en viales (formato de dosis unitarias), o en un formato a granel utilizando bandejas, bolsas u otros contenedores con o sin subsecuente molienda y/o micronizacion del material conservado. La molienda y/o la micronizacion permite formar polvo seco, el cual puede ser utilizado en productos mixtos (por ejemplo, cereales) para diferentes aplicaciones practicas de vacunas y otros productos biofarmaceuticos para uso tanto humano como animal, alimentacion (incluyendo alimentacion para bebes) y piensos animales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La conservacion y almacenamiento de materiales biologicamente activos, virus, celulas y pequenos espedmenes multicelulares es importante para muchas aplicaciones, incluyendo investigacion, industrias de alimentos, microbiologica, farmaceutica y de cuidado de la salud, asf como para la agricultura.

Uno de los criterios mas importantes en la evaluacion de la eficacia de practicamente todas las tecnicas de conservacion es cuan estable es el producto resultante. Es bien sabido que, en estado acuoso, las vacunas virales y bacterianas, las protemas terapeuticas y otros materiales biologicos pierden instantaneamente la actividad durante el almacenamiento a temperaturas ambiente (AT). Por ejemplo, de acuerdo con Dr. Truong (tal como se describe en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20030219475), los virus envueltos -tales como el virus vivo de la influenza manufacturado a partir de fluido alantoide de huevo- pierde una escala logantmica de potencia, definida como Dosis Infecciosa en Cultivo de Tejidos (TCID50), en menos de dos a tres semanas cuando se almacena bajo temperatura refrigerada, esto es, aproximadamente 4 grados Celsius. A condiciones de temperatura ambiente (aproximadamente 25 grados Celsius) y a temperaturas mas calidas tales como a 37 grados Celsius, el virus pierde tal potencia en materia de dfas a horas, respectivamente. Una capacidad para almacenar materiales biologicamente activos deshidratados a temperatura ambiente durante penodos extendidos de tiempo conlleva enormes beneficios.

Los reactivos, materiales y materiales biologicos deshidratados son caracterizados por un peso significativamente reducido. Ademas, requieren menos espacio para almacenamiento y, al mismo tiempo, ofrecen estabilidad incrementada.

Actualmente, las vacunas contra el sarampion son conservadas por liofilizacion. Debido a que las vacunas liofilizadas son estables a temperaturas cercanas a 0°C, las vacunas contra el sarampion necesitan ser refrigeradas en todo momento. La Organizacion Mundial de la Salud (OMS) se han estimado que solo en mantenimiento de la "cadena de fno" existente en pafses economicamente debiles (ECC) cuesta mas de $ 200 millones de dolares anualmente. Ademas, muchas areas rurales no tienen refrigeracion ninguna, lo que hace practicamente imposible o muy costoso administrar vacunas contra sarampion existentes en tales areas.

La disponibilidad de vacunas estables a temperatura ambiente y mas potentes contra MMR, tuberculosis, gripe y otras enfermedades tendra un enorme impacto sobre la salud humana a nivel mundial. El almacenamiento a temperaturas ambientales eliminana la necesidad de una cadena de fno, un problema logfstico costoso y desafiante en muchas partes del mundo, especialmente aquellas partes donde se requiere una maxima cantidad de estas vacunas.

Los metodos existentes para la manufactura y almacenamiento de vacunas vivas requieren un mejoramiento por dos razones principales. Primero, durante la manufactura, la vacuna tipicamente es liofilizada o secada por congelacion.

La liofilizacion convencional es muy nociva para los componentes celulares y otros materiales biologicos, lo cual, tipicamente, da como resultado una viabilidad reducida de la vacuna por una escala logantmica o mas. En segundo lugar, los productos liofilizados convencionalmente son estables solamente a o cerca de 0°C, lo que requiere que la vacuna sea refrigerada desde el momento en que es manufacturada hasta el momento en que es administrada. Por lo tanto, una asf llamada "cadena de fno" necesita ser mantenido durante el almacenamiento y el transporte. En muchos casos, incluyendo el transporte dentro de areas del mundo en desarrollo y remotas, la refrigeracion o no esta disponible o es problematica. Incluso si hay refrigeracion disponible, incrementa significativamente los costes de almacenamiento y transporte. Asf, el desarrollo de un metodo para la estabilizacion de vacunas de manera que puedan ser almacenadas y transportadas a temperaturas ambiente es un objetivo importante de esta invencion.

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Hasta ahora, sin tener en cuenta los intentos de numerosos investigadores, no se han desarrollado tales metodos utilizando liofilizacion, y los metodos mas comunes basados en liofilizacion han fallado en eliminar la necesidad de la "cadena de fno".

Estabilizacion por vitrificacion (formacion vftrea)

Mientras que para una cantidad limitada de tiempo (varios d^as), puede lograrse una estabilizacion de materiales biologicos sensibles, incluyendo macromoleculas biologicas, virus y objetos celulares, en un estado ftquido, la estabilizacion a largo plazo, (varios meses, varios anos o mas) de los materiales biologicos requiere de tener la movilidad molecular para detener los procesos de degradacion durante el almacenamiento. Esto puede lograrse mediante vitrificacion, la cual es una transformacion de un ftquido a un estado solido amorfo altamente inmovil, no cristalino, conocido como el "estado vftreo".

Un “estado vftreo" es un estado solido amorfo, el cual puede lograrse por superenfriamiento de un material que estaba inicialmente en estado ftquido. La difusion en los materiales vitrificados (por ejemplo, vidrios) ocurre a ratas extremadamente bajas (por ejemplo, micrones/ano). Consecuentemente, los cambios qmmicos y biologicos que requieren la interaccion de mas de una unidad estructural son en la practica completamente inhibidos. Los vidrios normalmente aparecen como solidos homogeneos, transparentes, fragiles, que pueden ser triturados o molidos para convertirlos en un polvo. Por encima de una temperatura conocida como la temperatura de transicion vftrea Tg, la viscosidad cae rapidamente y el material se transforma a partir de un estado vftreo en lo que se conoce como un "estado de caucho" deformable. A medida que se incrementa la temperatura, el material sufre una transicion a un estado ftquido. Los beneficios optimos de la vitrificacion para almacenamiento a largo plazo pueden ser asegurados solamente bajo condiciones en las que Tg es mayor que la temperatura de almacenamiento.

Aunque los cientfficos todavfa tienen disputas acerca de los modelos termodinamicos que explican la transformacion de ftquidos altamente superenfriados o soluciones sobresaturadas, hacia el “estado vftreo”, durante el enfriamiento, la vitrificacion ha sido utilizada ampliamente para preservar materiales biologicos y agentes qmmicos altamente reactivos. La premisa basica de la vitrificacion es que una difusion limitada de procesos ffsicos y las reacciones qmmicas, incluyendo los procesos responsables de la degradacion de los materiales biologicos, se detiene en el estado vftreo. Esta premisa esta basada en la teona de Einstein que establece la relacion entre viscosidad y difusion. En terminos generales, los vidrios son materiales amorfos termodinamicamente inestables que son mecanicamente estables a una viscosidad muy alta (1012-1014 Pa.s.). Un ftquido ftpico tiene una rata de flujo de 10 m/s en comparacion con 10"14 m/s en el estado vftreo.

Durante muchos anos, se ha sabido que los materiales biologicos pueden ser conservados a -196°C. La Tg para el agua pura es aproximadamente -145°C. Si se forman cristales de hielo durante el enfriamiento, la solucion que permanece no congelada en los canales entre los cristales de hielos se vitrificara a Tg', la cual es mayor que Tg para agua pura. Los materiales biologicos que son rechazados en los canales durante la formacion del hielo seran estables a temperaturas por debajo de Tg'.

El efecto nocivo de la criopreservacion esta asociado principalmente con deshidratacion inducida por la congelacion, cambio en pH, incremento en la concentracion extracelular de electrolitos, transformacion de fases en membranas biologicas y macromoleculas a temperaturas bajas, y otros procesos asociados con la cristalizacion del hielo. El criodeterioro potencial es una desventaja en los metodos que se basan en la congelacion de los materiales biologicos. Este deterioro podna ser disminuido utilizando excipientes crioprotectores (protectores), por ejemplo, glicerol, etilen glicol, dimetilsulfoxido (DMSO), sacarosa y otros azucares, aminoacidos, poftmeros sinteticos y/o biologicos, etc.

Los materiales biologicos pueden ser estabilizados a temperaturas substancialmente superiores a -145°C si se colocan en soluciones de conservacion concentradas con alta Tg. Por ejemplo, para una solucion que contiene 80% de sacarosa, la Tg es aproximadamente -40°C. Una solucion que contiene 99% de sacarosa esta caracterizada por Tg de aproximadamente 52°C. La presencia de agua en una muestra da como resultado un fuerte efecto plastificante, el cual hace disminuir la Tg. La Tg es directamente dependiente de la cantidad de agua presente, y por lo tanto puede ser modificada controlando el nivel de hidratacion - cuanto menos agua, mayor sera la Tg-. Por lo tanto, los espedmenes (que van a ser vitrificados a una temperatura ambiente) deben ser fuertemente deshidratados por secado. Sin embargo, el secado puede ser nocivo para los materiales biologicos. Por lo tanto, para estabilizar los materiales biologicos a temperatura ambiente y todavfa conservar su viabilidad y funciones, necesitan ser secados en la presencia de un excipiente protector (esto es, un protector) o una combinacion de excipientes, los cuales tienen una temperatura de transicion vftrea Tg superior a la temperatura ambiente.

Hay al menos dos aspectos de estabilizacion en un estado seco que debenan ser optimizados para llegar a un metodo para conservar materiales biologicos que den como resultado un material conservado adecuado para un almacenamiento a largo plazo a temperaturas ambiente: (1) es importante formular una solucion de conservacion efectiva que no cristalice durante el proceso de secado y, al mismo tiempo, proteja de manera confiable el agente biologico frente al deterioro que pueda ser causado por la tension de la deshidratacion; y (2) el metodo de deshidratacion debe permitir una manera eficiente y escalable de secar el material objetivo.

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La tecnica anterior ensena varios metodos para proveer preparaciones de estabilidad potenciada de materiales biologicos labiles en forma deshidratada: liofilizacion, secado al vado con aire por evaporacion (conservacion por evaporacion), y conservacion por formacion de espuma.

Conservacion por evaporacion

La aplicacion de secado para la conservacion de agentes biofarmaceuticos fue registrada hace varios siglos. Se reporto entonces que el zumo de bayas de endrina "podfa ser reducido por ebullicion suave hasta una consistencia solida, estado en el cual se mantendra durante todo el ano". A comienzo del siglo anterior, muchos cienffficos llevaron a cabo comparaciones entre los efectos estabilizadores de la evaporacion a partir del estado ffquido versus la liofilizacion. Como resultado, se ha establecido que la actividad de materiales biologicos secados por secado evaporativo de pequenas gotas es comparable con y en muchos casos incluso mejor que la actividad de muestras liofilizadas. Por ejemplo, se ha demostrado que enzimas labiles (luciferasa y deshidrogenasa isodtrica) pueden ser conservadas por secado evaporativo durante mas un ano a 50°C sin ninguna perdida detectable de actividad durante el secado y almacenamiento subsecuente a 50°C (Bronshtein, V., Frank, J.L., and Leopold, A.C. (1996). Protection of Desiccated Enzymes by Sugars. In: "Cryo 96 program", Abstract 22 of a Paper Presented at the 33rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology, Indianapolis, Indiana; Bronshtein, V., and Leopold, A.C. (1996) Accelerated aging of dried luciferase and isocitrate dehydrogenase. Effect of sugar/enzyme mass ratio. In: "Cryo 96 program", Abstract 23 of a Paper Presented at the 33rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology, Indianapolis, Indiana). Desafortunadamente debido a que las soluciones deshidratadas que contienen protectores se hacen muy viscosas, toma largos penodos de tiempo evaporar el agua incluso de gotas pequenas de una solucion. Por lo tanto, hasta ahora, las aplicaciones industriales han utilizado los metodos de liofilizacion porque el secado evaporativo es un proceso limitado en difusion que no es escalable a cantidades industriales.

Liofilizacion (FD)

El secado por congelacion o liofilizacion, ha sido conocido y aplicado para conservar diversos tipos de protemas, virus y celulas, incluyendo RBCs, plaquetas y microorganismos. El FD consiste de dos etapas principales: secado primario y secado secundario.

La liofilizacion puede ser utilizada para producir materiales biologicos estables en cantidades industriales. Sin embargo, como asunto practico, es muy diffcil (sino imposible) desarrollar un proceso de liofilizacion de carga continua, para la confesion efectiva en costes de cantidades industriales de materiales biologicos estables. Ademas, es muy diffcil ejecutar la liofilizacion como un proceso barrera (esto es, como un proceso donde el operador esta suficientemente separado del material que esta siendo conservado) tanto en viales para la produccion de dosis unitarias, en bolsas, bandejas u otros contenedores para produccion a granel. Son necesarios nuevos metodos para satisfacer todos los requerimientos de la produccion industrial.

Liofilizacion primaria

Las limitaciones de la liofilizacion, tal como se describieron mas arriba, resultan en parte de una necesidad de utilizar presion baja (o alto vado) durante un proceso de liofilizacion. Se requiere un alto vado porque la temperatura del material durante la liofilizacion primaria debena estar por debajo de su temperatura de colapsamiento, la cual es aproximadamente igual a Tg'. A tales temperaturas bajas, el secado primario toma muchas horas (a veces dfas) puesto que la presion de equilibrio por encima del hielo a temperaturas por debajo de -25°C es inferior a 0.476 Torrs.

Por lo tanto, un nuevo proceso debe permitir tiempos de produccion mas cortos. La presion de vado baja utilizada en los metodos de liofilizacion existentes limita la cantidad de agua que puede ser retirada de una camara de secado a un condensador por unidad de tiempo. Por lo tanto, es imposible construir un liofilizador interconectado industrial con un volumen de material para ser secado en cada camara igual a varios litros o mas, lo cual es necesario para una produccion a escala industrial. Son necesarios nuevos metodos para permitir la produccion a escala industrial eficiente de cantidades suficientemente grandes de materiales biologicos conservados.

Ademas, tales presiones de vapor de agua bajas limitan la seleccion de peffculas que pueden ser utilizadas para aislar el material objetivo en bolsas con respecto al ambiente de la camara durante el proceso de liofilizacion. Actualmente la industria utiliza bandejas Lyoguard cubiertas con membranas Gore. Las membranas Gore estan hechas con poros que son permeables al vapor de agua, lo cual es necesario para cualquier proceso de secado. Debido a la presencia de los poros, las membranas Gore tambien son permeables para algunos virus.

La liofilizacion primaria se lleva a cabo por sublimacion del hielo a partir de un especimen congelado a temperaturas cercanas a o por debajo de Tg' que es una temperatura a la cual una solucion que permanece sin congelar entre cristales de hielo se hace solida (vitrifica) durante el enfriamiento. De acuerdo con consideraciones convencionales, la ejecucion de la liofilizacion a tales temperaturas bajas es importante por al menos dos razones.

La primera razon por la cual la liofilizacion a bajas temperaturas (esto es, por debajo de Tg') es importante es para asegurar que la torta remanente despues de la eliminacion del hielo por sublimacion (secado primario) es "solida" y

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mecanicamente estable, esto es, que no colapsa. Esa es una razon valida. Al mantener la torta en un estado "solido" mecanicamente estable despues de la liofilizacion primaria es importante asegurar la reconstitucion efectiva del material liofilizado. Se propusieron varios metodos para medir la Tg' para un material espedfico. Estos metodos se basan en diferentes interpretaciones de las caractensticas que pueden verse en termogramas de DSC (calonmetro de barrido diferencial). La manera mas confiable para determinar la Tg' esta basada en una evaluacion de la temperatura a la cual el hielo comienza a fundirse y la concentracion de agua que permanece no congelada (Wg') durante el enfriamiento lento. Los siguientes datos relevantes han sido reportados:

• Sacarosa: -38.8°C < Tg'< -37.55°C, y 18.76 porcentaje en peso < Wg'=1-Cg') <19.42 porcentaje en peso;

• Glucosa: -59.9°C < Tg' < -49,37°C, y 18.76 porcentaje en peso < Wg'=1-Cg') <19.42 porcentaje en peso;

• Sorbitol: -54.44°C < Tg'< -52.03°C, y 18.76 porcentaje en peso < Wg'=1-Cg') <19.42 porcentaje en peso.

Para una solucion de albumina de suero bovino en agua Tg' es -20°C y Wg' es 20 porciento en peso. Por esta razon, la liofilizacion primaria debena llevarse a cabo a temperaturas por debajo de -20°C en un rango de temperatura denominado temperaturas bajas intermedias (ILT), las cuales estan aproximadamente entre -25°C y -50°C.

La segunda razon tfpicamente avanzada para soportar la importancia de la liofilizacion a bajas temperaturas (esto es, por debajo de Tg') es que la rata de supervivencia de materiales biologicos despues de la liofilizacion es mayor si la liofilizacion primaria se lleva a cabo a temperaturas mas bajas.

Se utilizan tfpicamente dos argumentos principales para soportar esta nocion. El primero es que el secado a temperaturas mas bajas es beneficioso porque "... disminuye la cinetica de las reacciones de degradacion" (vease por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 10/412,630). El segundo argumento utilizado para soportar la conexion entre la liofilizacion a bajas temperaturas y la rata de supervivencia de materiales biologicos es que los danos inducidos por la liofilizacion ocurren primariamente durante el secado secundario despues de que se completa la liofilizacion del hielo. (Webb, S.D. Effect of annealing lyophilized and spray-lyophilized formulations of recombinant human interferon-gamma. J Pharm Sci, 2003, 92 (4) :715-729).

Sin embargo, ambos argumentos anteriores son erroneos porque el descenso en las ratas de reaccion esperado a partir de la cinetica de Arrhenius es aplicable unicamente a soluciones no congeladas. Las ratas de reaccion realmente se incrementan en soluciones congeladas puesto que los cristales de hielo concentran los solutos y los materiales biologicos en los canales que permanecen no congelados entre los cristales. En teona y en la practica, la liofilizacion ("FD") es muy nociva para los materiales biologicos sensibles. Ocurren danos fuertes inducidos por FD durante la congelacion (formacion de cristales de hielo) asf como durante el equilibrio subsecuente de los espedmenes congelados a temperaturas bajas intermedias durante la sublimacion del hielo. Factores bien conocidos que producen el dano celular durante la congelacion incluyen: deshidratacion inducida por la congelacion, danos mecanicos de las celulas durante la cristalizacion y recristalizacion del hielo, transformacion de fases en las membranas celulares, incremento de la concentracion de electrolitos y otros. Sin embargo, posiblemente el factor principal que deteriora los materiales biologicos congelados es la ocurrencia de un gran cambio de pH en la fase ifquida que permanece no congelada entre los cristales de hielo. Este cambio de pH anormal, que puede ser tan grande como 5 unidades (esto es, pH >12), esta asociado con la hidrolisis por cristalizacion, como se describe en "Freezing Potentials Arising on Solidification of Dilute Aqueous Solution of Electrolytes." V.L. Bronshteyn, A.A. Chernov, J. Crystal Growth 112: 129-145 (1991).

La hidrolisis por cristalizacion ocurre porque los cristales de hielo capturan iones positivos y negativos de manera diferente. Esto crea un campo electrico significativo (aproximadamente 107 V/m) dentro de los cristales de hielo. La neutralizacion de este campo electrico ocurre debido a la electrolisis en los cristales de hielo a una rata proporcional a la constante de la disociacion de la molecula de agua en hielo. Esta neutralizacion da como resultado un cambio en el pH del lfquido que permanece entre los cristales de hielo. El efecto nocivo de la hidrolisis por cristalizacion puede atenuarse reduciendo la superficie de hielo que se forma durante la congelacion e incrementando el volumen de la fase lfquida que permanece entre los cristales de hielo. Este lfquido remanente tambien reduce el efecto nocivo (i) la concentracion de electrolito creciente (o cualquier otra molecula altamente reactiva) y (ii) el dano mecanico a las celulas entre los cristales de hielo. El incremento de lfquido entre los cristales de hielo puede alcanzarse mediante (I) incremento de la concentracion inicial de los protectores agregados antes de la congelacion y (ii) disminuyendo la cantidad de hielo formada en la muestra.

El evitar la congelacion a temperaturas iguales a Tg' o inferiores (a las cuales la liofilizacion se lleva a cabo tfpicamente) permitira reducir significativamente la cantidad de deterioro en el agente biologico conservado. Por lo tanto, un nuevo metodo que permita una conservacion de materiales biologicos sin someter los materiales biologicos a temperaturas cercanas o por debajo de Tg' mejorara significativamente la calidad del material conservado.

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Liofilizacion secundaria

Despues de que la eliminacion del hielo por sublimacion (secado primario) esta completa, la muestra puede ser descrita como una torta porosa. La concentracion de agua en la muestra al final del secado primario esta por encima de la concentracion de agua Wg' que permanece sin congelar en los canales vftreos entre los cristales de hielo a una temperature por debajo de Tg'. Los datos presentados mas arriba muestran que Tg' depende fuertemente de la composicion de la solucion, mientras que para la mayona de solutos Wg' es aproximadamente 20% en peso. A tales concentraciones altas de agua, la temperatura de transicion vftrea del material de torta esta por debajo de la temperatura de liofilizacion primaria, y/o significativamente por debajo de -20°C. Se lleva a cabo el secado secundario para eliminar el agua remanente (aproximadamente 20% en peso) e incrementar la temperatura de transicion vftrea en el material de torta. Como asunto practico, el secado secundario no puede ser llevado a cabo a temperaturas Tg' o inferiores puesto que la difusion del agua desde el material en un estado vftreo es extremadamente lenta. Por esta razon, el secado secundario se lleva a cabo calentando la torta hasta una temperatura de secado Td que es superior a la temperatura de transicion vftrea Tg del material de torta en un momento dado. Si durante la etapa de secado secundaria, Td es substancialmente mas alta que Tg, la torta "colapsada" y formara un jarabe viscoso, haciendo por lo tanto imposible una reconstitucion estandar. Por lo tanto, el colapso de la torta es altamente indeseable.

El fenomeno de colapso, el cual es cinetico por naturaleza, ha sido discutido extensamente en la literatura. La rata de colapso se incrementa a medida que la viscosidad del material de torta disminuye. Para evitar o llevar el proceso de colapso a una escala despreciable, Td se mantiene cercana a Tg durante el secado secundario, asegurando por lo tanto que la viscosidad del material de torta es alta y que la rata de colapso es lenta.

Durante el secado secundario, la eliminacion de agua ocurre a traves de la evaporacion desde las superficies interna y externa de la torta y esta limitada principalmente por la rata de difusion de agua dentro del material de la torta. Por esta razon, un secado secundario tambien toma muchas horas. La difusion de agua dentro del material de torta muy viscoso durante la etapa de secado secundaria es un proceso muy lento que crea altos gradientes de concentracion de agua dentro del material de torta. Por lo tanto, al final de la etapa de secado secundario, la Tg del material de torta esta normalmente todavfa muy por debajo de la Td maxima utilizada durante el secado secundario. En muchos casos, esto explica por que los materiales biologicos no son estables despues de conservacion por liofilizacion.

Para simplificar el analisis, el tiempo t caractenstico de este proceso puede ser estimado utilizando la ecuacion t = h2/D, en el que h es un espesor del especimen y D es el coeficiente de difusion de agua. Para agua, D es aproximadamente igual a 10"5cm2/seg. Dado D = l0"5cm2/seg, tomara solamente aproximadamente 10"3 segundos para secar un especimen pequeno con un espesor de 1 pm. Sin embargo, D disminuye rapidamente a medida que el grado de deshidratacion, a temperatura de vitrificacion (Tg) y viscosidad en el especimen se incrementa. Si Tg puede ser incrementado durante la deshidratacion hasta la temperatura a la cual se lleva a cabo el secado, D disminuira (mientras que la viscosidad se incrementara) aproximadamente catorce (14) ordenes de magnitud o mas. Como resultado, el tiempo requerido para eliminar agua de un especimen de 1 pm sera cercano a diez mil (10,000) anos.

Por lo tanto, como asunto practico, el estado vftreo solamente puede ser alcanzado enfriando (a presion constante) y no secando. Por la misma razon, cuando se seca una solucion biologica, se puede alcanzar una temperatura de vitrificacion Tg superior a la temperatura de Td a la cual lleva a cabo el secado. Este es un fenomeno basico que ha sido pasado por alto por muchos cientfficos que no aprecian cuan lento es el secado a temperaturas cercanas a Tg o por debajo. Por ejemplo, Roser et al., (Patentes de los Estados Unidos No. 5,762,961), Schebor et al. (Journal of Food Engineering, 30, 269-282, 1996), Sun et al. (Physiologia Plantarum 90, 621-628, 1994), y muchos otros investigadores han reportado valores de Tg mucho mayores que la temperatura a la cual el material fue secado Td. En estas publicaciones, para determinar Tg, los autores deben haber malinterpretado sus resultados de prueba obtenidos por dispositivos de DSC (calorimetna de barrido diferencial). Una medicion mas confiable de Tg debena llevarse a cabo midiendo la aparicion de polarizacion estimulada termicamente (o despolarizacion) o la aparicion en cambios de calor espedfico durante una transicion del estado vftreo al ftquido.

Conservacion por formacion de espuma (PFF)

Durante mas de quince anos, la liofilizacion ha sido un metodo dominante para conservacion de materiales biologicos labiles. Esta seleccion ha estado basada en la creencia convencional de que la liofilizacion es la unica tecnologfa escalable (industrial) que puede permitir la conservacion de materiales biologicos labiles en estado seco.

Otros metodos conocidos, tales como secado por aspersion, secado con fluidos supercrfticos y otros metodos escalables de desecacion han fallado en conservar los materiales biologicos sensibles. Durante el secado por aspersion, pequenas gotas de suspensiones o soluciones biologicas o farmaceuticas son asperjadas en un gas inerte caliente (por encima de 100°C) o en atmosfera de aire, en donde son rapidamente secados y convertidos en un polvo. Las altas temperaturas utilizadas en este metodo producen danos inaceptables a materiales biologicos sensibles. Ademas, este metodo puede no proveer suficiente agente biologico deshidratado y, dependiendo de los requerimientos de humedad residual espedfico para la estabilidad del producto, pueda requerirse secado adicional por otros medios, tales como secado en bandejas de vado.

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Aproximadamente hace medio siglo, fue demostrado por Annear que las soluciones concentradas y los Ifquidos biologicos que conteman azucares o aminoacidos podnan ser secados por un jarabe espumante bajo vado. Annear aplico este proceso para conservar varias bacterias en un estado seco. Para obtener un jarabe, Annear utilizo la sublimacion y evaporacion de agua de los espedmenes. El no crefa que este proceso pudiera ser utilizado para aplicaciones industriales. Mas adelante, en 1996, Roser y Gribbon (WO 96/040077) divulgaron el uso de exactamente el mismo proceso para incorporar materiales biologicos en una matriz de espuma seca. De acuerdo con Roser y Gribbon, las soluciones biologicas debenan ser evaporadas antes de obtener un "jarabe" y, en segundo lugar, debenan ser espumadas poniendo en ebullicion el jarabe bajo vado. Realmente definieron el termino "jarabe" con el significado de una solucion viscosa que formana espuma durante la ebullicion. Asf, para espumar espedmenes bajo vado, Annear tema que obtener el jarabe primero por evaporacion.

En 1996, se propuso un metodo para utilizar el proceso de espumacion descubierto por Annear para construir una tecnologfa practica para la conservacion de materiales biologicos sensibles en un estado seco y se desarrollo una conservacion escalable por un protocolo de formacion de espuma (Patente de los Estados Unidos Nos. 5,766,520 y 6,306,345). Estas tecnicas han sido utilizadas para desarrollar metodos para estabilizacion a temperaturas ambiente para muchas bacterias, virus, enzimas, protemas terapeuticas y otros objetos moleculares. Tambien ha sido demostrado que el proceso de Annear puede ser escalado hasta volumenes de 0.5 litros evitando la evaporacion para obtener el jarabe antes de que comience la ebullicion. Desde 1996, esta tecnologfa innovadora ha sido aplicada exitosamente para conservar materiales biologicos sensibles.

Despues de 1996, estudios adicionales extensos han demostrado los beneficios de la tecnologfa PFF. (La tecnologfa PFF tambien es conocida como tecnologfa VitriLife™). Algunos de los resultados obtenidos despues de 1996 demuestran que:

• Artfculos moleculares tales como anfotericina, uroquinasa, luciferasa, p-galactosidasa, protema nucleante en hielo, Taq ADN polimerasa y otros pueden ser estabilizados a temperaturas de 37°C o mayores sin ninguna perdida de actividad.

• Las vacunas virales vivas a partir de diferentes grupos taxonomicos, incluyendo Herpesviridae (Bovine Rhinotracheitis), Paramyxoviridae (sarampion, virus del smdrome respiratorio bovino (BRSV), Parainfluenza bovina, Parainfluenza canina, moquillo canino), Flaviviridae (Diarrea Viral Bovina), Parvoviridae (Parvovirus Canino) y retrovirus (MLV) pueden ser estabilizados a temperaturas de hasta de 37°C sin perdida significativa de actividad.

• Vacunas bacterianas vivas como Salmonella choleraesuis, Salmonella typhi, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida y Pasteurella haemolytica, y muchas otras bacterias incluyendo E. coli y L. acidophilus pueden ser estabilizadas efectivamente a 37°C o temperaturas mas altas.

Al mismo tiempo, intentos conocidos para conservar materiales biologicos sensibles por tecnologfa de liofilizacion convencional, en muchos casos, dieron como resultado 10% o menos de rendimiento de supervivencia y estabilidad limitada a temperaturas ambiente, es, sin refrigeracion. Por ejemplo, el rendimiento en supervivencia de BRSV despues de liofilizacion convencional fue menor del 10% de una muestra de control. Sin embargo, no se observo perdida detectable en la rata de supervivencia de BRSV en los espedmenes conservados usando conservacion por formacion de espuma. En 2002, la tecnologfa VitriLife™ fue adquirida por Avant Immunotherapeutics, Inc. (Avant).

Las ventajas de la tecnologfa de vitrificacion no han sido utilizadas completamente para alcanzar la estabilidad a largo plazo de materiales biologicos labiles a temperaturas ambiente. Los metodos existentes de conservacion a temperatura ambiente por secado estan disenados para el procesamiento a escala de laboratorio de cantidades relativamente pequenas de materiales en viales de dosis unitaria, lo que hace estos metodos incompatibles con operaciones comerciales a gran escala. Los problemas tecnicos relacionados con la monitorizacion de la temperatura de transicion vftrea tambien han presentado obstaculos a la implementacion comercial. Mientras que las tecnologfas de secado y vitrificacion son potencialmente atractivas como metodos escalables para almacenamiento eficiente a largo plazo de materiales biologicos, hay necesidad de abordar un cierto numero de problemas antes de que las ventajas de almacenamiento en el estado vftreo puedan ser explotadas comercialmente.

A pesar de los muchos beneficios de la tecnologfa PFF (VitriLife™), la tecnologfa tambien tiene algunas desventajas. Si se utiliza la metodologfa descrita por Roser y Gribbon (WO 96/040077) y se aplica la evaporacion para obtener un jarabe, se encontrara rapidamente que en muchos casos o en una porcion de viales, la ebullicion y el espumado no tendran lugar de manera alguna, incluso despues de una aplicacion de un alto vado puesto que la fase de vapor no puede nuclearse en un jarabe altamente viscoso. Este fenomeno hace practicamente imposible validar un proceso de PFF a escala industrial desarrollado en un laboratorio para materiales biologicos espedficos. El proceso divulgado por Bronshtein en 1996 (Patente de los Estados Unidos No. 5,766,520) provee una etapa de ebullicion antes de que se alcance la viscosidad alta del material. Las principales desventajas de este proceso son que esta caracterizado por erupciones incontrolables del material durante la ebullicion. Estas erupciones dan como resultado que una porcion de material se esparce sobre las paredes de los viales, lo cual puede contaminar los tapones.

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Ademas, una parte de tal material puede ser liberado de los viales hacia la camara de secado. Para suavizar la erupcion durante la ebullicion y para hacer la ebullicion mas suave, se ha propuesto utilizar protocolos de aplicacion bidimensionales de temperatura/presion que reducen el sobrecalentamiento hasta un nivel aceptable. Sin embargo, este protocolo es diffcil de implementar y es diffcil de reproducir de manera confiable con diferentes formulaciones.

En muchos casos el procesamiento especial requiere iniciar la nucleacion de burbujas de vapor (ebullicion) (Patente de los Estados Unidos No. 6,884,866) del jarabe obtenido por evaporacion.

Por lo tanto, el proceso PFF esta caracterizado por un cierto numero de desventajas significativas que limitan severamente su aplicacion a escala industrial. Consecuentemente, es necesario un nuevo proceso libre de las desventajas asociadas con los metodos de PFF para mejorar la conservacion de materiales biologicos a escala industrial.

La patente de los Estados Unidos No. 6,509,146 divulga metodos para la conservacion a largo plazo de soluciones y suspensiones biologicas a escala industrial que contiene moleculas, celulas y pequenos espedmenes multicelulares biologicamente activos, a temperaturas ambiente por deshidratacion en un ftquido viscoso muy amorfo o estado vftreo. El metodo de escalamiento comprende la etapa de secado primario de ebullicion bajo vacfo para formar una espuma mecanicamente estable y una etapa de secado secundario para incrementar la estabilidad. La vitrificacion puede ser alcanzada subsecuentemente enfriando el material secado a la temperatura de almacenamiento que es inferior a la temperatura de transicion vftrea.

La WO 97/45009 divulga un metodo util para conservar espedmenes biologicamente activos en almacenamiento vitrificandolos, esto es, deshidratandolos de tal manera que se alcance un verdadero estado vftreo a temperatura de almacenamiento por enfriamiento subsecuente. El metodo esta basado en el reconocimiento de que para almacenar muestras en un estado vftreo verdadero la temperatura de deshidratacion del material que va a ser deshidratado debe ser superior a la temperatura de almacenamiento sugerida. Puesto que la temperatura de vitrificacion disminuye rapidamente con el contenido creciente de agua la muestra necesita ser deshidratada fuertemente para incrementar la Tg por encima de la temperatura de almacenamiento (Ts). La temperatura de deshidratacion debena ser seleccionada tan alta como la temperatura de almacenamiento sugerida, y el estado vftreo es alcanzado subsecuentemente enfriando despues de la deshidratacion.

La Patente de los Estados Unidos No. 5,298,261 divulga una tableta que se desintegra rapidamente en solucion acuosa incluyendo una red de matriz parcialmente colapsada que ha sido secada al vado por encima de la temperatura de colapsamiento de la matriz. La matriz preferiblemente es secada al menos parcialmente por debajo del punto de congelacion de equilibrio de la matriz. Secar al vado la tableta por encima de su temperatura de colapso en vez de liofilizarla por debajo de su temperatura de colapso provee un proceso para producir tabletas con integridad estructural potenciada, a la vez que se desintegran rapidamente en cantidades normales de saliva. La tableta preferiblemente lleva un farmaco, tal como acetaminofen. La red de matriz de la tableta incluye preferiblemente una goma, un carbohidrato y el farmaco. Realizaciones especialmente preferidas incluyen tambien un saborizante, un endulzante y un surfactante. La goma es prefereriblemente goma de acacia, de guar, de xantano, de carragenano o tragacanto. El carbohidrato es preferiblemente manitol, dextrosa, sacarosa, lactosa, maltosa, maltodextrina o solidos de jarabe de mafz.

La US 2003/0219475 revela metodos y composiciones para conservar materiales bioactivos en una matriz de espuma seca. Los metodos proveen la generacion de espuma sin ebullicion y la penetracion de agentes conservantes a temperaturas cercanas a la temperatura de transicion de fase de las membranas.

La Patente de los Estados Unidos No. 4,520,574 divulga un proceso para secar un alimento bajo una presion reducida para la preparacion de un alimento seco que puede ser rehidratado a la condicion original en un tiempo muy corto para tener sabor y textura placenteros sustancialmente comparables a un alimento no tratado. El proceso es caracterizado por la etapa de colocar el alimento que se va a secar en un ambiente de presion reducida suficientemente bajo para vaporizar una porcion del agua contenida en el alimento y congelar el resto de agua por irradiacion de calor por la vaporizacion, y la etapa de calentar para secar el alimento a temperatura relativamente baja bajo la presion reducida. Un rasgo caractenstico adicional del proceso es una cafda subita o abrupta de la presion que circunda el alimento en la etapa inicial, con lo cual el alimento es ablandado de alguna manera mediante la accion del agua que se vaporiza vigorosamente a un estado seco con una porcion de nucleo sustancialmente hueca y una capa superficial mas densa.

La Patente de los Estados Unidos No. 3,716,382 divulga alimentos ftquidos deshidratados sometiendolos a un vado y a una temperatura baja solamente suficiente para congelar parte del contenido de agua para producir una masa. Se provee una rata de secado alta, acoplada con buena retencion del sabor.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion es como se define en las reivindicaciones.

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La presente invencion incluye nuevos y ventajosos metodos para conservar materiales bioactivos para el almacenamiento y transporte. La conservacion por vaporizacion (PBV) es un nuevo metodo para la conservar materiales biologicos sensibles. El metodo comprende dos etapas principales: secado primario y secado para estabilidad. La etapa de secado primario se lleva a cabo mediante vaporizacion intensiva (sublimacion, ebullicion y evaporacion) del agua a temperaturas significativamente mas altas (aproximadamente 10°C o mas) que Tg' a partir de un estado parcialmente congelado y al mismo tiempo sobrecalentado (cuando una presion de vacfo esta por debajo de la presion de equilibrio del vapor de agua) de un material biologico. El material que esta siendo conservado puede tomar muchas diversas formas, incluyendo una solucion biologica, suspension biologica y un material biologico (por ejemplo, bacterias, virus, protemas terapeuticas encapsuladas en hidrogeles, etcetera).

Al final de la etapa de secado primaria, el material que esta siendo conservado es mecanicamente estable (por ejemplo, no colapsa) a una temperatura ambiente bajo alto vado. Despues de esto, se lleva a cabo el secado por estabilidad para incrementar la temperatura de transicion vftrea del material seco para hacerlo mecanicamente estable a temperaturas ambiente sin vacfo y para maximizar la potencia y viabilidad del material biologico despues de un almacenamiento y/o transporte a largo plazo a temperaturas ambiente.

La conservacion de hidrogeles (incluyendo un gel de alginato) por secado es mas efectiva cuando el tamano de las partfculas de hidrogel es pequeno (aproximadamente 1 mm, o menos). Una razon que puede explicar el fenomeno es que el crecimiento de burbujas de vapor nucleadas dentro de las partfculas de gel es limitado por la alta viscosidad dentro del gel.

Los contenedores (por ejemplo, bolsas) para el secado a granel descrito aqrn permiten introducir asepticamente un fluido (por ejemplo, una solucion biologica o una suspension viral o celular) en un contenedor, secar asepticamente el fluido, almacenar asepticamente el especimen seco en el contenedor, o transferir asepticamente el material seco desde el contenedor a otros dispositivos para procesamiento corriente abajo (por ejemplo, moliendas).

El proceso PBV es beneficioso en comparacion con los procesos de liofilizacion mas convencionales porque entre otras cosas: (i) permite una conservacion significativamente mas rapida de materiales biologicos, (ii) puede ser llevado a cabo eficientemente a presiones de vacfo (por ejemplo, aproximadamente de 1 a 3 Torrs (133.3 a 400 Pa)) y (iii) produce materiales biologicos conservados que pueden ser almacenados y transportados durante penodos extendidos de tiempos sin refrigeracion.

Las bolsas (u otros contenedores) usados para el procesamiento segun los metodos de la invencion reivindicados puede tener un coeficiente de permeacion mas bajo para el vapor de agua que una membrana Gore convencional (politetrafluoroetileno expandido) que contiene poros de 0.2 micrones. Por ejemplo, membranas respirables de polipropileno o poliuretano de 10 a 50 micrones (espesor) de Mylan Technologies Inc., o Inspire para vendajes de InteliCoat Technologies pueden ser utilizadas para reemplazar las membranas Gore en el diseno de los contenedores (por ejemplo, bolsas) utilizadas para el secado. Ademas, los contenedores que utilizan membranas de polipropileno o poliuretano son menos costosos que las bandejas utilizadas comunmente en la industria para tales aplicaciones (esto es, bandejas Lyogard) cubiertas con membranas costosas (por ejemplo, membranas Gore).

El uso de membranas de polipropileno o poliuretano en el diseno de los contenedores (por ejemplo, bolsas) permite hacer del secado un proceso de barrera aseptica. Al mismo tiempo, puesto que tales membranas son caracterizadas por una resistencia mecanica limitada, para abordar tal problema, se usa un diseno en “sandwich” que comprende la membrana respirable entre dos membranas porosas debajo coste (por ejemplo, membranas de Sartorius para ultrafiltracion) caracterizadas por una permeabilidad mas alta a vapores de agua y por una resistencia mecanica mas alta. Equipo dedicado y especialmente disenado permite utilizar por completo los beneficios del nuevo metodo PBV descrito aqrn a escala industrial. Tal equipo puede ser disenado como un colector multiple puesto que el nuevo metodo PBV no requiere el procesamiento bajo una presion de vacfo baja. Un diseno de un secador PBV multiple industrial comprende camaras de secado y un condensador a gran escala. Las camaras de secado pueden ser unidas al condensador mediante una pluralidad de conectores. Los conectores contienen valvulas de vacfo que controlan el flujo de aire o los vapores de agua provenientes de las camaras de secado hacia el condensador. El material que va a ser secado por el nuevo metodo sugerido sera colocado en una camara de secado. Se proveera calor apropiado mediante unas fuentes de calor para compensar la perdida de energfa debida a la evaporacion durante el proceso de secado primario. Puede utilizarse un intercambiador de calor para enfriar el material hasta aproximadamente -10°C (por lo tanto, congelandolo) antes de secarlo. En algunos casos para asegurar que la congelacion tiene lugar a temperaturas no significativamente por debajo de -10°C, puede ser necesario tomar medidas especiales para nuclear los cristales de hielo. Por ejemplo pueden utilizarse bacterias nucleadoras de hielo para este proposito.

El equipo tambien puede tener un sistema de control (por ejemplo, un aparato electrico o basado en un ordenador) para proveer el control de proceso apropiado de las diversas etapas del nuevo metodo. Por ejemplo, la etapa de calentamiento y los flujos de gas entre las camaras y el condensador pueden ser controlados apropiadamente. El sistema de control puede ser disenado y programado para proveer un proceso de secado automaticamente graduado en las camaras. Asf, cada camara completara el secado en un tiempo diferente, lo cual a su vez permitira un procesamiento de carga continua. El diseno del equipo puede permitir conectar una nueva camara a la fuente de

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vado (por ejemplo, un condensador) y desconectar una camara de la fuente de vado cuando el proceso de secado dentro de esa camara esta terminado. La conexion y desconexion de camaras a la fuente de vado no tiene que resultar en un desprendimiento o movimiento ffsico de las camaras. Las camaras pueden ser desconectadas de la fuente de vado mediante una valvula u otro dispositivo. Sin embargo, las camaras que permiten desprendimientos qmmicos pueden proveer beneficios adicionales puesto que es considerablemente mas facil y menos costoso esterilizar y mantener esteriles las camaras en oposicion a mantener esteril el conjunto completo de equipo.

Los nuevos metodos propuestos en conjuncion con un diseno de equipo dedicado pueden permitir una manufactura a escala industrial de materiales biologicos conservados que pueden ser almacenados y transportados sin refrigeracion durante penodos extendidos de tiempo. Al mismo tiempo, los nuevos metodos propuestos y un equipo dedicado pueden permitir llevar a cabo tales procesos de manufactura a las velocidades y con la eficiencia considerablemente mayor que las velocidades y la eficiencia disponibles a traves de los metodos actualmente conocidos.

Definiciones.

Tal como se utiliza en esta especificacion y en las reivindicaciones anexas, o las formas singulares "un", "una" y "el/la/los/las" incluyen referentes plurales a menos que el contexto en el cual se utilizan dicte de manera no ambigua a otra cosa. Si un termino definido esta en mayuscula o no en el texto de esta divulgacion no tendra efecto sustantivo sobre su significado.

Los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aqrn estaran en concordancia con los terminos utilizados comunmente por una persona normal de experiencia del arte al cual es pertinente la invencion. Por esta razon, a menos que se establezca expresamente aqrn de otra manera seran utilizadas, las definiciones expresas mantenidas en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003/0219475 A1 (Vu Truong-Le, "Preservation of Bioactive Materials by Freeze Dried Foam.").

"Temperaturas Ambiente" son aquellas en cualquier momento dado en un ambiente dado. Tfpicamente la temperatura ambiente (RT) es de aproximadamente 22 grados Celsius. Aqrn, en busca de claridad podemos referirnos a una temperatura entre aproximadamente -10 grados Celsius y mas 40 grados Celsius como temperatura ambiente.

"Ebullicion" se refiere a la transicion de fase rapida de lfquido a vapor que tiene lugar cuando la temperatura de un lfquido esta por encima de su temperatura de ebullicion bajo condiciones espedficas. La temperatura de ebullicion, como es bien sabido por los experimentados en el arte, como es la temperatura en la cual la presion de vapor de un lfquido es igual a la presion aplicada. Durante el proceso de ebullicion, las burbujas de vapor se nuclean dentro del lfquido.

"Evaporacion" significa un proceso de movimiento de moleculas a traves de la interfase lfquido-gas desde la superficie de un lfquido hacia una fase gaseosa que ya existe. La evaporacion no necesariamente requiere sobrecalentamiento y nucleacion de las burbujas de vapor.

"Sublimacion" o "Liofilizacion" significa un proceso de movimiento de moleculas desde un estado cristalizado solido directamente a una fase gaseosa a traves de una interfase cristal-fase gaseosa.

"Vaporizacion" significa un movimiento de moleculas hacia una fase gaseosa por evaporacion, sublimacion o ebullicion.

"Regulador" significa una solucion regulada que resiste cambios en pH mediante la accion de sus componentes conjugados acido-base. El pH del regulador generalmente se seleccionara para estabilizar el material activo preferido, y podra ser establecido por los expertos en el arte. En generalmente, el pH del regulador estara en el rango del pH fisiologico, aunque algunas protemas, pueden ser estables a un rango de pH mas amplio, por ejemplo, pH acido. Asf, rangos de pH preferidos son desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10, siendo particularmente preferidos de aproximadamente 3 a aproximadamente 8. Aun mas preferiblemente, el pH esta en el rango desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 8.0. Aun mas preferiblemente, el pH esta en el rango de aproximadamente 7.0 hasta aproximadamente 7.4, y lo mas preferiblemente, el pH esta en el rango entre aproximadamente 7.0 y aproximadamente 7.2. Reguladores adecuados incluyen un regulador de fosfato de pH 7.2 y un regulador de citrato de pH de 7.0. Como sera apreciado por los experimentados en la tecnica, hay un gran numero de reguladores adecuados que pueden ser usados. Los reguladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfato de potasio, fosfato de sodio, acetato de sodio, histidina, imidazol, citrato de sodio, succinato de sodio, bicarbonato de amonio y carbonato. En general, los reguladores utilizan a molaridades que van desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 2 M, siendo preferido desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 1 M, y desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 0.5 M especialmente preferidos, y siendo particularmente preferido de 25 a 50 mM.

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"Seco" se refiere a un material con un contenido de humedad residual menor de aproximadamente 10%. Las composiciones secas comunmente son secadas hasta humedades residuales de 5% o menos, o entre aproximadamente 3% y 0.1%.

"Excipientes protectores" o "protectores" (por ejemplo, incluyendo pero no limitandose a crioprotectores y lipoprotectores) se refieren generalmente a compuestos o materiales que se agregan para evitar el deterioro del agente terapeutico o de un agente biologico durante un proceso de secado y posteriormente. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, protemas tales como albumina de suero humana y bovina, gelatina, inmunoglobulinas, carbohidratos incluyendo monosacaridos (galactosa, d-manosa, sorbosa, etcetera.) y sus derivados no reductores (por ejemplo, metilglucosido), disacaridos (trehalosa, sacarosa, etcetera.), ciclodextrinas y polisacaridos (rafinosa, maltodextrinas, dextranos, etcetera); un aminoacido tal como glutamato monosodico, glicina, alanina, arginina o histidina, asf como aminoacidos hidrofobos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etcetera); una metilamina como betama; una sal excipiente tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes azucares trihndricos o superiores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilen glicol; polietilen glicol; Pluronics; surfactantes; y combinaciones de los mismos.

Los "cosolutos" pueden estar presentes en las formulaciones y composiciones de la invencion en pequenas concentraciones que son mucho mas pequenas que las concentraciones de azucares y otros protectores. Los Cosolutos pueden estar presentes en las formulaciones de la invencion en cantidades desde aproximadamente 0.01 por ciento en peso hasta varios porcentajes en peso. De manera similar a lo reportado por otras personas, hemos encontrado que la supervivencia de algunos materiales biologicos despues del secado puede ser mejorada si el hidrogel, solucion o suspension del metodo puede incluir cosolutos (surfactantes y/o un zwitterion). Los surfactantes pueden incluir, por ejemplo, monolauratos de polietilen glicol sorbitano (por ejemplo, Tween 80), monooleatos de polioxietilen sorbitano (por ejemplo, Tween 20), o poftmeros de bloque de polietilen y propilen glicol (por ejemplo, Pluronic F68) y/o similares. Los zwitteriones del metodo pueden incluir, por ejemplo, arginina, histidina, glicina y/o similares. Creemos que es bien sabido que los Cosolutos como polietilenglicol, polipropilenglicol, copoftmeros de bloque de polietilenglicol/polipropilenglicol, alquil eteres de polietilenglicol, alquileteres de polipropilenglicol, copoftmeros de bloque de polietilenglicol/polipropilenglicol, eter, alquilarisulfonatos, fenilsulfonatos, sulfatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos de alquil eter, sulfatos de aril alquil eter, fosfatos de alquil poliglicol eter, fosfatos de poliaril fenil eter, alquilsulfosuccinatos, sulfonatos de olefinas, sulfonatos de parafina, sulfonatos de petroleum, tauridos, sarcosidos, acidos grasos, acidos alquilnaftalenosulfonicos, acidos naftalenosulfonicos, acidos lignosulfonicos, condensados de naftalenos sulfonados con formaldehndo, o condensados de naftalenos sulfonados con formaldehndo y fenol, licor residual de lignina-sulfito, fosfatos de alquilo, compuestos de amonio cuaternario, oxidos de amina, betamas y/o similares. Surfactantes de Tween.RTM. y Pleuronic.RTM. tales como, por ejemplo, monolaurato de polietilenglicol sorbitano, monooleato de polioxietilensorbitano, o copoftmeros de bloque de poletilen y prolipropilen glicol y muchos otros pueden ser incluidos en la formulacion antes del secado, sin embargo, las concentraciones optimas de los cosolutos para diferentes materiales biologicos son diferentes y debenan ser determinadas experimentalmente.

"Vftreo", "estado vftreo" o "matriz vftrea" se refiere a un ftquido que ha perdido su capacidad de fluir, esto es, un ftquido con una viscosidad muy alta, en donde los rangos de viscosidad vanan de 1010 hasta 1014 pascal-segundos. Puede verse como un sistema amorfo metaestable en el cual las moleculas tienen un movimiento vibracional pero muy lentos componentes rotacionales y traslacionales (casi no medibles). Como sistema metaestable, es estable durante penodos largos de tiempo cuando se almacena bien por debajo de la temperatura de transicion vftrea.

"Temperatura de Transicion Vftrea" es representada por el sfmbolo Tg y es la temperatura a la cual una composicion cambia de un estado vidrioso o vftreo a un estado de jarabe o gomoso durante el calentamiento. En general, la Tg se determina utilizando calorimetna diferencial de barrido (DSC) y se toma tfpicamente como la temperatura a la cual ocurre la aparicion del cambio de capacidad de calor (Cp) de la composicion por barrido a traves de la transicion. La definicion de Tg siempre es arbitraria y no hay una convencion internacional actual que se aplique. La Tg puede ser definida como la aparicion, punto medio o punto final de la transicion. Para los propositos de esta invencion y divulgacion utilizaremos la aparicion de los cambios en Cp cuando se utiliza DSC. Vease el artfculo titulado "Formation of Glasses from Liquids and Biopolymers" by C. A. Angell: Science, 267, 1924-1935 (Mar. 31, 1995) y el artfculo titulado "Differential Scanning Calorimetry Analysis of Glass Transitions" de Jan P. Wolanczyk: Cryo-Letters, 10, 73-76 (1989). Para un tratamiento matematico detallado, vease "Nature of the Glass Transition and the Glassy State" de Gibbs and DiMarzio: Journal of Chemical Physics, 28, NO. 3, 373-383 (March, 1958).

Excipientes "Farmaceuticamente Aceptables" (vehnculos, aditivos) son aquellos que pueden ser administrados razonablemente a un sujeto mamfero para proveer una dosis efectiva del ingrediente activo empleado. Preferiblemente, son excipientes que la Federal Drug Administration (FDA) tiene hasta la fecha designados como 'Vistos Generalmente como Seguro' (GRAS). "Composicion farmaceutica" se refiere a preparaciones que estan en forma tal que permiten que la actividad biologica de los ingredientes activos sea ineqmvocamente efectiva y que no contienen componentes adicionales que sean toxicos para los sujetos a los cuales se administrana la composicion.

"Poliol" significa una sustancia con multiples grupos hidroxilo, e incluye, por ejemplo, azucares (azucares reductores y no reductores), alcoholes azucares y acidos azucares. Los polioles preferidos aqrn tienen un peso molecular que

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es menor de aproximadamente 600 kDa (por ejemplo, en el rango desde aproximadamente 120 hasta 400 kDa). Un "azucar reductor" es un poliol que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir los iones metalicos o reaccionar covalentemente con la lisina y otros grupos amino en las protemas. Un "azucar no reductor" es un azucar que no tiene estas propiedades de un azucar reductor. La mayona de los monosacaridos son azucares reductores incluyendo fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azucares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melizitosa y rafinosa. El manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes azucares. El metil glucosido y la 2-dioxiglucosa son ejemplos de derivados no reductores de monosacaridos. Como acidos azucares, se incluyen L-gluconato y sales metalicas del mismo.

"Polvo" significa una composicion que consiste de partmulas solidas finamente dispersadas que tienen flujo relativamente libre y son capaces de ser dispersadas facilmente en un dispositivo de inhalacion y subsecuentemente inhaladas por un paciente de tal manera que las parffculas son adecuadas para administracion intranasal o pulmonar a traves del tracto respiratorio superior incluyendo la mucosa nasal.

"Temperatura de almacenamiento" para una composicion es la temperatura (Ts) a la cual la composicion seca puede ser almacenada para mantener la estabilidad del producto durante la vida util de la composicion con el fin de asegurar una dosis suministrada consistentemente. Esta temperatura esta determinada inicialmente por el fabricante de la composicion y aprobada por una agencia gubernamental responsable y por la aprobacion de la composicion para su comercializacion (por ejemplo, la Food and Drug Administration de los Estados Unidos para productos farmaceuticos). Esta temperatura variara para cada farmaco aprobado u otro producto dependiendo de la sensibilidad a la temperatura del farmaco activo y otros materiales en el producto. La temperatura de almacenamiento recomendada variara desde aproximadamente 0 grados C hasta aproximadamente 40 grados C, pero en general estara alrededor de RT 22 grados C.

Se dice que un material biologicamente activo "retiene su actividad biologica" en una composicion farmaceutica u otra, si la actividad biologica del material biologicamente activo, tal una enzima, en un momento dado esta dentro de aproximadamente 10% (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biologica exhibida en el momento en que la composicion de la que se trata fue preparada segun se determino en un ensayo de enlazamiento. En el caso de virus o bacterias vivos, la actividad biologica puede ser considerada retenida cuando el tftulo viral o el recuento de colonia de la composicion esta dentro de una escala logantmica del tftulo o recuento inicial. Para celulas vivas, la actividad biologica se considera retenida cuando el recuento de celulas vivas de la composicion esta dentro del 50% del recuento inicial. Una escala logantmica FFU/ml es aproximadamente igual a una escala logantmica de dosis infecciosa en cultivo de tejidos por ml (log TCID50/ml).

Un material biologicamente activo "retiene su estabilidad qmmica" en una composicion farmaceutica o biologica, si la estabilidad qmmica en un momento dado es tal que el material biologicamente activo se considera que retiene su actividad biologica como se define aqm. La estabilidad qmmica puede ser establecida detectando y cuantificando las formas qmmicamente alteradas del material biologicamente activo. La alteracion qmmica puede involucrar modificacion de tamano (por ejemplo recorte de protemas) lo cual puede ser evaluado utilizando cromatograffa de exclusion por tamano, SDS-PAGE y/o espectrometna de masas desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI/TOF MS).Otros tipos de alteracion qmmica incluyen alteracion de carga (por ejemplo, que ocurre como resultado de la desamidacion) lo cual puede ser evaluado por cromatograffa de intercambio de iones u otros metodos.

Un material biologicamente activo "retiene su estabilidad ffsica" en una composicion farmaceutica o biologica si no muestra incrementos significativos en la agregacion, precipitacion y/o colapso por examen visual del color y/o claridad, o segun se mide por dispersion de luz Ultra Violeta o por cromatograffa de exclusion por tamano.

Una formulacion o composicion "Estable" es aquella en el cual el material biologicamente activo en la misma retiene esencialmente (dependiendo de una aplicacion espedfica) su estabilidad ffsica y/o estabilidad qmmica y/o potencia biologica durante el almacenamiento y/o transporte. En el arte se conocen diversas tecnicas analfticas para medir la estabilidad y estan revisadas como por ejemplo, en Peptide and Protein Drug Delivery, 247- 301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad puede ser medida a una temperatura seleccionada durante un penodo de tiempo seleccionado. El analisis de tendencias puede ser utilizado para estimar una vida util esperada antes de que un material haya estado realmente en almacenamiento durante ese penodo de tiempo. Para virus de influenza vivos, la estabilidad se define como el tiempo que toma perder 1 log de FFU/ml o 1 log de TCID50/ml. Preferiblemente, la composicion es estable a una temperatura ambiente durante al menos tres meses, o a 40 grados Celsius durante al menos 1 mes, y/o estable a aproximadamente 2-8 grados Celsius durante al menos 1 ano. Adicionalmente, la composicion es preferiblemente estable despues de la congelacion (por ejemplo, hasta -70 grados Celsius), y descongelacion de la composicion.

Una "cantidad terapeuticamente efectiva" de un material biologicamente activo se refiere a una cantidad efectiva en la prevencion o tratamiento de un trastorno o una enfermedad en la que un "trastorno" es cualquier condicion que se beneficiana del tratamiento con el material biologicamente activo. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicos y agudos incluyendo aquellas condiciones patologicas que predisponen a los mairftferos al trastorno en cuestion.

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"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas. Aquellos que requieren un tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno asf como aquellos en los cuales el trastorno va a ser prevenido.

"Dosificacion unitaria" se refiere a un receptaculo que contiene una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de la invencion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Los metodos novedosos de la presente invencion permiten el almacenamiento y transporte extendidos de materiales bioactivos a temperaturas ambiente.

Secado primario

Se ha sabido comunmente evitar o minimizar la congelacion de los materiales biologicos porque la congelacion es considerada por muchos como un proceso nocivo. Sin embargo, la congelacion a temperaturas de cerca de -0°C puede no ser nociva (o al menos es menos nociva en comparacion con la congelacion a o hasta -20°C o menos) porque el cambio de pH asociado con la hidrolisis por cristalizacion es proporcional a la superficie de los cristales de hielo dividida por el volumen de fase lfquida que permanece entre los cristales de hielo. Esta relacion sera pequena durante la congelacion cercana a 0°C. Al mismo tiempo, la vaporizacion de agua desde un material parcialmente congelado a temperaturas cercanas al punto de fusion del hielo (por ejemplo a -5°C o superior) puede ser muy eficiente si se lleva a cabo bajo vado, por ejemplo, por debajo de 3 Torr (400 Pa), la cual es la presion de equilibrio de vapor de agua sobre el hielo a -5°C. A tales temperaturas, que son considerablemente mas altas que Tg', el material objetivo sera una "masa", un sistema en dos fases de cristales de hielo y una solucion concentrada que permanece entre los cristales de hielo.

Debido a que el potencial qrnmico del agua en la masa es igual al potencial qrnmico del hielo, la presion de equilibrio del vapor de agua por encima de la porcion lfquida en la masa es igual a la del hielo. Si la presion de vado esta por debajo de la presion de equilibrio, el lfquido en la masa se sobrecalienta y hierve. Por lo tanto, el sometimiento de una masa a un vado dara como resultado una vaporizacion rapida de agua desde la masa por sublimacion desde los cristales de hielo, poniendo en ebullicion la solucion no congelada entre los cristales de hielo, y por evaporacion desde la superficie de la masa simultaneamente.

La conservacion por vaporizacion (PBV) es un proceso de conservacion que comprende secado primario y secado en estabilidad. El secado primario se lleva a cabo por vaporizacion intensiva (sublimacion, ebullicion y evaporacion) del agua a temperaturas significativamente (aproximadamente 10 C o mas) superiores a Tg' a partir de un material parcialmente congelado y al mismo tiempo sobrecalentado (la presion de vapor esta por debajo de la presion de equilibrio de vapor de agua).

Durante la PBV, la ebullicion en el transcurso del secado primario no produce mucha dispersion puesto que la presion de equilibrio a temperaturas por debajo de cero encima de la masa es baja y los cristales de hielo sobre la superficie de la masa evitan o inhiben la dispersion. Tfpicamente, un material (por ejemplo, soluciones o suspensiones congeladas) que ha sido sometido a secado por PBV, se asemeja a una espuma cubierta parcialmente con una capa de una torta liofilizada delgada.

La prevencion de erupciones (dispersion) durante la etapa de ebullicion es importante para un secado a granel mas efectivo. Es particularmente importante cuando se utilizan bandejas Lyoguard u otras bolsas cubiertas por membranas permeables al agua. Si tiene lugar la dispersion, afecta negativamente el flujo de vapor a traves de la membrana puesto que la membrana esta cubierta con gotas del material dispersado sobre su superficie. La dispersion tambien afecta negativamente la apariencia del material despues del secado en los viales. La eliminacion de la dispersion tambien obvia la necesidad de un protocolo de secado complejo y no confiable "bidimensional" discutido mas arriba y simplifica la ejecucion de la etapa de secado.

Ademas, a diferencia de la conservacion por formacion de espuma (PFF), la conservacion por vaporizacion (PBV) puede ser muy efectiva para conservar materiales biologicos contenidos o incorporados con una formulacion en gel de alginato u otras formulaciones en gel. Un proceso PBV puede ser llevado a cabo secando partfculas de gel congeladas bajo vado a temperaturas pequenas negativas (en escala Celsius). Para tales sistemas en hidrogel, la vaporizacion comprende sublimacion simultanea de cristales de hielo, ebullicion de agua dentro de las microinclusiones no congeladas y evaporacion desde la superficie del gel.

La PBV es diferente de la liofilizacion porque la liofilizacion sugiere que la temperatura de procesamiento del producto este en o por debajo de Tg' (la cual tfpicamente esta por debajo de -25°C) durante el secado primario y porque la liofilizacion sugiere evitar el fenomeno de "colapso" durante el secado primario y el secundario. La VBP comprende el secado a temperaturas substancialmente superiores a Tg', esto es, superiores a-15°C, mejor superiores que -10°C, y aun mejor superiores a-5°C.

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Los metodos PFF divulgados en la Patente de los Estados Unidos No. 5,766,520 (Bronshtein) o en WO 96/040077 (Roser y Gibbon)) sugieren que la congelacion del material que se va a secar debena ser evitada durante el secado primario.

Secado en estabilidad

El secado en estabilidad difiere del secado secundario, el cual es parte del proceso de liofilizacion. Sin secado secundario, el material liofilizado colapsara. Por otro lado al final de la etapa de secado primaria de PBV el material es estable mecanicamente (es decir, no colapsa) a temperatura ambiente bajo vado. El secado en estabilidad se lleva (1) para incrementar adicionalmente la temperatura de transicion vftrea del material seco, (2) para hacerlo mecanicamente estable a temperaturas ambiente sin vado, y (3) para conservar la potencia (y, por lo tanto la eficiencia) del agente biologico durante un almacenamiento a largo plazo a temperaturas ambiente.

Para incrementar la Tg del material a por ejemplo a 37°C y por lo tanto asegurar la estabilizacion a esa temperatura, la etapa de secado en estabilidad debena llevarse a cabo a temperaturas significativamente mayores a 37°C durante muchas horas para eliminar el agua del interior del material ya secado.

El proceso de deshidratacion de los espedmenes biologicos a temperaturas elevadas puede ser muy nocivo para los materiales biologicos objetivos si la temperatura utilizada para secar es mayor que la temperatura de desnaturalizacion de la protema aplicable. Para proteger la muestra del dano que puede ser causado por temperaturas elevadas, el proceso de deshidratacion en estabilidad (esto es, secado en estabilidad) pueda requerir llevarse a cabo en etapas. La primera etapa (bien sea en aire o al vado) debe de llevarse a cabo a una temperatura de partida para asegurar la deshidratacion sin una perdida significativa de la viabilidad y potencia de los materiales biologicos. Despues de tal primera etapa de secado, el proceso de deshidratacion puede ser continuado en etapas subsecuentes secando a una temperatura gradualmente superior durante cada etapa subsecuente. Cada etapa permitira incrementos simultaneos en el grado de la deshidratacion alcanzable y la temperatura usada para secar durante la siguiente etapa.

Por ejemplo, en el caso de la conservacion de enzimas, se ha demostrado que despues de secar a temperatura ambiente la temperatura de secado puede ser incrementada hasta al menos 50 grados Celsius. sin una perdida de actividad enzimatica. El grado de deshidratacion obtenida o despues de secar a 50 grados Celsius permitira un incremento adicional en temperatura de secado, sin una perdida de actividad. Cualquier especimen dado que vaya a ser conservado se caracteriza por una temperatura maxima que puede soportar durante el proceso de conservacion.

Sin embargo, diversos protectores y Cosolutos protectores pueden proveer proteccion adicional a los materiales durante el proceso de secado.

Escalamiento del secado aseptico a granel

El proceso PBV es escalable porque el area de evaporacion del material se incrementa muchos cientos de veces durante la formacion de un especimen mecanicamente estable. Esta area de evaporacion se crea por la sublimacion de los cristales de hielo y la formacion de burbujas de vapor dentro del material. Es valido tanto para el secado de un hidrogel como para el secado de una solucion o suspension biologica.

El secado de una solucion o suspension por un proceso de VBP puede llevarse efectivamente en viales de 3 a 5 ml (llenado 0.5 ml), viales de 200 ml (llenados de 10-30 ml), contenedores de copa Lyoguard RTM cilmdricos pequenos, y bandejas Lyoguard RTM (250-300 ml llenos). Al final del secado primario por vaporizacion a partir del estado de masa, el material luce como una espuma seca parcialmente recubierta con una piel de torta liofilizada. Al final del secado primario, el material se hace mecanicamente estable si se almacena bajo vado. El area de alta evaporacion de este material permite entonces llevar a cabo efectivamente una etapa de secado en estabilidad bajo un vado por evaporacion a temperaturas elevadas.

El secado de los hidrogeles mas efectivo cuando las partfculas de hidrogel son pequenas (aproximadamente 1 mm, o menos). La razon para esto puede ser que el crecimiento de burbujas de vapor nucleadas dentro de las partfculas de gel es limitado por la alta viscosidad dentro del gel. Una etapa de secado PBV eficiente puede llevarse a cabo cuando el tamano de partfcula esta alrededor o por debajo de 0.2 mm. Asf, se ha demostrado que el secado por PBV primario de 1.5 kg de una enzima industrial encapsulada adentro de partfculas esfericas de gel de alginato por un diametro por debajo de 0.2 mm puede hacerse dentro de aproximadamente seis (6) horas. Para lograr esto, las partfculas de gel se colocan y se secan sobre una bandeja de acero abierta utilizada en liofilizacion convencional.

El proceso PBV es beneficioso en comparacion con el proceso de liofilizacion no solamente porque es mas rapido, sino tambien porque puede ser llevado a cabo de manera eficiente a presiones de vado mas altas. Por ejemplo a 5°C o mas el secado primario por PBV puede ser llevado a cabo efectivamente a varios Torrs (1 a 3) (133.3 a 400 Pa) en la camara. La presion de vapor durante la liofilizacion debena ser significativamente inferior a 0.476 Torrs (63.5 Pa), la cual es la presion de equilibrio por encima del hielo a temperaturas por debajo de -25°Celsius. El proceso es incluso mas eficiente si la presion esta por debajo de 0.1 Torr (13.3 Pa). Debido a esto, las bolsas

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utilizadas para el procesamiento de liofilizacion a granel debenan estar caracterizadas por un coeficiente muy alto de permeacion al vapor de agua.

Un ejemplo de tales bolsas permeables a gases es un producto denominado Lyoguard. RTM, el cual ha sido desarrollado por W. L. Gore para liofilizacion a granel. La bolsa de liofilizacion Lyoguard RTM es una bolsa flexible y sellable por calor. Uno de sus lados esta hecho de un plastico que no es permeable al vapor de agua. Su otro lado esta hecho de una membrana de Gore-Tex RTM. Esta membrana es politetrafluoroetileno (PTFE) expandido, que contiene nominalmente 0.2 micrones, de tamano de polo, hidrofobo y no permeable al agua lfquida, pero permeable al vapor de agua.

Debido a que la bolsa de Lyoguard puede pasar vapor de agua mientras esta evitando todavfa que un producto lfquido penetre desde la membrana y se fugue, provee una manera de proveer los procesos de productos que requieren alguna esterilidad. Tambien puede aplicarse una bandeja para productos de salud a animales, probioticos, alimentos, etcetera. Cualquier producto para el cual un contenedor incluido de procesamiento puede presentar una ventaja puede beneficiarse potencialmente del uso de las bolsas Lyoguard en la conservacion por el proceso de vaporizacion. Tales ventajas pueden ser derivadas donde la esterilidad, la facilidad de manejo, el aislamiento de los patogenos (por ejemplo, bacterias) del personal de manufactura o el control de contaminacion potenciados sean deseables.

Las bandejas Lyoguard pueden ser utilizadas en un equipo de procesamiento por PBV a escala industrial. Sin embargo, las bandejas Lyoguard RTM estan caracterizadas por varias desventajas que necesitan ser abordadas: (1) las bandejas Lyoguard RTM son costosas y (2) los poros de 0.2 micrones en membranas de politetrafluoroetileno expandido no aseguran una barrera adecuada para virus, toxinas y otros agentes qmmicos peligrosos.

Puesto que el proceso PBV (y el proceso PFF) pueden ser llevados a cabo a presiones que son considerablemente mas altas que las requeridas para la liofilizacion, las membranas de politetrafluoroetileno expandido costosas no son necesarias y pueden ser reemplazadas por membranas hechas de materiales menos costosos. Al mismo tiempo, tales membranas menos costosas pueden proveer mejores barreras para evitar virus, toxinas y otros agentes qmmicos peligrosos que puedan salir de los contenedores utilizados para el secado. Por ejemplo, las bolsas cubiertas con membranas Sartorius relativamente baratas utilizadas para ultrafiltracion pueden ser utilizadas de manera efectiva en el secado por PBV a escala industrial segun los metodos divulgados aqm. Otras membranas grado medico que pueden ser utilizadas para reemplazar las membranas de politetrafluoroetileno expandido son membranas respirables de polipropileno o poliuretano de 10 a 50 micrones tales como las pelfculas Medfilm® Medical manufacturadas por Mylan Technologies Inc. y diversas pelfculas de vendaje de herida Inspire (por ejemplo, Inspire 1101 (10 pm), 2202 (20 pm), etc.) hecha por InteliCoat Technologies. Debe entenderse que pueden utilizarse muchas otras membranas para implementar los metodos y disenos y aparatos divulgados aqm.

El uso de las membranas como se describio mas arriba hace que el metodo de secado propuesto sea un proceso aseptico de barrera. Una metodologfa para utilizar membranas respirables ha sido divulgada para la liofilizacion (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,309,649). Sin embargo, esa metodologfa no ha sido utilizada en la industria porque la permeacion de las membranas transpirables no porosas es demasiado lenta para la ejecucion de un liofilizado efectivo. Por lo tanto el rendimiento de secado por PBV o PFF en un contenedor (por ejemplo, una bolsa) cubierta con una membrana respirable (por ejemplo, polipropileno o poliuretano) sin poros presenta una oportunidad novedosa para una conservacion aseptica a escala industrial por secado. Puesto que tales membranas (las cuales estan caracterizadas por un espesor en el rango de 20-50 micrones) tienen resistencia mecanica limitada, el diseno puede ser reforzado utilizando un "sandwich" que contiene una membrana respirable entre dos membranas porosas de bajo coste (por ejemplo, membranas Sartorius) que estan caracterizadas por una permeabilidad al vapor de agua y por una resistencia mecanica mas alta.

Los contenedores (por ejemplo, bolsas) para secar segun los metodos de la invencion divulgados aqm requieren conectores adecuados que permitan: (1) introducir asepticamente un fluido, tal como una solucion biologica y/o una suspension viral o celular, en un contenedor sin colapsar el contenedor, (2) secar asepticamente el fluido, (3) almacenar asepticamente el especimen seco en el contenedor, y (4) transferir el producto seco terminado desde el contenedor a otros dispositivos para procesamiento corriente abajo (por ejemplo, molienda, mezcla, empaque, transporte, etcetera). Preferiblemente, los contenedores usados en los metodos novedosos divulgados podnan ser menos costoso que las bandejas Lyoguard costosas cubiertas con membranas costosas.

Equipo para produccion industrial de carga continua.

Ahora, se describira una realizacion de equipo para implementacion a escala industrial de los metodos novedosos para conservacion de materiales biologicos. Debe entenderse que las realizaciones descritas se presentan aqm solamente con propositos de ilustracion.

Hay varias barreras a traves de las cuales tiene que pasar el vapor de agua en su camino desde el especimen que va a ser secado hasta el condensador. Primero, el vapor pasa a la membrana que cubre el contenedor del especimen (por ejemplo, una bolsa o bandeja utilizada para secado a granel) o sale de los viales a traves de orificios

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bajo los tapones durante el secado de la dosis unitaria. En segundo lugar, el vapor debe viajar a traves de la camara de secado hasta el condensador.

Debido a que la liofilizacion se lleva a cabo a presiones muy bajas, el flujo de vapor entre las camaras de secado y el condensador se "atascan", limitando por lo tanto la velocidad del proceso de secado. Por esta razon, un liofilizador industrial tipico que puede condensar muchos litros de agua desde el material objeto en un tiempo dado se construye actualmente como un aparato de una camara en el cual el diametro del conector entre la camara y el condensador debe ser relativamente grande (tipicamente, aproximadamente 1 metro o mas). Esta es la razon por la cual los liofilizadores a vado a escala industrial no pueden ser construidos utilizando un diseno multiple, esto es, como un aparato con un cierto numero de camaras grandes.

A diferencia del equipo que utiliza un proceso de liofilizacion, el equipo que utiliza un equipo de proceso PBV hace posible construir un PBV basado en un multiple o un equipo de PFF basado en un multiple puesto que el secado primario para estos procesos puede ser llevado a cabo a presiones de vapor considerablemente mas altas (por ejemplo 1 a 3 Torrs (183.3 a 400 Pa)), permitiendo por lo tanto flujos considerablemente mas altos entre las camaras y el condensador. Por ejemplo, se ha establecido en la practica que el secado por PBV primario de 4.5 kg de una enzima industrial incorporada dentro de perlas de alginato dentro de una camara de vapor del liofilizador modificado Genesis (de Virtis Co) puede ser logrado al cabo de aproximadamente seis horas. El aparato usado en ese proceso tiene un conector entre la camara de secado y el condensador con un diametro de solo aproximadamente 0.1 metro.

De la misma forma se ha reportado (Patentes de los Estados Unidos No. 6,306,345 y 6,692,695) que un aparato que utiliza un proceso PFF es capaz de eliminar una cantidad similar de agua de una camara a un condensador a traves de un conector con un diametro similar al cabo de varias horas. Por lo tanto, el equipo que utiliza un proceso bien sea un PBV o PFF puede ser construido utilizando un diseno de aparato de secado multiple, aprovechando por lo tanto una produccion en carga continua (y asf, mas rapida y mas eficiente).

Un secador multiple puede ser disenado y construido como un condensador grande, que comunica a traves de una pluralidad de conectores con una pluralidad de camaras de secado. Los conectores pueden estar equipados opcionalmente con valvulas de vacfo (u otros dispositivos adecuados) para controlar o cerrar el flujo de aire o vapores de agua desde la camara hacia el condensador. El material que va a ser secado se coloca dentro de las camaras. Se provee una pluralidad de fuentes de calor para transportar calor a las camaras con el fin de compensar perdida de energfa debido a la evaporacion durante el proceso de secado. Adicionalmente, se provee un dispositivo de enfriamiento para permitir el enfriamiento del material antes de la etapa de secado hasta aproximadamente - 10°C. El dispositivo de enfriamiento puede utilizar cualquier diseno convencional conocido para equipos de refrigeracion, esto es, poder comprender un compresor y un intercambiador de calor.

Las camaras, por ejemplo, pueden ser cilmdricas como se divulga en la Patente de los Estados Unidos No. 6,692,695. Las camaras tambien pueden ser planas para acomodar una bandeja llena con viales, o bolsas como una bolsa Lyoguard.

El calor puede ser suministrado por conduccion, radiacion infrarroja, utilizando bajas frecuencias (50 Hz - 500 Hz), calentamiento electromagnetico por radio frecuencia (5 MHz - 60 MHz) del material en el estado de masa durante el estado primario o por cualquier otra fuente o metodo conocido de generacion y transferencia de calor.

El aparato tambien puede estar equipado con un sistema de control opcional que controlara los diversos procesos.

Por ejemplo, el sistema de control puede proveer control automatico u otro del calentamiento, flujos de gas, enfriamiento y otras funciones del aparato. Adicionalmente, el sistema de control podna ser programable. Tambien puede ser programado para definir ventajosamente el avance del proceso de secado en diversas camaras del aparato. Esta caractenstica permitira conectar una nueva camara al multiple y desconectar una camara cuando el proceso de secado haya terminado desde el secador dentro de periodos predeterminados de tiempo, por ejemplo, cada hora, o 30 minutos. Asf, si la capacidad de la camara es 5 Kg y se conecta a una nueva camara cada 30 minutos, el rendimiento de la produccion de una camara sera igual a aproximadamente 240 kg por dfa, esto es, 10 Kg por hora. Sera apreciado por los experimentados en el arte que tales rendimientos son considerablemente superiores a los que se obtienen por el equipo de liofilizacion convencional.

El diseno de equipo tipo multiple descrito mas arriba puede proveer una rata de produccion que esta limitada no solamente por la capacidad del condensador. Si en lugar de utilizar un dispositivo de refrigeracion mecanico, se utiliza nitrogeno lfquido para enfriar el condensador, pueden alcanzarse ratas de produccion considerablemente mas alta. Incluso de forma mas importante desde el punto de vista de produccion industrial, el equipo de secado multiple que utilizan bien sea un proceso PFF o PBV permite llevar a cabo producciones a alta velocidad en carga continua que, como se discutio mas arriba, son imposibles utilizando un proceso de liofilizacion.

Debe entenderse que hay una gran pluralidad de maneras de disenar y construir el equipo divulgado aqrn que seran consistentes con los principios novedosos de la invencion presente. Por ejemplo, el diseno mecanico de las camaras

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de secado, el diseno y configuracion de los conectores, la geometna del multiple, etc. pueden tomar muchas diferentes formas.

Calidad de la conservacion.

Se ha llevado a cabo un cierto numero de experimented de factibilidad que demuestran que los metodos divulgados aqu son funcionales y efectivos. Por ejemplo, una vacuna viral envuelta viva ha sido estabilizada sin perdida de actividad despues de secado siguiendo un metodo PBV y almacenamiento subsecuente a 40°C durante un mes. Ademas, se han conservado enzimas y protemas nucleantes en hielo utilizando el metodo PBV sin perdida de actividad. Despues de una conservacion por vaporizacion, el material puede ser molido o procesado de alguna otra manera para hacerlo adecuado para modos espedficos de administracion.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente para ilustrar, pero no para limitar la invencion reivindicada.

Ejemplo 1.

Conservacion de bacterias nucleantes en hielo utilizando un proceso de PFF

Para obtener bacterias nucleantes en hielo (INB), se mezclo una mezcla de conservacion de 180 g de suspension concentrada de bacterias nucleantes en hielo Pseudomonas Syringae ATCC 53543 con 108 g de sacarosa y 12 g de maltrina. La mezcla fue mezclada entonces hasta que los azucares se disolvieron por completo.

La mezcla resultante fue colocada en viales de suero de 100 ml. Asf, se colocaron 16.66 g de la mezcla dentro de cada vial. La mezcla en los viales fue secada entonces dentro de una maquina de liofilizacion "Ultra" hecha por Virtis Corporation y modificada para un mejor control de presion de vacte en la camara de secado. Los viales fueron colocados sobre la superficie de un estante de acero inoxidable dentro de la camara de secado. La temperatura del estante fue mantenida circulando anticongelante de etilenglicol/agua a temperatura controlada dentro de la estantena. Los espedmenes fueron conservados utilizando una conservacion mediante el proceso de formacion de espuma descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,766,520. No se observo congelacion en los viales durante la conservacion. Despues de que se formaron espumas secas estables dentro de los viales, las espumas fueron secadas a 50°C durante 24 horas bajo alto vacte. Despues de esto, los viales fueron cerrados con tapones de goma bajo vacte y sellados con sellos de aluminio. Se observo mucha dispersion sobre las paredes de los viales. La dispersion intensiva tuvo lugar durante la ebullicion del material dentro de los viales. Todas las paredes de vidrio de los viales fueron cubiertas con pequenas gotas (1 mm o menos de diametro) de la mezcla.

El material seco en los viales fue irradiado para esterilizar el material. La esterilidad fue probada sembrando bacterias reconstituidas sobre diferentes medios de agar. No se observo crecimiento bacteriano. La activacion de nucleacion de la INB conservada fue medida despues de la reconstitucion de la muestra con 100 ml de reconstitucion de fosfato de 0.01 M. La actividad de nucleacion en hielo fue medida como una concentracion de centros nucleantes de hielo que pueden nuclear en un cristal de hielo en una gota de regulador de10pl durante 5 minutos a -5 grados Celsius. Los resultados del ensayo muestran que mas del 50% de la actividad nucleante de hielo permanecio en las muestras conservadas incluso despues del tratamiento con radiacion. No se observo descenso en la actividad de la INB durante el almacenamiento subsecuente a temperatura ambiente y 37°C.

Ejemplo 2.

Conservacion de bacterias nucleantes de hielo utilizando un proceso PBV

Cinco viales con bacterias INB conservadas del ejemplo 1 fueron reconstituidos con 9 g de agua. Los viales fueron colocados en una maquina liofilizadora "Ultra" (hecha por Virtis Corporation). Antes de la aplicacion de vacte, la estantena fue preenfriada a -10°C y el material en el interior de los viales se congelo. Luego se aplico vacte simultaneamente con incrementos en la temperatura de la estantena hasta 35°C. La presion de vacte fue controlada de tal manera que la temperatura dentro de los viales se mantuvo entre -5°C y -10°C. Despues de aproximadamente 3 horas, el secado primario fue terminado sin dispersion visible del material sobre las paredes de los viales. El material seco era similar en espuma parcialmente cubierto con una piel de torta liofilizada delgada. Despues de que se formo un material seco estable dentro de los viales, el material fue secado a 50°C durante 24 horas bajo alto vacte. Despues de esto, los viales fueron cerrados con tapones de goma y sellados con sellos de aluminio. Los resultados del ensayo llevado a cabo despues de la reconstitucion de los viales con 100 ml de regulador de fosfato de 0.01 M no mostro descenso estadfsticamente significativo de la actividad despues del secado por PBV.

Ejemplo 3

Conservacion de solucion de isocitrato deshidrogenasa mediante un proceso PBV

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Una solucion acuosa al 50% de glicerol de Isocitrato deshidrogenasa de Sigma Chemical Co. fue dializado durante 5 horas en regulador TRIS HCl 00.1 M (pH 7.4). La actividad de la Isocitrato deshidrogenasa (IDH) en la solucion TRIS HCl 0.1 M despues de la dialisis fue de 23 ±1 unidad por ml. La IDH dializada fue mezclada 1:1 con solucion de conservacion que contema 30% de sacarosa y 15% de rafinosa, depositada en viales de 5 ml (0.5 ml por vial) y colocada sobre el estante del liofilizador "Genesis" (hecho por VirTis Corporation) modificado para proveer mejor control de la presion de vado en la camara de secado. El material fue congelado primero por enfriamiento del estante a -15°C. Luego se aplico un vado (1 Torr (133.3 Pa) simultaneamente con la elevacion de la temperatura del estante hasta 45°C.

Despues de aproximadamente 1 hora se incremento el vado (la presion se disminuyo por debajo de 0.2 Torrs (26.7 Pa)). Luego el material fue secado durante la noche y sellado con tapones de goma; se libero el vado y los viales fueron colocados a 37°C. Despues del secado, el material era similar a una espuma cubierta parcialmente con una piel de torta liofilizada. No se observo dispersion sobre las paredes de los viales. Despues de un mes de almacenamiento a 37°C, los espedmenes fueron reconstituidos con 0.375 ml de agua y se midio la actividad de IDH. Las muestras reconstituidas fueron probadas en cuanto a su actividad ensayando la capacidad de reducir NADP, medida espectrofotometricamente a 340 nm. La mezcla de reaccion inclrna: 2 ml de regulador TRIS HCl 0.1 M, pH 7.4; 10 |jl de 0.5% en peso de NADP +; 10 jl de MnSO4 10 Mn; 10 jl de1-isocitrato 50 Mn; y 10 jl de solucion de IDH reconstituida. La actividad fue 11 ± 0.5 unidades/ml, lo que significa que no hubo perdida significativa de la actividad durante el secado y durante el mes de almacenamiento subsecuente a 37°C.

Ejemplo 4

Conservacion por PBV de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

El Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 es la cepa tipo de esta especie comercialmente significativa. El L. acidophilus (probioticos) crece por fermentacion de lactosa, glucosa y una variedad de carbohidratos. El producto final de esta fermentacion es casi exclusivamente acido lactico.

Soluciones usadas:

1. Caldo Difco MRS que contiene 0.05% de cistema y 0.1% de Ca Cl12;

2. Agar MRS;

3. 10% de cistema, solucion salina regulada de fosfato de Dulbecco (DPBS);

4. Solucion de conservacion - 1(PS-1): 20% de sacarosa, 10% de MSG; 0.1% de INB reconstituida del experimento

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5. Solucion de Conservacion - 2(PS-2): 20% de sacarosa, 10% de MSG, 1% de alginato; 0.1% de INB reconstituida del experimento 1.

6. Solucion de EDTA-1 para reconstitucion del polvo de gel seco que comprende 45g de KH2PO4 0.2 M + 30g de K2HPO4 0.3 M + 75 g de agua + 15g de solucion estandar de EDTA de J.T. Baker.

Crecimiento de precultivo:

Etapas:

1. L. acidophilus, cepa 4356, obtenida de ATCC se utilizo para inocular 150 ml de caldo MRS + 0.05% de cistema.

2. El precultivo fue cultivado en un matraz de rotacion Belco en incubadora a 37°C con agitacion suave durante la noche. Al final la densidad optica A (600) en precultivo fue de 3.027 y pH fue de 4.03.

Fermentacion:

La fermentacion se llevo a cabo utilizando un fermentador New Brunswick Scientific Company BioFlo 2000 con una capacidad de trabajo de 2 L.

Etapas:

1. Se prepararon 2L de caldo MRS a partir de polvo Difco comercial y se sometieron a autoclave dentro del fermentador BioFlo 2000 durante 30 minutos (ciclo lfquido).

2. Se agregaron 10 ml de cistema al 10% en el fermentador para obtener la concentracion final de cistema = 0.05%

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3. Se inocularon 20 ml de precultivo en el fermentador.

4. El fermentador fue operado a 37°C, con agitacion a 50 RPM, sin regulacion de pH.

5. Densidad optica A (600) y pH despues de 9 horas de fermentacion permanecieron estables. A (600) = 2.9 - 3.0; pH = 4.08-4.00.

6. Despues de 10.5 horas de fermentacion el fermentador fue recolectado y el cultivo fue distribuido en tubos de centnfuga de 8 x 250 ml, 250 g de cultivo en cada tubo.

7. Los tubos fueron centrifugados a 4°C, a 3000 rpm, durante 15 minutos.

8. El sobrenadante fue separado por decantacion.

Preparacion de los espedmenes para secado Etapas:

1. Para preparar la mezcla de conservacion -1 (PM-1) las pellas en 7 tubos fueron reconstituidas con PS-1 (50g de PS-1 en cada tubo). Las mezclas fueron sometidas a vortex exhaustivamente y unidas entre si.

2. Para preparar la mezcla de conservacion -2 (PM-2) la pella en el octavo tubo remanente fue reconstituida con 50 g de PS-2. La mezcla fue sometida a vortex exhaustivamente.

3. Se distribuyo el PM-1 en 50 x 5ml viales de suero, 0.5 g por vial (formulacion 1).

4. El PM-1 fue depositado en cada uno de 5 contenedores pequenos cilmdricos Lyoguard (con tapa), 10 g portapa (formulacion 2).

5. Se colocaron 250g de PM-1 en una bandeja Lyoguard (Formulacion 3).

6. Se liberaron 10 g de PM-2 a traves de la aguja 20G en un bano que contema CaCl2 al 2% disuelto en 90% de PS- 1 para formar partmulas de gel similares a espaguetis. Las partmulas de gel fueron recolectadas utilizando un tamiz de 90 micrones. El lfquido por fuera de las partmulas de gel fue extrafdo utilizando una bomba de vado de laboratorio. Las partmulas fueron colocadas en contenedores cilmdricos pequenos de 200 ml Lyoguard (tapas). Se llenaron 5 tapas (formulacion 4).

7. La actividad de las bacterias en PM-1 y PM-2 antes del secado fue determinada sembrando 0.1 ml de PM diluido millones de veces sobre agar MRS + 0.05% de cistema.

8. Todas las placas fueron almacenadas bajo condicion anaerobica en incubadora a 37°C durante 48 horas.

Protocolo de secado.

1. La temperatura inicial del estante fue fijada a 0°C;

2. Los espedmenes se congelaron despues de que la temperatura dentro de los espedmenes disminuyo a aproximadamente -4°C como resultado de la evaporacion despues de la aplicacion de vado. La congelacion comenzo sobre la superficie de los espedmenes. Despues de esto la temperatura del estante fue incrementada a 35°C.

3. El secado primario fue llevado a cabo manteniendo la temperatura dentro de los espedmenes entre -5°C y -10°C para obtener un estado deshidratado mecanicamente estable. Despues de secar el material en los viales y en la bandeja Lyoguard tiene un aspecto espumoso con una piel de torta liofilizada por encima de la espuma. Las partmulas de alginato teman la apariencia de espagueti seco.

4. El secado en estabilidad fue llevado a cabo bajo vado completo primero a 25°C durante la noche. Luego la temperatura del estante fue elevada a 50°C durante 48 horas adicionales.

5. Despues del secado en viales de vidrio la masa de material seco en un vial fue de aproximadamente 0.15g.

6. Despues del secado, los materiales de las tapas y la bandeja fueron molidos en un cuarto seco (a 15% de humedad relativa) utilizando un homogeneizador de laboratorio VirTis. Los polvos molidos fueron depositados en viales de vidrio de 5ml (0.15 g por vial). Los viales fueron sellados con tapones de goma cubiertos con sellos de aluminio.

7. Para medir la actividad de 0.15 g de material seco en cada vial se reconstituyo con 4.85 ml de DPBS y luego se diluyo 100.000 veces adicionales antes de sembrar 0.1 ml sobre agar MRS + 0.05% de cistema.

8. Para medir la actividad de 0.15g de material seco que contema alginato se reconstituyo 4.85 ml de solucion de 5 EDTA-1 y luego se diluyo 100.000 veces adicionales antes de sembrar 0.1 ml sobre agar MRS + cistema al 0.05%.

Los resultados se muestran en la Tabla 2 a continuacion:

Tabla 2

Condiciones de almacenamiento

Numero de colonias

Form. 1

Form. 2 Form. 3 Form. 4

Justo antes del secado

PM-1 168±12 PM-1 170±16 PM-1 173±9 PM-2 106±10

Justo despues del secado

79±8 76±13 66±6 72±12

1 semana a RT

75±9 70±12 72±13 79±11

1 semana a 37°C

83±11 69±15 69±12 48±7

1 mes a RT

82±14 85±12 84±7 63±9

1 mes a 37°C

77±10 71±7 57±7 54±4

10 Referencias citadas

Documentos de Patentes de los Estados Unidos

4215153

Jul., 1980 Kai et al.

4396563

Aug., 1983 Gusmer.

4451569

May., 1984 Kobayashl et al.

4559298

Dec., 1985 Fahy.

4642903

Feb., 1987 Davies et al.

4891319

Jan., 1990 Roser.

5026566

Jun., 1991 Roser.

5030469

Jul., 1991 Mergelsberg.

5039540

Aug., 1991 Ecanow et al.

5079018

Jan., 1992 Ecanow et al.

5084101

Jan., 1992 Engles et al.

5149653

Sep., 1992 Roser.

5190987

Mar., 1993 Parkinson.

5200399

Apr., 1993 Wettlaufer et al.

5250429

o o CD CD CO Jolly et al.

5252620

O o CD CD CO Elliott et al.

5290582

Mar., 1994 Dressel et al.

5354558

o o CD CD Britton et al.

5425951

Jun., 1995 Goodrich, Jr., et al.

5439945

Aug., 1995 Smies.

5565318

o o CD CD O) Walker et al.

5597416

Jan., 1997 Fuisz et al.

5621094

Apr., 1997 Roser.

5648206

Jul., 1997 Goodrich, Jr. et al.

5762961

Jun., 1998 Roser et al.

5766520

Jun., 1998 Bronshtein.

Documentos de Patentes Extranjeros

959786

Sep., 1982 RU.

WO 9314191

Jul., 1993 WO.

WO 9640077

Dec., 1996 WO.

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Claims (49)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo escalable para conservar uno o mas materiales a una temperature de almacenamiento, que comprende:

   proveer uno o mas materiales seleccionados del grupo consistente de una solucion biologica, suspension biologica y un agente biologico incorporado en un hidrogel y uno o mas excipientes protectores para formar una primera composicion;

   llevar a cabo un secado primario por vaporizacion intensiva del agua a partir de una masa en dos fases que comprende una cantidad de hielo y una cantidad de solucion concentrada y dispuesta entre los cristales de hielo, en donde dicho secado primario se lleva a cabo a temperaturas que son al menos 10°C mayores que la temperatura a la cual dicha solucion concentrada solidifica durante el enfriamiento y dicho secado primario comprende simultaneamente aplicar vado y calor de tal forma que dicha solucion concentrada permanece en un estado lfquido, en el que el agua es eliminada de dicha masa en dos fases a traves de ebullicion simultanea de la solucion, sublimacion de los cristales de hielo, y evaporacion de las moleculas de agua de la superficie de la masa para formar una espuma seca; y

   llevar a cabo un secado en estabilidad que comprende calentar dicha espuma seca hasta una temperatura elevada.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que uno o mas materiales es una solucion o suspension biologica.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que uno o mas materiales comprende un tejido biologico delgado o un especimen multicelular pequeno.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde uno o mas materiales es conservado en viales de suero o en un contenedor para la conservacion de barrera a granel.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el hidrogel es un gel de alginato, gel de pectina, gel basado en gelatina, o gel basado en quitosano.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el hidrogel consiste de partfculas de gel pequenas, o es cortado a tamanos de partfculas pequenas de aproximadamente 1 mm o menos.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el hidrogel es colocado en un contenedor cubierto con una membrana permeable al agua antes de llevar a cabo dicho secado primario.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el agente biologico es seleccionado del grupo consistente de peptidos, proternas, acidos nucleicos, anticuerpos, vacunas, bacterias, virus, liposomas, plaquetas y otros componentes sangurneos, y suspensiones celulares de mairnfero.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, en que la temperatura durante dicho secado primario es al menos 10°C superior que una temperatura de colapso y la temperatura a la cual la solucion concentrada solidifica completamente durante el enfriamiento y la presion de vado en la camara de secado esta por debajo de la presion de vapor de agua en equilibrio de tal manera que la primera composicion es sobrecalentada.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 8, en el que las vacunas son atenuadas comprendiendo las vacunas virales virus vivos seleccionados del grupo consistente de virus de la influenza, virus de la parainfluenza, AAV, adenovirus, virus sincicial respiratorio, virus del herpes simplex, citomegalovirus, virus de SARS, miembros de la familia de virus corona, matapneumovirus humano y virus de Epstein-Barr, sarampion, paperas, rubeola.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho secado en estabilidad se lleva a cabo a una temperatura por encima de 40°C.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho secado en estabilidad se lleva a cabo en etapas; como una primera etapa llevada a cabo a una temperatura de partida para asegurar la deshidratacion sin perdida de dicha viabilidad y potencia de los materiales biologicos y etapas subsecuentes en las cuales la deshidratacion se continua a una temperatura gradualmente mas alta durante cada etapa subsecuente.
13. 13. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de almacenamiento es 22°C.
14. 14. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de almacenamiento esta por encima de 40°C.
15. 15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de almacenamiento esta por encima de 50°C.

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16. 16. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de almacenamiento esta por encima de 70°C.
17. 17. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de almacenamiento esta por encima de 80°C.
18. 18. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado en estabilidad se lleva a cabo a una temperatura superior a la temperatura de almacenamiento en tanto llega a alcanzar estabilidad a la temperatura de almacenamiento.
19. 19. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que el secado en estabilidad se lleva a cabo a una temperatura superior a la temperatura de almacenamiento en tanto alcanza una temperatura de transicion vftrea (Tg) igual o mayor que la temperatura de almacenamiento.
20. 20. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que uno o mas materiales es una solucion biologica.
21. 21. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el uno o mas materiales es una suspension biologica, incluyendo una suspension viral, celular, liposomica y/o bacteriana de partfculas de gel pequenas.
22. 22. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que uno o mas materiales es congelado antes de que se aplique vacfo haciendo disminuir la temperatura de congelacion externa por debajo de 0°C.
23. 23. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que la temperatura de congelacion esta por encima de - 20°C.
24. 24. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que la temperatura de congelacion esta por encima de - 15°C
25. 25. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que la temperatura de congelacion esta por encima de - 10°C.
26. 26. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que la temperatura de congelacion esta por encima de - 5°C.
27. 27. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en la que la congelacion se lleva a cabo por enfriamiento evaporativo bajo un vacfo que mantiene la temperatura externa en o por encima de 0°C.
28. 28. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que el secado en estabilidad se lleva a cabo a una temperatura de secado en estabilidad entre 20°C y 40°C durante 1 a 12 horas.
29. 29. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que la etapa de secado en estabilidad se lleva a cabo a una temperatura de secado en estabilidad entre 20°C y 100°C durante 6 a 24 horas.
30. 30. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que los materiales comprenden soluciones y suspensiones de vacunas, componentes sangumeos (celulares y no celulares), suspension bacteriana (incluyendo probioticos), agentes terapeuticos o de diagnostico.
31. 31. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que subsecuente a dicho secado en estabilidad de la espuma seca es molida para incorporarla en aplicaciones para administracion por inhalacion, intranasal o intradermica.
32. 32. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que dicho uno o mas excipientes protectores comprende uno o mas de: un monosacarido o un derivado no reductor del mismo, alcohol azucar, oligosacaridos, aminoacidos, protectores polimericos, albumina, gelatina, protemas estables al calor, y protemas de suero, polaxomeros y/o moleculas anfifflicas.
33. 33. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en que una pequena cantidad de protemas nucleantes de hielo se agregan a la primera composicion para evitar un superenfriamiento inicial de la misma.
34. 34. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la temperatura de la solucion durante el secado primario esta por encima de -20°C.
35. 35. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de la solucion durante el secado primario esta por encima de -15°C.
36. 36. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperatura de la solucion durante el secado primario esta por encima de -10°C.

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37. 37. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la temperature de la solucion durante el secado primario esta por encima de -5°C.
38. 38. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado primario se lleva a cabo a hasta 400 Pa (3 Torrs) de presion de vado.
39. 39. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado primario se lleva a cabo a hasta 266.6 Pa (2 Torrs) de presion de vado.
40. 40. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado primario se lleva a cabo hasta a 133.3 Pa (1 Torr) de presion de vado.
41. 41. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado primario se lleva a cabo hasta a 66.7 Pa (0.5 Torr) de presion de vado.
42. 42. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dichos materiales incluyen objetos celulares que incluyen sangre y otras celulas animales, cargados con disacaridos, derivados no reductores de la glucosa, y/o aminoacidos utilizando metodos artificiales incluyendo poracion y electroporacion qrnmica.
43. 43. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 42 en el que dicho derivado no reductor de glucosa es arbutina o metillglucosido.
44. 44. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado primario por vaporizacion intensiva se lleva a cabo en contenedores cubiertos con una membrana de politetrafluoretileno expandido u otras membranas biocompatibles porosas que tienen alta permeabilidad al vapor de agua.
45. 45. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el secado primario por la vaporizacion intensiva se lleva a cabo en contenedores cubiertos con una membrana respirable no porosa que es permeable al agua y otras moleculas pequenas de vapor.
46. 46. El metodo de la reivindicacion 1, en el que un contenido de humedad de dicha espuma seca vana desde aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2%.
47. 47. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el contenido de humedad de dicha espuma seca vana desde aproximadamente 2% hasta aproximadamente 5%.
48. 48. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 llevado a cabo utilizando un aparato de secado al vado de una camara convencional o un secador multiple.
49. 49. El metodo de la reivindicacion 32, en la que el derivado no reductor de un monosacarido es metilglucosido.