ES2643712T3

ES2643712T3 - Procedimiento para la deconvolución de mezclas de sustancias que contienen ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2643712T3
Application number: ES15701486.1T
Authority: ES
Inventors: Yixin Zhang; Jana HERRMANN; Robert Wieduwild; Annett BERTHOLD
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2014-01-13
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-01-12
Also published as: DK3094745T3; EP3094745A1; JP2017505611A; US11473134B2; WO2015104411A1; EP3094745B1; CA2936133C; DE102014200446B3; CA2936133A1; JP6626448B2; US20160362736A1

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la deconvolucion de mezclas de sustancias que contienen acidos nucleicos

La invencion se refiere a un procedimiento para la deconvolucion de mezclas de sustancias que contienen acidos nucleicos con el uso de secuencias de acido nucleico diana generadas sinteticamente.

Los acidos nucleicos sirven en la naturaleza para la codificacion de informaciones geneticas. Los procedimientos para el reconocimiento e interpretacion de secuencias de acido nucleico, a partir de las cuales se forman acidos nucleicos, son por tanto de gran interes para muchos campos de investigacion. Con los procedimientos segun Maxam y Gilbert o segun Sanger, pudieron asentarse los fundamentos pioneros para la secuenciacion de acidos nucleicos. Tambien se han establecido ya procedimientos para la sintesis de secuencias nucleotidicas cortas (sintesis de oligonucleotidos) como, por ejemplo, el procedimiento de triester fosfito, y se cuentan en el estado de la tecnica. A causa de estas capacidades, se han desarrollado otros procedimientos que aprovechan las secuencias nucleotidicas, particularmente secuencias de ADN, como portadores de informacion. Una tecnologia que se sirva de moleculas de ADN para el almacenamiento de informaciones se denomina codigo de barras del ADN. El fin es a este respecto sintetizar secuencias de ADN cortas, los denominados codigos de barras de ADN, para asignar entonces a secuencias nucleotidicas conocidas (habitualmente mayores) o sustancias o para acoplar con la secuencia nucleotidica o sustancia que representan. La identificacion de las secuencias nucleotidicas o sustancias asi preparadas es entonces posible de modo sencillo mediante el codigo de barras de ADN respectivo, cuyas secuencias cortas se secuencian en menos tiempo y/o se amplifican con procedimientos correspondientes (PCR) y de este modo pueden enriquecerse. A causa de la amplificabilidad de las secuencias nucleotidicas, los procedimientos basados en acidos nucleicos se cuentan en el campo de la quimica analitica y bioquimica entre los procedimientos de deteccion mas sensibles.

Se encuentra un campo de aplicacion adicional en la investigacion quimica, biologica y medica. Un objetivo basico consiste aqui en el descubrimiento de estructuras moleculares con afinidades de union especificas por proteinas. Para ello, las colecciones de moleculas quimicas codificadas por ADN sirven como una herramienta eficaz para la localizacion de ligandos para proteinas farmaceuticamente relevantes. Asi, las moleculas codificadas por ADN pueden enriquecerse por ejemplo mediante una seleccion basada en la afinidad y a continuacion descodificarse a causa de su codificacion de ADN definida (codigo de barras de ADN). Habitualmente, se obtienen en tales experimentos de seleccion (cribados) mezclas de sustancias codificadas por ADN. Tales mezclas contienen habitualmente una pluralidad de sustancias codificadas por ADN.

A pesar de esto, por razones de costes en el analisis de mezclas de sustancias de los experimentos de seleccion, se ha renunciado ampliamente a etapas de aislamiento y purificacion. Los datos recogidos a este respecto se basan convenientemente en la suposicion de que las sustancias enriquecidas en codigos de barras de ADN se presentan en una de tales mezclas con una alta probabilidad y por consiguiente se secuencian tambien con una elevada probabilidad. Esta correlacion no se aplica sin embargo necesariamente. Asi, el resultado puede estar afectado por varios factores, como por ejemplo a causa de la transformacion de diferentes plasmidos en bacterias (en la preparacion para secuenciacion de Sanger) o mediante procesos de reasociacion y amplificacion con microestructuras/nanoestructuras (procedimientos de secuenciacion profunda). Esta circunstancia hace necesaria otra etapa de procedimiento prolongada en que debe comprobarse si en la sustancia presuntamente identificada se trata realmente de la sustancia enriquecida en la mezcla.

Respecto a la baja paralelizacion de los procedimientos de secuenciacion habituales (Maxam y Gilbert o procedimientos de didesoxi segun Sanger), es inevitable por tanto una costosa preparacion de muestra, particularmente en mezclas de sustancias que no presentan un enriquecimiento significativo de un acido nucleico o secuencia nucleotidica buscado. Ademas, los procedimientos de secuenciacion de nueva generacion, como por ejemplo la pirosecuenciacion, requieren tambien un aislamiento y purificacion de una mezcla de muestras antes de poder empezar la verdadera secuenciacion.

Faircloth, B.C. y Glenn, T.C. ("Large sets of edit-metric sequence identification tags to facilitate large-scale multiplexing of reads from massively parallel sequencing", disponible en Nature Precedings,

http://hdl.handle.net/10101/npre.2011.5672.1; S. 1-15, 2011), Krishnan, A.R. et al. ("Barcodes for DNA sequencing with guaranteed error correction capability", Electronic Letters, The Institution of Engineering and Technology, vol. 47, n° 4, S. 236-237, 2011), Bystrykh, L.V. et al. ("Generalized DNA barcode design based on hamming codes", Plos One, vol. 7, n° 1, e36852, 2013) divulgan respectivamente un procedimiento para la generacion y deconvolucion de secuencias nucleotidicas en el que, segun un algoritmo predeterminado, se generan secuencias nucleotidicas diana distintas entre si que se acoplan con una sustancia.

Por tanto, debe ser objetivo de la invencion proponer un procedimiento con el que puedan identificarse secuencias nucleotidicas individuales en mezclas de sustancias que contienen acidos nucleicos en un tiempo corto y economicamente.

Se consigue este objetivo mediante un procedimiento segun la reivindicacion 1. Las configuraciones y realizaciones

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adicionales ventajosas del procedimiento segun la invencion pueden concretarse con los rasgos designados en las reivindicaciones dependientes.

Segun la presente invencion, se propone para conseguir el objetivo un procedimiento para la deconvolucion de mezclas de sustancias que contienen acidos nucleicos en que, en una primera etapa, se generan a partir de varios nucleotidos (A, C, G, T/U), segun un algoritmo predeterminado, varias secuencias nucleotidicas diana (TNS) diferentes entre si (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) con posiciones de secuencia N0-Nn. En una etapa adicional, al menos una de las TNS generadas (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) se asigna respectivamente a al menos una sustancia o combinacion de sustancias y se acopla quimicamente con esta. Ademas, en el procedimiento segun la invencion se proporciona al menos una mezcla de sustancias para analizar con al menos dos TNS contenidas y/o sustancias acopladas a TNS diferentes entre si que se secuencian segun un procedimiento de secuenciacion, en el que simultaneamente se recogen todas las TNS contenidas en la mezcla de sustancias (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) u otros acidos nucleicos o secuencias nucleotidicas en un espectro de secuencia comun. Para facilitar la deconvolucion y por tanto para la identificacion de las TNS enriquecidas, los espectros de secuencia de una mezcla de sustancias deben restarse/sustraerse entre si antes y despues del experimento de seleccion.

Simultaneamente o a continuacion de ello, se deconvolucionan las secuencias superpuestas en el espectro de secuencia mediante cribado de las posiciones de secuencia N0-Nn segun el algoritmo predeterminado, y segun su asignacion, se identifican como una sustancia o combinacion de sustancias. A este respecto, puede plantearse por ejemplo asi que las posiciones de secuencia N0-Nn que presentan en el espectro de secuencia una intensidad de senal significativamente elevada de un nucleotido particular (A, C, G, T/U), se criben segun el algoritmo predeterminado.

La intensidad de senal de un nucleotido (A, C, G, T/U) en una posicion de secuencia N0-Nn corresponde a la frecuencia del nucleotido (A, C, G, T/U) en la posicion de secuencia N0-Nn contemplada. En la senal, puede tratarse preferiblemente de una senal luminosa, como por ejemplo fluorescencia o quimioluminiscencia excitada externamente. En consecuencia, el limite de deteccion para la deteccion de un nucleotido (A, C, G, T/U) depende del ruido de fondo o de la sensibilidad del procedimiento usado y/o del detector.

Se evalua como significativa una intensidad de senal de un nucleotido (A, C, G, T/U) cuando en una posicion de secuencia N0-Nn esta elevada frente a al menos un nucleotido, preferiblemente frente a dos nucleotidos, con especial preferencia frente a tres nucleotidos al menos un 5 %, preferiblemente al menos un 30 %. A este respecto, pueden presentarse tambien en una posicion de secuencia N0-Nn intensidades de senal significativamente elevadas para dos o tres nucleotidos (A, C, G, T/U).

El espectro de secuencia registrado en la secuenciacion deberia reflejar al menos las TNS para identificar de posiciones de secuencia N0-Nn. Es especialmente ventajoso cuando en las posiciones de secuencia respectivas en el espectro de secuencia puede representarse una frecuencia relativa de nucleotidos individuales (A, C, G, T/U). Tal distribucion de frecuencia puede determinarse mediante comparacion de las intensidades de senal de los nucleotidos individuales en las posiciones de secuencia respectivas. La determinacion de la frecuencia puede realizarse mediante al menos una TNS patron que se anade a la mezcla de sustancias para analizar a concentracion conocida, antes de realizar la etapa de secuenciacion.

Asi, puede llevarse a cabo la deconvolucion del espectro de secuencia adicionalmente o como alternativa tambien de modo que en el espectro de secuencia se sustraigan las intensidades de senal significativamente elevadas de nucleotidos individuales (A, C, G, T/U) por etapas, hasta alcanzar en cada posicion de secuencia N0-Nn como maximo un nucleotido (A, C, G, T/U) de intensidad de secuencia minima (legible), y los espectros de sustraccion obtenidos a este respecto, que presentan respectivamente al menos una secuencia o al menos segmentos de secuencia en las posiciones de secuencia N0-Nn , se criban segun el algoritmo predeterminado.

La ventaja esencial del procedimiento segun la invencion se basa en la aplicacion del algoritmo predeterminado, con cuya base pueden generarse una pluralidad de TNS con alto grado de diferencia. El alto grado de diferencia influye favorablemente particularmente en la identificacion de las TNS individuales, que puede realizarse de este modo con sensibilidad mas elevada. Asi, la identidad de una TNS o un candidato a TNS en consideracion puede establecerse ya mediante pocas posiciones de secuencia de una serie de nucleotidos cribadas por el algoritmo predeterminable. De esta manera, pueden deconvolucionarse tambien espectros de secuencia con secuencias individuales o fragmentos de secuencia superpuestos repetidos, en que segun el algoritmo predeterminado se criban preferiblemente las posiciones de secuencia N0-Nn con diferencia de secuencia conocida. La deconvolucion de una mezcla de sustancias que contiene acidos nucleicos puede realizarse por tanto respecto a una TNS para identificar sin etapas de amplificacion ni aislamiento.

Habitualmente, se realiza la descodificacion despues de experimentos de seleccion realizados mediante matrices de ADN y secuenciacion de alto rendimiento/secuenciacion profunda/secuenciacion de la nueva generacion. Esto es caro y complejo. Mediante el procedimiento segun la invencion, es posible deconvolucionar, despues de realizar experimentos de seleccion, una mezcla que contiene acidos nucleicos, como por ejemplo una mezcla de ADN, de modo rapido, economico y sencillo, por ejemplo mediante secuenciacion de Sanger.

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En la identificacion de TNS enriquecidas (iguales), es suficiente con cribar unicamente las posiciones de secuencia del espectro de secuencia que presenten una intensidad de senal significativamente elevada para nucleotidos individuales (A, C, G, T/U). Las TNS clarificadas sirven entonces como prueba de la presencia de la sustancia asignada respectivamente. Debe entenderse aqui por el termino sustancia preferiblemente moleculas, componentes moleculares y particularmente sus grupos funcionales y/o estructurales. Puede tratarse tambien en el termino sustancia, segun el tipo de aplicacion, de particulas de hollin, humo de tabaco, polucion, humo de aceite, cenizas volatiles, cemento en suspension, metal, oxido metalico, plastico, polen, bacterias o virus.

Se establece la ocupacion nucleotidica de los nucleotidos (A, C, G, T/U) en las posiciones de secuencia N0-Nn de una TNS para formar (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) mediante el algoritmo predeterminado. Para ello, se predetermina para cada posicion de secuencia N0-Nn una condicion que esta ligada a una ocupacion nucleotidica de al menos una posicion de secuencia adicional. Asi, puede plantearse por ejemplo en la formacion de la TNS segun el algoritmo que, para cada posicion de secuencia N0+i-Nn de una TNS para formar, se predetermine una limitacion referida a un nucleotido (A, C, G, T/U) de una posicion de secuencia precedente respectivamente para al menos un nucleotido (A, C, G, T/U).

Para una identificacion sencilla preferida de las TNS, es ventajoso cuando las TNS formadas se diferencian entre si en al menos dos posiciones de secuencia y/o mediante al menos una serie nucleotidica consistente en al menos 5 posiciones de secuencia. Apropiadamente, las TNS que presentan una diferencia de secuencia de al menos un 75 %, preferiblemente mas de un 80 %, con especial preferencia mas de un 90 %, deberian asignarse respectivamente a sustancias que presenten la mayor diferencia estructural y/o funcional entre si.

Preferiblemente, las TNS que representan respectivamente sustancias individuales deberian ser respectivamente de la misma longitud, es decir presentar respectivamente el mismo numero de posiciones de secuencia N0-Nn . Asi, puede simplificarse la identificacion ya solo con limitar la deconvolucion a una longitud de secuencia predeterminada. Esto posibilita tambien la comparacion directa en las posiciones de secuencia respectivas N0-Nn de TNS superpuestas. En este contexto, es ademas ventajoso cuando todas las TNS presentan un segmento de secuencia comun a causa del cual pueden identificarse como tales. Este segmento de secuencia deberia concretarse preferiblemente en la region de inicio o final de una TNS.

Ademas, las TNS formadas pueden presentar al menos un segmento de secuencia que codifique un grupo de sustancias, tamano de sustancia, coordenadas geograficas de una variedad de exposicion o una fecha. Las propiedades de las sustancias pueden codificarse tambien por la longitud de la TNS, es decir, por el numero de posiciones de secuencia. Las propiedades de las sustancias pueden codificarse tambien en forma de distintos sitios de union a cebador. Por ejemplo, una TNS puede codificar coordenadas geograficas. Con un segmento de secuencia adicional que funcione como sitio de union a cebador durante la secuenciacion, puede codificarse un grupo de sustancias. Por tanto, mediante el empleo de diferentes cebadores durante la reaccion de secuenciacion, puede establecerse la secuencia de la TNS respectiva y asi las coordenadas geograficas. Por medio del cebador utilizado en la secuenciacion respectivo, es conocido que grupo de sustratos contemplar/considerar en este caso. En la elaboracion de la secuencia de sitios de union a cebador, no se utiliza el algoritmo anteriormente descrito. En lugar de ello, esta secuencia deberia disenarse mediante parametros que permitan una union a cebador/secuenciacion exitosas. Estos pueden ser, por ejemplo, el contenido de G/C, la longitud de cebador y la temperatura de fusion del cebador.

Las sustancias combinadas, y particularmente aquellas sustancias que se combinan entre si como resultado de un experimento de seleccion o experimento de afinidad, pueden acoplarse quimicamente con las correspondientes TNS combinadas (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn). Adecuadamente, las TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) y/o segmentos de secuencia de

TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) pueden combinarse entre si.

A causa de la variedad de combinaciones de secuencia posibles, la formacion de las TNS segun el algoritmo predeterminado puede simularse in silico. A este respecto, pueden comprobarse las TNS formadas respecto a posibles colisiones con secuencias nucleotidicas ya conocidas.

La sintesis quimica de las TNS puede realizarse entonces preferiblemente segun el procedimiento de triester fosfito.

Ya que el numero de combinaciones de secuencia posibles se guia por el numero de posiciones de secuencia que estan disponibles, deberian formarse TNS con suficiente longitud, es decir suficiente numero de posiciones de secuencia N0-Nn. Por consiguiente, deberian formarse o sintetizarse TNS con una longitud de mas de 5 posiciones de secuencia.

En las TNS, puede tratarse de moleculas de ARN o ADN monocatenarias o bicatenarias, prefiriendose moleculas de ADN bicatenarias. El acoplamiento quimico de las TNS con las sustancias que representan puede realizarse preferiblemente mediante union covalente.

En el transcurso del procedimiento segun la invencion, puede disponerse al menos una etapa de procedimiento para la seleccion de al menos una TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) o al menos una sustancia acoplada a TNS. Asi, puede

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llevarse a cabo una primera etapa de seleccion, por ejemplo despues de la formacion/sintesis de las TNS, para retirar las TNS incorrectas. Puede realizarse una etapa de seleccion adicional despues del acoplamiento de las TNS con sus sustancias asignadas, de modo que se establezcan las sustancias acopladas incorrectamente y por tanto pueda evaluarse la calidad de la coleccion. A este respecto, puede plantearse respectivamente asi que los componentes para seleccionar (sustancia o TNS) que se encuentren en una fase movil liquida se unan a una fase estacionaria en la que se inmovilizan los correspondientes coparticipes de union o conjugados de los componentes para seleccionar. Asi, puede proporcionarse una fase estacionaria respectivamente a una mezcla de sustancias para analizar de una fase movil liquida y/o de una elucion liquida.

Como alternativa o adicionalmente, puede establecerse la proporcion de sustancias indeseadas o acopladas incorrectamente con TNS en una etapa de seleccion adicional. A este respecto, las sustancias indeseadas se llevan a una reaccion de degradacion mediante el empleo de un reactivo de terminacion que contiene el mismo grupo reactivo que los componentes de la sustancia de la etapa de reaccion precedente. Por tanto, el reactivo de terminacion puede reaccionar con moleculas precursoras todavia no reaccionadas y marcar estas, de modo que el reactivo de terminacion pueda designarse tambien como sustancia marcadora. Una sustancia marcadora puede presentar, por ejemplo para posibilitar el acoplamiento con una fase estacionaria, una secuencia de ADN o ADN, una molecula de biotina o estreptavidina/avidina y/ azida/alquino.

La mezcla de sustancias asi preparada puede asociarse entonces en forma de una fase movil con una fase estacionaria en la que se inmovilizan los correspondientes dominios de captura, conjugados, secuencias de ARN y/o ADN para acoplamiento de la sustancia marcadora, en la que pueden establecerse y/o cuantificarse las sustancias indeseadas unidas a la fase estacionaria. Como sistema marcador/de captura, se tienen en cuenta por ejemplo la reaccion de biotina-estreptavidina/avidina, ADN/ADN, ARN/ARN o azida-alquilo de Huisgen Klick.

Las etapas de seleccion descritas anteriormente pueden realizarse particularmente a continuacion de una primera secuenciacion de una mezcla de sustancias para analizar. Para ello, pueden retirarse ya en una primera etapa de secuenciacion las TNS o sustancias acopladas con TNS identificadas de la mezcla de sustancias para analizar. Ademas, puede conseguirse de este modo tambien un aislamiento de las TNS o sustancias acopladas con TNS. Con ello, pueden identificarse TNS adicionales mediante secuenciacion de nuevo de la mezcla de sustancias restante, que se presentan en una menor cantidad. Pueden disponerse por tanto una o varias etapas de seleccion para la seleccion de al menos una TNS o sustancia acoplada con TNS para la provision de la mezcla de sustancias para analizar.

Respecto al procedimiento de secuenciacion para usar, para la secuenciacion de una mezcla de sustancias para analizar, no se predeterminan limitaciones. Preferiblemente, la secuenciacion puede llevarse a cabo segun Sanger con el uso de didesoxinucleotidos marcados fluorescentemente, al menos una polimerasa y al menos un cebador que sea complementario de un segmento de secuencia de al menos una TNS.

A continuacion, se ilustra detalladamente el procedimiento segun la invencion mediante ejemplos de realizacion y aplicacion en relacion con las Figuras.

A este respecto, se muestra:

Figura 1: un ejemplo de un algoritmo para la generacion in silico de secuencias nucleotidicas diana (TNS) diferentes. Figura 2: un ejemplo de una etapa de seleccion para la seleccion de TNS.

Figura 3: un ejemplo de una deconvolucion de un espectro de secuencia segun el algoritmo predeterminado.

Figura 4a/b: un diagrama esquematico de un ejemplo de aplicacion del procedimiento segun la invencion.

En la Figura 1, se representa la generacion de diferentes secuencias nucleotidicas diana (TNS) en un ejemplo. La generacion de las TNS se realiza mediante el algoritmo X in silico. En primer lugar, se establece la longitud de las TNS para formar mediante el requisito de posiciones de secuencia. En el presente caso, la longitud de secuencia asciende a 14 posiciones N0-N13, en el que para cada posicion de secuencia N0-N13 se predetermina una operacion z, a, d o e. En la posicion de secuencia N0, la operacion z no predetermina ninguna limitacion para un nucleotido A, C, G, T. Para cada posicion de secuencia adicional N1-N13, se predetermina respectivamente segun las operaciones a, d o e una limitacion referida a la posicion de secuencia precedente de un nucleotido A, C, G, T respectivamente para dos nucleotidos A, C, G o T. El algoritmo X presenta la forma z-a-a-d-d-e-a-a-d-d-e-a-d-e. La eleccion de la TNS asi formada puede extraerse de la tabla de codigos adjunta en el anexo (veanse las pag. 15 a 18 de la descripcion) Como puede deducirse de la Tabla con la referencia 10 en la Figura 1, un par cualquiera de TNS seleccionadas (generadas) presenta al menos seis diferencias de secuencia.

No representado, existe la posibilidad de una ampliacion/realizacion adicional de las TNS asi formadas con posiciones de secuencia adicionales mediante las que pueden depositarse (codificarse) informaciones adicionales. Asi, pueden disponerse posiciones de secuencia o segmentos de secuencia adicionales que codifican

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respectivamente propiedades de las sustancias para acoplar, como por ejemplo un grupo de sustancias, tamano de sustancia, coordenadas geograficas de una variedad de exposicion o una fecha. Ademas, pueden disponerse tambien posiciones de secuencia complementarias mediante las cuales pueden identificarse las TNS como tales. A este respecto, las TNS de igual genero deberian presentar iguales longitudes de secuencia.

A continuacion de ello, se lleva a cabo una sintesis in vitro de las TNS generadas in silico mediante el procedimiento de triester fosfito.

El acoplamiento quimico de las TNS sintetizadas con la sustancia que representan puede realizarse mediante la formacion de un enlace amida con la ayuda de reactivos de acoplamiento peptidico.

La Fig. 2 muestra un ejemplo de una etapa de seleccion en el que en una primera secuenciacion se pueden identificar las TNS como enriquecidas y retirarse de una mezcla. De este modo, se posibilita poder identificar TNS adicionales mediante secuenciacion que, a causa de su menor numero en la mezcla de sustancias (y por tanto menor intensidad de senal asociada) en la primera secuenciacion, se ocultan por la intensidad de senal de las TNS de aparicion frecuente. De este modo, pueden identificarse no solo las TNS mas enriquecidas sino tambien otras enriquecidas en menor medida.

En el presente ejemplo, se representa en el lado izquierdo una mezcla de TNS con 11 posiciones, en el que cada posicion representa una TNS combinada. Las mayusculas representan a este respecto respectivamente una TNS individual. Se caracteriza con la referencia 20 una fase estacionaria con la que se inmovilizan las secuencias nucleotidicas A1', A3', A5', B3', B4' y B9' que son complementarias frente a las TnS A1, A3, A5, B3, B4 y B9 y por tanto posibilitan la conexion de las TNS citadas. Si se asocia la mezcla de TNS que contiene las posiciones 1 a 11 como fase movil con la fase estacionaria 20, se unen las posiciones 1 a 9 con la fase estacionaria 20 y se retiran de la fase movil. La mezcla de TNS procedente de este experimento de seleccion (lado derecho) contiene entonces solo las TNS de posiciones 10 y 11.

La Figura 3 muestra un esquema de flujo de un ejemplo de deconvolucion de un espectro de secuencia 31, que se extrae de una secuenciacion de una mezcla de sustancias que contienen acidos nucleicos. En el presente ejemplo, se llevo a cabo la secuenciacion segun Sanger con el uso de didesoxinucleotidos marcados fluorescentemente. A causa de la intensidad de senal de los didesoxinucleotidos, podia determinarse en las posiciones de secuencia respectivas N0-N13 en el espectro de secuencia 31, la frecuencia relativa de los nucleotidos A, G, C, T, que se representa en forma de barras. A causa de la distribucion de frecuencia de los nucleotidos respectivos en las posiciones de secuencia N0-N13, pueden deducirse a partir del espectro de secuencia 31 distintos candidatos a TNS que se tienen en cuenta para una identificacion. En el presente ejemplo, se establecieron los candidatos a TNS 321 y 322. Estos se criban mediante el algoritmo X predeterminado con la serie de operaciones z-a-a-d-d-e-a-a-d-d-e-a- d-e y se deconvolucionan. A causa de la deconvolucion, pueden identificarse dos TNS 331 y 332, en los que la TNS 331 representa la sustancia i y la TNS 332 la sustancia ii.

La Fig. 4a muestra un diagrama esquematico de sustancias acopladas a una TNS de ejemplo de aplicacion. Segun el ejemplo de realizacion, deberia entenderse la propagacion de particulas acopladas con TNS o marcadas con TNS en el ambiente. Para ello, se exponen las particulas acopladas con TNS-A1B3 en la posicion X, las particulas con acoplamiento con TNS A3B4 en la posicion Y y las particulas con acoplamiento con TNS A8B7 en la posicion Z. En las particulas, se trata por ejemplo de particulas nocivas con un tamano en el intervalo de 10 nm a 100 pm. Las respectivas posiciones X, Y o Z en las que se exponen las particulas estan codificadas en un segmento de secuencia separado de la TNS respectiva. Ademas, las TNS pueden presentar tambien un segmento de secuencia separado que codifica la fecha de exposicion (en la posicion X, Y, Z respectiva) de las particulas. Puede realizarse una extraccion de muestras por ejemplo en una posicion L. Esto puede concretarse por ejemplo con un correspondiente filtro de aire. Las particulas recogidas con el filtro de aire se dispersan entonces en un liquido. La mezcla de sustancias que contienen acidos nucleicos asi proporcionada puede someterse a continuacion a una secuenciacion. A este respecto, puede ser ventajoso someter la mezcla de sustancias que contienen acidos nucleicos para analizar antes de la secuenciacion a una amplificacion mediante PCR, en la que se utilizan los correspondientes cebadores de TNS A1B3, TNS A3B4 y TNS A8B7. De esta manera, puede establecerse la presencia de particulas marcadas con TNS A1B3, TNS A3B4 y TNS A8B7 en la posicion L, con lo que puede entenderse una migracion de las particulas de las posiciones X, Y y Z.

La Figura 4b muestra un ejemplo de un esquema segun el cual pueden exponerse y atraparse las particulas marcadas con TNS. Para ello, se representa una superficie A formada por 16 cuadrados pequenos 1.1-1.16. La longitud del borde de los cuadrados pequenos asciende, p.ej., respectivamente a 40 km, de modo que una superficie A presenta en este caso una extension de 1600 km2. Los puntos representados con forma redonda en las esquinas de los cuadrados pequenos 1.1-1.16 caracterizan respectivamente una ubicacion en la que se exponen particulas marcadas con TNS, en la que preferiblemente se dispone respectivamente centrada en los cuadrados pequenos una superficie de al menos 16 m2 para atrapar o detectar las particulas marcadas con TNS.

Con las particulas marcadas con TNS recogidas, puede conseguirse una asignacion local de la posicion respectiva en la que se localizan y analizan una o varias particulas marcadas con TNS. Esto es particularmente ventajoso

cuando debe recogerse una distribucion local determinada de particulas marcadas con TNS que se desplazan por influencias externas de una posicion a otras posiciones.

El ejemplo de aplicacion descrito es tambien adaptable a sistemas acuaticos.

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Se encuentra un campo de aplicacion adicional en la investigacion quimica, biologica y medica. Asi, pueden utilizarse por ejemplo TNS para identificar estructuras moleculares con afinidades de union especifica por proteinas. Ademas, pueden utilizarse tambien colecciones de moleculas quimicas codificadas por TNS o ADN como herramienta eficaz para la localizacion de ligandos para proteinas farmaceuticamente relevantes. Asi, pueden 10 enriquecerse moleculas codificadas por TNS o ADN por ejemplo mediante una seleccion basada en afinidad y a continuacion decodificarse a causa de su codificacion por TNS o ADN definida. Las mezclas de sustancias codificadas por TNS o ADN obtenidas en tales experimentos de seleccion pueden deconvolucionarse entonces segun el procedimiento segun la invencion de manera sencilla, sin requerir un aislamiento/purificacion o amplificacion de la mezcla.

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Anexo

Numero (=SEQ ID NO): Codigo de TNS N° de ronda

1: GCGAT GAGACAT GT 0

2: AT CAT AT ACGT AT A 1

3: TAGACATCATAGAG 2

4: TATGTGCTCGCGAG 3

5: AGATGCTATGTCAC 4

6: TCTCGTAGTCTCGT 5

7: TCGATGATCACTCT 6

8: GCTCAGCTGTGCAG 7

9: CTCGAGATCGCTGC 8

10: CGCACTAGATGCGT 9

11: GCTCGCGCGAGCAC 10

12: AGCGTGAGTCTCAG 11

13: CTCGACTATCAGAC 12

14: CGATGCTCATAGTA
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15: ATCGACGCATGCAG
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16: GAGTGCGATCAGAG 17

17: CTACACTCACTACA 18

18: TATCGTCGATGATA 20

19: TCTGTATATCTCAC 21

20: GATCACTCGTATCA 23

21: AGCATAGCGACGTA 24

22: TCTGAGCGATAGTA 25

23: ATATCTCTGACGTG 27

24: GAGTCTAGACTCAG 29

25: GAGTGTAGTGTACA 30

26: GCTGTGCTGAGATA 31

27: CTACGTATGTATCT 32

28: TATCGCGACGTATA 34

29: GAGACTCGTGCGTG 36

30: TATCGCTCACAGAC 37

Numero (=SEQ ID NO): Codigo de TNS N° de ronda

31: TATCGCTACAGCGT 40

32: CTCACTCTCAGCAG 41

33: GATCAGCTCACTGT 47

34: AGCGTGCTGTATGT 50

35: CGACGCGCGACGAG 52

36: TCGATAGACAGATG 53

37: GCGATGCTGTATCA 54

38: CTACGCGATGCTGC 55

39: CGCACAGCACAGTG 56

40: GCGTCAGATGCTCA 57

41: TAGTCTCGATGCGC 59

42: ATCACAGCATGACA 60

43: CTATGCTACACGAC 68

44: CGCACAGATGTCGT 72

45: AGACAGATGAGACT 74

46: ATATCATCGTATGT 79

47: GATGTAGCACTACT 84

48: TATGTATCGACTCT 88

49: CGACAGAGACAGTG 92

50: CTCGTAGATCATGT 99

51: CGACGTCTCGTCGT 100

52: TAGTGCGACGCTCT 105

53: GAGACAGACACTGT 108

54: GCGACTCGATGACA 109

55: AGACACGCGTGATA 114

56: ATCATATCACTCAG 118

57: GATGTATCATATGC 122

58: GCTCGTCGTCAGTA 124

59: CGATGTATCACGTA 139

60: CTATGCTCGTGACT 140

61: TATGTGAGACTATA 147

62: CTCGTGAGTCAGTA 148

63: TCTGACGCGAGACT 155

64: TAGTCTATGACTGC 161

65: CGCGACTATGCTGT 163

66: GATCGTATGTGCGC 167

67: AGATCATACAGACT 168

68: TATGAGCGTGCTGC 170

69: TCGATATATGCTGC 177

70: AGCACTCTCGTATG 185

71: CTATCATATGCGTA 187

Numero (=SEQ ID NO): Codigo de TNS N° de ronda

72: TCGTGTCGTGCTGT 197

73: GCTGTAGCGTAGTG 198

74: TCTGTGCGTGTACT 202

75: GAGAT ATCGTGAT A 209

76: TCGACTAGACAGTA 235

77: GCGACATATCAGTG 239

78: CGCACTATGTAGTA 245

79: AGCGACGACAGCGT 261

80: CTCATATCGTGCGC 263

81: GAGACTATGAGATG 270

82: GCTCGCTACGTCAG 295

83: CGCACTCGTGCTCA 299

84: GCGTGCTACAGACA 311

85: AGCATGCTCACGAC 322

86: TCGTCAGACACGAC 325

87: AGCGTAGCATAGAC 330

88: TATCAGAGATGCGT 342

89: TCGTCTATCGTCGT 344

90: CTCGACGACACGTA 360

91: AGACACGACGCTCA 362

92: CTATCTCGTCTCAC 368

93: TCTCACTATCATGC 380

94: GCTGAGATCACGAC 381

95: ATATGCGATCATCT 386

96: GCGTGCTCATATCT 401

97: TCTCGTATCGCGTG 405

98: AGATCTCTGTGACA 414

99: GAGATATACGCGAG 424

100: ATCGTGAGATGATG 437

101: TCTCACGCACTATG 440

102: GCGATGCGTGTCAC 445

103: TCGTGTCGATAGAG 458

104: GATCACTATGCGTA 484

105: CTACGTAGTCTATA 535

106: GAGTGCGCACTCGT 541

107: TCGTGCTATGTATG 542

108: AGATGTAGACTACT 581

109: ATACAGAGATATGC 594

110: CTACAGCTCGTATA 596

111: CGACGTCTGAGATG 608

112: CTCGAGCGATGCGC 625

Numero (=SEQ ID NO)

113

114

115

116

117

118

119

120 121 122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

Codigo de TNS

TAGATAGATCATCA

AGCATGCGACTACA

CGCGAGCTGACTCA

GATGTAGACGTCGC

CGCAT GAT CAGAT G

GCGTCATCGAGCGC

CTACAGCGTCATCT

ATACGCGCACTCAC

CTATGTATGAGCAC

CTCGTGATGACGAG

CGCGACGCACATGC

CTATCAGACGTCAG

ATACAGAGTGCGAG

ATACGTATCACTGC

CGACAGCTCAGCAC

CTATCAGCGAGATG

ATCACTCGATAGTG

CGCATATCATATCT

CGCGAGAGTGTACA

GAGATGCTGAGCGC

AGCATGAGTGCTGT

CGCGTAGCGAGCAG

AGATCATCATGCAC

TCTGTATACACGTA

TCTGTATCATGACA

TCGTCTCTCAGATA

ATACACGATGTATG

ATACGCTCGACTCA

TCTGACGATGCGAG

GATGAGCGTCAGAG

GAGTCTCGTCATCT

ATACGTAGATGCAG

GATCACGATCTCAC

ATCACTAGTCATGC

TAGTGCGCGTGATG

GCTCAGATCGTACT

GCTGACTACACTCT

AGCGAGAGACATCT

TCTCGTCTGACTCT

GATGACGCACAGTA

ATCACAGATGCGAC

N° de ronda 664 669 680 756 779 790 817 893 899 951 997 1049 1112 1251 1311 1355 1376 1399 1525 1568 1589 1778 1890 1909 2169 2196 2609 2833 2857 2910 3395 3415 3428 3651 3680 4170 4243 4391 4568 5440 5554

Numero (=SEQ ID NO): Codigo de TNS N° de ronda

154: GCGACTCTCGCTGC 5938

155: CGACAGCGAT GACA 7003

156: AGATCAGCACATCA 7229

157: GCT GT GAGAT GCAC 7364

158: GCGAT AGCAT GCAG 8343

159: GATCGTAGTGCGAC 8520

160: CTCACATACGCTCT 8522

161: CGATGTCGATATGT 8744

162: ATCACTATGACTCT 8809

163: TCGATAGCGTATGT 8963

164: ATACACTCGTAGAG 9308

165: GCGTGTATGTGACT 9847

166: TATCAGATGACGTA 10090

167: GAGACTCTGTAGAC 10629

168: GCGTGCGCGACGTA 10690

169: TAGTCAGATCTCGC 11570

170: AGACAGCGACTCGT 12132

171: CGATCAGATCAGAC 12906

172: GATGACGACAGATG 13442

173: AGCGAGATGTGCAC 13445

174: GCGTCAGCACTATA 13898

175: AGCGTATACACTGC 14072

176: CTCATGCTGTGACT 15131

177: GAGATGATCGTATA 15693

178: TATGACTATCTACT 16035

179: TAGATGATGTAGTG 17311

180: TCGACATCACTCGT 19265

181: GCTGACTCACTCGC 19811

182: GAGTGTCTCGTCAC 19988

183: CGACACTCGAGCGT 21276

184: TATCACGCGACTGC 21882

185: AGATGTATGTAGAG 21955

186: AGACGTCGACAGAC 22214

187: ATCGAGCTCGTCAG 22328

188: TCTGAGATGTATGC 25668

189: AGCGACTCGACGAC 25671

190: GAGACATATGTACT 31084

191: GCTGTGAGTGCGTG 34906

192: CTCATGCGTCTCGT 34923

193: TATGACTCGTGCAC 42593

194: AGACGCTCACATGT 43050

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Numero (=SEQ ID NO)

Codigo de TNS CGCGTAGATGCGTG

N° de ronda

195

196

197

198

TAGATGCGACAGAC

CGATGTCGTGCGAG

CTACACGACAGACT

48624

50109

66603

93912

Listado de secuencias

<110> Universidad Tecnica de Dresde

<120> Procedimiento para la deconvolucion de mezclas de sustancias que contienen acidos nucleicos <130> 1

<150> DE 10 2014 200 446.2 <151 >

<160> 198

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 1

gcgatgagac atgt 14

<210>2 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 2

atcatatacg tata 14

<210>3 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 3

tagacatcat agag 14

<210>4 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 4

tatgtgctcg cgag 14

<210>5 <211 > 14 <212> ADN <213> -

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

agatgctatg tcac 14

<210>6 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 6

tctcgtagtc tcgt 14

<210>7 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 7

tcgatgatca ctct 14

<210>8 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 8

gctcagctgt gcag 14

<210>9 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 9

ctcgagatcg ctgc 14

<210> 10 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 10

cgcactagat gcgt 14

<210> 11 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 11

gctcgcgcga gcac 14

<210> 12 <211 > 14 <212> ADN <213> -

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 13

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 13

ctcgactatc agac 14

<210>: 14

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 14

cgatgctcat agta 14

<210>: 15

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 15

atcgacgcat gcag 14

<210>: 16

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 16

gagtgcgatc agag 14

A O CNJ V: 17

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 17

ctacactcac taca 14

<210>: 18

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 18

tatcgtcgat gata 14

<210>: 19

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 19

tctgtatatc tcac 14

<210>: 20

<211 >: 14

<212>: ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 20 gatcactcgt atca 14

<210>21 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 21

agcatagcga cgta 14

<210> 22 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 22 tctgagcgat agta 14

<210> 23 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 23 atatctctga cgtg 14

<210> 24 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 24

gagtctagac tcag 14

<210> 25 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 25 gagtgtagtg taca 14

<210> 26 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 26 gctgtgctga gata 14

A O CNJ V: 27

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ctacgtatgt atct 14

<210> 28 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 28 tatcgcgacg tata 14

<210> 29 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 29

gagactcgtg cgtg 14

<210> 30 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 30 tatcgctcac agac 14

<210>31 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 31

tatcgctaca gcgt 14

<210> 32 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 32 ctcactctca gcag 14

<210> 33 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 33 gatcagctca ctgt 14

<210> 34 <211> 14 <212> ADN <213> -

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 35

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 35

cgacgcgcga cgag 14

<210> 36 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 36

tcgatagaca gatg 14

<210> 37 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 37 gcgatgctgt atca 14

<210> 38 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 38 ctacgcgatg ctgc 14

<210> 39 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 39

cgcacagcac agtg 14

<210> 40 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 40

gcgtcagatg ctca 14

<210>41 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 41

tagtctcgat gcgc 14

<210> 42 <211> 14 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> - <400> 42

atcacagcat gaca 14

<210> 43 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 43 ctatgctaca cgac 14

<210> 44 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 44

cgcacagatg tcgt 14

<210> 45 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 45

agacagatga gact 14

<210> 46 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 46 atatcatcgt atgt 14

<210> 47 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 47 gatgtagcac tact 14

<210> 48 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 48 tatgtatcga ctct 14

A O CNJ V: 49

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 49

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cgacagagac agtg 14

<210> 50 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 50 ctcgtagatc atgt 14

<210>51 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 51

cgacgtctcg tcgt 14

<210> 52 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 52 tagtgcgacg ctct 14

<210> 53 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 53

gagacagaca ctgt 14

<210> 54 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 54

gcgactcgat gaca 14

<210> 55 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 55

agacacgcgt gata 14

<210> 56 <211> 14 <212> ADN <213> -

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 57

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 57

gatgtatcat atgc 14

<210>: 58

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 58

gctcgtcgtc agta 14

<210>: 59

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 59

cgatgtatca cgta 14

<210>: 60

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 60

ctatgctcgt gact 14

<210>: 61

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 61

tatgtgagac tata 14

<210>: 62

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 62

ctcgtgagtc agta 14

<210>: 63

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 63

tctgacgcga gact 14

<210>: 64

<211 >: 14

<212>: ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 64 tagtctatga ctgc 14

<210> 65 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 65 cgcgactatg ctgt 14

<210> 66 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 66 gatcgtatgt gcgc 14

<210> 67 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 67

agatcataca gact 14

<210> 68 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 68 tatgagcgtg ctgc 14

<210> 69 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 69 tcgatatatg ctgc 14

<210> 70 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 70 agcactctcg tatg 14

A O CNJ V: 71

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 71

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ctatcatatg cgta 14

<210> 72 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 72 tcgtgtcgtg ctgt 14

<210> 73 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 73 gctgtagcgt agtg 14

<210> 74 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 74 tctgtgcgtg tact 14

<210> 75 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 75 gagatatcgt gata 14

<210> 76 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 76

tcgactagac agta 14

<210> 77 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 77

gcgacatatc agtg 14

<210> 78 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 78 cgcactatgt agta 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 79

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 79

agcgacgaca gcgt 14

<210> 80 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 80 ctcatatcgt gcgc 14

<210>81 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 81

gagactatga gatg 14

<210> 82 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 82 gctcgctacg tcag 14

<210> 83 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 83 cgcactcgtg ctca 14

<210> 84 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 84

gcgtgctaca gaca 14

<210> 85 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 85

agcatgctca cgac 14

<210> 86 <211> 14 <212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> - <400> 86

tcgtcagaca cgac 14

<210> 87 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 87

agcgtagcat agac 14

<210> 88 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 88 tatcagagat gcgt 14

<210> 89 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 89 tcgtctatcg tcgt 14

<210> 90 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 90

ctcgacgaca cgta 14

<210>91 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 91

agacacgacg ctca 14

<210> 92 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 92 ctatctcgtc tcac 14

A O CNJ V: 93

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 93

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tctcactatc atgc 14

<210> 94 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 94

gctgagatca cgac 14

<210> 95 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 95 atatgcgatc atct 14

<210> 96 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 96 gcgtgctcat atct 14

<210> 97 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 97 tctcgtatcg cgtg 14

<210> 98 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 98 agatctctgt gaca 14

<210> 99 <211> 14 <212> ADN <213> -

<400> 99

gagatatacg cgag 14

<210> 100 <211 > 14 <212> ADN <213> -

<400> 100 atcgtgagat gatg 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 101

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 101

tctcacgcac tatg 14

<210>: 102

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 102

gcgatgcgtg tcac 14

<210>: 103

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 103

tcgtgtcgat agag 14

<210>: 104

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 104

gatcactatg cgta 14

<210>: 105

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 105

ctacgtagtc tata 14

<210>: 106

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 106

gagtgcgcac tcgt 14

<210>: 107

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 107

tcgtgctatg tatg 14

<210>: 108

<211 >: 14

<212>: ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213>: -

A O O V: 108

agatgtagac tact 14

<210>: 109

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 109

atacagagat atgc 14

<210>: 110

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 110

ctacagctcg tata 14

<210>: 111

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 111

cgacgtctga gatg 14

<210>: 112

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 112

ctcgagcgat gcgc 14

<210>: 113

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 113

tagatagatc atca 14

<210>: 114

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 114

agcatgcgac taca 14

<210>: 115

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 115

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cgcgagctga ctca 14

<210>: 116

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 116

gatgtagacg tcgc 14

<210>: 117

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 117

cgcatgatca gatg 14

<210>: 118

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 118

gcgtcatcga gcgc 14

<210>: 119

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 119

ctacagcgtc atct 14

<210>: 120

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 120

atacgcgcac tcac 14

<210>: 121

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 121

ctatgtatga gcac 14

<210>: 122

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 122

ctcgtgatga cgag 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 123

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 123

cgcgacgcac atgc 14

<210>: 124

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 124

ctatcagacg tcag 14

<210>: 125

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 125

atacagagtg cgag 14

<210>: 126

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 126

atacgtatca ctgc 14

<210>: 127

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 127

cgacagctca gcac 14

<210>: 128

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 128

ctatcagcga gatg 14

<210>: 129

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 129

atcactcgat agtg 14

<210>: 130

<211 >: 14

<212>: ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213>: -

A O O V: 130

cgcatatcat atct 14

<210>: 131

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 131

cgcgagagtg taca 14

<210>: 132

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 132

gagatgctga gcgc 14

<210>: 133

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 133

agcatgagtg ctgt 14

<210>: 134

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 134

cgcgtagcga gcag 14

<210>: 135

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 135

agatcatcat gcac 14

<210>: 136

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 136

tctgtataca cgta 14

<210>: 137

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 137

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tctgtatcat gaca 14

<210>: 138

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 138

tcgtctctca gata 14

<210>: 139

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 139

atacacgatg tatg 14

<210>: 140

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 140

atacgctcga ctca 14

<210>: 141

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 141

tctgacgatg cgag 14

<210>: 142

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 142

gatgagcgtc agag 14

<210>: 143

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 143

gagtctcgtc atct 14

<210>: 144

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 144

atacgtagat gcag 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 145

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 145

gatcacgatc tcac 14

<210>: 146

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 146

atcactagtc atgc 14

<210>: 147

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 147

tagtgcgcgt gatg 14

<210>: 148

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 148

gctcagatcg tact 14

<210>: 149

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 149

gctgactaca ctct 14

<210>: 150

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 150

agcgagagac atct 14

<210>: 151

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 151

tctcgtctga ctct 14

<210>: 152

<211 >: 14

<212>: ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213>: -

A O O V: 152

gatgacgcac agta 14

<210>: 153

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 153

atcacagatg cgac 14

<210>: 154

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 154

gcgactctcg ctgc 14

<210>: 155

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 155

cgacagcgat gaca 14

<210>: 156

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 156

agatcagcac atca 14

<210>: 157

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 157

gctgtgagat gcac 14

<210>: 158

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 158

gcgatagcat gcag 14

<210>: 159

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 159

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

gatcgtagtg cgac 14

<210>: 160

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 160

ctcacatacg ctct 14

<210>: 161

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 161

cgatgtcgat atgt 14

<210>: 162

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 162

atcactatga ctct 14

<210>: 163

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 163

tcgatagcgt atgt 14

<210>: 164

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 164

atacactcgt agag 14

<210>: 165

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 165

gcgtgtatgt gact 14

<210>: 166

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 166

tatcagatga cgta 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 167

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 167

gagactctgt agac 14

<210>: 168

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 168

gcgtgcgcga cgta 14

<210>: 169

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 169

tagtcagatc tcgc 14

<210>: 170

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 170

agacagcgac tcgt 14

<210>: 171

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 171

cgatcagatc agac 14

<210>: 172

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 172

gatgacgaca gatg 14

<210>: 173

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 173

agcgagatgt gcac 14

<210>: 174

<211 >: 14

<212>: ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213>: -

A O O V: 174

gcgtcagcac tata 14

<210>: 175

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 175

agcgtataca ctgc 14

<210>: 176

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 176

ctcatgctgt gact 14

<210>: 177

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 177

gagatgatcg tata 14

<210>: 178

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 178

tatgactatc tact 14

<210>: 179

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 179

tagatgatgt agtg 14

<210>: 180

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 180

tcgacatcac tcgt 14

<210>: 181

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 181

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

gctgactcac tcgc 14

<210>: 182

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 182

gagtgtctcg tcac 14

<210>: 183

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 183

cgacactcga gcgt 14

<210>: 184

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 184

tatcacgcga ctgc 14

<210>: 185

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 185

agatgtatgt agag 14

<210>: 186

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 186

agacgtcgac agac 14

<210>: 187

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 187

atcgagctcg tcag 14

<210>: 188

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 188

tctgagatgt atgc 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210>: 189

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 189

agcgactcga cgac 14

<210>: 190

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 190

gagacatatg tact 14

<210>: 191

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 191

gctgtgagtg cgtg 14

<210>: 192

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 192

ctcatgcgtc tcgt 14

<210>: 193

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 193

tatgactcgt gcac 14

<210>: 194

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 194

agacgctcac atgt 14

<210>: 195

<211 >: 14

<212>: ADN

<213>: -

A O O V: 195

cgcgtagatg cgtg 14

<210>: 196

<211 >: 14

<212>: ADN

<400> 196 ctacacgaca gact 14 5

<210> 197 <211 > 14 <212> ADN 10 <213> -

<400> 197 cgatgtcgtg cgag 14

15

<210> 198 <211> 14 <212> ADN <213> -

20

<400> 198 tagatgcgac agac 14

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la deconvolucion de mezclas de sustancias que contienen acidos nucleicos, en el que:

a) se generan a partir de varios nucleotidos (A, C, G, T/U) segun un algoritmo predeterminado varias secuencias nucleotidicas diana (TNS) diferentes entre si (Ai-An, Bi-Bn,.... Zn) con posiciones de secuencia N0-Nn , de las que

b) respectivamente al menos una TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) se asigna respectivamente a al menos una sustancia o combinacion de sustancias y se acopla quimicamente con esta, y

c) se proporciona al menos una mezcla de sustancias para analizar con al menos dos TNS distintas contenidas (Ai- An, Bi-Bn, ..., Zn) o sustancias acopladas con TNS, que

d) se secuencian segun un procedimiento de secuenciacion, en el que simultaneamente se recogen todas las TNS contenidas en la mezcla de sustancias (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) en un espectro de secuencia comun, en el que

e) las secuencias superpuestas en el espectro de secuencia se deconvolucionan mediante cribado de las posiciones de secuencia N0-Nn segun el algoritmo predeterminado y se identifican segun su asignacion,

caracterizado porque se predetermina una ocupacion nucleotidica para los nucleotidos (A, C, G, T/U) en las posiciones de secuencia N0-Nn de una TNS para formar (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) mediante una condicion establecida por el algoritmo predeterminado que esta ligada a una ocupacion nucleotidica de al menos una posicion de secuencia adicional.
2. Procedimiento segun la reivindicacion i, caracterizado porque se criban segun el algoritmo predeterminado las posiciones de secuencia N0-Nn que presentan una intensidad de senal significativamente elevada de nucleotidos individuales (A, C, G, T/U).
3. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se sustraen por etapas las intensidades de senal significativamente elevadas de nucleotidos individuales (A, C, G, T/U) en el espectro de secuencia hasta alcanzar en cada posicion de secuencia N0-Nn como maximo un nucleotido (A, C, G, T/U) de intensidad de senal detectable minima, en el que los espectros de sustraccion obtenidos a este respecto, que presentan respectivamente al menos segmentos de secuencia o fragmentos de secuencia, se criban en las posiciones de secuencia N0-Nn segun el algoritmo predeterminado.
4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se predetermina segun el algoritmo predeterminado para cada posicion de secuencia N0+i-Nn de una TNS para formar (Ai-An, Bi-Bn, .... Zn), una limitacion referida a un nucleotido (A, C, G, T/U) de una posicion de secuencia precedente respectivamente para al menos un nucleotido (A, C, G, T/U).
5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se diferencian entre si las TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) en al menos dos posiciones de secuencia y/o por al menos una serie de nucleotidos consistente en al menos 5 posiciones de secuencia.
6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se forman TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) con una longitud de al menos 5 posiciones de secuencia.
7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se asignan TNS (Ai-An, Bi- Bn, ..., Zn) que presentan una diferencia de secuencia de al menos un 50 %, preferiblemente un 75 %, con especial preferencia un 90 %, respectivamente a sustancias que presentan las mayores diferencias estructurales y/o funcionales entre si.
8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se forman TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) que presentan al menos un segmento de secuencia que codifica un grupo de sustancias, tamano de sustancia, coordenadas geograficas de una variedad de exposicion o una fecha.
9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) presentan al menos un segmento de secuencia mediante el cual son identificables como TNS.
10. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se trata en las TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) de moleculas de ARN o ADN monocatenarias o bicatenarias.
11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se combinan entre si las TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn) y/o segmentos de secuencia de TNS (Ai-An, Bi-Bn, ..., Zn).
12. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se unen covalentemente las TNS (A1-An, B1-Bn, ..., Zn) con su sustancia o sustancias asignadas.
13. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se lleva a cabo al menos 5 una etapa de procedimiento para la seleccion de al menos una de las TNS (ArAn, BrBn, ..., Zn) y/o al menos una de

las sustancias acopladas a TNS, en el que se proporciona una mezcla de sustancias para analizar a partir de una fase movil liquida y/o una elucion liquida de una fase estacionaria.
14. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se secuencia la mezcla de 10 sustancias para analizar mediante el uso de didesoxinucleotidos marcados fluorescentemente, al menos una

polimerasa y al menos un cebador que es complementario de un segmento de secuencia de al menos una TNS (A1- An, B1-Bn, ..., Zn).